BRPI0806365B1

BRPI0806365B1 - composto, uso do composto, composição farmacêutica e uso da composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0806365B1
Application number: BRPI0806365A
Authority: BR
Inventors: Johnson Francis; S Kovach John
Original assignee: Lixte Biotechnology Holdings Inc; Lixte Biotechnology Inc
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2008-02-06
Publication date: 2020-01-21
Also published as: BRPI0806365B8; WO2008097561A8; WO2008097561A1; JP5693850B2; AU2008214299A1; US20090036309A1; US9079917B2; EP2124550A1; JP2010518081A; BRPI0806365A2; EP2124550A4; CA2676422A1; EP2124550B1; US10023587B2; US20180370983A1; US8822461B2; CN101662939B; MX2009008347A; EA023804B1; US20130302402A1

Abstract

composto, composiçao farmacêutica, processo de preparação de um composto, método de controle de vegetação indesejada, método de inibição da atividade de fosfatase vegetal, uso do composto. a presente invenção fornece compostos que possuem a estrutura que pode ser utilizada para o tratamento de tumores.

Description

COMPOSTO, USO DO COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Ao longo do presente pedido, são indicadas algumas publicações. As citações completas dessas publicações podem ser encontradas imediatamente antes das reivindicações. Os relatórios descritivos dessas publicações são integralmente incorporados ao presente por meio de referência ao presente pedido, a fim de descrever mais completamente o estado da técnica a que se refere a presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Retinóides, metabólitos de vitamina A, foram examinados terapeuticamente contra uma série de tumores, incluindo gliomas (Yung et al (1996)). Co-repressor receptor nuclear (N-CoR) é intimamente associado ao receptor retinóide e liberado mediante ligação de ligantes ao receptor (Bastien et al (2004)). Evitando-se a ação de proteína fosfatase-l e proteína fosfatase-2A, as antifosfatases aumentam a forma fosforilada de N-CoR e promovem a sua translocalização citoplasmática subsequente (Hermanson et al (2002)).

O inibidor de fosfatase, Cantaridina, possui atividade antitumor contra cânceres humanos do fígado (hepatomas) e do trato gastrointestinal superior, mas é tóxico para o trato urinário (Wang, 198 9).

A publicação de um relatório dando conta que cantaridina age como um inibidor de fosfatase de proteínas despertou um interesse mais geral em compostos com este tipo de estrutura química (Li e Casida, 1992) . Descobriu-se anteriormente que o congênere mais simples e o seu produto de hidrólise (disponível comercialmente como o herbicida Endothal) são hepatotóxicos (Graziani e Casida, 1997). Estudos de ligação demonstraram que a ação de certos homólogos de cantaridina é direta sobre fosfatase-2A de

Petição 870190058207, de 24/06/2019, pág. 8/25

2/ΊΊ proteína e indireta sobre fosfatase-1 de proteína (Honkanen et al, 1993; Li et al, 1993) .

Dos congêneres conhecidos deste tipo de composto, apenas o original, cantaridina, e seu derivado . 5 bis(normetila) , norcantaridina, observaram qualquer uso como substância de droga anticancerígena e apenas norcantaridina é utilizada como agente antineoplástico (Tsauer et al, 1997).

Apesar destes sucessos, poucos compostos deste tipo foram selecionados pela atividade antitumorosa ou citotóxica.

Atualmente, existe uma necessidade significativa de desenvolvimento de inibidores de fosfatases de proteína que sejam mais ativas, menos tóxicas e apresentem ação mais específica que as substâncias conhecidas mencionadas acima.

RESUMO DA INVENÇÃO

Composto que possui a estrutura:

em que:

a ligação α está presente ou ausente;

Ri e R₂ são, independentemente entre si, H, O' ou

OR₉,' em que R₉ é H, alquila, alquenila, alquínila ou arila;

ou Ri e R₂ juntos são =O;

R₃ e R₄ são diferentes entre si e cada qual é OH,

O’, OR₉, SH, S' OU SR₉;

3/77

em que X é O, S, NR₁₀ ou N⁺R_loRio;

em que cada R₁₀ é independentemente alquila, alquila C₂-Ci₂ substituída, alquenila, alquenila C₄-Ci₂substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída em que o substituinte é diferente de cloro quando Ri e R₂ forem =O;

_ -CH₂CN,_ -CH₂CO₂Rh , -CH₂CORh, -NHRn ou -NH⁺ (Rn) ₂, -em que R_X1 é alquila, alquenila ou alquinila, cada uma das quais substituída ou não substituída, ou H;

R₅ e R₆ são, independentemente entre si, H, OH; ou R₅ e R₆, tomados em conjunto, são =O; e

R₇ e R₈ são, independentemente entre si, H, F, Cl, BR, SO₂Ph, CO₂CH₃ ou SRi₂, em que R_i2 é H, arila ou alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída;

ou um sal, enantiômero ou zwitterion do composto. Composto que possui a estrutura:

o

em que:

4/ΊΊ a ligação α está presente ou ausente;

R₉ está presente ou ausente e, quando presente, é

H, alquila, alquenila, alquinila ou fenila; e X é O, NRio ou NH⁺R₁₀, em que cada R_xo é . 5 independentemente H, alquila, alquila C₂-C_x2 substituída, alquenila, alquenila C₄-Ci₂ substituída, alquinila, alquinila substituída, arila ou arila substituída em que o substituinte é diferente de cloro;

-CH₂CN, -CH₂CO₂R₁₂ ou -CH₂COR₁₂, em que R₁₂ é H ou alquila;

qu um sal, zwitterion ou enantiômero^do composto.Composto que possui a estrutura:

B

À em que:

A e B são, independentemente entre si, H, F, Cl,

Br, SO₂Ph, CO₂CH₃, CN, COR₁₄ ou SR_i4 ;

em que R_i4 é H, arila ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída;

X é O, NH ou S;

Z é O, S, SRi5, NH, NR₁₅, CH₂OH ou CH₂ORi₅, em que R_X5 é arila ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída; e

Y e W são, independentemente entre si, CH₂, CHOH,

C=O ou C=S;

ou um sal do composto.

5/77

Α presente invenção contempla adicionalmente um método de controle de vegetação indesejada que compreende o contato da vegetação ou seu ambiente com uma quantidade eficaz como herbicida dos compostos conforme a presente invenção.

A presente invenção contempla ainda um método de inibição da atividade de fosfatase de plantas que compreende o contato da planta ou seu ambiente com uma quantidade eficaz como herbicida dos compostos conforme a presente invenção.

A presente invenção contempla ainda um método de prevenção ou tratamento de infecções fúngicas em pacientes, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz dos compostos conforme a presente invenção.

A presente invenção contempla ainda um método de tratamento’ de câncer em pacientes, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz dos compostos conforme a presente invenção. __ _ _ -__—

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: curva logarítmica de linhagem celular de glioma U373 tratada com Endothal (End), tioanidrido Endothal (ET), norcantaridina (nor-Can) ou Composto 100. O aumento das dosagens demonstra maior inibição do crescimento. Barras de erros indicam desvio padrão.

Figura 2: inibição da linhagem de células de glioma U373 tratadas com Endothal (End) ou Composto 100 ou cada qual com e sem ácido retinóico totalmente trans (ATRA) por sete dias. O tratamento individual com Endothal e Composto 100 exibe inibição modesta do crescimento. Combinação de End ou Composto 100 com ATRA exibe redução sinérgica do crescimento celular. Barras de erro indicam desvio padrão.

Figura 3: inibição do crescimento de linhagem de células de câncer renal, UMRC por tioanidrido de Endothal (ET), Endothal (End), ácido retinóico totalmente trans

6/ΊΊ (ATRA), Tricostatina A (TSA) e norcantaridina (nor-Can) por sete dias. As barras de erro indicam desvio padrão.

Figura 4: inibição do crescimento de linhagem de células de glioma U373 por tioanidrido Endothal (ET), . 5 Endothal (End), ácido retinóico’ totalmente trans (ATRA), tricostatina A (TSA) e norcantaridina (nor-Can) por sete dias. Tratamento individual com tioanidrido Endothal exibiu a maior inibição do crescimento. Barras de erro indicam desvio padrão.

Figura 5: inibição de crescimento de linhagem de células de câncer de mama, MCF-7 por meio de inibição de UMRC por tioanidrido Endothal (ET) , Endothal (End), ácido retinóico totalmente trans (ATRA), tricostatina A (TSA) e norcantaridina (nor-Can) por sete dias. Tratamento com doses

- 15 individuais' de' Endothal, ATRA e TSA exibiu inibição do crescimento. Barras de erro indicam desvio padrão.

Figura 6: curva logarítmica de linhagem^ de células

- ' “ de “ glibmã Ü373 tratada com 1-(3-exocarbóxi-7-oxabiciclo [2.2.1]heptano-2-exocarbonil)-4-etilpiperazina (Composto 105) 20 após três dias. O aumento das dosagens demonstra uma maior inibição do crescimento.

Figura 7: curva logarítmica de linhagem de células GBM humanas U373 tratada com 1-(3-exocarbóxi-7-oxabiciclo [2.2.1]heptano-2-exocarbonil)-4-etilpiperazina (Composto 105) 25 após sete dias. O aumento das dosagens demonstra maior inibição do crescimento.

Figura 8: inibição do crescimento de linhagem de células GBM humanas U373 tratada com Composto 105 por sete dias. O gráfico exibe a inibição do crescimento ao longo de 30 sete dias nas dosagens a seguir: 1, 2, 5, 10, 50 e 100 μΜ de composto 105, 10 μΜ de composto 100 e uma dosãgem controle.

Figura 9: inibição do crescimento da linhagem de células de glioma U373 pelo Composto 105 ao longo de sete dias .

Figura 10: inibição do crescimento da linhagem de células de glioma U373 pelo Composto 102 ao longo de sete dias.

Figura 11: inibição do crescimento da linhagem de células de glioma U373 pelo Composto 101 ao longo de sete dias.

Figura 12: inibição do crescimento da linhagem de células de glioma U373 pelo Composto 103 ao longo de sete 10 dias.

Figura 13: inibição do crescimento da linhagem de células de glioma U373 pelo Composto '104 ao longo de sete dias.

Figura 14: inibição do crescimento da linhagem de ₌ células- de - glioma* U373 ’pelo “Composto 106 ao longo de sete dias.

Figura 15: inibição do crescimento da linhagem de — - células^- de glioma “ U373 pelo Composto 100 ao longo de sete dias.

Figura 16: inibição do crescimento da linhagem de células de meduloblastoma DAOY pelo Composto 100 ao longo de sete dias.

Figura 17: efeito do composto 100 sobre o volume de tumor de xenoenxerto U87 ao longo de 26 dias.

Figura 18: efeito do composto 100 e do Composto 102 sobre o volume de tumor de xenoenxerto DAOY ao longo de 23 dias.

Figura 19A: representação gráfica e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição 30 de células MDA-MB-231 ao Composto 100 e Composto 102 utilizando um teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio

8/77 padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19B: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células HT-29 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19C: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células NCI-H460 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão-de amostras^_pélo“mends ’em três cópias.

Figura 19D: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição 'de' cêíuTás- NCI-H522 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19E: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células NCI-H69 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19F: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células GXF-209 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de

9/77 doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19G: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células HepG2 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio 10 padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19H: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células OVCAR-3 ao composto 100 e ao composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de 15 doxorubicina ‘que foi ^utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias. -----~ ~ “Figura Ϊ9Ι: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a 20 exposição de células PANC-1 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19J: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células DU-145 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também

0 são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19K: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a

10/77 exposição de células LNCAP ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio . 5 padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19L: representação gráfica (I) e adequação * de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células HL-60 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de 10 doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidos em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19M: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a 15 exposição de células^- K^L562 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também -- -‘são^- exibidos' êm ΐ. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

Figura 19N: representação gráfica (I) e adequação de curvas com valor IC₅₀ (II) de dados obtidos após a exposição de células MOLT-4 ao Composto 100 e ao Composto 102 utilizando o teste CellTiter-Glo. Os efeitos de 10 μΜ de doxorubicina que foi utilizada como controle positivo também são exibidas em I. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de amostras pelo menos em três cópias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Composto que possui a estrutura:

11/ΊΊ

em que a ligação α está presente ou ausente; R_x e R₂ são, independentemente entre si, H, O' ou OR₉, em que R₉ é H, alquila, alquenila, alquinila ou arila; ou Ri e R₂ juntos são 5 =0; R₃ e R₄ são diferentes entre si e cada qual é OH, 0‘, OR₉,

SH, S’, SR₉;

em que X é O, S, NRi₀ ou N⁺RiORio/ ^em que cada Rio é independentemente alquila, alquila C2-Ci₂ substituída, alquenila, alquenila C₄-C_X2 substituída, alquinila, alquinila substituída, arila ou arila substituída, em que o substituinte é diferente de cloro quando Ri e R₂ forem =O;

-CH₂CN, -CH₂CO₂Rh, -CH₂CORh, -NHR_u ou -NH⁺(Ru)₂, em que cada Rn é independentemente alquila, alquenila ou alquinila, cada uma das quais substituída ou não substituída, ou H;

12/77

R_s e R₆ são, independentemente entre si, H, OH ou R₅e R_s, tomados em conjunto, são =O; e R₇ e Rs são, independentemente entre si, H, F, Cl, Br, SO₂Ph, CO₂CH₃, CN, CORi₂ ou SRi₂, em que R₁₂ é H, arila ou alquila, alquenila ou 5 alquinila substituída ou não substituída ou urn sal, enantiômero ou zwitterion do composto.

Uma realização conforme a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura:

A presente invenção fornece ainda a composição do presente em que Ri e R₂ juntos são =O; R₃ é O' ou OR₉, em que R₉ é H, metila,._jeti.la--ou—fenila,-Rrérr^-* ~

em que X é O, S, NR₁₀ ou N⁺Ri_ORio;

em que cada Ri₀ é independentemente H, alquila, alquila C₂-Ci₂ substituída, alquenila, alquenila C₄-C_i2substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída em que o substituinte é diferente de cloro quando Ri e R₂ fõrem =0;

-CH₂CN, -CH₂CO₂Rh, -CH₂COR_11z -NHRii, -NH⁺(Rn)₂ em que Rn é alquila, alquenila ou alquinila, cada um dos quais substituída ou não substituída, ou Η;

-Rs e R₆, tomados em conjunto, são =O; e R₇ e Rs são, independentemente entre si, H, F, Cl, Br, SO₂Ph, CO₂CH₃, CN, COR_i2 ou SR₁₂, em que R_i2 é H ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída.

A presente invenção fornece ainda a composição do presente, em que R₃ é O'.

A presente invenção fornece ainda a composição do

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 104):

14/77

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 104E):

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 106) :

o

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 106E):

o

A presente invenção fornece adicionalmente composição do presente, em que R₄ é:

em que X é O, NRio ou N⁺RiqRioz que cada Rio é

15/77 independentemente H, alquila, alquila C₂-C_x2, alquenila, alquenila C₄-Ci₂ substituída, alquinila, alquinila substituída;

A presente invenção fornece adicionalmente composição do presente, em que R⁴ é:

RfO em que R₁₀ é H, alquila, . alquila C₂-C₁₂-substituída, alquenila, alquenila C₄-C_i2 substituída, alquinila, substituída, arila substituída em que o diferente de cloro quando. R_x .e R₂-forem alquinila substituinte é que Rn é presente,

-CH₂CN, -CH₂CO₂Rh, -CH₂C0Rh,

H ou alquila.

A presente invenção fornece em que R₄ é:

-NHRii ainda

OU NH⁺(R11)₂, a composição em do

N*---A presente invenção fornece ainda a composição do presente, em que R₄ é:

em que Rio é:

A presente invenção fornece ainda a composição do presente, em que R₄ é:

em que Rio é :

A presente'invenção fornece ainda composição. do presente.,- em que - R₄’ é :

N⁺---CHjCHj presente, presente, presente,

A presente invenção fornece em que R₄ é:

A presente em que R₅ e

A presente em que R₇ e

H.

ainda composição do invenção

R₆ juntos fornece são =O.

fornece ainda ainda composição invenção

R₈ são independentemente H.

composição do do

A presente invenção também fornece um composto que

17/77 possui a estrutura:

está presente ou ausente e, quando presente, é H, alquila Ci5 Cio, alquenila C₂-Ci₀ ou fenila; e X é O, S, NRio ou N⁺RiORio» ^emque cada Rxo é independentemente alquila, alquila C₂-C₁₂substituída, alquenila, alquenila C₄-Ci₂ substituída, alquinila, alquinila substituída, arila e arila substituída, em que o substituinte é diferente de cloro;

______________

- CH^CO^m^ -CH₂CORii-, - - CH₂CN ’ou ”-CH₂CH₂R₁₆, em que Rn é H ou alquila e em que R_Xg θ qualquer substituinte que é um precursor de um intermediário aziridinila ou um sal, enantíômero ou zwitterion do composto.

Em uma realização, a presente invenção fornece a estrutura:

em que a ligação α está presente ou ausente; X é O, S, NR₁₀ ou N⁺R1_OR1O, em que cada Rio é independentemente H, 20 alquila, alquila C₂-Ci₂ substituída, alquenila, alquenila C₄C_X2 substituída, alquinila, alquinila substituída, arila e

18/77 arila substituída, em que o substituinte é diferente de cloro;

-CH₂CO₂Rh, -CH₂CORh, -CH₂CN ou -CH₂CH₂R₁₆, em que Rn é H ou alquila e em que Ri₆ é qualquer substituinte que é um precursor de um intermediário aziridinila;

ou um sal, enantiômero ou zwitterion do composto.

A presente invenção fornece ainda uma realizaçao em que X é O ou NH⁺Ri₀, em que R₁₀ é H, alquila, alquila C₂-C₁₂substituída, alquenila, alquenila C4-Ci₂ substituída, alquinila, alquinila substituída, arila ou arila substituída, em que o substituinte é diferente de cloro; __

A presente invenção fornece ainda uma realização em que X é O.

A presente invenção fornece ainda uma realizaçao em que X é -CH₂CH₂Ri₆, em que Ri₆ é qualquer substituinte que é um precursor de um intermediário de aziridinila.

A presente invenção fornece ainda uma realização em que X é NH⁺R₁₀, em que Rio é H, alquila, alquila C₂-Ci₂substituída, alquenila, alquenila C₄-Ci₂ substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída em que o substituinte é diferente de cloro;

19/77

-CH₂CO₂Rh, -CH₂CORh, -CH₂CN ou -CH₂CH₂R₁₆, em que R_u é H ou alquila e em que Ri₆ é qualquer substituinte que é um precursor de um intermediário aziridinila.

A presente invenção fornece ainda uma realização em que Rio é metila.

A presente invenção fornece ainda uma realização em que Rio é:

A presente invenção fornece ainda uma realização em.. que_Ri_{0 =} é ~ ~

A presente invenção fornece ainda uma realização em que Rio é etila.

A presente invenção fornece ainda uma realização em que Rio é ausente.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece a estrutura:

O

ORg

N

O em que R₉ é presente ou ausente e, quando presente, é H, alquila, alquenila, alquinila ou fenila; e X é O, NRio ou N⁺R_loRio/ em que cada Rio é independentemente alquila, alquila- C₂-Ci₂ substituída, alquenila, alquenila C₄-Ci₂substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída em que o substituinte é diferente de cloro;

-CH₂CO₂Rh, -CH₂CORh ou -CH₂CN, em que Rn é H ou alquila;

ou um sal, zwitterion ou enantiômero do composto.

Em uma outra realização da presente invenção, Rio θ 10 ciclopropila.

Em uma outra realização, a presente invenção fornece a estrutura: _ . . _ _ _.. = = - = = = - - - ~ '

O _t em que X é O ou NH⁺Ri₀, em que R_x0 está presente ou ausente e, quando presente, é alquila, alquenila ou alquinila, cada uma das quais é substituída ou não substituída;

-CH₂CO₂Rn, -CH₂CORh ou -CH₂CN, em que Rn é H ou 20 alquila.

Em uma realização, a presente- invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 100) :

21/77 ο

ο

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 102):

o

o

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 101):

o

o

22/77

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 103):

o

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 105):

Em uma outra realização, a presente invenção fornece a estrutura:

o

o em que X é O, NRi₀ ou NH⁺Ri₀;

em que R₉ é alquila, alquenila, alquinila ou arila;

23/77 em que Ri₀ está presente ou ausente e, quando presente, é alquila, alquenila ou alquinila, cada uma das quais substituída ou não substituída;

-CH₂CO₂Rii, -CH₂CORh ou -CH₂CN, em que Rn é H ou alquila.

Em uma outra realização da presente invenção, R_Xo é ciclopropila.

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 111):

o

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui ’a estrutura (Composto,104E) :

o - ’ -

o

Em uma realização, a presente invenção fornece um

2Α/ΊΊ composto que possui a estrutura (Composto 10OE):

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 102E):

o

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 101E):

composto

Em uma realização, a presente invenção fornece um que possui a estrutura (Composto 103E):

o

composto

Em uma realização, a presente invenção fornece um que possui a estrutura (Composto 105E):

o

o

o

26/77

Em uma realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 111E):

A presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 106):

A presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 106E):

o

A presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 108):

A presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 107):

27/77

A presente invenção fornece um composto que possui a estrutura (Composto 107E) :

Em uma outra realização, a presente invenção fornece um composto que possui a estrutura:

em que A e B são, independentemente entre si, H, F, Cl, Br, SO₂Ph, CO₂CH₃, C0R_X4, SR_i4, em que R_i4 é H ou arila ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída; X é O, NH ou S; Z é O, S, SRi₅ , NH, NRi_S, CH₂OH, CH₂OR₁₅ em que Ri₅ é arila ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída; e Y e W são, independentemente entre si, CHOH CH₂, C=S ou C=O, ou um sal do composto.

Em uma realização da presente invenção, Y e W são, independentemente entre si, CH₂ ou C=S.

A presente invenção fornece ainda uma realização em que XéO; ZéS; eYeW são, independentemente, C=S.

A presente invenção fornece ainda uma realização em que A e B são independentemente F.

A presente invenção fornece ainda uma realização em

28/77 que A é H; e B é F.

em que A é F ou SRi₄, em que R_i4 é arila ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída; e B é F, Cl, Br, SO₂Ph, CO₂CH₃ ou SRi₄, em que R_i4é arila ou um alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída.

a presente invenção

Em uma realização adicional,

29/77

A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende os compostos conforme a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também fornece um processo de elaboração de um composto que compreende a reação de um composto que possui a estrutura:

O

com um composto que possui a estrutura:

para formar um composto que possui a estrutura a seguir:

reação de um composto que possui a estrutura acima com hidrogênio na presença de um catalisador para formar:

30/77

A presente invenção também fornece um processo de fabricação de um composto que compreende a reação de um composto que possui a estrutura:

com um composto que possui a estrutura:

para formar um composto que possui a estrutura a seguir:

A presente invenção também fornece um processo de fabricação de um composto que possui a estrutura:

31/77

Ο

que compreende :

-dissolução de um composto que possui a estrutura a seguir:

em benzeno e adição de um composto que possui a estrutura:

à temperatura ambiente para produzir um composto que possui a estrutura:

o

e recristalização do composto produzido a partir de um solvente quente.

A presente invenção também fornece um processo de fabricação de um composto que compreende:

-dissolução de um composto que possui a estrutura a seguir:

em estrutura:

benzeno e adição de um composto que possui a

HN temperatura ambiente para produzir um composto que possui a estrutura:

recristalização do um solvente quente.

Em uma realização, (DMF) ou etanol.

composto produzido a partir de o solvente é dimetilformamida

A presente invenção : de um paciente que sofre de um que compreende a administração fornece um método de tratamento compostos conforme a combinação tumor que sobre-expressa N-CoR ao paciente de um ou mais dos invenção, isoladamente ou com um ou um ou mais cada caso paciente.

presente mais ligantes receptores de histona desacetilase, ligantes quantidade eficaz para em uma

Em uma realização, o composto é em retinoides ou ambos, tratamento s e1ec ionado ou em do partir do Composto

100 e do Composto 105.

No método conforme a presente invenção, o ligante

33/77 histona desacetilase pode ser um inibidor, tal como o inibidor histona desacetilase de HDAC-3 (histona. desacetilase-3) . O ligante histona desacetilase pode também ser selecionado a partir do grupo que consiste de 2-amino-8oxo-9,10-epoxidecanoíla, 3-(4-aroil-lH-pirrol-2-il)-Nhidróxi-2-propenamida, Composto APHA 8, apicidina, butirato de arginina, ácido butírico, depsipeptídeo, depudecina, HDAC3, bis-hidroxamida de ácido m-carboxicinâmico, N-(2aminofenil)-4-[N-(piridin-3ilmetoxicarbonil)aminometil]benzamida, MS 275, oxanfiatin, butirato de fenila, piroxamida, escriptaid, sirtinol, butirato de sódio, ácido subérico bis-hidroxâmico, ácido suberoilanilido hidroxâmico, tricostatina A, trapoxin A, trapoxin B e ácido valpróico. _

Os compostos conforme a presente invenção podem ser utilizados em combinação com compostos que inibem a enzima histona desacetilase (HDAC). Essas enzimas HDAC modificam por meio de pós-tradução histonas (Patente Norte-Americana Publicada n° 2004/0197888, Armour et al). Histonas são grupos de proteínas que se associam com DNA em células eucarióticas para formar estruturas compactadas denominadas cromatina. Esta compactação permite a localização de uma enorme quantidade de DNA no interior do núcleo de uma célula eucariótica, mas a estrutura compacta de cromatina restringe o acesso de fatores de transcrição ao DNA. A acetilação das histonas reduz a compactação da cromatina, o que permite que fatores de transcrição unam-se ao DNA. Desacetilação, catalisada por histona desacetilases (HDACs), aumenta a compactação de cromatina, de forma a reduzir a acessibilidade do fator de transcrição a DNA. Inibidores de histona desacetilases evitam, portanto, a compactação' de cromatina, permitindo que fatores de transcrição unam-se a DNA e aumentem a expressão dos genes.

34/77

Nos métodos conforme a presente invenção, uma determinação do percentual de células com N-CoR no citoplasma com relação ao percentual de células com N-CoR no núcleo é representativo da razão entre a quantidade de células não diferenciadas e a quantidade de células menos diferenciadas em um dado tecido.

No método conforme a presente invenção, os tumores que sobre-expressam N-CoR podem incluir glioblastoma multiforme, câncer de mama, câncer colo-retal, câncer do pulmão de células pequenas ou câncer do ovário.

A presente invenção também fornece um método de inibição do crescimento de um tumor que sobre-expressa N-CoR em pacientes, que compreende a administração ao paciente de um ou mais dos compostos conforme a presente invenção^ isoladamente ou em combinação com um ou mais ligantes receptores de retinóide, um ou mais ligantes de histona desacetilase ou ambos e, em cada caso, em quantidades eficazes para afetar N-CoR, de forma a induzir, com isso, a diferenciação de células do N-CoR que sobre-expressa tumores e inibir o crescimento do tumor no paciente.

Em uma realização, o composto é selecionado a partir do Composto 100 e do Composto 102.

Nos métodos conforme a presente invenção, uma determinação do percentual de células com N-CoR no citoplasma com relação ao percentual de células com N-CoR no núcleo é representativa da razão entre a quantidade de células mais diferenciadas e a razão de células menos diferenciadas em um dado tecido.

No método conforme a presente invenção, tumores que sobre-expressam N-CoR podem incluir glioblastoma multiforme, câncer de mama, câncer colo-retal, câncer do pulmão de células pequenas ou câncer do ovário.

A presente invenção contempla ainda um método de

35/77 controle de vegetação indesejada que compreende o contato da vegetação ou seu ambiente com uma quantidade eficaz como herbicida dos compostos conforme a presente invenção.

A presente invenção contempla ainda um método de prevenção ou tratamento de infecções fúngicas em um paciente 10 que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz dos compostos conforme a presente invenção.

A presente invenção contempla ainda um método de tratamento de câncer em pacientes que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz dos 15 compostos conforme a presente invenção.

A presente invenção contempla ainda um método de tratamento de pacientes que sofrem de câncer de mama, câncer do cólon, câncer do pulmão de células grandes, adenocarcinoma do pulmão, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do 20 estômago, câncer do fígado, adenocarcinoma do ovário, carcinoma do pâncreas, carcinoma da próstata, leucemia promilocítica, leucemia mielocítica crônica ou leucemia linfocítica aguda que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos 25 conforme a presente invenção, de forma a tratar o paciente.

A presente invenção contempla ainda o uso de pródrogas que são convertidas in vivo nos compostos conforme a presente invenção (vide, por exemplo, R. B. Silverman, 1992, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, 30 Academic Press, Capítulo 8, cujo conteúdo integral é incorporado ao presente como referência) . ' Essas pró-drogàs podem ser utilizadas para alterar a biodistribuição (tal como para permitir compostos que tipicamente não entrariam em um

36/77 local reativo) ou a farmacocinética do composto.

Em uma realização da presente invenção, o composto possui a estrutura:

da

Em uma realização presente invenção, o composto possui a estrutura:

Da um composto positivas e

R?

CO₂

Re no-presente forma utilizada zwitterion indica que é eletricamente negativas’ formais neutro, sobre mas conduz cargas átomos diferentes.

Zwitterions são polares, possuem alta solubilidade em água e possuem baixa solubilidade na maior parte dos solventes orgânicos.

o grupo funcional aziridina que é um heterociclo

Aziridinas são compostos orgânicos que compartilham com três membros com um grupo amina e dois grupos metileno.

Precursores de intermediários aziridinila incluem compostos conhecidos dos técnicos no assunto que fornecem rapidamente intermediários de arizidinila sob condições apropriadas.

Os compostos descritos na presente invenção encontram-se em forma racêmica ou como enantiômeros individuais.

Os enantiômeros podem ser separados utilizando métodos conhecidos, tais como os descritos, por exemplo, em

Pure and Applied Chemistry 69, 1469-1474 (1997), IUPAC.

Da forma utilizada no presente, sobre-expressão de

37/77

N-CoR indica que o nível de correpressor receptor nuclear (N-CoR) expresso nas células do tecido testado é elevado em comparação com os níveis de N-CoR conforme medido em células saudáveis normais do mesmo tipo de tecido sob condições 5 análogas. O correpressor receptor nuclear (N-CoR) conforme a presente invenção pode ser qualquer molécula que se una ao domínio de ligação de ligantes do receptor de hormônio da tireóide unido por DNA (T₃R) e receptor de ácido retinóico (RAR) (Patente Norte-Americana n° 6.949.624, Liu et al) .

Exemplos de tumores que sobre-expressam N-CoR podem incluir glioblastoma multiforme, câncer de mama (Myers et al) , câncer colo-retal (Giannini e Cavallini), carcinoma do pulmão de células pequenas (Waters et al) ou câncer do ovário (Havrilesky et al).

-15 “ “Solvente’, da forma utilizada no presente, destina-se a incluir compostos tais como hexanos, benzeno, tolueno, dietil éter, clorofórmio, cloreto de metileno, acetato de etila, 1,4-dioxano, água, THF, acetona, acetonitrila, DMF, DMSO, ácido acético, n-butanol, isopropanol, n-propanol, etanol, metanol, ácido fórmico, tetracloreto de carbono,· benzenotiol, clorobenzeno, ciclohexanotiol, 1-dietilaminoetanol, dicloreto de etileno, etileno glicol, xileno, 1,1,2,2-tetracloroetano, fenol, ácido acético, 1-butanol, 2-butanol, 2-butanona, diglima, dimeti1 25 éter, dioxano, éter de petróleo, (NMP) N-metil-2pirrolidinona, heptano, glicerina, HMPA (hexametilfósforo triamida), MTBE (metil t-butil éter), nitrometano, piridina, 1-propanol, 2-propanol e trietilamina.

Certas realizações dos compostos descritos podem conter um grupo funcional básico, tal como amino ou alquilamino, e são, portanto, capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com ácidos farmaceuticamente aceitáveis ou conter um grupo funcional ácido e são,

38/77 portanto, capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis

com bases	. Os compostos	do	presente	podem	apresentar-	se,
portanto,	em uma	forma	de	sal	Da	forma	utilizada	no
presente,	um sal	é um	sal	dos	compostos do presente	que

tenha sido modificado por meio da elaboração de sais de ácidos ou bases dos compostos. O sal pode ser farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitar-se a sais de ácidos orgânicos ou minerais de resíduos básicos, 10 tais como aminas; sais álcali ou orgânicos de resíduos ácidos, tais como fenóis. Os sais podem ser elaborados utilizando um ácido orgânico ou inorgânico. Esses sais de ácidos são cloretos, brometos, sulfatos, nitratos, fosfatos, sulfonatos, formatos, tartaratos, maleatos, malatos^ 15_ citratos, -benzoatos7 “sMTicilátõs, ascorbatos e similares.

Sais de fenolato são os sais de metais alcalino-terrosos, sódio, potássio ou lítio. A expressão sal farmaceuticamente aceitável, neste particular, indica os sais de adição de bases ou ácidos orgânicos e inorgânicos relativamente não 20 tóxicos de compostos conforme a presente invenção. Esses sais podem ser preparados in situ durante o isolamento final e purificação dos compostos conforme a presente invenção, ou por meio de reação separada de um composto purificado conforme a presente invenção na sua forma de ácido livre ou 25 de base livre com uma base ou ácido orgânico ou inorgânico apropriado e isolamento do sal formado desta maneira. Os sais representativos incluem os sais de bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, 30 fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naftilato, mesilato, gluco-heptonato, lactobionato, laurilsulfonato e similares. Para uma descrição de possíveis sais, vide, por exemplo, Berge et al (1977),

39/77

Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci. 66: 1-19.

Da forma utilizada no presente, quantidade terapeuticamente eficaz designa uma quantidade suficiente para tratar um paciente que sofre com uma doença (tal como tumores que sobre-expressam N-CoR) ou para aliviar um sintoma ou uma complicação associada à doença.

Da forma utilizada no presente, eficaz como herbicida indica uma quantidade suficiente para prejudicar o crescimento das plantas, particularmente por meio da inibição da atividade de fosfatase 2A da planta.

Da forma utilizada no presente, tratamento indica a redução da velocidade, suspensão ou reversão do progresso de uma doença, particularmente tumores que sobre-expressam NCoR. _ _ _ _ _ _ _ = - Da - forma utilizada^-rio presente, alquila destinase a incluir grupos hidrocarbonetos alifãticos saturados de cadeia linear e ramificada que contêm o número especificado de átomos de carbono. Desta forma, Ci-C_n como em alquila CiC_n é definido como incluindo grupos que contêm 1, 2, , n-1 ou n carbonos em uma disposição linear ou ramificada e, especificamente, inclui metila, etila, propila, butila, pentila, hexila e assim por diante. Uma realização pode ser alquila Ci~Ci₂. Alcóxi representa um grupo alquila conforme descrito acima ligado por meio de uma ponte de oxigênio.

O termo alquenila indica um radical hidrocarboneto não aromático, linear ou ramificado, que contém pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e até o número máximo possível de uniões duplas carbono-carbono não aromáticas pode estar presente. Desta forma, alquenila C₂-C_né definido como incluindo grupos que contêm 1, 2, . . . , n-1 ou n carbonos. Alquenila C₂-C₆, por exemplo, indica um radical alquenila que contém dois, três, quatro, cinco ou seis átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e

40/77 até, por exemplo, três uniões duplas carbono-carbono no caso de um alquenila C₆, respectivamente. Os grupos alquenila incluem etenila, propenila, butenila e ciclo-hexenila. Conforme descrito acima com relação a alquila, a parte linear, ramificada ou cíclica do grupo alquenila pode conter uniões duplas e pode ser substituída caso seja indicado um grupo alquenila substituída. Uma realização pode ser alquenila C₂-Ci₂.

O termo alquinila indica um radical hidrocarboneto linear ou ramificado, que contém pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e até a quantidade máxima possível de uniões triplas carbono-carbono não aromáticas pode estar presente. Desta forma, alquinila C₂-C_n é definido como incluindo grupos que contêm 1, 2, . . ., n-1 ou n carbonos. Alquinila C₂-C₆ ,· -por’ exemplo,' indica um radical alquinila que contém dois ou três átomos de carbono e uma ligação tripla carbono-carbono, ou que contém quatro ou cinco átomos de carbono e até duas uniões triplas carbono-carbono, ou que contém seis átomos de carbono e até três uniões triplas carbono-carbono. Os grupos alquinila incluem etinila, propinila e butinila. Conforme descrito acima com relação a alquila, a parte linear ou ramificada do grupo alquinila pode conter uniões triplas e pode ser substituída caso seja indicado um grupo alquinila substituída. Uma realização pode ser um alquinila C₂-C_n.

Da forma utilizada no presente, arila destina-se a indicar qualquer anel de carbono monocíclico ou bicíclico estável com até dez átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático. Exemplos desses elementos arila incluem fenila, naftila, tetra-hidronaftila, indanila, bifenila, fenantrila, antrila ou acenaftila. Em casos êfn que o substituinte arila é bicíclico e um anel é não aromático, compreende-se que a ligação é realizada por meio do anel

41/77 aromático. As arilas substituídas incluídos na presente invenção incluem substituição em qualquer posição apropriada com aminas, aminas substituídas, alquilaminas, hidróxis e alquil-hidróxis, em que a porção alquila das alquilaminas e alquil-hidróxis é um alquila C₂-C_n conforme definido acima. As aminas substituídas podem ser substituídas com grupos alquila, alquenila, alquinila ou arila, conforme definido acima.

Os substituintes alquila, alquenila, alquinila e arila podem ser substituídas ou não substituídas, a menos que definido especificamente em contrário. Alquila (Ci-C₆) pode ser substituída, por exemplo, com um ou mais substituintes selecionados a partir de OH, oxo, halogênio, alcóxi, dialquilamino ou heterociclila, tal como morfolinila,₌piperidinila- e assim por diante.

Nos compostos conforme a presente invenção, grupos alquila, alquenila e alquinila podem ser adicionalmente substituídas por meio da substituição de um ou mais átomos de hidrogênio por grupos não de hidrogênio descritos no presente até o máximo possível. Estes incluem, mas sem limitações, halo, hidróxi, mercapto, amino, carbóxi, ciano e carbamoíla.

O termo substituída, da forma utilizada no presente, indica que uma dada estrutura possui um substituinte que pode ser um grupo alquila, alquenila ou arila, conforme definido acima. O termo deve ser considerado como incluindo diversos graus de substituição por um substituinte designado. Quando forem descritas ou reivindicadas diversas porções substituintes, o composto substituído pode ser substituído independentemente por uma ou mais das porções substituintes descritas ou reivindicadas, isoladamente ou em conjunto. Por independentemente substituída, indica-se que os (dois ou mais) substituintes podem ser idênticos ou diferentes.

42/77

Da forma utilizada no presente, administração de um agente pode ser realizada utilizando qualquer dos diversos métodos ou sistemas de fornecimento bem conhecidos dos técnicos no assunto. A administração pode ser realizada, por exemplo, por via parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, lipossômica, inalatória, vaginal, intraocular, por administração local, subcutânea, por .via intra-adiposa, intra-articular, intratecal, em um ventrículo cerebral, intraventricular, intratumoral, na parênquima cerebral ou intraparenquimal.

Os sistemas de administração a seguir, que empregam uma série de veículos farmacêuticos utilizados rotineiramente, podem ser utilizados, mas são apenas representativos- dosdiversos sistemas possíveis idealizados para administração de composições conforme a presente invenção.

Sistemas de fornecimento de drogas injetáveis incluem soluções, suspensões, géis, microesferas e injetáveis poliméricos e podem compreender excipientes tais como agentes de alteração da solubilidade (tais como etanol, propileno glicol e sacarose) e polímeros (tais como policaprilactonas e PLGAs).

Sistemas implantáveis incluem varas e discos e podem conter excipientes tais como PLGA e policaprilactona.

Sistemas de fornecimento oral incluem pastilhas e cápsulas. Estes podem conter excipientes tais como aglutinantes (por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, polivinil pirilodona, outros materiais celulósicos e amido), diluentes (tais como lactose e outros açúcares, amido, fosfato dicálcico e materiais celulósicos), agentes desintegrantes (tais como polímeros de amido e materiais celulósicos) e agentes lubrificantes (tais como estearatos e

43/77 talco).

Sistemas de fornecimento transmucosa incluem emplastros, pastilhas, supositórios, pessários, géis e cremes e podem conter excipientes tais como solubilizantes e amplificadores (tais como propileno glicol, sais de bile e aminoácidos) e outros veículos (tais como polietileno glicol, ésteres de ácidos graxos e derivados e polímeros hidrofílicos, tais como hidroxipropilmetilcelulose e ácido hialurônico).

Sistemas de fornecimento dérmico incluem, por exemplo, géis aquosos e não aquosos, cremes, emulsões múltiplas, microemulsões, lipossomos, unguentos, soluções aquosas e não aquosas, loções, aerossóis, pós e bases de hidrocarboneto e podem conter excipientes tais _ como solubilizantes,= amplificadores dà permeação (tais como ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, álcoois graxos e aminoácidos) e polímeros hidrofílicos (tais como policarbofil e polivinilpirrolidona). Em uma realização, o veículo farmaceuticamente aceitável é um lipossomo ou um amplificador transdérmico.

Soluções, suspensões e pós para sistemas de fornecimento reconstituíveis incluem veículos tais como agentes formadores de suspensão (tais como gomas, zantanas, celuloses e açúcares), umectantes (tais como sorbitol), solubilizantes (tais como etanol, água, PEG e propileno glicol), tensoativos (tais como lauril sulfato dè sódio, Spans, Tweens e cetil piridina), conservantes e antioxidantes (tais como parabens, vitaminas E e C e ácido ascórbico) , agentes antiaglomeração, agentes de revestimento e agentes quelantes (tais como EDTA).

Compreende-se que substituintes e padrões de substituição sobre os compostos conforme a presente invenção podem ser selecionados por um técnico comum no assunto para

44/77 fornecer compostos que sejam quimicamente estáveis e que possam ser facilmente sintetizados por meio de métodos conhecidos na técnica, bem como os métodos descritos abaixo, a partir de materiais de partida facilmente disponíveis. Caso um substituinte seja, por si próprio, substituído por mais de um grupo, compreende-se que esses diversos grupos podem estar sobre o mesmo carbono ou sobre carbonos diferentes, desde que resulte uma estrutura estável.

DISCUSSÃO

Descobrimos que uma proteína que possui maior expressão de glioblastoma multiforme (GBMs) em comparação com cérebro normal é correpressor receptor nuclear (N-CoR), um regulador do conjunto de células haste neurais normais. A expressão de N-CoR em GBM foi confirmada por meio de imunohistoquímica.e Western Blot; --------N-CoR é expresso no núcleo de células haste neurais (NSCs) (Hermanson et al (2002)). Após a fosforilação dependente de Aktl quinase/fosfatidilinositol-3-OH quinase, N-CoR desloca-se para o citoplasma e gera diferenciação astrocítica de NSCs. A retenção nuclear de N-CoR é, portanto, essencial para ã manutenção de NSCs no estado não diferenciado (Hermanson et al) . De forma análoga a CD133+ NSC encontrado no interior do cérebro em desenvolvimento, células haste de tumores do cérebro (BTSC) que contêm CD133 foram identificadas em GBM (Uchida et al (2000) ; e Singh et al (2003)). BTSCs são capazes de proliferação, autorrenovação e diferenciação. BTSCs, mas não apenas células de tumores diferenciadas por CD133, são capazes de recapitular tumores mediante transplante de xenoenxerto (Singh et al (2004)) .

Retinoides, metabolites de vitamina A, foram examinados terapeuticamente em uma série de tumores, incluindo gliomas (Yung et al (1996)) . N-CoR é intimamente associado ao receptor de retinoide e liberado mediante

45/77 ligação de ligantes ao receptor (Bastien et al (2004)) . Formulamos a hipótese de que um efeito de retinoides sobre gliomas malignos pode ser a indução de diferenciação por meio da ligação de retinoides ao receptor de retinoides, seguida por dissociação do complexo de receptor de retinoides e N-CoR e deslocamento de N-CoR para o citoplasma. Esta ideia explicaria a observação anterior de aumento da expressão de GFAP em uma linhagem de células de glioma (U343 MG-A) tratadas com retinoides (Rudka et al (1988)) . Para testar isso, direcionamos a dois locais diferentes, individual ou simultaneamente, dentro do processo de N-CoR por meio de tratamento da linhagem de células GBM U343 MG-A com 50 μΜ de ácido retinóico (RA) e/ou 10 nM de ácido ocadaico (OA) , um inibidor de fosfatase 1 de proteína e fosfatase 2A de proteína._ Evitando-se- a- ação¹ “dê“'fosfatase 1 de proteína e fosfatase 2A de proteína, ácido ocadaico aumenta a forma fosforilada de N-CoR e promove a sua deslocação citoplasmática subsequente (Hermanson et al (2002)) .

A linhagem celular U343 MG-A é disponível por meio do Banco de Tecidos do Centro de Pesquisa de Tumores Cerebrais da Universidade da Califórnia em Sao Francisco (UCSF) (Universidade da Califórnia, São Francisco, Health Sciences West Building, San Francisco, Califórnia 941430520) . Além disso, as linhagens de células U343 e U87 são disponíveis comercialmente por meio da EPO GmbH, RobertRõssle-Str. 10, 13092 Berlin-Buch, Alemanha.

Diversas moléculas que possuem atividade anti-PP2A sinergizam-se com ácidos retinóicos na inibição do crescimento de células de tumores que sobre-expressam N-CoR in vitro. O grupo mais eficaz de inibidores de fosfatase que se sinergizam com ácidos retinóicos e foram avaliados sao análogos do antigo agente terapêutico, Mylabris, derivado dos corpos moídos do besouro da bolha, em que o principal agente

46/77 ativo é cantaridina, conhecido como potente inibidor de ΡΡ2Ά (Wang, 1989; Peng et al, 2002) .

Cantaridina possui atividade antitumorosa contra canceres humanos do fígado (hepatomas) e do trato gastrointestinal superior, mas é tóxico para o trato urinário (Wang, 1989) . Norcantaridina, uma cantaridina demetilada, mantém atividade antitumorosa de cantaridina contra hepatomas e cânceres do estômago e esôfago, mas possui pouca ou nenhuma toxicidade do trato urinário. Norcantaridina também estimula a produção de glóbulos brancos do sangue em pacientes e camundongos, um fenômeno não compreendido mecanicamente, mas um efeito farmacológico de benefício potencial como um agente anticancerígeno (Wang et al, 1986; Wang, 1989) .

A publicação de um relatório que cantaridina age como um inibidor^ . da . f-osfabase ““ dè proteínas causou um interesse mais geral em compostos com este tipo de estrutura química (Li e Casida, 1992). Anteriormente, havia sido descoberto que o congênere mais simples e seu produto de hidrólise (disponível comercialmente como o herbicida Endothal) são hepatóxicos (Graziano e Casida, 1997) . Os alvos primários no fígado aparentemente são as fosfatases de proteína PP2A e PP1, em que todos os compostos exibem valores ED₅₀ em nível micromolar. Estudos de ligação demonstraram que a ação de certos homólogos de cantaridina sao diretos sobre PP2A e indiretos sobre PP1 (Honkanen et al, 1993; Li et al, 1993). Fosfatase PP1B é afetada apenas em níveis milimolares desses compostos, enquanto a enzima PP2C nao é influenciada.

No passado, diversos análogos de cantaridina haviam sido sintetizados e avaliados para determinar a atividade antifosfatase e pela sua capacidade de inibir o crescimento de células cancerígenas em cultivo (Sakoff e McClusky, 2004; Hart et al, 2 004) . Algumas das moléculas de norcantaridina modificadas e avaliadas anteriormente inibiram o crescimento

47/77 de diversas linhagens de células de tumores humanos. A atividade de análogos de norcantaridina contra células de tumores que sobre-expressam N-CoR ou a atividade de norcantaridinas combinada com outros potenciais agentes antitumores não foi analisada. Estudos adicionais incluíram dezesseis norcantaridinas modificadas avaliadas para determinar a atividade contra quatro linhagens de células de tumores humanos, que incluem ovário, rim, colo-retal e pulmão, bem como uma linhagem de leucemia de camundongo. Nenhuma era tão ativa quanto agentes isolados tais como cantaridina ou norcantaridina e nenhuma foi avaliada para determinar a atividade em combinação com um outro agente antitumor (McCluskey et al, Pedido de Patente Norte-Americano Publicado n° 2006/0030616, 2006).

Uma série . diferente de ' análogos de cantaridina havia sido sintetizada anteriormente e avaliada como pesticidas e para atividade antitumores contra linhagens de células de câncer. Quarenta e três análogos de Endothal e cantaridina foram desenvolvidos e tiveram determinada sua atividade como herbicidas e sua letalidade a camundongos (Matsuzawa et al, 1987). Demonstrou-se que tioanidrido Endothal é um herbicida mais potente que Endothal, mas foi tóxico para o fígado de camundongos (Matsuzawa et al, 1987; Kawamura et al, 1990).

Mais recentemente, descobriu-se que tioanidrido Endothal é um agente ativo contra PP2A e PPI in vivo (Erdodi et al, 1995). Endothal e anidrido Endothal, como cantaridina, inibem a atividade de PP2A e, até certo ponto, a atividade de PP1 (Erdodi et al, 1995) . No fígado, o alvo principal aparentemente é PP1. Em fibroblastas, apenas tioanidido Endothal causou notáveis alterações morfológicas, ao contrário de cantaridina e Endothal (Erdodi et al, 1995). Acredita-se que a maior atividade de tioanidrido Endothal in

48/77 vivo esteja relacionada com a sua maior lipofilicidade, o que resulta em aumento da difusão ao longo da plasmalema (Essers et al, 2001). Uma publicação mais recente descreveu a síntese dos análogos mono e difluor de Endothal e também os anidridos correspondentes, mas nenhum dado farmacológico acompanhou esse trabalho sintético (Essers et al, 2001) .

Dos congêneres conhecidos deste tipo de composto, apenas o parental, cantaridina e seu derivado bis(normetila), norcantaridina, tiveram qualquer uso como substâncias de drogas anticancerígenas e apenas norcantaridina é utilizada como agente antineoplástico (Tsauer et al, 1997) .

Na pesquisa do desenvolvimento de novas substâncias de drogas nesta área, descobrimos que é essencial desenvolver inibidores que possuam maior especificidade, especialmente para as enzimas que. exibam alta-atividade contra os processos de reprodução de células de câncer. Alta especificidade também sustenta a possibilidade de evitar alvos importantes para a função celular normal. Do ponto de vista das características físicas de qualquer substância de droga recém desenvolvida, ela deve possuir predominantemente boa permeabilidade de membrana (ou seja, possui um valor log P de duas a quatro unidades).

Os compostos descritos no presente possuem um efeito antagonista sobre fosfatase 2A e fosfatase 1. Confirmamos que pelo menos os Compostos 100, 105 e 102 sao eficazes na inibição do crescimento de células de tumores que sobre-expressam N-CoR. Os Compostos 100 e 105 sao vantajosos sobre outros homólogos de cantaridina, pois eles existem na forma de zwitterions, o que os torna hidrossolúveis e estáveis sob pH ácido, que são características desejáveis para drogas oralmente eficazes. O composto 102 é solúvel ém lipídios, o que fornece maior capacidade que os Compostos 100 e 105 de cruzar a barreira entre o sangue e o cérebro. Isso é

49/77 especialmente importante ao tratar-se tumores tais como glioblastoma multiforme.

O Composto 100, norcantaridina (nor-Can), Endothal (End) e tioanidrido Endothal (ET) foram avaliados 'para determinar a sua capacidade de inibir o crescimento de GBMs de forma dependente de dosagem in vivo conforme exibido na Figura 1.

A partir de plotagens gráficas da linhagem celular de glioblastoma multiforme GBM U373 (disponível por meio do Instituto Nacional de Disfunções Neurológicas e Unidade de Patogênese Molecular de Apoplexia, Building 10, Room 5 D37, Institutos Nacionais de Saúde, 900 Rockville Pike, Bethesda, Maryland 20892) em função da exposição a diferentes doses da droga por sete dias, foi estimada a concentração de cada composto que inibiu_ a, proliferação de' células de tumores do cérebro em 50% (IC50). As IC50s expressas em micromolaridade (μΜ) foram: 2,5, 3,0, 12,0 e 15,0 para tioanidrido Endothal, Composto 100, norcantaridina e Endothal, respectivamente, conforme exibido na Figura 1. Conforme exibido, em base molar, o Composto 100 foi um inibidor potente de GBMs in vi tro.

Em combinação com antifosfatases, retinoides inibem sinergicamente a proliferação de glioblastoma multiforme. Afirma-se que a sinergia (potencializaçao) da atividade inibidora de duas drogas em combinação está presente quando o percentual de sobrevivência na presença de duas drogas é maior que a soma dos percentuais de sobrevivência das duas drogas utilizadas isoladamente nas mesmas doses na combinação.

A atividade inibidora do Composto 100 foi adicionalmente avaliada em combinação com retinoides, bem como individualmente. Conforme exibido na Figura 2, a combinação de Composto 100 com ácido retinóico totalmente

50/77 trans (ATRA) demonstrou uma redução sinérgica do crescimento celular.

O percentual de sobrevivência esperado de células U3 73 expostas à combinação de Atra e End é de 50% (77% por ATRA x 65% por End = 50%), enquanto a sobrevivência observada foi de 32%. O percentual esperado de sobrevivência na presença da combinação de ATRA e Composto 100 é de 60% (77% por ATRA x 78% por Composto 100 = 6 0%) , enquanto a sobrevivência observada foi de 53%.

Para determinar se existe especificidade de tipo de tumor das propriedades inibidoras de inibidores de PP2A, ácido retinóico e tricostatina A, medimos os seus efeitos inibidores como agentes isolados contra a linhagem GBM U373, uma linhagem de câncer de mama, MCF-7 (obtida por meio de ATCC) e uma linhagem, de células decâhcér “^-rénãl, UMRC (UMRC obtida por meio do Dr. Zhuang, NINDS, NIH do Programa de Suporte à Pesquisa Intramural, SAIC, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento do Câncer Frederick.

A linhagem de células de câncer dos rins, UMRC (Figura 3) foi menos sensível que a linhagem de tumor do cérebro, U3 73 (Figura 4) , enquanto a linhagem de câncer de mama, MCF-7 (Figura 5) foi tão sensível quanto U373 a ácido retinóico totalmente trans, tioanidrido Endothal, norcantaridina, Endothal e tricostatina A. Existe alguma especificidade de tipo celular dessas drogas para GBMs. A atividade das drogas contra células MF-7 indica que os regimes que estão sendo desenvolvidos para o tratamento de tumores do cérebro provavelmente também são úteis contra câncer de mama e outros tumores que sobre-expressam N-CoR.

Demonstramos que o Composto 100 possuirá efeitos inibidores similares no tratamento de câncer de mama e outros tumores que sobre-expressam N-CoR devido às similaridades

51/77 estruturais entre o Composto 100 e Endothal, bem como seus efeitos similares no tratamento de glioblastoma multiforme.

Endothal também é conhecido como um desfoliante ativo e potente herbicida de contato utilizado em muitas situações agrícolas. Ele é considerado eficaz como dissecante pré-colheita e como herbicida pré-emergência (Crafts, 1953).

Endothal, norcantaridinas e cantaridina são todos inibidores bem conhecidos de fosfatase de proteína de mamíferos, bem como potentes herbicidas (Matsuzawa et al, 1987) . O mecanismo por meio do qual Endothal e outros homólogos exercem a sua potente atividade herbicida não foi estudado extensamente, apesar do uso disseminado de Endothal internacionalmente na agricultura. Dever-se-ã observar que Endothal é hidrossolúvel, ao contrário de cantaridina e norcantaridina. _ - - - ‘

Considerou-se que a atividade de Endothal como herbicida de contato e desfoliante é relacionada à conhecida toxicidade irritante do seu composto parental, norcantaridina. Estudos mais recentes sugerem, entretanto, que a atividade herbicida de Endothal pode ser uma função principalmente da sua atividade anti-proteínas de plantas (PP2A) . Li et al (1993) demonstraram que cantaridina e Endothal inibem PP2A e PP1 de folha de espinafre e inibem a ativação de nitrato reductase pela luz na folha de espinafre intacta, um processo mediado por PP2A. Smith et al (1994), demonstram que os inibidores de fosfatase de proteína não relacionados estruturalmente ácido ocadaico e caliculina A são potentes inibidores sob concentrações nanomolares do crescimento de certas plantas. A atividade de ácido ocadaico e caliculina A sugere fortemente que a atividade de Endothal como herbicida deve-se à sua atividade antifosfatase.

Baskin e Wilson (1997) exibiram inibidores de proteína serino-treonina fosfatases que incluem cantaridina,

52/77 que inibe a organização de microtúbulos de plantas. Ayaydin et al (2000) demonstram que Endothal inibiu a atividade de PP2A, causando alteração da divisão celular em células de alfafa cultivadas. Eles observaram que Endothal era permeável às células.

Como Endothal, os Compostos 100 e 105 são hidrossolúveis. Mas, ao contrário de Endothal, que é um diácido, os Compostos 100 e 105 podem ser zwitterions. O fato de que os compostos descritos no presente tais como o Composto 100 são mais potentes que Endothal contra o crescimento de células de câncer de mamíferos pode dever-se à maior permeabilidade celular dos zwitterions com relação ao diácido. Os Compostos 100 e 105 são herbicidas mais potentes em base molar devido à melhor penetração celular. Os Compostos 100 e 105como - zwitterions, também são menos tóxicos para distribuidores e aplicadores do herbicida, bem como para o público exposto inadvertidamente ao agente. Os Compostos 100 e 105 não possuem o caráter ácido de Endothal.

Os compostos do presente, incluindo os Compostos 100 e 105, são, portanto, herbicidas úteis, comercialmente viáveis e mais seguros com relação à exposição humana e ao meio ambiente.

DETALHES EXPERIMENTAIS

MÉTODOS E MATERIAIS

Preparação de anidrido Endothal

Esquema 1

Conforme exibido no Esquema 1, preparamos anidrido

53/77

Endothal por meio da adição de anidrido acético (0,5 ml) (4) a uma suspensão de Endothal (186 mg) (3) em benzeno (3 ml) e a mistura foi agitada em seguida até que o sólido houvesse entrado em solução (duas horas). A solução foi aquecida a vácuo para remover o benzeno e o resíduo foi aquecido em seguida a 80 °C por trinta minutos. Adicionou-se em seguida éter de petróleo (5 ml) e o anidrido desejado cristalinizouse espontaneamente. O produto foi removido por meio de filtragem e lavado com um pouco de éter de petróleo para gerar o produto puro (85 mg) que foi utilizado imediatamente nas duas preparações a seguir.

Preparação de Endothal 4-metilpiperazina monoamida (EMPM) (Composto 100):

o

O

............

NH

N

O

Esquema 2

Anidrido Endothal (85 mg) (5) , preparado conforme descrito acima, foi dissolvido em benzeno (2 ml) e Nmetilpiperazina (60 mg) (6) foi adicionada em uma parcela à temperatura ambiente. Quase imediatamente, surgiu um cristalino branco. A mistura foi mantida a temperatura ambiente por uma noite e o produto foi removido em seguida por meio de filtragem, lavado com um pouco de benzeno e seco em seguida (145 mg) . Um espectro de massa de íons negativos exibiu um ion parental a m/z 267 (267 teóricos) , que confirma o peso molecular de 268 unidades de massa. O produto foi recristalizado a partir de DMF quente para gerar 95 mg da monoamida pura, Composto 100 (1), ponto de fusão 226-227 C, com alguma decomposição iniciando-se em 224 °C. O espectro de NMR ^ΧΗ do sal de sódio do Composto 100 confirma a estrutura.

54/77

Sal de sódio. NMR ^TH (D₂O) : 1,41-1,70 (m, 4H) , 2,18 (s, 3H) , 2,21-2,55 (m, 4H) , 2,92 (d, 1H) , 3,17 (d, 1H) , 3,22-3,40 (m, 2H) , 3,45 (m, 2H) , 4,60 (q, 1H) , 4,78 (q, 1H) . Os dados de espectrometria de massa que medem a razão entre massa e carga do Composto 100 exibiram picos a 141 m/z, 167 m/z, 254 m/z, 199 m/z e 185 m/z, correspondentes a fragmentos com carga negativa (Tabela 1).

Preparação de Endothal 4-etilpiperazina monoamida (EEPM) (Composto 105):

Anidrido Endothal (1,68 g, 10 mmol) e Netilpiperazina (3,42 g, 30 mmol) foram adicionados. a 10 ml de tolueno e aquecidos sob refluxo por dezoito horas. O solvente foi evaporado em seguida sob pressão reduzida e o resíduo foi cristalizado a partir de metil t-butil éter para gerar o produto bruto (1,8. g) . Recristalizaçãò a partir do mesmo solvente gerou um total de 1,2 g (rendimento de 42,5%) em duas safras. Ponto de fusão 215-218 °C (com decomposição). O NMR ¹H do sal de sódio em D20 e o espectro de íons negativos MS confirmam a estrutura e o peso molecular (m/z 282,2 ams) , respectivamente. Sal de sódio. NMR ¹H (D2O) : 0,95 (t, 3H) , 1,42-1,65 (m, 4H) , 2,20-2,42 (m, 4H) , 2,43-2,55 (m, 2H) , 2,93 (d, 1H) , 3,08 (d, 1H) , 3,20-3,33 (m, 2H) , 3,42-3,58 (m, 2H) , 4,45 (q, 1H) , 4,75 (q, 1H) . O espectro de MS indica a presença do dímero de associação em m/z 563,3 ams, que poderia ser esperado para um zwitterion. Além disso, um traço de Endothal (MS m/z 185 ams) está presente, mas não é evidente no espectro de NMR. Um espectro de massa de íons negativos exibiu um ion parental a 282,2 m/z (282,2 teórico), o que confirma o peso molecular como 282,2 unidades de massa.

Preparação de terc-butil éster de ácido 4-(3carbóxi-7 -oxa-biciclo [2.2.1] heptano-2-carbonil)piperazino-1 carboxilico (Composto 102):

55/77

Anidrido Endothal (1) (500 mg, 3 mmol) e N-BOC piperazina (2) (1,86 g, 10 mol) foram adicionados a tolueno seco (8 ml) e aquecidos a 100-110 °C por oito horas. O solvente foi removido em um evaporador giratório e adicionouse ao resíduo uma mistura de ácido cítrico aquoso a 10% (20 ml) e acetato de etila (20 ml) . O sólido separado (Composto 102) (3) foi filtrado, lavado com hexano e seco a vácuo. Rendimento, 5 00 mg (4 7%) , ponto de fusão 206-2 08 °C. O espectro de massa e os dados de NMR ^XH confirmaram a identidade do Composto. 102 . -Dados - de espectrómetria de massa que medem a razão entre massa e carga do Composto 102 exibiram picos a 141,1 m/z, 185 m/z e 354 m/z. NMR ^XH (DMSOd₆) : 1,42 (s, 9H) , 1,45-1,72 (m, 4H) , 3,02-3,15 (d, 1H) ,

3,20-3,55 (m, 9H) , 4,65-4,70 (m, 2H) .

Preparação de ácido 3-{1-[2-(4-metoxifenil)etil] piperidin-4-ilcarbamoil} -7-oxabiciclo [2.2.1] -heptano-2 carboxílico (Composto 104):

Anidrido Endothal (1) (500 mg, 3 mmol) e amina (4) (2,34 g, 10 mmol) foram adicionados a tolueno seco (8 ml) e aquecidos a 100 °C por vinte horas. O solvente foi evaporado em seguida sob pressão reduzida, o resíduo foi absorvido em água e a solução foi acidif içada até pH 5,5 a 6 com HC1 diluído. O sólido foi filtrado e recristalizado a partir de metanol para gerar (5) puro (Composto 104) . Rendimento, 450

56/77 mg (36%) . Ponto de fusão: 140-142 °C. O espectro de massa e os dados de NMR ¹H confirmaram a identidade do Composto 104. Dados de espectrometria de massa que medem a razão entre massa e carga do Composto 104 exibiram picos em 385. NMR ^XH (CDC1₃) : 1,48-1,65 (m, 4H) , 1,78-1,95 (m, 2H) , 1,98-2,15 (t, 2H) , 2,40-2,60 (m, 4H) , 2,68-2,78 (m, 2H) , 2,80 (s, 2H) ,

3,02-3,15 (d, 2H) , 3,78 (s, 3H) , 3,82-3,98 (m, 1H) , 4,82-4,88 (m, 2H) , 6,78-6,82 (d, 2H) , 7,09-7,12 (d, 2H) .

Preparação de ácido 3-(4-benzilpiperazino-lcarbonil)-7-oxabiciclo[2.2.1] heptano-2-carboxílico (Composto 103) : este composto foi preparado em três etapas a partir de anidrido Endothal (1) conforme exibido abaixo no Esquema 1.

MeOH

COjMe

C°2H

CgHgO4

Mõl.Wt: 168.15

CgHjjOj

Mol. Wt.: 200.19

ÉDC.HCI

HOBr | DIPEA I

CHjCIj U

H N.

..,S C-i-iHigNj * Mol. Wt.: 176.26

CH₂Ph 7

Composto 103

Esquema 1

Etapa 1: preparação de monometil éster de ácido 7oxabiciclo[2.2.1]heptano-2,3-dicarboxílico:

Anidrido Endothal (1) (4 g, 24 mmol) foi aquecido sob refluxo em metanol seco (20 ml) por três horas. A mistura de reação foi resfriada à temperatura ambiente e o sólido separado (6) foi filtrado e cristalizado a partir de metanol. Rendimento: 4,6 g (96%). Ponto de fusão: 114-146 °C.

Etapa 2: preparação de metil éster de ácido 3-(4benzilpiperazino-l-carbonil) -7-oxabiciclo [2.2.1] heptano-257/77

-15“ carboxílico (8):

À mistura de derivado ácido (6) (2,6 g, 13 mmol) em cloreto de metileno (40 ml), adicionou-se EDC.HC1 (2,75 g, 15 mmol) seguido por HOBt (15 0 mg) . A mistura foi agitada por dez minutos à temperatura ambiente antes da adição de Nbenzil piperazina (7) (1,76 g) seguida por DIPEA (3,5 ml, 20 mmol) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Adicionou-se água à mistura de reação, a camada de cloreto de metileno foi separada, lavada uma vez com NaHCO₃ aquoso, seca em seguida sobre NaSO₄, filtrada e concentrada. O resíduo bruto foi purificado por meio de cromatografia de coluna utilizando 1 a 2% de metanol em cloreto de metileno como eluente para gerar o material puro necessário (8). Rendimento: 2,7 g (58%). _ _ _ ·= “· - ^—Etapa 3: preparação de ácido 3-(4-benzilpiperazino1-carbonil)-7-oxabiciclo[2.2.1] heptano-2-carboxílico (Composto 103):

A uma solução de éster (8) (2,50 g, 7 mmol) em metanol (20 ml), adicionou-se NaOH aquoso (360 mg dissolvidos em 5 ml de água) e agitou-se à temperatura ambiente. O solvente foi evaporado em seguida até secar, adicionou-se água (20 ml) e o pH da solução foi ajustado em seguida até pH 5 utilizando 6 N HC1. Ele foi evaporado até secar em seguida e adicionou-se cloreto de metileno (30 ml). O NaCl sólido residual foi removido por meio de filtragem e o filtrado foi concentrado. O sólido resultante foi triturado com isopropil éter para gerar o ácido puro (9) (Composto 103) . Rendimento: 1,8 g (75%). Ponto de fusão > 190 °C (dec). O espectro de massa e os dados de NMR ¹H confirmaram a identidade do Composto 103. NMR ^ÃH (CDC1₃) : 1,45-1,84 (m, 4H) , 2,45-2,68 (m, 2H) , 2,75-2,95 (m, 2H) , 3,12-3,35 (m, 2H) , 3J38-3,55 (m, 2H) , 3,60-3,80 (m, 2H) , 3,95-4,20 (m, 2H) , 4,75-4,85 (m, 2H) , 7,40 (s, 5H) . Dados de espectrometria de massa que medem a

58/77 razão entre massa e carga de composto 103 exibiram picos a 177,2 m/z, 345 m/z e 711 m/z.

Preparação de ácido 3-(piperazino-l-carbonil)-7oxabiciclo[2.2.1]heptano-2-carboxílico (Composto 101):

O derivado ácido N-benzil protegido (9) (500 mg,

1,45 mmol) em metanol foi hidrogenado utilizando balão de hidrogênio sobre um catalisador Pd/C (5%, 50 mg) à temperatura ambiente por uma noite. A mistura de reação foi filtrada a partir dos catalisadores e concentrada até secar. O resíduo bruto foi cristalizado a partir de 2-proponal para gerar .amina - (10) -(Composto “101)’ na forma de sólido branco puro. Rendimento: 215 mg (58%), ponto de fusão > 240 °C (dec). O espectro de massa e os dados de NMR confirmaram a identidade do Composto 101. NMR ¹H (CDC1₃-CD₃OD) : 1,42-1,78 (m, 4H) , 2,92-3,15 (m, 8H) , 3,52-3,82 (m, 2H) , 4,58 (q, 1H) , 4,78 (q, 1H) . Dados de espectrometria de massa que medem . a razão entre massa e carga do Composto 101 exibiram picos a 177,2 m/z, 255,2 m/z, 277,2 m/z e 318,2 m/z.

Preparação de sal de ácido 3-(piperazino-1carbonil)-7-oxabiciclo[2.2.1] heptano-2-carbotioico de N-metil piperazina (Composto 108):

Tolueno

Δ

Tioanidrido Endothal (11) (552 mg, 3 mmol) e Nmetil piperazina (12) ' (1 g, 10 mmol) foram adicionados a tolueno seco (10 ml) e aquecidos sob refluxo por duas horas e meia. A mistura de reação foi resfriada à temperatura

59/77 ambiente e o sólido que havia se separado foi filtrado e cristalizado a partir de cloreto de metileno e acetato de etila para gerar (13) necessário puro (Composto 108) . Rendimento: 585 mg (51%), ponto de fusão > 180 °C (dec) . O espectro de massa e os dados de NMR ¹H confirmaram a identidade do Composto 108. NMR ¹H (CDC1₃) : 1,52-1,56 (m,

2H) , 1,82-1,85 (m, 2H) , 2,27 (s, 3H) , 2,28-2,42 (m, 11H) ,

3,01 (s, 3H) , 3,28-3,36 (m, 2H) , 3,42-3,49 (m, 4H) , 3,60-3,78 (m, 2H) , 4,89-4,91 (m, 2H) . Dados de espectrometria de massa que medem a razão entre massa e carga do Composto 108 exibiram picos a 217 m/z, 251 m/z e 351 m/z.

Preparação de metil éster de ácido 3- (4metilpiperazino-l-carbonil)-7-oxabiciclo[2.2.1]2-carboxílico (Composto 107) :

A uma suspensão de derivado ácido (14) (53 6 mg,. 2 mmol) em cloreto de metileno, adicionou-se cloreto de tionila (0,5 ml)' seguido por duas gotas de DMF. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Foi uma suspensão de sal de cloridrato cloreto ácido. Adicionou-se metanol seco (10 ml) , agitou-se por trinta minutos e evaporou-se até secar utilizando evaporador giratório. Ao resíduo, adicionou-se água (20 ml) e extraiu-se com acetato de etila (20 ml). O pH da camada aquosa foi ajustado em 4,5 utilizando NaHCO₃ (10%) e evaporado até secar. O resíduo foi transformado em azeotropo com acetonitrila. Ele foi novamente dissolvido em acetonitrila e o NaCl separado foi removido por meio de filtragem. O filtrado foi evaporado até secar e triturado com acetato de etila para gerar um sólido pegajoso, que foi seco em um forno a vácuo para obter o composto

60/77 desejado na forma de sólido incolor (15) (Composto 107) . Rendimento: 14 0 mg (25%, ponto de fusão 105-107 °C). Os dados de NMR ^XH foram compatíveis com o espectro esperado para o Composto 107. NMR ^XH (D₂0) : 1,49-1,53 (m, 2H) , 1,60-1,64 (m,

2H) , 2,8 (s, 3H) , 2,96-3,36 (m, 10H) , 3,52 (s, 3H) , 4,84-4,86 (m, 2H) . Dados de espectrometria de massa que medem a razão entre massa e carga do Composto 107 exibiram picos a 123 m/z, 183 m/z, 251 m/z e 283 m/z.

Preparação de 1-{N-(3-exocarbóxi-7-oxabiciclo 10 [2.2.1] heptano-2-exocarbonil) amino-2- (N, W-dimetil) aminoetano (Composto 106).

Anidrido Endothal (1,68 g, 10 mmol) e unsim-N, 27dimetiletileno diamina (2,64 g, 30 mmol) foram adicionados a tolueno (10 ml) e aquecidos sob refluxo por duas horas O . 15 - solvente foi “removido em seguida por meio de evaporação sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com um pouco de di-isopropil éter para causar cristalização. O produto foi recristalizado duas vezes em seguida a partir de hexano por meio de resfriamento a -20 °C. O produto puro (1,9 g;

rendimento de 74%) fundiu-se a 48-50 °C. O espectro de NMR ¹H encontra-se em perfeito acordo com a estrutura que é zwitteriônica e sofre uma substituição de dois prótons quando tratado com D20. O espectro de massa também confirmou a identidade do Composto 106. NMR ^XH (CDC13) : 1,62-1,75 (m,

2H) , 1,85-1,95 (m, 2H) , 2,2 (s, 6H) , 2,45 (t, 2H) , 2,92 (s, 2H) , 3,60 (t, 2H) , 4,85-4,95 (m, 2H) . Dados de espectrometria de massa que medem a razão entre massa e carga do Composto 106 exibiram picos a 239,2 m/z, 257 m/z e 513 m/z.

ESPECTROMETRIA DE MASSA:

A Tabela 1 demonstra a correlação entre a razão entre massa e carga dos ions e as estruturas correspondentes. Uma amostra do composto 100 foi ionizada no espectrômetro de massa, ions com massas-» diferentes foram separados e a sua

61/77 abundância relativa foi medida.

Tabela 1: Relação Entre Massa e Carga de íons

Razão entre massa e carga (m/z)	Estrutura teórica de íons
141	.-CO/ O
167	o o
254	1 8 1 / \<- ^N\ II ÚU o
199	o₂c.	/ \ + II \____/ H O
185	.c c	θ2 H \i--H

A Tabela 2 exibe a correlação entre a razão entre massa e carga dos íons e estruturas correspondentes. Uma amostra do Composto 105 foi ionizada no espectrômetro de massa, tons com massas diferentes foram separados e foi medida a sua abundância relativa.

Tabela 2: Relação Entre Massa e Carga de íons

Razão entre massa e carga (m/z)

Estrutura teórica de íons

62/77

141	o
167	o
249	• ° \ ---N N---- O '
» 199	O2C. a· Ί- _ _ - -· N—--— \|\| \___/ H O
185	.co₂- L Η --H O

EXEMPLO 1: EFEITO DO COMPOSTO 100 E ANÁLOGOS RELACIONADOS SOBRE CÉLULAS GBM

Para identificar alvos terapêuticos inovadores para o tratamento de glioblastoma multiforme (GBM), análogos de 5 cantaridina foram avaliados para determinar a sua capacidade de inibição do crescimento de células de glioblastoma multiforme. Especificamente, a linhagem de células GBM U373 foi utilizada nas avaliações.

Os homólogos de cantaridina que foram avaliados 10 foram norcantaridina (nor-Can) , que é uma bis (normetil) cantaridina; Endothal (End) , que é um derivado de ácido dicarboxílico de norcantaridinas; tioanidrido Endothal (ET) ;

63/77 e Compostos 100 e 105, preparados conforme descrito acima.

As células foram colocadas em placas em três cópias no dia 1 com e sem quantidades diferentes de cada droga dissolvidas em meios (Composto 100, Composto 105 e Endothal) ou em sulfóxido de dimetila (tioanidrido Endothal e norcantaridina). O número total de células é contado nos cultivos em três cópias em cada dose e em controles após sete dias e determina-se o número médio de células e o desvio padrão.

A quantidade de inibição do crescimento de células

GMB é expressa como a proporção do número de células nas placas experimentais em comparação com o número de células em placas controle que contêm apenas o veículo da droga e o meio de cultivo. O percentual médio de controle _é_ plotadoe -15- -inserido* entre' parênteses por um desvio padrão calculado a partir das medições em três cópias.

RESULTADOS Cada um dos análogos de norcantaridina inibiu o crescimento de GMBs de forma dependente de dosagem in vivo, 20 conforme exibido na Figura 1.

A partir das plotagens de gráficos da linhagem de células GBM U373 em função da exposição a diferentes doses de droga por sete dias, foi estimada a concentração de cada composto que inibiu a proliferação de células de tumor do 25 cérebro em 50% (IC50) . As IC50s expressas em micromolaridade (μΜ) foram: 2,5, 3,0, 12,0 e 15,0 para tioanidrido endothal, Composto 100, norcantaridina e endothal, respectivamente, conforme observado na Figura 1.

Além disso, curvas logarítmicas da linhagem de 30 células de glioma U373 tratadas com diferentes doses de Composto 105 por três (Figura 6) e sete dias (Figura 7) indicam que o aumento das dosagens demonstra uma inibição maior do crescimento. Além disso, a Figura 8 é uma curva de

64/77 reação à dosagem para o Composto 105 contra o cultivo de células de GBM humanas ao longo de sete dias em diversas concentrações do Composto 105. Dever-se-ã observar que o Composto 100 foi incluído em uma única concentração de 10 μΜ 5 e que, nessa concentração, os dois compostos possuem valores inibidores idênticos.

EXEMPLO 2: EFEITO DO COMPOSTO 100 COMBINADO COM ÁCIDO RETINÓICO

Para identificar ,o efeito de combinações de 10 antifosfatases PP2A e retinoides que afetam complexos nucleares, concentramo-nos em derivados de cantaridina hidrossolúveis que se demonstrou serem ativos contra GBMs humanos in vitro, Endothal e Composto 100.

Para observar os efeitos do Composto__ 100 „ em „ 15- -combinação Còm ^ “ácidos retinóicos, o Composto 100 foi combinado com ácido retinóico totalmente trans.

As células foram colocadas em placas em três cópias no dia 1 com e sem quantidades diferentes de cada droga dissolvidas em meios (Composto 100 e Endothal). O número 2 0 total de células é contado nos cultivos em três cópias em cada dose e nos controles após sete dias e é determinado o número médio de células e o desvio padrão.

A quantidade de inibição do crescimento de células GBM é expressa na forma de proporção entre o número de 25 células nas placas experimentais em comparação com o número de células em placas controle que contêm apenas o veículo de droga e o meio de cultivo. O percentual médio de controle é plotado e inserido entre parênteses por um desvio padrão calculado a partir das medições em três cópias.

RESULTADOS

A Figura 2 demonstra que o Composto 100, bem como Endothal, cada qual em combinação com ATRA, inibiram sinergicamente a proliferação da linhagem de células GBM

65/77

U373. Afirma-se que a sinergia (potencialização) da atividade inibidora de duas drogas em combinação está presente quando o percentual de sobrevivência na presença de duas drogas for menor que o produto dos percentuais de sobrevivência das duas drogas utilizadas isoladamente nas mesmas doses em combinação. A extensão da sinergia do Composto 100 e Endothal (end) em combinação com ATRA é quantificada abaixo na Tabela 3 .

Tabela 3: Endothal e Composto 100 +/- Inibição de

ATRA de células U373

	Percentual	de controle
	Observado	Esperado se aditivo
ATRA 25 μΜ	77%	-
END 10 μΜ	65%	-
ATRA 25 μΜ + END 10. μΜ.	. - - -32% -	- “ - ‘50%’
Compos t ò 100 1 μΜ	78%	-
ATRA 25 μΜ + Composto 100 1 μΜ	53%	60%

O percentual esperado de sobrevivência de células

U373 expostas à combinação de ATRA e Composto 1 foi de 60% (77% por ATRA x 78% por Composto 100 = 60%) , enquanto a sobrevivência observada foi de 53%. O percentual esperado de sobrevivência na presença da combinação de ATRA e End foi de 50% (77% por ATRA x 65% por End = 50%) , enquanto a sobrevivência esperada foi de 32%.

O Composto 100, quando combinado com Tricostatina A ou quando combinado com ácido 13-cis retinóico, inibiu sinergicamente o crescimento de linhagem de células GBM U373 conforme exibido abaixo na Tabela 4.

Tabela 4: Composto 100 +/- Ácido 13-Cis Retinóico (CIS-RA) e Composto 1 +/- Tricostatina A (TSA) na Inibição de

Linhagem de Células GBM U373

----------------------------—---	Percentual d	e controle
	Observado	Esperado se aditivo
Cis-RA 50 μΜ	93,3 +/- 2,2

TSA 0,033 μΜ (0,01 μς/ιηΐ)	71,6 +/- 0,4
Composto 100 - 1 μΜ	97,9 +/- 1,0
Composto 100 - 5 μΜ	52,5 +/- 2,9
Cis-RA 50 μΜ + Composto 100 - 1 μΜ	79,3 +/- 3,2	91,3
Cis-RA 50 μΜ + Composto 100 - 5 μΜ	31,6 +/- 2,0	49,0
TSA 0,033 μΜ + Composto 100 - 1 μΜ	65,7 +/- 2,0	70,1
TSA 0,033 μΜ + Composto 100 - 5 μΜ	13,9 +/- 1,0	37,6

As duas drogas foram sinérgicas na sua inibição do crescimento de células U373. O percentual de sobrevivência das células após a exposição às duas drogas em combinação foi menor que o que seria esperado do percentual de sobrevivência 5 das células quando expostas a cada uma das duas drogas às mesmas dosagens utilizadas na combinação.

EXEMPLO 3 : DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DE TIPOS

DE TUMORES

Para determinar se existe especificidade de tipo de 1J) ₌ tumores, das. propriedades inibidòfas de análogos de Composto

100, ácido retinóico e Tricostatina A, medimos os seus efeitos inibidores como agentes isolados contra a linha GBM U373, uma linhagem de câncer de mama, MCF-7 (obtida por meio da ATCC) e uma linhagem de células de câncer do fígado, UMRC 15 (UMRC obtida por meio do Dr. Zhuang, NINDS, NIH do Programa de Suporte à Pesquisa Intramural, SAIC, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Câncer Frederick) .

RESULTADOS

A linhagem de células de câncer renal, UMRC (Figura

3) , foi menos sensível que a linhagem de tumor do cérebro, U373 (Figura 4), enquanto a linhagem de câncer de mama, MCF-7 (Figura 5), foi tão sensível quanto U373 para ácido retinóico totalmente trans, tioanidrido Endothal, norcantaridina, 25 Endothal e Tricostatina A. Existe alguma especificidade de tipo celular dessas drogas para GBMs. A atividade das drogas contra células MCF-7 indica que os regimes sendo desenvolvidos para o tratamento de tumores do cérebro podem

67/77 também ser úteis contra câncer de mama, bem como outros tumores que sobre-expressam N-CoR.

EXEMPLO 4

Além das atividades inibidoras sob baixas concentrações micromolares de Composto 100, o Composto 105, como o Composto 100, também é um zwitterion e é altamente ativo, conforme exibido na Figura 9. O composto solúvel em lipídios 102 também é altamente potente na inibição de linhagens de células de glioma, U373 (Figura 10) . Outros derivados de nocantaridina, os Compostos 101, 103, 104 e 106 possuem menos atividade (Figuras 11 a 14)·.

Para todos os experimentos de cultivo celular, as células são mantidas em crescimento na presença ou ausência de diferentes concentrações de droga ou na presença^ _do..

. veículo - utilizado pàra’dissolver a droga, PBS para Composto 100 e DMSO para o Composto 102. As contagens de células são realizadas em três cópias no dia 3 e no dia 7 e a inibição de crescimento é expressa na forma de percentual do número de células presentes na cavidade experimental dividido pelo número de células em uma cavidade controle.

Existe inibição dependente de dosagem pelo Composto 100 da linhagem de células GBM U373 (Figura 15) e inibição dependente de dosagem da linhagem de células de meduloblastoma DAOY (Figura 16).

Para experimentos in vivo, células de tumores implantadas por via subcutânea são mantidas em crescimento por sete dias até um tamanho de 5 a 7 mm. No dia 7, a administração da droga inicia-se por via intraperitoneal por vinte dias. Os diâmetros perpendiculares máximos das massas de tumor são medidos a cada dois a cinco dias. No 21° dia após o início do tratamento, os animais são sacrificados e dissecados livres dos tecidos subcutâneos e medidos.

Demonstra-se que o Composto 100 suprime o

68/77 crescimento da linhagem de células GBM U87 que cresce de forma subçutânea em camundongos SCID (Figura 17) . Também se demonstra que o Composto 100 e o Composto 200 inibem a proliferação de células DAOY quando implantados por via subçutânea em camundongos SCID (Figura 18).

EXEMPLO 5 : ATIVIDADE DE DROGAS CONTRA LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER HUMANO DIFERENTES DE GLIOBLASTOMAS E MEDULOBLASTOMAS

MATERIAIS E MÉTODOS

Linhagens celulares MDA-MB-231, HT-29, NCI-H460,

NCI-H522, NCI-H69, GXF-209, HepG2, OVAR-3, PANC-1, DU-145, LNCAP, HL-60, K-562 e MOLT-4 foram obtidas da Coleção NorteAmericana de Cultivos de Tipos (ATCC, Manassas VA) ou do Instituto Nacional de Câncer (NCI, Frederick MD). Meios RPMI1640, dipeptídeo- -L-glutamina (HyQ SG-200) e HEPES foram obtidos por meio da Hyclone (Logan UT).

Soro de feto bovino (FBS) foi obtido por meio da Sigma-Aldrich (St. Louis MO) . DMSO foi adquirido da Fisher Chemicals (Fair Lawn NJ) . O reagente do Teste de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo foi . obtido por meio da Promega Corporation (Madison WI). Todos os plásticos de cultivo de tecido foram obtidos por meio da Corning Incorporated (Nova Iorque NY) . O Composto 100 e o Composto 102 foram fornecidos pela Lixte Biotechnology Holdings, Inc. (East Setauket NY).

Todas as linhagens celulares foram cultivadas rotineiramente duas vezes por semana em meio RPMI-1640 suplementado com 2 mM de dipeptídeo L-glutamina, 10 mM de HEPES e 10% FBS.

As linhagens celulares aderentes células MDA-MB231, HT-29, NCI-H460, NCI-H522, GXF-209; HepG2, OVAR-3, PANC1, DU-145 e LNCAP foram semeadas em duas placas com 96 cavidades a 2500 células por cavidade em um volume total de

69/77 μΐ e incubadas em um incubador de cultivo de células de CO₂ a 5% umidificado a 37 °C por uma noite. As linhagens de células em suspensão NCI-H69, HL-60, K-562 e MOLT-4 foram semeadas em duas placas com 96 cavidades a dez mil células por cavidade em um volume total de 50 μΐ e incubadas em um incubador de CO₂ a 5% umidificado a 37 °C por uma noite.

Um estoque de 20 mM de droga hidrossolúvel Composto 100 foi elaborado em água estéril e estoques de 20 mM de Composto 102 foram elaborados em DMSO. Isso foi seguido pela elaboração de 2X estoques das concentrações finais necessárias em meio RPMI-1640. 50 μΐ das soluções padrão 2X foram adicionados às cavidades apropriadas, que continham 50 μΐ de células e meio para gerar as concentrações finais descritas no Apêndice. A concentração superior do Composto 100, foi - esterilizada pôr’~filtragem antes do uso. Foram adicionados 50 μΐ de meios aos meios e cavidades de controle de células e 50 μΐ de uma solução padrão 2X DMSO imitação foram adicionados às células de controle de veículos. Ao mesmo tempo em que as drogas eram adicionadas às células, uma das placas de cada linhagem celular foi utilizada para o teste CellTiter-Glo conforme descrito abaixo, para a fim de obter valores de Dia 0 para cada linhagem celular. Após um período de incubação de 72 horas, o teste CellTiter-Glo foi realizado sobre a placa remanescente.

TESTE CELLTITER-GLO

O teste foi realizado conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, placas foram removidas do incubador e colocadas sobre a bancada sob temperaturas ambiente por trinta minutos. As placas não foram empilhadas. Após a incubação por trinta minutos à temperatura ambiente, 100 μΐ de reagente CellTiter-Glo foram adicionados a cada cavidade sobre a placa e misturados por dois minutos, seguidos por incubação por dez minutos adicionais à

ΊΟ/ΊΊ temperatura ambiente. A luminescência foi registrada em seguida utilizando o contador de luminescência e cintilação Perkin Elmer Microbeta (Trilux).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Estes estudos foram realizados conforme descrito em

Materiais e Métodos, com os dados brutos e configuração de placas descritos no Apêndice. Os valores IC50 obtidos para cada droga em cada linhagem celular são descritos na Tabela

5. A representação gráfica do efeito dos compostos em cada 10 linhagem celular, junto com as adequações de curvas associadas, é ilustrada nas Figuras 19A a N.

A maior parte das linhagens celulares testadas foi sensível a todas as drogas na faixa com baixo μΜ (Tabela 5) . 0 Composto 100 e o Composto 102 possuem^ atiy idade 15₌ significativa- -(aproximadamente igual para todas as linhagens à droga anticancerígena utilizada clinicamente como comparador positivo, doxorubicina). As drogas foram ativas contra linhagens celulares de: câncer de mama; câncer do cólon; os três tipos principais de câncer do pulmão, células 20 grandes, adenocarcinoma e células pequenas; câncer do estômago; câncer do fígado (hepatoma); adenocarcinoma do ovário; carcinoma do pâncreas, dois tipos de carcinoma da próstata; e três tipos de leucemia, promilocítica, mielocítica crônica e linfocítica aguda (Tabela 5).

Tabela 5: Concentração do Composto 100 e 102 que

Resulta em Inibição de 50% da Proliferação (IC50) Obtida das Adequações de Curvas de Quatorze Linhagens de Células de

Câncer Humano (Figuras 19A a N)

Linhagem celular	IC₅₀ μΜ
Tipo de câncer	Composto 100	Composto 102
MDA-MB-231 Mama	9,5	6,6
HT-29 Cólon	5,3	3,6

Ί1/ΊΊ

NCI-H460 Pulmão: células grandes	24,3	17,5
NCI-H522 Pulmão adenoca	3,4	2,2
NCI-H69 Pulmão: células pequenas	23,9	24,6
GXF-209 Estômago	7,9	5,3
HepG2 Fígado	31,6	22,1
OVCAR-3 Ovário adenoca	2,9	5,1
PANC-1 Pâncreas	25,1	20,7
DU-145 Próstata	16,4	13,0
LNCAP Próstata	1,5	0,48
HL-60 - - - - LeücémTã promielocítico	7,7	6,5
K-562 Leucemia mielo crônico	10,7	13,7
MOLT-4 agudo linfo	5,7	5,6

EXEMPLO 6: ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

A população crescente de pacientes com comprometimento imunológico devido a transplantes, HIV/AIDS e câncer, principalmente leucemia, resultou em um aumento das 5 infecções fúngicas severas. Os fungos mais frequentemente recuperados de infecções nesses pacientes são Aspergillus spp e Candida spp. Terapias eficazes são disponíveis para o tratamento de Candida spp, mas permanece a preocupação sobre o tratamento de infecções causadas por Aspergillus spp, que 10 são associadas a alta mortalidade no hospedeiro imunocomprometido. Essas infecções são de difícil limpeza neste grupo de pacientes, de forma a aumentar a necessidade de agentes com boa atividade contra esses fungos. Além disso, infecções fúngicas trabalhosas menos sérias, mas crônicas das

72/77 unhas e da pele dos pés e das mãos, as dermatofitoses, afetam milhões de pessoas em todo o mundo. Como resultado do cenário mutante de infecções fúngicas e da falta de uma cura geral para essas infecções, os Compostos 100 e 102 estão passando por testes para possível desenvolvimento futuro.

MATERIAIS E MÉTODOS

Testes antifúngicos foram completados com um lote comum para os Compostos 100 e 102.

Uma porção de 10 mg de cada pó foi pesada e adicionada a 1 ml de água destilada estéril para o Composto 100 e DMSO para o Composto 102. A concentração resultante de 10 pg/ml foi diluída em uma concentração de trabalho de 64 0 pg/ml para cada composto. Todas as diluições subsequentes foram também realizadas utilizando os diluentejs correspondentes ; Concentrações de teste finais variaram de 0,125 a 64 pg/ml.

RESULTADOS

Um totaf de 23 isolados foi testado para incluir 3 Candida albicans, 3 Candida glabrata, 3 Cryptococcus neoformans, 3 Aspergillus fumigatus, 3 Rhizopus oryzae, 3 Fusarium solani, 3 Pseudallescheria boydii e 2 Trichosporon rubrum. Todos os isolados foram isolados clínicos submetidos ao Laboratório de Testes com Fungos para avaliaçao. Testes de susceptibilidade antifúngica foram realizados conforme os métodos descritos no Comitê Nacional de Padrões de Laboratórios Clínicos, M-27A2, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard, e M3 8-A, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of ConidiumForming Filamentous Fungi; Approved Standard. Estes incluem teste em RPMI-1640 com glutamina e sem bicarbonate, um tamanho de inoculado de 0,5 a 2,5 x 10³ para leveduras ou 1 a 5 x 10⁴ para fungos e incubação a 35 °C por 24 e 48 horas. A

Ί3/ΊΊ concentração inibidora mínima (MIC) foi definida como a concentração mais baixa que resultou em uma redução de 50% da turvação em comparação com um tubo controle livre de drogas para a levedura e 80% de inibição para os moldes.

Embora não se observasse a atividade do Composto

100 nos níveis testados, descobriu-se atividade significativa para o Composto 102 contra T. rubrum (Tabela 6).

CONCLUSÃO

Dependendo dos níveis deste composto que podem ser 10 atingidos em pacientes humanos, perfis de segurança e outros fatores pertinentes, este composto pode ser um combatente viável das infecções dermatofíticas causadas por Trichosporon rubrum.

Tabela 6

_¥ _ -- . - - — -	_ _ .. = · — · - ⁼	Composto' 100/24 horas	Composto 100/48 horas	Composto 102/24 horas	Composto 102/48 horas
CP	Controle	>64	>64	>64	>64
07-3006	C. albicans	>64	>64	>64	>64
07-3011	C. albicans	>64	>64	>64	>64
07-3012	C. albicans	>64	>64	>64	>64
07-2964	C. glabrata	>64	>64	>64	>64
07-2965	C. glabrata	>64	>64	>64	>64
07-3013	C. glabrata	>64	>64	>64	>64
07-2665	C. neoformans	>64	>64	>64	>64
07-2737	C. neoformans	>64	>64	>64	>64
07-2829	C. neoformans	>64	>64	>64	>64
07-1870	R. arrhizus	>64	>64	>64	>64
07-2044	R. arrhizus	>64	>64	>64	>64
07-2078	R. arrhizus	>64	>64	>64	>64
07-1399	F. solani	>64	>64	>64	>64
07-1755	F. solani	>64	>64	>64	>64
07-1867	F. solani	>64	>64	>64	>64
07-1333	P. boydii	>64	>64	>64	>64
07-1502	P. boydii	>64	>64	>64	>64
07-1601	P. boydii	>64	>64	>64	>64
05-388	A. fumigatus	>64	>64	>64	>64
06-4126	A. fumigatus	>64	>64	>64	>64
07-2039	A. fumigatus	>64	>64	>64	>64
07-1743	T. rubrum	>64	>64	2	2
07-2055	T. rubrum	>64	>64	2	2

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	Patente	Norte-Americana	n° 6.949.624,	Liu et al.
	Patente	Norte-Americana	Publicada	n°	2004/0197888,
Armour et	al.
	Patente	Norte-Americana	Publicada	n°	2004/0253637,
Buechler	et al.
	Patente	Norte-Americana	Publicada	n°	2005/0203082,
Hsu et al	.
	Patente	Norte-Americana	Publicada n°

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1931-1935.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. COMPOSTO caracterizado por compreender

O

Petição 870190100409, de 07/10/2019, pág. 5/11
2/4

O

Petição 870190100409, de 07/10/2019, pág. 6/11
3/4

CO2Me

NCH₃

CO₂Me

NCH₃

O

ou um sal ou íon dipolar do composto.

2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação caracterizado por compreender a estrutura

ou um sal ou íon

3. COMPOSIÇÃO dipolar do composto.

FARMACÊUTICA caracterizado por compreender o composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. USO DO COMPOSTO, conforme definido em qualquer

Petição 870190100409, de 07/10/2019, pág. 7/11

4/4 uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por ser na produção de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção fúngica ou na produção de um medicamento o tratamento de câncer de mama, câncer do cólon, câncer do pulmão de células grandes, adenocarcinoma de pulmão, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do estômago, câncer do fígado, adenocarcinoma do ovário, carcinoma do pâncreas, carcinoma da próstata, leucemia promilocítica; leucemia mielocítica crônica, leucemia linfocítica aguda, glioblastoma multiforme, câncer do colorretal ou câncer de ovário.
5. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definido na reivindicação 3, caracterizado por ser na produção de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção fúngica ou na produção de um medicamento o tratamento de câncer de mama, câncer do cólon, câncer do pulmão de células grandes, adenocarcinoma de pulmão, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do estômago, câncer do fígado, adenocarcinoma do ovário, carcinoma do pâncreas, carcinoma da próstata, leucemia promilocítica; leucemia mielocítica crônica, leucemia linfocítica aguda, glioblastoma multiforme, câncer do colorretal ou câncer de ovário.