BRPI0711557A2

BRPI0711557A2 - métodos para determinar uma quantidade de um primeiro analito em uma amostra pela espectroscopia de massa e para triar sangue pela espectroscopia de massa quanto a pelo menos um distúrbio, e, substrato sólido

Info

Publication number: BRPI0711557A2
Application number: BRPI0711557-1A
Authority: BR
Inventors: Blas Cerda
Original assignee: Perkinelmer Las Inc
Priority date: 2006-05-05
Filing date: 2007-05-04
Publication date: 2011-11-08
Also published as: CA2651227C; AU2007248476B2; CA2651227A1; CN101484808A; EP2018566A1; CN101484808B; US20070259445A1; AU2007248476A1; WO2007130629A1

Abstract

MéTODOS PARA DETERMINAR UMA QUANTIDADE DE UM PRIMEIRO ANALITO EM UMA AMOSTRA PELA ESPECTROSCOPIA DE MASSA E PARA TRIAR SANGUE PELA ESPECTROSCOPIA DE MASSA QUANTO A PELO MENOS UM DISTúRBIO, E, SUBSTRATO SóLIDO. Um substrato que incorpora um padrão interno facilita analitos quantitativos em uma amostra pelas técnicas de espectroscopia de massa que apuram a superficie sem preparação de amostra da química úmida. O usuário coloca em posição uma amostra a ser analisada sobre a superficie do substrato pré tratado. Depois o substrato sólido que carrega a amostra, que incorpora um padrão interno para cada analito a ser quantificado, está pronto para a apuração.

Description

"MÉTODOS PARA DETERMINAR UMA QUANTIDADE DE UM PRIMEIRO ANALITO EM UMA AMOSTRA PELA ESPECTROSCOPIA DE MASSA E PARA TRIAR SANGUE PELA ESPECTROSCOPIA DE MASSA QUANTO A PELO MENOS UM DISTÚRBIO, E, SUBSTRATO SÓLIDO"

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

Esta invenção diz respeito às técnicas espectrométricas de massa que apuram a superfície. Em particular, esta invenção diz respeito ao uso destas técnicas para a análise quantitativa de etapa única de amostras colocadas em posição em superfícies.

Informação de Fundamentos

A cada ano, pelo menos 4 milhões de bebês - mais do que 98 % de todas as crianças recém-nascidas - nos Estados Unidos são testadas quanto a distúrbios congênitos que, não diagnosticados, podem causar retardo mental, doença grave e morte prematura em crianças. Os distúrbios metabólicos específicos (por exemplo, fenilcetonúria (PKU), distúrbios hematológicos (por exemplo, doença de célula falciforme) e endocrinopatias (por exemplo, hipotireoidismo) podem ser cada um diagnosticados determinando-se se os níveis sangüíneos de um analito tal como um aminoácido, variante de hemoglobina ou hormônio, respectivamente, que correspondem ao distúrbio específico estão dentro dos níveis normais esperados.

Tipicamente uma amostra de sangue tirada de um calcanhar do bebê no hospital, dentro de 48 horas do nascimento, é colocado sobre um cartão de papel de filtro. Fixado deste modo sobre o cartão, a "mancha de sangue" é estável e facilmente conduzida até que a preparação e análise da amostra sejam realizadas. No geral, estas etapas não são manipuladas nos hospitais onde as amostras são coletadas, mas ao invés as amostras são enviadas a uma instalação de saúde pública estadual ou outro laboratório participante e processadas em uma escala maior.

A espectroscopia de massa é bem adequada para esta análise por que a mesma é capaz de certificar a quantidade de vários analitos distintos simultaneamente e conseqüentemente pode triar quanto aos muitos distúrbios em um ensaio. Nao obstante, cada ensaio inclui diversas etapas de preparação, cada uma apresentando oportunidades para introduzir erro devido à contaminação da amostra ou perda de analito. A saber, de modo a detectar analitos de interesse por este método, uma porção do cartão de papel de filtro que carrega a amostra é perfurado e colocado em um reservatório de amostra para extrair o sangue com solvente. Em alguns casos, o analito também é derivado. De modo a quantificar os analitos detectados, a preparação de amostra deve além disso incluir a adição à amostra eluída de uma quantidade conhecida de um padrão interno para cada analito.

Os desenvolvimentos recentes na espectroscopia de massa têm facilitado a detecção de analitos diretamente de amostras em superfícies, eliminando a necessidade quanto aos procedimentos de preparação de amostra que colocam a amostra em solução. A primeira técnica de espectroscopia de massa ambiente, DESI (ionização por eletropulverização de dessorção) usa uma pulverização de líquido, tal como de metanol ou metanol aquoso, pulverizado sobre uma superfície que constitui o espécime de interesse de modo a produzir íons do espécime. Estes íons são puxados no espectrômetro de massa para a análise. (Ver, por exemplo, Takats et al., "Mass Spectroscopy Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization" Science; 2004; 36, 471-3; e Publicação do Pedido de Patente U.S. Nq 2005/0230635).

Na técnica comercial conhecida como DART (Análise Direta em Tempo Real), espécies em estado excitado (moléculas de hélio ou nitrogênio metaestáveis) reagem com moléculas na amostra e com moléculas atmosféricas tais como água para formar íons que são puxados no espectrômetro de massa. (Ver, por exemplo, Cody et al., "Versatile New Ion Source for the Analysis of Materials in Open Air under Ambient Conditions", Anal. Chem.; 2005; 77(8), 2297-2302 e Publicação do Pedido de Patente U. S. N2 2005/0196871).

DESI e DART foram usados para a apuração qualitativa de uma ampla faixa de superfícies diretamente, obtendo-se deste modo espectros de massa de alta qualidade para uma ampla faixa de moléculas. Compostos incluindo explosivos, imitadores de combate química, aminoácidos, peptídeos, proteínas, moléculas medicamentosas, alcalóides, terpenóides e esteróides foram ionizados com êxito por estes métodos. Foi mencionado que fluidos biológicos podem ser diretamente analisados por DESI na forma de manchas secas sobre papel ou outra superfície apropriada. (Ver, por exemplo, Takats et al., "Ambient mass spectroscopy using desorption electrospray ionization (DESI: instrumentation, mechanisms and applications in forensics, chemistry and biology," J. Mass Spectrom.; 2005; 40: 1261-1275). Um espectro de DESI contendo centenas de picos identificando componentes de amostra de fluidos secos tais como sangue, urina ou plasma pode ser montado em menos do que um minuto.

Além disso, a determinação quantitativa de componentes do sangue diagnosticamente relevantes - por exemplo, acilcarnitinas, ácidos biliares, glicose, creatinina e bilirrubina -, por DESI foi proposta. Tal quantificação seria feita possível pela adição de padrões internos rotulados com isótopo a uma amostra de sangue antes da deposição sobre o substrato.

Adotar uma técnica tipo DESI para triar sangue reduziria o número de etapas preparatórias comparadas com a prática corrente. Entretanto, ao contrário da prática de triagem de sangue quantitativa corrente, esta exigência moveria a química úmida preparatória da amostra residual da instalação analítica especializada para o hospital. Mudar mais da carga do programa de triagem para os hospitais expande a complexidade do procedimento entre um número maior de instalações e técnicos, introduzindo mais variabilidade na preparação de amostra e, por este motivo, um risco enorme de erro no resultado da análise.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornecer um método para quantificar um ou mais analitos em uma amostra pelas técnicas de espectroscopia de massa que apuram a superfície. O método é possibilitado por um novo substrato sólido que carrega a constituição da amostra que incorpora um padrão interno. O substrato da invenção compreende um material de suporte e uma quantidade conhecida de um padrão interno, incorporado antes da deposição da amostra na superfície, para cada analito a ser quantificado.

De acordo com o método da invenção, uma amostra a ser analisada é depositada sobre o substrato preparado. Depois o substrato é submetido a uma espectrometria de massa que apura a superfície, que acarreta necessariamente a transferência de energia para a superfície do substrato de modo a ionizar, quanto a cada analito designado, um componente na amostra e o padrão interno correspondente e depois classificando os íons em um espectrômetro de massa para determinar as concentrações de sinal relativo. Usando os dados resultantes, a presença e quantidade de analitos é avaliada. A capacidade de classificação da espectrometria de massa torna possível quantificar diversos analitos em uma única rodada. Em princípio, esta capacidade é generalizável para a análise de etapa única de uma amostra contendo qualquer número de analitos.

Por exemplo, para avaliar os níveis diagnosticamente relevantes de aminoácidos e carnitinas em sangue de crianças, a invenção fornece um substrato preparado que incorpora padrões internos na forma de análogos isotopicamente rotulados dos aminoácidos e carnitinas. A amostra de sangue pode ser depositada sobre o substrato imediatamente depois de coletá-lo do recém nascido ou logo a seguir em um laboratório hospitalar. O substrato que carrega a amostra está depois pronto para ser tomado em lugar não especificado para análise, sem nenhuma outra preparação. Durante uma análise os analitos e os padrões internos são ionizados juntos te o espectro de massa resultante indica os níveis dos analitos e dos padrões internos correspondentes. A partir destes dados a concentração de cada analito na amostra de sangue pode ser calculada. Para distúrbios tendo os diagnósticos mais diretos, a amostra de sangue pode ser julgada como estando dentro ou fora da faixa normal esperada para um único analito indicativo. Para distúrbios tendo diagnósticos mais complexos, os níveis de diversos analitos podem ser relevantes.

A invenção não é limitada à análise de espectroscopia de massa de sangue ou mesmo aos líquidos biológicos como uma classe. Ao invés, o método da invenção é adaptável à quantificação de qualquer analito tendo um padrão interno correspondente suscetível de unir a um material de suporte para formar o substrato da invenção e depois suscetível de ionização durante o processo que apura a superfície.

Tampouco é o método da invenção limitado a qualquer técnica particular para ionizar o componente de interesse sobre o substrato. Qualquer técnica capaz de ionizar analitos presentes em uma superfície pode ser usada para gerar as espécies carregadas para entrada no espectrômetro de massa. Por exemplo, ao invés de direcionar as partículas para o substrato como no método que apura a superfície já mencionado, radiação pode ser usada para remover o analito e o padrão interno do absorvente. A dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz (MALDI) é um tal método adaptável para a presente invenção. (Ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. N2 2007/0065949).

O substrato sólido da invenção pode incluir imateriais de suporte tais como os cartões de filtro usados na triagem de sangue (por exemplo, materiais de papel comercialmente disponíveis tais como FTA® e Schleicher, Schueil 903 e papéis CEP assim como outros materiais de "cartão de sangue" comerciais), vidro, produtos têxteis, cerâmicas, resina, metais e metalóides - qualquer material adequado para receber uma amostra e capaz de reter estavelmente o padrão interno selecionado até a análise.

Além disso, o substrato da invenção pode ter qualquer um de uma variedade de formatos físicos. Além do cartão de papel familiar usado para armazenar manchas de sangue, os exemplos incluem uma membrana; mecha; uma superfície configurada como um tubo, coluna, lâmina ou vaso; uma pérola oca ou sólida; um particulado fino; um gel; e uma matriz. Como aqui usado, "substrato sólido" denota um substrato na fase sólida ou um semissólido - como oposto, por exemplo, a uma solução líquida - sem considerar a porosidade do substrato ou quaisquer cavidades deste modo incluídas.

O termo "que incorpora," como aqui usado com referência para o substrato e um padrão interno, denota que o padrão interno é uma parte integral estável do substrato sob condições normais de armazenagem e manuseio até a exposição aos meios de apuração. Equivalentemente, o substrato pode ser descrito como um padrão interno unido ou fixo a um material de suporte. O substrato preparado pode incorporar um padrão interno em qualquer maneira física que permite a formação de íons de padrão interno adequados a partir do padrão interno durante a apuração.

Similarmente, a amostra no substrato que carrega a amostra pode ocupar um volume distinto residindo na superfície ou ser parcial ou completamente absorvido de modo que o mesmo penetre o material de suporte. Conseqüentemente, a frase "colocar a amostra em posição na superfície" refere-se à maneira em que a amostra é transferida para o substrato preparado e não impede um substrato de absorver a amostra da superfície.

Através da incorporação do padrão interno para constituir um substrato preparado, a invenção remove a necessidade para introduzir o padrão interno na amostra convenientemente antes da deposição. Assim, a preparação de amostra simplificada produzida pelas técnicas de espectroscopia de massa que apuram a superfície não é mais limitada à detecção do analito. A invenção estende este benefício à análise quantitativa. Deste modo, a invenção possibilita a análise espectrométrica de massa rápida e precisa. No caso de triagem de saúde, este benefício se traduz em risco reduzido de diagnósticos positivos ou negativos falsos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A descrição de invenção abaixo refere-se aos desenhos anexos, dos quais:

As FIGs. 1A a 1D representam um substrato da invenção tendo um revestimento de superfície de um padrão interno, A FIG. 1A sendo uma vista do plano de topo, a FIG. IB uma elevação do substrato preparado da invenção e as FIGs 1C e 1D sendo as vistas correspondentes do substrato preparado que carrega uma amostra para análise;

As FIGs. 2A a 2B representam um substrato da invenção tendo um padrão interno difuso em uma camada de topo do material de suporte, a FIG. 2A sendo uma vista do plano de topo do substrato que carrega uma amostra e a FIG. 2B uma elevação;

As FIGs. 3A a 3B representam um substrato da invenção tendo um padrão interno impregnando o material de suporte em uma extremidade do substrato, a FIG. 3 A sendo uma vista do plano de topo do substrato que carrega uma amostra e a FIG. 3B uma elevação correspondente;

As FIGs. 4A a 4B representam um substrato da invenção tendo um padrão interno impregnando o material de suporte inteiro, FIG. 4A sendo uma vista do plano de topo do substrato que carrega uma amostra e a FIG. 4B um elevação correspondente; e

A FIG. 5 esquematicamente representa um sistema de espectroscopia de massa que apura a superfície compatível com a invenção.

As apresentações nos desenhos, no geral, não são desenhos em escala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE UMA FORMA DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVA

O substrato sólido preparado da invenção compreende um padrão interno unido a um material de suporte. A FIG. 1 mostra as características particulares de uma forma de realização ilustrativa de um substrato sólido 10. Uma placa 12 de material de suporte tendo uma face de topo 14 que é coberta por uma camada substancialmente distinta 16 contendo o padrão interno. Para o uso na análise pela espectroscopia de massa, uma amostra é depositada sobre o substrato 10 de modo que a amostra S seja colocada em posição no topo da camada 16. Com referência à FIG. 2, em uma outra forma de realização, o padrão interno está contido em uma camada de infusão 26 que penetra a placa 12 de material de suporte. Para a análise, a amostra S é colocada em posição no topo da face 14 do material de suporte, na camada de infusão 26. Com referência à FIG. 3, em uma outra forma de realização o padrão interno permeia a profundidade inteira da placa 12 de material de suporte em uma extremidade para formar uma zona de infusão 36.

Para a análise, a amostra S é colocada em posição no topo da face 14 da placa 12 de material de suporte. Com referência à FIG. 4, já em uma outra forma de realização o padrão interno permeia a profundidade inteira da placa 12, de modo que o material de suporte inteiro seja um volume infundido 46. Para a análise, a amostra S é depositada na face 14 da placa 12, a partir da qual a mesma é absorvida na placa 12.

A placa de suporte 12 de substrato 10 inclui papel, vidro, produtos têxteis, cerâmicas, metais ou plásticos tais como poliestireno, polietileno glicol, divinilbenzeno; metacrilato, polimetacrilato, poliacriloilmorfolida, poliamida, poli(tetrafluoroetileno), polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poli(tereftalato de etileno), náilon, poli(butirato de vinila), difluoreto de polivinilideno (PVDF), siliconas, poliformaldeído. Silicato agarose, acetato de celulose, nitrocelulose, algodão, raion e plásticos naturais também são materiais candidatos para o material de suporte.

A invenção não limita a maneira em que o padrão interno é unido ao material de suporte no substrato 10. O padrão interno pode ser secado em toda ou parte de uma face do material de suporte, infundido ou espalhado em uma porção ou por todo do material de suporte, quimicamente ligado ao material de suporte ou de outro modo ligado covalente, não covalentemente, por intermédio de ligação de hidrogênio, forças capilares ou tensão superficial ao material de suporte. A união ao material de suporte pode ser efetuada por métodos tais como pulverização do padrão interno sobre uma face do material de suporte; embebimento de um material de suporte em uma solução contendo o padrão interno; ou formando-se o substrato a partir de uma pasta fluida contendo o padrão interno junto com o precursor a partir do qual o material de suporte é formado. Métodos para impregnar papel com materiais químicos, por exemplo, são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, como descrito, na Patente U. S. N° 6.890.481.

A FIG. 4 esquematicamente ilustra o substrato 10 das FIGs 1 a 3 como o mesmo é usado com um sistema de espectroscopia de massa que apura superfície. Um sistema DESI 40 adequado para o uso na presente invenção usa um dispositivo de eletropulverização convencional 41 para gerar uma pulverização 42. Qualquer dispositivo capaz de gerar uma corrente de gotícuias líquidas transportadas por um jato de gás nebulizador pode ser usado para formar a pulverização de DESI 42.

O dispositivo 40 inclui um capilar de pulverização 43 através do qual um solvente líquido 44 é alimentado. Um capilar nebulizador 45 circunda o capilar de pulverização 43 para formar um espaço anelar através do qual um gás nebulizador 46 é alimentado em alta velocidade. Nitrogênio é um candidato típico para o gás nebulizador 46. Metanol aquoso tem sido usado para o solvente líquido 44.

Uma fonte de energia 47 aplica uma voltagem alta ao solvente líquido 44. A interação entre o gás nebulizador de fluxo rápido 46 e o líquido 44 que deixa o capilar 43 forma a pulverização dessortiva, ionizante 42 que compreende gotículas líquidas. A pulverização 42 também pode incluir moléculas atmosféricas neutras, gás de nebulização e íons gasosos.

A pulverização 42 é direcionada sobre o material de amostra S que é sustentado em um substrato preparado 10 que incorpora um padrão interno. O substrato 10 pode estar em uma plataforma móvel por meios de acionamento bem conhecidos para dessorver e ionizar áreas diferentes da amostra S com o tempo, por exemplo para efetuar um rastreio da superfície do substrato inteira. O potencial elétrico e a temperatura de uma tal plataforma também podem ser controlados por meios conhecidos.

Uma linha de transferência de íon 52 coleta os íons dessorvidos 54 que deixam o substrato 10 e os introduz na entrada ou interface atmosféricas 56 de um espectrômetro de massa para a análise. Qualquer interface atmosférica que seja normalmente encontrada em espectrômetros de massa é adequada para o uso em um sistema do tipo DESI. As interfaces que foram descobertas funcionar bem incluem uma interface atmosférica capilar aquecida típica e uma interface atmosférica que amostra por intermédio de uma linha de transferência de íon flexível estendida feita de metal ou um isolante.

Considerações informando a seleção de um padrão interno incorporado no substrato 10 para a avaliação de um analito particular por uma configuração experimental particular são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. No geral um padrão interno adequado é quimicamente similar ao analito, que é o que é intencionado por um padrão interno "que corresponde" ao analito. Além disso, o padrão interno deve ser resolvível a partir do analito usando a espectroscopia de massa. Finalmente, o padrão interno não reage quimicamente com o analito e substancialmente não contém nenhuma quantidade traço do analito.

Uma forma isotopicamente rotulada estável do analito é habitualmente encontrada para preencher estas exigências. Referências publicadas extensivas fornecem orientação quanto a seleção de um padrão interno por aqueles habilitados na técnica. (Ver, por exemplo, Liu et al., "Selecting a appropriate isotopic internai standard for gas chromatography/mass spectroscopy analysis of drugs of abuse -pentobarbital example," J. Forensic Sci.; Nov. 1995; 40(6): 938-9). A quantidade absoluta de padrão interno detectado durante uma análise de amostra pode ser pré determinada por testes empíricos do padrão interno particular incorporado em um substrato particular sob condições de ionização especificadas. Tipicamente, a quantidade do padrão interno está bem acima do limite de quantificação mas não tão alto como para suprimir a ionização do analito.

Uma variedade de tipos de amostras pode ser analisada usando os métodos aqui descritos, incluindo amostras biológicas, médicas, industriais, agrícolas, de laboratório e alimentícias. Para as aplicações biológicas e médicas, as amostras podem incluir qualquer fluido biológico, célula, tecido ou fração destes, que incluam moléculas que correspondam aos padrões internos selecionados. Uma amostra pode ser, por exemplo, um espécime obtido de um paciente (por exemplo, um mamífero tal como um ser humano) ou pode ser derivada de um tal paciente. Por exemplo, uma amostra pode ser uma seção de tecido obtida pela biópsia ou células que são colocadas em ou adaptadas para cultura de tecido. As amostras exemplares portanto incluem fibroblastos cultivados, células de fluido amniótico cultivadas e amostra de vilo coriônico. Uma amostra também pode ser um espécime de fluido biológico tal como urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, catarro, fluido cérebro espinhal, lágrimas, muco e outras. Uma amostra pode ser ainda fracionada, se desejado, a uma fração contendo tipos de célula particulares. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada em soro ou em frações contendo tipos particulares de células sangüíneas tais como células sangüíneas vermelhas ou células sangüíneas brancas (leucócitos). Se desejado, uma amostra pode ser uma combinação de amostras de um paciente tal como uma combinação de um tecido e amostra fluida e outras. Métodos para a obtenção de amostras que preservem a atividade ou a integridade de moléculas na amostra são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Tais métodos incluem o uso de tampões apropriados e/ou inibidores, incluindo iniciadores de nuclease, protease e fosfatase, que preservam ou minimizam as mudanças nas moléculas na amostra. Tais inibidores incluem, por exemplo, queladores tais como o ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), o ácido bis(Éter Paminoetílico)-N,N,NI,Nl-tetraacético de etileno glicol (EGTA), inibidores de protease tais como fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), aprotinina, leupeptina, antipaína e outros e inibidores de fosfatase tais como fosfato, fluoreto de sódio, vanadato e outros. Os tampões apropriados e condições para isolar moléculas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem ser variados dependendo, por exemplo, do de molécula na amostra a ser caracterizada (ver, por exemplo, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nova Iorque (1999); Harlow e Lane, Anticorpos: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinicai Chemistry, 3a ed. Burtis e Ashwood, eds. W. B. Saunders, Filadélfia, (1999)).

A invenção é bem adaptada para triar sangue de recém- nascido, que no geral envolve ensaiar mais do que vinte analitos em uma amostra. As Tabelas 1 e 2 listam analitos tipicamente testados em um ensaio de sangue de recém-nascido. Para muitos dos distúrbios diagnosticáveis usando os níveis sangüíneos de recém-nascido destes analitos, diversos critérios para o diagnóstico foram relatados na literatura. Por exemplo, a fenilcetonúria pode ser indicada apenas pelo nível de fenilalanina (como relatado por CDC; U.S. Department of Health and Human Services, "Using Tandem Mass Spectroscopy for Metabolic Disease Screening Among Newborns," MMTYR13 de abril de 2001; Vol. 50, N° RR-3; Rashed et al, Clinicai Chemistry; 1997; 43(7): 1129-41; e The Wisconsin NBS Laboratory - Wisconsin State Laboratory of Hygieno, "Health Professionals Guide to Newborn Screening," recuperado em 28 de outubro de 2003, do site da web do The Board of Reagents of the University of Wisconsin System). Alternativamente, o nível de tirosina pode ser adicionalmente considerado (ACMG/ASHG Test and Technology Transfer Committee. Working Group, Tandem Mass Spectroscopy in Newborn Screening, Genetics in Medicine; Julho/Agosto de 2000; 2(4); e Schulze et al., Pediatrics; 2003; 111(6): 1399- 1406). Um terceiro método considera o nível de fenilanalina e a razão Phe/Tyr (Zytkovicz et al, Clinicai Chemistry; 2001; 47(11): 1945-55).

Seis critérios foram relatados para diagnosticar o distúrbio de oxidação de ácido graxo conhecido como deficiência da acil-CoA desidrogenase de cadeia média (MCAD), nenhum dos quais contam com um único indicador. Um paradigma usa os níveis de C8 e C10:1. (ACMG/ASHG Test and Technology Transfer Committee Working Group). Um segundo adicionalmente usa os níveis de C10 e C6 (CDC). Um terceiro considera a razão de C8/C10 além do quarto nível individual (Chace et al., Clinicai Chemistry; 2001; 47: 1166-82). Um quarto método considera apenas os níveis de C6, C8, C10:1 (Bashed et al. e Zytkovicz et al.). Um quinto método considera os níveis individuais de C6, C8, C10 e as razões C8/C2, C8/C10 e C8/C12 (Schulze et al). Um sexto seleciona os níveis individuais de C6, C8 e C10: 1 e a razão C8/C10 (Wisconsin NBS Laboratory). O substrato da invenção é capaz de incorporar padrões internos para todos estes diversos analitos. Tabela 1 Aminoácidos ensaiados na triagem de sangue de recém-nascido

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Tabela 2. Carnitinas ensaiadas na triagem de sangue de recém-nascido

<table>table see original document page 15</column></row><table> Será portanto observado que o precedente representa um método altamente vantajoso para a espectroscopia de massa de apuração de superfície quantitativa, especialmente para a quantificação de componentes do sangue. Os termos e expressões aqui utilizadas são usadas como termos de descrição e não de limitação e não existe nenhuma intenção, no uso de tais termos e expressões, de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções destas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.

Claims

1. Método para determinar uma quantidade de um primeiro analito em uma amostra pela espectroscopia de massa, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer um substrato sólido tendo uma superfície e que incorpora uma quantidade conhecida de um primeiro padrão interno que corresponde ao primeiro analito; b. colocar a amostra em posição na superfície; c. transferir energia ao substrato de modo a ionizar o primeiro analito e o primeiro padrão interno, gerando deste modo íons do primeiro analito e íons do primeiro padrão interno; d. coletar os íons do primeiro analito e os íons do primeiro padrão interno em um espectrômetro de massa de modo a gerar um sinal do primeiro analito a partir dos íons do primeiro analito e um sinal do primeiro padrão interno a partir dos íons do primeiro padrão interno; e. calcular a quantidade do primeiro analito com base no sinal do primeiro analito, no sinal do primeiro padrão interno e na quantidade conhecida do primeiro padrão interno.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende sangue.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transferência de energia para o substrato é realizada bombardeando-se a superfície com partículas.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as partículas são transferidas pela pulverização.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as partículas são carregadas.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as partículas estão em estados excitados eletricamente neutros.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transferência de energia para o substrato é realizada disparado-se um laser na superfície.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um aminoácido.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é um hormônio.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito é uma variante da hemoglobina.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato incorpora uma quantidade conhecida de um segundo padrão interno que corresponde a um segundo analito a ser quantificado na amostra, a etapa de transferência de energia para o substrato ioniza o segundo analito e o segundo padrão interno para gerar íons do segundo analito e íons do segundo padrão interno, a etapa de coletar os íons também coleta os íons do segundo analito e os íons do segundo padrão interno no espectrômetro de massa e compreendendo ainda a etapa de calcular uma quantidade do segundo analito na amostra com base no sinal do segundo analito e no sinal do segundo padrão interno e na quantidade conhecida do segundo padrão interno.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o substrato incorpora ainda uma quantidade conhecida de cada um de uma pluralidade de padrões internos, cada um dos quais corresponde a um de uma pluralidade de analitos a serem quantificados na amostra, a etapa de transferência de energia para o substrato ioniza cada um da pluralidade de analitos e cada um da pluralidade de padrões internos para gerar íons de analito de cada um da pluralidade de analitos e íons de padrão interno de cada um da pluralidade de padrões internos, a etapa de coletar os íons também coleta a pluralidade de íons de analito e a pluralidade de íons de padrão interno no espectrômetro de massa de modo a gerar os respectivos sinais de analito e sinais de padrão interno e compreendendo ainda a etapa de calcular uma quantidade de cada um da pluralidade de analitos com base no respectivo sinal de analito, no respectivo sinal de padrão interno e na quantidade conhecida do respectivo padrão interno.

13. Método para triar sangue pela espectroscopia de massa quanto a pelo menos um distúrbio, um primeiro analito indicando um primeiro distúrbio, um primeiro padrão interno que corresponde ao primeiro analito, caracterizado pelo fato de qüe compreende as etapas de: a. fornecer um substrato sólido tendo uma superfície e que incorpora uma quantidade conhecida do primeiro padrão interno; b. colocar em posição o sangue na superfície; c. transferir energia para o substrato de modo a ionizar o primeiro analito e o primeiro padrão interno, gerando deste modo íons do primeiro analito e íons do primeiro padrão interno; d. coletar o primeiro analito e íons do primeiro padrão interno em um espectrômetro de massa de modo a gerar um sinal do primeiro analito a partir dos íons do primeiro analito e um sinal do primeiro padrão interno a partir dos íons do primeiro padrão interno; e. determinar se o primeiro distúrbio está presente calculando- se a quantidade do primeiro analito no sangue com base no sinal do primeiro analito e no sinal do primeiro padrão interno e na quantidade conhecida do primeiro padrão interno.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o substrato incorpora uma quantidade conhecida de um segundo padrão interno que corresponde a um segundo analito indicando um segundo distúrbio, a etapa de transferência de energia para o substrato ioniza o segundo analito e o segundo padrão interno para gerar íons do segundo analito e os íons do segundo padrão interno, a etapa de coletar os íons também coleta os íons do segundo analito e os íons do segundo padrão interno no espectrômetro de massa de modo a gerar um sinal do segundo analito a partir dos íons do segundo analito e um sinal do segundo padrão interno a partir dos íons do segundo padrão interno, compreendendo ainda a etapa de determinar se o segundo distúrbio está presente calculando-se uma quantidade do segundo analito no sangue com base no sinal do segundo analito e no sinal do segundo padrão interno e na quantidade conhecida do segundo padrão interno.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o substrato incorpora ainda uma quantidade conhecida de cada um de uma pluralidade de padrões internos, cada um dos quais corresponde a um de uma pluralidade de analitos cada um indicando um de uma pluralidade de distúrbios, a etapa de transferência de energia para o substrato ioniza cada um da pluralidade de analitos e cada um da pluralidade de padrões internos para gerar íons de analito de cada um da pluralidade de íons de analito e padrão interno de cada um da pluralidade de padrões internos, a etapa de coletar os íons também coleta a pluralidade de íons de analito e a pluralidade de íons de padrão interno no espectrômetro de massa de modo a gerar os respectivos sinais de analito e sinais de padrão interno e compreendendo ainda a etapa de determinar se cada um da pluralidade de distúrbios está presente calculando-se uma quantidade de cada um da pluralidade de analitos com base no respectivo sinal de analito, no respectivo sinal de padrão interno e na quantidade conhecida do respectivo padrão interno.

16. Substrato sólido para receber uma amostra a ser ensaiada quanto a um primeiro analito que corresponde a um primeiro padrão interno e para carregar a amostra durante a análise pela espectroscopia de massa, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um material de suporte; e b. uma quantidade conhecida do primeiro padrão interno unida ao material de suporte.

17. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o substrato é um cartão de papel.

18. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o material de suporte tem uma face, o primeiro padrão interno revestindo pelo menos uma porção da face.

19. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro padrão interno impregna o material de suporte.

20. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro padrão interno é unido ao material de suporte dissolvendo-se o padrão interno em um solvente para formar uma solução e imergindo pelo menos uma porção do material de suporte na solução.

21. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro padrão interno é unido ao material de suporte pulverizando-se o padrão interno sobre o material de suporte.

22. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o substrato recebe um fluido líquido que mais tarde seca sobre o substrato.

23. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a amostra recebida pelo substrato é sangue.

24. Substrato de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a amostra recebida pelo substrato é sangue.

25. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que uma quantidade conhecida de um segundo padrão interno é unido ao material de suporte, o segundo padrão interno que corresponde a um segundo analito a ser ensaiado na amostra.

26. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que uma quantidade conhecida de cada um de uma pluralidade de padrão interno é ainda unido ao material de suporte, cada um da pluralidade de padrões internos que corresponde a um da pluralidade de analitos a serem ensaiados na amostra.

27. Substrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica.

28. Substrato de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada de um fluido corporal ou tecido ou fração deste.