BRPI0620453A2

BRPI0620453A2 - composições farmaceuticas compreendendo antìgenos de ácido siálico de-n-acetila e anticorpos para os mesmos, e seus usos

Info

Publication number: BRPI0620453A2
Application number: BRPI0620453-8A
Authority: BR
Inventors: Gregory R Moe; Charles Paul Plested
Original assignee: Childrens Hosp & Res Ct Oakland
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2011-11-08
Also published as: JP5384941B2; CA2634755C; CR10143A; EP1976554A2; KR101462963B1; KR20080091777A; EP1976554A4; WO2007075921A3; MX2008008185A; AU2006331634B2; JP2009525947A; WO2007075921A2; EP1976554B1; CA2634755A1; ECSP088636A; AU2006331634A1

Abstract

COMPOSIçõES FARMACeUTICAS COMPREENDENDO ANTìGENOS DE áCIDO SIáLICO DE-N-ACETILA E ANTICORPOS PARA OS MESMOS, E SEUS USOS. A presente invenção refere-se, de modo geral, métodos e composições relacionados ao diagnóstico e/ou tratamento contra o câncer possuindo um antígeno de ácido siálico N-acetilado de superfície da célula, por exemplo, um gangliosídeo pelo menos parcialmente de-N-acetilado e/ou uma proteína de superfície de célula modificada com ácido siálico N- acetilado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO ANTÍGENOS DE ÁCIDO SIÁLICO DE-N-ACETILA E ANTICORPOS PARA OS MESMOS, E SEUS USOS"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. N0 de série 60/753.847, depositado em 23 de dezembro de 2005, pedi- do o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

ESTABELECIMENTO COM RELAÇÃO À PESQUIDA FEDERALMENTE CUSTEADA

A presente invenção foi feita com suporte do governo sob as concessões no. AI46464 e AI45642 outorgadas pelo National Institute of Al- lergy and Infectious Diseases e o National Institute of Health. O governo po- de ter determinados direitos sobre a presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em geral, o objetivo da imunoterapia anticâncer tem sido identifi- car antígenos estáveis que são altamente expressos, mas não saem ou são secretados de células tumorígenas, antígenos os quais podem, então, ser usados como a base de imunoterapia, por exemplo, como o antígeno em uma vacina para o câncer ou como um alvo para terapia de câncer anticor- po-baseada. Otimamente, tais antígenos de tumor também seriam aqueles que estimulam uma resposta imune que é aceitavelmente específica para as células alvo cancerígenas, de modo a reduzir efeitos colaterais prejudiciais que podem resultar de reatividade cruzada com células não cancerígenas do indivíduo que está sendo tratado. Onde reatividade cruzada afeta células que podem ser repovoadas, pode ser aceitável relaxar esse requisito para a especificidade de imunoterapia.

Por exemplo, embora outros anticorpos estejam disponíveis para uso no tratamento de leucemias/linfomas, a norma atual para terapia com anticorpo monoclonal (mAb) de linfoma não-Hodgkins é RITUXIMAB®, um mAb murino/humano quimérico que reconhece o antígeno CD20. CD20 é al- tamente expresso na maioria das células B maduras e linfomas de células B, exibe modulação lenta de expressão ou determinantes antigênicas e não sai ou é secretado. Embora esse anticorpo também se ligue ao CD20 sobre cé- lulas B não cancerígenas, essa população de células pode ser restaurada, por exemplo, através de tratamento de suporte com produtos terapêuticos de intensificação imune, tais como fator de estimulação de colônia de granulóci- to-macrófago (GM-CSF), eritropoietina (EPO) etc.

Regiões Fc de anticorpos que se ligam a antígenos na superfície celular podem mediar depósito de complemento e Iise de célula (citotoxici- dade complemento dependente ou CDC) ou citotoxicidade celular anticorpo- dependente (ADCC) através de ativação de células assassinas naturais (NK).

Embora não seja comum, anticorpos também podem ser citotó- xicos através de ligação a antígenos na superfície celular que afetam uma via de sinalização que leva à apoptose. Por exemplo, embora o mecanismo de ação do RITUXIMAB® não seja completamente compreendido, parece que ele exerce seus efeitos citotóxicos sobre células tumorígenas CD20- positivas através de uma combinação de CDC anticorpo-dependenté, ADCC e através de ativação de vias de sinalização celular que levam à apoptose. Com o sucesso do Rituximab, vários outros antígenos celulares foram objeti- vados com mAbs incluindo CD22, CD30 e CD80.

Além de imunoterapia passiva através de administração de anti- corpo, várias estratégias de imunização ativa também têm sido exploradas. Vacinas para o câncer exemplificativas envolvem administração de um antí- geno de tumor de modo a estimular respostas imunes celulares e/ou de anti- corpo humoral que são capazes de ativar complemento e morte opsonofa- gocitótica de células tumorígenas. Composições de vacina exemplificativas incluem aquelas baseadas em Iisatos de células tumorígenas e antígenos tumor-específicos (por exemplo, proteínas, gangliosídeos (Tai, T. et al., Int J Câncer, 1985. 35: 607-12), imunoglobulina antiidiotipo (Ig), etc. (Foon et al., Clin Oncol, 2000. 18: 376-84) ou fragmentos peptídicos de proteínas tu- mor-específicas ou superexpressas que são derivadas de cânceres não- autólogos e autólogos do mesmo tipo (Morioka et al., J Immunol1 1994. 153: 5650-8; Morioka, N. et al., Mol Immunol, 1995. 32: páginas 573-81). Uma limitação dessas abordagens tem sido que, embora os an- tígenos alvo sejam tipicamente mais altamente expressos em células tumo- rígenas, todavia, eles são auto-antígenos e, assim, pobremente imunogêni- cos. Assim, vacinas para o câncer freqüentemente empregam várias estra- tégias para intensificação de imunogenicidade do antígeno cancerígeno, por exemplo, combinação com adjuvantes, administração com uma citocina, li- gação à proteínas-veículo e uso em pulso-ativação de células dendríticas maduras in vitro. Uma tendência mais recente tem sido desenvolver estraté- gias de vacinação mais elaboradas que são configuradas para o paciente, na qual células dendríticas autólogas são isoladas, estimuladas com Iisatos ou peptídeos tumorígenos e reinjetadas sozinhas ou em combinação com citocinas imunoestimulatórias potentes (por exemplo, GM-CSF, interleucinas IL-2 e IL-12, interferon gama).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporcionarem geral, composições, mé- todos e composições referentes ao diagnóstico e/ou tratamento de cânceres tendo um antígeno de ácido siálico de-N-acetilado na superfície celular, por exemplo, pelo menos um gangliosídeo parcialmente de-N-acetilado e/ou uma proteína na superfície celular ácido siálico de-N-acetilado-modificada.

A descrição proporciona vários aspectos da invenção. Esses incluem as seguintes modalidades exemplificativas.

Em uma modalidade, métodos de inibição do crescimento de uma célula cancerígena são proporcionados, métodos os quais compreen- dem administração, a um indivíduo, de uma formulação farmaceuticamente aceitável compreendendo um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo de ácido siálico de-N-acetilado (deNAc SA) sobre uma superfície extracelularmente acessível de uma célula cancerígena presente no indiví- duo, em que a administração facilita a redução na viabilidade de células cancerígenas ligadas pelo anticorpo. Em modalidades relacionadas, o epito- po de deNAc SA é apresentado sobre uma superfície da célula cancerígena durante divisão celular. Em outras modalidades relacionadas, o câncer é melanoma, uma leucemia ou um neuroblastoma. O anticorpo pode ser ad- ministrado através de infusão ou através de injeção local e pode ser adminis- trado antes, no momento de ou após intervenção cirúrgica para remover as células cancerígenas. O anticorpo pode também ser administrado como par- te de uma terapia combinada, na qual pelo menos um de uma quimioterapia para o câncer ou uma terapia de radiação é administrada ao indivíduo.

Em outra modalidade, métodos de inibição de crescimento de uma célula cancerígena em um indivíduo são proporcionados, métodos os quais compreendem administração, a um indivíduo, de uma formulação far- maceuticamente aceitável compreendendo um anticorpo que se liga especi- ficamente a um antígeno SEAM 3-reativo sobre uma superfície extracelular- mente acessível de uma célula cancerígena presente no indivíduo, em que administração facilita a redução na viabilidade de células cancerígenas liga- das pelo anticorpo. Em modalidades relacionadas, o antígeno SEAM 3- reativo é apresentado sobre uma superfície da célula cancerígena durante divisão celular. Em outras modalidades relacionadas, o câncer é um mela- noma, uma leucemia ou um neuroblastoma. O anticorpo pode ser adminis- trado através de infusão Ou através de injeção local e pode ser administrado antes, no momento de ou após intervenção cirúrgica para remover células cancerígenas. O anticorpo pode também ser administrado como parte de uma terapia combinada, na qual pelo menos um de uma quimioterapia para o câncer ou uma terapia de radiação é administrada ao indivíduo. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é um anticorpo monoclonal SEAM 3 (Depósito na ATCC No. HB-12170). Em uma outra modalidade relacionada, o anticorpo monoclonal SEAM 3 foi isolado usando uma etapa com alta con- centração de sal, na qual uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal SEAM 3 é incubada em uma solução com alta concentração de sal sob condições adequadas para facilitar separação das moléculas carre- gadas do mAb SEAM 3 na solução. O mAb SEAM 3 é isolado dessa solu- ção, usualmente através de remoção de precipitados e isolamento adicional do mAb.

Em outra modalidade, métodos de estimulação de anticorpos a uma célula cancerígena em um indivíduo são proporcionados, métodos os quais compreendem administração, a um indivíduo, de uma composição i- munogênica compreendendo um antígeno de ácido siálico de-N-acetilado (deNAc SA) e um adjuvante, em que o indivíduo tem ou é suspeito de ter um câncer caracterizado por um antígeno de ácido siálico de-N-acetilado (de- NAc SA), onde tal administração é eficaz para estimular a produção de um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo de deNAc SA sobre uma superfície extracelularmente acessível de uma célula cancerígena. Em mo- dalidades relacionadas, o câncer é um melanoma, Iinfoma ou leucemia ou neuroblastoma. Em outras modalidades relacionadas, o antígeno de deNAc SA da composição imunogênica é preparado através de tratamento com e- xosialidase do antígeno de deNAc SA. Em ainda outras modalidades rela- cionadas, o antígeno de deNAc SA é um conjugado de antígeno de deNAc SA o qual pode ser, por exemplo, um conjugado de antígeno de deNAc SA propionila-ligado ou acetila-ligado.

Em outra modalidade, métodos de detecção de um tumor em um indivíduo são proporcionados, métodos os quais compreendem contato de uma amostra biológica obtida de um indivíduo suspeito de ter câncer com um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo de ácido siálico de- N-acetilado (deNAc SA), onde o contato é sob condições adequadas para ligação específica do anticorpo a um epitopo de deNAc SA na amostra bio- lógica, a presença ou ausência de ligação do anticorpo é indicativa da pre- sença ou ausência de células cancerígenas tendo um epitopo de deNAc SA na superfície celular no indivíduo.

Em outra modalidade, métodos de detecção de um tumor em um indivíduo são proporcionados, métodos os quais compreendem contato de uma amostra biológica obtida de um indivíduo suspeito de ter câncer com um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno SEAM 3-reativo, o referido contato sendo sob condições adequadas para ligação específica do anticorpo a um antígeno SEAM 3-reativo na amostra biológica, onde a pre- sença ou ausência de ligação do anticorpo é indicativa da presença ou au- sência de células cancerígenas tendo um antígeno SEAM 3-reativo na su- perfície celular no indivíduo. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é o anticorpo monoclonal SEAM 3 (Depósito na ATCC No. HB-12170).

Em outra modalidade, métodos de produção de um derivado de polissacarídeo (PS) que é um antígeno de deNAc SA adequado são propor- cionados, métodos os quais compreendem cultura de uma bactéria Escheri- chia coli K1 em um meio de crescimento compreendendo uma N-acil- manosamina e uma manosamina amina-protegida, em que a bactéria é defi- ciente quanto à produção de polissacarídeo capsular na ausência de mano- samina suplementar, onde a cultura proporciona a produção de um derivado de PS amina-protegido tendo um grupo de proteção amina e um grupo N- acilado. Em modalidades relacionadas, o método também inclui tratamento do derivado de PS amina-protegido sob condições para remover o grupo de proteção amina e acopiamento do resíduo desprotegido a um veículo de pro- teína para produzir um derivado de PS conjugado.

Em outra modalidade, métodos de produção de um antígeno de deNAc SA são propor onados, métodos os quais compreendem cultura de uma célula de mamíft em um meio de crescimento compreendendo uma N-acil-manosamina e uma manosamina amina-protegida, onde a cultura proporciona a produção de um antígeno de deNAc SA amina-protegido ten- do um grupo de proteção amina e um grupo N-acetilado sobre a superfície da célula de mamífero. Em modalidades relacionadas, o método também inclui tratamento do antígeno de deNAc SA amina-protegido sob condições para remover o grupo de proteção amina e acopiamento do resíduo despro- tegido a um veículo de proteína para produzir um antígeno de deNAc SA conjugado. Antígenos deNAc SA amina-protegidos produzidos através desse método também são proporcionados, assim como células de mamífero tendo um antígeno de deNAc SA na superfície celular produzido através desse método e extratos de membrana e lipídio de tais células de mamífero.

Em outra modalidade, métodos de produção de uma composi- ção imunogênica são proporcionados, métodos os quais compreendem con- tato de uma composição compreendendo um antígeno de ácido siálico de-N- acetilado (deNAc SA) com uma exosialidase, o referido contato sendo sob condições suficientes para proporcionar degradação de contaminantes poli- méricos de ácido siálico N-acilado na composição, onde o contato produz uma composição enriquecida em antígeno de deNÀc SA. Composições compreendendo o antígeno de deNAc SA preparadas através desse método de tratamento com exosialidase são também proporcionadas.

Em outra modalidade, métodos de isolamento de um anticorpo com epitopo anti-deNAc SA e métodos de isolamento de um anticorpo mo- noclonal SEAM 3 são proporcionados, onde tais métodos compreendem in- cubação de uma composição compreendendo o anticorpo em uma solução com alta concentração de sal, a referida incubação sendo o sob condições adequadas para facilitar separação de moléculas carregadas do mAb SEAM 3 na solução e isolamento do mAb SEAM 3 da solução. Também proporcio- nadas são composições compreendendo um anticorpo com epitopo anti- deNAc SA e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde o anticorpo é isolado através desse método. Também proporcionadas são composições compreendendo um anticorpo monoclonal SEAM 3 e um veículo farmaceuti- camente aceitável, onde o anticorpo é isolado através desse método.

Em outra modalidade, polinucleotídeos isolados são proporcio- nados, polinucleotídeos os quais compreendem uma seqüência de nucleotí- deo que codifica um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo i) resíduos de aminoácido 24 a 39, ii) resíduos de aminoácido 55 a 61 e iii) resíduos de aminoácido 94 a 100 de uma região variável de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3. Em modalidades relacionadas, o polipeptídeo de cadeia leve codificado compreende a seqüência de aminoácido da região variável de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3. Em outras modalidades rela- cionadas, vetores e células hospedeiras recombinantes contendo tais poli- nucleotídeos são proporcionados.

Em outra modalidade, polinucleotídeos isolados são proporcio- nados, polinucleotídeos os quais compreendem uma seqüência de nucleotí- deo que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo i) resí- duos de aminoácido 26 a 35, ii) resíduos de aminoácido 50 a 66 e iii) resí- duos de aminoácido 101 a 108, de uma região variável de um polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3. Em modalidades relacionadas, o polipeptídeo de cadeia pesada codificado compreende a seqüência de aminoácido da região variável de um polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3. Em outras modalidades relacionadas, vetores e células hospedeiras recombinantes contendo tais polinucleotídeos são proporcionados.

Em outra modalidade, conjugados de anticorpo são proporcio- nados, onde os conjugados de anticorpo compreendem um anticorpo com- preendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo monoclonal SEAM 3 (Depósito na ATCC No. HB-12170) e uma porção covalentemente ligada, onde a porção covalentemente ligada é uma porção de polietileno glicol, um fármaco anticâncer ou uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo. Em modalidades relacionadas, o anticorpo do conjugado é um anticorpo monoclonal SEAM 3.

Outras características da invenção se tornarão prontamente evi- dentes para aqueles versados na técnica quando de leitura da descrição a- qui.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 proporciona a estrutura de PS de NmB após de-N- acetilação de acordo com a invenção. R é H sobre a maioria dos resíduos para proporcionar uma amina livre (sobre um grupo deacetilado). Em uma pequena fração de resíduos no produto de-N-acetilado, R pode ser CH3C=O (um grupo acetila), "n" representa um número de resíduos de ácido siálico no polímero, o qual pode ter um valor de "n" em outras fórmulas descritas aqui.

A figura 2 proporciona a estrutura de uma porção de Iactose formada entre os grupos carboxila Cl e o grupo hidroxila C9 do resíduo pre- cedente em PS dé NmB após tratamento com ácido de PS de NmB.

A figura 3 proporciona a estrutura de um derivado de PS tendo um grupo aldeído no resíduo terminal da extremidade de não-redução.

A figura 4 mostra o espectro de massa de derivados de PS sele- cionados e protegidos de clivagem por neuraminidase de SEAM 3.

A figura 5 é uma tabela resumindo as massas observadas para cada amostra e massas teóricas de íons correspondentes que são consis- tentes com as massas observadas.

As figuras 6-15 proporcionam estruturas de derivados de PS de- N-acetilados identificados na figura 5.

As figuras 16-18 proporcionam estruturas de derivados de PS de NmB de dodecilamina preparados e identificados no EXEMPLO 1.

As figuras 19-33 proporcionam estruturas de derivados de PS de-N-acetilados de acil amina exemplificativos da invenção.

A figura 34 é uma tabela resumindo os resultados de ligação dos mAbs SEAM 2, 3, 12, 18 e 35 a derivados de PS de NmB de dodecilamina, conforme medido através de ELISA de ligação direta. O mAb SEAM 3 é des- crito na US 6.048.527.

A figura 35 é uma tabela resumindo os resultados de ligação dos mAbs SEAM 2, 3, 12, 18 e 35 a conjugados derivados de PS de BSA-NmB, conforme medido através de ELISA de ligação direta. O mAb SÉAM 3 é des- crito na US 6.048.527.

A figura 36 é um cromatograma de cromatografia por troca de ânions de elevado desempenho de ácido colomínico (isto é, ácido poli alfa (2→8) N-acetil neuramínico preparado a partir de E. coli K1 (número de cur- va 1) e PS de N-Pr NmB que tinha sido exaustivamente tratado com sialida- se A.

A figura 37 é um painel de fotografias ilustrando a ligação de SEAM 3 à cepa de NmB M7 na qual o meio de crescimento foi suplementa- do com derivados de N-acil manosamina, conforme medido através de mi- croscopia por fluorescência. Painel esquerdo: ligação do mAb SEAM 12 à M7 suplementada com N-acetil manosamina; painel mediano à esquerda: ligação de SEAM 12 à M7 sem suplemento com N-acetil manosamina; painel mediano à direita: ligação do mAb SEAM 12 com suplemento de N-tricloro- acetil manosamina; painel à direita: ligação do mAb SEAM 12 ao PS capsu- lar contendo grupos N-trifluoroacetila. O mAb SEAM 12 é descrito na US. 6.048.527.

A figura 38 é uma fotografia mostrando a reatividade de um mAb anti-de-N-acila GD3, GAG2 e SEAM 3 com gangliosídeos de ácido de-N- acetil siálico preparados química ou biossinteticamente. Os derivados de gangliosídeo foram separados através de cromatografia em camada fina de elevado desempenho e detectados através de Western blot com GAG2 (Fi- leiras 1-3) ou SEAM 3 (Fileiras 4-6).

A figura 39 é uma série de fotografias de tecidos humanos nor-

mais e cancerígenos de melanoma representando a análise imunohistoquí- mica de ligação de SEAM 3 e o mAb anti-GD3, R24.

A figura 40 é uma tabela resumindo o s resultados de análise imunohistoquímica de ligação de SEAM 3 a um painel de cânceres huma- nos.

A figura 41 é uma fotografia mostrando a ligação por fluorescên- cia de SEAM 3 a células de melanoma SK-MEL 28 (tonalidade escura).

A figura 42 é uma fotografia mostrando a ligação por fluorescên- cia de SEAM 3 a células de neuroblastoma CHP-134 (tonalidade escura).

A figura 43 é uma fotografia mostrando a ligação por fluorescên- cia de SEAM 3 a células de leucemia de célula T Jurkat (tonalidade escura).

A figura 44 é um conjunto de gráficos mostrando a ligação de SEAM 3, mAb anti-GD3 R24 e um mAb de controle isotipo-equivalente irre- levante a células dè melanoma SK-MEL 28 na ausência e presença de Tri- ton X-100.

A figura 45 é um conjunto de gráficos mostrando ligação de SE- AM 3, mAb anti-NCAM e mAbs de controle isotipo-equivalente irrelevantes a células de neuroblastoma CHP-134 na ausência e presença de Triton X-100 através de citometria de fluxo.

A figura 46 é um conjunto de gráficos mostrando a ligação de SEAM 3 e um mAb de controle isotipo-equivalente irrelevante a células Jur- kat na ausência e presença de Triton X-100 e o inibidor de polissacarídeo solúvel, PS de N-Pr NmB1 através de citometria de fluxo.

A figura 47 é um gráfico mostrando a diminuição na viabilidade celular de células de melanoma SK-MEL 28 após incubação das células na presença de 5 μg/ml de SEAM 3 durante 24 h.

A figura 48 são gráficos comparando a diminuição na viabilidade celular e aumento no número de células de melanoma SK-MEL 28 apoptóti- cas e mortas após incubação das células na presença de 5 μg/ml de SEAM 3, mAb anti-GD3, R24 ou um mAb de controle isotipo-equivaiente irrelevante durante 48 h.

A figura 49 são gráficos mostrando o desvio das células de me- lanoma SK-MEL 28 para pre Go na presença de SEAM 3, comparado com os efeitos do fármaco nocodozola e do mAb anti-GD3 R24.

A figura 50 é uma plotagem de dispersão comparando o percen- tual de células SK-MEL 28 expressando antígeno SEAM 3-reativo e o mar- cador de proliferação celular Ki67.

A figura 51 é uma tabela mostrando uma comparação da origem genética de regiões variáveis de mAbs anti-MBPS e anti-N-PrMBPS.

A figura 52 é um esquema mostrando uma comparação de se- qüências de VL e VH para o mAb 735 e mAbs SEAM. Os segmentos entre retângulos correspondem a Ioops de regiões de determinação de comple- mentaridade (CDR). Números de acesso ao GenBank: SEAM 2 VH,

DQ113489; SEAM 2 VL,

DQ113490; SEAM 3 VH, DQ113491; SEAM 3 VL, DQ113492; SEAM 12 VH,

DQ113493;

SEAM 12VL, DQ113494; SEAM 18 VH, DQ113495; SEAM 18 VH,

DQ113496; SEAM 35

VH, DQ113497; SEAM 35 VL, DQ113498.

A figura 53 é um esquema mostrando as seqüências de ácido nucléico e aminoácido do polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3.

A figura 54 é um esquema mostrando as seqüências de ácido nucléico e aminoácido do polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3.

A figura 55 é uma tabela mostrando uma comparação do gene de linhagem germinativa atribuído e seqüências de aminoácido com as res- pectivas seqüências expressas para mAbs anti-PS de NmB e anti-PS de Pr NmB.

A figura 56 é um esquema mostrando a relação das seqüências de DNA da cadeia leve de deNAc SA para a framework de região variável e CDRs, conforme definido pelas definições do International Immunogenetics Information System (IMGT) (Lefranc et al.. IMGT, the international ImMuno- GeneTics information system®. Nucl. Acids Res., 2005, 33, D593-D597).

A figura 57 é um esquema mostrando a relação das seqüências de DNA da cadeia pesada de SEAM 3 para a framework de região variável e CDRs, conforme definido pelas definições do International Immunogenetics Information System (IMGT) (Lefranc et al.. IMGT, the international ImMuno- GeneTics information system®. Nucl. Acids Res., 2005, 33, D593-D597).

A figura 58 é um esquema mostrando a relação das seqüências de DNA da cadeia pesada de SEAM 3 para as cadeias D e J de região vari- ável, conforme definido pelas definições do International Immunogenetics Information System (IMGT) (Lefranc et al.. IMGT, the international ImMuno- GeneTics information system®. Nucl. Acids Res., 2005, 33, D593-D597).

Antes que a presente invenção e modalidades específicas da invenção sejam descritas, deve ser compreendido que a presente invenção não está limitada às modalidades particulares descritas uma vez que as mesmas podem, naturalmente, variar. Também, deve ser compreendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particula- res apenas e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da pre- sente invenção será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

Onde uma faixa de valores é proporcionada, deve ser compre- endida que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do menor limi- te, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo, entre o limite máximo e mínimo dessa faixa e qualquer outro valor estabelecido ou inter- veniente nessa faixa estabelecida, é abrangido pela invenção. Os limites máximo e mínimo dessas faixas menores podem, independentemente, ser incluídos nas faixas menores também abrangidas dentro da invenção, sujeita a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo ambos esses limites também são incluídas na invenção.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui também possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais exemplificativos são agora des- critos. Todas as publicações mencionadas aqui são aqui incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.

Deve ser notado que, conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem as referên- cias no plural, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "um antígeno" inclui uma pluralidade de tais antígenos e referência a "um peptídeo" inclui referência a um ou mais peptídeos e equivalentes do(s) mesmo(s) conhecidos por aqueles versados na técnica e assim por diante.

As publicações divulgadas aqui são fornecidas unicamente para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui de- ve ser construído como uma admissão de que a presente invenção não é designada como prevendo tal publicação em virtude de invenção anterior. Ainda, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais, o que pode precisar ser confirmado independentemente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As composições de antígeno de ácido de-N-acetil siálico (deNAc SA) divulgadas aqui são úteis em imunoterapia de câncer, bem como na produção de anticorpos que podem ser usados em quimioterapia de câncer anticorpo-baseada. Conseqüentemente, a descrição proporciona antígenos de deNAc SA, bem como métodos de seu uso para estimular a resposta i- mune antitumor e/ou intensificação de uma resposta imune antitumor, onde o tumor contém células tendo antígeno de deNAc SA acessível na superfície celular.

Em geral, antígenos deNAc SA contêm resíduos de ácido de-N- acetil siálico que, após administração a um indivíduo, podem estimular anti- corpos que se ligam especificamente a epitopos de deNAc SA sobre uma célula cancerígena. Em algumas modalidades, o antígeno de deNAc SA proporciona uma resposta de anticorpo que tem reatividade cruzada mínima com os auto antígenos de ácido polissiálico (PSA) presentes sobre tecidos humanos. O epitopo mínimo de deNAc SA é um dissacarídeo de resíduos de ácido siálico no qual um ou ambos os resíduos contêm resíduos de de-N- acetila. O epitopo mínimo de deNAc SA pode também ser descrito como uma unidade dissacarídica compreendendo um ou mais resíduos de ácido siálico na qual o grupo N-acetila sobre o grupo C-5 amino foi removido, dei- xando uma amina livre ou onde um dos dois resíduos são de-N-acetilados, o segundo resíduo contém um grupo N-acetila (mas, em algumas modalida- des, não um grupo N-propionila). A unidade dissacarídica que define esse epitopo mínimo pode estar na extremidade de redução, na extremidade de não-redução ou dentro de um polímero de resíduos de ácido siálico (por e- xemplo, dentro de um polissacarídeo). Resíduos de-N-acetilados, no contex- to de PSA contendo resíduos N-acilados, são imunogênicos e estimulam anticorpos que são reativos com o epitopo de deNAc SA, mas são minima- mente reativos ou não detectavelmente reativos com antígenos de PSA hu- manos.

O epitopo de polissacarídeo NmB de-N-acetilado foi identificado usando um mAb de polissacarídeo anti-B-Pr NmB de murino (anticorpos monoclonais), SEAM 3, descrito em Granoff et al., 1998, J Immunol 160: 5028 (mAbs anti-PS N-Pr NmB); US 6.048.527 (anticorpos anti-NmB); e US 6.350.449 (anticorpos anti-NmB).

A invenção se caracterizada por epitopos de deNAc SA e formu- lações dos mesmos adaptadas para administração a um hospedeiro para estimular uma resposta de anticorpo antiepitopo de deNAc SA. As composi- ções de antígeno de deNAc SA podem ser adaptadas para administração a um indivíduo para estimular uma resposta imune antiepitopo de deNAc SA, resposta imune a qual dirigida contra os epitopos de deNAc SA sobre a su- perfície de determinadas células cancerígenas, conforme discutido em deta- lhes abaixo. As composições de antígeno de deNAc SA podem também ser usadas para gerar anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo de deNAc SA sobre a superfície de uma célula cancerígena (por exemplo, uma proteína acessível na superfície ácido deNAc siálico- ou gangliosídeo de deNAc-modificada). Tais anticorpos são úteis em anticorpo baseado em te- rapia de câncer.

Outras características da invenção são descritas aqui e serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica quando de leitura da presente descrição.

DEFINIÇÕES

Definições fornecidas aqui prevalecerão com relação àquelas apresentadas no pedido de prioridade.

O termo "antígeno de ácido de-N-acetil siálico" (o qual também pode ser referido como "antígeno de ácido siálico de-N-acetilado" ou "antí- geno de deNAc SA") se refere a um composto tendo ou imitando um epitopo de ácido deNAc siálico (epitopo de deNAc SA), epitopo o qual é minimamen- te definido por um dímero de resíduos de ácido siálico ou derivados de ácido siálico, onde o dímero contém pelo menos um resíduo de ácido siálico de-N- acetilado adjacente a um resíduo de ácido siálico N-acilado (por exemplo, acetilado ou propionilado) ou um resíduo derivado de ácido siálico. exemplos de antígenos de ácido de-N-acetil siálico são fornecidos na presente descri- ção e incluem, sem limitação, derivados de polissacarídeo de-N-acetilados ("derivados de PS"), gangliosídeos de-N-acetilados e derivados de-N- acetilados de uma proteína ácido siálico-modificada, particularmente uma proteína ácido siálico-modificada que é acessível em uma superfície extrace- lular de uma célula de mamífero, particularmente uma célula humana, mais particularmente uma célula cancerígena, particularmente uma célula de cân- cer humano. Deve ser notado que a descrição de um antígeno de deNAc SA como um derivado de uma molécula de iniciação (por exemplo, um derivado de PS ou derivado de gangliosídeo) não se destina a ser Iimitativa quanto ao método de produção do antígeno de ácido de-N-acetil siálico, mas antes sig- nifica uma forma conveniente de descrever a estrutura do antígeno de de- NAc SA exemplificativo.

"Antígeno SEAM 3-reativo" se refere a um antígeno tendo um epitopo que é especificamente ligado pelo anticorpo monoclonal (mAb) SE- AM 3 (No. de Depósito na ATCC HB-12170). Antígenos SEAM 3-reativos exemplificativos são fornecidos nos exemplos de trabalho.

"Antígeno na superfície celular" (ou "epitopo na superfície celu- lar") se refere a um antígeno (ou epitopo) sobre a superfície de uma célula que é extracelularmente acessível em qualquer estágio do ciclo celular da célula, incluindo antígenos que são predominantemente ou apenas extrace- lularmente acessíveis durante divisão celular. "Extracelularmente acessível", nesse contexto, se refere a um antígeno que pode ser ligado por um anticor- po fornecido fora da célula sem a necessidade de permeabilização da mem- brana celular.

"PS", conforme usado aqui, se refere a um polissacarídeo, usu- almente um polissacarídeo capsular, particularmente um polissacarídeo cap- sular tendo um ou mais resíduos de-N-acetilados, incluindo polissacarídeo capsular de A. meningitidis ou Escherichia coli, com o Grupo B de N. menin- gitidis e E. coli K1 sendo de interesse particular.

"PS de NmB", conforme usado aqui, se refere a um PS do Gru- po B de N. meningitidis. Referência a um PS de NmB por toda a especifica- ção se destina a ser exemplificativa de estruturas de PS passíveis de produ- ção de composições e uso nos métodos da invenção.

"Derivado de PS", conforme usado aqui, se refere a um polissa- carídeo (PS) modificado, usualmente modificado quimicamente, particular- mente um PS do grupo B de Neisseria meningitidis (NmB) ou Escherichia coli K1, com derivados de PS tendo uma amina livre (isto é, uma amina pri- mária) em lugar de um ou mais grupos N-acetila sendo de interesse particu- lar. Em algumas modalidades, derivados de PS são NmB. Em outras moda- lidades, os derivados de PS são derivados de gangliosídeo biossintetica- mente produzidos (por exemplo, produzidos em uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula cancerígena de mamífero). "Derivado de PS", conforme usado aqui, inclui derivados de PS protegidos, tais como aqueles descritos aqui.

"Derivado de PS de-N-acetilado", conforme usado aqui, se refe- re a um derivado de PS tendo um ou mais resíduos de-N-acetilados, por e- xemplo, uma ou mais aminas livres na posição C-5 de um ou mais resíduos do derivado de polissacarídeo. O termo "derivado de PS de-N-acetilado" não se destina a implicar que os derivados de PS de-N-acetilados estão limitados a derivados de PS gerados através de um processo envolvendo remoção de um grupo acetila de uma molécula de PS, mas antes, a menos que especifi- camente indicado de outro modo, se destina a abranger derivados de PS de- N-acetilados gerados através de qualquer método adequado (por exemplo, através de um método biossintético no qual as aminas livres são geradas em um derivado de PS de-N-acetilado através de remoção de um grupo de pro- teção de trihaloacila incorporado na molécula de PS durante biossíntese de PS). Ainda, "resíduo de-N-acetilado" é usado aqui no contexto de um deriva- do de PS para se referir a um resíduo de ácido siálico na molécula que tem, em lugar de um grupo acetila nativo, uma amina primária,

"Amina livre" e "amina primária" são usados permutavelmente aqui para se referir a um grupo NH2 conforme por exemplo, em RNH2, onde "R" é um resíduo de ácido siálico de um derivado de PS da invenção.

"Conjugado de antígeno de deNAc SA" se refere a um antígeno de deNAc SA ligado, usualmente covalentemente ligado, a uma molécula veículo (tal como uma proteína-veículo). Conjugados de antígeno de ácido 1 de-N-acetil siálico inclui um "conjugado de PS", o qual geralmente se refere a um conjugado de uma molécula veículo (tal como uma proteína-veículo) e um polímero homolinear de ácido alfa(2->8) N-acetil neuramínico ou qual- quer outro polissacarídeo contendo essa unidade monomérica ou derivados do mesmo, incluindo os derivados de PS de-N-acetilados da invenção. De interesse particular é um conjugado de uma proteína-veículo e um derivado de polissacarídeo capsular de Neisseria meningitidis (particularmente um polissacarídeo capsular do Grupo B), particularmente um derivado de PS de- N-acetilado da invenção. Também de interesse particular é um conjugado de uma proteína-veículo e um derivado de polissacarídeo capsular de E. coli K1, particularmente um derivado de PS de-N-acetilado da invenção.

"Veículo", conforme usado no contexto de um veículo conjugado a um antígeno de ácido de-N-acetil siálico geralmente se refere a uma subs- tância que, quando ligada a um antígeno, serve como um antígeno T- dependente o qual pode ativar e recrutar células T e, desse modo, aumentar a produção de anticorpo dependente de célula Τ. O veículo não precisa ser fortemente imunogênico em si, embora veículos fortemente imunogênicos estejam dentro do escopo da presente invenção. Veículos, nesse contexto, são geralmente polipeptídeos, os quais podem ser toda ou um fragmento de uma proteína.

"Conjugado" geralmente se refere a uma ligação química, quer covalente ou não covalente, usualmente covalente, que se associa proxi- malmente ao PS de-N-acetilado com o veículo, de modo que o antígeno de ácido de-N-acetil siálico veículo-conjugado tem imunogenicidade aumentada com relação ao antígeno de ácido de-N-acetil siálico não conjugado.

"Quimioterapia", conforme usado aqui, se refere ao uso de um agente (por exemplo, fármaco, anticorpo etc.), particularmente (um) agen- te(s) que é(sáo) seletivamente destrutivo(s) para uma célula cancerígena, no tratamento de uma doença, com tratamento de câncer sendo de interesse particular.

"Imunoterapia" se refere ao tratamento de doença (por exemplo, câncer) através de modulação de uma resposta imune a um antígeno de doença. No contexto do presente pedido, imunoterapia se refere ao forneci- mento de uma resposta imune anticâncer em um indivíduo através de admi- nistração de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) e/ou a- través de administração de um antígeno que estimula uma resposta imune anti-antígeno de tumor no indivíduo.

"Tratamento" ou "tratar", conforme usado aqui, significa qualquer intervenção terapêutica em um indivíduo, usualmente um mamífero, geral- mente um ser humano, incluindo: (i) prevenção, isto é, redução do risco de desenvolvimento de sintomas clínicos, incluindo fazer com que os sintomas clínicos não se desenvolvam, por exemplo, impedindo a progressão da do- ença para um estado prejudicial; (ii) inibição, isto é, interrupção do desenvol- vimento ou desenvolvimento adicional de sintomas clínicos, por exemplo, alívio ou inibição completa de uma doença ativa, por exemplo, de modo a diminuir a carga de tumor, diminuição a qual pode incluir eliminação de célu- las cancerígenas detectáveis; e/ou (iii) alívio, isto é, causar a regressão de sintomas clínicos.

O termo "imunidade protetora" significa que uma vacina ou es- quema de imunização que é administrado a um mamífero induz a uma res- posta imune que previne, retarda o desenvolvimento de ou reduz a gravida- de de uma doença (por exemplo, câncer) ou diminui ou em geral elimina os sintomas da doença.

Por "auto-reativo", no contexto de ligação de anticorpo, entenda- se que o anticorpo exibe ligação significativa a um antígeno do hospedeiro (por exemplo, ácido polissiálico (PSA) nativo a um hospedeiro). Anticorpos auto-reativos incluem aqueles que se ligam a antígenos do hospedeiro (por exemplo, PSA sobre células hospedeiras não cancerígenas), bem como a antígenos estranhos (por exemplo, a um antígeno de tumor apresentado por uma célula cancerígena, ao PS de NmB ou PS de E. coli K1). Um anticorpo "não auto-reativo" é um anticorpo que não se liga significativa ou detecta- velmente a um antígeno do hospedeiro, sem ligação detectável a um antíge- no nativo do hospedeiro sendo de interesse particular. Anticorpos não auto- reativos de interesse de interesse são anticorpos que se ligam especifica- mente a um epitopo de ácido de-N-acetil siálico (por exemplo, um epitopo de deNAc SA de um gangliosídeo de-N-acetilado de uma célula cancerígena, um epitopo de deNAc.SA de PS de NmB ou PS de E. coli K1), anticorpos os quais podem facilitar a redução de viabilidade de uma célula à qual o anti- corpo se liga (por exemplo, são bactericidas para NmB e/ou E. coli K1 e/ou facilitar a redução de viabilidade celular de uma célula cancerígena).

A frase "em uma quantidade suficiente para estimular uma res- posta imune" (por exemplo, a epitopos presentes em um preparado) significa que há uma diferença detectável entre um indicador de resposta imune me- dido antes e após administração de um preparado de antígeno em particular. Indicadores de resposta imune incluem, mas não estão limitados a: titulação ou especificidade de anticorpo, conforme detectado por um ensaio tal como um imunoensaio enzima-ligado (ELISA), citometria de fluxo, imunoprecipita- ção, imunodifusão de Ouchter-Lowry; ensaios de detecção de ligação, por exemplo, de spot, Western blot ou fileiras de antígeno; ensaios de citotoxici- dade; e similares.

O termo "anticorpo" (também usado permutavelmente com "i- munoglobulina") abrange preparados de anticorpo policlonal e monoclonal onde o anticorpo pode ser de qualquer classe de interesse (por exemplo, IgM, IgG e subclasses das mesmas), bem como preparados incluindo anti- corpos híbridos, anticorpos alterados, fragmentos F(ab')2, moléculas de F(ab), fragmentos Fv, variável de fragmento com cadeia simples visualiza- das sobre fago (scFv), anticorpos com cadeia simples, anticorpos com um único domínio, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e fragmentos funcionais dos mesmos os quais exibem propriedades de ligação imunológi- ca da molécula de anticorpo precursora. Em algumas modalidades, por e- xemplo, terapia de câncer, anticorpos que proporcionam morte complemen- to-mediada e/ou citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) são de interesse particular. Os anticorpos descritos aqui podem ser detectavelmente rotulados, por exemplo, com um radioisótopo, uma enzima a qual gera um produto detectável, uma proteína fluorescente e similares. Os anticorpos po- dem ainda ser conjugados à outras porções, tal como uma molécula citotóxi- ca ou outra molécula (por exemplo, para proporcionar distribuição de um fármaco anticâncer a uma célula cancerígena), membros de pares de liga- ção específicos, por exemplo, biotina (membro do par de ligação específico de biotina-avidina) e similares. Os anticorpos podem também ser ligados a um suporte (por exemplo, sobre um suporte sólido), tal como uma lâmina de poliestireno ou glóbulo, tira de teste e similares.

Polipeptídeos de imunoglobulina incluem as cadeias leves kap- pa e Iambda e as cadeias pesadas alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, delta, epsilon e mu ou equivalentes em outras espécies. "Cadeias leves" de imu- noglobulina de comprimento total (usualmente de cerca de 25 kDa ou cerca de 214 aminoácidos) compreendem uma região variável de cerca de 110 aminoácidos no NH2-término e uma região constante kappa ou Iambda no COOH-término. "Cadeias pesadas" de imunoglobulina de comprimento total (de cerca de 50 kDa ou cerca de 446 aminoácidos) compreendem, similar- mente, uma região variável (de cerca de 116 aminoácidos) e uma das regi- ões constantes de cadeia pesada antes mencionadas, por exemplo, gama (de cerca de 330 aminoácidos).

Uma região variável de cadeia pesada ou leve de imunoglobuli- na é composta de uma !região de "framework" (FR) interrompida por três re- giões hipervariáveis, também denominadas "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs". A extensão da região de framework e das CDRs foi precisamente definida (vide "Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest", E.Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Servi- ces, (1991) e Lefranc et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics infor- mation system®. Nucl. Acids Res., 2005, 33, D593-D597)). Uma discussão detalhada do sistema IMGTS, incluindo como o sistema IMGTS foi formulado e como ele se compara a outros sistemas, é fornecida na World Wide Web em imgt.cines.fr/textes/IMGTScientificChart/Numbe ring/IMGTnumberingsTable.h tml. As seqüências das regiões de framework de diferentes cadeias leves e pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de framework de um anticorpo, isto é, as regiões de framework combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDRs. As CDRs são primariamente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antígeno.

"Anticorpos quiméricos" se refere a anticorpos tendo genes de cadeia leve e/ou pesada que tenham sido construídos, tipicamente através de engenharia genética, a partir de genes de região constante e variável de anticorpo pertencendo a diferentes anticorpos, por exemplo, de uma espécie diferente. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal não-humano (por exemplo, camundongo) podem ser unidos a segmentos constantes humanos, tais como gama 1 e gama 3. Um exemplo de um anticorpo quimérico terapêutico é uma proteína híbrida composta do domínio variável ou de ligação a antígeno de um anticorpo não-humano (por exemplo, camundongo) e o domínio constante ou efetuador de um anticorpo humano, embora outras espécies de mamífero possam ser usadas.

Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" ou "imu- noglobulina humanizada" se refere a um anticorpo não-humano (por exem- plo, camundongo ou coelho) contendo um ou mais aminoácidos (em uma região de framework, uma região constante ou uma CDR, por exemplo) que tenha sido substituído por um aminoácido correspondentemente posicionado de um anticorpo humano. Em geral, anticorpos humanizados produzem uma resposta imune reduzida em um hospedeiro humano, quando comparado com uma versão não-humanizada do mesmo anticorpo.

Deve ser compreendido que os anticorpos humanizados proje- tados e produzidos através do presente método podem ter substituições de aminoácido conservativas adicionais as quais não têm efeito substancial so- bre a ligação a antígeno ou outras funções do anticorpo. Por substituições conservativas entenda-se combinações tais como aqueles dos seguintes grupos: gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; e phe, tyr.

Uma "variante" de um polipeptídeo, tal como um anticorpo vari- ante, é definido como um polipeptídeo que é alterado por um ou mais resí- duos de aminoácido com relação a uma seqüência de referência, por exem- plo, um polipeptídeo precursor, o qual pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente. Tais alterações incluem substituições, deleções ou inserções de aminoácido ou uma combinação dos mesmos. Variantes de um polipeptí- deo de cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo de interesse são aquelas que retém suas características estruturais básicas e atividade biológica na ligação ao antígeno de interesse e, em algumas modalidades, a atividade biológica ao realizar redução de viabilidade de uma célula cancerígena.

Orientação para determinação de quais e quantos resíduos de aminoácido podem ser substituídos, deletados ou inseridos pode ser encon- trada comparando a seqüência de um polipeptídeo com a seqüência de um polipeptídeo com uma estrutura e função relacionadas, por exemplo, se- qüências de outras fontes (por exemplo, comparação entre seqüências de fontes de mamífero, por exemplo, humana, rato, camundongo e similares).

O termo "ligação específica de um anticorpo" ou "anticorpo antí- geno-específico", no contexto de uma característica de um anticorpo, se re- fere à capacidade de um anticorpo de se ligar, de preferência, a um antígeno em particular que está presente em uma mistura homogênea de diferentes antígenos. Em determinadas modalidades, uma interação de ligação especí- fica discriminará entre antígenos desejáveis e indesejáveis (ou antígenos "alvo" e "não-alvo") em uma amostra, em algumas modalidades mais do que cerca de 10 a 100 vezes ou mais (por exemplo, mais do que cerca de 1000 ou 10.000 vezes). Em determinadas modalidades, a afinidade entre um anti- corpo e antígeno, quando eles são especificamente ligados em um complexo de anticorpo-antígeno, é caracterizada por uma Kd (constante de dissocia- ção) de menos de 10"-6 M, menos do que 10"-7 M, menos do que 10"-8 M, me- nos do que 10"-9 M, menos do que 10"-10 M, menos do que 10"-11 M ou menos do que 10"-12 M ou menos.

A frase "se liga especificamente a um anticorpo" ou "especifica- mente imunorreativo com" é também usada quando de referência a um antí- geno, tal como um polissacarídeo, fosfolipídio, proteína ou peptídeo, especi- almente no contexto de uma reação de ligação a qual é baseada em e/ou é probatória da presença do antígeno sob condições as quais também incluem uma população heterogênea de outras moléculas (por exemplo, conforme em uma amostra ou in vivo). Assim, sob as condições relevantes (por exem- plo, designadas condições de imunoensaio), o anticorpo ou anticorpos espe- cificados sé ligam a um antígeno ou antígenos particulares e não se ligam, em uma quantidade significativa, a outras moléculas presentes na amostra, particularmente quando comparado com a ligação a um epitopo de um antí- geno alvo contra o qual o anticorpo foi estimulado.

Uma "substituição" resulta da substituição de um ou mais ami- noácidos ou nucleotídeos por diferentes aminoácidos ou nucleotídeos, res- pectivamente, quando comparado com uma seqüência de aminoácido ou polipeptídeo ou ácido nucléico. No contexto de polipeptídeos, se uma substi- tuição é conservativa, o aminoácido que é substituído em um polipeptídeo tem propriedades químicas ou estruturais similares (por exemplo, carga, po- laridade, hidrofobicidade e similares) ao aminoácido que ele está substituin- do. Substituições conservativas de aminoácidos que ocorrem naturalmente usualmente resultam em uma substituição de um primeiro aminoácido por um segundo aminoácido do mesmo grupo que o primeiro aminoácido, onde grupos de aminoácido exemplificativos são como segue: gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; Iys1 arg; e phe, tyr.

Uma "deleção" é definida como uma carga em uma seqüência de aminoácido ou nucleotídeo na qual um ou mais resíduos de aminoácido ou nucleotídeo, respectivamente, estão ausentes quando comparado com uma seqüência de aminoácido ou seqüência de nucleotídeo de um polipep- tídeo que ocorre naturalmente. No contexto de um polipeptídeo e aminoáci- do com elemento de polipeptídeo ou seqüência de polinucleotídeo, uma de- leção pode envoJver deleção de cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10, até cer- ca de 20, até cerca de 30 ou até cerca de 50 ou mais aminoácidos. Um poli- peptídeo de acordo com a invenção pode conter mais do que uma deleção.

Uma "inserção" ou "adição" é aquela alteração em uma seqüên- cia de aminoácido ou nucleotídeo a qual resultou na adição de um ou mais resíduos de aminoácido ou nucleotídeo, respectivamente, quando compara- do com a seqüência de aminoácido ou a seqüência de nucleotídeo de um polipeptídeo que ocorre naturalmente. "Inserção" geralmente se refere à adi- ção de um ou mais resíduos dentro de uma seqüência de um polipeptídeo ou ácido nucléico, enquanto que "adição" pode ser uma inserção ou se refe- rir a resíduos de aminoácido adicionados no N- ou C-término de um polipep- tídeo ou a nucleotídeos adicionados às extremidades 5' ou 3' de um ácido nucléico. Uma inserção ou adição pode ser de até cerca de 10, até cerca de 20, até cerca de 30 ou até cerca de 50 ou mais aminoácidos.

"Aminoácidos correspondentes", conforme será exemplificado abaixo, são resíduos de aminoácido que estão em uma posição idêntica (isto é, eles estão situados uns ao lado dos outros) quando duas ou mais se- qüências de aminoácido são alinhadas. Métodos para alinhamento e nume- ração de seqüências de anticorpo são apresentadas em maiores detalhes em Chothia, supra, Kabat supra e outros. Conforme é conhecido na técnica (vide, por exemplo, Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological In- terest, DHHS, Washington, DC), algumas vezes um, dois ou três vãos e/ou inserções de até um, dois, três ou quatro resíduos ou até cerca de 15 resí- duos (particularmente nas CDRs L3 e H3) podem ser feitas em um ou am- bos os aminoácidos de um anticorpo de forma a realizar um alinhamento.

Um anticorpo "natural" é um anticorpo no qual as imunoglobuli- nas pesadas e leves do anticorpo foram naturalmente selecionadas pelo sis- tema imune de um organismo multicelular, em oposição a anticorpos não naturalmente emparelhados feitos, por exemplo, através de phage display ou anticorpos humanizados. Como tal, os anticorpos precursores em questão usualmente não contém quaisquer seqüências derivadas de vírus (por e- xemplo, bacteriófago M13). Baço, nódulos linfáticos e medula óssea são e- xemplos de tecidos que produzem anticorpos naturais.

Uma "posição substituível", conforme no contexto de variantes de um determinado polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve de anti- corpo, é uma posição particular de uma seqüência de aminoácido de poli- peptídeo que pode ser substituída por diferentes aminoácidos, de preferên- cia sem diminuir significativamente a atividade de ligação do anticorpo. Mé- todos para identificação de posições substituíveis e como elas podem ser substituídas são descritos em detalhes muito maiores abaixo. Uma posição substituível pode também ser referida como uma "posição tolerante à variação".

Um anticorpo "precursor", conforme será descrito em maiores detalhes abaixo, é o anticorpo que é o template ou alvo para modificações de aminoácido. Em determinadas modalidades, aminoácidos podem ser "doados" por um anticorpo "doador" ao anticorpo precursor para produzir um anticorpo alterado.

"Anticorpos relacionados", conforme será descrito em maiores detalhes abaixo, são anticorpos que têm uma seqüência similar e são produ- zidos por células que têm um ancestral de células B em comum. Tal ances- trai de célula B contém um genoma tendo uma região VJC de cadeia leve reestruturada e uma região VDJC de cadeia pesada reestruturada e produz um anticorpo que ainda não sofreu maturação por afinidade. Células B "nai- ve" ou "virgens" presentes em tecido de baço são ancestrais comuns de cé- lula B. Anticorpos relacionados se ligam ao mesmo epitopo de um antígeno e são, tipicamente, muito similares quanto à seqüência, particularmente em suas CDRs L3 e H3. As CDRs H3 e L3 de anticorpos relacionados têm um comprimento idêntico e uma seqüência quase idêntica (isto é, diferem em 0,1 ou 2 resíduos). Anticorpos relacionados são relacionados por meio de um ancestral de anticorpo em comum, o anticorpo produzido no ancestral de célula B naive. O termo "anticorpos relacionados" não se destina a descrever um grupo de anticorpos que não tem um ancestral de anticorpo em comum produzido por uma célula B.

Uma "região variável" de uma cadeia pesada ou leve de anticor- po é um domínio maduro N-terminal das cadeias. Vh é o domínio variável de uma cadeia pesada de anticorpo. Vl é o domínio variável de uma cadeia le- ve de anticorpo, a qual poderá ser do isotipo kappa (K) ou lambda. Anticor- pos K-1 têm o isotipo kappa-1, enquanto que anticorpos K-2 têm o isotipo kappa-2 e a Vl é a cadeia leve lambda variável.

Conforme usaido aqui, o termo "anticorpo monoclonal" se refere a uma composição de anticorpo tendo uma população homogênea de anti- corpo. O termo não está limitado à maneira pela qual ele é feito. O termo abrange moléculas de imunoglobulina inteiras, bem como moléculas Fab, fragmentos F (ab')2, fragmentos Fv, variável de fragmento com cadeia sim- ples visualizada sobre fago (scFv), proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo e uma proteína de não- anticorpo e outras moléculas que exibem propriedades de ligação imunológi- ca da molécula de anticorpo monoclonal precursora. Métodos de fabricação de anticorpos policlonais e monoclonais são conhecidos na técnica e descri- tos mais completamente abaixo.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína", usados permutavelmente aqui, se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer com- primento, os quais podem incluir aminoácidos codificados e não-codificados, aminoácidos química ou bioquimicamente modificados ou derivatizados e polipeptídeos tendo estruturas principais peptídicas modificadas. O termo inclui proteínas de fusão incluindo, mas não limitado a, proteínas de fusão com uma seqüência de aminoácido heteróloga, fusões com seqüências líde- res heterólogas e homólogas, com ou sem resíduos de metionina N- terminais; protèínas imunologicamente rotuladas; proteínas de fusão com parceiros de fusão detectáveis, por exemplo, proteínas de fusão incluindo, como um parceiro de fusão, uma proteína florescente, β-galactosidase, Iuci- ferase etc.; e similares.! Polipeptídeos podem ser de qualquer tamanho e o termo "peptídeo" se refere a polipeptídeos que têm 8-50 resíduos (por e- xemplo, 8-20 resíduos) de comprimento.

"Heterólogo", conforme usado no contexto de um ácido nucléico ou polipeptídeo, geralmente significa que o ácido nucléico ou polipeptídeo é de uma origem diferente (por exemplo, molécula de diferente seqüência, di- ferente origem de espécie e similares) daquela da qual o ácido nucléico ou polipeptídeo está associado ou unido, de modo que o ácido nucléico ou poli- peptídeo é um que não é encontrado na natureza. Por exemplo, em uma proteína de fusão, um polipeptídeo de cadeia leve e um polipeptídeo repórter (por exemplo, GFP) são ditos como sendo "heterólogos" um ao outro. Simi- larmente, uma CDR de um anticorpo de camundongo e uma região constan- te de um anticorpo humano são ditas como sendo "heterólogas" uma à outra.

Por "isolado" entenda-se que um composto é separado de todos ou alguns dos componentes que o acompanham na natureza. "Isolado" tam- bém se refere ao estado de um composto separado de todos ou alguns dos componentes que o acompanham durante fabricação (por exemplo, síntese química, expressão recombinante, meio de cultura e similares).

Por "purificado" entenda-se um composto de interesse que te- nha sido separado de componentes que o acompanham na natureza e for- necido em uma forma enriquecida. "Purificado" também se refere a um com- posto de interesse separado de componentes que podem acompanhá-lo du- rante fabricação (por exemplo, em síntese química, expressão recombinan- te, meio de cultura e similares) e fornecido em uma forma enriquecida. Tipi- camente, um composto é substancialmente puro quando ele é pelo menos 50% a 60% em peso isento de moléculas orgânicas com as quais ele está naturalmente associado ou com as quais ele é associado durante fabricação.

Geralmente, o preparado é pelo menos 75%, mais usualmente pelo menos 90% e geralmente pelo menos 99% em peso do composto de interesse. Um composto substancialmente puro pode ser obtido, por exemplo, através de extração de uma fonte natural (por exemplo, bactéria), através de síntese química de um composto ou através de uma combinação de purificação e modificação química. Um composto substancialmente puro pode também ser obtido, por exemplo, através de enriquecimento de uma amostra tendo um composto que sé liga a um anticorpo de interesse. A pureza pode ser medi- da através de qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia, es- pectroscopia de massa, análise por HPLC etc.

"Enriquecido" significa que uma substância (por exemplo, anti- corpo ou antígeno) em uma composição é manipulado por um pesquisador ou um clínico, de modo que ele está presente em uma concentração pelo menos duas vezes maior em peso, usualmente pelo menos em uma concen- tração três vezes maior em peso total, usualmente em uma concentração pelo menos 10 vezes maior, mais usualmente em uma concentração pelo menos 100 vezes maior e, ainda mais usualmente, uma concentração pelo menos 1.000 vezes maior do que a concentração desse antígeno na cepa da qual a composição de antígeno foi obtida. Assim, por exemplo, se a concen- tração de um antígeno em particular é 1 micrograma por grama de prepara- do total (ou de proteína total), um preparado enriquecido conteria pelo me- nos 3 microgramas por grama de preparado total (ou de proteína total).

"Inativação" de uma célula é usada aqui para indicar que a célu- la foi tornada incapaz de divisão celular para formar uma prole. A célula, to- davia, pode ser capaz de responder a estímulos e/ou biossíntese durante um período de tempo, por exemplo, para proporcionar a produção de uma molé- cula na superfície celular (por exemplo, proteína ou polissacarídeo na super- fície celular).

O termo "imunologicamente naive com relação a um antígeno de deNAc SA" denota um indivíduo (por exemplo, um mamífero, tal como um paciente humano) que não foi exposto ao antígeno de ácido de-N-acetil siáli- co descrito aqui (por exemplo, um derivado de PS), quer sozinho ou no con- texto de uma molécula maior, em quantidades suficientes para causar uma resposta imunè (por exemplo, iniciador). Se o indivíduo foi exposto a uma vacina de conjugado de antígeno de ácido de-N-acetil siálico (em uma ou mais doses), o indivíduo tem uma propensão à produção de anticorpos.

Um indivíduo "iniciado" se refere a um indivíduo que tenha sido exposto (por exemplo, através de administração) a um antígeno (por exem- plo, um antígeno de SA de-N-acetilado) em uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imune que, quando de subseqüente exposição ao mesmo ou a um segundo antígeno (por exemplo, conjugado de antígeno de ácido de-N-acetil siálico), proporciona uma resposta imune protetora.

Por "nenhuma resposta de auto-anticorpo clinicamente relevan- te" entenda-se que a produção de auto-anticorpos é reduzida em pelos me- nos 25%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou mais usando os métodos de imunização descritos aqui comparado com a produção de auto-anticorpo após imunização de um indivíduo naive com uma vacina de polissacarídeo de NmB convencional (por exemplo, uma vacina de conjugado de PS, conforme descrito na US 4.727.136 (vacina de conjugado de N-Pr-NmB)).

"Excipiente farmaceuticamente aceitável", conforme usado aqui, se refere a qualquer substância adequada a qual proporciona um veículo farmaceuticamente aceitável para administração de um composto de inte- resse a um indivíduo. "Excipiente farmaceuticamente aceitável" pode abran- ger substâncias referidas como diluentes farmaceuticamente aceitáveis, adi- tivos farmaceuticamente aceitáveis e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

"Em combinação com", conforme usado aqui, se refere a usos onde, por exemplo, uma primeira terapia é administrada durante o curso to- do de administração de uma segunda terapia; onde a primeira terapia é ad- ministrada durante um período de tempo que se sobrepõe à administração da segunda terapia, por exemplo, onde a administração da primeira terapia começa antes da administração da segunda terapia e a administração da primeira terapia termina antes da administração da segunda terapia; onde a administração da segunda terapia começa antes da administração da primei- ra terapia e administração da segunda terapia termina antes da administra- ção da primeira terapia; onde a administração da primeira terapia começa antes de administração da segunda terapia e a administração da segunda terapia termina antes da administração da primeira terapia; onde a adminis- tração da segunda terapia começa antes da administração da primeira tera- pia e a administração da primeira terapia termina antes da administração da segunda terapia. Como tal, "em combinação" também pode se referir a um regime envolvendo administração de duas ou mais terapias. "Em combina- ção com" conforme usado aqui, também se refere à administração de duas. ou mais terapias as quais podem ser administradas na mesma ou em dife- rentes formulações, através da mesma ou diferentes vias e no mesmo ou em diferentes tipos de formas de dosagem.

Os termos "indivíduo", "hospedeiro", "paciente" e "indivíduo" são usados permutavelmente aqui para se referir a qualquer mamífero para o qual diagnóstico ou terapia é desejada, particularmente seres humanos. Ou- tros indivíduos podem gado, cães, gatos, porcos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos e assim por diante.

No contexto de terapias e diagnóstico de câncer descritos aqui, "indivíduo" ou "paciente" são usados permutavelmente aqui para se referir a um indivíduo tendo, suspeito de ter ou em risco de desenvolver um tumor, onde o câncer é um associado a células cancerígenas tendo um antígeno de ácido de-N-acetil siálico em uma superfície celular (por exemplo, um gangli- osídeo pelo menos parcialmente de-N-acetilado, proteína modificada com ácido siálico de-N-acetilado). Amostras obtidas de tal indivíduo provavelmen- te são adequadas para uso nos métodos da invenção.

Conforme usado aqui, os termos "determinação", "medição" e "avaliação" e "ensaio" são usados permutavelmente e incluem determina- ções quantitativas e qualitativas.

Deve ser ainda notado que as reivindicações podem ser esbo- çadas para excluir qualquer elemento opcional ou alternativo. Como tal, a presente afirmativa se destina a servir como a base antecedente para uso de terminologia exclusiva como "unicamente", "apenas" e similares com relação à menção de elementos reivindicados ou ao uso de uma limitação "negati- va".

CONJUGADOS E ANTÍGENOS deNAc SA

Antígenos de ácido de-N-acetil siáiico (deNAc SA) da presente descrição contêm pelo menos um epitopo mínimo de um dímero de resíduos de ácido siáiico ou derivados de ácido siáiico, onde o dímero contém pelo menos um resíduo de ácido de-N-acetil siáiico adjacente a um resíduo de ácido siáiico N-acilado (por exemplo, acetilado ou propionilado) ou um resí- duo derivado de um ácido siáiico. Esse epitopo dimèrico, referido aqui como um epitopo de deNAc SA, pode estar posicionado dentro de qualquer região acessível a solvente de um antígeno de ácido de-N-acetil siáiico. Por exem- plo, onde o antígeno de deNAc SA está posicionado dentro de um polímero (por exemplo, um polissacarídeo), por exemplo, conforme em um derivado de PS de-N-acetilado, o epitopo de deNAc SA pode estar posicionado na extremidade de redução, na extremidade de não-redução ou dentro do inte- rior do composto (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais resíduos da extremi- dade de redução ou da extremidade de não-redução do composto). O epito- po dimérico pode estar presente como uma ou mais unidades diméricas den- tro de um antígeno de deNAc SA (por exemplo, como unidades de repetição diméricas consecutivas ou não-consecutivas) ou pode estar presente dentro de outras unidades presentes no deNAc SA, dentro de uma unidade triméri- ca, a qual pode estar presente como unidades de repetição consecutivas ou não consecutivas. Moléculas exemplificativas dentro do escopo da invenção são apresentas nas figuras 6-33.

Deverá ser notado que todos os compostos de deNAc SA des- critos aqui, incluindo aqueles tendo um PS bacteriano ou um gangliosídeo como um material de iniciação ou estrutura principal, podem ser usados em qualquer um dos métodos de imunização, terapêuticos e diagnósticos descri- tos aqui. Assim, por exemplo, um antígeno de deNAc SA (por exemplo, ge- rado usando um PS de NmB) pode ser usado no contexto de uma vacina para o câncer e usado para estimular anticorpos que podem ser usados no tratamento de câncer. Da mesma forma, um antígeno de ácido de-N-acetil siálico (por exemplo, tal como um gerado usando um gangliosídeo de célula de mamífero) pode ser usado no contexto de uma vacina de NmB e para detectar NmB em diagnóstico.

Antígenos de deNAc SA descritos aqui e úteis nos métodos da invenção geralmente compreendem pelo menos um epitopo dimérico, o qual pode estar presente em um polissacarídeo completamente de-N-acetilado ou um polissacarídeo pelo menos parcialmente de-N-acetilado e pode estar presente em unria molécula homopolimérica ou heteropolimérica. Por exem- plo, um antígeno de deNAc SA pode compreender uma ou mais estruturas conforme apresentado abaixo (vide, por exemplo, Fórmulas I-VIII abaixo). Antígenos de deNAc SA podem compreenderá, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 55, 60 ou mais resíduos de ácido siálico ou derivados do mesmo e pode ter um grau de polimeriza- ção (Dp) de cerca de 2 a cerca de 60, cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 30 a cerca de 50, cerca de 10a 20 ou cerca de 12 a cerca de 18, com um Dp de cerca de 2 a cerca de 10 sendo de interesse particular. Antígenos de deNAc SA que são de menor tamanho podem compreender outras modifica- ções (ser conjugados a um veículo, Iipidados e similares) para proporcionar moléculas de tamanho e/ou imunogenicidade adequados. Antígenos de de- NAc SA podem, adicionalmente, compreender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais resíduos de-N-acetilados adjacentes em que, em algumas modalida- des, particularmente onde o antígeno de deNAc SA é composto apenas de resíduos N-acetilados e de-N-acetilados e ainda não foi modificado (por e- xemplo, através de conjugação a um veículo ou através de modificação de um resíduo de ácido siálico na extremidade de redução para conter uma al- quil amina secundária), os resíduos de-N-acetilados de um antígeno de de- NAc SA podem ser 30% ou menos dos resíduos de ácido siálico totais da molécula e resíduos N-acetilados podem ser cerca de 70% ou mais dos re- síduos de ácido siálico totais da molécula. Deve ser notado que "de-N- acetilado" se refere a qualquer número de resíduos de ácido de-N-acetil siá- lico em um polímero de resíduos de ácido siálico, contanto que o epitopo mínimo de deNAc SA esteja presente e, assim, "de-N-acetilado" abrange o termo "pelo menos parcialmente de-N-acetilado".

Arítígenos de deNAc SA de interesse particular são aqueles que, quando administrados a um indivíduo, estimulam a produção de anticorpos que se ligam a uma célula cancerígena que exibe um epitopo de deNAc SA, não reagem, de maneira cruzada, significativa ou detectavelmente com PSA do indivíduo (por exemplo, PSA humano encontrado em células não cance- rígenas). Anticorpos anti-antígeno de deNAc SA são aqueles que facilitam a redução na viabilidade de uma célula cancerígena apresentando epitopo de deNAc SA.

Em geral, antígenos de deNAc SA de interesse são pelo menos parcialmente de-N-aciiados, de modo que os antígenos de deNAc SA são compostos zwiteriônicos compostos, por exemplo, de resíduos de polissaca- rídeo ou derivados dos mesmos e compreendem um ou mais dímeros e/ou um ou mais trímeros, os quais compreendem um epitopo conforme descrito acima. Os antígenos de deNAc SA, tais como derivados de PS de-N- acetilados em geral compreendem pelo menos um epitopo dimérico, onde o epitopo dimérico é caracterizado por ter (1) primeiro e segundo resíduos de- N-acetilados; (2) um primeiro resíduo N-acilado e um segundo resíduo de-N- acilado adjacente (isto é, um resíduo tendo um grupo amina livre), onde o resíduo N-acilado não é um grupo N-propionila (N-Pr); ou (3) um primeiro resíduo de-N-acilado (isto é, um resíduo tendo um grupo amina livre) e um segundo resíduo N-acilado adjacente. Em determinadas modalidades, o re- síduo N-acilado compreende um grupo acila insaturado; em outras modali- dades, o resíduo N-açilado não compreende um grupo N-propionila (N-Pr) (isto é, o resíduo de ácido siálico no dímero não é N-propionilado).

Conforme usado aqui, um "grupo acila" inclui um grupo acila saturado ou insaturado, usualmente, um grupo C2-18 acila saturado ou insatu- rado, um grupo C2-16 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-12 acila satu- rado ou insaturado, um grupo C2-10 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-8 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-6 acila saturado ou insatura- do, um grupo C2-4 acila saturado ou um grupo C2-4 acila insaturado. Um gru- po acila saturado, conforme usado aqui, se destina a se referir a uma carbo- nila unida a um grupo alquila saturado; um grupo acila insaturado, conforme usado aqui, se destina a se referir a uma carbonila unida a um grupo alquila insaturado. Em algumas modalidades, grupos acila insaturados são de inte- resse particular. Os resíduos do dímero podem ser um ácido siálico ou um derivado de ácido siálico, tal como uma Iactona ou ácido siálico cíclico.

Conseqüentemente, os antígenos de deNAc SA compreendem um ou mais resíduos de-N-acetilados de uma porção de ácido siálico ou de- rivado do mesmo (por exemplo, uma lactona, ácido siálico cíclico e simila- res), resíduos de-N-acetilados os quais podem estar posicionados dentro do antígeno de deNAc SA na extremidade de redução, na extremidade de não redução ou dentro do interior de um polímero de resíduos de ácido siálico (isto é, entre as extremidades de redução e não redução), com os antígenos de deNAc SA tendo resíduos de-N-acetilados na extremidade de redução do polímero de polissacarídeo sendo de interesse particular.

Os antígenos de deNAc SA podem ser fornecidos como uma estrutura compreendendo um único epitopo dimérico ou uma unidade poli- mérica compreendendo dois ou mais epitopos diméricos. Antígenos de de- NAc SA podem ser estruturas homopoliméricas ou heteropoliméricas, as quais podem ser compostas de uma ou mais das estruturas abaixo, bem como, em algumas modalidades, resíduos de ácido siálico de-N-acetilados ou N-acetilados adicionais. Quando uma fórmula é proporcionada abaixo com referência a "n" unidades (por exemplo, unidades de uma estrutura di- mérica ou trimérica), o antígeno de deNAc SA pode compreender múltiplos de tais "n" unidades. Por exemplo, um antígeno de deNAc SA pode compre- ender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades consecutivas ou não conse- cutivas de uma determinada estrutura dimérica ou trimérica, onde "n" se re- fere ao número de estruturas diméricas ou triméricas consecutivas dentro de cada unidade. Tais unidades diméricas e triméricas podem ser separadas por resíduos de ácido siálico.

Os antígenos de deNAc SA podem ainda compreender porções adicionais presas ao resíduo de ácido siálico ou derivado do mesmo no tér- mino de não redução, no término de redução ou nos términos de redução e não redução do polímero de polissacarídeo.

Eni uma modalidade, os antígenos de deNAc SA incluem aque- les compreendendo uma estrutura representada pela fórmula:

<formula>formula see original document page 36</formula>

FÓRMULA 1

em que:

X e Y são, independentemente H, um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila) ou um grupo acila saturado ou insatura- do (usualmente um grupo acila saturado) onde, em algumas modalidades, X e Y são independentemente 1) H ou um grupo de proteção amina; ou 2) um grupo acila saturado ou insaturado e

η é pelo menos 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13,14, 15,16, 17,18,19,20,25,30,35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais, usualmente 5 ou mais, mais usualmente cerca de 10 ou mais e pode ter um grau de polimerização (Dp) de cerca de 2 a cerca de 60, cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 30 a cerca de 50, cerca dê 10 a 20 ou cerca de 12 a cerca de 18, com um Dp de cerca de 2 a cerca de 10 sendo de interesse particular, e ainda em que

quando X é um grupo acila saturado ou insaturado (em algumas modalidades, outro que não um grupo propionila e, em outras modalidades outro que não um grupo acila insaturado, Y é H ou um grupo de proteção amina; e

quando Y é um grupo acila saturado ou insaturado (em algumas modalidades, outro que não um grupo propionila e, em outras modalidades outro que não um grupo acila insaturado, X é H ou um grupo de proteção amina. Em outra modalidade de interesse particular, XeY são, independen- temente, H ou um grupo acila saturado ou insaturado, usualmente um grupo acila insaturado. Em outras modalidades, XeY são, independentemente, um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila) ou um grupo acila saturado ou insaturado, usualmente um grupo acila saturado. Em algumas modalidades, particularmente onde X ou Y é H ou um grupo acila insaturado, o derivado de PS é menos do que 90%, usualmente menos do que 8% ou menos do que 80% N-acilado, particularmente onde o derivado de PS compreende pelo menos 10 ou 20 resíduos.

Em uma modalidade de interesse, X na Fórmula I é um grupo acila saturado e Y é H ou um grupo de proteção amina. Em uma modalidade de interesse particular, X na Fórmula I é um grupo acetila e Y é H ou um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila (por exemplo, um grupo trihaloacetila)). Em outra modalidade de interesse, X na Fórmula I é um grupo acila saturado e Y é H; ou X é um grupo acetila e Y é H.

Onde X ou Y são um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila) tais antígenos de deNAc SA são referidos aqui como "an- tígenos de deNAc SA protegidos" (por exemplo, "derivados de PS protegi- dos"), onde o grupo de proteção amina atua para impedir que o grupo amina sofra uma reação durante modificação adicional do antígeno de deNAc SA protegido, por exemplo, conjugação da molécula a um veículo (por exemplo, uma proteína-veículo), adição de uma porção lipídica (por exemplo, adição de uma acil amina em uma extremidade de não redução de um derivado de PS protegido) e similares. O grupo de proteção amina pode, subseqüente- mente, ser modificado para proporcionar uma amina livre no resíduo. Antí- genos de deNAc SA protegidos, em geral, são exemplificados pelas estrutu- ras descritas aqui, onde um grupo de proteção amina está presente em uma posição variável em lugar de um hidrogênio. Isto é, onde um hidrogênio po- deria ser desejado no antígeno de deNAc SA para proporcionar uma amina livre, antígenos de deNAc SA protegidos contêm um grupo de proteção ami- na nesse resíduo em lugar do hidrogênio da amina livre.

Conforme usado aqui, "grupo de proteção amina" se refere a um radical ou grupo de átomos que é ligado a um átomo de nitrogênio da amina de uma molécula para impedir esse átomo de nitrogênio de participar em reações que ocorrem sobre outras porções da molécula. O termo "amina- protegida" denota a característica estrutural de uma molécula contendo um átomo de nitrogênio da amina pelo qual esse átomo de nitrogênio é impedido de participar em reações que ocorrem sobre outras porções da molécula.

Grupos de proteção amina exemplificativos para uso na inven- ção incluem, mas não estão necessariamente limitados a, carbamatos, ami- das, N-alquil e N-aril aminas, derivados de imina, derivados de enanina, N- sulfonilas e similares. Outros grupos de proteção amina exemplificativos in- cluem, mas não estão limitados a: os tipos acila, tais como formila, trifluoroa- cetila, ftalila e p-tolueno-sulfonila; os tipos carbamato aromático, tais como benziloxicarbonila (Cbz) e benziloxicarbonilas substituídas, 1-(p-bifenil)-1- metiletóxi-carbonila e 9-fluorenil-metilóxi-carbonila (Fmoc); os tipos carbama- to alifático, tais como terc-butoxicarbonila (tBoc), etoxicarbonila, diisopropil metóxi carbonila e alilóxi carbonila; os tipos alquil carbamato cíclicos, tais como ciclopentilóxi carbonila e adamantilóxi carbonila; os tipos alquila, tais co- mo trifenilmetila e benzila; trialquil-silano, tal como trimetil-silano; e os tipos con- tendo tiol, tais como feniltiocarbonila e ditia-succinoíla. Grupos de proteção a- mina e grupos amina-protegidos são descritos, por exemplo, em C. B. Reese e E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry," J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, N.Y., 1973, Capítulos 3 e 4, respectivamente e T. W.

• Greene e P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Segunda Edição, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991, Capítulos 2 e 3.

Outros grupos de proteção amina exemplificativos de interesse particular incluem grupos trihaloacila, tais como grupos trihaloacetila e triha- lopropionila (por exemplo, tricloroacetila, trifluoroacetila, tricloropropionila, trifluoropropionila) e similares, com grupos trihaloacetila sendo de interesse.

Em uma modalidade, o antígeno de deNAc SA compreendendo uma estrutura da Fórmula I é conjugado a um veículo, por exemplo, por meio de fixação covalente através de uma C2 acetona, um C6 aldeído, C7 aldeído ou C8 aldeído, conforme descrito abaixo (por exemplo, proteína-veículo-C2- NH ou proteína-veículo-C6-NH), onde o veículo pode estar presente na ex- tremidade de redução ou não redução ou ambas (por exemplo, através de uma ligação a um resíduo na extremidade de redução do derivado, a um resíduo na extremidade de não redução do derivado ou ambos). Em outra modalidade de interesse particular, o antígeno de de-NAc SA compreende pelo menos um dímero de Fórmula I e compreende, na extremidade de não redução, um resíduo de ácido siálico N-acilado ou de-N-acilado substituído por uma acil amina (por exemplo, uma acil amina saturada ou insaturada, usualmente uma acil amina graxa saturada ou insaturada, usualmente uma acil amina saturada (por exemplo, NHC2-18, NHC2-12, NHC2-10, NHC2-8, NHC4-12, e similares) (vide, por exemplo, a porção na extremidade de não redução das Fórmulas IVa e IVb). Essas últimas modalidades compreendendo um veículo e/ou uma acil amina são de interesse particular onde o antígeno de deNAc SA compreende uma estrutura de Fórmula I, em que X é H e Y é um grupo acetila ou onde X é um grupo acetila e Y é H. Em outra modalidade específica, onde o antígeno de deNAc SA compreende uma estrutura de Fórmula I, em que X é H e Y é um grupo acetila ou onde X é um grupo acetila e Y é H1 o derivado de PS é proporcionado em combinação com um adjuvante, conforme descrito abaixo, onde o derivado de PS e o adjuvante são usualmente fornecidos em um veículo farmaceuticamente aceitável (diluente seco ou aquoso).

Em uma modalidade, o dímero é um dissacarídeo, onde o dis- sacarídeo compreende um ou mais resíduos nos quais o grupo N-acetila sobre o grupo C-5 amino foi removido ou onde um dos dois resíduos são de- N-acetilados, o segundo resíduo contém um grupo N-acetila (mas, em algumas modalidades, não um grupo N-propionila). A unidade dissacarídica que define esse epitopo mínimo pode estar na extremidade de redução, na extremidade de não redução ou dentro do polissacarídeo. Onde o antígeno de deNAc SA é proporcionado como um dissacarídeo, a composição pode ter a estrutura:

<formula>formula see original document page 39</formula>

FÓRMULA II

em que X e Y são, independentemente, H, um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila) ou um grupo acila saturado ou insaturado; de preferência ainda em que, quando X é um grupo acila (de preferência, outro que não um grupo propionila), Y é H ou um grupo de proteção amina e, quando Y é uni grupo acila (de preferência, outro que não um grupo propio- nila), X é H ou um grupo de proteção amina. Em uma modalidade de inte- resse particular, X é um grupo acetila e Y é H. Onde X e/ou Y são um grupo de proteção amina, o composto é referido aqui como um antígeno de deNAc SA protegido, onde os grupos de proteção podem ser explicados conforme descrito acima. Grupos de proteção amina exemplificativos são aqueles des- critos acima. Um antígeno de deNAc SA de Fórmula Il pode ser ainda modi- ficado para incluir um veículo e/ou uma acil amina, conforme descrito acima para os antígenos de deNAc SA de Fórmula I, particularmente onde X é H e Y é um grupo acetila; ou onde X é um grupo acetila e Y é H.

Antígenos de deNAc SA também incluem aqueles compreen- dendo uma estrutura representada pela fórmula:

<formula>formula see original document page 40</formula>

FÓRMULA III

onde X, Y e η são conforme definido acima e R1 e R2 são independentemen- te H ou um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila); ou um grupo acila (por exemplo, grupo acetila), conforme descrito acima. Um antígeno de deNAc SA de Fórmula III pode ainda ser modificado para incluir um veículo e/ou uma acil amina, com modificação de antígenos de deNAc SA protegidos sendo de interesse, conforme descrito acima para os antíge- nos de deNAc SA das Fórmulas I e II, particularmente onde X e H e Y é um grupo acetila e onde X é um grupo acetila e Y é H.

Em outra modalidade, o antígeno de deNAc SA compreende uma estrutura representada pelas fórmulas: <formula>formula see original document page 41</formula>

em que:

Χ1, X, Y e Z são H1 um grupo de proteção amina (por exemplo, um grupo trihaloacila) ou um grupo acila saturado ou insaturado, usualmente um grupo acila insaturado, usualmente em que Χι, X, Y e Z são 1) H ou um grupo de proteção amina ou 2) um grupo acila saturado ou insaturado (usu- almente um grupo acila saturado); contanto que pelo menos um de X, Y e Z seja H ou um grupo de proteção amina; e pelo menos um de X, Y e Z seja um grupo acila saturado ou insaturado (usualmente saturado); com modali- dades de interesse particular sendo aquelas nas quais pelo menos um de X, Y e Z é H ou um grupo de proteção amina; pelo menos um de X, Y e Z é um grupo acetila e pelo menos um de X, Y e Z é um grupo propionila;

η é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais, usualmente 5 resíduos ou mais, mais usualmente cerca de 10 resíduos ou mais (por exemplo, tendo um grau de polimerização (Dp) de cerca de 2 a cerca de 60, cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 30 a cerca de 50, cerca de 10 a 20 ou cerca de 12 a cerca de 18, com um Dp de cerca de 2 a cerca de 10 sendo de interesse particular);

R1 é uma acil amina saturada ou insaturada, usualmente um acil amina graxa saturada ou insaturada, usualmente uma acil amina saturada (por exemplo, NHC2-18, NHC2-12, NHC2-10> NHC2-8, NHC4-12 e similares); e

R2 é uma hidroxila ou um ou mais resíduos de ácido acilado, aminaprotegidás (isto é, tendo um grupo de proteção amina, por exemplo, trihaloacilados) ou de-N-acetilados e resíduos de ácido siálico acilados (usu- almente um resíduo de ácido siálico tendo um grupo N-acila saturado, por exemplo, resíduos de ácido siálico acetilados, resíduos de ácido siálico pro- pionilados e similares).

Em uma modalidade, os antígenos de deNAc SA da Fórmula IVa e IVb compreendem pelo menos um de cada um de uma amina livre (ou um grupo de proteção amina), um grupo acetila e um grupo propionila. Nes- sa modalidade, o derivado de PS pode ter a estrutura da Fórmula V em que, quando X é Η, Y e Z são diferentes grupos acila e são um grupo acetila ou um grupo propionila; quando X é um grupo acetila, Y e Z são diferentes por- ções e são H (ou um grupo de proteção amina) ou um grupo propionila; e quando X é um grupo propionila, YeZ são diferentes porções e são H (ou um grupo de proteção amina) ou um grupo acetila. Modalidades exemplifica- tivas são apresentadas nas Figs. 23-37.

Em outra modalidade, os antígenos de deNAc SA podem ser descritos como compreendendo pelo menos um trímero tendo uma estrutura representada pela fórmula:

<formula>formula see original document page 42</formula>

FÓRMULA V

em que:

X, Y e Z são, independentemente, H, um grupo de proteção a- mina (por exemplo, um grupo trihaloacila) ou um grupo acila saturado ou insaturado (usualmente um grupo acila saturado); usualmente onde X, Y e Z são independentemente 1) H ou um grupo de proteção amina ou 2) um gru- po acila saturado ou insaturado, usualmente um grupo acila saturado; con- tanto que pelo menos um de X, Y e Z seja H ou um grupo de proteção ami- na; e pelo menos um de X, Y e Z seja um grupo acila saturado ou insatura- do, usualmente um grupo acila saturado; com modalidades de interesse par- ticular sendo aquelas nas quais pelo menos um de X1 Y e Z é H ou um grupo de proteção amina; pelo menos um de X, Y e Z é um grupo acetila; e pelo menos um de X, Y e Z é um grupo propionila;

n é pelo menos 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60 ou mais, usualmente cerca de 4 resíduos ou mais, mais usualmente cerca de 10 resíduos ou mais (por e- xemplo, tendo um grau de polimerização (Dp) de cerca de 2 a cerca de 60, cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 30 a cerca de 50, cerca de 10 a 20 ou cerca de 12 a cerca de 18, com um Dp de cerca de 2 a cerca de 10 sendo de interesse particular).

Em uma modalidade, o antígeno de deNAc SA tèm uma estrutu- ra de acila misturada em que cada trímero compreende pelo menos um de cada de uma amina livre, um grupo acetila e um grupo propionila. Nessa modalidade, o antígeno de deNAc SA tem a estrutura de Fórmula V em que, quando X é Η, Y e Z são diferentes grupos acila e são um grupo acetila ou um grupo propionila; quando X é um grupo acetila, YeZ são diferentes por- ções e são H ou um grupo propionila; e quando X é um grupo propionila, Y e Z são diferentes porções e são H ou um grupo acetila.

Antígenos de deNAc SA incluem derivados de acila tendo gru- pos alquila saturados ou insaturados, usualmente saturados, de C1-C4, usu- almente C1-C3 incluindo, por exemplo, acetila, propionila, isopropila, butionila e similares. Antígenos de deNAc SA ainda incluem derivados de acila mistu- rados contendo um ou mais sítios de-N-acilados, onde os antígenos de de- NAc SA incluem diferentes grupos acila saturados ou insaturados, usual- mente saturados.

Antígenos de deNAc SA ainda incluem aqueles contendo uma porção de lactona, uma porção ácido siálico cíclico ou outro derivado de áci- do siálico, além de ou em lugar de uma ou mais porções de ácido siálico de um antígeno de deNAc SA descrito aqui. Por exemplo, os antígenos de de- NAc SA tendo üma porção de lactona podem compreender a estrutura:

<formula>formula see original document page 44</formula>

FÓRMULA VI

onde X, Y e η são conforme definido acima.

Antígenos de deNAc SA tendo uma porção de lactona podem estar presentes em um heteropolímero compreendendo um ou mais políme- ros (por exemplo, dímeros, trímeros) tendo uma estrutura conforme descrito aqui.

Em outro exemplo, o antígeno de deNAc SA compreende uma imina cíclica e/ou reduzida para uma porção de amina secundária cíclica (por exemplo, 1-(4-hidróxi-5-hidróximetil-pirrolidin-2-il)-etanona) em Iugarde uma porção de ácido siálico podem compreender a estrutura:

FÓRMULA VII

<formula>formula see original document page 44</formula>

onde Xen são conforme definido acima.

Antígenos de deNAc SA tendo uma porção amina secundária cíclica ou imina cíclica podem estar presentes em um heteropolímero com- preendendo um ou mais polímeros (por exemplo, dímeros, trímeros) tendo uma estrutura conforme descrito aqui.

Onde o antígeno de deNAc SA é fornecido como uma única uni- dade do epitopo (isto é, dois resíduos conforme apresentado acima ou três resíduos conforme descrito abaixo), o antígeno de deNAc SA é normalmente covalentemente preso a um veículo (por exemplo, um veículo de proteína). Em geral e particularmente onde o antígeno de deNAc SA é um dissacarídeo (por exemplo, conforme mostrado na figura 11), trissacarídeo ou outra molé- cula de 3 ou menos resíduos, o antígeno de deNAc SA pode ser acoplado através de da C2 cetona ou, após tratamento com periodato, o C6 aldeído através de aminação redutiva a uma proteína-veículo (por exemplo, proteína C2-NH-veículo ou proteína C6-NH-veículo). Em outras modalidades, a amina é acoplada a aldeídos em C7, C6 e/ou C8 (vide, por exemplo, figuras 20-22), o que provavelmente é o resultado de oxidação incompleta. Acoplamento a C7 é mais comum, com acoplamento a C6 e C8 sendo menos comum.

Antígenos de deNAc SA ainda incluem aqueles tendo um ou mais resíduos tendo porções lipídicas presas (tal como descrito em US 6.638.513). antígenos de deNAc SA também incluem aqueles tendo um ou mais resíduos tendo grupos N-acila graxa presos (por exemplo, N-lauroíla, N-oleoíla e similares). De interesse particular são antígenos de deNAc SA nos quais resíduos contendo N-acila graxa constituem, por exemplo, 50% de resíduos de ácido siálico de um polímero de ácido siálico de antígeno de deNAc SA ou menos, de modo que os antígenos de deNAc SA resultantes ainda são solúveis em água. Antígenos de deNAc SA também incluem aque- les tendo um ou mais resíduos de ácido siálico amidados, resíduos os quais têm uma alquil amina secundária, usualmente em uma extremidade de não redução de um polímero de um antígeno de deNAc SA. Antígenos de deNAc SA tendo um ou mais resíduos de ácido siálico amidados podem ser prepa- rados, por exemplo, através de acoplamento de aminas graxas (por exem- plo, dodecil amina, oleoil amina e similares) a um grupo C1 carboxila através de substituição nucleofílica. De interesse particular são antígenos de deNAc SA nos quais tais derivados de C1 amida constituem, por exemplo, cerca de 50% de resíduos ou menos do antígeno de deNAc SA. Antígenos de deNAc SA ainda incluem aqueles conjugados a um veículo na extremidade de redu- ção ou não redução ou ambas (por exemplo, através de ligação a um resí- duo na extremidade de redução do derivado, a um resíduo na extremidade de não redução do derivado ou ambas).

Os antígenos de deNAc SA podem ser homopolímeros ou hete- ropolímeros dé 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16,17, 18,19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais unidades de epitopo dimérico (definin- do o epitopo mínimo) conforme descrito acima, unidades diméricas as quais podem ser adjacentes ou separadas por monômeros ou polímeros de resí- duos de ácido siálico ou derivados do mesmo. Em algumas modalidades, os resíduos N-acilados do antígeno de deNAc SA representam menos de 90%, menos de 85%, menos de 84%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 60% ou menos de 55% dos resíduos totais do composto.

Em outras modalidades, a proporção de resíduos de-N-acetila- dos para resíduos N-acilados é 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1 ou mais. Em modali- dades específicas, a proporção de resíduos de-N-acetilados pára resíduos N-acetilados é 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1 ou mais. Em outras modalidades es- pecíficas, a proporção de resíduos de-N-acetilados para resíduos N-pro- pionilados é 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1 ou mais. Em outras modalidades espe- cíficas, a proporção de resíduos de-N-acetilados para resíduos N-alquilados é 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1 ou mais. Em outra modalidade específica, a pro- porção de resíduos de-N-acetilados para resíduos N-acetilados é 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1 ou mais.

Antígenos de deNAc SA podem ser proporcionados como uma composição que é homogênea ou heterogênea com relação ao antígeno de deNAc SA contido na mesma. Por exemplo, a invenção considera composi- ções compreendendo os antígenos de deNAc SA que são homogêneos ou heterogêneos com relação a uma ou mais da estrutura de epitopo dimérica, posição do epitopo dimérico dentro do antígeno de deNAc SA, presença ou ausência de uma proteína-veículo conjugada, Dp, peso molecular, proporção de resíduos de-N-acilados para N-acilados, grau de N-acilação (por exem- pio, grau de N-acetilação ou N-propionilação) e similares.

Deve ser compreendido que os antígenos de deNAc SA podem ser modificados para proporcionar uma variedade de atributos desejados, por exemplo, características farmacológicas aperfeiçoadas, ao mesmo tem- po em que aumenta ou pelo menos retarda substancialmente toda a antige- nicidade ou Lmunogenicidade do antígeno de deNAc SA não modificado. Por exemplo, um PS pode ser modificado através de extensão, diminuição do número de resíduos no polímero (por exemplo, de modo a proporcionar dife- rentes graus de polimerização (Dp)). Por "Dp" entenda-se o número de resí- duos de um polímero.

Substituições com diferentes resíduos, quer que ocorrem natu- ralmente ou não ocorrem naturalmente, também podem ser feitas, por exemplo, como um resultado de modificação química durante de-N-acetilação, N-aci- lação e similares. Por exemplo, os antígenos de deNAc SA descritos aqui podem ser modificados por uma porção lipídica (conforme descrito, por e- xemplo, nos Exemplos 1 e 5 abaixo e na US 6.638.513 (Seid)), conjugados a um veículo (por exemplo, na extremidade de redução ou não redução) e po- dem compreender estruturas de lactona, ácido siáíico cíclico, imina e imina reduzida. Em outro exemplo, os antígenos de deNAc SA podem ser modifi- cados através de fixação de um grupo N-acila graxa (por exemplo, N-Iau- roíla, N-oleoíla e similares). Em outro exemplo, os antígenos de deNAc SA podem incluir um ou mais resíduos de ácido siálico tendo uma alquil amina secundária (por exemplo, derivados de C1 amida), os quais podem ser pre- parados, por exemplo, através de acoplamento de aminas graxas (por e- xemplo, dodecil amina, oleoil amina e similares) a um grupo C1 ceto através de substituição nucleofílica.

O antígeno de deNAc SA (por exemplo, PS de-N-acetilado) em- pregado na invenção em questão não precisa ser idêntico àqueles descritos na seção Exemplos abaixo, na medida em que o PS de-N-acetilado em questão seja capaz de induzir a uma resposta imune em um hospedeiro que proporciona a produção de anticorpos que se ligam seletivamente ao polis- sacarídeo capsular de N. meningitidis, com pouca ou nenhuma ligação signi- ficativa a antígenos do hospedeiro (por exemplo, ao ácido polissiálico do hospedeiro (PSA)). Assim, aqueles versados na técnica reconhecerão que uma série de derivados (descritos em maiores detalhes abaixo) podem ser feitos sem afetar substancialmente a atividade do PS de-N-acetilado. Métodos de fabricação de antígenos de SA de-N-acetilados

Conforme descrito abaixo em maiores detalhes, a presente des- crição proporciona métodos para a produção de antígenos de deNAc SA.

Em uma modalidade, antígenos de deNAc SA são produzidos através de modificação química de um polissacarídeo bacteriano. Em outra modalidade, os antígenos de deNAc SA são produzidos usando um método biossintético envolvendo cultura de bactérias (grupo B de Neisseria meningitidis ou Es- cherichia coli K1) ou uma célula de mamífero na presença de um composto de trihaloacetila, seguido por modificação química de um composto interme- diário derivado de PS expresso sobre a superfície celular. Cada um desses é descrito em maiores detalhes abaixo.

Produção de antígenos de SA de-N-acetilados usando PS bacteriano

Em uma modalidade, antígenos de deNAc SA podem ser produ- zidos através de de-N-acetilação de um PS de N. meningitidis ou E. coli K1 ou outra fonte adequada de PS bacteriano, seguido por re-N-acilação parci- al. Re-N-acilação parcial proporciona a produção de um derivado de PS de- N-acetilado tendo menos do que 90%, menos do que 85%, menos do que 84%, menos do que 80%, menos do que 75%, menos do que 70%, menos do que 60% ou menos do que 55%, usualmente cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40% ou cerca de 45% de resíduos N-acilados com relação aos resíduos totais do composto. A esse respeito, a invenção proporciona o controle do nível de acilação do produto final, de modo a proporcionar um PS de-N-acetilado tendo um nível desejado de acilação. Em geral, re-acilação é controlada ou impedida através de limitação da quantidade do reagente de acilação.

Os antígenos de deNAc SA também podem ser produzidos atra- vés de de-N-acetilação de um PS de N. meningitidis ou E. coli K1 ou qual- quer outra fonte adequada de PS bacteriano, seguido por re-N-acilação com uma mistura de um grupo amina-protegido e grupos acila (por exemplo, gru- pos trihaloacetila e acetila) em uma proporção desejada, de modo que o de- rivado de PS contenha menos do que 90%, menos do que 85%, menos do que 84%, menos do que 80%, menos do que 75%, menos do que 70%, me- nos do que 60%, menos do que 55% de resíduos amina-protegidos, usual- mente cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40% ou cerca de 45% de resíduos amina- protegidos (por exemplo, resíduos N-trihaloacilados) com relação aos resí- duos totais do composto (onde o composto geralmente contém pelo menos 10 ou pelo menos 20 resíduos). O nível de acilação do produto final após remoção do grupo de proteção amina pode ser controlado para reduzir rea- ções colaterais indesejáveis com grupos amino livres, de modo a proporcio- nar um antígeno de deNAc SA tendo um nível desejado de acilação. Remo- ção dos grupos de proteção amina para uma amina livre no resíduo despro- tegido. Em geral, a proporção de resíduos de de-N-acetila é controlada limi- tando a quantidade de reagente de proteção amina (por exemplo, a quanti- dade de um reagente de trihaloacilação).

Antígenos de deNAc SA também podem ser produzidos através de biossíntese de um PS de meningitidis ou E. coli K1 ou outra fonte ade- quada de PS bacteriano, no qual o meio de crescimento bacteriano é suple- mentado com uma mistura de uma manosamina amina-protegida (por e- xemplo, N-trihaloacil manosamina) e acil manosamina (por exemplo, N- trihaloacetil e N-acetil manosamina) em uma proporção desejada, de modo que o antígeno de deNAc SA expresso pelas bactérias contêm menos do que 90%, menos do que 85%, menos do que 84%, menos do que 80%, me- nos do que 75%, menos do que 70%, menos do que 60% ou menos do que 55% de resíduos amina-protegidos (por exemplo, N-trihaloacilados) com re- lação aos resíduos totais do PS produzido. O nível de acilação do produto final após remoção do grupo de proteção amina é controlado para reduzir reações colaterais indesejáveis com grupos amino livres, de modo a propor- cionar um antígeno de deNAc SA tendo um nível desejado de acilação. Em geral, a proporção de resíduos de de-N-acetila é controlado limitando a quantidade do reagente de manosamina amina-protegido (por exemplo, N- trihaloacetil manosamina).

PS, incluindo PS de NmB e E. coli K1, são moléculas exemplifi- cativas adequadas para uso nos derivados de PS e conjugados e outras mo- léculas da invenção e tais materiais de partida são conhecidos na técnica, assim como métodos para seu isolamento e conjugação a um veículo.

Antígenos de deNAc SA podem ser gerados através de qualquer meio convencional adequado. Por exemplo, em uma modalidade, os antíge- nos de deNAc SA podem ser produzidos através de de-N-acetilação de um PS, o que pode ser realizado através de contato de um PS nativo com um meio aquoso básico em temperaturas elevadas, por exemplo, cerca de 90 eC a cerca de 110 eC e em um pH de cerca de 13 a cerca de 14 (por exemplo, em hidróxido de sódio em uma concentração de cerca de 2M). Alternativa- mente, hidrazina em solução aquosa pode ser usada. O grau de N- deacetilação nesse estágio pode variar, com pelo menos cerca de 85%, cer- ca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% até cerca de 100% de de-N- acetilação sendo de interesse. O produto de-N-acetilado pode ser recupera- do, por exemplo, através de resfriamento, neutralização, purificação se dese- jado e liofilização.

Os métodos de produção não-aquosos e biossintéticos são des- critos em maiores detalhes abaixo, bem como nos Exemplos. Métodos de produção não-aquosos

Em uma modalidade, antígenos de ácido de-N-acetil siálico po- dem ser produzidos através de modificação química de um PS em um sol- vente orgânico prático polar contendo menos de 5% de água. Métodos ba- seados em solução aquosa usados para preparar derivados de PS de NmB (conforme, por exemplo, no Exemplo 1) produzem quantidades relativamen- te pequenas de material que é reativo com mAbs não auto-reativos proteto- res (por exemplo, SEAM 2.3). Sem estar preso à teoria, esse baixo rendi- mento resulta de uma ou mais de falha em remover todos os grupos N- acetila conforme descrito acima, falha em controlar quantitativamente a quantidade de re-N-acilação em virtude de pobre reatividade dos grupos a- - mino do PS (emparelhamento de carga de COO" e NH3+ intramolecular), hi- drólise competitiva do reagente de acilação e/ou oxidação do grupo amino através de periodato quando de preparação de aldeídos da extremidade de não redução.

Realização de acilação de PS em um solvente orgânico prático polar e, onde desejado, na presença de uma pequena quantidade de água (por exemplo, formamida, formamida misturada/2,5% de água e similares), grupos de amino proteção (por exemplo, com uma trihaloacila (por exemplo, tricloroacetila ou trifluoroacetila), amida), o qual é depois removido para ge- rar frações previsíveis de resíduos de de-N-acetila e uso de uma base forte (por exemplo, hidróxido ou metóxido de sódio) durante a etapa de acilação para assegurar reatividade do grupo amino proporciona rendimentos aper- feiçoados e melhor controle da fração de resíduos de-N-acetilados).

O solvente orgânico pode ser qualquer solvente adequado, usu- almente um solvente orgânico prático ou aprótico polar. Exemplificativo de tais solventes incluem formamida, dimetilformamida, formamida/dimetilfor- mamida misturadas e similares ou misturas de solventes orgânicos e um pequeno percentual de água (tipicamente pelo menos cerca de 2% ou 2,5% de água, mas usualmente menos do que 10%, menos do que 5%). Água é adicionada conforme necessário para assegurar solubilidade dos componen- tes, particularmente do PS.

Os grupos amina da molécula são protegidos através de modifi- cação dos mesmos com um grupo de proteção amina adequado. Grupos de proteção amina exemplificativos são descritos acima e incluem, sem limita- ção, um carbamato ou amida, incluindo N-alquil e N-aril aminas, derivados de imina, derivados de enamina, N-sulfonila e similares. Em uma modalidade de interesse particular, os grupos de proteção amina são uma trihaloacil a- mida, usualmente grupos trihaloacila de C2-C12, mais usualmente C2-C10, mais usualmente C2-C8, mais usualmente C2-C6, ainda mais usualmente um grupo de proteção de trihaloacetila ou trihalopropionila. Tais grupos de pro- teção podem ser selecionados com relação à estabilidade em um pH de 8 ou menor, estabilidade na presença de periodato e/ou facilidade de remoção, conforme descrito abaixo. Em geral, o grupo de proteção amina impede N- oxidação na presença de periodato. A forma do antígeno de deNAc SA pro- duzido após esse etapa de proteção é referida aqui como o "antígeno de deNAc SA protegido", "antígeno de deNAc SA acilado protegido", "derivado de PS protegido" ou "derivado de PS acilado protegido", em que o composto compreende um ou mais grupos de proteção amina (por exemplo, grupos amina trihaloacila-protegidos).

Em geral, a produção de um antígeno de deNAc SA protegido é realizada através de contato de uma molécula de PS pelo menos parcial- mente de-N-acetilada com um reagente de grupo de proteção amina e um reagente de acilação na presença de um solvente orgânico, conforme descri- to acima. O reagente de proteção amina pode ser, por exemplo, um reagen- te de trihaloacilação, por exemplo, anidrido trihaloacético ou alquil ésteres trihaloacéticos sendo de interesse particular (por exemplo, anidrido tricloroa- cético, anidrido trifluoroacético, etil trifIuoroacetil éster ou etil tricloroacetil éster e similares). Reagentes de acilação proporcionam um grupo acila ati- vado, em que o grupo acila ativado é usualmente um grupo acetila ou grupo propionila, mais usualmente um grupo acetila. Em algumas modalidades, o reagente de trihaloacilação e reagentes de acilação são contatados com a molécula de PS de-N-acetilada como uma mistura.

As quantidades relativas de reagente de trihaloacilação e rea- gente de acilação na mistura são proporcionadas de modo que o produto final da etapa de proteção contenha a proporção desejada de resíduos triha- loacilados e resíduos acilados, em que os grupos trihaloacilados geralmente serão removidos para proporcionar uma amina livre no produto final. Por e- xemplo, onde a proporção de aminas livres para resíduos acilados no produ- to antígeno de deNAc SA final tem de ser cerca de 1:10, 1:4 ou 1:1, a pro- porção de reagente de trihaloacilação para reagente de acilação está pre- sente na mistura em uma proporção de cerca de 1:10, 1:4 ou 1:1. Dizendo de modo diferente, a quantidade de reagente de trihaloacilação na mistura é aproximadamente igual à fração de grupos de-N-acetila desejada no produto antígeno de deNAc SA final após desproteção (por exemplo, 10%, 25%, 50% e similares). Ό reagente de acilação também pode ser proporcionado como uma mistura de diferentes grupos acila (por exemplo, acetila, propioni- la) de modo a proporcionar uma proporção desejada de grupos diferente- mente acilados no derivado de PS. Por exemplo, onde o antígeno de deNAc SA tem de ter uma proporção de resíduos acetilados para resíduos propioni- lados de 2:1 ou 1:1, os agentes de acilação para grupos acetila e propionila ativados são proporcionados na mesma ou em uma proporção similar na mistura de agente de acilação.

Após a etapa de proteção, o antígeno de deNAc SA protegido pode, então, ser modificado conforme desejado, por exemplo, através de conjugação a um veículo desejado, por exemplo, através de periodinação, seguido por aminação redutiva. Os grupos de proteção podem, então, ser removidos (por exemplo, através de hidrólise ou proteção) para deixar uma amina livre, assim, proporcionando o antígeno de deNAc SA final. Os grupos de proteção amina podem ser removidos através de hidrólise usando uma base aquosa forte (por exemplo, pH de 9 ou maior), através de redução (por exemplo, com borohidreto de sódio) ou através da amina adicionada durante a preparação de conjugados através de aminação redutiva (vide, por exem- plo, Exemplo 5). O antígeno de deNAc SA pode, então, ser isolado de acor- do com métodos bem-conhecidos na técnica.

Os métodos de produção não-aquosos podem ser desejáveis por uma série de diferentes razões. Primeiro, realização das reações de aci- lação em um solvente orgânico proporciona maior flexibilidade no tipo de grupos acila que podem ser usados. Por exemplo, o uso de um solvente or- gânico facilita o uso de grupos acila graxos de mais de 4 carbonos, o que pode impor desafios com relação à solubilidade em sistemas aquosos, bem como grupos acila ativados altamente reativos (por exemplo, trifluoroacetila e tricloroacetila). A reação em solvente orgânico também proporciona maior controle sobre o grau de acilação, uma vez que não há ou há uma reação de competição mínima com a água e OH para eliminar o reagente. Como um resultado, as reações de acilação com o polissacarídeo podem ser projeta- das de modo que elas processem até término.

A abordagem não-aquosa também permite o uso de grupos a- mina protegidos. Quando deixados desprotegidos, os grupos amina do polis- sacarídeo podem participar em outras reações indesejadas, tal como oxida- ção na presença de periodato e reações intramoleculares com grupos car- boxila ativados ou com aldeídos introduzidos na extremidade de não redu- ção e na cetona da extremidade de redução. Trifluoroacetila ou tricloroacetila são grupos de proteção preferidos, uma vez que eles são estáveis em um pH de menos do que cerca de 8, estáveis na presença de periodato e podem ser facilmente removidos em base aquosa ou através de redução com boro- hidreto de sódio para produzir o antígeno de deNAc SA contendo resíduos de de-N-acetila, onde o percentual de resíduos de de-N-acetila é controlado pela quantidade de amina derivatizada com grupos de proteção. Métodos biossintéticos de produção de antígeno de deNAc SA usando bac- térias

Em outra modalidade, os antígenos de deNAc SA são gerados através de cultura de bactérias N. meningitidis, particularmente bactérias do Grupo B, na presença de um ou mais derivados de N-acil manosamina e sob condições para promover a produção de antígeno de deNAc SA tendo resí- duos de ácido N-acil siálico. Isso pode ser realizado incluindo, no meio de cultura bacteriano, um derivado de manosamina tendo um grupo N-acila de- sejado.

Em uma modalidade, o derivado de N-acil manosamina é uma manosamina compreendendo um grupo de proteção amina (uma "manosa- mina protegida" ou "manosamina amina-protegida"), exemplificado aqui por N-trihaloacil manosaminas, para realizar alimentação do derivado de mano- samina às bactérias. .Manosaminas amina-protegidas exemplificativas ade- quadas para uso na invenção incluem qualquer manosamina amina- protegida que pode ser incorporada na via sintética do PS bacteriano para proporcionar a produção de um antígeno de deNAc SA protegido. Reagentes de manosamina amina-protegida exemplificativos incluem N-trihaloacil ma- nosamina, por exemplo, N-trihaloacetil manosamina (por exemplo, N- tricloroacetil manosamina, trifluoroacetil manosamina), N-formil manosamina e similares). Além da manosamina amina-protegida, o meio de cultura ge- ralmente também inclui uma N-acetil manosamina, para proporcionar um antígeno de deNAc SA tendo resíduos de ácido siálico protegidos e resíduos de ácido siálico N-acetilados.

Sem estar preso à teoria, quando cultivadas na presença da manosamina amina-protegida, enzimas bacterianas envolvidas na biossínte- se capsular incorporam a manosamina amina-protegida no ácido siálico o qual, então, é incorporado no polissacarídeo capsular. Métodos padrão de fermentação e purificação podem ser usados para gerar um antígeno de de- NAc SA protegido contendo uma fração desejada de monômeros tendo gru- pos de proteção presos. O antígeno de deNAc SA contendo esses grupos de proteção pode ser das estruturas descritas acima, por exemplo.

Em uma modalidade relacionada, onde um antígeno de deNAc SA tendo resíduos de ácido N-acil siálico misturados é desejado, o meio de cultura inclui reagentes de N-acil manosamina misturados. Por exemplo, a N-acil manosamina pode compreender grupos acila saturados ou insatura- dos, usualmente grupos acila saturados de C1-C5, mais usualmente C2-C5, mais usualmente C2-C4, mais usualmente C2-C3, com grupos acetila ou pro- pionila sendo de interesse particular. Cultura das bactérias na presença de tais reagentes de N-acil manosamina misturados pode proporcionar a produ- ção de um antígeno de deNAc SA tendo resíduos de ácido N-acil siálico mis- turados, por exemplo, ácido N-acetil siálico, ácido N-propionil siálico e simila- res. Em uma modalidade de interesse particular, as bactérias são cultivadas na presença de uma mistura de uma manosamina protegida (por exemplo, uma N-trihaloacil manosamina) e N-acil manosaminas (por exemplo, uma mistura de N-acetil manosamina e N-propionil manosamina).

Em uma modalidade, bactérias N. meningitidis, de preferência uma cepa do Grupo B, são cultivadas na presença de uma mistura de uma N-acil manosamina (por exemplo, N-acetil manosamina) e uma N-trihaloacil manosamina. Em outras modalidades, a bactéria é uma cepa não encapsulada e pode ser uma cepa que é defectiva quanto à sínte- se de PS capsular na ausência de N-acetil manosamina suplementar no meio de cultura (por exemplo, em virtude de um defeito em uma ou mais en- zimas, de modo que a bactéria não pode sintetizar PS capsular, a menos que o meio de crescimento seja suplementado com N-acetil manosamina). Por exemplo, a cepa pode ser defectiva quanto a uma epimerase de N- acetil-D-glicosamina-6-fosfato 2, tal como na cepa de NmB M7.

As quantidades relativas de reagentes de manosamina na cultu- ra (por exemplo, a proporção de N-trihaloacil manosamina e N-acetil mano- samina) são proporcionadas de modo que o produto biossintético final con- tenha a proporção desejada de diferentes resíduos e/ou derivados de ácido siálico no antígeno de SEAM 3 (por exemplo, resíduos trihaloacilados e resí- duos acilados sobre o antígeno de deNAc SA). Em geral, os grupos de pro- teção (por exemplo, os grupos trihaloacilados) são removidos para propor- cionar uma amina livre no produto antígeno de deNAc SA final. Por exemplo, onde a proporção das aminas livres para resíduos acilados no produto antí- geno de deNAc SA final tem de ser cerca de 1:10, 1:4 ou 1:1, a proporção de N-trihaloacil manosamina para manosamina é cerca de 1:10, 1:4 ou 1:1. Fa- lando de modo diferente, a quantidade de N-trihaloacil manosamina na cultu- ra é aproximadamente igual à fração de grupos ácido de-N-acetil siálico de- sejados no produto antígeno de deNAc SA final após desproteção (por e- xemplo, 10%, 25%, 50% e similares).

Similarmente, as quantidades relativas de N-acil manosaminas "não protegidas" (manosaminas que não contêm um grupo de proteção ami- na, mas as quais podem compreender, por exemplo, um grupo acetila ou propionila como o grupo N-acila) na cultura podem ser fornecidas de modo a proporcionar uma proporção desejada de diferentes resíduos de ácido siálico acilado no antígeno de deNAc SA. Por exemplo, onde o antígeno de deNAc SA tem de ter uma proporção de resíduos acetilados para resíduos propioni- lados de 2:1 ou 1:1, N-acetil manosamina e N-propionil manosamina é pro- porcionada na mesma ou em uma proporção similar na cultura.

Os antígenos de deNAc SA podem, então, ser isolados das bac- térias usando métodos conhecidos na técnica. Onde o antígeno de deNAc SA contém um grupo de proteção amina, tal antígeno de deNAc SA é espe- cialmente adequado para a geração de um antígeno de deNAc SA tendo outra modificação, por exemplo, um conjugado (por exemplo, através de oxi- dação com periodato da extremidade dé não redução) ou modificação de um resíduo de ácido siálico para proporcionar uma alquil amina secundária, par- ticularmente uma C1 amida, na extremidade de não redução do polímero (polissacarídeo). Após modificação estar completa, os grupos de proteção trihaloacila podem ser removidos conforme descrito acima. Por exemplo, os grupos de proteção podem ser removidos através de aminação redutiva (por exemplo, com cianoborohidreto de sódio) ou outra redução (por exemplo, com borohidreto de sódio ou tratamento com uma base em um pH de 9 ou maior) para proporcionar uma amina livre. Fragmentos, re-acilacão e outras modificações

Onde o antígeno de deNAc SA é produzido através de modifica- ção química de PS, fragmentos de PS são usualmente produzidos como um resultado de N-deacetilação, fragmentos os quais têm um peso molecular médio oscilando de cerca de 3.000 a cerca de 50.000 Dáltons. Embora a invenção considere o antígeno de deNAc SA como derivados de comprimen- to total de PS, bem como fragmentos, antígenos de deNAc SA de fragmen- tos de PS também são considerados.

Onde desejado, re-acilação para proporcionar o antígeno de deNAc SA pode ser realizada através de resuspensão do PS de-N-acetilado em um meio aquoso com pH de cerca de 8 a 9 (por exemplo, em hidróxido de sódio), seguido pela adição de um anidrido de acila apropriado. Em uma modalidade, o polissacarídeo e agente de acilação (por exemplo, anidrido acético ou anidrido propiônico) são proporcionados em uma mistura de sol- vente orgânico/água (por exemplo, 2% (vol/vol), água em formamida ou di- metilformamida). Essa modalidade proporciona, em particular, níveis mais controlados de re-acilação. O método da invenção envolve o uso de menos de 1 equivalente molar, menos de 0,75 equivalentes molares, menos de 0,5 equivalentes molares, menos de 0,25 equivalentes molares, menos de 0,1 equivalentes molares, menos de 0,05 equivalentes molares, menos de 0*025 equivalentes molares ou tão pouco quanto 0,02 equivalentes molares de a- nidrido ácido ou agente de acilação (por exemplo, acil éster ativo, tal como O-acil hidróxi-succinimida).

Grupos O-acila podem ser removidos aumentando o pH para cerca de 12. O pH é, então, diminuído para cerca de 8 (por exemplo, através da adição de ácido clorídrico) e o derivado purificado conforme desejado, por exemplo, através de diálise. Os produtos da reação podem ser ainda purifi- cados e liofilizados conforme desejado.

O grau de N-acilação do antígeno de deNAc SA resultante é geralmente menos do que 90%, menos de 85%, menos de 84%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 60% ou menos de 55%, usualmente mais de 10%, 15%, 16%, 25%, 30%, 40% ou 45%. O peso mo- lecular do polissacarídeo do antígeno de deNAc SA pode variar, com os an- tígenos de deNAc SA produzidos a partir de PS geralmente oscilando, quan- to ao peso molecular, de cerca de 0,5 kDa (por exemplo, um dissacarídeo) a 80 kDa, cerca de 1 kDa a cerca de 70 kDa, cerca de 2 kDa a cerca de 60 kDa, cerca de 3 kDa a cerca de 50 kDa, cerca de 5 kDa a cerca de 25 kDa, cerca de 10 kDa a 80 kDa, cerca de 20 kDa a 60 kDa, cerca de 30 kDa a cerca de 50 kDa, usualmente cerca de 0,5 kDa a cerca de 10 kDa.

Métodos de fabricação de antíaenos de deNAc SA a partir da qanqliosídeos Em geral, antígenos de deNAc SA podem ser produzidos a partir de gangliosídeos através de biossíntese de um derivado de gangliosídeo em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula mamífero-cancerígena) ou outra fonte adequada, através de cultura da célula em meio de cresci- mento suplementado com uma mistura de uma manosamina amina- protegida (por exemplo, N-trihaloacil manosamina) e acil manosamina (por exemplo, N-trihaloacetil e N-acetil manosamina). A manosamina amina- protegida e acil manosamina podem ser proporcionadas no meio de cultura em uma proporção desejada, de modo que o derivado de gangliosídeo ex- presso pela célula contenha menos do que 90%, menos do que 85%, menos do que 84%, menos do que 80%, menos do que 75%, menos do que 70%, menos do que 60% ou menos do que 55%, usualmente mais de 10%, 15%, 16%, 25%, 30%, 40% ou 45% de resíduos amina-protegidos (por exemplo, N-trihalo acilados) com relação aos resíduos totais do gangliosídeo produzido.

Esse método pode proporcionar controle do nível de acilação do produto final após remoção do grupo de proteção amina e redução ou evitar reações colaterais indesejáveis com grupos amina livres, de modo a propor- cionar um gangliosídeo de-N-acetilado tendo um nível desejado de acilação. Em geral, a proporção de resíduos de de-N-acetila é controlada limitando a quantidade de reagente de manosamina amina-protegido (por exemplo, N- trihalo acetil manosamina). O produto de-N-acetilado pode ser recuperado das células através de qualquer método convencional, por exemplo, resfria- mento, neutralização, purificação se desejado e liofilização.

Os métodos de produção biossintéticos são descritos em maio- res detalhes abaixo, bem como nos Exemplos.

Produção biossintética de antíqeno de deNAc SA através da produção de um derivado de gangliosídeo em uma célula de mamífero

Em uma modalidade, antígenos de deNAc SA são gerados atra- vés de cultura de uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula cancerí- gena de um tipo de tecido ou tipo de câncer desejado (por exemplo, uma célula de um tumor primário, uma metástase de um tumor ou urria linhagem de célula tumorígena, por exemplo, uma linhagem de célula de melanoma (por exemplo, a linhagem de célula SL-MEL-28), na presença de um ou mais derivados de N-acil manosamina e sob condições para promover a produção de derivados de gangliosídeo tendo resíduos de ácido N-acil siálico. Isso pode ser realizado incluindo, no meio de cultura, um derivado de manosami- na tendo um grupo N-acila desejado.

Qualquer célula de mamífero a qual proporciona a produção de gangliosídeo em um nível desejado pode ser usada nos métodos biossintéti- cos da invenção. Tais células podem expressar naturalmente gangliosídeos 25 ou podem ser manipuladas para expressar ou superexpressar um gangliosí- deo, por exemplo, GD3 (vide, por exemplo, células CHO transfectadas com sintase de GD3 (ST8Sia-l), descritas em Satake et al., J. 2003 Biol. Chem. 278: 7942-7948). Em algumas modalidades, a célula usada nos métodos biossintéticos usa células cancerígenas que produzem GD3 em um nível elevado com relação a células não cancerígenas (por exemplo, do mesmo tipo de tecido ou origem). Células exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, células ou linhagens de célula de origem neuroectodérmica, cé- lulas ou linhagens de células cancerígenas (por exemplo, células SK-MEL- 28, células SK-MEL-37, células M21, células MELUR e similares) e simila- res.

Em uma modalidade, o derivado de N-acil manosamina é uma manosamina compreendendo um grupo de proteção amina (uma "manosa- mina protegida" ou "manosamina amina-protegida"), exemplificado aqui por N-trihaloacil manosaminas, para realizar "alimentação" do derivado de ma- nosamina à célula cancerígena. Manosaminas amina-protegidas exemplifica- tivas adequadas para uso na invenção incluem qualquer manosamina ami- na-protegida que pode ser incorporada na via sintética de gangliosídeos de células para proporcionar a produção de um derivado de gangliosídeo prote- gido. Reagentes de manosamina amina-protegida exemplificativos incluem N-trihaloacil manosamina, por exemplo, N-trihaloacetil manosamina (por e- xemplo, N- -tricloroacetil manosamina, trifluoroacetil manosamina), N-formil manosamina e similares). Além da manosamina amina-protegida, o meio de cultura geralmente também inclui uma N-acetil manosamina, para proporcio- nar um derivado de gangliosídeo tendo resíduos de ácido siálico protegidos e resíduos de ácido siálico N-acetilados.

Em uma modalidade relacionada, onde um derivado de ganglio- sídeo tendo resíduos de ácido N-acil siálico misturados é desejado, o meio de cultura inclui reagentes de N-acil manosamina misturados. Por exemplo, a N-acil manosamina pode compreender grupos acila saturados ou insatura- dos, usualmente grupos acila saturados, de CrC5, mais usualmente C2-Cs, mais usualmente C2-C4, mais usualmente C2-C3, com grupos acetila ou pro- pionila sendo de interesse particular, cultura das células cancerígenas na presença de tais reagentes de N-acil manosamina misturados pode propor- cionar a produção de um derivado de gangliosídeo tendo resíduos de ácido N-acil siálico misturados, por exemplo, ácido N-acetil siálico, ácido N- propionil siálico e similares. Em uma modalidade de interesse particular, as células são cultivadas na presença de uma mistura de uma manosamina protegida (por exemplo, uma N-trihaloacil manosamina) N-acil manosaminas (por exemplo, uma mistura de N-acetil manosamina e N-propionil manosa- mina).

Em outra modalidade, uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula cancerígena) é cultivada na presença de uma mistura de uma N- acil manosamina (por exemplo, N-acetil manosamina) e a N- trihaloacil ma- nosamina. As quantidades relativas de reagentes de manosamina na cultura (por exemplo, a proporção de N-trihaloacil manosamina e N-acetil manosa- mina) são proporcionadas de modo que o produto biossintético final conte- nha a proporção desejada de diferentes resíduos e/ou derivados de ácido siálico no derivado de gangliosídeo (por exemplo, resíduos trihaloacilados e resíduos aciladõs sobre o derivado de gangliosídeo). Em geral, os grupos de proteção (por exemplo, os grupos trihaloacilados) são removidos para pro- porcionar uma amina livre no produto derivado de gangliosídeo final. Por exemplo, onde a proporção de aminas livres para resíduos acilados no pro- duto derivado de gangliosídeo de-N-acetilado final tem de ser cerca de 1:10, 1:4 ou 1:1, a proporção de N-trihaloacil manosamina para manosamina é cerca de 1:10, 1:4 ou 1:1. Falando de modo diferente, a quantidade de N- trihaloacil manosamina na cultura é aproximadamente igual à fração de gru- pos ácido de-N-acetil siálico desejados no produto derivado de gangliosídeo de-N-acetilado final após desproteção (por exemplo, 10%, 25%, 50% e simi- lares).

Similarmente, as quantidades relativas de N-acil manosaminas "não protegidas" (manosaminas que não contêm um grupo de proteção ami- na, mas as quais podem compreender, por exemplo, um grupo acetila ou propionila como o grupo N-acila) na cultura podem ser fornecidas de modo a proporcionar uma proporção desejada de resíduos de ácido siálico diferen- temente acilados no derivado de gangliosídeo. Por exemplo, onde o deriva- do de gangliosídeo tem de ter uma proporção de resíduos acetilados para resíduos propionilados de 2:1 ou 1:1, N-acetil manosamina e N-propionil manosamina são proporcionadas na mesma ou em uma proporção similar na cultura.

Os antígenos de deNAc SA produzidos a partir dos gangliosí- deos podem, então, ser isolados das células usando métodos conhecidos na técnica. Onde o derivado de gangliosídeo contém um grupo de proteção a- mina, tais derivados de gangliosídeo são especialmente adequados para a geração de um derivado de gangliosídeo tendo outra modificação, por e- xemplo, geração de um conjugado (por exemplo, através de oxidação com periodato da extremidade de não redução) ou modificação de um resíduo de ácido siálico para proporcionar uma alquil amina secundária, particularmente uma C1 amida, na extremidade de não redução do derivado de gangliosí- deo. Após modificação estar completa, os grupos de proteção trihaloacila podem ser removidos conforme descrito acima. Por exemplo, os grupos de proteção podem ser removidos através de aminação redutiva (por exemplo, com cianoborohidreto de sódio) ou ainda reduzidos (por exemplo, com boro- hidreto de sódio ou tratamento com uma base em um pH de 9 ou maior) pa- ra proporcionar uma amina livre.

Em modalidades relacionadas, composições compreendendo uma célula de mamífero tendo um derivado de gangliosídeo trihaloacilado na superfície celular, incluindo células inteiras e extratos de membrana das mesmas, são consideradas pela invenção. A invenção também considera derivados de gangliosídeo trihaloacilados isolados de tais células. Além dis- so, a invenção considera métodos de fabricação de antígenos de deNAc SA usando tais células. Em modalidades relacionadas, a invenção proporciona uma composição tendo células com gangliosídeos de-N-acetilados na super- fície celular e/ou membranas obtidas de tais células, onde as células ou membranas são produzidas usando os métodos biossintéticos descritos a- qui. Essas composições podem ser usadas para estimular anticorpos espe- cíficos para gangliosídeos de-N-acetilados. Protocolos de imunização dispo- níveis na técnica, bem como aqueles descritos aqui, podem ser prontamente adaptados para realizar a produção de anticorpos de uma especificidade desejada.

Conjugados de antígeno de deNAc SA

Antígenos de deNAc SA, um antígeno de deNAc SA amina- protegido, podem ser conjugados a um veículo, de modo a proporcionar um complexo de antígeno de deNAc SA-vèículo. O complexo antígeno-veículo conjugado pode compreender múltiplas moléculas veículo, múltiplas molécu- las de antígeno de deNAc SA ou ambos.

Conforme mencionado acima, o antígeno de deNAc SA do con- jugado pode ser proporcionado como um dímero que define um epitopo mí- nimo conforme descrito acima ou como uma unidade polimérica (por exem- plo, duas ou mais unidades diméricas que definem o epitopo descrito acima). Onde o antígeno de deNAc SA é uma estrutura polimérica, o antígeno de deNAc SA pode ser homopolimérico ou heteropolimérico. A composição po- de compreender resíduos adicionais presos no término de não redução, no término de redução ou nos términos de não redução e redução do polímero ou polímero amina-protegido.

O veículo pode ser uma proteína, um peptídeo, um adjuvante de célula T ou qualquer outro composto capaz de intensificar a resposta imune. A proteína pode ser selecionada do grupo consistindo em, mas não limitado a, proteínas virais, bacterianas, parasíticas, animais e fúngicas. Em uma modalidade, o veículo é albumina. Esse veículo pode ser um toxóide do té- tano, toxóide de difteria, complexos de proteína na membrana externa me- ningocócica (vide, por exemplo, US 4.707.543; US 6.476.201; US 6.558.677) ou uma proteína externa bacteriana (tal como porina B de N. meningitidis recombinante). Tais veículos podem ser obtidos de companhias que forne- cem produtos farmacêuticos ou bioquímicos ou preparados através de me- todologia padrão (Cruse, J M (ed.) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology vol. 10 (1989)). Peptídeos sintéticos contendo epitopos de células T adequados para uso como um veículo podem incluir o epitopo de célula T "universal" (Panina-Bordignon et ai., 1989 Eur J Immunol 19: 2237) ou peptídeos de epitopo Pan DR não naturais (PADRE) (dei Guer- cio et al., 1997 Vaccine 15: 441). Outros agentes, incluindo outras proteínas, que podem funcionar como veículos serão conhecidos por aqueles versados na técnica de imunologia.

Métodos exemplificativos para conjugação dos antígenos de deNAc SA incluem, mas não estão necessariamente limitados a, conjugação de PS conforme descrito nas Pats. U.S. Nos. 4.727.136; 5.811.102 (que descrevem um conjugado de polissacarídeo derivo de C3-5 N-acila insatura- da meningocócico do grupo B); US 5.969.130; e US 6.080.589. Por exemplo, conjugação pode ser realizada através de introdução de um grupo aldeído na extremidadè de não redução, na extremidade de redução ou ambas de um polissacarídeo de um antígeno de deNAc SA1 para uso na fixação cova- Iente de uma ou mais proteínas-veículo. Isso pode ser realizado através de periodinação por meio de contato do PS ou derivado de PS, por exemplo, com meta periodato de sódio.

Onde um antígeno de deNAc SA compreende um grupo amino não derivatizado, determinadas restrições podem ser impostas sobre os pro- cedimentos que podem ser usados para acoplar o antígeno de deNAc SA a um veículo, tal como uma proteína-veículo. Nessa modalidade, o veículo é geralmente modificado para conter um ou mais grupos azida (hidrazida ou dihidrazida adípica) através da reação de hidrazida ou dihidrázida adípica com a proteína-veículo ativada em grupos carboxila com EDAC (vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 6.632.437). Uma vez que a pKa do grupo amino da hidrazida é cerca de 2,5 e uma vez que hidrazidas são nucleófilos fortes, a reação de conjugação à imina pode ser realizada em um pH de cerca de 5,5- 7,5, no qual as aminas primárias sobre o a proteína-veículo e o polissacarí- deo são protonadas de modo substancialmente completo e, assim, menos reativos.

Vacina de conjugado de proteína-antígeno de deNAc SA podem ser purificadas através de cromatografia por exclusão de tamanho (ToyoPerI HW-45F). A concentração de proteína é determinada através do ensaio de proteína de Lowry e a quantidade de polissacarídeo conjugado através do ensaio de resorcinol (Svennerholm 1957 Biochim biophys Acta 24: 604). Pa- ra assegurar que a proteína e o polissacarídeo são covalentemente ligados, as vacinas de conjugado são decompostas sobre SDS-PAGE e a proteína e o polissacarídeo são detectados separadamente através de Western blot usando anti-soro antiproteína-veículo policlonal e mAbs anti-PS para detec- tar o componente polissacarídico.

Em um exemplo, onde o antígeno de deNAc SA compreende epitopos diméricos, o antígeno de deNAc SA pode ser modificado para pro- porcionar fixação a um veículo e ter a seguinte estrutura:

FÓRMULA VIII

<formula>formula see original document page 65</formula>

onde X, Y e n são conforme definido acima e R1 é H ou um grupo acila (por exemplo, um grupo acetila). Em outras modalidades, R1 é selecionado inde- pendentemente de H; um grupo acila saturado ou insaturado (por exemplo, um grupo C2-C18 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-16 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C12 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C10 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C8 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C6 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C4 acila saturado, um grupo C2-C4 acila insaturado); um grupo N-acila graxa (por exemplo, N- lauroíla, N-oleoíla e similares); ou uma amina graxa (por exemplo, dodecil ami- na, oleoil amina e similares). Em uma modalidade, R1 é um grupo C4 a C8 acila, tal como n-butanoíla, isobutanoíla, n-pentanoíla, n-hexanoíla, n-heptanoíla ou n-octanoíla (conforme descrito, por exemplo, na US 5.576.002) ou um grupo C3-C5 acila insaturado, tal como aquele descrito na US 6.350.449.

Em outra modalidade onde o antígeno de deNAc SA compreen- de repetições triméricas, o antígeno de deNAc SA pode ser modificado para modificar a fixação a um veículo e têm a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 65</formula>

FÓRMULA IX

em que:

X, Y e Z são, independentemente, H ou um grupo de proteção amina; ou um grupo acila saturado ou insaturado (usualmente um grupo aci- Ia saturado), contanto que pelo menos um de X, Y e Z seja H ou um grupo trihaloacila; e pelo menos um de X, Y e Z seja um grupo acila saturado ou insaturado, usúalmente um grupo acila saturado, com modalidades de inte- resse particular sendo aquelas nas quais pelo menos um de X, Y e Z é H (ou um grupo de proteção amina), pelo menos um de X, Y e Z é um grupo aceti- Ia e pelo menos um de X, Y e Z é um grupo propionila;

η é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60 ou mais, usualmente cerca de 4 resíduos ou mais, mais usualmente cerca de 10 resíduos ou mais (por e- xemplo, tendo um grau de polimerização (Dp) de cerca de 2 a cerca de 60, cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 30 a cerca de 50, cerca de 10 a 20 ou cerca de 12 a cerca de 18, com um Dp de cerca de 2 a cerca de 10 sendo de interesse particular); e

R1 é H, um grupo de proteção amina ou um grupo acila (por e- xemplo, um grupo acila saturado, tal como um grupo acetila). Em outras mo- dalidades, Ri é selecionado indivíduo de H; um grupo de proteção amina; um grupo acila saturado ou insaturado (por exemplo, um grupo C2-C18 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-i6 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C12 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C10 acila saturado ou insaturado, um grupo G2-C8 acila saturado ou insaturado, um grupo C2-Ce acila saturado ou insaturado, um grupo C2-C4 acila saturado, um grupo C2-C4 acila insaturado); um grupo N-acila graxa (por exemplo N-lauroíla, N-oleoíla e similares); ou um grupo amina graxa (por exemplo, dodecil amina, oleoil amina e similares). Em uma modalidade, Ri é um grupo C4 a Ce acila, tal como n-butanoíla, isobutanoíla, n-pentanoíla, n-hexanoíla, n-heptanoíla ou n- octanoíla (conforme descrito, por exemplo, na US 5.576.002) ou um grupo C3-C5 acila insaturado, tal como aquele descrito na US 6.350.449. Conjugados propionila-liqados ou acetila-ligados

Em outra modalidade, a invenção se caracterizada por uma composição compreendendo um antígeno de deNAc SA compreendendo uma estrutura representada pela fórmula: <formula>formula see original document page 67</formula>

em que X, Y e Z são, independentemente, üm grupo acrila (por exemplo, N- acrila, metacrila) ou um grupo haloacetila (por exemplo, bromoacetila, cloro- acetila), em que pelo menos um de X, Y e Z é H e pelo menos um de X, Y e Z é um grupo acila saturado. O antígeno de deNAc SA pode ser opcional- mente conjugado a uma proteína-veículo ou alquil amina secundária cova- lentemente ligada através de reação com o grupo acrila ou haloacetila, Anti- genos de deNAc SA, nessa modalidade, geralmente têm uma ou mais de tais estruturas posicionadas dentro do polímero. Por exemplo, a estrutura acima pode representar, por exemplo, de cerca de 10% a 100%, de cerca de 25% a 90%, de cerca de 50% a 75% do antígeno de deNAc SA.

Conjugados de antígeno de deNAc SA propionila-ligados ou a- cetila-ligados podem ser gerados através de reação de um PS pelo menos parcialmente de-N-acetilado (ou outro polímero contendo resíduo de ácido siálico, tal como uma proteína ou gangliosídeo ácido siálico-modificado) com ácido acrílico ativado ou ácido haloacético ativado, onde o ácido acrílico ati- vado ou ácido haloacético ativado é gerado através de reação com um agen- te de ativação carboxila, tal como uma carbodiimida, por exemplo, EDC (hi- drocloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida). A quantidade de ácido acrílico ativado ou ácido haloacético ativado pode ser selecionada em um nível desejado de conjugação, por exemplo, de cerca de 10% a cerca de 100%, cerca de 25% a cerca de 80%, cerca de 50% to 75% do deNAc SA no PS.

Conjugados propionila-ligados exemplificativos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: <formula>formula see original document page 67</formula> em que x é um tiol de um resíduo de cisteína reagido de uma proteína- veículo ou um grupo amino de um resíduo de lisina, histidina ou arginina re- agido de uma proteína-veículo e Y e Z são, independentemente, H ou um grupo acila, em que pelo menos um de Y e Z é H e pelo menos um de Y e Z é um grupo acila saturado. Deve ser compreendido que os conjugados de antígeno de deNAc SA considerados aqui incluem aqueles nos quais o veí- culo é conjugado através de um grupo acila posicionado em Y (com YeZ sendo H ou um grupo acila saturado) ou conjugado através de um grupo a - crila posicionado em Z (com XeY sendo H ou um grupo acila saturado).

Conjugados exemplificativos ligados a um veículo através de reação com um grupo haloacetila compreendem uma estrutura representada pela formula:

<formula>formula see original document page 68</formula>

em que X é um tiol de um resíduo de cisteína reagido de uma proteína- veículo ou um grupo amino de um resíduo de lisina, histidina ou arginina re- agido de uma proteína-veículo e YeZ são, independentemente, H ou um grupo acila, em que pelo menos um de Y e Z é H e pelo menos um de Y e Z é um grupo acila saturado. Deve ser compreendido que os conjugados de antígeno de deNAc SA considerados aqui incluem aqueles nos quais o veí- culo é conjugado através de um grupo haloacetila posicionado em Y (com Y e Z sendo H ou um grupo acila saturado) ou conjugado através de um grupo haloacetila posicionado em Z (com XeY sendo H ou um grupo acila saturado).

Tratamento de preparados de antígeno de deNAc SA com exosialidase

Contaminantes de polissacarídeo (PS), oligossacarídeo (OS) ou outro polímero de ácido siálico N-acilado que não contêm os resíduos de deNAc SA podem ser diminuídos e, assim, o antígeno de deNAc SA enri- quecido, em composições contendo os antígenos de deNAc SA através de tratamento com uma exosialidase (também referida como uma exoneurami- nidase) para promover clivagem de resíduos de ácido siálico em polímeros de ácido siálico contaminantes (por exemplo, conforme em PS e OS) na li- gação (2-»8) glicosídica. Exosialidases adequadas incluem as exosialidases de Actinobacter ureafaciens (por exemplo, SIALIDASE A®), Clostridium per- fringens (por exemplo, SIALIDASE I®), Vibrio cholerae (por exemplo, SIALI- DASE V®), Salmonella typhimurium (por exemplo, SIALIDASE T®), vírus da doença de Newcastle, cepa B1 de Hitchner (por exemplo, SIALIDASE N®) e outras exosialidases que podem clivar ligações (2-»8) glicosídicas. Exosiali- dases adequadas para uso estão comercialmente disponíveis.

Tratamento com sialidase pode ser realizado, por exemplo, atra- vés de incubação da composição em um tampão (por exemplo, um tampão de acetato alcalino, tal como um tampão de acetato de sódio) em um pH a- dequado, onde o pH pode ser selecionado de modo a evitar degradação do antígeno de deNAc SA (por exemplo, derivado de PS) e/ou hidrólise do antí- geno de deNAc SA (por exemplo, derivado de PS) (por exemplo, o que pode resultar na produção de derivados de ácido siálico, tais como resíduos de lactona cíclica). Por exemplo, incubação da amostra em um pH de cerca de 6,5 pode proporcionar atividade de exosialidase, ao mesmo tempo em que reduz a degradação de antígeno de deNAc SA. Incubação pode ser durante qualquer período adequado, por exemplo, várias horas (por exemplo, 5, 10, 12 horas ou mais) a vários dias (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dias). In- cubação pode ser realizada em qualquer temperatura adequada, incluindo temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 37 -C). Onde um baixo pH resulta na formação de derivados de ácido siálico, a composição pode ser incubada em um pH elevado (por exemplo, um pH de mais de 6,5, usual- mente um pH de mais de 10) durante um curto período de tempo (por exem- plo, 30 minutos a 1 hora) de forma a hidrolisar, por exemplo, Iactonas cícli- cas.

Tratamento com exosialidase elimina polímeros de ácido siálico totalmente N-acilados não reativos (por exemplo, PS N-acilado) os quais podem estar presentes como um contaminante nos preparados de antígeno de deNAc SA, particularmente aqueles preparados feitos usando um método sintético, tal como aqueles descritos aqui. Dessa maneira, tratamento com uma exosialidase pode proporcionar enriquecimento do antígeno de deNAc SA em uma composição. Por exemplo, tratamento com sialidase pode pro- porcionar uma composição com menos de 60% ou menos de 40% em peso de PS N-aciladb.

Antígeno de deNAc SA tratado com exosialidase pode ser con- jugado a uma proteína-veículo usando qualquer método adequado. Por e- xemplo, o antígeno de deNAc SA exosialidase-tratado pode ser conjugado através de N-acilação (por exemplo, usando ácido acrílico ou ácido haloacé- tico), seguido por conjugação a um veículo de proteína de interesse. Imunoqenicidade de antíqenos de deNAc SA e conjugados de antígeno de deNAcSA

O antígeno de deNAc SA isolado, com ou sem outra conjugação ou na presença ou ausência de uma estrutura de apresentação, pode ser imunogênico ou, alternativamente, a imunogenicidade pode surgir da conju- gação. Métodos de medição de imunogenicidade são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, primariamente, medição de anticor- po no soro, incluindo medição de concentração, avidez e distribuição de iso- tipo em vários momentos após injeção da estrutura. Maior imunogenicidade pode ser refletida por uma maior titulação e/ou expectativa de vida aumenta- da dos anticorpos. A imunogenicidade pode ser medida usando ensaios bac- • tericidas in vitro, bem como através da capacidade de soros de animais imu- nizados de conferir proteção passiva à infecção ou doença em um modelo de estímulo animal adequado. A imunogenicidade pode ser medida na popu- lação de pacientes a ser tratada ou em uma população que imita a resposta imune da população de paciente.

Um meio de determinação da imunogenicidade de uma determi- nada substância é primeiro obter soro de um animal (por exemplo, camun- dongo) antes de imunização e, então, após iniciação com o antígeno ou con- jugado de deNAc SA, seguido por reforço com doses adicionais. Após isso, a resistência de ligação dos soros pós-imunização a um epitopo de deNAc SA é determinada usando um ELISA e comparado os resultados correspon- dentes com animais de controle simuladamente imunizados. O antígeno de deNAc SA pode produzir uma resposta imune a um conjugado de antígeno de deNAc SA que reduz a produção de ou evita a produção de auto-anticorpos e pode proporcionar resposta de anticorpo in- tensificada ao conjugado de antígeno de deNAc SA comparado com uma resposta de um indivíduo não iniciados com o PS de-N-acetilado e que tenha sido vacinado com o mesmo conjugado de PS.

FORMULAÇÕES DE COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA

"Composição de antígeno", "composição antigênica" ou "compo- sição imunogênica" são usados aqui como uma questão de conveniência para se referir geneticamente à composições que compreendem um antíge- no de deNAc SA1 conjugado do mesmo ou ambos. Composições úteis para estimular anticorpos contra NmB1 E. coli K1 ou células cancerígenas, particu- larmente células cancerígenas, são consideradas pela presente invenção.

Os antígenos de deNAc SA podem ser proporcionados em tais composições em uma forma isolada ou em membranas (por exemplo, em vesículas, por exemplo, vesículas ou microvesículas de membrana externa, tal como produzidas a partir de uma cepa de NmB). Onde o antígeno de de- NAc SA é gerado usando os métodos biossintéticos envolvendo células de mamífero, o antígeno de deNAc SA pode ser proporcionado sobre a superfí- cie de uma célula de mamífero inteira ou uma membrana ou extrato lipídico de uma célula de mamífero. Onde uma célula de mamífero inteira é usada, a célula de mamífero usualmente será inativada, de modo a impedir prolifera- ção adicional uma vez administrada ao indivíduo, qualquer meio físico, quí- mico ou biológico de inativação pode ser usado incluindo, mas não limitado a, irradiação (por exemplo, com pelo menos cerca de 5.000 cGy, usualmente pelo menos cerca de 10.000 cGy, mais usualmente pelo menos cerca de 20.000 cGy); ou tratamento com mitomicina C (por exemplo, usualmente pelo menos 10 mu.g/mL; mais usualmente pelo menos cerca de 50 μl/mL).

Em uma modalidade, especialmente onde ò antígeno de deNAc SA foi gerado através de um PS, a composição de antígeno de deNAc SA foi tratada com uma exosialidase para diminuir contaminação de PS e OS e enriquecer pelo deNAc SA na composição. Composições da invenção (particularmente aquelas adequadas para uso como vacinas) compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno, bem como quaisquer outros componentes compatíveis, conforme necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" entenda-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, quer em uma única dose, como parte de uma série das mesmas ou diferentes composições an- tigênicas, é eficaz para estimular uma resposta de anticorpo eficaz para tra- tamento ou prevenção de um sintoma de uma célula cancerígena tendo um epitopo de deNAc SA acessível na superfície celular (por exemplo, um gan- gliosídeo que é pelo menos parcialmente de-N-acetilado). Composições de antígeno de deNAc SA podem ser administradas para estimular uma respos- ta de anticorpo anti-antígeno SEAM 3-reativo em um indivíduo.

A quantidade administrada varia dependendo do objetivo da administração (por exemplo, proporcionar imunoterapia em um ser humano, proporcionar produção de anticorpo para a geração de hibridomas (por e- xemplo, conforme em um hospedeiro não-humano)), da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, o grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, ser humano, primata não-humano, primata, etc.), a capacidade do sistema imune do indivíduo de produzir anticorpos, o grau de proteção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico da situa- ção médica e outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade caia em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de expe- rimentos de rotina. Tratamento de dosagem pode ser um esquema com uma única dose ou um esquema com múltiplas doses (por exemplo, incluindo doses de reforço). A vacina pode ser administrada em conjunto com outros agentes imunorregulatqrios.

As composições da invenção podem ser proporcionadas em um excipiente farmaceuticamente aceitável, o qual pode ser uma solução, tal como uma solução aquosa, freqüentemente uma solução salina, ou elas po- dem ser proporcionadas na forma de pó. As composições da invenção po- dem compreender um antígeno de deNAc SA e um adjuvante. Exemplos de adjuvantes adequados conhecidos que podem ser usados em seres huma- nos incluem, mas não estão limitados necessariamente a, alume, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MF59 (4,3% peso/v de esqualeno, 0,5% pe- so/v de Tween 80, 0,5% peso/v de Span 85), ácido nucléico contendo CpG (onde a citosina é não metilada), QS21, MPL, 3DMPL, extratos de Aquillaf ISCOMS, mutantes de LT/CT, micropartículas de (poli)D,L-lactídeo-co- glicolídeo (PLG), Quil A, interleucinas e similares. Para animais experimen- tais, pode-se usar Freund1S, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr- MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referida como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(r-2'- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidróxifosforilóxi)-etilamina (CGP 19835 A, referida como MTP-PE) e RIB I, o qual contém três componentes extraídos de bacté- rias, monofosforil lipícfio A, dimicolato de trealose e esqueleto de parede ce- lular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de esqualeno/Tween 80 a 2%. A eficácia de um adjuvante pode ser determinada medindo-se a quantidade de anticorpos dirigidos contra o antígeno imunogênico.

Outros adjuvantes exemplificativos para intensificar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a: (1) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes de imunoestimulação específi- cos, tais como peptídeos de muramila (vide abaixo) ou componentes da pa- rede celular bacteriana) tais como, por exemplo, (a) MF59® (WO 90/14837; Capítulo 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo MTP-PE) formu- lada em partículas de submícron usando um microfluidificador, (b) SAF, con- tendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero pluronic- bloqueado, L121 e thr-MDP microfluidizados em uma emulsão em submí- cron ou submetidos a turbilhonamento para gerar uma emulsão com um ta- manho de partícula maior e (c) o sistema adjuvante RIBI® (RAS), (Ribi Im- munochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana, tal como monofosfo- lipídio A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (DETOX®); (2) adjuvantes de saponina, tais como QS21 ou STIMULON® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) podem ser usados ou partículas gerados a partir dos mesmos, tais como ISCOMs (complexos de imunoestimulação), ISCOMS os quais podem ser desprovidos dé detergente adicional, por exemplo, WO 00/07621; (3) Adju- vante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA); (4) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (W099/44636), etc.), interferons (por exemplo, gama interferon), fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), etc.; (5) monofosforil lipídio A (MPL) ou MPL 3-0-deacilado (3dMPL), por exemplo, GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente na au- sência substancial de alume quando usado com sacarídeos pneumocócicos, por exemplo, WO 00/56358; (6) combinações de 3dMPL, por exemplo, com QS21 e/ou emulsões óleo-em-água, por exemplo, EP-A-0835318, EP-A- 0735898, EP-A-0761231; (7) oligonucleotídeos compreendendo motivos de CpG (Krieg, Vaccine 2000,19, 618-622; Krieg, Curr Opin Mol Ther 2001, 3: 15-24; Roman et al., Nat. Med. 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol. 160, 870-876; Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340- 2344; Moldoveami et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Bailas • et al., J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol. 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Câncer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al., J. Immunol, 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J. Immunol, 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. immunol, 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761; e Yi et al., J. Immu- nol, 1998, 160, 5898-5906; Pedidos de Patente International WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 e WO 98/52581], isto é, contendo pelo menos um dinucleotídeo de CQ, onde a citocina é não metilada; (8) um éter de polioxietileno ou um éster de polioxie- tileno, por exemplo, WO 99/52549; (9) um tensoativo de sorbitan éster de polioxietileno em combinação com um Octoxinol (WO 01/21207) ou um alquil éter de polioxietileno ou tensoativo de éster em combinação com pelo menos um tensoativo não-iônico adicional, tal como octoxinol (WO 01/21152); (10) uma saponina e um oligonucleotídeo imuno-estimulatório (por exemplo, um oligonucleotídeo de CpG) (WO 00/62800); (11) um imunoestimulante e uma partícula de sal de metal, por exemplo, WO 00/23105; (12) uma saponina e uma emulsão óleo-em-águà, por exemplo, WO 99/11241; (13) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IM2 (opcionalmente + um esterol), por e- xemplo, WO 98/57659; (14) outras substâncias que atuam como agentes de imunoestimulação para intensificar a eficácia da composição. Peptídeos de muramila incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil- normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)- etilamina (MTP-PE) e similares. Adjuvantes adequados para uso humano são de interesse particular, onde o indivíduo é um ser humano.

As composições de antígeno podem compreender outros com- ponentes, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estea- rato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, mag- nésio, carbonato e similares. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme requerido para se aproxi- mar das condições fisiológicas, tais como agentes para ajuste e tampona- mento de pH, agentes para ajuste de toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lac- tato de sódio e similares. A concentração de antígeno nessas formulações pode variar amplamente e será selecionada primariamente baseado nos vo- lumes de fluido, viscosidades, peso corporal e similares de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do pacien- te. As composições resultantes podem estar na forma de uma solução, sus- pensão, tablete, pílula, cápsula, pó, gel, creme, loção, pomada, aerossol ou semelhante.

A concentração de antígenos da invenção nas formulações far- macêuticas pode variar amplamente, isto é, de menos de cerca de 0,1%, usualmente em ou pelo menos cerca de 2% a tanto quanto 20% a 50% ou mais em peso e serão selecionadas primariamente através dos volumes de fluido, viscosidades, etc. de acordo com o modo de administração selecio- nado em particular. IMUNIZAÇÃO'

O antígeno de deNAc SA (o qual pode ser opcionalmente conju- gado) pode ser usado sozinho ou em combinação com outras vacinas. Quando usadas em combinação, as várias composições podem ser forneci- das na mesma ou em diferentes formulações. Quando administradas em diferentes formulações, as composições podem ser administradas no mes- mo ou em um regime de dosagem diferente (por exemplo, através da mes- ma ou de diferentes vias, ao mesmo ou em um momento diferente (por e- xemplo, no mesmo ou em diferentes dias)) e similares). Em geral, a adminis- tração do antígeno de deNAc SA pode ser realizada serialmente, ao mesmo tempo ou como uma mistura, conforme descrito em maiores detálhes abaixo. De preferência, a administração é serial, com doses repetidas de antígeno de deNAc SA. Regimes de imunização exemplificativos são descritos abaixo em maiores detalhes.

Em geral, imunização é realizada através de administração por meio de qualquer via adequada, incluindo administração da composição o- ralmente, nasalmente, nasofaringealmente, parenteralmente, entericamente, gastricamente, topicamente, transdermicamente, subcutaneamente, intra- muscularmente, na forma de tablete, sólida, em pó, líquida, aerossol, local ou sistemicamente, com ou sem excipientes adicionados. Métodos reais pa- ra preparação de composições parenteralmente administradas serão conhe- cidos ou evidentes para aqueles versados na técnica e são descritos em maiores detalhes em publicações tais como Remington1S Pharmaceutical Science, 15§ ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia (1980).

É reconhecido que, quando administrados oralmente, os antíge- nos de deNAc SA deverão ser protegidos de digestão. Isso é, tipicamente, realizado através de formação de complexo do antígeno de deNAc SA com uma composição para torná-la resistente à hidrólise ácida e enzimática ou através de acondicionamento em um veículo apropriadamente resistente, tal como um lipossoma. Meios de proteção de um composto de interesse de digestão são bem-conhecidos na técnica.

De forma a assegurar a meia-vida no soro, os preparados anti- gênicos que são injetados também podem ser encapsulados, introduzidos no lúmen de lipossomas, preparados como um colóide ou outras técnicas con- vencionais podem ser empregadas, as quais proporcionam uma meia-vida prolongada no soro dos peptídeos. Uma variedade de métodos estão dispo- níveis para preparação de lipossomas conforme descrito, por exemplo, em Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), Patentes U.S. Nos. 4.235.871, 4.501.728 e 4.837.028. Os preparados podem também ser pro- porcionados em formas com liberação controlada ou liberação lenta para liberação e administração dos preparados antígênicos como uma mistura ou de um modo serial.

Onde usadas como uma imunoterapia, as composições podem ser administradas a Um indivíduo que está em risco de uma doença para prevenir ou pelo menos interromper parcialmente o desenvolvimento da do- ença e suas complicações. Um indivíduo está "em risco" onde, por exemplo, o indivíduo exibe um ou mais sinais ou sintomas da doença, mas os quais são insuficientes para diagnóstico determinado e/ou que tenha sido exposto à condições que aumentam a probabilidade de doença. Por exemplo, as composições antigênicas podem também ser administradas a um indivíduo que está em risco de câncer, tem um câncer ou está em risco de metástase de um câncer tendo um epitopo de deNAc SA na superfície celular (por e- xemplo, um gangliosídeo na superfície celular que é pelo menos parçialmen- te de-N-acetilado).

Uma quantidade adequada para realizar isso é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para uso tera- pêutico dependerão, por exemplo, da composição de antígeno, da maneira de administração, do peso e estado geral de saúde dó paciente e do julga- mento do médico que prescreve. Doses únicas ou múltiplas das composi- ções de antígeno podem ser administradas, dependendo da dosagem e fre- qüência requeridas e toleradas pelo paciente e da via de administração. Em geral, imunização é proporcionada para estimular uma resposta imune no indivíduo. Conforme discutido aqui, as composições de antígeno de deNAc SA podem proporcionar a vantagem de que a imunização não estimula anti- corpos detectáveis que reagem cruzadamente de modo significativo com ácido polissiálico no indivíduo, mas que se ligam especificamente a um epi- topo de deNAc SA (por exemplo, sobre uma célula cancerígena).

Regime de imunização

Antígenos de deNAc SA são administrados a um hospedeiro de uma maneira que proporciona a produção de anticorpos antiepitopo de de- NAc SA seletivos. Composições de antígeno de deNAc SA podem ser admi- nistradas serialmente. Primeiro, uma dose imunogenicamente eficaz de um antígeno de deNAc SA (o qual pode ser conjugado a um veículo e pode ser com ou sem excipientes) é administrada a um indivíduo. A primeira dose é geralmente administrada em uma quantidade eficaz para estimúlar uma res- posta imune (por exemplo, ativação de células B e/ou T). Quantidades para a imunização inicial geralmente oscilam de cerca de 0,001 mg a cerca de 1,0 mg por 70 quilogramas do paciente, mais comumente de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,2 mg por 70 quilogramas do paciente, usualmente cerca de 0,005 mg a cerca de 0,015 mg por 70 quilogramas do paciente. Dosagens de 0,001 até cerca de 10 mg por paciente por dia podem ser usadas, particu- larmente quando o antígeno é administrado a um local diferenciado e não na corrente sangüínea, tal como em uma cavidade corporal ou em um lúmen de um órgão. Dosagens substancialmente maiores (por exemplo, 10 a 100 mg ou mais) são possíveis em administração oral, nasal ou tópica.

Após administração da primeira composição de antígeno de de- NAc SA, uma dose terapeuticamente eficaz de uma segunda composição de antígeno (por exemplo, antígeno de deNAc SA, opcionalmente conjugado e com ou sem excipientes) pode ser administrada ao indivíduo após o indiví- duo ter sido imunologicamente iniciados através de exposição à primeira dose. O reforço pode ser administrado dias, semanas ou meses após a imu- nização inicial, dependendo da resposta e condição do paciente.

Uma resposta imune à primeira composição de antígeno pode ser determinada através de métodos conhecidos (por exemplo, através de obtenção de soro do indivíduo antes e após a imunização inicial e demons- trando uma alteração no estado imune do indivíduo, por exemplo, um ensaio de imunoprecipitação ou um ELISA ou um ensaio bactericida ou uma Wes- tern blot ou ensaio citométrico de fluxo ou semelhante) e/ou demonstrando que a magnitude da resposta imune à segunda injeção é maior do que aque- la de animais de controle imunizados pela primeira vez com a composição de matéria usada para a segunda injeção (por exemplo, iniciação imunológi- ca). Iniciação imunológica e/ou a existência de uma resposta imune à primei- ra composição de antígeno também pode ser admitida esperando um perío- do de tempo após a primeira imunização que, baseado em experiência ante- rior, é um tempo suficiente para que uma resposta imune e/ou iniciação te- nha ocorrido - por exemplo, 2, 4, 6, 10 ou 14 semanas. Dosagens de reforço da segunda composição de antígeno são, tipicamente, de cerca de 0,001 mg a cerca de 1,0 mg de antígeno, dependendo da natureza do imunogênio e da via de imunização.

Em determinadas modalidades, uma dose eficaz de uma tercei- ra composição de antígeno de deNAc SA (por exemplo, antígeno de deNAc SA, opcionalmente conjugado e com ou sem excipientes) é administrada ao indivíduo após o indivíduo ter sido iniciados e/ou montado uma resposta i- mune à segunda composição de antígeno. O terceiro reforço pode ser admi- nistrado dias, semanas ou meses após a segunda imunização, dependendo da resposta e condição do indivíduo. A existência de iniciação e/ou uma res- posta imune à segunda composição de antígeno pode ser determinada atra- vés dos mesmos métodos usados para detectar uma resposta imune à se- gunda composição de antígeno. A existência de iniciação e/ou uma resposta imune à segunda composição de antígeno pode também ser admitida espe- rando um período de tempo após a segunda imunização que, baseado em experiência anterior, é um tempo suficiente para que uma resposta imune tenha ocorrido - por exemplo, 2, 4, 6, 10 ou 14 semanas. Dosagens de refor- ço da segunda composição de antígeno são, tipicamente, de cerca de 0,001 mg a cerca de 1,0 mg de antígeno, dependendo da natureza do imunogênio e da via de imunização.

O uso de uma quarta, quinta, sexta ou mais imunizações de re- forço, usando uma quarta, quinta ou sexta composição de antígeno ou mais também é considerado.

Em uma modalidade, uma composição de antígeno de deNAc SA é administrada pelo menos uma vez, usualmente pelo menos duas vezes e, em algumas modalidades, mais de duas vezes.

Em uma modalidade, uma composição de antígeno de deNAc SA (por exemplo, derivado de PS de-N-acetilado ou conjugado de derivado de PS de-N-acetilado) é administrada como a primeira composição de antí- geno de modo a produzir a resposta imune. Subseqüentes composições de antígeno administradas (por exemplo, as doses de reforço) podem ser as mesmas ou uma composição de antígeno de deNAc SA diferente ou podem ser uma composição antigênica que reforça a resposta imune produzida pela primeira composição de antígeno. Sem estar preso à teoria, a dose de inici- ação inicial de uma composição de antígeno de deNAc SA dirige a resposta imune do hospedeiro à produção de anticorpos que reagem cruzadamente de modo mínimo com ácido polissiálico do hospedeiro e, assim, para longe da produção de tais anticorpos auto-reativos. Uma vez que a resposta imune do hospedeiro é produzida dessa maneira, então, exposição a antígenos que poderiam, de outro modo, estimular uma resposta auto-imune pode resultar em produção reduzida (incluindo não substancial ou não clinicamente rele- vante) de auto-anticorpos que reagem cruzadamente com ácido polissiálico do hospedeiro.

Em uma modalidade, as composições de antígeno podem ser administradas a um indivíduo mamífero (por exemplo, ser humano) que é imunologicamente naive com relação a um antígeno contendo epitopo de deNAc SA. Em outras modalidades (as quais podem ou não ser relaciona- das), o indivíduo é uma criança de cerca de cinco anos de idade ou mais nova e, de preferência, de cerca de dois anos de idade ou mais nova e as composições de antígeno são administradas em qualquer um ou mais dos seguintes momentos: duas semanas, um mês, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses ou um ano ou 15, 18 ou 21 meses após o nascimento ou a 2, 3, 4 ou anos de idade. Tratamento com indivíduos mais novos pode ser de inte- resse no tratamento de determinados cânceres, tais como neuroblastomas.

Quando a composição de antígeno de deNAc SA tem de ser usada como uma vacina, administração pode ser iniciada antes do primeiro sinal de sintomas da doença, ao primeiro sinal de possível doença ou antes ou após diagnóstico de um câncer primário e/ou uma metástase de um cân- cer tendo um epitopo de deNAc SA na superfície celular (por exemplo, um gangliosídeo que é pelo menos parcialmente de-N-acetilado). Produção de anticorpo

Será prontamente evidente que composições compreendendo antígeno de deNAc SA podem ser usadas para produzir anticorpos anti- antígeno de deNAc SA, incluindo anticorpos monoclonais (mAbs) que podem ser adequados para uso em terapias para câncer anticorpo-baseadas descri- tas aqui. Métodos para geração de mAbs são bem-conhecidos na técnica e podem ser adaptados para uso na produção de mAbs antiepitopo de deNAc SA.

Por exemplo, hibridomas para a produção de mAb podem ser formados através dé isolamento das células imunes estimuladas de um ani- mal imunizado com um antígeno de deNAc SA (usualmente um animal não- humano), tal como aquelas do baço de um animal imunizado. Essas células são, então, fundidas a células imortalizadas, tais como células de mieloma ou células transformadas, as quais são capazes de replicar indefinidamente em cultura de célula, desse modo, produzindo uma linhagem de linhagem imortal que secreta imunoglobulina. A linhagem de célula imortal utilizada pode ser selecionada para ser deficiente em enzimas necessárias para a utilização de determinados nutrientes. Muitas de tais linhagens de célula (tais como mielomas) são conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo: quínase de timidina (TK) ou fosfóribosil transferase de hipoxantina-guanina (HGPRT). Essas deficiências permitem a seleção de células fundidas de acordo com sua capacidade de crescer, por exemplo, sobre meio de mainopterintimidina de hipoxantina (HAT). As parceiras de fusão imortais utilizadas podem ser derivados de uma linhagem que não secreta imunoglobulina. As células ou hibridomas fundidas resultantes são cultivados sob condições que permitem a sobrevi- vência de células fundidas, mas não não-fundidas, e as colônias resultantes selecionadas quanto à produção dos anticorpos monoclonais desejados. Colônias que produzem tais anticorpos são clonados, expandidos e cresci- dos de modo a produzir grandes quantidades de anticorpo, veja Kohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495 (a descrição do qual é aqui incorporada por referência).

Grandes quantidades de mAbs tendo uma especificidade antie- pitopo de deNAc SA desejada podem ser obtidas através de identificação de hibridomas de secreção que produzem os anticorpos desejados e injeção desses clones de hibridoma na cavidade peritoneal de camundongos e cole- ta de fluido de ascites dos mesmos. Os camundongos, de preferência inicia- dos com pristano ou algum outro promotor de tumor e imuno-suprimidos quimicamente ou através de irradiação, podem ser de qualquer um de vários gêneros adequados conhecidos por aqueles versados na técnica. O fluido de ascites é coletado dos camundongos e o anticorpo monoclonal purificado do mesmo, por exemplo, através de uma coluna CM Sepharose ou outro meio cromatográfico. Alternativamente, os hibridomas podem ser cultivados in vitro ou como culturas de suspensão. Cultura em batelada, cultura contínua ou outros processos de cultura adequados podem ser utilizados. Anticorpos monoclonais são, então, recuperados do meio de cultura ou sobrenadante.

Anticorpos antiepitopo de deNAc SA, incluindo fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos antiepitopo de deNAc SA, podem ser pro- duzidos através de engenharia genética. Nessa técnica, conforme com o procedimento de hibridoma padrão, células que produzem anticorpo são sensibilizadas ao antígeno ou imunogênio desejado. O RNA mensageiro iso- lado das células imunes de baço ou hibridomas é usadò como um template para fazer cDNA usando amplificação por PCR. Uma biblioteca de vetores, cada uma contendo um gene de cadeia pesada e um gene de cadeia leve retendo a especificidade por antígeno inicial, é produzida através de inser- ção de seções apropriadas do cDNA de imunoglobulina amplificado em veto- res de expressão. Uma biblioteca combinatorial pode ser construída através de combinação da biblioteca de gene de cadeia pesada com a biblioteca de gene de cadeia leve. Isso resulta em uma biblioteca de clones a qual co- expressa uma cadeia pesada e leve (semelhante ao fragmento Fab ou frag- mento de ligação a antígeno de uma molécula de anticorpo). Os vetores que podem trazer esses genes são co-transfectados em um hospedeiro (por e- xemplo, bactérias, células de inseto, células de mamífero ou outra célula hospedeira que produz proteína adequada). Quando a síntese de gene de anticorpo é indúzida no hospedeiro transfectado, as proteínas de cadeias pesada e leve se auto-estruturam para produzir anticorpos ativos que podem ser detectados através de seleção com o antígeno ou imunogênio.

Uma vez obtido, o anticorpo pode ser isolado e, onde desejado, purificado para uso nos ensaios e terapias descritos aqui. Isolamento e puri- ficação de anticorpos podem ser realizados usando métodos bem- conhecidos na técnica e podem proporcionar preparados contendo anticorpo pelo menos 50% a 60% em peso isentos de moléculas orgânicas com as quais o anticorpo está naturalmente associado ou com as quais ele é asso- ciado durante fabricação. Preparados de anticorpo incluem aqueles que con- têm anticorpo em uma quantidade de pelo menos 75%, mais usualmente pelo menos 90% e geralmente pelo menos 99% em peso.

Em uma modalidade, o anticorpo antiepitopo de deNAc SA é isolado de contaminantes, especialmente contaminantes catiônicos, através de contato de uma suspensão de anticorpo (por exemplo, em um tampão) sob condições de alta concentração de sal. Sais adequados incluem sais de metal alcalino (por exemplo, sulfatos de metal alcalino (por exemplo, sulfato de sódio), haletos de metal alcalino (por exemplo, cloreto de sódio), sais de acetato de metal alcalino (por exemplo, acetato de sódio) e similares. Uma "alta concentração de sal" se refere a uma concentração de sal de pelo me- nos cerca de 0,5 M ou mais até e incluindo sal a 1 Μ. A solução com alto teor de sal contendo o anticorpo é incubada sob condições adequadas para se- parar contaminantes do anticorpo e durante um tempo suficiente para pro- porcionar ruptura de ligações tônicas e/ou eletrostáticas que possam estar presentes entre o anticorpo e contaminantes catiônicos e outros carregados. Períodos de tempo adequados incluem, mas não estão limitados a, cerca de 12 horas, 16 horas, 18 horas ou mais. A solução pode ser incubada em qualquer temperatura adequada, por exemplo, 4 QC, 37 QC, etc. O anticorpo pode, então, ser isolado e/ou purificado da solução. Por exemplo, a solução contendo anticorpo pode ser processada para remover precipitados (por e- xemplo, através de centrifugação) e submetida à técnicas de isolamento e/ou purificação adicionais para isolar o anticorpo da solução, por exemplo, através de cromatografia por exclusão de tamanho. Frações contendo anti- corpo podem ainda ser purificadas através de diálise (por exemplo, contra solução tamponada com fosfato (PBS) e filtração. Descobriu-se que esse tratamento com alto teor de sal é particularmente adequado para isolamento e/ou purificação de mAb SEAM 3, uma vez que ele resultou na remoção de contaminantes que afetavam a atividade do mAb SEAM 3 contra células cancerígenas apresentando antígeno SEAM 3-reativo na superfície celular.

PRODUTOS DIAGNÓSTICOS E TERAPÊUTICOS BASEADOS EM ANTI- CORPO

Antígenos de deNAc SA (incluindo formas não conjugadas e conjugadas) podem ser usados para gerar anticorpos, anticorpos os quais podem ser usados como reagentes para uso em ensaios diagnósticos e em terapia anticorpo-baseado. A presente descrição proporciona anticorpos que se ligam seletivamente a um epitopo de deNAc SA (por exemplo, conforme presente sobre um gangliosídeo de-N-acetilado; PS de N. meningitidis, parti- cularmente PS de NmB; ou PS de E. coli K1 e similares). Tais anticorpos podem exibir pouca ou nenhuma ligação detectável ao ácido polissiálico hu- mano (isto é, os anticorpos não reagem cruzadamente de modo significativo com PSA sobre tecido humano normal (não cancerígeno)). Os anticorpos antiepitopo de deNAc SA podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser fornecidos com um excipiente adequado. Em algumas modalidades, os anti- corpos podem ser imobilizados sobre um suporte ou proporcionados em um recipiente, tal como um frasco, particularmente um frasco estéril, opcional- mente rotulado para uso em um método diagnóstico ou terapêutico, confor- me descrito em maiores detalhes abaixo. Diagnóstico

Anticorpos reativos com um epitopo de deNAc SA podem ser usados para detectar antígenos de deNAc SA em uma amostra biológica obtida de um indivíduo tendo ou suspeito de ter células cancerígenas tendo um epitopo de deNAc SA acessível na superfície celular (por exemplo, um gangliosídeo na superfície celular de-N-acetilado) usando anticorpos antiepi- topo de deNAc SA em técnicas de imunodiagnóstico. A especificidade de ligação a antígerio de anticorpos antiepitopo de deNAc SA pode ser explora- da nesse contexto para facilitar detecção de epitopos de deNAc SA sobre uma célula cancerígena em uma amostra com pouca ou nenhuma ligação detectável ao PSA derivado de hospedeiro, desse modo, reduzindo a inci- dência de resultados falso positivos. Tais métodos de detecção podem ser usados no contexto de diagnóstico, identificação de indivíduo adequado para terapia baseada em anticorpo e/ou baseada em anticorpo anti-deNAc SA, onde o anticorpo se liga especificamente a um epitopo de deNAc SA ou um antígeno SEAM 3-reativo, monitoramento de terapia (por exemplo, para a- companhar a resposta à terapia) e similares.

Técnicas imunodiagnósticas adequadas incluem, mas não estão necessariamente limitadas a, métodos in vitro e in vivo (formação de ima- gem). Onde os métodos são in vitro, a amostra biológica pode ser qualquer amostra na qual o antígeno de deNAc SA pode estar presente incluindo, mas não limitado a, amostras de sangue (incluindo sangue inteiro, soro, etc.), tecidos, células inteiras (por exemplo, células intactas) e extratos de tecido ou célula. Ensaios podem tomar uma ampla variedade de formas, tais como ensaios de competição, reação direta ou do tipo sanduíche. Ensaios exemplificativos incluem Western blots; testes de aglutinação; imunoensaios enzima-rotulados e mediados, tais como ELISAs; ensaios do tipo bioti- na/avidina; radioimunoensaios; imunoeletroforese; imunoprecipitação e simi- lares. As reações geralmente incluem rótulos detectáveis, tais como rótulos fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos, enzimáticos ou moléculas de corante ou outros métodos para detecção da formação de um complexo entre o antígeno na amostra e o anticorpo ou anticorpos reagidos com o mesmo.

Os ensaios podem envolver separação de anticorpo não ligado em uma fase líquida de um suporte em fase sólida ao qual complexos de antígeno-anticorpo são ligados. Suportes sólidos os quais podem ser usados na prática da invenção! incluem substratos, tais como nitrocelulose (por e- xemplo, na forma de membrana ou cavidade de microtitulação); cloreto de polivinila (por exemplo, folhas ou cavidades de microtitulação); látex de poli- estireno (por exemplo, glóbulos ou lâminas de microtitulação); fluoreto de polivinilideno, papel diazotizado; membranas de náilon; glóbulos ativados, glóbulos magneticamente responsivos e similares.

Onde um suporte sólido é usado, o suporte sólido usualmente é primeiro reagido com um componente de fase sólida (por exemplo, um anti- corpo antiepitopo de deNAc SA) sob condições de ligação adequadas, de modo que o componente esteja suficientemente imobilizado ao suporte. Al- gumas vezes, imobilização ao suporte pode ser intensificada primeiro atra- vés de acoplamento do anticorpo a uma proteína com melhores proprieda- des de ligação ou que proporciona imobilização do anticorpo sobre o supor- te, sem perda significativa de atividade de ligação ou especificidade do anti- corpo. Proteínas de acoplamento adequadas incluem, mas não estão limita- das a, macromoléculas, tais como albuminas do soro, incluindo albumina de soro bovino (BSA), hemocianina do caramujo megathura crenulata, molécu- las de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina e outras proteínas bem- conhecidas por aqueles versados na técnica. Outras moléculas que podem ser usadas para ligar anticorpos ao suporte incluem polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e similares, contanto que a molécula usada para imobilizar o anticorpo não tenha um impacto adverso sobre a capacidade do anticorpo de se ligar especificamente ao antígeno. Tais moléculas e métodos de aco- plamento dessas moléculas a antígenos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Brinkley, M. A. Bioconjugate Chem. (1992) 3: 2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6: 56-63; e Anjaneyulu e Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124.

Após reação do suporte sólido com o componente de fase sóli- da, quaisquer componentes de fase sólida não imobilizados são removidos do suporte através de lavagem e o componente suporte-ligado é, então, con- tatado com uma amostra biológica suspeita de conter epitopos de deNAc SA sob condições de ligação adequadas. Após lavagem para remover qualquer ligante não ligado, uma porção Iigante secundária é adicionada sob condi- ções de ligação adequadas, em que o Iigante secundário é capaz de se as- sociar seletivamente com o Iigante ligado. A presença ou ausência do Iigante secundário pode, então, ser detectada usando métodos bem-conhecidos na técnica.

Um método ELISA pode ser usado, em que as cavidades de uma placa de microtitulação são revestidas com anticorpo antiepitopo de deNAc SA de acordo com a presente invenção. Uma amostra biológica con- tendo ou suspeita de conter um antígeno de deNAc SA (por exemplo, um antígeno de tumor tendo um epitopo de deNAc SA, tal como um gangliosí- deo de-N-acetilado) é, então, adicionada às cavidades revestidas. Após um período de incubação suficiente para permitir ligação do anticorpo, a(s) lâmi- na(s) pode(m) ser lavada(s) para remover porções não ligadas e uma molé- cula de ligação secundária detectavelmente rotulada adicionada. A molécula de ligação secundária é deixada reagir com qualquer antígeno capturado, a lâmina lavada e a presença ou ausência da molécula de ligação secundária detectada usando métodos bem-conhecidos na técnica.

Onde desejado, a presença ou ausência de antígeno de deNAc SA ligado de uma amostra biológica pode ser prontamente detectada usan- do um Iigante secundário compreendendo um anticorpo dirigido contra os igantes de anticorpo. Por exemplo, uma série de moléculas anti- imunoglobulina bovina (Ig) são conhecidas na técnica, as quais podem ser prontamente conjugadas a um rótulo enzimático detectável, tal como peroxi- dase de armorácia, fosfatase alcalina ou urease, incluindo métodos conheci- dos por aqueles versados na técnica. Um substrato enzimático apropriado é, então, usado para gerar um sinal detectável. Em outras modalidades rela- cionadas, técnicas de ELISA do tipo competitivo podem ser praticadas usan- do métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

Ensaios também podem ser conduzidos em solução, de modo que os anticorpos e antígeno de deNAc SA formam complexos sob condi- ções de precipitação. Por exemplo, o anticorpo pode ser preso a uma partí- cula em fase sólida (por exemplo, um glóbulo de agarose ou semelhante) usando métodos de acoplamento conhecidos na técnica, tal como através de acoplamento químico direto ou indireto. A partícula revestida de anticorpo é, então, contatada sob condições de ligação adequadas com uma amostra biológica suspeita de conter o antígeno de deNAc SA para proporcionar a formação de agregados de complexo em partícula de antígeno de deNAc SA-anticorpo os quais podem ser precipitados e separados da amostra u- sando lavagem e/ou centrifugação. A mistura de reação pode ser analisada para determinar a presença ou ausência de complexos de anticorpo- antígeno usando qualquer um de uma série de métodos-padrão, tais como aqueles métodos de imunodiagnóstico descritos acima.

A amostra de teste usada nos ensaios diagnósticos pode ser qualquer amostra na qual um antígeno de deNAc SA pode estar presente incluindo, mas não limitado a, amostras de sangue (incluindo sangue inteiro, soro, etc.), tecidos, células inteiras (por exemplo, células intactas) e extratos de célula e tecido contendo células (por exemplo, tecido, células isoladas, etc.), um Iisato de célula (isto é, uma amostra contendo células não intactas), onde cada tipo de amostra pode conter elementos de ambos os tipos (por exemplo, uma amostra de células pode conter Iisatos de célula e vice-versa). Em algumas modalidades, pode ser desejável conduzir o ensaio usando uma amostra do indivíduo a ser diagnosticado que contém células vivas in- tactas. Detecção de antígeno de deNAc SA pode, então, ser avaliada sobre uma superfície extracelular das células e pode ainda ser avaliada durante divisão celular.

Ensaios diagnósticos também podem ser conduzidos in situ. Por exemplo, anticorpos antiepitopo de deNAc SA podem ser detectavelmente rotulados, administrados a um indivíduo suspeito de ter um câncer caracteri- zado por expressão na superfície celular de um epitopo de deNAc SA e anti- corpo detectavelmente rotulado ligado detectado usando métodos de forma- ção de imagem disponíveis na técnica.

Os ensaios diagnósticos descritos aqui podem ser usados para determinar se um indivíduo tem um câncer e é passível de terapia usando uma imunoterapia antígeno de deNAc SA-baseada (por exemplo, vacina de antígeno de deNAc SA e/ou terapia com anticorpo anti-antígeno de deNAc SA). Os ensaios diagnósticos podem informar seleção de terapia e regime de tratamento pára um médico.

Em uma modalidade, o ensaio de detecção envolve detecção de um antígeno SEAM 3- reativo em uma amostra, onde a amostra pode conter [faltando um trecho]. Onde os métodos são in vitro, a amostra biológica pode ser qualquer amostra na qual um antígeno SEAM 3-reativo pode estar pre- sente incluindo, mas não limitado a, amostras de sangue (incluindo sangue inteiro, soro, etc.), tecidos, células inteiras (por exemplo, células intactas, isto é, células que não foram submetidas à permeabilização) ou Iisatos de célula (por exemplo, conforme obtido de tratamento de uma amostra tecidual). Por exemplo, o ensaio pode envolver detecção de um antígeno SEAM 3-reativo sobre células em Uma amostra tecidual histológica. Por exemplo, a amostra tecidual pode ser fixada (por exemplo, através de tratamento com formalina) e pode ser fornecida incrustada em um suporte (por exemplo, em parafina) ou tecido não fixado congelado.

O antígeno SEAM 3-reativo pode ser detectado através de de- tecção de ligação específica de um anticorpo, usualmente um anticorpo mo- noclonal (mAb) que tem especificidade de ligação a antígeno de SEAM 3. Nessa modalidade, o antígeno SEAM 3-reativo pode estar presente sobre a superfície em qualquer estágio do ciclo celular, incluindo durante divisão ce- lular. De nota é que, em alguns casos, cânceres que apresentam um antíge- no SEAM 3-reativo durante divisão celular podem apresentar um nível menor ou não detectável de antígeno SEAM 3-reativo quando a celular é quiescen- te (isto é, não está sofrendo divisão celular). Contudo, conforme ilustrado nos exemplos abaixo, antígeno SEAM 3-reativo pode ser detectado em célu- las em não divisão detectando o antígeno SEAM 3-reativo em uma célula de teste permeabilizada. Uma célula cancerígena de teste que exibe um padrão de coloração còm um anticorpo SEAM 3 (ou um anticorpo tendo a especifici- dade de ligação a antígeno do SEAM 3) que é distinto de um padrão de colo- ração de anticorpo em uma célula normal é identificada como uma célula cancerígena que exibe um antígeno SEAM 3-reativo. Tais cânceres são, as- sim, passíveis de terapia com um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno SEAM 3-reativo (por exemplo, o mAb SEAM 3).

Os reagentes de ensaio acima descritos, incluindo os anticorpos gerados através de imunização com o antígeno de deNAc SA de acordo com os métodos descritos aqui podem, ser fornecidos em kits, com instruções adequadas e outros reagentes necessários, de forma a conduzir imunoen- saios, conforme descrito acima. O kit também pode conter, dependendo do imunoensaio usado em particular, rótulos adequados e outros reagentes e materiais embalados (isto é, tampões de lavagem e similares). Imunoensaios padrão, tais como aqueles descritos acima, podem ser conduzidos usando esses kits.

Terapias baseadas em anticorpo

Anticorpos gerados usando os métodos da invenção para tratar ou prevenir câncer associado que apresenta um epitopo de deNAc SA em um indivíduo mamífero, particularmente em um ser humano. Anticorpos ge- rados usando um antígeno de deNAc SA (incluindo conjugados) podem ser fornecidos em uma composição farmacêutica adequada para administração a um indivíduo, de modo a proporcionar terapia anticâncer.

Mais particularmente, anticorpos antiepitopo de deNAc SA gera- dos de acordo com os métodos descritos aqui podem ser administrados a um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) para, por exemplo, facilitar a redução de viabilidade de células cancerígenas, por exemplo, para propor- cionar ou intensificar uma resposta imune ou terapia anticâncer para reduzir o tamanho do tumor, reduzir a carga de tumor e/ou melhorar os resultados clínicos em pacientes. Em particular, anticorpos que têm a especificidade de ligação do mAb SEAM 3 (e, assim, se ligam ao epitopo ligado pelo mAb SE- AM 3) podem ser usados para romper o ciclo celular da célula cancerígena e facilitar a entrada da célula em apoptose, por exemplo, induzindo as células cancerígenas a entrar na fase de ciclo celular pré-G0. Os anticorpos podem, opcionalmente, ter sido presos a um fármaco anticâncer para distribuição a um local de uma célula cancerígena para facilitar adicionalmente a morte ou clearance de tumor, por exemplo, uma porção anti-proliferação (por exem- plo, antagonista de VEGF, por exemplo, um anticorpo anti-VEGF), uma toxi- na (por exemplo, uma toxina anticâncer, por exemplo, ricina, exotoxina A de Pseudomonas é similares), radionuclídeo (por exemplo, 90Y, 131l, 177L e simi- lares), fármacos anticâncer (por exemplo, doxorrubicina, calicheamicina, maitancinóide DM1, auristatina, caupecitabina, 5-fluorouracila, leucovorina, irinotecan e similares) e/ou podem, opcionalmente, ser modificados para proporcionar um perfil farmacocinético aperfeiçoado (por exemplo, através de PEGuilação, hiperglicosilação e similares).

Métodos para a produção e formulação de anticorpos antiepito- po de deNAc SA adequados para administração a um indivíduo (por exem- plo, um indivíduo humano) são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser proporcionados em uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo e excipientes far- macêuticos (por exemplo, solução salina). A composição farmacêutica pode, opcionalmente, incluir outros aditivos (por exemplo, tampões, estabilizantes, conservantes e similares). Uma quantidade eficaz de anticorpo é geralmente uma quantidade eficaz para proporcionar intensificação de uma resposta imune anticâncer em um indivíduo durante um período desejado. Um objetivo terapêutico (por exemplo, redução na carga de tumor) pode ser realizado atra- vés de uma única ou múltiplas doses sob um regime de dosagem variado.

Anticorpos administrados a um outro organismo que não a es- pécie na qual eles são estimulados são, freqüentemente, imunogênicos. As- sim, por exemplo, anticorpos de murino ou suíno administrados a um ser humano freqüentemente induzem a uma resposta imunológica contra o anti- corpo. As propriedades imunogênicas do anticorpo são reduzidas alterando porções ou todo o anticorpo em seqüências caracteristicamente humanas, desse modo, produzindo anticorpos quiméricos ou humanos, respectivamente.

De interesse particular são anticorpos que têm a especificidade de ligação a antígeno do mAb SEAM 3. Exemplos de tais anticorpos incluem aqueles tendo um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3 (resíduos de aminoácido 24 a 39, resíduos de aminoácido 55 a 61 e resí- duos de aminoácido 94 a 100, respectivamente, apresentados na figura 52) e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável do polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 (resíduos de aminoácido 26 a 35, resíduos de aminoácido 50 a 66 e resíduos de ami- noácido 101 a 108, respectivamente, apresentados na figura 52). Tais anti- corpos incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e similares.

Anticorpos quiméricos

Anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina com- preendendo uma porção não-humana e uma humana. Mais especificamente, a região de combinação com antígeno (ou região variável) de um anticorpo quimérico humanizado é derivada de uma fonte não-humana (por exemplo, murino) e a região constante do anticorpo quimérico (a qual confere função efetuadora biológica à imunoglobulina) é derivada de uma fonte humana. O anticorpo quimérico pode ter a especificidade de ligação a antígeno da mo- lécula de anticorpo não-humana e a função efetuadora conferida pela molé- cula de anticorpo humana. Um grande números de métodos de geração de anticorpos quiméricos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Pats. U.S. Nos. 5.502.167, 5.500.362, 5.491.088, 5.482.856, 5.472.693, 5.354.847, 5.292.867, 5.231.026, 5.204.244, 5.202.238, 5.169.939, 5.081.235, 5.075.431 e 4.975.369). Uma abordagem alternativa é a geração de anticorpos humanizados através de ligação das regiões de CDR de anticorpos não-humanos à regiões constantes humanas 30 através de técnicas de DNA recombinante. Veja Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989) e WO 90/07861.

Métodos de DNA recombinante podem ser usados para gerar anticorpos quiméricos em um sistema de expressão recombinante. Por e- xemplo, um vetor de DNA recombinante é usado para transfectar uma linha- gem de célula que produz um anticorpo antiepitopo de deNAc SA. O vetor de DNA recombinante pode conter um "gene de reposição" para substituir todo ou uma porção do gene que codifica a região constante de imunoglobulina na linhagem de célula (por exemplo, um gene de reposição pode codificar toda ou uma porção de uma região constante de uma imunoglobulina huma- na ou uma classe de imunoglobulina específica) e uma "seqüência alvo" o que permite a recombinação homóloga objetivada com seqüências de imu- noglobulina dentro da célula que produz o anticorpo (por exemplo, hibridoma).

Em outro exemplo, um vetor de DNA recombinante é usado para transfectar uma linhagem de célula que produz um anticorpo tendo uma fun- ção efetuadora desejada (por exemplo, uma região constante de uma imu- noglobulina humana), caso no qual o gene de reposição contido no vetor recombinante pode codificarõ toda ou uma porção de uma região de um an- ticorpo e a seqüência alvo contida no vetor recombinante permite recombi- nação homóloga e modificação objetivada de gene dentro da célula que produz o anticorpo. Em outra modalidade, quando apenas uma porção da região cons- tante ou variável é substituída, o anticorpo quimérico resultante pode definir a mesma ligação a antígeno e/ou ter a mesma função efetuadora, ainda que al- terada ou aperfeiçoada, de modo que o anticorpo quimérico pode demons- trar uma maior especificidade por antígeno, maior constante de afinidade de ligação, função efetuadora aumentada ou secreção e produção aumentadas pela linhagem de célula transfectada que produz o anticorpo etc.

Anticorpos humanos

Em outra modalidade, os anticorpos antiepitopo de deNAc SA são anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanos são primariamente compostos de seqüências de polipeptídeo caracteristicamente humanas. Os anticorpos humanos da presente invenção podem ser produzidos através de uma ampla variedade de métodos (vide, por exemplo, Larrick et al., Patente U.S. No. 5.001.065). Anticorpo antiepitopo de deNAc SA humano pode ser produzido inicialmente em células de trioma (descendidas de três células, duas humanas e uma de camundongo). Genes que codificam os anticorpos são, então, clonados e expressos em outras células, particularmente células de mamífero não-humanas. A abordagem geral para a produção de anticor- pos humanos átravés da tecnologia de trioma foi descrita por Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, Patente U.S. No. 4.634.664 e En- gelman et al., Patente U.S. No. 4.634.666. Descobriu-se que triomas produ- zem anticorpo mais estavelmente do que hibridomas comuns feitos de célu- las humanas.

Terapia de Câncer

Anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo de de- NAc SA podem ser usados em terapia anticâncér para um indivíduo mamífe- ro, particularmente um ser humano, onde as células cancerígenas apresen- tam um epitopo de deNAc SA sobre um superfície celular extracelularmente acessível (por exemplo, um epitopo de deNAc SA sobre um gangliosídeo pelo menos parcialmente de-N-acetilado). Particularmente, os anticorpos gerados usando os antígenos de deNAc SA (incluindo conjugados de antí- geno de deNAc SA) podem ser proporcionados em uma composição farma- cêutica adequada para administração a um indivíduo que precisa de trata- mento.

Administração terapêutica dos anticorpos em questão pode in- cluir administração como uma parte de um regime terapêutico que pode ou não ser em conjunto com produtos terapêuticos anticâncér padrões adicio- nais incluindo, mas não limitado a, agentes quimioterapêuticos e cirurgia (por exemplo, conforme ainda descrito abaixo). Além disso, administração tera- pêutica dos anticorpos em questão também pode ser tratamento pós- terapêutico do indivíduo com uma terapia anticâncér, onde a terapia anticân- cér pode ser, por exemplo, cirurgia, terapia de radiação, administração de agentes quimioterapêuticos e similares. Uso de anticorpos monoclonais, an- ticorpos monoclonais que podem proporcionar morte complemento-mediada e/ou morte mediada por citotoxicidade celular anticorpo-dependente de uma célula alvo são de interesse particular.

Em determinadas modalidades, o anticorpo pode ser proporcio- nado sozinho ou pode, opcionalmente, ser preso a um composto para facili- tar a distribuição do composto à célula cancerígena para facilitar morte ou desobstrução do tumor, por exemplo, uma toxina (por exemplo, ricina, toxina de difteria, exotoxina A de Pseudomonas ou outra toxina), um radionuclídeo ou outra molécula que é citotóxica (por exemplo, 90Y, 13iIl 177L e similares). O anticorpo (ou, onde ligado a um composto, o conjugado de anticorpo- composto) pode ser proporcionado em solução (por exemplo, diluído em so- lução salina normal, PBS ou solução salina normal ou PBS em combinação com albumina humana (5%)). O anticorpo pode ser proporcionado em uma concentração oscilando de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, incluin- do de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 9 mg/ml, cerca de 1 mg/ml a cerca de 8 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 7,5 mg/ml, cerca de 2 mg/ml a cerca de 7 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml a cerca de 6,5 mg/ml, cerca de 3 mg/ml a cerca de 6 mg/ml, cerca de 3,5 mg/ml a cerca de 5,5 mg/ml, cerca de 4 mg/ml a cerca de 5 mg/ml e similares.

Em outras modalidades, o anticorpo pode ser administrado em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos (por exemplo, ci- clofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona (CHOP)) e/ou em com- binação com tratamento por radiação e/ou em combinação com intervenção cirúrgica (por exemplo, pré- ou pós-cirurgia para remover um tumor). Onde o anticorpo antiepitopo de deNAc SA é usado em conexão com intervenção cirúrgica, o anticorpo pode ser administrado antes de, no momento de ou após cirurgia para remover células cancerígenas e pode ser administrado sistêmica ou localmente no local cirúrgico. O anticorpo sozinho ou em com- binações descritas acima pode ser administrado sistemicamente (por exem- plo, através de administração parenteral, por exemplo, através de uma via intravenosa) ou localmente (por exemplo, em um local de tumor, por exem- plo, através de administração intratumoral (por exemplo, em um tumor sólido em um nódulo linfático envolvido em um Iinfoma ou leucemia), administração em um vaso sangüíneo que supre um tumor sólido etc.). A administração de anticorpo pode ser realizada através de infusão, por exemplo, através de infusão em uma taxa de cerca de 50 mg/h a cerca de 400 mg/h, incluindo cerca de 75 mg/h a cerca de 375 mg/h, cerca de 100 mg/h a cerca de 350 mg/h, cerca de 150 mg/h a cerca de 350 mg/h, cerca de 200 mg/h a cerca de 300 mg/h, cerca de 225 mg/h a cerca de 275 mg/h. Taxas de infusão exem- plificativas podem obter uma dose terapêutica desejada, por exemplo, de cerca de 0,5 mg/m/dia a cerca de 10 mg/m /dia, incluindo cerca de 1 mg/m2/dia a cerca de 9 mg/m2/dia, cerca de 2 mg/m2/dia a cerca de 8 mg/m2/dia, cerca de 3 mg/m2/dia a cerca de 7 mg/m2/dia, cerca de 4 mg/m2/dia a cerca de 6 mg/m2/dia, cerca de 4,5 mg/m2/dia a cerca de 5,5 mg/m2/dia. Administração (por exemplo, através de infusão) pode ser repeti- da durante um período desejado, por exemplo, repetida durante um período de cerca de 1 dia a cerca de 5 dias ou uma vez a cada vários dias, por e- xemplo, cerca de 5 dias, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses etc. Terapia anticorpo-baseada de metástases

Um problema primário com o tratamento de câncer é metásta- ses ou a propensão para serem liberados do local primário do tumor, trafe- gando na corrente sangüínea para locais distais, seguido por fixação em te- cidos em locais distais e formação de tumor secundário. O problema é, fre- qüentemente, exacerbado durante remoção cirúrgica do tumor primário co- mo o resultado de ruptura mecânica da massa, resultando em metástase e adesão a uma localização secundária após cirurgia. Tratamento com um anticorpo antiepitopo de deNAc SA (por exemplo, SEAM 3) após identifica- ção de um tumor primário composto de células expressando um epitopo de deNAc SA (por exemplo, um gangliosídeo de de-N-acetila) e/ou após remo- ção cirúrgica de um tumor pode impedir adesão de quaisquer células cance- rígenas após metástase e é considerado pela invenção. Além disso, anticor- po antiepitopo de deNAc SA (por exemplo, SEAM 3) que se liga a células cancerígenas que expressam um epitopo de deNAc SA (por exemplo, gan- gliosídeo de de-N-acetila ou proteína ácido siálico-modificada) pode propor- cionar um efeito citotóxico sobre células que é independente de complemen- to (vide seção Exemplos). Portanto, em determinadas modalidades, um anti- corpo antiepitopo de deNAc SA (por exemplo, SEAM 3) é útil no tratamento de pacientes com câncer que têm uma deficiência de complemento, por e- xemplo, como um resultado de uma exposição ambiental (por exemplo, du- rante uma terapia com fármaco) uma deficiência genética etc. Exemplos de deficiências de complemento incluem aquelas envolvendo inibição de C1, C2, C6, C9 e properdina.

Terapias combinadas para o câncer

Qualquer uma de uma ampla variedade de terapias para o cân- cer pode ser usada em combinação com as terapias baseadas em deNAc SA ou baseados em anticorpo antiepitopo de deNAc SA descritas aqui. Tais terapias para o câncer incluem cirurgia (por exemplo, remoção cirúrgica do tecido canceroso), terapia de radiação, transplante de medula óssea, trata- mento quimioterapêutico, tratamento com um modificador da resposta bioló- gica e determinadas combinações dos precedentes.

Terapia de radiação inclui, mas não está limitada a, raios χ ou raios gama que são distribuídos a partir de uma fonte externamente aplicada, tal como um feixe ou através de implante de pequenas fontes radioativas.

Agentes quimioterapêuticos são compostos não peptídicos (isto é, não proteináceos) que reduzem a proliferação de células cancerígenas e abrangem agentes citotóxicos e agentes citostáticos. Exemplos não Iimitati- vos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes de alquilação, nitrosou- réias, antimetabólitos, antibióticos antitumor, (vinca) alcalóides de planta e hormônios esteroidais.

Agentes que atuam para reduzir a proliferação celular são co- nhecidos na técnica e amplamente usados. Tais agentes incluem agentes de alquilação, tais como mostardas de nitrogênio, nitrosouréias, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquila e triazenos incluindo, mas não limitado a, mecloretamina, ciclofosfamida (CYTOXAN®), melphalan (L-sarcolisina), car- mustina (BCNU), Iomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU), estreptozoci- na, clorozotocina, mostarda de uracila, clormetina, ifosfamida, clorambucila, pipobroman, trietilenomelamina, trietileno tiofosforaminà, busulfan, dacarba- zina e temozolomida.

Agentes antimetabólitos incluem análogos de ácido fólico, aná- logos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de deaminase de adenosi- na incluindo, mas não limitado a, citarabina (CYTOSAR-U), arabonosídeo de citocina, fluorouracila (5-FU), floxuridina (FudR), 6-tioguanina, 6-mercapto- purina (6-MP), pentostatina, 5-fluorouracila (5-FU), metotrexato, 10-propargil- 5,8-dideazafoláto (PDDF, CB3717), ácido 5,8-dideazatetra hidrofólico (DDA- THF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina e gemcitabina.

Produtos naturais adequados e seus derivados (por exemplo, vinca alcalóides, antibióticos antitumor, enzimas, Iinfocinas e epipodofilotoxi- nas) incluem, mas não estão limitados a, Ara-C, paclitaxel (TAXOL®), doce- taxel (TAXOTERE®), deõxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginase, aza- tioprina; brequinar; alcalóides, por exemplo, vincristina, vinblastina, vinorrel- bina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por exemplo, etoposídeo, teniposídeo etc.; antibióticos, por exemplo, antraciclina, hidrocloreto de daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidina), idarubicina, doxorrubicina, epirrubi- cina e derivados de morfolino etc.; bisciclopeptídeos de fenoxizona, por e- xemplo, dactinomicina; glicopeptídeos básicos, por exemplo, bleomicina; glicosídeos de antraquinona, por exemplo, plicamicina (mitramicina); antra- cenodionas, por exemplo, mitoxantrona; azirinopirrolo indoladionas, por e- xemplo, mitomicina; imunossupressores macrocíclicos, por exemplo, ciclos- porina, FK-506 (tacrolimus, prograf), rapamicina etc.; e similares.

Outros agentes citotóxicos anti-proliferativos são navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosa- mida e droloxafina.

Agentes que afetam o microtúbulo que têm atividade antiprolife- rativa são também adequados para uso e incluem, mas não estão limitados a, alocolchicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por exemplo, NSC 33410), dolstatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (TAXOL®), derivados de TAXOL®, docetaxel (TAXOTERE®), tiocolchicina (NSC 361792), tritil cisterina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, epotilonas naturais e sintéticas incluindo, mas não limitado a, epotilona A, epotilona B, discodermolida; estramustina, nocodazol, e similares.

Moduladores hormonais e esteróides (incluindo análogos sintéti- cos) que são adequados para uso incluem, mas não estão limitados a, adre- nocorticosteróides, por exemplo, prednisona, dexametasona etc.; estrogê- nios e pregestinas, por exemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, estradiol, clomifeno, tamoxi- feno etc.; e supressores adrenocorticais, por exemplo, aminoglutetimida; 17a-etinilestradiol; dietilestilbestrol, testosterona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglu- tetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, Flutami- da (Drogenil), Tòremifeno (Fareston) e ZOLADEX®. Estrogênios estimulam a proliferação e diferenciação, portanto, compostos que se ligam ao receptor de estrogênio são usados para bloquear essa atividade. Corticosteróides podem inibir a proliferação de células T.

Outros agentes quimioterapêuticos incluem complexos de metal, por exemplo, cisplatina (cis-DDP), carboplatina etc.; uréias, por exemplo, hidroxiuréia; e hidrazinas, por exemplo, N-metilhidrazina; epidofilotoxina; um inibidor de topoisomerase; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur etc.. Outros agentes anti-proliferativos de interesse incluem imunossupresso- res, por exemplo, ácido micofenóliço, talidomida, desoxiespergualina, azas- porina, lefmnomida, mizoribina, azaspirana (SKF 105685); IRESSA® (ZD 1839, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metóxi-6-(3-(4-morfolinil)propóxi) qui- nazolina) etc.

"Taxanos" incluem paclitaxel, bem como qualquer derivado de taxano ativo ou pró-fármaco. "Paclitaxel" (o qual deverá ser compreendido aqui como incluindo análogos, formulações e derivados tais como, por e- xemplo, docetaxel, TAXOL®, TAXOTERE® (uma formulação de docetaxel), análogos de 10-desacetila de paclitaxel e análogos de 3'N-desbenzoil-3'N-t- butoxicarbonila de paclitaxel) podem ser prontamente preparados utilizando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica (vide também WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; Pats. U.S. Nos. 5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534; 5.229.529; e EP 590.267) ou obtidos de uma varieda- de de fontes comerciais incluindo, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 de Taxus brevifolia; ou T-1912 de Taxus yannanensis).

Paclitaxel deverá ser compreendido como se referindo não ape- nas à forma quimicamente disponível comum de paclitaxel, mas também análogos e derivados (por exemplo, TAXOTERE® docetaxel, conforme nota- do acima) e conjugados de paclitaxel (por exemplo, paclitaxel-PEG, paclita- xel-dextrana ou paclitaxel-xilosé).

Também incluídos dentro do termo "taxano" estão uma varieda- de de derivados conhecidos, incluindo derivados hidrofílicos e derivados hi- drofóbicos. Derivados de taxano incluem, mas não estão limitados a, deriva- dos de galactose e manose descritos no Pedido de Patente Internacional No. WO 99/18113; piperazino e outros derivados descritos no WO 99/14209; derivados de taxano descritos no WO 99/09021, WO 98/22451 e Patente U.S. No. 5.869.680; derivados de 6-tio descritos no WO 98/28288; derivados de sulfenamida descritas na Patente U.S. No. 5.821.263; e derivados de ta- xol descritos na Patente U.S. No. 5.415.869. Ele ainda inclui pró-fármacos de paclitaxel incluindo, mas não limitado a, aqueles descritos no WO 98/58927; WO 98/13059; e Patente U.S. No. 5.824.701.

CÂNCERES PASSÍVEIS DE TERAPIA ATRAVÉS DE UMA TERAPIA BA- SEADA EM ANTICORPO OU BASEADA EM IMUNIZAÇÃO COM ANTÍGE- NO DEdeNAc SA

O antígeno de 2 encontra uso em uma variedade de terapias de câncer (incluindo prevenção de câncer (vacina para o câncer) e terapia pós- diagnóstico de câncer) ou diagnóstico de câncer para cânceres tendo um epitopo de deNAc SA na superfície celular. Indivíduos tendo, suspeitos de ter ou em risco de desenvolver um tumor são considerados para terapia e diagnóstico descritos aqui. Amostras obtidas de tal indivíduo são, da mesma forma, adequadas para uso nos métodos da invenção.

Cânceres tendo um epitopo de deNAc SA acessível na superfí- cie celular incluem aqueles tendo um gangliosídeo pelo menos parcialmente de-N-acetilado e/ou uma proteína tendo uma modificação de ácido siálico que contém um epitopo de deNAc SA. Cânceres tendo gangliosídeos de-N- acetilados foram descritos.

A presença de resíduos de ácido de-N-acetil siálico em tecido humano normal parece ser transitória e com uma abundância muito baixa, sendo encontrada apenas em uns poucos vasos sangüíneos, células mono- nucleares infiltradas na pele e cólon e, em níveis moderados, em melanóci- tos da pele. Ele é prevalente apenas em células anormais, tais como mela- nomas, Ieucemias e linfomas. Uma vez que a expressão de altos níveis de antígenos de deNAc SA (por exemplo, gangliosídeos de de-N-acetila) ocorre predominantemente em células cancerígenas, imunização com antígenos de deNAc SA pode ser usada para estimular anticorpos que podem afetar a citotoxicidade complemento-mediada e a citotoxicidade celular anticorpo- dependente e podem bloquear o crescimento de tumor. Além disso, anticor- pos que são específicos para oligômeros de ácido de-N-acetil siálico curtos encontrados em alguns gangliosídeo podem ser usados terapeuticamente para afetar a citotoxicidade complemento-mediada e a citotoxicidade celular anticorpo-dependente e podem bloquear o crescimento de tumor e impedir a adesão e invasão de células cancerígenas em outros tecidos.

Cânceres exemplificativos que apresentam um epitopo de de- NAc SA incluem células cancerígenas apresentando um gangliosídeo de de- N-acetila contendo um resíduo de ácido de-N-acetil siálico (por exemplo, GM2alfa, GMIalfa, GDIbeta1 GMIb, GDIc1 GDIalfa, GM3, GM2, GM1, GD13, GT13, GTlhalfa, GD3, GD2, GDIb, GTIb, GQIb, Gomegalhalfa, GT3, GT2, GTIc, GQIc e GPIc). De interesse particular são gangliosídeos que contêm dois ou mais resíduos de ácido siálico ligados através de ligações glicosídi- cas alfa 2-8 (por exemplo, GDIc, GT13, GD3, GDIb, GTIb, GQIb, Gomega- lhalfa, GT3, GTIc, GQIc e GPIc) nos quais pelo menos um resíduo é de-N- acetilado. Em algumas modalidades, o gangliosídeo que contém dois ou mais resíduos de ácido siálico ligados por ligações glicosídicas alfa 2-8 é um outro gangliosídeo que não GD3 e/ou outro GM3. Em algumas modalidades, o alvo do câncer é um outro epitopo de deNAc SA que não um presente so- bre um gangliosídeo de-N-acetilado (por exemplo, um resíduo de-N- acetilado de uma proteína ácido siálico-modificada). Em uma modalidade, anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno SEAM 3-reativo são usados no tratamento de cânceres que apresentam um antígeno SEAM 3-reativo sobre uma superfície celular, inclu- indo cânceres que exibem um antígeno SEAM 3-reativo extracelularmente acessível durante divisão celular. Cânceres que apresentam um antígeno SEAM 3-reativo, particularmente um antígeno SEAM 3-reativo na superfície celular são particularmente passíveis de terapia com um anticorpo tendo a especificidade de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal SEAM 3, inclu- indo cânceres que exibem um antígeno SEAM 3-reativo extracelularmente acessível durante divisão celular.

Deverá ser notado que os epitopos de deNAc SA e/ou antígenos SEAM 3-reativos contra os quais terapia de câncer é dirigida podem ser ex- pressos em maiores níveis sobre uma célula cancerígena comparado com uma célula não cancerígena, de modo a aliviar o dano a células normais, isso não sendo uma limitação das terapias descritas aqui. Por exemplo, on- de o câncer envolve um tipo de célula que pode ser substituído (por exem- plo, célula B, célula T ou outra célula de origem Hematopoiética, conforme em leucemias e linfomas), ligação de anticorpos antiepitopo de deNAc SA (por exemplo, SEAM 3) a células normais pode ser aceitável, uma vez que dano a um indivíduo através de eliminação de tais células pode ser tratado (por exemplo, com fármacos para estimular a repopulação de células nor- mais, por exemplo, GM-CSF, EPO e similares).

Os métodos referentes ao câncer considerados aqui incluem, por exemplo, o uso de antígenos de deNAc SA como uma vacina ou terapia anticâncer, bem como o uso de anticorpos gerados usando os antígenos de deNAc SA em vacinas anticâncer (por exemplo, através de imunização pas- siva) ou terapias. Os métodos são úteis no contexto de tratamento ou pre- venção de uma ampla variedade de cânceres, incluindo carcinomas, sarco- mas, leucemias e linfomas.

Carcinomas que podem ser passíveis de terapia através de um métodos descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, carcinoma eso- fageal, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basais (uma forma de câncer de pele), carcinoma de células escamosas (vários tecidos), carcino- ma da bexiga, incluindo carcinoma de células transitórias (um neoplasma maligno da bexiga), carcinoma broncogênico, carcinoma de cólon, carcino- ma colorretal, carcinoma gástrico, carcinoma de pulmão, incluindo carcinoma de células pequenas e carcinoma de células não-pequenas do pulmão, car- cinoma adrenocortical, carcinoma da tiróide, carcinoma pancreático, carci- noma de mama, carcinoma ovarianò, carcinoma de próstata, adenocarcino- ma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, car- cinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinóma de célula renal, carcinoma dutal in situ ou carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriônico, tumor de Wilm1 carcinoma cervical, carcinoma uterino, carcinoma testicular, carcinoma osteogênico, carcinoma epitelial e carcinoma nasofaringeal.

Sarcomas que podem ser passíveis de terapia através de um método descrito aqui incluem, mas não estão limitados a fibrossarcoma, mi- xossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, cordoma, sarcoma orteogêni- co, osteossarcoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendotélio sarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiossarcoma, râbdomiossarcoma e outros sarcomas de tecidos moles.

Outros tumores sólidos podem ser passíveis de terapia através de um método descrito aqui, incluem, mas não estão limitados a, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

Leucemias que podem ser passíveis de terapia através de um método descrito aqui incluem, mas não estão limitadas a, a) síndromes mie- loproliferativas crônicas (distúrbios neoplásicos de células tronco hematopoi- éticas multipotenciais); b) Ieucemias mielogêneas agudas (transforma neo- plásica de uma célula tronco hematopoiética multipotèncial ou uma célula hematopoiética de potencial de linhagem restrita; c) leucemias linfocíticas crônicas (CLL; proliferação clonal de linfócitos pequenos imunologicamente imaturos e funcionalmente incompetentes), incluindo CLL de células B, leu- cernia pró-linfocítica CLL de célula T e leucemia de células pilosas; e d) Ieu- cemias linfoblásticas agudas (caracterizadas pelo acúmulo de linfoblastos). Linfomas que podem ser tratados usando o método em questão incluem, mas não estão limitados a, Iinfomas de células B (por exemplo, Iinfoma de Burkitt); Iinfoma de Hodgkin; Iinfoma não-Hodgkin e similares.

Outros cânceres que podem ser passíveis de tratamento de a- cordo com os métodos descritos aqui incluem meningioma atípico (cérebro), carcinoma de células da ilhota (pâncreas), carcinoma medula (tiróide), me- senquimoma (intestino), carcinoma hepatocelular (fígado), hepatoblastoma (fígado), carcinoma de células de eliminação (rim) e neurofibroma do medi- astino.

Outros cânceres exemplificativos que podem ser passíveis de tratamento usando os métodos descritos aqui incluem, mas não estão limita- dos a, cânceres de origem neuroectodérmica e epitelial. Exemplos de cânce- res de origem neuroectodérmica incluem, mas não estão limitados a, sarco- ma de Ewings, tumores espinhais, tumores de cérebro, tumores neuroecto- dérmicos primitivos supratenbriais da infância, carcinoma tubulocístico, car- cinoma de células de fuso e tubular mucinoso, tumores renais, tumores do mediastino, neurogliomas, neuroblastomas e sarcomas em adolescentes e adultos jovens. Exemplos de origem epitelial incluem, mas não estão Iimita- 1 dos a, câncer de pulmão de célula pequena, câncer da mama, da lente ocu- lar, cólon, pâncreas, rim, fígado, ovário e epitélio brônquico. Em algumas modalidades, os métodos em questão não incluem tratamento de melanoma (isto é, o câncer é outro que não melanoma). Em outras modalidades, os métodos em questão não incluem o tratamento de Iinfoma (isto é, o câncer é outro que não linfoma).

Em determinadas modalidades, os métodos da presente inven- ção são usados para tratar células cancerígenas conhecidas por expressar gangliosídeos de de-N-acetila, incluindo melanomas e alguns linfomas. Cân- ceres que superexpressam os gangliosídeos precursores GM3 e GD3 são prováveis de também expressar a maior quantidade de gangliosídeos de de- N-acetila sobre a superfície celular. Em uma modalidade, o câncer é um que apresenta um antígeno SEAM 3-reativo. Cânceres que apresentam um antígeno SEAM 3-reativo podem ser identificados através de métodos conhecidos na técnica. Métodos exemplificativos de detecção e diagnóstico são descritos abaixo.

Onde a terapia anticâncer compreender administração de um anticorpo que tem a especificidade de ligação a antígeno do anticorpo mo- noclonal (mAb) SEAM 3 (discutido abaixo em detalhes), a terapia anticâncer pode ser particularmente dirigida a células cancerígenas em divisão (replica- ção, proliferação). Conforme mostrado nos Exemplos abaixo, o epitopo es- pecificamente ligado pelo SEAM 3 é primariamente acessível durante divisão celular. Isto é, o nível de antígeno extracelularmente acessível ligado por SEAM 3 é aumentado durante divisão celular quando comparado com célu- las em não-divisão e a ligação de SEAM 3 aciona a célula à anáfase (para pré-G0). Uma vez que a maioria dos cânceres se dividem mais rapidamente do que células normais do mesmo tipo, anticorpos que se ligam a um antí- geno SEAM 3-reativo são atraentes para anticorpo baseado em terapia de câncer.

Assim, a presente descrição proporciona, particularmente uma terapia anticâncer dirigida a células cancerígenas envolvendo administração de um anticorpo tendo a especificidade de ligação a antígeno do mAb SEAM 3. Cânceres particularmente passíveis de terapia com anticorpo usando um anticorpo tendo a especificidade de ligação a antígeno do SEAM 3 podem ser identificados examinando marcadores de proliferação celular (por exem- plo, antígeno Ki-67) e/ou examinando a acessibilidade do epitopo de deNAc SA ligado pelo SEAM 3 em células em divisão (por exemplo, conforme em um ensaio in vítro).

ANTICORPOS TENDO ESPECIFICIDADE DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO ANTICORPO MONOCLONAL SEAM 3

A descrição proporciona anticorpos monoclonais recombinantes (mAbs) e ácidos nucléicos que codificam tais anticorpos, em que os mAbs recombinantes têm a especificidade de ligação a antígeno do SEAM 3, mAb o qual se liga a gangliosídeos de-N-acetilados sobre a superfície de células cancerígenas e facilita a redução de viabilidade celular de células cancerí- genas. Anticorpos recombinantes tendo a especificidade de ligação a antí- geno do SEAM 3 incluem anticorpos tendo pelo menos uma porção de liga- ção a antígenò do SEAM 3. Tais mAbs recombinantes podem ser descritos como tendo as seguintes características gerais:

a) alta afinidade por um epitopo de deNAc SA1 particularmente um epitopo de deNAc SA sobre a superfície extracelularmente acessível de uma célula cancerígena (por exemplo, um Kd de cerca de 10'6, cerca de 10"8 ou menos);

b) diminuem a taxa de dissociação com um antígeno de deNAc SA (por exemplo, uma KdesHgado de cerca de 1x10'3 seg"1 ou menos);

c) não se liga significativamente ao ácido polissiálico que não contém resíduos de de-N-acetila;

d) atividade para facilitar a perda de aderência de células cance- rígenas tendo um epitopo de deNAc SA na superfície celular (por exemplo,

um gangliosídeo de-N-acetilado) in vitro; e

e) atividade para facilitar a redução de viabilidade de uma célula cancerígena tendo epitopo de deNAc SA na superfície celular ou, particular- mente, antígeno SEAM 3-reativo, anticorpo o qual pode romper o ciclo celu- lar e/ou ser capaz de ligação a complemento e/ou dirigir a ADCC contra a • célula cancerígena à qual ele está ligado.

Anticorpos tendo a especificidade de ligação a antígeno do SE- AM 3 podem ser produzidos através de técnicas baseadas em imunização e seleção de anticorpos que se ligam competitivamente ao antígeno SEAM 3- reativo. Tais anticorpos também podem ser gerados através de métodos re- combinantes, usando a informação fornecida pelo aminoácido e polinucleotí- deos de codificação do polipeptídeo de cadeia pesada do mAb SEAM 3 e polipeptídeo de cadeia leve descritos aqui. Por exemplo, anticorpos tendo a especificidade de ligação a antígeno do SEAM 3 podem ser gerados produ- zindo um polipeptídeo de cadeia leve recombinante compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de um polipeptídeo de cadeia leve de SE- AM 3 (resíduos de aminoácido contínuos 24 a 39, resíduos de aminoácidos contínuos 55 a 61 e resíduos de aminoácidos contínuos 94 a 100, respecti- vamente, apresentados na figura 52) e produzindo um polipeptídeo de ca- deia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável do polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 (resíduos de aminoácido contí- nuos 26 a 35, resíduos de aminoácidos contínuos 50 a 66 e resíduos de a- minoácidos contínuos 101 a 108, respectivamente, apresentados na figura 52). Essas CDRs podem ser proporcionadas em um polipeptídeo de cadeia leve e polipeptídeo de cadeia pesada, respectivamente, flanqueados por re- síduos de framework apropriados para proporcionar a formação de um sítio de ligação a antígeno tendo a especificidade de ligação a antígeno do SEAM 3. Tais anticorpos podem tomar qualquer uma de uma variedade de formas, incluindo fragmentos F(ab), anticorpos com cadeia simples, anticorpos qui- méricos, anticorpos humanizados.

Métodos para medição da afinidade de ligação, taxa off e outros cinéticas de ligação de anticorpo são bem-conhecidos na técnica e podem ser empregados para determinar se um anticorpo tem uma alta afinidade e uma taxa off lenta para um antígeno de deNAc SA. Em muitos métodos e conforme é bem-conhecido na técnica, a cinética de ligação de anticorpo pode ser medida através de métodos ELISA ou através de medição de res- sonância de plasmônio em superfície usando, por exemplo, um biossensor BIACORE® (Pharmacia/Pfizer) ou calorimetria por exploração diferencial (Bliznukov et al. 2001 Biochemistry (Mosc) 66:27-33). Métodos para medição da ligação de antígenos a anticorpos usando ressonância de plasmônio em superfície são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Methods of Dev. Biol. 2003 112: 141-51 e J. Mol. Recognit. 1999 12: 310-5) e são pron- tamente adaptados para uso aqui.

Em determinadas modalidades, um anticorpo monoclonal re- combinante tendo as características de ligação a antígeno do mAb SEAM 3 tem uma cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido que é subs- tancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% idêntica) a uma seqüência contínua do domínio variá- vel de cadeia leve de SEAM 3. Em modalidades particulares, um anticorpo recombinante tem seqüência de aminoácido de CDR ou framework que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca dè 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% idênticas) a uma seqüência de framework con- tínua ou uma seqüência de CDR contínua de qualquer uma das seqüências de cadeia pesada ou cadeia leve mostradas nas Figs. 46 e 47. Tais polipep- tídeos são úteis na construção de anticorpos quiméricos tendo especificida- de de ligação a antígeno do SEAM 3. Tais seqüências contínuas podem in- cluir as CDRs dos polipeptídeos de cadeia leve (L-CDR1, L-CDR2, L- CDR3) e/ou polipeptídeos de cadeia pesada (H-CDR1, H-CDR2, H- CDR3).

Em determinadas modalidades, anticorpos monoclonais recom- binantes contêm uma cadeia pesada ou leve que é codificada por um polinu- cleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência à um ácido nu- cléico que codifica uma cadeia leve ou pesada de SEAM 3, Condições de alta estringência incluem incubação a 50 eC ou maior em 0,1 χ SSC (solução salina a 15 mM/ citrato de sódio a 0,15 mM). Tais polinucleotídeos são úteis na detecção da produção de anticorpo SEAM 3 em uma célula, bem como na construção de anticorpos quiméricos tendo especificidade de ligação a antígeno de SEAM 3.

Em determinadas modalidades, anticorpos monoclonais recom- binantes dã invenção podem conter uma cadeia pesada ou leve que é codifi- cada por um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 80% idêntica a (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%) a uma seqüência contínua de um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada ou leve de SEAM 3. A identidade percentual é baseada na mais curta das seqüências comparadas. Progra- mas bem-conhecidos são BLASTN (2.0.8) (Altschul et al. (1997) Nucl Acids. Res. 25: 3389-3402) usando os parâmetros de default e nenhum filtro pode ser empregado para fazer uma comparação de seqüência.

O anticorpo monoclonal recombinante pode ser um anticorpo de comprimento total ou qualquer quimera do mesmo, por exemplo. Métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Morrison et al. (Science 1985 229: 1202); Oi et al. (BioTechni- ques 1986 4: 214); Gillies et al. (J. Immunol. Methods 1989 125: 191-202) e Pats. U.S. Nos. 5.807.715, 4.816.567 e 4.81.397, as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

As seqüências de aminoácido das CDRs das cadeias pesada e leve de SEAM 3 são proporcionadas na figura 52 e as regiões de framework e CDR são definidas nas figuras 53 e 54 para as cadeias pesada e leve de SEAM 3, respectivamente.

A descrição também proporciona anticorpos que são modifica- dos através de conjugação a uma porção que pode proporcionar uma carac- terística desejada, por exemplo, aumento na meia-vida no soro, atividade anticâncer etc. Tais conjugados de anticorpo são exemplificados abaixo.

Anticorpos modificados tendo especificidade de ligação a antíqeno de SEAM 3

Os anticorpos monoclonais recombinantes descritos acima ten- do uma região de ligação a antígeno de SEAM 3 podem ser modificados pa- ra proporcionar anticorpos modificados que se ligam a um epitopo de deNAc SA e têm uma atividade desejada, por exemplo, capacidade intensificada de facilitar a redução de viabilidade de célula cancerígena, meia-vida intensifi- cada no soro, imunogenicidade reduzida, e similares. Os anticorpos modifi- cados podem ser feitos através de substituição, adição ou deleção de pelo menos um aminoácido de um anticorpo monoclonal SEAM 3 descrito acima. Em uma modalidade, o anticorpo SEAM 3 é modificado para particularmente um anticorpo humanizado para uso terapêutico humano ou outro tipo de an- ticorpo modificado. Em geral, esses anticorpos modificados têm as caracte- rísticas de ligação a antígeno gerais do anticorpo SEAM 3 e contêm pelo menos as CDRs de um polipeptídeo de cadeia pesada de anticorpo SEAM 3 e um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3.

Orientação para substituições de aminoácido que podem ser feitas pode ser encontrado nas figuras em anexo 52, 53 e 54, as quais ilus- tram as seqüências e posições das CDRs nos precursores de cadeia pesada e cadeia leve e seqüências de DNA de codificação de SEAM 3. Por exem- pio, em algumas modalidades, variantes podem ser geradas fazendo altera- ções de aminoácido (por exemplo, substituições, particularmente, substitui- ções conservativas de aminoácido) nas áreas fora das CDRs assim identifi- cadas. Orientação adicional para substituições de aminoácido podem ser encontradas através de alinhamento das seqüências de aminoácido de ou- tros anticorpos antiepitopo de deNAc SA com aquelas de SEAM 3 e obser- vando regiões que são! conservadas ou variáveis e fazendo alterações nas regiões variáveis que repousam fora das CDRs.

Em modalidades particulares, esses métodos incluem fazer uma ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, uma, até duas, até três, até quatro ou até cinco ou mais, usualmente até 10 ou mais). Uma substitui- ção de aminoácido pode ser em qualquer posição e o aminoácido nessa po- sição pode ser substituído por um aminoácido de qualquer identidade. De preferência, um anticorpo modificado tem as mesmas características gerais do mAb SEAM 3. Em uma modalidade, após uma posição substituível ter sido identificada através de alinhamento das seqüências proporcionadas aqui com as seqüência de outros anticorpos, os aminoácidos nessa posição podem ser substituídos. Em modalidades particulares, uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de humanização (isto é, uma substitu- ição que torna a seqüência de aminoácido mais similar àquela de um anti- corpo humano), uma substituição dirigida (por exemplo, uma substituição que torna a seqüência de aminoácido de um anticorpo mais similar àquela e um anticorpo relacionado no mesmo grupo), uma substituição aleatória (por exemplo, uma substituição com qualquer um dos 20 aminoácidos que ocor- rem naturalmente) ou uma substituição conservativa (por exemplo, uma substituição com um aminoácido tendo propriedades bioquímicas similares àqueles em questão sendo substituídos).

Em determinadas modalidades, anticorpos modificados da in- venção podem conter uma cadeia leve ou pesada que é codificada por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência a um áci- do nucléico que codifica uma cadeia pesada ou leve de SEAM 3, particular- mente aos fragmentos que codificam a CDR1, CDR2 e CDR3 da região vari- ável de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3 (resíduos de aminoácido contínuos 24 a 39 resíduos de aminoácido contínuos 55 a 61 e resíduos de aminoácido contínuos 94 a 100, respectivamente, apresentados na figura 52) e a fragmentos que codificam CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável do polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 (resíduos de aminoácido con- tínuos 26 a 35, resíduos de aminoácido contínuos 50 a 66 e resíduos de a- minoácido contínuos 101 a 108, respectivamente, apresentado na figura 52). Condições de alta estringência incluem incubação a 50 eC ou maior em 0,1 χ SSC (solução salina a 15 mM/citrato de sódio a 0,15 mM).

Em determinadas modalidades, anticorpos modificados da in- venção podem conter uma cadeia leve ou pesada que é codificada por um polinucleotídeo que é pelo menos 80% idêntico a (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%) ao ácido nucléi- co que codifica cadeia leve ou pesada de SEAM 3 contínuo. A identidade percentual é baseada na mais curta das seqüências comparadas. Progra- mas bem-conhecidos, tal como BLASTN (2.0.8) (Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25: 3389-3402) usando os parâmetros de default e nenhum filtro podem ser empregados para fazer uma comparação de seqüência. Anticorpos humanizados

Em uma modalidade, a invenção proporciona versões humani- zadas do anticorpo monoclonal SEAM 3. Em geral, anticorpos humanizados podem ser feitos através de substituição de aminoácidos nas regiões de framework de um anticorpo não-humano precursor para produzir um anticor- po modificado que é menos imunogênico em um ser humano do que o anti- corpo não-humano precursor. Anticorpos podem ser produzidos usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo, enxertagem de CDR (EP 239,400; publicação PCT WO 91/09967; Pats. U.S. Nos. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), embutimento ou reformação de superfície (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91: 969-973 (1994)) e embaralhamento de cadeia (Pat U.S. No. 5.565.332). Em determinadas modalidades, substituições de framework são identificadas através de modelamento das interações dos resíduos de CDR e framework para identificar resíduos de framework importantes para a liga- ção a antígeno e comparação de seqüência para identificar resíduos de fra- mework incomuns em posições em particular (vide, por exemplo, Pat. U.S.

No. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)). Métodos adicio- nais para humanização de anticorpos considerados para uso na presente invenção são descritos nas Pats. U.S. Nos. 5.750.078; 5.502.167; 5.705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; e 4.816.567 e publi- cações PCT WO 98/45331 e WO 98/45332. Em modalidades particulares, o anticorpo SEAM 3 pode ser humanizado de acordo com os métodos apre- sentados nos pedidos de patente U.S. publicados nos. 20040086979 e 20050033031. Conseqüentemente, o anticorpo SEAM 3 descrito acima pode ser humanizado usando métodos que são bem-conhecidos na técnica.

Um anticorpo SEAM 3 humanizado, portanto, pode conter as CDRs inalteradas do anticorpo SEAM 3 ou, em determinadas modalidades, CDRs alteradas do anticorpo SEAM 3. Um anticorpo humanizado contendo CDRs alteradas do anticorpo SEAM 3 geralmente contém CDRs tendo 1 , até 2, até 3, até 4, até 5, até 6, até 7 e, em certos casos, até cerca de 10 substi- tuições de aminoácido, quando comparado com as CDRs do anticorpo SE- AM 3. As posições substituíveis em particular de uma CDR, bem como os aminoácidos doadores que podem ser substituídos nessas posições podem ser determinados através de alinhamento das seqüências de ácido nucléico e/ou aminoácido do SEAM 3 proporcionado aqui com aquelas de outros an- ticorpos.

Anticorpos polietileno qlicol (PEG)-modificados

Os anticorpos antiepitopo de deNAc SA considerados aqui in- cluem anticorpos antiepitopo de deNAc SA PEGuilados, com anticorpos an- tiepitopo de deNAc SA recombinantes PEGuilados tendo especificidade por antígeno de SEAM 3 sendo de interesse particular. Métodos e reagentes adequados para PEGuilação de um anticorpo são bem-conhecidos na técni- ca. Em geral, PEG adequado para conjugação a um anticorpo é geralmente solúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmula geral R(0-CH2- CH2)nO-R, onde R é hidrogênio ou um grupo protetor, tal como um grupo alquila ou alcanoíla e onde η é um número inteiro de 1 a 1000. Onde R é um grupo protetor, ele geralmente tem de 1 a 8 carbonos.

Erri muitas modalidades, PEG tem pelo menos um grupo hidroxi- la, por exemplo, um grupo hidroxila terminal, grupo hidroxila o qual é modifi- cado para gerar um grupo funcional que é reativo com um grupo amino, por exemplo, um grupo epsilon amino de um resíduo de Iisina1 um grupo amino livre no N=-término de um polipeptídeo ou qualquer outro grupo amino, tal como um grupo amino de asparagina, glutamina, arginina ou histidina.

Em outras modalidades, o PEG é derivatizado de modo que ele é reativo com grupos carboxila livres no polipeptídeo do anticorpo, por e- xemplo, o grupo carboxila livre no carbóxi término do polipeptídeo de anti- corpo. Derivados adequados de PEG que são reativos com o grupo carboxi- la livre no término de carboxila de um polipeptídeo de cadeia pesada ou ca- deia leve incluem, mas não estão limitados a, PEG-amina e derivados de hidrazina de PEG (por exemplo, PEG-NH-NH2).

Em outras modalidades, o PEG é derivatizado de modo que ele compreende um grupo ácido tiocarboxílico terminal- COSH, o qual reage seletivamente com grupos amino para gerar derivados de amida. Em virtude da natureza reativa do tio ácido, seletividade de determinados grupos amino com relação à outros é obtida. Por exemplo, -SH exibe capacidade de grupo de condução suficiente em reação com o grupo amino N-terminal em condi- ções de pH apropriadas, de modo que os grupos ε-amino nos resíduos de Iisina são protonados e permanecem não nucleofílicos. Por outro lado, rea- ções sob condições de pH adequadas podem tornar alguns dos resíduos de Iisina acessíveis para reagir com seletividade.

Em outras modalidades, o PEG compreende um éster reativo, tal como um N-hidróxi succinimidato na extremidade da cadeia de PEG. Tal molécula de PEG contendo N-hidróxi succinimidato reage com grupos amino selecionados em condições de pH particulares, tal como um pH neutro de 6,5-7,5. Por exemplo, os grupos amino N-terminais podem ser seletivamente modificados sob condições de pH neutro. Contudo, se a reatividade do rea- gente for extrema, grupos NH2 acessíveis da Iisina também podem reagir.

O PEG pode ser conjugado diretamente a um resíduo de ami- noácido do anticorpo ou através de um ligante. Em algumas modalidades, um ligante é adicionado a um polipeptídeo de anticorpo, formando um poli- peptídeo de anticorpo ligante-modificado. Tais Iigantes proporcionam várias funcionalidades, por exemplo, grupos reativos, tais como grupos sulfidrila, amino ou carboxila, para acoplar um reagente de PEG ao polipeptídeo de anticorpo ligante-modificado.

Em tais modalidades, o PEG conjugado ao polipeptídeo de anti- 10 corpo é linear. Em outras modalidades, o PEG conjugado ao polipeptídeo de anticorpo é ramificado. Derivados de PEG ramificados, tais como aqueles descritos na Pat. U.S. No. 5.643.575, "PEG em estrela" e PEGs com múlti- plos braços, tais como aqueles descritos em Sheanwater Polymers, Inc. cata- log "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998." PEGs em estrela são des- critos na técnica incluindo, por exemplo, Patente U.S. No. 6.046.305.

PEG tendo um peso molecular na faixa de cerca de 2 kDa a cer- ca de 100 kDa, é geralmente usado, onde o termo "cerca de", no contexto de PEG, indica que em preparados de polietileno glicol, algumas modalidades pesaram mais, algumas menos do que o peso molecular estabelecido. Por exemplo, PEG adequado para conjugação a um anticorpo tem um peso mo- lecular de cerca de 2 kDa a cerca de 5 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, de cerca de 10 kDa a cerca de 15 kDa, de cerca de 15 kDa a cerca de 20 kDa, de cerca de 20 kDa a cerca de 25 kDa, de cerca de 25 kDa a cerca de 30 kDa, de cerca de 30 kDa a cerca de 40 kDa, de cerca de 40 kDa a cerca de 50 kDa, de cerca de 50 kDa a cerca de 60 kDa, de cerca de 60 kDa a cerca de 70 kDa, de cerca de 70 kDa a cerca de 80 kDa, de cerca de 80 kDa a cerca de 90 kDa ou de cerca de 90 kDa a cerca de 100 kDa. Preparação de conjugados de PEG-anticorpo

Conforme discutido acima, a porção de PEG pode ser presa, diretamente ou por meio de um ligante, a um resíduo de aminoácido em ou próximo do N-término, internamento ou em ou próximo do C-término do poli- peptídeo de anticorpo. Conjugação pode ser realizada em solução ou na fase sólida.

Ligação N-terminal

Métodos para fixação de uma porção de PEG a um resíduo de aminoácido enri ou próxima do N-término de um polipeptídeo de anticorpo são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, métodos conhecidos para obtenção seletiva de um anticorpo N-terminalmente modificado quimi- camente são usados. Por exemplo, um método de modificação de proteína através de alquilação redutiva o qual explora a reatividade diferencial de di- ferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o N-término) disponí- veis para derivatização em uma proteína em particular podem ser usados. Sob as condições de reação apropriadas, derivatização substancialmente seletiva da proteína no N-término com um polímero contendo um grupo car- bonila é obtida. A reação é realizada em um pH o qual permite tomar vanta- gem das diferenças de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e aquela do grupo alfa-amino do resíduo N-terminal da proteína. Através de tal derivatização seletiva, fixação de uma porção de PEG ao anticorpo é contro- lada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-término do anticorpo e nenhuma modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina, ocorre.

Ligação C-terminal

MonoPEGuilação pode ser realizada usando um reagente de PEG que é seletivo para o C-término de polipeptídeo, o qual pode ser prepa- rado com ou sem espaçadores. Por exemplo, polietileno glicol modificado como metil-éter em uma extremidade e tendo uma função amino na outra extremidade pode ser usado como o material de iniciação.

Preparação ou obtenção de uma carbodiimida solúvel em água como o agente de condensação pode ser realizado. Acoplamento do anti- corpo com uma carbodiimida solúvel em água como o reagente de conden- sação é geralmente realizado em um meio aquoso com um sistema tampão adequado em um pH ótimo para realizar a ligação de amida. Um PEG de elevado peso molecular pode ser adicionado à proteína covalentemente para aumentar o peso molecular. Os reagentes selecionados dependerão de estudos de otimiza- ção de processo. Um exemplo não limitativo de um reagente adequado é EDC ou 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida. A solubilidade em água da EDC permite a adição direta a uma reação sem a necessidade de disso- lução prévia em um solvente orgânico.

Mesmo embora o uso de PEG amina tenha sido mencionado acima pelo nome ou estrutura, tais derivados se destinam a ser exemplifica- tivos apenas e outros grupos, tais como derivados de hidrazina, conforme em PEG-NH-NH2 os quais também condensarão com o grupo carboxila da O proteína de anticorpo, podem também ser usados. Além da fase aquosa, as reações também podem ser conduzidas sobre uma fase sólida. Polietileno glicol pode ser selecionado da lista de compostos de peso molecular osci- lando de 300-40000. A escolha dos vários polietilenos glicóis também será orientada pela eficiência de acoplamento e o desempenho biológico do deri- vado purificado in vitro e in vivo, isto é, tempos de circulação, atividades an- tivirais etc.

Adicionalmente, espaçadores adequados podem ser adiciona- dos à extremidade C-terminal da proteína de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do anticorpo. Os espaçadores podem ter grupos reativos, tais como SH, NH2 ou COOH, para acoplar com o reagente de PEG apropriado a fim de proporcionar os derivados de anticorpo de elevado peso molecular. Uma metodologia de fase em solução/sólida combinada pode ser aconselhada para o preparação de polipeptídeos de anticorpo PEGuiIado C-terminaL

Se desejado, um anticorpo PEGuiIado é separado do anticorpo não PEGuiIado usando qualquer método conhecido incluindo, mas não limi- tado a, cromatografia de troca de íons, cromatografia por exclusão de tama- nho e combinações das mesmas.

Proteínas de fusão-anticorpo

A invenção também considera anticorpos recombinantes tendo a especificidade de ligação a antígeno de um mAb SEAM 3, onde o anticorpo é modificado para incluir uma proteína heteróloga. Por exemplo, um polipep- tídeo de cadeia pesada de SEAM 3 ou polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3 pode ser unido a uma proteína repórter ou a uma proteína tendo um efeito anticâncer desejado. Por exemplo, SEAM 3 pode ser conjugado a um se- gundo anticorpo (ou pelo menos uma porção de ligação a antígeno do mes- mo), por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um fator angi- ogênico ou proliferativo, de modo que o anticorpo é dirigido contra o fato de crescimento endotelial vascular (VEGF), o qual é um mediador chave de an- giogênese, onde o SEAM 3 objetiva o conjugado a células cancerígenas es- pecíficas e o anticorpo anti-VEGF inativa o VEGF, assim, inibindo a angio- gênese.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma CDR de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3 ou uma CDR de um polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 a qual é ligada a um polipeptídeo heterólogo, isto é, é ligada a um polipeptídeo ao qual ela normalmente não está associada no anticorpo SEAM 3 nativo. Métodos para produção de uma proteína de fusão de interesse quando proporcionada com um seqüência de ácido nu- cléico são bem-conhecidos na técnica.

Métodos para produção de anticorpos recombinantes

Em muitas modalidades, os ácidos nucléicos que codificam um anticorpo monoclonal SEAM 3 ou pelo menos uma CDR de um polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 ou pelo menos uma CDR de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3 são introduzidos diretamente em uma célula hos- pedeira e ã célula é incubada sob condições suficientes para induzir à ex- pressão do anticorpo, codificado. Conseqüentemente, a invenção também considera células hospedeiras recombinantes contendo um polinucleotídeo exógeno que codifica pelo menos uma CDR de um polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 ou pelo menos uma CDR de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3.

Qualquer célula hospedeira adequada, vetor e promotor podem ser usados com relação aos ácidos nucléicos que codificam SEAM 3 da in- venção. De interesse particular são vetores tendo um inserto que codifica pelo menos uma CDR de um polipeptídeo de cadeia pesada de SEAM 3 e/ou pelo menos uma CDR de um polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3. Também de interesse são polinucleotídeos que são compostos de uma se- qüência de ácido nucléico que codifica pelo menos uma CDR de um polipep- tídeo de cadeia pesada de SEAM 3 ou pelo menos uma CDR de um polipep- tídeo de cadeia leve de SEAM 3, onde a seqüência que codifica o SEAM 3 é operavelmente ligada a um promotor heterólogo. Células hospedeiras, veto- res e promotores exemplificativos serão agora descritos em maiores deta- lhes.

Qualquer célula adequada para expressão de cassetes de ex- pressão pode ser usada como uma célula hospedeira. Por exemplo, células de levedo, inseto, planta etc. Em muitas modalidades, uma linhagem de cé- lula hospedeira de mamífero que não produz naturalmente anticorpos, por exemplo, células de mamífero que não são células de hibridoma, células B ou células de baço. Também pode ser de interesse usar células que propor- cionam glicosilação alterada do anticorpo recombinante ou as quais carecem de glicosilação. Células exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a: células de rim de macaco (células COS), células CVI de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células de rim embriô- nico humano (HEK-293, Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hâmster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hâmster chinês (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77: 4216, (1980); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco African Green (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de car- cinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals Ν. Y. Acad. Sci 383: 44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); e células L de camundongo (ATCC CCL-1). Linhagens de células adicionais se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica. Uma variedade de linhagens de célula estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boule- vard, Manassas, Va. 20110-2209.

Em células hospedeiras de mamífero, uma série de sistemas de expressão baseados em vírus podem ser utilizados para expressar um anti- corpo em questão. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a seqüência que codifica o anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/ tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a seqüência líder tripartida. Esse gene quimérico pode, então, ser inserido no genoma do adenovírus através de recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, a região E1 ou E3) resultará em um vírus re- combinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (vide, por exemplo, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 355-359 (1984)). A eficiência de expressão pode ser intensifi- cada através da inclusão de elementos intensificadores de transcrição apro- priados, terminadores de transcrição etc. (vide, por exemplo, Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1987)).

Para produção a longo prazo em alto rendimento de anticorpos recombinantes, expressão estável pode ser usada. Por exemplo, linhagens de célula as quais expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Ao invés de usar vetores de expressão os quais contêm origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com cassetes de expressão de imunoglobulina e um marcador selecionável. Após a introdução do ONA estranho, as células manipuladas podem ser dei- xadas crescer durante 1-2 dias em um meio enriquecido e, então, são troca- das para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombi- nante confere resistência à seleção e permite que as células se integrem estavelmente em um cromossoma e cresçam para formar focos os quais, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens de célula. Tais linhagens de célula manipuladas podem ser particularmente úteis na seleção e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a mo- lécula de anticorpo.

Métodos de introdução de ácidos nucléicos em células são bem- conhecidos na técnica. Métodos adequados incluem eletroporação, a tecno- logia de pistola de partícula, precipitação com fosfato de cálcio, micro injeção direta e similares. A escolha do método é geralmente dependente do tipo de célula que está sendo transformada e das circunstâncias sob as quais a transformação ocorre (isto é, in vitro, ex vivo ou in vivo) uma discussão geral desses métodos pode ser encontrada em Ausubel et al. al, Short Protocols in Molecular Biology, 3ã edição, Wiley & Sons, 1995. Em algumas modalidades, lipofectamina e tecnologias de transferência de gene cálcio-mediadas são usadas.

Após os ácidos nucléicos em questão terem sido introduzidos em uma célula, a célula é, tipicamente, incubada, normalmente a 37°C, al- gumas vezes sob seleção, durante um período de cerca de 1-24 horas de forma a permitir a expressão do anticorpo. Em modalidades de interesse particular, o anticorpo é, tipicamente, secretado no sobrenadante do meio no qual a célula é cultivada.

Uma vez que uma molécula de anticorpo recombinante da in- venção tenha sido produzida, ela pode ser purificada através de qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imuno- globulina, por exemplo, através de cromatografia (por exemplo, troca de í- ons, afinidade, particularmente através de afinidade por um antígeno especí- fico após cromatografia de proteína A e coluna de dimensionamento), centri- fugação, solubilidade diferencial ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Em muitas modalidades, anticorpos são se- cretados da célula no meio de cultura e coletados do meio de cultura.

KITS

Também proporcionados pela invenção são kits para a prática dos métodos descritos aqui, conforme descrito acima. Os kits podem incluir um ou mais, dependendo do uso pretendido do kit, das composições descri- tas aqui, tais como: um antígeno de deNAc SA, células adequadas para uso nos métodos biossintéticos de produção de PS de-N-acetilado (opcionalmen- te com os reagentes de acil manosamina e trihaloacil manosamina descritos nos métodos acima), um anticorpo antiepitopo de deNAc SA, um ácido nu- cléico que codifica o mesmo (especialmente um ácido nucléico que codifica uma CDR de uma cadeia pesada e/ou leve do mAb SÊÀM 3) ou uma célula recombinante contendo a mesma. Outros componentes opcionais do kit in- cluem: tampões etc., para administração do anticorpo antiepitopo de deNAc SA ou antígeno de deNAc SA e/ou para a realização de um ensaio diagnós- tico. Os ácidos nucléicos recombinantes do kit também podem ter sítios de restrição, sítios de clonagem múltipla, sítios de primer, etc. para facilitar sua ligação à regiões constantes de ácidos nucléicos que codificam não-SEAM 3. Os vários componentes do kit podem estar presentes em recipientes se- parados ou determinados compatíveis podem ser pré-combinados em um único recipiente, conforme desejado.

Além dos componentes mencionados acima, os kits em questão ainda incluem, tipicamente, instruções para uso dos componentes do kit para praticar os métodos descritos. As instruções para praticar os métodos em questão são geralmente registradas sobre um meio de registro adequado. Por exemplo, as instruções podem ser impressas sobre um substrato, tal como papel ou plástico etc. Como tal, as instruções podem estar presentes nos kits como uma bula, na etiqueta do recipiente do kit ou componentes do mesmo (isto é, associadas com a embalagem ou subembalagem) etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de ar- mazenamento de dados eletrônico presentes sobre um meio de armazena- mento legível em computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete etc. Em ainda outras modalidades, as instruções reais não estão presentes no kit, mas meios para obtenção das instruções de uma fonte remota, por exemplo, via internet são proporcionados. Um exemplo dessa modalidade é um kit que inclui um endereço na web onde as instruções podem ser visuali- zadas e/ou do qual o download das instruções pode ser realizado. Conforme com as instruções, esse meio para obtenção das instruções é registrado so- bre um substrato adequado.

Também proporcionados pela presente invenção são kits inclu- indo pelo menos um meio legível em computador, incluindo programação conforme discutido acima e instruções. As instruções podem incluir orienta- ções para instalação ou setup. As instruções pode incluir orientações quanto ao uso da invenção com opções ou combinações de opções, conforme des- crito acima. Em determinadas modalidades, as instruções incluem ambos os tipos de informação.

As instruções são geralmente registradas sobre um mejo de re- gistro adequado. Por exemplo, as instruções podem ser impressas sobre um substrato, tal como papel ou plástico etc. Como tal, as instruções podem es- tar presentes nos kits como uma bula, na etiqueta do recipiente do kit ou componentes do mesmo (isto é, associadas com a embalagem ou subemba- lagem) etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de armazenamento de dados eletrônico presentes sobre um meio de armazenamento legível em computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete etc, incluindo o mesmo meio sobre o qual o programa é apresentado.

EXEMPLOS

Deve ser compreendido que os exemplos e modalidades descri- tos aqui são para fins ilustrativos apenas que várias modificações ou altera- ções à luz das mesmas serão sugeridos por aqueles versados na técnica e têm de ser incluídas dentro do espírito e visado do presente pedido e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui são aqui incorporados por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE PS DE N-ACILA DE NMB E DERIVADOS TENDO EPITOPO DE deNAc SA

Polissacarídeo de N-acila (PS) do Grupo B de Neisseria menin- gitidis (NmB) (acila = acetila [Ac] ou propionila [Pr]) foi preparado através do método de Guo e Jennings, com diferenças conforme mencionado abaixo (Guo, Z. e Jennings, H. em 2001. N-Propionylation. Em Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols. A. J. Pollard e C. J. M. Maiden, eds.Humana Press Inc., Totowa1 N.J., página 55) como segue para produzir derivados de PS tendo um epitopo de deNAc SA. Ácido colomínico ou PS de NmB (100 mg; EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA) e 10 mg de borohidreto de sódio (Sigma-Aldrich) foram dissolvidos em 10 ml de NaOH a 2M e aquecidos para 90 °C em um tubo vedado (Pierce Chemical Co., Rock- ford, IL) durante 2 h.

As condições da reação de de-N-acetilação diferem daquelas descritas por Guo e Jennings. Ao invés de produzir um derivado de PS com- pletamente de-N-acetilado, conforme descrito por Guo e Jennings, o produto continha, tipicamente, 20% de resíduo de N-acetila conforme determinado através de um ensaio com resorcinol, descrito abaixo. Também, aquecimen- to da solução para 100 9C e acima e tempos hidrólise mais longos do que 2 horas resultam em degradação do polissacarídeo e produção dè subprodu- tos colaterais indesejáveis. A figura 1 proporciona a estrutura 1 de um PS de-N-acetilado exemplificativo.

A abordagem descrita aqui tem vantagens para o preparação de derivados de PS contendo uma mistura de resíduos de N-acetila e N-acila (por exemplo, N-propionila, N-butanoíla etc.), bem como para o preparação de derivados de PS contendo uma mistura de resíduos N-acetilados e de-N- acetilados, uma vez que ela proporciona um mínimo de cerca de 20% dos resíduos que foram de-N-acetilados. Também, a adição de borohidreto de sódio reduz acetona na extremidade de redução do polissacarídeo para um álcool e também uma imina que poderia ser formada entre o grupo amino de-N-acetilado e a C2 cetona da extremidade de redução do resíduo a uma amina secundária. Derivados de PS de NmB contendo resíduos com grupos N-acetila, sítios de de-N-acetila e uma amina secundária cíclica na extremi- dade de redução do resíduo foram ligados através do mAb anti-PS N-Pr de NmB não auto-reativo SEAM 3 (vide Exemplo 3 abaixo) e, portanto, são an- tígenos importantes para estimular anticorpos que são reativos com os antí- genos de ácido de-N-acetil siálico (em particular, em polímeros de ácido alfa (2→8) de-N-acetil neuramínico) que são expressos em células canceríge- nas.

Após esfriar a solução para a temperatura ambiente, a solução foi ajustada para um pH de 8,0 com HCl a 2 M ou ácido acético glacial, sub- metida à diálise contra água e liofilizada. Ela foi reacilada conforme descrito abaixo sem outra purificação.

Grupos amino livres foram adiados através de ressuspensão do PS 100 mg) em 3-5 ml de água e ajustando pH para 8-9 através da adi- ção de NaOH a 0,1 Me adição de 0,5 ml de anidrido de acila (por exemplo, anidrido de ácido acético ou anidrido de ácido propiônico) em 5 alíquotas com agitação durante várias horas. (Anidrido acético não foi incluído nos derivados previamente preparados por Guo e Jennings). Alternativamente, o ácido carboxílico foi ativado combinando 0,5 ml do ácido com 1 equivalente de hidrocloreto de l-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, Pierce Chemical Compàny, Rockford, IL). Uma pequena quantidade de água (apro- ximadamente 1 ml) foi adicionada para dissolver completamente a EDC. Conforme com os anidridos, o ácido carboxílico carbodiimida-ativado foi adi- cionado em 5 alíquotas iguais durante várias horas com agitação. Em algu- mas aplicações, tal como no preparação de derivados para uso na conjuga- ção a uma proteína-veículo, por exemplo, N-acril, -metacril, -bromoacetil (BrAc) ou -cloroacetil (CIAc), conforme descrito abaixo, a quantidade de áci- do carboxílico foi reduzida para uma fração da quantidade da amina livre no polissacarídeo (por exemplo, 10% a 90%), conforme determinado através do ensaio com resorcinol (conforme descrito abaixo). A vantagem de usar os reãgentes de acilação EDC-ativados é que eles não hidrolisam tão rapida- mente em água quanto os anidridos ou cloretos de acila e reagem mais sele- tivamente com aminas. Isso permite um melhor controle sobre a fração de grupos amino acilados. Uma vez que a hidrólise é mais lenta, grandes flutu- ações no pH, as quais podem resultar em hidrólise extensiva de grupos N- acrila, BrAc, e CIAc, são evitadas. O pH da solução foi mantido em -8-9 a- través de adição de NaOH a 2 M conforme requerido. A solução foi submeti- da à diálise e liofilizada.

Embora a maioria dos grupos amino tenham sido acilados nesse procedimento (80% - 90%), alguns grupos amino não foram derivatizados e permanecem grupos amino livres. PS contendo resíduos com os sítios de de-N-acetila, incluindo na extremidade de não redução do polímero foi ligado pelo SEAM 3 (vide exemplo 3 abaixo) e, portanto, é um determinante impor- tante para estimulação de anticorpos anticapsular de NmB protetores não auto-reativos.

Fragmentos menores do PS (grau médio de polimerização [Dp] < 20) foram produzidos através de hidrólise em água em um pH ácido. Uma porção do N-acil PS de NmB (20 mg) foi dissolvida em 5 ml de NaOAc a 20 mM, pH de 5,5 e aquecido para 50°C em um tubo vedado durante 1-24 h, tipicamente 5 h, dependendo do tamanho dos fragmentos desejados. A so- lução foi submetida à diálise e liofilizada.

Além de produção do PS tendo um Dp que é, em média, menor do que aquele do PS de iniciação, tratamento com ácido resulta na formação de Iactonas entre o grupo C1 carboxila e o grupo C9 OH do resíduo prece- dente (figura 2). PS contendo pequenas quantidades de Iactona podem ocor- rer em antígenos de ácido siálico expressos em células cancerígenas. A pre- sença de pequenas quantidades de Iactona em preparados de derivados de PS de NmB pode facilitar a estimulação de anticorpos que são reativos com os antígenos de deNAc SA expressos sobre a superfície de células cancerí- genas.

Grupos aldeído foram introduzidos nas extremidades de não redução e redução do PS para uso na fixação covalente a uma proteína- veículo. O PS (20 mg) foi dissolvido em 1 ml de tampão de NaOAc a 0,1 M, pH de 6,5. Meta periodato de sódio (5 mg, Sigma-AIdrich) foi adicionado e a solução foi mantida no escuro durante 30 min. O Nal04 restante foi degra- dado através da adição de 0,1 ml de etileno glicol a 10% (peso/vol) em água e deixado durante 30 min. Esse procedimento produz grupos aldeído em C8 e/ou C7 do resíduo terminal com extremidade de não redução e, para o PS que contém um resíduo terminal com extremidade de redução na qual a C2 cetona foi reduzida a um álcool durante de-N-acetilação (vide acima), um grupo aldeído sobre C7 (figura 3).

Alguma fração de resíduos de de-N-acetila foi também oxidada em aldeídos usando periodato, uma vez que o grupo C5 amino é proximal ao grupo C4 hidroxila. Para minimizar destruição de resíduos de SA de-N- acetila, os quais são epitopos reconhecidos por SEAM 3, através do perioda- to, grupos N-acrila, -BrAc ou -CIAc foram alternativamente introduzidos em PS N-Pr e N-Ac de NmB que continham resíduos de de-N-acetila como o resultado de de-N-acetilação e reacilação incompleta. Os grupos ácido car- boxílico foram ativados com EDC como descrito acima. Somente a fração das aminas livres presentes no PS foram aciladas (10% - 90%) por limitar a quantidade do ácido carboxílico ativado, adicionado à reação. Os grupos acrila, BrAc e CIAc são reativos com grupos tióis e amino presentes em pro- teínas-veículo sob condições suaves e, assim, os derivados de PS podem ser conjugados a uma proteína-veículo sem o dano oxidativo causado pelo tratamento do PS com periodato.

Preparação de conjugados de derivado de PS-proteína e dodecilamina

Derivados de dodecilamina foram preparados combinando 20 miligramas de derivado de PS de NmB contendo aldeídos ou cetonas na extremidade de não redução ou redução com 10 miligramas de dodecilamina em 5 mililitros de água. Após aquecimento da mistura a cerca de 50 graus C durante 30 minutos com agitação, 5 mg de cianoborohidreto de sódio foram adicionados. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 24 ho- ras, então, submetida à diálise em água durante 3 a 5 dias para remover a dodecilamina em excesso.

A reatividade dos derivados de dodecilamina com mAbs SEAM 3 foi determinada através de um ELISA de ligação direta no qual o antígeno (isto é, o derivado de PS dodecilamina) foi absorvido sobre a superfície de uma placa de microtitulação através de incubação de uma solução do antí- geno em tampão de PBS na cavidade de uma placa de microtitulação duran- te a noite a 4 graus C. As lâminas foram lavadas com tampão de PBS (5x) e bloqueadas com tampão de PBS contendo 1% (peso/peso) de albumina de soro bovino (Sigma; tampão de bloqueio) durante 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram diluídos em tampão de bloqueio e adiciona- dos à lâmina (100 microlitros por cavidade). Após incubação da lâmina du- rante 4 horas em temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas com tam- pão de PBS (5x) e anticorpo anticonjugado de fosfatase alcalina de coelho (Zymed) diluído em tampão de bloqueio foi adicionado. Após incubação du- rante mais uma hora, as lâminas foram lavadas (5x) com tampão de PBS e o anticorpo ligado foi detectado através da adição de substrato fosfato de p- nitrofenila em tampão de carbonato de sódio a 50 mM, pH de 9, contendo MgCI2 a 1 mM.' A absorbância a 405 nm após incubação de 30 minutos em temperatura ambiente foi medida usando um leitor para placa de microtitula- ção BioRad Modelo 550. Os resultados de experimentos de ligação são mostrados na figura 34..

Derivados de PS conjugados a uma proteína-veículo foram pre- parados através de combinação de 5 miligramas de toxóide do tétano de albumina de soro bovino (BSA, Pierce Chemical Co.) com 10 mg de derivado de PS ou derivado de PS contendo grupos aldêído na extremidade terminal ou grupos N-acrila, BrAc ou CIAc em tampão de PBS. 5 miligramas de cia- noborohidreto de sódio (PS contendo aldeídos) ou nada (N-acrila, -BrAc, - CIAc) foram adicionados e a mistura foi agitada no escuro durante 5 dias em temperatura ambiente. A solução foi submetida à diálise (membrana com corte de 10-14 kDa) em tampão de PBS. A reatividade dos conjugados de derivado de PS-BSA com mAbs foi determinada através de um ELISA de ligação direto, conforme descrito no parágrafo anterior. Os resultados de ex- perimentos de ligação são mostrados na figura 35.

A concentração de ácido siálico e ácido de-N-acetil siálico em soluções de estoque de derivado de PS de NmB foi determinada através de reação de Svennerholm com resorcinol (Svennerholm, L. (1957) Biochim. Biophys. Acta 24: 604) modificada conforme segue. Reagente de trabalho resorcinol foi preparado através de combinação de 9,75 mililitros de água, 0,25 mililitros de CuS04.5H20 a 0,1 M, 10 mililitros de solução a 20 miligra- ma por mililitro de resorcinol em água e 80 mililitros de HCI concentrado. O reagente de trabalho de resorcinol (300 microlitros) foi combinado com a so- lução de amostra de ácido siálico ou ácido de-N-acetil siálico (até 50 micro- gramas de ácido siálico) ou solução de estoque padrão em água (300 micro- litros) em uma placa de microtitulação com cavidade profunda de polipropi- leno (2 mililitros). A lâmina foi vedada com uma cobertura para lâmina e a- quecida em um banho de água em ebulição durante 30 minutos. Após esfriar para a temperatura ambiente, álcool isoamílico (600 microlitros) foi adiciona- do e misturado usando uma pipeta. As fases foram deixadas separar e a camada superior de álcool isoamílico foi removida para uma placa de micro- titulação limpa. 250 microlitros do extrato de álcool isoamílico e a solução aquosa inferior foram transferidas separadamente para uma placa de micro- titulação de poliestireno e a absorbância a 495 nm e 580 nm foi medida.

A quantidade de ácido de-N-acetil siálico foi determinada a partir da absorbância da fração de álcool isoamílico a 580 nm e a quantidade de ácido de-N-acetil siálico foi determinada a partir da absorbância da fração aquosa a 495 rim em comparação com uma curva padrão para cada. A quantidade de ácido de-N-acetil siálico foi corrigida para a quantidade de de- N-acetilação que ocorre durante a etapa de hidrolise ácida do ensaio através de medição da quantidade de de-N-acetilação que ocorre no padrão de áci- do siálico.

Purificação através de HPLC de fase reversa de derivados de PS de NmB contendo grupos alauila de cadeia longa

Derivados de PS de NmB contendo grupos alquila de cadeia longa (isto é, > C8) (por exemplo, derivados de dodecilamina) foram separa- dos através de HPLC de fase reversa usando uma coluna Poros R1/H e Bi- oCAD Perfusion Chromatography Workstation. Derivados foram eluídos com um gradiente de 0% a 80% de acetonitrilo em tampão de acetato de amônio a 20 mM, pH de 6,5 durante 30 minutos em uma taxa de fluxo de 5 mililitros por minuto. Frações (1 mililitro cada) foram coletadas.

Frações contendo derivados que eram reativos com mAbs (por exemplo, SEAM 3, SEAM 12 Granoff etaL 1998, supra) foram determinados através da adição de 100 microlitros de cada fração a uma cavidade de uma placa de microtitulação com 96 cavidades (Immulon II, Dynatech) e incuba- ção da lâmina a 4 graus C durante a noite. As lâminas foram lavadas com tampão de PBS (5x) e bloqueadas com tampão de PBS contendo 1% (pe- so/peso) de albumina de soro bovino (Sigma; tampão de bloqueio) durante 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram diluídos em tampão de bloqueio e adicionados à lâmina (100 microlitros por cavidade). Após incu- bação da lâmina durante 4 horas em temperatura ambiente, as lâminas fo- ram lavadas com tampão de PBS (5x) e anticorpo anti-conjugado de fosfata- se alcalina de camundongo de coelho (Zymed) diluído em tampão de blo- queio foi adicionado. Após incubação durante mais uma hora, as lâminas foram lavadas (5x) com tampão de PBS e o anticorpo ligado foi detectado através da adição de substrato fosfato de p-nitrofenila em tampão de carbo- nato de sódio a 50 mM, pH de 9, contendo MgCI2 a 1 mM. A absorbância a 405 nm após 30 minutos de incubação em temperatura ambiente foi medida usando um leitor para placa de microtitulação BioRad Modelo 550.

MALDI-TOF - espectrometria de massa de derivados de dodeci- lamina com extremidade de não redução de PS de NmB

O solvente em frações obtidas da HPLC de fase reversa foi eva- porado usando um SpinVac (ThermoSavant). O resíduo foi dissolvido em acetonitrilo/água (1:1). Uma matriz de trihidróxi acetofenona (THAP) em uma concentração de 3 miligramas por mililitro em acetonitrilo/água foi colocada sobre o alvo (0,5 microlitro por colocação). Após secagem dos pontos de matriz sob vácuo, a amostra foi colocada por cima do ponto de matriz (0,5 microlitro). MALDI-TOF (Autoflex, Bruker Daltonics) foi realizado nos modos lineares positivo e negativo (30 disparos, laser de N2, energia de laser de 50%) e nos modos negativo e positivo do refletor (30 disparos, laser de N2, energia de laser de 50%). Os espectros de massa foram calibrados usando padrões de peptídeo externo (Bruker Daltonics) e ácido siálico (EY Laborato- ries). O erro das massas observadas foi estimado como sendo ≤ 0,1%. As figuras 16-18 mostram estruturas identificadas através de MALDI-TOF de um preparado de PS de NmB que era reativo com o mAb anticápsula de NmB não auto-reativo protetor SEAM 3 e purificado através de HPLC de fase re- versa, conforme descrito acima. Os derivados contendo uma mistura de re- síduos de de-N-acetila, N-acetila e N-propionila com pelo menos um resíduo de de-N-acetila.

EXEMPLO 2: DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA DE DERIVADOS DE PS DE NmB RECONHECIDOS POR SEAM 3 ATRAVÉS DE ESPECTROME- TRIA DE MASSA POR MALDI-TOF SEAM 3 foi ligado a glóbulos magnéticos como segue. Glóbulos anti-lgG de camundongo de cabra MagnaBind® (200 μΙ; Pierce) foram com- binados com 5 ug de SEAM 3 em tampão de PBS. A mistura foi incubada em temperatura ambiente sobre uma roda giratória durante 1 h. Os glóbulos foram lavados 3 vezes com tampão de lavagem. O anticorpo ligado foi ligado cruzadamente aos glóbulos através da adição de BS3® (Pierce) a uma con- centração de 2 mM em tampão de PBS e misturados através de turbilhona- mento durante 30 min em temperatura ambiente. BS3® não reagido foi de- gradado através da adição de Tris a 0,1 M, pH de 8,0 durante 10 min. Os glóbulos foram lavados 3 vezes com tampão de PBS. PS N-Pr de NmB (240 microgramas) preparado no Exemplo 1 foi adicionado aos glóbulos lavados em tampão de PBS. Após incubação da mistura sobre uma roda giratória durante 1 h em temperatura ambiente, o material não ligado foi removido e os glóbulos lavados 2 vezes com tampão de lavagem e uma vez com tam- pão de PBS, então, ressuspenso em 200 μΙ de tampão de PBS. Neuramini- dase (0,00175 U, EC3.2.1.18; Sigma) foi adicionada a cada tubo e a mistura incubada durante a noite a 37 graus C sobre uma roda giratória. O PS ligado é heterogêneo com relação ao Dp, portanto, o complexo de glóbulo- anticorpo-PS foi tratado com neuraminidase, a qual remove seqüencialmente resíduos da extremidade de não redução do polímero, para reduzir o tama- nho do polímero para o comprimento que pode ser protegido de digestão adicional pelo anticorpo. Após o tratamento com neuraminidase, os glóbulos foram lavados 3 vezes com tampão de carbonato de amônio a 50 mM, pH de 8,5 e o PS ligado foi finalmente eluído com trietilamina a 0,1 M em água.

Para análise através de espectroscopia de massa por ionização por desabsorção a laser matriz-assistida tempo de vôo (MALDI-TOF), a so- lução de PS eluída e trietilamina/água foi removida através de evaporação em um Spin-Vac (Savant). A amostra seca foi ressuspensa em 4 μΙ de ace- tonitrilo a 50%/água (vol/vol). A matriz, uma solução saturada de 2,)4,,6'- trihidroxiacetofenona (THAP, Fluka Chemical) em acetonitrilo a 50%/água (0,5 ml), foi colocada sobre uma lâmina alvo de aço inoxidável. Amostra de PS (2 vezes, 0,5 μΙ) foi colocada por cima do ponto de THAP seco. As amos- tras foram analisadas usando um espectrômetro de massa Bruker Autoflex MALDI-TOF operando no modo de íons negativos de refletor.

A figura 4 mostra um espectro de massa representativo de deri- vados de PS ligados por SEAM 3 após tratamento com neuraminidase. A Figure 5 mostra as massas observadas para cada amostra e as massas teó- ricas de íons correspondentes que são consistentes com as massas obser- vadas. As estruturas de derivados de PS são mostradas nas figuras 6 a 15. Todas as massas correspondem a um dissacarídeo contendo um ou mais resíduos nos quais o grupo N-acetila sobre o grupo C-5 amino foram remo- vidos.

EXEMPLOS 3: ANÁLISE DE DERIVADOS DE PS N-Pr DE NmB CONTEN- DO EPITOPO DE deNAc SA QUE SE LIGAM A UM SEAM 3 ATRAVÉS DE DIGESTÃO COM SIALIDASE E CROMATOGRAFIA DE TROCA DE Â- NIONS DE ELEVADO DESEMPENHO COM DETECÇÃO AMPÈROMÉTRI- CA PULSADA (HPAC-PAD)

A exo sialidase de Arthrobacter ureafaciens (SIALIDASE A®, Prozyme1 Hayward, CA) não pode degradar ácido polissiálico (derivados de N-Ac ou N-Pr) que terminam sobre a extremidade de não redução com um resíduo de ácido de-N-Ac siálico. Portanto, digestão exaustiva de um prepa- rado de PS de NmB ou PS N-Pr de NmB que contém resíduos de de-N- acetila aleatoriamente localizados por todo o polímero com sialidase A resul- tou na conversão do ácido polissiálico em um ácido 5-N-acil neuramínico quando a sialidase encontra um resíduo de de-N-acetila. Nesse ponto, ne- nhuma outra degradação do polímero ocorrerá. Também, as moléculas de ácido siálico que não são degradadas têm um resíduo de ácido de-N-acetil siálico na extremidade de não redução. Para confirmar os resultados apre- sentados no Exemplo 2 de que o SEAM 3 se liga a uma mistura de resíduos de de-N-acetila e N-acila, preparados de ácido colomínico (EY Laboratories) e PS N-Pr de NmB (10 mg cada) foram suspensos em tampão de NaOAc a 50 mM, pH de 6,5: SIALIDASE A® (0,1 U, Prozyme) foi adicionada e as solu- ções foram incubadas a 37°C durante 3 dias.

A fração de oligossacarídeo (OS) e polissacarídeo (PS) de N-Ac NraB e OS e PS N-Pr de NmB restante após tratamento com sialidase e o grau de polimerização foram quantificados através de HP AC-PAD. A amos- tra foi injetada em um cromatógrafo de líquido Dionex (Sunnyvale, CA) adap- tado com uma GP40 Gradient Pump, coluna PA200 equilibrada com NaOH a 0,1 M (93%) e NaOH a 0,1 M contendo NaOAc a 1M (7%) e um ED40 Elec- trochemical Detector. Sacarídeos foram eluídos com um gradiente linear começando a partir das condições iniciais a 100% de NaOH a 0,1 M/NaOAc a 1M. Sacarídeos que eluíram da coluna foram detectados através de detec- ção amperométrica pulsada usando o ED40 Electrochemical Detector.

O cromatograma resultante mostrou que de cerca de 81 % a 88% de ambos os PSs tinham sido degradados em ácido N-Ac ou N-Pr neu- ramínico, respectivamente, com os cerca de 12-19% restantes compostos principalmente de oligossacarídeo tendo um Dp de cerca de 2 a cerca de 18 (figura 36) e quantidades muito pequenas de polímeros de elevado peso mo- lecular. A análise por HP AC-PAD mostra que os preparados de ácido colo- mínico e PS N-Pr de NmB contêm resíduos de de-N-acetila, mesmo embora o preparado de ácido colomínico não tenha sido submetido a procedimentos de de-N-acetilação/reacilação.

A capacidade do ácido colomínico e PS N-Pr de NmB de inibir a ligação de SEAM 3 em um ELISA foi comparada com ácido colomínico tra- tado com sialidase A e PS N-Pr de NmB preparado conforme descrito acima. As cavidades de lâminas de microtitulação (Immulon 2; Dynatech Laborato- ries, Inc.) foram revestidas com PS-dodecilamina N-Pr de NmB (preparado conforme descrito no Exemplo 1) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH de 7,4). As lâminas foram incubadas durante a noite a 4°C. Após lavagem três vezes com PBS, as cavidades foram enchidas com 200 μΙ de tampão de bloqueio (PBS contendo 1% de albumina de soro bovino [BSA, Sigma] e azida de sódio a 0,1%; [pH de 7,4]) e, então, incubadas durante 30- 60 min em temperatura ambiente para bloquear sítios de ligação não especí- fica. As lâminas foram lavadas três vezes com tampão de PBS. Inibidores foram serialmente diluídos em tampão de bloqueio sobre a lâmina em um volume final de 50 ul. SEAM 3 diluído em tampão de bloqueio para uma con- centração que produziu uma OD405 nm de 0,5 quando desenvolvido com substrato foi adicionado às cavidades em um volume de 50 ul. As lâminas foram cobertas e incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as cavi- dades foram lavadas quatro vezes com tampão de PBS e foram incubadas durante 2 h em temperatura ambiente com 100 μΙ/cavidade de anticorpo po- Iiclonal anti-camundongo conjugado à fosfatase alcalina (IgA + IgG + IgM; Zymed) diluído a 1:3000 em tampão de bloqueio. As lâminas foram, então, lavadas com tampão de PBS e 100 μΙ de substrato recentemente preparado (fosfato de p-Nitrofenila; Sigma) diluído para 1 mg/ml em tampão de substra- to to em tampão de carbonato de sódio a 50 mM, pH de 9, contendo MgCb a 1 mM. A absorbância a 405 nm após 30 minutos de incubação em temperatura ambiente foi medida usando um leitor para placa de microtitulação BioRad Modelo 550. A atividade relativa de cada amostra foi comparada através de determinação da diluição requerida para diminuir a absorbância a 405 nm em 50% da absorbância observada em cavidades contendo SEAM 3, mas nenhum inibidor.

Quando medido através de ELISA de inibição, o preparado de ácido colomínico tinha aproximadamente 200 vezes menos atividade com relação à ligação ao SEAM 3 do que o PS N-Pr de NmB. Contudo, não hou- ve atividade significativa na atividade do ácido colomínico tratado com exo- sialidase ou PS N-Pr de NmB comparado com os preparados não tratados, menos embora mais de 80% do PS tivessem sido convertidos em ácido N- acil neuramínico monomérico, conforme determinado através de HP AC- PAD. Os resultados mostram claramente que o epitopo reconhecido pelo SEAM 3 é composto de uma mistura de resíduos de de-N-acetila e N-acila, mas não derivados de PS de NmB que não contêm resíduos de de-N-acetila. Uma vez que o Dp caracterizado por HP AC-PAD varia entre 2 e cerca de 27, os resíduos de de-N-acetila podem ocorrer internamente dentro do polí- mero ou na extremidade de não redução.

A quantidade de antígeno reconhecido por SEAM 3 em prepara- dos de ácido colomínico ou PS N-Pr de NmB não é afetada pela digestão exaustiva com exosialidase, enquanto que as moléculas não nos preparados que não contêm resíduos de de-N-acetila são degradados. Portanto, trata- mento exaustivo com exosialidase proporciona um meio de enriquecer gran- demente preparados de ácido colomínico e PS N-Pr de NmB por moléculas que se ligam ao mAb.

EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE VACINA CONTENDO DERIVADOS DE PS ENRIQUECIDOS COM RELAÇÃO A ANTÍGENOS DE deNAc SA

O seguinte proporciona um exemplo de um método para a pro- dução de uma vacina contendo antígeno de deNAc SA a partir de PS usan- do o método de enriquecimento baseado em sialidase e a geração de um conjugado através de reação com e ligação através de um grupo acrila ou haloacetila.

De-N-acetilação. Ácido colomínico (100 mg, EY Laboratories) e 10 mg de borohidreto de sódio (Sigma-AIdrich) são dissolvidos em 10 ml de NaOH a 2M, colocados em um tubo de vidro para hidrolise vedado (Pierce) e aquecidos para 90°C durante 2 h. A solução é deixada esfriar para a tempe- ratura ambiente e ácido acético glacial é adicionado para diminuir o pH da solução para aproximadamente 7, A solução é submetida à diálise (corte de 1 kDa) em 2x 4L de água e liofilizada.

Re-N-acilação. O PS de NmB de-N-acetilado é ressuspenso em 5 ml de água e o pH ajustado para 8-9 com NaOH a 2M. Anidrido de acila (por exemplo, anidrido acético ou anidrido propiônico) é adicionado em 5 porções de 0,1 ml durante um período de várias horas, com agitação. O pH é monitorado com um medidor de pH e é ajustado para 8-9 com NaOH a 2M conforme necessário. A solução é submetida à diálise em água conforme antes e liofilizada. O PS de NmB reacilado contém, tipicamente, 10%-30% de ácido de-N-acetil siálico conforme determinado através de um ensaio com resorcinol (vide supra). O produto é enriquecido com relação a antígenos que são reativos com SEAM3 através de tratamento com SIALIDASE A® (Prozyme).

Tratamento com sialidase. O pó liofilizado é ressuspenso em 1 ml de tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH de 6,5. (1U) é adicionado e a solução é incubada a 37°C durante 3-7 dias. O progresso da reação é moni- torado através de análise por HP AC-PAD periódica de uma pequena porção da mistura de reação se primeiro filtrada através de uma membrana Centri- con (corte de 30 kDa, Millipore) para remover o [?]. Quando mais nenhuma liberação de ácido 5-N-acil neuramínico ocorre, a reação é terminada e Iac- tonas cíclicas são hidrolisadas através de aumento do pH da reação para 12 com NaOH a 2M durante 1 h, neutralização com ácido acético glacial, filtra- ção através de uma membrana Centricon de 30 kDa, diálise em água (tubu- lação de diálise de 1 kDa) e liofilização do produto.

N-acilação com ácido acrílico (ou ácido haloacético). O PS de NmB parcialmente de-N-acetilado tratado com sialidase é ressuspenso em água e o pH é ajustado para 8-9 com NaOH a 2M. Uma quantidade de ácido acrílico (ou ácido haloacético) igual a 10% a 100% da quantidade de ácido de-N-acetil siálico presente no preparado de PS de NmB re-N-acilado (tipi- camente 40%-50% da quantidade total de ácido siálico determinada através do ensaio com resorcinol) é combinada com 0,9 equivalentes de EDC (Pier- ce). Uma pequena quantidade de água é adicionada conforme necessário para dissolver a EDC. A solução de ácido acrílico ativada (ou ácido haloacé- tico ativado) é adicionada ao preparado de PS de NmB parcialmente re-N- acilado com agitação e o pH é mantido em 8-9 através da adição de NaOH a 2M conforme necessário. Embora uma quantidade de ácido acrílico acilado (ou ácido haloacético ativado) igual à quantidade de ácido de-N-acetil siálico pode ser adicionada à reação, alguma quantidade de ácido de-N-acetil siáli- co restará, uma vez que um pouco do ácido acrílico ativado hidrolisará. Após agitação durante 1 h, a mistura de reação é submetida à diálise e Iiofilizada conforme descrito acima. O produto é armazenado vedado sob argônio no escuro a -80°C até usado para conjugação a uma proteína-veículo.

Conjugação a uma proteína-veículo. A proteína-veículo (10 mg) é dissolvida em HEPES a 50 mM, pH de 8,0, contendo NaCI a 150 mM. O preparado de PS de NmB contendo acila é adicionado (20 mg) e a solução deixada descansar em temperatura ambiente no escuro durante 2 dias. A solução é, então, submetida à diálise em tampão de PBS usando uma mem- brana de diálise tendo um corte de massa de 30 kDa. O conjugado submeti- do à diálise é finalmente filtrado estéril (0,2 μ) e armazenado a 4°C até usa- do. A quantidade de ácido siálico conjugado à proteína é determinada atra- vés do ensaio de resorcinol e confirmação de que o PS é covalentemente ligado à proteína é determinada através de detecção por SDS-PAGE e Wes- tern blot com SEAM3.

EXEMPLO 5: INCORPORAÇÃO BIOSSINTÉTICA DE RESÍDUOS DE ÁCI- DO SIÁLICO N-TRICLOROACETIL (OU TRIFLUOROACETIL)-PROTEGIDO EM PS BACTERIANO E USO DO PS CAPSULAR RESULTANTE PARA PREPARAR VACINAS DE CONJUGADO DE PS-PROTEÍNA

0,5 milimol (108 miligramas) de hidrocloreto de manosamina foram dissolvidos em 10 mililitros de metanol contendo 0,55 milimol de me- tóxido de sódio e esfriada para 4 graus C. 0,6 milimol de anidrido tricloroacé- tico (ou trifluoroacetato de etila) foram adicionados e a mistura agitada du- rante 2 horas. O progresso da reação foi monitorado colocando a mistura de reação sobre uma lâmina de TLC de sílica-gel, revelando a lâmina com ace- tato de etila, metanol, água (5:2:1) e detecção do desaparecimento da ma- nosamina na origem com vapor de iodo ou reagente de niidrina com aque- cimento, Ao término da reação, 1,5 miliequivalentes de resina de leito mistu- rado AG 501-8X (BioRad) e 10 mililitros de água foram adicionados, o pH foi ajustado para 7 através da adição de NaOH ou HCI conforme necessário e a mistura gentilmente agitada durante 1 hora. A mistura de solvente e glóbulos foi separada e o solvente foi removido através de liofilização. Purificação adicional do produto, se necessário, foi realizada através de cromatografia em sílica-gel usando o mesmo sistema de solvente descrito para TLC. Sol- vente das frações combinadas contendo o material desejado foi removido através de evaporação. Finalmente, o produto seco foi ressuspenso em á- gua e liofilizado.

A manosamina trihaloacetilada foi incorporada em PS de NmB através de inoculação de colônias da cepa M7 de NmB durante a noite a 37 graus C em 5% de dióxido de carbono sobre uma lâmina de agar de choco- laté recentemente preparada para uma OD620 nm de 0,1 em caldo de Mul- ler-Hinton suplementado com 5 milimolares de N-acil manosamina, por e- xemplo, N-acetil, tricloroacetil, trifluoroacetil manosamina. A cepa M7 contém um transposon que interrompe o gene que codifica epimerase de N-acetil-D- glicosamina-6-fosfato 2 (Swartley et al., 1994, J. Bact. 176: 1530; Swartley et al., 1996, J. Báct. 178: 4052). Como um resultado, as bactérias não podem sintetizar PS capsular, a menos que o meio seja suplementado com N-acetil manosamina. Portanto, o teor de N-acila do PS capsular sintetizado nesse sistema pode ser determinado através da N-acila ou mistura de N-acil mano- samina fornecida no meio de crescimento. As bactérias foram crescidas a 37 graus C para uma OD620 nm durante a noite.

Mutantes de E. coli K1 também podem ser usados nesse méto- do de produção em lugar de uma cepa de NmB. Mutantes de E. coli K1 ade- quados que são deficientes em PS capsular podem ser gerados, por exem- plo, através de expressão por knòckdown de um produto de gene neuC fun- cional. Uma vez que o neuC codifica uma epimerase dé N-acetil-D- glicosamina-6-fosfato 2, cepas de E. coli deficientes nesse gene não podem sintetizar PS capsular e, assim, são adequadas para uso nesse método de produção de derivado de PS.

A produção de PS capsular contendo os grupos trihalo acetila foi demonstrada através de microscopia por fluorescência usando o mAb SEAM 12 (Granoff et al. (1998) J. Immunol 160, 5028-36) para detectar a presença de PS capsular sobre a cepa de produção M7. Os resultados são mostrados na figura 37. A ligação de SEAM 12 a M7 suplementada com N-acetil mano- samina é mostrada na figura 37 (painel A), onde a ligação é indicada pela presença de fluorescência vermelha (tonalidade em cinza na figura) do anti- corpo secundário rodamina-rotulado de detecção (Zymed). Não há ligação de SEAM 12 à M7 sem N-acil manosamina ou com suplemento de N- tricloroacetil manosamina (figura 37, painéis B e C). SEAM 12 não se liga ao PS capsular contendo os grupos tricloroacetila porque o grande tamanho do grupo triclorometila rompe a ligação. Contudo, SEAM 12 se liga ao PS cap- sular contendo grupos N-trifluoroacetila (figura 37, painel D, tonalidade em cinza na figura), uma vez que o grupo trifluorometila tem aproximadamente o mesmo tamanho que o grupo metila do derivado de N-acetila. O polissacarídeo foi purificado do meio de crescimento conforme descrito com Guo e Jennings (Guo, Z. e Jennings, H. em 2001. em Menin- gococcal Vaccines: Methods and Protocols. A. J. Pollard, e C. J. M. Maiden1 eds. Humana Press Inc., Totowa, N.J., página 41). O polissacarídeo purifica- do foi oxidado, conjugado à proteínas-veículo ou aminas graxas através de aminação redutiva conforme descrito acima e os grupos trihaloacetila foram expostos através de redução com borohidreto de sódio. O produto final foi purificado através de cromatografia por exclusão de tamanho conforme des- crito acima, submetido à diálise em PBS e liofilizado.

EXEMPLO 6: INCORPORAÇÃO BIOSSINTÉTICA DE RESÍDUOS DE ÁGIDO SIÁLICO N-TRICLOROACETIL (OU TRIFLUOROACETIL)-PROTEGIDOS EM GANGLIOSÍDEOS E USO DOS GANGLIOSÍDEOS RESULTANTES PARA PREPARAÇÃO DE VACINAS DE CONJUGADO DE PROTEÍNA E VACINAS DE VESÍCULA DA MEMBRANA EXTERNA

1g de hidrocloreto de manosamina (4,5 mmols) foi dissolvido em 50 ml de metanol contendo um equivalente de metóxido de sódio e res- friada para 4°C. 5,1 milimols de cloreto tricloroacético (ou trifluoroacetato de etila) foram adicionados e a mistura agitada durante 2 horas. Metóxido de sódio extra foi adicionado conforme necessário para manter o pH a ~8. O progresso da reação foi monitorado colocando a mistura de reação sobre uma lâmina de sílica-gel, revelando a lâmina com acetato de etila, metanol, água (5:2:1) e detecção do desaparecimento de manosamina na origem com vapor de iodo. Ao término da reação, o solvente foi removido através de e- vaporação. Após trituração do sólido restante com 5 ml de metanol, o deri- vado de N-trihaloacetila foi cristalizado a partir de metanol/clorofórmio.

Células SK-Mel-28 foram crescidas sobre um disco de bioensaio quadrado de 245 mm χ 245 mm (Corning) até próximo da confluência. Meio de crescimento (RPMI suplementado com glutamina a 5 mM, piruvato de sódio a 1 mM, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, soro bovino fetal a 10% e antibióticos) foi substituído por meio de crescimento contendo triclo- roacetil manosamina (5 mM) durante 24 horas, após o que as células foram lavadas três vezes com PBS e submetidas à lise através de choque hipotô- nico em água destilada (1 hora a 4°C). Isso foi seguido por 3 ciclos de con- gelamento/descongelamento usando etanol sobre gelo seco/banho de água a 37°C. A fração de membrana bruta foi empelotada através de centrifuga- ção a 4500 g durante 20 minutos a 4°C. A pelota foi liofilizada e os lipídios extraídos através de lavagem gradual com metanol/clorofórmio (1:2, 1:1, 2:1 em volume) durante 30 minutos (Geilen et al., 1992, Arch. Biochem. Biophys. 296, 108-114). A fase orgânica foi seca sob uma corrente uniforme de gás nitrogênio isento de oxigênio e ressuspensa em 200 μL de clorofór- mio/metanol/CaCl2 a 0,02% (50:40:10).

De-N-acil GM3 e GD3 (CaIbiochem) foram preparados suspen-

dendo 1 mg de gangliosídeo em 2 ml de hidróxido de tetrabutilamônio a 2,5 M e 3 ml de butanol, então, aquecimento da mistura para >100 graus C du- rante 4 horas. Após esfriar a mistura para a temperatura ambiente, o pH foi ajustado para cerca de 7 através da adição de HCi a 2 M e o butanol remo- vido através de evaporação sob uma corrente de N2. A camada aquosa res- tante foi submetida à diálise (tubulação de diálise com corte de 1K) contra tampão de PBS e usada sem outra modificação como um antígeno para E- LISA.

Lipídios no extrato em GD3 quimicamente de-N-acilado foram analisados através de separação sobre cromatografia em camada fina de elevado desempenho (HPTLC) e Western blot. Amostras do extrato de gan- gliosídeo que tinham sido tratadas com borohidreto de sódio (1 mg/100 μl em temperatura ambiente durante 2 h) para remover o grupo de proteção tricloroacetila e GD3 quimicamente de-N-acilado foram colocados sobre uma lâmina HPTLC 60 com sílica-gel revestida de alumínio 60 (Merck) e a lâmina foi revelada em clorofórmio/metanol/CaCb a 0,02% (50:40:10). As lâminas usadas para Western blot foram secas e imersas em uma solução de meta- crilato de polilisobutila a 0,4% em hexano/clorofórmio (21:8) durante 1 min. As lâminas foram bloqueadas com albumina de soro bovino a 1% (BSA) em tampão de PBS contendo azida de sódio a 0,1%. mAbs (5 mg/ml) no mesmo tampão de bloqueio foram incubados com as lâminas a 4°C durante a noite. As lâminas foram lavadas 3 vezes em tampão de PBS, então, incubadas com conjugado anti-lg de camundongo-HRP de cabra (Zymed) em PBS con- tendo BSA a 1%. Após lavagem das lâminas 3 vezes com PBS1 substrato (HRP Chemiluminescence Reagent Plus da Perkin-Elmer) foi adicionado para revelar as lâminas. A imagem Iuminescente foi capturada sobre um fil- me.

Western blot para avaliar a reatividade de um mAb anti-de-N-acil GD3 com gangliosídeos de ácido de-N-acetil siálico preparados química ou biossinteticamente foi realizada com GAG2 (Fileiras 1 -3, figura 38) ou SEAM 3 (Fileiras 4-6, figura 38). GAG2 é um anticorpo monoclonal de murino (IgM) preparado ao dé-N-acil GD3 através de imunização de camundongos com vesículas da membrana externa de N. meningitidis (cepa H44/76 na qual o gene siaD tenha sido inativado) contendo de-N-acil GD3 (EXEMPLO 9). As vesículas foram preparadas conforme descrito abaixo. GÀG2 se liga ao de- N-acil GD3, mas não ao GD3 re-N-acetilado. As fileiras 1 e 3 são gangliosí- deos obtidos de tratamento de GD3 com hidróxido de tetrabutil amônio (isto é, de-N-acilação química). As Fileiras 2, 3, 5 e 6 são gangliosídeos extraídos de células SK-MEL-28 crescidas em meio suplementado com N-tricloroacetil manosamina (isto é, gangliosídeos contendo ácido siálico N-protegido bios- sintético). O extrato lipídico nas fileiras 2 e 5 foi tratado com NaBH4 para re- mover o grupo de proteção N-tricloroacetila para produzir os gangliosídeos de ácido de-N-acetil siálico. As fileiras 3 e 6 contêm o mesmo extrato lipídico que não foi tratado com NaBH4. SEAM 3 não reage com qualquer um dos gangliosídeos de de-N-acila produzidos através de tratamento alcalino. GAG2 reage com um gangliosídeo de ácido de-N-acetil siálico produzido biossinteticamente que se move com a frente de solvente (fileira 2), enquan- to que SEAM 3 reage com um derivado de gangliosídeo de de-N-acetila dife- rente que se move mais lentamente (fileira 5). A falta de reatividade com ambos os mAbs com extrato lipídico operado nas fileiras 3 e 6 mostra que o grupo de proteção N-tricloroacetila permanece intacto durante o procedimen- to de isolamento e que derivados de gangliosídeo de ácido de-N-acetil siáli- co são produzidos após remoção do grupo de proteção com NaBH4.

Os resultados na figura 38 demonstram que o SEAM 3 se liga aos gangliosídeos de ácido de-N-acetil siálico preparados através de bios- síntese de gangliosídeos N-tricloroacetil-protegidos em células SK-MEL-28, seguido por remoção do grupo de proteção por NaBtLj (fileira 5), mas não ao derivado protegido (fileira 6) ou ao GD3 quimicamente de-N-acilado (fileira 6). Além disso, um mAb que é específico para o GD3 de-N-acilado prepara- do através de tratamento com álcali (GAG2) reage com um derivado diferen- te que se move mais rápido no extrato lipídico de SK-MEL-28 tratado com NaBhU. Assim, os métodos descritos aqui podem ser usados para preparar seletivamente derivados de gangliosídeo para uso como uma vacina e antí- genos diagnósticos que são reativos com mAbs, tal como SEAM 3, que re- conhecem resíduos de ácido de-N-acetil siálico e têm atividade funcional citotóxica contra células cancerígenas que expressam antígenos de ácido de-N-acetil siálico.

EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DE ANTÍGENOS DE deNAc SA - DERIVA- DOS DE GANGLIOSÍDEO TENDO UMA MISTURA DE RESÍDUOS DE Á- CIDO N-ACETIL E DE-N-ACETIL SIÁLICO

Derivados de gangliosídeo de ácido N-tricloroacetil/N-acetil siáli- co obtidos através de biossíntese em células SK-MEL-28 foram solubilizados em clorofórmio/metanol/CaCl2 a 0,02% O grupo de proteção amina N-tri- cloroacetila foi removido através de redução com borohidreto de sódio 1 mg de NaBH4, 10 mg de extrato lipídico bruto). Borato de cálcio que precipitou da reação foi removido através de centrifugação. Os derivados lipídicos fo- ram separados através de HPTLC. A banda contendo material reativo com SEAM 3 foi raspada da lâmina e extraída com clorofórmio/metanol (1:1). A- pós remoção do sílica-gel através de centrifugação, o solvente da banda ex- traída foi seco sob N2.

Vesículas da membrana externa foram preparadas a partir da cepa H44/76 do grupo B de Neisseria meningitidis da qual o gene de sialil transferase siaD tinha sido removido. Células de 1 litro de H44/76 crescidas em caldo de Muller-Hinton para uma A620 nm de 0,6 foram peletizadas atra- vés de centrifugação a 10.000 x g durante 30 min. O pélete de célula foi res- suspenso em Tris-HCl a 0,1 M, pH de 8,6. contendo EDTA a IO mM e DOC a 141

0,5% com a proporção de tampão para biomassa de 5:1 (v/peso. O sobre- nadante foi coletado após centrifugação (20.000 x g; 30 minutos; 4°C) e a extração foi repetida com o volume de tampão reduzido para um terço. Os sobrenadantes combinados foram ultracentrifugados (125.000 x g; 2 horas;

54°C) e o pélete de OMV ressuspenso em tampão de Tris-HCl a 50 mM, pH de 8,6, contendo EDTA a 2 mM, DOC a 1,2% e 20% de sacarose. A concen- tração de proteína foi determinada usando um ensaio padrão de proteína (BCA, BioRad). O preparado de veículo e Empigen (1% peso/v; Calbiochem) foram adicionados ao filme lipídico e submetidos a ultra-som com um apare- lho de ultra-som para banho (Branson) durante 30 min, então, deixados agi- tar durante a noite a 4°C. A mistura foi, então, submetida à diálise em tam- pão de PBS durante 5 dias. Os complexos de OMV/gangliosídeo resultantes foram filtrados e congelados até usados para vacinação.

EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DE VACINA DE CONJUGADO DE PROTEÍ- NA-GANGLIOSÍDEO DE ÁCIDO N-TRIHALOACETIL/N-ACETIL SIÁLICO

A fração lipídica brita da biossíntesé de gangliosídeos de ácido N-trihaloacetil/N-acetil siálíco em células SK-MEL-28 foi purificada através de HPTLC e os derivados de gangliosídeo de ácido N-trihaloacetil/N-acetil siáli- co foram extraídos da lâmina conforme descrito no Exemplo 7. Após remo- ção do sílica-gel através de centrifugação, um grupo aldeído foi gerado no gangliosídeo através de ozonólise da ligação dupla de esfingosina. O aldeí- do foi purificado através de HPLC de fase reversa (Waters Bondpak C18 Microbore) e acoplado ao toxóide do tétano através de aminação redutiva com cianoborohidreto de sódio. Um excesso de borohidreto de sódio foi adi- cionado à mesma mistura de reação para remover o grupo de proteção N- trihaloacetila. A mistura de reação foi submetida à diálise em tampão de PBS, filtrada estéril e congelada até usada para imunização.

EXEMPLO 9: PURIFICAÇÃO DO mAb SEAM 3

Sulfato de sódio sólido (Sigma-Aldrich Chemical Co., Saint Louis, MO) foi adicionado a uma solução de SEAM 3 em tampão de PBS (concen- tração de anticorpo de aproximadamente 30 microgramas/ml, conforme de- terminado através de um ensaio de captura de anticorpo (Southern Biotech, Birmingham, Al)) para uma concentração final de 0,5 M. Após dissolver completamente o sulfato de sódio sólido, a solução foi incubada aproxima- damente 18 horas a 4°C. A solução foi centrifugada (10.000 χ g) para remo- ver os precipitádos e filtrada (0,2 μ). O anticorpo foi, então, purificado atra- vés de cromatografia por exclusão de tamanho sobre uma coluna Toyopearl HW55F (Supelco, Bellefonte1 PA; 1,5 mm χ 25 mm) equilibrada com tampão de PBS contendo sulfato de sódio a 0,5 M. Frações contendo anticorpo ativo foram determinadas através de ELISA usando N-propionil NmB PS- dodecilamina (vide supra) como o antígeno em fase sólida e detecção usan- do fosfatase alcalina conjugada a anti-lgA, G, M (H e L) de camundongo de coelho (Zymed, South San Francisco, CA) e reveladas com substrato fosfato de 4-nitrofenila (Sigma-AIdrich). Frações contendo anticorpo ativo foram combinadas e submetidas à diálise contra PBS, filtradas estéreis (0,2 μ) e armazenadas a 4°C. As concentrações de anticorpo purificado foram deter- minadas através de um ensaio de captura de anticorpo (Southern Biotech). SEAM 3 purificado foi usado nos Exemplos abaixo.

EXEMPLO 10: PRESENÇA DE ANTÍGENO SEAM 3-REATIVO EM CÉLULAS CANCERÍGENAS E AUSÊNCIA EM CÉLULAS NORMAIS

Para determinar se há uma diferença na expressão de antígeno SEAM 3-reativo entre melanócitos normais e células de tumor de melanoma, imunocoloração de seções finas de cada tipo de tecido foram realizadas. Além de SEAM 3, controles incluíam o anticorpo secundário apenas e R24, o qual se liga ao gangliosídeo GD3 que é expresso em melanócitos normais e é superexpresso em alguns melanomas (Dippold et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(10): 6114-8.; Graus et al., Brain Res, 1984. 324(1): 190-4; Houghton et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(4): 1242-6; Panneersel- vam et al., J Immunol, 1986. 136(7): 2534-41; Real et al., Câncer Res, 1985. 45(9): 4401-11; Vadhan-Raj et al., J Clin Oncol, 1988. 6(10): 1636-48; Welt et al., Clin Immunol Immunopathol, 1987, 45(2): 214-29).

As seções teciduais foram feitas de amostras congeladas de pele normal (HuSkinTbI 11 na figura 39) e dois melanomas humanos (HuMeII 151 e HuMel4034). Para prevenir a possibilidade de bloqueio do antígeno de de-N-acetila ou extração de um lipídio que contata o antígeno, as seções foram preparadas a partir de tecido congelado e foram secas sobre as lâmi- nas, mas não fixadas com aideídos ou solventes orgânicos (Chammas et al., Câncer Res, 1999. 59(6): 1337-46). Peroxidases endógenas foram removi- das através de incubação em peróxido a 0,03% durante 30 min., seguido por lavagens com tampão e, então, a biotina endógena também foi bloqueada usando o kit de bloqueio com Avidina/Biotina da Vector Labs (Burlingame, CA). Ligação não específica ao colágeno foi bloqueada com BSA/PBS a 1%. BSA ou os mAbs R24 ou SEAM 3 foram, então, incubados em uma câmara úmida. Anticorpo não ligado foi removido através de enxágües com tampão. O anticorpo ligado foi, então, detectado usando o kit DAKO LSAB seguindo as orientações do fabricante (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Após lavagens adicionais, os núcleos foram contracorados usando hematoxilina de Mayer (Vector Labs).

Os resultados em uma ampliação de 400x são mostrados na figura 39. Imunocoloração de pele humana normal mostra que o mAb anti- GD3 R24 identifica melanócitos (setas), bem como alguns ramos neurais na derme da pele. SEAM 3 se liga a um antígeno em estruturas semelhantes às neurais da derme, mas não está presente em melanócitos. Coloração dos dois melanomas mostra que R24 reage fortemente com algumas, mas não todas as células. Em contraste, coloração com SEAM 3 é mais fraca, mas quase todas as células de melanoma são coradas, conforme indicado por áreas de tonalidade escura. A coloração de SEAM 3 parece ser granular e intracelular nas células de melanoma. Assim, o antígeno reconhecido pelo SEAM 3 não está detectavelmente presente em melanócitos normais, mas está presente em tumores de melanoma humano. Baseado em microscopia por fluorescência e citotoxicidade contra melanoma SK-MEL-28, neuroblas- toma CHP-134 células Jurkat (leucemia de células T linfoblástica aguda) descrita abaixo (vide infra), o antígeno está presente sobre a superfície celu- lar durante alguns estágios de crescimento (dados não mostrados). O efeito citotóxico de SEAM 3 foi observado sobre cada tipo de célula (melanoma SK-MEL-28, neuroblastoma CHP-134 e células Jurkat) e era aproximada- mente proporcional ao nível de antígeno presente sobre a superfície celular. EXEMPLO 11: LIGAÇÃO DE SEAM 3 À SEÇÕES DE TECIDO INCRUSTADAS EM PARAFINA FORMALINA-FIXADAS DE TUMORES HUMANOS

Análise imunohistoquímica inicial de antígenos reconhecidos pelo SEAM 3 foi realizada sobre tecidos não fixados não se preocupando se os grupos de-N-acetil amino pudessem ser bloqueados através de reação com formaldeído (vide supra). Subseqüentemente, foi determinado que o grupo amino em ácido de-N-acetil siálico era relativamente não reativo como um resultado de sua proximidade íntima ao grupo G1 carboxila. Portanto, seleção em larga escala de tumores humanos com relação à presença de antígenos SEAM 3-reativos foi realizada usando seções teciduais incrusta- das em parafina fixadas em formalina, uma vez que processamento das a - mostras através desse método melhora consideravelmente a preservação das características estruturais.

Microfileiras de tecido humano foram obtidas da US BioMax (Rockville, MD). As microfileiras de tecido foram desparafinizadas em xileno (2 trocas, 10 minutos cada), então, reidratadas através de lavagens seqüen- ciais de 5 minutos em etanol a 100%, etanol a 95%, etanol a 70%, etanol a 50% e tampão de PBS. Peroxidase endógena foi bloqueada através de in- cubação com solução Peroxidazed 1 (Biocare, Concord, CA) durante 5 minu- tos em temperatura ambiente. As seções foram bloqueadas com Terminator (Biocare) contendo estreptavidina, então, enxaguadas com tampão de PBS. O anticorpo primário (SEAM 3 purificado (vide infra), controle irrelevante de lgG2b etc. em concentrações de 1 a 5 μg/ml)) foram diluídos em tampão de diluição Da Vinci Green (Biocare) e incubados durante a noite a 4 graus C ou durante 1 hora em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos cada com tampão de PBS, então, incubadas com anti- corpo secundário anti-lgG de camundongo de coelho conjugado à biotina (5 μg/ml, Vector Labs, Burlingame, CA) durante 30 minutos em temperatura ambiente. Após lavagem 3 vezes durante 10 minutos cada com tampão de PBS, conjugado de peroxidase de armorácia-estreptavidina de cavalo (Vec- tor Labs) foi adicionado em temperatura ambiente durante 30 minutos. As lâminas foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos cada com tampão de PBS e incubadas com substrato AEC (Vector Labs) contendo peróxido de hidrogênio para desenvolvimento da cor. Desenvolvimento da cor foi deixado processar durante 30 segundos a 30 minutos, dependendo da amostra e foi, então, cessado através de lavagem com água, contracorado com Hematoxi- lina QS (Vector Labs), enxaguado com água e finalmente montado em meio de montagem aquoso VectraMount AQ (Vector Labs) e visualizado/ fotogra- fado sob um microscópio (Zeiss Axioplan).

Os resultados para 47 tumores humanos são resumidos na figu- ra 40. Todos os tumores e tecidos normais testados eram negativos com relação à ligação com o mAb de controle isotipo-equivalente irrelevante (lgG2b.de murino, Southern Biotech). A intensidade de coloração e o núme- ro de células coradas era variável nas amostras de tumor oscilando de ne- nhuma coloração (indicado por"-") à coloração escura de todas as células (indicado por"+++") com variações entre os extremos. A maioria das amos- tras testadas foi positiva para ligação ao SEAM 3 (38 de 47) e representam uma ampla faixa de tipos de tumor. Tipicamente, a coloração resultante de ligação a SEAM 3 observada nos tecidos de tumor tem uma aparência "gra- nular" e é coincidente com as estruturas celulares. Uma micro fileira de teci- dos normais também foi testada. Geralmente, as amostras de tecido "nor- mal" foram obtidas dos mesmos indivíduos que os tumores, mas foram obti- das de regiões fora das margens dos tumores primários. Todos os tecidos normais (17 amostras) foram negativos com relação à ligação com o mAb de controle. SEAM 3 foi positivo para ligação a 15 de 17 amostras, oscilando de +a ++. Contudo, diferente da coloração observada em tecidos de tumor, co- loração resultante de ligação a SEAM 3 nos tecidos normais não é granular, mas antes, é homogênea, não é coincidente com estruturas celulares, exce- to quanto a umas poucas células e é contínua com tecidos estromais. No presente momento, as diferenças na aparência da coloração não são com- preendidas.

EXEMPLO 12: LIGAÇÃO DE SEAM 3 À LINHAGENS DE CÉLULAS DE MELANOMA SK-MEL-28 E NEUROBLASTOMA CHP-134 HUMANAS A- TRAVÉS DE MICROSCOPIA POR FLUORESCÊNCIA E CITOMETRIA DE FLUXO

Células SK-MEL-28 (Carey et al.. Proc Natl Acad Sci USA, 1976. 73(9): 3278-82) foram adquiridas da American Type Culture Colleetion (ATCC). As células foram crescidas rotineiramente em meio RPM11640 con- tendo aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, piruvato de sódio a 1,0 mM, glutamato a 0,1 mM, penicilina/estreptomicina e soro fetal bovino a 10% a 37°C em 95% de ar:5% de CO2. Células confluentes foram subcultivadas (1:3 a 1:8) através de tratamento com solução de Tripsina a 0,25% (pe- so/v)/EDTA a 0,53 mM, lavadas e trituradas antes de recultura em novo meio de crescimento. Células SK-MeI 28 foram usadas apenas até a passagem das células de estoque da ATCC. Essas células expressam o gangliosí- deo GD3.

A linhagem de célula de leucemia de células T humana Jurkat (Schneider et al.. Int J Câncer, 1977. 19(5); Schneider et al.. Haematol Blood Transfus, 1977, 20:) foi cultivada em RPMI 1640 contendo FBS a 10%, L-glutamina a 2 mM em 5% de C02 a 37°C e subcultivadas a cada 3 dias com uma proporção de divisão de cerca de 1:5. As células foram coletadas através de centrifugação (500 g) e ressuspensas em meio fresco antes de subcultura. As células são positivas para expressão dos seguintes antígenos de CD: CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD34 e são negativas para ex- pressão dé CD8, CD 13, CD 19, TCRalfa/delta, TCRgama/delta.

Células de neuroblastoma CHP-134 (Livingston et al.. J Biol Chem, 1988. 263(19): 9443-8) foram rotineiramente crescidas em meio RP- MM 640 contendo aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, piruvato de sódio a í,0 mM, glutamato a 0,1 mM, penicilina/estreptomicina e a soro bovino fetal a 10% a 37°C em 95% de ar:5% de CO2. Células confluentes foram subculti- vadas (1:3 a 1:5) através de tratamento com Cell Dispersai Reagent (CDR, Guava Technologies, Haywood, CA), lavadas e trituradas antes de recultura em novo meio de crescimento. Essas células expressam a molécula de ade- são de células neurais (NCAM), a qual é modificada com ácido polissiálico de cadeia longa (isto é, ácido poli alfa 2-8 N-acetil neuramínico). Para observar a ligação de SEAM 3 à superfície das células, células CHP-134 ou SK-Mel-28 aderentes (aproximadamente 105 células) foram cultivadas sobre lâminas para microscópio com múltiplas cavidades que tinham sido tratadas com poli-L-lisina (Nunc). Após uma incubação du- rante a noite, as células foram gentilmente lavadas com tampão de PBS e fixadas com formaldeído gelado a 1% (v/v). Após 20 minutos, as células fo- ram lavadas com PBS antes de bloqueio da ligação não específica com uma solução de soro de cabra a 3% durante 1 hora. Para observar a presença de antígeno SEAM 3-reativo que está presente dentro das células, as células foram tratadas com Triton X-100 0,5% peso/v em soro de cabra a 3% duran- te 1 hora. Os anticorpos primários foram adicionados e incubados durante 2 horas ou durante a noite a 4°C. As células foram gentilmente lavadas serial- mente (pelo menos duas vezes) com PBS gelado antes que anticorpo se- cundário isotipo-específico (produzido em cabra) conjugado com Alexa Fluor 488 (imunofluorescência e confocal), Alexa Fluor 546 (confocal) Alexa Fluor 594 (imunofluorescência), Alexa Fluor 633 (confocal) fossem aplicados du- rante pelo menos 1 hora a 4°C no escuro (todos os anticorpos secundários conjugados a fluoroforos foram obtidos da Invitrogen, Carlsbad, CA). Após outra série de ligeiras lavagens, um meio de montagem de endurecimento contendo DAPI foi aplicado.

Imunofluorescência foi observada com um Microscópio de Fluo- rescência Zeiss Axioplan adaptado com uma câmara digital. Imagens confo- cais foram obtidas usando um Zeiss Meta510 CLSM na Biological Imaging Facility, University of Califórnia, Berkeíey, CA e foram analisadas usando o Software lmage! (NIH). Anticorpos de controle e anticorpos secundários apli- cados sozinhos foram rotineiramente usados para avaliar a fluorescência de base. O mAb de controle positivo que é específico para GD3, R24, era posi- tivo para ligação a células de melanoma SK-MEL-28, mas negativo para li- gação a células de neuroblastoma CHP-134 (Livingstoh et al.. J Biol Chem, 1988. 263(19): 9443-8) e células de leucemia de células T Jurkat, as quais não expressam GD3 (dados não mostrados).

A figura 41 e figura 42 mostram a fluorescência sobre a superfí- cie celular (tonalidade escura na figura) resultante de ligação de SEAM 3 a células de melanoma SK-MEL-28 e células CHP-134, conforme medido a - través de microscopia confocal. A figura 43 mostra a ligação de SEAM 3 a células Jurkat1' conforme medido através de microscopia por fluorescência. Em cada caso, a fluorescência é uniforme sobre a superfície celular. Contu- do, nem todas as células no campo visual mostram ligação ao SEAM 3. Para células SK-MEL 28 e CHP-134 aderentes, células que são positivas para ligação ao SEAM 3 diferem morfologicamente de células negativas para o SEAM 3. Células positivas são arredondadas, enquanto que células negati- vo vas são alongadas, usando fotografia com lapso de tempo de células SK- MEL-28 em cultura (a 37°C, 95% de ar:5% de C02), foi confirmado que as células arredondadas não eram células mortas, mas células que sofreram divisão celular. As células permaneceram no formato esférico durante apro- ximadamente 3 horas, antes que elas se dividissem em duas células filhas.

"Deve ser notado que células SK-Mel-28 superexpressam gan- gliosídeo GD3 e são positivas para ligação pelo mAb anti-GD3 R24. Células CHP-134 são GD3 negativas e não são ligadas pelo mAb R24. Além disso, uma vez que células CHP-134 não expressam GD3, elas também não pro- duzem qualquer um dos derivados de GD3 de-N-acetilados. Uma vez que o SEAM 3 se liga a células SK-Mel-28 e células CHP-134 (e, na verdade, exi- be maior ligação a células CHP-134), esses dados indicam que o SEAM 3 se liga a um outro antígeno que não GD3 ou um derivado de GD3. Além disso, SEAM 3 não se liga a um antígeno derivado de ácido polissiálico, uma vez que ele se liga a células SK-MEL-28, as quais não expressam N-CAM. Por- tanto, o SEAM 3 se liga a um outro antígeno que não GD3 ou N-CAM.

EXEMPLO 13: LIGAÇÃO DE SEAM 3 A CÉLULAS DE MELANOMA SK-MEL 28, LEUCEMIA DE CÉLULAS t JURKAT E DE NEUROBLASTOMA CHP-134 MEDIDA ATRAVÉS DE CITOMETRIA DE FLUXO.

Células (aproximadamente 105 por cavidade) foram colocadas sobre uma lâmina de cultura tecidual com 96 cavidades de fundo plano (Nunc) e incubadas com meio de crescimento durante a noite antes do en- saio. As células foram soltas da lâmina através de tripsina (SK-MEL-28) ou CDR (CHP-134) antes de serem coletadas em uma lâmina com fundo re- dondo com 96 cavidades, centrifugadas a 500 g durante 5 minutos e fixadas com formaldeído gelado a 1 % (v/v). Após 20 minutos, as células foram pele- tizadas através de centrifugação (acima) e incubadas com uma solução de bloqueio de soro de cabra a 3% (v/v) com e sem Triton X-100 (0,5% peso/v) durante 1 hora. Após o que, os anticorpos primários foram adicionados e incubados durante 2 h ou durante a noite a 4°C. As células foram lavadas duas vezes através de peletização e ressuspensão em PBS gelado. Anticor- . po secundário (Invitrogen, conforme descrito acima) foi incubado com as células durante menos 1 hora a 4°C no escuro. Após outra série de centrifu- gações e lavagens (3 vezes), a ligação foi analisada através de um citômetro de fluxo Guava EastCyte. Amostras de controle foram tratadas com um anti- corpo irrelevante isotipo-equivalente (Southern Biotech), as quais foram usa- das para criar a fluorescência de linha de base ou mAbs de controle positivo que são reativos com antígenos especificamente expressos pelas células (isto é, anti-GD3 para células SK-MEL 28 e anti-NCAM em células CHP- 134). Além disso, a especificidade de ligação foi mostrada para as células Jurkat através de pré-incubação de SEAM 3 com 50 μg/ml de PS N-Pr de NmB antes de adição do mAb às células.

Conforme mostrado nas figuras 44-46, SEAM 3 se liga à super- fície de todas as três linhagens de célula (-Triton). A maior quantidade de ligação foi observada para as células CHP-134 (figura 45) e a menor em cé- lulas Jurkat (figura 46), embora a ligação a células Jurkat ainda fosse signifi- cativa. Todas as três linhagens de células contêm quantidades maiores de antígeno SEAM 3-reativo interno (+Triton).

EXEMPLO 14: EFEITO DE LIGAÇÃO A SEAM 3 SOBRE A VIABILIDADE DE CÉLULAS CANCERÍGENAS.

A viabilidade celular de células SK-MEL 28 incubadas na pre- sença de SEAM 3 ou mAbs de controle (lgG2b isotipò-irrelevante ou anti- GD3, R24) foi determinada usando ViaCount Reagent (Guava Technologies, Hayward, CA), conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, célu- las que tinham sido incubadas com os mAbs durante 48 h foram clivadas da lâmina de cultura tecidual (conforme descrito acima para os ensaios de liga- ção), coletadas através de centrifugação e ressuspensas em ViaCount Rea- gent. A viabilidade foi analisada usando um programa pré-ajustado sobre o citômetro de flúxo Guava EasyCyte. O programa tem uma ativação de pré- ajustada para apoptose e essa foi incorporada em nossos estudos. Confor- me mostrado na figura 47, SEAM 3 diminui significativamente o número de células viáveis comparado com o mAb de controle irrelevante IgG2b (P<0,001 indicado ***) após 24 h de incubação com o mAb. Em um segundo experimento mostrado na figura 48, SEAM 3 diminui o número de células viáveis comparado com um mAb de controle lgG2b (P<0,05 indicado por *) e aumenta o número de células apoptóticas (P<0,05) e mortas (P < 0,01). Si- milarmente, o mAb de controle positivo, R24, diminui o número de células viáveis (P < 0,01 indicado **) e aumenta o número de células apoptóticas (P<0,01) e mortas (P<0,001) comparado com o controle negativo. Os resul- tados demonstram que o SEAM 3 se liga à superfície celular e induz à apop- tose e aumenta a morte celular.

EXEMPLO 15: CORRELAÇÃO ENTRE LIGAÇÃO A SEAM 3 E PROLIFE- RAÇÃO CELULAR CONFORME MEDIDO ATRAVÉS DA EXPRESSÃO DE ANTÍGENO Ki-67.

Os dados acima indicaram que SEAM 3 se liga à superfície de células cancerígenas que estão em alguns estágios de divisão celular. Para demonstrar isso, células SK-MEL 28 foram analisadas com relação à ligação a SEAM 3 e a expressão de antígeno Ki-67, o qual é um marcador de prolife- ração celular (Brown et al.. Histopathology. 2002, 40: 2-11). As células foram processadas através dos mesmos procedimentos usados para medir a liga- ção a SEAM 3 na ausência de Triton. Após SEAM 3 não ligado ter sido lava- do, as células foram tratadas com soro de cabra a 3% (v/v) contendo Triton a 0,5% para permitir a entrada de um anticorpo anti-Ki-67. Após 1 h a 4°C, um anti-Ki-67 foi adicionado e incubado sobre gelo durante 2 horas. As células foram, então, coletadas através de centrifugação, lavadas duas vezes com PBS e dois anticorpos secundários anticamundongo de cabra fluorescente- mente rotulados foram adicionados, anti IgG2b-Alexa Flour 594 (Invitrogen); anti-IgM-Alexa Flour 488 (Invitrogen). Após lavagem extensiva, as células forma analisadas sobre um citômetro de fluxo Guava EasyCyte.

Quando as células estão na fase de crescimento exponencial, descobriu-se que aproximadamente 20% das células expressam antígeno SEAM 3-reativo sobre sua superfície (através de citrometria de fluxo e dados de microscopia por fluorescência) e 20-25% expressam o marcador de proli- feração Ki-67 (através de citometria de fluxo). Conforme mostrado na figura 50, há uma população de células (aproximadamente 11%) que expressa Ki- 67 e antígeno SEAM 3-reativo sobre sua superfície. Contudo, há algumas células que expressam apenas antígeno Ki-67 (12%) ou antígeno SEAM 3- reativo (13%). Detecção de antígeno Ki-67 pode ser usada para determinar o percentual de células tumorígenas que estão em divisão ativa de biópsias de câncer (Brown et al.. Histopathology. 2002, 40: 2-11). O número obtido atra- vés desse exame é denominado "S-fase", crescimento ou fração proliferativa (Brown et al.. Histopathology. 2002, 40: 2-11). Na verdade, Ki-67 está pre- sente por toda a proliferação da "S-fase" até pelo menos a anáfase. O expe- rimento de rotulação dupla por citometria de fluxo (figura 50) mostra que a expressão de antígeno Ki-67 e SEAM 3-reativo sobre a superfície de células se sobrepõem e confirma que, pelo menos em alguma parte, expressão de antígeno SEAM 3-reativo sobre a superfície pode estar envolvida em algum estágio posterior de divisão celular.

Para avaliar adicionalmente o efeito do mAb SEAM 3 sobre o crescimento celular, o estágio do ciclo celular após tratamento com SEAM 3 foi determinado. Nesse experimento, as células foram coradas com o coran- te de ligação a DNA fluorescente iodeto de propídio para caracterizar popu- lações de célula em vários estágios do ciclo celular e os efeitos da adição de anticorpos de controle, nocodazol (um fármaco que interrompe as células em mitose) e SEAM 3.

Aproximadamente 105 células SK-MEL 28 foram colocadas so- bre uma lâmina de cultura tecidual com 96 cavidades e deixadas aderir. A- pós 24 h, o meio foi substituído por um que tinha anticorpo ou fármaco e in- cubado durante mais 48 h. As células foram centrifugadas (para coletar quaisquer células que tenham se soltado) e fixadas em metanol gelado a 70% (adicionado gota a gota) durante pelo menos 30 minutos a 4°C. As cé- lulas foram lavadas duas vezes com PBS e, para assegurar que apenas o DNA era corado, as células fixadas foram tratadas com ribonuclease I (100 μg/ml,'fonte) durante 30 minutos a 37°C. Iodeto de propídio (50 ug/ml) foi adicionado e as amostras foram analisadas usando um citômetro de fluxo Guava EasyCyte.

Conforme mostrado na figura 49, as células incubadas durante 48 h com um anticorpo de controle isotipo-equivalente exibiam um perfil on- de a maioria das células (68%) estavam em Go ou em repouso (não- proliferação), enquanto que 10% estavam na "S-fase" e ainda 15% na fase G2/M. Uma outra população (aproximadamente 10%) de células estava na fase pré-Go. Essa fase pré-Go pode ser indicativa de apoptose. Células SK- MEL-28 puderam ser interrompidas na fase G2/M (mitose) através de trata- mento com nocodazol (100 nM) durante 48 h (figura 49). Nesse caso, apro- ximadamente 50% das células foram interrompidas na fase G2/M. Em con- traste, incubação das células com SEAM 3 reduziu a proporção de células na fase Go1 S-fase e fase G2/M, ao mesmo tempo em que aumenta o núme- ro em pré-Go (figura 49).

Esses dados proporcionam evidência adicional de que o SEAM

• 3 diminui a viabilidade de células SK-MEL 28 e sugere que o efeito do anti- corpo é promover a entrada das células na fase pré-Go. De modo interes- sante, as células que .tinham sido tratadas com o anticorpo antigangliosídeo GD3 (R24), o qual foi previamente mostrado como matando células de me- lanoma, aumentando o número de células em mitose. Assim, o(s) mecanis- mo(s) de ação do SEAM 3 sobre a interrupção do ciclo celular/mecanismos apoptóticos pode(m) ser diferente(s) daqueles exibidos por R24. Além disso, essa diferença no efeito sobre o ciclo celular é outra evidência de que o SE- AM 3 e R24 se ligam a diferentes epitopos sobre células cancerígenas. EXEMPLO 16: CLONAGEM E SEQÜÊNCIAMENTO DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICA O mAb SEAM 3

Para investigar a base molecular para reconhecimento de antí- geno, os genes de região variável (V) de cinco mAbs anti-PS N-Pr de NmB de murino que são bactericidas para bactérias do Grupo B de N. meningitidis foram clonados e seqüenciados. Os materiais e métodos a seguir foram u- sados nesse exemplo.

Métodos e materiais

mAbs. Os mAbs anti-PS N-Pr de NmB de murino SEAM 2 (lgG3), SEAM 3 (lgG2b), SEAM 12 (lgG2a), SEAM 18 (lgG2a) são represen- tativos de cada um dos quatro grupos de especificidade antigênica fina des- critos previamente(Granoff et al.. (1998) J Immunol 160, 5028-36). SEAM 35 (lgG2a) também foi incluído porque ele exibe mais reatividade cruzada com antígenos de ácido polissiálico expressos pela linhagem de célula neuronal humana CHP-134 que não aqueles dos outros quatro mAbs SEAM. Os mAbs são bactericidas na presença de complemento e conferem proteção passiva contra bacteremia meningocócica em um modelo com rato bebê. SEAM 2 e SEAM 3 não têm atividade auto-reativa detectável com o ácido polissiálico do hospedeiro, enquanto que SEAM 12 e SEAM 18 mostram rea- tividade cruzada mínima.

ELISA de dsDNA. A ligação do mAb ao dsDNA foi medida usan- do os métodos descritos por Gilkeson et al.. (1993) J Immunol 151, 1353-64. O mAb de controle positivo anti-DNA foi obtido da QED Biosciences (San Diego, CA) e mAbs irrelevantes isotipo-equivalentes foram obtidos da Sou- thern Biotech Inc. (Birmingham, AL).

Seqüenciamento de gene V. Genes de região variável de cadei- as pesada e leve de imunoglobulina de linhagens de célula de hibridoma foram amplificados através de PCR usando iniciadores degenerados e clo- nados no vetor pGEM3zf (Promega, Madison, Wl) conforme descrito por Wang et al. (2000) J Immunol Methods 233,167-77 usando a cepa de E. coli XL-2 Blue como um hospedeiro. DNA de plasmídeo de transformantes sele- cionados sobre lâminas de LB-ampicilina foi isolado usando o Qiagen Mini Prep Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Os genes V clonados foram seqüenciados pela BioNexus (Oakland, CA).

Análise de seqüência do gene V. As seqüências de nucleotídeo do mAb foram analisadas usando IGMT/V-QUEST e da base de dados de seqüência de nucleotídeo de imunoglobulina através de unidades online na web do international ImMunoGeneTics® information system (IMGT, na inter- net a imat.cinés.fr) que foi iniciada e coordenada por Marie-Paule Lefranc (Universite Montpellier II, GNRS1 LIGM, IGH, IFR3, Montpellier, França). Ge- nes de linhagem germinativa putativa foram selecionados baseado na com- binação mais próxima entre a seqüência de linhagem germinativa no banco de dados e a seqüência do gene V clonada. Seqüências de aminoácido e gene foram comparadas com as respectivas seqüências nos bancos de da- dos foram comparadas com as respectivas seqüências nos banco de dados de seqüência não redundante GenBank usando o BLAST (Altschul et ai. (1997) Nucleic Acids Res 25, 3389-402). Além disso, genes de linhagem germinativa putativa usados por um clone de hibridoma expressando o mAb anti-PS de NmB de murino, 735 (lgG2a) foram identificados da literatura. Uma vez que apenas a seqüência de aminoácido desse mAb estava dispo- nível (Klebert et al.. 1993 Biol Chem Hoppe Seiler 374, 993-1000; Vaesen et al.. (1991) Biol Chem Hoppe Seiler 372, 451-3), o gene de linhagem germi- nativa previsto para esse mAb é baseado na combinação de seqüência de aminoácido mais próxima nos bancos de dados IGMT/V-QUEST e Gen- Bank/EMBL (Chenna et al.. (2003) Nucleic Acids Res 31, 3497-500). Tam- bém incluiu-se na análise comparativa as seqüências de gene e as atribui- ções de gene de linhagem germinativa para o mAb anti-PS de NmB 2-2-B (IgM, Mandrell et al.. (1982) J Immunol 129, 2172-8) reportada por Berry et al.. ((2005) Mol Immunol 42, 335-44).

Resultados

Análise de seqüências de ácido nucléico e aminoácido de regi- ões variáveis de polipeptídeos de cadeias pesada e leve de SEAM 3. As se- qüências de ácido nucléico e aminoácido das regiões variáveis do polipeptí- deo de cadeia pesada e do polipeptídeo de cadeia leve de SEAM 3 são pro- porcionadas na figura 51. As figuras 52 e 53 mostram as seqüências de DNA de região variável de cadeia leve e cadeia pesada de SEAM 3, respectiva- mente, com a framework (denotada, por exemplo, por FR1 -IMTG; figura 56- 58) e regiões de CDR indicadas conforme definido pelas definições do Inter- national Immunogenetics Information System (IMGT) (Lefranc et al.. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system®. Nucl. Acids Res., 2005, 33, D593-D597).

Uso de gene de região variável de mAbs anti-PS N-Pr de NmB de murino. O uso de gene de linhagem germinativa para os mAbs anti-PS N- Pr de NmB e anti-PS de NmB é comparado na tabela fornecida na figura 55. As respectivas seqüências de aminoácido são mostradas na figuras 50 e 51. O repertório da região V está restrito à relativamente poucas famílias dos genes VL ou VH altamente relacionadas. Por exemplo, SEAM 2 e SEAM 3, os quais têm diferentes especificidades antigênicas, têm seqüências de ami- noácido de VL idênticas (figura 52) e o gene de VL é da mesma família de gene (IgGKVI) que aquela que codifica os mAbs anti-PS de NmB auto- reativos, 2-2-B e 735 (figura 55). Similarmente, os genes de VL usados pelo SEAM 12 e SEAM 18, os quais têm diferentes especificidades antigênicas finas, são da mesma família (lgGKV4). As respectivas seqüências dé VH de SEAM 3 e SEAM 18 são quase idênticas uma à outra (96% de identidade) e são da mesma família de gene de linhagem germinativa (lgGHV7S3) usada para VH de SEAM 35 (figura 55). Os genes de VH para SEAM 2 e SEAM 12 são diferentes um do outro e dos outros três mAbs anti-PS N-Pr de NmB PS, mas o gene de VH de linhagem germinativa usado para SEAM 2 é relacio- nado àquele usado pelos dois mAbs anti-PS de NmB auto-reativos, 2-2-B e 735 (ambos 72% idênticos).

Os mAbs anti-PS de NmB, 2-2-B e 735, são reativos com PS de NmB, enquanto que o anti-PS N Pr de NmB SEAM 2 não é. A homologia íntima das respectivas seqüências de aminoácido V de cadeias pesada e leve entre SEAM 2 e os mAbs auto-reativos 2-2-B e 735 (VH 70%, VL 75%) é, portanto, de interesse particular. A diferença mais marcante entre as duas seqüências está na cadeia pesada (H-CDR3), onde SEAM 2 consiste dos 4 aminoácidos mínimos, dois dos quais são glicina, comparado com um com- primento de 8 aminoácidos no mAb 735.

Os genes de VL e VH do mAb anti-PS de NmB 2-2-B são inalte- rados (100% idênticos) quando comparado com seus genes de linhagem germinativa putativa (figura 55). Similarmente, a seqüência de aminoácido da VL expressa do mAb anti-PS de NmB 735 é >99% idêntica àquela do ge- ne de linhagem germinativa atribuído. Em contraste, os mAbs anti-PS N-Pr de NmB têm um maior percentual de mutações quando comparado com as respectivas seqüências de linhagem germinativa (os genes expressos são 89% a 95% idênticos às seqüências de linhagem germinativa, figura 55). Também, todos os cinco mAbs anti-PS N-Pr de NmB contêm um ou mais resíduos de arginina em H-CD3, os quais são codificados através de edição da junção D-J. Nenhum dos dois mAbs anti-PS de NmB contém arginina em H-CDR3.

Claims

1. Composição farmacêutica para inibir o crescimento de uma célula cancerígena em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma quantidade eficaz de um anticorpo que liga especificamente um epítopo de ácido siálico de-N-acetilado (deNac SA), incluindo conjugados, e excipientes farmacêuticos.

2. Composição farmacêutica para fornecer anticorpos a uma cé- lula cancerígena em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que compreen- de uma quantidade eficaz de um antígeno de ácido siálico de-N-acetilado (deNac SA) em associação com adjuvante (s) farmacêutico.

3. Uso de um anticorpo que liga especificamente um epítopo de ácido siálico de-N-acetilado (deNac SA) a uma superfície extracelularmente acessível de uma célula cancerígena presente em um indivíduo, caracteriza- do peio fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir o crescimento de uma célula cancerígena no indivíduo, facilitando a redução na viabilidade das células cancerígenas ligadas pelo anticorpo.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o epítopo deNac SA está presente na superfície da célula canceríge- na durante a divisão celular.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o câncer é um melanoma ou uma leucemia.

6. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o câncer é um neuroblastoma.

7. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por infusão ou por injeção local.

8. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita administração precede a intervenção cirúrgica de modo a re- mover as células cancerígenas.

9. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita administração é realizada na hora ou após a intervenção cirúr- gica para remover as células cancerígenas.

10. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: administração ao indivíduo de pelo menos uma dentre uma qui- mioterapia para o câncer ou uma radioterapia.

11. Uso de um anticorpo que liga especificamente um antígeno reativo de SEAM-3 a uma superfície extracelularmente acessível de uma célula cancerígena presente em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir o cresci- mento de uma célula cancerígena no indivíduo, facilitando a redução de via- bilidade das células cancerígenas ligadas pelo anticorpo.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o antígeno reativo de SEAM 3 está presente na superfície da célula cancerígena durante a divisão celular.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é um meianoma ou uma leucemia..

14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é um neuroblastoma.

15. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por infusão ou por injeção local.

16. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dita administração precede é realizada na hora ou após a in- tervenção cirúrgica para remover as células cancerígenas.

17. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, administração ao indivíduo de pelo menos uma dentre uma quimioterapia para o câncer ou radioterapia.

18. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal SEAM 3 (Depósito ATCC número HB-12170).

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal SEAM 3 é isolado pelo método de: incubação de uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal SEAM 3 em uma solução contendo alta concentração de sal, a incubação sendo realizada sob condições apropriadas para facilitar a sepa- ração das moléculas carregadas de mAb SEAM 3 na solução; e isolamento do mAb SEAM 3 da solução.

20. Uso de um antígeno de ácido siálico de-N-acetilado (deNac SA) e um adjuvante, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para fornecer anticorpos a uma célula cance- rígena em um indivíduo que sofre ou corre o risco de sofrer de câncer tipifi- cado por um antígeno de ácido siálico de-N-acetilado (deNac SA), promo- vendo a produção de um anticorpo que liga especificamente um epítopo de deNac SA a uma superfície extracelularmente acessível de uma célula can- cerígena.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o câncer é um melanoma ou um linfoma.

22. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o câncer é um neuroblastoma.

23. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o antígeno deNac SA da composição imunogênica é preparado por tratamento com exosialidase do antígeno deNAc SA.

24. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o antígeno deNac SA é um conjugado do antígeno deNAc SA.

25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o conjugado de antígeno deNAc SA é um conjugado de antígeno deNAc AS ligado a propionila ou acetila.

26. Método para detecção de um tumor em um indivíduo, carac- terizado pelo fato de que compreende: contato de uma amostra biológica obtida de um indivíduo cor- rendo o risco de sofrer de câncer com um anticorpo que liga especificamente um epítopo de ácido siálico de-N-acetilado (deNac SA), o contato sendo sob condições apropriadas para ligação específica do anticorpo a um epítopo de deNac SA na amostra biológica; onde a presença ou ausência de ligação do anticorpo indica a presença ou ausência das células cancerígenas possuindo um epítopo de- Nac SA de superfície celular no indivíduo.

27. Método para detectar um tumor em um indivíduo, caracteri- zado pelo fato de que compreende: contato de uma amostra biológica obtida de um indivíduo cor- rendo o risco de sofrer de câncer com um anticorpo que liga especificamente um antígeno reativo SEAM 3, o contato sendo sob condições apropriadas para ligação específica do anticorpo a um antígeno reativo SEAM 3 na a - mostra biológica; onde a presença ou ausência de ligação do anticorpo indica a presença ou ausência das células cancerígenas possuindo um antígeno rea- tivo SEAM 3 de superfície celular no indivíduo.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe- lo fato de que o anticorpo é SEAM 3 (Depósito ATCC número HB-12170).

29. Método para produção de um derivado de polissacarídeo (PS), caracterizado pelo fato de que compreende: cultivo de uma bactéria Escherichia coli K1 em um meio de cres- cimento compreendendo uma N-acilmanosamina e uma manosamina prote- gida com amina, onde a bactéria é deficiente na produção da cápsula de polissacarídeo na ausência de manosamina suplementar; onde o dito cultivo provê a produção de um derivado de PS pro- tegido com amina possuindo um grupo de proteção amina e um grupo N- acilado.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pe- lo fato de que compreende, adicionalmente: tratamento do derivado de PS protegido com amina sob condi- ções de modo a remover o grupo de proteção de amina e acoplar o resíduo desprotegido a um veículo de proteína, de modo a produzir um derivado de PS conjugado.

31. Método para produção de um antígeno deNAc SA, caracteri- zado pelo fato de que compreende: cultivo de uma célula de mamífero em um meio de crescimento compreendendo N-acil-manosamina e manosamina protegida com amina; onde o dito cultivo provê a produção de um antígeno deNAc SA protegido com amina possuindo um grupo de proteção de amina e um grupo N-acilado na superfície da célula de mamífero.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pe- lo fato de que compreende, adicionalmente: tratamento do antígeno deNac SA protegido com amina sob condições de modo a remover o grupo de proteção de amina e acoplar o resíduo desprotegido a um veículo de proteína para produzir um antígeno deNAc SA conjugado.

33. Método para produção de uma composição imunogênica, caracterizado pelo fato de que compreende: contato de um composição compreendendo um antígeno de áci- do siálico de-N-acetilado (deNac SA) com uma exosialidase, o contato sendo feito sob condições suficientes para prover contaminantes do polímero do ácido siálico N-acetilado na composição; onde o contato produz uma composição enriquecida com antí- geno deNac SA.

34. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o antígeno deNAc SA tratado pelo método como definido na reivindicação 33.

35. Método para isolar um anticorpo monoclonal SEAM 3, carac- terizado pelo fato de que compreende: incubação de uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal SEAM 3 em uma solução com alta concentração de sal, a incu- bação sendo realizada sob condições apropriadas para facilitar a separação das moléculas carregadas de mAb SEAM 3 na solução; e isolamento do mAb SEAM 3 da solução.

36. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal SEAM 3 isolado e um veículo farmaceuticamente acei- tável, onde o anticorpo monoclonal SEAM 3 isolado é isolado pelo método como definido na reivindicação 35.

37. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma seqüência nucleotídica codificando um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo: i) resíduos de aminoácido 24 a 39, ii) resíduos de aminoácido 55 a 61, e iii) resíduos de aminoácido 94 a 100, de uma região variável de um polipeptídeo SEAM 3 de cadeia leve.

38. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácido da região variável de um polipeptídeo de SEAM 3 de cadeia leve.

39. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinu- cleotídeo isolado como definido na reivindicação 37.

40. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que contém o polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação 37.

41. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma seqüência nucleotídica codificando um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo: i) resíduos de aminoácido 26 a 35, ii) resíduos de aminoácido 50 a 66, e iii) resíduos de aminoácido 101 a 108, de uma região variável de um polipeptídeo de cadeia pesada SEAM 3.

42. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácido da região variável de um polipeptídeo SEAM 3 de cadeia pesada.

43. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinu- cleotídeo isolado como definido na reivindicação 41.

44. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que contém o polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação 41.

45. Conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: um anticorpo compreendendo porção de ligação de antígeno de um anticorpo monoclonal SEAM 3 (Depósito ATCC número HB-12170), e uma fração de ligação covalente; onde a fração de ligação covalente é uma fração de polietileno glicol, um medicamento anticâncer ou uma fração de ligação de antígeno de um anticorpo.

46. Anticorpo como definido na reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal SEAM 3.