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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von l-Leupeptinen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Leupeptine erzeugende Art von Streptomyces in ein Medium impft, welches Nährquellen enthält, diese Art aerob bei einem pH-Wert von 5,0 bis 7,0 kultiviert, am l-Leupeptine im Medium anzureichern, und die l-Leu- peptine bei einem pH-Wert von höchstens 7,0 aus der Kulturbrühe extrahiert und reinigt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium je 0,5 bis 1,25% Gew.-Vol. I-Leucin, I-Argin als Hydrochlorid und Glycin enthält.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium zusätzlich 0,05 bis 0,3% Gew.-Vol. mindestens einer der Substanzen Hefeextrakt, Kaseinhydrolysat und Ribonucleinsäuren enthält.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Leupeptine erzeugende Art von Streptomyces die Art Streptomyces roseus MAB39-Al (FERM-P Nr. 3017, ATCC 31245) ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das l-Leupeptin Acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal herstellt.
6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium je 0,5-1,25% Gew.-Vol. 1-Leucin, l-Argi- nin als Hydrochlorid und Glycin und höchstens 0,3% Gew.-Vol.
anderer als die obigen drei Aminosäuren oder von diesen anderen Aminosäuren enthaltenden Substanzen enthält, um Acetyl I-leucyl-l-leucyl-l-argininal zu bilden.
7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium zusätzlich mindestens eine der Substanzen Hefeextrakt, Kaseinhydrolysat oder Ribonucleinsäuren in der Menge von 0,05 bis 0,3% Gew.-Vol. enthält.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die gebildeten l-Leu- peptine aus der Kulturbrühe durch Anwendung eines porösen nichtionogenen Adsorptionsharzes beim pH-Wert von höchstens 7,0 extrahiert und gereinigt werden.
9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion und Reinigung der l-Leupeptine aus der Kulturbrühe bei einem pH-Wert von 5,0 bis 6,0 erfolgt.
10. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse nichtionogene Adsorptionsharz ausgewählt wird aus Styrol/Divinylbenzol-Copolymer, Acrylesterpolymer und Phenolharz.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von l-Leupeptinen.
Leupeptine sind Enzyminhibitoren, welche von Umezawa, einem der Urheber dieser Erfindung, und seinen Mitarbeitern in Kulturfiltraten von Streptomyces roseus und einer Vielfalt von Mikroorganismen der Arten von Stroptomyces gefunden wurden. Die chemischen Strukturen der Leupeptine werden durch die folgende allgemeine Formel dargestellt:
EMI1.1
und R -CH3 oder -± 2H5 bedeuten.
Diese Leupeptine sind nützliche Substanzen, da sie niedrige Toxizität und protease-inhibierende Wirksamkeit, wie Antiplas mit und Antitrypsinwirksamkeit, besitzen und entzündungshemmende und verschiedene andere pharmakologische Wirkungen aufweisen (siehe japanisches Patent Nr. 140, US Patent Nr.3840513).
Die Hauptbestandteile der bisher durch Fermentation erhaltenen Leupeptine sind Propionyl- und Acetyl-l-leucyl-lleucyl-dl-argininal, welche beide eine Argininalgruppe der sterischen dl-Konfiguration besitzen (hier in der Folge als dl-Leupeptine oder dl-Form bezeichnet) Kondo, S. et al., Chem.
Pharm. Bull. (Tokyo), 17, 1896(1969); US-Patent Nr.3840513).
Bis zur vorliegenden Erfindung waren durch Fermentation nie l-Leupeptine erhalten worden, und es wurde daher angenommen, dass dl-Leupeptine durch Fermentation erzeugt werden.
Shimizu et al. stellten auf chemischem Wege Leupeptine mit einer Arginalgruppe der l-Konfiguration (hier in der Folge als l-Leupeptine oder l-Form bezeichnet) her und synthetisierten auch andere Leupeptine mit einer Arginalgruppe der d-Konfiguration (hier in der Folge als d-Leupeptine oder d-Form bezeichnet). Durch biochemische Versuche wurde bestätigt, dass die aktiven Substanzen, auf welche die Inhibitionswirkung auf Enzyme zurückzuführen ist, die l-Leupeptine sind, während d-Leupeptine inaktiv sind und die durch Fermentation erhaltenen dl-Leupeptine nur die Hälfte der Wirksamkeit der l-Leupeptine zeigen (Shimizu, B. et al., J.
Antibiotics, 25, 515, 1972; Umezawa, H., Enzyme Inhibitors of Microbial Origin, University of Tokyo Press, 1972, 24-25).
Die Erfinder unternahmen ausgedehnte Studien über den Fermentationsvorgang sowie über die Extraktions- und Reinigungsverfahren und fanden als erste Ergebnisse die in der Folge einzeln aufgeführten Tatsachen. Diese Erkenntnisse führten zur vorliegenden Erfindung.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von l-Leupeptinen durch Fermentation, sowie zur Extraktion und Reinigung der in der Kulturbrühe durch Fermentation gebildeten l-Leupeptine. Dieses Ziel wird durch das Verfahren gemäss Anspruch 1 erreicht.
Die Erfindung wird in der folgenden Beschreibung näher erläutert.
Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen stellt das Fortschreiten der Razemisierung der durch das vorliegende Verfahren erhaltenen l-Leupeptine dar, ausgedrückt durch Werte der relativen Aktivität und spezifischen Drehung, beide gemessen als Funktion der Aufbewahrungsdauer in Tagen.
In Fig. 2 werden die Infrarot-Absorptionsspektra des gemäss dem vorliegenden Verfahren hergestellten l-Leupep
tinhydrochlorids (gezeigt als ausgezogene Linie) und des gemäss der herkömmlichen Fermentations- und Extraktionsverfahren hergestellten dl-Leupeptinhydrochlorids (gezeigt als gebrochene Linie) dargestellt.
(1) In einem Kulturmedium für die Leupeptinfermentation, in welchem der pH-Wert auf 5,0-7,0 gehalten wird, werden l-Leupeptine angereichert, während in Fällen, wo das Medium alkalisch wird, dl-Leupeptine erhalten werden. Selbst wenn das Kulturmedium innerhalb von pH 5 bis 7 gehalten wird, bewirkt fortgesetztes Kultivieren, nachdem die Anreicherung mit l-Leupeptinen das Maximum erreicht hat, teilweise Razemisierung der angereicherten l-Leupeptine, wobei durch die d-Form verunreinigte l-Leupeptine entstehen.
(2) Gereinigte l-Leupeptine werden in einem schwach alkalischen Medium, z. B. vom pH-Wert 8,0, unter milden Temperaturbedingungen, z. B. bei 23 "C, ebenfalls allmählich razemisiert und gehen nach einigen Tagen vollständig in die dl-Form über.
(3) In typischen bekannten Reinigungsverfahren werden Leupeptine im Kulturfiltrat Adsorptions- und Desorptionsbehandlungen unterworfen unter Verwendung von Aktivkohle oder einem Ionenaustauschharz vom Carbonsäuretyp, wie Lewatit CNP (Handelsmarke eines Carboxylgruppen enthaltenden Kationenaustauschharzes, hergestellt von Bayer Co.) oder Amberlite IRC-50 (Handelsmarke eines Carboxylgruppen enthaltenden Kationenaustauschharzes von Rohm und Haas Co.) in der H-Form, Na-Form oder gemischter Form. Im Falle der Anwendung der Kationenaustauschharze vom Carbonsäuretyp bewirkt die H-Form keine Razemisierung der l-Leupeptine, aber sie ist wegen ihrer niederen Adsorptionskapazität unwirtschaftlich. Die Na-Form hat ein noch geringeres Adsorptionsvermögen und bewirkt ausserdem vollständige Razemisierung.
Wenn auch eine gemischte Art von H- und Na-Formen im geeigneten Verhältnis (7-8:3-2 nach Volumen) irgendeinem anderen bekannten Adsorptionsmittel wegen der höchsten Adsorptionskapazität und hohen Ausbeuten bei der Adsorption und Desorption überlegen ist, ist sie doch ungeeignet zur Gewinnung von l-Leupeptinen, weil sie selbst bei Ausführung der Behandlungen unter schwach oder mässig sauren Bedingungen starke Razemisierung bewirkt.
(4) Verfahren, bei dem Leupeptine aus einem Kulturfiltrat auf Aktivkohle adsorbiert und nachfolgend in einem sauren wässrigen organischen Lösungsmittel, z. B. 80%igem Methanol vom pH-Wert 2,0 desorbiert werden, ergab dl-Leupeptine, wenn es auf herkömmliche Weise ohne pH-Kontrolle auf fermentiertes Bier angewandt wurde. Die Urheber dieser Erfindung fanden, dass dieses Verfahren l-Leupeptin ergibt, wenn es auf Bier angewandt wird, das nach einem in dieser Erfindung entwickelten Verfahren bereitet wurde. Die Ausbeute betrug jedoch nur 30 bis 50%. Es sei jedoch bemerkt, dass Aktivkohle, ähnlich wie Silicagel oder Tonerde, als Adsorptionsmittel bei der nachfolgenden Reinigung in der Kolonnenchromatographie mit Vorteil anwendbar ist.
(5) Das Verfahren, welches ein poröses nichtionogenes Adsorptionsharz anwendet, ist sowohl in der ersten Extraktions-Reinigungsstufe, welche die Adsorption von Leupeptinen aus dem Kulturfiltrat und die Desorption der adsorbierten Leupeptine umfasst, als auch in der späteren Stufe der weiteren Reinigung der l-Leupeptine in der vorgereinigte l-Leupeptine enthaltenden Lösung anwendbar. Die Anwendung in der ersten Stufe ist besonders vorteilhaft. Wenn ein Leupeptine enthaltendes Kulturfiltrat gemäss dem vorliegenden Verfahren behandelt wird, zeigen sich bei weitem grössere Vorteile als bei Anwendung irgendeiner anderer bekannter Methode, und zwar grösseres Adsorptionsvermögen im Vergleich zu anderen Methoden, keine Razemisierung der l-Leupeptine und hohe Ausbeute von etwa 90% in der Adsorptions-Desorptionsstufe.
(6) Durch Zusatz von je 0,5 bis 1,25% I-Leucin, 1-Arginin(als Hydrochlorid) und Glycin zum Fermentationsmedium der I-Leupeptine wird die Bildung von l-Leupeptinen verglichen mit jener, die nach herkömmlichen Verfahren erfolgt, um das 4bis 6fache erhöht.
(7) Die Ausbeute an l-Leupeptinen wird noch weiter auf das Sieben- bis Zehnfache der nach herkömmlichen Verfahren erhaltenen Ausbeuten erhöht, wenn dem oben genannten die erwähnten Aminosäuren enthaltenden Medium eine der organischen Substanzen: Ribonucleinsäuren, Hefeextrakt oder Kaseinhydrolysat zugesetzt wird.
(8) Bei Verwendung eines Fermentationsmediums, welches die drei oben genannten Aminosäuren und nicht mehr als 0,3% (Gew.-Vol.) anderer Aminosäuren oder Substanzen wie Peptide, Proteine und dergleichen, die andere Aminosäuren enthalten, enthält, besteht das produzierte Leupeptin hauptsächlich aus Acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung wurden aufgrund der vorstehenden Entdeckungen zuerst Verfahren zur Herstellung von l-Leupeptinen, welches die aktive Form ist, durch Fermentation und mit hoher Ausbeute festgelegt. Zur Herstellung von nur einem l-Leupeptin von gleichbleibender Beschaffenheit ist auch wesentlich, dass l-Leupeptin, welches nur aus Acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal besteht gemäss dem vorliegenden Verfahren erhalten werden kann, indem ein Kulturmedium verwendet wird, welches je 0,5 bis 1,25% 1-Leucin, Arginin (als Hydrochlorid) und Glycin und nicht mehr als 0,3% (Gew.-Vol.) anderer freier Aminosäuren und aminosäurehaltiger Substanzen wie Peptide, Proteine und dergleichen enthält.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der Folge anhand von Versuchsbeispielen erläutert.
In der vorliegenden Erfindung wurde die Potenz der Leupeptine in folgender Weise gemessen:
0,5 Milliliter einer Leupeptinlösung wurden in der Konzentration von 8 mcg (Potenz)/ml bereitet und mit 2,5 ml einer 1,25 x 10-4 molaren Lösung von p-Toluolsulfonyl-1-arginin- methylesterhydrochlorid in Trispuffer vom pH-Wert 8,1 versetzt. Nach Vorinkubation bei 32 "C während 5 Minuten wurde der Mischung 0,1 ml einer wässrigen Trypsinlösung (7,5 mcg/ml) zugesetzt. Unmittelbar nach der Inkubation bei 32 "C während 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf Absorption bei 247 nm geprüft und dadurch der Prüfwert erhalten. Der Blindwert wurde wie oben erhalten, nur wurde kein Leupeptin zugesetzt.
Der Grad der Trypsininhibition wurde durch Dividieren der Differenz zwischen dem Blindwert und dem Prüfwert durch den Blindwert berechnet. Gemäss dieser Prüfmethode betrug die 500/obige Trypsin-Inhibitionskonzentra.
tion (IDso) von hochgereinigtem Acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininalhydrochlorid 0,98 mcg/ml. Diese Substanz wurde als Normmuster verwendet, und die Potenz von Leupeptinen wurde in Gewicht, wie mcg (Potenz) und mg, ausgedrückt.
Der höchste IDso Wert von dl-Leupeptinen höchster Reinheit, welche gemäss den herkömmlichen Fermentations- und Reinigungsmethoden hergestellt wurden, betrug 1,87 mcg/ml.
Der Gehalt an l-Leupeptinen einer Mischung aus l-Leupep tinen und d-Leupeptinen wurde in folgender Weise gemessen.
Die zu prüfenden Leupeptine wurden in Wasser gelöst und mit Kaliumpermanganat zu Leupeptinsäuren oxydiert (der Argininalanteil der Leupeptine wurde zu Arginin oxydiert). Die erhaltenen Säuren wurden gereinigt und durch Aktivkohlen Chromatographie und mittels saurer Tonerde isoliert. Die isolierten Säuren wurden mit 6N Salzsäure bei 110 C während 24 Stunden hydrolysiert. Der gesamte Arginingehalt des Hydrolysats wurde mittels eines Aminosäure analysierenden Instruments bestimmt. Der Gehalt an Arginin wurde dagegen durch biologische Prüfung unter Verwendung von Milchsäurebakterien bestimmt. Der Gehalt (%) von 1 Arginin im gesamten Arginin wurde dem Gehalt an l-Leupeptinen (Prozente der 1-Form) in den gesamten Leupeptinen gleichgesetzt.
Der I-Formgehalt des Normmusters betrug 100% und jener der gemäss herkömmlichen Verfahren hergestellten dl-Leupeptine betrug 52%.
Versuchsbeispiel 1
Eine Schrägkultur von Streptomyces roseus MA839-A1 (FERM-P Nr.3017; ATCC 31245) wurde in 100 ml eines Mediums eingeimpft, welches 2% Glucose, 2% Stärke, 3% Polypep tone,0,5% NaCI und 0,3% KH2PO4 enthielt Dieses wurde in einem Kolben sterilisiert und dann während 2 Tagen bei 27-28 "C schüttelkultiviert, um so den Impfstoff herzustellen.
(Alle % in dieser Beschreibung sind Gewicht/Volumen %.)
Vom oben beschriebenen Medium wurden 201 in einen 301 fassenden Fermentierungsbehälter gebracht und mit 200 ml des vorstehend erwähnten Impfstoffes geimpft. Das Kultivieren erfolgte bei 27 "C unter Belüftung und Rühren. In regelmässigen Zeitabständen wurde ein Teil aus der Kulturbrühe entnommen und gemäss der vorliegenden Erfindung ohne Razemisierung gereinigt. Dies ergab gereinigtes Leupeptinhydrochlorid in Pulverform. Die Ergebnisse der Prüfungen auf Wirksamkeit und prozentuellen Anteil an l-Form werden in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Zeitbedingte Änderung der Leupeptinfermentation Kultivierungsdauer (Stunden) 24 36 42 48 60 72 pH 6,6 6,9 6,5 5,5 4,9 5,6 Potenz der Kulturbrühe (mcg/ml) 20 115 330 450 320 280 % der l-Form im Leupeptinpulver - - 100 100 92 84 Potenz des Leupeptinpulvers (mcg/mg) - - 1000 1000 910 820
Wie aus der Tabelle 1 hervorgeht, war die Potenz des Leupeptinpulvers nach 42 und 48 Stunden des Kultivierens 1000 mcglmg, während sie nach 60 Stunden auf 910 mcg/ml und nach 72 Stunden des Kultivierens weiter auf 820 mcg/mg sank. Der Gehalt an l-Form im Leupeptinpulver sank ebenfalls von 100% nach 42 und 48 Stunden auf 92% nach 60 Stunden und auf 83% nach 72 Stunden des Kultivierens.
Daraus folgt, dass unnötig langes Kultivieren zu vermeiden ist, weil selbst bei Kontrolle des pH-Wertes innerhalb 5,0 und 7,0 das Kultivieren nach Erreichung des Maximums der Anreicherung der l-Leupeptine eine teilweise Razemisierung der bereits gebildeten l-Leupeptine bewirkt.
Versuchsbeispiel 2
Die nach 48stündigem Kultivieren erhaltenen l-Leupeptinhydrochloride der Kultur des Versuchsbeispiels 1 wurden in 0,1 molarerPhosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 zu einer 1%gen Lösung gelöst. Man liess diese Lösung bei 23 "C stehen und bestimmte die zeitbedingten Änderungen in bezug auf die spezifische Drehung und relative Aktivität (mcg/mg). Die erhaltenen Resultate werden in der Fig. 1 dargestellt. Nach 7 Tagen gewonnene Leupeptine zeigten einen 50zeigen l-Formgehalt und eine relative Aktivität von 490 mcglmg, was anzeigt, dass vollständige Razemisierung eingetreten war. Daraus wird ersichtlich, dass die l-Leupeptine selbst unter so milden Bedingungen wie pH 8,0 und einer Temperatur von 23 "C razemisch werden.
Versuchsbeispiel 3
Unter Verwendung der nach 48stündigem Kultivieren erhaltenen Kulturbrühe des Versuchsbeispiels 1 wurden die folgenden beiden Reinigungsverfahren verglichen:
Verfahren A: Die Kulturbrühe von 6,0 pH wurde durch eine mit Lewatit"CNP-80 (Na-Form:H-Form = 2:8 nach Vol.) gefüllte Säule gegossen zwecks Adsorption der l-Leupeptine.
Das Adsorbat wurde mit I N Salzsäure enthaltendem 80%igem Methanol eluiert. Die gesamten eluierten Fraktionen waren sauer. Sie wurden zu einer wässrigen Lösung abgedampft. Aus der wässrigen Lösung wurden die Leupeptine mit n-Butanol extrahiert und das n-Butanol unter vermindertem Druck abgedampft. Die erhaltene wässrige Lösung goss man durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule und entwickelte die adsorbierte Phase mit mit 20%igem wässrigem Aceton, das mit Salzsäure auf den pH-Wert 2,0 eingestellt war. Die aktiven eluierten Fraktionen wurden gesammelt und mit Dowex 44 (OH-Form) (ein Polyamidharz aus primären, sekundären und tertiären Aminen, hergestellt von der Dow Chemical Co.) neutralisiert, sodann konzentriert und gefriergetrocknet.
Das erhaltene Pulver wurde in Methanol gelöst, an einer mit saurer, in Methanol suspendierter Tonerde gefüllten Säule adsorbiert und mit Methanol entwickelt. Die aufgefangenen aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne verdampft, um gereinigte l-Leu- peptinhydrochloride zu erhalten. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 33%.
Verfahren B: Das gleiche Kulturfiltrat wie im Verfahren A wurde durch eine mit Amberlite XAD-2 (Handelsmarke eines nichtionogenen Adsorptionsharzes aus einem Copolymer von Styrol und Divinylbenzol, hergestellt von Rohm & Haas Co.) gefüllte Säule geleert, um die Leupeptine zu adsorbieren, und die adsorbierte Phase wurde mit 50%igem Methanol vom pH-Wert 2,0 eluiert. Die aktiven eluierten Fraktionen wurden vereinigt und das Methanol abdestilliert, wodurch die wässrige Lösung zurückblieb. Die Leupeptine wurden aus der wässrigen Lösung mit n-Butanol extrahiert und wie nach dem Verfahren A weiterbehandelt, um gereinigte Leupeptinhydrochloride zu erhalten. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 65%. Die nach den beiden Verfahren erhaltenen Resultate wurden verglichen, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Vergleich zwischen den Verfahren A und B Ver- Ausbeute Potenz des l-Formgehalt fahren % Pulvers, mcglmg des Pulvers, % A 33 530 56 B 65 1000 100
Aus den Resultaten der Tabelle 2 wird offensichtlich, dass, wenn die Extraktion und Reinigung von l-Leupeptinen unter Anwendung eines schwach sauren, teilweise in die Na-Form umgewandelten Ionenaustauschharzes des Carbonsäuretyps zur Adsorption und Desorption erfolgt, ein erheblicher Teil der l-Leupeptine razemisch wird, selbst wenn die Lösungen, welche die Leupeptine enthalten, sauer bleiben.
Versuchsbeispiel 4
Vergleich der Leupeptin-Produktivität zwischen dem bevorzugten Medium und dem herkömmlichen Medium 1. Beschaffenheit der Medien: (1) Bevorzugtes Medium: 3% Glycerin, 0,75% 1-Leucin, 0,75% 1-Argininhydrochlorid, 0,75% Glycin,0,5% NH4NO3, 0,5% NaCI,0,3% KH2PO4.
(2) Herkömmliches Medium (Vergleichsmedium): 1% Glu cose, 2% Stärke, 3% Peptone, 0,5% NaCl, 0,3% KH2PO4 (siehe Japanisches Patent Nr.595 140; US-Patent Nr.3840513).
(3) Herkömmliches synthetisches Medium (Vergleichsmedium): 1% Glucose, 1% Stärke, 0,26% 1-Leucin, 0,4% Argininhy drochlorid, 0,3% Glycin, 0,2% NH4NO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO. 7H20,0,05% KCI,0,001% FeSO4- 7H20 (siehe
Umezawa, H., Enzyme Inhibitors of Microbial Origine, Univer sity of Tokyo Press 1972, Seite 20).
2. Verwendete Art: die gleiche wie im Versuchsbeispiel 1.
3. Kultivierungsbedingungen: 100 ml des Mediums in einem
500 ml fassenden Kolben wurden mit 1 ml des wie im Versuchs- beispiel 1 kultivierten Impfstoffes geimpft. Das geimpfte
Medium wurde bei 27-28 "C auf einer Schüttelmaschine mit 7 cm Amplitude und 135maligem Schütteln pro Minute kultiviert
Proben wurden nach 48 und 72 Stunden entnommen und auf die Wirksamkeit der Leupeptine geprüft.
4. Resultate: Die erhaltenen Resultate werden in der
Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Dauer der Kultur 48 Stunden 72 Stunden
Medium
Bevorzugtes Medium (1)1650 mcg/ml 2500 mcg/ml
Herkömmliches
Erzeugungsmedium (2) 520 mcg/ml 630 mcg/ml
Herkömmliches synthetisches Medium (3) 380 mcg/ml 440 mcg/ml
Wie aus der Tabelle 3 hervorgeht, erreichte die Produktivität des bevorzugten Mediums nach 72stündigem Kultivieren den 4- bis 6fachen Wert jener der beiden herkömmlichen
Medien, welche als Vergleichsmedien dienten; obwohl fast die gleichen Zutaten verwendet wurden, war die mit dem bevorzugten Medium erhaltene Ausbeute etwa 6 mal grösser als jene, welche mit dem herkömmlichen synthetischen Medium erreicht wurde, weil im bevorzugten Medium die Konzentratio nen von l-Leucin, Arginin und Glycin und deren gegenseitiges Verhältnis günstiger waren.
Versuchsbeispiel 5
Geeignete Mengenbereiche von l-Leucin, Arginin und Glycin:
1. Beschaffenheit der Medien:
Wie in der Tabelle 4 gezeigt, wurden verschiedene Mengen von l-Leucin, l-Argininhydrochlorid und Glycin dem Grundmedium, welches 3,OO/o Glucose,0,5% NH4NO3,0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO. 7H20,0,05% KC1,0,2% Ribonucleinsäure und 0,1% Silicon-Entschäumungsöl enthielt, zugesetzt.
2. Verwendete Art: die gleiche wie im Versuchsbeispiel 1.
3. Kultivierungsbedingungen: die gleichen wie im Versuchsbeispiel 4.
4. Resultate: die erhaltenen Resultate werden in der Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Zusatzmengen % Leupeptinausbeute, mcg/ml l-Leucin l-Argininhy- Glycin 48 Stunden 72 Stunden drochlorid 0,25 0,25 0,25 0,310 unwesentlich 0,50 0,50 0,50 2,080 3,300 0,75 0,75 0,75 3,460 4,370 1,00 1,00 1,00 2,080 2,860 1,25 1,25 1,25 0,400 2,560 1,50 1,50 1,50 unwesentlich unwesentlich
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, war bei Zugabe von je 0,25% I-Leucin, l-Argininhydrochlorid und Glycin zum Medium die
Ausbeute an Leupeptin nach 72stündigem Kultivieren unwe sentlich, während bei Zusätzen von 0,5 bis 1,25% der erwähnten
Aminosäuren in der gleichen Kultivierungszeit die Leupeptin ausbeuten 2,560 bis 4,370 mcg/ml betrugen. Wenn jedoch die Zusatzmengen der drei Aminosäuren auf je 1,50% erhöht wur den, wurde nur eine unwesentliche Menge von Leupeptin gebil det.
Diese Resultate bestätigen, dass eine hohe Ausbeute von
Leupeptinen besonders bei Zusätzen von 0,5-1,25% jeder der drei Aminosäuren, l-Leucin, Arginin (als Hydrochlorid) und Glycin zum Medium erhalten wird.
Versuchsbeispiel 6
Einfluss der Zugabe natürlicher komplexer organischer Substanzen
1. Mediumsbeschaffenheit: Die in der Tabelle 5 aufgeführten natürlichen organischen Substanzen wurden dem im Versuchsbeispiel 4 verwendeten Medium der vorliegenden Erfindung zugesetzt.
2. Verwendete Art: die gleiche wie im Versuchsbeispiel 1.
3. Bedingungen des Kultivierens: die gleichen wie im Versuchsbeispiel 4.
4. Resultate: Die erhaltenen Resultate werden in der Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5 Zusätze Zusatzmenge Leupeptinausbeute, mcg/ml nach 48 Stunden nach 72 Stunden Hefeextrakt 0,1 1,550 2,250 Hefeextrakt 0,2 1,770 2,300 Casaminosäuren 0,1 1,970 2,540 Casaminosäuren 0,2 1,780 2,550 Ribonucleinsäuren 0,1 2,040 3,420 Ribonucleinsäuren 0,2 2,050 3,520 Vergleichsmedium 0 1,380 1,750
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, wurde durch Zusatz von 0,1-0,2% Hefeextrakt, Casaminosäuren oder Ribonucleinsäuren zum ursprünglichen bevorzugten Medium (welches als Vergleichsmedium diente) die Ausbeute an Leupeptinen weiterhin erhöht; besonders bei Zugabe von Ribonucleinsäuren wurde die Ausbeute auf das Doppelte der mit dem ursprünglichen Medium erzielten Ausbeute erhöht.
Im vorliegenden Verfahren können alle Mikroorganismen, welche befähigt sind, l-Leupeptine zu erzeugen, verwendet werden. Beispiele für solche Mikroorganismen sind Streptomyces roseus (2 Arten, deren Laboratoriumsnummern im Institute of Microbial Chemistry waren MA839-AI, MB262-M1; MA839 wurde im Fermentationsforschungsinstitut, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (Kogyo Gijutsuin Biseibutsu, Kogyo Gijutsu Kenkyusho) und am 22. September 1976 in der Amerikanischen Typenkutlur-Sammlung, Maryland, Vereinigte Staaten, mit den Hinterlegungsnummern: FERM-P Nu 3017 bzw.
ATCC 31245 hinterlegt), Streptomyces roseochromogenes (3 Arten, MA943-M1, MB 456-AE1, MB260-A2), Streptomyces chartreusis (1 Art, MB58-MG1), Streptomyces albireticuli (1 Art, MB26-A1), Streptomyces thioluteus (1 Art, MB321 -A 1), Streptomyces lavendulae ( I Art, MB1 72-A2), und Streptomyces noboritoensis (1 Art, MB46-AG). Die Eigenschaften dieser Spezies wurden im The Actinomycetes , Band II (von S.A. Waksman, The Williams & Wilkins Company, 1961) beschrieben.
Die im Leupeptine erzeugenden Medium verwendbaren Kohlenstoffquellen sind: Essigsäure, Glycerin, Saccarose, Maltose, Dextrin, Stärke und dergleichen, von denen besonders Glycerin und Glucose mit Vorteil verwendet werden. Als anorganische Stickstoffquelle eignet sich Ammoniakstickstoff besser als Nitratstickstoff.
Die dem Medium mit Vorteil beizufügenden Aminosäuren sind l-Leucin, Arginin und Glycin.
Die dem Medium mit Vorteil beizufügenden natürlichen organischen Substanzen schliessen Ribonucleinsäuren, Hefeextrakt und Kaseinhydrolysat ein. Die Ribonucleinsäuren können gereinigt oder in roher Qualität verwendet werden, und auch Substanzen mit relativ hoher Konzentration von Ribonucleinsäuren sind verwendbar.
Die porösen, nichtionogenen Adsorptionsharze sind zum Beispiel Amberlite XAD-I, XAD-2, XAD4, XAD-5 (dies sind Handelsmarken der Hersteller Rohm & Haas Co., USA) und Diaion HP10, HP20, HP30, HP40, HP50 (Handelsmarken der Hersteller Mitsubishi Chemical Co., Japan); diese neun Harze sind Styrol-Divinylbenzol-Copolymere. Amberlite XAD-7, XAD-8 (Handelsmarken für Adsorptionsmittel, hergestellt von Rohm & Haas) sind Arcylesterpolymere und Duolite S-30 (Handelsmarke für Adsorptionsmittel, hergestellt von Chemical Process Co., USA) sind Phenolharze.
Gemäss dem vorliegenden Verfahren können l-Leupeptine auf die folgende Art hergestellt werden:
Das Kulturmedium enthält z. B. 1,0-6,0% Glycerin, O, 1-1,00/o NH4NO3, 0,05-0,5% K2HPO4, 0,01-0,1% MgSO4- 7H20,0,01- 0,1% KCI,0,5-1,25% 1-Leucin,0,5-1,25% I-Arginin (als Hydro chlorid), 0,5-1,25% Glycin, 0,05-0,3% natürliche organische Substanzen wie Ribonucleinsäure, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat und 0,01-0,3% Siliconantischäummittel (pH 6,5).
Nach auf herkömmliche Art erfolgter Sterilisation wird das Medium aseptisch mit der Saatkultur geimpft, welche durch Kultivieren einer Leupeptine erzeugenden Art wie Streptomyces roseus MA839.A1 (FERM-P Nr.3017; ATCC 31245) bereitet wurde, und sodann bei 23 bis 37 "C und vorzugsweise bei 25 bis 30 "C kultiviert. Falls der pH-Wert höher als 7,0 steigt, wird er mit Schwefelsäure oder Phosphorsäure auf 6,0-6,5 eingestellt. Meistens erreicht die l-Leupeptinanreicherung nach 3 bis 4 Tagen der Fermentation das Maximum.
Die so erhaltene Kulturbrühe wird filtriert und das Filtrat zur Gewinnung der l-Leupeptine mit einem Harz behandelt.
Die Harzbehandlung kann auf verschiedene Weise ausgeführt werden, am wirksamsten aber durch Anwendung einer Harzsäule. Das Adsorptionsharz wird in eine Säule gefüllt und durch Durchgiessen von z. B.80%igem wässrigem Methanol aktiviert und sodann mit Wasser gründlich nachgewaschen.
Das leupeptinhaltige Kulturfiltrat wird auf einen pH-Wert von etwa 5,0-6,0 eingestellt und zwecks Adsorption der Leupeptine auf dem Harz durch die Säule gegossen. Nach der Adsorption wird die Säule mit Wasser gewaschen und die adsorbierten Leupeptine werden eluiert. Als eluierende Mittel eignen sich niedere Alkohole wie Methanol, Äthanol, n-Propa- nol, Isopropanol, n-Butanol und Isobutanol, ferner wässrige Ketone wie wässriges Aceton oder Methyläthylketon, organische Lösungsmittel, die angesäuertes Wasser enthalten und säurehaltiges Wasser. Beispiele für günstige Eluierungsmittel: Mischungen von 10-95%igem Methanol mit Wasser, mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 4,0 oder tiefer eingestellt.
Eine geeignete Fliessgeschwindigkeit beträgt 0,5 bis 2,0 in der Adsorptionsstufe und 0,1 bis 1,0, besonders etwa 0,5, in der Eluierungsstufe. Das Eluat wird in Fraktionen festgesetzter Mengen aufgefangen. Einen die Leupeptine enthaltenden Teil des Eluats erhält man durch Vereinigen jener Fraktionen, die Antitrypsinwirksamkeit, positive Sakaguchi-Reaktion oder positive Rydon-Smith-Reaktion zeigen. Somit kann eine teilweise gereinigte Lösung von l-Leupeptinen durch Adsorption und Desorption unter sauren Bedingungen erhalten werden.
Weil bisher keine wirtschaftliche Methode zur Trennung von und l-Leupeptinen gefunden worden ist, ist es notwendig, zur Erzeugung von l-Leupeptinen durch Fermentation Massnahmen zu treffen, um die Razemierung von l-Leupeptinen in allen Verfahrensstufen der Fermentation und Reinigung zu verhindern. Einer der wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, dass dieses Verfahren die wirksame Gewinnung von l-Leupeptinen aus einem nur l-Leupeptine enthaltenden Filtrat einer Kulturbrühe ermöglicht. Eine weitere Reinigung der auf diese Weise erhaltenen l-Leupeptine kann durch geeignete Kombination bekannter Reinigungsverfahren, wie z. B.
Chromatographie unter sauren Bedingungen mit Aktivkohle, Tonerde (vorzugsweise saure Tonerde) oder Silicagel und Extraktion aus der wässrigen Lösung mit n-Butanol oder dergleichen durchgeführt werden.
In der Folge wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Ein Medium vom pH-Wert 7,0, welches 2% Glucose, 2% Stärke, 3% Polypepton,0,5% NaCI und 0,3% KH2PO4 enthält, wird in Teile von je 100 ml aufgeteilt, in je einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gebracht und bei 120 "C während 20 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit einer vollen Platinschlinge einer Schrägkultur einer Leupeptine-erzeugenden Art, Streptomyces roseus, MA839-A1 (FERM-P Nr.3017; ATCC 31245) geimpft und sodann während 2 Tagen bei 27 "C schüttelkultiviert.
Von der erhaltenen Kulturbrühe wurden 200 ml in ein 301 fassendes Fermentationsgefäss, das 201 des gleichen Mediums wie das oben verwendete enthielt, eingeimpft und bei 27 "C während 48 Stunden bei einer Luftstromgeschwindigkeit von 201/Minute unter Rühren mit 400 U/Min. kultiviert. Proben wurden nach 24,36,42 und 48 Stunden des Kultivierens entnommen. Dies zeigten die pH-Werte von 6,7,6,8,6,4, 6,7, sowie Leupeptinwirksamkeit von 35 230,420 und 670 mcg/ml.
Die dadurch erhaltene Kulturbrühe wurde mit 5% (Gew. Vol.) eines Filtrierhilfsmittels (Hyflo Super-Cel, hergestellt von Johns-Manville Co., USA) vermischt und sodann filtriert. Das Filtrat wurde mit verdünnter Salzsäure auf pH 5,5 eingestellt, wodurch etwa 151 eines Kulturfiltrats mit der Leupeptinpotenz von 665 mcg/ml erhalten wurden. Vier Liter (gesamte Potenz = 2,660 mg Einheit) des Kulturfiltrats wurden durch eine mit 100 ml Amberlite XAD-2, einem nichtionogenen Adsorptionsharz, gefüllten Säule gegossen, und zwar mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1, um die Leupeptine am Harz zu adsorbieren. Nach dem Waschen mit Wasser wurden die Leupeptine mit 80%igem wässrigem Methanol, das mit Salzsäure auf den pH-Wert 2,0 eingestellt war, eluiert.
Die aktiven Eluatfraktionen wurden vereinigt, das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert und die zurückgebliebene wässrige Lösung mit verdünnter Natronlauge auf pH 5,5 eingestellt, und auf diese Art erhielt man 100 ml einer wässrigen Lösung von 24,5 mg Potenz/ml (die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 92%). Diese wässrige Lösung wurde zweimal mit 70 ml n-Butanol extrahiert, aus den vereinigten Extraktionsschichten wurde unter Wasserzusatz das n-Butanol unter vermindertem Druck abdestilliert und man erhielt 50 ml einer wässrigen Lösung der Potenz 47 mglml (gesamte Potenz betrug 2,350 mg Einheit und die erhaltene Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 88%).
Diese wässrige Lösung wurde mit verdünnter Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und zwecks Adsorption der Leupeptine in eine mit 85 ml Aktivkohle gefüllte ( Refined Shirasagi -Marke für Chromatographie, hergestellt von der Takeda Chemical Co.) Säule gegossen.
Die adsorbierten Leupeptine wurden mit 20%igem wässrigem Aceton eluiert. Aus den vereinigten aktiven Fraktionen wurde das Aceton abdestilliert. Man erhielt eine wässrige Lösung, die mit Dowexe44 (OH-Form) auf pH 5,5 neutralisiert und sodann gefriergetrocknet wurde. Man erhielt 3,31 g eines blassgelben
Pulvers mit einer Potenz von 582 mcg/mg (die gesamte Potenz betrug 1,926 mg und die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 720/o). Das Pulver wurde in 30 ml Methanol gelöst, durch eine mit 90 g saurer Tonerde mit Methanol gefüllte Säule gegossen und bei einer Fliessgeschwindigkeit von 0,5 mit Methanol entwickelt. Die aktiven Eluatfraktionen wurden vereinigt und zur Trockne verdampft. Das erhaltene Pulver wurde in Wasser gelöst, vom unlöslichen Rückstand abfiltriert und das Filtrat gefriergetrocknet.
Man erhielt 1,85 g l-Leupeptinhydrochloride der Potenz 988 mcg/mg. Die gesamte Potenz des Pulvers betrug 1,828 mg und die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat war etwa 69%. Das Pulver hatte den l-Leupeptingehalt von 100%.
Beispiel 2
Je 100 ml eines Mediums (pH 6,5), welches 2% Glycerin, 1% Polypepton und 1% Fleischextrakt enthielt, wurden in 500 ml haltende Erlenmeyerkolben gefüllt, während 30 Minuten bei 120 "C sterilisiert, mit einer vollen Platinschlinge einer Schrägkultur von Streptomyce roseus, MA839-A1 (FERM-P Nr. 3017, ATCC 31245) geimpft und bei 27 OC während 24 Stunden schüt- telkultiviert, um eine vorkultivierte Brühe zu erhalten.
Von einem anderen Medium (pH 6,5), das 3% Glycerin, 0,75% I-Leu- cin, 0,75% I-Argininhydrochlorid, 0,75% Glycin, 0,5% NH4NOj, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO. 7H20, 0,05% KCI, 0,2% Ribonucleinsäure und 0,1% Silicon-Antischaummittel enthielt, wurden 100 ml in einen 500 ml fassenden Kolben gefüllt, bei 120 "C wäh rend 30 Minuten sterilisiert und sodann aseptisch mit 1 ml der obigen vorkultivierten Brühe geimpft. Nun wurde auf einer Schüttelkulturmaschine mit einer Amplitude von 7 cm und 210 Schüttelbewegungen pro Minute während 3 Tagen bei 27 "C kultiviert. Das Fortschreiten der Kultur wird in der Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
Entwicklung der Kultur Kultivierungsdauer (Stunden) 24 48 72 pH 6,7 5,9 5,7
Leupeptin (mcg/ml) 1,430 3,230 4,250
Nach 72stündigem Kultivieren wurde die Kulturbrühe filtriert, um das Mycel zu entfernen. Das erhaltene Filtrat (800 ml mit einem Leupeptingehalt von 4,070 mcg/ml wurde auf pH 6 eingestellt und durch eine mit 120 ml Diaion HP40 gefüllten Säule gegossen, um das Leupeptin zu adsorbieren. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Leupeptin mit 50 /0igem wässrigem Methanol vom pH-Wert 2 eluiert und 235 ml einer Leupeptinfraktion aufgefangen. Nachdem das Methanol unter vermindertem Druck bei 40 "C abdestilliert worden war, erhielt man 170 ml einer wässrigen Lösung. Diese Lösung wurde mit verdünnter Natronlauge auf pH 5,5 eingestellt und dreimal mit 50 ml n-Butanol extrahiert.
Der gesammelte Extrakt wurde zur Entfernung des mit Wasser azeotropen n-Butanols bei 40 "C destilliert. Man erhielt 100 ml einer wässrigen Lösung von 28 mg Potenz/ml Leupeptin. Diese wässrige Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 2 eingestellt und der gebildete Niederschlag durch Filtrieren entfernt. Zur Adsorption des Leupeptins wurde das Filtrat durch eine mit 100 ml Aktivkohle ( Refined Shirasagi , Handelsmarke, hergestellt von Takeda Chemical Co.) gegossen. Nach dem Waschen mit verdünnter Salzsäure vom pH 2 wurde das adsorbierte Leupeptin mit 20%igem wässrigem Aceton vom pH-Wert 2 eluiert und man erhielt 210 ml einer Leupeptinfraktion. Die Leupeptinfraktion wurde mittels Dowex 44 Harz (OH-Form) auf den pH-Wert 5,0 eingestellt und unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Man erhielt 4,00 g eines fast weissen Pulvers der Aktivität von 580 mcg/mg.
Das Pulver wurd ein Metha nol gelöst und die Lösung durch eine mit in Methanol suspen dierter saurer Tonerde (hergestellt von Woelm Co., BDR) gefüllte Säule gegossen und mit Methanol entwickelt. Die gesamte Leupeptinfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Man erhielt 2,22 g eines weissen Pul vers von Leupeptinhydrochlorid, welches eine Aktivität von
1,000 mcg/mg aufwies. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 68%.
Dieses Pulver zeigte eine spezifische Drehung(ol)D1' von -75 C (c = 1, H20) und schmolz unter Zersetzung bei
143-146 "C, zeigte positive Sakaguchi-Reaktion, positive
Rydon-Smith-Reaktion und negative Ninhydrinreaktion. Es zeigte keine spezifische Absorption im ultravioletten Bereich, sondern nur eine Endabsorption. Wie in Fig. 2 gezeigt, stimmt das Infrarot-Absorptionsspektrum des Pulvers mit jenem eines nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellten dl-Leupeptin überein.
Von den obigen Hydrochloriden wurden 20 mg mit 6N Salzsäure in einem verschlossenen Rohr bei 110 "C während 24 Stunden hydrolysiert. Die freie Fettsäure wurde aus dem
Hydrolysat mit Äthyläther extrahiert. Die Extraktionsschicht wurde konzentriert und unter Anwendung einer mit Chromosolb 101 (Handelsmarke, hergestellt von Nippon Kuromato Kogyo Co.) (60-80 Maschen) gefüllten Säule der Gaschromatographie unterworfen. Es konnte nur Essigsäure festgestellt werden. Dies bestätigte, dass das Pulver ein Leupeptinhydrochlorid mit einer Acetylgruppe als einzige Acylgruppe war.
Dann wurden etwa 200 mg des Hydrochlorids in 8 ml Wasser gelöst. Dieser Lösung wurden 52 mg Kaliumpermanganat gelöst in 2 ml Wasser bei Raumtemperatur unter Rühren zugetropft und, um die Oxydation zuende zu führen, während weiteren 2 Stunden gerührt. Sodann wurde das überschüssige Kaliumpermanganat mit Natriumthiosulfat neutralisiert und die erhaltene Mischung durch eine mit 5 ml Aktivkohle gefüllte Säule gegossen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die adsorbierte Phase mit 20%igem wässrigem Aceton vom pH-Wert 2,0 eluiert und Fraktionen, die eine positive Sakaguchi-Reaktion zeigten, aufgefangen. Diese Fraktionen wurden vereinigt, mit Dowex0 44 Harz (OH-Form) auf pH 5,0 eingestellt und zur Trockne verdampft. Man erhielt 170 g eines Pulvers.
Das Pulver wurde in 1 ml Methanol gelöst, die Lösung durch eine mit 5 g einer Suspension von saurer Tonerde in Methanol gefüllte Säule gegossen und mit 15 ml Methanol gefolgt von 25 ml 500/nigem Methanol vom pH-Wert 3,0 entwickelt. Die abfliessenden Fraktionen, welche positive Sakaguchi-Reaktion zeigten, wurden vereinigt, mit Dowex0 44 Harz (OH-Form) auf pH 5,0 eingestellt und zur Trockne verdampft. Man erhielt 75 mg Leupeptinsäure (Acyl-l-Leucyl-l-leucyl-l-arginin). Etwa 10 mg dieser Leupeptinsäure wurden genau eingewogen, mit 2 ml 6N Salzsäure versetzt und in einem verschlossenen Rohr bei 110 "C während 24 Stunden hydrolysiert. Die hydrolysierte Lösung wurde zur Trockne verdampft und in Wasser gelöst.
Ein Teil der erhaltenen Lösung wurde der Aminosäureanalyse unterworfen, um die aufbauenden Aminosäuren qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Der Rest der Lösung diente der biologischen Prüfung unter Verwendung von 1 Arginin erfordernden Milchsäurebakterien als Testorganismen, zwecks Bestimmung des Gehalts an Arginin. Die erhaltenen Resultate werden in der Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Zusammensetzung der Aminosäuren im Hydrolysat der
Leupeptinsäure Zur Hydrolyse verwendete Aminosäureanalyse Leupeptinsäuremenge 1 -Leucin gesamtes 1 Arginin
Arginin 8,10mg 3,95mg 2,56mg 2,61 mg (10,1 KLmol, (14,8,umol, (102%des
Rückgewin- Rückgewin- gesamten nung 89%) nung 87%) Arginin)
Aus den obigen Resultaten wurde geschlossen, dass die hydrolysierte Leupeptinsäure l-Leucin und Arginin im mola ren Verhältnis von 2:1, und kein Valin, kein Isovalin und kein d-Arginin enthielt. Infolgedessen war bestätigt, dass das im vor liegenden Beispiel erhaltene Leupeptin eine einzige Verbindung, und zwar Acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal ist.
Beispiel 3
Von einem Medium (pH 6,5), welches 3% Glycerin, 0,75% 1-Leucin, 0,75% 1-Argininhydrochlorid, 0,75% Glycin, 0,5% NH4NO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4 zu 7H20,0,5% KCI und 0,1%Silicon-Antischaummittel enthielt, wurden 100 ml in einen 500 ml fassenden Kolben gefüllt und bei 120 C während 30 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit 1 ml einer wie im Beispiel 2 bereiteten vorkultivierten Brühe geimpft und während 3 Tagen bei 27 C auf einem Schüttelkulturapparat mit 7 cm Amplitude und 210 Schüttelbewegungen pro Minute geschüttelt. Das Fortschreiten der Kultu wird in der Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8
Fortschreiten der Kultur
Kultivierungsdauer (Stunden) 24 48 72 pH 6,6 6,3 5,9 1-Leupeptin(mcglml) 830 1,610 2,460
Aus dem Kulturfiltrat (2,350 mcglml, 800 ml) wurde 1-Leu- peptin wie im Beispiel 2 extrahiert, ausgenommen, dass anstelle von Diaion HP40 Amberlite XAD-4 verwendet wurde. Man erhielt 1,22 g 1-Leupeptinhydrochlorid.
Beispiel 4
Von einem Medium (pH 6,5), welches 3% Glucose, 0,75%
1-Leucin, 0,75% 1-Argininhydrochlorid, 0,75% Glycin,0,8% (NH4)2SO4, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4 . 7H2O,0,05% KCI, 0,24
Ribonucleinsäure und 0,1% Silicon-Antischaummittel enthielt, wurden 100 ml in einen 500 ml fassenden Kolben gefüllt und bei
120 C während 30 Minuten sterilisiert, geimpft und schüttelkul tiviert wie im Beispiel 3. Das Fortschreiten der Kultur wird in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
Entwicklung der Kultur Kultivierungsdauer (Stunden) 24 48 72 pH 4,8 7,0 I-Leupeptin (mcg/ml) - 3,170 4,050
Aus dem Kulturfiltrat (3,880 mcg/ml, 800 ml) wurde 1-Leu- peptin wie im Beispiel 2 extrahiert und gereinigt, ausgenommen, dass Diaion HP20 anstelle von Diaion HP40 verwendet wurde. Man erhielt 1,96 g 1-Leupeptinhydrochlorid.
Beispiel 5
Je 100 ml eines Mediums (pH 6,5), welches 3% Glycerin, 2% Pepton, 0,5% 1-Leucin, 0,5% 1-Argininhydrochlorid, 0,5% Gly cin, 0,5% NaCl,0,2% KH2PO4,0,1% Ribonucleinsäure und 0,05% Silicon-Antischaummittel enthielt, wurden in 500 ml fassenden Kolben während 20 Minuten bei 120 C sterilisiert. Jeder Teil wurde wie im Beispiel 2 geimpft und kultiviert. Die Resultate werden in der Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10
Fortschreiten der Kultur Kultivierungsdauer (Stunden) 24 48 72 pH 6,5 6,3 6,6 I-Leupeptin (mcg/ml) 1,060 2,580 3,870
Aus dem Kulturfiltrat (3,700 mcglml, 800 ml) wurde 1-Leu- peptin wie im Beispiel 2 isoliert, nur wurde Diaion HP30 anstelle von Diaion HP40 verwendet. Man erhielt 1,93 g l-Leu- peptinhydrochlorid.
Beispiel 6
Von einem Medium, welches den pH-Wert 6,5 hatte und 3% Glycerin, 0,75% 1-Leucin, 0,75% 1-Argininhydrochlorid, 0,75% Glycin, 0,5% NH4NO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4. 7H2O, 0,05% KCl,0,2% Ribonucleinsäure und0,05% Silicon-Antischaummittel enthielt, wurden 201 in ein 301 fassendes Fermentationsgefäss gebracht und während 30 Minuten bei 120 C sterilisiert. Das sterile Medium wurde mit 200 ml einer wie im Beispiel 2 hergestellten Kulturbrühe geimpft und während 48 Stunden bei 27 C, einer Geschwindigkeit des Rührwerks von 400 U/min und einem Luftstrom von 20 imin kultiviert. Das Fortschreiten der Kultur wird in der Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11
Fortschreiten der Kultur Kultivierungsdauer (Stunden) 24 36 42 48 pH 6,5 5,0 5,3 5,5 I-Leupeptin (mcg/ml) 1,550 3,400 4,250 4,450
Aus dem Kulturfiltrat (4,350 mcglmi, je 800 ml) wurde l-Leupeptin wie im Beispiel 2 isoliert, nur dass anstelle von Diaion HP40 Amberlite XAD-I, XAD-5, XAD-7, XAD-8, Diaion HP10, HP50 und Duolite S-30 verwendet wurden. Man erhielt beziehungsweise 2,05 g, 2,20 g, 1,80 g, 1,75 g, 2,18 g, 2,22 g und 2,01 g 1-Leupeptinhydrochlorid.
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PATENT CLAIMS
1. Process for the preparation of l-leupeptins, characterized in that one inoculates a leupeptine-producing type of Streptomyces in a medium which contains nutrient sources, cultivating this type aerobically at a pH of 5.0 to 7.0, on the l-leupeptine accumulate in the medium, and the l-leepteptins are extracted and purified from the culture broth at a pH of at most 7.0.
2nd Method according to claim 1, characterized in that the medium each 0.5 to 1.25% by weight. -Vol. Contains I-leucine, I-argin as hydrochloride and glycine.
3rd Method according to claim 2, characterized in that the medium additionally 0.05 to 0.3% by weight. -Vol. contains at least one of the substances yeast extract, casein hydrolyzate and ribonucleic acids.
4th Method according to claim 1, characterized in that the leupeptine-producing species of Streptomyces is the species Streptomyces roseus MAB39-Al (FERM-P no. 3017, ATCC 31245).
5. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the l-leupeptin acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal is prepared.
6. Method according to claim 5, characterized in that the medium each 0.5-1.25% wt. -Vol. 1-leucine, l-arginine as hydrochloride and glycine and at most 0.3% by weight. -Vol.
contains other than the above three amino acids or substances containing these other amino acids to form acetyl I-leucyl-1-leucyl-1-argininal.
7. A method according to claim 6, characterized in that the medium additionally at least one of the substances yeast extract, casein hydrolyzate or ribonucleic acids in the amount of 0.05 to 0.3% by weight. -Vol. contains.
8th. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the l-leepeptins formed are extracted and purified from the culture broth by using a porous nonionic adsorption resin at a pH of at most 7.0.
9. A method according to claim 8, characterized in that the extraction and purification of the l-leupeptins from the culture broth is carried out at a pH of 5.0 to 6.0.
10th A method according to claim 8, characterized in that the porous nonionic adsorption resin is selected from styrene / divinylbenzene copolymer, acrylic ester polymer and phenolic resin.
The present invention relates to a process for the preparation of l-leupeptins.
Leupeptins are enzyme inhibitors found by Umezawa, one of the originators of this invention, and his collaborators in culture filtrates from Streptomyces roseus and a variety of microorganisms of the Stroptomyces species. The chemical structures of the leupeptins are represented by the following general formula:
EMI1. 1
and R is -CH3 or - ± 2H5.
These leupeptins are useful substances because they have low toxicity and protease inhibitory activity such as antiplasin and antitrypsin activity, and have anti-inflammatory and various other pharmacological effects (see Japanese Patent No. 140, U.S. Patent No. 3840513).
The main constituents of the leupeptins obtained so far by fermentation are propionyl and acetyl-l-leucyl-lleucyl-dl-argininal, both of which have an argininal group of the steric dl-configuration (hereinafter referred to as dl-leupeptins or dl-form) Kondo , S. et al. , Chem.
Pharm. Bull (Tokyo), 17, 1896 (1969); U.S. Patent No. 3840513).
Until the present invention, l-leupeptins had never been obtained by fermentation, and it was therefore believed that dl-leupeptins were produced by fermentation.
Shimizu et al. chemically produced leupeptins with an arginal group of the l configuration (hereinafter referred to as l-leupeptins or l-form) and also synthesized other leupeptins with an arginal group of the d configuration (hereinafter referred to as d-leupeptins or called d-shape). It was confirmed by biochemical experiments that the active substances which are responsible for the inhibitory effect on enzymes are the l-leupeptins, while the d-leupeptins are inactive and the dl-leupeptins obtained by fermentation show only half the effectiveness of the l-leupeptins (Shimizu, B. et al. , J.
Antibiotics, 25, 515, 1972; Umezawa, H. , Enzyme Inhibitors of Microbial Origin, University of Tokyo Press, 1972, 24-25).
The inventors undertook extensive studies on the fermentation process and on the extraction and purification processes, and found the facts listed individually below as the first results. These findings led to the present invention.
An object of the present invention is to provide a new process for producing l-leupeptins by fermentation, and for extracting and purifying the l-leupeptins formed in the culture broth by fermentation. This goal is achieved by the method according to claim 1.
The invention is explained in more detail in the following description.
Fig. 1 of the accompanying drawings shows the progress of racemization of the l-leupeptins obtained by the present method, expressed by values of relative activity and specific rotation, both measured as a function of the storage period in days.
In Fig. 2 become the infrared absorption spectra of the l-leupep produced according to the present method
tinhydrochloride (shown as a solid line) and the dl-leupeptin hydrochloride (shown as a broken line) produced according to the conventional fermentation and extraction processes.
(1) In a culture medium for leupeptin fermentation in which the pH is kept at 5.0-7.0, l-leupeptins are enriched, while in cases where the medium becomes alkaline, dl-leupeptins are obtained. Even if the culture medium is kept within pH 5 to 7, continued cultivation after the enrichment with l-leupeptins has reached the maximum causes partial racemization of the enriched l-leupeptins, resulting in l-leupeptins contaminated by the d-form.
(2) Purified l-leupeptins are in a weakly alkaline medium, e.g. B. pH 8.0, under mild temperature conditions, e.g. B. at 23 "C, also gradually racemized and after a few days change completely to the dl form.
(3) In typical known purification processes, leupeptins in the culture filtrate are subjected to adsorption and desorption treatments using activated carbon or a carboxylic acid type ion exchange resin such as Lewatit CNP (trademark of a carboxyl group-containing cation exchange resin manufactured by Bayer Co. ) or Amberlite IRC-50 (trademark of a carboxyl group-containing cation exchange resin from Rohm and Haas Co. ) in the H form, Na form or mixed form. In the case of using the carboxylic acid type cation exchange resins, the H form does not cause racemization of the l-leupeptins, but it is uneconomical because of its low adsorption capacity. The Na form has an even lower adsorption capacity and also causes complete racemization.
While a mixed type of H and Na forms in the appropriate ratio (7-8: 3-2 by volume) is superior to any other known adsorbent because of the highest adsorption capacity and high adsorption and desorption yields, it is unsuitable for Obtaining l-leupeptins because, even when the treatments are carried out under weakly or moderately acidic conditions, they cause severe racemization.
(4) Method in which leupeptins are adsorbed from a culture filtrate on activated carbon and subsequently in an acidic aqueous organic solvent, e.g. B. Desorbing 80% methanol of pH 2.0 gave dl-leupeptins when applied to fermented beer in a conventional manner without pH control. The inventors of this invention found that this method yields l-leupeptin when applied to beer made by a method developed in this invention. However, the yield was only 30 to 50%. However, it should be noted that activated carbon, similar to silica gel or alumina, can be advantageously used as an adsorbent in the subsequent purification in column chromatography.
(5) The method using a porous non-ionic adsorption resin is in the first extraction-purification stage, which includes the adsorption of leupeptins from the culture filtrate and the desorption of the adsorbed leupeptins, as well as in the later stage of further purification of the l- Leupeptine applicable in the pre-purified solution containing l-leupeptine. Use in the first stage is particularly advantageous. When a culture filtrate containing leupeptins is treated according to the present method, there are far greater advantages than using any other known method, namely greater adsorption capacity compared to other methods, no racemization of the l-leupeptins and high yield of about 90% in the adsorption-desorption stage.
(6) By adding 0.5 to 1.25% of I-leucine, 1-arginine (as hydrochloride) and glycine to the fermentation medium of the I-leupeptins, the formation of I-leupeptins is compared with that which is carried out by conventional methods to increase 4 to 6 times.
(7) The yield of l-leupeptins is increased even further to seven to ten times the yields obtained by conventional methods if one of the organic substances containing the abovementioned amino acids is added: ribonucleic acids, yeast extract or casein hydrolyzate.
(8) When using a fermentation medium which contains the three amino acids mentioned above and not more than 0.3% (wt. -Vol. ) other amino acids or substances such as peptides, proteins and the like, which contain other amino acids, the leupeptin produced consists mainly of acetyl-1-leucyl-1-leucyl-1-argininal.
In the practice of the present invention, based on the above discoveries, processes for producing l-leupeptins, which is the active form, were first established by fermentation and in high yield. For the production of only one l-leupeptin of a constant nature, it is also essential that l-leupeptin, which consists only of acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal, can be obtained according to the present method by using a culture medium , which each 0.5 to 1.25% 1-leucine, arginine (as hydrochloride) and glycine and not more than 0.3% (wt. -Vol. ) contains other free amino acids and substances containing amino acids such as peptides, proteins and the like.
The advantages of the present invention are explained below on the basis of experimental examples.
In the present invention, the potency of the leupeptins was measured in the following way:
0.5 milliliter of a leupeptin solution in a concentration of 8 mcg (potency) / ml was prepared and mixed with 2.5 ml of a 1.25 x 10-4 molar solution of p-toluenesulfonyl-1-arginine methyl ester hydrochloride in tris buffer of pH Value offset 8.1. After preincubation at 32 ° C. for 5 minutes, 0.1 ml of an aqueous trypsin solution (7.5 mcg / ml) was added to the mixture. Immediately after the incubation at 32 ° C. for 30 minutes, the reaction mixture was tested for absorption at 247 nm and the test value was thereby obtained. The blank value was obtained as above, but no leupeptin was added.
The degree of trypsin inhibition was calculated by dividing the difference between the blank value and the test value by the blank value. According to this test method, the 500 / above trypsin inhibition concentration was.
tion (IDso) of highly purified acetyl-l-leucyl-l-leucyl-l-argininal hydrochloride 0.98 mcg / ml. This substance was used as a standard pattern and the potency of leupeptins was expressed in weight such as mcg (potency) and mg.
The highest IDso value of dl-leupeptins of the highest purity, which were produced according to the conventional fermentation and purification methods, was 1.87 mcg / ml.
The content of l-leupeptins in a mixture of l-leupeptins and d-leupeptins was measured in the following manner.
The leupeptins to be tested were dissolved in water and oxidized with potassium permanganate to leupeptic acids (the argininal portion of the leupeptins was oxidized to arginine). The acids obtained were purified and isolated by activated carbon chromatography and using acidic alumina. The isolated acids were hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110 C for 24 hours. The total argin content of the hydrolyzate was determined using an amino acid analyzing instrument. In contrast, the arginine content was determined by biological testing using lactic acid bacteria. The content (%) of 1 arginine in the total arginine was equated with the content of l-leupeptins (percentages of the 1-form) in the total leupeptins.
The I-form content of the standard sample was 100% and that of the dl-leupeptins produced according to conventional methods was 52%.
Experimental example 1
A slant culture of Streptomyces roseus MA839-A1 (FERM-P no. 3017; ATCC 31245) was inoculated into 100 ml of a medium which contained 2% glucose, 2% starch, 3% polypeptone, 0.5% NaCl and 0.3% KH2PO4. This was sterilized in a flask and then at 27 for 2 days -28 "C shake-grown to produce the vaccine.
(All% in this description are weight / volume%. )
From the medium described above, 201 was placed in a 301 fermentation tank and inoculated with 200 ml of the above-mentioned vaccine. Cultivation was carried out at 27 ° C. with aeration and stirring. A portion was removed from the culture broth at regular intervals and cleaned in accordance with the present invention without racemization. This gave purified leupeptin hydrochloride in powder form. The results of the tests for effectiveness and percentage of l-form are shown in Table 1.
Table 1
Time-related change in leupeptin fermentation Cultivation time (hours) 24 36 42 48 60 72 pH 6.6 6.9 6.5 5.5 4.9 5.6 Potency of the culture broth (mcg / ml) 20 115 330 450 320 280% of l - Form in leupeptin powder - - 100 100 92 84 Potency of the leupeptin powder (mcg / mg) - - 1000 1000 910 820
As shown in Table 1, the potency of the leupeptin powder was 1000 mcglmg after 42 and 48 hours of cultivation, while it decreased to 910 mcg / ml after 60 hours and further to 820 mcg / mg after 72 hours of cultivation. The l-form content in the leupeptin powder also decreased from 100% after 42 and 48 hours to 92% after 60 hours and to 83% after 72 hours of cultivation.
It follows that unnecessarily long cultivation must be avoided, because even if the pH is controlled within 5.0 and 7.0, the cultivation after the maximum accumulation of the l-leupeptins has been reached causes a partial racemization of the l-leupeptins already formed.
Experimental example 2
The l-leupeptin hydrochlorides of the culture of Experimental Example 1 obtained after 48 hours of cultivation were dissolved in 0.1 molar phosphate buffer solution of pH 8.0 to a 1% solution. This solution was allowed to stand at 23 ° C and the time-related changes in specific rotation and relative activity (mcg / mg) were determined. The results obtained are shown in Fig. 1 shown. Leupeptins obtained after 7 days showed a 50% l-form content and a relative activity of 490 mcglmg, indicating that complete racemization had occurred. From this it can be seen that the l-leupeptins become racemic even under conditions as mild as pH 8.0 and a temperature of 23 "C.
Experimental example 3
Using the culture broth of Experimental Example 1 obtained after 48 hours of culture, the following two purification methods were compared:
Method A: The culture broth of 6.0 pH was treated with Lewatit "CNP-80 (Na form: H form = 2: 8 according to Vol. ) filled column poured to adsorb the l-leupeptins.
The adsorbate was eluted with 80% methanol containing 1N hydrochloric acid. All of the eluted fractions were acidic. They were evaporated to an aqueous solution. The leupeptins were extracted from the aqueous solution with n-butanol and the n-butanol was evaporated under reduced pressure. The resulting aqueous solution was poured through a column filled with activated carbon and the adsorbed phase was developed with 20% aqueous acetone, which was adjusted to pH 2.0 with hydrochloric acid. The active eluted fractions were collected and treated with Dowex 44 (OH form) (a polyamide resin made of primary, secondary and tertiary amines, manufactured by Dow Chemical Co. ) neutralized, then concentrated and freeze-dried.
The powder obtained was dissolved in methanol, adsorbed on a column filled with acidic alumina suspended in methanol and developed with methanol. The active fractions collected were pooled and evaporated to dryness to obtain purified 1-leupeptin hydrochloride. The yield from the culture filtrate was 33%.
Method B: The same culture filtrate as in Method A was obtained by using Amberlite XAD-2 (trademark of a nonionic adsorption resin made of a copolymer of styrene and divinylbenzene, manufactured by Rohm & Haas Co. ) filled column to adsorb the leupeptins and the adsorbed phase was eluted with 50% methanol pH 2.0. The active eluted fractions were combined and the methanol was distilled off, leaving the aqueous solution. The leupeptins were extracted from the aqueous solution with n-butanol and treated as in Method A to obtain purified leupeptin hydrochlorides. The yield from the culture filtrate was 65%. The results obtained by the two methods were compared as shown in Table 2.
Table 2
Comparison between methods A and B - yield potency of the 1-form content drive% powder, mcglmg of the powder,% A 33 530 56 B 65 1000 100
It is evident from the results of Table 2 that when the extraction and purification of l-leupeptins are carried out using a weakly acidic carboxylic acid type ion exchange resin partially converted to Na form for adsorption and desorption, a substantial part of the l-leupeptins is racemic will, even if the solutions containing the leupeptins remain acidic.
Experimental example 4
Comparison of leupeptin productivity between the preferred medium and the conventional medium 1. Media quality: (1) Preferred medium: 3% glycerin, 0.75% 1-leucine, 0.75% 1-arginine hydrochloride, 0.75% glycine, 0.5% NH4NO3, 0.5% NaCI, 0, 3% KH2PO4.
(2) Conventional medium (comparison medium): 1% glucose, 2% starch, 3% peptone, 0.5% NaCl, 0.3% KH2PO4 (see Japanese Patent No. 595 140; U.S. Patent No. 3840513).
(3) Conventional synthetic medium (comparison medium): 1% glucose, 1% starch, 0.26% 1-leucine, 0.4% arginine hydrochloride, 0.3% glycine, 0.2% NH4NO3, 0.1% K2HPO4 , 0.05% MgSO4. 7H20, 0.05% KCI, 0.001% FeSO4- 7H20 (see
Umezawa, H. , Enzyme Inhibitors of Microbial Origine, University of Tokyo Press 1972, page 20).
2nd Type used: the same as in experimental example 1.
3rd Cultivation conditions: 100 ml of the medium in one
500 ml flasks were inoculated with 1 ml of the vaccine cultured as in test example 1. The vaccinated
Medium was cultivated at 27-28 "C on a 7 cm amplitude shaker with 135 shakes per minute
Samples were taken after 48 and 72 hours and tested for the effectiveness of the leupeptins.
4th Results: The results obtained are in the
Table 3 shown.
Table 3
Duration of the culture 48 hours 72 hours
medium
Preferred medium (1) 1650 mcg / ml 2500 mcg / ml
Conventional
Generation medium (2) 520 mcg / ml 630 mcg / ml
Conventional synthetic medium (3) 380 mcg / ml 440 mcg / ml
As shown in Table 3, the productivity of the preferred medium after 72 hours of cultivation was 4 to 6 times that of the conventional two
Media that served as comparison media; although almost the same ingredients were used, the yield obtained with the preferred medium was about 6 times greater than that achieved with the conventional synthetic medium because, in the preferred medium, the concentrations of l-leucine, arginine and glycine and their mutual Ratio were cheaper.
Experimental example 5
Suitable quantity ranges of l-leucine, arginine and glycine:
1. Condition of the media:
As shown in Table 4, various amounts of l-leucine, l-arginine hydrochloride and glycine were added to the base medium containing 3, 00 / o glucose, 0.5% NH4NO3.0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4. 7H20, 0.05% KC, 1.0.2% ribonucleic acid and 0.1% silicone defoaming oil.
2nd Type used: the same as in experimental example 1.
3rd Cultivation conditions: the same as in Experiment Example 4.
4th Results: the results obtained are shown in Table 4.
Table 4 Additions% leupeptin yield, mcg / ml l-leucine l-arginine hyglycine 48 hours 72 hours drochloride 0.25 0.25 0.25 0.310 insignificant 0.50 0.50 0.50 2,080 3,300 0.75 0.75 0.75 3,460 4,370 1.00 1.00 1.00 2.080 2,860 1.25 1.25 1.25 0.400 2,560 1.50 1.50 1.50 insignificant insignificant
As can be seen from Table 4, the addition of 0.25% I-leucine, 1-arginine hydrochloride and glycine to the medium was the
Yield of leupeptin after 72 hours of cultivation insignificant, while with additions of 0.5 to 1.25% of those mentioned
Amino acids in the same cultivation time that yielded leupeptin were 2.560 to 4.370 mcg / ml. However, when the additions of the three amino acids were increased to 1.50% each, only an insignificant amount of leupeptin was formed.
These results confirm that a high yield of
Leupeptins especially when 0.5-1.25% of each of the three amino acids, l-leucine, arginine (as hydrochloride) and glycine are added to the medium is obtained.
Experimental example 6
Influence of the addition of natural complex organic substances
1. Medium quality: The natural organic substances listed in Table 5 were added to the medium of the present invention used in Experimental Example 4.
2nd Type used: the same as in experimental example 1.
3rd Cultivation conditions: the same as in Experimental Example 4.
4th Results: The results obtained are shown in Table 5.
Table 5 Additions Additional amount of leupeptin yield, mcg / ml after 48 hours after 72 hours of yeast extract 0.1 1.550 2.250 yeast extract 0.2 1.770 2.300 casamino acids 0.1 1.970 2.540 casamino acids 0.2 1.780 2.550 ribonucleic acids 0.1 2.040 3.420 ribonucleic acids 0.2 2.050 3,520 comparison medium 0 1,380 1,750
As can be seen from Table 5, the addition of 0.1-0.2% yeast extract, casamino acids or ribonucleic acids to the original preferred medium (which served as a comparison medium) further increased the yield of leupeptins; especially when adding ribonucleic acids, the yield was increased to twice the yield achieved with the original medium.
All microorganisms which are capable of producing l-leupeptins can be used in the present method. Examples of such microorganisms are Streptomyces roseus (2 species, the laboratory numbers of which were in the Institute of Microbial Chemistry MA839-AI, MB262-M1; MA839 was found in the fermentation research institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (Kogyo Gijutsuin Biseibutsu, Kogyo Gijutsu Kenkyusho) and on the 22nd September 1976 in the American Typenkutlur Collection, Maryland, United States, with the accession numbers: FERM-P Nu 3017 and
ATCC 31245 deposited), Streptomyces roseochromogenes (3 species, MA943-M1, MB 456-AE1, MB260-A2), Streptomyces chartreusis (1 species, MB58-MG1), Streptomyces albireticuli (1 species, MB26-A1), Streptomyces thioluteus ( 1 species, MB321-A1), Streptomyces lavendulae (I species, MB1 72-A2), and Streptomyces noboritoensis (1 species, MB46-AG). The properties of this species were described in The Actinomycetes, Volume II (by S. A. Waksman, The Williams & Wilkins Company, 1961).
The carbon sources which can be used in the leupeptine-producing medium are: acetic acid, glycerol, sucrose, maltose, dextrin, starch and the like, of which glycerol and glucose in particular are used with advantage. As an inorganic nitrogen source, ammonia nitrogen is more suitable than nitrate nitrogen.
The amino acids to be advantageously added to the medium are l-leucine, arginine and glycine.
The natural organic substances to be advantageously added to the medium include ribonucleic acids, yeast extract and casein hydrolyzate. The ribonucleic acids can be purified or used in crude quality, and substances with a relatively high concentration of ribonucleic acids can also be used.
The porous, nonionic adsorption resins are, for example, Amberlite XAD-I, XAD-2, XAD4, XAD-5 (these are trademarks of the manufacturers Rohm & Haas Co. , USA) and Diaion HP10, HP20, HP30, HP40, HP50 (trademarks of Mitsubishi Chemical Co. , Japan); these nine resins are styrene-divinylbenzene copolymers. Amberlite XAD-7, XAD-8 (trademarks for adsorbent manufactured by Rohm & Haas) are arcylester polymers and Duolite S-30 (trademark for adsorbent manufactured by Chemical Process Co. , USA) are phenolic resins.
According to the present method, l-leupeptins can be produced in the following way:
The culture medium contains e.g. B. 1.0-6.0% glycerol, O, 1-1.00 / o NH4NO3, 0.05-0.5% K2HPO4, 0.01-0.1% MgSO4- 7H20.01.01-0.1 % KCI, 0.5-1.25% 1-leucine, 0.5-1.25% I-arginine (as hydrochloride), 0.5-1.25% glycine, 0.05-0.3% natural organic substances such as ribonucleic acid, yeast extract, casein hydrolyzate and 0.01-0.3% silicone antifoam (pH 6.5).
After sterilization in a conventional manner, the medium is aseptically inoculated with the seed culture, which is obtained by cultivating a leupeptin-producing species such as Streptomyces roseus MA839. A1 (FERM-P No. 3017; ATCC 31245) was prepared, and then cultured at 23 to 37 "C and preferably at 25 to 30" C. If the pH rises above 7.0, it is adjusted to 6.0-6.5 with sulfuric acid or phosphoric acid. Usually the l-leupeptin enrichment reaches the maximum after 3 to 4 days of fermentation.
The culture broth thus obtained is filtered and the filtrate is treated with a resin to obtain the l-leupeptins.
The resin treatment can be carried out in various ways, but most effectively by using a resin column. The adsorption resin is filled into a column and by pouring z. B. 80% aqueous methanol activated and then washed thoroughly with water.
The leupeptin-containing culture filtrate is adjusted to a pH of about 5.0-6.0 and poured through the column to adsorb the leupeptins on the resin. After the adsorption, the column is washed with water and the adsorbed leupeptins are eluted. Lower alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol and isobutanol are suitable as eluting agents, furthermore aqueous ketones such as aqueous acetone or methyl ethyl ketone, organic solvents which contain acidified water and acidic water. Examples of cheap eluents: Mixtures of 10-95% methanol with water, with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid or phosphoric acid adjusted to a pH of 4.0 or lower.
A suitable flow rate is 0.5 to 2.0 in the adsorption stage and 0.1 to 1.0, especially about 0.5, in the elution stage. The eluate is collected in fractions of fixed amounts. A part of the eluate containing the leupeptins is obtained by combining those fractions which show antitrypsin activity, positive Sakaguchi reaction or positive Rydon-Smith reaction. Thus, a partially purified solution of l-leupeptins can be obtained by adsorption and desorption under acidic conditions.
Because no economical method for the separation of and l-leupeptins has so far been found, it is necessary to take measures to produce l-leupeptins by fermentation in order to prevent the racemation of l-leupeptins in all stages of the fermentation and purification process. One of the major advantages of the present invention is that this method enables the effective recovery of l-leupeptins from a culture broth filtrate containing only l-leupeptins. Further purification of the l-leupeptins obtained in this way can be achieved by a suitable combination of known purification processes, such as, for. B.
Chromatography under acidic conditions with activated carbon, alumina (preferably acidic alumina) or silica gel and extraction from the aqueous solution with n-butanol or the like can be carried out.
In the following, the invention is explained using examples.
example 1
A medium with a pH of 7.0, which contains 2% glucose, 2% starch, 3% polypeptone, 0.5% NaCl and 0.3% KH2PO4, is divided into 100 ml portions, each with 500 ml brought shaking flask and sterilized at 120 "C for 20 minutes. The sterilized medium was filled with a full platinum loop of a slant culture of a leupeptine-producing species, Streptomyces roseus, MA839-A1 (FERM-P No. 3017; ATCC 31245) and then shake cultured at 27 "C for 2 days.
From the culture broth obtained, 200 ml were inoculated into a 301 fermentation vessel containing 201 of the same medium as the one used above and at 27 ° C. for 48 hours at an air flow rate of 201 / minute with stirring at 400 rpm. cultured. Samples were taken after 24, 36, 42 and 48 hours of cultivation. This was shown by the pH values of 6,7,6,8,6,4, 6,7 and leupeptin activity of 35 230,420 and 670 mcg / ml.
The resulting culture broth was 5% (wt. Vol. ) of a filter aid (Hyflo Super-Cel manufactured by Johns-Manville Co. , USA) mixed and then filtered. The filtrate was adjusted to pH 5.5 with dilute hydrochloric acid, whereby about 151 of a culture filtrate with the leupeptin potency of 665 mcg / ml was obtained. Four liters (total potency = 2.660 mg unit) of the culture filtrate was poured through a column filled with 100 ml of Amberlite XAD-2, a nonionic adsorption resin, at a flow rate of 1 to adsorb the leupeptins on the resin. After washing with water, the leupeptins were eluted with 80% aqueous methanol, which was adjusted to pH 2.0 with hydrochloric acid.
The active eluate fractions were combined, the methanol was distilled off under reduced pressure and the remaining aqueous solution was adjusted to pH 5.5 with dilute sodium hydroxide solution, and in this way 100 ml of an aqueous solution of 24.5 mg potency / ml (the yield from the culture filtrate was 92%). This aqueous solution was extracted twice with 70 ml of n-butanol, from the combined extraction layers the n-butanol was distilled off under reduced pressure with the addition of water, and 50 ml of an aqueous solution of the power 47 ml / ml were obtained (total power was 2.350 mg unit and the resultant Yield from the culture filtrate was 88%).
This aqueous solution was adjusted to pH 2.0 with dilute hydrochloric acid and, for the purpose of adsorbing the leupeptins, into a refined Shirasagi brand for chromatography filled with 85 ml of activated carbon, manufactured by Takeda Chemical Co. ) Pillar cast.
The adsorbed leupeptins were eluted with 20% aqueous acetone. The acetone was distilled off from the combined active fractions. An aqueous solution was obtained which was neutralized to pH 5.5 with Dowexe44 (OH form) and then freeze-dried. 3.31 g of a pale yellow were obtained
Powder with a potency of 582 mcg / mg (the total potency was 1.926 mg and the yield from the culture filtrate was 720 / o). The powder was dissolved in 30 ml of methanol, poured through a column filled with 90 g of acidic alumina with methanol and developed with methanol at a flow rate of 0.5. The active eluate fractions were combined and evaporated to dryness. The powder obtained was dissolved in water, the insoluble residue was filtered off and the filtrate was freeze-dried.
1.85 g of l-leupeptin hydrochloride with a potency of 988 mcg / mg were obtained. The total potency of the powder was 1.828 mg and the yield from the culture filtrate was about 69%. The powder had the l-leupeptin content of 100%.
Example 2
100 ml each of a medium (pH 6.5), which contained 2% glycerol, 1% polypeptone and 1% meat extract, were filled in 500 ml Erlenmeyer flasks, sterilized for 30 minutes at 120 ° C., with a full platinum loop of a slant culture of Streptomyce roseus, MA839-A1 (FERM-P No. 3017, ATCC 31245) and shake cultured at 27 OC for 24 hours to obtain a pre-cultured broth.
From another medium (pH 6.5), the 3% glycerol, 0.75% I-leucine, 0.75% I-arginine hydrochloride, 0.75% glycine, 0.5% NH4NOj, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4. 7H20, 0.05% KCI, 0.2% ribonucleic acid and 0.1% silicone antifoam, 100 ml were placed in a 500 ml flask, sterilized at 120 ° C for 30 minutes and then aseptically with 1 ml of the vaccinated broth above. The cultivation was then carried out on a shaking culture machine with an amplitude of 7 cm and 210 shaking movements per minute at 27 ° C. for 3 days. The progression of the culture is shown in Table 6.
Table 6
Development of the culture Cultivation time (hours) 24 48 72 pH 6.7 5.9 5.7
Leupeptin (mcg / ml) 1.430 3.230 4.250
After culturing for 72 hours, the culture broth was filtered to remove the mycelium. The filtrate obtained (800 ml with a leupeptin content of 4.070 mcg / ml was adjusted to pH 6 and poured through a column filled with 120 ml Diaion HP40 to adsorb the leupeptin. After washing with water, the adsorbed leupeptin was eluted with 50/0 aqueous methanol of pH 2 and 235 ml of a leupeptin fraction was collected. After the methanol was distilled off at 40 ° C. under reduced pressure, 170 ml of an aqueous solution were obtained. This solution was adjusted to pH 5.5 with dilute sodium hydroxide solution and extracted three times with 50 ml of n-butanol.
The collected extract was distilled at 40 ° C. to remove the n-butanol azeotroped with water. 100 ml of an aqueous solution of 28 mg potency / ml leupeptin were obtained. This aqueous solution was adjusted to pH 2 with hydrochloric acid and the precipitate formed was removed by filtration. To adsorb the leupeptin, the filtrate was passed through a 100 ml activated carbon (Refined Shirasagi, trademark, manufactured by Takeda Chemical Co. ) poured. After washing with dilute hydrochloric acid of pH 2, the adsorbed leupeptin was eluted with 20% aqueous acetone of pH 2, and 210 ml of a leupeptin fraction was obtained. The leupeptin fraction was adjusted to pH 5.0 using Dowex 44 resin (OH form) and evaporated to dryness under reduced pressure. 4.00 g of an almost white powder with an activity of 580 mcg / mg were obtained.
The powder was dissolved in methanol and the solution was dissolved in acidic alumina suspended in methanol (manufactured by Woelm Co. , BDR) filled column and developed with methanol. The entire leupeptin fraction was evaporated to dryness under reduced pressure. 2.22 g of a white powder of leupeptin hydrochloride were obtained, which had an activity of
1,000 mcg / mg. The yield from the culture filtrate was 68%.
This powder showed a specific rotation (ol) D1 'of -75 C (c = 1, H20) and melted with decomposition
143-146 "C, showed positive Sakaguchi reaction, positive
Rydon-Smith reaction and negative ninhydrin reaction. It showed no specific absorption in the ultraviolet range, but only an end absorption. As in Fig. 2, the infrared absorption spectrum of the powder agrees with that of a dl-leupeptin produced by a conventional method.
20 mg of the above hydrochlorides were hydrolyzed with 6N hydrochloric acid in a sealed tube at 110 ° C. for 24 hours. The free fatty acid was extracted from the
Hydrolyzate extracted with ethyl ether. The extraction layer was concentrated and using a Chromosolb 101 (trademark, manufactured by Nippon Kuromato Kogyo Co. ) (60-80 mesh) filled column of gas chromatography. Only acetic acid was found. This confirmed that the powder was a leupeptin hydrochloride with an acetyl group as the only acyl group.
Then about 200 mg of the hydrochloride was dissolved in 8 ml of water. 52 mg of potassium permanganate dissolved in 2 ml of water were added dropwise to this solution at room temperature with stirring and, to complete the oxidation, the mixture was stirred for a further 2 hours. The excess potassium permanganate was then neutralized with sodium thiosulfate and the mixture obtained poured through a column filled with 5 ml of activated carbon. After washing with water, the adsorbed phase was eluted with 20% aqueous acetone pH 2.0 and fractions showing a positive Sakaguchi reaction were collected. These fractions were combined, adjusted to pH 5.0 with Dowex0 44 resin (OH form) and evaporated to dryness. 170 g of a powder were obtained.
The powder was dissolved in 1 ml of methanol, the solution was poured through a column filled with 5 g of a suspension of acidic alumina in methanol, and developed with 15 ml of methanol followed by 25 ml of 500% methanol of pH 3.0. The effluent fractions, which showed positive Sakaguchi reaction, were combined, adjusted to pH 5.0 with Dowex0 44 resin (OH form) and evaporated to dryness. 75 mg of leupeptic acid (acyl-1-leucyl-1-leucyl-1-arginine) were obtained. About 10 mg of this leupeptic acid were weighed exactly, mixed with 2 ml of 6N hydrochloric acid and hydrolyzed in a sealed tube at 110 ° C. for 24 hours. The hydrolyzed solution was evaporated to dryness and dissolved in water.
Part of the solution obtained was subjected to amino acid analysis in order to determine the building amino acids qualitatively and quantitatively. The rest of the solution was used for biological testing using 1 lactic acid bacteria requiring arginine as test organisms to determine the arginine content. The results obtained are shown in Table 7.
Table 7
Composition of the amino acids in the hydrolyzate
Leupeptic acid Amino acid analysis used for hydrolysis Leupeptic acid quantity 1 -Leucine total 1 arginine
Arginine 8.10mg 3.95mg 2.56mg 2.61 mg (10.1 KLmol, (14.8, umol, (102% of
Recovery Total recovery 89%) 87%) Arginine)
It was concluded from the above results that the hydrolyzed leupeptic acid contained l-leucine and arginine in a molar ratio of 2: 1, and no valine, no isovalin and no d-arginine. As a result, it was confirmed that the leupeptin obtained in the present example is a single compound, namely acetyl-1-leucyl-1-leucyl-1-argininal.
Example 3
From a medium (pH 6.5) containing 3% glycerin, 0.75% 1-leucine, 0.75% 1-arginine hydrochloride, 0.75% glycine, 0.5% NH4NO3, 0.1% K2HPO4, 0 , 05% MgSO4 to 7H20.0.5% KCI and 0.1% silicone antifoam, 100 ml were placed in a 500 ml flask and sterilized at 120 C for 30 minutes. The sterilized medium was inoculated with 1 ml of a pre-cultivated broth prepared as in Example 2 and shaken for 3 days at 27 ° C. on a shaker culture apparatus with a 7 cm amplitude and 210 shaking movements per minute. The progress of the culture is shown in Table 8.
Table 8
Advancement of culture
Cultivation time (hours) 24 48 72 pH 6.6 6.3 5.9 1-leupeptin (mcglml) 830 1.610 2.460
1-Leupeptin was extracted from the culture filtrate (2.350 ml / ml, 800 ml) as in Example 2, except that Amberlite XAD-4 was used instead of Diaion HP40. 1.22 g of 1-leupeptin hydrochloride were obtained.
Example 4
From a medium (pH 6.5) which is 3% glucose, 0.75%
1-Leucine, 0.75% 1-arginine hydrochloride, 0.75% glycine, 0.8% (NH4) 2SO4, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4. 7H2O, 0.05% KCI, 0.24
Ribonucleic acid and 0.1% silicone antifoam, 100 ml were placed in a 500 ml flask and at
Sterilized at 120 C for 30 minutes, inoculated and shaken as in Example 3. The progression of the culture is shown in Table 9.
Table 9
Development of the culture Cultivation time (hours) 24 48 72 pH 4.8 7.0 I-leupeptin (mcg / ml) - 3.170 4.050
From the culture filtrate (3.880 mcg / ml, 800 ml), 1-leupeptin was extracted and purified as in Example 2, except that Diaion HP20 was used instead of Diaion HP40. 1.96 g of 1-leupeptin hydrochloride were obtained.
Example 5
100 ml each of a medium (pH 6.5) which contains 3% glycerol, 2% peptone, 0.5% 1-leucine, 0.5% 1-arginine hydrochloride, 0.5% glycine, 0.5% NaCl, Containing 0.2% KH2PO4, 1.1% ribonucleic acid and 0.05% silicone antifoam were sterilized in 500 ml flasks for 20 minutes at 120 ° C. Each part was vaccinated and cultivated as in Example 2. The results are shown in Table 10.
Table 10
Culture progress Cultivation time (hours) 24 48 72 pH 6.5 6.3 6.6 I-leupeptin (mcg / ml) 1.060 2.580 3.870
From the culture filtrate (3,700 mcglml, 800 ml) 1-leupeptin was isolated as in example 2, only Diaion HP30 was used instead of Diaion HP40. 1.93 g of l-leepeptin hydrochloride were obtained.
Example 6
From a medium which had a pH of 6.5 and 3% glycerol, 0.75% 1-leucine, 0.75% 1-arginine hydrochloride, 0.75% glycine, 0.5% NH4NO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4. 7H2O, 0.05% KCl, 0.2% ribonucleic acid and 0.05% silicone antifoam were placed in a 301-liter fermentation vessel in 201 and sterilized at 120 C for 30 minutes. The sterile medium was inoculated with 200 ml of a culture broth prepared as in Example 2 and cultured for 48 hours at 27 ° C., a stirrer speed of 400 rpm and an air flow of 20 min. The progress of the culture is shown in Table 11.
Table 11
Culture progression Cultivation time (hours) 24 36 42 48 pH 6.5 5.0 5.3 5.5 I-leupeptin (mcg / ml) 1,550 3,400 4,250 4,450
From the culture filtrate (4,350 mcglmi, 800 ml each), l-leupeptin was isolated as in Example 2, except that instead of Diaion HP40 Amberlite XAD-I, XAD-5, XAD-7, XAD-8, Diaion HP10, HP50 and Duolite S-30 were used. 2.05 g, 2.20 g, 1.80 g, 1.75 g, 2.18 g, 2.22 g and 2.01 g of 1-leupeptin hydrochloride were obtained, respectively.