CA2491043A1 - Method for preparing animal or human adult stem cells and therapeutic use thereof - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues p ar le procédé d'extraction proposé dans des applications thérapeutiques, dont l a thérapie génique et cellulaire.Le procédé de préparation selon l'invention consiste essentiellement en : l'extraction cellulaire, la dissociation mécanique, la dissociation enzymatique, le maintien des cellules obtenues da ns un milieu de culture spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules.The present invention relates to the field of tissue regeneration and repair by cell transplantation. More particularly, the present invention relates to a process for the preparation of adult stem cells which preserves the diversity and plasticity of these cells. The present invention also relates to the use of these stem cells obtained by the extraction process proposed in therapeutic applications, including gene and cell therapy. The preparation process according to the invention essentially consists of: cell extraction, mechanical dissociation, enzymatic dissociation, maintaining the cells obtained in a specific culture medium making it possible to preserve the diversity and the plasticity, said process excluding the cultivation of the cells.
Description
PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE CELLULES SOUCHES ADULTES
ANIMALES OU HUMAINES ET UTILISATION DESDITES CELLULES
SOUCHES EN THERAPIE.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la régénéra-tion et la réparation tissulaïre par transplantation cellulaire. Plus particulière-ment, la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique et cellulaire.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Pour des raisons anatomiques et biologiques, le sang et ses dérivés ont été les premières cellules transplantées. Les greffes de cellules hématopoïétiques ont connu ~un chemin semblable. Depuis une vingtaine d'années, le transfert de cellules neuronales foetales est étudié comme approche thérapeutique dans les pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et plus récemment dans la chorée de Huntington. Les résultats cliniques sont cohérents et montrent une nette amélioration. La limi-tation majeure de cette dernière approche est la source de cellules trans-plantées. En effet, le recours à des cellules neuronales foetales rend difficile la diffusion de ce type d'approches thérapeutiques. Les autogreffes de kératino-cytes constituent une solution thérapeutique dans les cas de brûlures graves.
Un avantage de ce système : la capacité des kératinocytes, principales cellules de l'épiderme, à être cultivées ex vivo. Dans le même ordre d'idée, des cartilages défectueux ont pu être reconstruits par des chondrocytes amplifiés en culture puis greffés sous arthroscopie. Des approches similaires encore très expérimentales sont aussi en cours pour des organes comme le pancréas et le foie.
Ces données, encore trop restreintes, démontrent le potentiel de la médecine régénératrice par thérapie cellulaire. Les limitations à PROCESS FOR THE PREPARATION OF ADULT STEM CELLS
ANIMALS OR HUMANS AND THE USE OF SAID CELLS
STRAINS IN THERAPY.
FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the field of regeneration tion and tissue repair by cell transplantation. More particularly ment, the present invention relates to a method for preparing cells adult strains that preserve the diversity and plasticity of these cells. The the present invention also relates to the use of these stem cells obtained by the extraction process proposed in therapeutic applications, including gene and cell therapy.
DESCRIPTION OF THE PRIOR ART
For anatomical and biological reasons, blood and its derivatives were the first cells transplanted. Cell transplants hematopoietic have experienced a similar path. For about twenty of years the transfer of fetal neural cells is studied as therapeutic approach in neurodegenerative pathologies such as Parkinson's disease and more recently in Huntington's disease. The clinical results are consistent and show marked improvement. The limit The major source of this latter approach is the source of trans-planted. Indeed, the use of fetal neural cells makes difficult the dissemination of this type of therapeutic approach. Keratin autografts cytes are a therapeutic solution in cases of severe burns.
An advantage of this system: the capacity of the main keratinocytes epidermis cells, to be cultured ex vivo. With the same idea, defective cartilage could be reconstructed by chondrocytes amplified in culture and then grafted under arthroscopy. Similar approaches still very experimental are also underway for organs like the pancreas and liver.
These data, still too limited, demonstrate the potential of regenerative medicine by cell therapy. Limitations on
2 l'extension de ces approches sont de plusieurs natures. Pour être capable de suppléer aux défaillances d'un tissu par thérapie cellulaire il faut disposer de sources cellulaires répondant aux caractéristiques suivantes - les cellules doivent être faciles à prélever ;
- elles doivent survivre aux sites d'injection ;
- elles doivent présenter une bonne capacité de proliféra-tion et de colonisation ;
- elles doivent être capables de se différencier pour obtenir un résultat fonctionnel.
II existe donc un besoin pour de nouveaux procédés permet-tant d'obtenir des cellules souches aptes à être utilisées, entre autres, dans le cadre de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellu-taire.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention propose un procédé de préparation cellulaire répondant au besoin mentionné précédemment. Plus particulière-ment, la présente invention vise un procédé de préparation cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité des cellules souches de vertébrés provenant préférablement d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ulté-rieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par trans-plantation dans un animal, tel un être humain.
L'invention vise de plus un milieu de culture défini, particuliè-rement utile lors de la mise en oeuvre du procédé de préparation cellulaire.
La présente invention vise aussi la préparation cellulaire ou les cellules souches obtenues par le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé de préparation proposé dans des applica-tions thérapeutiques, dont la thérapie génique ou cellulaire.
La présente invention vise aussi une composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de préparation de l'invention. 2 the extension of these approaches are of several natures. To be able to to compensate for the failures of a tissue by cell therapy it is necessary to have of cellular sources meeting the following characteristics - the cells must be easy to collect;
- they must survive the injection sites;
- they must have a good capacity for proliferation-tion and colonization;
- they must be able to differentiate in order to obtain a functional result.
There is therefore a need for new processes allowing both to obtain stem cells suitable for use, inter alia, in the framework of tissue regeneration and repair by cell transplantation to hush up.
SUMMARY OF THE INVENTION
The present invention provides a method of preparation cell responding to the need mentioned above. More particular-ment, the present invention relates to a cell preparation process capable of to preserve the diversity and plasticity of vertebrate stem cells preferably from a tissue biopsy for later use as part of tissue regeneration or repair by trans-planting in an animal, such as a human being.
The invention further relates to a defined culture medium, particularly particularly useful during the implementation of the cell preparation process.
The present invention also relates to cell preparation or stem cells obtained by the preparation process of the invention.
The present invention also relates to the use of these cells strains obtained by the preparation process proposed in applications therapeutic actions, including gene or cell therapy.
The present invention also relates to a cell composition comprising human or animal stem cells obtained according to the process for preparing the invention.
3 La présente invention porte également sur un procédé de préparation de cellules souches capables de réparer ou de régénérer in viv~
des tissus ou des organes d'un vertébré.
La présente invention porte aussi sur une méthode de traite-ment, caractérisée par l'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'invention chez un animal.
L'originalité de la présente invention porte sur le fait que, contrairement aux procédés de préparation cellulaire utilisés dans le domaine, le procédé de préparation de la présente invention permet - d'extraire les cellules dans des conditions définies sans protéine animale d'origine extractive, donc dans des conditions sûres du point de vue sanitaire ;
- de maintenir la viabilité cellulaire par l'utilisation de molécules anti-oxydantes et anti-apoptotiques ;
- de préserver la diversité cellulaire ;
- de maintenir le potentiel de plasticité cellulaire ;
- de maintenir le potentiel de différenciation ;
- d'améliorer l'implantation, la colonisation et la différencia-tion des cellules greffées ; et - de procéder à une transplantation des cellules sans avoir à passer par une étape d'expansion en culture in vitro.
Par exemple, dans le procédé de préparation cellulaire décrit dans l'article de Pouzet ef al. (2000. Circulation. 102 : 1112210-5), il n'y a pas d'extraction ou d'isolement cellulaire selon un procédé de digestion enzy-matique. Alternativement, le tissu musculaire est haché. De plus, il n'y a pas d'étape de préparation de cellules telle qu'entendue au sens de la présente invention. La conclusion de cette étude est d'ailleurs à l'effet qu'il ne serait pas possible de courtcircuiter la phase d'expansion en culture in vitro, la récupéra-tion fonctionnelle telle que discutée dans l'article de Pouzet et al.
dépendant plutôt du nombre de cellules. Selon le procédé de l'invention, le mode de préparation des cellules conduit avantageusement, sans expansion en culture 3 The present invention also relates to a method of preparation of stem cells capable of repairing or regenerating in viv ~
tissues or organs of a vertebrate.
The present invention also relates to a method of processing characterized by the implantation of autologous animal stem cells or heterologous obtained according to the method of the invention in an animal.
The originality of the present invention relates to the fact that, unlike the cell preparation processes used in the field, the preparation process of the present invention allows - extract the cells under defined conditions without animal protein of extractive origin, so in point-safe conditions health;
- maintain cell viability through the use of antioxidant and anti-apoptotic molecules;
- to preserve cellular diversity;
- to maintain the potential of cellular plasticity;
- maintain the potential for differentiation;
- improve implantation, colonization and differentiation-tion of transplanted cells; and - to transplant the cells without having to go through an expansion step in in vitro culture.
For example, in the cell preparation process described in the article by Pouzet ef al. (2000. Circulation. 102: 1112210-5), there is not extraction or cell isolation according to an enzy- digestion process matic. Alternatively, the muscle tissue is chopped. In addition, there is no cell preparation step as understood within the meaning of this invention. The conclusion of this study is, moreover, to the effect that it does not would not possible to short-circuit the expansion phase in in vitro culture, the récupéra-functional function as discussed in the article by Pouzet et al.
dependent rather the number of cells. According to the method of the invention, the mode of cell preparation conducted advantageously, without expansion in culture
4 in vitro, à une colonisation très importante ainsi qu'à une récupération fonc-tionnelle rapide de l'organe traité.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures 1 à 5 sont des microphotographies illustrant la mise en évidence de cellules de muscle greffées dans le coeur de brebis. Les cellules ont été obtenues par dissociation enzymatique d'une biopsie de muscle squelettique puis directement implantées, sans phase d'expansion en culture in vitro, dans le myocarde de la même brebis (greffe autologue). La présence de cellules de muscle squelettique est révélée à l'aide de l'anticorps MY32 qui reconnaît spécifiquement la chaîne lourde de myosine squelettique.
La Figure 1 illustre la détection de cellules de muscle squelet-tique greffées avec l'anticorps MY32 par la présence, à l'intérieur de la paroi du myocarde, de zones de greffes massives (2 à 9 mm de diamètre) ou de foyers discrets (barre d'échelle, 250 microns).
La Figure 2 illustre l'immmunodétection de cellules de muscle squelettique avec l'anticorps MY32. Dans la paroi du myocarde, les fibres marquées par l'anticorps MY32 sont généralement alignées avec le réseau de cardiomyocytes natifs. Certaines fibres sont intensément marquées alors que d'autres ne sont que faiblement marquées; les cardiomyocytes natifs ne sont pas marqués (Barre d'échelle, 500 microns).
La Figure 3 montre des cellules greffées se différenciant en fibres musculaires et formant des sarcomères organisés (Barre d'échelle, 25 microns).
La Figure 4 illustre la spécificité immunohistochimique de l'anticorps MY32.
Coin supérieur gauche : détection immunohistochimique avec l'anticorps MY32 dans le muscle squelettique de brebis. On note les fibres intensément marquées (« fast twitch ») (en brun foncé) et les fibres faiblement marquées (« slow twitch ») caractéristiques d'une biopsie musclulaire (barre d'échelle, 25 microns).
Coin supérieur droit : détection immunohistochimique avec l'anticorps MY32 dans le myocarde de brebis greffé avec des cellules n'ayant pas subi de mise en culture in vitro (barre d'échelle, 25 microns).
Coin inférieur gauche : témoin immunohistochimique négatif 4 in vitro, to a very important colonization as well as to a functional recovery rapid treatment of the organ treated.
DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figures 1 to 5 are photomicrographs illustrating the detection of muscle cells grafted into the heart of sheep. The cells were obtained by enzymatic dissociation of a biopsy of skeletal muscle then directly implanted, without expansion phase in in vitro culture, in the myocardium of the same sheep (autologous graft). The presence of skeletal muscle cells is revealed using antibody MY32 which specifically recognizes the skeletal myosin heavy chain.
Figure 1 illustrates the detection of skeletal muscle cells tick grafted with the MY32 antibody by the presence, inside the wall myocardium, massive graft areas (2 to 9 mm in diameter) or discrete foci (scale bar, 250 microns).
Figure 2 illustrates immunodetection of muscle cells skeletal with MY32 antibody. In the wall of the myocardium, the fibers marked by the MY32 antibody are generally aligned with the network of native cardiomyocytes. Some fibers are intensely marked while others are only weakly marked; native cardiomyocytes are not not marked (Scale bar, 500 microns).
Figure 3 shows grafted cells differentiating by muscle fibers and forming organized sarcomeres (Scale bar, 25 microns).
Figure 4 illustrates the immunohistochemical specificity of the MY32 antibody.
Upper left corner: immunohistochemical detection with the MY32 antibody in the skeletal muscle of sheep. We note the fibers intensely marked (“fast twitch”) (in dark brown) and the fibers weakly marked ("slow twitch") characteristic of a muscle biopsy (bar scale, 25 microns).
Upper right corner: immunohistochemical detection with the antibody MY32 in the myocardium of sheep grafted with cells having no not undergone in vitro culture (scale bar, 25 microns).
Lower left corner: negative immunohistochemical control
5 avec l'anticorps MY32 dans un coeur de brebis normal (barre d'échelle, 250 microns).
Coin inférieur droit : témoin immunohistochimique négatif avec l'anticorps MY32 dans un coeur de brebis injecté avec du milieu seul (barre d'échelle, 250 microns).
La Figure 5 illustre la co-détection de cellules de muscle squelettique greffées et de cardiomyocytes avec l'anticorps MY32 et un anti-corps dirigé contre la connexine-43, protéine spécifique aux « gap junctions ou jonctions communicantes (points rouges). Cet essai n'a pas démontré la présence de connexine-43 à l'intérieur des cellules greffés ou entre les cellules greffées et leur microenvironnement.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La présente invention porte donc sur la mise au point d'un procédé de préparation de cellules souches animales ou humaines qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules provenant préférablement d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation directe des cellules, sans expansion en culture in vitro, ainsi préparées chez un animal ou chez l'homme.
Ainsi, il est entendu que la préparation initiale provenant d'une biopsie tissulaire est hétérogène ; par exemple, celle provenant d'une biospie de muscle squelettique peut contenir des myoblastes, fibroblastes, adipo-cytes, cellules nerveuses périphériques, cellules endothéliales et cellules de muscle lisse, en plus des cellules souches pluripotentes.
i) Définitions Par « cellule souche », on entend les cellules qui ont à la fois la capacité de s'autorenouveler et la capacité de se différencier en différents types de précurseurs cellulaires. 5 with antibody MY32 in a normal sheep's heart (scale bar, 250 microns).
Lower right corner: negative immunohistochemical control with the MY32 antibody in a sheep's heart injected with medium alone (bar scale, 250 microns).
Figure 5 illustrates the co-detection of muscle cells skeletal grafted and cardiomyocytes with the antibody MY32 and an anti body directed against connexin-43, a protein specific to "gap junctions"
or communicating junctions (red dots). This trial did not demonstrate the Connexin-43 inside the transplanted cells or between transplanted cells and their microenvironment.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention therefore relates to the development of a process for preparing animal or human stem cells which preserves the diversity and plasticity of these cells from preferably a tissue biopsy for later use in the context of a tissue regeneration or repair by direct transplantation of cell without expansion in in vitro culture, thus prepared in an animal or in the man.
Thus, it is understood that the initial preparation from a tissue biopsy is heterogeneous; for example, that from a biospie of skeletal muscle may contain myoblasts, fibroblasts, adipo-cytes, peripheral nerve cells, endothelial cells and cells smooth muscle, in addition to pluripotent stem cells.
i) Definitions By "stem cell" is meant cells which have both the ability to renew itself and the ability to differentiate itself by different types of cell precursors.
6 Par « diversité des cellules souches », on entend les cellules souches qui sont classées en fonction de leur stade de développement et de leur origine tissulaire. Plus particulièrement, on entend une classification de cellules souches embryonnaires ou adultes en fonction de leur origine tissu-taire, par exemple, les cellules souches de la peau ou neuronales ou du muscle.
Par « plasticité des cellules souches », on entend la capacité
pour ces cellules de traverser les frontières de lignée, par exemple la capacité
des cellules hématopoïétiques à se différencier en hépatocytes.
Par « régénération tissulaire », on entend la capacité à refor-mer un tissu soit par activation des cellules progénitrices du tissu (par exemple tissu de la peau, du foie, du coeur, de l'os ou de tissus nerveux), soit par transplantation directe, sans expansion en culture in vitro, de ces cellules progénitrices. Plus particulièrement, il s'agit alors d'une néoformation tissu-taire.
Par « réparation tissulaire », on entend une opération qui permet de pallier un déficit sans avoir recours à un processus de régénéra-tion. La réparation tissulaire se traduit par un apport exogène de cellules qui peuvent être différentes des cellules du tissu receveur.
Par « transplantation cellulaire », on entend une opération qui se caractérise par un apport de cellules isolées. Cette transplantation peut être effectuée, par exemple, par injection directement, sans expansion en culture in vitro, dans le tissu ou dans la circulation afférente.
Par « animal », on entend tout organisme vivant qui peut étre sujet à une transplantation cellulaire, et ceci inclut les êtres vertébrés tels que notamment les êtres humains, les animaux domestiques et sauvages, notamment les oiseaux.
ü) Procédé de préparation de cellules souches Un premier aspect de la présente invention vise un procédé
de préparation de cellules souches humaines ou animales. Ce procédé
consiste essentiellement en les étapes suivantes a) l'extraction cellulaire ; 6 "Stem cell diversity" means cells strains which are classified according to their stage of development and their tissue origin. More specifically, we mean a classification of embryonic or adult stem cells depending on their tissue origin-shut up, for example, skin or neuronal stem cells or muscular.
“Plasticity of stem cells” means the capacity for these cells to cross the line boundaries for example the capacity hematopoietic cells to differentiate into hepatocytes.
By "tissue regeneration" is meant the ability to reform sea tissue either by activation of the tissue's progenitor cells (by example skin, liver, heart, bone or nervous tissue), is by direct transplantation, without expansion in in vitro culture, of these cell progenitor. More particularly, it is then a neoformation tissue-to hush up.
By "tissue repair" is meant an operation which allows to overcome a deficit without having to use a regenerative process tion. Tissue repair results in an exogenous supply of cells who may be different from the cells of the recipient tissue.
By "cell transplant" is meant an operation which is characterized by a contribution of isolated cells. This transplant can be performed, for example, by direct injection, without expansion in culture in vitro, in tissue or in the related circulation.
By "animal" is meant any living organism which may be subject to cell transplantation, and this includes vertebrate beings such as including humans, domestic and wild animals, especially birds.
ü) Process for the preparation of stem cells A first aspect of the present invention relates to a method preparation of human or animal stem cells. This process basically consists of the following steps a) cell extraction;
7 b) la dissociation mécanique ;
c) la dissociation enzymatique ; et le maintien des cellules dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules, c'est-à-dire une phase d'expansion en culture in vitro.
Plus précisément, l'extraction cellulaire est obtenue tout d'abord suite à une biopsie pour fournir un fragment tissulaire, tel un fragment de muscle, de foie ou de peau. Par exemple, une biopsie musculaire est réali-sée sous anesthésie locale suite à une incision ou encore à l'aiguille. Le fragment tissulaire ainsi obtenu est ensuite humidifié dans un milieu défini, tel le DME/202 en présence de facteurs protecteurs et de facteurs inhibant la différenciation cellulaire (Pinset et Montarras), (1994) Cell Biology : A
labora-tory Handbook. Academic Press).
Préférablement, le milieu défini est un milieu ci-après nommé
DPM (Diversity Protecting Medium) et comprend au moins - un milieu nutritif de base tamponné avec des tampons dépendants ou indépendants de la concentration en C02. Les milieux utilisés sont, dans la plupart des cas, constitués d'un mélange dans un rapport 1:1 de milieu de type DME et de type F12. Parmi ceux-ci on peut citer en exemple le mélange DME/ F12 et DME/MCDB 202;
- un facteur protecteur, tel D des anti-oxydants (acide ascorbique, N-acétyl cystéine) ' des anti-caspases (Dose : environ 0,1 mU à 10 mU) D des protecteurs du métabolisme (L-Carnitine) ~ des facteurs protecteurs des métaux (Transferrine) (Dose : environ 0,1 pg/ml à 100 pg/ml) - des hormones tels glucocorticoïdes, insuline, acide rétinoïque, hormone thyroïdienne, minéralocorticoïdes, IGF1 ou IGF2 aux doses physiologiques allant préférentiellement de 10-6 à 10-9 M.
- des facteurs inhibant la différenciation, tels les FGF (Fibrobiast Growth Factors). Parmi les facteurs de la famille FGF, trois facteurs sont particulièrement importants et jouent un ô
rôle similaire, soit FGF-2, FGF-6 et FGF-10. Chacun des facteurs de la famille FGF est employé à des concentrations allant préférentiellement de 0,1 à 100 pgiml.
D fEGF (Epidermal Growth Factor) (Dose : environ 0,1 Ng/ml à 100 pgiml) D le LIF (Leukemia Inhibitory Factor) (Dose : environ 0,1 pg/ml à 100 pg/ml) [fraction non cellulaire du sang après coagulation]
D le sérum est également un facteur inhibant la différenciation et peut étre utilisé à une concentration variant de 0 à 100 %.
Ce milieu DPM ainsi défini est utilisé lors du procédé de préparation cellulaire. L'absence de fluide animal dans le milieu défini, comme le sérum par exemple, permet de garantir une meilleure sécurité infectieuse contre des virus, prions, etc. et une meilleure reproductibilité du procédé de l'invention. Les prélèvements provenant de biopsies sont maintenus soit à
température ambiante, soit conservés, préférablement, entre 4 et 6°C
dans le DPM pendant une période n'excédant préférablement pas 48 heures. II est clair que la composition précise du DPM pourra varier en fonction du type de biopsie tissulaire.
Lors de l'étape b) du procédé, le fragment tissulaire maintenu dans le milieu DPM est d'abord émincé jusqu'à l'obtention d'un homogénat cellulaire. Ceci est préférablement fait à l'aide de ciseaux chirurgicaux stériles mais tout autre outil semblable peut être utilisé. Par la suite, l'extrait tissulaire homogène ou l'homogénat tissulaire est préférablement libéré d'une partie des érythrocytes et des adipocytes grâce à une étape de lavage et de centri-fugation par sédimentation douce de 1 à 10 g (Pinset et Montarras. 1994. Cell Biology : A Laboratory Handbook. Academic Press).
Ä l'étape c) du procédé, l'homogénat tissulaire obtenu à
l'étape b) est soumis à une digestion enzymatique pour optimiser la dissocia-tion cellulaire. Lors de cette étape du procédé de l'invention, des enzymes protéolytiques d'origine bactérienne, comme la collagènase et/ou la pronase, sont préférablement utilisées. Toutefois, pour des raisons de sécurité sani-taire, on peut envisager l'utilisation de trypsine produite par génie génétique ou de toute autre enzyme acceptable. Ces enzymes peuvent être utilisées seules ou en combinaison à des concentrations variant, préférablement, de 0,1 à 0,5%.
Ä titre d'exemple non limïtatif, on peut procéder comme suit, lors de la mise en oeuvre de l'étape c) du procédé
le culot de fragments tissulaires obtenu à l'étape b) est suspendu dans du milieu DPM additionné de collagénase à une concentration finale de 0,4 g par 100 ml. La digestion enzymatique allant de 5 à 20 minutes peut être répétée plusieurs fois. La température de la réaction enzymatique se i0 situe préférablement entre 20°C et 37°C avec agitation externe. La digestion enzymatique a lieu préférablement en plusieurs étapes, et ce, jusqu'à cinq étapes. Ä chaque étape, les fragments et les cellules sont séparés par centri-fugation ménagée à 10 g. Le culot de fragments est alors resuspendu dans le milieu DPM additionné d'enzymes protéolytiques puis soumis à une nouvelle étape de digestion. Les cellules présentes dans le surnageant sont récoltées par centrifugation à 200 g et resuspendues dans du milieu DPM. On aboutit ainsi à une suspension cellulaire qui additionne les cellules extraites des diffé-rentes étapes de digestion. La suspension cellulaire est ensuite filtrée sur filtre de nylon dont le diamètre des pores est préférablement d'environ 34 microns, pour éliminer les fragments tissulaires.
Ainsi, grâce au procédé de préparation de cellules souches selon la présente invention, il est possible, par exemple, de préparer de manière sûre et reproductible, sans expansion en culture in vitro, une suspen-sion cellulaire issue d'une biopsie musculaire qui maintient son potentiel de colonisation et de plasticité cellulaire. Par exemple, pour un gramme de tissu, il est possible de préparer de 1 x 106 à 2 x 106 cellules. L'efficacité des procé-dés pour le maintien de la diversité et de la plasticité cellulaire est évaluée par des tests in vivo et des tests ex vivo. Dans les premiers, les suspensions cellulaires obtenues sont réintroduites dans l'animal après un marquage. Ä
titre d'exemple une molécule fluorescente comme la Green Fluorescente Protein sera employée. Le marquage cellulaire permet de suivre le devenir des cellules injectées dans l'organisme, d'analyser leur participation aux diffé-rents tissus et la différenciation des cellules injectées. Dans les conditions où
l'on maintient la diversité et la plasticité, les cellules injectées participent à la néoformation de différents tissus comme le muscle squelettique et cardiaque, les vaisseaux, les tendons, le cartilage, l'os, le tissu hématopoïétique.
Cette 5 diversité et cette plasticité cellulaire est dépendante du site d'injection souli-gnant l'importance de l'environnement dans le devenir cellulaire.
Les tests ex vivo (en culture) permettent aussi de mesurer la diversité cellulaire et la plasticité cellulaire. Ceux-ci sont basés sur l'analyse clonale et sur la réponse à différents inducteurs de la différenciation. Parmi 10 ceux-ci on peut citer ~~ des facteurs de croissance comme l'insuline et les IGFs, les TGFs, les BMPs, le VEGF ;
~~ des hormones comme les dérivés de l'acide rétinoïque, les hormones thyroïdiennes, les glucocorticoïdes ;
r des facteurs de la matrice extracellulaire ;
~~ des vitamines et agents permettant la minéralisation ;
~~ les composants de la matrice extracellulaire.
L'identification cellulaire est faite par des analyses immuno-logiques à l'aide de coloration spécifique et d'anticorps spécifiques, qui permettent à la fois l'identification et la quantification et par l'analyse transcriptomique.
Les approches complémentaires in vivo et ex vivo permettent de mesurer la diversité et la plasticité cellulaire qualitativement et quantitati vement et d'ainsi valider les conditions permettant le maintien de la diversité
cellulaire et de la plasticité cellulaire.
Les cellules ainsi préparées sans expansion en culture in vitro sont une source de cellules adéquates pour la thérapie cellulaire et peuvent étre soit réimplantées directement dans un organisme, soit conservées pour réimplantation ultérieure.
Le procédé de la présente invention peut comprendre une étape additionnelle, soit une étape de congélation. Cette étape optionnelle du procédé offre les avantages suivants r conservation des prélèvements tissulaires ;
~~ dissociation entre la préparation de la biopsie et la réimplantation cellulaire ;
r caractérisation biologique et sanitaire avant le réimplanta-tion cellulaire.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit lors de cette étape de congélation 106 à 2 x 106 cellules provenant de 1 gramme de tissu sont mises en présence de milieu DPM additionné d'agents cryopréservatifs, tel le DMSO. Pour le DMSO, la concentration utilisée est préférablement de 10%.
Dans ces conditions, les cellules sont maintenues à 20°C pour une période de 10 minutes puis la température est amenée lentement, en quelques heures, à
moins 80°C. Finalement, les cellules sont transférées dans de l'azote liquide.
II est important de noter que ces conditions de conservation ont l'avantage de ne pas modifier les caractéristiques cellulaires.
Avant de procéder à la transplantation cellulaire dans le cadre des futures applications cliniques, il peut ëtre préférable de caractériser la suspension cellulaire obtenue par le procédé selon la présente invention.
Cette caractérisation peut étre entreprïse au niveau protéique grâce à
l'utilisation de marqueurs cellulaires tels que - P-Cam comme marqueur de cellule endothéliales ;
- N-Cam comme marqueur de cellule neuronales et musculaires;
- Actine de muscle lisse comme marqueur de cellules du muscle lisse ;
- GFAP comme marqueur de cellules gliales ;
- Myf5, Pax3, Pax7, C-met et M-cadhérine comme marqueurs de cellules musculaires ;
- Sca1+, C-Kit, CD45 et CD34 comme marqueurs de cellules souches.
Cette caractérisation peut également étre entreprise au niveau de la transcription par l'utilisation de biopuces contenant des oligo-nucléotides codant pour des gènes cellulaires (par exemple, facteurs de transcription spécifiques et facteurs de la machinerie du cycle cellulaire) permettant d'identifier les cellules de la suspension cellulaire.
Conformément à l'invention, lesdites cellules souches sont des cellules souches animales ou humaines choisies dans le groupe constitué
par des cellules souches progénitrices d'un tissu.
Egalement conformément à l'invention, le tissu est choisi dans le groupe constitué par la peau, le foie, le coeur, l'os et les tissus nerveux.
iii) Utilisations thérapeutiques Un deuxième aspect de la présente invention vise l'usage d'une suspension cellulaire ou de cellules souches obtenues par le procédé
de l'invention dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique, suite à une transplantation de ces cellules chez un étre humain, par exemple.
Plus particulièrement, la présente invention propose d'utiliser les cellules préparées par le procédé de l'invention dans le cadre d'une réparation etlou régénération tissulaire par transplantation cellulaire sans expansion en culture in vitro. Les cellules ainsi préparées seront également utilisées comme vecteurs en thérapie génique.
Par exemple, les cellules souches adultes obtenues par le procédé de préparation selon l'invention peuvent servir dans le cadre d'une réparation de tissu osseux. Dans le cas présent, il s'agit de transplanter directement, sans expansion en culture in vifro, les cellules sur un site de réparation osseuse. Dans ce micro-environnement particulier, les cellules ou certaines d'entre elles peuvent adopter le phénotype osseux et ainsi participer à la réparation du tissu endommagé.
Le procédé de préparation cellulaire de la présente invention peut également fournir une suspension de cellules souches adultes de mammifère pouvant être utilisée lors d'une restauration du potentiel hémato-poïétique. En effet, la capacité des cellules souches de biopsie musculaire à
coloniser la moelle osseuse de souris irradiées et à contribuer à toutes les lignées hématopoïétiques, oblige à considérer le potentiel réparateur des cellules de biopsie musculaire dans le cas, par exemple, de leucémies.
D'autre part, il est connu que les greffes de cellules muscu-laires cultivées, dans le muscle sont peu efficaces et caractérisées par une mort massive des cellules réimplantées dans les heures qui suivent leur injec-tion. II est par conséquent proposé que le procédé de préparation de cellules souches selon l'invention qui ne comporte pas de phase d'expansion en culture in vitro peut contribuer à la réparation du tissu musculaire. Les cellules contenues dans la suspension pourront répondre aux micro-environnements et ainsi restaurer des fonctions ou réparer le tissu musculaire.
En conséquence, l'invention a également pour objet l'utilisation des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies par thérapie cellulaire ou thérapie génique.
La présente invention a, en outre, pour objet, une cellule souche obtenue selon le procédé selon l'invention.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement comprenant une étape d'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé selon l'invention chez un animal ou chez l'homme.
La présente invention a également pour objet une composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé selon l'invention.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite composition, les cellules souches ont une capacité de colonisation et une capacité à permettre une récupération fonctionnelle.
EXEMPLE
L'exemple qui suit sert à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équi-valents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Exemple 1 : Réparation du tissu cardiague Introduction A la différence du muscle squelettique, le tissu cardiaque ne possède pas à l'état adulte de cellules souches capables de réparer ce tissu après une lésion. De ce fait, l'ischémie cardiaque est toujours accompagnée d'une insuffisance de contraction qui, si importante, conduit à l'insuffisance cardiaque. L'objectif de la thérapie cellulaire dans cette indication est de restaurer la fonction de contraction. Des expériences dans ce sens ont été
conduites chez l'Homme avec comme source de cellules, des cellules musculaires amplifiées en culture. Cette première démarche montre la faisa-bilité de l'approche, mais aussi, certaines limitations de la stratégie adoptée.
L'amplification d'un grand nombre de cellules musculaires dans des milieux comprenant des fluides anïmaux tel le sérum de veau foetal, et leur trans-plantation dans un tissu hétérotypique sont des opérations à la fois lourdes et non sans danger sanitaire potentiel (contaminants viraux, prions, etc.). La limitation essentielle de ce procédé réside dans le fait que les cellules ainsi injectées ont une plasticité restreinte qui ne donnent que des cellules muscu-laires squelettiques. Le procédé de préparation de cellules souches de la présente invention sans phase d'expansion en culture in vitro évite l'appauvrissement de la diversité cellulaire par la culture.
Description de la transplantation cardiaque chez la brebis Protocole anesthésigue : prémédication avec du midazolam, induction à l'aide d'étomidate, intubation trachéale et ventilation à pression positive avec de l'isoflurane dans 100% d'oxygène. La surveillance est assu-rée par électrocardioscopie, pression artérielle invasive, capnographie.
Analgésie postopératoire avec de la bupivacaïne (bloc intercostal lors de thoracotomie), morphine et de la flunixine méglumine.
Bioasie du muscle sguelettigue : Une biopsie du muscle squelettique (approximativement 10 g) est explantée stérilement à partir des biceps fémoraux gauches de chaque brebis. Le tissu ainsi prélevé est main tenu dans du DMEM (SIGMA) ou du DPM, tel que défini ci-dessus, à tempé-rature de la pièce jusqu'à digestion mécanique ou enzymatique. La plaie de l'animal est refermée de la façon habituelle. Les animaux récupèrent pendant environ trois heures, puis sont ré-anesthésiés lorsque les cellules sont prêtes à être réimplantées.
Extraction des cellules musculaires : Les expiants de muscle 5 squelettique sont pesés puis lavés dans du DMEM ou du DPM. Le tissu adipeux et fascia sont retirés et le muscle est émincé aux ciseaux jusqu'à
l'obtention d'un homogénat tissulaire. Les fragments de muscle sont ensuite sédimentés dans du DMEM ou du DPM à 300 rpm pendant 2 minutes puis débarrassés du surnageant.
10 Afin de libérer les cellules satellites, les fragments de muscle sont incubés à 37°C avec agitation dans 10 mL de DMEM ou de DPM addi-tionné de 0,4% (P/V) de collagénase (Type IA, SIGMA) brute. Après 20 minutes, les fragments sont centrifugés à 300 rpm pendant 2 minutes.
Le surnageant contenant les cellules isolées est conservé
15 dans du DMEM à 20 % (VN) de sérum de veau foetal ou du DPM. Le culot subit jusqu'à quatre digestions supplémentaires (Pinset, C. et Montarras, D.
Cell Systems for Ex-vivo Studies of Myogenesis : A Protocol for the Isolation of Stable muscle cell populations from newborn to adult mice dans Cell Biology : A Laboratory Handbook ; deuxième édition e. J. F. Celis, Academic Press ; 1998).
Les cellules extraites sont ensuite filtrées sur un filtre de nylon avec pores de 250 ~.m de diamètre (Polylabo SA). Les cellules ainsi prépa-rées ne subissent pas de phase d'expansion en culture in vitro.
Marcruage des cellules : Afin de marquer leurs noyaux, les cellules sont resuspendues dans 10 mL de DMEM sans sérum contenant 25 ~.g/mL de 4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI, SIGMA) pendant 10 minutes ou du DPM dans les mêmes conditions. Les cellules sont rincées quatre fois dans du DMEM ou du DPM afin d'enlever le DAPI. Les cellules mono-nucléées sont dénombrées avec une cellule de numération sous microscopie à fluorescence. La préparation cellulaire est ensuite resuspendue dans 1,2 mL
de DMEM ou de DPM sans sérum et conservée à 4°C jusqu'à l'implantation sans subir de phase d'expansion en culture in vitro.
Greffe cellulaire : Les brebis préalablement anesthésiées selon la méthode décrite ci-dessus sont placées en décubitus latéral droit pour une thoracotomie gauche sur le Sème espace intercostal. Après péri-cardiotomie et suspension du péricarde, les cellules dans du DMEM ou du DPM sont injectées (0,1 mL par site) à l'aide d'une seringue à insuline connectée à un épijet 27 G, sur 10 zones du ventricule gauche. Une carto-graphie des vaisseaux coronaires est établie pour repérer les sites d'injection dans le myocarde. Des points de sutures épicardiques de repérage sont réali-sés pour au moins deux injections. Le thorax est refermé de la manière habi-tuelle et les animaux récupèrent sous régime analgésique (morphine à 0,5 mg/kg IM BID, flunixine 1 mg/kg IM une fois) jusqu'au lendemain inclusive-ment.
Cultures cellulaires témoins : Afin de confirmer la présence de cellules précurseurs du muscle dans la préparation cellulaire, un échantillon de 100 p,L de la suspension cellulaire est ensemencé dans une boîte de culture contenant du DMEM ou du DPM avec sérum de veau foetal. Les cellules sont maintenues à titre de témoin dans une atmosphère à 5% de C02. Trois à sept jours suivant l'ensemencement, les cellules servent à une immunodétection du facteur de régulation spécifique MyoD (DAKO) telle que décrite par Montarras, D. et al. (Cultured MyfS Null and MyoD Null Muscle Precursor Cells Display Distinct Growth Defects. Biol Cell 2000 ;92 :565-72).
Résultats La procédure d'injection cellulaire n'a pas d'effet sérieux sur les animaux. Une arythmie ventriculaire survient lors de l'insertion de l'aiguille et lors de l'injection des cellules mais se résorbe lorsque l'aiguille est retirée.
Le dénombrement des cellules permet de déterminer l'injection de 1.7 +!- 0.3 x 10' cellules mononucléées marquées au DAPI.
L'expression de la chaîne lourde de la myosine squelettique (MY32) est détectée à 3 semaines post-implantation dans 8 animaux sur 8, ce qui confirme la survie cellulaire et l'expression myogénique des cellules implantées. De larges surfaces de greffon (de 2 à 9 mm de diamètre) ou de discrets foyers sont observés à l'intérieur de la paroi du myocarde (Figure 1 ).
Des cellules isolées sont aussi observées dans le tissu adipeux du péricarde.
Ä l'intérieur de la paroi du myocarde, les fibres positives pour l'expression de MY32 sont généralement alignées avec des cardiomyocytes natifs. Certaines de ces fibres sont fortement marquées à l'anticorps dirigé contre MY32, alors que d'autres ne sont que faiblement marquées (Figure 2). Ces fibres ne sont pas couplées électro-mécaniquement entre elles ou avec les cardiomyocytes natifs tel que démontré par immunohistochimie négative à la connexine-43.
Les cellules implantées développent des sarcomères organi-sés et présentent soit une morphologie allongée caractéristique de myotubes multinucléés fusionnés, soit une morphologie qui demeure mononucléée (Figure 3). Ces cellules du muscle squelettique possèdent des noyaux obser-vés en périphérie ou au centre. Une fibrose de remplacement et des régions présentant des cellules mononucléées de la réponse inflammatoire sont aussi observées.
Aucun marquage au DAPI n'est observé dans les coeurs explantés. Ceci peut être dû à une division cellulaire active entraînant une dilution du DAPI. En effet, dans les cultures cellulaires servant de témoins, le DAPI devient indétectable après 6 à 8 doublements de population cellulaire.
Les boîtes de culture servant de témoins sont observées quotidiennement. L'immunodétection du facteur de régulation spécifique du muscle squelettique MyoD montrent qu'approximativement 50% des cellules en culture sont des cellules précurseurs du muscle squelettique. Quand on permet aux cellules de fusionner, toutes les cellules montrent de nombreux myotubes une semaine suivant l'ensemencement.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détails ci-dessus et illustrés dans les dessins annexés, l'invention n'est pas limitée à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention. 7 b) mechanical dissociation;
c) enzymatic dissociation; and maintaining the cells in a specific medium allowing the preservation of the diversity and plasticity, said process excluding the cultivation of cell that is to say an expansion phase in in vitro culture.
More specifically, cell extraction is obtained while first after a biopsy to provide a tissue fragment, such as a fragment muscle, liver or skin. For example, a muscle biopsy is performed under local anesthesia following an incision or even with the needle. The tissue fragment thus obtained is then moistened in a defined medium, Phone DME / 202 in the presence of protective factors and factors inhibiting the cell differentiation (Pinset and Montarras), (1994) Cell Biology: A
labora-tory Handbook. Academic Press).
Preferably, the defined medium is a medium hereinafter named DPM (Diversity Protecting Medium) and includes at least - a basic nutrient medium buffered with buffers dependent or independent of the C02 concentration. The media used are, in most cases, made up of a mixture in a 1: 1 ratio of DME and F12 type medium. Among these we can cite as an example the mixture of DME / F12 and DME / MCDB 202;
- a protective factor, such D antioxidants (ascorbic acid, N-acetyl cysteine) ' anti-caspases (Dose: about 0.1 mU to 10 mU) D metabolism protectors (L-Carnitine) ~ protective factors for metals (Transferrin) (Dose: about 0.1 pg / ml to 100 pg / ml) - hormones such as glucocorticoids, insulin, acid retinoic, thyroid hormone, mineralocorticoids, IGF1 or IGF2 physiological doses preferably ranging from 10-6 to 10-9 M.
- factors inhibiting differentiation, such as FGF (Fibrobiast Growth Factors). Among the factors of the FGF family, three factors are particularly important and play a role a oh similar role, FGF-2, FGF-6 and FGF-10. Each of the family factors FGF is used in concentrations preferably ranging from 0.1 to 100 pgiml.
D fEGF (Epidermal Growth Factor) (Dose: approx.
0.1 Ng / ml at 100 pgiml) D the LIF (Leukemia Inhibitory Factor) (Dose: about 0.1 pg / ml to 100 pg / ml) [non-cellular fraction of blood after coagulation]
D serum is also a factor inhibiting differentiation and can be used at a concentration varying from 0 to 100%.
This DPM medium thus defined is used during the process of cell preparation. The absence of animal fluid in the defined environment, as serum for example, ensures better infectious safety against viruses, prions, etc. and better reproducibility of the the invention. Biopsy samples are maintained either at room temperature, preferably stored between 4 and 6 ° C
in the DPM for a period preferably not exceeding 48 hours. II is clear that the precise composition of the DPM may vary depending on the type of tissue biopsy.
During step b) of the method, the tissue fragment maintained in the medium DPM is first sliced until a homogenate is obtained cellular. This is preferably done using surgical scissors sterile but any other similar tool can be used. Subsequently, the extract tissue homogeneous or the tissue homogenate is preferably released from a part erythrocytes and adipocytes thanks to a washing and centering step fugation by gentle sedimentation of 1 to 10 g (Pinset and Montarras. 1994. Cell Biology: A Laboratory Handbook. Academic Press).
Ä step c) of the process, the tissue homogenate obtained at step b) is subjected to an enzymatic digestion to optimize the dissociation cell tion. During this stage of the process of the invention, enzymes proteolytics of bacterial origin, such as collagenase and / or pronase, are preferably used. However, for health and safety reasons shut up, we can consider the use of genetically produced trypsin genetic or any other acceptable enzyme. These enzymes can be used alone or in combination at concentrations varying, preferably, from 0.1 to 0.5%.
As a nonlimiting example, we can proceed as follows, during the implementation of step c) of the process the pellet of tissue fragments obtained in step b) is suspended in DPM medium supplemented with collagenase at a concentration final 0.4 g per 100 ml. Enzyme digestion ranging from 5 to 20 minutes can be repeated several times. The temperature of the enzymatic reaction is i0 preferably between 20 ° C and 37 ° C with agitation external. The digestion enzymatic takes place preferably in several stages, and this, up to five steps. At each stage, the fragments and the cells are separated by centri-fugation at 10 g. The pellet of fragments is then resuspended in the DPM medium supplemented with proteolytic enzymes then subjected to a new digestion stage. The cells present in the supernatant are harvested by centrifugation at 200 g and resuspended in DPM medium. We succeed thus to a cell suspension which adds the cells extracted from differ-annuity digestion stages. The cell suspension is then filtered through filtered nylon, the pore diameter of which is preferably around 34 microns, to remove tissue fragments.
So, thanks to the stem cell preparation process according to the present invention, it is possible, for example, to prepare safely and reproducibly, without expansion in in vitro culture, a suspen-cell sion from a muscle biopsy that maintains its potential for colonization and cellular plasticity. For example, for one gram of tissue, 1 x 106 to 2 x 106 cells can be prepared. The effectiveness of proce-dice for maintaining cell diversity and plasticity is assessed by in vivo tests and ex vivo tests. In the former, the suspensions cells obtained are reintroduced into the animal after labeling. AT
as an example a fluorescent molecule like Green Fluorescent Protein will be employed. Cell marking allows to follow the fate cells injected into the body, analyze their participation in differ-tissue and the differentiation of the injected cells. In the conditions or we maintain diversity and plasticity, the injected cells participate in the neoformation of different tissues such as skeletal and heart muscle, vessels, tendons, cartilage, bone, hematopoietic tissue.
This 5 diversity and this cellular plasticity is dependent on the injection site empha-recognizing the importance of the environment in cell development.
Ex vivo tests (in culture) also make it possible to measure the cell diversity and cell plasticity. These are based on analysis clonal and on the response to different inducers of differentiation. Among 10 these we can cite ~~ growth factors like insulin and IGFs, TGFs, BMPs, VEGF;
~~ hormones such as retinoic acid derivatives, thyroid hormones, glucocorticoids;
r factors of the extracellular matrix;
~~ vitamins and agents allowing mineralization;
~~ the components of the extracellular matrix.
Cell identification is done by immunoassays logic using specific staining and specific antibodies, which allow both identification and quantification and through analysis transcriptomics.
Complementary in vivo and ex vivo approaches allow to measure cell diversity and plasticity qualitatively and quantitati and thus validate the conditions allowing the maintenance of the diversity cell and cell plasticity.
Cells thus prepared without expansion in in vitro culture are an adequate source of cells for cell therapy and can either be reimplanted directly into an organism, or kept for subsequent relocation.
The method of the present invention may include a additional step, i.e. a freezing step. This optional step of process offers the following advantages r conservation of tissue samples;
~~ dissociation between the preparation of the biopsy and the cell reimplantation;
r biological and health characterization before the reimplantation cell tion.
As a nonlimiting example, we can proceed as follows during this freezing step 106 to 2 x 106 cells from 1 gram of tissue are in the presence of DPM medium supplemented with cryopreservative agents, such as DMSO. For DMSO, the concentration used is preferably 10%.
Under these conditions, the cells are maintained at 20 ° C. for a period of 10 minutes then the temperature is brought slowly, over a few hours, to minus 80 ° C. Finally, the cells are transferred to nitrogen liquid.
It is important to note that these storage conditions have the advantage of do not modify cellular characteristics.
Before proceeding with cell transplantation as part future clinical applications, it may be preferable to characterize the cell suspension obtained by the method according to the present invention.
This characterization can be undertaken at the protein level thanks to the use of cell markers such as - P-Cam as an endothelial cell marker;
- N-Cam as a neural cell marker and muscle;
- Smooth muscle actin as a marker for smooth muscle;
- GFAP as a marker for glial cells;
- Myf5, Pax3, Pax7, C-met and M-cadherin as muscle cell markers;
- Sca1 +, C-Kit, CD45 and CD34 as markers for stem cells.
This characterization can also be undertaken at level of transcription by the use of biochips containing oligo-nucleotides encoding cellular genes (e.g.
specific transcription and factors of the cell cycle machinery) to identify cells in the cell suspension.
According to the invention, said stem cells are animal or human stem cells chosen from the group made up by tissue progenitor stem cells.
Also in accordance with the invention, the fabric is chosen from the group consisting of skin, liver, heart, bone and tissue nervous.
iii) Therapeutic uses A second aspect of the present invention relates to the use a cell suspension or stem cells obtained by the process of the invention in therapeutic applications, including gene therapy, following a transplant of these cells in a human being, for example.
More particularly, the present invention proposes to use the cells prepared by the process of the invention as part of a repair and / or tissue regeneration by cell transplantation without expansion in culture in vitro. The cells thus prepared will also be used as vectors in gene therapy.
For example, adult stem cells obtained by the preparation process according to the invention can be used in the context of a repair of bone tissue. In this case, it involves transplanting directly, without expansion in in vifro culture, the cells on a site of bone repair. In this particular microenvironment, the cells or some of them can adopt the bone phenotype and so participate repair of damaged tissue.
The cell preparation process of the present invention can also provide a suspension of adult stem cells from mammal that can be used during restoration of the blood-brain potential poetics. Indeed, the capacity of muscle biopsy stem cells to colonize the bone marrow of irradiated mice and contribute to all hematopoietic lines, obliges to consider the repairing potential of muscle biopsy cells in, for example, leukemia.
On the other hand, it is known that muscle cell transplants cultivated areas in the muscle are ineffective and characterized by massive death of re-implanted cells within hours of injection tion. It is therefore proposed that the process for preparing cells strains according to the invention which do not include an expansion phase in in vitro culture can help repair muscle tissue. The cell contained in the suspension will be able to respond to micro-environments and thus restore functions or repair muscle tissue.
Consequently, the subject of the invention is also the use of human or animal stem cells obtained according to the process according to the invention, for the preparation of a medicament intended for treatment of diseases by cell therapy or gene therapy.
The present invention further relates to a cell strain obtained according to the process according to the invention.
The present invention also relates to a method of treatment including a step of implanting animal stem cells autologous or heterologous obtained according to the method according to the invention at an animal or in humans.
The present invention also relates to a composition cell comprising human or animal stem cells obtained according to the method according to the invention.
According to an advantageous embodiment of said composition, stem cells have a colonization capacity and a ability to allow functional recovery.
EXAMPLE
The following example illustrates the extent of use of the present invention and not to limit its scope. Modifications and variations can be carried out without escaping the spirit and scope of the invention. Although other methods or similar products can be used valid to those found below to test or carry out the present Invention, preferred equipment and methods are described.
Example 1: Repairing the cardiague tissue Introduction Unlike skeletal muscle, heart tissue does not does not have stem cells capable of repairing this tissue in adulthood after an injury. As a result, cardiac ischemia is always accompanied insufficient contraction which, if significant, leads to insufficient heart. The objective of cell therapy in this indication is to restore the contraction function. Experiments in this direction have been conducted in humans with cells as source amplified muscles in culture. This first step shows how bility of the approach, but also, certain limitations of the strategy adopted.
The amplification of a large number of muscle cells in environments including animal fluids such as fetal calf serum, and their trans-planting in a heterotypic tissue are both cumbersome operations and not without potential health hazard (viral contaminants, prions, etc.). The essential limitation of this process is that the cells so injected have limited plasticity which only gives muscle cells skeletal laires. The process for preparing stem cells from the present invention without expansion phase in in vitro culture avoids the impoverishment of cell diversity by culture.
Description of heart transplant in sheep Anesthetic protocol: premedication with midazolam, induction with etomidate, tracheal intubation and pressure ventilation positive with isoflurane in 100% oxygen. Surveillance is ensured electrocardioscopy, invasive blood pressure, capnography.
Postoperative analgesia with bupivacaine (intercostal block during thoracotomy), morphine and meglumine flunixin.
Bioassie of the siguelettigue muscle: A biopsy of the muscle skeletal (approximately 10 g) is explanted sterile from the left femoral biceps of each sheep. The tissue thus removed is hand held in DMEM (SIGMA) or DPM, as defined above, at temp erasure of the part until mechanical or enzymatic digestion. The plague of the animal is closed in the usual way. Animals recover during about three hours and then are re-anesthetized when the cells are ready to be relocated.
Extraction of muscle cells: The muscle explants 5 skeletons are weighed and then washed in DMEM or DPM. The fabric adipose and fascia are removed and the muscle is minced with scissors until obtaining a tissue homogenate. The muscle fragments are then sedimented in DMEM or DPM at 300 rpm for 2 minutes then cleared of the supernatant.
10 In order to release satellite cells, muscle fragments are incubated at 37 ° C with shaking in 10 mL of DMEM or DPM addi-0.4% (W / V) of crude collagenase (Type IA, SIGMA). After 20 minutes, the fragments are centrifuged at 300 rpm for 2 minutes.
The supernatant containing the isolated cells is kept 15 in 20% DMEM (VN) of fetal calf serum or DPM. The nerve undergoes up to four additional digestions (Pinset, C. and Montarras, D.
Cell Systems for Ex-vivo Studies of Myogenesis: A Protocol for the Isolation of Stable muscle cell populations from newborn to adult mice in Cell Biology: A Laboratory Handbook; second edition e. JF Celis, Academic Press; 1998).
The extracted cells are then filtered on a nylon filter with pores of 250 ~ .m in diameter (Polylabo SA). The cells thus prepared rees do not undergo an expansion phase in in vitro culture.
Marking of cells: In order to mark their nuclei, cells are resuspended in 10 mL of serum-free DMEM containing 25 ~ .g / mL of 4'-6-diamino-2-phenylindole (DAPI, SIGMA) for 10 minutes or of the DPM under the same conditions. Cells are rinsed four times in DMEM or DPM to remove the DAPI. Mono- cells nucleated are counted with a counting cell under microscopy fluorescence. The cell preparation is then resuspended in 1.2 mL
of DMEM or DPM without serum and stored at 4 ° C until implantation without undergoing an expansion phase in in vitro culture.
Cell transplant: The sheep previously anesthetized according to the method described above are placed in right lateral decubitus for a left thoracotomy on the 5th intercostal space. After peri-cardiotomy and suspension of the pericardium, cells in DMEM or DPM are injected (0.1 mL per site) using an insulin syringe connected to a 27 G epijet, in 10 areas of the left ventricle. A card spelling of coronary vessels is established to identify sites injection in the myocardium. Epicardial stitches for locating are reali-for at least two injections. The chest is closed in the usual way.
tuelle and the animals recover under analgesic diet (morphine at 0.5 mg / kg IM BID, flunixin 1 mg / kg IM once) overnight inclusive-is lying.
Control cell cultures: To confirm the presence of muscle precursor cells in cell preparation, a sample 100 p, L of the cell suspension is seeded in a box of culture containing DMEM or DPM with fetal calf serum. The cells are maintained as a control in an atmosphere at 5% of C02. Three to seven days after seeding, the cells are used for immunodetection of the specific regulatory factor MyoD (DAKO) such as described by Montarras, D. et al. (Cultured MyfS Null and MyoD Null Muscle Precursor Cells Display Distinct Growth Defects. Biol Cell 2000; 92: 565-72).
Results The cell injection procedure has no serious effect on animals. Ventricular arrhythmia occurs during insertion of needle and when the cells are injected but resolves when the needle is withdrawn.
The cell count makes it possible to determine the injection of 1.7 +! - 0.3 x 10 'mononuclear cells labeled with DAPI.
Skeletal myosin heavy chain expression (MY32) is detected at 3 weeks post-implantation in 8 animals out of 8, this which confirms cell survival and myogenic expression of cells implanted. Large graft surfaces (2 to 9 mm in diameter) or discrete foci are observed inside the wall of the myocardium (Figure 1 ).
Isolated cells are also found in the adipose tissue of the pericardium.
Inside the myocardial wall, fibers that are positive for expression of MY32 are usually aligned with native cardiomyocytes. Some of these fibers are strongly labeled with the antibody directed against MY32, then others are only weakly marked (Figure 2). These fibers are not electro-mechanically coupled to each other or to cardiomyocytes natives as demonstrated by Connexin-43 negative immunohistochemistry.
The implanted cells develop organic sarcomeres and have either an elongated morphology characteristic of myotubes multinucleated merged, a morphology that remains mononuclear (Figure 3). These skeletal muscle cells have observable nuclei ves in the periphery or in the center. Replacement fibrosis and regions exhibiting mononuclear cells of the inflammatory response are also observed.
No DAPI labeling is observed in the hearts explanted. This may be due to active cell division resulting in dilution of DAPI. Indeed, in cell cultures serving as controls, the DAPI becomes undetectable after 6 to 8 doubling of the cell population.
The culture dishes serving as controls are observed daily. Immunodetection of the specific regulatory factor for skeletal muscle MyoD show that approximately 50% of the cells in culture are skeletal muscle precursor cells. When we allows cells to merge, all cells show many myotubes one week after sowing.
Although preferred embodiments of the invention have been described in detail above and illustrated in the accompanying drawings, the invention is not limited to these embodiments alone and several changes and modifications can be made by someone from profession without departing from the scope or spirit of the invention.
Claims (9)
b) un facteur protecteur;
c) des hormones;
d) des facteurs inhibant la différenciation. 2 o) Method according to claim 1, characterized in that said specific culture medium comprises at least a) a nutritive medium;
b) a protective factor;
c) hormones;
d) factors inhibiting differentiation.
permettre une récupération fonctionnelle. 9 o) Composition according to claim 8, characterized in that that stem cells have a colonization ability and an ability to allow functional recovery.
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