BRPI0716212A2 - Beta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransferase para produção de ácido 3-hidroxipropiônico - Google Patents

Abstract

BETA-ALANINA/ALFA-CETOGLUTARATO AMINOTRANSFERASE PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIPROPIÔNICO. A presente revelação provê novos ácido nucléico de betaalinina/alfa cetoglutarato aminotransferase e sequências de proteína possuindo atividade biológica aumentada. Também são providas células contendo enzimas, bem como métodos para sua utilização, por exemplo, para produção de semialdeído de malonila e produtos dos mesmos, tais como, ácido 3-hidroxipropiônico e seus derivados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BETA-ALA- NINA/ALFA-CETOGLUTARATO AMINOTRANSFERASE PARA PRODU- ÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIPROPIÔNICO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisó-

rio US número 60/824.031, depositado em 30 de agosto de 2006, incorpora- do neste documento como referência. CAMPO TÉCNICO

Esta descrição refere-se a ácido nucleico de beta-alanina/alfa- cetoglurarato aminotransferase (BAAT) e seqüências de aminoácidos aper- feiçoadas, células possuindo atividade de BAAT aperfeiçoada que podem ser usadas para converter beta-alanina em semialdeído de malonila, que por sua vez, pode ser convertido em ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por uma 3- HP desidrogenase, bem como aos métodos de emprego das células para produzir 3-HP e derivados dos mesmos.

DECLARAÇÃO DE PATROCÍNIO GOVERNAMENTAL

A presente invenção foi realizada com o patrocínio do Governo dos Estados Unidos sob o contrato GO 13144 concedido pelo Departamento de Energia. O Governo dos Estados Unidos da América possui determina- dos direitos com relação a presente esta invenção. Antecedentes

Substâncias químicas orgânicas, tais como, ácidos orgânicos, ésteres e polióis podem ser usadas para sintetizar materiais plásticos e ou- tros produtos. De modo a satisfazer a crescente demanda por substâncias químicas orgânicas, métodos de produção mais eficazes e de custo/bene- fício estão sendo desenvolvidos, os quais utilizam matérias-primas com base em carboidratos ao invés de hidrocarbonetos. Por exemplo, determinadas bactérias vem sendo usadas para produzir grandes quantidades de ácido láctico usado na produção do ácido poliláctico. Ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) é um ácido orgânico. Várias

vias de síntese química foram descritas para produzir 3-HP e vias biocatalíti- cas vêm sendo descritas (WO 01/16346 de Suthers e outros). 3-HP possui utilidade na síntese de especialidades e pode ser convertido em intermediá- rios comercialmente importantes por técnica conhecida na indústria química, tal como, ácido acrílico por desidratação, ácido malônico por oxidação, éste- res por reações de esterificação com alcoóis e 1,3-propanodiol por redução.

SUMÁRIO

O composto ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) pode ser produzido biocataliticamente a partir da glicose, através de um intermediário de beta- alanina (figura 1). A beta-alanina pode ser convertida em 3-HP via semialde- ído de malonila, empregando beta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransfera- se (BAAT) e uma 3-HP desidrogenase (figura 1). Contudo, esta via pode ser ineficiente.

São descritas neste documento as novas beta-alanina/alfa- cetoglutarato aminotransferases (BAAT) que possuem uma capacidade me- lhorada na conversão da beta alanina em semialdeído de malonila. Este au- mento na atividade da enzima BAAT conduziu a um aumento corresponden- te na produção de semialdeído de malonila e produtos a jusante, tais como, 3-HP.

Exemplos específicos de moléculas isoladas de BAAT incluem as seqüências de ácidos nucleicos mostradas nas SEQ ID N0S: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 e 18, e suas seqüências de aminoácidos correspondentes mos- tradas nas SEQ ID N0S: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19, bem como variantes, fragmentos, fusões e polimorfismos destas seqüências que mantêm a capa- cidade de interconversão de beta-alanina em semialdeído de malonila. As moléculas de ácido nucleico descritas podem ser operativamente ligadas a um promotor e podem fazer parte de um vetor.

As seqüências de BAAT descritas podem ser empregadas para transformar células, tal que, as células transformadas possuem atividade de BAAT, o que permite que as células produzam semialdeído de malonila a partir da beta-alanina. Em alguns exemplos, tais células transformadas pro- duzem 3-HP ou derivados do mesmo. Os agentes de ligação que se ligam especificamente a qualquer uma das SEQ ID N0S: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19 são englobados por esta descrição. Um exemplo de tais agentes de liga- ção é um anticorpo, tal como, um anticorpo policlonal ou monoclonal.

São providas células isoladas que expressam uma molécula de ácido nucleico exógeno de BAAT, e assim possuem atividade de BAAT per- mitindo que a célula converta beta-alanina em semialdeído de malonila. Tais células podem ser células eucarióticas ou procarióticas, tais como, células de levedura, células de planta, células de fungo ou células bacterianas (por exemplo, células de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, ou Escherichia). Também são providas plantas transgênicas e organismos que incluem tais células. Em um exemplo, a célula é transformada com uma molécula de áci- do nucleico codificando BAAT (tal como, qualquer uma das SEQ ID N0S: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 e 18 ou fragmentos, fusões ou variantes das mesmas que mantêm atividade de BAAT) que confere atividade de BAAT às células trans- formadas. As células descritas podem ser usadas para produzir moléculas de ácido nucleico, peptídeos e compostos orgânicos, tais como, semialdeído de malonila e 3-HP ou derivados dos mesmos (tais como, 3-HP polimeriza- do, ésteres 3-HP ou 1,3 propanodiol). 3-HP é biológica e comercialmente importante. Por exemplo, a indústria alimentícia pode usar o 3-HP como um alimento, aditivo alimentar ou conservante, enquanto os derivados mencio- nados acima podem ser produzidos a partir de 3-HP. As células descritas neste documento podem ser usadas nos sistemas de cultura para produzir grandes quantidades de 3-HP, bem como outros compostos orgânicos, tais como aqueles listados acima. Os peptídeos podem ser usados para catalisar a formação dos compostos orgânicos ou podem ser usados como antígenos para criar agentes de ligação específicos. As células descritas que, além da atividade de BAAT, podem em

alguns exemplos, incluir outras atividades de enzima, tais como, atividade de 3-HP desidrogenase (tal como uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 21, 23, 27 ou 31), onde a célula produz 3-HP. As célu- Ias possuindo atividade de BAAT e de 3-HP desidrogenase podem incluir adicionalmente outras atividades de enzima, por exemplo, para produzir de- rivados de 3-HP. Em um exemplo, tais células também possuem atividade de Iipase ou esterase e produzem um éster de 3-HP. Em outro exemplo, tais células também possuem atividade de esterase e produzem 3-HP polimeri- zado. Ainda em outro exemplo, tais células também possuem atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) e atividade de aldeído desidrogenase (tal como uma enzima da classe 1.2.1) e produzem 1,3-propanodiol. A atividade de enzima adicional pode ser endógena em relação à célula ou exógena (por exemplo, fornecida por uma molécula de ácido nucleico exógena codificando a enzima).

Em alguns exemplos, as células descritas, que além da atividade de BAAT incluem outras atividades de enzima, tais como aquelas necessá- rias para produzir beta-alanina. Tais atividades podem ser endógenas em relação à célula ou podem ser fornecidas por uma ou mais moléculas exó- genas de ácido nucleico. Exemplos de tais enzimas incluem PEP carboxilase (por exemplo, quando produzindo oxaloacetato a partir de PEP), piruvato carboxilase (por exemplo, quando produzindo oxaloacetato a partir de piru- vato), aspartato aminotransferase e aspartato descarboxilase (tal como uma proteína possuindo pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N°: 39 ou 41). Nos exemplos específicos, pelo menos uma molé- cula de ácido nucleico exógena codificando tais enzimas inclui um promotor não-nativo para melhorar a expressão da enzima, tal como um aumento de pelo menos 20%.

Nos exemplos específicos, as células descritas incluem muta- ções que aumentam o piruvato disponível para fabricar beta-alanina. Exem- plos de tais mutações incluem, porém não estão limitados a: uma mutação ΔροχΒ (tal como uma que diminua a formação de acetato pela célula em pe- lo menos 20%), uma mutação AadhE ou AatpFH (ou ambas) (tal como muta- ções que resultam na produção da célula de pelo menos 20% ou mais de 3- HP em comparação à ausência de AadhE ou AatpFH), ou a expressão de uma molécula de ácido nucleico exógena compreendendo pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 52.

É descrito um método para produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina empregando as células descritas possuindo ativida- de de BAAT. Em um exemplo, a célula é transfectada com uma ou mais en- zimas necessárias para converter semialdeído de malonila a partir de beta- alanina. Em outro exemplo, o método inclui purificação da beta-alanina a partir da célula, então contato da beta-alanina com os polipeptídeos neces- sários para converter semialdeído de malonila a partir de beta-alanina.

A presente descrição também prove métodos para fabricação de 3-HP ou derivados do mesmo. Em um exemplo, as células descritas são cul- tivadas sob condições que permitam a formação de 3-HP ou um derivado do mesmo. Em outro exemplo, uma enzima necessária para a produção de 3- HP, tal como 3-HP desidrogenase, é primeiro purificada das células descri- tas e então incubada sob condições com semialdeído de malonila para per- mitir a formação de 3-HP. Ainda em outro exemplo, 3-HP é purificado das células descritas e então incubado com álcool desidrogenase e aldeído de- sidrogenase sob condições que permitam a formação de 1,3-propanodiol, ou incubado com esterase sob condições que permitam a formação de 3-HP polimerizado ou incubado com Iipase ou esterase sob condições que permi- tam a formação de um éster 3-HP.

Em alguns exemplos, os produtos descritos são produzidos in vitro (fora de uma célula). Em outros exemplos, os produtos são fabricados empregando uma combinação dos métodos in vitro e in vivo (dentro da célu- la). Ainda em outros exemplos, os produtos são fabricados in vivo. Para os métodos envolvendo etapas in vivo, as células podem ser células cultivadas isoladas ou organismos integrais, tais como, plantas transgênicas ou orga- nismos de célula simples, tais como, leveduras e bactérias (tais como, célu- Ias de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, e Escherichia). Os produtos fa- bricados por estas células podem ser produtos orgânicos, tais como, beta- alanina, semialdeído de malonila, 3-HP e derivados dos mesmos, tais como, ácidos orgânicos, polióis, (tais como, 1,3-propanodiol), bem como uma en- zima BAAT descrita neste documento. Os aspectos precedentes e outros da descrição ficarão mais a-

parentes a partir da descrição detalhada que se segue com referência às figuras anexas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um diagrama de uma via para geração de 3-HP e derivados do mesmo através de um intermediário de beta-alanina. As figuras 2A-B mostram um alinhamento das beta-alanina aminotransfera- ses aperfeiçoadas (BAATs) (SEQ ID N0S: 6, 10, 12, 14, 17 e 19) em compa- ração com a seqüência de BAAT nativa (SEQ ID N0: 4). Os resíduos em ne- grito são alterações feitas em relação a seqüência de BAAT nativa (SEQ ID N°: 4).

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

As seqüências de ácido nucleico e aminoácido listadas na lista-

gem de seqüência que se segue são mostradas empregando abreviaturas de letra-padrão para bases de nucleotídeo e código de três letras para ami- noácidos. Apenas um filamento de cada seqüência de ácido nucleico é ilus- trado, porém a fita complementar é entendido como estando incluído por qualquer referência à fita exibido.

SEQ ID N°s: 1 e 2 são iniciadores da PCR empregados para ampliar por PCR um gene de BAAT de S. avermitilis.

SEQ ID N°s: 3 e 4 mostram, respectivamente, um DNAc de BA- AT e seqüência de proteína de S. avermitilis. SEQ ID N0S: 5 e 6 mostram, respectivamente, DNAc de BAAT

de S. avermitilis mutado e seqüência de proteína, referidos neste documento como BAAT1. A proteína inclui uma mutação S24T em comparação a se- qüência nativa.

SEQ ID N°s: 7 e 8 mostram, respectivamente, DNAc de BAAT e seqüência de proteína de S. avermitilis mutado, referidos deste documento como BAATIb. A proteína inclui mutações T83A, S314T e E348G em com- paração a seqüência nativa.

SEQ ID N°s: 9 e 10 mostram, respectivamente, um DNAc de BAAT de S. avermitilis mutado e seqüência de proteína, referidos neste do- cumento como BAAT2. A proteína inclui mutações S24T e F113L compara- das a seqüência nativa.

SEQ ID N°s: 11 e 12 mostram, respectivamente, um DNAc de BAAT de S. avermitilis mutado e seqüência de proteína referidos neste do- cumento como BAAT3. A proteína inclui mutações S24T, F113L e A133T em comparação a seqüência nativa.

SEQ ID N°s: 13 e 14 mostram, respectivamente, um DNAc de BAAT de S. avermitilis mutado e seqüência de proteína, referidos neste do- cumento como BAATP3H. A proteína inclui uma mutação de P3H em com- paração a seqüência nativa.

SEQ ID N0: 15 mostra o iniciador usado para introduzir a muta- ção P3H nos mutantes BAAT2 e BAAT3. SEQ ID N°s: 16 e 17 mostram, respectivamente, um DNAc de

BAAT de S. avermitilis e seqüência de proteína, referidos neste documento como BAAT3ML. A proteína inclui mutações P3H, S24T, F113L e A133T em comparação a seqüência nativa.

SEQ ID N°s: 18 e 19 mostram, respectivamente, um DNAc de BAAT de S. avermitilis e seqüência de proteína, referidos neste documento como BAAT5-9. A proteína inclui mutações P3H, S24T, D110N, F113L e A133T em comparação a seqüência nativa. A seqüência de ácido nucleico também inclui mutações silenciosas c207t, c381g e t471c.

SEQ ID N°s: 20 e 21 mostram, respectivamente, um DNAc de Pseudomonas aeruginosa 3-HP desidrogenase e uma seqüência de proteí- na.

SEQ ID N°s: 22 e 23 mostram, respectivamente, um DNAc de Alcaligenes faecalis M3A 3-HP desidrogenase e seqüência de proteína.

SEQ ID N°s: 24 e 25 mostram iniciadores de ampliação usados para clonar P. putida 3-HP desidrogenase.

SEQ ID N°s: 26 e 27 mostram, respectivamente, um DNAc de P. putida 3-HP desidrogenase e seqüência de proteína.

SEQ ID N0: 28 mostra o iniciador usado para introduzir mutações na P. putida 3-HP desidrogenase mostrada na SEQ ID N0: 26. SEQ ID N0: 29 é uma seqüência de DNAc de P. putida 3-HP de-

sidrogenase mutada, que não altera a seqüência de aminoácido da SEQ ID N0: 27. SEQ ID N°s: 30 e 31 mostram, respectivamente, um DNAc de E. coli ydfG e seqüência de proteína.

SEQ ID N°s: 32 e 33 são os iniciadores empregados para clonar SEQ ID N0: 30 no vetor pET28b.

SEQ ID N°s: 34 e 35 são os iniciadores a frente e reversos, res-

pectivamente, empregados para clonar C. acetobutylicum aspartato descar- boxilase.

SEQ ID N°s: 36 e 37 são os iniciadores a frente e reversos, res- pectivamente, empregados para clonar S. avermitilis aspartato descarboxila- se.

SEQ ID N°s: 38 e 39 mostram, respectivamente, um DNAc de C. acetobutylicum aspartato descarboxilase e seqüência de proteína.

SEQ ID N°s: 40 e 41 mostram, respectivamente, um DNAc de S. avermitilis aspartato descarboxilase e seqüência de proteína. SEQ ID N°s: 42 e 43 são os iniciadores a frente e reversos, res-

pectivamente, empregados para ampliar o marcador de resistência de ca- namicina flanqueado-FRT, a partir do plasmídeo pKD4 para deleção inser- cional do gene poxB no Escherichia coli.

SEQ ID N°s: 44 e 45 são os iniciadores a frente e reversos, res- pectivamente, empregados para confirmar inserção do marcador de resis- tência de canamicina flanqueado-FRT no gene de poxB.

SEQ ID N°s: 46 e 47 são os iniciadores a frente e reversos, res- pectivamente, empregados para ampliar o FRT-marcador de resistência de cloranfenicol flanqueado e promotor Piac/ara no pKDprom para inserção a montante do gene ppc no E. coli.

SEQ ID N°s: 48 e 49 são os iniciadores empregados para ampli- ar FRT-marcador de resistência de cloranfenicol flanqueado e promotor Piac/ara no pKDprom para inserção à montante do gene aspC no E. coli.

SEQ ID N°s: 50 e 51 são os iniciadores a frente e reversos, res- pectivamente, empregados para ampliar o FRT-marcador de resistência de cloranfenicol flanqueado no pKD3 para inserção a montante do gene gltA de E.coli para reduzir a expressão da citrato sintase. SEQ ID N0: 52 é a seqüência de nucleotídeo resultante do local de gltA modificado (KDgItA) na cepa atenuada decomposta. A translação dos nucleotídeos de seqüência alterada 57-138 se inicia no par de bases 138.

SEQ ID N°s: 53-55 são os iniciadores empregados para testar

integração do local gltA modificado.

SEQ ID N°s: 56 e 57 são os iniciadores a frente e reversos, res- pectivamente, empregados para ampliar o FRT-marcador de resistência de canamicina flanqueado a partir do plasmídeo pKD4 para deleção insercional dos genes atpFH no E. coli.

SEQ ID N°s: 58 e 59 são os iniciadores empregados para con- firmar a inserção do FRT-marcador de resistência de canamicina flanqueado FRT nos genes atpFH. DESCRIÇÃO DETALHADA AbreviaturaseTermos

A seguir são providas explicações dos termos e métodos que descrevem melhor a presente descrição e guiam os versados na técnica na prática da presente descrição. Conforme usado neste documento, "compre- endendo" significa "incluindo" e as formas singulares "um ou uma" ou "o, a" incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Por exemplo, referência ao termo "compreendendo uma célula" inclui uma ou várias de tais células e referência a "compreendendo a enzima de BAAT" inclui referência a uma ou mais enzimas de BAAT e equivalentes das mesmas conhecidas dos versados na técnica e assim por diante. O ter- mo "ou" refere-se a um elemento simples de elementos alternativos declara- dos ou uma combinação de dois ou mais elementos, a menos que o contex- to dite claramente o contrário. Por exemplo, a frase "atividade de álcool de- sidrogenase ou atividade de aldeído desidrogenase" refere-se à atividade de álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase ou uma combinação de ambas a atividade de álcool desidrogenase e a atividade da aldeído desidrogenase.

A menos que de outra forma explicado, todos os termos técnicos e científicos empregados neste documento possuem o mesmo significado como geralmente entendido pelos versados na técnica a qual esta descrição refere -se. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descri- tos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente descrição, métodos apropriados e materiais são descritos a seguir. Os mate- riais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam à limi- tação. Outros aspectos e vantagens da descrição ficarão claros a partir da descrição detalhada que se segue e das reivindicações. 3-HP: ácido 3-hidroxipropiônico BAAT: beta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransferase adhE: o gene que codifica a álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1).

Também inclui álcool desidrogenase proteína que catalisa a oxidação rever- sível dos alcoóis primário e secundário nos aldeídos empregando NAD+ co- mo um aceitador de elétrons. O ácido nucleico e seqüências de proteína de adhE se encontram disponíveis publicamente. Por exemplo, os números de acesso ao GenBank: M33504, AF093749, AB008676 e CP000255 revelam as seqüências de ácido nucleico de adhE e os números de acesso ao Gen- Bank: aAA2342 AAC78120, BAA77747 e ABD21317 revelam as seqüências de proteína de adhE.

atpFH: os genes (atpF e atpH) que codificam as duas proteínas que acoplam os componentes Fi e Fo da FoFi-ATP sintase. Também inclui as proteínas codificadas pelos genes. Ácido nucleico e seqüências de prote- ína de atpFH se encontram publicamente disponíveis. Por exemplo, os nú- meros de acesso ao GenBank: aB206839, AF522463, NC000913, A- E009952 e CR931997 revelam seqüências de ácido nucleico de atpFH. Anticorpo: uma molécula incluindo um sítio de ligação que se

liga, especificamente, (imunoreage) com um antígeno (tal como uma enzima BAAT ou fragmento a mesma). Exemplos incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos monoclonais humanizados ou porções imunologicamente eficazes dos mesmos. Inclui moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas das mesmas.

Os anticorpos monoclonais para quaisquer dos polipeptídeos descritos neste documento podem ser preparados de hibridomas de murino, de acordo com o método clássico de Kohler & Milstein (Nature 256:495, 1975) ou um método derivado do mesmo.

Antissoro policlonal contendo anticorpos para epitopos hetero- gêneos de qualquer polipeptídeo descrito neste documento pode ser prepa- rado por imunização de animais apropriados com o polipeptídeo (ou frag- mento, fusão ou variante do mesmo) que pode ser modificado ou não para melhorar a imunogenicidade. Um protocolo de imunização eficaz para coe- lhos pode ser encontrado em Vaitukaitis e outros (J. Clin. Endocrinoi Metab. 33:988-91,1971).

Os fragmentos de anticorpo podem ser usados no lugar dos an-

ticorpos integrais e podem ser prontamente expressos nas células procarió- ticas do hospedeiro. Os métodos de fabricação e emprego de porções imu- nologicamente eficazes de anticorpos monoclonais, também referidos como "fragmentos de anticorpo" são bem-conhecidos e incluem aqueles descritos em Better & Horowitz (Methods Enzymol. 178:476-96,1989), Glockshuber e outros (Biochemistry 29:1362-7,1990), Patente US número 5.648.237 ("Ex- pression of Functional Antibody Fragments"), Patente US número 4.946.778 ("Single Polypeptide Chain Binding Molecules"), Patente US número 5.455.030 ("lmmunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecu- les") e referências citadas neste documento.

Os anticorpos podem ser produzidos para um peptídeo de BAAT (tal como, SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19 ou fragmentos imunogê- nicos das mesmas). Polipeptídeos substancialmente puros apropriados para uso como um imunógeno podem ser obtidos de células transfectadas, célu- Ias transformadas ou células do tipo selvagem. De modo ótimo, os anticor- pos que surgem contra um ou mais epitopos no antígeno de peptídeo detec- tarão especificamente aquele peptídeo. Isto é, os anticorpos que surgem contra um polipeptídeo específico reconhecerão e se ligarão a aquele poli- peptídeo específico e substancialmente não reconhecerão ou se ligarão a outros polipeptídeos. A determinação de que um anticorpo se liga especifi- camente a um polipeptídeo específico é feita por qualquer um dos inúmeros métodos de imunoensaio padrão; por exemplo, o Western blotting. "Se liga especificamente" refere-se à capacidade de um agente específico (um "agente de ligação específica") de reagir especificamente com um analisado específico, por exemplo, para imunorreagir especifica- mente com um anticorpo ou para se ligar especificamente a uma seqüência de peptídeo específica. A ligação é uma reação de ligação não aleatória, por exemplo, entre uma molécula de anticorpo e um determinante antigênico. A especificidade da ligação de um anticorpo é tipicamente determinada do ponto de referência da capacidade do anticorpo de se ligar diferencialmente ao antígeno específico e um antígeno não correlato e, portanto, distinguir entre dois antígenos diferentes, especificamente quando os dois antígenos possuem epitopos únicos. Um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo específico é referido como um "anticorpo específico".

Beta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransferase (BAAT): uma enzima que pode converter beta-alanina em semialdeído de malonila, por exemplo, em uma célula. Inclui qualquer gene de BAAT, DNAc, RNA ou proteína de qualquer organismo, tal como, procarioto. Nos exemplos especí- ficos, uma seqüência de ácido nucleico de BAAT inclui ou consiste nas se- qüências mostradas nas SEQ ID N0S: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 e 18, bem como fragmentos, variantes ou fusões das mesmas que mantêm a capacidade de codificar uma proteína possuindo atividade de BAAT. Em outro exemplo, uma proteína de BAAT inclui ou consiste em uma seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19, bem como fragmentos, fusões ou variantes das mesmas que mantêm atividade de BAAT. Esta des- crição inclui variantes alélicas de BAAT, bem como qualquer variante, frag- mento ou seqüência de fusão que mantenha a capacidade de converter be- ta-alanina em semialdeído de malonila.

Uma seqüência de aminoácido de BAAT inclui uma seqüência de comprimento pleno, tal como, SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19, bem como seqüências mais curtas ou variantes que mantenham a capaci- dade de converter beta-alanina em semialdeído de malonila. Exemplos de substituições específicas que podem ser feitas a uma seqüência amino de BAAT mantendo a atividade biológica desejada incluem, porém não estão limitadas a V53L, R104K, L200I, T312S, A400S, W411Y ou suas combina- ções, na SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19. Fragmentos exemplares incluem aminoácidos 1-150, 1-140, 1-200, 1-250, 1-300, 1-350, ou 1-400 da SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19.

Atividade de BAAT: a capacidade de uma enzima BAAT de

converter beta-alanina no semialdeído de malonila. Em um exemplo, tal ati- vidade ocorre em uma célula. Em outro exemplo, tal atividade ocorre in vitro. Tal atividade pode ser medida empregando qualquer ensaio conhecido na técnica. Por exemplo, a atividade de BAAT pode ser identificada por incuba- ção da enzima com beta-alanina e alfa-cetoglutarato e determinando os pro- dutos de reação (tais como, semialdeído de malonila e glutamato) por cro- matografia líquida de alto desempenho (por exemplo, empregando o método de Abe e outros, J. Chromatography B, 712:43-9, 1998). Em um exemplo específico, atividade de BAAT pode ser determinada por medição da produ- ção de semialdeído de malonila a partir de beta alanina na presença de BA- AT empregando um ensaio Purpald® (vide Exemplo 1). Em um exemplo es- pecífico, a atividade de BAAT pode ser determinada por medição da produ- ção de 3-HP a partir dos intermediários da beta alanina e semialdeído de malonila, na presença de BAAT e 3-HP desidrogenase empregando LC/MS (vide Exemplo 8).

Em um exemplo específico, é dito que uma enzima tem atividade de BAAT se a atividade específica de uma enzima para beta-alanina for de pelo menos 0,3 U/mg (onde U é 1 pmol/min) (por exemplo, empregando mé- todos descritos no Exemplo 4), tais como, pelo menos 1,5 U/mg, pelo menos 2 U/mg, pelo menos 2,5 U/mg ou pelo menos 3 U/mg.

cDNA (DNA complementar): uma peça de DNA isenta de seg- mentos internos, de não codificação (íntrons) e seqüências reguladoras que determinam transcrição. DNAc pode ser sintetizado por transcrição reversa a partir de RNA mensageiro extraído das células. Substituição conservante: uma ou mais substituições de ami-

noácido (por exemplo, 1, 2, 5, 10, ou 15 resíduos de aminoácido) possuindo propriedades bioquímicas similares. Tipicamente, as substituições de con- servação possuem pouco ou nenhum impacto na atividade de um peptídeo resultante. Por exemplo, uma substituição conservante em um peptídeo de BAAT que não afeta substancialmente a capacidade do peptídeo de conver- ter beta-alanina em semialdeído de malonila. Em um exemplo específico, uma substituição conservante é uma substituição de aminoácido em um pep- tídeo de BAAT, tal como uma substituição conservante na SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19, que significativamente não diminui (tal como uma diminuição de não mais de 20%, tal como não mais de 10%) da capacidade da proteína de converter beta-alanina em semialdeído de malonila ou outros produtos a jusante tais como, 3-HP.

Uma varredura com alanina pode ser empregada para identificar resíduos de aminoácido em um peptídeo que podem tolerar substituição. Em um exemplo, a atividade não é alterada em mais de 25%, por exemplo, não mais de 20%, por exemplo, não mais de 10%, quando uma alanina ou outro aminoácido conservador (tais como os listados a seguir) é substituído por um ou mais dos aminoácidos nativos.

Em um exemplo específico, a atividade de BAAT não é substan- cialmente alterada se a quantidade do semialdeído de malonila produzido não for reduzida em mais de cerca de 25%, tal como não mais de cerca de 10%), em relação a uma quantidade de produção de semialdeído de malonila na presença de uma BAAT contendo uma ou mais substituições de aminoá- cido conservantes, quando comparado a uma quantidade de produção de semialdeído de malonila na presença de uma BAAT nativa (tal como SEQ ID N0: 4).

Um peptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais subs-

tituições conservantes por manipulação da seqüência de nucleotídeo que codifica aquele peptídeo usando, por exemplo, procedimentos-padrão, tais como, mutagênese direcionada ao sítio ou PCR. Alternativamente, um pep- tídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservan- tes por emprego dos métodos de síntese de peptídeo-padrão.

Variantes de substituição são aquelas nas quais pelo menos um resíduo na seqüência de aminoácido foi removido e um resíduo diferente é inserido em seu lugar. Exemplos de aminoácidos que podem ser substituí- dos por um aminoácido original em uma proteína e que são considerados como substituições conservantes incluem: Ser por Ala; Lys por Arg; Gln ou His por Asn; Glu por Asp; Ser por Cys; Asn por Gln; Asp por Glu; Pro por Gly; Asn ou Gln por His; Leu ou Val por He; Ile ou Val por Leu; Arg ou Gln por Lys; Leu ou Ile por Met; Met, Leu ou Tyr por Phe; Thr por Ser; Ser por Thr; Tyr por Trp; Trp ou Phe por Tyr; e Ile ou Leu por Vai.

Informações adicionais a respeito das substituições conservan- tes podem ser encontradas, entre outros locais em Ben-Bassat e outros (J. Bacteriol. 169:751-7,1987), O1Regan e outros (Gene 77:237-51, 1989), Sa- hin-Toth e outros, (Protein Sei. 3:240-7,1994), Hochuli e outros (Bi- ofTechnology 6:1321 -5, 1988), WO 00/67796 (Curd e outros) e nos livros de texto padrão de genética e biologia molecular.

Deleção: a remoção de um ou mais nucleotídeos de uma molé- cuia de ácido nucleico ou um ou mais aminoácidos de uma proteína, as regi- ões em cada lado sendo ligadas em conjunto.

Detectável: Capaz de ter a existência ou presença determinada. Por exemplo, produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina, ou a produção ou 3-HP de beta-alanina, é detectável se o sinal gerado do semialdeído de malonila ou 3-HP, respectivamente, for forte o suficiente para ser medido.

DNA: ácido desoxirribonucleico. DNA é um polímero de cadeia longa que inclui o material genético da maioria dos organismos vivos (alguns vírus possuem genes incluindo ácido ribonucleico, RNA). As unidades de repetição nos polímeros DNA são quatro nucleotídeos diferentes, cada um incluindo uma das quatro bases, adenina, guanina, citosina e timina ligada a um açúcar, ao qual um grupo fosfato é anexado. Os tripletos de nucleotídeos referidos como códons, nas moléculas de DNA codificam o aminoácido em um peptídeo. O termo códon é também empregado para as seqüências cor- respondentes (e complementares) dos três nucleotídeos no RNAm no qual a seqüência de DNA é transcrita.

Melhora ou aumento: aperfeiçoamento da qualidade, quantida- de ou resistência de alguma coisa.

Em um exemplo, uma enzima BAAT mutante, tal como uma va- riante da SEQ ID N0: 4, pode melhorar a atividade da enzima BAAT se a ati- vidade da enzima for diminuída em relação à atividade da enzima BAAT na- tiva (tal como, SEQ ID N0: 4). Em um exemplo específico, uma enzima BAAT mutante (tal como SEQ ID N0: 5, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19) possui uma ca- pacidade aumentada de converter beta alanina em semialdeído de malonila, tal como um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100% ou mesmo pelo menos 200%. Por exemplo, a ex- pressão de uma enzima BAAT mutante exógena (tal como, SEQ ID N0: 5, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19) em uma célula, pode aumentar a produção de produ- tos a jusante, tais como, semialdeído de malonila, 3-HP, ou derivados dos mesmos (se as outras enzimas apropriadas forem expressas pela célula). Tal melhora pode ser medida empregando os métodos descritos neste do- cumento, por exemplo, determinação da quantidade de semialdeído de ma- lonila ou 3-HP produzido na presença da enzima BAAT mutante, empregan- do os métodos descritos nos exemplos a seguir (tais como, Exemplos 1 e 8).

Exógeno: conforme empregado neste documento, com referên- cia a qualquer molécula de ácido nucleico e uma célula específica refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico que não se origina da célula específi- ca conforme encontrada na natureza. Assim, uma molécula de ácido nuclei- co que não ocorre naturalmente é considerada como sendo exógena a uma célula uma vez introduzida na célula. Uma molécula de ácido nucleico que ocorre naturalmente pode também ser exógena a uma célula específica. Por exemplo, toda a seqüência de codificação isolada da célula X é um ácido nucleico exógeno com relação à célula Y uma vez que a seqüência de codi- ficação é introduzida dentro da célula Y, mesmo se X e Y forem o mesmo tipo de célula.

Expressão: o processo pelo qual as informações codificadas do gene são convertidas nas estruturas e funções de uma célula, tal como uma proteína, RNA de transferência ou RNA ribossômico. Os genes expressos incluem aquelas que são transcritos no RNAm e então traduzidos na proteí- na e aqueles que são transcritos no RNA, porém não traduzidos na proteína (por exemplo, RNAs de transferência ou ribossômicos).

Deleção funcional: uma mutação, deleção parcial ou completo, inserção ou outra variação feita em relação a seqüência gênica que reduz ou inibe a produção do produto de gene ou torna o produto de gene não- funcional. Por exemplo, deleção funcional de poxB no E. coli reduz a produ- ção de acetato pela piruvato oxidase, que é codificada pelo gene poxB. Em outro exemplo, a deleção funcional de atpFH em E. coli reduz a produção de ATP através de translocação do próton do complexo F0F1. Funcionalmente equivalente: possuindo uma função similar, tal

como a capacidade de uma variante, fragmento ou fusão de seqüência de ter uma função similar à da seqüência nativa. Em alguns exemplos, um e- quivalente funcional possui atividade biológica mesmo superior a da seqüên- cia nativa. Por exemplo, as moléculas de BAAT funcionalmente equivalentes incluem aquelas moléculas que mantêm a função de BAAT, isto é, a capaci- dade de converter beta-alanina em semialdeído de malonila. Por exemplo, equivalentes funcionais podem ser providos por alterações de seqüência em uma BAAT, onde o peptídeo com uma ou mais alterações de seqüência (tais como, SEQ ID N0S: 6, 8, 10, 12, 14, 17, 19) mantém uma função do peptí- deo inalterado (tal como, SEQ ID N0: 4), tal que ele mantém sua capacidade de converter beta-alanina em semialdeído de malonila.

Exemplos de alterações de seqüência incluem, porém não são limitados às substituições, deleções, mutações, deslocamentos de estrutura e inserções conservantes. Em um exemplo, um dado peptídeo se liga a um anticorpo e um equivalente funcional é um peptídeo que se liga ao mesmo anticorpo. Assim, um equivalente funcional inclui peptídeos que possuem a mesma especificidade de ligação que um peptídeo e que podem ser usados como um reagente no lugar do peptídeo (tal como, na produção de semial- deído de malonila, 3-HP, e derivados dos mesmos). Em um exemplo, um equivalente funcional inclui um peptídeo onde a seqüência de ligação é des- contínua, onde o anticorpo se liga a um epitopo linear. Assim, se a seqüên- cia de peptídeo for MTPQPNPQVG (aminoácidos 1-10 da SEQ ID N0: 4) um equivalente funcional inclui epitopos descontínuos, que podem se parecer como se segue (** = qualquer número de aminoácidos de intervenção): NH2 _**_l\/l**T**P**Q**P**N**P**Q**V**G-COOH. Neste exemplo, o peptídeo é funcionalmente equivalente aos aminoácidos 1-10 da SEQ ID N0: 4 se a es- trutura tridimensional do peptídeo for tal que ele possa ser ligar a um anti- corpo monoclonal que se liga aos aminoácidos 1-10 da SEQ ID N0: 4.

Hibridização: a capacidade do DNA de filamento simples com- plementar ou RNA de formar uma molécula de dúplex. Em alguns exemplos, a hibridização é usada para determinar a complementaridade entre duas ou mais seqüências de nucleotídeo. Técnicas de hibridização de ácido nucleico podem ser usadas para obter um ácido nucleico isolado dentro do escopo da descrição. Em resumo, qualquer molécula de aminoácido possuindo alguma homologia com relação a uma molécula de ácido nucleico de BAAT (tal co- mo, homologia com relação a SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16, ou 18, vari- antes ou fragmentos da mesma) pode ser usada como uma sonda para i- dentificar uma molécula de ácido nucleico similar por hibridização sob condi- ções de estringência moderada a alta. Uma vez identificado, o aminoácido pode então ser purificado, sequenciado e analisado para determinar se ele é uma BAAT possuindo atividade de BAAT. A hibridização pode ser realizada por análise Southern ou Nor-

thern para identificar uma seqüência de DNA ou RNA, respectivamente, que hibridiza com relação à sonda. A sonda pode ser marcada, por exemplo, com uma biotina, um fluorforo, digoxigenina, uma enzima, ou um radioisóto- po, tal como, 32P. O DNA ou RNA a ser analisado pode ser separado eletro- foreticamente sobre um gel de agarose ou poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, náilon ou outra membrana apropriada e hibridizado com a sonda empregando técnicas-padrão bem-conhecidas na técnica, tais como aquelas descritas nas seções 7.39-7.52 de Sambrook e outros (1989) Mole- cular Cloning, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY. Tipicamente, a sonda possui pelo menos 20 nucleotídeos de compri- mento. Por exemplo, uma sonda incluindo 20 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de ácido nucleico de BAAT (tal como, 20 nucleotídeos contínuos da SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16, ou 18) pode ser usada para identificar um ácido nucleico idêntico ou similar. Além disto, as sondas mais longas ou mais curtas que 20 nucleotídeos podem ser usadas.

A descrição também provê seqüências de ácido nucleico isolado que possuem pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento (tal como, pelo menos cerca de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1.000, 1.400, 2.000, 3.000, 4.000, ou 5.000 nucleotídeos de com- primento) e hibridizam, sob condições de hibridização moderadas ou altas na fita de sentido ou antisenso de uma seqüência de ácido nucleico de BA- AT1 por exemplo, SEQ ID N0: 3,5, 7, 9, 11, 13, 16, ou 18).

Condições de hibridização moderadamente estringentes são a- quelas onde a hibridização é realizada a cerca de 42°C em uma solução de hibridização contendo KPO4 25 mM (pH 7,4), 5X SSC, 5X solução de De- nhart, 50 μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, sonicado, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano e sonda de 1-15 ng/mL (cerca de 5x107 cpm^g), enquanto as lavagens são realizadas a cerca de 50°C com uma solução de lavagem contendo 2X SSC e 0,1% de sulfato de dodecil de sódio.

Condições de hibridização altamente estringentes são aquelas onde a hibridização é realizada a cerca de 42°C em uma solução de hibridi- zação contendo KPO4 25 mM (pH 7,4), 5X SSC, 5X solução de Denhart1 50 μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, sonicado, 50% de for- mamida, 10% de sulfato de dextrano e sonda de 1-15 ng/mL (cerca de 5x107 cpm^g), enquanto as lavagens são realizadas a cerca de 65°C com uma solução de lavagem contendo 0,2X SSC e 0,1% de sulfato de dodecil de só- dio.

Isolado: um componente biológico "isolado" (tal como uma mo- lécula de ácido nucleico, proteína ou célula) foi substancialmente separado ou purificado separado de outros componentes biológicos, nos quais o com- ponente ocorre naturalmente tal como outro DNA e RNA cromossômico e extracromossômico e proteínas. As moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purifi- cadas por métodos de purificação-padrão. O termo também engloba molécu- las de ácido nucleico e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como, moléculas de ácido nucleico quimi- camente sintetizadas e proteínas.

Em um exemplo, isolada refere-se a uma molécula de ácido nu-

cleico ocorrendo naturalmente que não é imediatamente contínua a ambas as seqüências com as quais ela é imediatamente contígua (uma na extremi- dade 5' e uma na extremidade 3') no genoma ocorrendo naturalmente do organismo a partir do qual deriva. Por exemplo, uma molécula isolada de ácido nucleico pode ser, sem limitação, uma molécula de DNA recombinante de qualquer comprimento, contanto que uma das seqüências de ácido nucle- ico normalmente encontrada imediatamente flanqueando aquela molécula de DNA recombinante em um genoma ocorrendo naturalmente seja removida ou esteja ausente. Assim, uma molécula isolada de ácido nucleico inclui, sem limitação, um DNA recombinante que existe como uma molécula sepa- rada (por exemplo, um DNAc ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento de endonuclease de restrição), independente de ou- tras seqüências, bem como DNA recombinante que é incorporado ao vetor, um plasmídeo de replicação autônoma, um vírus (por exemplo, um retroví- rus, adenovírus ou vírus de herpes) ou ao DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. Além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir uma molé- cula de DNA recombinante que faz parte de um híbrido ou seqüência de áci- do nucleico de fusão.

Em um exemplo, o termo "isolada" conforme usado com referên- cia a uma molécula de ácido nucleico também inclui qualquer molécula de ácido nucleico não ocorrendo naturalmente, uma vez que seqüências de á- cido nucleico não ocorrendo naturalmente não são encontradas na natureza e não possuem seqüências imediatamente contínuas em um genoma ocor- rendo naturalmente. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico não ocorren- do naturalmente, tais como, uma molécula de ácido nucleico construída ge- neticamente é considerada como sendo uma molécula isolada de ácido nu- cleico. As moléculas de ácido nucleico construídas geneticamente podem ser fabricadas usando clonagem molecular comum ou técnicas de síntese química de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico que não ocorre na- turalmente, isolada pode ser independente de outras seqüências ou incorpo- rada em um vetor, um plasmídeo de replicação autônoma, um vírus (tal co- mo, um retrovírus, adenovírus ou vírus de herpes) ou o DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. Além disto, uma molécula de ácido nucleico não ocorrendo naturalmente pode incluir uma molécula de ácido nucleico que faz parte de um híbrido ou uma seqüência de ácido nucleico de fusão.

Molécula de ácido nucleico: engloba ambos RNA e DNA inclu- indo, sem limitação, DNAc, DNA genômico e RNAm. Inclui moléculas de áci- do nucleico sintéticas, tais como aquelas que são sintetizadas quimicamente ou produzidas recombinantemente. A molécula de ácido nucleico pode se de filamento duplo ou filamento simples. Quando de filamento simples, a molé- cula de ácido nucleico pode ser a fita de sentido ou a fita de antisenso. Além disso, a molécula de ácido nucleico pode ser circular ou linear.

Operativamente ligada: uma primeira seqüência de ácido nu- cleico é operativamente ligada a uma segunda seqüência de ácido nucleico quando a primeira seqüência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma seqüência de codificação (tal como uma seqüência de codificação BAAT) se o promotor afetar a transcrição ou expressão da seqüência de codificação. De modo geral, seqüências de DNA operativamente ligadas são contínuas e, quando necessário unem duas re- giões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura. Configura- ções de genes separados que são transcritos em tandem como um RNA mensageiro simples são indicadas como óperons. Assim, a colocação dos genes em proximidade, por exemplo, em um vetor de plasmídeo, sob a regu- lação transcricional de um promotor simples, constitui um óperon sintético.

ORF (quadro aberto de leitura): uma série de tripletos de nu- cleotídeo (códons) codificando os aminoácidos, sem quaisquer códons de terminação. Estas seqüências são geralmente traduzíveis no peptídeo.

Modificações de peptídeo: a presente descrição provê novos peptídeos (tais como, novas BAAT, aspartato descarboxilases e 3-HP desi- drogenases), bem como concretizações sintéticas. Além disto, análogos (molécula orgânicas não peptídeo), derivados (moléculas de peptídeo quimi- camente funcionalizadas obtidas partindo das seqüências de peptídeo des- critas) e variantes (homólogos) possuindo atividade de alanina 2,3- aminomutase podem ser utilizados nos métodos descritos aqui. Os peptí- deos descritos neste documento incluem uma seqüência de aminoácidos que pode tanto ser de L ou D-aminoácidos, ocorrendo naturalmente e de outra forma.

Os peptídeos podem ser modificados por várias técnicas quími-

cas para produzir derivados possuindo essencialmente a mesma atividade que os peptídeos não-modificados e opcionalmente possuindo outras propri- edades desejáveis. Por exemplo, grupos ácido carboxílico de proteína, se de cadeia lateral ou de término carboxila podem ser providos na forma de um sal de um cátion farmaceuticamente aceitável ou esterificado para formar um C1-Cie éster ou convertido em uma amida da fórmula NR1R2 onde R1 e R2 são independentemente H ou C1-C16 alquila ou combinados para formar um anel heterocíclico, tal como um anel de 5 ou 6 elementos. Grupos amino do peptídeo, se de cadeia lateral ou término amino podem estar na forma de um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, tal como, HCI, HBr, sais acético, benzóico, tolueno sulfônico, maléico, tartárico e outros sais orgâni- cos ou podem ser modificados na C1-C16 alquila ou dialquil amino ou adicio- nalmente convertidos em uma amida.

Grupos hidroxila de cadeia laterais de peptídeo podem ser con- vertidos em C1-C1S alcóxi ou em um C1-C16 éster empregando técnicas bem reconhecidas. Anéis fenila e fenólicos das cadeia laterais de peptídeo podem ser substituídos com um ou mais átomos de halogênio, tais como, F, Cl, Br ou I, ou com C1-C16 alquila, C1-C16 alcóxi, ácidos carboxílicos e ésteres dos mesmos, ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Grupos metileno das cadei- as laterais de peptídeos podem ser estendidos em C2-C4 alquilenos homólo- gos. Os tióis podem ser protegidos com qualquer dos vários grupos de pro- teção bem reconhecidos, tais como, grupos acetamida. Os versados na téc- nica também reconhecerão os métodos para introdução de estruturas cícli- cas nos peptídeos desta descrição para selecionar e prover contenções con- formacionais em relação à estrutura, que resultam em estabilidade melhora- da. Por exemplo, uma cisteína de término C ou N pode ser adicionada ao peptídeo, de modo que, quando oxidado, o peptídeo conterá uma ligação de dissulfeto gerando um peptídeo cíclico. Outros métodos de ciclização de peptídeo incluem a formação de tioéteres e amidas e éster de término car- boxila e amino.

Concretizações de peptidomiméticos e organomiméticos tam- bém se encontram dentro do escopo da presente descrição, pelo que, a dis- posição tridimensional dos constituintes químicos de tais peptídeos e orga- nomiméticos mimetiza a disposição tridimensional da estrutura do peptídeo e cadeias laterais de aminoácido componente, resultando em tais peptídeo e organomiméticos de proteínas desta invenção possuindo atividade alanina 2,3-aminomutase detectável. Para aplicações de modelagem por computa- dor, um farmacoforo é uma definição idealizada, tridimensional, dos requisi- tos estruturais para atividade biológica. Peptídeo e organomiméticos podem ser projetados para ajustar cada farmacoforo com software de modelagem por computador corrente (empregando projeto para medicamentos auxiliado por computador ou CADD). Vide, Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", in Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-174 e Principies of Pharmaco- Iogy Munson (ed.) 1995, Ch. 102, para as descrições das técnicas emprega- das no CADD.

poxB: o gene que codifica a piruvato oxidase. Também inclui

uma proteína piruvato oxidase que metaboliza piruvato em acetato e CO2. poxB é expresso primariamente nas culturas sob tensão ou na fase estacio- nária sob condições aeróbias. seqüências de ácido nucleico e de proteína de poxB se encontram disponíveis publicamente. Por exemplo, números de a- cesso ao GenBank: aE009952, AX537387, M28208, e CR931997 revelam seqüências de ácido nucleico de poxB e números de acesso ao GenBank: aAM86372, CAD57486, AAB59101 e CAI36877 revelam seqüências de pro- teína de poxB.

Promotor: uma disposição de seqüências de controle de ácido nucleico que dirigem a transcrição de uma molécula de ácido nucleico. Um promotor inclui necessariamente, seqüências de ácido nucleico próximas ao sítio de início de transcrição, tal como, no caso de um promotor do tipo poli- merase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui, opcionalmente, melhorador distai ou elementos repressores que podem estar localizados como tantos milhões de pares de base a partir do sítio de início de transcri- ção.

O termo inclui seqüências promotoras endógenas bem como

seqüências promotoras exógenas (tais como aquelas introduzidas no cro- mossoma para promover a expressão de um gene, tal como uma BAAT). Tipos específicos de promotores que podem ser usados para praticar os mé- todos descritos neste documento incluem, porém não estão limitados aos promotores constitutivos e promotores induzíveis (tal como um promotor sensível ou insensível a um estímulo específico, por exemplo, tal como, luz, oxigênio ou concentração química, tal como uma lactose, IPTG, arabinose ou promotor induzível por tetraciclina).

Purificado: o termo purificado não requer pureza absoluta; ao invés disto, pretende ser um termo relativo. Assim, por exemplo, uma prepa- ração de peptídeo purificado (tal como, preparação de peptídeo de BAAT) é uma onde o peptídeo na mesma é mais enriquecido que o peptídeo que está em seu ambiente dentro da célula, tal que, o peptídeo se encontra substan- cialmente separado dos componentes celulares (ácidos nucleicos, lipídeos, carboidratos e outros peptídeos) que podem acompanhar o mesmo. Em ou- tro exemplo, uma preparação de peptídeo purificado é uma onde o peptídeo é substancialmente isento de contaminantes, tal como aquelas que podem estar presentes seguindo-se a síntese química do peptídeo.

Em um exemplo, um peptídeo é purificado quando pelo menos cerca de 50% em peso de uma amostra são compostos do peptídeo, por exemplo, quando pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, ou 99% ou mais de uma amostra são compostos do peptídeo. Exemplos de métodos que podem ser usados para purificar um peptídeo incluem, porém não são limitados aos métodos descritos em Sambrook e outros (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17). A pureza da proteína pode ser determinada, por exem- pio, por eletroforese de gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguido por visualização de uma faixa de peptídeo simples por coloração do gel de poliacrilamida; cromatografia de líquido de alta pressão; sequencia- mento ou outros métodos convencionais.

Recombinante: uma molécula de ácido nucleico recombinante ou proteína é uma que possui uma seqüência que não ocorre naturalmente, possui uma seqüência que é fabricada por uma combinação artificial de dois outros segmentos da seqüência de outra forma separados ou ambos. Esta combinação artificial pode ser obtida, por exemplo, por síntese química ou por manipulação artificial de segmentos isolados das moléculas de ácido nucleico ou proteínas, tal como técnicas de construção genética. Recombi- nante é também usado para descrever moléculas de ácido nucleico que fo- ram artificialmente manipuladas, porém que contém as mesmas seqüências reguladoras e regiões de codificação que são encontradas no organismo do qual o ácido nucleico foi isolado. Identidade da seqüência/similaridade: a identidade/simila-

ridade entre duas ou mais seqüências de ácido nucleico ou duas ou mais seqüências de aminoácidos é expressa em termos de identidade ou similari- dade entre as seqüências. A identidade da seqüência pode se medida em termos de porcentagem de identidade; quanto maior a porcentagem, mais idênticas são as seqüências. A similaridade da seqüência pode ser medida em termos de porcentagem de similaridade (que leva em consideração as substituições de aminoácido conservantes); quanto maior a porcentagem, mais similares são as seqüências. Homólogos ou ortólogos de ácido nuclei- co ou seqüências de aminoácidos possuem um grau relativamente grande de identidade/similaridade de seqüência quando alinhados empregando mé- todos-padrão.

Os métodos de alinhamento das seqüências para comparação são bem-conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinha- mento são descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appi Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Moi Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet e outros, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang e outros, Computer Appls. in the Bioseien- ces 8, 155-65, 1992; e Pearson e outros, Meth. Moi Bio. 24:307-31, 1994. Altschul e outros, J. Moi Bioi 215:403-10,1990, apresenta uma considera- ção detalhada dos métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de ho- mologia.

A NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215:403-10,1990) está disponível em várias fontes, inclu- indo o National Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) e na Internet para uso em conexão com os programas de análise de seqüência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Informações adicionais podem ser encontra- das no sítio da web NCBI.

BLASTN é usado para comparar seqüências de ácido nucleico, enquanto BLASTP é usado para comparar seqüências de aminoácidos. De modo a comparar duas seqüências de ácido nucleico, as opções podem ser estabelecidas como se segue: -i é ajustado a um arquivo contendo a primei- ra seqüência de ácido nucleico a ser comparada (tal como C:\seq1.txt); -j é ajustado a um arquivo contendo a segunda seqüência de ácido nucleico a ser comparada (tal como C:\seq2.txt); -p é ajustado a blastn; -o é ajustado a qualquer nome de arquivo desejado (tal como C:\output.txt); -q é ajustado a - 1; -r é ajustado a 2; e todas outras opções são deixadas em seu ajuste- padrão. Por exemplo, o comando que se segue pode ser usado para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre duas seqüências: C:\BI2seq -i c:\seq1 .txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. De modo a comparar as duas seqüências de aminoácidos, as

opções de BI2seq podem ser ajustadas como se segue: -i é ajustado a um arquivo contendo a primeira seqüência de aminoácido a ser comparada (tal como C:\seq1.txt); -j é ajustado a um arquivo contendo a segunda seqüência de aminoácido a ser comparada (tal como C:\seq2.txt); -p é ajustado a blastp; -o é ajustado a qualquer nome de arquivo desejado (tal como C:\output.txt); e todas outras opções são deixadas em seu ajuste-padrão.

Por exemplo, o comando que se segue pode ser usado para gerar um arqui- vo de saída contendo uma comparação entre duas seqüências de aminoáci- dos: C:\BI2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Se as duas seqüências comparadas compartilharem de homologia, então o arquivo de saída designado apresentará aquelas regiões de homologia como sequên- cias alinhadas. Se as duas seqüências comparadas não compartilharem homologia, então o arquivo de saída designado não apresentará seqüências alinhadas.

Uma vez alinhadas, o número de combinações é determinado por contagem do número de posições onde um nucleotídeo idêntico ou resí- duo de aminoácido está presente em ambas seqüências. A porcentagem de identidade de seqüência é determinada pela divisão do número de combina- ções tanto pelo comprimento da seqüência estabelecido na seqüência identi- ficada, quanto por um comprimento articulado (tal como, 100 nucleotídeos consecutivos ou resíduos de aminoácido de uma seqüência estabelecida em uma seqüência identificada), seguido por multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico que possui 1.166 combinações quando alinhada com uma seqüência de teste possuindo 1.554 nucleotídeos é 75,0% idêntica a seqüência de teste (1166+1554*100=75,0). O valor percentual de identidade da seqüência é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 75,11, 75,12, 75,13, e 75,14 são arredondados para baixo para 75,1, enquanto 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 e 75.19 são arre- dondados para cima para 75,2. O valor do comprimento sempre será um número inteiro. Em outro exemplo, uma sequência-alvo contendo uma região de 20 nucleotídeos que se alinha com os 20 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência identificada como se segue, contém uma região que compar- tilha 75% de identidade de seqüência em relação àquela seqüência identifi- cada (isto é, 15-20*100=75). 1 20 Sequência-alvo: ' Γ<-ή *<" ΆΊ'-.νϊ"· J-WXCC

ι ■ I i ι I I ι| Seqüência identificada: "* * W .W * Vi·'. ·. JWTSC

Para comparações das seqüências de aminoácidos superiores a cerca de 30 aminoácidos, a função Blast de 2 seqüências é empregada u- sando a matriz BLOSUM62 padrão ajustada para parâmetros padrão, (custo de existência da fenda de 11, e um custo de fenda por resíduo de 1). Os homólogos são tipicamente caracterizados por possuírem pelo menos 70% de identidade de seqüência contada em relação ao alinhamento de compri- mento pleno com uma seqüência de aminoácido empregando o NCBI Basic Blast 2.0, blastp fendido com bases de dados, tais como a base de dados nr ou swisscprot. Dúvidas de pesquisas com o programa blastn são filtradas com DUST (Hancock and Armstrong, 1994, Comput. Appi Biosci. 10:67-70). Outros programas utilizam SEG. Além disso, um alinhamento manual pode ser realizado. As proteínas com similaridades mesmo maiores mostrarão aumento na porcentagem de identidade quando avaliadas por este método, tal como, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade de seqüência em relação à qualquer uma da SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19.

Quando do alinhamento de peptídeos curtos (em torno de 30 aminoácidos), o alinhamento é realizado empregando função Blast de 2 se- quências, usando a matriz PAM30 ajustada para parâmetros padrão (interva- lo aberto 9, penalidades de extensão do intervalo 1). As proteínas com simi- laridade mesmo maior com relação a seqüência de referência mostrarão por- centagens de identidade crescentes quando avaliadas por este método, tais como, pelo menos de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de seqüência. Quando se comparar menos que toda a seqüência com relação à identidade da seqüência, os homólogos possuirão, tipicamen- te, menos de 75% de identidade de seqüência em janelas curtas de 10-20 aminoácidos e poderão possuir identidades de seqüência de pelo menos 85%, 90%, 95% ou 98%, dependendo de sua identidade com relação a se- quência de referência. Os métodos para determinação da identidade de se- qüência com relação a tais janelas curtas são descritos no sítio NCBI da web.

Uma indicação de que duas moléculas de ácido nucleico estão proximamente relacionadas é o fato de que as duas moléculas híbridizam uma com relação a outra sob condições estringentes. As condições estrin- gentes dependem da seqüência e são diferentes em parâmetros ambientais diferentes. As moléculas de ácido nucleico que híbridizam sob condições estringentes em uma seqüência gênica de BAAT tipicamente híbridizam em uma sonda com base tanto no gene de BAAT total quanto nas porções sele- cionadas do gene, respectivamente, sob as condições descritas acima.

Seqüências de ácido nucleico que não mostram um alto grau de identidade podem codificar, não obstante, seqüências de aminoácidos idên- ticas ou similares (conservadas), em razão da degeneração do código gené- tico. As alterações em uma seqüência de ácido nucleico podem ser feitas empregando esta degeneração para produzir moléculas de ácido nucleico múltiplas que codificam todas substancialmente a mesma proteína. Tais se- qüências de ácido nucleico homólogas podem possuir, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de seqüência em relação à qualquer uma das SEQ ID N0S: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18 de- terminadas por este método.

Um versado na técnica apreciará que estas faixas de identidade de seqüência são providas apenas como diretriz; sendo possível que homó- Iogos fortemente significativos sejam obtidos fora destas faixas que foram providas.

Uma indicação alternativa (e não necessariamente cumulativa) de que duas seqüências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que o peptídeo que o primeiro aminoácido codifica possui reação imunologi- camente cruzada com o peptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.

Agente de ligação específico: Um agente que se liga substan- cialmente apenas a um alvo definido, tal como, um peptídeo-alvo. Por exem- pio, um agente de ligação de BAAT inclui anticorpos anti-BAAT e outros a- gentes (tais como um peptídeo ou fármaco) que se liga substancialmente a apenas uma proteína de BAAT. Os anticorpos para uma proteína de BAAT (ou fragmentos da mesma) podem ser usados para purificar ou identificar tal proteína.

Célula transformada: uma célula na qual uma molécula de áci- do nucleico foi introduzida, tal como uma molécula de ácido nucleico de BA- AT, por exemplo, por técnicas de biologia molecular. A transformação englo- ba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula, incluindo, porém não-limitada à transfecção com vetores viróticos, conjugação, transformação com vetores de plasmídeo e introdução de DNA nu por eletroporação, lipofecção e aceleração por pistola de partícula.

Sob condições suficientes para: a frase que é usada para descrever qualquer ambiente que permita atividade desejada.

Em um exemplo, inclui cultivo de células (tais como, células bac- terianas) em meio de crescimento e a temperatura suficiente para permitir a atividade desejada. Nos exemplos específicos, a atividade desejada é a pro- dução de beta-alanina (ou produto a jusante da mesma, tal como, semialde- ido de malonila, 3-HP ou derivados dos mesmos) pela célula.

Variantes, fragmentos ou fusões: a proteína e seqüências de ácido nucleico descritas (tais como, BAAT, aspartato descarboxilase e 3-HP desidrogenase) incluem variantes, fragmentos, e fusões das mesmas que mantêm a atividade biológica desejada. Por exemplo, seqüências de DNA que codificam uma proteína de BAAT (por exemplo, SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18), proteína de fusão de BAAT ou um fragmento ou variante de uma proteína de BAAT podem ser construídas geneticamente para permi- tir que uma proteína seja expressa nas células eucarióticas, bactérias, inse- tos ou plantas. Para obter a expressão, a seqüência de DNA pode ser alte- rada e operativamente ligada às outras seqüências reguladoras. O produto final que contém as seqüências reguladoras e a proteína é referido como um vetor. Este vetor pode ser introduzido nas células eucarióticas, bactérias, insetos ou plantas. Uma vez dentro da célula, o vetor permite que a proteína seja produzida.

Em um exemplo, uma proteína de fusão inclui uma seqüência de aminoácido de BAAT (ou variante ou fragmento da mesma), por exemplo, SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19, ligada às outras seqüências de a- minoácidos que não diminuem significativamente a atividade de BAAT1 por exemplo, a capacidade de converter beta-alanina no semialdeído de maloni- la. Em um exemplo, as outras seqüências de aminoácido não possuem mais de cerca de 10, 12, 15, 20, 25, 30, ou 50 aminoácidos de comprimento, tal como, 5-50 aminoácidos. Além disso, seqüências espaçadoras podem ser colocadas entre a seqüência de BAAT e a seqüência de aminoácido adicio- nal. Tais espaçadores podem ser, pelo menos 4, pelo menos 6, ou pelo me- nos 10 aminoácidos, tais como 4-12 aminoácidos.

Um versado na técnica apreciará que a seqüência de DNA pode ser alterada de várias formas, sem afetar a atividade biológica da proteína codificada. Por exemplo, PCR pode ser usada para produzir variações na seqüência de DNA que codifica uma BAAT. Tais variantes podem ser varian- tes otimizadas para preferência de códon em uma célula hospedeira usada para expressar a proteína ou outras alterações de seqüência que facilitam a expressão.

Vetor: uma molécula de ácido nucleico é introduzida dentro de uma célula, pelo que, produzindo uma célula transformada. Um vetor pode incluir seqüências de ácido nucleico que permitam que o mesmo replique na célula, tal como, uma origem de replicação. Um vetor também pode incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica.

Seqüências Beta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransferase

A presente descrição provê novas proteínas de beta-alani- na/alfa-cetoglutarato aminotransferase (BAAT) e seqüências de ácido nucle- ico que codificam tais proteínas. Proteínas

Os peptídeos que possuem atividade beta-alanina/alfa-cetoglu- tarato aminotransferase (BAAT) são descritos neste documento. Pelo em- prego de várias rodadas de mutagênese seguidas por classificação para produção de semialdeído de malonila, foram identificadas várias mutações na seqüência de aminoácido de BAAT que aumentaram a atividade biológica de uma seqüência de BAAT nativa (SEQ ID N0: 4). Estas substituições inclu- íram: P3H, S24T, D110N, F113L e A133T, bem como combinações dos mesmos (numeração das substituições com base na SEQ ID N0: 4).

Os peptídeos de BAAT possuem a capacidade de converter be- ta-alanina em semialdeído de malonila, por exemplo, em uma célula expres- sando BAAT exógena. Nos exemplos específicos, a atividade biológica de BAAT é determinada por medição da atividade específica da enzima (por exemplo, por medição da produção de L-glutamato de beta-alanina e alfa- cetoglutarato, vide Exemplo 4). Em outro exemplo, a atividade biológica de BAAT é determinada por medição do Km da enzima para beta-alanina (vide Exemplo 4). Nos exemplos específicos, uma enzima BAAT possuindo ativi- dade biológica aumentada (tal como, uma enzima BAAT variante) é uma que possui uma atividade específica que é aumentada pelo menos duas vezes em relação à enzima nativa (tal como SEQ ID N0: 4), tal como um aumento de pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes ou mesmo pelo menos dez ve- zes. Em um exemplo específico, uma enzima BAAT possuindo atividade bio- lógica (tal como uma enzima BAAT variante) é uma que possui uma ativida- de específica de pelo menos 1,5 U/mg (onde U é 1 pmol/minuto), tal como uma atividade específica de pelo menos 2 U/mg, ou mesmo uma atividade específica de pelo menos 3 U/mg. Os peptídeos de BAAT descritos podem ser usados para produ-

zir 3-HP, por exemplo, em combinação com uma 3-HP desidrogenase (tais como SEQ ID N°s: 21, 23, 27 e 31) (vide figura 1). Exemplos específicos dos peptídeos de BAAT são mostrados nas SEQ ID N°s: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19. A SEQ ID N0 4 é uma seqüência de BAAT nativa, enquanto as SEQ ID N0S: 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19 são seqüências variantes possuindo atividade biológica de BAAT aumentada.

A descrição também engloba variantes, fusões e fragmentos das SEQ ID N0S: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19 que mantêm atividade biológica de BAAT ou mesmo atividade de BAAT aumentada, seqüências de peptídeo de BAAT variantes podem ser produzidas por manipulação da seqüência de nucleotídeo codificando um peptídeo de BAAT empregando procedimentos- padrão, tais como, mutagênese direcionada ao sítio ou PCR. Nos exemplos específicos, variantes, fusões e fragmentos das SEQ ID N0S: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19 possuem, pelo menos, 90% de atividade de BAAT como SEQ ID N0: 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19, tal como pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 100%, ou mesmo pelo menos 150% de atividade de BAAT da SEQ ID N0: 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19.

Em alguns exemplos, um peptídeo de BAAT inclui pelo menos 80% de identidade de seqüência (tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de seqüência) em relação a SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19 e inclui uma substituição P3H, S24T, D110N, F113L, ou A133T ou suas combinações e mantêm atividade de BAAT. Por exemplo, tal se- qüência pode incluir uma substituição P3H, S24T, D110N, F113L, ou Α133T, ambas uma substituição S24T e F113L; uma substituição S24T, F113L e A133T; uma substituição P3H, S24T, F113L e A133T; ou uma substituição S24T, F113L e A133T; uma substituição P3H, S24T, D110N, F113L e A133T. Um versado na técnica apreciará outras combinações que são pos- síveis de prover atividade de BAAT. Moléculas de ácido nucleico codificando tais proteínas são também providas por esta descrição.

Variantes incluem substituição de um ou mais aminoácidos, tais como, uma ou mais substituições de aminoácido conservantes, uma ou mais substituições de aminoácido não-conservantes ou suas combinações. Vari- antes também incluem deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos (ou combinações dos mesmos, tal como uma deleção simples em conjunto com inserções múltiplas), tal como adição ou deleção de não mais de 50 aminoá- cidos, não mais de 20 aminoácidos, não mais de 10 aminoácidos, não mais de 5 aminoácidos, ou não mais de 2 aminoácidos, tal como uma adição ou deleção de 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, ou 2-20 aminoácidos. Em um exemplo específico, uma seqüência de BAAT variante inclui pelo menos 80% de identidade de seqüência em relação a qualquer uma das SEQ ID N°S: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19, à medida que o peptídeo codificado pela seqüência de aminoáci- do mantém atividade de BAAT.

Substituições não-conservantes são aquelas onde os aminoáci- dos possuem mais diferença substancial, tal como seu efeito na manuten- ção: (a) a armação da estrutura de polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal; (b) a carga ou hidrofo- bicidade do polipeptídeo no sítio-alvo; ou (c) o volume da cadeia lateral. As substituições que em geral se espera produzam as alterações maiores na função do polipeptídeo como aquelas nas quais: (a) um resíduo hidrófilo, tal como serina ou treonina é substituído por um resíduo hidrófobo, tal como, leucina, isoleucina, fenilalanina, valina ou alanina; (b) uma cisteína ou prolina é substituída por qualquer outro resíduo; (c) um resíduo possuindo uma ca- deia lateral eletropositiva, tal como, lisina, argina ou histidina é substituído por um resíduo eletronegativo, tal como, ácido glutâmico ou ácido aspártico; ou (d) um resíduo possuindo uma cadeia lateral volumosa, tal como, fenila- lanina, é substituído por um não possuindo uma cadeia lateral, tal como, gli- cina. Os efeitos dessas substituições de aminoácido (ou outras deleções ou adições) podem ser avaliados para peptídeos possuindo atividade de BAAT por análise da capacidade do peptídeo de catalisar a conversão da beta- alanina no semialdeído de malonila empregando os ensaios descritos neste documento. De modo ideal, substituições de aminoácido não-conservantes substancialmente não diminuem a atividade biológica de uma BAAT, e pode mesmo aumentar a atividade biológica de BAAT e pode mesmo aumentar a atividade biológica de BAAT (conforme demonstrado pela SEQ ID N0S: 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19).

Em contraste, as substituições conservantes são aquelas onde os aminoácidos possuem propriedades bioquímicas similares. Em um exem- pio, uma seqüência de BAAT inclui pelo menos uma substituição de aminoá- cido conservante em qualquer uma da SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19, tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 substitui- ções de aminoácido conservantes, por exemplo, 1-5, 1-10, ou 1-20 substitui- ções de aminoácido conservantes. Exemplos específicos de substituições conservantes que podem ser feitas enquanto ainda retendo atividade de BAAT incluem, porém não estão limitados a:

A205S, L250V, Y52W, R50K ou S144T (o número de aminoácidos refere-se a qualquer uma das SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19).

São providos fragmentos de BAAT que podem ser expressos nas células da presente descrição, por exemplo, para produzir 3-HP in vivo. A descrição também provê peptídeos de BAAT que contém pelo menos 15 aminoácidos contíguos da SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19 que man- têm atividade de BAAT. Os peptídeos de BAAT podem também incluir pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 400, ou pelo menos 425 resíduos de aminoácido contínuos da SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19, à medida que tais fragmentos man- têm a capacidade de converter beta-alanina no semialdeído de malonila.

Proteínas de fusão (e as seqüências de ácido nucleico corres- pondentes) podem ser geradas empregando as seqüências de BAAT descri- tas. As seqüências de fusão podem incluir uma seqüência de proteína de BAAT de comprimento pleno (tal como, SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, ou 19) ou uma variante ou fragmento da mesma que tem atividade de BAAT, ligada a uma segunda seqüência de aminoácido. Em alguns exemplos, a segunda seqüência de aminoácido inclui pelo menos 5 aminoácidos, tal co- mo pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos, pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 150 aminoácidos, ou mesmo pelo me- nos 200 aminoácidos, por exemplo, 5-500 aminoácidos. Nos exemplos es- pecíficos, a seqüência de BAAT e uma segunda seqüência de aminoácido são ligadas através de uma seqüência espaçadora. Exemplos específicos de espaçadores incluem um ou mais resíduos de alanina ou glicina ou outros aminoácidos não-polares ou aminoácidos polares neutros. Em alguns exem- plos, os espaçadores se constituem em não mais de 50 aminoácidos, tal como não mais de 20 aminoácidos, não mais de 10 aminoácidos, não mais de 5 aminoácidos, por exemplo, 5-50 aminoácidos. Moléculas de ácido nucleico

Também são descritas moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam peptídeos possuindo atividade de BAAT, por exemplo, uma se- qüência que inclui SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18. Contudo, a descri- ção também engloba variantes, fusões e fragmentos da SEQ ID N0S: 3, 5, 7, 9, 11,13, 16 ou 18 que mantêm atividade para codificar uma proteína possu- indo atividade de BAAT ou mesmo atividade de BAAT aumentada. Em um exemplo uma molécula isolada de ácido nucleico codificando um peptídeo possuindo atividade de BAAT é operativamente ligada a uma seqüência promotora e pode fazer parte de um vetor. Nos exemplos específicos, o promotor é um que melhora as expressões de BAAT, tal como, um aumento de pelo menos 25%. O ácido nucleico pode ser um ácido nucleico recombi- nante que pode ser usado para transformar células e constituir as células transformadas ou plantas transgênicas.

São descritas células transformadas incluindo pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica um peptídeo possuindo atividade de BAAT (tal como SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18 ou frag- mentos, fusões ou variantes dos mesmos que mantém atividade de BAAT). Em um exemplo, tal célula transformada produz semialdeído de malonila a partir de beta-alanina. Em outro exemplo, a célula produz 3-HP (ou deriva- dos da mesma, tais como, ésteres de 3-HP ou 3-HP polimerizado) ou com- postos orgânicos, tais como, 1,3-propanodiol. As células transformadas po- dem ser eucarióticas ou procarióticas, tais como, células bacterianas, células fúngicas, células de plantas ou células de levedura. Exemplos específicos de células transgênicas incluem células de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus ou Escherichia. Também são providas plantas que incluem as moléculas de ácido nucleico de BAAT ou células transgênicas expressando tais moléculas de ácido nucleico de BAAT.

Seqüências de ácido nucleico codificando uma BAAT que con- têm uma seqüência de ácido nucleico total codificando a enzima, bem como, porções dos mesmos que mantêm a atividade de enzima desejada. Por e- xemplo, uma molécula de ácido nucleico de BAAT pode conter pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma seqüência de ácido nucleico de BAAT (tal como SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18). Será apreciado que a descri- ção também provê moléculas isoladas de ácido nucleico que contêm pelo menos 18, pelo menos 21, pelo menos 27, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 1000, ou pelo menos 1.200 nucleotídeos contínuos da SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18. Em alguns exemplos, fragmentos da SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18 (ou a fita complementar) não codifica uma proteína possuindo atividade de BAAT, po- rém são fragmentos mais curtos que podem ser usados como sondas ou iniciadores.

Seqüências de ácido nucleico de BAAT variantes são descritas

neste documento. As variantes podem conter uma inserção simples, uma deleção simples, uma substituição simples, inserções múltiplas, deleções múltiplas, substituições múltiplas ou qualquer combinação das mesmas (tal como uma deleção simples em conjunto com inserções múltiplas) à medida que o peptídeo codificado desta forma mantém atividade de BAAT (ou pode funcionar como uma sonda ou iniciador). Tais moléculas isoladas de ácido nucleico podem compartilhar pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com uma seqüência de BAAT (tal como SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18), à medida que o peptídeo codificado pelo ácido nucleico mantém atividade de BAAT. Por exemplo, uma ou mais das variações que se seguem podem ser feitas em relação a SEQ ID N0: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18: o "g" na posi- ção 24 pode ser substituído com um "a"; o "c" na posição 96 ou 144 pode ser substituído com um "t"; o "c" na posição 339 ou 1.110 pode ser substituí- do com um "t;" o "a" na posição 816 pode ser substituído com um "c" "t" ou "g"; a "c" na posição 1.200 ou 1.296 pode ser substituído com um "a" "t" ou "g"; e o "g" na posição 1.152; pode ser substituído com um "a" "t" ou "c"; o "g" na posição 1.344 pode ser substituído com um "a"; e o "t" na 1.353 pode ser substituído com um "g" "a" ou "c". A região de codificação de uma seqüência de BAAT pode ser

alterada quando se tira vantagem da degeneração do código genético para alterar a seqüência de codificação de modo que, enquanto a seqüência de ácido nucleico é substancialmente alterada, isto não obstante codifica um peptídeo possuindo uma seqüência de aminoácido idêntica ou substancial- mente similar a seqüência de aminoácido nativa. Por exemplo, preferências de códon e tabelas de uso de códon para uma espécie específica podem ser usadas para construir geneticamente moléculas isoladas de ácido nucleico que tiram vantagem das preferências de uso do códon da espécie específi- ca. Em razão da degeneração do código genético, alanina é codificada pelos quatro tripletos de códon de nucleotídeo: GCT, GCA, GCC e GCG. Assim, a seqüência de ácido nucleico do quadro aberto de leitura pode ser alterada em uma posição da alanina para qualquer um destes códons sem afetar a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado ou as características do peptídeo. Com base na degeneração do códon genético, as variantes do ácido nucleico podem ser derivadas de uma seqüência de ácido nucleico empregando técnicas de mutagênese de DNA-padrão, conforme descritas neste documento ou por síntese de seqüências de ácido nucleico. Assim, esta descrição também engloba moléculas de ácido nucleico que codificam o mesmo polipeptídeo, porém variam na seqüência de ácido nucleico, em vir- tude da degeneração do código genético. Portanto, as seqüências de BAAT descritas neste documento podem ser projetadas pra terem códons que são usados preferivelmente por um organismo de interesse específico (por e- xemplo, conforme descrito nos Exemplos a seguir).

Ácidos nucleicos codificando variantes, fusões e fragmentos de uma seqüência de BAAT (tais como aquelas relevadas acima) são engloba- dos por esta descrição. A descrição também provê seqüências isoladas de ácido nucleico que codificam uma BAAT, onde a seqüência possui pelo me- nos 12 nucleotídeos de comprimento (tal como pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo me- nos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1.000, ou pelo menos 1.200 nucleotídeos de comprimento) e hibridiza, sob condições de hibridização, com relação à fita de sentido ou antisenso de uma molécula de ácido nucleico codificando a enzima. As condições de hi- bridização podem ser condições de hibridização moderadas ou altamente estringentes.

Os peptídeos de BAAT e moléculas de ácido nucleico codifican-

do tais peptídeos podem ser produzidos por técnicas de mutagênese de DNA-padrão, por exemplo, mutagênese de iniciador M13. Os detalhes des- tas técnicas são providos em Sambrook e outros (ed.), Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, N.Y., 1989, Ch. 15. As moléculas de ácido nucleico po- dem conter alterações de uma região de codificação para ajuste da tendên- cia de uso do códon do organismo específico no qual a molécula será intro- duzida.

Células com atividade de BAAT

São descritas as células possuindo atividade de BAAT, por e-

xemplo, devido à presença de um ácido nucleico de BAAT exógeno ou pro- teína. Tais células podem produzir semialdeído de malonila a partir de beta- alanina, e, em alguns exemplos, também produzem 3-HP (ou derivados dos mesmos) a partir de semialdeído de malonila se a atividade de 3-HP desi- drogenase também estiver presente na célula.

As atividades da enzima expressas pelas células descritas neste documento podem ser providas por expressão das moléculas de ácido nu- cleico que codificam enzimas possuindo a atividade desejada ou por forne- cimento da enzima diretamente. Os métodos para introdução de seqüências de ácido nucleico exógeno (tais como aquelas em um vetor) dentro de uma célula são rotina.

Em um exemplo, as células possuem atividade de BAAT devido

à expressão de uma molécula de ácido nucleico de BAAT exógeno, tal como uma molécula variante que aumenta a atividade de BAAT (por exemplo, quando comparada a uma seqüência de BAAT nativa, tal como SEQ ID N°s: 3 e 4). Exemplos de tais moléculas variantes são providos neste documento (por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico apresentando pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18). Em alguns exemplos, a atividade de BAAT aumentada resulta em produção aumentada de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina pelas células e podem também resultar em produção aumentada de 3-HP (ou derivados dos mesmos) a partir de semialdeído de malonila se a célula também tiver atividade de 3-HP desidrogenase. Nos exemplos específicos, a produção ou rendimento do semialdeído de malonila ou um produto a jusante, tal como, 3-HP (ou derivados dos mesmos) for au- mentado em pelo menos 20%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, ou pelo menos 150%. A produção aumentada de semial- deído de malonila ou 3-HP pode ser relativa a uma célula do mesmo tipo que expressa uma seqüência de BAAT nativa (se exógena ou não, tal como SEQ ID N°s: 3 e 4). Os métodos para medição de tal produção são conhecidos na técnica e exemplos não Iimitantes específicos são providos neste documen- to.

As células incluindo atividade de BAAT podem ser eucarióticas ou procarióticas. Exemplos de tais células incluem, porém não estão limita- dos às células bacterianas (tais como, Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Escherichia, Geobacillus, Corynebacterium, ou Clostridium), células de fungo (tal como células de Aspergillus ou Rhizopus), células de plantas (tais como, milho, trigo, arroz ou soja) e células de levedura. Em um exemplo, uma célu- la é um micro-organismo. O termo "micro-organismo" refere-se a qualquer organismo microscópico incluindo, porém não-limitado às bactérias, algas, fungos e protozoários. Assim, E. coli, B. subtilis, B. licheniformis, S. cerevisi- ae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, e Pichia pastoris são micro-organismos e podem se usados. Em outro exemplo, a célula faz parte de um organismo maior, tal como uma planta, tal como uma planta transgênica. Exemplos de plantas que podem ser usadas para obter 3-HP ou outros compostos de beta-alanina incluem, porém não estão limitadas às colheitas de plantas obtidas por construção genética, tais como, milho, arroz, trigo e soja.

Em um exemplo, as células possuindo atividade de BAAT são

células transformadas. Tais células podem incluir pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica um BAAT, por exemplo, uma se- qüência que inclui as SEQ ID N°s: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18 ou suas varian- tes, fragmentos, ou fusões que mantêm a capacidade de codificar uma pro- teína possuindo atividade de BAAT (vide a discussão das moléculas de áci- do nucleico de BAAT acima). Em alguns exemplos, pelo menos duas molé- culas de BAAT diferentes são expressas, tais como duas ou mais das SEQ ID N0S: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 e 18.

Em um exemplo, a molécula de ácido nucleico exógena é uma BAAT mutada, onde a BAAT mutada (tal como SEQ ID N0S: 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18) aumenta a atividade de BAAT na célula e pode aumentar a produ- ção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina. Por exemplo, a BA- AT mutada pode aumentar, em alguns exemplos, a produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina na célula em pelo menos 3 vezes com relação a uma quantidade de produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina na presença de uma BAAT nativa (tal como SEQ ID N°s: 3 e 4), tal como um aumento de pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 8 vezes ou mesmo pelo menos 10 vezes.

São descritas células que incluem atividade de BAAT, bem como outras atividades de enzima. Tais células podem ser usadas para produzir beta-alanina, semialdeído de malonila, 3-HP, polióis, tais como, 1,3- propanodiol, 3-HP polimerizado, copolímeros de 3-HP e ésteres de 3-HP. As outras atividades da enzima podem ser nativas em relação à célula ou po- dem se exógenas devido à introdução de uma molécula de ácido nucleico codificando a(s) enzima(s) desejada(s). Nos exemplos específicos, óperons que codificam duas ou mais de tais enzimas desejadas, tais como, três das enzimas mais desejadas são introduzidos na célula. Por exemplo, óperons que incluem moléculas de ácido nucleico codificando duas ou mais de BATT, 3-HP desidrogenase e aspartato descarboxilase podem ser expressos pela célula.

São providas neste documento células que possuem atividade de BAAT exógena (por exemplo, devido à expressão de pelo menos uma das moléculas de BAAT descritas neste documento), bem como uma ou mais moléculas de ácido nucleico endógeno ou exógeno que permitem a produção de produtos a jusante de semialdeído de malonila, tais como 3-HP e seus derivados. A presença de 3-HP pode ser determinada empregando métodos de rotina, tal como descrito em Sullivan and Clarke (J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 38:514-8, 1955). Por exemplo, as células possuindo atividade de BAAT e de 3-HP desidrogenase (3-atividade de hidroxipropionato desi- drogenase, EC 1.1.1.59) (por exemplo, devido à expressão de uma seqüên- cia de ácido nucleico que codifica uma proteína apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 21, 23, 27, ou 31 tal como SEQ ID N0: 20, 22, 26, 29 ou 30). Tais células são capazes de pro- duzir 3-HP a partir de intermediários de beta-alanina e semialdeído de malo- nila. De modo similar, as células possuindo atividade de aspartato amino- transferase, atividade de aspartato descarboxilase (por exemplo, devido à expressão de uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 39 ou 41, tal como SEQ ID N0: 38 ou 40), atividade de PEP car- boxilase, atividade de BAAT exógena (por exemplo, devido à expressão de pelo menos uma das moléculas de BAAT descritas neste documento) e ati- vidade de 3-HP desidrogenase (por exemplo, devido à expressão da SEQ ID N0: 20, 22, 26 ou 29) são capazes de produzir 3-HP a partir da glicose ou piruvato. Nestes exemplos, as células podem ser usadas para produzir 3- HP.

As células descritas acima que produzem 3-HP podem conter, adicionalmente, atividade de Iipase ou esterase, por exemplo, devido à ex- pressão de uma molécula de ácido nucleico exógeno codificando uma Iipase ou esterase (EC 3.1.1.-). Tais células podem ser usadas para produzir um éster de 3-HP, tal como 3-hidroxipropionato de metila, 3-hidroxipropionato de etila, 3-hidroxipropionato de propila, 3-hidroxipropionato de butila, ou 3- hidroxipropionato de 2-etilexila. As células descritas acima que produzem 3- HP podem conter, adicionalmente, atividade de esterase, por exemplo, devi- do à expressão de uma molécula de ácido nucleico exógeno codificando uma esterase. Tais células podem ser usadas para produzir 3-HP polimeri- zado. As células descritas acima que produzem 3-HP podem conter, adicio- nalmente, atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1), atividade de alde- ído desidrogenase (EC 1.2.1.-) ou ambas, por exemplo, devido à expressão de uma molécula de ácido nucleico exógeno codificando uma álcool desi- drogenase, aldeído desidrogenase ou ambas. Tais células podem ser em- pregadas para produzir 1,3 propanodiol.

Nos exemplos específicos, uma molécula de ácido nucleico exó- gena codificando a atividade da enzima desejada em uma célula inclui um promotor não-nativo que melhora a expressão da enzima desejada. Tal ex- pressão aumentada de precursores desejáveis pode resultar na produção aumentada de produtos a jusante, tais como, beta-alanina, piruvato, oxaloa- cetato, semialdeído de malonila, bem como 3-HP e seus derivados. Nos e- xemplos específicos, a expressão de um ou mais destes produtos a jusante é aumentada em pelo menos 20%, pelo menos 50%, ou mesmo pelo menos 100%, por exemplo, quando comparada a uma quantidade de expressão com um promotor nativo.

Por exemplo, promotores, tal como o promotor Iac que pode ser induzido com Iactose ou IPTG, o promotor ara que pode ser induzido com arabinose, ou o promotor tet que pode ser induzido com tetraciclina ou um promotor constitutivo, podem ser substituídos por um promotor nativo da en- zima empregando métodos de biologia molecular de rotina. Tais promotores não-nativo sou sintéticos são ligados operativamente a seqüência de codifi- cação da enzima. Nos exemplos específicos, ais promotores não-nativos podem aumentar a expressão de uma enzima em pelo menos 20%, tal como pelo menos 50% quando comparado ao promotor nativo da enzima. A ex- pressão aumentada da enzima (no ácido nucleico ou nível de proteína) pode ser detectada empregando métodos de rotina, tais como, Southern blotting, Northern blotting, RT-PCR, eletroforese de poliacrilamida gel, Western blot- ting ou citometria de fluxo. Em um exemplo, as células da presente descri- ção que incluem atividade de BAAT exógena também incluem uma ou mais moléculas de ácido nucleico exógeno codificando uma PEP carboxilase, as- partato aminotransferase, aspartato descarboxilase, piruvato carboxilase, BAAT, ou 3-HP desidrogenase (tal como 2, 3, 4, 5, ou 6 destas enzimas), onde uma ou mais destas enzimas são expressas a partir de um promotor não-nativo.

As células descritas possuindo atividade de BAAT exógena (tal

como aquelas que produzem 3-HP) podem também incluir mutações (tais como, uma deleção funcional de um ou mais genes) que aumentam a dispo- nibilidade do piruvato de servir como um precursor para produtos a jusante, tais como, beta-alanina e 3-HP. A disponibilidade aumentada do piruvato pode aumentar a produção dos produtos a jusante desejáveis, tais como, 3- HP e seus derivados, tal como um aumento menos 20%, ou pelo menos 50%. Por exemplo, mutações funcionais no gene poxB (ApoxB) reduzem a formação de acetato pela célula (tal como uma redução de pelo menos 20%, ou pelo menos 50%) e podem aumentar o piruvato na célula. Em outro e- xemplo, mutações funcionais nos genes adhE ou AatpFH (AadhE ou Aatp- FH) podem aumentar o piruvato na célula e, desta forma, aumentam a pro- dução de beta-alanina, semialdeído de malonila, 3-HP (ou combinações dos mesmos), em pelo menos 20%, ou pelo menos 50% (por exemplo, em com- paração à presença de genes adhE ou AatpFH funcionais). Os métodos para deleção funcional dos genes são rotina na técnica.

As células descritas possuindo atividade de BAAT exógena (tais como aquelas que produzem 3-HP) podem também incluir mutações nos genes de citrato sintase (tal como uma deleção funcional de tais genes) que reduzem significativamente a atividade biológica da citrato sintase. Tais mu- tações podem aumentar a quantidade de oxaloacetato disponível como substrato para a reação da aspartato aminotransferase (figura 1), pelo que, aumentando a produção dos produtos a jusante, tais como, beta-alanina e 3- HP. A quantidade acrescida de oxaloacetato pode aumentar a produção de produtos a jusante desejáveis, tais como, 3-HP e seus derivados, tal como um aumento de pelo menos 20% ou pelo menos 50%. Por exemplo, a ex- pressão da SEQ ID N0: 52 (uma gltA mutada), pode aumentar a produção de 3-HP.

Um versado na técnica apreciará que as células isoladas descri- tas podem incluir combinação múltipla de elementos desejados, tais como, promotores não-nativos operativamente ligados a uma ou mais das enzimas desejadas (onde o promotor aumenta a expressão da enzima em relação ao promotor nativo), mutações que aumentam o piruvato disponível e mutações que diminuem a expressão da citrato sintase.

Em alguns exemplos, o produto desejado (tal como, beta- alanina, semialdeído de malonila e 3-HP ou seus derivados) é secretado a partir da célula, reduzindo ou eliminando a necessidade de se romper as membranas da célula para recuperar o composto desejado. Em um exemplo, a célula fabrica o(s) produto(s) desejado(s) em uma concentração de pelo menos 1 mg per L (tal como pelo menos 1 mg/L, pelo menos 5 mg/L, pelo menos 10 mg/L, pelo menos 50 mg/L, pelo menos 100 mg/L, pelo menos 200 mg/L, pelo menos 500 mg/L, pelo menos 1 g/L, pelo menos 2 g/L, pelo menos 5 g/L, ou pelo menos 10 g/L). Quando da determinação do rendimen- to do produto, tal como, 3-HP ou seus derivados, de uma célula específica, qualquer método pode ser empregado. Vide, por exemplo, Applied Environ- mentai Microbioiogy 59(12):4261-5 (1993). Uma célula, dentro do escopo da descrição, pode utilizar várias fontes de carbono. Em outro exemplo, o pro- duto de radical da enzima SAM (ou sua substância química orgânica a ju- sante) não é secretado a partir da célula. Em tais exemplos, a membrana da célula pode ser interrompida usando métodos bem-conhecidos na técnica para recuperar o composto orgânico).

Métodos para produção de semialdeído de malonila, 3-HP e derivados dos mesmos

São descritos os métodos e materiais relacionados à produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina, através das seqüências de BAAT descritas e as células descritas possuindo atividade de BAAT. A- lém disso, os métodos e materiais relacionados à produção de 3-HP a partir de semialdeído de malonila, bem como compostos orgânicos, tais como, 1,3- propanodiol, 3-HP polimerizado, copolímeros de 3-HP e outros compostos, tais como, butiratos, valeratos e outros compostos e ésteres de 3-HP, são descritos. Especificamente, a descrição provê moléculas de ácido nucleico de BAAT (tais como SEQ ID N°s: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16, e 18), peptídeos (tais como SEQ ID N0: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19), células hospedeiras, além de métodos e materiais para produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina, que podem ser usados para fabricação mais eficiente semial- deído de malonila e 3-HP bem como seus derivados, tais como, 1,3- propanodiol, 3-HP polimerizado e ésteres de 3-HP. Embora sejam providos métodos e enzimas específicos para produção de beta-alanina e substâncias químicas a jusante, um versado na técnica apreciará que métodos e enzi- mas variantes e similares podem ser empregados.

Inúmeras vias metabólicas podem ser usadas para produzir compostos orgânicos a partir de semialdeído de malonina os quais foram produzidos de beta-alanina (figura 1). 3-HP pode ser fabricado de beta- alanina por emprego de um peptídeo possuindo atividade de BAAT que gera semialdeído de malonila a partir de beta-alanina. O semialdeído de malonila pode ser convertido em 3-HP com um peptídeo possuindo atividade de 3-HP desidrogenase (EC 1.1.1.59 ou 31). O 3-HP resultante pode ser convertido em 3-HP polimerizado por um peptídeo possuindo atividade de esterase. 3- HP pode ser convertida em 1,3-propanodiol por peptídeos que possuem ati- vidade aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-) e atividade de álcool desidroge- nase (EC 1.1.1.1). O 3-HP resultante pode ser convertido em um éster de 3- HP por um polipeptídeo possuindo atividade Iipase ou esterase (EC 3.1.1.-). A presente descrição também provê métodos para aumentar a produção de beta-alanina, semialdeído de malonila, 3-HP (e seus deriva- dos). Nos exemplos específicos, o emprego de seqüências de BAAT varian- tes providas neste documento aumentou atividade de BAAT, por exemplo, em combinação com o uso de promotores não-nativos para expressar enzi- mas e aumentando o piruvato disponível, a produção de beta-alanina, semi- aldeído de malonila e 3-HP pode ser aumentada, tal como um aumento de pelo menos 20%, pelo menos 40%, ou mesmo pelo menos 50% ou pelo me- nos 100%. A produção aumentada do produto desejado pode ser relativa a uma célula do mesmo tipo que não expressa uma BAAT aperfeiçoada, não expressa uma ou mais enzimas de um promotor não-nativo ou não inclui mutações que aumentam o piruvato disponível. Por exemplo, o aumento po- de ser relativo a um valor de referência do produto esperado quando uma BAAT nativa é expressa (tal como SEQ ID N0: 3). Em outro exemplo, o au- mento pode ser relativa a uma amostra experimental contendo uma BAAT nativa. Os métodos para medir a fabricação do produto desejado são conhe- cidos na técnica e nos exemplos específicos não Iimitantes são descritos neste documento.

Os métodos descritos podem ser realizados in vivo, in vitro ou suas combinações. Por exemplo, uma célula ou micro-organismo provido neste documento pode ser usado para realizar uma ou mais das etapas for- necidas na figura 1 ou um extrato contendo peptídeos possuindo as ativida- des enzimáticas indicadas pode ser usado para realizar uma ou mais etapas providas na figura 1. Em um exemplo, o método pode incluir cultivo das célu- Ias descritas possuindo BAAT e outras atividades de enzima desejadas sob condições suficientes para que a célula fabrique o produto desejado (tal co- mo semialdeído de malonila, 3-HP, ou seus derivados). Para os métodos envolvendo etapas in vivo, as células podem ser células cultivadas isoladas ou organismos integrais, tais como, plantas transgênicas ou organismos de célula simples, tais como, leveduras ou bactérias (por exemplo, células de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus e Escherichia). Tais células podem ser referidas como células de produção. Os produtos obtidos destas células de produção podem ser produtos orgânicos, tais como, beta-alanina, semialdeí- do de malonila e 3-HP (ou seus derivados).

Em outro exemplo, métodos in vitro (ou uma combinação de mé- todos in vivo e in vitro) são empregados. Por exemplo, semialdeído de malo- nila pode ser produzido por células possuindo atividade de BAAT descritas neste documento, purificadas e então incubadas com uma 3-HP desidroge- nase in vitro sob condições que permitam a formação de 3-HP. Um versado na técnica apreciará que a etapa ou etapas de síntese in vitro pode(m) ser realizada(s) através de reação química ou reação enzimática. Por exemplo, tratamentos químicos podem ser usados para realizar as conversões provi- das na figura 1. Em um exemplo, 3-HP pode ser convertido em éster de 3- HP por transesterificação ou em 1,3-propanodil por hidrogenação. A hidro- genação de um ácido orgânico, tal como, 3-HP pode ser realizada usando qualquer método, tal como aqueles usados para hidrogenar ácido succínico ou ácido láctico. Por exemplo, 3-HP pode ser hidrogenado usando um catali- sador de metal. Em outro exemplo, 3-HP pode ser desidratado para formar ácido acrílico. Qualquer método pode ser usado para realizar a reação de desidrogenação. Por exemplo, 3-HP pode ser aquecido na presença de um catalisador (tal como um catalisador de metal ou ácido mineral) para formar ácido acrílico.

Produção in vivo de semialdeído de malonila e 3-HP e seus derivados

São fornecidos métodos e materiais relacionados à produção in vivo de semialdeído de malonila e produtos a jusante, tais como, 3-HP (e seus derivados). Por exemplo, semialdeído de malonila e 3-HP podem ser produzidos em uma célula, tais como as células providas neste documento. As células podem ser células de culturas isoladas ou organismos integrais, tais como, plantas transgênicas ou organismos de célula simples, tais como, leveduras e bactérias (por exemplo, células de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus e Escherichia). Nos exemplos específicos, o método inclui o cultivo da célula sob condições suficientes para que o produto desejado seja obtido. Por exemplo, uma célula pode ser transfectada com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que expressam as enzimas apropriadas para gerar o pro- duto desejado e então cultivadas sob condições suficientes para fabricar o produto desejado. O produto desejado pode ser extraído das células ou po- de ser recuperado do meio extracelular, se o produto for secretado pela célu- la. Um versado na técnica apreciará que a molécula de ácido nucleico exó- geno codificando as enzimas apropriadas pode ser parte de um ou mais ve- tores e pode incluir outras seqüências de ácido nucleico.

São providos os métodos e materiais relacionados à produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina in vivo. Em um exemplo, o método inclui cultivo das células descritas possuindo atividade de BAAT sob condições que permitem que a célula fabrique semialdeído de malonila a partir de beta-alanina. Nos exemplos específicos, a atividade de BAAT se deve á presença de uma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima BAAT (tal como uma enzima apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19). Em alguns exemplos, a célula também inclui uma molécula de ácido nucleico exógeno codificando outras atividades de enzima, tais como aquelas neces- sárias para produzir beta-alanina de PEP, piruvato ou ambos. Exemplos de tais enzimas incluem, porém não se limitam a:

PEP carboxilase, aspartato aminotransferase e piruvato carboxi- lase, aspartato descarboxilase. Em um exemplo, a célula inclui uma molécu- la de ácido nucleico exógeno que codifica uma aspartato descarboxilase (tal como uma molécula de ácido nucleico exógeno codificando uma aspartato descarboxilase apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 38 ou 40). A célula também pode incluir mutações que aumentam a disponibilidade de piruvato. Exemplos de tais mutações incluem, porém não estão limitados a: uma mutação ΔροχΒ (tais como aque- las que diminuem a formação de acetato pela célula em pelo menos 20%), uma mutação AadhE ou AatpFH (por exemplo, aquelas que aumentam a produção de semialdeído de malonila em pelo menos 20% em comparação à ausência de AadhE ou AatpFH), ou uma mutação de diminui a produção de citrato sintase (tal como, expressão de uma molécula de ácido nucleico exógeno apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em re- lação a SEQ ID N0: 52).

São descritos métodos e materiais relacionados à produção de 3-HP do semialdeído de malonato in vivo. 3-HP pode ser empregado na in- dústria de nutrição como um alimento, aditivo alimentício ou conservante.

Além disto, 3-HP pode ser empregado para produzir derivados do mesmo, tais como, 1,3-propanodiol, ésteres de 3-HP, acrilato ou ácido acrílico, acrila- to polimerizado, ésteres de acrilato, 3-HP polimerizado, copolímeros de 3-HP e outros compostos, tais como, butiratos, valerato. Em um exemplo, o méto- do inclui cultivo de uma célula descrita possuindo atividade de BAAT (por exemplo, as descritas acima) e atividade de 3-HP desidrogenase (EC 1.1.1.59) sob condições que permitem que a célula fabrique 3-HP a partir de semialdeído de malonila. Nos exemplos específicos, a atividade de 3-HP desidrogenase se deve à presença de uma molécula de ácido nucleico exó- gena que codifica uma 3-HP desidrogenase (tal como uma enzima apresen- tando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 21, 23, 27 ou 31).

Derivados de 3-HP podem ser fabricados in vivo a partir de 3-HP gerado de malonila conforme descrito acima. Derivados de 3-HP, tais como, um éster de 3-HP, 3-HP polimerizado, ou 1,3 propanodiol, podem ser gera- dos a partir de 3-HP in vivo por emprego de células que expressam as enzi- mas apropriadas (vide figura 1). Em um exemplo, estas enzimas são supri- das à célula por transfecção da célula com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que podem expressar uma proteína possuindo a atividade de enzi- ma necessária. Por exemplo, as células que possuem adicionalmente, ativi- dade de Iipase ou esterase (EC 3.1.1.-) podem converter 3-HP em um éster de 3-HP (tal como, acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de propila ou acrilato de butila, por exemplo, 3-hidroxipropionato de metila, 3-hidroxipro- pionato de etila, 3-hidroxipropionato de propila, 3-hidroxipropionato de butila ou 3-hidroxipropionato de 2-etilexila. As células que possuem, adicionalmen- te, atividade de aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-) e atividade de álcool de- sidrogenase (EC 1.1.1.1) podem ser usadas para converter 3-HP em 1,3- propanodiol. As células que possuem adicionalmente atividade de esterase (EC 3.1.1.-) podem ser usadas para converter 3-HP em 3-HP polimerizado. Produção de 3-HP e seus derivados empregando métodos in vivo e in vitro

Nos exemplos específicos, os métodos para produção de um produto, tal como, 3-HP ou seus derivados são realizados empregando uma combinação de métodos in vivo e in vitro. Por exemplo, para gerar 3-HP a partir de semialdeído de malonila, o semialdeído de malonila pode ser gera- do in vivo em uma célula (que, em alguns exemplos, é subseqüentemente isolada ou purificada a partir da célula ou meio de cultura) e o semialdeído de malonila contatado com outras enzimas ou substâncias químicas in vitro para gerar o 3-HP ou um seu derivado. Embora enzimas e métodos especí- ficos sejam providos, a descrição não se limita a tais enzimas ou métodos.

Por exemplo, o semialdeído de malonila pode ser gerado in vivo em uma célula que possui atividade aumentada de BAAT (por exemplo, de- vido à expressão de um BAAT possuindo atividade biológica aumentada) e subseqüentemente purificado empregando métodos-padrão conhecidos na técnica. O semialdeído de malonila é então contatado ou incubado com as enzimas apropriadas para gerar a substância química orgânica a jusante desejada in vitro. Por exemplo, para gerar um 3-HP a partir de semialdeído de malonila, semialdeído de malonila pode ser contatado com um peptídeo possuindo atividade 3-hidroxipropionil desidrogenase para fabricar 3-HP.

Derivados de 3-HP, tais como um éster de 3-HP, 3-HP polimeri- zado, ou 1,3 propanodiol, podem ser gerados a partir de 3-HP in vitro. Por exemplo, 3-HP pode ser produzido in vitro conforme descrito acima, ou pro- duzido in vivo e então isolado. O 3-HP resultante pode ser incubado na pre- sença de enzimas apropriadas (vide, figura 1 e a presente descrição). Em um exemplo, todas estas enzimas são incubadas com semialdeído de malo- nila e as reações prosseguem in vitro. Em outro exemplo, 3-HP purificado é tratado com uma substância química para gerar o derivado desejado. Por exemplo, 3-HP pode ser convertido em um éster 3-HP por transesterificação em 1,3-propanodiol por hidrogenação ou desidratado para formar ácido acrí- lico. Produção de semialdeído de malonila e 3-HP e seus derivados in vitro

Peptídeos purificados possuindo a atividade enzimática deseja- da podem ser usados para produzir semialdeído de malonila ou 3-HP (ou derivados dos mesmos tais como, 1,3-propanodiol, ácido acrílico, acrilato polimerizado, ésteres de acrilato, ésteres de 3-HP e 3-HP polimerizado). Por exemplo, uma preparação incluindo um peptídeo substancialmente puro possuindo atividade de BAAT pode ser usada para catalisar a formação de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina.

Adicionalmente, os extratos isentos de célula contendo um pep- tídeo possuindo a atividade enzimática desejada podem ser usados sozi- nhos ou em combinação com peptídeos purificados ou células para produzir 3-HP ou derivados dos mesmos. Por exemplo, um extrato isento de célula que inclui um peptídeo possuindo atividade de BAAT e atividade de 3-HP desidrogenase pode ser usado para formar 3-HP de beta-alanina. Qualquer método pode ser usado para produzir um extrato isento de célula. Por e- xemplo, choque osmótico, sonicação ou um ciclo de liofilização repetido se- guido por filtração ou centrifugação pode ser usado para produzir um extrato isento de célula a partir de células intactas.

Um peptídeo purificado ou extrato isento de célula pode ser usa- do para produzir 3-HP que, por sua vez, é tratado quimicamente para produ- zir outro composto. Por exemplo, um processo químico pode ser usado para modificar 3-HP em um derivado, tal como, 1,3-propanodiol, ácido acrílico, acrilato polimerizado, ésteres de acrilato, ésteres de 3-HP e 3-HP polimeri- zado.

Fermentação de Células para produzir Ácidos Orgânicos

São providos métodos para produção de semialdeído de maloni- la e 3-HP (bem como seus derivados) que incluem métodos in vivo (por e- xemplo, sozinhos ou em combinação com métodos in vitro). Os métodos in vivo podem incluir cultivo da célula (tal como um micro-organismo) possuin- do as atividades de enzima apropriadas no meio de cultivo, tal que, o produ- to desejado é produzido. Em geral, os meios de cultivo ou condições de cul- tura podem ser, tais que, as células crescem a uma densidade adequada e produzem o produto de forma eficiente. Para processos de produção em grande escala, qualquer método pode ser usado, tal como, aqueles descritos no (Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2a edição, Editores: Demain and Davies, ASM Press; e Principies of Fermentation Technology, Stanbury and Whitaker, Pergamon).

Em resumo, um tanque (tal como, um tanque de 3,78 litros, 18,92 litros, 37,85 litros, 189,27 litros, 378,54 litros, 757,08 litros, 1.892 litros ou mais) contendo meio de cultura apropriado, por exemplo, com uma fonte de carbono glicose é inoculado com uma ou mais das células descritas (tais como, micro-organismos). Após a inoculação, as células são incubadas para permitir que a biomassa seja produzida. Uma vez que uma biomassa seja alcançada, o caldo contendo as células pode ser transferido para um segun- do tanque. Este segundo tanque pode ser de qualquer tamanho. Por exem- plo, o segundo tanque pode ser maior, menor ou do mesmo tamanho que o primeiro tanque. Tipicamente, o segundo tanque é maior que o primeiro, tal que, o meio de cultura adicional possa se adicionado ao caldo a partir do primeiro tanque. Além disso, o meio de cultura dentro deste segundo tanque pode ser o mesmo ou diferente do usado no primeiro tanque. Por exemplo, o primeiro tanque pode conter meio com xilose, enquanto o segundo tanque contém meio com glicose.

Uma vez transferidas, as células podem ser incubadas para permitir a produção de beta-alanina, semialdeído de malonila, 3-HP ou deri- vados de 3-HP. Uma vez produzido, qualquer método pode ser empregado para isolar o produto formado. Por exemplo, técnicas de separação comum podem ser usadas para remover a biomassa a partir do caldo e procedimen- tos de isolamento comuns (tais como, extração, destilação e procedimentos de troca de íon) podem ser usados para obter o produto desejado a partir do caldo isento de célula. Alternativamente, o produto pode ser isolado enquan- to ele está sendo produzido, ou pode ser isolado a partir do caldo após a fase de fabricação do produto ter terminado. Em alguns exemplos, as células são isoladas e o produto desejado extraído das células. Enzimas As células descritas podem incluir uma ou mais das seguintes enzimas. Tais enzimas podem ser endógenas, exógenas ou suas combina- ções. O termo "peptídeo possuindo atividade enzimática" refere-se a qual- quer peptídeo que catalisa uma reação química ou outras substâncias sem propriamente serem destruídas ou alteradas quando do término da reação. Tipicamente, um peptídeo possuindo atividade enzimática catalisa a forma- ção de um ou mais produtos a partir de um ou mais substratos. Tais peptí- deos podem ter qualquer tipo de atividade enzimática incluindo, sem limita- ção, a atividade enzimática ou atividades enzimáticas associadas às enzi- mas, tais como, PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato amino- transferase, aspartato descarboxilase, BAAT, 3-HP desidrogenase, lipase, esterase, aldeído desidrogenase e álcool desidrogenase.

Peptídeos possuindo atividade PEP carboxilase, bem como, áci- do nucleico codificando tais peptídeos podem ser isolados a partir de várias espécies incluindo, porém não-limitado aos Streptomyces coelicolor, Ther- mosynechococcus vulcanus e E. coli. A atividade da PEP carboxilase refere- se à capacidade de converter PEP em oxaloacetato. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas da PEP carboxilase são descritos nos Números de acesso ao GenBank AB057454, AF177946, ou X05903 (ácidos nucleicos) e BAB64533, AAD53311, ou CAA29332 (proteínas). Será apreciado que se- qüências publicamente disponíveis podem conter variações á medida que o peptídeo mantém a atividade da PEP carboxilase.

Os peptídeos possuindo atividade de piruvato carboxilase, bem como, ácidos nucleicos codificando tais peptídeos podem ser obtidos a partir de inúmeras espécies incluindo, porém não-limitado ao Rhizobium etli, Cory- nebacterium glutamicum, e BaciHus stearothermophilus além do E. coli. A atividade de piruvato carboxilase refere-se à capacidade de converter piruva- to em oxaloacetato. Por exemplo, ácidos nucleicos de piruvato carboxilase e proteínas são descritos nos números de acesso ao GenBank: U51439, AF038548 ou D83706 (ácidos nucleicos) e AAC44388, AAB92588, ou BA- A12072 (proteínas). Será apreciado que as seqüências publicamente dispo- níveis podem conter variações, à medida que o peptídeo mantenha atividade de piruvato carboxilase.

Os peptídeos possuindo atividade de aspartato aminotransfera- se, bem como ácido nucleico codificando tais peptídeos podem ser obtidos a partir de várias espécies incluindo, porém não-limitados aos Rhizobium meli- loti, Thermus thermophilus e E coli. A atividade da aspartato aminotransfe- rase refere-se à capacidade de converter oxaloacetato em aspartato. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas de aspartato aminotransferase são descritos nos números de acesso ao GenBank: L05064, D38459, ou X03629 (ácidos nucleicos) e AAA26245, BAA07487, ou CAA27279 (proteínas). Será apreciado que as seqüências disponíveis publicamente podem conter varia- ções, à medida que o peptídeo mantém atividade de aspartato aminotransfe- rase.

Peptídeos possuindo atividade de aspartato descarboxilase, bem como ácido nucleico codificando tais peptídeos podem ser obtidos a partir de várias espécies incluindo, porém não-limitado aos Corynebacterium glutami- cum, Mesorhizobium loti, Clostridium acetobutylicum, Streptomyces avermiti- Iis e E. coli. Atividade de aspartato descarboxilase refere-se à capacidade de converter aspartato em beta-alanina. Por exemplo, ácidos nucleicos e prote- ínas de aspartato descarboxilase são descritos nos números de acesso ao GenBank: aF116114, AF311738, L17086 bem como SEQ ID N0S: 38 e 40 (ácidos nucleicos), e números de acesso ao GenBank: aAD28430, A- AG47796, AAA24271, bem como SEQ ID N0S: 39 e 41 (proteínas). Será a- preciado que seqüências publicamente disponíveis podem conter variações, à medida que o peptídeo mantenha atividade de aspartato descarboxilase. Peptídeos possuindo atividade de BAAT, bem como ácido nucle-

ico codificando tais peptídeos podem ser obtidos a partir de várias espécies incluindo, porém não-limitado aos Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e E. coli. A atividade de BAAT refere-se à capacidade de converter beta-alanina no semialdeído de malonila. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas de BAAT são descritos nos números de acesso ao GenBank: a- E004091 ou AE015451 bem como SEQ ID N°s: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 e 18 (ácidos nucleicos), e números de acesso ao GenBank: aAG08698 ou Ρ28269 bem como SEQ ID N°s: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 17 e 19 (proteínas). Será apreciado que seqüências publicamente disponíveis podem conter varia- ções, à medida que o peptídeo mantenha atividade de BAAT.

Peptídeos possuindo atividade de 3-HP desidrogenase, bem como ácido nucleico codificando tais peptídeos podem ser obtidos a partir de várias espécies incluindo, porém não-limitado aos Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e E. coli. A atividade de 3- HP desidrogenase refere-se à capacidade de converter semialdeído de ma- Ionila em 3-HP. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas de 3-HP desidro- genase são descritos nos números de acesso ao GenBank: aF316325, M84911, NC002516, AE015451, bem como SEQ ID N0S: 20, 22, 26, 29 e 30 (ácidos nucleicos), e números de acesso ao GenBank: aAL26884, AA- A25892, NP 252259, AAN70239, bem como SEQ ID N°s: 21, 23, 27 e 31 (proteínas). Será apreciado que seqüências publicamente disponíveis po- dem conter variações, à medida que o peptídeo mantenha atividade de 3-HP desidrogenase. Por exemplo, ácido nucleico que codifica um peptídeo pos- suindo atividade de 3-HP desidrogenase pode ser obtido a partir do gene de 3-hidroxisobutirato desidrogenase (mmsB) de Pseudomonas aeruginosa e pode ter uma seqüência conforme estabelecida no número de acesso ao GenBank M84911 (com uma seqüência de proteína correspondente mostra- da no número de acesso ao GenBank AAA25892.1).

Peptídeos possuindo atividade de lipase, bem como ácido nucle- ico codificando tais peptídeos podem ser obtidos a partir de várias espécies incluindo, sem limitação, Candida rugosa, Candida tropicalis e Candida albi- cans. A atividade de lipase refere-se à capacidade de catalisar a hidrólise ou formação de ligações éster, especificamente entre 3-HP e um álcool. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas da lipase são descritos nos números de acesso ao GenBank: a81171, Z30945, AF188894 (ácidos nucleicos) e Z30945 e AF188894 (proteínas). Será apreciado que seqüências publica- mente disponíveis podem conter variações, à medida que o peptídeo mante- nha atividade de lipase.

Peptídeos possuindo atividade de esterase, bem como ácido nucleico codificando tais peptideos podem ser obtidos a partir de várias es- pécies incluindo, sem limitação, Candida rugosa, Candida tropicalis e Candi- da albicans. A atividade da esterase refere-se à capacidade de catalisar a hidrólise ou formação de ligações de éster, especificamente, para formar uma ligação éster entre duas moléculas de 3-HP ou entre uma molécula de 3-HP e um polímero de 3-HP, ou entre dois polímeros de 3-HP. Por exem- plo, ácidos nucleicos e proteínas de esterase são descritos nos números de acesso ao GenBank: Z30945 e AF188894 (ácidos nucleicos) e CAA83122 e AAF35171 (proteínas). Será apreciado que seqüências publicamente dispo- níveis podem conter variações, à medida que o peptídeo mantenha atividade de esterase.

Peptideos possuindo atividade de aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-), bem como ácido nucleico codificando tais peptideos podem ser ob- tidos a partir de várias espécies incluindo, sem limitação, Pseudomonas pu- tida, E. coli e S. cerevisiae. A atividade de aldeído desidrogenase refere-se à capacidade de reduzir um grupo carboxílico em um grupo aldeído empre- gando NADH ou NADPH como o redutor. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas de aldeído desidrogenase são descritos nos números de acesso ao GenBank: aB100375, L40742, e Z17314 (ácidos nucleicos) e BAD07372, AAC36938 e CAA78962 (proteínas). Será apreciado que seqüências publi- camente disponíveis podem conter variações, à medida que o peptídeo man- tenha atividade de aldeído desidrogenase.

Peptideos possuindo atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) bem como ácido nucleico codificando tais peptideos podem ser obti- dos a partir de várias espécies incluindo, sem limitação, Pseudomonas puti- da, Z. mobilis e S. cerevisiae. A atividade de álcool desidrogenase refere-se à capacidade de reduzir um grupo aldeído em um grupo álcool, empregando NADH ou NADPH como o redutor. Por exemplo, ácidos nucleicos e proteí- nas de álcool desidrogenase são descritos nos números de acesso ao Gen- Bank: aB100375, M32100 e M38457 (ácidos nucleicos) e BAD07371, AA- A27682 e AAA34411 (proteínas). Será apreciado que seqüências publica- mente disponíveis podem conter variações, à medida que o peptídeo mante- nha atividade de álcool desidrogenase.

Embora exemplos específicos de enzimas que podem ser usa- das sejam descritos, um versado na técnica apreciará que a molécula de ácido nucleico codificando um peptídeo possuindo a atividade enzimática desejada pode ser identificada e obtida empregando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico que codificam um peptí- deo possuindo a atividade enzimática desejada pode ser identificadas e ob- tidas empregando procedimentos e técnicas de síntese química de ácido nucleico ou clonagem molecular comuns, incluindo PCR. Além disso, técni- cas de sequenciamento de ácido nucleico-padrão e programas de software que traduzem as seqüências de ácido nucleico em seqüências de aminoáci- dos com base no código genético podem ser usados para determinar se ou não um ácido nucleico específico possui qualquer homologia de seqüência com peptídeos enzimáticos conhecidos. O software de alinhamento de se- quências, tal como, MEGALIGN (DNASTAR, Madison, Wl, 1997) pode ser usado para comparar várias seqüências. Além disso, bases de dados de ácido nucleico e aminoácidos (tais como, GenBank e EMBL) podem ser u- sadas para identificar uma seqüência de ácido nucleico que codifica um pep- tídeo possuindo a atividade enzimática desejada. Em resumo, qualquer se- quência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de homologia em relação a um peptídeo possuindo a atividade enzimática desejada (tal como uma PEP carboxilase), ou qualquer seqüência de ácido nucleico apresen- tando pelo menos 50% de homologia em relação a uma seqüência codifi- cando um peptídeo possuindo a atividade enzimática desejada pode ser u- sada como uma questão para busca no GenBank. Os peptídeos identifica- dos podem então ser analisados para determinar se ou não eles exibem a atividade enzimática desejada.

Técnicas de hibridização de ácido nucleico também podem ser usadas para identificar e obter uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo possuindo a atividade enzimática desejada. Em resumo, a mo- lécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo enzimático conhecido ou fragmento do mesmo pode ser usada como uma sonda para identificar mo- léculas de ácido nucleico similares por hibridização sob condições de estrin- gência moderada a alta. Tais moléculas de ácido nucleico similares podem então ser isoladas, sequenciadas e analisadas para determinar se o peptí- deo codificado possui a atividade enzimática desejada.

Técnicas de clonagem de expressão também podem ser usadas

para identificar e obter uma molécula de ácido nucleico que codifica um pep- tídeo possuindo a atividade enzimática desejada. Por exemplo, um substrato conhecido por interagir com uma enzima específica pode ser usado para classificar uma biblioteca de exibição de fago contendo aquela enzima. Bibli- otecas de exibição de fato podem ser geradas conforme descrito (Burritt e outros, Anal. Biochem. 238:1-13,1990), ou podem ser obtidas a partir de for- necedores comerciais, tais como, Novagen (Madison, Wl).

Técnicas de sequenciamento de peptídeo também podem ser usadas para identificar e obter uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo possuindo a atividade enzimática desejada. Por exemplo, um peptídeo purificado pode ser separado por eletroforese de gel e sua seqüên- cia de aminoácidos determinada, por exemplo, por técnicas de microse- quenciamento de aminoácido. Uma vez determinada, a seqüência de ami- noácido pode ser usada para projetar a degeneração dos iniciadores de oli- gonucleotídeo. A degeneração dos iniciadores de oligonucleotídeo pode ser usada para obter ácido nucleico codificando o polipeptídeo por PCR. Uma vez obtido, o ácido nucleico pode ser sequenciado, clonado em um vetor de expressão apropriado e introduzido em um micro-organismo. Expressão de Proteínas Recombinantes As enzimas descritas neste documento (tal como as enzimas lista-

das na figura 1) podem ser produzidas individualmente ou em combinação em uma célula. Os métodos para produção de proteínas recombinantes são bem-conhecidos na técnica e, portanto, o escopo desta descrição inclui a expressão recombinante de qualquer enzima descrita neste documento. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico recombinantes podem ser usadas para gerar as células e praticar os métodos descritos neste documento. Nos exemplos específicos, as células descritas (ou métodos que utilizam tais cé- lulas) incluem pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógeno.

Com as seqüências enzimáticas de ácido nucleico e aminoácido disponíveis publicamente e descritas, tais como, PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT, 3- HP desidrogenase, lipase, esterase, aldeído desidrogenase e álcool desi- drogenase (bem como variantes, fragmentos e fusões das mesmas que mantêm a atividade desejada da enzima), é permitida a expressão ou purifi- cação de tais enzimas por técnicas laboratoriais-padrão. Um versado na téc- nica entenderá que os peptídeos podem ser produzidos de modo recombi- nante em qualquer célula ou organismo de interesse e purificados antes do uso, por exemplo, antes da produção de 3-HP ou seus derivados.

Os peptídeos que possuem uma atividade enzimática específica podem ser um peptídeo que ocorre ou não naturalmente. Um peptídeo que ocorre naturalmente é qualquer peptídeo que possui uma seqüência de ami-

I

noácido conforme encontrada na natureza incluindo peptídeos do tipo selva- gem e polimórficos. Os peptídeos que ocorrem naturalmente podem ser ob- tidos de quaisquer espécies incluindo, porém não-limitado às leveduras, plantas, fungos e espécies bacterianas. Um peptídeo que não ocorre natu- ralmente é qualquer peptídeo que possui uma seqüência de aminoácido na natureza (tais como, SEQ ID N°s: 5-14, e 16-19). Assim, um peptídeo que não ocorre naturalmente pode ser uma versão mutada de um peptídeo que ocorre naturalmente ou um peptídeo construído geneticamente. Por exem- plo, um peptídeo que não ocorre naturalmente possuindo atividade de BAAT aumentada pode ser uma versão mutada de um peptídeo de BAAT ocorren- do naturalmente. Um peptídeo pode ser mutado, por exemplo, por adições, deleções de seqüência, substituições ou suas combinações empregando métodos conhecidos na técnica.

Células transformadas podem ser usadas para realizar uma ou mais etapas das etapas nas vias descritas neste documento ou as células transformadas podem ser usadas para produzir os peptídeos descritos para uso subsequente in vitro. Por exemplo, um micro-organismo individual pode conter ácido(s) nucleico(s) exógeno(s) codificando cada peptídeo necessário para realizar as etapas descritas na figura 1, tais como as enzimas necessá- rias para produzir beta-alanina, semialdeído de malonila ou 3-HP (ou deriva- dos dos mesmos). Tais células podem conter qualquer número de moléculas de ácido nucleico exógeno. Por exemplo, uma célula específica pode conter pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro moléculas de ácido nucleico exógeno diferentes onde cada uma codifica o(s) peptídeo(s) necessário(s) para converter PEP ou piruvato em beta-alanina (ou um produto subsequente, tal como, semialdeído de malonila ou 3-HP), conforme mostrado na figura 1 ou uma célula específica pode produzir en- dogenamente os peptídeos para conversão de piruvato em beta-alanina, enquanto contendo moléculas de ácido nucleico exógeno que codificam os peptídeos para conversão de beta-alanina em 3-HP.

Moléculas de ácido nucleico codificando as enzimas descritas neste documento podem ser introduzidas em uma célula empregando méto- dos de biologia molecular-padrão. Uma molécula de ácido nucleico simples pode codificar mais de uma enzima ou outra molécula desejada. Por exem- plo, óperons incluindo duas ou mais seqüências de ácido nucleico, tais co- mo, duas, três, quatro, cinco, seis ou mesmo sete seqüências podem ser usadas. Por exemplo, cada seqüência de ácido nucleico pode codificar uma PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT1 3-hidroxipropionato desidrogenase, lipase, esterase, aldeído desidrogenase ou álcool desidrogenase. Em um exemplo específico, a seqüência de ácido nucleico recombinante inclui uma seqüência codifican- do uma ou mais dentre PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato a- minotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT, 3-hidroxipropionato desi- drogenase, lipase, esterase, aldeído desidrogenase e álcool desidrogenase.

Seqüências de ácido nucleico recombinante podem incluir um elemento regulador que promove a expressão de uma seqüência de ácido nucleico codificando a enzima. Tipicamente, elementos reguladores são se- quências de DNA que regulam a expressão de outras seqüências de DNA no nível de transcrição. Assim, os elementos reguladores incluem, sem limi- tação, promotores, melhoradores e similares. Por exemplo, uma ou mais seqüências promotoras podem ser usadas para promover a expressão de uma seqüência de codificação por colocação do promotor a montante da seqüência de DNAc. Em um exemplo, é usado um promotor não-nativo que melhora a expressão da seqüência de codificação em relação ao promotor nativo. Exemplos de promotores incluem, sem limitação, promotores consti- tutivos e promotores sensíveis ou não sensíveis a um estímulo específico (tal como, luz, oxigênio, concentração química). As moléculas de ácido nu- cleico descritas podem ser incorporadas a um vetor, que pode ser usado para transformar uma célula ou ser incorporado ao genoma da célula ou ambos. Por exemplo, um DNAc codificando a enzima desejada é ligado ao vetor de expressão, tal como um vetor de expressão bacteriano. Outros veí- culos de clonagem, tais como outros plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos, vírus de animais e cromossomos artificiais de levedura podem ser usados. Estes vetores podem ser introduzidos em uma variedade de hospedeiros incluindo organismos simples ou complexos, tais como, bactérias, fungos ou plantas, que são tornados transgênicos por introdução do cDNA heterólogo.

Uma molécula de ácido nucleico exógeno simples pode codificar um ou mais de um peptídeo. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico exógeno simples que contém seqüências que codificam dois, três ou mesmo quatro peptídeos diferentes, tais como, pelo menos dois dos que se seguem: PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT, 3-HP desidrogenase, lipase, esterase, aldeído desi- drogenase e álcool desidrogenase. Adicionalmente, as células descritas nes- te documento podem conter uma cópia simples ou múltiplas cópias (tal co- mo, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 35, pelo me- nos 50, pelo menos 75, pelo menos 100 ou pelo menos 150 cópias), de uma molécula de ácido nucleico exógena específica. As células descritas neste documento podem conter mais de um ácido nucleico exógeno específico. Por exemplo, uma célula específica pode conter cerca de 15 cópias de mo- lécula de ácido nucleico exógeno X bem como cerca de 25 cópias de molé- cula de ácido nucleico exógeno Y.

Qualquer método pode ser usado para introduzir uma molécula de ácido nucleico exógeno em uma célula. A transferência de DNA dentro das células eucarióticas é uma técnica convencional. Métodos exemplares não Iimitantes para introdução de uma molécula de ácido nucleico nas célu- las incluem choque térmico, lipofecção, eletroporação, conjugação, fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio ou fosfato de estrôncio, DE- AE dextrano, microinjeção e distribuição biolística (por exemplo, vide Ito e outros J. Bacterol. 153:163-8, 1983; Durrens e outros Curr. Genet. 18:7-12, 1990; Sambrook e outros Molecular Cloning: a Iaboratory manual, Cold S- pring Harbour Laboratory Press, New York, USA, segunda edição, 1989; e Becker and Guarente, Methods in Enzymology 194:182-7, 1991). Em um exemplo, DNAc pode ser introduzido por infecção com vetores de vírus, por exemplo, retrovírus (Bernstein e outros 1985, Geri. Engrg. 7:235) tal como adenovírus (Ahmad e outros 1986, J. Viroi 57:267) ou Herpes (Spaete e ou- tros 1982, Cell 30:295). Uma molécula de ácido nucleico exógeno contida dentro de uma

célula específica da descrição pode ser mantida dentro da célula em qual- quer forma. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico exógeno podem ser integradas no genoma da célula ou mantidas em um estado epissômico. Isto é, uma célula pode ser um transformante estável ou transitório. EXEMPL01

Purificação e clonagem de beta-alanina aminotransferase

Este exemplo descreve métodos empregados para clonar uma beta-alanina aminotransferase de nativo (BAAT) a partir de Streptomyces griseus. Um versado na técnica apreciará que métodos similares podem ser usados para clonar BAAT a partir de qualquer organismo desejado.

Streptomyces griseus (ATCC21897; American Type Culture Col- lection, Manassas, VA) se desenvolveu em meio contendo 1% de glicose, 0,1% de K2HPO4, 0,1% de peptona, 0,05% de extrato de levedura, 0,01% de MgS04-7H20, e 0,2% de beta-alanina. As culturas se desenvolveram em volumes de 1 litro em um fraco de 2,8 litros a 26°C com agitação a 250 rpm. Após crescimento por toda a noite, as células foram colhidas por centrifuga- ção e lavadas com 0,2 volume de 0,85% NaCI, e a microesfera celular (-10 g de células a partir de meio de 2 litros) foi armazenada a -80°C até o uso.

A microesfera celular foi descongelada sobre gelo. A pasta de célula foi transferida para um pilão e moída com -2 de areia do mar. A mis- tura de célula/areia foi ressuspensa em -30 mL de tampão A (fosfato de po- tássio 20 mM, pH 7,2, fosfato piridoxal a 20 μΜ, 0,01% beta- mercaptoetanol), transferida para um tubo de vidro e sonicada para Iisar as células. Os fragmentos celulares e areia foram removidos por centrifugação (30.000 χ g por 30 minutos). O sobrenadante foi aplicado a uma coluna de DEAE sefarose e foi equilibrado com tampão A, a proteína foi eluída com um gradiente de etapas (0%, 30%, 50%, 100%) com tampão B (tampão A + Na- Cl a 1 Μ). A atividade da beta-alanina aminotransferase eluiu a uma etapa de 50%.

As frações com atividade foram coletadas, concentradas e apli- cadas a uma coluna Superdex75 equilibrada com tampão A + NaCI a 150 mM. As frações com atividade beta-alanina aminotransferase foram agrupa- das, dessalgadas empregando uma coluna PD-10 com fosfato de potássio 1 mM, pH 7,2, fosfato piridoxal 20 μΜ, 0,01% beta-mercaptoetanol como o tampão e a fração dessalgada foi aplicada a uma coluna de hidroxiapatita que foi equilibrada com tampão HA (fosfato piridoxal a 20 μΜ, 0,01% beta- mercaptoetanol) e 1% tampão HB (fosfato de potássio a 100 mM, fosfato piridoxal a 20 μΜ, 0,01% beta-mercaptoetanol). A proteína foi eluída com um gradiente escalonado de tampão HB (1%, 10%, 20%, 100%). A atividade da beta-alanina aminotransferase eluiu na etapa a 100%. A proteína foi concen- trada e armazenada a -80°C. A proteína purificada foi operada em um gel de poliacrilamida

SDS e a faixa a -48.000 dáltons excisada e sequenciada. Uma vez que a seqüência de nucleotídeo do genoma de S. griseus não se encontra publi- camente disponível, os fragmentos de peptídeo resultantes foram usados para pesquisar a seqüência de genoma S. avermitilis publicada empregando o software BLAST e para identificar um gene homólogo. Os iniciadores fo- ram projetados para ampliar o quadro aberto de leitura a partir do DNA ge- nômico de S. avermitilis (ATCC#31267D): CGGGATCCCTAAACCGTG- TACTCGTCC (SEQ ID N0: 1) e GGAATTCCATATGACCCCTCAGCCGAATC (SEQ ID N°: 2).

A PCR foi realizada com o sistema PCR GC-Rich (Roche) e o fragmento PCR resultante foi digerido com Nde\ e BamHI e ligado empre- gando o Quick Ligation Kit (Roche) no pET28b que havia sido digerido com NdeI e SamHI para construir pET28b/SaBAAT.

O DNAc de S. avermitilis BAAT nativo e seqüências de proteína são mostrados nas SEQ ID N°s: 3 e 4, respectivamente. EXEMPLO 2

Seleção de BAAT com atividade biológica aumentada

Este exemplo descreve métodos empregados para isolar as pro- teínas de BAAT (e os nucleotídeos que codificam as mesmas) possuindo atividade aumentada na direção da beta-alanina. Métodos similares podem ser usados para identificar outras moléculas de BAAT. Em resumo, o método de seleção envolve crescimento das célu-

las contendo bibliotecas mutagenizadas de BAAT nos meios com beta- alanina como a única fonte de nitrogênio. Sob estas condições, apenas as células que podem converter beta-alanina em um metabolito central podem se desenvolver. Por exemplo, a BAAT pode converter beta-alanina e alfa- cetoglutarato no semialdeído de malonila e glutamato, respectivamente, com o glutamato entrando no metabolismo central e sustentando o desenvolvi- mento da célula.

PCT mutagênica foi conduzida com base no protocolo de Cadwell and Joyce (PCR Methods Appi 2:28-33, 1992). Este método utiliza várias diluições de um tampão mutagênico contendo MgCI2 a 21,2 mM, Mn- Cl2 a 2,0 mM, dTTP a 3,2 mM, e dCTP a 3,2 mM. 6,3 e 9,4% (v/v) de tampão mutagênico foram adicionados para separar as regiões de PCR (cada uma de volume final de 100 μΙ_), além disso para 1X tampão Taq PCR com MgCI2 a 1,5 mM de 0,25 μΜ de iniciadores de vetor a frente e reverso, 200 μΜ de cada dNTP, 5 ng de pET28b/SaBAAT DNA como gabarito, 5% de DMSO, e unidades de Taq DNA polimerase (Roche). O programa da PCR consistiu na desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos; 30 ciclos de 94°C por 30 se- gundos, 54°C por 45 segundos e 72°C por 2,25 minutos; e uma extensão final a 72°C por 7 minutos.

O produto da PCR foi digerido com enzimas de restrição BamH\ e NdeI, ligado dentro do vetor pPRONde digerido de modo similar e trans- formado em células de E. coli Electromax® DH10B® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O plasmídeo pPRONde é um derivado de pPROLar.A122 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) no qual um sítio NdeI foi construído no có- don ATG do iniciador por mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo em- pregando kit de Mutagênese Direcionado ao Sítio QuikChange da Stratage- ne. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de colônias simples escolhidas aleatoriamente e sequenciado para obter uma estimativa da taxa de muta- ção (3 alterações por 1.000 nucleotídeos). Múltiplas transformações foram colocadas em placa para meios LB contendo 25pg/mL de canamicina, de modo a obter aproximadamente 90.000 colônias. As colônias foram raspa- das das placas e o DNA do plasmídeo preparado empregando um procedi- mento de Plasmídeo MiniSpin (Qiagen, Valencia, CA). O DNA de plasmídeo agrupado foi concentrado por precipitação com etanol.

A biblioteca de plasmídeo de BAAT mutagenizada de S. avermi- tilis foi transformada em células eletrocompetentes de uma cepa AgabT de E. coli BW25113 (Datsenko and Wanner, Proc. Nati Acad. Sei. USA 97:6640-5, 2000). A deleção do gene gabT foi usada para prevenir qualquer atividade possível na beta-alanina pela 4-aminobutirato aminotransferase hospedeira codificada por este gene. Os transformantes foram desenvolvi- dos por 1 hora e meia em meios SOC, centrifugados, lavados com 0,85% NaCI, e ressuspensos em 0,75 mL de NaCI para remover traços de fontes de nitrogênio. 200 pL foram usados para inocular 25 mL de meio mínimo M9 sem NH4CI, suplementado com 0,5% de glicerol, piridoxina-HCI a 50 μΜ, IPTG a 100 μΜ, MOPS pH 7,0 a 100 mM, 40 pg/mL de canamicina e beta- alanina a 5 mM. Após 5 dias de crescimento aeróbico, 1 mL da cultura foi usado para inocular 25 mL de meios frescos. Após 6 dias de desenvolvimen- to, 12.000 colônias foram colocadas em placa em meios ricos e DNA do plasmídeo foi isolado a partir das colônias combinadas. Aproximadamente 700 ng de DNA foram transformados em célu- las não desafiadas de E. coli nçjdbT. Os transformantes foram recuperados em uma hora em meios SOC1 centrifugados, lavados com 0,85% de NaCI e usados para inocular 25 mL dos meios acima. Após 3 dias, a cultura foi sub- cultivada em meios frescos. Dois dias mais tarde, a colocação em placa foi realizada para obter 20.000 colônias nos meios LB contendo 25pg/mL de canamicina. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir destas colônias combi- nadas e precipitado com acetato de amônio e etanol. Esta biblioteca foi usa- da para classificação no Exemplo 3. A subcultura foi também diluída e colo- cada em placas em meios mínimos com beta-alanina a 5 mM para obter co- lônias individuais. As maiores colônias individuais foram manchadas em re- lação aos meios frescos e aquelas mostrando o melhor crescimento foram manchadas em relação meios mínimos com beta-alanina a 5 mM, 50 μg/ mL de paranitrosanilina solúvel em água e 250 μg/mL de NaHSO4. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de três colônias que

mostraram bom desenvolvimento de cor nos meios de corante e foi trans- formado em células competentes não desafiadas da cepa AgabT de E.coli. As colônias retransformadas foram testadas em um teste de crescimento de líquido nos meios mínimos M9 fornecidos acima suplementados tanto com beta-alanina a 5 mM e quanto com glutamato a 5 mM. Colônias aperfeiçoa- das isoladas por este método de seleção foram sequenciadas e múltiplos clones mostraram realizar uma mutação resultando na alteração da serina na posição 24 para treonina (S24T). Esta variante é referida como BAAT1 (SEQ ID N°s: 5 e 6). Um conjunto de outros clones aperfeiçoados, embora com menos atividade que os mutantes S24T, realizaram as mutações T83A, S314T, e E348G (BAAHb; SEQ ID N°s: 7 e 8). Ensaios Purpald

Clones foram também testados diretamente quanto à produção de semialdeído de malonila empregando o corante de aprisionamento de aldeído Purpald® (Aldrich). A mistura de reação incluiu tampão borato de Na a 50 mM, pH 8,0, 0,035% de beta-mercaptoetanol, alfa-cetoglutarato a 10 mM, fosfato de piridoxal a 0,5 mM, 50 mM de beta-alanina e 50-500 μ9 de extrato de célula ou aproximadamente 20 μ9 de proteína purificada. Alterna- tivamente, um tampão de fosfato de K a 100 mM, pH 8, pode ser usado no lugar do tampão de borato e beta-mercaptoetanol.

A reação foi incubada a 37°C por 30 minutos e então parada por adição de um volume igual de 10 mg/mL Purpald® em NaOH a 1N. Uma vez que uma cor púrpura começou a se desenvolver, a absorvência das reações foi lida espectrofotometricamente a 535 nm. Segunda rodada da mutagênese

Uma biblioteca mutagênica foi fabricada empregando dois mu- tantes diferentes da primeira rodada (SEQ ID N°s: 5 e 7) e beta-alanina ami- notransferase de S. avermitilis do tipo selvagem (SEQ ID N0: 4) como gabari- to. A biblioteca foi construída conforme descrito acima com a exceção de que 3,9% e 5,5% de tampão mutagênico e gabaritos foram clonados no ve- tor pPRONde. O programa PCR incluiu uma desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos; 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 45 segundos e 72°C por 2 minutos; e uma extensão final a 72°C por 5 minutos. O produto da PCR foi purificado com gel e clonado conforme descrito acima com a adição de uma etapa de digestão de Dpn\ para eliminar qualquer gabarito residual.

A ligação utilizou quantidades iguais de DNA a partir dos três gabaritos. Transformações múltiplas da ligação foram realizadas na cepa BW25113 AgabT. As transformações foram recuperadas em meios SOC por 2 horas, agrupadas, lavadas, e ressuspensas em 1 mL de 0,85% NaCI. 300 μΙ_ da ressuspensão foram usados para inocular frascos contendo 25 mL de meios de seleção, conforme descrito acima, contendo tanto beta-alanina a 1 mM, 5 mM, ou 20 mM. Após as culturas terem se desenvolvido a 37°C para ODeoo 0,5-1,8, aproximadamente 6.000 colônias de cada cultura foram colo- cadas em placas em 2 placas de LB contendo 25 μg/mL de canamicina. As colônias foram raspadas das placas e o DNA do plasmídeo preparado em- pregando um procedimento de Plasmídeo MiniSpin, separadamente para cada concentração de beta-alanina. O DNA do plasmídeo foi precipitado pa- ra obter concentrações de 350-372 ng^L. Dois pL de cada subbiblioteca foram retransformados na cepa BW25113zlgab7"de modo a reduzir a contri- buição das mutações de hospedeiro para cultivo na beta-alanina.

As transformações foram recuperadas por uma hora em meios SOC1 lavadas e ressuspensas em 0,85% de NaCI. A ressuspensão foi usada para inocular meios de seleção líquidos com beta-alanina a 1 mM, 5 mM ou 20 mM e também para colocar em placa as colônias distribuídas sobre as placas dos mesmos meios de seleção. Várias colônias que se desenvolve- ram bem na distribuição de placas foram raiadas para purificação e adicio- nalmente testadas nos testes de crescimento em líquido. Estes testes de crescimento em líquido utilizaram 3 mL de meios de seleção em tubos de cultura de vidro. Quantidades aproximadamente iguais de inócuo foram usa- das para inocular as culturas e o DNA do plasmídeo foi isolado das culturas promissoras e retransformado em BW25113zlgaô7~ não-desafiada e os re- transformantes foram retestados em um teste de crescimento em líquido. Retransformantes que pareciam promissores foram desenvolvidos nos mei- os ricos e incubados com IPTG a 1 mM a 30°C por 4 horas. O extrato de célula foi obtido empregando reagente de extração BugBuster (Novagen, Madison, Wl) e ensaiados empregando o regente Purpald® descrito anteri- ormente.

O mutante de melhor desempenho, isolado da seleção de beta- alanina a 5 mM, realizou uma mutação de F113L além da mutação de S24T da primeira rodada e mutação e seleção; esta variante é referida como BA- AT2 (SEQ ID N0: 9 e 10) e foi clonada no pET28b para permitir purificação e análise de cinética da proteína purificada. Terceira rodada de mutaqênese BAAT2 (SEQ ID N0: 9) foi empregado como gabarito para a ter-

ceira rodada de mutagênese. A mutagênese foi conduzida conforme descrito acima, empregando 3,9 e 5,5% de tampão mutagênico. O produto de PCR mutado foi clonado no vetor pPRONde, e a reação de ligação foi transforma- da na cepa BW25113/lgabTe submetida ao crescimento nos meios de sele- ção contendo beta-alanina a 2 e 5 mM. Foram obtidas subculturas nos meios de seleção frescos a cada dois dias. As terceiras subculturas foram coloca- das em placas nos meios de seleção para obter aproximadamente 250 colô- nias por placa. As maiores colônias foram manchadas em relação às placas de seleção frescas e as colônias com crescimento mais rápido foram testa- das nos testes de crescimento em líquido empregando meios de seleção. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir dos clones de crescimento mais rápido e retransformado no hospedeiro de seleção. Os clones retransformados fo- ram testados novamente no teste de crescimento em líquido e usando o en- saio Purpald® conforme descrito acima.

A melhor variante (BAAT3, SEQ ID N°s: 11 e 12) derivada da terceira rodada de mutagênese continha uma mutação A133T adicional, a partir da seleção de beta-alanina a 5 mM. Este mutante foi clonado em pET28b para permitir a purificação da proteína e análises cinéticas da prote- ína purificada.

Mutagênese direcionada da mutação de P3H em mutantes BAAT2 e BAAT3 É descrita no Exemplo 3 uma classificação de alto rendimento para beta-alanina aminotransferases aperfeiçoadas, com base na atividade aumentada com o reagente Purpald®. Esta classificação resultou no isola- mento de uma variante com a alteração adicional de P3H (SEQ ID N°s: 13 e 14, seqüência de ácido nucleico e proteína, respectivamente) e esta muta- ção foi transferida para as variantes de BAAT2 (SEQ ID N0: 9) e BAAT3 (SEQ ID N0: 11) empregando o Kit de Mutagênese direcionada a múltiplos sítios Quikchange® (Stratagene). O iniciador usado para mutagênese possu- ía a seqüência: 5'Phos-AAGGTACATATGACCCATCAGCCGAATCCC-3' (SEQ ID N0: 15).

A reação tratada com Dpnl foi transformada diretamente na cepa BW251 '\3AgabT. As colônias contendo a mutação desejada foram identifica- das quanto a PCR e confirmadas por sequenciamento. Os ensaios com o reagente Purpald nos extratos a partir de células induzidas confirmaram um aumento de aproximadamente duas vezes e meia na produção do aldeído atribuída à mutação de P3H com substrato a 50 mM. A variante portando as mutações da terceira rodada de mutagênese e seleção e a alteração de P3H é referida como BAAT3ML (SEQ ID N°s: 16 e 17). Quinta rodada de mutagênese BAAT3ML (SEQ ID N0: 16) foi empregado como gabarito para uma quinta rodada de mutagênese. A mutagênese foi conduzida conforme descrito acima, empregando 3,9 e 5,5% de tampão mutagênico. O produto da PCR mutado foi clonado no vetor pCEK/Pgaam8-1/PpmmsB/Spaat, onde Pgaam8-1 é o gene codificando uma alanina 2,3-aminomutase, PpmmsB é o gene codificando metil-semialdeído de maloníla desidrogenase de Pseudo- momas putida (vide Exemplo 5) e Spaat é o gene codificando a glutamato- piruvato aminotransferase de Schizosaccharomyces pombe. A reação de ligação limpa foi transformada nas células Electromax® DH10B® de E. coli e uma biblioteca foi obtida para preparação do DNA do plasmídeo a partir de um grupo de aproximadamente 78.000 colônias. 2,3 pg da biblioteca foram transformados na cepa BW25113Qgaò7ou na cepa BW25113 com um pro- motor integrado na frente do gene ydfG (BW25113 gabT/Píac.araydfG). Esta última cepa foi empregada de reduzir possíveis efeitos tóxicos da produção de semialdeído de malonila, uma vez que o produto do gene ydfG pode re- duzir semialdeído de malonila em ácido 3-hidróxi propiônico (Exemplo 5).

Após a recuperação, as transformações foram submetidas ao crescimento nos meios de seleção (meio mínimo M9 sem NH4CI, suplemen- tado com beta-alanina a 1mM, 1% de glicose, piridoxina-HCI a 50 μΜ, IPTG a 500 μΜ, MOPS a 100 mM, pH 7,0, 40 μg/mL de canamicina). Após 2-3 subcultivos nos meios de seleção frescos, as colônias foram colocadas em placas nos meios de seleção, de modo a obter aproximadamente 400 colô- nias por placa. As colônias maiores foram manchadas em relação às placas de seleção frescas e as colônias de crescimento mais rápido foram testadas nos testes de crescimento em líquido empregando meios de seleção.

O DNA do plasmídeo foi isolado a partir dos clones de cresci- mento mais rápido e retransformado no BW25113zlgaib77 Piac-araydfG do hospedeiro. Os clones retransformados foram testados novamente em um teste de crescimento em líquido e o plasmídeo isolado dos retranformantes para confirmar estabilidade do plasmídeo. O melhor mutante foi clonado em pET28B para permitir purificação da proteína e análise cinética da proteína purificada. A melhor variante derivada da quinta rodada de mutagênese foi denominada BAAT5-9 (SEQ ID N0S: 18 e 19, seqüências de ácido nucleico e proteína, respectivamente) e continha a mutação de codificação adicional D110N e as mutações silenciosas c207t, c381g e t471c.

As figuras 2A-B mostram um alinhamento aperfeiçoado das se-

qüências de aminoácidos da beta-alanina aminotransferases (SEQ ID N°s: 6, 10, 12, 14, 17 e 19) em comparação a seqüência nativa (SEQ ID N0: 4). EXEMPLO 3

Classificação das beta-alanina aminotransferases aperfeiçoadas

Este exemplo descreve uma avaliação de alto rendimento em-

pregada para identificar alterações de aminoácido que podem aumentar a atividade biológica de BAAT.

Colônias simples, cada uma portando um clone da biblioteca mutagenizada por PCR da primeira rodada do Exemplo 2 foram desenvolvi- das em cavidades simples das placas de microtitulação de 384 cavidades com um fundo transparente para permitir leitura densitométrica. O meio era LB contendo canamicina (50 Mg/mL) e IPTG (1 mM). As placas com as colô- nias inoculadas foram recobertas com uma tampa e colocadas em um dis- positivo de rotação por 24 horas em um incubador a 37°C. Um sistema de manuseio robótico (Beckman-Coulter Biomeck com um braço ORCA ope- rando com software desenvolvido internamente e equipado com um espec- trofotômetro com interface) foi empregado para identificar colônias com um ODeoo acima de um limite fixado e 45 μί destas culturas foram então transfe- ridos para as placas de 96 cavidades. Cinco μΐ de solução Popculture® (Novagen) (100 μΐ de Popcul-

ture®, 10 μΐ de rLyso (diluição 1/750) e 2 μΐ de benzonase) foram adiciona- dos a cada cavidade e misturados duas vezes. Após um período de incuba- ção de 30 minutos, 100 μΐ de uma mistura de substrato (fosfato de piridoxal a 0,13 mM, fosfato K a 66,5 mM, alfa-cetoglutarato a 13,3 mM, beta-alanina a 26,6 mM) foram adicionados. As placas foram então removidas do carros- sel do robô, vedadas com uma película autoadesiva de alumínio e mistura- das a 200 rpm a 37°C. Após duas horas, a vedação de alumínio foi removida, as placas foram colocadas de volta no carrossel do robô e 140 μί de uma solução de Purpald® (AIdrich) (10 mg de Purpald® em 1 mL NaOH a 2M) foram adicio- nados para detectar o aldeído. As placas foram incubadas por 45 minutos a temperatura ambiente para desenvolver a cor. Possíveis bolhas, criadas du- rante a incubação com Purpald foram removidas por adição de 10 μΙ de 95% EtOH. Leituras de teste colorimétrico robotizado foram realizadas a 540 nm.

Clones identificados como produzindo quantidades aumentadas de aldeído foram recuperados, seus plasmídeos purificados e os genes de beta-alanina aminotransferase sequenciados. Estes clones portavam uma mutação resultando na alteração adicional de uma prolina na posição 3 em histidina (P3H) (SEQ ID N0S: 13 e 14, seqüências de ácido nucleico e prote- ína, respectivamente). EXEMPLO 4

Ensaio de atividade de beta-alanina aminotransferase

Este exemplo descreve um método in vitro que foi empregado para medir a atividade biológica de BAAT. Tal ensaio pode ser usado para determinar se variantes, fusões ou fragmentos específicos de BAAT mantêm a atividade biológica de BAAT desejada.

Beta-alanina aminotransferases (SEQ ID N°s: 3, 5, 9, 11, 16 e 18) clonadas em pET28b foram purificadas empregando cromatografia por afinidade de metal, conforme descrito pelo fabricante (Novagen). A atividade enzimática das enzimas purificadas foi medida por seguir-se a produção de L-glutamato de beta-alanina e alfa-cetoglutarato. As misturas de reação con- tinham HEPPS a 50 mM, pH 8,0, alfa-cetoglutarato a 10 mM, 5-fosfato de piridoxal a 0,2 mM e quantidades variadas de beta-alanina e enzima. As in- cubações foram realizadas a 25°C e alíquotas de 0,05 mL foram removidas em intervalos de 30 segundos e adicionadas a 0,15 mL do tampão de satu- ração de reação (50% ácido fórmico/HEPPS a 50 mM, pH 8). L-glutamato foi determinado por cromatografia de troca de íon em alta pressão em uma co- luna AMINOSep-511 (Transgenomic) desenvolvida empregando fases mó- veis de tampões de pH 3,28 e pH 7,48, da Pickering, seguido por derivatiza- ção de pós coluna com O-ftalaldeído e detecção fluormétrica. As atividades específicas das BAATs aperfeiçoadas e suas Kms para beta- alanina são mostradas na tabela 1. Tabela 1: propriedades das beta-alanina aminotransferases aperfeiçoadas

Enzima (mutações) Atividade específica Kmb (Ua/mg) (mM) BAAT Tipo selvagem 0,3 2,5 BAAT1 (S24T) 1,6 7,3 BAAT2 (S24T, F113L) ndc nd BAAT3 (S24T, F113L, A133T) 1,2 14,7 BAAT3ML (P3H, S24T, F113L, A133T) 2,5 21 BAAT5-9 (P3H, S24T, D110N, F113L, A133T) 3,3 25

a 1 U = 1 μηποΙ/min b para beta-alanina c não determinada EXEMPLO 5 Clonagem das 3-HP desidrogenases

Este exemplo descreve métodos de clonagem de 3-HP desidro- genases quem pode ser usados para converter semialdeído de malonila em 3-HP, por exemplo, em uma célula.

Um gene (SEQ ID N°: 20) codificando uma proteína possuindo atividade de 3-HP desidrogenase (PammsB) foi isolado a partir de Pseudo- monas aeruginosa conforme descrito em Gokarn e outros US 2004/0076982. A enzima purificada (SEQ ID N0: 21) apresentava uma atividade específica de 70 U/mg e uma Km para semialdeído de malonila de 4,5 mM; NADH sen- do o redutor preferido. Outro gene (SEQ ID N0: 22) codificando uma proteína possuindo

atividade de 3-HP desidrogenase (SEQ ID N0: 23) foi isolado a partir de Al- caligenes faecalis M3A conforme descrito em Liao e outros PCT WO 03/062173 A2.

Ainda outro gene codificando uma proteína possuindo atividade de 3-HP desidrogenase foi clonado por ampliação do gene mmsB a partir do DNA genômico (ATCC 47054D) da cepa P. putida KT2440. Os iniciadores de ampliação permitiram clonagem de (PpmmsB), e forneceram um sítio de ligação ribossômico introduzido dentro dos sítios Not\ e Xbal de um vetor pPRONde contendo a BAAT3ML beta-alanina aminotransferase.

5'-TACTGCGGCCGCAAGAAGGAGATATAGATATGCGTATTG CATTCATTGGC-3' (SEQ ID N0: 24) e 5'-CCTAGTCTAGATCAATCCTTCT TGCGATACCCCT-3' (SEQ ID N0: 25)

SEQ ID N°s: 26 e 27 são as seqüências de nucleotídeo e proteí- na, respectivamente do gene da P. putida 3-HP desidrogenase gene. Esta enzima mostrou produção maior em comparação a P. aeruginosa 3-HP de- sidrogenase (SEQ ID N0: 21) e permitiu mais crescimento na beta-alanina como uma fonte de nitrogênio única em um hospedeiro de E. coli BW25113 AydfG portando BAAT3ML.

De modo a melhorar a produção de proteína, uma biblioteca contendo várias combinações de códons 2-7, conforme projetada pelo pro- grama Proteoexpert foi construída em um vetor pET28b/BAAT5-9. Foi útili- zado um iniciador que continha nucleotídeos degenerados incorporando alte- rações sugeridas pelo software Protoexpert (48 combinações).

5'-GGAGGTATTTATATGCGTATYGCWTTYATYGGHCTGGGC AACATGGGCGCGCC-3' (SEQ ID N0: 28):

O iniciador também incluiu 20 bases de seqüência em cada ex- tremidade da região de degeneração. Os fragmentos de gene imediatamente a montante e a jusante, porém não contendo a região de degeneração foram ampliados separadamente. O gabarito usado para fabricar estes fragmentos continha o gene BAAT5-9, com o gene PpmmsB clonado a jusante do mes- mo dentro dos sítios de restrição BamHl e NheI. O fragmento a montante incluiu uma porção do gene de BAAT5-9 e terminou com os 20 nucleotídeos a montante da região de degeneração. O fragmento a jusante começou com as 20 bases a montante da região de degeneração e continha a extremidade 3' de PpmmsB. O iniciador degenerado foi então usado para ligar em ponte estes dois fragmentos em uma segunda ampliação de DNA empregando os iniciadores homólogos às extremidades de fragmento 5' e 3'. O gene PpmmsB contendo uma biblioteca de códons de degeneração para resíduos de aminoácido 3-7, foi cortado a partir do produto da segunda rodada com BamHI e NheI e clonado nos sítios BamHI e Λ/oíl no vetor pET28B/BAAT5-9.

Após transformação na cepa BW25113 ApanD (DE3), colônias aleatórias foram transferidas para LB com IPTG a 100 μΜ para indução. As colônias que cresceram bem foram transferidas para meios de seleção con- tendo 5 mM beta-alanina e para meios de seleção contendo ambos beta- alanina e um corante de aprisionamento de aldeído (cloreto de pararosanili- na, Sigma P-3750). Os meios de seleção continham sais M9 sem NH4CI1 MOPS a 100 mM, pH 8,0, piridoxina-HCI a 100 μΜ, 1% de glicose, beta- alanina a 5 mM, 40 μg/mL de canamicina, IPTG a 500 μΜ e elementos de traço. Muitas colônias cresceram melhor que a média nos meios de seleção. Destas, a colônia número 31 apresentou cor mais escura que o restante. Duas colônias, incluindo a colônia 31, apresentaram cor mais clara nos mei- os de corante, conforme esperado se o semialdeído de malonila fosse rapi- damente convertido em 3-HP. Vários clones foram testados em uma biotransformação de beta-

alanina em 3-HP. Os clones se desenvolveram a 37°C por toda a noite em meios LB contendo 25 μg/mL de canamicina e subcultivados 1:24 em 12 mL de meios 2YT contendo 25 μ9/ιτιί de canamicina e pantotenato a 10 μΜ. As culturas se desenvolveram a 37°C e foram induzidas em OD de 0,4-0,6 com IPTG a 100 μΜ por 5 horas a 34°C. Um volume de cultura possuindo uma OD total de 7.200 foi rotacionado e ressuspenso em 1,7 mL dos meios de biotransformação. 1,5 mL da ressuspensão foram transferidos para um tubo HPLC de vidro de 2 mL e colocados a 34°C com agitação a 225 rpm. Os meios de biotransformação continham sais de M9 sem NH4CI, MOPS a 100 mM, pH 8,0, piridoxina-HCI a 100 μΜ, 1% de glicose, beta-alanina a 5 mM e pantotenato Ca2+ a 20 μΜ. As amostras coletadas após 17 horas foram aci- dificadas por adição de volume de 5% de ácido fórmico a 90% e foram tes- tadas quanto à concentração de 3-HP por LC/EM. A colônia 31 forneceu a maior porcentagem de conversão de beta-alanina em 3-HP (35 mg/L 3HP versus 2 mg/L para o controle de PpmmsB do tipo selvagem) e também mostrou a maior expressão da proteína PpmmsB quando avaliada por den- sidade de faixa em um gel de poliacrilamida SDS. SEQ ID N0: 29 é uma seqüência de nucleotídeo de PpmmsB31; a seqüência de proteína é idêntica a SEQ ID N0: 27. A seqüência de BAAT5- 9/PpmmsB31 foi incorporada em vários óperons diferentes para a produção de 3-HP empregando clonagem-padrão, ampliação de DNA ou técnicas de mutagênese direcionada.

Em outro exemplo, foi empregada uma classificação da bibliote- ca genômica para identificar proteínas que melhoram a expressão de BAAT por remoção do semialdeído de malonila potencialmente perigoso. Isto foi obtido por clonagem da biblioteca genônica dentro de um vetor contendo uma BAAT ativa e seleção dos meios mínimos contendo beta-alanina como a única fonte de nitrogênio. As células com inserções codificando as proteí- nas que melhoram a atividade de BAAT poderão crescer mais eficazmente e assim serão de tamanho maior quando crescerem em meios seletivos. A atividade da BAAT seria melhorada, por exemplo, por absorção aumentada da beta-alanina, diminuição da secreção da beta-alanina, utilização melho- rada do cofator ou processamento aumentado do semialdeído de malonila.

O DNA genômico de E. coli AgabTfoi digerido com endonuclea- se Sau3A\ de restrição e os fragmentos de 1 a 3 Kb de tamanho foram puri- ficados com gel empregando um kit da Qiagen (Valencia, CA). O DNA purifi- cado foi ligado ao vetor de pPRONde contendo uma beta-alanina amino- transferase aperfeiçoada (BAAT2, SEQ ID N0: 9) e transformado em células de E. coli AgabT. A reação de transformação foi recuperada por uma hora em 1 ml_ de meios SOC, centrifugada, lavada com 0,85% de NaCI, e res- suspensa em 1 mL de 0,85% de NaCI. Vinte μΙ_ da ressuspensão foram co- locados em placa nos meios LB contendo 25 pg/mL de canamicina para ob- ter uma contagem de colônia. A reação de transformação restante foi colo- cada em placa em meios mínimos M9 para obter aproximadamente 600 co- lônias por placa. Estes meios M9 se baseiam nos meios M9 padrão, exceto que NH4CI é omitido e suplementado com 0,5% de glicerol, piridoxina-HCL a 50 μΜ, IPTG a 100 μΜ, MOPS a 100 mM, pH 7,0, 40 pg/mL de canamicina e 2 mM de beta-alanina.

Após dois dias de desenvolvimento, 8 grandes colônias (de um total de ~7.000) foram vistas, as quais eram várias vezes maiores que as outras colônias na placa. Estas colônias eram colônias purificadas, seus plasmídeos foram isolados e os fragmentos de inserção comparados por digestão da enzima de restrição. Das oito colônias, 6 portavam inserções de tamanho único. Os fragmentos de DNA da inserção destes clones foram se- quenciados e os resultados da seqüência foram comparados contra a base de dados do genoma de E.coli empregando o software BLAST. Todas as seis colônias eram homólogas à mesma região do genoma de E.coli. Um dos genes contido dentro de todas as inserções era o gene ydfG (SEQ ID N°s: 30 e 31), que é indicado como uma desidrogenase em potencial. Con- sequentemente, o efeito de melhora do crescimento da expressão aumenta- da deste gene devido a sua presença em plasmídeos de múltiplas cópias pode se dever a sua capacidade de converter semialdeído de malonila em 3- HP, e assim, tanto aliviar a toxicidade em potencial do semialdeído de malo- nila quanto aumentar a taxa de incorporação de nitrogênio de beta-alanina ao L-glutamato, por remoção de um dos produtos da reação catalisada pela beta-alanina aminotransferase aperfeiçoada.

Com base nestes resultados, a proteína codificada por ydfG po- de ser usada em combinação com BAAT para melhorar a produção de 3-HP. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico expressando ydfG pode ser ex- pressa em uma célula juntamente com BAAT para melhorar a produção de 3-HP pela célula.

O gene ydfG foi clonado no vetor pET28b (Novagen, Madison, Wl) para permitir purificação e estudos cinéticos na proteína purificada. Os iniciadores usados para esta clonagem tinham sítios de restrição adiciona- dos para permitir a clonagem nos sítios NdeI e BamH\. GGTAGACATAT- GATCGTTTTAGTAACTGGAGCAAC (SEQ ID N0: 32) e GTTCTCG- GATCCTTACTGACGGTGGACATTCAGTC (SEQ ID N0: 33). A ampliação do fragmento foi realizada empregando Pfu DNA polimerase para minimizar os erros da ampliação e usada uma temperatura de recombinação de 58°C. Uma faixa do produto da PCR de aproximadamente 750 pares de base foi purificada com gel, digerida com NdeI e BamH\ e ligada empregando um método NEB Quick Ligation (New England BioLabs1 Waverly MA), ao vetor pET28B que havia sido digerido com as mesmas enzimas. A reação de liga- ção foi transformada nas células E. coli Electromax® DH10B® e colocada em placa no meio LB contendo 25 μg/mL de canamicina. O DNA do plasmídeo de uma colônia mostrando o tamanho de inserção correto foi sequenciado e mostrou ser idêntico a seqüência de ydfG do E.coli MG1655. A enzima puri- ficada apresentava uma atividade específica de 48,5 U/mg, e uma Km a 3,7 mM para semialdeído de malonila; NADPH sendo o único cofator usado por esta enzima e nenhuma atividade foi obtida com NADH.

Exemplos onde a preferência do cofactor de uma desidrogenase foi expandida ou alterada são mostrados na técnica e estas abordagens po- dem ser aplicadas ao desenvolvimento de uma proteína de ydfG variante que utiliza NADH. A seleção para crescimento em meios mínimos com beta- alanina como a única fonte de nitrogênio, na presença de um BAAT e um gene ydfG mutagenizado em um hospedeiro, cuja função de ydfG intrínseca é deletada (tal como uma cepa de AydfG E. coli) é uma abordagem para a identificação de uma desidrogenase utilizando NADH. EXEMPLO 6

Óperons sintéticos contendo BAAT e 3-HP Desidrogenase

Este exemplo descreve óperons que incluem uma BAAT e uma 3-HP desidrogenase. Tais óperons podem ser transformados dentro de uma célula para permitir produção de 3-HP ou derivados da mesma em uma célu- la, por exemplo, por integração do óperon no cromossoma da célula. Embo- ra BAAT e 3-HP desidrogenases específicas sejam descritas, um versado na técnica apreciará que métodos similares podem ser usados com outras BA- ATs (tal como SEQ ID N0: 5, 7, 9, 13, 16 ou 19) e 3-HP desidrogenases (tal como SEQ ID N0: 20, 22, ou 30).

A integração de óperons sintéticos que incluem uma BAAT (SEQ ID N0: 11) e uma 3-HP desidrogenase (SEQ ID N0: 27) foi realizada empre- gando um sistema à base de Tn5 conforme descrito em Purvis e outros (Ap- pl. Environ. Microbiol. 71:3761-9, 2005). O plasmídeo pCEK-BAAT3ML- PpmmsB foi digerido com endonucleases de restrição Xho\ e AvaíI e o frag- mento de DNA portanto o promotor Piac/ara e genes BAAT3ML-PpmmsB foi ligado ao plasmídeo pLOI3472 digerido com Xho\ e SpeI. A construção re- sultante, pLOI-Bm3, foi então digerida com Pacl e o fragmento portando o promotor Piac/ara, genes BAAT3ML-PpmmsB e marcador de resistência de canamicina flanqueado pelos sítios FRT foi ligado ao pLOI3469 digerido com a mesma endonuclease, tal que, todo o fragmento de pLOI-Bm3 é flanquea- do pelos sítios de reconhecimento da extremidade externa (OE) e extremi- dade interna (IE) para a Tn5 transposase presente em pLOI3469. A mistura de ligação foi transformada em E. coli cepa BW25141 (Datsenko and Wan- ner, Proc. Nati Acad. Sei. USA 97:6640-5, 2000; BW25141 sendo uma cepa pir+ que sustenta replicação dos plasmídeos com uma origem de replicação derivada de R6K tal como pl_OI3469). O plasmídeo resultante, plnt-Bm3, pode ser introduzido na cepa-alvo não -p/r+ para transformação ou conjuga- ção e ação da transposase faz com que o fragmento de pLOI-Bm3 seja inse- rido em sítios aleatórios no cromossoma da cepa alvo, considerando-se que pLOI-Bm3 propriamente é incapaz de replicar neste hospedeiro.

Em um exemplo, plNT-Bm3 foi transformado no E. coli 11303 AIdhA Apan(C-D) Klfld (onde o marcador genético Klfld indica a inserção de um promotor sintético Piac/ara na frente do gene fldA). A seleção de transfor- mantes com resistência à canamicina, porém a sensibilidade à ampicilina (indicando perda do plasmídeo pl_OI-Bm3) resultou na cepas onde a cons- trução BAAT3ML-PpmmsB foi integrada ao cromossoma; cepas portando os genes integrados são indicadas como INT(BAAT3ML/PpmmsB). A presença destes genes foi demonstrada por crescimento na beta-alanina como a única fonte de nitrogênio, como no Exemplo 2, por produção de 3-HP quando beta- alanina está presente, por observação da presença das faixas de proteína BAAT3ML e PpmmsB na eletroforese de gel poliacrilamida SDS ou por en- saio enzimático dos extratos.

Uma construção similar portando as variantes aperfeiçoadas BAAT5-9 (SEQ ID N0: 18) e PpmmsB31 (SEQ ID N0: 29) foi também gerada e integrada conforme descrito.

Os genes de BAAT-mmsB foram introduzidos em outras cepas de E.coli por transdução com base em P1, empregando o marcador de resis- tência à canamicina para monitorar a incorporação dos genes no cromosso- ma receptor. EXEMPLO 7

Clonagem dos genes da aspartato descarboxilase

Este exemplo descreve métodos empregados para clonar aspar- tato descarboxilase a partir de Clostridium acetobutylicum e Streptomyces avermitilis. Aspartato descarboxilases podem ser usadas de converter aspar- tato em beta-alanina (vide figura 1), por exemplo, em uma célula na qual uma aspartato descarboxilase exógena é expressa. Um versado na técnica apreciará que métodos similares podem ser usados para clonar aspartato descarboxilase a partir de outras espécies desejadas, tais como, as espécies de célula nas quais é desejada a produção de 3-HP.

Genes codificando aspartato descarboxilase (codificada pelo ge- ne panD) foram clonados de C. acetobutylicum e S. avermitilis como se se- gue. Células de C. acetobutylicum (ATCC 824) foram desenvolvidas anaero- bicamente em 5 mL de meio Clostrídio Reforçado (Oxoid CM149) e o DNA genômico isolado empregado o kit de isolamento de DNA genômico "Pure- gene" (Gentra Systems; Minneapolis, MN). O DNA genômico de S. avermiti- lis foi obtido do ATCC (ATCC 31267D). Ambos DNAs genômicos foram usa- dos como gabaritos pra ampliação os respectivos genes panD.

Os iniciadores que se seguem foram projetados para panD de C. acetobutylicum: 5'-GGAATTCCATATGCATTTAAATATGTTAAAATC-3' (Ca- panNdeF; SEQ ID N0: 34), e 5'-ACCCAAGCTTTAGCCAATTGTCCCGTG CTTTTC-3' (CapanHdR; SEQ ID N0: 35). C. acetobutylicum foi ampliado em 100 μΐ_ de PCR com DNA genômico de 100 ng, iniciadores CapanNdeF1 Ca- panHdR e Pfu Turbo polimerase (Stratagene, La Jolla, CA). As condições da PCR eram: 2 minutos a 94°C; 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 48°C por segundos, e 72°C por 45 segundos; 15 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos e 72°C por 45 segundos e ao final, 7 minutos de ex- tensão final a 72°C.

Iniciadores para panD de S. avermitilis foram: 5'-GGAATTCCA TATGCTGCGTACCATGTTCAAGTC-3' (SapanNdeF; SEQ ID N0: 36) e 5'- ACACAAGCTTTAGGCGGTGACGGCCTGC-3' (SapanHdR; SEQ ID N0: 37). DNA de S. avermitilis foi ampliado em 100 pL PCR com DNA genômico 100 ng, iniciadores SapanNdeF, SapanHdR e uma mistura de 2 μΙ_ de rTth poli- merase (Applied Biosystems, Foster City, CA) e 0,5 μΙ_ de Pfu Turbo polime- rase (Stratagene, La Jolla1 CA). As condições da PCR eram: 2 minutos a 94°C; 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos e 70°C por 45 segundos; seguido por 15 ciclos de 94°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, e 70°C por 45 segundos e ao final 7 minutos a 70°C. Os produtos resultantes da PCR foram purificados empregando

kit de purificação da PCR Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Produtos da PCR purificados e vetor p- PRONde foram digeridos por toda a noite com enzimas de restrição Nde\ e HindlW a 37°C. O vetor pPRONde foi então tratado por uma hora com fosfa- tase alcalina de intestino de bezerro (New England BioLabs, Ipswich, MA) de acordo com as instruções do fabricante e purificados com gel empregando o kit de extração de gel Qiagen. Os produtos da PCR digeridos com Nde\ e Hind\\\ foram aquecidos a 75°C por 30 minutos para inativar as enzimas de restrição e usados diretamente em uma reação de ligação Quick (New En- gland Biolabs) com vetor purificado com gel. Após uma ligação de 5 minutos, a mistura de reação foi submetida à troca de tampão com o kit de purificação da PCR Qiagen e 1 pL da reação de ligação foi empregado para transforma- ção do eletrocomponente das células E.coli DH10B. As células transforma- das foram colocadas em placas nas placas com LB suplementado com 25 pg/mL de canamicina e as colônias resultantes foram testadas quanto a pre- sença dos genes panD.

Clones positivos foram sequenciados para verificar a exatidão e retransformados em E. coli 11303 AIdhA ApanC-D Kl fld. Os clones resultan- tes foram usados para biotransformações e ensaios da enzima aspartato descarboxilase. As SEQ ID N°s: 38 e 39 ilustram as seqüências de nucleotí- deo e proteínas, respectivamente, do gene da aspartato descarboxilase de C. acetobutylicum (CapanD). As SEQ ID N°s: 40 e 41 ilustram as seqüências de nucleotídeo e proteína, respectivamente, do gene da aspartato descarbo- xilase de S. avermitilis (SapanD).

Para biotransformações, as células portando plasmídeos p- PROCapanD e pPROSapanD foram desenvolvidas no meio 2YT suplemen- tado com 25 μg/mL de canamicina para OD600~0,6-0,8 e induzidas com 1 mM de IPTG por 6 horas. Após indução as células foram esferonizadas, e ress- suspensas a uma OD000 de ~ 4 tanto em meio M9 suplementado com 10 g/L glicose, MOPS a 100 mM, pH 8,0, 100 μΜ de piridoxina HCI, e 10 μΜ de pantotenato ou em meio M9 sem nitrogênio suplementado com 0., g/L glico- se, aspartatob a 20 mM, MOPS a 100 mM e pantotenato a 10 μΜ. A bio- transformação foi realizada em 1 mL de meio em tubos Falcon de 14 mL (Número do catálogo 2059) a 37°C, 225 rpm, por 20 horas. Ao final da bio- transformação as células foram esferonizadas, os sobrenadantes foram aci- dificados por adição de ácido fórmico a 5%, filtrados e analisados por HPLC conforme descrito no Exemplo 4, quanto à produção de beta-alanina a partir da glicose sozinha ou ambos glicose e aspartato.

Conforme mostrado na tabela 2, a produção de beta-alanina a partir da glicose sozinha foi de cerca de 2 mM. A adição de aspartato ao meio de biotransformação aumentou em 2-3 vezes a produção de beta- alanina.

Tabela 2: produção de beta-alanina por aspartato descarboxilases

Plasmídeo Meio beta-alanina (mM) pPROCapanD Glicose 2,1 pPROSapanD Glicose 1,9 pPROCapanD Glicose + aspartato 7,6 pPROSapanD Glicose + aspartato 4,9

A atividade da aspartato descarboxilase foi ensaiada para medi- ção da conversão de aspartato em beta-alanina. As células portando plas- mídeos pPROEcpanD, pPROCapanD e pPROSapanD foram desenvolvidas em meio 2YT a OD600 -0,4-0,6 e induzidas com IPTG a 1 mM e 0,2% de a- rabinose por 6 horas. Após indução as células foram esferonizadas e res- suspensas em tampão HEPPS a 50 mM (pH = 8,0). As células foram rompi- das empregando uma prensa French. A mistura e reação padrão continha aspartato a 1,2 mM, HEPPS a 50 mM (pH=8,0) e 0,4 mg de extrato bruto em um volume final de 1 ml_. Após incubação a 37°C, 50 μΙ da mistura de rea- ção foram removidos em intervalos de tempo e saturados com 150 μΙ_ da solução de parada (10% ácido fórmico). Proteína precipitada foi removida por centrifugação e a beta-alanina em cada amostra foi quantificada confor- me descrito.

As atividades específicas da aspartato descarboxilase nos extra- tos brutos são mostradas na tabela 3.

Tabela 3: atividade da aspartato descarboxilase nos extratos brutos

Plasmídeo_Atividade específica (UZmga)

pPROEcpanD 0,004

pPROSapanD 0,074

pPROCapanD 0,048

a 1 U = 1 pmol/min

Por substituição da origem ρ 15a de replicação do plasmídeo pPROSapanD, que possui um número de cópias médio por célula de 15, pela origem de replicação da CoIEI, que possui um número de cópias médio por célula de 30~50, para gerar pCECSapanD, a atividade específica da as- partato descarboxilase nos extratos de célula aumentou para 0,54 U/mg. EXEMPLO 8

Produção de 3-HP por células expressando panD, BAAT e 3-HP desi- drogenase

Este exemplo descreve métodos empregados para produzir 3- HP in vivo, expressando aspartato descarboxilase exógena, beta-alanina aminotransferase e 3-HP desidrogenase na célula. Embora as seqüências de enzima específicas tenham sido usadas, um versado na técnica apreciará que tais seqüências conhecidas na técnica ou descritas neste documento podem ser usadas.

Células expressando um gene panD exógeno (SEQ ID N0: 40),

gene de BAAT5-9 exógeno (SEQ ID N0: 18), e gene de PpmmsB31 exógeno (SEQ ID N0: 29), tanto integrados no cromossoma quanto presentes em um ou mais plasmídeos, são capazes de produzir 3-HP a partir da glicose (figura 1). Em um exemplo de tais células, o hospedeiro com os genes BAAT5-9-PpmmsB31 integrados no cromossoma é transformado com plas- mídeo pCECSapanD. O hospedeiro é derivado da cepa de E.coli ATCC 11303 (uma cepa B) e transporta, adicionalmente, os marcadores genéticos Apan(C-D) AIdhA KItfd ApoxB.

Os transformantes foram desenvolvidos em meio LB mais clo-

ranfenicol para manter o plasmídeo por 6 horas a 30°C, então diluídos 100 vezes em meio Overnight Express (Novagen/EMD Biosciences, Madison Wl) conforme descrito pelo fabricante, exceto a fonte de carbono (solução 1 no kit Overnight Express) que é substituída por 0,1% (peso/volume) de glicose, 2% de L-arabinose, e adicionalmente possui 30 pg/mL de cloranfenicol, pan- totenato de Ca2+ a 20 μΜ, e IPTG a 1 mM. As células se desenvolveram a 30°C por aproximadamente 18 horas, então porções de 0,25 ml_ foram diluí- das com 0,75 mL de meio de biotransformação (sais de M9, M MOPS a 0,1, pH 8,0, piridoxina a 133 μΜ, 2,67% de glicose, NaHCO3 a 13,3 mM) e a in- cubação continuou a 30°C por 23 horas. O sobrenadante da cultura foi recu- perado por centrifugação, e acidificado com 0,05 volumes de 90% ácido fór- mico (concentração final ~ 1 M).

3-HP no sobrenadante foi quantificado por LC/MS conforme descrito em WO 2005/118719 A2. Em resumo, cromatografia foi realizada em um sistema de cromatografia líquida da Waters 2690 empregando uma coluna de cromatografia de fase inversa de 2,1 mm χ 250 mm Phenomenex Aqua Cie com eluição isocrática a 45°C empregando 1% de metanol:aquoso contendo 0,1% (v/v) de ácido fórmico como a fase móvel em uma taxa de circulação de 0,18 mL/min. Os parâmetros para espectrômetro de massa quadrupolo Micromass ZQ operando em modo de ionização em electrospray negativo (-ESI) foram ajustados como se segue: capilaridade: 2,0 kV; cone: V; extrator: 4 V; lentes RF: 1 V; temperatura da fonte: 120QC; temperatu- ra de dessolvação: 380°C; gás de dessolvação: 600 L/h; gás no cone: desli- gado; baixa resolução de massa: 15,0; alta resolução de massa: 15,0; ener- gia do íon: 0,2; multiplicador: 650. Um parâmetro EM de monitoramento de íon selecionado foi ajustado para permitir seleção de m/z 89, corresponden- do ao íon molecular desprotonado, [M-H]", de 3-HP. Células portando o gene de aspartato descarboxilase em pCECSapanD, e com os genes de BAAT e 3-HP desidrogenase integrados ao cromossoma sob o controle de expressão do promotor Piac/ara sintético, acumularam 2,7 g/L de 3-HP.

EXEMPLO 9

Efeito do acetato e piruvato na beta-alanina aminotransferase

Este exemplo descreve métodos empregados para determinar o efeito do acetato e piruvato na atividade de beta-alanina aminotransferase, conforme determinado pela produção de 3-HP. O acetato e o piruvato são produtos neutros do metabolismo de E. coli, e, em alguns exemplos, é dese- jável reduzir ou eliminar os mesmos porque eles podem drenar precursores e inibir enzimas na via de 3-HP.

O acetato reduziu a atividade biológica in vivo de BAAT sob condições anaeróbicas e aeróbicas. Uma cultura de E. coli 11303 Apta Aa- dhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D) ApoxB INT(BAAT5-9/PpmmsB31) portando o vetor pCEC/SapanD foi desenvolvida em meio LB com cloranfenicol a 30°C. Esta cultura foi empregada para inocular 20 mL de meio Overnight Express (Novagen) modificado a uma OD6oo inicial de 0,05 em um frasco de 125 mL. A modificação ao meio incluiu a substituição da Solução 1 por glico- se a uma concentração de 0,1% e arabinose a 2%, e adição de pantotenato de Ca2+ a 20 μΜ, cloranfenicol a 25 μg/mL, piridoxina-HCI a 100 μΜ e IPTG a 1 mM. Após crescimento no meio de indução por 17 horas, a OD6oo foi de 8,4. Um total de 32.500 unidades OD (OD/mL multiplicado por mL) foram rotacionadas e ressuspensas em 7,31 mL tanto de meio de biotransforma- ção de glicose ou beta-alanina. Meio de biotransformação de glicose consis- tia em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, IPTG a 500 μΜ e piridoxina-HCI a 50 μΜ. O meio de biotransformação de beta-alanina conti- nha beta-alanina a 16 mM além dos componentes do meio de biotransfor- mação de glicose.

Para biotransformações aeróbicas, 900 μί. da cultura ressuspen-

sa foram aliquotados em um tubo Falcon de 14 mL e o volume trazido para 1 mL com água e/ou acetato de sódio (pH 7). Para biotransformações anaeró- bicas, 1,35 mL da cultura ressuspensa foram aliquotados em um frasco de vidro de 1,8 mL e o volume foi trazido para 1,5 mL com água e/ou acetato de sódio (pH 7). As concentrações finais de acetato de sódio adicionado foram 0,20 mM, e 100 mM e incubações de biotransformação foram de 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras foram obtidas após 3 horas de biotrans- formação para culturas aeróbicas de beta-alanina, após 6 horas e meia para culturas anaeróbicas de beta-alanina e culturas aeróbicas de glicose, e após 28 horas para culturas anaeróbicas de glicose. Os sobrenadantes da cultura foram acidificados com 0,05 volumes de 90% de ácido fórmico, centrifuga- dos, filtrados e analisados quanto à produção de 3-HP conforme descrito no Exemplo 8.

Sob condições aeróbicas, acetato a 20 mM causaram uma redu- ção de 22% no 3-HP da beta-alanina e uma redução de 28% da glicose, acetato a 100 mM causaram uma redução de 47% no 3-HP da beta-alanina e uma redução de 52% da glicose sob as mesmas condições (Tabela 3). A redução no 3-HP vista sob condições anaeróbicas variou de 8-29% e pode ter sido menos devido à presença de acetato como um produto de fermenta- ção natural em todas as culturas, incluindo o acetato adicionado sem contro- le. Embora esta biotransformação tenha sido realizada em uma cepa com ambos os genes poxB e pta deletados, a produção de acetato ainda é ob- servada sob determinadas condições de cultura. Tabela 4: efeito do acetato na produção de 3-HP

Substrato_Condição Acetato adicionado (mM) 3-HP produzido (mg/L)

beta-alanina Aeróbica 0 180

140

100 95

anaeróbica 0 71

65

100 61

Glicose aeróbica 0 88

63

100 42

anaeróbica 0 38

30

100 22

O efeito do acetato na atividade biológica in vitro das enzimas de BAAT nos extratos de células foi também medido empregando um ensaio acoplado, onde o produto de semialdeído de malonila da reação catalisada por BAAT foi reduzido por uma 3-HP desidrogenase. Um extrato de células portando o BAAT5-9/PpmmsB31 integrado foi obtido por ressuspensão das células coletadas por centrifugação com Bugbuster (EMD/Novagen, Madison Wl) conforme descrito pelo fabricante. As misturas de reação de volume final de 200 μΙ_ foram formadas nas cavidades de uma placa de fundo plano de 96 cavidades Costar 3635 UV-transparente (Corning Incorporated, Corning NY) e continham de K a 50 mM fosfato, pH 8,0, fosfato de piridoxal a 100 μΜ, alfa-cetoglutarato a 7,5 mM, beta-alanina a 20 mM, NADH a 1 mM, 0,4 mg de proteína de extrato de célula. O progresso da reação foi monitorado como a diminuição em A34O devido à oxidação de NADH. O efeito do acetato ou piruvato foi determinado por adição de 20 mM de cada composto (como o sal neutro Na+).

Empregando o acima no ensaio in vitro, a atividade do sistema da BAAT-3-HP desidrogenase foi reduzida em aproximadamente 50% na presença de 10 mM de acetato ou piruvato. Com base nestas observações, a redução da presença de ace-

tato ou piruvato quando da produção de 3-HP in vivo para uma célula ex- pressando BAAT, aumenta a produção de 3-HP. EXEMPLO 10 Mutações de hospedeiros que aumentam a produção de 3-HP por redu- ção da produção de acetato

Este exemplo descreve métodos de redução da produção de acetato, desta forma aumentando a produção de 3-HP, por exemplo, em uma célula expressando BAAT exógena.

Os resultados obtidos no Exemplo 9 indicam que a produção de 3-HP é aumentada quando a produção de acetato é reduzida ou está ausen- te. Isto pode ser realizado pelos controles do processo de fermentação, tais como os descritos em Vemuri e outros (/App/. Environ. Microbiol. 72:3653-61, JO 2006), ou por emprego de cepas, nas quais a produção de acetato é reduzi- da devido à ausência de genes codificando atividades enzimáticas que cata- lisam a produção de acetato ou uma combinação de ambas abordagens.

Qualquer método para redução da produção de acetato, tanto através de manipulação genética ou através do controle dos meios e/ou con- dições de crescimento, ou ambos, poderia aumentar a produção de 3-HP a partir de qualquer via utilizando a beta-alanina aminotransferase. Um método para redução da produção de acetato por uma cepa de E. coli é deletar o gene poxB, que codifica a piruvato oxidase. A piruvato oxidase metaboliza piruvato em acetato e CO2 e é primariamente expressa nas culturas sob es- tresse ou na fase estacíonária sob condições aeróbicas. A outra grande via para produção de acetato é a via ack-pta de CoA acetila, que é primariamen- te ativo sob condições anaeróbicas.

O exemplo que se segue ilustra um método, pelo qual um gene em E. coli, tal como o gene poxS, pode ser rompido. Os iniciadores que se seguem são empregados para ampliar o marcador de canamicina flanquea- do FRT do plasmídeo pKD4 (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:6640-5, 2000): 5'- TAAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGAT GGAGAACCATGAAACAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC -3' (poxBkoF; SEQ ID N0: 42), e 5'- TCATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTT TTTACCTTAGCATATGAATATCCTCCTTAG -3' (poxBkoR; SEQ ID N0: 43).

A ampliação foi realizada empregando rTth DNA polimerase XL (Applied Biosystems) de acordo com as construções do fabricante, empre- gando oito ciclos com uma temperatura de recombinação de 52°C e 22 ci- clos com uma temperatura de recombinação de temperatura de 60°C, e uma extensão de 2 minutos a 68°C. O produto de ampliação foi purificado com gel (Qiagen), digerido por 3 horas com endonuclease de restrição Dpn\, e limpo empregando uma coluna de purificação Qiagen PCR. DNA purificado (100 ng) foi transformado nas células competentes BW25115 portando o plasmídeo auxiliar Red induzido pKD046 (Datsenko and Wanner, 2000) e células transformadas foram colocadas em placas nos meios LB contendo μg/mL de canamicina. As colônias resultantes foram raiadas novamente para purifica-

ção e colônias simples foram testadas quanto a integração desejada empre- gando iniciadores a montante (poxBupF) e a jusante (poxBdnR) da região substituída: 5'- GGGATTTGGTTCTCGCATAATC -3' (poxBupF; SEQ ID N0: 44) e 5'- GTAGGGTCGTCTCCGTAAAC -3' (poxBdnR; SEQ ID N0: 45). Um Iisado de fago P1 foi fabricado a partir da cepa Β\Λ/25113Δ

poxfí::kan e usado para transferir a mutação para E. coli ATCC11303 por- tando Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D). O marcador de canamicina foi removido de acordo com os procedimentos ressaltados em Datsenko and Wanner (2000), com a exceção de que os transformantes de pCP20 foram selecionados a 30°C em meios líquidos contendo carbenicilina e foram puri- ficados duas vezes não seletivamente a 42 C.

As biotransformações da glicose em 3-HP foram conduzidas nos frascos agitados para testar o efeito da deleção de ApoxB. Duas replicações de cada uma das cepas com e sem ApoxB portando o vetor pPRON- de/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31 foram desenvolvidas nos meios LB com canamicina. Estas culturas foram usadas para inocula 15 mL de meios 2T contendo 25 μg/mL canamicina e 10 μΜ de pantotenato de Ca2+ em um frasco de 125 mL. As células foram induzidas a ODeoo de 0,53 com IPTG a 1 mM e 0,2% de arabinose por 6 horas. Um total de 4.000 unidades de OD (OD/mL multiplicado por mL) foram rotacionadas para cada cultura e foram ressuspensas em 1 mL de meios de biotransformação, consistindo em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, IPTG a 500 μΜ e piridoxina-HCI a 100 μΜ. Ambas culturas de indução e biotransformação se desenvolveram a 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras de sobrenadante tomadas a- pós 22 horas e meia foram acidificadas com 0,05 volumes de ácido fórmico a 90%, centrifugadas, filtradas e analisadas para 3-HP conforme descrito no Exemplo 8. O sobrenadante não-acidificado foi analisado quanto aos ácidos orgânicos em uma coluna de troca de íon BioRad Aminex HPX 87H (Bio-Rad cat N0 125-0140), operada a 60°C, 0,6 mL/min de taxa de circulação com ácido sulfúrico a 0,01 N como a fase móvel de sistema. A detecção do ácido acético foi por índice de refração e quantificado contra um padrão de con- centração conhecido.

As cepas com ApoxB mostraram um aumento de 25% em 3-HP por OD comparado ao controle sem o ApoxB e não produziram acetato de- tectável em comparação ao 0,64 g/L de acetato produzido pelo controle. As- sim a redução da produção metabólica ou presença de acetato conduz à produção aumentada de 3-HP pela via que envolve BAAT, tal como um au- mento de pelo menos 20% ou pelo menos 25%.

As abordagens genéticas alternativas podem ser usadas para reduzir a pro- dução de acetato, tal como por deleção dos genes pta e/ou ack. EXEMPLO 11

Mutações de hospedeiro que aumentam a produção de 3-HP por au- mento dos precursores ou redução das vias de competição

Este exemplo descreve métodos adicionais ou alternativos pelos quais a produção de 3-HP pode ser aumentada, por exemplo, em uma célula expressando BAAT exógenos. A produção de 3-HP pode ser aumentada por aumento da disponibilidade de precursores nas vias ou redução da drena- gem de intermediários em outros produtos metabólicos. ρpc, fosfoenol piruvato carboxilase

A disponibilidade de um precursor pode ser aumentada, por e- xemplo, pela escolha do promotor. Por exemplo, uma cepa foi construída, na qual a atividade da PEP carboxilase, catalisando a formação de oxaloacetato a partir de piruvato de fosfo enol e CO2, foi aumentada por colocação de um promotor sintético na frente do gene cromossomicamente codificado, ppc, que codifica esta função. Uma modificação do método para inserção dos fragmentos gerados por PCR nos sítios específicos no genoma de E.coli (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Soe. USA 97:6640-5, 2000) foi empregada. Um novo plasmídeo, pKDprom, foi construído por inserção da região promotora Piac/arade pPRONde dentro do plasmídeo pKD3 de Datsen- ko e Wanner.

O plasmídeo pKDprom transporta o marcador de resistência ao cloranfenicol entre duas regiões FRT (para permitir excisão do marcador pa- ra a proteína FLP) imediatamente adjacente ao promotor Piac/ara· Este seg- mento compreendendo o marcador e o promotor em pKDprom foi ampliado usando os iniciadores que se seguem que transportaram extensões 5' homó- logas às regiões imediatamente a montante do gene ppc: 5'-AGGAT ACAGGGCTATCAAACGATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAATGTGTAGGC TGGAGCTGCTTC (SEQ ID N0: 46) e 5-GAGCATACTGACATTACTACGC AATGCGGAATATTGTTCGTTCATATGTACCTTTCTCCTCTTTAA (SEQ ID N0: 47). O produto PCR foi recombinado no sítio ppc no genoma E. coli BW 25113 pelas funções de Red recombinase do fago Iambda conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000). A inserção foi seguida por seleção quanto à resistência ao cloranfenicol, e confirmada por PCR. A cepa portando o promotor artificial e cassete de resistência ao

cloranfenicol na frente do gene ppc é designada como Klppc::cam, e cepas portando o promotor artificial antes do gene ppc, do qual o marcador de re- sistência a cloranfenicol foi excisado são denominadas Klppc. O Klppc::cam foi transferido por transdução do fago P1 para o E. coli ATCC 11303 portan- do Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D) ApoxB 2XINT(BAAT5-9/ Ppmmsb31) que contém duas cópias da beta-alanina aminotransferase aperfeiçoada (SEQ ID N°: 18) e P. putida 3-HP desidrogenase (SEQ ID N0: 29) integradas no genoma. Os marcadores de resistência foram decompostos da cepa Klppc e a mesma foi transformada com o vetor pCEC/SapanD. Esta cepa foi comparada à cepa de controle sem o marcador Klppc em uma biotransfor- mação medindo a produção de 3-HP a partir da glicose.

Culturas que se desenvolveram nos meios LB contendo cloran- fenicol foram usadas para inocular 9 mL de meios Overnight Express modifi- cados (Novagen) a uma OD inicial de 0,05-0,07 em um frasco de 125 mL. A modificação ao meio incluiu a substituição da Solução 1 por glicose a uma concentração de 0,1% e arabinose a 2%, e adição de pantotenato de Ca2+ a 20 μΜ, cloranfenicol a 25 μg/mL, piridoxina-HCI a 5 μΜ e NaHCO3 a 10 mM. IPTG foi adicionado a uma concentração de 1 mM após 2 horas de cresci- mento. Após crescimento no meio de indução por 19 horas, a OD6oo variou de 8,3 (para a cepa Klppc) a 13,8 (controle). Um total de 32.000 unidades OD de cada cepa foram centrifugadas e ressuspensas em 8 mL dos meios de biotransformação. Meios de biotransformação de glicose consistiam em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, IPTG a 500 μΜ e NaHCO3 a 10 μΜ. Ambas as culturas de indução e biotransformação cresceram a 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras foram retiradas após indução e após 7,5 e 23 horas de biotransformação, e foram acidificadas com 0,05 vo- lumes de ácido fórmico a 90%, centrifugadas, filtradas e analisadas por 3- HP, beta-alanina e aspartato conforme descrito nos Exemplos 8 e 4.

Após 23 horas de biotransformação, toda a glicose havia sido utilizada, apenas quantidades de traço de beta-alanina permaneceram e a cepa portando o Klppc produziu tanto quanto 2,4 vezes de 3-HP por OD co- mo o controle (Tabela 5). Portanto, o aumento da atividade da PEP carboxi- Iase fornece oxaloacetato precursor aumentado para a via de produção de 3- HP. Concretizações alternativas para aumentar a formação de oxaloacetato incluem clonagem e expressão de PEP carboxilase em um plasmídeo, ou clonagem e expressão de piruvato carboxilase, que converte piruvato mais C02/HC03" em oxaloacetato com o consumo de ATP. Tabela 5: efeito da expressão aumentada de ppc na produção de 3-HP

Cepa Ponto de tempo (h) 3-HP(mg/L por OD) Beta alanina (mg/L per OD) Controle3 ONEXb 27 114 7,5 38 30 23 92 1 Klppc ONEX 41 126 7,5 40 84 23 218 0,8

aE. coli ATCC 11303 Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D) ApoxB 2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)/pCECSapanD

bONEX = 3-HP e beta-alanina presentes nos sobrenadantes das culturas no Overnight Express antes da centrifugação.

asiPC, aspartato aminotransferase

Outro exemplo de uma construção genética, pelo que a disponi- bilidade de um precursor é aumentada, é uma cepa onde a atividade da as- partato aminotransferase, catalisando a formação de aspartato a partir de oxaloacetato e glutamato (figura 1), foi aumentada por colocação de um promotor sintético na frente do gene codificado cromossomicamente, aspC, que codifica esta função. O segmento compreendendo o marcador de resis- tência ao cloranfenicol e o promotor em pKDprom foi ampliado empregando os iniciadores que se seguem que portavam extensões 5' homólogas às re- giões imediatamente a montante do gene aspC: 5'-CCCTGATAGCGGACT TCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTT C (SEQ ID N0: 48), e 5-GCCCAGAATCGGGTCGGCAGGAGCGGCGGTAA TGTTCTCAAACATATGTACCTTTCTCCTCTTTAA (SEQ ID N0: 49). O produto da PCR foi recombinado no sítio aspC no genoma E.

coli BW 25113 pelas funções da Red recombinase de fago lambida conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000). A inserção foi seguida por seleção quanto à resistência ao cloranfenicol e confirmada por PCR. Uma cepa por- tando o promotor artificial e cassete de resistência ao cloranfenicol em frente ao gene aspC é denominada KlaspC::cam, e as cepas portando o promotor artificial antes do gene aspC, do qual o marcador de resistência ao cloranfe- nicol foi excisado são denominadas KlaspC. A KlaspC::cam foi transferida por transdução de fago P1 para o E.coli ATCC 11303 portando AldhA Apan(C-D) Klppc 2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31) que contém duas cópias da beta-alanina aminotransferase aperfeiçoada (SEQ ID N0: 18) e P. putida 3- HP desidrogenase (SEQ ID N0: 29) integradas ao genoma. Os marcadores de resistência foram decompostos da cepa KIaspC e ETA foi transformada com o vetor pCEC/SapanD. Esta cepa foi comparada à cepa de controle sem o marcador KIaspC em uma biotransformação medindo a produção de 3-HP a partir da glicose.

As culturas que se desenvolveram em meios LB contendo clo- ranfenicol foram usadas para inocular 7 mL de meios Overnight Express modificados (Novagen). A modificação aos meios incluiu a substituição da Solução 1 por glicose a uma concentração de 0,1% e L-arabinose a 2% e JO adição de Ca2+pantotenato a 10 μΜ, cloranfenicol a 30 μg/mL e piridoxina- HCI a 5 μΜ. IPTG foi adicionado a uma concentração de 1 mM após 3 horas de desenvolvimento. Após crescimento no meio de indução por 19 horas, 2,5 mL da cultura foram diluídos com 7,5 mL dos meios de biotransformação consistindo em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, piridoxina- HCI a 100 μΜ. Ambas as culturas de indução e biotransformação se desen- volveram a 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras foram retiradas após 21 horas de biotransformação e foram acidificadas com 0,05 volumes de 90% ácido fórmico, centrifugadas, filtradas e analisadas quanto a 3-HP con- forme descrito no Exemplo 8. A cepa com o KIaspC produziu 441 mg/L.OD, um aumento de

duas vezes e meia a quantidade de 175 mg/L.OD produzida pela cepa de controle. Portanto, o aumento na atividade de aspartato aminotransferase provê mais precursor aspartato para a via de produção de 3-HP. Concretiza- ções alternativas pelas quais a produção de aspartato por ser aumentada incluem expressão de aspartato aminotransferase (por exemplo, em um plasmídeo). qltA. citrato sintase

A expressão de citrato sintase foi modulada para elevar os níveis de oxaloacetato disponíveis como substrato para a reação da aspartato ami- notransferase, de CoA-acetila para atuar como ativador positivo de piruvato carboxilase e/ou PEP carboxilase, e para reduzir a quantidade de carbono que é perdida em dióxido de carbono no ciclo de ácido cítrico. A produção da citrato sintase foi reduzida por alteração do códon de partida ATG transla- cional para GTC e do sítio de ligação ribossômica a uma seqüência menos ideal para E.coli, porém pode também ser realizada usando outras mutações naquelas regiões, mutações no promotor e regiões de codificação, incorpo- ração de códons raros ou estrutura secundária ou tecnologia de interferência de RNA. As mutações usadas neste exemplo mostradas sublinhadas a se- guir foram incorporadas no iniciador a jusante usado na técnica de nocaute do gene de Wanner (Datsenko e Wanner, 2000). O iniciador a frente (gl- tAKDF) foi projetado de modo que, uma vez que o marcador de resistência tenha sido decomposto, a "cicatriz" remanescente substitua um número e- quivalente de nucleotídeos na região a montante. Esta região não continha quaisquer outros genes conhecidos e está a jusante do promotor gltA previs- to. 5'-CTGTACCCAGGTTTTCCCCTCTTTCACAGAGCGGCGAGCCAAATA AAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' (gltAKDF; SEQ ID N0: 50), e 5-TC AACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCAÇA TGAATATCCGCCTTAGTTC-3' (gltAKDR; SEQ ID N0: 51).

SEQ ID N0: 52 é a seqüência resultante do local gltA modificado (KDgItA) na cepa atenuada decomposta.

Os iniciadores gltAKDF e gltAKDR foram empregados para am- pliar o marcador de canamicina flanqueado FRT a partir de plasmídeo pKD4 (Datsenko e Wanner, 2000). A ampliação foi realizada empregando rTth DNA polimerase XL (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricantes, empregando oito ciclos com uma temperatura de recombinação de 52°C e 22 ciclos com uma temperatura de recombinação de 60°C, e uma extensão de 2,25 minutos a 68°C. O produto de ampliação foi purificado com gel (Qiagen), digerido por 2 horas com enzima de restrição Dpn\, e limpo empregando uma coluna de purificação de PCR Qiagen. O DNA purificado (100 ng) foi transformado nas células BW25115 competentes portando o plasmídeo auxiliar Red pKD046 e as células transformadas foram colocadas em placas nos meios LB contendo 25 ng/mL de canamicina.

As colônias foram raiadas novamente para purificação e as co- lônias simples foram testadas quanto à integração desejada empregando iniciadores a montante (gltAupF; 5'- GATTCGCCATTTATTCGTCATC- 3'; SEQ ID N0: 53) e a jusante (gltAdwnR; 5'-CTGGGTCAAAGGTGAACAC-3'; SEQ ID N0: 54) da região substituída ou com o iniciador a montante e o inici- ador específico para os nucleotídeos alterados (gltAtestR; 5'-GTTTT GCTTTTGTATCAGCCACA-3'; SEQ ID N0: 55). Empregando uma tempera- tura de recombinação de 59,5°C, os iniciadores gltAupF/gltAtestR não pro- duziram um produto da PCR com gabarito gltA selvagem, porém produziram um produto de tamanho esperado com transformantes purificados.

Um Iisado de fago P1 foi então fabricado da cepa gltA modulada sendo empregado para transferir a mutação para dentro do E. coli ATCC11303 portando Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D) ApoxB e uma cópia da integração de BAAT5-9/PpmmsB31. O marcador de canamicina foi decomposto de acordo com os procedimentos ressaltados em Datsenko e Wanner (2000), com a exceção de que os transformantes pCP20 foram se- lecionados a 30°C em meios líquidos contendo carbenicilina e foram purifi- cados duas vezes de modo não seletivo a 42°C.

Biotransformações da glicose em 3HP foram conduzidas em frascos agitados para testar o efeito da modulação de gltA (KDgItA). Culturas das cepas 11303 portando Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D) ApoxB INT e 11303 portando Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D) ApoxB INT KDgltA, ambas portando o vetor pCEC/SapanD, foram desenvolvidas em meios LB com cloranfenicol. Estas culturas foram empregadas para inocular mL de meio Overnight Express modificado (Novagen) a uma OD inicial de 0,05-0,10 em um frasco de 125 mL. A modificação ao meio incluiu a substitu- ição da Solução 1 por glicose a uma concentração de 0,1% e arabinose a 2%, e adição de 20 μΜ de pantotenato de Ca2+, 25 μg/mL de cloranfenicol, 50 μΜ de piridoxina-HCI e NaHCO3 a 10 mM. IPTG a uma concentração de 1 mM foi adicionado após 1 hora e 25 minutos de desenvolvimento. Após crescimento no meio de indução por 18 horas, ODeoo variou de 4,5 (KDgltA) a 11,2 (controle). Um total de 32.000 unidades de OD (OD/mL multiplicado por mL) foram centrifugadas e ressuspensas em 8 mL de meios de biotrans- formação. Os meios de biotransformação consistiram em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, 500 μΜ de IPTG, 50 μΜ de piridoxina-HCI e mM de NaHCO3. Ambas as culturas de indução e biotransformação se desenvolveram a 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras foi retiradas após indução e após 6 e 24 horas de biotransformação e foram analisadas quanto a 3-HP e beta-alanina conforme descrito no Exemplos 8 e 4.

A cepa com KdgItA mostrou um aumento de 2,5 a 3,7 vezes em 3-HP por OD em comparação ao controle (Tabela 6) indicando que a redu- ção do fluxo metabólico através da etapa de citrato sintase é benéfica para a produção de 3-HP.

Tabela 6: efeito de modulação da produção de citrato sintase

Cepa Ponto de tempo (h) 3-HP (mg/L por OD) beta-alanina (mg/L per OD) Controle3 ONEXb 26 106 6 22 57 24 90 0 KDgItA ONEXb 95 159 6 77 34 24 222 22

aE. coli ATCC 11303 Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D) ApoxB INT(BAAT5-9/Ppmmsb31)/pCECSapanD

bONEX = 3-HP e beta-alanina presentes nos sobrenadantes das culturas em Overnight Express antes da centrifugação. Componentes atpFH, F1 e Fn da FnF1-ATP sintase

Os genes atpFH codificam duas proteínas que acoplam os com- ponentes Fi e F0 a F0FrATP sintase. Uma cepa com uma deleção destes dois genes é incapaz de sintetizar ATP através da translocação do próton via o complexo e ao invés disto, possui uma Fi-ATPase citoplásmica. Mutantes ATP dependem da fosforilação ao nível do substrato para regenerar ATP de ADP. O fluxo é aumentado através da via glicolítica para produzir ATP atra- vés da fosfotransacetilase (produção de acetato) e através do ciclo de TCA para produzir GTP/ATP através de sucinil-CoA sintase. O fluxo aumentado através destas vias conduz a produção aumentada de NADH. A atividade de ATPase citoplasmática provê ADP para glicólise e a taxa de crescimento diminuída do mutante reduz a utilização de piruvato para crescimento da célula. Causey e outros (Proc. Nati Acad. Sei. USA 101(8): 2235-40, 2004) mostrou que a deleção do gene atpFH gene (AatpFH) conduz ao acúmulo de piruvato, uma vez que o aumento no fluxo glicolítico foi maior que a capaci- dade da via de acetato.

Na via de aspartato para 3-HP, a combinação da mutação de AatpFH com superexpressão de piruvato ou PEP carboxilase aumentaria o fluxo de carbono do piruvato para oxaloacetato e a NADH seria usado pela 3-HP desidrogenase para direcionar a via. Outras mutações que aumentam o agrupamento de piruvato viável são AldhA, Aack-pta, AfrdABCD, ApoxB, e AadhE. A deleção de atpFH pode ser usada em combinação com a atenua- ção de citrato sintase para reduzir o fluxo através do ciclo de TCA, embora NADH propriamente seja um inibidor alostérico da citrato sintase.

Os iniciadores que se seguem foram empregados para construir a deleção do gene atpFH: 5'- GAGCAATATCAGAACGTTAACTAAATAGA GGCATTGTGCTGTGAATCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' (atpFHkoF; SEQ ID N0: 56), and 5'- CGCTGATTTCGGTGGAATTCAGTTGCATGCTCC AGTCCCCTTAAGACTGCATATGAATATCCTCCTTAG - 3' (atpFHkoR; SEQ ID N0: 57). Estes iniciadores foram empregados para ampliar o marcador de canamicina flanqueado FRT a partir do plasmídeo pKD4 (Datsenko e Wan- ner, 2000). A ampliação foi realizada empregando rTth DNA polimerase XL (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, empregan- do oito ciclos com uma temperatura de recombinação de 52°C e 22 ciclos com uma temperatura de recombinação de 60°C, e uma extensão de dois minutos a 68°C. Um produto de ampliação foi purificado com gel (Qiagen), digerido por três horas com endonuclease de restrição Dpn\, e limpo empre- gando uma coluna de purificação de PCR Qiagen. DNA purificado (100 ng) foi transformado nas células competentes BW25115 portando o plasmídeo auxiliar Red Iambda pKD046 e as células transformadas foram colocadas em placas nos meios LB contendo 25 μg/mL de canamicina. As colônias resul- tantes foram raiadas novamente para purificação e as colônias simples fo- ram testadas quanto a integração desejada empregando iniciadores a mon- tante (atpFHupF; 5'-CTCTGCTGCGTACTCAGTTC- 3'; SEQ ID N0: 58) e a jusante (atpFHdnR; 5'-GATCATTTCACCCTGCATACAATC-3'; SEQ ID N0: 59) da região substituída. Um Iisado de fago P1 foi então fabricado a partir da cepa BW251 '\3AatpFH e foi empregado para transferir a mutação para E. coli ATCC 11303 Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D). O marcador de canamicina foi decomposto de acordo com os procedimentos ressaltados em Datsenko e Wanner (2000), com a exceção de que os transformantes pCP20 foram selecionados a 30°C seqüencialmente nos meios líquido e sólido con- tendo ampicilina e foram purificados duas vezes não seletivamente a 42°C.

Biotransformações da glicose em 3-HP foram conduzidas em frascos de agitação para testar o efeito de nocaute de atpFH. As culturas das cepas 11303 Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D) (controle) e 11303 Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D) AatpFH, ambas portando os vetores pPRONde/SapanD/BAAT5-9/PpmmsB31 e pPRONde/CapanD/BAAT5-9/ PpmmsB31 foram desenvolvidas nos meios LB com canamicina, permitindo mais tempo para o crescimento das cepas AatpFH de desenvolvimento mais lento. As culturas foram empregadas para inocular 20 mL de meios 2YT con- tendo 25 μg/mL de canamicina e 10 μΜ de pantotenato de Ca2+ em um fras- co de 125 mL. As células foram induzidas a OD6oo de 0,29 (AatpFH) ou 0,65 (controle) com IPTG a 1 mM e 0,2% de arabinose por ambas 6 horas e 22 horas e meia. 4.000 unidades OD (OD/mL multiplicado por mL) foram rota- cionadas e ressuspensas em 1 mL de meios de biotransformação. Os meios de biotransformação consistiram em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, 500 μΜ de IPTG e 50 μΜ de piridoxina-HCI. Ambas culturas de in- dução e biotransformação se desenvolveram a 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras foram retiradas após aproximadamente 23 horas e foram analisadas quanto a 3-HP conforme descrito no Exemplo 8.

A cepa portando o AatpFH mostrou um aumento de 2 a 3,4 ve- zes em 3-HP por OD em comparação ao controle (Tabela 7). Tabela 7: efeito de AatpFH na produção de 3-HP

Cepa panD Ponto de tempo (h) 3-HP (mg/L per OD) Controle3 Ca 6 15 22,5 8 Sa 6 23 22,5 23 AatpFH Ca 6 32 22,5 16 Sa 6 60 22,5 79

aE. coli ATCC 11303 Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D)ZpPRONdef SapanD/BAAT5-9/PpmmsB31 ou pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31 Biotransformações também foram realizadas para medir a pro- dução de beta-alanina a partir da glicose por cepas E coli 11303 Apta Aa- dhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D) e 11303 Apta AadhE AfrdABCD AIdhA Apan(C-D) AatpFH portando o plasmídeo pCEC/SapanD. As culturas que cresceram nos meios LB com cloranfenicol foram empregadas para inocular mL de meios Overnight Express modificados (Novagen) a uma OD6oo ini- ciai de 0,05-0,15 em um frasco de 125 mL. A modificação ao meio incluiu a substituição da Solução 1 por glicose a uma concentração final de 0,1% e arabinose a 2%, adição de 20 μΜ de pantotenato de Ca2+, 25 μg/mL de clo- ranfenicol, 50 μΜ de piridoxina-HCI e NaHCOs a 10 mM. IPTG a uma con- centração de 1 mM foi adicionado após 1 hora e 25 minutos de desenvolvi- mento. Após crescimento no meio de indução por 20 horas, ODs variaram de 1,8 (AatpFH) a 13,2 (controle). 10.000 unidades OD (OD/mL multiplicado por mL) foram rotacionadas e ressuspensas em 2,5 mL de meio de biotrans- formação. Biotransformações foram realizadas empregando 1 e 1,5 mL de cultura ressuspensa em tubos Falcon de 14 mL. Os meios de transformação consistiam em sais M9, MOPS a 100 mM, pH 8, 1% de glicose, 500 μΜ de IPTG, 50 μΜ de piridoxina-HCI e NaHCO3 a 10 mM. Ambas culturas de in- dução e biotransformação se desenvolveram a 30°C com agitação a 225 rpm. As amostras foram retiradas após indução e após 24 horas da biotrans- formação e foram analisadas quanto a beta-alanina conforme descrito no Exemplo 4.

A cepa 11303Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D) AatpFHI pCECSapanD mostrou um aumento de 1,4 a 2,2 vezes na beta-alanina por OD em comparação ao controle (Tabela 8). Assim, a deleção dos genes atpFH conduz à formação aumentada de beta-alanina e 3-HP na presença da via metabólica para formação de 3-HP a partir de beta-alanina. Tabela 8: efeito de AatpFH na produção de beta-alanina

Cepa Ponto de tempo (h) beta-alanina (mg/L por OD) Controle3 ONEXb 113 24 113 AatpFH ONEX 247 24 157

aE. coli ATCC 11303 Apta AadhE AfrdABCD AldhA Apan(C-D)/pCECSapanD bONEX = beta-alanina presente nos sobrenadantes das culturas em Ovemi- ght Express antes da centrifugação.

Embora os efeitos das mutações designadas Klppc, KlaspC, KdgltA e AatpFH tenham sido determinados individualmente e cada um mos- trado como conduzindo à produção aumentada de 3-HP por células com ati- vidade aspartato descarboxilase, atividade de BAAT aperfeiçoada, e ativida- de de 3-HP, espera-se que a combinação de duas ou mais destas mutações aumente a quantidade de produção de 3-HP por estas células. Exemplo 12

Produção de Beta-alanina

Este exemplo descreve métodos para produção de beta-alanina e células que podem produzir beta-alanina. Um versado na técnica apreciará que embora enzimas específicas sejam descritas, as mesmas enzimas de outras espécies podem ser usadas (bem como variantes das enzimas des- critas), por exemplo, dependendo da célula do hospedeiro na qual se deseja a produção de beta-alanina.

Beta-alanina pode ser gerada a partir de aspartato, por exemplo, na presença de uma aspartato descarboxilase (figura 1) in vitro, in vivo (tal como na célula) ou suas combinações. Por exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo aspartato podem ser construídas geneticamen- te para fabricar beta-alanina por expressão de moléculas de ácido nucleico que codificam uma enzima possuindo atividade de aspartato descarboxilase na célula, por exemplo, empregando tecnologias recombinantes. Moléculas de ácido nucleico de aspartato descarboxilase incluem aquelas mostradas nas SEQ ID N°s: 38 e 40, bem como variantes das mesmas que mantêm a capacidade de codificar uma enzima que pode converter aspartato em beta- alanina (tal como um ácido nucleico codificando SEQ ID N0: 39 ou 41). A célula também pode apresentar atividade PEP carboxilase ou atividade piru- vato carboxilase (ou ambas) e atividade aspartato aminotransferase para permitir a produção de aspartato a partir de PEP ou piruvato (ou ambos). Tal atividade pode ser endógena à célula ou exógena (por exemplo, conforme fornecida por uma molécula de ácido nucleico exógeno codificando o peptí- deo).

Em um exemplo específico, a célula inclui um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxilase, piruvato carboxilase, as- partato aminotransferase e aspartato descarboxilase, onde a expressão de pelo menos uma destas moléculas de ácido nucleico é controlada por um promotor não-nativo que aumenta a expressão de uma molécula de ácido nucleico. Nos exemplos específicos, tal expressão aumentada eleva a quan- tidade de beta-alanina produzida pela célula, por exemplo, uma elevação de pelo menos 20%. Tais células podem também incluir mutações que aumen- tam o grupo disponível de piruvato, tal como, uma deleção funcional de poxB, adhE, atpFH ou suas combinações. Em alguns exemplos, as células também incluem mutações ou moléculas de ácido nucleico que diminuem a produção de citrato sintase (tal como expressão da SEQ ID N0: 52).

Métodos de produção beta-alanina in vivo podem incluir, portan- to, cultivo das células descritas sob condições suficientes para produção de beta-alanina a partir de aspartato. Em um exemplo específico, tais métodos para fabricação de beta-alanina incluem transfecção de uma célula com um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase e aspartato descarboxilase e o culti- vo da célula transfectada de modo a permitir que a célula transfectada fabri- que beta-alanina. A beta-alanina resultante pode ser isolada a partir do meio de cultura da célula ou extraída das células.

Métodos de produção beta-alanina a partir de aspartato in vitro também são providos. Por exemplo, a conversão de aspartato em beta- alanina pode ser obtida por contato do aspartato com uma enzima possuindo atividade de aspartato descarboxilase. Tal conversão também pode ser rea- lizada por uma combinação de métodos in vivo e in vitro.

A formação de beta-alanina durante a fermentação in vivo ou in

vitro pode ser analisada empregando HPLC (vide Exemplo 4) ou outros mé- todos (vide Exemplo 7). Exemplo 13

Produção de semialdeído de malonila

Este exemplo descreve métodos de produção de semialdeído de

malonila, e células que podem produzir semialdeído de malonila. Nos exem- plos específicos, tais métodos e células podem servir como um ponto de par- tida para fabricação de 3-HP. Um versado na técnica apreciará que embora enzimas específicas sejam descritas, as mesmas enzimas de outras espé- cies podem ser usadas (bem como enzimas variantes), por exemplo, depen- dendo da célula do hospedeiro na qual a produção de semialdeído de malo- nila é desejada.

Semialdeído de malonila pode ser gerado de beta-alanina via BAAT (figura 1) in vitro, in vivo (tal como em uma célula) ou suas combina- ções. Por exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo beta- alanina (vide Exemplo 12) podem ser construídas geneticamente para fabri- car semialdeído de malonila expressando uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam uma enzima possuindo atividade de BAAT na célula, por exemplo, empregando tecnologias recombinantes. Moléculas de ácido nucleico de BAAT exemplares incluem aquelas mostradas nas SEQ ID N°s: 5, 7, 9, 11, 13, 16 e 18 bem como variantes das mesmas que mantêm a ca- pacidade de codificar uma enzima que pode converter aspartato em beta- alanina (tal como um ácido nucleico codificando SEQ ID N0: 6, 8, 10, 12, 14, 17 ou 19).

Métodos de produção beta-alanina in vivo podem incluir, portan-

to, cultivo das células descritas sob condições suficientes para produção de semialdeído de malonila a partir de beta-alanina. Em um exemplo específico, tais métodos para fabricação de semialdeído de malonila incluem transfec- ção de uma célula com um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase e BAAT1 e cultivo da célula transfectada de modo a permitir que a célula transfectada fabrique semialdeído de malonila. O semialdeído de malonina resultante pode ser usado como um precursor para fabricação de outros produtos, tais como, 3-HP. Nos exemplos específicos, semialdeído de malonila é isolado do meio de cultura da célula ou extraído das células para uso.

Também são providos métodos de produção semialdeído de ma-

lonila a partir de beta-alanina in vitro. Por exemplo, a conversão de beta- alanina no semialdeído de malonila pode ser obtida por contato da beta- alanina com uma enzima possuindo atividade de BAAT. Tal conversão tam- bém pode ser realizada por uma combinação de métodos in vivo e in vitro.

A formação de semialdeído de malonila durante fermentação in

vivo ou in vitro pode ser analisada empregando HPLC ou o corante de apri- sionamento de aldeído Purpald (vide Exemplo 1). Exemplo 14

Produção de 3-HP a partir de beta-alanina

Este exemplo descreve métodos para produção de 3-HP, e célu-

las que podem produzir 3-HP. Nos exemplos específicos, tais métodos e células podem servir como um ponto de partida para fabricação de derivados de 3-HP, tais como, ésteres 3-HP, 1,3-propanodiol e 3-HP polimerizado (vide Exemplos 14-16, respectivamente). Um versado na técnica apreciará que

embora enzimas específicas sejam descritas, as mesmas enzimas de outras espécies podem ser usadas (bem como enzimas variantes), por exemplo, dependendo da célula do hospedeiro na qual a produção de 3-HP é deseja- da.

3-HP pode ser gerado da beta-alanina via semialdeído de malo-

nila (figura 1) in vitro, in vivo (tal como em uma célula) ou suas combinações. Por exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo semialdeí- do de malonila (vide Exemplo 13) podem ser construídas geneticamente pa- ra fabricar 3-HP expressando uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam uma enzima possuindo atividade de 3-HP desidrogenase na célu- la, por exemplo, empregando tecnologias recombinantes. Moléculas de áci- do nucleico de 3-HP desidrogenase incluem aquelas mostradas nas SEQ ID N°s: 20, 22, 26 e 29 bem como variantes das mesmas que mantêm a capa- cidade de codificar uma enzima que pode converter aspartato em beta- alanina (tal como um ácido nucleico codificando a SEQ ID N0: 21, 23, 27 ou 31).

Métodos para produção de 3-HP in vivo podem incluir, portanto, cultivo das células descritas sob condições suficientes para produzir 3-HP de beta-alanina e semialdeído de malonila. Em um exemplo específico, tais mé- todos para fabricação de 3-HP incluem transfecção de uma célula com um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT e 3-HP desidrogenase e cultivo da célula transfectada de modo a permitir que a célula transfectada fabrique 3-HP. O 3-HP resultante pode ser usado como um precursor para fabricação de outros produtos, tais como, ésteres de 3- HP1 3-HP polimerizado e 1,3 propanodiol. Nos exemplos específicos, 3-HP é isolado a partir do meio de célula da célula ou extraído a partir das células para uso.

Métodos para produção de 3-HP a partir de semialdeído de ma- lonila in vitro também são providos. Por exemplo, a conversão de semialdeí- do de malonila em 3-HP pode ser obtida por contato do semialdeído de ma- lonila com uma enzima possuindo atividade de 3-HP desidrogenase. Tal conversão também pode ser realizada por uma combinação de métodos in vivo e in vitro.

A formação de 3-HP durante fermentação in vivo ou in vitro pode ser analisada empregando os métodos descritos no US 20040076982A1 (incorporado neste documento como referência aos outros métodos). Exemplo 15

Produção de um éster de 3-HP

Este exemplo descreve métodos de produção de um éster de 3- HP e células que podem produzir um éster de 3-HP. Exemplos específicos de ésteres de 3-HP incluem, porém não estão limitados ao: 3-hidro- xipropionato de metila, 3-hidroxipropionato de etila, 3-hidroxipropionato de propila, 3-hidroxipropionato de butila ou 3-hidroxipropionato de 2-etilexila.

Um versado na técnica apreciará que embora enzimas específicas sejam descritas, as mesmas enzimas de outras espécies podem ser usadas (bem como enzimas variantes), por exemplo, dependendo da célula do hospedeiro na qual a produção do éster 3-HP é desejada.

Um éster de 3-HP pode ser gerado a partir de 3-HP. Por exem- pio, células ou micro-organismos produzindo 3-HP (tais como aqueles des- critos no Exemplo 14) podem ser construídas geneticamente para fabricar um éster de 3-HP expressando genes que codificam enzimas possuindo ati- vidade Iipase ou esterase (EC 3.1.1.-).

Por exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo 3-HP podem ser construídas geneticamente para fabricar um éster de 3-HP expressando genes que codificam enzimas possuindo atividade Iipase ou esterase. Em um exemplo específico, uma célula transformada que produz um éster de 3-HP pode incluir uma ou mais seqüências de ácido nucleico (tal como uma seqüência de ácido nucleico exógeno) que codifica uma proteína possuindo atividade Iipase ou esterase, e em alguns exemplos, a célula in- clui, adicionalmente, uma ou mais seqüências de ácido nucleico que codifi- cam uma proteína possuindo atividade de PEP carboxilase, atividade de pi- ruvato carboxilase, atividade de aspartato aminotransferase, atividade de aspartato descarboxilase, atividade de BAAT e atividade de 3-HP desidroge- nase.

Métodos de produção de um éster de 3-HP in vivo podem incluir, portanto, cultivo das células descritas sob condições suficientes para produ- ção do éster de 3-HP a partir de 3-HP. Em um exemplo específico, tais mé- todos para fabricação de ésteres de 3-HP incluem transfecção de uma célula com um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT, 3-HP desidrogenase e Iipase ou esterase e cultivo da célula transfec- tada de modo a permitir que a célula transfectada fabrique um éster de 3- HP. O éster de 3-HP resultante pode ser isolado a partir do meio de cultura de célula ou extraído das células para uso.

Métodos de produção um éster de 3-HP a partir de 3-HP in vitro também são providos. A conversão de 3-HP em um éster de 3-HP pode ser obtida por contato do 3-HP com uma enzima possuindo atividade Iipase ou esterase para formar um éster de 3-HP. Estas conversões também podem ser realizadas empregando uma combinação de métodos in vivo e in vitro.

A formação de um éster de 3-HP durante fermentação in vivo ou em um ensaio in vitro pode ser analisada empregando métodos descritos no US 20040076982A1. Exemplo 16

Produção de 1,3-propanodiol

Este exemplo descreve métodos de produção 1,3-propanodiol e células que podem produzir 1,3-propanodiol. Um versado na técnica aprecia- rá que embora enzimas específicas sejam descritas, as mesmas enzimas de outras espécies podem ser usadas (bem como enzimas variantes), por e- xemplo, dependendo da célula do hospedeiro na qual a produção de 1,3- propanodiol é desejada. 1,3-propanodiol pode ser gerado a partir de 3-HP (figura 1). Por

exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo 3-HP (tal como aquelas descritas no Exemplo 14) podem ser construídas geneticamente para fabricar 1,3-propanodiol expressando moléculas de ácido nucleico que codificam enzimas possuindo atividades de aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-) e álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1).

Por exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo 3-HP podem ser construídas geneticamente para fabricar 1,3-propanodiol expressando genes que codificam enzimas possuindo atividade de aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-) e atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1)). Em um exemplo específico, uma célula transformada que produz 3-HP pode incluir uma ou mais seqüências de ácido nucleico (tal como uma seqüência de ácido nucleico exógeno) que codificam uma proteína possuin- do atividade de aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-) e atividade de álcool de- sidrogenase (EC 1.1.1.1), e, em alguns exemplos, a célula inclui, adicional- mente, uma ou mais seqüências de ácido nucleico que codificam uma prote- ína possuindo atividade de PEP carboxilase, atividade de piruvato carboxila- se, atividade de aspartato aminotransferase, atividade de aspartato descar- boxilase, atividade de BAAT e atividade de 3-HP desidrogenase.

Métodos de produção de 1,3-propanodiol in vivo podem incluir, portanto, cultivo das células descritas sob condições suficientes para produ- ção de 1,3-propanodiol a partir de 3-HP. Em um exemplo específico, tais métodos para fabricação de 1,3-propanodiol incluem transfectação de uma célula com um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxi- lase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxi- lase, BAAT, 3-HP desidrogenase, atividade de aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.-), atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) e cultivo da célula transfectada de modo a permitir que a célula transfectada fabrique 1,3- propanodiol. O 1,3-propanodiol resultante pode ser isolado do meio de cultu- ra da célula ou extraído das células para uso.

Métodos de produção 1,3-propanodiol a partir de 3-HP in vitro também são providos. 3-HP pode ser convertido em 1,3-propanodiol por contato do 3-HP com enzimas possuindo atividade de aldeído desidrogena- se (EC 1.2.1.-) e atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1). Alternati- vamente, podem ser usados métodos químicos de produção in vitro de 1,3- propanodiol a partir de 3-HP, tal como o método descrito no US 2005/0283029 por Meng, Tsobanakis e Abraham. A formação de 1,3-propanodiol durante fermentação ou em um

processo in vitro pode ser analisada empregando uma Cromatografia de Lí- quido de Alto Desempenho (HPLC). A separação cromatográfica pode ser obtida por emprego de uma coluna de troca de íon Bio-Rad 87H. Uma fase móvel de ácido sulfúrico a 0,01 N é passada a uma taxa de circulação de 0,6 mL/minuto e a coluna mantida a uma temperatura de 45-65°C. A presença de 1,3-propanodiol na amostra pode ser detectada empregando um detector de índice de refração (Skraly e outros Appl. Environ. Microbiol. 64:98-105, 1998).

Exemplo 17

Produzindo 3-HP polimerizado

Este exemplo descreve métodos para produção de 3-HP polime- rizado, e células que podem produzir 3-HP polimerizado. Um versado na técnica apreciará que embora enzimas específicas sejam descritas, as mesmas enzimas de outras espécies podem ser usadas (bem como enzimas variantes), por exemplo, dependendo da célula do hospedeiro na qual a pro- dução de 3-HP polimerizado é desejada. 3-HP polimerizado pode ser gerado a partir de 3-HP (figura 1).

Por exemplo, células (tal como um micro-organismo) produzindo 3-HP (tais como aquelas descritas no Exemplo 14) podem ser construídas genetica- mente para fabricar 3-HP polimerizado expressando moléculas de ácido nu- cleico que codificam enzimas possuindo atividade de esterase. Por exemplo, células produzindo 3-HP (tais como aquelas des-

critas no Exemplo 14) podem ser construídas geneticamente para fabricar 3- HP polimerizado por expressão de um gene que codifica uma enzima possu- indo atividade de esterase. Em um exemplo específico, uma célula transfor- mada que produz 3-HP polimerizado pode incluir uma ou mais seqüências de ácido nucleico (tal como uma seqüência de ácido nucleico exógeno) que codifica uma proteína possuindo atividade de esterase, e, em alguns exem- plos, a célula inclui, adicionalmente, uma ou mais seqüências de ácido nu- cleico que codificam uma proteína possuindo atividade de PEP carboxilase, atividade de piruvato carboxilase, atividade de aspartato aminotransferase, atividade de aspartato descarboxilase, atividade de BAAT e atividade de 3- HP desidrogenase.

Métodos para produção de 3-HP polimerizado in vivo podem in- cluir, portanto, cultivo das células descritas sob condições suficientes para produzir 3-HP polimerizado a partir de 3-HP. Em um exemplo específico, tais métodos para fabricação de 3-HP polimerizado incluem transfectação de uma célula com um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando PEP carboxilase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxilase, BAAT, 3-HP desidrogenase e atividade de esterase, além do cultivo da célula transfectada de modo a permitir que a célula transfectada fabrique 3-HP polimerizado. O 3-HP polimerizado resultante pode ser isolado a partir do meio de cultura de célula ou extraído das células para uso.

Métodos para produção de 3-HP polimerizado a partir de 3-HP in

vitro também são providos. A conversão de 3-HP em 3-HP polimerizado po- de ser obtida por contato do 3-HP com uma enzima possuindo atividade de esterase para formar 3-HP polimerizado. Estas conversões também podem ser realizadas empregando uma combinação de métodos in vivo e in vitro. A formação de 3-HP polimerizado durante fermentação in vivo

ou em um ensaio in vitro pode ser analisada empregando HPLC de exclusão por tamanho. Exemplo 18

Síntese de peptídeo e purificação

As enzimas descritas neste documento, tais como, PEP carboxi-

lase, piruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, aspartato descarboxi- lase, BAAT, 3-hidroxipropionato desidrogenase, lipase, esterase, aldeído desidrogenase e álcool desidrogenase (e variantes das mesmas que man- têm a atividade enzimática desejada) podem ser sintetizadas quimicamente por qualquer número de métodos de síntese manuais ou automatizados co- nhecidos na técnica. Tais peptídeos sintetizados podem ser usados em uma reação in vitro para produzir o produto final desejado.

Por exemplo, a síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) é rea- lizada em uma escala de 0,25 milimol (mmol) empregando um Sintetizador de Peptídeo da Biosystems Modelo 431A e utilizando proteção de término amino (Fmoc) de 9-fluorenilmetiloxicarbonila, acoplando com dicicloexilcar- bodiimida/hidroxibenzotriaol ou 2-(1 H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilu- rônio hexafluorfosfato/hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBT) e empregando p- hidroximetilfenoximetilpoliestireno (HMP) ou resina Sasrin para ácidos de terminação carboxila ou resina de amida Rink para amidas de término car- boxila.

Aminoácidos derivatizados Fmoc são preparados a partir dos aminoácidos precursores apropriados por tritilação e trifenilmetariol e ácido trifluoracético, seguido por derivatização de Fmoc, conforme descrito por Atherton e outros (Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press: oxford, 1989).

Os peptídeos ligados à resina Sasrin são clivados empregando uma solução de TFA a 1% em diclorometano para render o peptídeo prote- gido. Caso apropriado, os precursor de peptídeo protegidos são ciclizados entre os términos amino e carboxila por reação da amina isenta de terminal amina e ácido isento de terminal carboxila empregando difenilfoforilazida nos peptídeos nascentes, onde as cadeias laterais de amino são protegidas. Produtos ligados à resina de amida Rink ou HMP são rotineira-

mente clivados e peptídeos cliclizados contendo cadeia lateral protegida desprotegidos usando uma solução compreendida de ácido trifluoracético (TFA)1 opcionalmente também compreendendo água, tioanisol e etanoditiol, em razões de 100:5:5:2,5 por meia a três horas a temperatura ambiente. Os peptídeos brutos são purificados por cromatografia de líquido

de pressão alta preparatória (HPLC), por exemplo, usando coluna Waters Delta-Pak C18 e eluição de gradiente com 0,1% de TFA em água modificada com acetonitrila. Após eluição da coluna, a acetonitrila é evaporada das fra- ções eluídas que são então liofilizadas. A identidade de cada produto assim produzido e purificado pode ser confirmada por espectroscopia de massa com bombardeamento rápido de átomos (FABMS) ou espectroscopia de massa de electrospray (ESMS).

Em vista das muitas concretizações possíveis às quais os prin- cípios da invenção descrita podem se aplicados, seria reconhecido que as concretizações ilustradas são apenas exemplos da invenção e não devem ser tidas como limitando o escopo da invenção. Ao invés disto, o escopo da invenção será definido pelas reivindicações que se seguem. Portanto, reivin- dica-se como nossa invenção tudo que estiver dentro do escopo e espírito das reivindicações que se seguem. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Cargill Incorporated

<120> BETA-ALANINA/ALFA-CETOGLUTARATO AMINOTRANSFERASE PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIPROPIÔNICO.

<130> 6682-76022-03

<150> US 60/824,031

<151> 2006-08-30

<160> 59

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 1

cgggatccct aaaccgtgta ctcgtcc 27

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 2

ggaattccat atgacccctc agccgaatc 29

<210> 3

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitílís

<400> 3

atgacccctc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccact cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120

gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180

ttcaccaaca tcgggtacca gcaccccaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg 240

agcctgacca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc 300

atcgccgagc ggacgcccgg agacctcgac aagatcttct tcaccaacgg cggggccgac 360

gccatcgagc acgccgtgcg catggcgcgg atacacgccg ggcggcccaa ggtgctgtcc 420

gcctaccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600 gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag 900

accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc 960

gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020

aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc 1080

gtgggcgagg tgcgcggtgt cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140

acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200

ttcggtgccg ccgccaaggc gaacggcctg tggccgttca tcaacatgaa ccgcacgcac 1260

gtcgtgcccc cgtgcaacgt cacggaggcc gaggccaagg aaggcctggc ggccctcgac 1320

gcggccctct cggtggcgga cgagtacacg gtttag 1356

<210> 4

<211> 451

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu

Met Thr Pro Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

10 15

Asp Arg Ala His Val Phe His Ser Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp

25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile

50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala Ala Arg Ile His Ala Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 340 345 350

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 355 360 365

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro 370 375 380

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 385 390 395 400 Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu

Tyr Thr Val 450

<210> 5

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 5

atgacccctc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccaca cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120

gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180

ttcaccaaca tcgggtacca gcaccccaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg 240

agcctgacca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc 300

atcgccgagc ggacgcccgg agacctcgac aagatcttct tcaccaacgg cggggccgac 360

gccatcgagc acgccgtgcg catggcgcgg atacacgccg ggcggcccaa ggtgctgtcc 420

gcctaccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc, ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600

gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag 900

accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc 960

gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020

aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc 1080

gtgggcgagg tgcgcggtgt. cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140

acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200

ttcggtgccg ccgccaaggc. gaacggcctg tggccgttca tcaacatgaa ccgcacgcac 1260

gtcgtgcccc cgtgcaacgt cacggaggcc gaggccaagg aaggcctggc ggccctcgac 1320

gcggccctct cggtggcgga cgagtacacg gtttag 1356 <210> 6

<211> 451

<212> PRT

<213> Streptomyces avermítílis

<400> 6

Met Thr Pro Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

10 15

Asp Arg Ala His Val Phe His Thr Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile 50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala 65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 85 90 95

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile 100 105 110

Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 115 120 125

Ala Arg Ile His Ala Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile VaI Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240 Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 340 345 350

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 355 360 365

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro 370 375 380

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 385 390 395 400

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met 405 410 415

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala 420 425 430

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu 435 440 445

Tyr Thr Val 450

<210> 7

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 7

atgacccctc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccact cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120 gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180 ttcaccaaca tcgggtacca gcaccccaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg 240

agcctggcca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc 300

atcgccgagc ggacgcccgg agacctcgac aagatcttct tcaccaacgg cggggccgac 360

gccatcgagc acgccgtgcg catggcgcgg atacacgccg ggcggcccaa ggtgctgtcc 420

gcctaccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600

gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag 900

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gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020

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gtgggcgagg tgcgcggtgt cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140

acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200

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<210> 8

<211> 451

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitílis

<4 00> 8

Met Thr Pro Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala

Asp Arg Ala His Val Phe His Ser Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile Ser Leu Ala Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 85 90 95

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile 100 105 110

Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 115 120 125

Ala Arg Ile His Ala Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Thr Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Gly Pro Gly Leu Arg 340 345 350 Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu

Tyr Thr Val 450

<210> 9

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 9

atgacccctc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccaca cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120

gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180

ttcaccaaca tcgggtacca gcaccccaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg 240

agcctgacca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc 300

atcgccgagc ggacgcccgg agacctcgac aagatcctct tcaccaacgg cggggccgac 360

gccatcgagc acgccgtgcg catggcgcgg atacacgccg ggcggcccaa ggtgctgtcc 420

gcataccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600

gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag 900

accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc 960

gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020 aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc 1080 gtgggcgagg tgcgcggtgt cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140 acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200 ttcggtgccg ccgccaaggc gaacggcctg tggccgttca tcaacatgaa ccgcacgcac 1260 gtcgtgcccc cgtgcaacgt cacggaggcc gaggccaagg aaggcctggc ggccctcgac 1320 gcggccctct cggtggcgga cgagtacacg gtttag 1356

<210> 10

<211> 451

<212> PRT

<213> Stceptomyces avermitilis

<4 00> 10

Met Thr Pro Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

10 15

Asp Arg Ala His Val Phe His Thr Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile 50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val VaI Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala 65 7 0 75 80

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 85 90 95

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile 100 105 110

Leu Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 115 120 125

Ala Arg Ile His Ala Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190 Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 340 345 350

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 355 360 365

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro

370 375 380

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 385 390 395 400

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met 405 410 415

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala 420 425 430

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu 435 440 445

Tyr Thr Val 450 <210> 11

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis

<4 00> 11

atgacccccc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccaca cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120

gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180

ttcaccaaca tcgggtacca gcaccccaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg 240

agcctgacca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc 300

atcgccgagc ggacgcccgg agacctcgac aagatcctct tcaccaacgg cggggccgac 360

gccatcgagc acgccgtgcg catggcgcgg atacacaccg ggcggcccaa ggtgctgtcc 420

gcataccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600

gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

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accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc 960

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aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc 1080

gtgggcgagg tgcgcggtgt cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140

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<210> 12

<211> 451

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 12

Met Thr Pro Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

Asp Arg Ala His Val Phe His Thr Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile 50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala 65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 85 90 95

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile 100 105 110

Leu Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 115 120 125

Ala Arg Ile His Thr Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met. Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

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Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300 Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 340 345 350

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 355 360 365

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro 370 375 380

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 385 390 395 400

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met 405 410 415

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala 420 425 430

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu 435 440 445

Tyr Thr Val 450

<210> 13

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermítílis

<400> atgacccatc 13 agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat gtcttccact cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc ttcaccaaca tcgggtacca gcaccccaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg agcctgacca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc atcgccgagc ggacgcccgg agacctcgac aagatcttct tcaccaacgg cggggccgac gccatcgagc acgccgtgcg catggcgcgg atacacgccg ggcggcccaa ggtgctgtcc gcctaccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag 900

accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc 960

gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020

aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc 1080

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acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200

ttcggtgccg ccgccaaggc gaacggcctg tggccgttca tcaacatgaa ccgcacgcac 1260

gtcgtgcccc cgtgcaacgt cacggaggcc gaggccaagg aaggcctggc ggccctcgac 1320

gcggccctct cggtggcgga cgagtacacg gtttag 1356

<210> 14

<211> 451

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 14

Met Thr His Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile

Asp Arg Ala His Val Phe His Ser Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile

50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala

65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu

Ala Arg Ile His Ala Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140 Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 340 345 350

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 355 360 365

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro 370 375 380

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 385 390 395 400

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met 405 410 415 Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala 420 425 430

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu 435 440 445

Tyr Thr Val 450

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotídeo sintético

<400> 15

aaggtacata tgacccatca gccgaatccc 30

<210> 16

<211> 1356

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 16

atgacccatc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccaca cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120

gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180

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gcataccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg tgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600

gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag

accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc

aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc

840 900 960

gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020

1080

gtgggcgagg tgcgcggtgt cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140 acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200 ttcggtgccg ccgccaaggc gaacggcctg tggccgttca tcaacatgaa ccgcacgcac 1260 gtcgtgcccc cgtgcaacgt cacggaggcc gaggccaagg aaggcctggc ggccctcgac 1320

1356

gcggccctct cggtggcgga cgagtacacg gtttag <210> 17 <211> 451 <212> PRT <213> Streptomyces avermítílís <4 00> 17

Met Thr His Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala 10 15

Asp Arg Ala His Val Phe His Thr Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp 40 45

Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile 50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala 65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 85 90 95

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asp Lys Ile 100 105 110

Leu Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 115 120 125

Ala Arg Ile His Thr Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205 Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys

290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320

Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val 325 330 335

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg 340 345 350

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly 355 360 365

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro 370 375 380

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala 385 390 395 400

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met 405 410 415

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala 420 425 430

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu 435 440 445

Tyr Thr Val 450

<210> 18 <211> 1356

<212> DNA <213> Streptomyces avermitilis

<4 00> 18

atgacccatc agccgaatcc ccaggtcggt gccgccgtca aggccgcgga ccgtgcgcat 60

gtcttccaca cctggtcagc gcaggagctc atcgacccgc tcgccgtcgc cggtgcggag 120

gggtcgtact tctgggacta cgacggcagg cggtacctgg acttcaccag cggactcgtc 180

ttcaccaaca tcgggtacca gcaccctaag gtcgtcgccg ccattcagga gcaggccgcg 240

agcctgacca ccttcgcgcc cgccttcgcc gtcgaggcgc ggtccgaggc ggcccggctc 300

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gccatcgagc acgccgtgcg gatggcgcgg atacacaccg ggcggcccaa ggtgctgtcc 420

gcataccgct cctaccacgg tggcacccag caggccgtca acatcaccgg cgatccgcgc 480

cgctgggcct ccgacagcgc ctcggcgggc gtcgtgcact tctgggcgcc gtacctctac 540

cggtcgcgct tctacgcgga gaccgagcag caggagtgtg agcgggcgct ggagcacctg 600

gagacgacca tcgccttcga ggggccgggc acgatcgccg cgatcgtgct ggagaccgtt 660

ccggggaccg cggggatcat ggttccgccg cccggatatc tcgccggggt gcgtgagctg 720

tgcgacaagt acggcatcgt cttcgtcctg gacgaggtga tggccgggtt cggacggacc 780

ggtgagtggt tcgccgcgga tctcttcgac gtcacacccg acctgatgac cttcgccaag 840

ggcgtgaact ccggatatgt gccgctgggc ggtgtcgcga tctccgggaa gatcgccgag 900

accttcggga agcgggccta cccgggcggt ctgacctact ccgggcatcc gctcgcctgc 960

gccgccgccg tcgccacgat caacgtcatg gccgaggagg gggtcgtcga gaacgcggcg 1020

aacctcggcg cccgggtcat cgagccgggg ctgcgcgagc tggccgagcg gcacccgtcc 1080

gtgggcgagg tgcgcggtgt cggcatgttc tgggcgctgg agctggtcaa ggaccgggag 1140

acgcgggagc cgctggtgcc gtacaacgcg gcgggcgagg cgaacgcgcc gatggccgcc 1200

ttcggtgccg ccgccaaggc gaacggcctg tggccgttca tcaacatgaa ccgcacgcac 1260

gtcgtgcccc cgtgcaacgt cacggaggcc gaggccaagg aaggcctggc ggccctcgac 1320

gcggccctct. cggtggcgga cgagtacacg gtttag 1356

<210> 19

<211> 451

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<4 00> 19

Met Thr His Gln Pro Asn Pro Gln Val Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala

Asp Arg Ala His Val Phe His Thr Trp Ser Ala Gln Glu Leu Ile Asp 25 30

Pro Leu Ala Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Tyr Phe Trp Asp Tyr Asp Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Phe Thr Ser Gly Leu Val Phe Thr Asn Ile

50 55 60

Gly Tyr Gln His Pro Lys Val Val Ala Ala Ile Gln Glu Gln Ala Ala 65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Phe Ala Pro Ala Phe Ala Val Glu Ala Arg Ser Glu 85 50 95

Ala Ala Arg Leu Ile Ala Glu Arg Thr Pro Gly Asp Leu Asn Lys Ile 100 105 110

Leu Phe Thr Asn Gly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ala Val Arg Met 115 120 125

Ala Arg Ile His Thr Gly Arg Pro Lys Val Leu Ser Ala Tyr Arg Ser 130 135 140

Tyr His Gly Gly Thr Gln Gln Ala Val Asn Ile Thr Gly Asp Pro Arg 145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ala Gly Val Val His Phe Trp Ala 165 170 175

Pro Tyr Leu Tyr Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Glu Thr Glu Gln Gln Glu 180 185 190

Cys Glu Arg Ala Leu Glu His Leu Glu Thr Thr Ile Ala Phe Glu Gly 195 200 205

Pro Gly Thr Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Thr Val Pro Gly Thr Ala 210 215 220

Gly Ile Met Val Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu 225 230 235 240

Cys Asp Lys Tyr Gly Ile Val Phe Val Leu Asp Glu Val Met Ala Gly 245 250 255

Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala Ala Asp Leu Phe Asp Val Thr 260 265 270

Pro Asp Leu Met Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ser Gly Tyr Val Pro 275 280 285

Leu Gly Gly Val Ala Ile Ser Gly Lys Ile Ala Glu Thr Phe Gly Lys 290 295 300

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Cys 305 310 315 320 Ala Ala Ala Val Ala Thr Ile Asn Val Met Ala Glu Glu Gly Val Val

Glu Asn Ala Ala Asn Leu Gly Ala Arg Val Ile Glu Pro Gly Leu Arg

Glu Leu Ala Glu Arg His Pro Ser Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly

Met Phe Trp Ala Leu Glu Leu Val Lys Asp Arg Glu Thr Arg Glu Pro

Leu Val Pro Tyr Asn Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ala Pro Met Ala Ala

Phe Gly Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gly Leu Trp Pro Phe Ile Asn Met

Asn Arg Thr His Val Val Pro Pro Cys Asn Val Thr Glu Ala Glu Ala

Lys Glu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Ala Asp Glu

Tyr Thr Val 450

<210> 20 <211> 897

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<4 00> 20

atgaccgaca tcgcattcct cggcctgggc aacatgggtg ggccgatggc cgccaacctg 60

ctcaaggccg gccaccgggt gaatgtcttc gacttgcagc ccaaggccgt gctgggcctg 120 gtcgagcagg gcgcgcaggg cgccgatagc gccttgcagt gctgcgaagg cgccgaagtg 180 gtgatcagca tgctgccggc cgggcagcac gtggaaagcc tgtatctcgg cgacgacggc 240 ctgctcgcgc gggtcgccgg caagcccctg ctgatcgact gctcgaccat cgccccggag 300 accgcgcgca aggtcgccga ggccgccgcg gcgaagggcc tgaccctgct cgacgcgccg 360 gtttccggcg gcgtcggcgg cgcccgcgcc ggcaccctga gcttcatcgt cggcggcccc 420 gccgaaggct tcgcgcgggc ccggccggtc ctcgagaaca tgggccggaa catcttccac 480 gccggcgatc acggcgccgg ccaggtggcg aagatctgca acaacatgct cctcggcatc 540 ctcatggccg gcaccgccga ggccctggcg ctgggggtga agaacggcct cgacccggcg 600 gtgctgtccg aggtgatgaa gcagagttcc ggcggcaact gggcgctgaa cctctacaac 660 ccctggcccg gggtgatgcc gcaggcgccg gcgagcaacg gctatgccgg cggtttccag 720 gtgcgcctga tgaacaagga cctcggcctg gcgctggcca acgcccaggc ggtgcaggcc 780 tcgacgccgc tcggcgcgct ggcgcgcaac ctgttcagcc tgcacgccca ggccgatgcc 840 gagcacgagg ggctggactt ctccagcatc cagaagctct accgcggcaa ggactga 897

<210> 21 <211> 298 <212> PRT <213> Pseudomonas aerugínosa <400> 21 Met Thr Asp Ile Ala Phe Leu Gly Leu

15

Ala Ala Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Val Asn Val Phe Asp Leu 25 30

Gln Pro Lys Ala Val Leu Gly Leu Val Glu Gln Gly Ala Gln Gly Ala 40 45

Asp Ser Ala Leu Gln Cys Cys Glu Gly Ala Glu Val Val Ile Ser Met 50 55 60

Leu Pro Ala Gly Gln His Val Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Asp Asp Gly 65 70 75 80

Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Asp Cys Ser Thr 85 90 95

Ile Ala Pro Glu Thr Ala Arg Lys Val Ala Glu Ala Ala Ala Ala Lys IuO 105 Ilu

Gly Leu Thr Leu Leu Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Val Gly Gly Ala 115 120 125

Arg Ala Gly Thr Leu Ser Phe Ile Val Gly Gly Pro Ala Glu Gly Phe 130 135 140

Ala Arg Ala Arg Pro Val Leu Glu Asn Met Gly Arg Asn Ile Phe His 145 150 155 160

Ala Gly Asp His Gly Ala Gly Gln Val Ala Lys Ile Cys Asn Asn Met 165 170 175

Leu Leu Gly Ile Leu Met Ala Gly Thr Ala Glu Ala Leu Ala Leu Gly 180 185 190

Val Lys Asn Gly Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Glu Val Met Lys Gln 195 200 205

Ser Ser Gly Gly Asn Trp Ala Leu Asn Leu Tyr Asn Pro Trp Pro Gly 210 215 220 Val Met Pro Gln Ala Pro Ala Ser Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Gln 225 230 235 240

Val Arg Leu Met Asn Lys Asp Leu Gly Leu Ala Leu Ala Asn Ala Gln 245 250 255

Ala Val Gln Ala Ser Thr Pro Leu Gly Ala Leu Ala Arg Asn Leu Phe 260 265 270

Ser Leu His Ala Gln Ala Asp Ala Glu His Glu Gly Leu Asp Phe Ser 275 280 285

Ser Ile Gln Lys Leu Tyr Arg Gly Lys Asp 290 295

<210> 22

<211> 1387

<212> DNA

<213> Alcaligenes faecalis

<220>

<221> CDS

<222> (408) .. (1304)

<4 00> 22

cattacacag gctctgcagc agtggcaggg cagtgccgac ccctggttgt cccgtgccgc 60

gcaaaccttc gccaaaggtg cgcctggttc ggctcgtttg tcctttgagc tgctggagag 120

ggtgcatcac ctgtctttgg ccgatgtttt ccgtctggaa tacattgtgt cgctgcaatg 180

tggcgtacag ggcgacttcc aggaaggcat acgggcactg ctgattgata aagacaaaca 240

gccgcgctgg aatcctgcct cgctggaaca ggcggatgca cgctgggtgg aacgtttttt 300

tgttcctgcc tggccggcag aaacgactca tcccttggct gacctgtaac ccaggcagac 360

cgctgcggcg ccagacggcg ccgctttcat aatgacgagg agacaaa atg agt aac 416

Met Ser Asn 1

acg att gca ttt ate ggg ctg ggc cat atg ggt aaa ccc atg gcg ctg Thr Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly His Met Gly Lys Pro Met Ala Leu 10 15

caa gcc atg cag gaa ctg cag gca gca ggg gca cag gtg ggg gaa tcg

Gln Ala Met Gln Glu Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gln Val Gly Glu Ser

40 45 50

gcg gtg caa ate gcc caa gac gcg cag atg gtc ttt acc atg ctg cct

Ala Val Gln Ile Ala Gln Asp Ala Gln Met Val Phe Thr Met Leu Pro

55 60 65

gct ggc cgc cat gtt cgt cag gtt tac gag ggc gag aac ggc ttg ctg

Ala Gly Arg His Val Arg Gln Val Tyr Glu Gly Glu Asn Gly Leu Leu 70 75 80

464

aat ctg ctc aaa gcc ggt cat age ctg aac gtc ttt gac ttg aat gcg 512

Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Ser Leu Asn Val Phe Asp Leu Asn Ala 25 30 35

560

608

656 cag act gtg gcc ccc ggt acg gtg ctg gtc gat tgc age acc att gat 704

Gln Thr Val Ala Pro Gly Thr Val Leu Val Asp Cys Ser Thr Ile Asp 85 90 95

gcg caa acc age cag gat ctg gcg gcc aaa gcc age aag ctg ggt ctg 752

Ala Gln Thr Ser Gln Asp Leu Ala Ala Lys Ala Ser Lys Leu Gly Leu

100 105 110 115

ttc atg ctg gat gcg ccg gtc tcc ggt ggg acc ggt ggc gcc att gct 800

Phe Met Leu Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ile Ala 120 125 130

ggc acc ttg acc ttt atg gtc ggg ggc gag gat cag gcc ctg gaa aag 848

Gly Thr Leu Thr Phe Met Val Gly Gly Glu Asp Gln Ala Leu Glu Lys 135 140 145

gcg cgc cct tac ttg gat gcc atg ggc aag aac att ttc cac gcg ggt 896

Ala Arg Pro Tyr Leu Asp Ala Met Gly Lys Asn Ile Phe His Ala Gly 150 155 160

aaa gcc ggt gcg ggt cag gtt gcc aag att tgc aac aat atg ctc ttg 944

Lys Ala Gly Ala Gly Gln Val Ala Lys Ile Cys Asn Asn Met Leu Leu 165 170 175

ggg att ttg atg gcg ggt act gct gaa gcc ttg gct ttg ggc gtt gcc 992

Gly Ile Leu Met Ala Gly Thr Ala Glu Ala Leu Ala Leu Gly Val Ala

180 185 190 195

cac ggt ctg gac cct gcc gtg ctg tcg acc ate atg gcg cgc agt tcc 1040

His Gly Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Thr Ile Met Ala Arg Ser Ser 200 205 210

ggt cga aac tgg gea acc gag ctg tac aac ccc tgg cct ggg gtg atg 1088

Gly Arg Asn Trp Ala Thr Glu Leu Tyr Asn Pro Trp Pro Gly Val Met 215 220 225

ccg gat gta ccg gct tcg cgt gat tat cag ggc ggt ttt gcg acg ggc 1136

Pro Asp "vai Pro Ala Ser Arg Asp Tyr Gln Giy Giy Phe Aia Thr Giy 230 235 240

ctg atg ctc aaa gac ctg ggt ctg gea gcc gat gcg gct gtc age cag 1184

Leu Met Leu Lys Asp Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Ala Vai Ser Gln 245 250 255

aac age gcg acg cct ttg ggc gaa ctg gea cgt aac ctg ttc gcc ttg 1232

Asn Ser Ala Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Arg Asn Leu Phe Ala Leu

260 265 270 275

cac gcc gea caa ggt cag aat gea ggg ctg gat ttc tcc age att ctt 1280

His Ala Ala Gln Gly Gln Asn Ala Gly Leu Asp Phe Ser Ser Ile Leu

280 285 290

aat ttg tac cgt cag aag cac taa gttctggcag tgcgtagggc aggggctgca 1334

Asn Leu Tyr Arg Gln Lys His 295

gttccagcgc ctgtccttgc tccaattgaa actggccttg ttccaggtcc gcc 1387

<210> 23

<211> 298

<212> PRT

<213> Alcaligenes faecalis

<4 00> 23 Met Ser Asn Thr Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly His Met Gly Lys Pro 10 15

Met Ala Leu Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Ser Leu Asn Val Phe Asp 25 30

Leu Asn Ala Gln Ala Met Gln Glu Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gln Val 40 45

Gly Glu Ser Ala Val Gln Ile Ala Gln Asp Ala Gln Met Val Phe Thr

50 55 60

Met Leu Pro Ala Gly Arg His Val Arg Gln Val Tyr Glu Gly Glu Asn 65 70 75 80

Gly Leu Leu Gln Thr Val Ala Pro Gly Thr Val Leu Val Asp Cys Ser 85 90 95

Thr Ile Asp Ala Gln Thr Ser Gln Asp Leu Ala Ala Lys Ala Ser Lys 100 105 110

Leu Gly Leu Phe Met Leu Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly 115 120 125

Ala Ile Ala Gly Thr Leu Thr Phe Met Val Gly Gly Glu Asp Gln Ala 130 135 140

Leu Glu Lys Ala Arg Pro Tyr Leu Asp Ala Met Gly Lys Asn Ile Phe 145 150 155 160

His Ala Gly Lys Ala Gly Ala Gly Gln Val Ala Lys Ile Cys Asn Asn 165 170 175

Met Leu Leu Gly Ile Leu Met Ala Gly Thr Ala Glu Ala Leu Ala Leu 180 185 190

Gly Val Ala His Gly Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Thr Ile Met Ala 195 200 205

Arg Ser Ser Gly Arg Asn Trp Ala Thr Glu Leu Tyr Asn Pro Trp Pro 210 215 220

Gly Val Met Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Asp Tyr Gln Gly Gly Phe 225 230 235 240

Ala Thr Gly Leu Met Leu Lys Asp Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Ala 245 250 255

Val Ser Gln Asn Ser Ala Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Arg Asn Leu 260 265 270 Phe Ala Leu His Ala Ala Gln Gly Gln Asn Ala Gly Leu Asp Phe Ser 275 280 285

Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Gln Lys His 290 295

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotídeo sintético

<400> 24

tactgcggcc gcaagaagga gatatagata tgcgtattgc attcattggc 50

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciadores de nucleotídeo sintético

<4 00> 25

cctagtctag atcaatcctt cttgcgatac ccct 34

<210> 26

<211> 888

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

< 4 υ 0>

atgcgtattg cattcattgg cctgggcaac atgggcgcgc ccatggcccg caacctgatc aaggccgggc atcagctgaa cctgttcgac ctgaacaagg ccgtgctggc cgagctggca gaactgggcg ggcagatcag cccctcgccc aaggacgcgg cggccaacag cgagctggtg atcaccatgc tgccggccgc agcccatgtg cgtagcgtgt acttgaacga ggacggcgta ctggccggta ttcgtcctgg cacgccgacc gttgactgca gcaccatcga cccgcagacc gcacgtgacg tgtccaaggc cgcagcggca aagggcgtgg acatggggga tgcgccggtt tccggtggta ctggcggcgc ggcggccggc accctgacgt tcatggtcgg cgccagtacc gagttgttcg ccagcctcaa gccggtactg gagcagatgg gccgcaacat cgtgcactgc ggggaagtcg gtaccggcca gatcgccaag atctgcaaca acctgctgct cggcatttcg atgatcggcg tgtccgaggc catggccctg ggtaacgcgc tgggtatcga taccaaggtg ctggccggca tcatcaacag ttcgaccggg cgttgctgga gctcggacac ctacaacccg tggccgggca tcatcgaaac cgcacctgca tcgcgtggct acaccggtgg ctttggcgcc gaactcatgc tcaaggacct ggggttggcc accgaagcgg cacgccaggc acaccaaccg gtgattctcg gtgccgtggc ccagcagctg taccaggcca tgagcctgcg aggcgagggt ggcaaggact tctcggccat cgtagagggg tatcgcaaga aggattga

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 <210> 27

<211> 295

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<4 00> 27

Met Arg Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly Asn Met Gly Ala Pro Met Ala

10 15

Arg Asn Leu Ile Lys Ala Gly His Gln Leu Asn Leu Phe Asp Leu Asn 25 30

Lys Ala Val Leu Ala Glu Leu Ala Glu Leu Gly Gly Gln Ile Ser Pro 40 45

Ser Pro Lys Asp Ala Ala Ala Asn Ser Glu Leu Val Ile Thr Met Leu 50 55 60

Pro Ala Ala Ala His Val Arg Ser Val Tyr Leu Asn Glu Asp Gly Val 65 70 75 80

Leu Ala Gly Ile Arg Pro Gly Thr Pro Thr Val Asp Cys Ser Thr Ile 85 90 95

Asp Pro Gln Thr Ala Arg Asp Val Ser Lys Ala Ala Ala Ala Lys Gly 100 105 110

Val Asp Met Gly Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala 115 120 125

Ala Gly Tnr Leu Thr Phe Met Val Gly Ala Ser Thr Glu Leu Phe Ala 130 135 140

Ser Leu Lys Pro Val Leu Glu Gln Met Gly Arg Asn Ile Val His Cys 145 150 155 160

Gly Glu Val Gly Thr Gly Gln Ile Ala Lys Ile Cys Asn Asn Leu Leu 165 170 175

Leu Gly Ile Ser Met Ile Gly Val Ser Glu Ala Met Ala Leu Gly Asn 180 185 190

Ala Leu Gly Ile Asp Thr Lys Val Leu Ala Gly Ile Ile Asn Ser Ser 195 200 205

Thr Gly Arg Cys Trp Ser Ser Asp Thr Tyr Asn Pro Trp Pro Gly Ile 210 215 220

Ile Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Gly Ala 225 230 235 240 Glu Leu Met Leu Lys Asp Leu Gly Leu Ala Thr Glu Ala Ala Arg Gln 245 250 255

Ala His Gln Pro Val Ile Leu Gly Ala Val Ala Gln Gln Leu Tyr Gln 260 265 270

Ala Met Ser Leu Arg Gly Glu Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ala Ile Val 275 280 285

Glu Gly Tyr Arg Lys Lys Asp 290 295

<210> 28

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 28

ggaggtattt atatgcgtat ygcwttyaty gghctgggca acatgggcgc gcc 53

<210> <211> <212> <213> 29 888 DNA Pseudomonas putida <400> atgcgtattg 29 catttatcgg tctgggcaac atgggcgcgc ccatggcccg caacctgatc aaggccgggc atcagctgaa cctgttcgac ctgaacaagg ccgtgctggc cgagctggca gaactgggcg ggcagatcag cccctcgccc aaggacgcgg cggccaacag cgagctggtg atcaccatgc tgccggccgc agcccatgtg cgtagcgtgt acttgaacga ggacggcgta ctggccggta ttcgtcctgg cacgccgacc gttgactgca gcaccatcga cccgcagacc gcacgtgacg tgtccaaggc cgcagcggca aagggcgtgg acatggggga tgcgccggtt tccggtggta ctggcggcgc ggcggccggc accctgacgt tcatggtcgg cgccagtacc gagttgttcg ccagcctcaa gccggtactg gagcagatgg gccgcaacat cgtgcactgc ggggaagtcg gtaccggcca gatcgccaag atctgcaaca acctgctgct cggcatttcg atgatcggcg tgtccgaggc catggccctg ggtaacgcgc tgggtatcga taccaaggtg ctggccggca tcatcaacag ttcgaccggg cgttgctgga gctcggacac ctacaacccg tggccgggca tcatcgaaac cgcacctgca tcgcgtggct acaccggtgg ctttggcgcc gaactcatgc tcaaggacct ggggttggcc accgaagcgg cacgccaggc acaccaaccg gtgattctcg gtgccgtggc ccagcagctg taccaggcca tgagcctgcg aggcgagggt ggcaaggact tctcggccat cgtagagggg tatcgcaaga aggattga

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840

<210> <211>

30 747 <212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 30

atgatcgttt tagtaactgg agcaacggca ggttttggtg aatgcattac tcgtcgtttt attcaacaag ggcataaagt tatcgccact ggccgtcgcc aggaacggtt gcaggagtta aaagacgaac tgggagataa tctgtatatc gcccaactgg acgttcgcaa ccgcgccgct attgaagaga tgctggcatc gcttcctgcc gagtggtgca atattgatat cctggtaaat aatgccggcc tggcgttggg catggagcct gcgcataaag ccagcgttga agactgggaa acgatgattg ataccaacaa caaaggcctg gtatatatga cgcgcgccgt cttaccgggt atggttgaac gtaatcatgg tcatattatt aacattggct caacggcagg tagctggccg tatgccggtg gtaacgttta cggtgcgacg aaagcgtttg ttcgtcagtt tagcctgaat ctgcgtacgg atctgcatgg tacggcggtg cgcgtcaccg acatcgaacc gggtctggtg ggtggtaccg agttttccaa tgtccgcttt aaaggcgatg acggtaaagc agaaaaaacc tatcaaaata ccgttgcatt gacgccagaa gatgtcagcg aagccgtctg gtgggtgtca acgctgcctg ctcacgtcaa tatcaatacc ctggaaatga tgccggttac ccaaagctat gccggactga atgtccaccg tcagtaa <210> 31

<211> 248

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<4 00> 31

Met Ile Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Ala Gly Phe Gly Glu Cys Ile 10 15

Thr Arg Arg Phe Ile Gln Gln Gly His Lys Val Ile Ala Thr Gly Arg 25 30

Arg Gln Glu Arg Leu Gln Glu Leu Lys Asp Glu Leu Gly Asp Asn Leu 40 45

Tyr Ile Ala Gln Leu Asp Val Arg Asn Arg Ala Ala Ile Glu Glu Met 50 55 60

Leu Ala Ser Leu Pro Ala Glu Trp Cys Asn Ile Asp Ile Leu Val Asn 65 70 75 80

Asn Ala Gly Leu Ala Leu Gly Met Glu Pro Ala His Lys Ala Ser Val 85 90 95

Glu Asp Trp Glu Thr Met Ile Asp Thr Asn Asn Lys Gly Leu Val Tyr

100 105 110

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 747 Met Thr Arg Ala Val Leu Pro Gly Met Val Glu Arg Asn His Gly His 115 120 125

Ile Ile Asn Ile Gly Ser Thr Ala Gly Ser Trp Pro Tyr Ala Gly Gly 130 135 140

Asn Val Tyr Gly Ala Thr Lys Ala Phe Val Arg Gln Phe Ser Leu Asn 145 150 155 160

Leu Arg Thr Asp Leu His Gly Thr Ala Val Arg Val Thr Asp Ile Glu 165 170 175

Pro Gly Leu Val Gly Gly Thr Glu Phe Ser Asn Val Arg Phe Lys Gly 180 185 190

Asp Asp Gly Lys Ala Glu Lys Thr Tyr Gln Asn Thr Val Ala Leu Thr 195 200 205

Pro Glu Asp Val Ser Glu Ala Val Trp Trp Val Ser Thr Leu Pro Ala

210 215 220

His Val Asn Ile Asn Thr Leu Glu Met Met Pro Val Thr Gln Ser Tyr 225 230 235 240

Ala Gly Leu Asn Val His Arg Gln 245

<210> 32

<21i> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 32

ggtagacata tgatcgtttt agtaactgga gcaac 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 33

gttctcggat ccttactgac ggtggacatt cagtc

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético <400> 34

ggaattccat atgcatttaa atatgttaaa ate 33

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotídeo sintético

<400> 35

cccaagctttagccaattgtcccgtgcttttc 32

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificiai <220>

<223> Iniciadores de nucleotídeo sintético

<4 00> 36

ggaattccat atgctgcgta ccatgttcaa gtc 33

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotídeo sintético

<4 00> 37

28

dcacaagctt taggcgg tga cggcctgc <210> <211> <212> <213> 38 384 DNA Clostridii jm acetobutylicum <4 00> atgcatttaa 38 atatgttaaa atctaaaatt catagagcaa cagttgttca agctgattta aattatgttg gaagcataac tattgataga aaccttatgg ataaagccaa tatacttgaa tacgaaaagg tagagatage aaatataaat aatggtgcta gatttgaaac ctacgtaata gctggagaag ctggaagtgg aataatatgc cttaatggag ccgctgcaag atgtgcccaa gctggcgata aagtaataat tatgtgctat tgcagcttaa cacctgaaga agcatcagaa catagaccaa aagtcgtat t tgtaaatgat gacaatagta tatctaatgt tacagagtac gaaaagcacg ggacaattgg ctaa <210> <211> <212> 39 127 PRT

60 120 180 240 300 360 384

<213> Clostridium acetobutylicum

<400>

39 Met His Leu Asn Met Leu Lys Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Val 10 15

Gln Ala Asp Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Arg Asn Leu 25 30

Met Asp Lys Ala Asn Ile Leu Glu Tyr Glu Lys Val Glu Ile Ala Asn 40 45

Ile Asn Asn Gly Ala Arg Phe Glu Thr Tyr Val Ile Ala Gly Glu Ala 50 55 60

Gly Ser Gly Ile Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Cys Ala Gln 65 70 75 80

Ala Gly Asp Lys Val Ile Ile Met Cys Tyr Cys Ser Leu Thr Pro Glu 85 90 95

Glu Ala Ser Glu His Arg Pro Lys Val Val Phe Val Asn Asp Asp Asn 100 105 110

Ser Ile Ser Asn Val Thr Glu Tyr Glu Lys His Gly Thr Ile Gly 115 120 125

<210> 40

<211> 420

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitílis

<400> 40

atgctgcgta ccatgttcaa gtccaagatc caccgagcca ccgtcaccca ggccgacctg 60

cactacgtcg gatccgtcac catcgacgcc gatcttctgg acgccgccga tctgctgccc 120

ggcgagttgg ttcatatcgt cgacatcacc aacggtgccc gcctggagac gtacgtcatc 180

gagggcgagc gtggctccgg agtcgtcggg atcaacgggg cggcggccca tctcgtccac 240

cccggcgacc tggtgatcat catcagctac gctcaggttt ccgacgccga ggcgagggca 300

ctgcggccga gggtcgtgca cgtggaccgc gacaaccgcg tcgtggccct gggcgcggac 360

ccggccgagc cggtaccggg ctcggaccag gcgcgcagcc cgcaggccgt caccgcctga 420

<210> 41

<211> 139

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitílis

<400> 41

Met Leu Arg Thr Met Phe Lys Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Thr 10 15

Gln Ala Asp Leu His Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu 25 30 Leu Asp Ala Ala Asp Leu Leu Pro Gly Glu Leu Val His Ile Val Asp 40 45

Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Glu Gly Glu Arg 50 55 60

Gly Ser Gly Val Val Gly Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Val His 65 70 75 80

Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Ile Ser Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ala 85 90 95

Glu Ala Arg Ala Leu Arg Pro Arg Val Val His Val Asp Arg Asp Asn 100 105 110

Arg Val Val Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Glu Pro Val Pro Gly Ser 115 120 125

Asp Gln Ala Arg Ser Pro Gln Ala Val Thr Ala 130 135

<210> 42

<211> 69

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 42

taaacLLgLL accgttatca cattcaggag atggagaacc atgaaacaag tgtaggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 43

<211> 69

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 43

tcatggcatg tccttattat gacgggaaat gccacccttt ttaccttagc atatgaatat 60

cctccttag 69

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 44

gggatttggt tctcgcataa tc <210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 45

gtagggtcgt ctccgtaaac 20

<210> 46

<211> 65

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 46

aggatacagg gctatcaaac gataagatgg ggtgtctggg gtaatgtgta ggctggagct 60

gcttc 65

<210> 47

<211> 66

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 47

gagcatactg acattactac gcaatgcgga atattgttcg ttcatatgta cctttctcct 60

ctttaa 66

<210> 48

<211> 65

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 48

ccctgatagc ggacttccct tctgtaaeca taatggaacc tcgtcgtgta ggctggagct 60

gcttc

<210> 49

<211> 66

<2 12> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 49

gcccagaatc gggtcggcag gagcggcggt aatgttctca aacatatgta cctttctcct ctttaa

65

60 66 <210> 50

<211> 69

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 50

ctgtacccag gttttcccct ctttcacaga gcggcgagcc aaataaaaag tgtaggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 51

<211> 70

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 51

tcaacagctg tatccccgtt gagggtgagt tttgcttttg tatcagccac atgaatatcc 60

gccttagttc 70

<210> 52

<211> 263

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de nucleotideo de um lócus gltA modificado

<4 00> 52

cagagctctg tacccaggtt ttcccctctt tcacagagcg gcgagccaaa taaaaagtgt 60

aggctggagc tgcttcgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa 120 ctaaagcgga tattcatgtg gctgatacaa aagcaaaact caccctcaac ggggatacag 180 ctgttgaact ggatgtgctg aaaggcacgc tgggtcaaga tgttattgat atccgtactc 240 tcggttcaaa aggtgtgttc acc 263

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 53

gattcgccat ttattcgtca tc 22

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético <4 00> 54

ctgggtcaaa ggtgaacac 19

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<400> 55

gttttgcttt tgtatcagcc aca 23

<210> 56

<211> 69

<212> DNA

<213> Seqüência artificiai <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 56

gagcaatatc agaacgttaa ctaaatagag gcattgtgct gtgaatcttg tgtaggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 57

<211> 69

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 57

cgctgatttc ggtggaattc agttgcatgc tccagtcccc ttaagactgc atatgaatat 60

cctccttag

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 58

etctgctgcg tactcagttc 20

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciadores de nucleotideo sintético

<4 00> 59

24

gatcatttca ccctgcatac aatc

Claims (63)

1. Proteína isolada compreendendo pelo menos 80% de identi- dade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 4, 6, 10, 12, 14, 17 ou 19, onde a proteína apresenta atividade beta-alanina aminotransferase (BAAT).

2. Proteína isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína compreende uma seqüência apresentando pelo menos 95% de i- dentidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 4, 6, 10, 12, 14, 17 ou 19, onde a proteína apresenta atividade BAAT.

3. Proteína isolada de acordo com a reivindicação 1, onde a pro- teína compreende a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N0: 4, 6,10, 12, 14, 17 ou 19.

4. Proteína isolada de acordo com a reivindicação 1, onde a pro- teína isolada compreende de 1 a 10 substituições de aminoácido conservan- tes e apresenta atividade BAAT.

5. Proteína isolada de acordo com a reivindicação 1, onde a pro- teína inclui uma substituição de P3H, um substituição de S24T, uma substi- tuição de D110N, uma substituição de F113L, uma substituição de Α133T ou suas combinações.

6. Proteína isolada de acordo com a reivindicação 1, onde a pro- teína compreende pelo menos 50 aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID N°S: 4, 6, 10, 12, 14, 17 ou 19, e onde a proteína apresenta atividade BAAT.

7. Molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma se- qüência de ácido nucleico que codifica a proteína isolada como definido na reivindicação 1.

8. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindi- cação 7, operativamente ligada a uma seqüência promotora.

9. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindi- cação 7, onde a seqüência de ácido nucleico compreende pelo menos 80% ou pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação a seqüência de ácido nucleico mostrada em qualquer uma das SEQ ID N°s: 3, 5, 7, 9, 11,13, 16 ou 18.

10. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindi- cação 7, onde a seqüência de ácido nucleico compreende qualquer uma das SEQ ID N°s: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18.

11. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada como definido na reivindicação 7.

12. Molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada como definido na reivindicação 7.

13. Célula isolada transformada com a molécula de ácido nuclei- co recombinante como definido na reivindicação 12.

14. Célula isolada de acordo com a reivindicação 13, onde a cé- lula é uma célula procariótica.

15. Célula isolada de acordo com a reivindicação 13, onde a cé- lula é uma célula de planta.

16. Planta transgênica compreendendo a célula de planta como definido na reivindicação 15.

17. Planta transgênica compreendendo a molécula de ácido nu- cleico recombinante como definido na reivindicação 12.

18. Célula isolada de acordo com a reivindicação 13, onde a se- qüência de ácido nucleico isolada compreende uma seqüência de ácido nu- cleico apresentando pelo menos 80% de identidade em relação a SEQ ID N0: 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18, e onde a célula produz pelo menos 50% mais semialdeído de malonila de beta-alanina que na presença de uma seqüência de ácido nucleico de BAAT nativa.

19. Célula isolada de acordo com a reivindicação 18, onde a se- quência de ácido nucleico isolada compreende SEQ ID N0: 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18.

20. Célula isolada de acordo com a reivindicação 18, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena ou endógena que codifica uma 3-HP desidrogenase e onde a célula produz ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP).

21. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma Iipase ou esterase e que produz um éster de 3-HP.

22. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma esterase e que produz 3-HP polimerizado.

23. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena ou endógena que codifica uma álcool desidrogenase, uma aldeído desidro- genase ou ambas e onde a célula produz 1,3-propanodiol.

24. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a mo- lécula de ácido nucleico codificando uma 3-HP desidrogenase que codifica uma proteína apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em : relação a SEQ ID N0: 21, 23, 27 ou 31.

25. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a mo- lécula de ácido nucleico que codifica uma 3-HP desidrogenase compreende pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 20, 22, 26 ou 29.

26. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma aspartato descarboxilase.

27. Célula isolada de acordo com a reivindicação 26, onde a mo- lécula de ácido nucleico exógena que codifica uma aspartato descarboxilase compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína apresentando pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 39 ou 41.

28. Célula isolada de acordo com a reivindicação 26, onde a mo- lécula de ácido nucleico exógena que codifica uma aspartato descarboxilase compreende pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 38 ou 40.

29. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena ou endógena que codifica uma PEP carboxilase e uma molécula de ácido nucleico exógena ou endógena codificando uma aspartato aminotransferase.

30. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma piruvato carboxilase.

31. Célula isolada de acordo com a reivindicação 29, onde a mo- lécula de ácido nucleico que codifica PEP carboxilase inclui um promotor sintético operativamente ligado a PEP carboxilase.

32. Célula isolada de acordo com a reivindicação 29, onde a mo- lécula de ácido nucleico que codifica aspartato aminotransferase inclui um promotor sintético operativamente ligado a aspartato aminotransferase.

33. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula inclui uma mutação ΔροχΒ que diminui a formação de acetato pela célu- : Ia em pelo menos 20%.

34. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula inclui uma mutação AadhE ou AatpFH e onde a produção de 3-HP pela célula é aumentada em pelo menos 20% em comparação à ausência de Aa- dhe ou AaptFH.

35. Célula isolada de acordo com a reivindicação 20, onde a cé- lula inclui uma molécula de ácido nucleico exógena compreendendo pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 52.

36. Célula isolada compreendendo uma molécula de ácido nu- cleico exógena que codifica a SEQ ID N0: 6, 12, 17 ou 19, onde a expressão da molécula de ácido nucleico resulta em um aumento no ácido 3-hidro- xipropiônico (3-HP) na célula de pelo menos duas vezes, quando comparada à expressão de 3-HP na célula ausência da molécula de ácido nucleico exó- gena.

37. Célula isolada de acordo com a reivindicação 36, onde a ex- pressão da molécula de ácido nucleico codificando BAAT resulta em um aumento em 3-HP na célula de pelo menos duas vezes em comparação a expressão de 3-HP na célula, na presença de uma molécula de ácido nuclei- co exógena codificando SEQ ID N0: 4.

38. Célula transformada compreendendo uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica a proteína como definido na reivindicação 1.

39. Célula transformada de acordo com a reivindicação 38, onde a célula produz semialdeído de malonila de beta-alanina.

40. Célula transformada de acordo com a reivindicação 39, onde a célula produz 3-HP, um éster de 3-HP, polimerizado de 3-HP, 1,3-propa- nodiol ou suas combinações.

41. Método para fabricação de semialdeído de malonila de beta- alanina, compreendendo: cultivo da célula como definido na reivindicação 13 sob condi- ções que permitem que a célula fabrique semialdeído de malonila de beta- alanina.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, onde a célula : compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma aspartato descarboxilase.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, onde a molécula de ácido nucleico exógena codifica uma aspartato descarboxilase compre- endendo pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 38 ou 40.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, onde a molécula de ácido nucleico exógena compreende pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 39 ou 41.

45. Método de acordo com a reivindicação 42, onde a célula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena ou endógena que codifica uma PEP carboxilase e uma molécula de ácido nu- cleico exógena ou endógena codificando uma aspartato aminotransferase.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, onde a célula compreende, adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico exógena codi- ficando uma piruvato carboxilase.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, onde a molécula de ácido nucleico que codifica PEP carboxilase inclui um promotor sintético operativamente ligado a PEP carboxilase.

48. Método de acordo com a reivindicação 45, onde a molécula de ácido nucleico que codifica aspartato aminotransferase inclui um promo- tor sintético operativamente ligado a aspartato aminotransferase.

49. Método de acordo com a reivindicação 45, onde a célula in- clui uma mutação ΔροχΒ que diminui a formação de acetato pela célula em pelo menos 20%.

50. Método de acordo com a reivindicação 45, onde a célula in- clui um AadhE ou AatpFH, e onde produção de semialdeído de malonila pela célula é aumentada em pelo menos 20% em comparação à ausência de Aa- dhe ou AaptFH.

51. Método de acordo com a reivindicação 45, onde a célula in- clui uma molécula de ácido nucleico exógena compreendendo pelo menos 95% de identidade de seqüência em relação a SEQ ID N0: 52.

52. Método para fabricação de 3-HP, compreendendo: cultivo da célula isolada como definido na reivindicação 20 sob condições que permitem que a célula produza 3-HP a partir de semialdeído de malonila.

53. Método para fabricação de um éster de 3-HP, compreenden- do: cultivo da célula como definido na reivindicação 21 sob condi- ções que permitem que a célula produza o éster de 3-HP a partir de 3-HP.

54. Método para fabricação de 3-HP polimerizado, compreen- dendo: cultivo da célula como definido na reivindicação 22 sob condi- ções que permitem que a célula produza o 3-HP polimerizado a partir de 3- HP.

55. Método para fabricação de 1,3-propanodiol, compreendendo: cultivo da célula como definido na reivindicação 23 sob condi- ções que permitem que a célula produza o 1,3-propanodiol a partir de 3-HP.

56. Método para fabricação de 3-HP, compreendendo: purificação de semialdeído de malonila a partir da célula como definido na reivindicação 13; e contato do semialdeído de malonila com um peptídeo compre- endendo 3-atividade de hidroxipropionato desidrogenase para formar 3-HP.

57. Método para fabricação de 3-HP, compreendendo: transfecção da célula como definido na reivindicação 13 com uma molécula de ácido nucleico codificando um peptídeo compreendendo atividade de 3-HP desidrogenase; e cultivo da célula transfectada de modo a permitir que a célula transfectada fabrique 3-HP.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, onde a molécula de ácido nucleico que codificando um peptídeo compreendendo atividade de 3-HP desidrogenase compreende pelo menos 95% de identidade de se- quência em relação a SEQ ID N0: 20, 22, 26, 29 ou 30.

59. Método para fabricação de 1,3-propanodiol a partir de 3-HP, compreendendo: isolamento de 3-HP gerado empregando o método como defini- do na reivindicação 56; e contato de 3-HP com um peptídeo compreendendo atividade de álcool desidrogenase e um polipeptídeo que compreende a atividade de al- deído desidrogenase, pelo que gerando 1,3-propanodiol.

60. Método para fabricação de 3-HP polimerizado, compreen- dendo: isolamento de 3-HP gerado empregando o método como defini- do na reivindicação 56; e contato do 3-HP com um peptídeo compreendendo atividade de esterase pelo que gerando 3-HP polimerizado.

61. Método para fabricação de um éster 3-HP, compreendendo: isolamento de 3-HP gerado empregando método como definido na reivindicação 56; e contato do 3-HP com um peptídeo compreendendo atividade de Iipase ou esterase, pelo que gerando o éster 3-HP.

62. Método de acordo com a reivindicação 41, onde a célula é uma célula procariótica.

63. Agente de ligação específico que se liga especificamente à proteína como definido na reivindicação 1.