CH636449A5 - Verfahren zur gewinnung eines neuen, spezifischen alpha-l-antikoerpers. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE körper nachgewiesen werden können, genügen die genannten

1. Verfahren zur Gewinnung eines neuen, a-L-Antikörpers, Nachweismethoden nicht.

dadurch gekennzeichnet, dass ein Tier mittels a-L-Antigen oder Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung des a-L-Antigen/a-L-Antikörperkomplex aus einer das a-L-Anti- neuen a-L-Antikörpers ist im vorangehenden Patentanspruch gen enthaltenden Lösung, welche der Dichtegradient-Zentrifu- 5 1, die erfindungsgemässe Verwendung in den Patentansprü-gierung unterzogen worden ist, wobei nur die das a-L-Antigen chen 2 bis 6 charakterisiert.

enthaltende Fraktion mit einer Dichte unter 1,1 g/ml gewon- Das a-L-Antigen hat die folgenden Eigenschaften :

nen und verwendet wird, immunisiert wird und dass das den l. Molmasse : ungefähr 1 000 000 (das Antigen wird aus a-L-Antikörper enthaltende Serum des Tieres gewonnen wird. einer Chromatographiekolonne mit Biogel A-1,5 m (Marke für

2. a-L-Antikörper, gewonnen mittels des Verfahrens gemäss io Biored Laboratories) beinahe in der gleichen Fraktion wie das Patentanspruch 1. IgM mit der Molmasse 900 000 bis 1 000 000 eluiert).

3. Verwendung des mittels des Verfahrens gemäss Patentan- 2. Elektrophoretische Mobilität: ß-a2-Globulinbereich (die-spruch 1 gewonnenen a-L-Antikörpers in Methoden für die ser Bereich liegt zwischen demjenigen von HBs-Antigenen und Prüfung auf Anwesenheit von a-L-Antigen und a-L-Antikör- a-Fetoprotein).

per. 15 3. Isoelektrischer Punkt: PI = 5,04 (Die Aktivität des

4. Verwendung des a-L-Antikörpers gemäss Patentanspruch a-L-Antigens liegt beim Messen mit Ampholien-Kolonnen im 3, dadurch gekennzeichnet, dass es zusammen mit einem Bereich von 4,22 bis 5,68).

Trägermedium gelöst und die Lösung in Form eines Plättchens 4. Dichte der Aufschlämmung : d = 1,08 g/ml in einer »

verfestigt wird. Lösung von Cäsiumchlorid; d = 1,03 g/ml in einer Lösung von

5. Verwendung des a-L-Antikörpers gemäss Patentanspruch 20 Saccharose.

3, dadurch gekennzeichnet, dass es mit feinteiligen Partikeln 5. Komplexbildung : ein fällbarer Komplex wird bei Anwe-

verbunden wird. senheit von Magnesiumchlorid mit Dextransulfat gebildet. Der

6. Verwendung des a-L-Antikörpers gemäss Patentanspruch Komplex zeigt Lipiprotein-ähnliche Eigenschaften.

3, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Isotopen markiert wird. 6. Färbung : Der a-L-Antigen/a-L-Antikörperkomplex in

25 Agar-Agar-Gel kann mit Sudan Black B gefärbt werden.

7. Thermostabilität : die antigenischen Eigenschaften im Serum sind auch nach 30minütigem Erwärmen bei 56 °C noch Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung vorhanden.

eines neuen, spezifischen a-L-Antikörpers, sowie dessen Ver- 8. Form des Antigen/Antikörperkomplexes : sphärische wendung für die Prüfung auf Anwesenheit von a-L-Antigen 30 Partikel von ungefähr 300 Â Durchmesser, und a-L-Antikörper. Es wurden Untersuchungen ausgeführt, um die verschiede-

Bis zu dieser Erfindung war es bekannt, dass bei Patienten, nen Antigene und Antikörper bei verschiedenen Lebererkran-welche Lebererkrankungen hatten, verschiedene Antigene kungen nachzuweisen. Diese Nachweise wurden mit denjeni-

nachgewiesen werden können. So zeigen sich bei Patienten mit gen des neuen a-L-Antigens verglichen. Die heute bekannten Hepatitis die HB-Antigene (HBs, HBc, HBe) und die HA-Anti- 35 Antigene und Antikörper bei Lebererkrankungen sind HBs-gene. In Patienten mit primärem Lebertumor ist a-Fetoprotein Antigensystem, e-Antigensystem und a-Fetoprotein (im folgennachzuweisen usw. Der Nachweis dieser Antigene und ihrer den wird dieses Protein a-FP genannt werden). Die Resultate entsprechenden Antikörpern wird für die Diagnose auf der Vergleiche sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Lebererkrankungen sowie für die Untersuchung des Blutes für Die Vergleichsmethoden waren für HBs-Antigen die IAHA-Transfusionen verwendet. Da aber in vielen Fällen von 40 Methode, für HBs-Antikörper die PHA-Methode und die

Lebererkrankungen keine der genannten Antigene und Anti- andern wurden mittels der MO-Methode bestimmt.

Tabelle

Diagnose Anzahl a-L Anzahl pos. HBs e a-FP

Proben Bestimmungen Ag(+) Ak(+) Ag(+) Ak(+) Ag(+)

Leber- 39

Ag(+)

9

6

0

1

0

4

tumor

Ak(+)

1

0

0

0

0

1

Ag,Ak(—)

29

15

3

0

0

12

Leber- 35

Ag(+)

6

2

0

0

0

0

zirrhose

Ak(+)

6

5

0

0

2

0

Ag,Ak(-7

23

16

2

0

0

0

Chronische 40

Ag(+)

3

1

1

0

1

0

Hepatitis

Ak(+)

0

0

0

0

0

0

Ag,Ak(—)

37

19

1

1

0

0

Akute 40

Ag(+)

4

3

0

0

1

0

Hepatitis

Ak(+)

4

2

1

0

1

0

Ag,Ak(—)

32

15

8

2

4

0

HBs Ag(+) 20

Ag(+)

0

0

0

0

0

0

Blutspender

Ak(+)

1

1

0

0

0

0

AgjAk(-)

20

0

4

0

0

0

Gesunder 20

Ag( + )

0

0

0

0

0

0

Mensch

Ak( + )

0

0

0

0

0

0

Ag, Ak( — )

20

0

4

0

0

0

Wie aus der oben angegebenen Tabelle hervorgeht, zeigt das eindeutig bei chronischer und akuter Hepatitis nachgewiesen. a-L-Antigen hohe Selektivität in bezug auf Bestimmung von Das a-L-Antigen kann aber nicht nachgewiesen werden im Blut Lebertumor und Leberzirrhose. Das a-L-Antigen wird auch von Blutspendern, bei denen HBs-Antigen positiv nachgewie

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sen worden ist und im Blut von gesunden Personen. wenn die Bestimmung nach den Methoden der «Single Radial

Der a-L Antikörper zeigt eine hohe Selektivität in bezug auf immuno diffusion method (SRID)», nach der «Radioimmuno Bestimmung von Leberzirrhose und wird auch im Blut von assay method (RIA)», nach der «Enzyme-linked immuno-sol-Blutspendern nachgewiesen, die positiv auf HBs-Antikörper vent assay (ELISA)», nach der «Passive hemagglutination reagieren. Ungefähr 60% der Sera, die sowohl a-L-Antigen und s method (PHA)» und nach ähnlichen Methoden, ausgeführt a-L-Antikörper anzeigen, reagieren auch positiv auf HBs-Anti- wird.

gen/HBs-Antikörper. Im Falle des Serums bei Lebertumoren Im Falle der «Single radial immunodiffusion method enthalten ungefähr 45% der Fälle, in denen a-L-Antigen positiv (SRID)» kann zum Beispiel das vorbehandelte a-L-Antigen nachgewiesen wird, auf das a-FP. Andererseits können in unge- verwendet werden, welches durch Auflösen desselben mit fähr 45% der Sera, die auf a-Antigen positiv reagieren, keinerlei io einem Trägermedium und Erstarren dieser Lösung in Form andere, bekannte Antigen/Antikörpersysteme nachgewiesen von Platten erhalten wird. Solche Trägermedien sind zum Beiwerden. spiel Agar-Agar, Agarose, Stärke, Polyacrylamid, Gele und ähn-

Daraus folgt, dass das a-L-Antigen und der a-L-Antikörper liehe hochmolekulare Stoffe. Das Probeplättchen aus der sehr repräsentativ die Anwesenheit von Lebererkrankungen Lösung mit dem a-L-Antigen kann mittels konventionellen anzeigen. Der Nachweis von a-L-Antigen und von a-L-Antikör- is Methoden hergestellt werden. Beispielsweise kann das Träger-per ist also sehr nützlich für die Diagnose von Lebererkrankun- medium unter Wärmeeinwirkungen in einer Pufferlösung auf-gen und für die Untersuchungen von Blut für Bluttransfusion. gelöst werden. Der Lösung wird anschliessend das a-L-Antigen

Der a-L-Antikörper wird wie gesagt dadurch hergestellt, zugegeben und die erhaltene Mischung gerührt. Die so erhal-dass ein Tier mit a-L-Antigen oder mit a-L-Antigen/a-L-Anti- tene Lösung wird anschliessend auf eine Glasplatte ausgebreitet körperkomplex immunisiert wird und das Antiserum anschlies-20 oder in Kunststoffbehältern abgefüllt. Anschliessend wird das send gewonnen wird. Ganze abgekühlt und die Lösung erstarrt zu einem Feststoff.

Das a-L-Antigen kann entweder in einem a-L-Antigen posi- Die erhaltenen Plättchen können nun anschliessend zur tiven Serum oder in Ascites per se verwendet werden. Das Untersuchung von Sera verwendet werden.

gleiche Antigen kann aber mit Vorteil in einer gereinigten Im Fall der «Passive hemagglutination method (PHA)»

Form eingesetzt werden. Die Reinigungsformen umfassen die 25 wird das a-L-Antigen mit Vorteil an fein verteilten Partikeln bekannten Protein- oder Lipoprotein-Trennmethoden. Bei- gebunden verwendet. Dazu können die konventionellen, feispiele solcher Methoden sind diejenigen, welche heute schon in nen Partikel verwendet werden. Speziell bevorzugt werden der Immunologie verwendet werden. Diese umfassen beispiels- dabei Erythrocyten von Säugetieren und von Vögeln. Es kön-weise Verfahren der Dichte Gradientzentrifugierung, Aussal- nen aber auch Teilchen aus Polystyrol, Latex, Polyesterlatex, zung, Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatogra- 30 Polyvinylchlorid, Bentonit, Glas und ähnliche Materialien ver-phie, isoelektrische Focusierung, Ultrafiltration, Cohn's Frak- wendet werden, wenn der Durchmesser der Teilchen im tionierung, Fällung mittels Dextransulfat und Verfahren, Bereich von 1 bis 10 |im liegt. Um das a-L-Antigen an die fei weiche die Zugabe von Antiserum umfassen, um damit die nen Teilchen zu binden, können die üblichen Bindemittel ver

Unreinheiten, nicht jedoch das a-L-Antigen, aus der Lösung zu wendet werden. Solche Bindemittel umfassen beispielsweise entfernen. 35 Gluataraldehyd, Formaldehyd, Tanninsäure, bisdiazodiertes

An Tieren, welche sich für die oben beschriebene Immuni- Benzidin, Chromchlorid, Carbodiimid und ähnliche Verbin-sierung gut eignen, erwähnen wir Kaninchen, Guinea- düngen.

Schweine, Ziegen, Pferde, Kühe und ähnliche. Im Falle der «Radioimmuno assay method (RIA)» wird das

Um Antisera von hoher Antikörperaktivität zu erhalten, ist a-L-Antigen markiert mit einem Isotop eingesetzt. Die Markie-es von Vorteil, wenn die Immunisierung mit a-L-Antigen oder 40 rung kann dabei mittels konventioneller Methoden wie zum a-L-Antigen/a-L-Antikörperkomplex ausgeführt wird, die mit Beispiel die Chloramin-T-Methode geschehen, wobei 125I oder dem Freund-Zusatz emulgiert worden sind. Ebenso sollte die »q eingesetzt wird.

Immunisierung nicht nur einmal, sondern mehrere Male Im Falle der «Enzyme-linked immuno solvent assay geschehen. (ELISA)» wird das a-L-Antigen vor Verwendung an ein Enzym

Der a-L-Antikörper, welcher gemäss dieser Erfindung 45 gebunden. An Enzymen können zum Beispiel Glukoseoxydase, erhalten wird, kann mittels konventioneller Bestimmungsme- Alkaliphosphatase, Peroxydase und ähnliche Enzyme verwen-thoden nachgewiesen werden. Beispiele solcher Methoden sind det werden. Normalerweise wird Glutaraldehyd als Bindemittel die Ouchterlony-Methode (MO), die «Single radial immuno dabei verwendet.

diffusion method (SRID)», die «Immuno electrophoresis (IES, Das a-L-Antigen und der a-L-Antikörper können mittels

IEP)», die «Enzyme-linked immuno solvent assay (ELISA)», 50 konventioneller Methoden bestimmt werden, wobei die oben-die «Complément fixation method (CF)», die «Reverse passive genannten Reagenzien verwendet werden, welche das a-L-Anti-hemagglutination method (RPHA)», und die «Immune adhe- gen enthalten. In allen Fällen, in denen der a-L-Antikörper rence hemagglutination method (IAHA)». bestimmt und nachgewiesen werden soll, enthält das Nachweis-

Das Bestimmungsreagens, welches das a-L-Antigen enthält, reagenz das a-L-Antigen. Das gleiche Reagenz kann auch zur kann für konventionelle immunologische Methoden verwendet 55 Bestimmung des a-L-Antikörpers verwendet werden, indem die werden, welche die Antigen/Antikörperreaktion benutzen. inhibierte Reaktion aufgeführt wird, wobei in jeder Methode Solche Verfahren umfassen Reagenzien, welche das Antigen der a-L-Antikörper verwendet wird. In allen Ausführungsfor-per se enthalten und Verfahren, welche ein vorbehandeltes men können mit Vorteil gewisse andere Stoffe zugegeben wer-

Antigen benutzen. Das Bestimmungsreagenz, welches das den wie z.B. Erythracyten, Pufferlösungen, a-L-Antikörper und a-L-Antigen gemäss dieser Erfindung enthält, kann für beide 60 ähnliche, falls dies nötig ist.

Methoden eingesetzt werden. Die oben gegebene Beschreibung des Bestimmungsreagenz,

Das a-L-Antigen per se wird dann eingesetzt, wenn die welches das a-L-Antigen enthält, kann wortwörtlich für die

Bestimmungsmethoden nach der Ouchterlony-Methode (MO), Beschreibung desjenigen Bestimmungsreagenz verwendet wer-nach der «Immunoelectrophorese Methode (IES, IEP)», nach den, das den a-L-Antikörper enthält. Es muss einfach jedesmal der «Complément fixation method (CF)», nach der «Immuno 65 der Ausdruck «a-L-Antikörper» durch den Ausdruck «a-L-adherence hemagglutination method (IAHA)» und ähnlicher Antigen» ersetzt werden und umgekehrt.

Methoden ausgeführt wird. Die Reinigungsmethode für das a-L-Antigen gemäss dieser

Das vorbehandelte a-L-Antigen wird dann verwendet, Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Material, wel

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ches das a-L-Antigen enthält, einer Dichtegradient-Zentrifugie- 0,01 M Tris-aminomethan/Salzsäurepufferlösung. Diese rung unterworfen ist. Anschliessend wird die Fraktion mit a-L-Antigenlösungsfraktion wurde zuoberst im Zentrifugie-

einer Dichte von kleiner als 1,1 g/ml gewonnen, mit Vorteil rungsrohr aufgebracht, so dass sich verschiedene Schichten auswird die Fraktion mit einer Dichte von 1,03 bis 1,08 g/ml, bildeten. Das Ganze wurde anschliessend 24 Stunden lang bei gewonnen. 5 40 000 Umdrehungen pro Minute der Dichtegradient-Zentrifu-Mittels dieses Verfahrens kann das a-L-Antigen vom gros- gierung unterworfen. Die a-L-Antigen positive Fraktion wurde sten Teil der unerwünschten, andern Proteinkomponenten bei anschliessend gewonnen und mittels destilliertem Wasser und Lebererkrankungen getrennt werden. Das a-L-Antigen hat eine anschliessend mittels Trisaminomethan/Salzsäurepufferlösung sehr niedere Dichte. über Nacht dialysiert. Die resultierende Lösung wurde

Als Materialien, welche das a-L-Antigen enthalten, und die io anschliessend mittels Amicon-Diaflow-XM-50 auf die 5fache gemäss dieser Erfindung verwendet werden können, können Lösung gebracht. Das erhaltene a-L-Antigen bildet mit dem zum Beispiel a-L-Antigen positive Sera, und Ascites genannt a-L-Antikörper Komplexe. In der Lösung konnten keine ande-werden. ren, zu Lebererkrankungen gehörenden Antigene wie HBs-

Als Medium für den Gebrauch in der genannten Dichtegra- Antigene, e-Antigene, a-FP und ähnliche mittels MO-Metho-dient-Zentrifugierung können die üblichen Stoffe, z.B. Cesi- 15 den nachgewiesen werden. Die spezifische Aktivität des so umchlorid, Cesiumbromid, Kaliumbromid, Lithiumbromid, gewonnenen a-L-Antigens konnte durch die beschriebenen Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Glyzerol, Saccharose und Verfahren ungefähr 100 mal erhöht werden. Dieses a-L-Anti-ähnliche Verbindungen verwendet werden. gen kann nun mit Vorteil in Bestimmungsreagenzien eingesetzt

Beim Ausführen der Reinigungsmethode können neben der werden.

genannten Zentrifugierung und in Kombination damit andere, 20 herkömmliche Trennverfahren für Protein- oder Lipoprotein- Beispiel 3

fraktionen verwendet werden. Beispiele solcher weiterer Trenn- Die im Beispiel 1 gewonnene a-L-Antigenlösung wurde verfahren sind Aussalzmethoden, Elektrophorese, Gelfiltra- durch Zugeben von Freund-Zusatz im Verhältnis 1:1 emulgiert. tion, Affinitätschromatographie, isoelektrische Focusierung, Ein ml dieser Emulsion wurde anschliessend in den Rücken Ultrafiltration, Cohn's Fraktionierung, Fällung mittels Dex- 25 eines Kaninchens subcutan oder intracutan injiziert. Die transulfat oder die Methoden, welche die Zugabe von Antikör- gleiche Lösung wurde auch in die Fusssohle des Tieres injiziert, pern gegen Komponenten - nicht aber gegen das a-L-Antigen - Das Kaninchen wurde dadurch immunisiert. Eine Woche nach umfassen. der ersten Immunisierung wurde das Tier ein zweites Mal auf

Die Reinigungsmethode zeigt speziell gute Resultate, wenn die gleiche Art und Weise und mit der gleichen Menge Mittel sie als erste Reinigungsmethode für das Rohmaterial, d.h. für 30 immunisiert. Einen Monat nach der ersten Immunisierung wurde das Serum oder Ascytes verwendet wird. Das gleiche Verfahren eine dritte analoge Immunisierung, dieses Mal jedoch mit der kann aber auch als eine Reinigungsstufe nach verschiedenen doppelten Menge Immunisierungsmittel ausgeführt. Eine anderen Vorreinigungen eingesetzt werden. Woche nach der dritten und letzten Immunisierung wurde aus

Im folgenden werden einige Beispiele und Experimente dem Blut des Tieres das Serum abgetrennt. Diesem Serum beschrieben, welche die Erfindung illustieren sollen. Es muss 35 wurde nun die gleiche Menge Serum vom gesunden Menschen darauf hingewiesen werden, dass die Beispiele nicht als Ein- zugegeben. Die Mischung wurde vorerst einmal eine Stunde schränkung der Erfindung genommen werden können. lang bei 37 °C belassen. Anschliessend wurde sie eine Nacht lang bei 4 °C kaltgestellt. Das Serum wurde anschliessend 10 Beispiel 1 Minuten lang bei 10 000 U/min zentrifugiert. Das so erhaltene

Nach Zentrifugierung von 100 ml eines a-L-Antigen positi- 40 Antiserum, welches den a-L-Antikörper enthält, reagiert prak-ven Serums während 20 Minuten bei 10 000 Umdrehungen pro tisch nur mit dem a-L-Antigen. Mit den andern Antigenen von Minute wurde die über dem Niederschlag liegende klare Flüs- Lebererkrankungen, wie HBs-Antigen, e-Antigen, a-FP und sigkeit entnommen. Der Lösung wurde pulverförmiges Cäsi- ähnliche reagiert der gewonnene a-L-Antikörper praktisch umchlorid zugegeben, und zwar in einem Verhältnis von 0,3 nicht. Ebenso zeigt er keine Reaktionen mit dem Serum von g/ml Lösung. Das Salz löste sich vollständig auf. Die so erhal- 45 gesunden Menschen.

tene Salzlösung wurde nun der Dichtegradient-Zentrifugierung Es folgt daraus, dass das gewonnene Antiserum mit dem bei 40 000 U/min während 40 Stunden unterworfen. Die a-L-Antikörper zum Nachweis und zur Bestimmung gemäss oberste Fraktion mit einer Dichte von weniger als 1,1 g/ml dieser Erfindung verwendet werden kann.

wurde abgenommen und mittels destilliertem Wasser bzw. Salzlösung über Nacht dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde auf so Beispiel 4

die 5fache Konzentration eingedickt. Dies geschah mittels Ami- Zur Lösung von a-L-Antigen gemäss dem Beispiel 2 wurde con Diaflow XM-50 (TM, Amicon Co.). Das so erhaltene Freund-Zusatz gegeben, und zwar im Verhältnis 1:1, um das a-L-Antigen bildet mit dem a-L-Antikörper ein Komplex. In Ganze zu emulgieren. 0,5 ml dieser Emulsion wurden in Teilvo-der Lösung konnten keine andere Antigene von Lebererkran- lumina in den Rücken eines Guinea-Schweins subcutan oder kungen, wie z.B. HBs-Antigen, e-Antigen, a-FP und ähnliche 55 Intracutan injiziert. Die gleiche Injektion wurde auch in die mittels MO-Methoden nachgewiesen werden. Die spezifische Fusssohlen des Tieres gemacht. Das Guinea-Schwein wurde so Aktivität des a-L-Antigens wurde durch diese Konzentrierung immunisiert. Anschliessend wurde gleich verfahren, wie dies und Reinigung ungefähr 30fach vergrössert. Dieses a-L-Anti- im Beispiel 3 beschrieben worden ist. Es wurde ein Antiserum gen ist nun sehr gut geeignet, um in einem Nachweisreagenz gewonnen, welches den a-L-Antiköper enthält.

verwendet zu werden. 60 Das erhaltene Antiserum reagiert sehr selektiv nur mit a-L-Antigen. Es reagiert nicht mit andern, Lebererkrankungen Beispiel 2 zugeordneten Antigenen wie zum Beispiel HBs-Antigene,

Ausgehend von 100 ml a-L-Antigen positivem Ascites e-Antigen, a-FP und ähnliche. Es zeigt auch keinerlei Umset-

wurde die gleiche, konzentrierte a-L-Antigenlösung hergestellt zungen, wenn es in Kontakt mit Serum von gesunden Men-wie im Beispiel 1 beschrieben. Vor der Dichtegradient-Zentrifu- 65 sehen gebracht wird.

gierung wurde der Dichtebereich zwischen 1,05 und 1,2 g/ml Das so erhaltene Antiserum mit dem a-L-Antikörper kann der Lösung gewonnen. Dies geschah in einem Zelluloserohr also als Bestimmungs- und Nachweisagenz gemäss dieser Erfin-und unter Verwendung einer Cäsiumchloridlösung in einer dung verwendet werden.

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Beispiel 5 Proteinkonzentration von 10 mg/ml verdünnt. Zu dieser

Zu 25 ml der a-L-Antigenlösung des Beispiels 1 wurden Lösung wurde die äquivalente Menge eines mittels Bromcyanid nacheinander 50 ml des Antiserums gemäss Beispiel 3 gegeben, aktivierten Sepharose 4B-Gel (Handelsmarke der Firma Phar-d.h. eines Antiserums, welches den a-L-Antikörper enthält. Das macia AB) gegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Ganze wurde unter Rühren gemischt. Die Mischung wurde 1 5 4 °C belassen. In dieser Zeit lief die Reaktion ab. Anschliessend Stunde lang bei 37 ° C und anschliessend eineiNacht lang bei 4 CC wurde Protein, welches nicht reagiert hatte, durch Auswaschen gehalten. Anschliessend wurde die Mischung 20 Minuten lang mit 0,05 M Phosphatsalzpufferlösung bei pH 7,5 entfernt. Die bei 10 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der so erhaltene Lösung wurde hierauf in eine Kolonne von Innen-

a-L-Antigen/a-L-Antikörperkomplex wurde als Fällung daraus durchmesser 1,5 cm und Länge 20 cm gegeben. Die a-L-Anti-gewonnen. Zum ausgefallenen Feststoff wurde eine Pufferlö- ,0 genlösung aus dem Beispiel 2 wurde auf die gleiche Kolonne sung von 0,01 M Tris-aminomethan/Salzsäure gegeben und die gegeben.

Mischung nochmals zentrifugiert, um so Verschmutzungen Nach dem Entfernen von .Substanzen, die nicht reagiert hat-

darin auszuwaschen. ten, mittels Auswaschen mit der oben erwähnten Pufferlösung,

Der gereinigte a-L-Antigen/a-L-Antikörperkomplex wurde ,wurde eine 3,5 M Natriumjodidlösung auf die Kolonne gege-in 5 ml Salzlösung suspendiert und die Suspension durch >5 ben, um das Reaktionsprodukt zu disoziieren und das a-L-Anti-

Zugabe von Freund-Zusatz in gleicher Menge emulgiert. Mit gen auszuwaschen. Die so erhaltene a-L-Antigenlösung wurde dieser Lösung konnte anschliessend mittels des gleichen Ver- mittels destilliertem Wasser dialysiert, um so das Natriumjodid fahrens, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist, Antiserum mit zu entfernen. Die saubere Lösung wurde anschliessend über Anti-L-Antikörper gewonnen werden. Das so gewonnene Anti- Amicon Diaflow-XM-50 konzentriert. Nun war die konzen-serum reagiert wiederum nur mit a-L-Antigenen und nicht mit 20 trierte a-L-Antigenlösung bereit, um als Bestimmungsmittel den andern, mit Lebererkrankungen auftretenden Antigenen verendet zu werden ; diese Lösung wird im folgenden als wie HBs-Antigen, e-Antigen, a-FP und ähnliche. Das Antise- Lösung 7 bezeichnet.

rum reagiert ebenfalls nicht mit dem Serum von gesunden Die im Beispiel 1 erhaltene a-L-Antigenlösung wurde in

Menschen. einer 0,1 M Barbitalpufferlösung aufgelöst. Die Konzentration

Zum Antiserum mit dem a-L-Antikörper gemäss dem Bei- 25 von Proteinen wurde auf 10 mg/ml eingestellt. Zu dieser spiel 3 wurde die gleiche Menge einer phosphatsalzhaltigen Lösung wurde die gleiche Menge mittels Bromcyanid aktivier-Pufferlösung von 0,05 M gegeben (pH 7,5). Zur so erhaltenen ten Sepharose 4B-Gel gegeben. Wiederum liess man die Lösung wurde noch einmal die gleiche Menge einer wässrigen, Mischung 24 Stunden lang bei 4 °C reagieren. Protein, welches gesättigten Ammoniumsulfatlösung (pH 6,8) gegeben. Das nicht reagiert hatte, wurde anschliessend mittels 0,05 M Phos-

Ganze wurde unter Rühren gemischt. Nach einer Stunde wurde 30 phatsalz-Pufferlösung von pH 7,5 ausgewaschen. Anschlies-die Lösung 30 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Das send wurde das erhaltene Produkt in eine Kolonne mit Innen-anschliessend abgetrennte Präzipitat wurde in einer Phosphat- durchmesser 1,5 cm und Länge 20 cm gegeben. Das Antiserum salzpufferlösung aufgelöst. Es wurde soviel Lösung zugegeben, von Beispiel 3, welches den a-L-Antikörper enthält, wurde um das gleiche Volumen wie das Ausgangsserum zu erreichen. ebenfalls auf die Kolonne gegeben. Nach dem Auswaschen von Von einer gesättigten, wässrigen Ammoniumsulfatlösung (pH 35 Substanzen, die nicht reagiert hatten, wurde eine Lösung von 6,8) wurde der vierte Teil des oben genannen Volumens zur 3,5 M Natriumjodid auf die Kolonne gegeben. Mittels des Phosphatpufferlösung gegeben. Eine Stunde später wurde die Natriumjodids wurde das Produkt dissoziiert und das a-L-Anti-Lösung 30 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. gen ausgewaschen. Die so erhaltene a-L-Antigenlösung wurde

Anschliessend wurde noch einmal ein Viertel des Ausgangsvo- mittels destilliertem Wasser dialysiert, um so das Natriumjodid lumens wässrige, gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugege- 40 daraus zu entfernen. Die reine Lösung wurde hierauf über ben. Die so erhaltene Lösung enthielt nun also 33% gesättigte Amicon Dioaflow-XM-50 konzentriert. Nun war die reine, kon-Ammoniumsulfatlösung. Nach einer Stunde wurde auch diese zentrierte a-L-Antigenlösung bereit zur Verwendung als Lösung 30 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Die Prä- Bestimmungs- und Prüfungsagens ; diese Lösung wird im fol-zipitate wurden eingesammelt und in einer 0,01 M Tris-amino- genden als Lösung 8 bezeichnet.

methan/Salzsäurepufferlösung von pH 8,0 gelöst. So wurde 45 Schafsblut wurde 5 mal 10 Minuten lang bei 2000 U/min eine Lösung erhalten, die eine Proteinkonzentration von 70 mg zentrifugiert. Dazwischen wurden die ausgefällten Erythrocy-pro ml aufwies. Die Lösung wurde mittels Gelfiltration über ten mit Salzlösung gewaschen. Anschliessend wurde zu den Sephadex G 50 (Marke der Firma Pharmacia AB) mit der gewaschenen Erythrocyten eine 0,15 M Phosphatsalzpufferlö-

genannten Pufferlösung filtriert. Die Lösung wurde dadurch sung von pH 7,5 gegeben und die Konzentration der Erythrocy-entsalzt und gepuffert. Die erhaltene Lösung wurde konzen- 50 ten auf 5% gebracht. Zur Lösung, in der die Erythrocyten triert und auf einen Proteingehalt von 70 mg/ml gebracht. schwammen, wurden Vs des Volumens einer Glutaraldehydlö-

Dazu wurde Amicon Diaflow-XM-50 gewählt. Nun wurde eine sung gegeben. Die Konzentration der letztgenannten Verbin-Kolonne mit aktivierter DEAE-Zellulose gefüllt. Die Kolonne dung wurde mit der Phosphatsalzpufferlösung auf 2,5%

hatte einen Innendurchmesser von 2,6 cm und eine Länge von gebracht. Zur Reaktion wurde die Mischung bei Raumtempera-40 cm. Dazu wurde die obengenannte Tris-aminomethan/Salz- 55 tur 5 Stunden lang langsam gerührt. Die Erythrocyten wurden säure-Pufferlösung verwendet. Die konzentrierte Proteinlö- so fixiert. Nach Zentrifugierung der Suspension wurden die sung wurde auf die Kolonne gegeben, und der a-L-Antikörper fixierten Erythrocyten erhalten, welche anschliessend mehrere auf der aktivierten DEAE-Zellulose adsorbiert. Das adsorbierte Male mittels Auswaschen und Zentrifugieren gereinigt wurden. a-L-Antigen wurde anschliessend mit einer 0,1 M Natriumchlo- Nach Herstellung einer 5%igen Suspension der fixierten Ery-rid/Tris-aminomethan/Salzsäurepufferlösung bei pH 8,0 60 throcyten in der Phosphatpufferlösung wurde die gleiche eluiert. Diese Eluationsflüssigkei wurde dadurch hergestellt, Menge Tanninsäure zugegeben. Die Tanninsäure lag in einer dass Natriumchlorid zur oben erwähnten Tris-aminomethan/ Konzentration von 3 mg/dl in der Phosphatsalzpufferlösung Salzsäurepufferlösung gegeben wurde. Die a-L-Antikörper- vor. Die Gesamtlösung wurde 15 Minuten lang gerührt.

fraktion wurde isoliert und aufgefangen. Die Fraktion wurde Anschliessend wurden die mit Tanninsäure behandelten Ery-konzentriert und auf einen Proteingehalt von 70 mg/ml mittels 65 throcyten mittels Zentrifugierung wieder abgetrennt und einige Amico Diaflow-XM-50 gebracht. Male gewaschen. Die so vorbehandelten Erythrocyten wurden

Die oben erhaltne a-L-Antikörper wurde in einer 0,1 M nun in einer Salzpufferlösung aufgeschlämmt. Die Konzentra-Barbital-Pufferlösung von pH 1,0 aufgelöst. Es wurde auf eine tion der Erythrocyten wurde so eingestellt, dass sie in einer

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Menge von 5% vorlag. Zu dieser Suspension von Erythrocyten wurde die Lösung aus dem Beispiel 6 mit dem a-L-Antikörper gegeben. Die Konzentration des Proteins wurde in der Mischlösung mittels Phosphatsalzpufferlösung auf 1 mg/ml gebracht. Die Mischlösung wurde anschliessend 30 Minuten lang bei 5 Raumtemperatur gerührt. Dadurch wurde der Komplex sensibilisiert. Nach Abtrennung der Erythrocyten mittels Zentrifugierung und Waschen derselben wurden sie in einer Phosphatsalzpufferlösung aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung enthielt 7,5% vorbehandelte rund komplexierter Erythrocyten. Als 'o Antiseptikum wurde eine kleine Menge Tymelosal gegeben. Die Lösung wurde bei 4 °C aufbewahrt. Die a-L-Antikörper sensibilisierten Erythrocyten aus dem Schafsblut können als Bestimmungsreagenzien in der RPHA-Methode eingesetzt werden. 15

Das oben beschriebene Vorgehen wurde wiederholt, nur dass die vorbehandelten Erythrocyten mit dem a-L-Antigen vom Beispiel 2 beladen wurden. Die Konzentration des Proteins betrug diesmal 100 ug/ml. Die mittels a-L-Antigen sensibilisierten Erythrocyten des Schafs können als Bestimmungs- 20 und Nachweisagenz in der PHA-Methode eingesetzt werden.

Das a-L-Antigen aus der Lösung 7 (siehe weiter oben)

wurde in einer 0,04 M Phosphatpufferlösung vonpH 7,4 aufgelöst. Die Lösung wurde auf ein Proteingehalt von 1 mg/ml eingestellt. 25

Zu 10 jj.1 dieser Lösung wurden 50 [il einer Lösung von 125I-Na ( 1 mc) gegeben. Zur so erhaltenen Lösung wurden 10 jxl einer Lösung, in der Chloramin T zu 1,5 mg/ml in der Phosphatpufferlösung gelöst war, gegeben. Die zuletzt erhaltene Lösung wurde 30 Sekunden lang gerührt. Nach der Zugabe von 30 weiteren 100 )xl Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt von 2 mg/ml Natriumbisulfit wurde die Reaktion gestoppt. Zur Reaktionslösung wurden nochmals 100 |il Phosphatpufferlösung gegeben, welche aber 10 mg/ml Kaliumjodid enthielt.

Sofort darauf wurde die erhaltene Lösung über Sephadex G-50 der Gelfiltration unterzogen. Dadurch wurde das mit 125I-mar-kierte a-L Antigen vom restlichen I25I getrennt. Die spezifische Radioaktivität des erhaltenen, mit 125I markierten a-L-Antigens betrug 80 uc/jj.g.

Das mit 125I markierte a-L-Antigen kann als Bestimmungsreagenz in der RIA-Methode eingesetzt werden. Die Erfassungsgrenze bei der Bestimmung von a-L-Antigen liegt zwischen 10 ng und 600 ng/ml und diejenigen für die Bestimmung von a-L-Antikörper zwischen 30 ng und 1000 ng/ml.

Die in Lösung 8 enthaltenen a-L-Antikörper wurden in einer 0,04 M Phosphatpufferlösung von pH 7,4 aufgelöst. Die Proteinkonzentration in der Lösung wurde auf 1 mg/ml eingestellt. Zu 10 jj.1 dieser Lösung wurden 50 ja.1 einer Lösung von 125I-Na (1 mc) gegeben. Anschliessend wurden zur Lösung 10 ml einer Lösung von 1,5 mg Chloramin T pro ml Phosphatpuf- so ferlösung gegeben. Diese Zwischenlösung wurde 30 Sekunden lang gerührt. Anschliessend wurden 100 ml einer Phosphatlösung mit 2 mg/ml Natriummethabisulfit zugegeben. Dadurch wurde die Reaktion sofort gestoppt. Zur Reaktionslösung wurde nochmals eine Phosphatpufferlösung gegeben, die 10 55 mg/ml Natriumjodid enthielt. Sofort wurde die Lösung über Sephadex G-50 der Gelfiltration unterzogen, um den mit 125I-markierten a-L-Antikörper und freies 125I zu trennen. Die spezifische Radioaktivität des erhaltenen, mit 125I markierten a-L-Antikörpers betrug 70 |j.c/ug. 60

Der mit 125I markierte a-L-Antikörper kann als Bestimmungsagenz in der RIA-Methode verwendet werden. Die Bestimmungsgrenzen mit dem genannten Agens liegen bei der Bestimmung von a-L-Antigen zwischen 10 und 600 ng/ml und bei der Bestimmung von a-L-Antikörper zwischen 30 und 1000 65 ng/ml.

Agarose wurde unter Erwärmen in einer 0,01 M Tris-amino-methan/Salzsäurepufferlösung bei einem pH7,5 gelöst. Die

Lösung enthielt zusätzlich 0,15 M Natriumchlorid und 0,1% Natriumnitrid. Die Konzentration der Agarose wurde auf 1,2% eingestellt. 80 ml dieser Agarose-Lösung wurden auf ungefähr 56 °C abgekühlt, worauf ihr 20 ml der a-L-Antikörper enthaltenden Lösung aus dem Beispiel 3 zugegeben wurde. Nach Rühren wurde die Lösung in einen Plastikbehälter geschüttet und dort abgekühlt. Es wurde eine a-L-Antikörper enthaltende Agaroseplatte mit einer Dicke von 1 mm erhalten. In diese Platte, die immer noch auf dem Kunststoffbehälter lag, wurden in gleichmässigen Abständen Ausbohrungen von 3 mm Durchmesser gemacht. Die Anordnung ist nun geeignet, als Reaktionsagens für die Bestimmung in der SRID-Methode verwendet zu werden.

Das oben beschriebene Vorgehen wurde wiederholt, nur dass statt dem a-L-Antikörper das a-L-Antigen des Beispiels 2 eingesetzt wurde. Auch dieses Produkt kann nun als Bestimmungsvorrichtung für die SRID-Methode verwendet werden.

Bestimmung 1

Es wurden Versuche ausgeführt für die Bestimmung von a-L-Antigen aus Sera von verschiedenen Lebererkrankungen, von HBs-Antigen positiven Bluts und von Blut von gesunden Menschen. Die Bestimmung wurde mittels der MO-Methode ausgeführt, verwendet wurde der a-L-Antikörper aus dem Beispiel 3.

Eine Parallelbestimmung wurde mittels der SRID-Methode ausgeführt, wobei für die Bestimmung die Reagenzanordnung aus dem Beispiel 13 verwendet wurde. Die Resultate der Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle

Diagnose

35

Anzahl Anzahl Proben, in denen das Proben y -L-Antigen nachgewiesen wurde

MO-Methode SRID-Methode

40

45

Lebertumor

39

9

24

Leberzirrhose

35

6

10

Chronische Hepatitis

40

3

3

Akute Hepatitis

40

4

10

HBs-AG(+)-Blutspender

20

0

0

Gesunder Mensch

20

0

0

Bestimmung 2

Es wurden Untersuchungen ausgeführt, um in Sera von verschiedenen Lebererkrankungen und von gesunden Menschen den a-I^Antikörper mittels SRID-Methode nachzuweisen. Als Reagens wurde das Mittel gemäss dem Beispiel 14 eingesetzt. Daneben wurde dieselbe Bestimmung auch mittels der MO-Methode ausgeführt, wobei als Bestimmungsagens die Probe aus dem Beispiel 1 verwendet wurde. Die Resultate dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle

Diagnose

Anzahl Anzahl Proben, in denen der Proben a-L-Antikörper nachgewiesen wurde

MO-Methode SRID-Methode

Lebertumor

39

1

2

Leberzirrhose

35

6

7

Chronische Hepatitis

40

0

2

Akute Hepatitis

40

4

6

Gesunder Mensch

40

1

3

Bestimmung 3

Es wurden Untersuche ausgeführt zur Bestimmung des a-L-Antigens aus Sera von verschiedenen Lebererkrankungen oder von gesunden Menschen. Bei der Bestimmung mittels der SRID-Methode wurde das Reagens aus dem Beispiel 13, bei der Bestimmung mittels der IES-Methode, dasjenige aus dem Beispiel 3 eingesetzt.

Die Resultate der Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt:

7 636 449

Tabelle

Diagnose Anzahl Anzahl Proben, in denen das

Proben a-L-Antigen nachgewiesen wurde

5 MO-Methode SRID-Methode

Lebertumor

40

21

19

Leberzirrhose

52

15

14

Chronische Hepatitis

78

15

15

Akute Hepatitis

44

17

13

Gesunder Mensch

50

0

0

G