BRPI0608794A2 - processes and compositions for the evaluation of lung function and disorders - Google Patents
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Abstract
PROCESSOS E COMPOSIçõES PARA A AVALIAçãO DA FUNçãO E DISTúRBIOS PULMONARES. A presente invenção refere-se a processos para a avaliação do risco de desenvolvimento de doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema em fumantes e não-fumantes utilizando a análise de polimorfismos genéticos. A presente invenção também se refere ao uso de polimorfismos genéticos na avaliação do risco de um indivíduo de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR FUNCTION ASSESSMENT AND PULMONARY DISORDERS. The present invention relates to methods for assessing the risk of developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema in smokers and non-smokers using genetic polymorphism analysis. The present invention also relates to the use of genetic polymorphisms in the assessment of an individual's risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOS E COMPOSIÇÕES PARA A AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO E DISTÚRBIOS PULMONARES".Report of the Invention Patent for "PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR THE EVALUATION OF FUNCTION AND PULMONARY DISORDERS".
Campo da InvençãoField of the Invention
A presente invenção está direcionada a métodos para a avalia-The present invention is directed to methods for the evaluation of
ção da função e/ou distúrbios pulmonares e, em particular, para a avaliação do risco do desenvolvimento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e enfisema em fumantes e não-fumantes utilizando a análise de polimorfis-mos genéticos e da expressão gênica alterada. A presente invenção também está direcionada ao uso de polimorfismos genéticos na avaliação do risco de um indivíduo de desenvolver COPD e enfisema. Antecedentes da Invençãopulmonary function and / or disorders and, in particular, to assess the risk of developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and emphysema in smokers and non-smokers using analysis of genetic polymorphisms and altered gene expression. The present invention is also directed to the use of genetic polymorphisms in assessing an individual's risk of developing COPD and emphysema. Background of the Invention
A doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é a A- causa principal de morte nos países desenvolvidos e uma causa principal para read-missão em hospitais em todo o mundo. É caracterizada pela inflamação insi-diosa e destruição pulmonar progressiva. Se torna clinicamente evidente depois que a falta de ar por esforço é observada por fumantes afetados quando 50% ou mais da função pulmonar foram perdidos irreversivelmente. Esta perda da função pulmonar é detectada clinicamente através de vazões expiratórias reduzidas (especificamente o volume expiratório forçado em um segundo ou FEV1). Mais de 95% da COPD são atribuídos ao fumo de cigarros ainda apenas ou em torno de 20% de fumantes desenvolvem COPD (fumante susceptível). Os estudos mostram de forma surpreendente que a dose de fumo é responsável por apenas aproximadamente 16% da função pulmonar prejudicada. Um número de estudos com famílias que compara a concordância em irmãos (gêmeos ou não-gêmeos) mostra de forma coerente uma forte tendência familiar e a pesquisa de genes de susceptibilidade à doença COPD (ou que modificam a doença) está em andamento.Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is the leading cause of death in developed countries and a leading cause for readmission in hospitals worldwide. It is characterized by insidious inflammation and progressive pulmonary destruction. It becomes clinically evident after breathlessness is observed by affected smokers when 50% or more of lung function has been irreversibly lost. This loss of lung function is clinically detected through reduced expiratory flow rates (specifically forced expiratory volume in one second or FEV1). Over 95% of COPD is attributed to cigarette smoking still only or around 20% of smokers develop COPD (susceptible smoker). Studies surprisingly show that the smoking dose accounts for only about 16% of impaired lung function. A number of family studies comparing concordance in siblings (twins or non-twins) consistently show a strong family tendency and research into disease-susceptible COPD (or disease-modifying) genes is underway.
Apesar dos avanços no tratamento de doença das vias aéreas, as terapias atuais não alteram significativamente o histórico natural da COPD com perda progressiva da função pulmonar causando falência respiratória e morte. Embora tenha sido mostrado que cessar o ato de fumar reduzeste declínio na função pulmonar, se isto não for atingido dentro dos primeiros 20 anos ou aproximadamente de fumo para os fumantes susceptíveis, a perda é considerável e os sintomas de piora de falta de ar não podem ser evitados. Os estudos de cessação do fumo indicam que as técnicas para ajudar os fumantes a pararem possuem sucesso limitado. Análoga à descoberta do colesterol no soro e sua ligação com a doença da artéria coronaria-na, há uma necessidade de melhor entender os fatores que contribuem para a COPD de forma que testes que identifiquem fumantes em risco possam ser desenvolvidos e que novos tratamentos possam ser descobertos para reduzir os efeitos adversos do fumo.Despite advances in the treatment of airway disease, current therapies do not significantly alter the natural history of COPD with progressive loss of lung function causing respiratory failure and death. Although smoking cessation has been shown to reduce this decline in lung function, if this is not achieved within the first 20 years or so of smoking for susceptible smokers, the loss is considerable and symptoms of worsening breathlessness cannot be avoided. Smoking cessation studies indicate that techniques to help smokers quit have limited success. Analogous to the discovery of serum cholesterol and its link with coronary artery disease, there is a need to better understand the factors that contribute to COPD so that tests identifying at-risk smokers can be developed and new treatments can be developed. discovered to reduce the adverse effects of smoking.
Um número de estudos epidemiológicos mostrou de forma coerente que a doses de exposição de 20 ou mais maços-ano, a distribuição na função pulmonar tende em direção à trimodalidade com uma proporção de fumantes mantendo uma função pulmonar normal (fumantes resistentes) até mesmo após 60+ maços-ano, uma proporção exibindo reduções modestas na função pulmonar que nunca desenvolveu sintomas e uma proporção que exibe uma perda acelerada na função pulmonar que invariavelmente desenvolve a COPD. Isto sugere que entre os fumantes há 3 populações, aquela resistente ao desenvolvimento da COPD, aquela com risco modesto e aquela com alto risco (denominada de fumantes susceptíveis).A number of epidemiological studies have consistently shown that at exposure doses of 20 or more pack-years, the distribution in lung function tends toward trimodality with a proportion of smokers maintaining normal lung function (resistant smokers) even after 60 years. + pack-years, a proportion showing modest reductions in lung function that never developed symptoms, and a proportion showing an accelerated loss in lung function that invariably develops COPD. This suggests that among smokers there are 3 populations, one resistant to the development of COPD, one at modest risk and one at high risk (called susceptible smokers).
A COPD é uma doença heterogênea que abrange, em graus variáveis, enfisema e bronquite crônica que se desenvolvem como parte de um processo de remodelamento após o dano inflamatório proveniente da exposição ao fumo de tabaco crônico e a outros poluentes do ar. É provável que muitos genes estejam envolvidos no desenvolvimento da COPD.COPD is a heterogeneous disease that encompasses, to varying degrees, emphysema and chronic bronchitis that develop as part of a remodeling process following inflammatory damage from exposure to chronic tobacco smoke and other air pollutants. It is likely that many genes are involved in the development of COPD.
Até hoje, foi identificado um número de biomarcadores úteis no diagnóstico e na avaliação da propensão ao desenvolvimento de vários distúrbios pulmonares. Estes incluem, por exemplo, polimorfismos de um único nucleotídeo que incluem os seguintes: A-82G no promotor do gene que codifica a elastase de macrófagos humanos (MMP12); T->C dentro do códon 10 do gene que codifica o fator beta de crescimento transformante (TGFp); C+760G do gene que codifica a superóxido dismutase 3 (SOD3); T-1296Cdentro do promotor do gene que codifica o inibidor da metaloproteinase 3 (TIMP3); e polimorfismos em desequilíbrio de ligação (LD) com estes poli-morfismos, como descrito no Pedido de Patente Internacional PCT PCT/NZ02/00106 (publicado como WO 02/099134 e incorporado aqui em sua totalidade).To date, a number of useful biomarkers have been identified in the diagnosis and assessment of the propensity to develop various lung disorders. These include, for example, single nucleotide polymorphisms that include the following: A-82G in the promoter of the human macrophage elastase (MMP12) encoding gene; T-> C within codon 10 of the gene encoding transforming growth factor beta (TGFβ); C + 760G of the gene encoding superoxide dismutase 3 (SOD3); T-1296C within the promoter of the gene encoding metalloproteinase 3 inhibitor (TIMP3); and linkage disequilibrium (LD) polymorphisms with these polymorphisms, as described in PCT International Patent Application PCT / NZ02 / 00106 (published as WO 02/099134 and incorporated herein in its entirety).
Seria desejável e vantajoso ter biomarcadores adicionais que pudessem ser utilizados para avaliar o risco de um indivíduo de desenvolver distúrbios pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e o enfisema ou um risco de desenvolver função pulmonar prejudicada relacionada com COPD/enfisema, particularmente se o indivíduo for >v um fumante.It would be desirable and advantageous to have additional biomarkers that could be used to assess an individual's risk of developing lung disorders such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and emphysema or a risk of developing COPD / emphysema-related impaired lung function, particularly if the individual is> v a smoker.
É primariamente a tais biomarcadores e ao uso dos mesmos nos métodos para avaliar o risco de desenvolvimento de tais distúrbios que a presente invenção está direcionada.It is primarily such biomarkers and their use in methods for assessing the risk of developing such disorders that the present invention is directed to.
Sumário da InvençãoSummary of the Invention
A presente invenção se baseia primariamente na descoberta de que certos polimorfismos são encontrados mais freqüentemente em indivíduos com COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema que os indivíduos de controle. A análise destes polimorfismos descreve uma associação entre genótipos e o risco do indivíduo de desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.The present invention is based primarily on the discovery that certain polymorphisms are found more frequently in individuals with COPD, emphysema, or both COPD and emphysema than control subjects. Analysis of these polymorphisms describes an association between genotypes and the individual's risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Assim, de acordo com um aspecto é fornecido um método de determinação do risco de um indivíduo de desenvolver uma ou mais doenças pulmonares obstrutivas que compreende a análise de uma amostra do dito indivíduo em relação à presença ou à ausência de um ou mais polimorfismos selecionados do grupo que consiste em: -765 C/G no promotor do gene que codifica a Ciclooxigenase 2 (COX2); 105 C/A no gene que codifica a Interleucina18 (IL18); -133 G/C no promotor do gene que codifica a IL18;Thus, according to one aspect there is provided a method of determining an individual's risk of developing one or more obstructive pulmonary diseases comprising analyzing a sample of said individual for the presence or absence of one or more selected polymorphisms of the group consisting of: -765 C / G in the promoter of the gene encoding Cyclooxygenase 2 (COX2); 105 C / A in the gene encoding Interleukin18 (IL18); -133 G / C on the promoter of the IL18 encoding gene;
-675 4G/5G no promotor do gene que codifica o Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (PAI-1);-675 4G / 5G on the promoter of the gene encoding Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1);
874 A/T no gene que codifica o Interferon-y (IFN-y);+489 G/A no gene que codifica o Fator de Necrose de Tumor a (TNFa); C89Y A/G no gene que codifica SMAD3;874 A / T in the gene encoding Interferon-y (IFN-y) + 489 G / A in the gene encoding Tumor Necrosis Factor a (TNFα); C89Y A / G in the gene encoding SMAD3;
E 469 K A/G no gene que codifica a molécula de Adesão Intracelular 1 (I-CAM1);E 469 K A / G in the gene encoding the Intracellular Adhesion molecule 1 (I-CAM1);
Gly 881 Arg G/C no gene que codifica a Caspase (NOD2);Gly 881 Arg G / C in the Caspase (NOD2) encoding gene;
161 G/A no gene que codifica a lectina 2 de ligação à Manose (MBL2); -1903 G/A no gene que codifica a Quimase 1 (CMA1); Arg 197 Gln G/A no gene que codifica a N-Acetil transferase 2 (NAT2); -366 G/A no gene que codifica a 5 Lipo-oxigenase (ALOX5);161 G / A in the gene encoding Mannose binding lectin 2 (MBL2); -1903 G / A in the chimase 1 encoding gene (CMA1); Arg 197 Gln G / A in the gene encoding N-Acetyl transferase 2 (NAT2); -366 G / A in the gene encoding 5 Lipooxygenase (ALOX5);
HOM T2437C no gene que codifica a Proteína do Choque Térmico 70 (HSP 70);HOM T2437C in the gene encoding Heat Shock Protein 70 (HSP 70);
+13924 T/A no gene que codifica o Canal de Cloreto ativado por Cálcio 1 (CLCA1);+13924 T / A in the gene encoding Calcium Activated Chloride Channel 1 (CLCA1);
-159 C/T no gene que codifica o antígeno de diferenciação de Monócito CD-15 14(CD-14);-159 C / T in the gene encoding the CD-15 14 monocyte differentiation antigen (CD-14);
éxon 1 +49 C/T no gene que codifica a Elafina; ouexon 1 +49 C / T in the gene encoding Elafin; or
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica a Metaloproteinase de Matriz 1 (MMP1), com referência apenas ao alelo 1G;-1607 1G / 2G in the promoter of the Matrix 1 Metalloproteinase (MMP1) encoding gene, with reference only to the 1G allele;
em que a presença ou a ausência de um ou mais dos ditos polimorfismos é indicativa do risco de um indivíduo de desenvolver uma ou mais doenças . pulmonares obstrutivas tradas do grupo que consiste em doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfisema ou ambos COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.wherein the presence or absence of one or more of said polymorphisms is indicative of an individual's risk of developing one or more diseases. obstructive pulmonary arteries in the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
O um ou mais polimorfismos podem ser detectados diretamente ou através da detecção de um ou mais polimorfismos que estão em desequilíbrio de ligação com o dito um ou mais polimorfismos.The one or more polymorphisms may be detected directly or by detecting one or more polymorphisms that are in disequilibrium of binding with said one or more polymorphisms.
O desequilíbrio de ligação (LD) é um fenômeno em genética através do qual duas ou mais mutações ou polimorfismos estão em uma proximidade genética tal que são co-herdados. Isto significa que na genotipagem, a detecção de um polimorfismo como presente infere a presença do outro. (Reich DE e outros; Linkage disequilibrium in the human genome, Na-ture 2001, 411: 199-204.)O método pode compreender adicionalmente a análise de umaLinkage disequilibrium (LD) is a phenomenon in genetics whereby two or more mutations or polymorphisms are in such close proximity that they are co-inherited. This means that in genotyping, detecting one polymorphism as present infers the presence of the other. (Reich DE et al; Linkage disequilibrium in the human genome, Nature 2001, 411: 199-204.) The method may further comprise the analysis of a
amostra do dito indivíduo em relação à presença de um ou mais polimorfismos adicionais selecionados do grupo que consiste em:sample of said individual in relation to the presence of one or more additional polymorphisms selected from the group consisting of:
16Arg/Gly no gene que codifica o Receptor Adrenérgico (32 (ADBR);16Arg / Gly in the gene encoding the Adrenergic Receptor (32 (ADBR);
130 Arg/Gln (G/A) no gene que codifica a Interleucinal3 (IL13);130 Arg / Gln (G / A) in the gene encoding Interleucinal3 (IL13);
298 Asp/GIu (T/G) no gene que codifica a Oxido Nítrico Sintase 3 (NOS3);298 Asp / GIu (T / G) in the gene encoding Nitric Oxide Synthase 3 (NOS3);
He 105 Vai (A/G) no gene que codifica a Glutationa S Transferase P (GST-P);He 105 Val (A / G) in the gene encoding Glutathione S Transferase P (GST-P);
Glu 416 Asp (T/G) no gene que codifica a proteína de ligação com a Vitamina D (VDBP);Glu 416 Asp (T / G) in the gene encoding Vitamin D binding protein (VDBP);
Lys 420 Thr (A/C) no gene que codifica VDBP;Lys 420 Thr (A / C) in the gene encoding VDBP;
-1055 C/T no promotor do gene que codifica IL13;-1055 C / T on the promoter of the gene encoding IL13;
-308 G/A no promotor do gene que codifica TNFoc;-308 G / A on the promoter of the gene encoding TNFoc;
-511 A/G no promotor do gene que codifica a Interleucina 1B (IL1B);-511 A / G on the promoter of the gene encoding Interleukin 1B (IL1B);
Tyr 113 His T/C no gene que codifica a epóxido hidrolase Microssomal (MEH);Tyr 113 His T / C in the gene encoding Microsomal epoxide hydrolase (MEH);
His139 Arg G/A no gene que codifica MEH;His139 Arg G / A in the gene encoding MEH;
Gln 27 Glu C/G no gene que codifica ADBR;Gln 27 Glu C / G in the gene encoding ADBR;
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica a Metaloproteinase de Matriz 1 (MMP1) com referência apenas ao alelo 2G;-1607 1G / 2G in the promoter of the Matrix 1 Metalloproteinase (MMP1) encoding gene with reference to the 2G allele only;
-1562 C/T no promotor do gene que codifica a Metaloproteinase 9 (MMP9); M1 (GSTM1) nulo no gene que codifica a Glutationa S Transferase 1 (GST-1);-1562 C / T on the promoter of the gene encoding Metalloproteinase 9 (MMP9); M1 (GSTM1) null in the gene encoding Glutathione S Transferase 1 (GST-1);
1237 G/A na região a 3' do gene que codifica a a1-antitripsina;1237 G / A in the 3 'region of the α1-antitrypsin coding gene;
-82 A/G no promotor do gene que codifica MMP12;-82 A / G on the promoter of the gene encoding MMP12;
T-^C dentro do códon 10 do gene que codifica TGFB; 760 C/G no gene que codifica SOD3;T-C within codon 10 of the gene encoding TGFB; 760 C / G in the gene encoding SOD3;
-1296 T/C dentro do promotor do gene que codifica TIMP3;-1296 T / C within the promoter of the TIMP3 encoding gene;
ou a mutação S no gene que codifica a a1 -antitripsina.or the S mutation in the gene encoding α1-antitrypsin.
Novamente, a detecção do um ou mais polimorfismos adicionais pode ser realizada diretamente ou através da detecção dos polimorfismos em desequilíbrio de ligação com o um ou mais polimorfismos adicionais.Again, detection of one or more additional polymorphisms may be performed either directly or by detecting polymorphisms in binding disequilibrium with one or more additional polymorphisms.
A presença de um ou mais polimorfismos selecionados do grupoque consiste em:The presence of one or more polymorphisms selected from the group consisting of:
genótipo -765 CC ou CG no promotor do gene que codifica COX2;-765 CC or CG genotype in the promoter of the COX2 encoding gene;
genótipo 130 Arg/Gln AA no gene que codifica IL13;130 Arg / Gln AA genotype in the gene encoding IL13;
genótipo 298 Asp/GIu TT no gene que codifica NOS3;298 Asp / GIu TT genotype in the gene encoding NOS3;
genótipo Lys 420 Thr AA ou AC no gene que codifica VDBP;Lys 420 Thr AA or AC genotype in the gene encoding VDBP;
genótipo Glu 416 Asp TT ou TG no gene que codifica VDBP;Glu 416 Asp TT or TG genotype in the gene encoding VDBP;
genótipo Me 105 Vai AA no gene que codifica GSTP-1;Me 105 Vai AA genotype in the gene encoding GSTP-1;
genótipo MS no-gene-que codifica a a1 -antitripsina;no-gene-MS coding for α1-antitrypsin;
genótipo +489 GG no gene que codifica TNFoc;+489 GG genotype in the gene encoding TNFoc;
genótipo -308 GG no gene que codifica TNFa;-308 GG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo C89Y AA ou AG no gene que codifica SMAD3;C89Y AA or AG genotype in the gene encoding SMAD3;
genótipo 161 GG no gene que codifica MBL2;161 GG genotype in the gene encoding MBL2;
genótipo -1903 AA no gene que codifica CMA1;-1903 AA genotype in the gene encoding CMA1;
genótipo Arg 197 Gln AA no gene que codifica NAT2;Arg 197 Gln AA genotype in the gene encoding NAT2;
genótipo His 139 Arg GG no gene que codifica MEH;His 139 Arg GG genotype in the gene encoding MEH;
genótipo -366 AA ou AG no gene que codifica ALOX5;-366 AA or AG genotype in the gene encoding ALOX5;
genótipo HOM T2437C TT no gene que codifica HSP 70;HOM T2437C TT genotype in the gene encoding HSP 70;
éxon 1 +49 CT ou o genótipo TT no gene que codifica a Elafina;exon 1 +49 CT or the TT genotype in the gene encoding Elafin;
genótipo Gln 27 Glu GG no gene que codifica ADBR; ouGln 27 Glu GG genotype in the gene encoding ADBR; or
genótipo -1607 1G1G ou 1G2G no promotor do gene que codifica MMP1;-1607 genotype 1G1G or 1G2G in the promoter of the gene encoding MMP1;
pode ser indicativa de um risco reduzido de desenvolver COPD, enfisema outanto COPD quanto enfisema.may be indicative of a reduced risk of developing COPD, emphysema or COPD as well as emphysema.
A presença de um ou mais polimorfismos selecionados do grupoThe presence of one or more polymorphisms selected from the group
que consiste em:that consists of:
genótipo 105 AA no gene que codifica IL18;105 AA genotype in the gene encoding IL18;
genótipo -133 CC no promotor do gene que codifica IL18;-133 CC genotype in the promoter of the IL18 encoding gene;
genótipo -675 5G5G no promotor do gene que codifica PAI-1;-675 5G5G genotype in the promoter of the PAI-1 encoding gene;
genótipo -1055 TT no promotor do gene que codifica IL13;-1055 TT genotype in the promoter of the gene encoding IL13;
genótipo 874 TT no gene que codifica IFN-y;874 TT genotype in the gene encoding IFN-γ;
genótipo +489 AA ou AG no gene que codifica TNFa;+489 AA or AG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo -308 AA ou AG no gene que codifica TNFa;-308 AA or AG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo C89Y GG no gene que codifica SMAD3;genótipo E469K GG no gene que codifica ICAM1;C89Y GG genotype in the gene encoding SMAD3, genotype E469K GG in the gene encoding ICAM1;
genótipo Gly 881 Arg GC ou CC no gene que codifica NOD2;Gly 881 Arg GC or CC genotype in the gene encoding NOD2;
genótipo -511 GG no gene que codifica IL1B;-511 GG genotype in the gene encoding IL1B;
genótipo Tyr 113 His TT no gene que codifica MEH;Tyr 113 His TT genotype in the gene encoding MEH;
genótipo -366 GG no gene que codifica ALOX5;-366 GG genotype in the gene encoding ALOX5;
genótipo HOM T2437C CC ou CT no gene que codifica HSP 70;HOM T2437C CC or CT genotype in the gene encoding HSP 70;
genótipo +13924 AA no gene que codifica CLCA1; ou+13924 AA genotype in the gene encoding CLCA1; or
genótipo-159 CC no gene que codifica CD-14;159 CC genotype in the gene encoding CD-14;
pode ser indicativa de um maior risco de desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.may indicate an increased risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Os métodos da invenção são particularmente úteis em fumantes (tanto atuais como ex fumantes).The methods of the invention are particularly useful in smokers (both current and former smokers).
Será considerado que os métodos da invenção identificam duas categorias de polimorfismos - a saber aquelas associadas a um risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema (que podem ser denominadas de "polimorfismos protetores") e aquelas associadas a um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema (que podem ser denominadas de "polimorfismos de susceptibilidade").It will be appreciated that the methods of the invention identify two categories of polymorphisms - namely those associated with a reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema (which may be termed "protective polymorphisms") and those associated with a higher risk. development of COPD, emphysema or both COPD and emphysema (which may be called "susceptibility polymorphisms").
Portanto, a presente invenção fornece ainda um método de avaliação do risco de um indivíduo de desenvolver doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, o dito método compreendendo:Therefore, the present invention further provides a method of assessing an individual's risk of developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema, said method comprising:
a determinação da presença ou da ausência de pelo menos um polimorfismo protetor associado com o risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema; edetermining the presence or absence of at least one protective polymorphism associated with the reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema; and
na ausência de pelo menos um polimorfismo protetor, determinando a presença ou a ausência de pelo menos um polimorfismo de susceptibilidade associado a um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema;in the absence of at least one protective polymorphism, determining the presence or absence of at least one susceptibility polymorphism associated with a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema;
em que a presença de um ou mais dos ditos polimorfismos protetores é indicativa de um risco reduzido de desenvolvimento de COPD, en-fisema ou tanto COPD quanto enfisema e a ausência de pelo menos um po-wherein the presence of one or more of said protective polymorphisms is indicative of a reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and the absence of at least one
limorfismo protetor em combinação com a presença de pelo menos um poli-protective limorphism in combination with the presence of at least one
morfismo de susceptibilidade é indicativa de um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.susceptibility morphism is indicative of a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Preferencialmente, o dito pelo menos um polimorfismo protetor é selecionado do grupo que consiste em:Preferably said at least one protective polymorphism is selected from the group consisting of:
-765 C no promotor do gene que codifica COX2;-765 C on the promoter of the COX2 encoding gene;
-130 Arg/Gln A no gene que codifica IL13;-130 Arg / Gln A in the gene encoding IL13;
298 Asp/GIu T no gene que codifica NOS3;298 Asp / GIu T in the gene encoding NOS3;
Lys 420 Thr A no gene que codifica VDBP;Lys 420 Thr A in the gene encoding VDBP;
Glu 416 Asp T no gene que codifica VDBP;Glu 416 Asp T in the gene encoding VDBP;
lie 105 Vai A no gene que codifica GSTP-1;Ile 105 Val A in the gene encoding GSTP-1;
a mutação S no gene que codifica a a1-antitripsina;the S mutation in the α1-antitrypsin coding gene;
+489 G no gene que codifica TNFoc;+489 G in the gene encoding TNFoc;
-308 G no gene que codifica TNFoc;-308 G in the gene encoding TNFoc;
C89Y A no gene que codifica SMAD3;C89Y A in the gene encoding SMAD3;
161 G no gene que codifica MBL2;161 G in the gene encoding MBL2;
-1903 A no gene que codifica CMA1;-1903 A in the gene encoding CMA1;
Arg 197 Gln A no gene que codifica NAT2;Arg 197 Gln A in the gene encoding NAT2;
His 139 Arg G no gene que codifica MEH;His 139 Arg G in the gene encoding MEH;
-366 A no gene que codifica ALOX5;-366A in the gene encoding ALOX5;
HOM 2437 T no gene que codifica HSP 70;HOM 2437 T in the gene encoding HSP 70;
éxon 1 +49 T no gene que codifica a Elafina;exon 1 + 49 T in the gene encoding Elafin;
Gln 27 Glu G no gene que codifica ADBR; ouGln 27 Glu G in the gene encoding ADBR; or
-1607 1G no promotor do gene que codifica MMP1.-1607 1G in the promoter of the gene encoding MMP1.
Em uma outra modalidade, o dito pelo menos um polimorfismoIn another embodiment, said at least one polymorphism
protetor é um genótipo selecionado do grupo que consiste no:Protector is a genotype selected from the group consisting of:
genótipo -765 CC ou CG no promotor do gene que codifica COX2;-765 CC or CG genotype in the promoter of the COX2 encoding gene;
genótipo 130 Arg/Gln AA no gene que codifica IL13;130 Arg / Gln AA genotype in the gene encoding IL13;
genótipo 298 Asp/GIu TT no gene que codifica NOS3;298 Asp / GIu TT genotype in the gene encoding NOS3;
genótipo Lys 420 Thr AA ou AC no gene que codifica VDBP;Lys 420 Thr AA or AC genotype in the gene encoding VDBP;
genótipo Glu 416 Asp TT ou TG no gene que codifica VDBP;genótipo Ne 105 Vai AA no gene que codifica GSTP-1;Glu 416 Asp TT or TG genotype in the gene encoding VDBP, genotype Ne 105 Vai AA in the gene encoding GSTP-1;
genótipo MS no gene que codifica a oc1-antitripsina;MS genotype in the gene encoding oc1-antitrypsin;
genótipo +489 GG no gene que codifica TNFa;+489 GG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo -308 GG no gene que codifica TNFa;-308 GG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo C89Y AA ou AG no gene que codifica SMAD3;C89Y AA or AG genotype in the gene encoding SMAD3;
genótipo 161 GG no gene que codifica MBL2;161 GG genotype in the gene encoding MBL2;
genótipo -1903 AA no gene que codifica CMA1;-1903 AA genotype in the gene encoding CMA1;
-genótipo Arg 197 Gln AA no gene que codifica NAT2;- Arg 197 Gln AA genotype in the gene encoding NAT2;
genótipo His 139 Arg GG no gene que codifica MEH;His 139 Arg GG genotype in the gene encoding MEH;
genótipo -366 AA ou AG no gene que codifica ALOX5;-366 AA or AG genotype in the gene encoding ALOX5;
genótipo HOM T2437C TT no gene que codifica HSP 70;HOM T2437C TT genotype in the gene encoding HSP 70;
éxon 1 +49 CT ou TT genótipo no gene que codifica a Elafina;exon 1 +49 CT or TT genotype in the gene encoding Elafin;
o genótipo Gln 27 Glu GG no gene que codifica ADBR; outhe Gln 27 Glu GG genotype in the gene encoding ADBR; or
o genótipo -1607 1G1G ou 1G2G no promotor do gene que codifica MMP1.the -1607 1G1G or 1G2G genotype in the promoter of the gene encoding MMP1.
Opcionalmente, o dito método compreende a etapa adicional dedeterminação da presença ou da ausência de pelo menos um polimorfismoprotetor adicional selecionado do grupo que consiste em:Optionally, said method comprises the additional step of determining the presence or absence of at least one additional protective polymorphism selected from the group consisting of:
o genótipo +760GG ou +760CG dentro do gene que codifica SOD3;the + 760GG or + 760CG genotype within the gene encoding SOD3;
o genótipo -1296TT dentro do promotor do gene que codifica TIMP3; outhe -1296TT genotype within the promoter of the TIMP3 encoding gene; or
o genótipo CC (alelo P homozigoto) dentro do códon 10 do gene que codificaTGFB.the CC genotype (P homozygous allele) within codon 10 of the gene encoding TGFB.
O pelo menos um polimorfismo de susceptibilidade pode ser umgenótipo selecionado do grupo que consiste no:The at least one susceptibility polymorphism may be a genotype selected from the group consisting of:
genótipo 105 AA no gene que codifica IL18;105 AA genotype in the gene encoding IL18;
genótipo -133 CC no promotor do gene que codifica IL18;-133 CC genotype in the promoter of the IL18 encoding gene;
genótipo -675 5G5G no promotor do gene que codifica PAI-1;-675 5G5G genotype in the promoter of the PAI-1 encoding gene;
genótipo -1055 TT no promotor do gene que codifica IL13;-1055 TT genotype in the promoter of the gene encoding IL13;
genótipo 874 TT no gene que codifica IFN-y;874 TT genotype in the gene encoding IFN-γ;
genótipo +489 AA ou AG no gene que codifica TNFa;+489 AA or AG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo -308 AA ou AG no gene que codifica TNFa;-308 AA or AG genotype in the gene encoding TNFα;
genótipo C89Y GG no gene que codifica SMAD3;C89Y GG genotype in the gene encoding SMAD3;
genótipo E469K GG no gene que codifica ICAM1;genótipo Gly 881 Arg GC ou CC no gene que codifica NOD2;E469K GG genotype in the gene encoding ICAM1, Gly 881 Arg GC or CC genotype in the gene encoding NOD2;
genótipo -511 GG no gene que codifica IL1B;-511 GG genotype in the gene encoding IL1B;
genótipo Tyr 113 His TT no gene que codifica MEH;Tyr 113 His TT genotype in the gene encoding MEH;
genótipo -366 GG no gene que codifica ALOX5;-366 GG genotype in the gene encoding ALOX5;
genótipo HOM T2437C CC ou CT no gene que codifica HSP 70;HOM T2437C CC or CT genotype in the gene encoding HSP 70;
genótipo +13924 AA no gene que codifica CLCA1; ou+13924 AA genotype in the gene encoding CLCA1; or
genótipo-159 CC no gene que codifica CD-14.159 CC genotype in the gene encoding CD-14.
Opcionalmente, o dito método compreende a etapa de determinação da presença ou da ausência de pelo menos um polimorfismo de susceptibilidade adicional triada do grupo que consiste no:Optionally, said method comprises the step of determining the presence or absence of at least one additional screened susceptibility polymorphism of the group consisting of:
genótipo -82AA dentro do promotor do gene que codifica MMP12;-82AA genotype within the promoter of the gene encoding MMP12;
genótipo -1562CT ou -1562TT dentro do promotor do gene que codifica MMP9;-1562CT or -1562TT genotype within the promoter of the MMP9 encoding gene;
genótipo 1237AG ou 1237AA (genótipos do alelo Tt ou tt) dentro da região a 3'do gene que codifica a a 1-antitripsina; ou1237AG or 1237AA genotype (Tt or tt allele genotypes) within the 3'-region of the 1-antitrypsin coding gene; or
genótipo 2G2G dentro do promotor do gene que codifica MMP1.2G2G genotype within the promoter of the gene encoding MMP1.
Em uma forma preferida da invenção a presença de dois ou mais polimorfismos protetores é indicativa de um risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.In a preferred form of the invention the presence of two or more protective polymorphisms is indicative of a reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em uma forma adicionalmente preferida da invenção a presença de dois ou mais polimorfismos de susceptibilidade é indicativa de um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.In a further preferred form of the invention the presence of two or more susceptibility polymorphisms is indicative of a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Ainda em uma forma adicionalmente preferida da invenção a presença de dois ou mais polimorfismos protetores independente da presença de um ou mais polimorfismos de susceptibilidade é indicativa de risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.Still in a further preferred form of the invention the presence of two or more protective polymorphisms independent of the presence of one or more susceptibility polymorphisms is indicative of reduced risk of development of COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de determinação do risco de um indivíduo desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, o dito método compreendendo a obtenção do resultado de um ou mais testes genéticos de uma amostra do dito indivíduo e a análise do resultado em relação à presença ou à ausência de um ou maispolimorfismos selecionados do grupo que consiste em:In another aspect, the invention provides a method for determining an individual's risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, said method comprising obtaining the result of one or more genetic tests from a sample of said individual and analyzing of the result in relation to the presence or absence of one or more polymorphisms selected from the group consisting of:
-765 C/G no promotor do gene que codifica a Ciclooxigenase 2 (COX2);-765 C / G at the promoter of the gene encoding Cyclooxygenase 2 (COX2);
105 C/A no gene que codifica a Interleucina18 (IL18);105 C / A in the gene encoding Interleukin18 (IL18);
-133 G/C no promotor do gene que codifica IL18;-133 G / C on the promoter of the IL18 encoding gene;
-675 4G/5G no promotor do gene que codifica o Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (PAI-1);-675 4G / 5G on the promoter of the gene encoding Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1);
874 A/T no gene que codifica o Interferon-Y(IFN-y);874 A / T in the gene encoding Interferon-Y (IFN-y);
-+489 G/A no gene que codifica o Fator de Necrose de Tumor a (TNFa);- + 489 G / A in the gene encoding Tumor Necrosis Factor a (TNFα);
C89Y A/G no gene que codifica SMAD3;C89Y A / G in the gene encoding SMAD3;
E 469 K A/G no gene que codifica a molécula de Adesão Intracelular 1 (I-CAM1);E 469 K A / G in the gene encoding the Intracellular Adhesion molecule 1 (I-CAM1);
Gly 881Arg G/C no gene que codifica a Caspase (NOD2);Gly 881Arg G / C in the Caspase (NOD2) encoding gene;
161 G/A no gene que codifica a lectina 2 de ligação à Manose (MBL2);161 G / A in the gene encoding Mannose binding lectin 2 (MBL2);
-1903 G/A no gene que codifica a Quimase 1 (CMA1);-1903 G / A in the chimase 1 encoding gene (CMA1);
Arg 197 Gln G/A no gene que codifica a N-Acetil transferase 2 (NAT2);Arg 197 Gln G / A in the gene encoding N-Acetyl transferase 2 (NAT2);
-366 G/A no gene que codifica a Lipo-oxigenase 5 (ALOX5);-366 G / A in the gene encoding Lipooxygenase 5 (ALOX5);
HOM T2437C no gene que codifica a Proteína do Choque Térmico 70 (HSP 70);HOM T2437C in the gene encoding Heat Shock Protein 70 (HSP 70);
+13924 T/A no gene que codifica o Canal de Cloreto ativado por Cálcio 1 (CLCA1);+13924 T / A in the gene encoding Calcium Activated Chloride Channel 1 (CLCA1);
-159 C/T no gene que codifica o antígeno de diferenciação de Monócito CD-14 (CD-14);-159 C / T in the gene encoding the CD-14 Monocyte Differentiation Antigen (CD-14);
éxon 1 +49 C/T no gene que codifica a Elafina;exon 1 +49 C / T in the gene encoding Elafin;
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica a Metaloproteinase de Matriz 1 (MMP1), com referência apenas ao alelo 1G;-1607 1G / 2G in the promoter of the Matrix 1 Metalloproteinase (MMP1) encoding gene, with reference only to the 1G allele;
ou um ou mais polimorfismos que estão em desequilíbrio de ligação com qualquer um ou mais destes polimorfismos;or one or more polymorphisms that are in disequilibrium of binding with any one or more of these polymorphisms;
em que um resultado que indica a presença ou a ausência de um ou mais dos ditos polimorfismos é indicativo do risco de um indivíduo de desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.wherein a result indicating the presence or absence of one or more of said polymorphisms is indicative of an individual's risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em um aspecto adicional a invenção fornece um método de determinação do risco de um indivíduo desenvolver doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, o dito meto-do compreendendo a determinação da presença ou da ausência do alelo -765 C no promotor do gene que codifica COX2 e/ou do alelo S no gene que codifica a 1-antitripsina, em que a presença de qualquer um ou mais dos ditos alelos é indicativa de um risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.In a further aspect the invention provides a method for determining the risk of an individual developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema, said method comprising determining the presence or absence of the -765 C allele. in the promoter of the gene encoding COX2 and / or the S allele in the gene encoding 1-antitrypsin, wherein the presence of any one or more of said alleles is indicative of a reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em um aspecto adicional a invenção fornece um método de determinação do risco de um indivíduo desenvolver doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, o dito método compreendendo a determinação da presença ou da ausência do genótipo -765 CC ou CG no promotor do gene que codifica COX2 e/ou do genótipo MS no gene que codifica a 1 -antitripsina, em que a presença de qualquer um ou mais dos ditos genótipos é indicativa de um risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.In a further aspect the invention provides a method for determining the risk of an individual developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema, said method comprising determining the presence or absence of the -765 CC or CG genotype. in the promoter of the COX2 coding gene and / or the MS genotype in the 1-antitrypsin coding gene, wherein the presence of any one or more of said genotypes is indicative of a reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em uma forma particularmente preferida da invenção é fornecido um método de determinação do risco de um indivíduo desenvolver doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, que compreende a análise de um ou mais polimorfismos selecionados do grupo que consiste em:In a particularly preferred form of the invention there is provided a method for determining an individual's risk of developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema, comprising analyzing one or more polymorphisms selected from the group consisting of:
-765 C/G no promotor do gene que codifica COX2;-765 C / G at the promoter of the COX2 encoding gene;
105 C/A no gene que codifica IL18;105 C / A in the gene encoding IL18;
-133 G/C no promotor do gene que codifica IL18;-133 G / C on the promoter of the IL18 encoding gene;
-675 4G/5G no promotor do gene que codifica PAI-1;-675 4G / 5G on the PAI-1 encoding gene promoter;
874 A/T no gene que codifica IFN-y, +489 G/A no gene que codifica TNFa;874 A / T in the IFN-γ encoding gene, +489 G / A in the TNFα encoding gene;
C89Y A/G no gene que codifica SMAD3;C89Y A / G in the gene encoding SMAD3;
E 469 K A/G no gene que codifica ICAM1;E 469 K A / G in the gene encoding ICAM1;
Gly 881 Arg G/C no gene que codifica NOD2;Gly 881 Arg G / C in the gene encoding NOD2;
161 G/A no gene que codifica MBL2;161 G / A in the gene encoding MBL2;
-1903 G/A no gene que codifica CMA1;-1903 G / A in the gene encoding CMA1;
Arg 197 Gln G/A no gene que codifica NAT2;Arg 197 Gln G / A in the gene encoding NAT2;
-366 G/A no gene que codifica ALOX5;-366 G / A in the gene encoding ALOX5;
HOM T2437C no gene que codifica HSP 70;+13924 T/A no gene que codifica CLCA1;HOM T2437C in the gene encoding HSP 70: +13924 T / A in the gene encoding CLCA1;
-159 C/T no gene que codifica CD-14;-159 C / T in the gene encoding CD-14;
éxon 1 +49 C/T no gene que codifica a Elafina; ouexon 1 +49 C / T in the gene encoding Elafin; or
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica MMP1 (com referência apenas ao alelo 1G)-1607 1G / 2G on MMP1-encoding gene promoter (with reference to 1G allele only)
em combinação com um ou mais polimorfismos selecionados do grupo que consiste em: 16Arg/Gly no gene que codifica ADBR; 130 Arg/Gln (G/A) no gene que codifica IL13;in combination with one or more polymorphisms selected from the group consisting of: 16Arg / Gly in the gene encoding ADBR; 130 Arg / Gln (G / A) in the gene encoding IL13;
298 Asp/GIu (T/G) no gene que codifica NOS3; lie 105 Vai (A/G) no gene que codifica GSTP; Glu 416 Asp (T/G) no gene que codifica VDBP; Lys 420 Thr (A/C) no gene que codifica VDBP; -1055 C/T no promotor do gene que codifica IL13;298 Asp / GIu (T / G) in the gene encoding NOS3; Ile 105 Val (A / G) in the gene encoding GSTP; Glu 416 Asp (T / G) in the gene encoding VDBP; Lys 420 Thr (A / C) in the gene encoding VDBP; -1055 C / T on the promoter of the gene encoding IL13;
a mutação S no gene que codifica a a1 -antitripsina;the S mutation in the α1-antitrypsin coding gene;
-308 G/A no promotor do gene que codifica TNFoc; -511 A/G no promotor do gene que codifica IL1B; Tyr 113 His T/C no gene que codifica MEH; His 139 Arg G/A no gene que codifica MEH; ou-308 G / A on the promoter of the gene encoding TNFoc; -511 A / G on the promoter of the gene encoding IL1B; Tyr 113 His T / C in the gene encoding MEH; His 139 Arg G / A in the gene encoding MEH; or
Gln 27 Glu C/G no gene que codifica ADBR.Gln 27 Glu C / G in the gene encoding ADBR.
Em um aspecto adicional é fornecido um método de determinação do risco de um indivíduo desenvolver doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, que compreende a análise de dois ou mais polimorfismos selecionados do grupo que consiste em:In an additional aspect there is provided a method for determining the risk of an individual developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema, comprising the analysis of two or more polymorphisms selected from the group consisting of:
-765 C/G no promotor do gene que codifica COX2;-765 C / G at the promoter of the COX2 encoding gene;
105 C/A no gene que codifica IL18;105 C / A in the gene encoding IL18;
-133 G/C no promotor do gene que codifica IL18;-133 G / C on the promoter of the IL18 encoding gene;
-675 4G/5G no promotor do gene que codifica PAI-1;-675 4G / 5G on the PAI-1 encoding gene promoter;
874 A/T no gene que codifica IFN-y;874 A / T in the gene encoding IFN-γ;
16Arg/Gly no gene que codifica ADBR;16Arg / Gly in the gene encoding ADBR;
130 Arg/Gln (G/A) no gene que codifica IL13;298 Asp/GIu (T/G) no gene que codifica NOS3;130 Arg / Gln (G / A) in the gene encoding IL13, 298 Asp / GIu (T / G) in the gene encoding NOS3;
lie 105 Vai (A/G) no gene que codifica Glutationa S transferase P (GST-P);Ile 105 Val (A / G) in the gene encoding Glutathione S transferase P (GST-P);
Glu 416 Asp (T/G) no gene que codifica VDBP;Glu 416 Asp (T / G) in the gene encoding VDBP;
Lys 420 Thr (A/C) no gene que codifica VDBP;Lys 420 Thr (A / C) in the gene encoding VDBP;
-1055 C/T no promotor do gene que codifica IL13;-1055 C / T on the promoter of the gene encoding IL13;
a mutação S no gene que codifica a a1-antitripsina;the S mutation in the α1-antitrypsin coding gene;
+489 G/A no gene que codifica TNFa;+489 G / A in the gene encoding TNFα;
C89Y A/G no gene que codifica SMAD3;C89Y A / G in the gene encoding SMAD3;
E 469 K A/G no gene que codifica ICAM1;E 469 K A / G in the gene encoding ICAM1;
Gly 881 Arg G/C no gene que codifica NOD2;Gly 881 Arg G / C in the gene encoding NOD2;
161 G/A no gene que codifica MBL2;161 G / A in the gene encoding MBL2;
-1903 G/A no gene que codifica CMA1;-1903 G / A in the gene encoding CMA1;
Arg 197 Gln G/A no gene que codifica NAT2;Arg 197 Gln G / A in the gene encoding NAT2;
-366 G/A no gene que codifica ALOX5;-366 G / A in the gene encoding ALOX5;
HOM T2437C no gene que codifica HSP 70;HOM T2437C in the gene encoding HSP 70;
+13924 T/A no gene que codifica CLCA1;+13924 T / A in the gene encoding CLCA1;
-159 C/T no gene que codifica CD-14;-159 C / T in the gene encoding CD-14;
éxon 1 +49 C/T no gene que codifica a Elafina;exon 1 +49 C / T in the gene encoding Elafin;
-308 G/A no promotor do gene que codifica TNFa;-308 G / A on the promoter of the gene encoding TNFα;
-511 A/G no promotor do gene que codifica IL1B;-511 A / G on the promoter of the gene encoding IL1B;
Tyr 113 His T/C no gene que codifica MEH;Tyr 113 His T / C in the gene encoding MEH;
Arg 139 G/A no gene que codifica MEH;Arg 139 G / A in the gene encoding MEH;
Gln 27 Glu C/G no gene que codifica ADBR; ouGln 27 Glu C / G in the gene encoding ADBR; or
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica MMP1 (com referência apenas ao alelo 1G).-1607 1G / 2G on the promoter of the MMP1 encoding gene (with reference to the 1G allele only).
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 298 do gene que codifica NOS3.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 298 of the gene encoding NOS3.
A presença de glutamato na dita posição é indicativa de um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto en-fisema.The presence of glutamate in said position is indicative of a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and enphysema.
A presença de asparagina na dita posição é indicativa de riscoreduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.The presence of asparagine in said position is indicative of reduced risk of development of COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 420 do gene que codifica proteína de ligação com a Vitamina D.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 420 of the gene encoding Vitamin D binding protein.
A presença de treonina na dita posição é indicativa de um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.The presence of threonine in this position is indicative of a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
A presença de lisina na dita posição é indicativa de risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.The presence of lysine in said position is indicative of reduced risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 89 do gene que codifica SMAD3.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 89 of the gene encoding SMAD3.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 469 do gene que codifica ICAM1.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 469 of the gene encoding ICAM1.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 881 do gene que codifica NOD2.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 881 of the gene encoding NOD2.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 197 do gene que codifica NAT2.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 197 of the gene encoding NAT2.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 113 do gene que codifica MEH.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 113 of the MEH coding gene.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posição que se mapeia no códon 139 do gene que codifica MEH.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 139 of the MEH coding gene.
Em várias modalidades, qualquer um ou mais dos métodos anteriores compreende a etapa de análise do aminoácido presente em uma posi-ção que se mapeia no códon 27 do gene que codifica ADBR.In various embodiments, any one or more of the foregoing methods comprises the step of analyzing the amino acid present at a position that maps to codon 27 of the gene encoding ADBR.
Em uma forma preferida da invenção os métodos que são descritos aqui são realizados em associação a uma análise de um ou mais fatores de risco, que incluem um ou mais fatores de risco epidemiológico, associados a um risco de desenvolvimento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e/ou enfisema. Tais fatores de risco epidemiológico incluem, mas não estão limitados ao fumo ou à exposição ao tabaco, à idade, ao sexo e ao histórico familiar de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.In a preferred form of the invention the methods that are described herein are performed in combination with an analysis of one or more risk factors, including one or more epidemiological risk factors, associated with a risk of developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD). ) and / or emphysema. Such epidemiological risk factors include, but are not limited to, smoking or exposure to tobacco, age, gender, and family history of COPD, emphysema, or both COPD and emphysema.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de pelo menos um polimorfismo na avaliação do risco de um indivíduo de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, em que o dito pelo menos um polimorfismo é selecionado do grupo que consiste em:In a further aspect, the invention provides the use of at least one polymorphism in the risk assessment of an individual developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, wherein said at least one polymorphism is selected from the group consisting of:
-765 C/G no promotor do gene que codifica a Ciclooxigenase 2 (COX2);-765 C / G at the promoter of the gene encoding Cyclooxygenase 2 (COX2);
105 C/A no gene que codifica Interleucinal 8 (IL18);105 C / A in the gene encoding Interleucinal 8 (IL18);
-133 G/C no promotor do gene que codifica IL18;-133 G / C on the promoter of the IL18 encoding gene;
-675 4G/5G no promotor do gene que codifica o Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (PAI-1);-675 4G / 5G on the promoter of the gene encoding Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1);
874 A/T no gene que codifica o Interferon-y (IFN-y);874 A / T in the gene encoding Interferon-y (IFN-y);
+489 G/A no gene que codifica o Fator de Necrose de Tumor a (TNFa);+489 G / A in the gene encoding Tumor Necrosis Factor a (TNFα);
C89Y A/G no gene que codifica SMAD3;C89Y A / G in the gene encoding SMAD3;
E 469 K A/G no gene que codifica a molécula de Adesão Intracelular 1 (I-CAM1);E 469 K A / G in the gene encoding the Intracellular Adhesion molecule 1 (I-CAM1);
Gly 881 Arg G/C no gene que codifica a Caspase (NOD2);Gly 881 Arg G / C in the Caspase (NOD2) encoding gene;
161 G/A no gene que codifica a lectina 2 de ligação à Manose (MBL2);161 G / A in the gene encoding Mannose binding lectin 2 (MBL2);
-1903 G/A no gene que codifica a Quimase 1 (CMA1);-1903 G / A in the chimase 1 encoding gene (CMA1);
Arg 197 Gln G/A no gene que codifica a N-Acetil transferase 2 (NAT2);Arg 197 Gln G / A in the gene encoding N-Acetyl transferase 2 (NAT2);
-366 G/A no gene que codifica a Lipo-oxigenase 5 (ALOX5);-366 G / A in the gene encoding Lipooxygenase 5 (ALOX5);
HOM T2437C no gene que codifica a Proteína do Choque Térmico 70 (HSP 70);HOM T2437C in the gene encoding Heat Shock Protein 70 (HSP 70);
+13924 T/A no gene que codifica o Canal de Cloreto ativado por Cálcio 1 (CLCA1);+13924 T / A in the gene encoding Calcium Activated Chloride Channel 1 (CLCA1);
-159 C/T no gene que codifica o antígeno de diferenciação de Monócito CD-14(CD-14);-159 C / T in the gene encoding the CD-14 Monocyte Differentiation Antigen (CD-14);
éxon 1 +49 C/T no gene que codifica a Elafina;exon 1 +49 C / T in the gene encoding Elafin;
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica a Metaloproteinase de Matriz 1 (MMP1), com referência apenas ao alelo 1G; ou-1607 1G / 2G in the promoter of the Matrix 1 Metalloproteinase (MMP1) encoding gene, with reference only to the 1G allele; or
um ou mais polimorfismos em desequilíbrio de ligação com qualquer um dos ditos polimorfismos.one or more polymorphisms in linkage disequilibrium with any of said polymorphisms.
Opcionalmente, o dito uso pode ser em associação com o uso de pelo menos um polimorfismo adicional selecionado do grupo que consiste em:Optionally, said use may be in association with the use of at least one additional polymorphism selected from the group consisting of:
16Arg/Gly no gene que codifica ADBR;16Arg / Gly in the gene encoding ADBR;
130 Arg/Gln (G/A) no gene que codifica IL13;130 Arg / Gln (G / A) in the gene encoding IL13;
298 Asp/GIu (T/G) no gene que codifica NOS3;298 Asp / GIu (T / G) in the gene encoding NOS3;
Me 105 Vai (A/G) no gene que codifica GSTP;Me 105 Val (A / G) in the gene encoding GSTP;
Glu 416 Asp (T/G) no gene que codifica VDBP;Glu 416 Asp (T / G) in the gene encoding VDBP;
Lys 420 Thr (A/C) no gene que codifica VDBP;Lys 420 Thr (A / C) in the gene encoding VDBP;
-1055 C/T no promotor do gene que codifica IL13;-1055 C / T on the promoter of the gene encoding IL13;
a mutação S no gene que codifica a a1 -antitripsina;the S mutation in the α1-antitrypsin coding gene;
-308 G/A no promotor do gene que codifica TNFa;-308 G / A on the promoter of the gene encoding TNFα;
-511 A/G no promotor do gene que codifica IL1B;-511 A / G on the promoter of the gene encoding IL1B;
Tyr 113 His T/C no gene que codifica MEH;Tyr 113 His T / C in the gene encoding MEH;
His 139 Arg G/A no gene que codifica MEH;His 139 Arg G / A in the gene encoding MEH;
Gln 27 Glu C/G no gene que codifica ADBR;Gln 27 Glu C / G in the gene encoding ADBR;
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica MMP1;-1607 1G / 2G on the promoter of the gene encoding MMP1;
-1562 C/T no promotor do gene que codifica MMP9;-1562 C / T on the promoter of the gene encoding MMP9;
M1 (GSTM1) nulo no gene que codifica GST-1;M1 (GSTM1) null in gene encoding GST-1;
1237 G/A na região a 3' do gene que codifica a a1-antitripsina;1237 G / A in the 3 'region of the α1-antitrypsin coding gene;
-82 A/G no promotor do gene que codifica MMP12;-82 A / G on the promoter of the gene encoding MMP12;
T->C dentro do códon 10 do gene que codifica TGFB;T-> C within codon 10 of the gene encoding TGFB;
760 C/G no gene que codifica SOD3;760 C / G in the gene encoding SOD3;
-1296 T/C dentro do promotor do gene que codifica TIMP3; ou-1296 T / C within the promoter of the TIMP3 encoding gene; or
a mutação S no gene que codifica a ct1 -antitripsina.mutation S in the gene encoding ct1-antitrypsin.
Em um outro aspecto a invenção fornece um conjunto de sondase/ou iniciadores de nucleotídeos para uso nos métodos preferidos da invenção descritos aqui. Preferencialmente, as sondas e/ou os iniciadores de nucleotídeos são aqueles que abrangem ou que são capazes de serem utilizados para abrangir, as regiões polimórficas dos genes.In another aspect the invention provides a set of nucleotide sondase / or primers for use in the preferred methods of the invention described herein. Preferably, the nucleotide probes and / or primers are those that encompass or are capable of being used to encompass the polymorphic regions of the genes.
Ainda em um aspecto adicional, a invenção fornece um microar-ranjo de ácidos nucléicos para uso nos métodos da invenção, cujo microar-ranjo compreende um substrato que apresenta seqüências de ácidos nucléicos capazes de se hibridizarem com seqüências de ácidos nucléicos que codificam um ou mais dos polimorfismos de susceptibilidade ou protetoresdescritos aqui ou seqüências complementares aos mesmos.In a still further aspect, the invention provides a nucleic acid microarray for use in the methods of the invention, which microarrangement comprises a substrate having nucleic acid sequences capable of hybridizing to nucleic acid sequences encoding one or more susceptibility polymorphisms or protectors described herein or sequences complementary thereto.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um microarranjo de anticorpos para uso nos métodos da invenção, cujo microarranjo compreende um substrato que apresenta anticorpos capazes de se ligarem a um produto da expressão de um gene cuja expressão é regulada para mais ou reguiada para menos quando associado a um polimorfismo de susceptibilidade ou protetor como descrito aqui.In another aspect, the invention provides an antibody microarray for use in the methods of the invention, which microarray comprises a substrate having antibodies capable of binding to an expression product of a gene whose expression is up-regulated or down-regulated when associated with a susceptibility or protective polymorphism as described herein.
Em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema que compreende a etapa de replicação, genotipicamente ou fenotipicamente, da presença . e/ou do efeito funcional de um polimorfismo protetor no dito indivíduo.In a further aspect the present invention provides a method of treating an individual who has a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema comprising the replication step, genotypically or phenotypically, of the presence. and / or the functional effect of a protective polymorphism on said individual.
Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, o dito indivíduo possuindo um polimorfismo de susceptibilidade que pode ser detectado que regula para mais ou regula para menos a expressão de um gene de forma que a concentração fisiologicamente ativa do produto gênico expresso fica fora de uma faixa que é normal para a idade e o sexo do indivíduo, o dito método compreendendo a etapa de restauração da concentração fisiologicamente ativa do dito produto da expressão gênica que estará dentro de uma faixa que é normal para a idade e para o sexo do indivíduo.In a still further aspect, the present invention provides a method of treating a subject having a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, said subject having a detectable susceptibility polymorphism that regulates further or down-regulates the expression of a gene so that the physiologically active concentration of the expressed gene product falls outside a range that is normal for the individual's age and sex, said method comprising the step of restoring the physiologically active concentration of the gene. said product of gene expression that will be within a range that is normal for the age and sex of the individual.
Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece ummétodo de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e para o qual foi determinada a presença do genótipo GG no polimorfismo -765 C/G presente no promotor do gene que codifica COX2, o dito método compreendendo a administração ao dito indivíduo de um agente capaz de reduzir a atividade de COX2 no dito indivíduo.In a still further aspect, the present invention provides a method of treating an individual who has a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and for which the presence of the GG genotype in the -765 C / G polymorphism has been determined. present in the promoter of the COX2 encoding gene, said method comprising administering to said individual an agent capable of reducing COX2 activity in said individual.
Em uma modalidade, o dito agente é um inibidor de COX2 ou um fármaco antiinflamatório não esteróide (NSAID), preferencialmente o dito inibidor de COX2 é selecionado do grupo que consiste em Celebrex (Celecõxib), Bextra (Valdecoxib) e Vioxx (Rofecoxib).In one embodiment, said agent is a COX2 inhibitor or a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), preferably said COX2 inhibitor is selected from the group consisting of Celebrex (Celecoxib), Bextra (Valdecoxib) and Vioxx (Rofecoxib).
Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e para o qual foi determinada a presença do genótipo AA no polimorfismo 105 C/A no gene que codifica IL18, o dito método compreendendo a administração ao dito indivíduo de um agente capaz de aumentar a atividade de IL18 no dito indivíduo.In a further aspect, the present invention provides a method of treating an individual who has a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, and for which the presence of the AA genotype in the 105 C / A polymorphism has been determined. gene encoding IL18, said method comprising administering to said individual an agent capable of increasing IL18 activity in said individual.
Ainda em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e para o qual foi determinada a presença do genótipo CC no polimorfismo -133 G/C no promotor do gene que codifica IL18, o dito método compreendendo a administração ao dito indivíduo de um agente capaz de aumentar a atividade de IL18 no dito indivíduo.In a still further aspect the present invention provides a method of treating an individual who has a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and for which the presence of the CC genotype in the -133 G / C polymorphism has been determined. in the IL18-encoding gene promoter, said method comprising administering to said individual an agent capable of enhancing IL18 activity in said individual.
Ainda em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e para o qual foi determinada a presença do genótipo 5G5G no polimorfismo -675 4G/5G no promotor do gene que codifica PAI-1, o dito método compreendendo a administração ao dito indivíduo de um agente capaz de aumentar a atividade de PAI-1 no dito indivíduo.In a still further aspect the present invention provides a method of treating an individual having a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and for which the presence of the 5G5G genotype in the -675 4G / 5G polymorphism has been determined. in the PAI-1 encoding gene promoter, said method comprising administering to said individual an agent capable of increasing PAI-1 activity in said individual.
Ainda em um aspecto adicional a presente invenção fornece ummétodo de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e para o qual foi determinada a presença do genótipo AA no polimorfismo 874 A/T no gene que codifica IFN-y, o dito método compreendendo a administração ao dito indivíduo de um agente capaz de modular a atividade de IFN-y no dito indivíduo.In a still further aspect the present invention provides a method of treating an individual who has a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and for which the presence of the AA genotype in the 874 A / T polymorphism in the gene has been determined. encoding IFN-γ, said method comprising administering to said individual an agent capable of modulating IFN-γ activity in said individual.
Ainda em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e para o qual foi determinada a presença do genótipo CC no polimorfismo -159 C/T no gene que codifica CD-14, o dito método compreendendo a administração ao dito indivíduo de um agente capaz de modular a atividade de CD-14 e/ou de IgE no dito indivíduo.In a still further aspect the present invention provides a method of treating an individual who has a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and for which the presence of the CC genotype in the -159 C / T polymorphism has been determined. in the gene encoding CD-14, said method comprising administering to said individual an agent capable of modulating CD-14 and / or IgE activity in said individual.
Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a triagem de compostos que modulam a expressão e/ou a atividade de um gene, cuja expressão é regulada para mais ou para menos quando associada com um polimorfismo de susceptibilidade ou protetor, o dito método compreendendo as etapas de:In a still further aspect, the present invention provides a method for screening compounds that modulate expression and / or activity of a gene, the expression of which is up-or-down-regulated when associated with a susceptibility or protective polymorphism. said method comprising the steps of:
contato de um composto candidato com uma célula que compreende um polimorfismo de susceptibilidade ou protetor que foi determina-. do como estando associado à regulação para mais ou a regulação para menos da expressão de um gene; econtacting a candidate compound with a cell comprising a susceptibility or protective polymorphism that has been determined. being associated with up-regulation or down-regulation of gene expression; and
medida da expressão do dito gene após o contato com o dito composto candidato,expression of said gene after contact with said candidate compound,
em que uma alteração no nível de expressão após a etapa de contato quando comparado a antes da etapa de contato é indicativa da capacidade do composto de modular a expressão e/ou a atividade do dito gene.wherein a change in expression level after the contacting step as compared to before the contacting step is indicative of the compound's ability to modulate expression and / or activity of said gene.
Preferencialmente, a dita célula é uma célula pulmonar humana que foi pré-triada para confirmar a presença do dito polimorfismo.Preferably, said cell is a human lung cell that has been pre-screened to confirm the presence of said polymorphism.
Preferencialmente, a dita célula compreende um polimorfismo de susceptibilidade associado à regulação para mais da expressão do dito genee a dita triagem é em relação a compostos candidatos que regulam para menos a expressão do dito gene.Preferably, said cell comprises a susceptibility polymorphism associated with up-regulation of said gene expression and said screening is with respect to candidate compounds that down-regulate expression of said gene.
Alternativamente, a dita célula compreende um polimorfismo de susceptibilidade associado à regulação para menos da expressão do dito gene e a dita triagem é em relação a compostos candidatos que regulam para mais a expressão do dito gene.Alternatively, said cell comprises a susceptibility polymorphism associated with down regulation of said gene expression and said screening is for candidate compounds that further regulate expression of said gene.
Em uma outra modalidade, a dita célula compreende um polimorfismo protetor associado à regulação para mais da expressão do dito gene e a dita triagem é em relação a compostos candidatos que regulam para mais a expressão do dito gene.In another embodiment, said cell comprises a protective polymorphism associated with further regulation of said gene expression and said screening is with respect to candidate compounds that further regulate expression of said gene.
Alternativamente, a dita célula compreende um polimorfismo protetor associado à regulação para menos da expressão do dito gene e a dita triagem é em relação a compostos candidatos que regulam adicionalmente para menos a expressão do dito gene.Alternatively, said cell comprises a protective polymorphism associated with down-regulation of said gene expression and said screening is for candidate compounds that further down-regulate expression of said gene.
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a triagem de compostos que modulam a expressão e/ou a atividade de um gene, cuja expressão é regulada para mais ou regulada para menos quando associada a um polimorfismo de susceptibilidade ou protetor, o dito método compreendendo as etapas de:In another aspect, the present invention provides a method for screening compounds that modulate expression and / or activity of a gene whose expression is up-regulated or down-regulated when associated with a susceptibility or protective polymorphism. said method comprising the steps of:
contato de um composto candidato com uma célula que compreende um gene, cuja expressão é regulada para mais ou regulada para menos quando associada a um polimorfismo de susceptibilidade ou protetor, mas que na dita célula sua expressão não é regulada para mais nem regulada para menos; econtacting a candidate compound with a cell comprising a gene whose expression is up-regulated or down-regulated when associated with a susceptibility or protective polymorphism, but in said cell its expression is not up-regulated or down-regulated; and
medida da expressão do dito gene após o contato com o dito composto candidato, em que uma alteração no nível de expressão após a etapa de contato quando comparado com antes da etapa de contato é indicativa da capacidade do composto de modular a expressão e/ou a atividade do dito gene.expression of said gene after contact with said candidate compound, wherein a change in expression level after the contact step as compared to before the contact step is indicative of the compound's ability to modulate expression and / or expression. activity of said gene.
Preferencialmente, a dita célula é uma célula pulmonar humana que foi pré-triada para confirmar a presença e o nível de linha de base de expressão, do dito gene.Preferencialmente, a expressão do gene é regulada para menos quando associada com um polimorfismo de susceptibilidade e a dita triagem é em relação a compostos candidatos que na dita célula, regulam para mais a expressão do dito gene.Preferably, said cell is a human lung cell that has been pre-screened to confirm the presence and baseline level of expression of said gene. Preferably, gene expression is down-regulated when associated with a susceptibility polymorphism. and said screening is with respect to candidate compounds which in said cell further regulate the expression of said gene.
Alternativamente, a expressão do gene é regulada para mais quando associada a um polimorfismo de susceptibilidade e a dita triagem é em relação a compostos candidatos que, na dita célula, regulam para menos a expressão do dito gene.Alternatively, gene expression is up-regulated when associated with a susceptibility polymorphism and said screening is for candidate compounds that down-regulate expression of said gene in said cell.
Em uma outra modalidade, a expressão do gene é regulada para mais quando associada a um polimorfismo protetor e a dita triagem é em relação a compostos que, na dita célula, regulam para mais a expressão do dito gene.In another embodiment, gene expression is further regulated when associated with a protective polymorphism and said screening is for compounds that in said cell further regulate expression of said gene.
Alternativamente, a expressão do gene é regulada para menos quando associada a um polimorfismo protetor e a dita triagem é em relação a compostos que, na dita célula, regula para menos a expressão do dito gene.Alternatively, gene expression is down-regulated when associated with a protective polymorphism and said screening is for compounds which in said cell down-regulate expression of said gene.
Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de avaliação da capacidade de resposta provável de um indivíduo em risco de desenvolver ou de sofrer de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema a um tratamento profilático ou terapêutico, cujo tratamento envolve a restauração da concentração fisiologicamente ativa de um produto . da expressão gênica que estará dentro de uma faixa que é normal para a idade e para o sexo do indivíduo, cujo método compreende a detecção no dito indivíduo da presença ou da ausência de um polimorfismo de susceptibilidade que quando presente regula para mais ou regula para menos a expressão do dito gene de forma que a concentração fisiologicamente ativa do produto gênico expresso esteja fora da dita faixa normal, em que a detecção da presença do dito polimorfismo é indicativa da probabilidade do indivíduo de responder ao dito tratamento.In a still further aspect, the present invention provides a method of assessing the likely responsiveness of an individual at risk of developing or suffering from COPD, emphysema or both COPD and emphysema to prophylactic or therapeutic treatment, the treatment of which involves restoration. physiologically active concentration of a product. gene expression that will be within a range that is normal for the age and sex of the subject, the method of which comprises detecting in said subject the presence or absence of a susceptibility polymorphism which when present regulates up or down expressing said gene such that the physiologically active concentration of the expressed gene product is outside of said normal range, wherein detection of the presence of said polymorphism is indicative of the individual's likelihood of responding to said treatment.
Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit para a avaliação do risco de um indivíduo de desenvolver uma ou mais doenças pulmonares obstrutivas tradas de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, o dito kit compreendendo um meio de análise de uma a-mostra do dito indivíduo em relação à presença ou à ausência de um ou mais polimorfismos descritos aqui. Breve Descrição das FigurasIn a further aspect, the present invention provides a kit for assessing the risk of an individual of developing one or more COPD, emphysema or both COPD and emphysema obstructive pulmonary diseases, said kit comprising a means of analyzing a disease. shows that subject in relation to the presence or absence of one or more polymorphisms described herein. Brief Description of the Figures
Figura 1: representa um gráfico que mostra a porcentagem de pessoas com COPD representada graficamente contra o número de variantes genéticos protetores.Figure 1: represents a graph showing the percentage of people with COPD plotted against the number of protective genetic variants.
Figura 2: representa um gráfico que mostra a porcentagem de pessoas com COPD representada graficamente contra o número de variantes genéticos de susceptibilidade.Figure 2: represents a graph showing the percentage of people with COPD plotted against the number of genetic susceptibility variants.
Descrição das Modalidades PreferidasDescription of Preferred Modalities
Utilizando estudos de controle de casos foram comparadas as freqüências de inúmeros variantes genéticos (polimorfismos) de genes candidatos em fumantes que desenvolveram COPD, fumantes que parecem resistentes à COPD e controles de doadores de sangue. A maior parte destes genes candidatos confirmou (ou provavelmente) os efeitos funcionais sobre a expressão gênica ou a função das proteínas. Especificamente, foram comparadas as freqüências de polimorfismos entre controles de doadores de sangue, fumantes resistentes e aqueles com COPD (subdivididos naqueles com início precoce e aqueles com início normal). A presente invenção demonstra que há tanto polimorfismos protetores quanto de susceptibilidade presentes nos genes candidatos selecionados dos pacientes testados.Using case control studies we compared the frequencies of numerous genetic variants (polymorphisms) of candidate genes in COPD smokers, COPD resistant smokers and blood donor controls. Most of these candidate genes confirmed (or probably) the functional effects on gene expression or protein function. Specifically, the frequencies of polymorphisms were compared between controls of blood donors, resistant smokers and those with COPD (subdivided into those with early onset and those with normal onset). The present invention demonstrates that there are both protective and susceptibility polymorphisms present in the selected candidate genes of the patients tested.
Especificamente, 17 polimorfismos genéticos de susceptibilidade e 19 polimorfismos genéticos protetores foram identificados.Specifically, 17 susceptibility genetic polymorphisms and 19 protective genetic polymorphisms were identified.
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Um polimorfismo genético de susceptibilidade é um que, quando presente, é indicativo de um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Em contraste, um polimorfismo genético protetor é um que, quando presente, é indicativo de um risco reduzido de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.A genetic susceptibility polymorphism is one that, when present, is indicative of a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema. In contrast, a protective genetic polymorphism is one that, when present, is indicative of a reduced risk of developing COPD, emphysema, or both COPD and emphysema.
Como utilizado aqui, a expressão "risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema" significa a probabilidade de que um indivíduo ao qual o risco se aplica em desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema e inclui a predisposição a e o início potencial da doença. Conseqüentemente, a expressão "maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema" significa que um indivíduo que possui tal risco maior possui uma inclinação ou tendência hereditária a desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Isto não significa que tal pessoa irá realmente desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema _ero qualquer momento, apenas que ele ou ela possui uma maior probabilidade de desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema comparada com a da população geral de indivíduos que não possui um polimorfismo associado a maior risco de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema ou que possui um poli-morfismo associado a menor risco de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Os indivíduos com um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema incluem aqueles com uma predisposição a COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, tal como uma tendência o predileção independentemente de sua função pulmonar no momento da avaliação, por exemplo, um indivíduo que é geneticamente inclinado a COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, mas que possui função pulmonar normal, aqueles em risco potencial, incluindo indivíduoscom uma tendência à função pulmonar suavemente reduzida que provavelmente prosseguirão até sofrer de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema se continuarem fumando e indivíduos com início potencial de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, que possuem uma tendência à função pulmonar fraca em espirometria etc, coerente com COPD no momento da avaliação.As used herein, the term "risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema" means the likelihood that an individual to whom the risk applies in developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema and includes a predisposition to and potential onset. of the disease. Accordingly, the term "increased risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema" means that an individual who has such a higher risk has an inherited tendency or tendency to develop COPD, emphysema or both COPD and emphysema. This does not mean that such a person will actually develop COPD, emphysema or both COPD and emphysema at any time, only that he or she is more likely to develop COPD, emphysema or both COPD and emphysema compared to the general population of non-emphysema. has a polymorphism associated with a higher risk of COPD, emphysema or both COPD and emphysema or has a polymorphism associated with lower risk of COPD, emphysema or both COPD and emphysema. Individuals at a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema include those with a predisposition to COPD, emphysema or both COPD and emphysema, such as a tendency to predilection regardless of their lung function at the time of assessment, for example. , an individual who is genetically inclined to COPD, emphysema or both COPD and emphysema, but who has normal lung function, those at potential risk, including individuals with a mildly reduced tendency to lung function who are likely to continue until suffering from COPD, emphysema or both COPD regarding emphysema if they continue smoking and individuals with potential onset of COPD, emphysema or both COPD and emphysema, who have a tendency to poor pulmonary function on spirometry etc., consistent with COPD at the time of assessment.
Similarmente, a expressão "menor risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema" significa que um indivíduo que possui tal risco diminuído possui uma desinclinação hereditária ou uma tendência reduzida ao desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Isto não significa que tal pessoa não desenvolverá COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema em qualquer momento, apenas que ele ou ela possui uma menor probabilidade de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema comparada com a da população geral de indivíduos que possui um ou mais polimorfismos associados a maior risco de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema ou não possui um polimorfismo associado com menor risco de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.Similarly, the term "lower risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema" means that an individual who has such a decreased risk has a hereditary disinclination or reduced tendency to develop COPD, emphysema or both COPD and emphysema. This does not mean that such a person will not develop COPD, emphysema or both COPD or emphysema at any time, only that he or she is less likely to develop COPD, emphysema or both COPD and emphysema compared to the general population of individuals who have one or more polymorphisms associated with increased risk of COPD, emphysema or either COPD or emphysema or not having a polymorphism associated with lower risk of COPD, emphysema or either COPD or emphysema.
Será entendido que no contexto da presente invenção o termo "polimorfismo" significa a ocorrência junta na mesma população a uma taxa . maior que a que pode ser atribuída à mutação aleatória (geralmente maior que 1 %) de duas ou mais formas alternadas (tais como alelos ou marcadores genéticos) de um lócus cromossômico que difere na seqüência de nucle-otídeos ou que possui números variáveis de unidades de nucleotídeos repetidas. Ver www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome/publicat/97pr/09gloss.html #p. Conseqüentemente, o termo "polimorfismos" que é utilizado aqui considera variações genéticas, incluindo substituições de nucleotídeos isolados, inserções e deleções de nucleotídeos, seqüências repetitivas (tais como microssatélites) e a ausência total ou parcial de genes (por exemplo, mutações nulas). Como utilizado aqui, o termo "polimorfismos" inclui ainda genótipos e haplotipos. Um genótipo é a composição genética em um lócus específico ouum conjunto de loci. Um haplotipo é um conjunto de marcadores genéticos intimamente ligados presentes em um cromossomo que não podem ser facilmente separados por recombinante, tendem a ser herdados juntos e podem estar em desequilíbrio de ligação. Um haplotipo pode ser identificado através de padrões de polimorfismos tais como SNPs. Similarmente, o termo "polimorfismo de um único nucleotídeo" ou "SNP" no contexto da presente invenção inclui substituições de nucleotídeos em base única e polimorfismos curtos de deleção e inserção.It will be understood that in the context of the present invention the term "polymorphism" means the occurrence together in the same population at a rate. greater than can be attributed to the random mutation (usually greater than 1%) of two or more alternating forms (such as alleles or genetic markers) of a chromosomal locus that differs in nucleotide sequence or has variable numbers of units of repeated nucleotides. See www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome / publicat / 97pr / 09gloss.html #p. Accordingly, the term "polymorphisms" as used herein considers genetic variations, including isolated nucleotide substitutions, nucleotide insertions and deletions, repetitive sequences (such as microsatellites) and the total or partial absence of genes (eg, null mutations). As used herein, the term "polymorphisms" further includes genotypes and haplotypes. A genotype is the genetic makeup of a specific locus or set of loci. A haplotype is a set of closely linked genetic markers present on a chromosome that cannot be easily separated by recombinant, tend to be inherited together, and may be in binding disequilibrium. A haplotype can be identified by polymorphism patterns such as SNPs. Similarly, the term "single nucleotide polymorphism" or "SNP" in the context of the present invention includes single base nucleotide substitutions and short deletion and insertion polymorphisms.
Um risco reduzido ou aumentado de um indivíduo desenvolver COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema pode ser diagnosticado através da análise de uma amostra do dito indivíduo em relação à presença de um polimorfismo selecionado do grupo que consiste em: -765 C/G no promotor do gene que codifica a Ciclooxigenase 2 (COX2); 105 C/A no gene que codifica a Interleucina18 (IL18);A reduced or increased risk of an individual developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema can be diagnosed by analyzing a sample of said individual for the presence of a polymorphism selected from the group consisting of: -765 C / G at promoter the gene encoding cyclooxygenase 2 (COX2); 105 C / A in the gene encoding Interleukin18 (IL18);
-133 G/C no promotor do gene que codifica IL18;-133 G / C on the promoter of the IL18 encoding gene;
-675 4G/5G no promotor do gene que codifica o Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (PAI-1);-675 4G / 5G on the promoter of the gene encoding Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1);
874 A/T no gene que codifica o Interferon-y (IFN-y);874 A / T in the gene encoding Interferon-y (IFN-y);
+489 G/A no gene que codifica o Fator de Necrose de Tumor a (TNFa);+489 G / A in the gene encoding Tumor Necrosis Factor a (TNFα);
C89Y A/G no gene que codifica SMAD3;C89Y A / G in the gene encoding SMAD3;
E 469 K A/G no gene que codifica a molécula de Adesão Intracelular 1 (I-CAM1);E 469 K A / G in the gene encoding the Intracellular Adhesion molecule 1 (I-CAM1);
Gly 881 Arg G/C no gene que codifica a Caspase (NOD2);Gly 881 Arg G / C in the Caspase (NOD2) encoding gene;
161 G/A no gene que codifica a lectina 2 de ligação à Manose (MBL2);161 G / A in the gene encoding Mannose binding lectin 2 (MBL2);
-1903 G/A no gene que codifica a Quimase 1 (CMA1);-1903 G / A in the chimase 1 encoding gene (CMA1);
Arg 197 Gln G/A no gene que codifica a N-Acetil transferase 2 (NAT2);Arg 197 Gln G / A in the gene encoding N-Acetyl transferase 2 (NAT2);
-366 G/A no gene que codifica a Lipo-oxigenase 5 (ALOX5);-366 G / A in the gene encoding Lipooxygenase 5 (ALOX5);
HOM T2437C no gene que codifica a Proteína do Choque Térmico 70 (HSP 70);HOM T2437C in the gene encoding Heat Shock Protein 70 (HSP 70);
+13924 T/A no gene que codifica o Canal de Cloreto ativado por Cálcio 1(CLCA1);+13924 T / A in the gene encoding Calcium Activated Chloride Channel 1 (CLCA1);
-159 C/T no gene que codifica antígeno de diferenciação de Monócito CD-14 (CD-14);éxon 1 +49 C/T no gene que codifica a Elafina;-159 C / T in the gene encoding CD-14 Monocyte differentiation antigen (CD-14), exon 1 +49 C / T in the gene encoding Elafin;
-1607 1G/2G no promotor do gene que codifica MMP1 (com referência apenas ao alelo 1G);-1607 1G / 2G on the promoter of the MMP1 encoding gene (with reference to the 1G allele only);
ou um ou mais polimorfismos que estão em desequilíbrio de ligação com qualquer um ou mais do grupo acima.or one or more polymorphisms that are in disequilibrium of binding with any one or more of the above group.
Estes polimorfismos também podem ser analisados em combinações de dois ou mais ou em combinação com outros polimorfismos indicativos do risco de um indivíduo de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema, inclusive dos polimorfismos restantes listados anteriormente.These polymorphisms may also be analyzed in combinations of two or more or in combination with other polymorphisms indicative of an individual's risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, including the remaining polymorphisms listed above.
São expressamente consideradas as combinações dos polimorfismos anteriores com polimorfismos que são descritos no Pedido de Patente Internacional PCT PCT/NZ02/00106, publicado como WO 02/099134.Combinations of the above polymorphisms with polymorphisms which are described in PCT International Patent Application PCT / NZ02 / 00106, published as WO 02/099134, are expressly considered.
São preferidos os ensaios que envolvem combinações de polimorfismos, incluindo as tratáveis em alta circulação, tais como aqueles que utilizam microarranjos.Assays involving combinations of polymorphisms, including high circulation treatable ones, such as those using microarray are preferred.
As análises estatísticas, particularmente dos efeitos combinados destes polimorfismos, mostram que as análises genéticas da presente invenção podem ser utilizadas para determinar o risco cociente de qualquer fumante e em particular para identificar fumantes em maior risco de desenvolvimento de COPD. Tais análises combinadas podem ser de combinações de polimorfismos de susceptibilidade apenas, de polimorfismos protetores apenas ou de combinações de ambos. As análises também podem ser em etapas, com a análise da presença ou da ausência de polimorfismos protetores que ocorrem primeiramente e então com a análise de polimorfismos de susceptibilidade ocorrendo apenas onde nenhum polimorfismo protetor está presente.Statistical analyzes, particularly of the combined effects of these polymorphisms, show that the genetic analyzes of the present invention can be used to determine the quotient risk of any smoker and in particular to identify smokers at higher risk of developing COPD. Such combined analyzes may be combinations of susceptibility polymorphisms only, protective polymorphisms only, or combinations of both. Analyzes can also be in stages, with the presence or absence of protective polymorphisms occurring first and then with susceptibility polymorphisms occurring only where no protective polymorphisms are present.
Assim, através da análise sistemática da freqüência destes polimorfismos em grupos bem definidos de fumantes e não-fumantes, como descrito aqui, é possível implicar certas proteínas no desenvolvimento de COPD e aumentar a capacidade de identificar quais fumantes estão em risco maior de desenvolvimento de função pulmonar prejudicada relacionada com a COPD e COPD com finalidades de previsão.Os presentes resultados mostram pela primeira vez que a minoria de fumantes que desenvolveu COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema o fazem porque possuem um ou mais dos polimorfismos de sus-ceptibilidade e alguns ou nenhum dos polimorfismos protetores definidos aqui. Acredita-se que a presença de um ou mais polimorfismos susceptíveis, junto com os efeitos irritantes e oxidantes prejudiciais do fumo, se combinam para tornar este grupo de fumantes altamente susceptível ao desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Fatores de risco adicionais, tais como histórico familiar, idade, peso, maços-ano etc, também terão um impacto sobre o perfil de risco de um indivíduo e podem ser avaliados em combinação com as análises genéticas descritas aqui.Thus, by systematically analyzing the frequency of these polymorphisms in well-defined groups of smokers and nonsmokers, as described here, it is possible to implicate certain proteins in the development of COPD and increase the ability to identify which smokers are most at risk for developing function. COPD and COPD-related impaired pulmonary disease for predictive purposes. The present results show for the first time that the minority of smokers who have developed COPD, emphysema or both COPD and emphysema do so because they have one or more of the susceptibility polymorphisms and some or none of the protective polymorphisms defined herein. The presence of one or more susceptible polymorphisms, together with the irritating and detrimental oxidizing effects of smoking, is believed to combine to make this group of smokers highly susceptible to the development of COPD, emphysema or both COPD and emphysema. Additional risk factors such as family history, age, weight, pack-years, etc. will also have an impact on an individual's risk profile and can be assessed in combination with the genetic analyzes described here.
O um ou mais polimorfismos podem ser detectados diretamente ou através da detecção de um ou mais polimorfismos que estão em desequilíbrio de ligação com o dito um ou mais polimorfismos. Como discutido anteriormente, o desequilíbrio de ligação é um fenômeno na genética através do qual duas ou mais mutações ou polimorfismos estão em proximidade genética íntima de forma que são co-herdados. Isto significa que na genotipagem, a detecção de um polimorfismo, quando presente, infere a presença do outro. (Reich DE e outros; Linkage disequilibrium in the human genome, Nature 2001,411:199-204.)The one or more polymorphisms may be detected directly or by detecting one or more polymorphisms that are in disequilibrium of binding with said one or more polymorphisms. As discussed earlier, linkage disequilibrium is a phenomenon in genetics whereby two or more mutations or polymorphisms are in close genetic proximity so that they are co-inherited. This means that in genotyping, detecting one polymorphism, when present, infers the presence of the other. (Reich DE et al; Linkage disequilibrium in the human genome, Nature 2001,411: 199-204.)
Os exemplos de polimorfismos relatados como estando em desequilíbrio de ligação são apresentados aqui e incluem os polimorfismos -133 C/G e 105 A/C da lnterleucina-18 e os polimorfismos Glu 416 Asp e Lys 420 Thr da proteína de ligação com a Vitamina D, como mostrado abaixo.Examples of polymorphisms reported to be in disequilibrium of binding are presented herein and include the interleukin-18 -133 C / G and 105 A / C polymorphisms and Vitamin D-binding protein Glu 416 Asp and Lys 420 Thr polymorphisms. , as shown below.
<table>table see original document page 30</column></row><table>Será evidente que os polimorfismos em desequilíbrio de ligação com um ou mais outros polimorfismos associados a maior ou menor risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema também fornecerão utilidade como biomarcadores para o risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Os dados a-presentados aqui mostram que a freqüência para os SNPs em desequilíbrio de ligação é muito similar. Conseqüentemente, estes SNPs ligados geneticamente podem ser utilizados em análises combinadas de polimorfismos para derivar um nível de risco comparável ao calculado partindo do SNP original.<table> table see original document page 30 </column> </row> <table> It will be apparent that polymorphisms in binding disequilibrium with one or more other polymorphisms associated with a higher or lower risk of developing COPD, emphysema or both COPD emphysema will also provide utility as biomarkers for the risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema. The data presented here show that the frequency for linkage unbalanced SNPs is very similar. Consequently, these genetically linked SNPs can be used in combined polymorphism analyzes to derive a risk level comparable to that calculated from the original SNP.
Será, portanto, evidente que um ou mais polimorfismos em desequilíbrio de ligação com os polimorfismos especificados aqui podem ser identificados, por exemplo, utilizando bases de dados públicas. Os exemplos de tais polimorfismos relatados como estando em desequilíbrio de ligação com os polimorfismos especificados aqui são apresentados aqui na Tabela 31.It will therefore be apparent that one or more polymorphisms in linkage disequilibrium with the polymorphisms specified herein may be identified, for example, using public databases. Examples of such polymorphisms reported to be in disequilibrium of binding with the polymorphisms specified herein are presented here in Table 31.
Os métodos da invenção estão primariamente direcionados à detecção e à identificação dos polimorfismos anteriores associados à COPD, que são todos os polimorfismos de um único nucleotídeo. Em termos gerais, um polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) é uma alteração de base única ou uma mutação pontual que resulta na variação genética entre os indivíduos. Os SNPs ocorrem no genoma humano aproximadamente uma vez a cada 100 até 300 bases e podem ocorrer em regiões codificadoras ou não-codificadoras. Devido à redundância do código genético, um SNP na região codificadora pode ou não alterar a seqüência de aminoácidos de um produto protéico. Um SNP em uma região não-codificadora pode, por exemplo, alterar a expressão gênica, por exemplo, através da modificação de regiões de controle tais como promotores, sítios de ligação de fatores de transcrição, sítios de processamento, sítios de ligação ribossomal e afetar sítios de processamento, sítios de ligação ribossomal e afetar a transcrição, o processamento e a tradução do gene.The methods of the invention are primarily directed to the detection and identification of prior COPD-associated polymorphisms, which are all single nucleotide polymorphisms. In general terms, a single nucleotide polymorphism (SNP) is a single base change or point mutation that results in genetic variation between individuals. SNPs occur in the human genome approximately once every 100 to 300 bases and can occur in coding or non-coding regions. Due to the redundancy of the genetic code, an SNP in the coding region may or may not alter the amino acid sequence of a protein product. A SNP in a non-coding region may, for example, alter gene expression, for example, by modifying control regions such as promoters, transcription factor binding sites, processing sites, ribosomal binding sites, and affecting processing sites, ribosomal binding sites and affect gene transcription, processing and translation.
Os SNPs podem facilitar estudos genéticos de associação emgrande escala e tem havido recentemente grande interesse na descoberta e na detecção de SNPs. Os SNPs exibem grande promessa como marcadores para um número de características fenotípicas (incluindo características latentes), tais como, por exemplo, propensão e gravidade de doenças, pro-pensão ao estado saudável e capacidade de resposta a fármacos incluindo, por exemplo, susceptibilidade a reações adversas a fármacos. O conhecimento da associação de um SNP particular com uma característica fenotípi-ca, acoplado ao conhecimento do fato de um indivíduo ter o dito SNP particular, pode possibilitar o direcionamento de aplicações para diagnóstico, preventivas e terapêuticas para permitir melhor controle de doenças, para aumentar o entendimento de estados de doença e para em última análise facilitar a descoberta de tratamentos mais eficientes, tais como regimes de tratamento personalizados.SNPs may facilitate large-scale genetic association studies, and there has recently been great interest in the discovery and detection of SNPs. SNPs have great promise as markers for a number of phenotypic features (including latent features), such as, for example, disease propensity and severity, healthy state pension and responsiveness to drugs including, for example, susceptibility to disease. adverse drug reactions. Knowledge of the association of a particular SNP with a phenotypic characteristic, coupled with the knowledge of the fact that an individual has said particular SNP, may enable the directing of diagnostic, preventive and therapeutic applications to allow better disease control, to increase understanding disease states and ultimately facilitating the discovery of more efficient treatments, such as personalized treatment regimens.
Na verdade, foi construído um número de bases de dados de SNPs conhecidos e para alguns tais SNPs, o efeito biológico associado a um SNP. Por exemplo, a base de dados de SNP do NCBI "dbSNP" é incorporada no sistema NCBI's Entrez e pode ser pesquisada utilizando a mesma a-bordagem que as outras bases de dados Entrez tais como PubMed e Gen-Bank. Esta base de dados possui registros para mais de 1,5 milhões de SNPs mapeados na seqüência genômica humana. Cada entrada na dbSNP inclui o contexto de seqüência do polimorfismo (isto é, a seqüência circun-dante), a freqüência de ocorrência do polimorfismo (por população ou indivíduo) e o(s) método(s) experimental(is), protocolos e condições utilizadas para analisar a variação e pode incluir informação associada a um SNP com uma característica fenotípica particular.Indeed, a number of known SNP databases have been constructed and for some such SNPs, the biological effect associated with a SNP. For example, the NCBI SNP database "dbSNP" is incorporated into the Entrez NCBI's system and can be searched using the same embroidering as other Entrez databases such as PubMed and Gen-Bank. This database has records for over 1.5 million SNPs mapped in the human genomic sequence. Each entry in dbSNP includes the sequence context of the polymorphism (ie, the surrounding sequence), the frequency of occurrence of the polymorphism (per population or individual), and the experimental method (s), protocols, and conditions used to analyze variation and may include information associated with a SNP with a particular phenotypic characteristic.
Pelo menos em parte por causa do impacto potencial sobre a saúde e o bem-estar, foi e continua a ser um grande tarefa de esforço desenvolver métodos que identificam de forma confiável e rápida os SNPs. Esta não é uma tarefa trivial, pelo menos em parte, por causa da complexidade do DNA genômico humano, com um genoma haplóide de 3 x 109 pares de bases e os requerimentos de sensibilidade e discriminatórios associados.At least in part because of the potential impact on health and well-being, it has been and remains a major task to develop methods that reliably and rapidly identify SNPs. This is not a trivial task, at least in part, because of the complexity of human genomic DNA, with a 3 x 109 base pair haploid genome and associated sensitivity and discriminatory requirements.
As abordagens de genotipagem para detectar os SNPs são bemconhecidas na técnica e incluem o seqüenciamento do DNA, métodos que requerem hibridização específica a alelos de iniciadores ou sondas, incorporação específica a alelos de nucleotídeos aos iniciadores ligados próximos a ou adjacentes aos polimorfismos (freqüentemente referidos como "extensão de bases isoladas" ou "miniseqüenciamento"), ligação (união) específica ao alelo de oligonucleotídeos (reação em cadeia de ligação ou sondas "pad-lock" de ligação), clivagem específica ao alelo de oligonucleotídeos ou produtos da PCR por enzimas de restrição (análise de polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição.ou RFLP) ou agentes químicos ou outros, resolução de diferenças dependentes aos alelos nas mobilidades ele-troforéticas ou cromatográficas, por enzimas específicas às estruturas incluindo enzimas específicas a estruturas invasivas ou espectrometria de massa. A análise da variação de aminoácidos também é possível quando o SNP fica em uma região codificadora e resulta em uma alteração de aminoácido.Genotyping approaches for detecting SNPs are well known in the art and include DNA sequencing, methods that require primer or probe allele-specific hybridization, nucleotide allele-specific incorporation into primers linked to or adjacent to polymorphisms (often referred to as "isolated base extension" or "mini-sequencing"), oligonucleotide allele-specific binding (binding chain reaction or "pad-lock" probes), allele-specific cleavage of oligonucleotide or enzyme PCR products restriction analysis (restriction fragment length polymorphisms.or RFLP analysis) or chemical or other agents, resolution of allele-dependent differences in electrophoretic or chromatographic mobility, by structure-specific enzymes including invasive-structure-specific enzymes or pasta. Analysis of amino acid variation is also possible when SNP is in a coding region and results in an amino acid change.
O seqüenciamento do DNA permite a determinação direta e a identificação dos SN Ps. Os benefícios na especificidade e na acurácia são geralmente supervalorizados com a finalidade de triagem pelas dificuldades inerentes ao seqüenciamento do genoma inteiro ou até mesmo de subge-noma direcionado.DNA sequencing allows direct determination and identification of SN Ps. The benefits in specificity and accuracy are often overestimated for the purpose of screening for inherent difficulties in sequencing the entire genome or even directed subgenome.
O miniseqüenciamento envolve permitir que um iniciador se hibridize à seqüência de DNA adjacente ao sítio do SNP na amostra de teste sob investigação. O iniciador é estendido por um nucleotídeo utilizando todos os quatro didesoxinucleotídeos fluorescentes marcados de forma diferencial (A,C,G ou T) e uma DNA polimerase. Apenas um dos quatro nucleotídeos (caso homozigoto) ou dois dos quatro nucleotídeos (caso heterozigo-to) são incorporados. A base que é incorporada é complementar ao nucleotídeo na posição do SNP.Mini-sequencing involves allowing an primer to hybridize to the DNA sequence adjacent to the SNP site in the test sample under investigation. The primer is extended by a nucleotide using all four differentially labeled fluorescent dideoxynucleotides (A, C, G or T) and one DNA polymerase. Only one of four nucleotides (homozygous case) or two of four nucleotides (heterozygote case) are incorporated. The base that is incorporated is complementary to the nucleotide at the SNP position.
Um número de métodos atualmente utilizados para a detecção de SNPs envolve hibridização específica ao sítio e/ou específica ao alelo.A number of methods currently used for the detection of SNPs involve site-specific and / or allele-specific hybridization.
Estes métodos confiam enormemente na ligação discriminadora de oligonucleotídeos às seqüências alvo que contêm o SNP de interesse. As técnicas da Affymetrix (Santa Clara, Calif.) e da Nanogen Inc. (San Diego, Calif.) sãoparticularmente bem conhecidas e utilizam o fato de que os duplices de DNA que contêm combinações erradas de bases isoladas são muito menos estáveis que os duplices que têm bases perfeitamente pareadas. A presença de um dúplex combinado é detectada por fluorescência.These methods rely heavily on the discriminative binding of oligonucleotides to target sequences containing the SNP of interest. The techniques of Affymetrix (Santa Clara, Calif.) And Nanogen Inc. (San Diego, Calif.) Are particularly well known and utilize the fact that DNA duplicates containing wrong combinations of isolated bases are much less stable than duplicates. which have perfectly matched bases. The presence of a combined duplex is detected by fluorescence.
A maior parte dos métodos para a detecção ou para a identificação dos SNPs por hibridização específica ao sítio requer a amplificação direcionada através de métodos tal como a PCR para aumentar a sensibilidade e a especificidade (ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.679.524, a publicação PCT WO 98/59066, a publicação PCT WO 95/12607). O Pedido dePatente U.S. 20050059030 (incorporado aqui em sua totalidade) descreve um método para a detecção de um polimorfismo de um único nucleotídeo no DNA humano total sem amplificação prévia ou redução da complexidade para enriquecer seletivamente em relação à seqüência alvo e sem o auxílio de qualquer reação enzimática. O método utiliza uma hibridização em umaúnica etapa que envolve dois eventos de hibridização: hibridização de uma primeira parte da seqüência alvo com uma sonda de captura e hibridização de uma segunda parte da dita seqüência alvo com uma sonda de detecção. Ambos os eventos de hibridização ocorrem na mesma reação e a ordem em que a hibridização ocorre não é crítica.Most methods for the detection or identification of SNPs by site-specific hybridization require directed amplification by methods such as PCR to increase sensitivity and specificity (see, for example, US Patent No. 5,679. 524, PCT publication WO 98/59066, PCT publication WO 95/12607). US Patent Application 20050059030 (incorporated herein in its entirety) describes a method for detecting a single nucleotide polymorphism in total human DNA without prior amplification or reduction of complexity to selectively enrich over the target sequence and without the aid of any enzymatic reaction. The method utilizes a single step hybridization involving two hybridization events: hybridization of a first part of the target sequence with a capture probe and hybridization of a second part of said target sequence with a detection probe. Both hybridization events occur in the same reaction and the order in which hybridization occurs is not critical.
O Pedido de Patente U.S. 20050042608 (incorporado aqui em sua totalidade) descreve uma modificação do método de detecção eletrome-cânica de hibridização de ácidos nucléicos de Thorp e outros. (Patente U.S. N2 5.871.918). Sucintamente, as sondas de captura são planejadas, cada uma das quais possui uma base de SNP diferente e uma seqüência de bases da sonda em cada lado da base do SNP. As bases da sonda são com-plementares à seqüência alvo correspondente adjacente ao sítio do SNP. Cada sonda de captura é imobilizada sobre um eletrodo diferente que possui uma camada externa não condutora sobre uma superfície de trabalho con-dutora de um substrato. A extensão de hibridização entre cada sonda de captura e o alvo de ácido nucléico é detectada através da detecção da reação de oxidação-redução em cada eletrodo, utilizando um complexo de metal de transição. Estas diferenças nas taxas de oxidação nos eletrodos dife-rentes são utilizadas para determinar se o alvo de ácido nucléico selecionado possui um polimorfismo de um único nucleotídeo no sítio do SNP selecionado.U.S. Patent Application 20050042608 (incorporated herein in its entirety) describes a modification of the electromechanical detection method of Thorp et al nucleic acid hybridization. (U.S. Patent No. 5,871,918). Briefly, capture probes are designed, each of which has a different SNP base and a probe base sequence on each side of the SNP base. The probe bases are complementary to the corresponding target sequence adjacent to the SNP site. Each capture probe is immobilized on a different electrode that has a nonconductive outer layer on a conductive work surface of a substrate. The extent of hybridization between each capture probe and nucleic acid target is detected by detecting the oxidation-reduction reaction on each electrode using a transition metal complex. These differences in oxidation rates at the different electrodes are used to determine if the selected nucleic acid target has a single nucleotide polymorphism at the selected SNP site.
A técnica da Lynx Therapeutics (Hayward, Calif.) que utiliza a tecnologia MEGATYPE™ pode genotipar números muito grandes de SNPs simultaneamente partindo de conjuntos pequenos ou grandes de material genômico. Esta tecnologia utiliza sondas rotuladas de forma fluorescente e compara os genomas coletados de duas populações, possibilitando a detecção e a recuperação de fragmentos de DNA que abrangem os SNPs que distinguem as duas populações, sem requerer mapeamento ou conhecimento do SNP prévio.Lynx Therapeutics (Hayward, Calif.) Technique using MEGATYPE ™ technology can genotype very large numbers of SNPs simultaneously from small or large sets of genomic material. This technology utilizes fluorescently labeled probes and compares the genomes collected from two populations, enabling the detection and retrieval of DNA fragments that span the SNPs that distinguish the two populations without requiring prior mapping or knowledge of the SNP.
Existe um número de outros métodos para a detecção e a identificação dos SNPs. Estes incluem o uso de espectrometria de massa, por exemplo, para medir as sondas que se hibridizam com o SNP. Esta técnica varia em relação a quão rapidamente pode ser realizada, partindo de algumas amostras por dia até uma alta circulação de 40.000 SNPs por dia, utilizando rótulos de código de massa. Um exemplo preferido é o uso da determinação espectrométrica de massa de uma seqüência de ácido nucléico que compreende os polimorfismos da invenção, por exemplo, que inclui o promoter do gene COX2 ou uma seqüência complementar. Tais métodos espec-. trométricos de massa são conhecidos pelos versados na técnica e os métodos de genotipagem da invenção são tratáveis à adaptação para a detecção espectrométrica de massa dos polimorfismos da invenção, por exemplo, os polimorfismos do promotor COX2 da invenção.There are a number of other methods for detecting and identifying SNPs. These include the use of mass spectrometry, for example, to measure probes that hybridize to SNP. This technique varies from how quickly it can be performed, from a few samples per day to a high circulation of 40,000 SNPs per day using mass code labels. A preferred example is the use of mass spectrometric determination of a nucleic acid sequence comprising the polymorphisms of the invention, for example, which includes the COX2 gene promoter or a complementary sequence. Such methods specif. Mass spectrometers are known to those skilled in the art, and the genotyping methods of the invention are treatable to adapt for mass spectrometric detection of the polymorphisms of the invention, for example the COX2 promoter polymorphisms of the invention.
Os SNPs também podem ser determinados através da análise de ligação a partículas. A análise requer dois iniciadores que se hibridizam com um alvo com um espaço de nucleotídeo entre os iniciadores. Cada um dos quatro nucleotídeos é adicionado a uma mistura de reação separada contendo DNA polimerase, ligase, DNA alvo e os iniciadores. A polimerase adiciona um nucleotídeo na extremidade a 3' do primeiro iniciador que é complementar ao SNP e a ligase então liga os dois iniciadores adjacentes. Após o aquecimento da amostra, se tiver ocorrido ligação, o iniciador agoramaior permanecerá hibridizado e um sinal, por exemplo, fluorescência, pode ser detectado. Uma discussão adicional destes métodos pode ser encontrada nas Patentes U.S. N— 5.919.626; 5.945.283; 5.242.794; e 5.952.174.SNPs can also be determined by particle binding analysis. Analysis requires two primers that hybridize to a target with a nucleotide space between primers. Each of the four nucleotides is added to a separate reaction mixture containing DNA polymerase, ligase, target DNA and primers. The polymerase adds a nucleotide at the 3 'end of the first primer that is complementary to SNP and the ligase then binds the two adjacent primers. After heating of the sample, if binding has occurred, the now larger primer will remain hybridized and a signal, eg fluorescence, can be detected. Further discussion of these methods can be found in U.S. Patent Nos. 5,919,626; 5,945,283; 5,242,794; and 5,952,174.
A Patente U.S. N2 6.821.733 (incorporada aqui em sua totalidade) descreve métodos para a detecção das diferenças na seqüência de duas moléculas de ácidos nucléicos que incluem as etapas de: contato dos dois ácidos nucléicos sob condições que permitem a formação de um complexo de quatro vias e migração de ramificação; contato do complexo de quatro vias com uma molécula traçadora e uma molécula de detecção sob condições em que a molécula de detecção é capaz de se ligar com a molécula traçadora ou o complexo de quatro vias; e determinação da ligação da molécula traçadora com a molécula de detecção antes e depois da exposição ao complexo de quatro vias. A competição do complexo de quatro vias com a molécula traçadora em relação à ligação com a molécula de detecção indica uma diferença entre os dois ácidos nucléicos.US Patent No. 6,821,733 (incorporated herein in its entirety) describes methods for detecting differences in the sequence of two nucleic acid molecules that include the steps of: contacting the two nucleic acids under conditions that allow the formation of a complex of four-way and branch migration; contacting the four-way complex with a tracer molecule and a detection molecule under conditions wherein the detection molecule is capable of binding with the tracer molecule or the four-way complex; and determining the binding of the tracer molecule to the detection molecule before and after exposure to the four-way complex. Competition of the four-way complex with the tracer molecule for binding to the detection molecule indicates a difference between the two nucleic acids.
As abordagens com base em proteína e proteômica também são adequadas para a detecção e a análise dos polimorfismos. Os polimorfismos que resultam em ou estão associados à variação nas proteínas expressas podem ser detectados diretamente ou através da análise das ditas proteínas.Proteom and protein based approaches are also suitable for detecting and analyzing polymorphisms. Polymorphisms that result in or are associated with variation in expressed proteins may be detected directly or by analysis of said proteins.
Isto requer tipicamente a separação das várias proteínas dentro de uma a-mostra, por exemplo, através de eletroforese em gel ou HPLC e a identificação das ditas proteínas ou peptídeos derivadas das mesmas, por exemplo, por RMN ou seqüenciamento de proteínas tal como o seqüenciamento químico ou de forma mais prevalente espectrometria de massa. As metodologias proteômicas são bem conhecidas na técnica e possuem grande potencial para automação. Por exemplo, sistemas integrados, tal como o sistema Pro-teomlQ™ da Proteome Systems, fornecem plataformas de alta circulação para análise de proteomas que combina a preparação de amostras, a separação de proteínas, a aquisição de imagens e a análise, o processamento da proteína, a espectrometria de massa e as tecnologias de bioinformática.This typically requires the separation of the various proteins within a sample, for example by gel electrophoresis or HPLC, and the identification of said proteins or peptides derived from them, for example by NMR or protein sequencing such as sequencing. chemical or more prevalently mass spectrometry. Proteomic methodologies are well known in the art and have great potential for automation. For example, integrated systems such as Proteome Systems' Pro-teomlQ ™ system provide high-circulation proteome analysis platforms that combine sample preparation, protein separation, image acquisition and analysis, processing protein, mass spectrometry and bioinformatics technologies.
A maior parte dos métodos de proteômica de identificação de proteínas utiliza espectrometria de massa, incluindo espectrometria de mas-sa com captura iônica, cromatografia líquida (LC) e espectrometria de massa LC/MSn, espectrometria de massa com cromatografia a gás (GC), espec-trômetro de massa de ressonância de ciclotron iônica com transformação de Fourier (FT-MS), espectrometria de massa MALDI-TOF e espectrometria de massa ESI e seus derivados. Os métodos espectrométricos de massa também são úteis na determinação da modificação pós-tradução de proteínas, tal como fosforilação ou glicosilação e assim possuem utilidade na determinação dos polimorfismos que resultam em ou estão associados à variação nas modificações pós-tradução de proteínas.Most protein identification proteomics methods use mass spectrometry, including ion capture mass spectrometry, liquid chromatography (LC) and LC / MSn mass spectrometry, gas chromatography (GC) mass spectrometry, Fourier transformation ion cyclotron resonance mass spectrometer (FT-MS), MALDI-TOF mass spectrometry and ESI mass spectrometry and derivatives. Mass spectrometric methods are also useful in determining post-translational protein modification, such as phosphorylation or glycosylation, and thus have utility in determining polymorphisms that result in or are associated with variation in post-translational protein modifications.
As tecnologias associadas também são bem conhecidas e incluem, por exemplo, dispositivos para processamento de proteínas tal como "Chemical Inkjet Printer" que compreende a tecnologia de impressão piezoe-létrica que permite a digestão enzimática ou química in situ de amostras de proteínas "eletroblotted" provenientes de géis PAGE 2-D em membranasatravés do jato da enzima ou do reagente químico diretamente sobre os pontos de proteína selecionados. Após a digestão in situe a incubação das proteínas, a membrana pode ser colocada diretamente no espectrômetro de massa para a análise dos peptídeos.Associated technologies are also well known and include, for example, protein processing devices such as the Chemical Inkjet Printer which comprises piezoelectric printing technology that enables in situ enzymatic or chemical digestion of electroblotted protein samples. from PAGE 2-D gels on membranes through enzyme or chemical reagent jet directly over selected protein points. After digestion in situ the protein incubation, the membrane can be placed directly on the mass spectrometer for peptide analysis.
Um grande número de métodos confia na variabilidade conformacional de ácidos nucléicos foi desenvolvido para detectar os SNPs.A large number of methods rely on conformational variability of nucleic acids has been developed to detect SNPs.
Por exemplo, o Polimorfismo Conformacional de Filamento Simples (SSCP, Orita e outros, PNAS 1989 86: 2766-2770) é um método que confia na capacidade de ácidos nucléicos de filamento simples de formar estrutura secundária em solução sob certas condições. A estrutura secundária depende da composição de bases e pode ser alterada através de uma substituição de um único nucleotídeo, causando diferenças na mobilidade eletroforética sob condições não-desnaturantes. Os vários polimorfos são tipicamente detectados por autorradiografia quando marcados de forma radioativa, por coloração com prata das bandas, por hibridização com fragmentos de sonda marcados de forma que podem ser detectados ou pelo uso de iniciadores da PCR fluorescentes que são subseqüentemente detectados, por exemplo, através de um seqüenciador de DNA automatizado.As modificações nos SSCP são bem conhecidas na técnica e incluem o uso de condições de corrida em gel diferentes, tal como, por e-xemplo, diferindo a temperatura ou a adição de aditivos e matrizes de géis diferentes. Outras variações nos SSCP são bem conhecidas pelos versados na técnica, incluindo, RNA-SSCP, SSCP com padrão genético por endonu-cleases de restrição, padrão genético por didesóxi (um híbrido entre o se-qüenciamento de didesóxi e SSCP), padrão genético por didesóxi bidirecio-nal (em que a reação de terminação por didesóxi é realizada simultaneamente com dois iniciadores opostos) e PCR-SSCP Fluorescente (em que os produtos da PCR são marcados internamente com vários corantes fluorescentes, podem ser digeridos com enzimas de restrição, seguidas por SSCP e analisados em um seqüenciador de DNA automatizado capaz de detectar os corantes fluorescentes).For example, Single Filament Conformational Polymorphism (SSCP, Orita et al., PNAS 1989 86: 2766-2770) is a method that relies on the ability of single filament nucleic acids to form secondary structure in solution under certain conditions. The secondary structure depends on the base composition and can be altered by a single nucleotide substitution, causing differences in electrophoretic mobility under non-denaturing conditions. The various polymorphs are typically detected by autoradiography when radiolabeled, by silver staining of the bands, by hybridization to detectable labeled fragments or by the use of fluorescent PCR primers which are subsequently detected, for example. via an automated DNA sequencer. Modifications to SSCPs are well known in the art and include the use of different gel race conditions, such as, for example, differing temperature or the addition of different gel additives and matrices. . Other variations in SSCP are well known to those skilled in the art, including RNA-SSCP, restriction endonuclease genetic pattern SSCP, dideoxy genetic pattern (a hybrid between dideoxy sequencing and SSCP), Bidirectional dideoxy (where the dideoxy termination reaction is performed simultaneously with two opposite primers) and Fluorescent PCR-SSCP (where PCR products are internally labeled with several fluorescent dyes, may be digested with restriction enzymes, followed by SSCP and analyzed in an automated DNA sequencer capable of detecting fluorescent dyes).
Outros métodos que utilizam a mobilidade variável de estruturas de ácidos nucléicos diferentes incluem a Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE), a Eletroforese em Gel com Gradiente de Temperatura (TGGE) e a Análise de Heterodúplices (HET). Aqui, a variação na dissociação do DNA de filamento duplo (por exemplo, causada por combinações erradas de pares de bases) resulta em uma alteração na mobilidade eletroforética. Estas modificações na mobilidade são utilizadas para detectar variações de nucleotídeos.Other methods that utilize the variable mobility of different nucleic acid structures include Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE), and Heteroduplicate Analysis (HET). Here, variation in dissociation of double stranded DNA (for example, caused by wrong base pair combinations) results in a change in electrophoretic mobility. These mobility modifications are used to detect nucleotide variations.
A Cromatografia Líquida de Alta Pressão Desnaturante (HPLC) é ainda um método adicional utilizado para detectar os SNPs, utilizando métodos de HPLC bem conhecidos na técnica como uma alternativa aos métodos de separação descritos anteriormente (tal como a eletroforese em gel) para detectar, por exemplo, homodúplices e heterodúplices que são eluídos da coluna de HPLC em taxas diferentes, possibilitando assim a detecção de nucleotídeos com pareamento errado assim dos SNPs.Denaturing High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) is still an additional method used to detect SNPs using HPLC methods well known in the art as an alternative to the separation methods described above (such as gel electrophoresis) to detect, by homoduplices and heteroduplices which are eluted from the HPLC column at different rates, thus enabling the detection of mismatched nucleotides from SNPs.
Ainda métodos adicionais para a detecção dos SNPs se baseiam na susceptibilidade diferente de ácidos nucléicos de filamento simples e de filamento duplo à clivagem por vários agentes, incluindo agentes de cli-vagem química e enzimas nucleolíticas. Por exemplo, a clivagem dos pare-amentos errados dentro de heteroduplices de RNA:DNA pela RNase A, de heteroduplices, por exemplo, pela endonuclease Yll de bacteriófago T4 ou endonuclease I de 17, da extremidade a 5 das alças do "grampo de cabelo" na junção entre o DNA de filamento simples e de filamento duplo pela cleavase I e a modificação dos nucleotídeos com pareamento errado dentro dos heteroduplices por agentes químicos comumente utilizados na química de seqüenciamento de Maxam-Gilbert, são bem conhecidas na técnica.Further methods for detecting SNPs are based on the different susceptibility of single stranded and double stranded nucleic acids to cleavage by various agents, including chemical cleavage agents and nucleolytic enzymes. For example, cleavage of mismatches within RNA: DNA heteroduplicates by RNase A, from heteroduplicates, for example by bacteriophage T4 endonuclease Y11 or endonuclease I of 17, from the 5 to the 5 loop hairpin loops. "At the junction between cleavase I single stranded and double stranded DNA and modification of mismatched nucleotides within heteroduplices by chemical agents commonly used in Maxam-Gilbert sequencing chemistry are well known in the art.
Exemplos adicionais incluem o Teste de Tradução de Proteínas (PTT), utilizado para resolver códons de término por variações que levam a um término prematuro da tradução e a produtos de proteínas com tamanho reduzido e ao uso de proteínas de ligação com combinação errada. As variações são detectadas através da ligação, por exemplo, da proteína MutS, um componente do sistema de reparo de combinações erradas do DNA de Escherichia coli ou das proteínas hMSH2 e GTBP humanas, a heterodúplices de DNA de filamento duplo contendo bases com pareamento errado. Os dúplices de DNA são então incubados com a proteína de ligação com combinação errada e as variações são detectadas através do ensaio de alteração na mobilidade. Por exemplo, um ensaio simples se baseia no fato de que a ligação da proteína de ligação com combinação errada com o hetero-duplex protege o heteroduplex da degradação por exonucleases.Additional examples include the Protein Translation Test (PTT), which is used to resolve termination codons by variations that lead to premature termination of translation and reduced protein products and the use of mismatched binding proteins. Variations are detected by binding, for example, from MutS protein, a component of the Escherichia coli DNA mismatch repair system or human hMSH2 and GTBP proteins, to double-stranded double-stranded DNA heteroduplicates. The DNA duplicates are then incubated with the mismatched binding protein and variations are detected by the mobility change assay. For example, a simple assay is based on the fact that binding of the mismatched binding protein with hetero-duplex protects the heteroduplex from exonuclease degradation.
Os versados na técnica saberão que um SNP particular, particularmente quando ocorre em uma região reguladora de um gene tal como um promotor, pode estar associado com a expressão alterada de um gene. A expressão alterada de um gene também pode resultar quando o SNP estiver localizado na região codificadora de um gene que codifica proteína, por e-xemplo, em que o SNP está associado com códons de uso variado e assim com tRNAs de abundância diferente. Tal expressão alterada pode ser determinada através de métodos bem conhecidos na arte e pode assim ser empregada para detectar tais SNPs. Similarmente, quando um SNP ocorre na região codificadora de um gene e resulta em uma substituição de amino-ácido não sinônima, tal substituição pode resultar em uma alteração na função do produto gênico. Similarmente, em casos em que o produto gênico éum RNA, tais SNPs podem resultar em uma alteração da função no produto gênico de RNA. Qualquer tal alteração na função, por exemplo, quando avaliada em um ensaio de atividade ou de funcionalidade, pode ser empregrada para detectar tais SNPs.Those skilled in the art will know that a particular SNP, particularly when occurring in a regulatory region of a gene such as a promoter, may be associated with altered expression of a gene. Altered expression of a gene may also result when SNP is located in the coding region of a protein-encoding gene, for example, where SNP is associated with codons of varying use and thus with different abundance tRNAs. Such altered expression may be determined by methods well known in the art and may thus be employed to detect such SNPs. Similarly, when an SNP occurs in the coding region of a gene and results in a non-synonymous amino acid substitution, such substitution may result in a change in gene product function. Similarly, in cases where the gene product is RNA, such SNPs may result in a change in function in the RNA gene product. Any such change in function, for example when evaluated in an activity or functionality assay, may be employed to detect such SNPs.
Os métodos anteriores de detecção e de identificação de SNPs são tratáveis ao uso nos métodos da invenção.The foregoing SNP detection and identification methods are treatable for use in the methods of the invention.
Evidentemente, a fim de detectar e identificar os SNPs de acordo com a invenção, é obtida uma amostra contendo o material que será testado do indivíduo. A amostra pode ser qualquer amostra que contenha potencialmente os SNPs alvos (ou polipeptídeos alvos, como pode ser o caso) e obtida partindo de qualquer fluido corporal (sangue, urina, saliva etc) bióp-sias ou outras preparações de tecidos.Of course, in order to detect and identify SNPs according to the invention, a sample containing the material to be tested from the individual is obtained. The sample can be any sample that potentially contains the target SNPs (or target polypeptides, as may be the case) and is derived from any biopsy body fluid (blood, urine, saliva, etc.) or other tissue preparations.
O DNA ou o RNA podem ser isolados partindo da amostra de acordo com qualquer um de um número de métodos bem conhecidos naarte. Por exemplo, os métodos de purificação de ácidos nucléicos são descritos em Tijssen; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio-logy: Hybridization with nucleic acid sondas Part 1: Theory and Nucleic acid preparation, Elsevier, Nova York, N.Y. 1993, assim como em Maniatis, T., Fritsch, E. F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual 1989.DNA or RNA may be isolated from the sample according to any of a number of methods well known in the art. For example, nucleic acid purification methods are described in Tijssen; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio-logy: Hybridization with nucleic acid probes Part 1: Theory and Nucleic acid preparation, Elsevier, New York, NY 1993, as well as in Maniatis, T., Fritsch, EF and Sambrook, J., Molecular Cloning Manual 1989.
Para auxiliar com a detecção da presença ou da ausência de polimorfismos/SNPs, podem ser fornecidas as sondas e/ou os iniciadores de ácidos nucléicos. Tais sondas possuem seqüências de ácidos nucléicos específicas para alterações cromossômicas que evidenciam a presença ou a ausência do polimorfismo e são preferencialmente marcadas com uma substância que emite um sinal que pode ser detectado quando combinado com o polimorfismo alvo.To assist in detecting the presence or absence of polymorphisms / SNPs, probes and / or nucleic acid primers may be provided. Such probes have specific nucleic acid sequences for chromosomal alterations that evidence the presence or absence of the polymorphism and are preferably labeled with a substance that emits a signal that can be detected when combined with the target polymorphism.
As sondas de ácidos nucléicos podem ser de DNA genômico ou de cDNA ou de mRNA ou de qualquer material similar a RNA ou similar a DNA, tais como ácidos nucléicos peptídicos, DNAs ramificados e similares.Nucleic acid probes may be genomic or cDNA or mRNA DNA or any RNA-like or DNA-like material such as peptide nucleic acids, branched DNAs and the like.
As sondas podem ser sondas de polinucleotídeos senso ou anti-senso. Quando os polinucleotídeos alvos são de filamento duplo, as sondas podem ser de filamentos senso ou anti-senso. Quando os polinucleotídeos alvossão de filamento duplo, as sondas são filamentos simples complementares.The probes may be sense or antisense polynucleotide probes. When target polynucleotides are double stranded, the probes may be sense or antisense strands. When double stranded polynucleotides, the probes are complementary single strands.
As sondas podem ser preparadas através de uma variedade de esquemas sintéticos ou enzimaticos, que são bem conhecidos na técnica. As sondas podem ser sintetizadas, totalmente ou em parte, utilizando métodos químicos bem conhecidos na arte (Caruthers e outros, Nucleic Acids Res., Symp. Ser., 215-233 (1980)). Alternativamente, as sondas podem ser geradas, totalmente ou em parte, de forma enzimática.Probes may be prepared by a variety of synthetic or enzymatic schemes, which are well known in the art. Probes may be synthesized in whole or in part using chemical methods well known in the art (Caruthers et al., Nucleic Acids Res., Symp. Ser., 215-233 (1980)). Alternatively, the probes may be generated wholly or in part enzymatically.
Os análogos de nucleotídeos podem ser incorporados nas sondas através de métodos bem conhecidos na arte. O único requerimento é que o análogo de nucleotídeo incorporado tenha que servir para fazer pare-amento de bases com as seqüências de polinucleotídeos alvos. Por exemplo, certos nucleotídeos guanina podem ser substituídos por hipoxantina, que faz pareamento de base com resíduos de citosina. Entretanto, estes pares de bases são menos estáveis que aqueles entre guanina e citosina. Alternativamente, os nucleotídeos adenina podem ser substituídos por 2,6-diaminopurina, que pode formar pares de bases mais fortes que aqueles entre adenina e timidina.Nucleotide analogs may be incorporated into the probes by methods well known in the art. The only requirement is that the incorporated nucleotide analogue must be used to base pair with the target polynucleotide sequences. For example, certain guanine nucleotides may be substituted for hypoxanthine, which is base paired with cytosine residues. However, these base pairs are less stable than those between guanine and cytosine. Alternatively, adenine nucleotides may be replaced by 2,6-diaminopurine, which may form stronger base pairs than those between adenine and thymidine.
Adicionalmente, as sondas podem incluir nucleotídeos que foram derivatizados quimicamente ou enzimaticamente. As modificações químicas típicas incluem derivatização com grupos acila, alquila, arila ou amino.Additionally, probes may include nucleotides that have been chemically or enzymatically derivatized. Typical chemical modifications include derivatization with acyl, alkyl, aryl or amino groups.
As sondas podem ser imobilizadas em um substrato. Os substratos preferidos são qualquer suporte rígido ou semi-rígido adequado incluindo membranas, filtros, chips, lâminas, wafers, fibras, esferas magnéticas ou não magnéticas, géis, tubos, placas, polímeros, micropartículas e capilares. O substrato pode ter uma variedade de formas de superfície, tais como cavidades, fossos, pinos, canais e poros, à qual as sondas de polinucleotídeos são ligadas. Preferencialmente, os substratos são opticamente transparentes.Probes may be immobilized on a substrate. Preferred substrates are any suitable rigid or semi-rigid support including membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic spheres, gels, tubes, plates, polymers, microparticles and capillaries. The substrate may have a variety of surface shapes, such as cavities, pits, pins, channels, and pores, to which polynucleotide probes are attached. Preferably, the substrates are optically transparent.
Além disso, as sondas não têm que ser ligadas diretamente ao substrato, mas ao invés disso podem estar ligadas ao substrato através de um grupo ligante. Os grupos ligantes possuem tipicamente aproximadamente 6 até 50 átomos de comprimento para fornecer exposição à sonda ligada. Os grupos ligantes preferidos incluem oligômeros de etileno glicol, diaminas,diácidos e similares. Os grupos reativos sobre a superfície do substrato reagem com uma das porções terminais do ligante para ligar o ligante ao substrato. A outra porção terminal do ligante é então funcionalizada para a ligação da sonda.In addition, the probes do not have to be attached directly to the substrate, but instead may be attached to the substrate via a linker group. Linker groups are typically approximately 6 to 50 atoms in length to provide exposure to the bound probe. Preferred linking groups include ethylene glycol oligomers, diamines, diacids and the like. Reactive groups on the substrate surface react with one of the binder end portions to bind the binder to the substrate. The other terminal portion of the binder is then functionalized for probe binding.
As sondas podem ser ligadas a um substrato através do fornecimento dos reagentes para a síntese da sonda sobre a superfície do substrato ou através do fornecimento de fragmentos de DNA ou de clones pré-formados sobre a superfície do substrato. Os dispositivos de fornecimento típicos incluem uma solução de fornecimento por micropipeta ao substrato com um sistema robótico para controlar a posição da micropipeta em relação ao substrato. Pode haver uma variedade de dispositivos de fornecimento de forma que os reagentes possam ser fornecidos nas regiões de reação simultaneamente.Probes may be attached to a substrate by providing the probe synthesis reagents on the substrate surface or by providing DNA fragments or preformed clones on the substrate surface. Typical delivery devices include a micropipette substrate delivery solution with a robotic system for controlling the position of the micropipette relative to the substrate. There may be a variety of delivery devices so that reagents can be delivered to the reaction regions simultaneously.
São preferidos os microarranjos de ácidos nucléicos. Tais micro-arranjos (incluindo chips de ácidos nucléicos) são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N- 5.578.832; 5.861.242; 6.183.698; 6.287.850; 6.291.183; 6.297.018; 6.306.643; e 6.308.170, cada uma incorporada como referência).Nucleic acid microarrays are preferred. Such microarray (including nucleic acid chips) are well known in the art (see, for example, U.S. Patent Nos. 5,578,832; 5,861,242; 6,183,698; 6,287,850; 6,291,183; 6,297,018 6,306,643, and 6,308,170, each incorporated by reference).
Alternativamente, podem ser produzidos microarranjos de anti-corpos. A produção de tais microarranjos é essencialmente como descrito em Schweitzer & Kingsmore, "Measuring proteins on microarrays", CurrOpin Biotechnol 2002; 13(1): 14-9; Avseekno e outros, "Immobilization of proteins in immunochemical microarranjos fabricated by electrospray deposition", A-nal Chem 2001 15; 73(24): 6047-52; Huang, "Detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system, Immunol Methods 2001 1; 255 (1-2): 1-13.Alternatively, antibody microarray may be produced. Production of such microarrays is essentially as described in Schweitzer & Kingsmore, "Measuring proteins on microarrays", CurrOpin Biotechnol 2002; 13 (1): 14-9; Avseekno et al, "Immobilization of proteins in immunochemical microarray manufactured by electrospray deposition", A-nal Chem 2001 15; 73 (24): 6047-52; Huang, "Detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system, Immunol Methods 2001 1; 255 (1-2): 1-13.
A presente invenção também considera a preparação de kits para uso de acordo com a presente invenção. Os kits adequados incluem vários reagentes para uso de acordo com a presente invenção em recipientes e materiais para embalagem adequados, incluindo tubos, frascos e embalagens "shrink-wrapped" e moldadas por insuflação.The present invention also contemplates the preparation of kits for use in accordance with the present invention. Suitable kits include various reagents for use in accordance with the present invention in suitable containers and packaging materials, including shrink-wrapped and blow molded tubes, vials and packaging.
Os materiais adequados para inclusão em um exemplo de kit deacordo com a presente invenção compreendem um ou mais dos seguintes: pares de iniciadores para PCR específicos ao gene (oligonucleotídeos) que se anelam aos domínios de seqüências de DNA ou de cDNA que flanqueiam os polimorfismos genéticos de interesse, reagentes capazes de amplificar um domínio de seqüência específica no DNA genômico ou no cDNA sem o requerimento de realizar a PCR; reagentes necessários para discriminar entre os vários alelos possíveis nos domínios de seqüência amplificados pela PCR ou pela amplificação sem ser pela PCR (por exemplo, endonucleases de restrição, oligonucleotídeo que se anela preferencialmente a um alelo do polimorfismo, incluindo o modificado para conter enzimas ou grupos químicos fluorescentes que amplificam o sinal partindo do oligonucleotídeo e tornam a discriminação dos alelos mais forte); reagentes necessários para separar fisicamente os produtos derivados de vários alelos (por exemplo, aga-rose ou poliacrilamida e um tampão que será utilizado na eletroforese, colunas de HPLC, géis SSCP, géis de formamida ou um suporte de matriz para MALDI-TOF).Suitable materials for inclusion in an exemplary kit according to the present invention comprise one or more of the following: gene-specific PCR primer pairs (oligonucleotides) annealing to DNA or cDNA sequence domains flanking genetic polymorphisms of interest are reagents capable of amplifying a specific sequence domain in genomic DNA or cDNA without requiring PCR; reagents needed to discriminate between the various possible alleles in the sequence domains amplified by PCR or non-PCR amplification (eg, restriction endonucleases, oligonucleotides preferentially annealing to a polymorphism allele, including those modified to contain enzymes or groups fluorescent chemicals that amplify the signal from the oligonucleotide and make allele discrimination stronger); reagents needed to physically separate products derived from various alleles (eg, aga-rose or polyacrylamide and a buffer that will be used for electrophoresis, HPLC columns, SSCP gels, formamide gels or a MALDI-TOF matrix support).
Será considerado que os métodos da invenção podem ser realizados em associação a uma análise de outros fatores de risco conhecidos por estarem associados a COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema.It will be appreciated that the methods of the invention may be performed in connection with an analysis of other risk factors known to be associated with COPD, emphysema or both COPD and emphysema.
Tais fatores de risco incluem fatores de risco epidemiológicos associados a . um maior risco de desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Tais fatores de risco incluem, mas não estão limitados ao fumo e/ou à exposição ao fumo do tabaco, à idade, ao sexo e ao histórico familiar. Estes fatores de risco podem ser utilizados para aumentar uma análise de um ou mais polimorfismos que são descritos aqui quando se avalia o risco de um indivíduo de desenvolvimento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e/ou enfisema.Such risk factors include epidemiological risk factors associated with. a higher risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema. Such risk factors include, but are not limited to, smoking and / or exposure to tobacco smoke, age, gender, and family history. These risk factors can be used to augment an analysis of one or more polymorphisms that are described here when assessing an individual's risk of developing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and / or emphysema.
Os métodos de previsão da invenção permitem um número de intervenções terapêuticas e/ou de regimes de tratamento que serão avaliados em relação à adequabilidade e implementados para um certo indivíduo. O mais simples destes pode ser o fornecimento ao indivíduo de motivação para implementar uma alteração no estilo de vida, por exemplo, quando oindivíduo for um fumante atual, os métodos da invenção podem fornecer motivação para parar de fumar.The predictive methods of the invention allow for a number of therapeutic interventions and / or treatment regimens that will be assessed for suitability and implemented for a particular individual. The simplest of these may be providing the individual with motivation to implement a change in lifestyle, for example, when the individual is a current smoker, the methods of the invention may provide motivation to quit smoking.
A maneira da intervenção terapêutica ou do tratamento será prevista pela natureza do(s) polimorfismo(s) e pelo efeito biológico do(s) dito(s) polimorfismo(s). Por exemplo, quando um polimorfismo de susceptibilidade estiver associado a uma alteração na expressão de um gene, a intervensão ou o tratamento é preferencialmente direcionado à restauração da expressão normal do dito gene, por exemplo, através da administração de um agente capaz de modular a expressão do dito gene. Quando um alelo ou um genótipo de SNP estiver associado à expressão diminuída de um gene, a terapia pode envolver a administração de um agente capaz de aumentar a expressão do dito gene e de forma inversa, quando um alelo ou um genótipo de SNP estiver associado à maior expressão de um gene, a terapia pode envolver a administração de um agente capaz de diminuir a expressão do dito gene. Os métodos úteis para a modulação da expressão gênica são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, em situações em que um alelo ou um genótipo de SNP estiver associado com à expressão regulada para mais de um gene, a terapia utilizando, por exemplo, RNAi ou metodologias anti-sentido pode ser implementada para diminuir a abundância do mRNA e assim diminuir a expressão do dito gene. Alternativamente, a terapia pode envolver métodos direcionados, por exemplo, à modulação da atividade do produto do dito gene, compensando assim a expressão anormal do dito gene.The manner of therapeutic intervention or treatment will be predicted by the nature of the polymorphism (s) and the biological effect of said polymorphism (s). For example, when a susceptibility polymorphism is associated with a change in gene expression, intervention or treatment is preferably directed to restoring normal expression of said gene, for example by administering an agent capable of modulating expression. of said gene. When an SNP allele or genotype is associated with decreased gene expression, therapy may involve the administration of an agent capable of increasing expression of said gene and conversely when an SNP allele or genotype is associated with decreased gene expression. greater expression of a gene, therapy may involve the administration of an agent capable of decreasing expression of said gene. Methods useful for modulating gene expression are well known in the art. For example, in situations where an SNP allele or genotype is associated with expression regulated to more than one gene, therapy using, for example, RNAi or antisense methodologies may be implemented to decrease mRNA abundance and thus decrease expression of said gene. Alternatively, therapy may involve methods directed, for example, to modulating product activity of said gene, thereby compensating for abnormal expression of said gene.
Quando um alelo ou um genótipo de SNP de susceptibilidade estiver associado a uma menor função do produto gênico ou níveis diminuídos da expressão de um produto gênico, a intervenção terapêutica ou o tratamento pode envolver o aumento ou a substituição da dita função ou a su-plementação da quantidade do produto gênico dentro do indivíduo, por ne-xemplo, através da administração do dito produto gênico ou de um análogo funcional do mesmo. Por exemplo, quando um alelo ou genótipo de SNP estiver associado a uma menor função enzimática, a terapia pode envolver a administração da enzima ativa ou de um análogo da enzima ao indivíduo. Similarmente, quando um alelo ou um genótipo de SNP estiver associadocom uma função aumentada do produto gênico, a intervenção terapêutica ou o tratamento pode envolver a redução da dita função, por exemplo, através da administração de um inibidor do dito produto gênico ou de um agente capaz de diminuir o nível do dito produto gênico no indivíduo. Por exemplo, quando um alelo ou um genótipo de SNP estiver associado com uma maior função enzimática, a terapia pode envolver a administração de um inibidor da enzima ao indivíduo.Where a susceptibility SNP allele or genotype is associated with decreased gene product function or decreased levels of gene product expression, therapeutic intervention or treatment may involve increasing or replacing said gene function or supplementation. the amount of gene product within the individual, for example, by administering said gene product or a functional analogue thereof. For example, when an SNP allele or genotype is associated with lower enzyme function, therapy may involve administering the active enzyme or an enzyme analog to the individual. Similarly, when an SNP allele or genotype is associated with increased gene product function, therapeutic intervention or treatment may involve reduction of said gene product, for example, by administering an inhibitor of said gene product or an agent. able to lower the level of said gene product in the individual. For example, when an SNP allele or genotype is associated with increased enzyme function, therapy may involve administering an enzyme inhibitor to the subject.
Similarmente, quando um SNP benéfico (protetor) estiver associado à regulação para mais de um gene particular ou a expressão de uma enzima ou outra proteína, as terapias podem ser direcionadas para imitar tal regulação para mais ou expressão em um indivíduo que não possui o genótipo de resistência e/ou para o fornecimento de tal enzima ou outra proteína a tal indivíduo. Ainda, quando um SNP protetor estiver associado à regulação para menos de um gene particular ou com a expressão diminuída ou eliminada de uma enzima ou outra proteína, as terapias desejáveis podem ser direcionadas para imitar tais condições em um indivíduo que não possui o genótipo protetor.Similarly, when a beneficial (protective) SNP is associated with regulation for more than one particular gene or expression of an enzyme or other protein, therapies may be directed to mimic such further regulation or expression in an individual lacking the genotype. of resistance and / or for providing such enzyme or other protein to such individual. Further, when a protective SNP is associated with down regulation of a particular gene or with decreased or eliminated expression of an enzyme or other protein, desirable therapies may be directed to mimic such conditions in an individual lacking the protective genotype.
A relação entre os vários polimorfismos identificados anteriormente e a susceptibilidade (ou diferentemente) de um indivíduo a COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema também possui aplicação no pla-. nejamento e/ou na triagem de agentes terapêuticos candidatos. Este é particularmente o caso quando a associação entre um polimorfismo de susceptibilidade ou protetor é manifestada por uma regulação para mais ou uma regulação para menos da expressão de um gene. Em tais casos, o efeito de um agente terapêutico candidato sobre tal regulação para mais ou regulação para menos é facilmente detectável.The relationship between the various polymorphisms identified above and the susceptibility (or differently) of an individual to COPD, emphysema or both COPD and emphysema also has application in the pla-. screening and / or screening of candidate therapeutic agents. This is particularly the case when the association between a susceptibility or protective polymorphism is manifested by up-regulation or down-regulation of gene expression. In such cases, the effect of a candidate therapeutic agent on such up-regulation or down-regulation is readily detectable.
Por exemplo, em uma modalidade culturas de órgãos ou de células pulmonares humanas existentes são verificadas em relação aos genó-tipos de SNP como apresentado anteriormente. (Para informação sobre as culturas de órgãos e células pulmonares humanas, ver, por exemplo: Bo-hinski e outros (1996) Molecular and Cellular Biology\4: 5671-5681; Collett-solberg e outros (1996) Pediatric Research 39: 504; Hermanns e outros(2004) Laboratory Investigation 84: 736-752; Hume e outros (1996) In Vitro Cellular& Developmental Biology-Animal 32: 24-29; Leonardi e outros (1995) 38: 352-355; Notingher e outros (2003) Biopolymers (Biospectroscopy) 72: 230-240; Ohga e outros (1996) Biochemical and Biophysical Research Communications 228: 391-396; dos quais cada um é incorporado aqui como referência em sua totalidade.) As culturas que representam os grupos de genótipos susceptíveis e protetores são tradas, junto com culturas que são supostamente "normais" em termos da expressão de um gene que é regulada para mais ou regulada para menos quando um polimorfismo protetor estiver presente.For example, in one embodiment existing human lung organ or cell cultures are checked for SNP genotypes as shown above. (For information on human lung organ and cell cultures, see, for example: Bo-hinski et al. (1996) Molecular and Cellular Biology 4: 5671-5681; Collett-solberg et al. (1996) Pediatric Research 39: 504 Hermanns et al. (2004) Laboratory Investigation 84: 736-752; Hume et al. (1996) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal 32: 24-29; Leonardi et al. (1995) 38: 352-355; Notingher et al. 2003) Biopolymers (Biospectroscopy) 72: 230-240; Ohga et al. (1996) Biochemical and Biophysical Research Communications 228: 391-396, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.) Cultures representing groups of Susceptible and protective genotypes are screened, along with cultures that are supposedly "normal" in terms of expression of a gene that is up-regulated or down-regulated when a protective polymorphism is present.
As amostras de tais culturas são expostas a uma biblioteca de compostos terapêuticos candidatos e verificadas para qualquer um ou todos de: (a) regulação para menos de genes de susceptibilidade que são normalmente regulados para mais em genótipos susceptíveis; (b) regulação para mais de genes de susceptibilidade que são normalmente regulados para menos em genótipos susceptíveis; (c) regulação para menos de genes protetores que são normalmente regulados para menos ou não expressos (ou formas nulas são expressas) em genótipos protetores; e (d) regulação para mais de genes protetores que são normalmente regulados para mais em genótipos protetores. Os compostos são selecionados em relação a sua capacidade de alterar a regulação e/ou a ação dos genes de susceptibilidade e/ou genes protetores em uma cultura que possui um genótipo susceptível.Samples from such cultures are exposed to a library of candidate therapeutic compounds and verified for any or all of: (a) down-regulation of susceptibility genes that are normally up-regulated in susceptible genotypes; (b) up-regulation of susceptibility genes that are normally down-regulated in susceptible genotypes; (c) down-regulation of protective genes that are normally down-regulated or non-expressed (or null forms are expressed) in protective genotypes; and (d) up-regulation of protective genes that are normally up-regulated in protective genotypes. The compounds are selected for their ability to alter the regulation and / or action of susceptibility genes and / or protective genes in a culture having a susceptible genotype.
Similarmente, quando o polimorfismo for um que quando presente resulta em uma concentração fisiologicamente ativa de um produto gênico expresso fora da faixa normal para um indivíduo (ajustada para a idade e para o sexo) e quando houver uma abordagem profilática ou terapêutica disponível para restaurar os níveis de tal produto gênico expresso para dentro da faixa normal, os pacientes individuais podem ser selecionados para determinar a probabilidade de seu beneficiamento partindo de tal abordagem restauradora. Tal triagem envolve a detecção da presença ou da ausência do polimorfismo no indivíduo através de qualquer um dos métodos descritosaqui, com tais indivíduos em que o polimorfismo está presente sendo identificados como indivíduos prováveis de serem beneficiados pelo tratamento.Similarly, when the polymorphism is one which when present results in a physiologically active concentration of a gene product expressed outside the normal range for an individual (adjusted for age and sex) and when there is a prophylactic or therapeutic approach available to restore At levels of such gene product expressed within the normal range, individual patients may be selected to determine the likelihood of their benefit from such a restorative approach. Such screening involves detecting the presence or absence of the polymorphism in the subject by any of the methods described herein, with such individuals in which the polymorphism is present being identified as individuals likely to benefit from treatment.
ExemplosExamples
A invenção será agora descrita em maiores detalhes, com referência a exemplos não-limitantes.The invention will now be described in greater detail with reference to non-limiting examples.
Exemplo 1. Estudo de Associação de Casos Recrutamento dos IndivíduosExample 1. Case Study Study Recruitment of Individuals
Foram recrutados indivíduos descendentes de europeus que fumaram um mínimo de quinze maços-ano e diagnosticados por um médico com doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Os indivíduos satisfaziam os critérios a seguir: eram mais velhos que 50 anos de idade e tinham desenvolvido sintomas de falta de ar após os 40 anos de idade, tinham um volume expiratório Forçado em um segundo (FEV1) na forma de uma porcentagem prevista <70% e uma razão de FEV1/FVC (volume exporatório Forçado em um segundo/capacidade vital Forçada) de < 79% (medida utilizando os critérios da American Thoracic Society). Duzentos e noventa e quatro indivíduos foram recrutados, destes 58% eram mulheres, a média de FEV1/FVC (± 95% de limites de confiança) era de 51% (49-53), a média de FEV1 na forma de uma porcentagem de previsão era de 43 (41-45). A idademédia, cigarros por dia e histórico de maço-ano eram de 65 anos (64-66), 24 , cigarros/dia (22-25) e 50 maços-ano (41-55), respectivamente. Duzentos e dezessete indivíduos europeus que fumaram um mínimo de vinte maços-ano e que nunca sofreram falta de ar e não foram diagnosticados com uma doença pulmonar obstrutiva no passado, em particular, asma na infância ou doença pulmonar obstrutiva crônica, também foram estudados. Este grupo de controle foi recrutado através de clubes para a velhice e consistia em 63% de homens, a média de FEV1/FVC (95% de Cl) era de 82% (81-83), a média de FEV1 como uma porcentagem de previsão era de 96 (95-97). A idade média, os cigarros por dia e o histórico de maço-ano eram de 59 anos (57-61), 24 cigarros/dia (22-26) e 42 maços-ano (39-45), respectivamente. Utilizando um método baseado na PCR (Sandford e outros, 1999), todos os indivíduos foram genotipados em relação às mutações na a1-antitripsina(alelos S e Z) e aqueles com o alelo ZZ foram excluídos. Os grupos com COPD e de fumantes resistentes foram combinados para os indivíduos com o genótipo MZ (5% em cada grupo). 190 doadores de sangue europeus (condição de fumo desconhecida) foram recrutados consecutivamente através de serviços de doação de sangue locais. Sessenta e três por cento eram homens e sua idade média era de 50 anos. Na análise de regressão, foi observado que a diferença na idade e a diferença de maços-ano observadas entre os que sofriam de COPD e os fumantes resistentes não determinava FEVouCOPD.Individuals of European descent who smoked a minimum of 15 pack-years and recruited by a physician with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) were recruited. Subjects met the following criteria: they were older than 50 years old and had developed symptoms of shortness of breath after 40 years of age, had a forced expiratory volume in one second (FEV1) as a predicted percentage <70 % and a FEV1 / FVC (Forced Exposure in One Second / Forced Vital Capacity) ratio of <79% (measured using American Thoracic Society criteria). Two hundred and ninety-four individuals were recruited, of which 58% were women, the mean FEV1 / FVC (± 95% confidence limits) was 51% (49-53), the average FEV1 as a percentage of The forecast was 43 (41-45). The mean age, cigarettes per day and pack year history were 65 (64-66), 24 cigarettes / day (22-25) and 50 pack years (41-55), respectively. Two hundred and seventeen European individuals who smoked a minimum of twenty pack-years and who were never short of breath and were not diagnosed with an obstructive pulmonary disease in the past, in particular childhood asthma or chronic obstructive pulmonary disease, were also studied. This control group was recruited through old age clubs and consisted of 63% men, mean FEV1 / FVC (95% Cl) was 82% (81-83), mean FEV1 as a percentage of The forecast was 96 (95-97). The average age, cigarettes per day and pack-year history were 59 years (57-61), 24 cigarettes / day (22-26) and 42 pack-years (39-45), respectively. Using a PCR-based method (Sandford et al. 1999), all subjects were genotyped for α1-antitrypsin mutations (S and Z alleles) and those with the ZZ allele were excluded. The COPD and resistant smoker groups were combined for individuals with the MZ genotype (5% in each group). 190 European blood donors (unknown smoking status) were recruited consecutively through local blood donation services. Sixty-three percent were men and their average age was 50 years. In the regression analysis, it was observed that the difference in age and the pack-year difference observed between COPD sufferers and resistant smokers did not determine FEVouCOPD.
Este estudo mostra que os polimorfismos encontrados em maior freqüência em pacientes com COPD comparados com os de controle (e/ou fumantes resistentes) podem refletir uma maior susceptibilidade ao desenvolvimento de função pulmonar prejudicada e COPD. Similarmente, os polimorfismos observados em maior freqüência em fumantes resistentes compa-rados com os fumantes susceptíveis (pacientes com COPD e/ou controles) podem refletir uma função protetora.This study shows that polymorphisms found more frequently in COPD patients compared to control (and / or resistant smokers) patients may reflect a greater susceptibility to the development of impaired lung function and COPD. Similarly, the more frequently observed polymorphisms in resistant smokers compared to susceptible smokers (COPD patients and / or controls) may reflect a protective function.
Sumário das características para os doadores de sangue com COPD, fumantes resistentes e saudáveisSummary of Characteristics for COPD Blood Donors, Resistant and Healthy Smokers
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Métodos de GenotipaqemGenotyping Methods
Genotioagem do polimorfismo do promotor -765 G/C da Ciclo-oxigenase 2 (COX2) e da a1-antitripsinaGenotyping of the cyclooxygenase 2 (COX2) and α1-antitrypsin -765 G / C promoter polymorphism
O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue total (Ma-niatis, T., Fritsch, E. F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). O polimorfismo 2-765 da Ciclo-oxigenase 2 foi determinado através de modificações mínimas de um método previamente publicado (Papafili A, e outros, 2002, incorporado aqui em sua totalidade como referência)). A reação da PCR foi realizada em um volume total de 25 uL e continha 20 ng de DNA genômico, 500 pmols de iniciadores para frente e para trás, 0,2 mM de dNTPs, 10 mM de Tris-HCI (pH 8,4), 150 mM de KCI, 1,0 mM de MgCI2 e 1 unidade de polimerase (Life Technologies). Os tempos de ciclagem eram incubações durante 3 min a 95°C seguidas por 33 ciclos de 50 s a 94°C, 60 s a 66°C e 60 s a 72°C. Um alongamento final de 10 min a 72°C foi então realizado. 4 uL dos produtos da PCR foram visualizados por transiluminação em ultravioleta de um gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio. Uma alíquota de 3 uL do produto da amplificação foi digerida durante 1 h com 4 unidades de Acft (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 37°C. Os produtos digeridos foram separados em uma corrida em gel de agarose a 2,5% durante 2 horas a 80 mV com tampão TBE. Os produtos foram visualizados contra um padrão em escada de 123 pb utilizando transiluminação em ultravioleta após a coloração com brometo de etídio. Utilizando um método baseado na PCR referido anteriormente (Sandford e outros, 1999), todos os indivíduos com COPD e fumantes resistentes foram genotipados em relação , aos alelos S e Z da cc1-antitripsina.Genomic DNA was extracted from whole blood samples (Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). Cyclooxygenase 2 polymorphism 2-765 was determined by minor modifications of a previously published method (Papafili A et al., 2002, incorporated herein in its entirety by reference)). The PCR reaction was performed in a total volume of 25 µl and contained 20 ng genomic DNA, 500 pmols of forward and back primers, 0.2 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCI (pH 8.4) , 150 mM KCI, 1.0 mM MgCl 2 and 1 unit polymerase (Life Technologies). Cycling times were incubations for 3 min at 95 ° C followed by 33 cycles of 50 s at 94 ° C, 60 s at 66 ° C and 60 s at 72 ° C. A final stretch of 10 min at 72 ° C was then performed. 4 µl of the PCR products were visualized by ultraviolet transillumination of an ethidium bromide stained 3% agarose gel. A 3 µl aliquot of the amplification product was digested for 1 h with 4 units of Acft (Roche Diagnostics, New Zealand) at 37 ° C. Digested products were separated in a 2.5% agarose gel run for 2 hours at 80 mV with TBE buffer. Products were viewed against a 123 bp ladder pattern using ultraviolet transillumination after ethidium bromide staining. Using a PCR-based method referred to above (Sandford et al., 1999), all COPD-resistant smokers were genotyped relative to the cc1-antitrypsin S and Z alleles.
Polimorfismo +49C/T da ElafinaElafina + 49C / T polymorphism
O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue total (Ma-niatis, T., Fritsch, E. F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). O polimorfismo +49 da Elafina foi determinado através de modificações mínimas de um método previamente publicado ([Kuijpers ALA, e outros. Clinicai Genetics 1998; 54: 96-101.] incorporado aqui em sua totalidade como referência)). A reação da PCR foi realizada em um volume total de 25 uL e continha 20 ng de DNA genômico, 500 pmols de iniciadores para frente e para trás, 0,2 mM de dNTPs, 10 mM de Tris-HCI (pH 8,4), 150 mM de KCI, 1,0 mM de MgCI2 e 1 unidade de Taq polimerase] (Life Technologies). Os tempos de ciclagem eram incubações durante 3 min a 95°C seguidas por 33ciclos de 50 s a 94°C, 60 s a 66°C e 60 s a 72°C. Um alongamento final de 10 min a 72°C foi então realizado. 4 uL dos produtos da PCR foram visualizados por transiluminação em ultravioleta de um gel de agarose a 3% cora-do com brometo de etídio. Uma alíquota de 3 uL do produto da amplificação foi digerida durante 1 h com 4 unidades de Fok 1 (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 37°C. Os produtos digeridos foram separados em uma corrida em gel de agarose a 2,5% durante 2 horas a 80 mV com tampão TBE. Os produtos foram visualizados contra um padrão em escada de 123 pb utilizando transiluminação em ultravioleta após a coloração com brometo de etídio.Genomic DNA was extracted from whole blood samples (Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). Elafine +49 polymorphism was determined by minimal modifications of a previously published method ([Kuijpers ALA, et al. Clinical Genetics 1998; 54: 96-101.] Incorporated herein in its entirety by reference)). The PCR reaction was performed in a total volume of 25 µl and contained 20 ng genomic DNA, 500 pmols of forward and back primers, 0.2 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCI (pH 8.4) , 150 mM KCI, 1.0 mM MgCl 2 and 1 unit Taq polymerase] (Life Technologies). Cycling times were incubations for 3 min at 95 ° C followed by 33 cycles of 50 s at 94 ° C, 60 s at 66 ° C and 60 s at 72 ° C. A final stretch of 10 min at 72 ° C was then performed. 4 µl of the PCR products were visualized by ultraviolet transillumination of a 3% agarose gel stained with ethidium bromide. A 3 µl aliquot of the amplification product was digested for 1 h with 4 units of Fok 1 (Roche Diagnostics, New Zealand) at 37 ° C. Digested products were separated in a 2.5% agarose gel run for 2 hours at 80 mV with TBE buffer. Products were viewed against a 123 bp ladder pattern using ultraviolet transillumination after ethidium bromide staining.
Genotipaaem do polimorfismo -1607 1G2G do gene da Metaloproteinase de Matriz 1Matrix 1 Metalloproteinase Gene Polymorphism -1607 1G2G Genotipaaem
O DNA genômico foi extraído utilizando métodos padronizados de fenol e clorofórmio. Os grupos de pacientes e os controles foram configurados no formato de PCR de 96 cavidades contendo controles negativos estratégicos. Os detalhes dos iniciadores do ensaio, das condições da PCR e dos ensaios de RFLP foram descritos previamente [DunleaveyL e outros]. A genotipagem foi feita utilizando modificações mínimas do protocolo anterior otimizado para as condições de laboratório dos presentes inventores. As reações da PCR foram amplificadas em termocicladores MJ Research em um volume total de 25 uL e continham 80 ng de DNA genômico, 100 ng de iniciadores para frente e para trás, 200 mM de dNTPs, 20 mM de Tris-HCI (pH 8,4), 50 mM de KCI, 1,5 mM de MgCI2 e 1,0 unidade de Taq polimerase (Qiagen). As seqüências iniciadoras para frente e para trás eram 3' TCG TGA GAA TGT CTT CCC ATT-3' [SEQ ID Ne: 1] e 5TCT TGG ATT GAT TTG AGA TAA GTG AAA TC-3' [SEQ ID N2: 2]. As condições de ciclagem consistiam em 94C 60 s, 55C 30 s, 72C 30 s durante 35 ciclos com uma extensão final estendida de 3 min. As alíquotas do produto da amplificação foram digeridas durante 4 h com 6 Unidades da enzima de restrição Xmnl (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) nas condições de temperatura planejadas. Os produtos digeridos foram separados em gel de poliacrilamida a 6%. Os produtos foram visualizados por transiluminação em ultravioleta após corar com brometo de etídio e a migração foi comparada contra um padrãoem escada 1 Kb plus (Invitrogen). Os genótipos foram registrados em tabelas de informação de dados e foi realizada a análise estatística. Outra aenotipaaem de polimorfismoGenomic DNA was extracted using standard phenol and chloroform methods. Patient groups and controls were configured in 96-well PCR format containing strategic negative controls. Details of assay primers, PCR conditions, and RFLP assays have been previously described [DunleaveyL et al.]. Genotyping was done using minimal modifications of the previous protocol optimized for the laboratory conditions of the present inventors. PCR reactions were amplified in MJ Research thermocyclers in a total volume of 25 µl and contained 80 ng genomic DNA, 100 ng forward and back primers, 200 mM dNTPs, 20 mM Tris-HCI (pH 8, 4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 and 1.0 Taq polymerase unit (Qiagen). The forward and reverse primers were 3 'TCG TGA GAA TGT CTT CCC ATT-3' [SEQ ID Ne: 1] and 5TCT TGG ATT GAT TTG AGA TAA GTG AAA TC-3 '[SEQ ID N2: 2]. Cycling conditions consisted of 94 ° C 60 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 30 s for 35 cycles with a final extended extension of 3 min. Aliquots of the amplification product were digested for 4 h with 6 Units of restriction enzyme Xmnl (Roche Diagnostics, New Zealand) under the planned temperature conditions. The digested products were separated on 6% polyacrylamide gel. Products were visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium bromide and migration was compared against a 1 Kb plus ladder pattern (Invitrogen). Genotypes were recorded in data information tables and statistical analysis was performed. Other polymorphism aenotyping
O DNA genômico foi extraído partindo de amostras de sangue total (Maniatis, T., Fritsch, E. F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). O DNA genômico purificado foi aliquotado (concentração de 10 ng/uL) em placas de 96 cavidades e genotipado em um sistema Sequenom™ (Se-quenom™ Autoflex Mass Spectrometer e Samsung 24 pin nanodispenser) utilizando as seqüências, as condições de amplificação e os métodos a seguir.Genomic DNA was extracted from whole blood samples (Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). Purified genomic DNA was aliquoted (10 ng / µL concentration) into 96-well plates and genotyped on a Sequenom ™ (Se-quenom ™ Autoflex Mass Spectrometer and Samsung 24 pin nanodispenser) system using sequences, amplification conditions and methods to follow.
As condições a seguir foram utilizadas para a reação de PCR multiplex: as concentrações finais eram em relação ao Tampão 10X 15 mM de MgCI2 1,25x, 25 mM de MgCI2 1,625 mM, dNTP mix 25 mM 500 uM, ini-ciadores 4 uM 100nM, Taq polimerase (Qiagen hot start) 0,1511/reação, DNA genômico 10 ng/uL. Os tempos de ciclagem eram 95°C durante 15 min, (5°C durante 15 s, 56°C 30 s, 72°C 30 s durante 45 ciclos com um tempo de extensão prolongado de 3 min para terminar. O tratamento com a fosfatase alcalina de camarão (SAP) foi utilizado (2 uL até 5 uL por reação da PCR) incubado a 35°C durante 30 min e a reação de extensão (adicionar 2 uL até 7 uL após o tratamento com SAP) com os volumes a seguir por reação de: . água, 0,76 uL; hME tampão de terminação 10x, 0,2 uL; iniciador hME (10 uM), 1 uL; enzima MassEXTEND, 0,04 uL<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table>1. Genótipo. GG vs AG/AA para COPD vs controles, razão de possibilidades(OR) = 1,83, 95% de limites de confiança 1,2-2,8, %2 (Yates corrigido) =8,1, p=0,004,The following conditions were used for the multiplex PCR reaction: final concentrations were relative to 1.25x 10 x 15 mM MgCl2 Buffer, 1.625 mM 25 mM MgCl2, 500 mM 25 mM dNTP mix, 4 uM 100 nM initiators , Taq polymerase (Qiagen hot start) 0.1511 / reaction, genomic DNA 10 ng / µL. Cycling times were 95 ° C for 15 min, (5 ° C for 15 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 30 s for 45 cycles with an extended extension time of 3 min to finish. Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) was used (2 µL to 5 µL per PCR reaction) incubated at 35 ° C for 30 min and the extension reaction (add 2 µL to 7 µL after SAP treatment) with volumes to be followed by reaction of: water, 0.76 µL; hME 10x termination buffer, 0.2 µL; hME primer (10 µM), 1 µL; MassEXTEND enzyme, 0.04 µL <table> table see original document page 52 </column></row><table> <table> table see original document page 53 </column> </row> <table> <table> table see original document page 54 </column> </row> <table > <table> table see original document page 55 </column> </row> <table> <table> table see original document page 56 </column> </row> <table> <table> table see original document page 57 </column></row><table> <table> table see original document page 58 </column> </row> <table> <table> table see original document page 59 </column> </row> <table> <table> table see original document page 60 </column> </row> <table> 1. Genotype. GG vs AG / AA for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 1.83, 95% confidence limits 1.2-2.8,% 2 (corrected Yates) = 8.1, p = 0.004,
GG = susceptível à COPD (dependendo da presença de outros snps)GG = COPD susceptible (depending on the presence of other snps)
2. Genótipo. GG vs AG/AA para resistente vs controles, razão de possibi-lidades (OR) = 1,98, 95% de limites de confiança 1,3-3,1, %2 (Yates cor-rigido) = 9,43, p=0,0022. Genotype. GG vs AG / AA for resistant vs controls, odds ratio (OR) = 1.98, 95% confidence limits 1.3-3.1,% 2 (stiff-colored Yates) = 9.43, p = 0.002
GG = protetor para COPD (dependendo da presença de outros snps)Tabela 3a. Freqüência do alelo e do genótipo do polimorfismo 105 A/C daInterleucina 18 nos pacientes com COPD, fumantes resistentes e controles.GG = COPD protector (depending on the presence of other snps) Table 3a. Interleukin 18 105 A / C polymorphism allele and genotype frequency in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 61</column></row><table><table> table see original document page 61 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA vs AC/CC para COPD vs controles, razão de possibilida-des (OR) = 1,50, 95% de limites de confiança 1,0-2,3, x2 (Yates não-^corrigido) = 4,26, p=0,04,1. Genotype. AA vs AC / CC for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 1.50, 95% confidence limits 1.0-2.3, x2 (uncorrected Yates) = 4.26, p = 0.04,
AA = susceptível à COPDAA = COPD susceptible
2. Alelo. A vs C para COPD vs controle, razão de possibilidades (OR) =1,46, 95% de limites de confiança 1,1-2,0, %2 (Yates corrigido) = 5,76,p=0,022. Allele. A vs C for COPD vs control, odds ratio (OR) = 1.46, 95% confidence limits 1.1-2.0,% 2 (corrected Yates) = 5.76, p = 0.02
3. 8Genótipo. AA vs AC/CC para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 1,35, 95% de limites de confiança 0,9-2,0, x2 (Yates não-corrigido) = 2,39, p=0,12 (tendência)AA = susceptível à COPDTabela 3b. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo -133 C/G daInterleucina nos pacientes com COPD, fumantes resistentes e controles.3. 8Genotype. AA vs AC / CC for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.35, 95% confidence limits 0.9-2.0, x2 (uncorrected Yates) = 2.39, p = 0.12 (trend) AA = susceptible to COPDTable 3b. Allele and genotype frequencies of Interleukin -133 C / G polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 62</column></row><table><table> table see original document page 62 </column> </row> <table>
1. Genótipo. CC vs CG/GG para COPD vs controles, razão de possibilida-des (OR) = 1,44, 95% de limites de confiança 1,0-2,2, %2 (Yates corrigi-do) = 3,4, p=0,06,1. Genotype. CC vs CG / GG for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 1.44, 95% confidence limits 1.0-2.2,% 2 (Yates corrected) = 3.4, p = 0.06,
CC = susceptível à COPDCC = susceptible to COPD
2. Alelo. C vs G para COPD vs controle, razão de possibilidades (OR) =1,36, 95% de limites de confiança 1,0-1,9, %2 (Yates corrigido) = 53,7,2. Allele. C vs G for COPD vs control, odds ratio (OR) = 1.36, 95% confidence limits 1.0-1.9,% 2 (corrected Yates) = 53.7,
p=0,05p = 0.05
C = susceptível à COPDC = susceptible to COPD
Tabela 4. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo -675 4G/5Gdo Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 nos pacientes com COPD, fu-mantes resistentes e controles.Table 4. Allele and genotype frequencies of the -675 4G / 5G polymorphism genotype of Plasminogen Activator Inhibitor 1 in patients with COPD, resistant fuels and controls.
<table>table see original document page 62</column></row><table><table> table see original document page 62 </column> </row> <table>
1. Genótipo. 5G5G vs restante para COPD vs resistente, razão de possibi-lidades (OR) = 1,55, 95% de limites de confiança 0,9-2,6, %2 (Yatesnão-corrigido) = 3,12, p=0,08,5G5G = susceptível à COPD1. Genotype. 5G5G vs remainder for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.55, 95% confidence limits 0.9-2.6,% 2 (uncorrected Yates) = 3.12, p = 0 , 08.5G5G = susceptible to COPD
2. Genótipo. 5G5G vs restante para COPD vs controle, razão de possibili-dades (OR) = 1,48, 95% de limites de confiança 0,9-2,5, %2 (Yates não-corrigido) = 2,43, p=0,122. Genotype. 5G5G vs remainder for COPD vs control, odds ratio (OR) = 1.48, 95% confidence limits 0.9-2.5,% 2 (uncorrected Yates) = 2.43, p = 0.12
5G5G = susceptível à COPD5G5G = COPD susceptible
3. Alelo. 5G vs 4G para COPD vs resistente, razão de possibilidades (OR)= 1,33, 95% de limites de confiança 1,0-1,8, %2 (Yates corrigido) = 4,02,p=0,053. Allele. 5G vs 4G for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.33, 95% confidence limits 1.0-1.8,% 2 (corrected Yates) = 4.02, p = 0.05
5G = susceptível à COPD5G = susceptible to COPD
Tabela 5. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo Asp 298 Glu(T/G) da Oxido Nítrico Sintase 3 nos pacientes com COPD, fumantes resis-Table 5. Allele and genotype frequencies of Nitric Oxide Synthase 3 Asp 298 Glu (T / G) polymorphism in patients with COPD, smokers resistant to
tentes e controles.and controls.
<table>table see original document page 63</column></row><table><table> table see original document page 63 </column> </row> <table>
1. Genótipo. TT vs TG/GG para resistente vs controles, razão de possibili-dades (OR) = 2,2, 95% de limites de confiança 1,0-4,7, x2 (Yates corri-gido) = 4,49, p=0,03,Genótipo TT = protetor para COPD1. Genotype. TT vs TG / GG for resistant vs controls, odds ratio (OR) = 2.2, 95% confidence limits 1.0-4.7, x2 (corrected Yates) = 4.49, p = 0.03, TT genotype = COPD protector
Tabela 6a. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo Lys 420 Thr(A/C) da proteína de ligação com a Vitamina D nos pacientes com COPD,fumantes resistentes e controles.Table 6a. Allele and genotype frequencies of the Vitamin D-binding protein Lys 420 Thr (A / C) polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 63</column></row><table>* número de cromossomos (2n)<table> table see original document page 63 </column> </row> <table> * number of chromosomes (2n)
1. Genótipo. AA/AC vs CC para resistente vs COPD, razão de possibilida-des (OR) = 1,39, 95% de limites de confiança 0,9-2,1, %2 (Yates não-corrigido) = 2,59, p=0,10,1. Genotype. AA / AC vs CC for resistant vs COPD, odds ratio (OR) = 1.39, 95% confidence limits 0.9-2.1,% 2 (uncorrected Yates) = 2.59, p = 0.10,
AA/AC genótipo = protetor para COPDAA / AC Genotype = Protector for COPD
2. Alelo. A vs C para resistente vs COPD, razão de possibilidades (OR) =1,34, 95% de limites de confiança 1,0-1,8, %2 (Yates corrigido) = 3,94,p=0,052. Allele. A vs C for resistant vs COPD, odds ratio (OR) = 1.34, 95% confidence limits 1.0-1.8,% 2 (corrected Yates) = 3.94, p = 0.05
Alelo A = protetor para COPDAllele A = protector for COPD
Tabela 6b. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo Glu 416 Asp(T/G) da proteína de ligação com a Vitamina D nos pacientes com COPD,fumantes resistentes e controles.Table 6b. Allele and genotype frequencies of the Glu 416 Asp (T / G) polymorphism of the Vitamin D binding protein in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 64</column></row><table><table> table see original document page 64 </column> </row> <table>
1. Genótipo. TT/TG vs GG para resistente vs controles, razão de possibili-dades (OR) = 1,53, 95% de limites de confiança 1,0-2,5, %2 (Yates não-corrigido) = 3,52, p=0,06,1. Genotype. TT / TG vs GG for resistant vs controls, odds ratio (OR) = 1.53, 95% confidence limits 1.0-2.5,% 2 (uncorrected Yates) = 3.52, p = 0.06,
Genótipo TT/TG = protetor para COPDTT / TG Genotype = COPD protector
2. Alelo. T vs G para resistente vs controle, razão de possibilidades (OR)= 1,27, 95% de limites de confiança 1,0-1,7, %2 (Yates corrigido) = 2,69,p=0,12. Allele. T vs G for resistant vs control, odds ratio (OR) = 1.27, 95% confidence limits 1.0-1.7,% 2 (Yates corrected) = 2.69, p = 0.1
Alelo T = protetor para COPDAllele T = protector for COPD
Tabela 7. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo lie 105 Vai(A/G) da Glutationa S Transferase P1 nos pacientes com COPD, fumantesresistentes e controles.<table>table see original document page 65</column></row><table>Table 7. Frequencies of Glutathione S Transferase P1 allele and genotype of lie 105 Vai (A / G) polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls. <table> table see original document page 65 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA vs AG/GG para resistente vs controles, razão de possibi-lidades (OR) = 1,45, 95% de limites de confiança 0,9-2,2, %z (Yatesnão-corrigido)= 3,19, p=0,07,1. Genotype. AA vs AG / GG for resistant vs controls, odds ratio (OR) = 1.45, 95% confidence limits 0.9-2.2,% z (uncorrected Yates) = 3.19, p = 0.07,
Genótipo AA = protetor para COPDAA genotype = protector for COPD
2. Alelo. A vs G para resistente vs controle, razão de possibilidades (OR)=1,34, 95% de limites de confiança 1,0-1,8, x2 (Yates não-corrigido) =3,71,p=0,052. Allele. A vs G for resistant vs control, odds ratio (OR) = 1.34, 95% confidence limits 1.0-1.8, x2 (uncorrected Yates) = 3.71, p = 0.05
Alelo A .= protetor para COPDAllele A. = Protector for COPD
Tabela 8. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo 874 A/T doTable 8. Allele and genotype frequencies of the 874 A / T polymorphism of
Interferon-gama nos pacientes com COPD, fumantes resistentes e controles.Interferon-gamma in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 65</column></row><table><table> table see original document page 65 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA vs AT/TT para COPD vs controles, razão de possibili-dades (OR) = 1,51, 95% de limites de confiança 0,9-2,5, x2 (Yates não-corrigido) = 3,07, p=0,08,1. Genotype. AA vs AT / TT for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 1.51, 95% confidence limits 0.9-2.5, x2 (uncorrected Yates) = 3.07, p = 0.08,
Genótipo AA = susceptível à COPDTabela 9a. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo Arg 130 Gln(G/A) da lnterleucina-13 nos pacientes com COPD, fumantes resistentes econtroles.AA genotype = susceptible to COPDTable 9a. Allele and genotype frequencies of Arg 130 Gln (G / A) interleukin-13 polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 66</column></row><table><table> table see original document page 66 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA vs AG/GG para resistente vs controles, razão de possi-bilidades (OR) = 2,94, 95% de limites de confiança 0,7-14,0, x* (Yates não-corrigido)= 2,78, p=0,09,Genótipo AA = protetor para COPD1. Genotype. AA vs AG / GG for resistant vs controls, odds ratio (OR) = 2.94, 95% confidence limits 0.7-14.0, x * (uncorrected Yates) = 2.78, p = 0.09, Genotype AA = protector for COPD
Tabela 9b. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo do promotor -1055 C/T da lnterleucina-13 nos pacientes com COPD, fumantes resistentese controles.Table 9b. Allele and genotype frequencies of the interleukin-13 -1055 C / T promoter polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 66</column></row><table><table> table see original document page 66 </column> </row> <table>
1. Genótipo. TT vs TC/CC para COPD vs resistente, razão de possibilida-des (OR) = 6,03, 95% de limites de confiança 1,1-42, %2 (Yates corrigi-do)= 4,9, p=0,03,1. Genotype. TT vs TC / CC for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 6.03, 95% confidence limits 1.1-42,% 2 (Yates corrected) = 4.9, p = 0.03,
TT = susceptível à COPDTabela 10. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo S do cc1-anti-tripsina nos pacientes com COPD e fumantes resistentes.TT = susceptible to COPDTable 10. Allele and genotype frequencies of cc1 anti-trypsin S polymorphism in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 67</column></row><table><table> table see original document page 67 </column> </row> <table>
1. Genótipo. MS/SS vs MM para resistente vs COPD, razão de possibili-dades (OR) = 2,42, 95% de limites de confiança 1,2-5,1, %2 (Yates corrigido)= 5,7,p=0,01,S = protetor para COPD1. Genotype. MS / SS vs MM for resistant vs COPD, odds ratio (OR) = 2.42, 95% confidence limits 1.2-5.1,% 2 (corrected Yates) = 5.7, p = 0.01, S = COPD protector
Tabela 11a. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo +489 G/Ado Fator de Necrose de Tumor a nos pacientes com COPD e fumantes re-sistentes.Table 11a. Allele and polymorphism genotype frequencies +489 G / Ado Tumor Necrosis Factor a in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 67</column></row><table><table> table see original document page 67 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA/AG vs GG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 1,57, 95% de limites de confiança 0,9-2,7, %2 (Yates cor-rigido) = 2,52, p=0,11,1. Genotype. AA / AG vs GG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.57, 95% confidence limits 0.9-2.7,% 2 (stiff-colored Yates) = 2.52, p = 0.11,
AA/AG =susceptível (GG=protetor)AA / AG = susceptible (GG = protective)
2. Alelo. A vs G para COPD vs resistente, razão de possibilidades (OR) =1,61, 95% de limites de confiança 1,0-2,7, %2 (Yates corrigido)= 3,38,p=0,07,2. Allele. A vs G for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.61, 95% confidence limits 1.0-2.7,% 2 (corrected Yates) = 3.38, p = 0.07,
A = susceptívelTabela 11 b. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo -308 G/A doFator de Necrose de Tumor a nos pacientes com COPD e fumantes resistentes.A = susceptibleTable 11 b. Allele and genotype frequencies of -308 G / A Tumor Necrosis Factor a in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 68</column></row><table><table> table see original document page 68 </column> </row> <table>
1. Genótipo. GG vs AG/AA para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 0,77, 95% de limites de confiança 0,5-1,2, %2 (Yates não-corrigido) = 1,62, p=0,20,GG = protetor (AA/AG = susceptível) tendência1. Genotype. GG vs AG / AA for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.77, 95% confidence limits 0.5-1.2,% 2 (uncorrected Yates) = 1.62, p = 0.20, GG = protective (AA / AG = susceptible) trend
2. Alelo. A vs G para COPD vs resistente, razão de possibilidades (OR) =1,3, 95% de limites de confiança 0,9-1,9, %2 (Yates não-corrigido)= 1,7,p=0,20,2. Allele. A vs G for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.3, 95% confidence limits 0.9-1.9,% 2 (uncorrected Yates) = 1.7, p = 0, 20,
A = tendência susceptívelTabela 12. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo C89Y deSMAD3 nos pacientes com COPD e fumantes resistentes.A = susceptible trendTable 12. Allele and genotype frequencies of the SM893 C89Y polymorphism in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 68</column></row><table><table> table see original document page 68 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA/AG vs GG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 0,26, 95% de limites de confiança 0,04-1,4, %2 (Yatesnão-corrigido) = 3,19, p=0,07,AA/AG = protetor (GG susceptível)Tabela 13. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo A/G E469K(rs5498) da molécula de Adesão Intracelular 1 (ICAM1) em pacientes comCOPD e fumantes resistentes.1. Genotype. AA / AG vs GG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.26, 95% confidence limits 0.04-1.4,% 2 (uncorrected Yates) = 3.19, p = 0.07, AA / AG = protective (susceptible GG) Table 13. Allele and genotype frequencies of the E469K (rs5498) A / G polymorphism of the Intracellular Adhesion molecule 1 (ICAM1) in patients with COPD and resistant smokers.
<table>table see original document page 69</column></row><table><table> table see original document page 69 </column> </row> <table>
1. Genótipo. GG vs AG/GG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 1,60, 95% de limites de confiança 0,9-2,7, %2 (Yates cor-rigido) = 3,37, p=0,07,GG = susceptibilidade1. Genotype. GG vs AG / GG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.60, 95% confidence limits 0.9-2.7,% 2 (stiff-colored Yates) = 3.37, p = 0.07, GG = susceptibility
2. Alelo. G vs A para COPD vs resistente, razão de possibilidades (OR) =1,3, 95% de limites de confiança 1,0-1,7, %2 (Yates corrigido) = 2,90,2. Allele. G vs A for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.3, 95% confidence limits 1.0-1.7,% 2 (corrected Yates) = 2.90,
p=0,09p = 0.09
Tabela 14. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo Gly881Argda Caspase (NOD2) nos pacientes com COPD e fumantes resistentes.Table 14. Frequencies of the Gly881Argda Caspase (NOD2) polymorphism allele and genotype in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 69</column></row><table><table> table see original document page 69 </column> </row> <table>
1. Genótipo. CC/CG vs GG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 3,2, 95% de limites de confiança 0,6-22, %2 (Yates não-corrigido) = 2,41, p=0,11 (1 extremidade),GC/CC = susceptibilidade (tendência)1. Genotype. CC / CG vs GG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 3.2, 95% confidence limits 0.6-22,% 2 (uncorrected Yates) = 2.41, p = 0.11 (1 end), GC / CC = susceptibility (trend)
Tabela 15. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo +161 G/A dalectina 2 de ligação à Manose (MBL2) nos pacientes com COPD e fumantesresistentes.<table>table see original document page 70</column></row><table>Table 15. Frequencies of the allose and genotype of the Mannose-binding dalectin +161 G / A dalectin 2 polymorphism (COPD) and resistant smokers. <table> table see original document page 70 </column> </row> < table>
1. Genotipo. GG vs restante para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 0,53, 95% de limites de confiança 0,4-0,80, x2 (Yatesnão-corrigido) = 8,55, p=0,003,1. Genotype. GG vs remainder for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.53, 95% confidence limits 0.4-0.80, x2 (uncorrected Yates) = 8.55, p = 0.003,
GG = protetorGG = protector
Tabela 16. Freqüências do alelo e do genotipo do polimorfismo do promotor -1903 G/A da Quimase 1 (CMA1) nos pacientes com COPD e fumantes resis-tentes.Table 16. Frequencies of the allele and genotype of the Chimase 1 (CMA1) -1903 G / A promoter polymorphism in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 70</column></row><table><table> table see original document page 70 </column> </row> <table>
Genotipo. AA vs AG/GG para COPD vs resistente, razão de possibilirdades (OR) = 0,73, 95% de limites de confiança 0,5-1,1, x2 (Yates cor-rigido) = 1,91, p=0,17,Genotype. AA vs AG / GG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.73, 95% confidence limits 0.5-1.1, x2 (rigid Yates) = 1.91, p = 0 17
Genotipo AA = tendência à proteçãoAA genotype = protection tendency
Tabela 17. Freqüências do alelo e do genotipo do polimorfismo Arg 197 GlnG/A da N-Acetiltransferase 2 em COPD e fumantes resistentes.Table 17. Allele and genotype frequencies of Arg 197 GlnG / A N-Acetyltransferase 2 polymorphism in COPD and resistant smokers.
<table>table see original document page 70</column></row><table>1. Genótipo. AA vs AG/GG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 0,50, 95% de limites de confiança 0,2-1,0, %2 (Yates não-corrigido) = 3,82, p=0,05,Genótipo AA = protetor<table> table see original document page 70 </column> </row> <table> 1. Genotype. AA vs AG / GG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.50, 95% confidence limits 0.2-1.0,% 2 (uncorrected Yates) = 3.82, p = 0.05, Genotype AA = protector
Tabela 18". Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo -511 A/G daTable 18 ". Allele and genotype frequencies of the -511 A / G polymorphism of the
Interleucina 1B (IL-1 b) em COPD e fumantes resistentes.Interleukin 1B (IL-1b) in COPD and resistant smokers.
<table>table see original document page 71</column></row><table><table> table see original document page 71 </column> </row> <table>
1. Genótipo. GG vs AA/AG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 1,3, 95% de limites de confiança 0,9-2,0, %2 (Yates corri-gido) = 1,86, p=0,17,1. Genotype. GG vs AA / AG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.3, 95% confidence limits 0.9-2.0,% 2 (corrected Yates) = 1.86, p = 0.17,
Genótipo GG = tendência a susceptívelGG genotype = susceptible tendency
Tabela 19a. Freqüência do alelo e do genótipo do polimorfismo Tyr 113 HisT/C (éxon 3) da Epóxido hidrolase microssomal (MEH) em COPD e fuman-tes resistentes. • .-Table 19a. Allele and genotype frequency of Tyr 113 HisT / C (exon 3) polymorphism of microsomal epoxide hydrolase (MEH) polymorphism in COPD and resistant smokers. • .-
<table>table see original document page 71</column></row><table><table> table see original document page 71 </column> </row> <table>
1. Genótipo. TT vs CT/CC para COPD vs resistente, razão de possibilida-des (OR) = 1,5, 95% de limites de confiança 1,0-2,2, %2 (Yates corrigi-do) = 3,51, p=0,06,Genótipo TT = susceptívelTabela 19b. Freqüência do alelo e do genótipo do polimorfismo His 139 ArgA/G (éxon 4) da epóxido hidrolase Microssomal (MEH) em COPD e fuman-tes resistentes.1. Genotype. TT vs CT / CC for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.5, 95% confidence limits 1.0-2.2,% 2 (Yates corrected) = 3.51, p = 0.06, Genotype TT = susceptibleTable 19b. Allele and genotype frequency of His 139 ArgA / G (exon 4) polymorphism of Microsomal Epoxide Hydrolase (MEH) polymorphism in COPD and resistant smokers.
<table>table see original document page 72</column></row><table><table> table see original document page 72 </column> </row> <table>
1. Genótipo. GG vs AA/AG para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 0,64, 95% de limites de confiança 0,3-1,4, %2 (Yates não-corrigido) = 1,43, p=0,23,Genótipo GG = protetor (tendência)1. Genotype. GG vs AA / AG for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.64, 95% confidence limits 0.3-1.4,% 2 (uncorrected Yates) = 1.43, p = 0.23, Genotype GG = protective (trend)
Tabela 20. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo -366 G/A daLipo-oxigenase nos pacientes com COPD e fumantes resistentes.Table 20. Allele and genotype frequencies of -366 G / A daLipo-oxygenase polymorphism in COPD patients and resistant smokers.
<table>table see original document page 72</column></row><table><table> table see original document page 72 </column> </row> <table>
1. Genótipo. AA/AG vs GG para COPP^vs resistente, razão de possibili-,dades (OR) = 0,60, 95% de limites de confiança 0,3-1,1, (Yates cor-rigido^ 2,34, p=0,12,1. Genotype. AA / AG vs GG for COPP ^ vs resistant, odds ratio (OR) = 0.60, 95% confidence limits 0.3-1.1, (rigid Yates ^ 2.34, p = 0.12,
Genótipo AA/AG = tendência à proteção (GG susceptível)AA / AG genotype = Protective tendency (susceptible GG)
Tabela 21. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo HOM T2437Cda Proteína do Choque Térmico 70 (HSP 70) nos pacientes com COPD efumantes resistentes.Table 21. Allele and genotype frequencies of HOM T2437Cda Thermal Shock Protein 70 (HSP 70) polymorphism in patients with COPD resistant smokers.
<table>table see original document page 72</column></row><table><table> table see original document page 72 </column> </row> <table>
1. Genótipo. CC/CT vs TT para COPD vs resistente, razão de possibilidades(OR) = 2,0, 95% de limites de confiança 1,3-3,1, %2 (Yates não-corrigido) = 9,52, p=0,002,Genotipo CC/CT - susceptível (TT = protetor)1. Genotype. CC / CT vs TT for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 2.0, 95% confidence limits 1.3-3.1,% 2 (uncorrected Yates) = 9.52, p = 0.002, CC / CT Genotype - susceptible (TT = protective)
Tabela 22. Freqüências do alelo e do genotipo do polimorfismo +13924 T/Ado Canal de Cloreto ativado por Cálcio 1 (CLCA1) nos pacientes com COPDe fumantes resistentes.Table 22. Allele and genotype frequencies of the +13924 T / A polymorphism Calcium Activated Chloride Channel 1 (CLCA1) polymorphism in patients with COPD resistant smokers.
<table>table see original document page 73</column></row><table><table> table see original document page 73 </column> </row> <table>
1. Genotipo. AA vs AT/TT para COPD vs resistente, razão de possibilidades(OR) = 1,7, 95% de limites de confiança 1,0-2,7, %2 (Yates corrigido) =4,51,p=0,03,1. Genotype. AA vs AT / TT for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.7, 95% confidence limits 1.0-2.7,% 2 (corrected Yates) = 4.51, p = 0, 03,
AA = susceptívelAA = susceptible
Tabela 23. Freqüências do alelo e do genotipo do polimorfismo do promotor -159 do antígeno de diferenciação de Monócito CD-14 nos pacientes comCOPD e fumantes resistentes.Table 23. Allele and genotype frequencies of the CD-14 Monocyte Differentiation Antigen -159 promoter polymorphism in patients with COPD and resistant smokers.
<table>table see original document page 73</column></row><table><table> table see original document page 73 </column> </row> <table>
1. Genotipo. CC vs CT/TT para COPD vs Resistente, razão de possibili-dades (OR) = 1,4, 95% de limites de confiança 0,9-2,2, %2 (Yates não-corrigido) = 2,12, p=0,15,CC = susceptível (tendência)1. Genotype. CC vs CT / TT for COPD vs Resistant, odds ratio (OR) = 1.4, 95% confidence limits 0.9-2.2,% 2 (uncorrected Yates) = 2.12, p = 0.15, CC = susceptible (trend)
Tabela 24. Freqüências do alelo e do genotipo do polimorfismo +49 C/T daElafina nos pacientes com COPD, fumantes resistentes e controles.<table>table see original document page 74</column></row><table>Table 24. Allele and genotype frequencies of +49 C / T daffin polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls. <table> table see original document page 74 </column> </row> <table>
1. Genotipo. CT/TT vs CC para COPD vs resistente, razão de possibilida-des (OR) = 0,70, 95% de limites de confiança = 0,4-1,3, x2 (Yates não-corrigido) = 1,36, p=0,24,1. Genotype. CT / TT vs CC for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.70, 95% confidence limits = 0.4-1.3, x2 (uncorrected Yates) = 1.36, p = 0.24,
Genotipo CT/TT = protetor (tendência apenas)CT / TT Genotype = protective (trend only)
2. Alelo: T vs C para COPD vs resistente, razão de possibilidades (OR) =0,69, 95% de limites de confiança = 0,4-1,2, %2 (Yates não-corrigido) =1,91,p=0,17,2. Allele: T vs C for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.69, 95% confidence limits = 0.4-1.2,% 2 (uncorrected Yates) = 1.91 , p = 0.17,
Genotipo T = protetor (tendência apenas)T genotype = protective (trend only)
Tabela 25. Freqüências do alelo e do genotipo do.polimorfismo Gln 27 Gludo Beta2-adrenorreceptor nos pacientes com COPD, fumantes resistentes econtroles.Table 25. Allele and genotype frequencies of the Gln 27 Gludo Beta2-adrenoreceptor polymorphism in COPD patients, resistant smokers and controls.
<table>table see original document page 74</column></row><table><table> table see original document page 74 </column> </row> <table>
1. Genotipo. GG vs CG/CC para COPD vs resistente, razão de possibili-dades (OR) = 0,74, 95% de limites de confiança = 0,4-1,2, %2 (Yatesnão-corrigido) = 1,47, p=0,23,GG = protetor (tendência)1. Genotype. GG vs CG / CC for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 0.74, 95% confidence limits = 0.4-1.2,% 2 (uncorrected Yates) = 1.47, p = 0.23, GG = protector (trend)
2. Genotipo. GG vs CG/CC para COPD vs controles, razão de possibilida-des (OR) = 0,69, 95% de limites de confiança = 0,4-1,2, %2 (Yates não- corrigido) = 2,16, p=0,14,GG = protetor (tendência)2. Genotype. GG vs CG / CC for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 0.69, 95% confidence limits = 0.4-1.2,% 2 (uncorrected Yates) = 2.16 , p = 0.14, GG = protective (trend)
Tabela 26. Freqüências do alelo e do genótipo do polimorfismo -1607 1G/2Gda metaloproteinase de Matriz 1 (MMP1) em pacientes com COPD, fuman-tes resistentes e controles.Table 26. Allele and genotype frequencies of the -1607 1G / 2G polymorphism genotype Matrix 1 (MMP1) in COPD patients, smokers resistant and controls.
<table>table see original document page 75</column></row><table><table> table see original document page 75 </column> </row> <table>
1. Genótipo. 1G1G vs restante para COPD vs controles, razão de possibi-lidades (OR) = 0,43, 95% de limites de confiança 0,3-0,7, x2 (Yates não-corrigido) = 13,3, p=0,0003Genótipo 1G1G = protetor1. Genotype. 1G1G vs remainder for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 0.43, 95% confidence limits 0.3-0.7, x2 (uncorrected Yates) = 13.3, p = 0 .0003Genotype 1G1G = protector
2. Alelo. 1G vs 2G para COPD vs controles, razão de possibilidades (OR)= 0,45, 95% de limites de confiança 0,3-0,6, %2 (Yates corrigido) = 28,8,p<0,0001,1G = protetor2. Allele. 1G vs 2G for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 0.45, 95% confidence limits 0.3-0.6,% 2 (corrected Yates) = 28.8, p <0.0001, 1G = protector
3. Genótipo. 1G1G/1G2G vs restante para COPD vs fumantes resistentes,razão de possibilidades (OR) = 0,55, 95% de limites de confiança 0,4-0,9, x2 (Yates não-corrigido) = 6,83, p=0,009Genótipos 1G1 G/162G = protetor3. Genotype. 1G1G / 1G2G vs remainder for COPD vs resistant smokers, odds ratio (OR) = 0.55, 95% confidence limits 0.4-0.9, x2 (uncorrected Yates) = 6.83, p = 0.009Genotypes 1G1 G / 162G = Protector
4. Alelo. 1G vs 2G para COPD vs fumantes resistentes, razão de possibi-lidades (OR) = 0,73, 95% de limites de confiança 0,6-1,0, %2 (Yates cor-rígido) = 4,61, p=0,03,4. Allele. 1G vs 2G for COPD vs resistant smokers, odds ratio (OR) = 0.73, 95% confidence limits 0.6-1.0,% 2 (rigid Yates) = 4.61, p = 0.03,
1G = protetor1G = protector
5. Genótipo. 2G2G vs 1G1G/1G2G para COPD vs controles, razão depossibilidades (OR) = 3,17, 95% de limites de confiança 1,9-5,3, %2(Yates não-corrigido) = 21,4, p<0,00015. Genotype. 2G2G vs 1G1G / 1G2G for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 3.17, 95% confidence limits 1.9-5.3,% 2 (uncorrected Yates) = 21.4, p <0 .0001
Genótipo 2G2G = susceptível6. Alelo. 2G vs 1G para COPD vs controles, razão de possibilidades (OR)= 2,2, 95% de limites de confiança 1,6-3,0, %2 (Yates corrigido)= 28,8,p<0,00001,2G = susceptívelGenotype 2G2G = susceptible6. Allele. 2G vs 1G for COPD vs controls, odds ratio (OR) = 2.2, 95% confidence limits 1.6-3.0% 2 (corrected Yates) = 28.8, p <0.00001, 2G = susceptible
7. Genótipo. 2G2G vs 1G1G/1G2G para COPD vs resistente, razão depossibilidades (OR) = 1,81, 95% de limites de confiança 1,2-2,9, %2(Yates não-corrigido) = 6,83, p=0,009Genótipo 2G2G = susceptível7. Genotype. 2G2G vs 1G1G / 1G2G for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.81, 95% confidence limits 1.2-2.9,% 2 (uncorrected Yates) = 6.83, p = 0.009 2G2G genotype = susceptible
8. Alelo. 2G vs 1G para COPD vs resistente, razão de possibilidades (OR)= 1,4, 95% de limites de confiança 1,0-1,8, %2 (Yates corrigido) = 4,61,p=0,0,03,2G = susceptível8. Allele. 2G vs 1G for COPD vs resistant, odds ratio (OR) = 1.4, 95% confidence limits 1.0-1.8,% 2 (corrected Yates) = 4.61, p = 0.0, 03,2G = susceptible
Tabela 27. Tabela de sumário dos polimorfismos protetores e de susceptibi-Table 27. Summary table of protective and susceptibility polymorphisms
<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table> table see original document page 76 </column> </row> <table> <table> table see original document page 77 </column> </row> <table>
Tabela 28. Freqüências combinadas da presença ou da ausência de genóti-pos protetores selecionados (COX2 (-765) CC/CG, B2 adreno-receptor AA,lnterleucina-13 AA, Oxido Nítico Sintase 3 TT e proteína de ligação com aVitamina D AA) em indivíduos fumantes (indivíduos com COPD e fumantesresistentes).<table>table see original document page 78</column></row><table>Table 28. Combined Frequencies of Presence or Absence of Selected Protective Genotypes (COX2 (-765) CC / CG, B2 AA Adreneceptor, Interleukin-13 AA, Nitric Oxide Synthase 3 TT, and aVitamin D AA Binding Protein ) in smokers (COPD and smokers resistant). <table> table see original document page 78 </column> </row> <table>
Tabela 29. Freqüências combinadas da presença ou da ausência de genóti-pos de susceptibilidade selecionados (genótipos lnterleucina-18 105 AA,PAI-1 -675 5G5G, lnterleucina-13 -1055 TT e Interferon-y-874 TT) nos indi-víduos fumantes (indivíduos com COPD e fumantes resistentes).Table 29. Combined frequencies of the presence or absence of selected susceptibility genotypes (lnterleukin-18 105 AA, PAI-1 -675 5G5G, lnterleukin-13 -1055 TT and Interferon-y-874 TT genotypes) smokers (individuals with COPD and resistant smokers).
<table>table see original document page 78</column></row><table>Tabela 30. Freqüências combinadas da presença ou da ausência de genóti-pos protetores selecionados (COX2 (-765) CC/CG, lnterleucina-13 AA, OxidoNítico Sintase 3 TT, proteína de ligação com a Vitamina D AA/AC, GSTP1AA e a1 -antitripsina MS/SS) nos indivíduos fumantes (indivíduos com COPDe fumantes resistentes).<table> table see original document page 78 </column> </row> <table> Table 30. Combined frequencies of presence or absence of selected protective genotypes (COX2 (-765) CC / CG, lnterleukin-13 AA , OxiticNitic Synthase 3 TT, Vitamin D-binding protein AA / AC, GSTP1AA and α1-antitrypsin MS / SS) in smokers (individuals with COPD resistant smokers).
<table>table see original document page 79</column></row><table><table> table see original document page 79 </column> </row> <table>
DiscussãoDiscussion
Os resultados anteriores mostram que vários polimorfismos es-tavam associados a susceptibilidade e/ou resistance à doença pulmonarobstrutiva naqueles expostos a ambientes de fumo. É improvável que as as-sociações de polimorfismos individuais por si só, embora tenham valor dis-criminatório, ofereçam uma previsão aceitável de doença. Entretanto, emcombinação estes polimorfismos distinguem fumantes susceptíveis (comCOPD) daqueles que são resistentes. Os polimorfismos representam tantopolimorfismos de promotores, que se acredita que modifiquem a expressãogênica e conseqüentemente a síntese de proteínas quanto polimorfismos deéxons conhecidos por alterarem a seqüência de aminoácidos (e provavel-mente a expressão e/ou a função) em processos conhecidos como sendobásicos à remodelagem pulmonar. Os polimorfismos identificados aqui sãoobservados em genes que codificam proteínas centrais a estes processosque incluem inflamação, remodelagem de matriz e estresse oxidativo.Previous results show that several polymorphisms were associated with susceptibility and / or resistance to obstructive pulmonary disease in those exposed to smoking environments. Associations of individual polymorphisms alone are unlikely to provide an acceptable prediction of disease, although they have discriminatory value. However, in combination these polymorphisms distinguish susceptible smokers (comCOPD) from those who are resistant. Polymorphisms represent promoter tantopolymorphisms, which are believed to modify gene expression and consequently protein synthesis as dexon polymorphisms known to alter amino acid sequence (and probably expression and / or function) in processes known as sendobasic to remodeling. pulmonary. The polymorphisms identified here are observed in genes that encode proteins central to these processes including inflammation, matrix remodeling, and oxidative stress.
Na comparação de fumantes com COPD e fumantes combina-dos com função pulmonar quase normal, foram identificados vários polimor-fismos como sendo observados em uma freqüência significativamente maiorou menor que nos grupos de comparação (incluindo o grupo de doadores desangue).When comparing COPD smokers and combined smokers with near-normal lung function, several polymorphisms were identified as being observed at a significantly higher or lower frequency than in the comparison groups (including the blood donor group).
• Na análise dos polimorfismos no promotor -765 C/G do gene da cicloo-xigenase 2, foi observado que o alelo C e o genótipo CC/CG são signifi-cativamente maiores no grupo de fumantes resistentes comparado como grupo com COPD (OR=1,92, P<0,001 e OR=1,98, P=0,003) coerente• In the analysis of the -765 C / G promoter polymorphisms of the cyclo-xigenase 2 gene, it was observed that the C allele and the CC / CG genotype were significantly larger in the resistant smokers group compared with the COPD group (OR = 1.92, P <0.001 and OR = 1.98, P = 0.003) consistent
com uma função protetora. A maior freqüência comparada com a dogrupo de doadores de sangue também sugere que o alelo C (genótipoCC) está super representado no grupo resistente (ver a Tabela 1).with a protective function. The higher frequency compared to the blood donor group also suggests that the C allele (CC genotype) is overrepresented in the resistant group (see Table 1).
• Na análise do polimorfismo Arg16Gly do gene do receptor adrenérgico(32, foi observado que o genótipo GG era significativamente maior nogrupo com COPD comparado aos controles (OR=1,83, P=0,004) suge-rindo uma susceptibilidade possível ao fumo associada com este genó-tipo. Embora o genótipo GG também esteja super representado no gru-po resistente seus efeitos podem ser ofuscados por polimorfismos prote-tores (ver a Tabela 2).• In analysis of the Arg16Gly polymorphism of the adrenergic receptor gene (32, it was observed that the GG genotype was significantly larger in the COPD group compared to controls (OR = 1.83, P = 0.004) suggesting a possible susceptibility to smoking associated with Although the GG genotype is also overrepresented in the resistant group, its effects can be overshadowed by protective polymorphisms (see Table 2).
• Na análise do polimorfismo 105 C/A do gene IL18, foi observado que oalelo A e o genótipo AA eram significativamente maiores no grupo comCOPD comparado aos controles (OR=1,46, P=0,02 e OR=1,50, P=0,04,respectivamente) coerente com uma função de susceptibilidade. O ge-nótipo AA também era maior no grupo com COPD comparado aos fu-mantes resistentes (OR 1,4, P=0,12) uma tendência coerente com umafunção de susceptibilidade (ver a Tabela 3a).• In the analysis of the IL18 gene 105 C / A polymorphism, it was observed that the allele A and the AA genotype were significantly larger in the group with COPD compared to controls (OR = 1.46, P = 0.02 and OR = 1.50, P = 0.04, respectively) consistent with a susceptibility function. The AA genotype was also higher in the COPD group compared to resistant fuels (OR 1.4, P = 0.12) a trend consistent with a susceptibility function (see Table 3a).
• Na análise do polimorfismo do promotor -133 G/C do gene IL18, foi ob-servado que o alelo C e o genótipo CC eram significativamente maioresno grupo com COPD comparado aos controles (OR=1,36, P=0,05 e• In the analysis of the IL13 gene -133 G / C promoter polymorphism, it was noted that the C allele and CC genotype were significantly larger in the COPD group compared to controls (OR = 1.36, P = 0.05 and
OR=1,44, P=0,06, respectivamente) coerente com uma função de sus-ceptibilidade. O genótipo CC também era maior no grupo com COPDcomparado com os fumantes resistentes a tendência coerente com umafunção de susceptibilidade (ver a Tabela 3b).OR = 1.44, P = 0.06, respectively) consistent with a susceptibility function. The CC genotype was also larger in the COPD group compared with trend-resistant smokers consistent with a susceptibility function (see Table 3b).
Na análise do polimorfismo do promotor -675 4G/5G do gene do Inibidordo Ativador de Plasminogênio, foi observado que o alelo 5G e o genóti-po 5G5G eram significativamente maiores no grupo com COPD compa-rado ao grupo de fumantes resistentes (OR=1,33, P=0,05 e OR=1,55,P=0,08) coerente com uma função de susceptibilidade. A maior fre-qüência do 5G5G em COPD comparada com a do grupo de doadoresde sangue também sugere que o genótipo 5G5G está associado com asusceptibilidade (ver a Tabela 4).In the analysis of the -675 4G / 5G promoter polymorphism of the Plasminogen Activating Inhibidord gene, it was observed that the 5G allele and the 5G5G genotype were significantly larger in the COPD group compared to the resistant smokers group (OR = 1 , 33, P = 0.05 and OR = 1.55, P = 0.08) consistent with a susceptibility function. The higher frequency of 5G5G in COPD compared to the blood donor group also suggests that the 5G5G genotype is associated with susceptibility (see Table 4).
Na análise do polimorfismo 298 Asp/GIu (T/G) do gene da Oxido NítricoSintase (NOS3), foi observado que o genótipo TT era significativamentemaior no grupo de fumantes resistentes comparado com o grupo de do-adores de sangue (OR=2,2, P=0,03) coerente com uma função proteto-ra, (ver a Tabela 5).In the analysis of the 298 Asp / GIu (T / G) polymorphism of the Nitric Oxide Synthase (NOS3) gene, it was observed that the TT genotype was significantly larger in the group of resistant smokers compared with the group of blood donors (OR = 2, 2, P = 0.03) consistent with a protective function, (see Table 5).
Na análise do polimorfismo Lys 420 Thr (A/C) do gene da proteína deligação com a Vitamina D, foi observado que o alelo A e o genótipo A-A/AC eram maiores que no grupo de fumentes resistentes comparadoscom o grupo com COPD (OR=1,34, P=0,05 e OR=1,39, P=0,10, respec-tivamente) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 6a).Na análise do polimorfismo Glu 416 Asp (T/G) do gene da proteína deligação com a Vitamina D, foi observado que o alelo T e o genótipoTT/TG eram maiores no grupo de fumantes resistentes comparado como grupo de doadores de sangue (OR=1,27, P=0,10 e OR=1,53, P=0,06,respectivamente) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 6b).Na análise do polimorfismo lie 105 Vai (A/G) do gene da Glutationa Stransferase P, foi observado que o alelo A e o genótipo AA eram maio-res no grupo de fumantes resistentes comparado com o grupo de doa-dores de sangue (OR=1,34, P=0,05 e OR=1,45, P=0,07, respectivamen-te) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 7).Na análise do polimorfismo 874 A/T do gene do interferon-y, foi obser-vado que o genótipo AA era significativamente maior no grupo comCOPD comparado aos controles (OR-1,5, P=0,08) coerente com umafunção de susceptibilidade. (ver â Tabela 8).In the analysis of the Lys 420 Thr (A / C) polymorphism of the Vitamin D deletion protein gene, it was observed that the A allele and the AA / AC genotype were larger than in the resistant fumes group compared with the COPD group (OR = 1.34, P = 0.05 and OR = 1.39, P = 0.10, respectively) consistent with a protective function, (see Table 6a) .In the analysis of the Glu 416 Asp polymorphism (T / G ) of the Vitamin D deletion protein gene, it was observed that the T allele and the TT / TG genotype were higher in the resistant smokers group compared to the blood donor group (OR = 1.27, P = 0.10 and OR = 1.53, P = 0.06, respectively) consistent with a protective function, (see Table 6b) .In the analysis of the Ile 105 Vai (A / G) polymorphism of the Glutathione Stransferase P gene, it was observed that the allele A and AA genotype were higher in the resistant smokers group compared to the blood donor group (OR = 1.34, P = 0.05 and OR = 1.45, P = 0.07, respectively). -te) consistent with a protective function, (see Tabel 7) .In the analysis of the 874 A / T polymorphism of the interferon-y gene, it was observed that the AA genotype was significantly larger in the coCOPD group compared to the coherent controls (OR-1.5, P = 0.08). with a susceptibility function. (see Table 8).
• Na análise do polimorfismo Arg 130 Gln (G/A) do gene da Interleucina13, foi observado que o genótipo AA era maior no grupo de fumantesresistentes comparado com o grupo de doadores de sangue (OR=2,94,• In the analysis of the Arg 130 Gln (G / A) polymorphism of the Interleukin13 gene, it was observed that the AA genotype was larger in the resistant smoker group compared to the blood donor group (OR = 2.94,
P=0,09) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 9a).P = 0.09) consistent with a protective function, (see Table 9a).
• Na análise do polimorfismo -1055 (C/T) do gene da Interleucina 13, foiobservado que o genótipo TT era maior no grupo com COPD compara-do com o grupo resistente (OR=6,03, P=0,03) coerente com uma funçãode susceptibilidade. (ver a Tabela 9b).• In the analysis of the -1055 (C / T) polymorphism of the Interleukin 13 gene, it was observed that the TT genotype was larger in the COPD group compared with the coherent resistant group (OR = 6.03, P = 0.03). with a susceptibility function. (see Table 9b).
• Na análise do polimorfismo S da oc1-antitripsina, foi observado que oalelo S e o genótipo MS/SS eram maiores nos fumantes resistentescomparados com o grupo com COPD (OR=2,42, P=0,01) coerente comuma função protetora (Tabela 10).• In the analysis of oc1-antitrypsin S polymorphism, it was observed that the S allele and the MS / SS genotype were higher in resistant smokers compared with the COPD group (OR = 2.42, P = 0.01) consistent with a protective function ( Table 10).
• Na análise do polimorfismo +489 G/A do gene do Fator de Necrose deTumor a, foi observado que o alelo A e os genótipos AA e AG erammaiores no grupo com COPD comparado aos controles (OR=1,57,P=0,11) coerente com uma função de susceptibilidade (ver a Tabela11a). De maneira inversa, foi observado que o genótipo GG era maiorno grupo de fumantes resistentes, coerente com uma função protetora(ver a Tabela 11a).• In the analysis of the +489 G / A polymorphism of the Tumor Necrosis Factor a gene, it was observed that the allele A and genotypes AA and AG were higher in the group with COPD compared to controls (OR = 1.57, P = 0, 11) consistent with a susceptibility function (see Table 11a). Conversely, it was observed that the GG genotype was larger in the group of resistant smokers, consistent with a protective function (see Table 11a).
• Na análise do polimorfismo -308 G/A do gene do Fator de Necrose deTumor a, foi observado que o genótipo GG era maior no grupo de fu-mantes resistentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,77,P=0,20) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 11b). Demaneira inversa, foi observado que o alelo A e os genótipos AA e AGeram maiores no grupo com COPD (OR=1,3, P=0,20), coerente comuma função de susceptibilidade (ver a Tabela 11b).• In the analysis of the -308 G / A polymorphism of the Tumor Necrosis Factor a gene, it was observed that the GG genotype was larger in the group of resistant fuels compared with the group with COPD (OR = 0.77, P = 0 , 20) consistent with a protective function, (see Table 11b). Conversely, it was observed that the allele A and genotypes AA and AG were larger in the COPD group (OR = 1.3, P = 0.20), consistent with a susceptibility function (see Table 11b).
• Na análise do polimorfismo C89Y A/G do gene de SMAD3, foi observa-do que os genótipos AA e AG eram maiores no grupo de fumantes resis-tentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,26, P=0,07) coerentecom uma função protetora, (ver a Tabela 12). De maneira inversa, foiobservado que o genótipo GG era maior no grupo com COPD, coerente com uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 12).• In the analysis of the C89Y A / G polymorphism of the SMAD3 gene, it was observed that the AA and AG genotypes were larger in the resistant smokers group compared with the COPD group (OR = 0.26, P = 0, 07) consistent with a protective function, (see Table 12). Conversely, it was noted that the GG genotype was larger in the COPD group, consistent with a susceptibility function (see Table 12).
• Na análise do polimorfismo E469K A/G do gene da molécula de AdesãoIntracelular 1, foi observado que o alelo G e o genótipo GG eram maiores no grupo com COPD comparado aos controles (OR=1,3, P=0,09 e• In the analysis of the E469K A / G polymorphism of the Intracellular Adhesion molecule gene 1, it was observed that the G allele and GG genotype were larger in the COPD group compared to controls (OR = 1.3, P = 0.09 and
OR=1,6, P=0,07, respectivamente) coerente com uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 13).OR = 1.6, P = 0.07, respectively) consistent with a susceptibility function (see Table 13).
• Na análise do polimorfismo Gly 881 Arg G/C do gene da Caspase(NOD2), foi observado que os genótipos CC e CG eram maiores no grupo com COPD comparado aos controles (OR=3,2, P=0,11) coerentecom uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 14).• In the analysis of the Caspase Gly 881 Arg G / C polymorphism (NOD2), it was observed that the CC and CG genotypes were larger in the COPD group compared to controls (OR = 3.2, P = 0.11) coherent with a susceptibility function (see Table 14).
• Na análise do polimorfismo 161 G/A do gene da lectina 2 de ligação àManose, foi observado que o genótipo GG era maior no grupo de fumantes resistentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,53,P=0,003) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 15).• In the analysis of the 161 G / A polymorphism of the Manose-binding lectin 2 gene, it was observed that the GG genotype was larger in the resistant smokers group compared with the COPD group (OR = 0.53, P = 0.003) consistent with a protective function, (see Table 15).
• Na análise do polimorfismo -1903 G/A do gene da Quimase 1, foi observado que o genótipo AA era maior no grupo de fumantes resistentescomparado com o grupo com COPD (OR=0,73, P=0,17) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 16).• In the analysis of the Quimase 1 gene -1903 G / A polymorphism, it was observed that the AA genotype was larger in the resistant smokers group compared with the COPD group (OR = 0.73, P = 0.17) consistent with a protective function, (see Table 16).
• Na análise do polimorfismo Arg 197 Gln G/A do gene da N-Acetil transferase 2, foi observado que o genótipo AA era maior no grupo de fuman-tes resistentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,50, P=0,05)coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 17).• In the analysis of the Arg 197 Gln G / A polymorphism of the N-Acetyl transferase 2 gene, it was observed that the AA genotype was larger in the resistant smokers group compared to the COPD group (OR = 0.50, P = 0.05) consistent with a protective function, (see Table 17).
• Na análise do polimorfismo -511 A/G do gene da Interleucina 1B, foi observado que o genótipo GG era maior no grupo com COPD comparadoaos controles (OR=1,3, P=0,17) coerente com uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 18).• In the analysis of the -511 A / G polymorphism of the Interleukin 1B gene, it was observed that the GG genotype was larger in the COPD group compared to controls (OR = 1.3, P = 0.17) consistent with a susceptibility function ( see Table 18).
• Na análise do polimorfismo Tyr 113 His T/C do gene da epóxido hidrola-se Microssomal, foi observado que o genótipo TT era maior no grupocom COPD comparado aos controles (OR=1,5, P=0,06) coerente comuma função de susceptibilidade (ver a Tabela 19a).• In the analysis of the Tyr 113 His T / C polymorphism of the epoxide gene hydrolyzed Microsomal, it was observed that the TT genotype was larger in the group with COPD compared to controls (OR = 1.5, P = 0.06) consistent with a function. susceptibility (see Table 19a).
• Na análise do polimorfismo Arg 139 G/A do gene da epóxido hidrolaseMicrossomal, foi observado que o genótipo GG era maior no grupo defumantes resistentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,64,P=0,23) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 19b).• In the analysis of the Arg 139 G / A polymorphism of the Microsomal epoxide hydrolase gene, it was observed that the GG genotype was larger in the resistant smokers group compared with the COPD group (OR = 0.64, P = 0.23) consistent with a protective function, (see Table 19b).
• Na análise do polimorfismo -366 G/A do gene da Lipo-oxigenase 5, foiobservado que os genótipos AG e AA eram maiores no grupo de fuman-tes resistentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,60, P=0,12)coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 20). De maneira in-versa, foi observado que o genótipo GG era maior no grupo com COPD,coerente com uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 20).• In the analysis of the -366 G / A polymorphism of the Lipo-oxygenase 5 gene, it was observed that the AG and AA genotypes were larger in the resistant smokers group compared with the COPD group (OR = 0.60, P = 0 , 12) consistent with a protective function, (see Table 20). Conversely, it was observed that the GG genotype was larger in the COPD group, consistent with a susceptibility function (see Table 20).
Na análise do polimorfismo HOM T2437C do gene da Proteína do Cho-que Térmico 70, foi observado que os genótipos CC e CT eram maioresno grupo com COPD comparado aos controles (OR=2,0, P=0,002) coe-rente com uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 21). De manei-ra inversa, foi observado que o genótipo TT era maior no grupo de fu-mantes resistentes, coerente com uma função protetora (ver a Tabela21).In the analysis of the HOM T2437C polymorphism of the Thermal Shock Protein 70 gene, it was observed that the CC and CT genotypes were larger in the group with COPD compared to the controls (OR = 2.0, P = 0.002) which is consistent with a function. susceptibility (see Table 21). Conversely, it was observed that the TT genotype was larger in the group of resistant fuels, consistent with a protective function (see Table 21).
• Na análise do polimorfismo +13924 T/A do gene do Canal de Cloretoativado por Cálcio 1, foi observado que o genótipo AA era maior no gru-po com COPD comparado aos controles (OR=1,7, P=0,03) coerentecom uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 22).• In the analysis of the +13924 T / A polymorphism of the Calcium Chloride Activated Channel 1 gene, it was observed that the AA genotype was larger in the group with COPD compared to controls (OR = 1.7, P = 0.03) consistent with a susceptibility function (see Table 22).
• Na análise do polimorfismo -159 C/T do gene do antígeno de diferencia-ção de Monócito CD-14, foi observado que o genótipo CC era maior nogrupo com COPD comparado aos controles (OR=1,4, P=0,15) coerentecom uma função de susceptibilidade (ver a Tabela 23).• In the analysis of the -159 C / T polymorphism of the CD-14 Monocyte differentiation antigen gene, it was observed that the CC genotype was larger in the COPD group compared to controls (OR = 1.4, P = 0.15 ) consistent with a susceptibility function (see Table 23).
• Na análise do polimorfismo Éxon 1 +49 C/T do gene da Elafina, foi ob-servado que o T alelo e os genótipos CT e TT eram maiores no grupode fumantes resistentes comparado com o grupo com COPD (OR=0,69,P= 0,17, OR=0,70, P=0,24, respectivamente) coerente com uma funçãoprotetora, (ver a Tabela 24).• In the analysis of the Exon 1 +49 C / T polymorphism of the Elafina gene, it was observed that the T allele and the CT and TT genotypes were higher in the group of resistant smokers compared to the group with COPD (OR = 0.69; P = 0.17, OR = 0.70, P = 0.24, respectively) consistent with a protective function (see Table 24).
• Na análise do polimorfismo Gln 27 Glu C/G do gene do receptor (32-adrenérgico, foi observado que o genótipo GG era maior no grupo defumantes resistentes e nos controles doadores de sangue comparadoscom o grupo com COPD (OR=0,74, P=0,23, OR=0,69, P=0,14, respecti-vamente) coerente com uma função protetora, (ver a Tabela 25).• Na análise do polimorfismo do promotor -1607 1G/2G do gene deMMP1, foi observado que o alelo 1G e os genótipos 1G1G/1G2G eramsignificativamente maiores no grupo de fumantes resistentes comparadocom o grupo com COPD (OR=0,73, p=0,03 e OR=0,55, p=0,009), coe-rente com uma função protetora. A maior freqüência do 1G1G no gruporesistente comparado com o grupo de doadores de sangue também su-gere que o alelo 1G é protetor (ver a Tabela 26).• In the analysis of the Gln 27 Glu C / G polymorphism of the (32-adrenergic) receptor gene, it was observed that the GG genotype was higher in the resistant smokers group and in blood donor controls compared with the COPD group (OR = 0.74, P = 0.23, OR = 0.69, P = 0.14, respectively) consistent with a protective function (see Table 25) • In the analysis of the -1607 1G / 2G promoter polymorphism of the MMP1 gene , it was observed that the 1G allele and the 1G1G / 1G2G genotypes were significantly larger in the group of resistant smokers compared with the group with COPD (OR = 0.73, p = 0.03 and OR = 0.55, p = 0.009). with a protective function The higher frequency of 1G1G in the group resistant compared to the blood donor group also suggests that the 1G allele is protective (see Table 26).
É aceito que a disposição a doenças pulmonares obstrutivascrônicas (por exemplo, enfisema e COPD) é o resultado dos efeitos combi-nados da constituição genética individual e sua exposição durante toda avida a vários poluentes aéreos dos quais a fumaça do fumo é a mais co-mum. Similarmente, é aceito que a COPD abranja várias doenças pulmona-res obstrutivas e que seja caracterizada por vazões expiratórias prejudicadas(por exemplo, FEV1). Os dados contidos aqui sugerem que vários genespodem contribuir para o desenvolvimento de COPD. Um número de muta-ções genéticas atuando em combinação promovendo ou protegendo os pul-mões de danos pode estar envolvida na resistance ou na susceptibilidadeelevada.It is accepted that the disposition to chronic obstructive pulmonary diseases (eg, emphysema and COPD) is the result of the combined effects of the individual genetic make-up and its exposure throughout life to various air pollutants of which smoke is the most common. mum Similarly, it is accepted that COPD encompasses a number of obstructive pulmonary diseases and is characterized by impaired expiratory flow rates (eg FEV1). The data contained herein suggest that several genes may contribute to the development of COPD. A number of genetic mutations acting in combination promoting or protecting the lungs from damage may be involved in resistance or increased susceptibility.
Partindo das análises dos polimorfismos individuais, foram iden-tificados 19 genótipos protetores e analisados em relação as suas freqüên-cias no grupo de fumantes consistindo em fumantes resistentes e daquelescom COPD. Quando as freqüências de fumantes resistentes e fumantes comCOPD foram comparadas de acordo com a presença de genótipos proteto-res 0, 1 e 2+ (além de COX2 CC/CG, p2 adreno-receptor Arg 16 Gly AA,lnterleucina-13 Arg 130 Gln AA, Oxido Nítrico Sintase 3 298 TT e proteína deligação com a Vitamina D 420 AA/AC) foram observadas diferenças signifi-cativas (total ^2=16,43, P=0,0003) sugerindo que fumantes com genótiposprotetores 2+ tinham uma probabilidade três vezes maior de serem resisten-tes (OR=3,1, P=0,004) enquanto que naqueles sem genótipos protetores eraquase duas vezes mais provável que tivessem COPD (OR=1,74, P=0,006)(ver a Tabela 28). Verificadas de uma outra maneira, as chances de terCOPD diminuíram de 63%, 55% para 32% em fumantes com 0, 1 e 2+ dosgenótipos protetores testados, respectivamente. Na análise de uma triagemde genótipos protetores (além de COX2 CC/CG, NOS3 298 TT, VDBP-420AA/AC, VDBP-416 TT/TG, GSTP1 AA, IL-13-140 AA e a1 -AT MS/SS), foiobservada uma diferença significativa na freqüência de COPD versus resis-tência naqueles com 0 versus 1+ dos genótipos protetores testados(OR=2,82, P=0,0004) (ver a Tabela 30), mostrando um aumento de 2-3 ve-zes em COPD naqueles com 0 dos genótipos protetores.From the analysis of the individual polymorphisms, 19 protective genotypes were identified and analyzed in relation to their frequencies in the group of smokers consisting of resistant smokers and those with COPD. When the frequencies of resistant smokers and COPD smokers were compared according to the presence of 0, 1 and 2+ protective genotypes (in addition to COX2 CC / CG, p2 adrenoceptor Arg 16 Gly AA, lterterucine-13 Arg 130 Gln AA, Nitric Oxide Synthase 3 298 TT and protein deletion with Vitamin D 420 AA / AC) significant differences were observed (total ^ 2 = 16.43, P = 0.0003) suggesting that smokers with protective genotypes 2+ had a three times more likely to be resistant (OR = 3.1, P = 0.004) whereas those without protective genotypes were almost twice as likely to have COPD (OR = 1.74, P = 0.006) (see Table 28). ). In another way, the chances of terCOPD decreased from 63%, 55% to 32% in smokers with 0, 1 and 2+ of the protective genotypes tested, respectively. In the analysis of a screening of protective genotypes (in addition to COX2 CC / CG, NOS3 298 TT, VDBP-420AA / AC, VDBP-416 TT / TG, GSTP1 AA, IL-13-140 AA and a1 -AT MS / SS), A significant difference in COPD frequency versus resistance was observed in those with 0 versus 1+ of the protective genotypes tested (OR = 2.82, P = 0.0004) (see Table 30), showing an increase of 2-3 ve COPD in those with 0 of the protective genotypes.
Partindo das análises dos polimorfismos individuais, foram iden-tificados 17 genótipos de susceptibilidade e analisados em relação as suasfreqüências no grupo de fumantes consistindo de fumantes resistentes e da-queles com COPD. Quando as freqüências de fumantes resistentes e defumantes com COPD eram comparadas de acordo com a presença dos ge-nótipos de susceptibilidade 0, 1 e 2+ (além dos genótipos lnterleucina-18105 AA, PAI-1 -675 5G5G, lnterleucina-13 -1055 TT e Interferon-y-874 TT)foram observadas diferenças significativas (total x2=8,72, P=0,01) sugerindoque os fumantes com 2+ dos genótipos de susceptibilidade testados tinhamuma probabilidade duas vezes maior de ter COPD (OR=1,9, P=0,009) en-quanto que aqueles com nenhum dos genótipos de susceptibilidade testadostinham uma probabilidade de 1,5 vez de ter COPD (OR=1,5, P=0,05) (ver aTabela 29). Verificadas de outra maneira, as chances de ter COPD aumenta-ram de 49%, 55% para 68% em fumantes com 0, 1 e 2+ dos genótipos desusceptibilidade testados, respectivamente.From the analysis of individual polymorphisms, 17 susceptibility genotypes were identified and analyzed for their frequencies in the group of smokers consisting of resistant smokers and those with COPD. When the frequencies of COPD resistant smokers and smokers were compared according to the presence of susceptibility genotypes 0, 1, and 2+ (in addition to genotypes lnterleucine-18105 AA, PAI-1 -675 5G5G, lnterleucine-13 -1055 TT and Interferon-y-874 TT) significant differences were observed (total x2 = 8.72, P = 0.01) suggesting that smokers with 2+ of the susceptibility genotypes tested were twice as likely to have COPD (OR = 1 , 9, P = 0.009) whereas those with none of the susceptibility genotypes tested had a 1.5-fold probability of having COPD (OR = 1.5, P = 0.05) (see Table 29). In other words, the odds of having COPD increased from 49%, 55% to 68% in smokers with 0, 1 and 2+ of the tested non-susceptibility genotypes, respectively.
Estas descobertas indicam que os métodos da presente inven-ção podem prever COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema em umindivíduo bem antes que os sintomas se apresentem.These findings indicate that the methods of the present invention can predict COPD, emphysema or both COPD and emphysema in an individual well before symptoms appear.
Estas descobertas, portanto, apresentam ainda oportunidadespara intervenções terapêuticas e/ou regimes de tratamento, como discutidoaqui. Sucintamente, tais intervenções ou regimes podem incluir o forneci-mento ao indivíduo de motivação para implementar uma alteração no estilode vida ou métodos terapêuticos direcionados para a normalização da ex-pressão do gene aberrante ou da função do produto gênico. Por exemplo, oalelo -765 G no promotor do gene que codifica COX2 está associado à maiorexpressão do gene em relação à observada com o alelo C. Como mostradoaqui, o alelo C é protetor em relação à predisposição a ou ao risco potencialde desenvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema,em que uma terapia adequada nos indivíduos que se sabe que possuem oalelo -765 G pode ser a administração de um agente capaz de reduzir a ex-pressão do gene que codifica COX2. Uma terapia alternativa adequada podeser a administração a tal indivíduo de um inibidor de COX2 tal como aborda-gens terapêuticas adicionais, terapia gênica, RNAi. Em um outro exemplo,como mostrado aqui o alelo -133 C no promotor do gene que codifica IL18está associado à susceptibilidade a COPD, enfisema ou tanto COPD quantoenfisema. O alelo -133 G no promotor do gene que codifica IL18 está asso-ciado à maiores níveis de IL18, em que uma terapia adequada nos indiví-duos que se sabe que possuem o alelo -133 C.pode ser a administração deum agente capaz de aumentar a expressão do gene que codifica IL18. Aindaem um outro exemplo, como mostrado aqui o genótipo -675 5G5G no pro-motor do gene do Inibidor do Ativador de Plasminogênio está associado àsusceptibilidade a COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. O alelo5G está supostamente associado à maior ligação de uma proteína represso-ra e uma menor transcrição do gene. Uma terapia adequada pode ser a ad-ministração de um agente capaz de diminuir o nível de repressor e/ou dereprimir a ligação do repressor, aliviando assim seu efeito de regulação paramenos sobre a transcrição. Uma terapia alternativa pode incluir terapia gêni-ca, por exemplo, a introdução de pelo menos uma cópia adicional do genedo Inibidor do Ativador de Plasminogênio que possui uma afinidade reduzidaem relação à ligação do repressor (por exemplo, uma cópia do gene quepossui um genótipo -675 4G4G).These findings, therefore, still present opportunities for therapeutic interventions and / or treatment regimens, as discussed herein. Briefly, such interventions or regimens may include providing the individual with the motivation to implement a change in lifestyle or therapeutic methods aimed at normalizing aberrant gene expression or gene product function. For example, the -765 G allele in the promoter of the COX2 coding gene is associated with higher gene expression compared to that observed with the C allele. As shown here, the C allele is protective against predisposition to or potential risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, where appropriate therapy in individuals known to possess the -765 G allele may be the administration of an agent capable of reducing expression of the COX2 encoding gene. Suitable alternative therapy may be the administration to such an individual of a COX2 inhibitor such as additional therapeutic approaches, gene therapy, RNAi. In another example, as shown herein the -133 C allele in the IL18-encoding gene promoter is associated with susceptibility to COPD, emphysema or both COPD and emphysema. The -133 G allele in the IL18-encoding gene promoter is associated with higher levels of IL18, where appropriate therapy in individuals known to possess the -133C allele may be the administration of an agent capable of increase expression of the gene encoding IL18. In yet another example, as shown herein the -675 5G5G genotype in the Plasminogen Activator Inhibitor gene promoter is associated with susceptibility to COPD, emphysema or both COPD and emphysema. Allele5G is supposedly associated with higher binding of a repressor protein and lower gene transcription. A suitable therapy may be the administration of an agent capable of decreasing the repressor level and / or depressing the repressor binding, thereby alleviating its effect of regulating the transcription. An alternative therapy may include gene therapy, for example the introduction of at least one additional copy of the Plasminogen Activator Inhibitor genome that has a reduced affinity for repressor binding (e.g., a copy of the gene that has a genotype - 675 4G4G).
Os métodos e os agentes adequados para uso em tal terapiasão bem conhecidos na técnica e são discutidos aqui.Suitable methods and agents for use in such therapy are well known in the art and are discussed herein.
A identificação tanto de polimorfismos de susceptibilidade quan-to protetores como descrito aqui também fornece a oportunidade de selecio-nar compostos candidatos para avaliar sua eficiência nos métodos de trata-mento profilático e/ou terapêutico. Tais métodos de triagem envolvem a iden-tificação de qual de uma faixa de compostos candidatos possui a capacidadede reverter ou agir contra um efeito genotípico ou fenotípico de um polimor-fismo de susceptibilidade ou a capacidade de imitar ou reproduzir um efeitogenotípico ou fenotípico de um polimorfismo protetor.Identification of both protective and susceptibility polymorphisms as described herein also provides the opportunity to select candidate compounds to evaluate their effectiveness in prophylactic and / or therapeutic treatment methods. Such screening methods involve the identification of which of a range of candidate compounds has the ability to reverse or act against a genotypic or phenotypic effect of a susceptibility polymorphism or the ability to mimic or reproduce a genotypic or phenotypic effect of a polymorphism. protector.
Ainda adicionalmente, são fornecidos métodos para avaliar acapacidade de resposta provável de um indivíduo a uma abordagem profilá-tica ou terapêutica disponível. Tais métodos possuem aplicação particularquando a abordagem de tratamento disponível envolve a restauração daconcentração fisiologicamente ativa de um produto de um gene expressopartindo de um excesso ou de um déficit que estará dentro de uma faixa queé normal para a idade e para o sexo do indivíduo. Em tais casos, o métodocompreende a detecção da presença ou da ausência de um polimorfismo desusceptibilidade que, quando presente, regula para mais ou regula para me-nos a expressão do gene de forma que o estado de tal excesso ou déficit é oresultado, com aqueles indivíduos em que o polimorfismo está presentesendo provavelmente capazes de responder ao tratamento.Still further, methods are provided for assessing an individual's likely responsiveness to an available prophylactic or therapeutic approach. Such methods have particular application when the available treatment approach involves restoration of the physiologically active concentration of a gene product expressed from an excess or deficit that will be within a range that is normal for the individual's age and sex. In such cases, the method comprises detecting the presence or absence of a non-susceptible polymorphism which, when present, further regulates or regulates for us the expression of the gene such that the state of such excess or deficit is resultant with those individuals in whom the polymorphism is present are likely to respond to treatment.
A Tabela 31 abaixo apresenta exemplos representativos de po-limorfismos em desequilíbrio de ligação com os polimorfismos especificadosaqui. Os exemplos de tais polimorfismos podem ser localizados utilizandobancos de dados públicos, tal como o disponível em www.hapmap.org. Ospolimorfismos especificados estão indicados nas colunas marcadas comNOME DO SNP. Os identificadores únicos estão indicados nas colunas mar-casdas com NÚMERO RS.Tabela 31. Polimorfismos relatados como estando em desequilíbrio de liga-ção (a não ser que seja citado) com o polimorfismo especificado).Table 31 below provides representative examples of polymorphisms in binding disequilibrium with the polymorphisms specified herein. Examples of such polymorphisms can be found using public data banks, such as available at www.hapmap.org. The specified polymorphisms are indicated in the columns marked SNP NAME. Unique identifiers are indicated in columns matched with RS-NUMBER.Table 31. Polymorphisms reported to be in binding disequilibrium (unless noted) with specified polymorphism).
NÚMERO RS NOME DO SNP NÚMERO RS NOME DO SNP NÚMERO RSRS NUMBER SNP NAME RS NUMBER SNP NAME RS NUMBER
rs6684912 rs5277rs6684912 rs5277
rs7527769 rs2745559 rs2066823rs7527769 rs2745559 rs2066823
rs7550380 rs12042763 rs4648263rs7550380 rs12042763 rs4648263
rs2206594 rs4648250 rs4987012rs2206594 rs4648250 rs4987012
rs6687495 rs4648251 rs20428rs6687495 rs4648251 rs20428
rs6681231 rs2223626 rs20429rs6681231 rs2223626 rs20429
rs13376484 rs689462 rs4648264rs13376484 rs689462 rs4648264
rs12064238 rs4648253 rs4648265rs12064238 rs4648253 rs4648265
rs10911911 rs689465 rs4648266rs10911911 rs689465 rs4648266
rs12743673 rs12027712 rs4648267rs12743673 rs12027712 rs4648267
rs10911910 rs689466 rs11567824rs10911910 rs689466 rs11567824
rs12743516 rs2745558 rs4648268rs12743516 rs2745558 rs4648268
rs10911909 rs3918304 rs4648269rs10911909 rs3918304 rs4648269
rs1.119066 rs20415 rs4648270rs1.119066 rs20415 rs4648270
rs1119065 rs20416 rs12759220rs1119065 rs20416 rs12759220
rs1119064 rs4648254 rs20430rs1119064 rs4648254 rs20430
rs10798053 rs11567815 rs4648271rs10798053 rs11567815 rs4648271
rs12409744 -765G>C rs20417 rs11567825rs12409744 -765G> C rs20417 rs11567825
rs10911908 rs4648256 rs4648273rs10911908 rs4648256 rs4648273
rs10911907 rs20419 rs16825748rs10911907 rs20419 rs16825748
rs7416022 rs2734779 rs4648274rs7416022 rs2734779 rs4648274
rs2745561 rs20420 rs16825745rs2745561 rs20420 rs16825745
rs10911906 rs20422 rs20432rs10911906 rs20422 rs20432
rs2734776 rs20423 rs20433rs2734776 rs20423 rs20433
rs2734777 rs5270 rs3218622rs2734777 rs5270 rs3218622
rs12084433 rs20424 rs2066826rs12084433 rs20424 rs2066826
rs2734778 rs5271 rs5278rs2734778 rs5271 rs5278
rs2745560 rs4648257 rs4648276rs2745560 rs4648257 rs4648276
rs2223627 rs11567819 rs20434NOME DO SNP NÚMERO RSrs2223627 rs11567819 rs20434SNP NUMBER RS NUMBER
rs2383517rs2383517
rs4295848rs4295848
rs4428839rs4428839
rs4609389rs4609389
rs4428838rs4428838
rs12131210rs12131210
rs2179555rs2179555
rs2143417rs2143417
rs2143416rs2143416
rs11583191rs11583191
rs2383516rs2383516
rs2383515rs2383515
rs10911905rs10911905
rs10911904rs10911904
rs4648287rs4648287
rs5272rs5272
rs4648288rs4648288
rs5273rs5273
rs5274rs5274
rs3218625rs3218625
rs4648289rs4648289
rs4648290rs4648290
rs1051896rs1051896
rs5275rs5275
ADRB SNRsrs2082382rs2082394rs2082395rs9325119rs9325120rs12189018rs11168066rs11959615rs11958940rs4705270ADRB SNRsrs2082382rs2082394rs2082395rs9325119rs9325120rs12189018rs11168066rs11959615rs11958940rs4705270
rs10079142rs9325121rs11746634rs11168067rs9325122rs11957351rs10079142rs9325121rs11746634rs11168067rs9325122rs11957351
NOME DO SNP NÚMERO RSSNP NUMBER RS NUMBER
rs3134591rs3134591
rs3134592rs3134592
rs20426rs20426
rs4648258rs4648258
rs11567820rs11567820
rs2745557rs2745557
rs11567821rs11567821
rs4648259rs4648259
rs4648260rs4648260
rs4648261rs4648261
rs4648262rs4648262
rs11567822rs11567822
rs11567823rs11567823
rs2066824rs2066824
rs20427rs20427
rs1042719rs1042719
rs3729944rs3729944
rs3730182rs3730182
rs1042720rs1042720
rs6879202rs6879202
rs3777124rs3777124
rs1803051rs1803051
rs8192451rs8192451
rs4987255rs4987255
rs3177007rs3177007
rs1126871rs1126871
rs6885272rs6885272
rs6889528rs6889528
rs4521458rs4521458
rs10463409rs10463409
rs7702861rs7702861
IL-18 SNPsIL-18 SNPs
rs187238rs187238
rs5744228rs5744228
rs360718rs360718
rs360717rs360717
rs5744229rs5744229
rs 100000353rs 100000353
rs5744231rs5744231
rs5744232rs5744232
rs7106524rs7106524
rs 189667rs 189667
NOME DO SNP NÚMERO RSSNP NUMBER RS NUMBER
rs3218623rs3218623
rs3218624rs3218624
rs5279rs5279
rs4648278rs4648278
rs13306034rs13306034
rs2853803rs2853803
rs4648279rs4648279
rs4648281rs4648281
rs4648282rs4648282
rs11567826rs11567826
rs4648283rs4648283
rs4648284rs4648284
rs4648285rs4648285
rs11567827rs11567827
rs4648286rs4648286
rs5744244rs5744244
rs360722rs360722
rs5023207rs5023207
rs5744246rs5744246
rs5744247rs5744247
-133 C/G rs360721-133 C / G rs360721
rs4988359rs4988359
rs12721559rs12721559
rs5744248rs5744248
rs5744249rs5744249
rs5744250rs5744250
rs5744251rs5744251
rs100000356rs100000356
rs1834481rs1834481
rs17215057rs17215057
rs5744253rs5744253
rs5744254rs5744254
rs5744255rs5744255
rs5744256rs5744256
rs5744257rs5744257
rs360720rs360720
rs5744258rs5744258
rs5744259rs5744259
rs5744260rs5744260
rs5744261rs5744261
105 A/C rs549908105 A / C rs549908
PAI-1 SNPsNOME DO SNP NÚMERO RSFATHER-1 SNPs SNP NUMBER RS NUMBER
rs11948371rs11960649rs1432622rs1432623rs11168068rs17778257rs2400706rs2895795rs2400707rs2053044rs17108803rs12654778rs11168070rs11959427rs1042711rs1801704s Arg16Giy rs1042713rs1042714rs1042717rs1800888rs1042718rs3729943rs11948371rs11960649rs1432622rs1432623rs11168068rs17778257rs2400706rs2895795rs2400707rs2053044rs17108803rs12654778rs11168070rs11959427rs1042711rs1801704s Arg16Giy rs1042713rs1042714rs1042717rs1800888rs1042718rs3729943
rs12703107rs12703107
rs6946340rs6946340
rs6946091rs6946091
rs6946415rs6946415
rs10952296rs10952296
rs13309715rs13309715
rs10952297rs10952297
rs7784943rs7784943
rs11771443rs11771443
rs2243310rs2243310
rs1800783rs1800783
rs3918155rs3918155
rs3918156rs3918156
rs2566519rs2566519
rs3918157rs3918157
rs3918158rs3918158
rs3918159rs3918159
rs2566516rs2566516
rs3918225rs3918225
rs3918160rs3918160
rs1800779rs1800779
rs2243311rs2243311
rs3918161rs3918161
rs10952298rs10952298
rs2070744rs2070744
rs3918226rs3918226
rs3918162rs3918162
rs3918163rs3918163
NOME DO SNP NÚMERO RSSNP NUMBER RS NUMBER
rs 12290658rs 12290658
rs12271175rs12271175
rs11606049rs11606049
rs360716rs360716
rs360715rs360715
rs360714rs360714
rs2043055rs2043055
rs5744233rs5744233
rs795467rs795467
rs12270240rs12270240
rs100000354rs100000354
rs4937113rs4937113
rs100000355rs100000355
rs360723rs360723
rs5744237rs5744237
rs5744238rs5744238
rs5744239rs5744239
rs7932965rs7932965
rs11214103rs11214103
rs5744241rs5744241
rs5744242rs5744242
rs5744243rs5744243
rs9282804Asp298Glu rs1799983VDBP SNPsrs222035rs222036rs16846943rs7668653rs1491720rs16845007rs17830803Glu416Asp rs7041Lys420Thr rs4588rs9282804Asp298Glu rs1799983VDBP SNPsrs222035rs222036rs16846943rs7668653rs1491720rs16845007rs17830803Glu416Asp rs7041Lys420Thr rs4588
rs3737553rs3737553
rs9016rs9016
rs1352846rs1352846
rs222039rs222039
rs3775154rs3775154
rs222040rs222040
rs843005rs843005
rs222041rs222041
rs7672977rs7672977
rs705121rs705121
rs11723621rs11723621
rs2298850rs2298850
rs705120rs705120
rs2298851rs2298851
rs844806rs844806
rs1491709rs1491709
NOME DO SNP NÚMERO RSSNP NUMBER RS NUMBER
rs6465787rs7788533rs6975620rs6956010rs12534508rs4729664rs2527316rs2854235rs10228765rs2854225rs2854226rs2227707rs2227631-675 4G/5G No rsrs6465787rs7788533rs6975620rs6956010rs12534508rs4729664rs2527316rs2854235rs10228765rs2854225rs2854226rs2227707rs2227631-675 4G / 5G In the Rs
NOS3 SNPsrs2373962rs2373961rs6951150rs13238512rs10247107rs10276930rs10277237NOS3 SNPsrs2373962rs2373961rs6951150rs13238512rs10247107rs10276930rs10277237
rs2282679rs2282679
rs2282680rs2282680
rs705117rs705117
rs2070741rs2070741
rs2070742rs2070742
rs6821541rs6821541
rs222048rs222048
rs432031rs432031
rs432035rs432035
rs222049rs222049
rs222050rs222050
rs12510584rs12510584
rs17467825rs17467825
GSTP1 SNPsGSTP1 SNPs
rs656652rs656652
rs625978rs625978
rs6591251rs6591251
rs12278098rs12278098
rs612020rs612020
rs12284337rs12284337
rs12574108rs12574108
rs6591252rs6591252
rs597717rs597717
rs688489rs688489
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rs11168067rs9325122rs 11957351rs11948371rs11960649rs1432622rs1432623rs11168068rs17778257rs2400706rs2895795rs2400707rs2053044rs17108803rs12654778rs11168070rs11959427rs1042711rs1801704rs1042713rs11168067rs9325122rs 11957351rs11948371rs11960649rs1432622rs1432623rs11168068rs17778257rs2400706rs2895795rs2400707rs2053044rs17108803rs12654778rs11168070rs11959427rs1042711rs1801704rs1042713
Gln27Glu rs1042714rs1042717rs1800888rs1042718: SOD3 SNPsGln27Glu rs1042714rs1042717rs1800888rs1042718: SOD3 SNPs
Arg213Gly rs1799895 (2)Arg213Gly rs1799895 (2)
rs1529717rs1046909rs2241712rs2241713rs2241714rs11673525rs2873369rs11083617rs1529717rs1046909rs2241712rs2241713rs2241714rs11673525rs2873369rs11083617
rs11083616rs11083616
rs4803458rs11670143rs1982072rs11668109rs4803458rs11670143rs1982072rs11668109
rs1800468rs4987025rs1800469rs11466314rs12977628rs12977601rs12985978rs11466315rs11551223rs11551226rs11466316rs13306706rs13306707rs13306708rs9282871LeulOPro rs1982073rs1800471rs13447341rs11466318rs12976890rs12978333rs10420084rs10418010rs12983775rs12462166rs2241715rs9749548rs7258445rs11466320rs11466321rs8108052rs6508976rs8108632rs11466324rs2241716rs1800468rs4987025rs1800469rs11466314rs12977628rs12977601rs12985978rs11466315rs11551223rs11551226rs11466316rs13306706rs13306707rs13306708rs9282871LeulOPro rs1982073rs1800471rs13447341rs11466318rs12976890rs12978333rs10420084rs10418010rs12983775rs12462166rs2241715rs9749548rs7258445rs11466320rs11466321rs8108052rs6508976rs8108632rs11466324rs2241716
rs2241717rs2241717
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rs573764rs573764
rs7102189rs7102189
rs575727rs575727
rs552306rs552306
rs634607rs634607
rs12286876rs12286876
rs12285331rs12285331
rs519806rs519806
rs12283571rs12283571
rs2839969rs2839969
rs2000609rs2000609
rs7125865rs7125865
rs570662rs570662
rs11225427rs11225427
rs484915rs484915
rs470307rs470307
rs2408490rs2408490
rs12279710rs12279710
rs685265rs685265
rs7Í07224rs7Í07224
rs1155764rs1155764
rs534191rs534191
rs509332rs509332
rs12283759rs12283759
rs2105581rs2105581
rs470206rs470206
rs533621rs533621
-1607 G/GG rs1799750rs470211rs470146rs2075847rs473509rs498186GSTM1 poli-morfismoAlelo nulo-1607 G / GG rs1799750rs470211rs470146rs2075847rs473509rs498186GSTM1 polymorphismNull allele
Nulo Sem rs (2)Null Without rs (2)
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rs11666933 rs8102918 rs3933240rs11666933 rs8102918 rs3933240
rs11466310 rs4803455 rs6094237rs11466310 rs4803455 rs6094237
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rs2317130 rs529381 rs6130988rs2317130 rs529381 rs6130988
rs4803457 rs1144396 rs6073983rs4803457 rs1144396 rs6073983
rs3087453 rs504875 rs6130989rs3087453 rs504875 rs6130989
rs1800820 rs526215 rs6130990rs1800820 rs526215 rs6130990
rs1054797 rs12280880 rs10211842rs1054797 rs12280880 rs10211842
rs6073984 rs8125587 TIMP3 SNPsrs6073984 rs8125587 TIMP3 SNPs
rs6073985 rs3918253 rs5754289rs6073985 rs3918253 rs5754289
rs8121146 rs2274755 rs5754290rs8121146 rs2274755 rs5754290
rs6032620 rs2664538 rs9606994rs6032620 rs2664538 rs9606994
rs11698788 rs3918254 rs7285034rs11698788 rs3918254 rs7285034
rs6032621 rs6130993 rs13433582rs6032621 rs6130993 rs13433582
rs6065912 rs3918255 rs1962223rs6065912 rs3918255 rs1962223
TS6104417 rs2236416 rs8137129TS6104417 rs2236416 rs8137129
rs3848720 rs6130994 rs1807471rs3848720 rs6130994 rs1807471
rs13040272 rs3918256 rs7290885rs13040272 rs3918256 rs7290885
rs6104418 rs3918281 rs5749511rs6104418 rs3918281 rs5749511
rs3848721 rs3787268 rs11703366rs3848721 rs3787268 rs11703366
rs3848722 rs3918257 rs4990774rs3848722 rs3918257 rs4990774
rs6104419 rs6017725 -1296 T/C rs9619311rs6104419 rs6017725 -1296 T / C rs9619311
rs4810482 rs6032623 rs2234921rs4810482 rs6032623 rs2234921
rs3761157 rs3918258 rs2234920rs3761157 rs3918258 rs2234920
rs3761158 rs2250889 rs16991235rs3761158 rs2250889 rs16991235
rs3761159 rs3918259 rs4638893rs3761159 rs3918259 rs4638893
rs8113877 rs3918260 rs12169569rs8113877 rs3918260 rs12169569
rs6065913 rs13969 rs5998639rs6065913 rs13969 rs5998639
rs6104420 rs6104427 rs7284166rs6104420 rs6104427 rs7284166
rs6104421 rs6104428 rs5749512rs6104421 rs6104428 rs5749512
rs3918240 rs2274756rs3918240 rs2274756
rs6104422 rs6017726rs6104422 rs6017726
rs3918278 rs3918261rs3918278 rs3918261
rs3918241 rs6032624rs3918241 rs6032624
rs3918242 rs3918262rs3918242 rs3918262
rs3918243 rs3918263rs3918243 rs3918263
rs3918279 rs3918264rs3918279 rs3918264
rs3918280 rs6130995rs3918280 rs6130995
rs4578914 rs6130996rs4578914 rs6130996
rs6017724 rs3918265rs6017724 rs3918265
rs3918244 rs3918266rs3918244 rs3918266
rs3918245 rs3918267rs3918245 rs3918267
rs6130992 rs6073987rs6130992 rs6073987
rs3918247 rs6073988rs3918247 rs6073988
rs3918248 rs3918282rs3918248 rs3918282
rs3918249 rs1802909rs3918249 rs1802909
rs6104423 rs13925rs6104423 rs13925
rs6104424 rs20544rs6104424 rs20544
rs6104425 rs1056628rs6104425 rs1056628
rs6104426 rs1802908rs6104426 rs1802908
rs3918250 rs2664517rs1805089 rs9509rs3918251 rs3918268rs13040572 rs3918269rs13040580 rs3918270rs3918252 MMP12 SNPsrs3918250 rs2664517rs1805089 rs9509rs3918251 rs3918268rs13040572 rs3918269rs13040580 rs3918270rs3918252 MMP12 SNPs
rs8125581 -82 A/G rs2276109(2)rs8125581 -82 A / G rs2276109 (2)
(1 = nenhum outro SNPs relatado como estando em LD, 2 = nenhum outroSNPS relatado como estando em LD)(1 = no other SNPs reported as being in LD, 2 = no other SNPs reported as being in LD)
Aplicação IndustrialIndustrial application
A presente invenção se direciona a métodos para a avaliação dorisco de um indivíduo de desenvolvimento de doença pulmonar obstrutivacrônica (COPD), enfisema ou tanto COPD quanto enfisema. Os métodoscompreendem a análise dos polimorfismos contidos aqui mostrados comoestando associados a um maior ou um menor risco de desenvolvimento deCOPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema ou a análise dos resulta-dos obtidos partindo de tal análise. O uso dos polimorfismos contidos aquimostrados como estando associados a um maior ou um menor risco de de-senvolvimento de COPD, enfisema ou tanto COPD quanto enfisema na ava-liação do risco de um indivíduo também é fornecido, assim como sondas einiciadores de nucleotídeos, kits e microarranjos adequados para tal avalia-ção. São também fornecidos métodos de tratamento dos indivíduos quepossuem os polimorfismos descritos aqui. São também fornecidos métodospara a triagem de compostos capazes de modular a expressão dos genesassociados com os polimorfismos descritos aqui.The present invention is directed to methods for the risk assessment of an individual developing obstructive chronic obstructive pulmonary disease (COPD), emphysema or both COPD and emphysema. The methods comprise the analysis of the polymorphisms contained herein as being associated with a higher or lower risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema, or the analysis of results obtained from such analysis. The use of the polymorphisms contained herein as being associated with a higher or lower risk of developing COPD, emphysema or both COPD and emphysema in assessing an individual's risk is also provided, as well as nucleotide priming probes, kits and suitable microarray for such evaluation. Methods of treating individuals having the polymorphisms described herein are also provided. Methods for screening compounds capable of modulating gene expression associated with the polymorphisms described herein are also provided.
Todas as patentes, publicações, artigos científicos e outros do-cumentos e materiais referidos ou mencionados aqui são indicativos dos ní-veis de perícia dos versados na técnica à qual a invenção se refere e cadatal documento e material referidos é incorporado aqui como referência até amesma extensão como se tivesse sido incorporado como referência em suatotalidade individualmente ou apresentado aqui em sua totalidade. Os reque-rentes reservam o direito de incorporar fisicamente neste relatório descritivoqualquer e todos os materiais e informação de quaisquer tais patentes, pu-blicações, artigos científicos, sites da web, informação disponível eletroni-camente e outros materiais ou documentos referidos.All patents, publications, scientific articles and other documents and materials referred to or referred to herein are indicative of the skill levels of those skilled in the art to which the invention relates and each document and material referred to is incorporated herein by reference to the same. extension as if it were incorporated by reference in its entirety individually or presented here in its entirety. Applicants reserve the right to physically incorporate into this descriptive report any and all materials and information in any such patents, publications, scientific articles, websites, electronically available information and other such materials or documents.
Os métodos e as composições específicos descritos aqui sãorepresentativos de várias modalidades ou de modalidades preferidas e sãoapenas exemplos e não são pretendidos como limitações do âmbito da in-venção. Outros objetivos, aspectos, exemplos e modalidades ocorrerão aosversados na técnica após a consideração deste relatório descritivo e sãoabrangidos dentro do espírito da invenção que é definido pelo âmbito dasreivindicações. Será facilmente evidente para um perito na arte que substitu-ições e modificações variáveis podem ser feitas na invenção divulgada aquisem sair do âmbito e do espírito da invenção. A invenção descrita aqui ade-quadamente de forma ilustrativa pode ser praticada na ausência de qualquerelemento ou elementos ou limitação ou limitações, que não são especifica-mente divulgadas aqui como essenciais. Assim, por exemplo, em cada casocontido aqui, nas modalidades ou nos exemplos da presente invenção, qual-quer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e"consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois ter-mos no relatório descritivo, indicando assim exemplos adicionais, que pos-suem um âmbito diferente, de várias modalidades alternativas da invenção.Ainda, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo" etc. devem serlidos de forma expansiva sem limitação. Os métodos e os processos descri-tos de forma ilustrativa aqui podem adequadamente ser praticados em or-dens diferentes de etapas e que não são necessariamente restritos às or-dens de etapas indicadas aqui ou nas reivindicações. É ainda como utilizadoaqui e nas reivindicações em anexo, que as formas no singular "um", "uma","o" e "a" incluem referência no plural a não ser que o contexto determine cla-ramente outra maneira. Assim, por exemplo, uma referência a "uma célulahospedeira" inclui um grande número (por exemplo, uma cultura ou uma po-pulação) de tais células hospedeiras e assim por diante. Sob nenhuma cir-cunstância a patente pode ser interpretada como sendo limitada aos exem-plos ou às modalidades ou aos métodos específicos descritos especifica-mente aqui. Sob nenhuma circunstância a patente pode ser interpretada co-mo sendo limitada por qualquer citação feita por qualquer Examinador ouqualquer outro oficial ou funcionário do Escritório de Patentes e Marcas Re-gistradas a não ser que tal citação seja especificamente e sem qualificaçãoou reserva expressamente adotada em uma resposta por escrito pelos Re-querentes.The specific methods and compositions described herein are representative of various embodiments or preferred embodiments and are only examples and are not intended as limitations on the scope of the invention. Other objects, aspects, examples and embodiments will occur to those skilled in the art upon consideration of this specification and are encompassed within the spirit of the invention which is defined by the scope of the claims. It will be readily apparent to one skilled in the art that variable substitutions and modifications may be made to the disclosed invention and are beyond the scope and spirit of the invention. The invention described herein by way of illustration may be practiced in the absence of any element or elements or limitation or limitations, which are not specifically disclosed herein as essential. Thus, for example, in each case herein, in the embodiments or examples of the present invention, any of the terms "comprising", "consisting essentially of" and "consisting of" may be substituted for either of the other two terms. We will refer to the descriptive report, thus indicating further examples having a different scope, from various alternative embodiments of the invention. Further, the terms "comprising", "including", "containing", etc. should be read expansively without limitation. The methods and processes described illustratively herein may suitably be practiced at different step densities and are not necessarily restricted to the step densities indicated herein or in the claims. It is further as used herein and in the appended claims that the singular forms "one", "one", "o" and "a" include plural reference unless the context clearly determines otherwise. Thus, for example, a reference to a "host cell" includes a large number (for example, a culture or population) of such host cells and so on. Under no circumstances may the patent be construed as being limited to the specific examples or embodiments or methods specifically described herein. Under no circumstances may the patent be construed as being limited by any citation made by any Examiner or any other officer or employee of the Patent and Trademark Office unless such citation is specifically and unqualified or expressly adopted in a written reply by the Applicants.
Os termos e as expressões que foram empregadas são utiliza-dos como termos de descrição e não de limitação e não há intenção de utili-zar tais termos e expressões para excluir qualquer equivalente das caracte-rísticas mostradas e descritas ou partes das mesmas, mas é reconhecidoque várias modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção que éreivindicada. Assim, será entendido que embora a presente invenção tenhasido especificamente descrita através de modalidades preferidas e caracte-rísticas opcionais, a modificação e a variação dos conceitos descritos aquipodem ser recorridas pelos versados na técnica e que tais modificações evariações são consideradas como estando dentro do âmbito desta invençãocomo definido pelas reivindicações em anexo.The terms and expressions that have been used are used as terms of description rather than limitation and it is not intended to use such terms and expressions to exclude any equivalent of the characteristics shown and described or parts thereof, but it is It is recognized that various modifications are possible within the scope of the claimed invention. Thus, it will be appreciated that while the present invention has been specifically described by preferred embodiments and optional features, modification and variation of the concepts described herein may be resorted to by those skilled in the art and that such modifications and variations are deemed to be within the scope of this invention. invention as defined by the appended claims.
Listagem de ReferênciasReference Listing
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Waltenberg J. 2001. Pathophysiological basis of unstable coronary syndro-me. Herz 26, Sup 1; 2-8.Waltenberg J. 2001. Pathophysiological basis of unstable coronary syndromes. Herz 26, Sup 1; 2-8.
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