BRPI0717707A2 - Método para detectar a presença de plasmodium em uma amostra, fragmento de ácido nucléico, método para selecionar sondas de ácido nucléico e método para detectar e diferenciar espécies de protozoários - Google Patents
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Description
"MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE PLASMODIUM EM UMA AMOSTRA, FRAGMENTO DE ÁCIDO NUCLÉICO, MÉTODO PARA SELECIONAR SONDAS DE ÁCIDO NUCLÉICO E MÉTODO PARA DETECTAR E DIFERENCIAR ESPÉCIES DE PROTOZOÁRIOS".
Histórico da invenção
Plasmodium é um gênero de parasita protozoa. A infecção com este gênero de parasita é conhecida como malária. O parasita sempre tem dois hospedeiros em seu ciclo de vida: um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Pelo menos dez espécies infectam os humanos incluindo o P. falciparum, P. vivax, P. malariae, e P. ovale. A malária é uma doença infecciosa que é espalhada em regiões tropicais e subtropicais. A malária representa uma ameaça à sobrevivência dos homens, mulheres e crianças. Ela infecta entre 300 e 500 milhões de pessoas a cada ano e causa entre um e três milhões de doenças anualmente, predominantemente entre, crianças jovens na África subsariana.
A malária é uma das doenças infecciosas mais comuns e é um enorme problema na área de saúde pública. A doença é causada por parasita protozoa do gênero de Plasmodium. As formas mais sérias da doença são causadas por Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax e ainda por outras espécies relacionadas (Plasmodium ovale e Plasmodium malariae) pode também infectar seres humanos. Determinar as espécies infecciosas auxilia na determinação do curso do tratamento para o paciente.
O preferido e mais confiável diagnóstico de malária é o exame microscópio das lâminas de sangue, porque cada um das quatro maiores espécies tem características distintas. Dois tipos de lâminas de sangue são tradicionalmente utilizados. As lâminas finas são similares às películas de sangue usuais e permitem a identificação das espécies devido a aparência do parasita ser melhor conservada nesta preparação. As lâminas densas permitem ao microscopista classificar um volume maior do sangue e são cerca de onze vezes mais sensíveis do que as lâminas finas, de modo que colhem baixos níveis de infecção é mais fácil na lâmina densa, mas a aparência do parasita é muito mais distorcida e, portanto, a diferenciação entre espécies diferentes pode ser muito mais difícil.
A partir da lâmina densa, um microscopista experiente pode detectar os níveis de parasita (ou a parasitemia) abaixo de um nível inferior como 0,0000001% das células vermelhas do sangue. Entretanto, o diagnóstico por microscópico pode ser difícil por que o trofozoíta precoce ("forma de anel") de todas as quatro espécies mostra-se idêntico e ele nunca possibilita o diagnóstico de espécies com base em uma forma de anel única; a identificação de espécies é sempre com base em vários trofozoítas.
Em áreas onde a microscopia não está disponível, existem testes de detecção de antígenos que requerem apenas uma gota de sangue. 0 OptiMAL-IT® (TCS Bio Sciences, Buckingham, England) irá detectar de forma confiável o falciparum abaixo de 0,01% de parasitemia e não- falciparum abaixo de 0,1%. 0 Parachek-Pf® (Orchard Biomedical Systems, índia) irá detectar parasitemias abaixo de 0,002% mas não irá distinguir entre malária de falciparum e de não-falciparum. Os ácidos nucléicos de parasitas também podem ser detectados usando reação em cadeia de polimerase. Esta técnica é mais apurada do que a microscopia. Entretanto, ela é cara e requer um laboratório especializado. Além disso, os níveis de parasitemia não são necessariamente correlativos com o progresso da doença, particularmente, quando o parasita é capaz de aderir às paredes dos vasos sangüíneos. Métodos moleculares limitados estão disponíveis em alguns laboratórios clínicos e ensaios em tempo real rápidos, pro exemplo, QT-NASBA (amplificação baseada na seqüência de ácido nucleico quantitativa em tempo ral) com base na reação em cadeia de polimerase, mas estão sendo desenvolvidos apenas agora. Portanto, ferramentas de diagnóstico sensíveis, de baixa tecnologia necessitam ser desenvolvidas de modo a detectar baixos níveis de parasitemia no campo.
São necessários reagentes e métodos para a detecção rápida e apurada e a discriminação de várias espécies de Plasmodium causadoras de malária. Sumário da invenção
Esta invenção refere-se as sondas de ácido nucléico que detectam e discriminam entre espécies diferentes de parasitas Plasmodium em, por exemplo, ensaios de hibridização. Consequentemente, em um primeiro aspecto, a invenção caracteriza fragmentos de ácido nucléico a serem utilizados como sondas para detecção de Plasmodium em um ensaio de hibridização. A invenção também inclui sondas (DNA, RNA e PNA) que podem discriminar entre as espécies Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale. No contexto da presente invenção o termo "discriminar entre" (ou termos similares) significa que a sonda se liga ao ácido nucléico (por exemplo, RNA, DNA), rRNA [RNA ribossomal] ou r DNA [ DNA ribossomal] a partir de uma espécie mais favorável do que as outras três espécies. Em um segundo aspecto, a invenção caracteriza um fragmento de ácido nucléico contendo uma seqüência selecionada de, preferivelmente pelo menos cinco, mais pref erivelmente dez ou mais pref erivelmente pelo menos quinze nucleotídeos consecutivos ou a seqüencia completa de um ou mais das sondas designadas de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl, POl ou seqüência parcial ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
No terceiro aspecto, a invenção caracteriza um fragmento de ácido nucléico contendo uma seqüência selecionada de pelo menos cinco, preferivelmente, pelo menos dez, mais preferivelmente, pelo menos treze ou ainda mais preferivelmente, pelo menos quinze nucleotídeos consecutivos ou a seqüência completa de um ou mais das sondas designadas SEQ.ID.N0.:1 até SEQ.ID.NO. ι 15 ou as seqüências complementares parciais ou de extensão completa do mesmo.
Em um aspecto final, a invenção caracteriza um método para detecção da presença do Plasmodium em uma amostra.
Neste método, a amostra é contatada com um fragmento de ácido nucléico contendo uma seqüência selecionada de, preferivelmente, pelo menos cinco, pelo menos dez, mais preferivelmente pelo menos treze ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze nucleotideos consecutivos ou a seqüência completa de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl ou POl, as sondas sendo selecionadas a partir de ou de uma seqüência complementar de extensão completa ou parcial do mesmo (ou qualquer combinação do mesmo) ; sob condições que permite que o fragmento de ácido nucléico hibridize ao ácido nucléico do Plasmodium. A detecção do fragmento de ácido nucléico ligado ao ácido nucléico do Plasmodium na amostra é usada como uma indicação da presença de Plasmodium na amostra. Δ detecção com sondas da presente invenção que discriminam entre as quatro espécies de Plasmodium listadas acima indica qual espécie de Plasmodium está presente. Em uma configuração este aspecto da invenção, o fragmento de ácido nucléico contém uma seqüência selecionada, preferivelmente, a partir de pelo menos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze nucleotideos consecutivos ou a seqüência completa da sonda PGenusl ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo. Em uma segunda configuração deste aspecto da invenção, o fragmento de ácido nucléico contém uma seqüência selecionada, preferivelmente, de pelo menos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze nucleotideos consecutivos ou a seqüência completa da sonda PGenus2, ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo. Em uma terceira configuração deste aspecto da invenção, o fragmento de ácido nucléico contém uma seqüência selecionada de, preferivelmente, pelo menos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze ou a seqüência completa da sonda MalFl ou da seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
Em ainda uma outra configuração deste aspecto da invenção, o fragmento de ácido nucléico contém uma seqüência selecionada de, preferivelmente, pelo menos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze nucleotideos, ou a seqüência completa da sonda MalF2 ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
Em ainda uma outra configuração deste aspecto da invenção, o fragmento de ácido nucléico contém uma seqüência selecionada de, preferivelmente, pelo menos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze nucleotideos, ou a seqüência completa da sonda Mall.8F ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
Em ainda uma outra configuração deste aspecto da invenção, o fragmento de ácido nucléico contém uma seqüência selecionada de, preferivelmente, pelo menos cinco, mais preferivelmente pelo menos dez ou ainda mais preferivelmente pelo menos quinze nucleotideos, ou a seqüência completa da sonda Mall.8R ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
Uma vantagem das sondas PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F e Mall.8R é que enquanto ela detecta todas as três espécies de Plasmodium testado e, assim, não limitado a detectar uma única espécie de Plasmodium. Outras características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da descrição detalhada do mesmo a seguir e também a partir das reivindicações anexas. Em aspectos específicos, a presente invenção contempla um método para detecção da presença de Plasmodium em uma amostra, dito método compreendendo as etapas de: contatar a citada amostra com uma sonda para detecção de Plasmodium em um ensaio de hibridização, onde a referida sonda discrimina entre as espécies de Plasmodium, sob condições que permitem que dita sonda hibridize ao ácido nucléico do Plasmodium; e detectar se a referida sonda se liga ao citado ácido nucléico do Plasmodium na citada amostra como uma indicação da presença de Plasmodium na citada amostra.
Na configuração precedente, o fragmento de ácido nucléico compreende uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos de uma sonda PVl, PV2, PFl, PF3, PF4, PF5, PMl ou POl, ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
Em outros aspectos, a presente invenção contempla um método para detectar a presença de Plasmodium em uma amostra, dito método compreendendo a etapa de: contatar a referida amostra com um fragmento de ácido nucléico compreendendo uma seqüência selecionada de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos de uma sonda selecionada de um grupo consistindo de PGneusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall. 8 F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl e POl ou seqüência complementar de extensão completa do mesmo, sob condições que permitem que o referido fragmento de ácido nucléico hibridize com o ácido nucléico de Plasmodium; e detecte o referido fragmento de ácido nucléico ligado ao citado Plasmodium na citada amostra como uma indicação da presença de Plasmodium na referida amostra.
Na configuração precedente, o fragmento de ácido nucléico compreende uma seqüência selecionada a partir da seqüência de extensão completa, de pelo menos quinze nucleotideos consecutivos, pelo menos dez nucleotideos consecutivos, pelo menos cinco nucleotideos consecutivos de uma sonda selecionada de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl e POl ou a seqüência complementar de extensão completa deste. Δ presente invenção também contempla um fragmento de ácido nucléico compreendendo uma seqüência selecionada de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos de uma sonda selecionada a partir de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl e MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl, POl ou a seqüência complementar de extensão completa deste.
A presente invenção também contempla um fragmento de ácido nucléico compreendendo uma seqüência selecionada a partir de pelo menos dez nucleotideos consecutivos de uma sonda a partir de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl e Malf2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl, POl ou a seqüência complementar de extensão completa do mesmo. A presente invenção também contempla um fragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência completa selecionada de uma sonda selecionada a partir de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl e MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl, POl ou a seqüência complementar de extensão completa deste.
Em aspectos específicos, a presente invenção contempla um método de selecionar sondas de ácido nucléico que discrimina entre as espécies de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, e o método compreendendo: preparar um fragmento de ácido nucléico ou ácido nucléico polipeptideo, PNA correspondente a, ou complementar a, uma seqüência de pelo menos cinco nucleotideos de ácido nucléico a partir de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale; comparando a capacidade da sonda de detectar um ou mais das espécies de Plasmodium em um ensaio de hibridização; e selecionar a sonda ou sondas que detectam um, dois ou três espécies de Plasmodium, mas não todas as quatro espécies de Plasmodium.
A presente invenção também contempla um método para detecção e diferenciação entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale em uma amostra, dito método compreendendo: prover (i) uma amostra a partir de um indivíduo suspeito de ter malária e (ii) sondas compreendendo ácido nucléico apropriado para detectar e diferenciar entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale; contatar a citada amostra com a referida sonda sob condições apropriadas para hibridização da referida sonda aos alvos; e determinar a presença de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, se existente, na amostra.
Em uma configuração, o método contempla que a sonda para detectar P. falciparum é selecionada a partir da seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5. Em uma outra configuração, o método contempla que a sonda é selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5. Ainda em uma outra configuração, o método contempla que a sonda é selecionada a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5.
Em uma configuração, o método contempla que a sonda para detecção de P. vivax é selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de um ou mais de PVl ou PV2. Em uma outra configuração, o método contempla que a sonda é selecionada a partir da seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos contínuos de um ou mais de PVl ou PV2. Em uma outra configuração ainda, o método contempla que a sonda é selecionada a partir da seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais de PVl ou PV2.
Em uma configuração, o método contempla que as sondas para detectar P. malariae são selecionados a partir da seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de PMl e um ou mais PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 e onde a amostra é positiva para P. malariae se a sonda de pelo menos cinco nucleotideos contínuos do teste PMl positiva e a sonda de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de teste PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 negativa. Ainda uma outra configuração, o método
contempla que as sondas são selecionadas a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 e pelo menos dez nucleotideos contínuos de PMl. Ainda uma outra configuração, o método contempla que as sondas são selecionadas a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 e pelo menos quinze nucleotideos contínuos de PMl. Em uma configuração, o método contempla que as sondas para detectar P. ovale são selecionadas a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de POl e um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 e onde uma amostra é positiva para P. ovale se a sonda de pelo menos cinco nucleotideos contínuos do teste POl é positiva e a sonda de pelo menos cinco nucleotideos contínuos do teste de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 negativa. Em uma outra configuração, o método contempla que as sondas são selecionadas a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 e pelo menos dez nucleotideos contínuos de POl. Ainda uma outra configuração, o método contempla que as sondas são selecionadas a partir da seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 e pelo menos quinze nucleotideos contínuos de POl.
Em qualquer uma das configurações precedentes, a sonda ou as sondas utilizadas podem ter de uma seqüência de nucleotideos completa como descrito aqui ou da fita complementar da mesma bem como da seqüência complementar de cinco, dez, ou quinze nucleotideos contínuos das sondas.
Descrição detalhada da invenção A invenção caracteriza as sondas de ácido nucléico para detectar os parasitas Plasmodium (por exemplo, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale) em, por exemplo, ensaios de hibridização. As sondas da invenção podem ser utilizadas em métodos para detectar a presença de Plasmodium em uma amostra biológica. Nestes métodos, a sonda da invenção é contatada com uma amostra biológica (por exemplo, todo o sangue, CSF ou uma amostra de tecido) em um ensaio de hibridização e a detecção da sonda ligada ao ácido nucléico na amostra é utilizada como uma indicação da presença de Plasmodium na amostra. As sondas incluídas na invenção podem ser identificadas por:
A- (1) preparar o fragmento de ácido nucléico ou ácido nucléico de polipeptídeo, PNA (ou seja, uma sonda), correspondente a, ou complementar a, uma seqüência de pelo menos dez nucleotídeos do ácido nucléico de P. falciparum e (2) comparar a capacidade da sonda em detectar todas as espécies de Plasmodium em um ensaio de hibridização. As sondas que hibridizam com o P. falciparum mais favoravelmente do que às outras três espécies estão incluídas na invenção.
B- (1) preparar um fragmento de ácido nucléico ou PNA (ou seja, uma sonda) correspondente a, ou complementar a, uma seqüência de pelo menos dez nucleotídeos de ácido nucléico de P. vivax e (2) comparar a capacidade da sonda em detectar todas as espécies de Plasmodium em um ensaio de hibridização. As sondas que hibridizam com o P. vivax mais favoravelmente do que com as outras três espécies estão incluídas na invenção.
C- (1) preparar um fragmento de ácido nucléico ou PNA (ou seja, uma sonda) correspondente a, ou complementar a, uma seqüência de pelo menos dez nucleotídeos de ácido nucléico de P. malariae e (2) comparar a capacidade da sonda em detectar todas as espécies de Plasmodium em um ensaio de hibridização. As sondas que hibridizam com o P. malariae mais favoravelmente do que com as outras três espécies estão incluídas na invenção.
D- (1) preparar um fragmento de ácido nucléico ou PNA (ou seja, uma sonda) correspondente a, ou complementar a, uma seqüência de pelo menos dez nucleotídeos de ácido nucléico de P. ovale e (2) comparar a capacidade da sonda em detectar todas as espécies de Plasmodium em um ensaio de hibridização. As sondas que hibridizam com o P. ovale mais favoravelmente do que com as outras três espécies estão incluídas na invenção. O ácido nucléico de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale podem ser obtidos a partir de amostras biológicas (tais como todo o sangue, medula óssea, CSF) a partir de indivíduos infectados, usando métodos de isolamento de ácido nucléico padrões definidos no estado da técnica. P. falciparum (bem como P. vivax, P. malariae e P. ovale) podem também ser obtidos a partir da cultura. Por exemplo, o DNA codificando o RNA ribossomal de Plasmodium pode ser obtido por amplificação de PCR do DNA preparado a partir de uma amostra com todo o sangue de um paciente infectado usando os métodos e primers descritos aqui e que são conhecidos do estado da técnica. Qualquer seqüência de Plasmodium (por exemplo, uma seqüência codificante do RNA ribossomal 58, 5.8S, 18S, ou 28S) pode ser selecionada como uma seqüência candidato para a identificação de sondas. As seqüências preferidas são àquelas que divergem das seqüências análogas em Plasmodium não-humano ou outros parasitas do tipo protozoário, por exemplo, Babesia ou Thileria, como determinado por comparação filogenética. As sondas de ácido nucléico da invenção têm pelo menos 10 nucleotídeos no comprimento e pode conter deoxiribonucleotídeos (sondas de DNA) , ribonucleotídeos (sondas de RNA) , ácido nucléico peptídico (sondas de PNA) ou combinações ou modificação destes. As sondas podem ser fitas simples ou fitas duplas e podem ser preparados por qualquer um de um grande número de métodos padrões conhecidos da técnica. Por exemplo, as sondas podem ser feitas por síntese química, digestão por endonuclease de restrição de um vetor (por exemplo, um plasmídeo contendo uma seqüência correspondente à da sonda), amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR), ou transcrição in vitro de um vetor contendo uma seqüência contendo uma seqüência correspondente à sonda (ver, por exemplo, Ausubel et al, "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing, New York, N.Y., 1994, incorporado aqui por referência). As sondas podem ser marcadas durante ou após a síntese. Por exemplo, os nucleotídeos marcados contendo, por exemplo, radioisótopos (por exemplo, p32, S35, ou H3) , biotina ou digoxigenina podem ser incorporados dentro da sonda durante a síntese. As sondas contendo biotina são detectadas, através do uso de um reagente secundário, tal como avidina ou estreptoavidina, que contém um marcador detectável tal como um fluorocromo (por exemplo, fluoresceína ou rodamina) ou uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre). Similarmente, as sondas contendo digoxigenina podem ser detectadas através do uso de um anticorpo antidigoxigenina marcado. As sondas podem também ser marcadas após a síntese por, por exemplo, translação de incisão ou pelo uso de RNA ligase T4, poli (A) polimerase, transferase terminal ou polinucleotídeo quinase T4, em métodos padrões (ver, por exemplo, Ausubel, et al, supra). As sondas podem também conter nucleotídeos modificados de modo a aumentar a estabilidade da sonda. Por exemplo, ribonucleotídeos contendo grupos 2'-0'- alquila no grupo ribose podem ser utilizados. As sondas podem também conter modificações que facilitam a captura da sonda em um suporte sólido. Por exemplo, o poli-dA ou uma cauda poli-deaza-guanosina pode ser adicionado à extremidade 3' das sondas, usando transferase terminal, de modo a facilitar a ligação da sonda ao suporte sólido, por exemplo, poli-dT ou partículas magnéticas marcadas com poli-dC. As sondas podem ser purificadas antes do uso, usando métodos padrões tais como denaturação por eletroforese em gel de poliacrilamida, cromatografia líquida de alto desempenho ou cromatografia de filtragem em gel (ver, por exemplo, Ausubel, et al, supra) . As sondas da invenção podem ser utilizadas em qualquer ensaio de hibridização padrão para detectar a presença de Plasmodium em uma amostra. Por exemplo, Southern blot, dot blot, hibridização in situ, detecção por hibridização em tempo real por biosensores ou sonda dupla, ensaios de hibridização tipo sanduíche podem ser utilizados (ver, por exemplo, o pedido de patente norte-americano No. 07/826,657 [agora patente No. 5,519,127] e a patente norte-americana No.: US 5,629,156 (pedido de patente internacional No.: WO 94/10335), todos os quais incorporados aqui por referência). Alternativamente, as sondas podem ser utilizadas como primers em um ensaio de reação em cadeia de polimerase (ver, por exemplo, Ausubel, et al., supra). As amostras biológicas que podem ser analisadas usando as sondas e os métodos da invenção incluem todo o sangue, CSF, medula óssea e amostras de tecido a partir de, por exemplo, o baço. 0 ácido nucléico é extraído a partir da amostra por métodos padrões (exceto no caso de hibridização in situ, onde as células são mantidas intactas) e é analisada usando as sondas nos ensaios listados acima. Uma sonda simples ou combinações de sondas podem ser utilizadas no ensaio. As condições de hibridização podem ser utilizadas com as sondas (por exemplo, nos métodos da invenção) caindo dentro da faixa de, por exemplo, 30-50% de formamida a 25°C - 45°C ou misturas de GuSCN e formamida entre 25-37°C. Como é "conhecido por um técnico no assunto", a seleção de condições de hibridização depende da extensão e do conteúdo de nucleotídeo (ou seja, GC comparado a AT) da sonda. Conseqüentemente, as condições de hibridização podem ser ajustadas para acomodar estes fatores. Em adição, o uso de sais diferentes (por exemplo, tiocianato de guanidina ou hidrocloreto de guanidina comparado com NaCl) e agentes de denaturação (por exemplo, NP-40, sulfato de dodecil sódico) podem requerer o ajuste da concentração de sal e a temperatura, como pode ser facilmente determinado por um técnico no assunto. Exemplos não limitativos das condições de hibridização que podem ser utilizados na presente invenção são como a seguir. Na análise de Southern blot, as condições de hibridização a seguir podem ser utilizadas: 30% a 50% de formamida em 2xSSC a 42°C. Após hibridização, os filtros são lavados usando métodos padrões. Por exemplo, três lavagens pós-hibridização de 15 minutos a 25°C em 2xSSC a 0,1 xSSC e 0,1% de SDS podem ser realizados de modo a remover as sondas não ligadas. Para as hibridizações de RNA blots em formamida a 30% a temperatura ambiente durante a noite foram realizadas. As sondas em excesso foram removidas por lavagem, três lavagens de 15 minutos em 2xSSC com 0,1% de SDS.
O termo "hibridização" refere-se ao emparelhamento de ácidos nucléicos complementares. A hibridização e a extensão de hibridização (ou seja, a extensão da associação entre os ácidos nucléicos) são impactadas pelos referidos fatores como o grau de complementação entre os ácidos nucléicos, severidade das condições envolvidas, o Tm do hibrido formado, e a proporção G-C dentro dos ácidos nucléicos. Uma molécula simples que contém o emparelhamento dos ácidos nucléicos complementares dentro de sua estrutura é o referido a ser "auto-hibridizado".
É bem conhecido que numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para compreender as condições de hibridização apropriadas; fatores tais como a extensão e a natureza (DNA, RNA, composição básica) da sonda e da natureza do alvo (DNA, RNA, composição básica, presente na solução ou imobilizada, etc..) e a concentração dos sais e outros componentes (por exemplo, a presença ou a ausência de formamida, sulfato de dextran, polietileno glicol) são considerados e a solução de hibridização pode ser variada para produzir as condições de baixa severidade na hibridização, diferente de, mas equivalente às condições acima listadas. Em adição, as condições conhecidas do estado da técnica que promovem a hibridização sob condições de alta severidade (por exemplo, aumento da temperatura da hibridização e/ou etapas de lavagem, o uso de formamida na solução de hibridização, etc.).
Para a hibridização in situ, as condições a seguir podem ser utilizadas como descrito na patente norte-americana No.: US 6,165, 723 e no pedido de patente US 11/494, 430 (os quais são incorporados aqui por referência) : GuSCN (1,5 a 3,5M dependendo da seqüência da sonda) entre a temperatura ambiente e 370C ou misturas de GuSCN e formamida entre a temperatura ambiente e 370C durante 30 minutos a uma nora, seguido por lavagem em SSC (2X a 0,1X) e 0,1% SDS. Exemplificação
Sem elaboração adicional, acredita-se que um técnico no assunto pode, com base na descrição acima, utilizar a presente invenção para sua extensão completa. As configurações especificas a seguir são, portanto, construídas como exemplos meramente ilustrativos, e não são limitativos ao resíduo da descrição em qualquer forma limitativa.
Hibridização das sondas PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R às amostras de P. falciparum, P. vívax, P. ovale e P. malariae.
Os dados da análise dot-blot é mostrado na tabela 1. Nestes experimentos, aproximadamente 0,1 μg, de um plasmídeo contendo as seqüências de nucleotídeos codificantes da respectiva subunidades 18S rRNA foi utilizada por sítio. Os pontos foram hibridizados com sondas marcadas no local sob as condições de hibridização descritas acima. No caso de RNA, RNA foi sintetizada e 0,1 μg em 6xSSC foi identificada na membrana de nitrocelulose. A hibridização com as sondas marcadas no local (sondas marcadas com digoxiengin), foi realizada durante a noite em temperatura ambiente em formamida. Este método foi utilizado para comparar os sinais de hibridização entre organismos diferentes e sondas. As sondas que hibridizam a todas as espécies de rDNA 18 de todas as espécies de Plasmodium são PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F e Mall.8R. As sondas PGeneusl, PGenus2 e Mall.8R hibridizam com 18SsRNA de todas as espécies de Plasmodium. Sondas 18S rRNA-especificas do gênero Plasmodium
As sondas especificas do gênero Plasmodium da invenção incluem sondas PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F e Mall.8R que tem as seqüências:
PGenusl - 5'-TCTCGCTTGCGCGAATACTCG-3' (SEQ. ID.NO:1) PGenus2 - 5'-CCAAAGACTTTGATTTCTCAT-3' (SEQ. ID.NO:2) MalFl - 5'-CAGATACCGTCGTAATCTTA-3' (SEQ. ID.NO:3)
MalF2 - 5'-CGAAAGTTAAGGGAGTGAAGAC-3' (SEQ. ID.NO:4) Mall.8F - 5'-atgtagaaactgcgaacggc-3' (SEQ. ID.NO:5) Mall.8R - 5'-cagcacaatctgatgaatcatgc-3'(SEQ.ID.NO:6) 2 0 Sondas 18S rRNA-especificas da espécie Plasmodium
As sondas especificas das espécies Plasmodium da invenção incluem sondas PVl que tem as seqüências de uma sonda selecionada de PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PF6, PF7, PF8, PMl e POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
Sondas especificas de P. vivax:
PVl - 5'- TCTAAGAATAAACTCCGAAGAGAAAATTCTTATTTT-3' (SEQ.ID.NO:7)
PV2 - 5'- TACACAOTCAAGAAATGAATCAAGAGTGC-3' (SEQ. ID.NO:8) Sondas especificas de P. falciparum:
PFl - 5'-GCAATCTAAAAGTCACCTCGAAAGATGACTT-3' (SEQ. ID.NO:9) PF2 - 5'-CCTAACAAATACTTATCCAAAGATAAAAATCAAGGA-3'
(SEQ.ID.NO:10)
PF3 - 5'- ATTTTTAACACTTTCATCCAACACCTAGTCG-3' (SEQ.ID.NO:11)
PF4 - 5'-TTACAAAACCAAAAATTGGCCTTGCATTGTTATTT-3'
(SEQ.ID.NO:12) PF5 - 5'-TCCAATTGTTACTCTGGGAAGG-3' (SEQ. ID.NO:13) Sondas específicas de P. malariae:
PMl - 5'- GAAACACTCATATATAAGAATGTCTC-3' (SEQ. ID.NO:14) Sondas específicas de P. ovale: POl 5'-AATTTCCCCGAAAGGAATTTTC-3' (SEQ. ID.NO:15)
Tabela 1
Sondas P. falciparum P. viva χ P. malariae P. ovale PGenusl Positivo Positivo Positivo Positivo PGenus2 Positivo Positivo Positivo Positivo MalFl Positivo Positivo Positivo Positivo MalF2 Positivo Positivo Positivo Positivo Mall.8F Positivo Positivo Positivo Positivo Mall.8R Positivo Positivo Positivo Positivo PVl Negativo Positivo Negativo Negativo PV2 Negativo Positivo Negativo Negativo PFl Positivo Negativo Negativo Negativo PF2 Positivo Negativo Negativo Negativo PF3 Positivo Negativo Negativo Negativo PF4 Positivo Negativo Negativo Negativo PF5 Positivo Negativo Negativo Negativo PMl Positivo Negativo Negativo Negativo POl Positivo Negativo Negativo Positivo
Observação: Todas as sondas exceto MalFl, MalF2 e Mall.8F hibridizam ao rRNA também.
Em uma exemplificação da presente invenção, as amostras são testadas quanto à presença de Plasmodium sp e detecta as espécies de Plasmodium que são diferenciadas pelo uso das sondas da presente invenção. Uma amostra é testada com as sondas de pelo menos cinco, dez ou quinze nucleotídeos contínuos das sondas PVl e/ou PV2, sondas PFl, PF2, PF3, PF4 e/ou PF5, sondas PMl e sonda P01, ou a sonda completa ou as seqüências complementares destas. As amostras em que o teste é positivo para as sondas PFl, PF2, PF3, PF4 e/ou PF5 são determinados por serem infectados com P. falciparum. As amostras em que o teste é positivo para as sondas PMl mas não para PFl, PF2, PF3, PF4 e/ou PF5 são determinados por serem infectados com P. malariae. As amostras em que o teste positivo para as sondas P01, mas não para PFl, PF2, PF3, PF4 e/ou PF5 são determinados por serem infectados com P. ovale. A partir da descrição acima, um técnico no assunto pode facilmente averiguar as características essenciais da presente invenção e, sem fugir do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações na invenção para adaptá-la aos vários usuários e condições. Assim, outras configurações estão também dentro das reivindicações.
Claims (29)
1. Método para detectar a presença de Plasmodium em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) contatar a referida amostra com uma sonda para detecção de Plasmodium em um ensaio de hibridização, onde a citada sonda discrimina entre as espécies de plasmódios, sob condições que permite que a referida sonda hibridize com o ácido nucléico do Plasmodium; e b) detectar se a referida sonda se ligou ao referido ácido nucléico do Plasmodium na referida amostra como uma indicação da presença de Plasmodium na referida amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida sonda ser selecionada de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl e POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PVl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PV2 ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PFl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PF2 ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PF3 ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PF4 ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PF5 ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda PMl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos da sonda POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
12. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o citado fragmento de ácido nucléico compreender uma seqüência que é selecionada a partir de pelo menos dez nucleotideos da sonda selecionada de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl e POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
13. Fragmento de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência selecionada de pelo menos cinco nucleotideos consecutivos de uma sonda selecionada de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl e POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
14. Fragmento de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência selecionada de pelo menos dez nucleotideos consecutivos de uma sonda selecionada de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl e MalF2, Mall. 8 F, Mall. 8R, PVl, PV2 , PFl, PF2 , PF3, PF4 , PF5, PMl e POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
15. Fragmento de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência completa selecionada de uma sonda selecionada de um grupo consistindo de PGenusl, PGenus2, MalFl, MalF2, Mall.8F, Mall.8R, PVl, PV2, PFl, PF2, PF3, PF4, PF5, PMl e POl ou uma seqüência complementar de extensão completa do mesmo.
16. Método para selecionar sondas de ácido nucléico, que discriminam entre as espécies de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, caracteri zado pelo fato de compreender: a) preparar um fragmento de ácido nucléico ou ácido nucléico de polipeptideo, PNA correspondente a, ou complementar a, uma seqüência de pelo menos cinco nucleotideos de ácido nucléico a partir de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale; b) comparar a capacidade da sonda em detectar um ou mais das espécies de Plasmodium em um ensaio de hibridização; e c) selecionar a sonda ou sondas que detectam um, dois ou três espécies de Plasmodium mas não todas as quatro espécies de Plasmodium.
17. Método para detectar e diferenciar espécies de protozoários, entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, em uma amostra, caracterizado pelo fato de: a) prover (i) uma amostra de um indivíduo suspeito de ter malária e (ii) sondas compreendendo o ácido nucléico apropriado para detectar e diferenciar entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale; b) contatar a referida amostra com as citadas sondas sob condições apropriadas para hibridização das referidas sondas com o alvo; e c) determinar a presença de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, se estiverem presente, na amostra.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a citada sonda para detectar o P. faciparum ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 ou a seqüência complementar deste.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 ou a seqüência complementar deste.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 ou a seqüência complementar deste.
21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a citada sonda para detectar P. vivax ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de um ou mais de PVl ou PV2 ou a seqüência complementar deste.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos contínuos de um ou mais de PVl ou PV2 ou a seqüência complementar deste.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais de PVl ou PV2 ou a seqüência complementar deste.
24. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a citada sonda para detectar P. malariae ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de PMl, ou a seqüência complementar do mesmo, e um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5, ou a seqüência complementar do mesmo, e onde a amostra é positiva para P. malariae se a sonda para testes PMl positivo e a sonda para os testes PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 negativo.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos 10 nucleotideos contínuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 ou a seqüência complementar do mesmo, e pelo menos dez nucleotideos contínuos de PMl, ou a seqüência complementar do mesmo.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada a partir de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos contínuos de um ou mais PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5, ou uma seqüência complementar do mesmo, e pelo menos quinze nucleotideos contínuos de PMl, ou a seqüência complementar do mesmo.
27. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a citada sonda para detectar P. ovale ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cinco nucleotideos contínuos de POl, ou uma seqüência complementar do mesmo, e um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5, ou a seqüência complementar do mesmo, e onde a amostra é positiva para P. ovale se a sonda para o teste POl positiva e a sonda para os testes PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5 negativa.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada a partir da seqüência de ácido nucléico de pelo menos dez nucleotideos continuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5, ou a seqüência complementar do mesmo, e pelo menos dez nucleotideos continuos de P01, ou a seqüência complementar do mesmo.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de a citada sonda ser selecionada de uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos quinze nucleotideos continuos de um ou mais de PFl, PF2, PF3, PF4 ou PF5, ou uma seqüência complementar do mesmo e pelo menos quinze nucleotideos continuos de P01, ou a seqüência complementar do mesmo.
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