CA3084561A1 - Procede de detection des maladies articulaires - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite maladie, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre; b) séchage de la goutte déposée à l'étape a); c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence. Ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface (S) de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte. La valeur de la surface (S) est représentatif de la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial et la valeur de l'hauteur maximale (H) est représentatif de la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.

Description

PROCEDE DE DETECTION DES MALADIES ARTICULAIRES
La présente invention concerne un procédé de diagnostic.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour diagnostiquer, déterminer le type ou évaluer la sévérité d'une maladie articulaire affectant un mammifère, notamment l'arthrose.
Les maladies articulaires, ou arthropathies, touchent les articulations et comprennent notamment l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Parmi ces maladies articulaires, l'arthrose aussi dénommée ostéo-arthrite est la plus répandue. La prévalence de l'arthrose est en constante augmentation dans le monde, car elle est liée au vieillissement et au surpoids de la population. Elle se manifeste le plus souvent par des douleurs mécaniques et/ou une gêne, lors des mouvements d'une articulation.
De nombreuses articulations peuvent être touchées par l'arthrose. Les principales sont les cervicales et les lombaires (entre 70 et 75 %), le genou (40 %), le pouce (30 %), la hanche et la cheville (10 %) et les épaules (2 %).
L'arthrose a longtemps été présentée comme une usure du cartilage alors qu'il s'agit bien d'un syndrome destructeur et inflammatoire, associé à
différents facteurs de risque. Les scientifiques ne parlent plus d'arthrose en général mais des arthroses en fonction du profil du patient : arthrose liée à l'âge, arthrose liée à une obésité, arthrose liée à une maladie de l'articulation, etc. L'objectif à l'heure actuelle est d'individualiser la prise en charge et les traitements en fonction de ces différents profils.
Les lésions du cartilage ne régressent pas au cours du temps et leur évolution n'est pas linéaire. Elle peut être très rapide et rendre nécessaire la pose d'une prothèse en moins de 5 ans. L'arthrose peut également évoluer lentement, sur plusieurs années, sans induire de handicap majeur.
Le diagnostic de la maladie s'établit généralement par (i) l'observation par le patient lui-même d'une douleur ou d'une gêne dans une articulation, et (ii) une radiographie de l'articulation en question qui permet de constater de visu l'état de dégradation du cartilage. Toutefois, il n'y a pas de relation entre l'importance des lésions radiologiques et l'importance de la douleur arthrosique.

2 PCT/EP2017/080088 Des critères de diagnostic clinique ont été développés par l'ACR
(American College of Rheumatology), basés sur la description des douleurs et/ou gênes (Litwic et al., 2013).
Les radiographies peuvent montrer des signes très caractéristiques de l'arthrose telles que :
= le pincement articulaire, = l'ostéophyte, c'est-à-dire un surplus d'os autour de l'articulation, = la condensation de l'os sous le cartilage.
= les géodes dans l'os qui correspondent à des trous .
La sévérité de la maladie est le plus généralement mesurée selon l'échelle de Kellgren & Lawrence, qui ont établi une échelle de scores de sévérité
radiologique K/L
allant de 0 à 4, cette échelle ayant été maintenant adoptée par l'OMS.
Il n'existe à ce jour que des traitements symptomatiques pour soulager la douleur. Aucune thérapeutique anti-arthrosique capable de protéger le cartilage n'est actuellement disponible.
La recherche sur les maladies articulaires se focalise actuellement sur deux objectifs principaux, d'une part trouver des cibles thérapeutiques, et d'autre part identifier des biomarqueurs (i) permettant de diagnostiquer la maladie avant l'apparition des symptômes invalidants, (ii) permettant de déterminer le type de maladie afin de personnaliser le traitement, (iii) permettant de déterminer le stade de la maladie, et (iv) permettant de prédire l'évolution de la maladie.
La présente invention concerne la réalisation de ce deuxième objectif.
Actuellement, et comme indiqué précédemment, le diagnostic s'effectue sur la base de l'examen clinique et des images radiologiques. Les chercheurs s'emploient à
identifier des molécules dont la présence ou la concentration dans le sérum ou l'urine pourrait servir de biomarqueur, sans que toutefois à l'heure actuelle aucune molécule candidate ne permette de catégoriser les patients (Lotz et al., 2013). Il a cependant été mis en évidence un lien entre la présence de certains micro-ARN circulants dans le sérum, et la sévérité de l'arthrose du genou ou de la hanche (Beyer et al., 2015) Lors d'une poussée avec un épanchement de liquide intra-articulaire aussi appelé liquide synovial, l'analyse de ce liquide recueilli lors d'une ponction de l'articulation peut aider à confirmer et/ou affiner le diagnostic.

3 PCT/EP2017/080088 Des procédé in vitro permettant d'évaluer la sévérité d'une maladie articulaire chez un mammifère, à partir d'échantillons de liquide synovial, sont activement recherchés.
L'article (Esmonde-White et al., 2009a) décrit notamment un procédé
permettant de discriminer différents stades de la maladie, comprenant la mesure, sur une goutte séchée de liquide synovial, des paramètres suivants : présence de cristaux au centre de la goutte, et présence de marques d'érosion radiales sur les bords de la goutte.
De plus, en analysant la composition du liquide synovial pathologique par spectroscopie Raman, l'équipe du Dr Esmonde-White a identifié un lien entre ledit spectre Raman du liquide synovial et la sévérité, selon le score K/L, de l'arthrose du genou. En particulier, des ratios d'intensité de bandes Raman ont été corrélés de manière significative avec la sévérité radiographique de la maladie (Esmonde-White et al., 2009b).
Dans la demande US 2007/0082409, l'analyse du spectre Raman du liquide synovial a permis de déterminer la présence de certaines molécules, tel que l'acide hyaluronique (HA). Ce composé lubrifiant des articulations est un biomarqueur des maladies articulaires : en effet dans ces pathologies, il est soit dégradé, soit présent en concentration moindre suite à l'infiltration de fluides et protéines dans l'articulation ; de plus, l'acide hyaluronique présent est sous une forme moléculaire différente, de plus faible poids moléculaire, cette forme ne présentant pas les mêmes propriétés viscoélastiques que l'acide hyaluronique présent dans des articulations saines.
La détection de ce biomarqueur est indicative du stade de la maladie, mais reste toutefois difficile à mettre en oeuvre, un équipement permettant d'effectuer une spectroscopie Raman étant nécessaire.
En cas de maladies articulaires, d'autres modifications moléculaires du liquide synovial sont observées telles qu'une augmentation de la concentration en protéines, et une modification du taux de glycosaminoglycances (GAG) : augmentation de leur concentration aux stades précoces, diminution aux stades avancés.
Les inventeurs ont mis en évidence un lien entre les caractéristiques morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la présence, le type ou le stade d'une maladie articulaire touchant le mammifère dont est issu le liquide synovial.

4 PCT/EP2017/080088 Les inventeurs ont également mis en évidence une corrélation entre les caractéristiques morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la teneur en acide hyaluronique et en protéines dudit liquide synovial.
Le procédé tel que présenté ci-dessous permet de diagnostiquer une maladie articulaire et/ou d'obtenir des informations sur son type ou son stade et/ou de prédire son évolution, de manière simple, rapide et à faible coût.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite maladie, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de .. référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé peut comprendre de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention concerne également un procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :

5 PCT/EP2017/080088 a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Il, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant Ii, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
La présente invention concerne également un procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.

6 PCT/EP2017/080088 La présente invention concerne également un procédé de criblage in vivo chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
La présente invention concerne également un procédé de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :
= la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S) pour cette surface est obtenue, et/ou = la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est obtenue, et d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs suivantes :

7 PCT/EP2017/080088 = la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial ; et = la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
FIGURES
Figure 1. Représentation schématique du protocole de dépôt de gouttes (DDRS).
Figure 2. Images obtenues par la technique DDRS :
(a) Images prises au microscope à lumière blanche d'une goutte sèche de liquide synovial (LS) montrant des structures typiques dans deux régions distinctes : une zone périphérique translucide présentant des cracks radiaux et une zone centrale avec des dépôts cristallins de forme dendritiques. Les acquisitions Raman ont été réalisées dans les zones cardinales périphériques et sont représentées par des rectangles.
.. (b) L'image supérieure mesurée avec un interféromètre montre que les quatre ROI (Region of Interest) sont positionnées dans des zones où les solutés sont concentrés.
Figure 3. Exemples d'images 2D et 3D pour un LS sain (partie supérieure de la figure) et un LS arthrosique (LS OA ¨ partie inférieure de la figure) : la goutte de LS
sain est de taille inférieure à celle de LS OA; sur la goutte de LS sain, un cercle noir est visible entre la périphérie extérieure et le centre, et la hauteur maximale du bourrelet est de l'ordre de 12 ium (la hauteur est représentée par les variations de couleur noir/blanc) ;
sur la goutte de LS OA, on voit clairement un bourrelet en périphérie, dont la hauteur maximale est de l'ordre de 25 ium et est plus large que sur la goutte de LS sain.
Figure 4. A) Boîtes à moustache (i.e. box plot ) (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes (partie gauche de la Figure 4A) et des hauteurs de bourrelet entre gouttes (partie droite de la Figure 4A) de LS sains et arthrosiques : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05) et **
(p<0.01).
B) Profils Z le long de la périphérie des gouttes sur LS sains et arthrosiques : les lignes en gras et les zones ombrées représentent respectivement la moyenne et les écart-types. La courbe supérieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets OA.
La courbe inférieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets sains.

8 PCT/EP2017/080088 Figure 5. (A) Spectres Raman moyen normalisés de LS sains chez le chien (n=6) ;
macroscopiquement tous les échantillons présentaient un aspect normal (viscosité, turbidité, transparence, couleur). En ordonnées : valeur d'intensité du signal, exprimée en Unités Arbitraires (a.u.). En abscisse : nombres d'onde, exprimées en cm-1.
(B) Spectre Raman normalisé de LS arthrosique chez le chien (n=6) ; les échantillons étaient plus ou moins inflammatoires avec une couleur allant de jaune paille à
orange. Le spectre en gras représente l'empreinte spectrale Raman de LS sain, la zone grisée correspond à l'écart-type. En ordonnées : valeur d'intensité du signal, exprimée en Unités Arbitraires (a.u.). En abscisse : nombres d'onde, exprimées en cm-1.
(C) Zones spectrales d'intérêt.
Partie supérieure de la Figure 5C : spectres obtenus à partir de gouttes de sujets sains ; De gauche à droite : (i) spectres dans la gamme spectrale 910 à 990 cm-1 ; (ii) spectres dans la gamme spectrale 1020 à 1145 cm-1 ; (iii) spectre dans la gamme spectrale 1220 à
1280 cm-1 ;
Partie inférieure de la Figure 5C : spectres obtenus à partir de gouttes de sujets OA; De gauche à droite : (i) spectres dans la gamme spectrale 910 à 990 cm-1 ; (ii) spectres dans la gamme spectrale 1020 à 1145 cm-1 ; (iii) spectres dans la gamme spectrale 1220 à
1280 cm-1;
Les lignes verticales de la Figure 5C correspondent aux longueurs d'ondes spécifiées sur la ligne des abscisses de la partie inférieure de la figure, respectivement de gauche à droite :
945 cm-1, 960 cm-1, 970 cm-1, 1031 cm-1, 1046 cm-1, 1062 cm-1, 1081 cm-1, 1102 cm-1, 1127 cm-1, 1242 cm-1 et 1275 cm-1.
Figure 6. Résultats d'une Analyse des Composantes Principales (ACP ou PCA en anglais) basée sur 210 ratios de spectre Raman.
Chaque point (étoile pour les échantillons sains, cercle pour les échantillons malades OA) représente les 210 ratios du spectre Raman d'un échantillon. Les groupes de points sains et OA sont clairement situés dans des zones distinctes.
Figure 7. Cette figure montre une bonne corrélation entre trois ratios de pics de spectre Raman avec la quantité d'interleukine 6 (IL6) dans des échantillons de LS
humain.
(A) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1062 cm-1 par rapport au pic à
945 cm-1. En abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.

9 PCT/EP2017/080088 (B) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1081 cm-1 par rapport au pic à
1062 cm-1. En abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
(C) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1102 cm-1 par rapport au pic à
1062 cm-1. En abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
Figure 8. Les trois ratios des pics Raman 1448/1102 cm-1 (A) ; 1654/1102 cm-1 (B) ; et 1448/1317 cm-1 (C) ; sont corrélés avec la valeur (H) de hauteur des bourrelets, aussi bien dans les échantillons de LS issus d'humain que de chien. Le ratio 1031/1102 cm-(D) également lié aux protéines est fortement corrélé (R2>85%) avec la valeur (H) de hauteur de bourrelet chez le chien.
Figure 9. Les quatre ratios des pics Raman en relation avec l'acide hyaluronique :
1317/896 cm-1 (A) ; 1339/896 cm-1 (B) ; 1062/1046 cm-1 (C) et 1317/945 cm-1 (D), sont corrélés avec la valeur (S) de surface de la goutte de liquide synovial, dans des échantillons de LS issus de chiens.
Figure 10. (A) Boîtes à moustache (ie. box plot ) (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes entre gouttes de LS
SI (stade inflammatoire) et SNI (stade non inflammatoire) : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05) et ** (p<0.01).
(b) Boîtes à moustache (ie. box plot ) (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des hauteurs de bourrelet entre gouttes de LS SI
(stade inflammatoire) et SNI (stade non inflammatoire) : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05) et ** (p<0.01).
(C) Profils Z le long de la périphérie des gouttes sur LS SI et SNI : les lignes en gras et les zones ombrées représentent respectivement la moyenne et les écart-types. La courbe supérieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets au SI. La courbe inférieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets au SNI.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis en évidence de nouveaux biomarqueurs permettant de diagnostiquer ou de déterminer le type ou la sévérité d'une maladie articulaire, ces biomarqueurs étant des paramètres indicatifs des caractéristiques morphologiques d'une goutte séchée de liquide synovial issu d'un mammifère.

10 PCT/EP2017/080088 Par maladie articulaire, au sens de l'invention, on entend une maladie touchant les articulations et notamment le cartilage présent au niveau de ces articulations. Cette maladie articulaire peut être de type inflammatoire ou non, dégénérative ou non, et est notamment choisie parmi l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Par mammifère, au sens de l'invention, on entend notamment les animaux mammifères domestiques tels que les chats, les chiens, les hamsters, les lapins, les cochons d'inde et les furets ; sont également visés par la présente invention les animaux d'élevage tels que les ovins, bovins, caprins, équidés, camélidés et cervidés.
Plus particulièrement, la présente invention concerne les maladies articulaires affectant l'être humain. Dans la présente demande, le terme patient désigne un être humain, enfant ou adulte, affecté par une maladie articulaire.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère, comprenant les étapes .. suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par diagnostiquer on entend, au sens de l'invention, établir la présence d'une maladie articulaire chez un patient, y compris à un stade très précoce de la maladie où les symptômes cliniques sont difficiles à déceler ou à interpréter.

11 PCT/EP2017/080088 Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour déterminer le type de maladie articulaire affectant un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par déterminer le type de maladie articulaire on entend, au sens de l'invention, déterminer la ou les origines de la maladie articulaire, et en particulier déterminer s'il s'agit d'une maladie inflammatoire ou pas, ou s'il s'agit d'une maladie liée au profil du patient (âge, surpoids) ou à la présence d'un pathogène (bactéries, virus), ou encore s'il s'agit d'une maladie dégénérative.
En particulier, il sera possible de déterminer quelle est la maladie touchant le patient, parmi les maladies articulaires suivantes : l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour évaluer le stade d'une maladie articulaire affectant un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et

12 PCT/EP2017/080088 d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par évaluer le stade d'une maladie articulaire , également désigné dans la présente demande par l'expression évaluer la sévérité d'une maladie articulaire , on entend au sens de la présente invention déterminer le stade de la maladie selon les scores cliniques et biologiques préalablement établis, comme par exemple le score de sévérité
radio logique K/L.
Ce procédé permet notamment de distinguer le stade inflammatoire et le stade non inflammatoire d'une maladie articulaire.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, le procédé pour déterminer le stade d'une maladie articulaire affectant un mammifère permet également de donner un pronostic sur l'évolution de la maladie.
Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour prédire l'évolution d'une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et sévérité de la maladie articulaire, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.

13 PCT/EP2017/080088 Selon un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et déterminer le type de ladite maladie articulaire, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Selon un septième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour évaluer la sévérité et déterminer le type d'une maladie articulaire affectant un mammifère, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Selon un huitième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère, pour évaluer la sévérité et déterminer le type de ladite maladie, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Les procédés selon l'invention comprennent tous quatre étapes successives a) à
d) dont la mise en oeuvre est détaillée ci-dessous.
Etape a) La première étape consiste en un dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide .. synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre.
Echantillon de liquide synovial Le liquide synovial (LS), ou synovie, est un liquide biologique produit par la membrane synoviale. Ce liquide est visqueux, transparent ou jaune pâle. Il est composé
d'un dialysât du sérum comprenant des électrolytes, du glucose, des protéines, des glucoprotéines et de l'acide hyaluronique, et de liquide interstitiel filtré
du plasma sanguin.
La présence de ce liquide dans les articulations a pour fonction de réduire la friction par son pouvoir lubrifiant, d'absorber les chocs, de fournir de l'oxygène et des nutriments aux chondrocytes du cartilage articulaire, et d'éliminer le dioxyde de carbone et les déchets métaboliques de ces cellules.
Les échantillons de liquide synovial testés selon le procédé de l'invention sont issus d'articulations de mammifères atteints ou susceptibles d'être atteints par une maladie articulaire. Les prélèvements sont effectués stérilement par intervention chirurgicale. Les échantillons sont ensuite congelés pour leur conservation.
Avant le dépôt de la goutte, ces échantillons sont centrifugés pour éliminer les cellules présentes dans le liquide synovial.

14 PCT/EP2017/080088 Ces échantillons de LS peuvent être dilués avec des tampons classiques, ou non dilués. Ils peuvent également être traités avec des protéases et des RNAses afin de conserver au mieux les constituants biologiques.
Selon un aspect préféré de l'invention, la goutte déposée provient d'un échantillon de LS non dilué. Selon un autre aspect, l'échantillon de LS est non traité par des protéases et/ou RNAses.
Technique de Drop Deposition La technique de DD (Drop Deposition) est bien adaptée pour l'examen des biofluides de faible abondance, comme les larmes, le liquide synovial ou le liquide céphalo-rachidien, car il n'y a souvent pas assez de liquide pour effectuer des analyses en chromatographie ou en électrophorèse classique. Les biofluides peuvent être préparés en utilisant une seule goutte de liquide, et la même goutte séchée peut être examinée à l'aide de multiples techniques telles que la microscopie optique, l'interférométrie à
lumière blanche, la microscopie à force atomique (AFM), le laser assisté par matrice désorption /
ionisation (MALDI), la spectrométrie de masse, l'impédance acoustique-mécanique ou la spectroscopie optique, notamment la spectroscopie Raman.
Les multiples données obtenues à partir de quelques microlitres de biofluide sont représentatives des propriétés physiques et chimiques du fluide biologique analysé.
Nature du matériau constituant la surface plane Dans le procédé selon l'invention, le dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial est effectué sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, en particulier de nature hydrofuge.
Le terme matériau de nature hydrofuge désigne un matériau imperméable, qui repousse l'eau, celle-ci ne pouvant s'immiscer dans les pores du matériau grâce à la nature même ou au revêtement du matériau.
Selon une mise en mise en oeuvre particulière de l'invention, le support plan est préalablement traité pour éliminer toute trace de graisse à sa surface.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le support plan présente un angle de contact avec l'eau compris entre 500 et 90 .

15 PCT/EP2017/080088 Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, le support plan est transparent. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le support plan est constitué
de verre.
Au sens de l'invention, le terme verre désigne des solides amorphes obtenus par chauffage d'un mélange, en proportions appropriées, de silice et d'oxydes métalliques. Ce sont donc des silicates mixtes, solides, non cristallins, transparents et fragiles, formés par la juxtaposition désordonnée de tétraèdres de silice 5iO4 et par la présence d'oxydes alcalins, alcalinoterreux, de plomb, d'aluminium, etc. Le verre est dur, cassant et transparent à la lumière visible. Le verre considéré dans la présente invention est un verre minéral, et non un verre organique.
Il peut s'agir notamment de verre sodo-calcique, ou de verre borosilicaté, de qualité adaptée à la microscopie.
Le support plan est en particulier une lame porte-objet pour microscope, en verre de qualité optique, de faible épaisseur (environ 1 mm) et sans revêtement. Ce support .. est particulièrement avantageux du fait de son coût très faible et de sa grande disponibilité.
L'article de Esmonde-White et al., 2014, présente une étude sur la technique DD, basée sur deux biofluides : le plasma et le liquide synovial, où plusieurs matériaux légèrement hydrophiles ont été testés comme support pour le dépôt des gouttes.
Il s'agit en particulier de verre recouvert d'or ou de fluorure de calcium (CaF2). Ces matériaux sont utilisés car ils permettent d'optimiser la lecture du spectre Raman, le bruit de fond étant bien plus faible que celui généré par le verre sans revêtement. Toutefois, sur un support plan constitué de ces matériaux, les auteurs de l'article n'ont pas observé de différences au niveau des caractéristiques morphologiques des gouttes de LS issus de patient atteints d'arthrose, à différents stades de la maladie.
Etape b) : séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
Le séchage sera effectué de la manière la plus adéquate, comme cela est facilement déterminable par l'homme du métier.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, le séchage de la goutte de liquide synovial est effectué à température ambiante, pendant au moins 8 heures, voire au moins 12 heures, voire au moins 24 heures.

16 PCT/EP2017/080088 Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, le séchage de la goutte sera effectué pendant 30 minutes ou une heure, à 37 C.
Selon d'autres mises en oeuvre de l'invention, le temps de séchage pourra être raccourci jusqu'à moins de 30 minutes. En effet, le procédé de diagnostic selon l'invention sera de préférence mis en oeuvre de manière rapide, pour obtenir un diagnostic dans les plus courts délais.
Une fois la goutte séchée, des images en 2 et 3 dimensions pourront être obtenues afin de réaliser les mesures détaillées ci-dessous. De telles images de gouttes séchées sont présentées en figure 3.
Etape c).
La troisième étape du procédé est une étape de mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à
l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue.
Par paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte on entend tous les paramètres relatifs à la taille et à la forme de la goutte, et relatifs à la taille et à la forme du bourrelet qui se crée en périphérie de la goutte (voir figure 3, OA). Les paramètres représentatifs des caractéristiques morphologiques de la goutte sont notamment la surface de la goutte, le profil de surface (Z) de la goutte, la hauteur (H) du bourrelet et la largeur du bourrelet.
Selon l'invention, le paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Il est entendu que, dans le procédé selon l'invention, l'Homme du métier pourra choisir de mesurer un seul paramètre choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte, ou de mesurer les valeurs de deux paramètres ou encore de mesurer les valeurs des trois paramètres cités ci-dessus. Tous ces paramètres sont mesurables à partir d'images 2D et/ou images 3D de la goutte séchée sur un support plan, notamment une lame de verre.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, l'étape c) de mesure est réalisée par une méthode d'interférométrie à lumière blanche, permettant d'obtenir les images 3D des gouttes séchées.

17 PCT/EP2017/080088 L'interférométrie est une méthode de mesure qui exploite les interférences intervenant entre plusieurs ondes cohérentes entre elles.
Les interféromètres à lumière blanche utilisent des configurations optiques spéciales et des sources lumineuses de courte longueur de cohérence, qui optimisent l'interaction entre la lumière réfléchie par l'objet mesuré et le faisceau de référence.
La mesure elle-même est basée sur le principe de l'interféromètre de Michelson. La lumière est collimatée à partir de la source lumineuse et ensuite divisée en deux faisceaux : un faisceau objet et un faisceau de référence. Le faisceau objet est réfléchi par l'objet mesuré, et le faisceau de référence se reflète sur un miroir de référence. La lumière réfléchie à partir de chaque faisceau est captée et recombinée au niveau du diviseur de faisceau. Les faisceaux superposés sont ensuite mis en image par une caméra.
Etape d) : comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de reference représentative d'un liquide synovial de reference.
Chaque valeur de paramètre mesurée à l'étape c) doit être mise en perspective avec une valeur de référence correspondante, afin de pouvoir tirer une conclusion diagnostique sur la présence d'une maladie articulaire chez un mammifère et/ou sur le type de maladie articulaire présent et/ou pour évaluer la sévérité de ladite maladie articulaire.
Valeur de reference Au sens de l'invention, on entend par valeur de référence , une valeur d'un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques d'une ou plusieurs gouttes de LS, représentatives d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence.
Par liquide synovial de référence on entend, au sens de l'invention, un échantillon de LS issu d'un mammifère dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est connu.
Il pourra s'agir notamment d'échantillons de LS issus de mammifères ne présentant pas de maladies articulaires, ou au contraire présentant une maladie articulaire spécifique et dont le stade est connu.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, la valeur de référence est choisie parmi une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère non atteint par une maladie articulaire, et une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère

18 PCT/EP2017/080088 atteint par une maladie articulaire à un stade donné, notamment à un stade non inflammatoire.
Il est en effet difficile de se procurer des échantillons de liquide synovial issus d'individus sains. Ainsi, les échantillons de référence sont généralement des échantillons issus de mammifères dont le stade de la maladie est connu et caractérisé, par exemple dont le stade de la maladie est caractérisé comme étant non inflammatoire .
Il est entendu qu'un liquide synovial de référence sera issu d'un mammifère de la même espèce que le mammifère dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est testé. En particulier, pour diagnostiquer chez un être humain une maladie articulaire, le LS de référence sera issu d'un être humain.
Il est également entendu qu'un liquide synovial de référence sera issu d'un mammifère dont le statut ou le type ou le stade de sévérité vis-à-vis d'une maladie articulaire spécifique est connu, pour diagnostiquer ou déterminer le type ou évaluer la sévérité de ladite maladie articulaire. En particulier, pour diagnostiquer ou évaluer la sévérité de l'arthrose, le LS de référence sera issu d'un mammifère dont le statut vis-à-vis de l'arthrose est connu.
Il pourra être fait usage, dans certains cas, de plusieurs valeurs de référence.
Par exemple, pour évaluer la sévérité d'une arthrose chez un mammifère, la valeur d'un paramètre indicatif pourra être comparée à une première valeur de référence représentative d'un LS issu d'un mammifère atteint d'arthrose sévère, et à une seconde valeur de référence représentative d'un LS issu d'un mammifère atteint d'arthrose modérée.
Il est également entendu que pour chaque paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée, il sera affecté une valeur de référence dudit paramètre mesuré à partir d'un ou de plusieurs liquides synoviaux de référence.
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé, ladite valeur de référence est une valeur moyenne mesurée à partir de plusieurs échantillons de LS issus d'une pluralité
de mammifères dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est connu, en particulier issus de mammifères ne présentant pas de maladie articulaire, et en particulier de chiens ou d'êtres humains sains, c'est-à-dire non affectés par une maladie articulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation, la valeur de référence est une valeur dite seuil ou de cut-off , qui est déterminée à partir de valeurs déterminées à partir (i) d'échantillons de LS issus de mammifères atteints d'une maladie articulaire, et (ii) de

19 PCT/EP2017/080088 valeurs déterminées à partir d'échantillons de LS issus de mammifères sains, c'est-à-dire qui ne sont pas atteints par cette même maladie articulaire (LS témoins).
Une valeur moyenne de référence peut être définie, cette valeur seuil séparant sans ambiguïté les valeurs obtenues à partir d'échantillons de LS
témoins ne présentant pas de maladie articulaire, et ceux de mammifères présentant une maladie articulaire.
Dans ce mode de réalisation, un mammifère testé selon le procédé de l'invention sera considéré comme étant atteint d'une maladie articulaire lorsque la valeur du paramètre mesurée à partir de la goutte séchée de LS dudit mammifère est significativement différente de la valeur seuil de référence.
Différences significatives avec les valeurs de reference Les exemples 1 et 2 présentés dans la présente demande ont été réalisés à
partir d'échantillons de liquide synovial issus de chiens sains et de chiens présentant des signes de lésion du cartilage et divers degrés d'inflammation. L'exemple 3 est relatif à des échantillons de liquide synovial issus d'individus atteints d'arthrose.
L'exemple 4 est relatif à des échantillons de liquide synovial issus de lapins développant une arthrose induite chirurgicalement par transection chirurgicale du ligament croisé
antérieur.
Comme cela est connu par l'Homme du métier, les résultats mis en évidence sur ces échantillons s'appliquent également à des échantillons de LS issus d'autres espèces de mammifères, et sont donc applicables à d'autres espèces de mammifères.
Les caractéristiques morphologiques des gouttes de LS séchées ont été
observées sur des images en deux dimensions (2D), ainsi que sur des images en 3D prises par interférométrie à lumière blanche. Les résultats suivants ont été observés :
- la surface des gouttes est significativement plus grande dans le groupe des chiens malades (OA) que dans le groupe des chiens sains (figure 4A) ;
- la hauteur du bourrelet formé en périphérie de la goutte est significativement plus grande dans le groupe des chiens malades (H moyenne = 30.09 ium) que dans le groupe des chiens sains (H moyenne = 11.81 ium) (figure 4A) ;
- la valeur du profil Z (Z/X) de surface de la goutte est bien supérieure, dans le groupe des chiens malades, à la valeur de référence de ce profil de surface mesuré dans le groupe des chiens sains (figure 4B).

20 PCT/EP2017/080088 - dans le modèle lapin , la surface des gouttes est significativement plus grande dans le groupe des lapins présentant une OA à un stade inflammatoire (SI) que dans le groupe des lapins présentant une OA à un stade non inflammatoire (SNI) (figure 10A) ;
- de même, la hauteur des bourrelets est significativement plus grande lorsque le liquide synovial provient d'articulations à un stade inflammatoire (figure 10B) ;
- la valeur du profil Z (Z/X) de surface de la goutte est bien supérieure pour le liquide synovial provenant d'articulations à un stade inflammatoire (figure 10C).
Ainsi, les déductions suivantes peuvent donc être formulées :
= une valeur de surface de goutte supérieure à une valeur de référence de surface de goutte, représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
= une valeur de hauteur de bourrelet (H) supérieure à une valeur de référence de hauteur de bourrelet (HR), représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
= une valeur de profil (Z) de surface de goutte supérieure à une valeur de référence de profil (ZR) de surface de goutte, représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
= la valeur de surface de goutte, de hauteur de bourrelet et de profil de surface sont indicatives d'un stade inflammatoire de la maladie articulaire.
Etapes supplémentaires La spectroscopie Raman, ou spectrométrie Raman, est une méthode non destructive d'observation et de caractérisation de la composition moléculaire et de la structure externe d'un matériau, qui exploite le phénomène physique selon lequel un milieu modifie légèrement la fréquence de la lumière y circulant. Ce décalage en fréquence dit effet Raman correspond à un échange d'énergie entre le rayon lumineux et le milieu, et donne des informations sur la composition du milieu lui-même.

21 PCT/EP2017/080088 La spectroscopie Raman est mise en oeuvre en envoyant une lumière monochromatique sur un échantillon et en analysant la lumière diffusée. Les informations obtenues par la mesure et l'analyse de ce décalage permettent de définir certaines propriétés du milieu.
Ainsi, la spectroscopie Raman de la goutte séchée de LS fournit des informations sur la composition chimique et notamment sur la présence des protéines contenues dans ladite goutte.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou évaluer la sévérité de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite maladie, comprend de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
Comme indiqué dans les exemples, tous les spectres Raman des LS issus de chiens sains ne présentent que d'infimes différences, comme l'atteste le faible écart type.
Ainsi, un spectre Raman de référence peut notamment être une moyenne de plusieurs spectres Raman représentatifs de plusieurs échantillons de liquide synovial, issus de chiens sains.
Comme cela est présenté dans l'exemple 2, il a été constaté que la forme des bandes structurelles des protéines, ainsi que leurs intensités, varient significativement entre les spectres Raman d'échantillons LS de chiens sains, et ceux de chiens présentant une maladie articulaire.
En particulier, dans les spectres Raman d'échantillons de LS issus de chiens atteints d'une maladie articulaire :
- de nouvelles bandes apparaissent aux emplacements 970, 1248, 1575 cm-1 et à 1542 cm-1, attribuées respectivement à la fibrine et l'hémoglobine, résultant de l'inflammation de l'articulation (Virkler and Lednev, 2010) (Figure 5B).
- La région 910-990 cm-1 s'est révélée être drastiquement différente entre spectres sains et malades : alors que seule la bande de l'acide hyaluronique à
945 cm-1 est prédominante sur les spectres sains, des bandes à 960 cm-1 et 970 cm-1 apparaissent sur les spectres des sujets arthrosiques.

22 PCT/EP2017/080088 - La région 1020-1145 cm-1 est riche en information car contient les bandes correspondant à la phénylalanine (1031 cm-1), à l'acide hyaluronique (1046, 1102 et 1127 cm-1), à la chondroïtine 6-sulfate (C6S) (1062 cm-1) et au squelette des protéines (1081 cm-1).
- Finalement, la région 1220-1280 cm-1 des Amide III est la troisième à être notablement différente. (Figure 5C).
En conclusion, il s'avère que toutes les bandes liées au HA, au C6S et au squelette des protéines diminuent dans les échantillons de LS de chiens malades, tandis que l'on constate une augmentation des bandes de CH2/CH3 et des acides aminés, ainsi que du phosphate minéral osseux.
D'une manière générale, le spectre Raman des échantillons de LS de chiens malades est significativement différent de celui des échantillons de référence (figure 6).
Par ailleurs, et comme présenté dans l'exemple 3, la valeur de hauteur (H) des bourrelets des gouttes peut être corrélée à la présence de certaines bandes Raman des gouttes de LS, telles que les bandes 1448/1102; 1654/1102; et 1448/1317 cm-1' à la fois sur les échantillons de LS de chiens et d'êtres humains (voir tableau 4 et figure 8).
Applications du procédé selon l'invention Le procédé selon l'invention pour diagnostiquer et/ou déterminer le type et/ou évaluer la sévérité d'une maladie articulaire est notamment adapté pour les maladies articulaires suivantes : l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, ce procédé est adapté pour diagnostiquer et/ou déterminer le type et/ou évaluer la sévérité de l'arthrose.
La sévérité de la maladie articulaire pourra notamment être déterminée en fonction de 'scores' cliniques ou biologiques préalablement définis, notamment liés à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à
une synovite et/ou à un remodelage osseux.
Selon une mise en oeuvre de l'invention, la sévérité / le stade de la maladie articulaire correspond à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux.

23 PCT/EP2017/080088 La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Il, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte..
Selon une mise en oeuvre de ce procédé, aucune valeur de référence n'est utilisée puisque les deux valeurs comparées sont celles obtenues à partir d'échantillons de LS issus d'un même mammifère, mais à deux instants différents.
Selon une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'invention, une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence est utilisée en comparaison des valeurs obtenues à partir des échantillons de LS obtenus aux instants Io et Il.
Naturellement, dans ce procédé, il est également possible de comparer un grand nombre de valeurs d'un seul paramètre, obtenues à partir d'échantillons de LS
obtenus à des instants Io, Il, 12, 13 etc., et ainsi de suivre l'évolution de la maladie articulaire.
Selon une mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Io correspond à un instant où
le mammifère présentant une maladie articulaire n'est pas encore traité pour ladite maladie, et correspond en particulier à un état avant traitement .
Selon une autre mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Io correspond à un instant où le mammifère présentant une maladie articulaire débute un traitement contre ladite maladie.

24 PCT/EP2017/080088 Selon une mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Ii correspond à un instant où
le mammifère présentant une maladie articulaire suit un traitement contre ladite maladie, depuis au moins un jour, deux jours, trois jours, une semaine, deux semaines, trois semaines, un mois, deux mois, ou au moins trois mois.
Selon une autre mise en oeuvre de ce procédé, l'instant Ii correspond à un instant où le mammifère présentant une maladie articulaire a fini son traitement contre ladite maladie, et correspond en particulier à un état après traitement .
Ce procédé permet de suivre l'évolution d'une maladie, et ainsi de classifier la pathologie en plusieurs catégories telles que : maladie à évolution lente ou rapide, maladie dégénérative, etc.
Ce procédé permet également d'évaluer l'efficacité d'un traitement donné.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le début du traitement à Io.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, ce procédé pourra être complété par la mise en oeuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie, et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;

25 PCT/EP2017/080088 c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de .. référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Un tel procédé permettant de suivre l'évolution et/ou l'efficacité d'un traitement, correspond à ce que l'on peut appeler un 'test compagnon' qui permet d'adapter ou de changer un traitement, en fonction de la réponse spécifique d'un individu donné à ce traitement.
Dans ce procédé, la valeur de référence pourra en particulier être représentative du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Io avant le début du traitement.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le début du traitement à Io.
La valeur de référence pourra également être représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a) est sensiblement égale à la valeur de référence.
Il pourra également être utilisé deux valeurs de référence :
- une valeur de référence représentative du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Io avant le début du traitement ; et - une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.

26 PCT/EP2017/080088 Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a), se rapproche de la valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence tout en s'éloignant de la valeur Vo déterminée avant le début du traitement à lo.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, ce procédé pourra être complété par la mise en oeuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention se rapporte également à un procédé de criblage chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Dans ce procédé de criblage, la valeur de référence pourra en particulier être représentative du liquide synovial dudit mammifère non humain, obtenu à un instant Io avant le début de l'administration d'un composé candidat.

27 PCT/EP2017/080088 Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le début de l'administration à Io.
La valeur de référence pourra également être représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a) est sensiblement égale à la valeur de référence.
Il pourra également être utilisé deux valeurs de référence :
- une valeur de référence représentative du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Io avant le début de l'administration du composé candidat ; et - une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à
l'étape a), se rapproche de la valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence tout en s'éloignant de la valeur Vo déterminée avant le début de l'administration à Io.
Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, ce procédé pourra être complété par la mise en oeuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
En particulier, grâce à ce procédé de criblage in vivo, on pourra tester les composés à activité anti-arthrosique suivants : la chondroïtine sulfate, la glucosamine, la diacéréine, les insaponifiables d'avocat et de soja, et l'acide hyaluronique.

28 PCT/EP2017/080088 Naturellement, ce procédé est essentiellement destiné à tester de nouveaux composés dont l'activité anti-arthrosique n'a pas encore été démontrée.
Procédés de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère La présente invention concerne également un procédé de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :
= la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S) pour cette surface est obtenue, et/ou = la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est obtenue, et d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs suivantes:
= la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial ; et = la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
Comme cela est présenté dans l'exemple 2, sur les bases des résultats présentés dans le tableau 3 et la figure 9, une corrélation très nette (R2>70%) est observée entre la valeur (S) de surface des gouttes, et la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial ; plus la surface des gouttes augmente, plus la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial est faible.
Ainsi, une gamme de valeurs de surfaces de gouttes, comprenant des valeurs Si avec i = 1 à n, n étant au moins égal à 5, préférentiellement égal ou supérieur à 10, peut .. être indexée sur une gamme de concentration en acide hyaluronique, de la façon suivante :
Si correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci ;
S i+i correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci+i ;

29 PCT/EP2017/080088 Si correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci+2 S. correspond à une concentration en acide hyaluronique C.
Une telle gamme de valeurs sera aisément obtenue par un Homme du métier, en appliquant des techniques classiques de mesure de la concentration d'acide hyaluronique.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en acide hyaluronique, à partir de la valeur de la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Ainsi, par une simple mesure de la surface (S) d'une goutte séchée, il est possible de déterminer quel est le taux d'acide hyaluronique dans un échantillon de liquide synovial, sans recourir à des techniques d'analyses plus sophistiquées et coûteuses.
De même, comme cela est illustré dans le tableau 4 et la figure 8, une corrélation très nette (R2>85%) est observée entre la valeur (H) de hauteur des bourrelets, et la concentration en protéines dans le liquide synovial ; plus la hauteur du bourrelet augmente, plus la concentration en protéines dans ce liquide synovial est élevée.
Ainsi, une gamme de valeurs de hauteur des bourrelets, comprenant des valeurs Hi avec i = 1 à n, n étant au moins égal à 5, préférentiellement égal ou supérieur à 10, peut être indexée sur une gamme de concentration en protéines, de la façon suivante :
Hi correspond à une concentration en protéines Cpi ;
H 1+1 correspond à une concentration en protéines Cpi ;
Eli+2 correspond à une concentration en protéines Cpi Hi, correspond à une concentration en protéines Cp..
Une telle gamme de valeurs sera aisément obtenue par un Homme du métier, en appliquant des techniques classiques de détermination de la teneur en protéines.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en protéines, à
partir de la valeur de la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Ainsi, par une simple mesure de la hauteur (H) du bourrelet présent à la surface d'une goutte séchée, il est possible de déterminer quel est le taux de protéines dans un

30 PCT/EP2017/080088 échantillon de liquide synovial, sans recourir à des techniques d'analyses plus sophistiquées et coûteuses.
Les deux paramètres surface de goutte (S) et hauteur de bourrelet (H) pourront avantageusement être mesurés conjointement sur le même échantillon de liquide synovial, ce qui permettra de déterminer la concentration en acide hyaluronique et en protéines de ce liquide synovial.
L'Homme du métier pourra ainsi obtenir des informations sur le type de maladie articulaire, ou le stade de la maladie articulaire, en fonction des concentrations en acide hyaluronique et en protéines telles que déterminées selon le procédé de l'invention.
En particulier, si ces mesures sont réalisées sur des échantillons de liquide synovial prélevés à des différents moments dans le temps, il sera possible pour l'Homme du métier de déterminer l'évolution de la maladie chez un patient, en fonction de l'évolution dans le temps de la concentration en acide hyaluronique et en protéines dans le liquide synovial.
EXEMPLES
Les exemples présentés ci-dessous sont à but illustratifs et ne limitent en rien l'invention décrite dans la présente demande.

Echantillons de Liquide Synovial (LS) Les échantillons de LS sont prélevés in vivo sur des chiens sains et arthrosiques. Le protocole de prélèvement, en accord avec la législation de la Communauté
Européenne, a été validé par le Comité d'éthique (VetAgro Sup, saisine n 1187 pour les LS sains, n 1408 pour les LS pathologiques).
Les échantillons de LS ont été placés dans des eppendorfs hermétiques, sans additifs, puis stockés à -80 C jusqu'à leur utilisation.
Les échantillons de LS sains ont été obtenus par arthrocentèse (aiguille 20G, seringue 5m1) sur six chiens adultes de race Beagle, âgés de 2 à 3 ans, cliniquement et radio logiquement sains après sédation intramusculaire et préparation chirurgicale des articulations. Tous les échantillons étaient exempts de contamination sanguine et d'apparence (transparence, turbidité, viscosité, couleur) normale.

31 PCT/EP2017/080088 Les échantillons de LS pathologiques ont été prélevés stérilement en bloc opératoire sur des chiens de clients de la clinique du CHEV du campus vétérinaire de VetAgro Sup et nécessitant une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Les différentes articulations opérées présentaient des signes de lésions du cartilage et divers degrés d'inflammation évalués par les chirurgiens et notés sur chaque compte-rendu opératoire.
Le tableau 1 ci- dessous résume les caractéristiques des différents échantillons :
Tableau 1 LS Age Poids Deg Diagnostic clinique (mois) le,.
H1 34 10.6 (Sain) 112 35 8.8 (Sain) 112 34 9.8 (Sain) 114 35 11.5 (Sain) 115 34 11.0 (Sain) 116 11 12.8 (Sain) OA1 91 56.2 J Rupture des ligaments croisés 0A2 56 52.7 J Rupture des ligaments croisés 0A3 29 40.5 J Rupture des ligaments croisés 0A4 60 28 J Rupture des ligaments croisés 0A5 45 30 J Rupture des ligaments croisés 0A6 29 58.5 + Post TPLO sévère Dépôt de gouttes Après décongélation à température ambiante, 150 iil d'échantillon sont centrifugés à 3000 tr/min (soit 1000g) pendant 10 min, à 4 C. Le culot est séparé du surnageant. Des lames de verre sont préalablement dégraissées à l'alcool 70 .
Des gouttes de 8 iLt1 de surnageant sont ensuite déposées sur les lames puis laissées sécher à température ambiante semi-couvertes pendant une journée (Figure 1).
Observation des photos en 2D et 3D des gouttes séchées Un microscope standard équipé d'une caméra 2048 x 2048 pixels a été utilisé
pour photographier les gouttes séchées, avec un objectif 2,5X. Selon la taille des gouttes, plusieurs photos ont pu être nécessaires. Le logiciel 'Image J' a été utilisé
pour reconstruire des photos 2D grâce au module d'extension (plugin) `Mosaia' et pour mesurer la surface de chaque goutte.

32 PCT/EP2017/080088 Des topographies 3D ont été réalisées par interférométrie à lumière blanche (smartWLI-microscope, GBS mbH, Germany) en périphérie de chaque goutte (côté
droit) en mode vertical scanning interferometry (VSI) avec un objectif de Michelson.
Le logiciel d'analyse MountainsMap (DigitalSurf, France) a permis la reconstruction des cartes topographiques de taille 1.4 x 1.07 mm et l'enregistrement des données associées (X, Y, Z).
Des routines Matlab (The Mathworks, MA, USA, version R2013a) ont été
développées spécifiquement pour calculer les profils Z le long de chaque carte topographique.
DDRS (Drop Deposition RS) Les acquisitions spectrales ont été réalisées sur un microscope confocal Raman (LabRAM HR8000, Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d'Ascq, France). Quatre ROI
(Region of Interest) ont été sélectionnées avec un objectif 10X aux quatre points cardinaux de chaque goutte, de taille 20 x 60 um2, dans la zone périphérique où la pré-concentration des solutés est maximum, comme cela a pu être vérifié par interférométrie (Figure 2).
Avant toute acquisition, le système a été calibré en utilisant la raie à 520.7 cm-1 d'un échantillon de silicium de référence. Les acquisitions spectrales ont été
réalisées avec un objectif 50X, d'ouverture numérique 0.75 et une longueur d'onde du laser à
632.8 nm (HeNe, puissance à l'échantillon de 12 mW) donnant une taille de spot de 1 m.
La diffusion Raman était mesurée par un détecteur CCD (1024x 256 pixels refroidi par effet Peltier à -70 C). La résolution spectrale est inférieure à 1 cm-1 grâce à
l'utilisation d'un réseau 1800 traits/mm. La taille du trou confocal est ajustée à 200 um pour une résolution axiale de 2 um.
Dans chacune des ROI, six points ont été cartographiés, espacés chacun de 20 ium, dans la gamme spectrale de 800 à 1780 cm-1, avec un temps d'acquisition de 30 s et 3 accumulations. Les spectres ont été enregistrés avec le logiciel LabSpec6 (Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d'Ascq, France).
Prétraitement des résultats Raman Tous les spectres présentaient un haut rapport signal sur bruit. Tous ont été
prétraités dans Matlab (The Mathworks, MA, USA, version R2013a) par le

33 PCT/EP2017/080088 développement de routines utilisateurs pour éliminer la fluorescence et supprimer la ligne de base.
Pour la comparaison des signatures spectrales et l'identification des bandes Raman, le spectre moyen de chaque goutte de LS a été défini comme la moyenne des spectres moyens de chaque ROI.
La bande à 1002 cm-1 de la phénylalanine (dite respiration du cycle, ou ring breathing band) a été utilisée pour normaliser les intensités (Esmonde-White et al., 2009), cette bande n'étant pas sensible au changement de conformation des protéines.
Les fonctions Gauss et Lorentz ont servi à fitter les pics dans des bandes spécifiques. Classiquement en spectroscopie Raman, les ratios d'intensités de pics sont utilisés plutôt que les intensités elle-même pour détecter les différences entre échantillons (Nyman et al., 2011), les ratios associés aux pics fittés ont donc été
calculés.
Analyses statistiques Tous les tests statistiques ont été réalisés dans Matlab avec les outils Statistics and Machine Learning Toolbox . Des tests de Mann Whitney ont été
effectués sur tous les ratios calculés pour vérifier les différences statistiques entre les LS sains et arthrosiques. Le niveau de significativité a été un risque -a de 5% (p<0.05).
Des tests de corrélation de Pearson ont été réalisés sur ces mêmes ratios pour trouver s'il existe des corrélations entre les ratios et les caractérisations morphologiques des gouttes.
Des Analyses en Composantes Principales (ACP) ont également été réalisées sur ces ratios. L'ACP est une méthode statistique multivariée classiquement utilisée sur les données hyper spectrales pour réduire le grand nombre de variables contenu dans les spectres. Les Composantes Principales (PCs) sont calculées comme étant un nouvel ensemble de variables décorrélées, combinaisons linéaires des variables initiales corrélées, et expliquant le maximum de variance possible entre les données. Les diagrammes dits scatter plots , permettent une visualisation aisée des résultats de l'ACP, chaque spectre étant représenté par un point dans le système d'axe des PCs.
Exemple 1. Résultats obtenus par interférométrie à lumière blanche Les gouttes de LS ont été déposées sur des lames en verre standard et des images 2D des gouttes séchées ont été capturées (Figure 3).

34 PCT/EP2017/080088 La surface des gouttes était significativement plus grande (p=0.026) dans le groupe OA malade (n=6) avec une surface moyenne (écart-type) de 38.37 mm2 (4.80 mm2) que dans le groupe sain (n=6) avec une moyenne (écart-type) de 31.30 mm2 (2.85 mm2) (Figure 4).
Ces images prises au microscope ont révélé la présence d'un anneau noir entre la périphérique extérieur et le centre cristallin seulement visible sur les gouttes du groupe sain tandis qu'un bourrelet se voit distinctement sur les gouttes du groupe OA.
Les images 3D prises par interférométrie (Figure 3) ont confirmé que la hauteur du bourrelet en périphérie est significativement plus importante (p=0.002) dans le groupe OA (n=6) avec une hauteur moyenne (écart-type) de 30.09 ium (5.80 ,um), soit presque trois fois supérieure à celle du groupe sain (n=6) avec une hauteur moyenne (écart-type) de 11.81 ium (1.71,um) (Figure 4).
Exemple 2. Résultats obtenus par analyse du spectre Raman Aucune différence significative n'a été observée entre les différents spectres des LS sains comme en atteste le faible écart-type. La moyenne des 6 spectres des LS sains a ainsi été utilisée par la suite pour modéliser la signature spectrale des LS
sains (Figure 5A).
Les bandes Raman ont été identifiées et assignées à partir d'une étude bibliographique sur le liquide synovial, les protéines, les acides aminés, le sang et le sérum (Tableau 2).
Pour comparer les spectres sains et OA, les principales bandes ont été
identifiées, déconvoluées et les ratios afférents calculés. Ainsi, vingt et un pics ont été
sélectionnés, identifiés dans le Tableau 2, résultant dans le calcul de deux cent dix ratios (seulement la moitié de la matrice des ratios a été utilisée, considérant qu'il n'était pas nécessaire de calculer un ratio et son inverse).

35 PCT/EP2017/080088 Tableau 2. Bandes Raman des gouttes séchées de LS
Bande Molécule assignée Pics Raman Raman (cm-i) utilisés (n=21) 828 Tyrosine doublet 852 Tyrosine doublet 880 O(C-C) Tryptophan 896 Hyaluronic acid 945 Hyaluronic acicl 960 \'( P( Or phosphate bone 970 Fibrin or blood 1002 C-C aromatic ring or plicnylalaninc (breathing mode) 1031 O.((-H ) or phenylalanine 1046 Hyaluronic acid 1062 v( ( )S( )2-) or cliondroilin 6-su1 rate 1081 \'(C-C) or \'(C-O) or \'(C-N) protein and lipids 1102 Hyaluronie acid 1127 Hyaluronic acid 1172 Tyrosine 1207 Tyrosine, plicnylalaninc 1242 v( C-1\1), (')(N-E1) ()l'Amide Ill (il-shcet conrormation) 1248 Fibrin or Blood 1275 v(Ci-N), O(N-11) or Amide III (u-helix conliormation) 1317 CH2 CHt twist or proteins 1339 Tryptophan, CH2 CH 2 wag of prolcins 1363 Hente or blood 1448 (i(.2Ht in collagen 1542 Hente or blood 1554 Tryptophan 1575 Fibrin or blood 1586 Phenylitlaninc 1605 Plicnylalaninc 1615 Tyrosine 1654 v(C=0) stretching of Amide I (a-helix conformation) 1670 v(C=0) stretching of Amide I (f3-sheet conformation) Les assignements ont été réalisés à partir de la bibliographie sur le LS, les protéines, les acides aminés, l'acide hyaluronique, le sang et le sérum (Alkrad et al., 2003;
Bansil et al., 1978; Dingari et al., 2012; Ellis et al., 2009; Esmonde-White et al., 2008;
Mandair et al., 2006; Rygula et al., 2013; Tuma, 2005; Virkler and Lednev, 2010; Wei et al., 2008) Les bandes structurelles des protéines, comme les Amide III entre 1242 et 1275 cm-1 et les Amide I entre 1654 et 1670 cm-1 sont particulièrement reconnaissables, ainsi que les bandes des acides aminés comme la phénylalanine (mode breathing du cycle aromatique à 1002 cm-1) et la tyrosine (doublet à 828 et 850 cm-1). La teneur en protéine

36 PCT/EP2017/080088 peut également être identifiée par les différents modes de CH2CH3 à 1448 cm-1 (mode bending ), 1317 cm-1 (mode twisting ) et 1339 cm-1 (mode wagging ). La présence de l'acide hyaluronique (HA) est identifiable par la bande à 945 cm-1 et sa contribution dans la région 1020-1140 cm-1 (Esmonde-White et al., 2008).
La forme des bandes et leurs intensités varient significativement entre les spectres sains et OA, dans lesquels apparaissent de nouvelles bandes comme 970, 1248 et 1575 cm-1 et à 1542 cm-1 attribuées respectivement à la fibrine et l'hémoglobine, résultant de l'inflammation de l'articulation (Virkler and Lednev, 2010) (Figure 5B).
Plusieurs zones spectrales d'intérêt ont focalisé l'attention (Figure 5C). La région 910-990 cm-1 s'est révélée être drastiquement différente entre spectres sains et OA:
alors que seule la bande HA à 945 cm-1 est prédominante sur les spectres sains, des bandes à 960 cm-1 et 970 cm-1 apparaissent sur les spectres OA. La région 1020-1145 cm-1 est riche en information car contient des bandes de la phénylalanine (1031 cm-1), HA (1046, 1102 et 1127 cm-1), chondroïtine 6-sulfate (C6S) (1062 cm-1) et le squelette des protéines (1081 cm-1). Finalement, la région 1220-1280 cm-1 des Amide III est la troisième à être notablement différente.
Analyses statistiques univariées Des tests univariés de Mann Whitney ont été réalisés sur les deux cent dix ratios calculés pour comparer le groupe sain (n=6) et le groupe OA (n=6). Cent soixante-quatre d'entre eux se sont révélés être significativement différents.
L'analyse de ces ratios significativement différents permet de conclure que toutes les bandes liées au HA, au C6S
et au squelette des protéines diminuent tandis que l'on peut constater une augmentation des bandes de CH2/CH3 et des acides aminés, ainsi que du phosphate minéral osseux.
Régressions linéaires Des tests de corrélation de Pearson ont été menés sur les deux cent dix ratios pour trouver les corrélations pouvant exister entre les ratios et les caractérisations morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes).
Les tests ont montré que quatre ratios avaient une corrélation supérieure à
70%
(p<10-3) avec la surface des gouttes et dix-huit ratios avaient une corrélation supérieure 80% (p<10-4), dont 8 avec une corrélation supérieure à 85%, avec la hauteur des bourrelets.

37 PCT/EP2017/080088 Tous ces ratios faisaient partie des cent soixante-quatre ratios significativement différents entre groupes sain et OA (Tableaux 3 et 4).
Tableau 3. Liste des quatre ratios liés à l'acide hyaluronique, montrant un haut degré de corrélation avec la surface des gouttes : moyenne et écart-types des ratios, valeur p des tests de Mann-Whitney, tendance d'évolution, coefficients de corrélation avec la surface des gouttes.
Ratios Sain OA
Mann- Tendance Corrélation Whitney Surface Moyenne EC Moyenne EC p R2 (%) 1317/896 cm-1 3,00 H, 10 3,6S 0,00-1 71 77,3 1339/896 cin-1 2,74 0,06 3,65 0.2v 0 002 71 72,6 1317/945 cm-1 1,30 0.0/ 1,S6 0,26 0,002 71 70,8 1062/1046 cm' 0,88 0,06 1,05 0,05 0,002 71 71,8 La figure 9 présente de manière graphique cette corrélation très nette (R2>70%) entre la valeur de surface des gouttes et la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial ; plus la surface des gouttes augmente, plus la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial est faible.
Ainsi, une gamme de valeurs de surfaces de gouttes peut être indexée sur une gamme de concentration en acide hyaluronique.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en acide hyaluronique, à partir de la valeur de la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Une autre corrélation d'importance a été mise en évidence entre la hauteur (H) du bourrelet présent à la surface des gouttes, et le taux de protéines présent dans le LS
testé, comme cela est présenté dans le tableau 4 ci-dessous et la figure 8.
Tableau 4. Liste des huit ratios montrant un haut degré de corrélation avec la hauteur des bourrelets : moyenne et écart-types des ratios, valeur p des tests de Mann-Whitney, tendance d'évolution, coefficients de corrélation avec la hauteur des bourrelets.

38 PCT/EP2017/080088 Ratios Sain OA
Mann- Tendance Corrélation Whitney Hauteur Moyenne EC Moyenne EC p R2 (%) 1102/852 cnfl 0,92 0,06 0,42 0,07 0,002 88,3 1102/1002 cm-1 0,20 0,02 0,10 0,0/ 0,002 86,0 1102/1031 cm1 04 o 1)4 0,53 0- 0,002 90,5 1127/1102 cm-1 1,?S 00- 1,97 0 0,002 71 88,2 1172/1102 cm-1 0,3S 005 0,93 0 12 0 ,0 02 71 87,1 1448/1102 cm-1 25 1 0.21 6,04 0.2 0,002 71 86,6 1654/1102 cm-1 3,30 032 6,46 0 90 0,002 71 86,3 1448/1317 cm-1 137 0.03 1,70 () (r 0,007 71 88,6 La figure 8 présente de manière graphique cette corrélation très nette (R2>85%

chez le chien) entre la valeur de hauteur des bourrelets, et la concentration en protéines dans le liquide synovial ; plus la hauteur du bourrelet augmente, plus la concentration en protéines dans ce liquide synovial est élevée.
Ainsi, une gamme de valeurs de hauteur de bourrelet peut être indexée sur une gamme de concentration en protéines.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en protéines, à
partir de la valeur de la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Analyse statistique multivariée Afin d'évaluer les différences statistiques entre les spectres de LS sains et OA, une ACP a été effectuée en utilisant les deux cent dix ratios comme variables d'entrée. Les scatter plot des quatre premiers scores de PCA représentant 92,2% de la variance expliquée totale, ont montré que les groupes OA et sains sont distinctement séparés (Figure 6).
Exemple 3. Analyse de gouttes de liquide synovial humain Dans cette étude, les échantillons de LS humains ont été fournis prêts à
l'emploi par l'Hôpital Universitaire de Genève (HUG). Il s'agissait de LS
prélevés in vivo sur des patients de grades radiographiques 2 et 4. Ces échantillons ont été fournis avec un certain nombre de données patients (âge, IMC) et de biomarqueurs comme les dosages de la leptine, de l'interleukine-6 (IL6) ainsi que les scores WOMAC douleur et fonction.

39 PCT/EP2017/080088 Ces échantillons de LS ont été exploités comme présenté ci-dessus pour les échantillons de LS de chiens, à savoir dépôt de gouttes, images 2D et 3D des gouttes séchées et spectres Raman.
Analyses statistiques Tous les tests statistiques ont été réalisés dans Matlab avec les outils Statistics and Machine Learning Toolbox . Des tests de corrélation de Pearson ont été
réalisés sur tous les ratios pour rechercher l'existence de corrélations entre les deux cent dix ratios et (i) les biomarqueurs et (ii) les caractéristiques morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes).
Corrélation LS HUG / dosage IL6 Les tests de corrélation ont mis en évidence une corrélation linéaire supérieure à 50% entre trois ratios, tous liés à la chondroïtine 6-sulfate et le dosage en Interleukine-6 (Figure 7), pris sous forme de logio. Ces corrélations semblent très pertinentes puisqu'il est connu qu'il existe une relation entre chondroïtine 6-sulfate (un des glycosaminoglycanes de la matrice du cartilage) et l'Interleukine-6.
Corrélation LS HUG + CN / Hauteur Comme pour le chien, des tests de corrélation de Pearson ont été réalisés sur les deux cent dix ratios pour trouver les corrélations significatives entre les ratios et les caractéristiques morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes). Les tests ont notamment montré que les ratios fortement corrélés à
la hauteur des bourrelets chez l'humain, sont aussi très fortement corrélés chez le chien (Tableau 5) et qu'en outre les ratios sont très proches (Figure 8), rendant ces ratios très pertinents.
Tableau 5. Trois ratios montrent une corrélation supérieure à 70% (p<10-4) avec la hauteur des bourrelets des gouttes de LS humains. Ils sont aussi significativement corrélés avec les hauteurs des bourrelets des gouttes de LS de chiens.

40 PCT/EP2017/080088 Ratios Corrélation Hauteur R2 HUG(%) R2 Chiens(%) 1448/1102 cm-1 72,1 86,6 1654/1102 cm-1 73,9 86,3 1448/1317 cm-1 85,6 88,6 Exemple 4. Analyse de gouttes de liquide synovial de lapin Un modèle animal de l'arthrose induite chirurgicalement a été développé chez le lapin : ce modèle est désigné modèle de transection chirurgicale du ligament croisé
antérieur (ACLT) . Ce modèle est particulièrement approprié pour étudier les stades précoces de l'arthrose (Madry et al., 2016).
Deux groupes de lapins ont été étudiés :
- Un groupe 2 semaines après induction ACLT qui correspond au stade inflammatoire de la maladie, ci-après désigné Stade inflammatoire (SI) ;
- Un groupe 6 semaines après induction ACLT qui correspond à un stade non inflammatoire de l'arthrose, ci-après désigné Stade non inflammatoire (SNI) .
Dans chaque groupe, la moitié des individus a été traitée par injection d'acide hyaluronique dans l'articulation ; toutefois, aucune différence notable n'a été observée entre les lapins traités et non traités au regard des paramètres étudiés, ces différences ne sont donc pas présentées ici.
Le volume de liquide synovial prélevé est plus important dans le groupe SI que dans le groupe SNI, ceci étant dû à l'inflammation post-chirurgicale.
Les échantillons de tissus articulaires du groupe SI ne présentent pas encore de modifications macroscopiques visibles, typiques de l'arthrose. Au contraire les échantillons tissulaires du groupe SNI présentent des dégradations tissulaires caractéristiques de l'arthrose. Toutefois, dans le groupe SI, les propriétés viscoélastiques de l'articulation sont déjà affectées.
Le liquide synovial prélevé sur ces lapins a été étudié comme cela est présenté
dans le chapitre Matériel et Méthodes ci-dessus.
Le tableau 6 ci-dessous, ainsi que la figure 10, présentent les valeurs de surface des gouttes et de hauteur des bourrelets des liquides synoviaux identifiés.

41 PCT/EP2017/080088 Tableau 6. Valeurs moyennes et écart type de la surface et de la hauteur du bourrelet des gouttes de LS.
Surface Hauteur (mm) (mm2) Groupes C ô c SI (n=8) 38,07 2,70 27,55 1,52 SNI (n=9) 29,29 3,21 21,74 4,58 p-value 3.104 0,0037 Le liquide synovial issu de lapins SI présente des valeurs de surface de goutte et de hauteur de bourrelets nettement supérieures que le liquide synovial issu de lapins SNI, provenant d'articulations présentant des dégradations tissulaires typiques de l'arthrose mais où l'inflammation est atténuée.
Ainsi, les paramètres surface des gouttes et hauteur des bourrelets permettent de déterminer si la maladie est à un stade inflammatoire ou non inflammatoire.

42 PCT/EP2017/080088 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de la maladie, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur de référence est choisie parmi une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère non atteint par une maladie articulaire, et une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère atteint par une maladie articulaire à un stade donné, notamment à un stade non inflammatoire.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le procédé comprend de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape c) de mesure est réalisée par une méthode d'interférométrie à lumière blanche.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la maladie articulaire est l'arthrose.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le stade de la maladie articulaire correspond à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux.

7. Procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Il, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant Ii, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.

8. Procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;

c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.

9. Procédé de criblage chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.

10. Procédé de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :

.cndot. la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S) pour cette surface est obtenue, et/ou .cndot. la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est obtenue, et d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs suivantes:
.cndot. la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial ; et .cndot. la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.