BRPI0510717B1

BRPI0510717B1 - Uso de 3,3' diindolilmetano (DIM) ou 2-(indol-3-ilmetil)-3,3´-diindolilmetano (LTR)

Info

Publication number: BRPI0510717B1
Application number: BRPI0510717-2A
Authority: BR
Inventors: Michael A. Zeligs
Original assignee: Bioresponse, Llc
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2005-05-06
Publication date: 2019-10-01
Also published as: US20050267193A1; CA2565721A1; US8080577B2; CA2565721C; WO2005107747A2; BRPI0510717B8; BRPI0510717A; WO2005107747A3

Abstract

uso de 3,3 diindolilmetano (dim) ou um indol relacionado com dim. a presente invenção diz respeito a composições e métodos para tratar ou prevenir leiomiomas pela administração de diindolilmetano e indóis relacionados com diindolilmetano. a presente invenção também diz respeito a composições e métodos para tratar ou prevenir leiomiomas pela administração de diindolilmetano em combinação com um antagonista de egfr. os métodos fornecem tratamentos não invasivos para leiomiomas.

Description

“USO DE 3,3' DIINDOLILMETANO (DIM) OU 2-(INDOL-3-ILMETIL)-3,3'DIINDOLILMETANO (LTR)” [0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. N^o60/569.478, depositado em 6 de maio de 2004, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

1. CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção diz respeito às composições e métodos para tratar ou prevenir leiomiomas pela administração de diindolilmetano ou um indol relacionado com diindolilmetano. A presente invenção também diz respeito às composições e métodos para tratar ou prevenir leiomiomas pela administração de diindolilmetano ou um indol relacionado com diindolilmetano em combinação com um antagonista de EGFR. Os métodos fornecem tratamentos não invasivos para leiomiomas.

2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

2.1. Importância Clínica de Leiomiomas Uterinos [0003] Leiomiomas são tumores de tecido mole benignos que surgem de tecido do músculo liso. Leiomiomas do útero são o crescimento pélvico mais comum, anormal diagnosticado em mulheres. Os leiomiomas também são chamados “miomas” e “fibróides uterinos”. Como crescimentos benignos, não cancerosos que surge do músculo liso uterino (miométrio), leiomiomas não são relacionados com as formas comuns de câncer uterino e câncer cervical uterino que tipicamente surge do revestimento uterino (endométrio) ou epitélio cervical, respectivamente. Nos Estados Unidos, os leiomiomas ocorrem na maioria de todas as mulheres (Flake et al., 2003, Environ Health Perspect. 111: 1037-54). Os leiomiomas são particularmente prevalecentes em mulheres Afro-Americanas, que relatam uma taxa 3 vezes maior de ocorrência do que as mulheres Caucasianas (Marshall et al., 1997, Obstet Gynecol. 90: 967-73). Embora raros, os leiomiomas também se desenvolvem fora do útero tanto em mulheres quanto m homens. Os locais extra-uterinos de ocorrência de leiomioma incluem os mamilos, esôfago, escroto e vesículas seminais visto que todos possuem músculo liso (Farman, 1975, S Afr Med J. 49: 1333-40). Além disso, as síndromes familiares, raras incluindo a leiomiomatose difusa e a Síndrome de Alport, são

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2/48 associadas com leiomiomas recorrentes em locais anatômicos múltiplos. Os tumores de músculo liso também são comuns na espécie aviário, tipicamente envolvendo o oviduto, uma estrutura análoga ao útero mamífero. A cordoniz japonesa (Coturnix cturnix japonica) e a galinha comum (Gallus domesticus) são especialmente afetadas, com prevalências variando em até 60 % (Foster et al., 1989, Poult Sci. 68: 1447-53; e Anjum et al., 1988, Res Vet Sci. 45: 341-8). A despeito da sua frequência, a patobiologia de leiomiomas permanece insuficientemente entendida.

[0004] Em mulheres, os leiomiomas contribuem para um espectro de sintomas que incluem sangramento menstrual pesado, irregular e prolongado e anemia. Os leiomiomas também podem causar desconforto pélvico e disfunção intestinal e da bexiga da pressão nestas estruturas adjacentes. Os leiomiomas também foram associados com infertilidade e aborto recorrente. A presença de leiomiomas pode interferir com o trabalho de parto normal durante o processo de nascimento, necessitando do corte cesariano. Além do trabalho de parto anormal, os leiomiomas restringem o crescimento intra-uterino normal e predispõem à hemorragia pós-parto secundário à atonia uterina.

[0005] Histologicamente, os leiomiomas surgem do músculo liso, mostram estrutura celular benigna e são distintas e não relacionadas ao crescimento celular pré-canceroso e canceroso que afetam o revestimento uterino ou endométrio. Os leiomiomas surgem de clones geneticamente similares de células do músculo liso uterino e eles crescem sob a influência de fatores de crescimento locais e na presença de hormônios sexuais. A evidência sustenta uma contribuição mais importante da progesterona do que o estrogênio para o crescimento de mioma (Rein, 2000, Environ Health Perspect. 108 Supl 5: 791-3). A contribuição da progesterona e do estrogênio para o crescimento de leiomioma é incerta, entretanto, com base na observação de que os leiomiomas frequentemente regridem de tamanho durante a gravidez; que é um tempo de níveis de estrogênio e progesterona circulantes altos (Strobelt et al., 1994, J Ultrasound Med. 13: 399-401). Adicionando à incerteza do papel do estrogênio na etiologia do mioma, o uso clínico de tamoxifeno, um medicamento antagonista de estrogênio, foi associado com o crescimento aumentado, não diminuído, de

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3/48 leiomiomas (Schwartz et al., 1998, J Ultrasound Med. 17: 699-703). Tipicamente, os leiomiomas em mulheres aparecem depois da menarca, proliferam e crescem durante os anos reprodutivos e estabilizam ou regridem depois da menopausa. O diagnóstico de leiomiomas é fundamentado nos sinais e sintomas do indivíduo, seguido pela examinação física e pélvica, demonstrando uma massa pélvica e confirmação pela visualização ultra-sônica trans-abdominal ou transvaginal. A etiologia e as contribuições hormonais para os leiomiomas permanecem insuficientemente entendidas.

[0006] O estudo da bioquímica de leiomiomas uterinos tem mostrado que o tecido de mioma preferencialmente metaboliza o estrogênio aos metabólitos de 4-hidróxi estrogênio, demonstrando um padrão diferente de metabolismo do estrogênio do que o músculo liso miometrial normal circundante (Liehr et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92: 9220-4). A comparação bioquímica da matriz extra-celular de tecido de leiomioma comparada com o tecido normal circundante revela diferenças na composição e estrutura de colágeno que pode contribuir para o crescimento anormal (Berto et al., 2003, Biochim Biophys Acta. 1619: 98-112.).

[0007] A não ser a cirurgia, existem poucas opções de tratamento seguras e eficazes disponíveis para as mulheres com leiomiomas sintomáticos. Os agonistas do hormônio que libera gonadotropina (GnRH-a) inibem a esteroidogênese e induzem a menopausa farmacológica. Através deste mecanismo, os GnRH-a's podem reduzir o volume do leiomioma em 50 % em 3 a 6 meses. Entretanto, porque estes agentes causam sintomas menopáusicos sérios e o risco de perda óssea (osteoporose) relacionada com a deficiência de estrogênio, estes medicamentos não podem ser usados por períodos prolongados de tempo. Além disso, os leiomiomas tendem a crescer novamente depois da cessação da terapia com GnRH-a. Como um resultado, o tratamento com GnRH-a, independente de cirurgia subsequente, não é reconhecido como um tratamento eficaz, de longa duração de leiomiomas.

[0008] Os procedimentos cirúrgicos para o tratamento de leiomiomas uterinos são a miomectomia e a histerectomia (Nair, 2003, Ann Acad Med Singapore. 32: 615-23). A miomectomia, feita através de uma laparotomia ou laparoscopia, é realizada para

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4/48 remover o leiomioma e conserva o útero. Isto é usualmente tentado em mulheres jovens que podem desejar uma gravidez futura. Infelizmente, a miomectomia é seguida por adesões pélvicas extensas que elas mesmas podem reduzir a fertilidade futura. Adicionalmente, se o leiomioma penetra a cavidade uterina, qualquer gravidez futura depois da miomectomia implica em um risco aumentado de ruptura uterina e o parto deve ser realizado pelo corte cesariano.

[0009] A histerectomia permanece o tratamento cirúrgico definitivo para os leiomiomas. Os leiomiomas uterinos sintomáticos são responsáveis por aproximadamente um terço de todas as histerectomias realizadas entre as mulheres de meia idade (Nair, 2003, Ann Acad Med Singapore. 32: 615-23). O impacto deste método cirúrgico para leiomiomas é extremamente caro considerando o longo tempo pós operativo e de recuperação sem trabalho. Existe também complicações bem conhecidas para a histerectomia. Estas complicações incluem a hemorragia pós operativa, febre ou lesão aos órgãos adjacentes.

[0010] Duas modalidades recentes foram desenvolvidas para tratamento intervencional menos extremo de fibróides uterinos: miólise e embolização da artéria uterina (Lefebvre et al., 2003, J Obstet Gynaecol Can. 25: 396-418). A miólise referese à técnica de romper ou abolir o fornecimento de sangue para o fibróide causando o encolhimento pelo uso da eletrocirurgia bipolar ou monopolar. Esta é aplicável apenas se houver menos do que três fibróides presentes e/ou o maior medir menos do que 10 cm no diâmetro. O procedimento também não é recomendado para mulheres que desejam engravidar, visto que o risco de ruptura uterina é alto. A embolização da artéria uterina (UAE) é um procedimento feito pelos radiologistas com o objetivo de eliminar o fornecimento de sangue para o tecido de leiomioma. Depois de alguns meses seguindo o tratamento, a UAE tipicamente resulta em uma redução média de volume de tecido de mioma de cerca de 50 %. Entretanto, causar acentuadamente a morte de tecido de mioma devido ao bloqueio arterial tem efeitos colaterais. O procedimento pode ser seguido por dor severa requerendo hospitalização. Alguma preocupação acerca da fertilidade futura tem sido levantada a seguir da UAE, assim como a falta de capacidade para tratar todos os leiomiomas

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5/48 presentes. Uma porção de mulheres que passam pelo embolismo arterial uterino desenvolvem amenorréia e menopausa subsequentes devido à diminuição inadvertida da função ovariana (Spies et al., 2002, Obstet Gynecol. 100: 873-80).

[0011] Para as mulheres com leiomiomas sintomáticos, que desejam preservar a fertilidade ou evitar a cirurgia, métodos mais conservativos, mais eficazes e mais seguros de tratamento médico são necessários. Idealmente, tratamentos médicos melhorados para controlar os leiomiomas preservarão um útero intacto, preservará melhor a fertilidade, e, como tratamentos auxiliares, melhoram a segurança e a eficácia de longa duração de modalidades de tratamento mais conservativas tais como a UAE e a miomectomia laparoscópica.

2.2. ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE INDÓIS CRUCÍFEROS [0012] Os vegetais crucíferos contêm uma família de compostos protetores vegetais chamados de glicobrassicinas que dão origem a compostos ativos com o anel molecular de indol, exemplificado pelo indol-3-carbinol (I3C). Entretanto, o I3C é altamente instável em água e ácido. Quando dado oralmente, o I3C gera vários produtos da reação gástrica com uma variedade de ações biológicas (De Kruif et al., 1991, Chem Biol Interact; 80: 303-15). Estes produtos são altamente indutores de enzima e associados tanto com a inativação quanto ativação de carcinogênios. Como tal, o uso de I3C foi associado tanto com a inibição do crescimento quanto com a promoção do crescimento em cânceres experimentais. Além disso, a indução de enzima não desejada pelos produtos da reação de I3C a seguir do uso de I3C oral pode alterar o metabolismo de outros medicamentos, hormônios esteroidais que incluem estrogênio e contraceptivos aumentado preocupações com a segurança. O uso oral de I3C em seres humanos mostrou aumentar a produção dos metabólitos de

4-hidróxi estrogênio anteriormente associados com o tecido de leiomioma (Michnovicz et al., 1997, J Natl Cancer Inst. 89: 718-23). Além disso, o uso dos I3C's está associado com várias preocupações de segurança devido às suas ações indutoras de enzima e tóxico reprodutivas - tornando-o inaceitável para o uso em mulheres de idade reprodutiva (Dashwood, 1998, Chem Biol Interact. 110: 1-5; e Gao et al., 2002, Toxicol Appl Pharmacol. 183: 179-88).

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6/48 [0013] Um produto proeminente derivado de I3C e também presente nas plantas crucíferas é o 3,3’-diindolilmetano (DIM), a molécula dimérica linear formada da condensação de duas moléculas de I3C. Uma vez formado, o DIM é estável em ácido e menos indutor de enzima do que os outros produtos de I3C (Bradfield et al., 1987, J Toxicol Environ Health. 21: 31123). Em cultura celular, o DIM mostrou ter efeitos promotores da apoptose em células de câncer de mama tanto dependentes quanto independentes de estrogênio (Hong et al., 2002, Biochem Pharmacol 63: 1085-97). O DIM também mostrou induzir especificamente a apoptose em linhagens de célula de câncer cervical alteradas pelo papilomavírus (Chen et al., 2001, J Nutr. 131: 3294302). Em animais, o DIM oralmente administrado inibe o crescimento de certas formas quimicamente induzidas de câncer de mama (Chen et al., 1998, Carcinogenesis, 19: 1631-9).

[0014] As investigações do DIM resultaram na Patente U.S. 5.948.808, “Indole-3carbinol, diindolylmethane and substituted analogs as antiestrogens”, que fornece um método para tratar câncer dependente de estrogênio. A Patente U.S. 6.656.963, “Indole-3carbinol (I3C) derivatives and methods”, divulga derivados adicionais de I3C para o uso em métodos para inibir o crescimento de célula cancerosa, mas especificamente exclui o DIM.

[0015] Trabalho experimental anterior pelo presente inventor descreveu o uso de DIM e o derivado trimérico relacionado de I3C, o 2-(Indol-3-ilmetil)-3,3’-diindolilmetano (LTR), em formulações especializadas (Patente U.S. 6.086.915) e em tratamentos para a dor da mama (mastalgia) e endometriose (Patente U.S. 6.689.387). A endometriose é um distúrbio do tecido epitelial uterino (endométrio) que migra para fora da cavidade endometrial do útero e retoma o crescimento, tipicamente no abdômen. Os pedidos pendentes do presente inventor também incluem usos de DIM e LTR para a displasia cervical (pedido de Patente U.S. 10/616.477) e para as infecções do Vírus do Papiloma Humano (HPV) (Pedido de Patente U.S. 10/616.477). Semelhantes à endometriose, a displasia cervical e as infecções do HPV são distúrbios do tecido epitelial e não do músculo liso. Os leiomiomas são uma entidade patobiológica distinta, que surge apenas no músculo liso uterino ou extra-uterino que

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7/48 é um tecido distinto com aparência, estrutura, função e origem embriológica diferentes do que o endométrio e outro tecido epitelial.

[0016] Um pedido de patente mais recente (Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0220377, depositado em 7 de maio de 2003) descreve compostos antiestrogênicos de indol sintético, estruturalmente não relacionados a DIM, que são propostos para tratar condições tanto cancerosas quanto benignas que envolvam o útero. Em distinção a estes anti-estrogênios de indol, sintéticos, o DIM mostrou ter atividade estrogênica, promotora de crescimento em células do câncer de mama (Riby et al., 2000, Biochem Pharmacol. 60: 167-77) e atividade ativadora do receptor de estrogênio em células de câncer endometrial (Leong et al., 2004, Mol Endocrinol. 18: 291-302. Epub 26 de Nov de 2003). Finalmente, a Publicação do Pedido de Patente U.S. 2001/0002393 (depositado em 20 de Dezembro de 2000), descreve métodos e kits para tratar e diagnosticar leiomiomas usando inibidores de enzimas da metaloproteinase.

[0017] Seria benéfico ter novas opções terapêuticas para o tratamento de leiomioma que não fossem invasivas, que evitassem ou minimizassem a cirurgia e que evitassem os efeitos colaterais de terapias hormonais sistemicamente administradas. Novas terapias médicas para o tratamento de condições relacionadas com leiomioma são necessárias.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0018] A presente invenção fornece composições e métodos de usar diindolilmetano e indóis relacionados com diindolilmetano para tratar leiomiomas intrae extra-uterinos. Os métodos tipicamente envolvem o uso oral de 3,3’-diindolilmetano (DIM) em uma quantidade eficaz para reverter ou retardar o crescimento de leiomiomas. Os métodos, usando formulações farmaceuticamente aceitáveis, resultam em uma redução do tamanho dos miomas e uma resolução de sintomas relacionados com mioma. Em certas formas de realização, estes métodos utilizam compostos de diindolilmetano estruturalmente relacionados, sinteticamente derivados, substituídos. Os compostos relacionados com o DIM preferidos para o uso nos métodos e composições da invenção incluem, mas não são limitados a, DIMs

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8/48 hidroxilados, DIMs metoxilados, 2-(Indol-3-ilmetil)-3,3’-diindolilmetano (LTR), LTRs hidroxilados, LTRs metoxilados, 5,5’-dimetilDIM (5-Me-DIM), 2,2’-dimetilDIM (2-MeDIM), 5,5’-dicloroDIM (5-Cl-DIM), imidazolelil-3,3’-diindolilmetano, imidazolelil-3,3’diindolilmetanos substituídos por nitro, 2,10-dicarbetóxi-6-metóxi-5,7-diidro-indolo[2,3-b]carbazol, 6-etoxicarbonilóxi-5,7-diidro-indolo-[2,3-b]carbazol e 2,10-dicarbetóxi6-etoxicarbonilóxi-5,7-diidro-indolo-[2,3-b]carbazol e 2,6-dicarbetóxi-3,3’-dimetil13,14-diindolilmetano.

[0019] Em formas de realização preferidas, DIM ou o indol relacionado com DIM são colocados em suspensão como micropartículas em uma matriz carreadora de amido.

[0020] Em certas formas de realização, os métodos e composições da invenção envolvem o uso oral de DIM e compostos relacionados com DIM. Em certas formas de realização, DIM ou o indol relacionado com DIM é administrado intra-arterial, vaginalmente ou é injetado diretamente no tecido de mioma.

[0021] Em outras formas de realização, as composições da presente invenção úteis no tratamento de doença relacionada com leiomioma também incluem suspensões de DIM e diindolilmetanos sintéticos relacionados adequados para a injeção direta no tecido de leiomioma no momento da cirurgia abdominal pélvica ou durante a cirurgia intra-uterina trans-vaginal (histeroscopia). As microesferas que liberam DIM também são descritas para o uso durante os procedimentos de Embolização Arterial Uterina (UAE).

[0022] Em outras formas de realização, as preparações tópicas de DIM e diindolilmetanos relacionados são descritos para o uso em supositórios vaginais para tratar leiomiomas. As aplicações de supositório vaginais de DIM e diindolilmetanos sintéticos relacionados podem ser usadas sozinhos ou em conjunção com formas de dosagem oral para o tratamento de leiomioma.

[0023] Em certas formas de realização da invenção, o indivíduo é um ser humano. Os leiomiomas humanos podem ser leiomiomas uterinos ou leiomiomas extrauterinos. Em outras formas de realização, o indivíduo é um aviário. Os aviários adequados incluem, mas não são limitados a, galinhas e codornizes. Os leiomiomas

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9/48 aviários são no geral leiomiomas ovidutos.

[0024] Em uma outra forma de realização, a presente invenção descreve o uso oral de DIM e de diindolilmetanos sintéticos relacionados em conjunção com antagonistas oralmente ativos de receptores do fator de crescimento celular. Isto inclui o uso combinado de DIM com os antagonistas do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Os antagonistas de EGFR apropriados para o uso combinado com DIM e/ou derivados sintéticos de DIM, incluem os inibidores da tirosina-quinase de EGFR, tais como ZD1839 (Gefitinib, Iressa®, [AstraZeneca, UK]), OSI-774 (Erlotinib, Tarceva®, [OSI Pharmaceuticals, Boulder, CO]), CI 1033 [Parke-Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, MI], PKI 166 [Novartis Pharma, AG (Basel, Suíça)] e outros (por exemplo, GW2016; N-{3-Cloro-4-[(3-fluorobenzil)óxi]fenil}-6-[5({[2(metilsulfonil)etil]-amino}metil)-2-furil]-4-quinazolinamina). Outros antagonistas do receptor de EGFR adequado incluem aqueles de origem natural com a atividade inibidora de EGFR tal como silibinina, (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), resveratrol e seus metabólitos inibidores do crescimento celular ou derivados.

[0025] Já em uma outra forma de realização, a terapia combinada para leiomiomas, incluída dentro do escopo desta invenção, inclui o uso de DIM e compostos relacionados com DIM usados com e sem antagonistas de EGFR em conjunção com a Embolização Arterial Uterina (UAE), miomectomia cirúrgica, e/ou terapia de radiação de feixe externo de dose baixa. O objetivo do uso combinado de DIM e compostos relacionados com DIM com outras modalidades de tratamento para leiomiomas é aumentar a eficácia apenas em uma única modalidade de terapia.

4. breve DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0026] FIGS. IA-B Redução do volume de tumor de leiomioma em indivíduos tratados com DIM oral. A. Indivíduo A. B. Indivíduo B.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0027] O presente inventor verificou que a administração de DIM a uma fêmea ou macho tendo tecido de leiomioma resulta no retardo do crescimento e redução no tamanho do tecido de mioma. Nos seres humanos, os sintomas associados com mioma, que incluem dor, hemorragia menstrual dolorosa ou excessiva e disfunção

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10/48 intestinal e urinária relacionada com mioma melhoram a seguir do Tratamento com base em DIM. Embora raros, os leiomiomas também se desenvolvem fora do útero tanto em mulheres quanto em homens. Os locais extra-uterinos de ocorrência de leiomioma incluem os mamilos, esôfago, escroto e vesículas seminais que possuem todo músculo liso (Farman, 1975, S Afr Med J. 49: 1333-40). Na espécie aviária, DIM ou um indol relacionado com DIM, são usados para prevenir ou retardar o desenvolvimento de leiomiomas do oviduto e magnum, prolongamento do período de prochação e produção de ovos em aves domésticas economicamente importantes.

5.1. DIINDOLILMETANO E INDÓIS RELACIONADOS COM DIINDOLILMETANO [0028] Em certas formas de realização, os compostos de DIM úteis nos métodos da invenção incluem DIM (3,3’-diindolilmetano) e o trímero de DIM linear relacionado o (2-(indol-3-ilmetil)-3,3’-diindolilmetano [também escrito: 2 (lndol-3-ilmetil)-indol-3il]indol-3-ilmetano] (LTR). Como aqui usado, “composto relacionado com DIM”, “indol relacionado com DIM” e “derivado de DIM” são usados intercambiavelmente e referem-se tanto aos metabólitos naturais quanto aos análogos de DIM e também aos “compostos de diindolilmetano estruturalmente relacionados, sinteticamente derivados, substituídos” e “derivados sintéticos de DIM”, tais como aqueles aqui divulgados e conhecidos na técnica. Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que em qualquer uma das composições farmacêuticas ou métodos da invenção onde DIM é usado, um composto relacionado com DIM, que inclui um composto de diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído ou derivado sintético de DIM, podem ser usados.

[0029] A estrutura química de um DIM é como segue (onde cada um dos grupos Ré H):

[0030] A estrutura química de LTR é como segue (onde cada um dos grupos R é

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Η):

[0031] Em certas formas de realização, um metabólito hidroxilado ou metioxilado de DIM, isto é, um composto da fórmula I, em que R³², R³³, R³⁶ e R³⁷ são substituintes independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, hidroxila e metóxi, e R³¹, R³⁴, R³⁵, R³⁸, R⁴¹, R⁴², R⁵⁰ e R⁵¹ são hidrogênio, é utilizado.

[0032] Em certas formas de realização, um metabólito hidroxilado ou metioxilado de LTR, isto é, um composto da fórmula II, em que R⁶², R⁶³, R⁶⁶, R⁶⁷, R⁷⁰ e R⁷¹ são substituintes independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, hidroxila, e metóxi e R⁶¹, R⁶⁴, R⁶⁵, R⁶⁸, R⁶⁹, R⁷², R⁸¹, R⁸¹ e R⁸³ são hidrogênio, é utilizado.

[0033] Em uma forma de realização alternativa, derivados de DIM ativos com substituintes R³² e R³⁶ compostos de grupos etoxicarbonila e R⁵⁰, R⁵¹ são hidrogênio ou metila, são utilizados. Em uma outra forma de realização, derivados de DIM ativos substituídos que incluem compostos metilados e clorados, exemplificados por aqueles que incluem 5,5’-dimetilDIM (5-Me-DIM), 2,2’-dimetiIDIM (2-Me-DIM) e 5,5’-dicloroDIM (5-CI-DIM) são descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2002/0115708 por Safe, publicado em 22 de Agosto de 2002, aqui incorporada por referência em sua totalidade, são utilizados na presente invenção. Em uma outra forma de realização, derivados de DIM ativos incluem imidazolelil-3,3’-diindolilmetano, que incluem imidazolelil-3,3’-diindolilmetanos substituídos por nitro e compostos adicionais relacionados com DIM descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2004/0043965 por Jong, Ling, publicado em 4 de março de 2004, aqui incorporada

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12/48 por referência em sua totalidade, são utilizados.

[0034] Em certas formas de realização, um composto relacionado com DIM tem a fórmula (III):

[0035] em que:

[0036] R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ e R¹⁰são substituintes independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, alquila C1-C24, alquenila C2-C24, alquinila C2-C24, arila C5-C20, alcarila C6-C24, aralquila C6-C24, halo, hidroxila, sulfidrila, alcóxi C1-C24, alquenilóxi C2-C24, alquinilóxi C2-C24, arilóxi C5-C20, acila, acilóxi, alcoxicarbonila C2-C24, ariloxicarbonila C6-C20, halocarbonila, alquila C2-C24 carbonato, arila C6-C20 carbonato, carbóxi, carboxilato, carbamoíla, carbamoíla substituído por mono-(alquila C1-C24), carbamoíla substituído por di-(alquila C1-C24), arilcarbamoíla mono-substituído, tiocarbamoíla, carbamido, ciano, isociano, cianato, isocianato, isotiocianato, azido, formila, tioformila, amino, amino substituído pormonoe di-(alquila C1-C24), amino substituído por mono- e di-(arila C5-C20), alquila C2-C24 amido, arila C6-C20 amido, imino, alquilimino, arilimino, nitro, nitroso, sulfo, sulfonato, alquila C1-C24 sulfanila, arilsulfanila, alquila C1-C24 sulfinila, arila C5-C20 sulfinila, alquila C1-C24 sulfonila, arila C5-C20 sulfonila, fosfono, fosfonato, fosfinato, fosfo, fosfino e combinações destes e ainda em que quaisquer dois substituintes adjacentes (orto) podem ser ligados para formar uma estrutura cíclica selecionada de anéis de cinco membros, anéis de seis membros e anéis de cinco membros e/ou de seis membros fundidos, em que a estrutura cíclica é aromática, alicíclica, heteroaromática ou heteroalicíclica e tem de zero a 4 substituintes que não hidrogênio e de zero a 3 heteroátomos; e [0037] R¹¹ e R¹²são independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, alquila C1-C24, alcoxicarbonila C2-C24, alquila C1-C24 substituído por amino, alquila C1-C24 substituído por (alquila C1-C24 amino) e alquila C1-C24 substituído por

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13/48 di-(alquila Ci-C24)amino, [0038] Com as condições de que: pelo menos um de R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹ e R¹²seja outro que não hidrogênio; e quando R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ e R⁸ são selecionados de hidrogênio, halo, alquila e alcóxi, então R¹¹ e R¹²são outros que não hidrogênio e alquila.

[0039] Uma forma de realização preferida inclui o uso de 2,10-dicarbetóxi-6metóxi-5,7-diidro-indolo-[2,3-b]carbazol (SRI13668 (SRI Inc., Menlo Park, CA)). As formas de realização preferidas adicionais incluem o uso de 6-etoxicarbonilóxi-5,7diidro-indolo-[2,3b]carbazol e 2,10-dicarbetóxi-6-etóxi-carbonilóxi-5,7-diidro-indolo[2,3-b]carbazol (SRI Inc., Menlo Park, CA).

[0040] Em uma outra forma de realização, um composto relacionado com DIM tem a fórmula (IV)

[0041] em que:

[0042] R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ e R⁸ são substituintes independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, alquila C1-C24, alquenila C2-C24, alquinila C2-C24, ahla C5-C20, alcahla C6-C24, aralquila C6-C24, halo, hidroxila, sulfidrila, alcóxi C1-C24, alquenilóxi C2-C24, alquinilóxi C2-C24, ahlóxi C5-C20, acila, acilóxi, alcoxicarbonila C2-C24, ariloxicarbonila C6-C20, halocarbonila, alquila C2-C24 carbonato, arila C6-C20 carbonato, carbóxi, carboxilato, carbamoíla, carbamoíla substituído por mono-(alquila C1-C24), carbamoíla substituído por di-(alquila C1-C24), ahlcarbamoíla mono-substituído, tiocarbamoíla, carbamido, ciano, isociano, cianato, isocianato, isotiocianato, azido, formila, tioformila, amino, amino substituído pormonoe di-(alquila C1-C24), amino substituído por mono- e di-(arila C5-C20), alquila C2-C24 amido, arila C5-C20 amido, imino, alquilimino, ahlimino, nitro, nitroso, sulfo, sulfonato, alquila C1-C24 sulfanila, arilsulfanila, alquila C1-C24 sulfinila, arila C5-C20 sulfinila, alquila C1-C24 sulfonila, arila C5-C20 sulfonila, fosfono, fosfonato, fosfinato, fosfo, fosfino e

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14/48 combinações destes e ainda em que quaisquer dois substituintes adjacentes (orto) podem ser ligados para formar uma estrutura cíclica selecionada de anéis de cinco membros, anéis de seis membros e anéis de cinco membros e/ou de seis membros fundidos, em que a estrutura cíclica é aromática, alicíclica, heteroaromática ou heteroalicíclica e tem de zero a 4 substituintes que não hidrogênio e de zero a 3 heteroátomos, com a condição de que um mas não ambos de R² e R⁶ seja amino, amino mono-substituído ou amino di-substituído;

[0043] R¹¹ e R¹²são independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, alquila C1-C24, alcoxicarbonila C2-C24, alquila C1-C24 substituído por amino, alquila C1-C24 substituído por (alquila C1-C24 amino) e alquila C1-C24 substituído por di-(alquila Ci-C24)amino;

[0044] R¹³ e R¹⁴são definidos como para R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ e R⁸, com a condição de que pelo menos um de R¹³e R¹⁴seja outro que não hidrogênio; e [0045] X é O, S, arileno, heteroarileno, CR¹⁵R¹⁶ou NR¹⁷ em que R¹⁵ e R¹⁶ são hidrogênio, alquila C1-C6 ou juntos formam =CR¹⁸R¹⁹onde R¹⁸e R¹⁹são hidrogênio ou alquila C1-C6 e R¹⁷é como definidos para R¹¹ e R¹².

[0046]Uma forma de realização preferida inclui o uso de 2,6-dicarbetóxi-3,3’-dimetil13,14-diindolilmetano (SRI Inc., Menlo Park, CA).

[0047] Em uma outra forma de realização, um composto relacionado com DIM tem a fórmula (V):

[0048] em que:

[0049] R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹² e X são definidos como para compostos da fórmula (III); e [0050] R²⁰ e R²¹ são definidos como para R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ e R⁸.

[0051] Já em uma outra forma de realização, o indol relacionado com DIM é um derivado tetramérico de indol-3-carbinol (Brandi et al., 2003, Câncer Res. 63: 4028Petição 870190059146, de 26/06/2019, pág. 30/148

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4036).

5.2. DOSAGEM E ADMINISTRAÇÃO [0052] DIM ou um composto relacionado com DIM podem ser administrados por quaisquer meios e em qualquer dosagem, como descrito abaixo. A quantidade real administrada de DIM ou de um composto relacionado com DIM pode ser decidida por um médico ou veterinário supervisor e pode depender de fatores múltiplos, tais como, a idade, condição, história de arquivo, etc., do sujeito ou indivíduo, em questão.

[0053] O indivíduo ou paciente, a ser tratado usando os métodos da invenção é um animal, por exemplo, aviário (tal como uma galinha ou cordoniz) ou um mamífero e é preferível um ser humano e pode ser um feto, criança ou adulto. Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um ser humano do sexo feminino.

[0054] Uma forma de realização preferida é a administração oral de DIM ou derivados sintéticos em uma formulação aceitável para a administração oral. Preferivelmente, o diindolilmetano usado na invenção foi processado para realçar a biodisponibilidade, como é descrito na Patente U.S. 6.086.915; entretanto qualquer preparação adequada de diindolilmetano ou de um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído, pode ser usada nos métodos e composições da invenção.

[0055] O DIM é administrado em uma dose de 25 a 600 mg/dia ou de 25 a 500 mg/dia oralmente. O DIM pode ser administrado uma vez ao dia ou duas ou mais vezes ao dia. Preferivelmente a dose é administrada de 2 a 3 vezes ao dia. O mais preferivelmente, o DIM é administrado em uma formulação planejada para realçar a absorção oral, por exemplo, microencapsulado com TPGS (como descrito na Patente U.S. 6.086.915). Esta formulação (25 a 30 % de DIM em peso) é administrado em uma dose de 100 a 2000 mg/dia ou mais preferivelmente em uma dose de 300 a 600 mg, fornecendo 75 a 150 mg de DIM real, dados oralmente duas vezes ao dia. Como uma alternativa ao DIM, o trímero linear intimamente relacionado (LTR) pode ser utilizado nos métodos e doses descritos para DIM como um agente único para o tratamento de leiomioma. Como uma outra alternativa, os derivados de DIM oralmente ativos descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2004/0043965 podem ser

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16/48 utilizados na presente invenção como agentes únicos. Os diindolilmetanos estruturalmente relacionados, sinteticamente derivados, substituídos, como descritos por Jong (Patente U.S. 6.800.655 e Publicação do Pedido de Patente N^o2004/0043965) são administrados de acordo com a presente invenção em uma formulação aceitável para a administração oral em uma dose de 10 a 400 mg/dia. Preferivelmente, estes diindolilmetanos substituídos são administrados em uma formulação realçada na absorção em uma dose de 50 a 250 mg/dia.

[0056] Em uma forma de realização alternativa, DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído pode ser administrado na forma de uma suspensão estéril, injetável. A suspensão é injetada diretamente no tecido de leiomioma no momento da cirurgia abdominal pélvica exploratória, laparoscopia pélvica ou histereoscopia. A injeção do tecido de leiomioma é seguido pós operativamente pelo uso oral de DIM em uma formulação aceitável e em uma dose eficaz. Uma tal suspensão consiste, por exemplo, de DIM microcristalino ou diindolilmetanos estruturalmente relacionados, sinteticamente derivados, substituídos (0,2 a 2 % peso/volume) em uma suspensão de sais fisiológicos e ajustadores de pH. Os tamanhos de partícula de DIM ou cristais de diindolilmetano estruturalmente relacionado, substituído em suspensões são de 50 a 500 mícrons em diâmetro médio. Os ajustadores de pH tais como NaOH são adicionados para levar o pH a 7,5-8. Preferivelmente, 1 a 2 cm³ de suspensão contendo 10 a 20 mg de DIM ou um diindolilmetano substituído, dependendo do tamanho do mioma, são injetados diretamente em cada leiomioma.

[0057] Em formas de realização alternativa para a injeção direta no tecido fibróide, análogos de DIM, que incluem imidazolelil-3,3’-diindolilmetano, imidazolelil-3,3’diindolilmetanos substituído por nitro e compostos relacionados com DIM descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2004/0043965 por Jong, Ling, publicado em 4 de março de 2004, podem ser usados na fabricação da suspensão estéril. Preferivelmente, de 1 a 2 cm³ de suspensão contendo 0,001 mg/kg a 100 mg por kg de diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído como descrito por Jong podem ser administrados pela injeção direta nas massas de

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17/48 tecido fibróide individual.

[0058] Em uma outra forma de realização alternativa, emulsões injetáveis de DIM ou de um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído pode ser formulado para superar a baixa solubilidade de DIM tanto em água quanto lipídeo. Uma micro-emulsão especializada utiliza fosfolipídios para otimizar a solubilidade de DIM e compostos relacionados e melhorar a estabilidade da emulsão. Preferivelmente, 1 a 3 cm³ de uma emulsão estéril, injetável contendo 7 a 20 mg de DIM ou diindolilmetano substituído são injetados em cada leiomioma sob visão direta, dependendo do tamanho do mioma.

[0059] Em uma outra forma de realização alternativa, DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído pode ser incorporado dentro de microesferas biocompatíveis, estáveis para o uso durante a Embolização Arterial Uterina (UAE). Em um uso preferido, DIM e/ou antagonistas de EGFR são incluídos na produção de microesferas hidrofílicas, não reabsorvíveis, produzidas a partir de um polímero de acrílico e impregnado com gelatina porcina. Os exemplos de técnicas de produção para microesferas impregnadas com DIM para embolização controlada, alvejada de miomas são descritos na Patente U.S. 5.635.215 e Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0211165 por Vogel et al., publicado em 13 de novembro de 2003, ambos as quais são aqui expressamente incorporadas por referência em suas totalidades. As faixas de dose para a administração de DIM e diindolilmetanos estruturalmente relacionados, sinteticamente derivados, substituídos, quando usados em microesferas como dispositivos de liberação de medicamento de liberação prolongada, são de 25 a 2000 mg por tratamento de embolização. Quando usado em conjunção com microesferas impregnadas com antagonista de EGF, a faixa de dose para a administração de DIM ou de um composto relacionado com DIM é de 25 a 1000 mg e a dose de antagonista de EGFR é de 250 a 1000 mg por tratamento de embolização. DIM e/ou um inibidor de EGFR contendo microesferas são idealmente usados em tamanhos (diâmetros de 50 a 500 mícron) e doses menores (menores do que 500 a 1000 mg em peso de microesfera total) do que as microesferas inertes correntes que são recomendadas ser maiores do que 500 mícrons no diâmetro

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18/48 e ser usadas em doses maiores do que 1000 mg de peso de microesfera. As microesferas ativas menores contendo DIM e/ou um inibidor de EGFR resultam em bloqueio arterial subtotal e reduz os efeitos colaterais de pós tratamento associados com a necrose de tecido isquêmico.

[0060] A seguir da miomectomia, UAE ou terapia de radiação de dose baixa, as doses típicas de DIM oral ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído são de 25 a 100 mg duas vezes ao dia por 2 a 4 meses. Em uma forma de realização alternativa, DIM oral e um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído pode ser administrado com antagonistas de EGFR oralmente ativos. Em uma forma de realização, DIM ou um composto relacionado com DIM é usado com IRESSA® (Gefitinib [ZD1839]) por 1 a 4 meses usando uma dose de IRESSA de 50 a 100 mg/dia. [0061] Em uma forma de realização alternativa, DIM ou um composto relacionado com DIM podem ser colocados em suspensão em uma formulação vaginal tal como um supositório para o uso, por exemplo, e indivíduos com mioma. Tipicamente o supositório é colocado alto na vagina uma vez ao dia fornecendo uma dose de 250 a 1000 mg de DIM. Em uma forma de realização preferida, o uso uma vez ao dia de um supositório vaginal com 500 mg de DIM é continuado por 2 a 6 meses e acompanhado pelo uso oral de uma formulação de absorção realçada de DIM em uma dose de 300 mg duas vezes ao dia fornecendo 75 mg de DIM oralmente, duas vezes ao dia.

5.3. TERAPIA COMBINADA [0062] Como indicado, os métodos e composições da presente invenção também são úteis em combinação com outros agentes terapêuticos e modalidades terapêuticas que podem ser usados para o tratamento de leiomiomas. Espera-se que uma combinação de agentes resulte em terapia mais eficaz a ser usada por uma duração mais curta de tratamento. O estudo de cultura celular de células de mioma usando uma reação da cadeia da polimerase (PCR) demonstrou um excesso nos níveis de RNA mensageiro do fator de crescimento epidérmico (EGF) que foi observado em amostras de tecido da fase proliferativa, comparado com amostras da fase proliferativa de úteros normais (HarrisonWoolrych et al., 1994, J Clin Endocrinol

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Metab. 78: 1179-84). Estes resultados estabelecem a contribuição dominante da progesterona e elevações de EGF no crescimento anormal de tecido de mioma. 5.3.1. INIBIDORES DE EGFR [0063] Os inibidores de EGFR para o uso nos métodos e composições da presente invenção incluem, mas não são limitados a medicamentos de molécula pequena que inibem um ou mais EGFRs, anticorpos monoclonais que inativam EGFRs e DNA ou RNA de anti-sentido que inativam o DNA ou RNA de EGFR liberados a uma célula usando a terapia de gene. EGFRs que podem ser inibidos incluem qualquer EGFR conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Rajkumar, 2001, Current Science 81: 535541. Devido à interação sinergística esperada de DIM ou um DIM estruturalmente relacionado, com um inibidor de EGFR, doses reduzidas de um inibidor de EGFR podem ser usadas quando usadas em combinação com DIM.

[0064] Em uma forma de realização, DIM realçado na absorção ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído é administrado em conjunção com um antagonista oralmente ativo do receptor de EGF (EGFR). Em uma forma de realização preferida, doses eficazes de DIM pode ser as mesmas como usadas quando DIM é administrado sozinho. Uma dose representativa é de 15 mg de DIM (60 mg de um DIM formulado típico) ou 25 mg de DIM (100 mg de um DIM formulado típico).

[0065] Os inibidores de EGFR moleculares pequenos adequados para o uso na invenção incluem os inibidores de EGFR, Gefitinib (N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxi6-(3-morfolinopropóxi)quinazolin-4-amina, Iressa®, AstraZeneca, UK) e compostos relacionados (ver o Pedido de Patente Europeu N^o 0566226; os Pedidos de Patente Internacional WO 96/33980 e WO 97/30034; Woodburn et al., 1997, Proc. Amer. Assoc. Cancer Research 38: 633; e Woodburn et al., 1999, Pharmacol. Ther. 82, 241250), Erlotinib (N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietóxi)quinazolin-4-il]-(3etinilfenil)amina, Tarceva^®, OSI Pharmaceuticals [Boulder, CO]) e compostos relacionados (ver os Pedidos de Patente Internacional WO 96/30347 e WO 99/55683), CI 1033 (6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropóxi)quinazoli-n-4amina, Pfizer [Nova Iorque, NY]) e compostos relacionados (ver os Pedidos de Patente

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Internacional WO 97/38983 e WO 00/31048 e Smaill et al., 1999, J. Med. Chem. 42: 1803-1815), PKI 166 (4-[(1R)-1-feniletilamino]-6-(4-hidroxifenil)-7H-pirrolo[2,3-

d]pirimidina, Novartis Pharma, AG [Basel]) e compostos relacionados (ver o Pedido de Patente Internacional WO 97/02266) e GW2016 (N-{3-Cloro-4-[(3fluorobenzil)óxi]fenil}-6-[5-({[2-(metilsulfonil) etil]amino}metil)-2-furil]-4- quinazolinamina).

[0066] Os EGFR's específicos a serem inibidos incluem a família HER de EGFR's, PDGFR (Receptor do Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta) e VEGFR (Receptor do Fator de Crescimento Derivado do Endotelial Vascular). Os medicamentos de molécula pequena específicos representativos úteis na presente invenção, apresentados em relação ao EGFR inibido estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1: Medicamentos Inibidores de GRF Oralmente Ativos, para o Uso com Indóis Relacionados com DIM:

Medicament o	Fabricante	Classe de Medicamento	HER EGFR	VEGFR	PDG F
			I	II	IV	IV
ZD1839 Gefitinib (Iressa)	AstraZeneca	Grupo de Cabeça Pequena Quinazolina (reversível)	X
ZD6474	AstraZeneca		X	X
OSI-774 Erlotinib (Tarceva)	OSI//Roche/ Genentech	Grupo de Cabeça Pequena Quinazolina (reversível)	X
Lapatinib	GlaxoSmithKline	Grupo de Cabeça Grande	X	X
GW-572016		Quinazolina
GW-2016	GlaxoSmithKline		X	X
STI-571 Imatinib Myesilate (Gleevec)	Novartis		X					X
EKB-569	Wyeth	(irreversível)	X	X
CI-1033 (PD 183 805) Cancertinib	Pfizer	4anilinoquinazolina (irreversível)			X	X
SU5416	Sugen	indolin-2-cetona					X

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Semaxanib	Pharma/Pfizer
SU11248	Sugen Pharma/Pfizer	indolin-2-ona						X	X
SU6669	Sugen Phanna		X
Vatalanib PTK787 (ZK222584)	Novartis/Schering	anilino-ftalazinas			X	X		XX
PKI-166	Novartis	Pirrolopirimidinas (reversível)	X	X			X
CEP-7055	Sanofi-Synthelab	Dimetilglicina				X	X

[0067] Os anticorpos monoclonais inibidores de EGFR específicos representativos úteis específicos na presente invenção apresentados em relação ao EGFR inibido, incluem aqueles que aparecem na Tabela 2.

Tabela 2: Anticorpos específicos de EGFR Representativos

Medicamento	Fabricante	Classe	HER	VEGFR	PDGF
Cetuximab (Erbitux)	ImCloneB-MS	mAb de Camundongo/ ser humano	X
Trastuzumab (Herceptin)	Genentech/DNA	mAb	X
MDX-210	Medarex	mAb	X
ABX-EGF	Abgenix/Immunex	mAb	X
TheraCIM	YM	mAb	EGFR
Panitumumab	AbBenix	mAb	EGFR
EMD-72000	Merck	mAb	EGFR
bevacizumab (Avastin)	DNA/Hoffman	mAb		X
Ranibizumab (Lucentis)	DNA/Novartis	mAb		X

[0068] As doses de um inibidor de EGFR na ordem de 1/5 da dose quando administrado sozinho podem ser utilizadas. Tipicamente, Iressa® (Gefitinib) pode ser utilizado em uma dose de 50 a 500 mg/dia, mais preferivelmente, de 50 a 250 mg/dia ou 50 a 100 mg/dia, como o antagonista do receptor de EGF. Alternativamente, uma dose baixa, eficaz de um outro antagonista do fator de crescimento tal como OSI-774 (Erlotinib, Tarceva®), CI1033 [Parke-Davis Pharmaceutical Research (Ann Arbor, MI), PKI 166 [Novartis Pharma, AG (Basel, Suíça)] ou GW2016 pode ser utilizado em

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22/48 doses de 25 a 500 mg/dia. Usando o tratamento de DIM/antagonista de EGFR combinados permite um encurtamento do intervalo de tratamento de 1 a 3 meses. Como um exemplo de tal terapia combinada, uma formulação realçada na absorção de DIM em uma dose de 300 mg [75 mg de DIM real] é tomada oralmente duas vezes ao dia junto com uma dose de 100 mg de Iressa (ZD1839, Gefitinib) tomada uma vez ao dia. Alternativamente, as formulações de DIM oral realçado na absorção ou derivados relacionados com DIM podem ser usadas com várias classes de inibidor da tirosina-quinase de inibidores de EGF, tais como ZD1839 (Gefitinib, Iressa), OSI-774 (Erlotinib, Tarceva), CI-1033 e GW2016, usando doses orais eficazes do composto relacionado com DIM e o antagonista de EGF.

[0069] Mais detalhes do uso clínico de antagonistas de EGF para o uso combinado com DIM e/ou compostos relacionados com DIM são descritos nas seguintes publicações, aqui incorporadas por referência em sua totalidade (Janmaat et al., 2003, Oncologist 8: 576-86; e Janmaat et al., 2003, Drugs Today (Bart) 39 Supl C: 61-80).

Tabela 3: Faixas de Dose para os Usos Combinados de Indóis Relacionados com

DIM e Inibidores de EGFR

Medicament o	Fabricante	Faixa de Dose eficaz Mínima (MED) mg/dia	Faixa de Dose Tolerada Média (ATD) mg/dia	Faixa de Dose Tolerada Máxima (MTD) mg/dia
DIM Formulado (BR-DIM)	BioResponse	25 - 150	150 - 500	500 - 1000
ZD1839 Gefitinib (Iressa)	AstraZeneca	25 - 150	150 - 350	350 - 750
Lapatinib GW572016	G1axoSmithKlin e	175 - 500	500 - 900	900 - 1,800
OSI-774 Erlotinib (Tarceva)	OSI/DNA/ Roche	50 - 150	150 - 200	200 - 400
Imatinib Myesilate (Gleevec) STI-571	Novartis	100 - 300	300 - 400	400 - 800
CI-1033	Pfizer	10 - 100	100 - 500	500 - 700

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Efalizumab Xanelin EKB-569		5 - 25	25 - 75	75 - 200
PKT-166	Novartis	10 - 50	50 - 100	100 - 900
Semaxanib SU5416	Sugen Pharma/ Pfizer	10 - 50 mg/m²	50 - 100 mg/m²	100 - 200 mg/m²
CEP-7055	Sanofi- Synthelab	25 - 100	100 - 400	400 - 1000

[0070] Alternativamente, as combinações de DIM (ou de um composto relacionado com DIM) e um antagonista de EGFR de origem natural permite o uso de antagonistas de EGFR na dose oral máxima, devido à segurança e tolerabilidade maior dos inibidores de EGFR de origem vegetal. Os exemplos de compostos polifenólicos naturais com inibição demonstrada de atividade inibidora de EGFR incluem Silibinin, um flavolignano isolado das frutas de Silibum marianum (Cardo Mariano) (Silibin [3,5,7,-triidróxi-2-[3-(4-hidróxi-3-metoxifenil)-2-hidroximetil-1,4-benxodioxan-6-il]cronan-4-ona]; Sharma et al., 2001, Mol Carcinog. 30: 224-36), (-)epigalocatequina-3galato (EGCG), uma catequina polifenólica encontrada no chá verde (Sah et al., 2004, J Biol Chem. 279: 12755-62) e resveratrol, um derivado de estilbeno habitualmente isolado de videiras (Vitis vinifera L) e de Polygonium cuspidatum Sieb. Et Zucc (Japanese knotweed). Também úteis são compostos relacionados com o resveratrol tais como viniferinas, piceatanol (3,4,3’,5’-tetraidroxiestilbeno), oxiresveratrol (2,3’,4,5’-tetraidroxiestilbeno), 4,4’-diidroxiestilbeno e cis- e trans- piceids que também são preferidos para o uso na presente invenção (Stewart et al., 2004, Invest. New Drugs 22: 107-117). As doses de compostos relacionados com o resveratrol a serem usadas nos métodos e composições da invenção são similares às doses usadas para resveratrol. Em certas formas de realização, silibinin, EGCG ou resveratrol podem ser incorporados com indóis relacionados com DIM em supositórios vaginais para a aplicação tópica na proximidade aos leiomiomas uterinos.

Tabela 4: Faixas de Dose para Usos Combinados de Indóis Relacionados com DIM e Inibidores de EGFR de Origem Natural

Medicamento

Fabricante

Faixa de Dose Eficaz

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		(mg/dia)
DIM Formulado (BR-DIM)	BioResponse, LLC	25 - 750
Silibinin (SiliPhos)	Indena, Inc.	100 - 2000
Resveratrol (RegrapeX)	Interpharma Praha	100 - 2000
EGCG	Vários	500 - 2000

[0071] Também úteis em combinação com DIM ou indol relacionado com DIM, no tratamento de condições Leiomiomatosas são os extratos de Scutellaria barbata D. Don (SB), um componente herbáceo da medicina coreana tradicional conhecido como ‘Ban-Ji-Ryun,’ que demonstra atividade inibitória do crescimento em cultura de célula de leiomioma (Lee et al., 2004, Int Immunopharmacol. 4: 447-54) e Evodiamina, um componente alcalóide de indol extraído da fruta de Evodiae Fructus (Evodia rutaecarpa Benth.). O extrato de Scutellaria é tipicamente dado em uma dose de 200 a 800 mg/dia e o extrato de Evodia é tipicamente dado em uma dose de 300 a 800 mg/dia, fornecendo Evodiamina (40 a 200 mg/dia).

[0072] Visto que as características de metabólitos de 4-hidróxi estrogênio de tecido de leiomioma são pró oxidantes, compostos anti-oxidantes selecionados são de benefício adicional para o uso em terapia combinada com DIM. Estes incluem Licopeno, o carotenóide principal encontrado nos tomates. O licopeno tem demonstrado a inibição de tumores do músculo liso relacionados com leiomioma nos ovidutos de cordoniz japonesa (Sahin et al., 2004, Nutr Cancer, 50: 181-9). Além disso, o licopeno e o beta-caroteno relacionado, protegem as células dos efeitos pró oxidantes dos metabólitos de 4-hidróxi estrogênio, conhecidos ser produzidos em tecido de leiomioma (Muzandu et al., 2005, Jpn J Vet Res. 52: 173-84). Tipicamente, o Licopeno é administrado em associação com um indol relacionado com DIM em uma faixa de dose diária de 4 a 30 mg/dia. O licopeno ou um carotenóide relacionado também podem ser incorporados em supositórios vaginais para a aplicação tópica ao útero através do colo do útero.

[0073] As combinações de DIM (ou um composto relacionado com DIM) e um antagonista de EGFR, com ou sem um carotenóide ou extrato de Scutellaria, podem

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25/48 estar na mesma composição para a administração em combinação concorrentemente ou em composições diferentes para a administração concorrentemente, mas separada ou sequencialmente. Quando os compostos são administrados sequencialmente, os compostos podem ser administrados dentro de alguns minutos, algumas horas ou alguns dias um do outro.

[0074] O uso combinado de DIM ou de um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído e um antagonista de EGFR pode ser ainda combinado com outras modalidades intervencionais de tratamento de leiomioma. As modalidades intervencionais de tratamento preferivelmente incluem miomectomia, UAE e terapia de radiação de dose baixa. A miomectomia é realizada durante a laparotomia pélvica, laparoscopia pélvica ou histereoscopia uterina. O tecido de mioma não acessível à remoção durante estes procedimentos e assim é injetado diretamente durante o procedimento com suspensões de DIM ou um composto relacionado com DIM ou com suspensões de microesferas impregnadas com DIM ou um composto relacionado com DIM, opcionalmente com um antagonista de EGFR. A cirurgia é seguida pela administração oral de DIM ou um composto relacionado com DIM, sozinho ou em conjunção com antagonista de EGFR. A UAE pode ser realizada usando a administração padrão de microesferas de acrílico não reabsorvíveis (Embosphere Microspheres [Biosphere Medical, Inc., Rockland, MA]) seguida por 1 a 4 meses de administração oral de DIM ou um composto relacionado com DIM sozinho ou em conjunção com antagonistas de EGFR tais como IRESSA. Em uma forma de realização alternativa, a UAE é realizada utilizando uma microesfera como descrito no Exemplo 5 fabricada para conter e liberar lentamente DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído. Para administrar microesferas contendo DIM, uma suspensão estéril de microesferas é primeiro misturada com meios de contraste não iônicos. Tipicamente, uma dose total de 1 a 3 cm³ de uma suspensão de microesferas tendo um diâmetro de 300 a 500 mícrons contendo 250 a 750 mg de DIM ou de um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído, é misturada com meios de contraste e injetados em uma ou ambas as artérias uterinas usando guia fluoroscópico. Preferivelmente,

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26/48 microssomas impregnados com DIM podem ser usados em combinação com microssomas impregnados com antagonista de EGFR para tirar vantagem de atividades inibitórias de crescimento sinergístico antecipado dos dois agentes terapêuticos. Finalmente, a disponibilidade de terapia de radiação direcionada à lesão permite uso combinado de DIM e um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído durante a terapia de radiação de dose baixa para levar vantagem da atividade de sensibilização da radiação antecipada do DIM ou compostos relacionados com DIM e antagonistas de EGFR. Neste uso combinado, uma formulação de DIM oral com ou sem um antagonista de EGFR é administrado antes, durante e depois de uma série de tratamentos com terapia de radiação. Em uma forma de realização preferida, a tecnologia da terapia de radiação “Gammaknife” ou “Cyberknife” (Accuray, Inc., Sunnyvale, CA) é usada para concentrar e focalizar o feixe de radiação limitando a exposição à radiação de tecido da bexiga, ovariano e intestinal, adjacentes. O tratamento com a terapia de radiação não invasiva, limitada ao mioma, é seguido pelo tratamento oral com DIM oral, diindolilmetanos estruturalmente relacionados, sinteticamente derivados, substituídos, opcionalmente com IRESSA ou outro antagonista de EGF oralmente ativo. Preferivelmente, a dose de cGy é mantida abaixo da dose limítrofe conhecida para causar dano às estruturas adjacentes. Um programa de computador tal como aquele descrito na Patente U.S. 6.477.229 pode ser usado para escolher uma dose de radiação acumulativa segura. A seguir do tratamento com radiação Cyberknife, uma formulação realçadora de absorção de DIM em uma dose de 300 mg [75 mg de DIM reais] é tomada oralmente duas vezes ao dia sozinho ou com uma dose de 50 a 100 mg de Iressa (ZD1839, Gefitinib) tomada uma vez ao dia.

5.4. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS [0075] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção preferivelmente compreendem um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e os constituintes ativos. O(s) carreador(es) deve(m) ser “aceitável(is)” no sentido de ser(em) compatível(is) com os outros ingredientes da composição e não nocivo(s) ao seu receptor.

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27/48 [0076] Será avaliado que as quantidades de DIM ou de um composto relacionado com DIM requeridas para o dito tratamento variarão de acordo com a via de administração, o distúrbio a ser tratado, a condição, idade e história arquivada do indivíduo, a formulação galênica da composição farmacêutica, etc.

[0077] Preferivelmente, o DIM ou um composto relacionado com DIM usado na invenção foram processados para realçar a biodisponibilidade, como é descrito na Patente U.S. 6.086.915. DIM ou LTR processados desta maneira são aludidos como “DIM processado” e “LTR processado”, respectivamente. Entretanto, qualquer preparação adequada de DIM ou de um composto relacionado com DIM pode ser usada nos métodos e composições da invenção.

[0078] O que segue é uma lista de ingredientes úteis para a formulação de DIM ou de um composto relacionado com DIM processados:

1. Cerca de 10 a cerca de 40 por cento em peso de DIM ou de um composto relacionado com DIM.

2. Cerca de 10 a cerca de 40 por cento em peso do seguinte, sozinhos ou em combinação: succinato de vitamina E polietileno glicol 1000; succinato de vitamina E Polietileno glicóis com polietileno glicol (com uma faixa de peso molecular de 400 a 2000); outros ésteres de polietileno glicol tais como aqueles formados pelas ácidos graxos tais como ácido oléico ou ácido esteárico; polivinilpirrolidonas; polivinilpolipirrolidonas; Poloxâmero 188, Tweens; ou Spans.

3. Cerca de 5 a cerca de 20 por cento em peso dos seguintes, sozinhos ou em combinação: fosfatidil colina (derivada de lecitina de soja e fornecida como Phosfolipon 50G da Rhone Poulenc Rorer); dioleoil fosfatidilcolina; fosfatidilglicerol; dioleoilfosfatidilglicerol; dimiristoilfosfatidil-colina; dipalmitoilfosfatidilcolina;

fosfatidiletanolaminas; fosfatidilserinas; ou esfingomielinas; ou outras fontes de fosfolipídios como aquelas de Milk Fat Globule Membrane purificada; ésteres de glicerol; ésteres de poli glicerol; ou óleo de mamona etoxilado.

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4. Cerca de 15 a cerca de 30 por cento em peso dos seguintes, sozinhos ou em combinação: hexanol; etanol; butanol; heptanol; 2-metil-1pentanol; vários solventes de cetona que seriam aceitáveis em alimentos tais como metil etil cetona, acetona e outros; propileno glicol; e certos solventes de éster tais como acetato de etila.

5. Cerca de 20 a cerca de 40 por cento em peso dos seguintes, sozinhos ou em combinação: amido modificado tal como Amido Capsul® da National Starch, Inc.; metilcelulose; hidroxipropil metilcelulose; hidroxietilcelulose; hidroxipropiletilcelulose; pectina; goma arábica; gelatina; ou outra preparação que forme matriz polimérica conhecida por aqueles habilitados na técnica, solúvel em água e, adequada para a secagem por pulverização.

6. Cerca de 0,5 a cerca de 35 por cento em peso dos seguintes, sozinhos ou em combinação: aerosil 200; ou qualquer outro excipiente realçador de fluxo de sílica ou sal relacionado, conhecido por aqueles habilitados na técnica.

[0079] O seguinte é um método detalhado de formular DIM processado:

1. 6,75 kg de TPGS é aquecido mais além do seu ponto de fusão com agitação constante em um vaso aquecido (“Primeiro vaso”).

2. 9,38 kg de hexanol e 9,83 kg de DIM moído a jato é adicionado ao primeiro vaso e a mistura agitada a uma suspensão uniforme a 70° C. 1,4 kg de fosfatidil colina é depois adicionado.

3. Em um segundo vaso maior, 185 L de água e 10,7 kg de amido são cuidadosamente misturados com uma lâmina Cowles. Esta mistura é neutralizada até o pH 7 com uma pequena quantidade de carbonato de sódio e depois aquecida a 75° C e agitada por 1 hora.

4. Os conteúdos do primeiro vaso são adicionados à mistura de amido no segundo vaso maior e cuidadosamente misturados com um homogeneizador misturador do tipo rotor/estator em velocidade moderada por 15 minutos.

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5. A mistura da etapa 4 é secada por pulverização com uma pequena quantidade (aproximadamente 5 %) de sílica hidrofílica para fornecer um pó de fluxo livre de micropartículas finamente dispersadas contendo o TPGS co-precipitado, fosfatidil colina e DIM em uma estrutura amorfa, não cristalina.

6. O produto em pó fluível é coletado e armazenado em sacos de folhas metálicas evacuados, depois de desaerar e escoar com nitrogênio.

7. A análise da presença de ingrediente dietético não alterado, revela cerca de 30 a cerca de 33 por cento em peso de DIM.

[0080] O procedimento de fabricar DIM processado pode ser resumido como segue:

(a) aquecer um ou mais emulsificadores solubilizadores selecionados do grupo que consiste de succinato de vitamina E polietileno glicol 1000, polivinilpirrolidona, estearato de polioxietileno, colato, desoxicolato e taurocolato de sódio;

(b) adicionar ao produto da etapa (a) um solvente e um fosfolipídio tensoativo selecionado do grupo que consiste de fosfatidil colina, dioleoil fosfatidil colina, fosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidil-colina, dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e esfingomielina para produzir uma solução;

(c) dissolver na solução da etapa (b) LTR e/ou DIM;

(d) adicionar à solução da etapa (c) uma solução contendo um encapsulador;

(e) misturar a solução produzida na etapa (d) para produzir uma microdispersão com um tamanho de partícula de 5 mícrons ou menos; e (f) secar por pulverização a mistura resultante para deixar uma composição fitoquímica hidrofóbica sólida.

[0081] No geral, uma quantidade (terapeuticamente eficaz) adequada de DIM ou

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LTR é de 50 a 500 mg por dia. DIM é preferivelmente administrado em uma formulação realçadora de absorção, como descrito na Patente U.S. 6.086.915, de 50 a 200 mg por dia, mais preferivelmente de 400 a800 mg por dia, como uma suspensão de micropartículas em uma matriz carreadora de amido. O LTR é preferivelmente administrado em uma formulação realçadora de absorção de 50 a 200 mg por dia, mais preferivelmente de 200 a 800 mg por dia, como uma suspensão de micropartículas em uma matriz carreadora de amido. As quantidades realmente administradas de fitoquímica podem ser decididas por um médico ou veterinário.

[0082] As formulações terapêuticas incluem aquelas adequadas para a administração parenteral (que incluem intramuscular e intravenosa), intra-arterial, oral, retal, intra-vaginal ou intradérmica, embora a administração oral seja a via preferida. Assim, a composição farmacêutica pode ser formulada como suspensão parenteral, microesferas degradáveis e não degradáveis para a administração intra-arterial durante a UAE, tabletes, pílulas, xaropes, cápsulas, supositórios, formulações para a aplicação transdérmica, formulações para usos intradérmicos, pós, especialmente pós liofilizados para reconstituição com um carreador para a administração intravenosa, pelotas de ração para uso veterinário, etc.

[0083] O termo “carreador” refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com os quais o produto terapêutico é administrado. Os carreadores na composição farmacêutica podem compreender um aglutinante, tal como celulose microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona ou povidona), goma tragacanto, gelatina, amido, lactose ou lactose monoidrato; um agente desintegrante, tal como ácido algínico, amido de milho e outros; um lubrificante ou tensoativo, tais como estearato de magnésio ou lauril sulfato de sódio; um agente de deslizamento, tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tal como sacarose ou sacarina; e/ou um agente flavorizante, tal como hortelã, salicilato de metila ou sabor de laranja.

[0084] As formulações terapêuticas adequadas para a administração oral, por exemplo, tabletes e pílulas, podem ser obtidas pela compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Tabletes comprimidos podem ser preparados misturando-se DIM ou um diindolilmetano estruturalmente

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31/48 relacionado, sinteticamente derivado, substituído e comprimido esta mistura em um aparelho adequado em tabletes tendo um tamanho adequado. Antes de misturar, o DIM ou DIM estruturalmente relacionado podem ser misturados com um aglutinante, um lubrificante, um diluente inerte e/ou um agente desintegrante.

[0085] Em uma forma de realização preferida, DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído são misturados com um aglutinante, tal como celulose microcristalina e um tensoativo, tal como lauril sulfato de sódio até que uma mistura homogênea seja obtida. Subsequentemente, um outro aglutinante, tal como polividona, é transferido para a mistura sob agitação com uma pequena quantidade de água adicionada. Esta mistura é passada através de peneiras de granulação e secada pela dessecação antes da compressão em tabletes em um aparelho de tabletagem padrão.

[0086] Um tablete pode ser revestido ou não revestido. Um tablete não revestido pode ser sulcado. Um tablete revestido pode ser revestido com açúcar, goma laca, película ou outros agentes de revestimentos entéricos.

[0087] As formulações terapêuticas adequadas para a administração parenteral incluem soluções ou suspensões estéreis dos constituintes ativos. Um carreador aquoso ou oleoso pode ser usado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser estéreis líquidos, tais como água e óleos, que incluem aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e outros. As formulações para a administração parenteral também incluem um pó liofilizado que compreende fitoquímicos que devem ser reconstituídos pela dissolução em um carreador farmaceuticamente aceitável que dissolva ao dito fitoquímico.

[0088] Quando a composição farmacêutica é uma cápsula, a mesma pode conter um carreador líquido, tal como um óleo graxo, por exemplo, manteiga de cacau.

[0089] Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e outros. Estas composições podem tomar a forma de

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32/48 soluções, suspensões, emulsão, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação controlada e outros. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes tradicionais e carreadores tais como triglicerídeos.

[0090] Já em uma outra forma de realização, o composto terapêutico pode ser liberado em um sistema de liberação controlada. Em uma forma de realização, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em uma outra forma de realização, materiais poliméricos podem ser usados (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); ver também Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105).

[0091] Para o uso em UAE e injeção em tecido de mioma, microesferas estáveis, biocompatíveis, facilmente injetadas através de agulhas e catéteres de angiografia, são preferidas. As microesferas com diâmetros de 10 a cerca de 300 micrômetros no diâmetro são as mais preferidas. Devido à solubilidade em água deficiente de DIM e do diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído, um método para a preparação de dispositivos de liberação de medicamento polimérico biodegradável usando temperaturas relativamente baixas e soluções não aquosas é útil. As técnicas para a fabricação de microesferas apropriadas quanto as características físico-químicas de DIM, LTR e medicamentos relacionados com DIM sintéticos são descritos na Patente U.S. 5.718.921, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A fabricação de microesferas apropriadas com características de liberação prolongada desejáveis contendo DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído, e/ou antagonista de EGFR é ainda descrita na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0211165 por Vogel et al., publicado em 13 de novembro de 2003, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Alternativamente, composições

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33/48 embólicas que compreendem macrômeros tendo uma cadeia principal de um polímero tendo unidades com uma estrutura de 1,2-diol e/ou 1,3-diol que incorporam DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído, e/ou antagonistas de EGFR podem ser fabricadas de acordo com a Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0223956 por Goupil et al., publicado em 4 de dezembro de 2003, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0092] Em outras formas de realização, uma formulação de liberação controlada que compreende microesferas ou micropartículas poliméricas biodegradáveis em que DIM ou um diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído são colocados em suspensão em uma matriz polimérica, a matriz polimérica que é formada de pelo menos dois polímeros biodegradáveis altamente solúveis em água e as microesferas sendo revestidas com um copolímero (d, 1 lactídeo-glicolídeo) é preferida. A seleção do copolímero (d, 1 lactídeo-glicolídeo) particular dependerá em uma grande parte de quão longo é o período no qual a microesfera é intencionada a liberar o ingrediente ativo. Por exemplo, um copolímero (d, 1 lactídeo-glicolídeo) fabricado de cerca de 80 % de ácido lático e 20 % de ácido glicólico é muito estável e forneceria uma microesfera adequada para a liberação de DIM, LTR e medicamentos relacionados com DIM sintéticos em um período de semanas.

[0093] Outros sistemas de liberação controlada são debatidos na revisão por Langer (1990, Science 249: 1527-1533).

[0094] Em uma forma de realização da composição farmacêutica de acordo com a invenção, dois ou mais constituintes ativos são compreendidos como entidades separadas.

[0095] A invenção também fornece uma embalagem farmacêutica ou kit que compreendem um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dos ingredientes para a prática dos métodos da invenção. Opcionalmente associado com tal(is) recipiente(s) pode estar uma orientação na forma prescrita por uma agência governamental que regule a fabricação, usa ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, orientação esta que reflita a aprovação pela agência da fabricação, uso ou

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34/48 venda para a administração humana.

[0096] A invenção é ainda explicada pelos seguintes exemplos ilustrativos.

6. EXEMPLO 1: FABRICAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO REALÇADA NA ABSORÇÃO DE DIM PARA O TRATAMENTO DE LEIOMIOMAS [0097] No geral, uma quantidade adequada (terapeuticamente eficaz) de diindolilmetano é preferivelmente administrada em uma formulação que realce a absorção, como descrito na Patente U.S. 6.086.915, de 100 a 2000 mg por dia como uma suspensão de micropartículas em uma matriz carreadora de amido. As quantidades realmente administradas de Diindolilmetano podem ser decididas por um médico supervisor.

[0098] A preparação de Diindolilmetano processado foi realizada de acordo com as etapas esboçadas na Patente U.S. 6.086.915, aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em resumo, esta incluiu a mistura de cerca de 10 a 40 % em peso final de diindolilmetano com cerca de 10 a 40 % em peso final de succinato de vitamina E polietileno glicol 1000 (Vitamin-E-TPGS, Eastman Chemical), 2 a 20 % em peso final de fosfatidil colina (Phosfolipon 500, Rhone Poulenc) e 15 a 30 % em peso final de hexanol. Esta mistura foi feita homogênea por mistura. A mistura homogênea de indóis e outros substituintes solúveis em óleo listados acima foi adicionada a uma solução de amido modificado em água (Amido Capsul da National Starch, Inc.). O componente de amido forma de 30 a 70 % do peso seco final do produto. A mistura combinada final bem dispersada foi depois submetida às secagem por pulverização. O produto resultante foi um pó fino contendo diindolilmetano contido dentro das partículas de amido.

[0099] Alternativamente, o componente de amido descrito acima como Amido Capsul da National Starch, Inc., ao invés pode ser fabricado usando Maltodextrina NF (Maltrin M100, GPC), 20 a 30 % do peso seco final, junto com Goma Arábica USP/NF (TIC Pretested, TIC Gums), 20 a 30 % do peso seco final, representando juntos de 40 a 70 % do peso seco final. Adicionalmente, sílica fumigada (Aerosil 200, Degussa), 1 a 2 % do peso final, pode ser adicionada durante o processo de secagem por pulverização como um auxiliar de fluxo.

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7. EXEMPLO 2: FABRICAÇÃO DE CÁPSULAS CONTENDO DIINDOLILMETANO [0100] As cápsulas contendo 150 a 300 mg de diindolilmetano processado, como produzido de acordo com as etapas descritas no Exemplo 1, foram fabricadas misturando-se o diindolilmetano processado com celulose microcristalina e colocandose o pó misturado em cápsulas de gelatina opacas.

[0101] Alternativamente, cápsulas contendo diindolilmetano processado (DIM), como produzido de acordo com as etapas descritas no Exemplo 1, foram fabricadas misturando-se o DIM processado com compostos inibidores de EGFR polifenólico de acordo com as seguintes quantidades por cápsula. Os ingredientes são misturados de acordo com estas quantidades e as cápsulas são enchidas usando maquinaria padrão.

Tabela 5

Componente	Peso de Cápsula Preferido (mg)	Faixa de Peso de Cápsula (mg)
DIM Processado	75	(50-100)
Silibinina (SiliPhos)	100	(100-200)
Extrato de chá verde (EGCG)	150	(150-300)
Peso Cheio Ativo Total (mg)	325	(300-625)

[0102] Opcionalmente, 6 a 25 mg de Licopeno são adicionados a cada cápsula e/ou 25 a 100 mg de extrato de Scutellaria barbata ou Evodia rutaecarpa são adicionalmente adicionados como desejado pelo formulador. 1 a 6 cápsulas da formulação combinada são tomadas, preferivelmente duas vezes ao dia, com água como deliberado por um técnico de cuidado de saúde ou instruções de rótulo.

8. EXEMPLO 3: FABRICAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DE SUPOSITÓRIO VAGINAL DE DIM PARA O TRATAMENTO DE LEIOMIOMAS EM CONJUNÇÃO COM A TERAPIA ORAL [0103] Em um vaso aquecido, 90 gramas de álcool cetoestearílico (Alfol 16/18, Vista) foram aquecidos a 100° C aos quais 5 g de DIM microcristalino (LKT Labs, St. Paul, MN) foram adicionados com mistura constante para formar uma pasta fluida quente. Alternativamente, 90 gramas de álcool cetoestearílico (Alfol 16/18, Vista) foram aquecidos a 100° C aos quais 5 g de DIM microcristalino são misturados,

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36/48 sozinhos ou juntos com 10 gramas de ceramida ou derivados de cerimida sintéticos, ceramida C2. Em um segundo vaso 400 g de IV Novata (Base de Supositório de Glicerídeo Semi-sintético, Ashland Chemicals) foram aquecidos a 40° C com mistura constante. A pasta fluida bem misturada do primeiro vaso foi adicionada com mistura contínua ao segundo vaso. O material de supositório fundido homogeneizado foi formado em supositórios de 2 g cada e esfriado. Monoesterato de glicerila 10 a 50 g foi adicionado à mistura fundida como necessário para aumentar a firmeza dos supositórios finais.

[0104] Alternativamente, supositórios vaginais são produzidos usando DIM microcristalino como descrito acima, combinado com silibinina, resveratrol ou antagonista farmacêutico de EGFR (por exemplo, Gefitinib) para fornecer uma dose minimamente eficaz para o inibidor de EGFR particular (25 a 500 mg) por 2 g de supositório.

9. EXEMPLO 4: FABRICAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DE EMULSÃO INJETÁVEL DE DIM PARA O TRATAMENTO DE LEIOMIOMAS [0105] Para preparar uma emulsão de DIM para injeção em leiomiomas, Oleato de etila (EO), Fosfatidil Colina (PC) (da gema do ovo) e calceína, são adquiridos da Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO). Distearoil-fosfatidiletanolamina-N-poli(etilenoglicol) 2000 (DSPE-PEG) é adquirido da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

[0106] Usando uma modificação do método de Yu et al. (Yu W et al., 1993, Int. J. Pharm. 89: 139-146), a microemulsão é fabricada como segue: 160 gramas de EO e 60 gramas de PC são dissolvidos em 1 litro de etanol puro. 24 gramas de DIM microcristalino (tamanho médio de partícula 0,25 mícron) são adicionados e são dissolvidos nesta “fase oleosa”. 20 gramas de DSPEG-PEG são depois dissolvidas em 500 cm³ de água USP (Fase aquosa). A solução etanólica oleosa (fase oleosa) com o DIM dissolvido é depois lentamente adicionada na solução de DSPE-PEG (fase aquosa) sob agitação magnética moderada. A fase aquosa imediatamente torna-se leitosa com opalescência como o resultado da microemulsão produzida. A microemulsão é depois submetida à baixa pressão a 360 mm Hg e mantida a 50° C. A pressão baixa é usada para concentrar a emulsão através da remoção do etanol e

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37/48 uma porção da água. Usando um ensaio de absorção de infravermelho para determinar o teor de DIM da microemulsão, uma concentração final de DIM de 7,5 mg/ml é estabelecida. Hidróxido de sódio é adicionado para aumentar o pH até a faixa de 5,0 a 7,5.

[0107] Usando esta técnica de fabricação emulsões de DIM são preparadas e são submetidas ao teste de estabilidade para demonstrar que o tamanho da partícula dentro da emulsão permanece entre 150 e 200 nm. A técnica de produção resulta em uma micro-emulsão com faixas de % em peso dos componentes nas seguintes faixas preferidas:

Componente	% em Peso Aproximado
DIM	0,05 - 0,1
Lipídeos (EO: PC: DSPE-PEG; 8: 3: 1)	45 - 28
Água	50 - 70
Etanol	1 - 2

[0108] Alternativamente, um método de produção isento de etanol pode ser utilizado para produzir uma micro-emulsão estável de DIM ou de derivados de DIM e análogos, usando Lipofundin MCT B. Braun Melsungen AG (Melsungen, Alemanha), uma emulsão básica pré formada e homogeneização em alta pressão de DIM microcristalino. Este método utiliza DIM moído a jato, com tamanho de partícula reduzido ao diâmetro médio de 0,1 mícron (realizado pela Micron Technologies, Inc., Exton, PA). Usando esta técnica 700 mg de cristais de DIM com 0,1 mícrons de diâmetro são homogeneizados em 100 cm³ de Lipofundin usando equipamento e métodos como descritos (Akkar et al., 2003, Eur J Pharm Biopharm. 55: 305-12). Isto resultará em uma micro-emulsão com base em lipídeo estável com tamanho de partícula menor do que 200 nm e um teor de DIM de 7 mg/cm³ da emulsão.

10. EXEMPLO 5: FABRICAÇÃO DE MICROESFERAS ESTÁVEIS CONTENDO DIM PARA O TRATAMENTO DE LEIOMIOMAS DURANTE A EMBOLIZAÇÃO DA ARTÉRIA UTERINA (UAE) SELETIVA [0109] Devido à solubilidade em água deficiente de DIM, uma técnica de produção para microesferas estáveis, biocompatíveis contendo DIM é desenvolvida com base na tecnologia de produção descrita na Patente U.S. 5.718.921, aqui expressamente

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38/48 incorporada por referência em sua totalidade. Este processo usa um polímero de polianidrido que é dissolvido em um solvente orgânico volátil, em que o DIM ou o diindolilmetano estruturalmente relacionado, sinteticamente derivado, substituído são dispersados e co-dissolvidos na solução polimérica. A mistura é colocada em suspensão em um óleo orgânico e o solvente orgânico é extraído no óleo, criando microesferas. O método permite a preparação de microesferas contendo DIM a partir de uma variedade de polímeros biodegradáveis, que incluem polianidridos hidrofóbicos tais como (pCPP:SA, 50:50) e CPP copolimerizado com ácido dodecanodióico (DD), (pCPP: DD, 20:80) e (pCPP: DD, 50:50).

[0110] Para a preparação de microesferas de DIM, quatro gramas do polímero, pCPP:SA, 20:80, pm = 16000, são dissolvidas em 20 ml de cloreto de metileno, ao qual é adicionado 1 grama de DIM microcristalino e colocado em suspensão na solução polimérica usando um agitador mecânico. A mistura é depois gotejada em óleo de silício (Dow Chemical Company, Midland, Mich.) que contém entre aproximadamente 1,0 e 20 % de Span® ou um outro tensoativo ou agente emulsificante. Os emulsificantes Span® são preferidos. Esta é depois agitada em uma taxa de agitação ajustada. A agitação é feita usando um agitador suspenso tipo RZR⁵⁰, (“CAFRAMA”, Wiarton, Ont.) e uma hélice de impulsão de três lâminas. Depois de 1 hora, éter de petróleo é introduzido e a agitação é continuada por mais uma hora. As microesferas são isoladas pela filtração, lavadas com éter de petróleo, secadas durante a noite em um liofilizador (Labconco, Freeze Dryer 8), são peneiradas (U.S. Standard Sieve Series, Newark, Wire Cloth Company, Newark, N.J.) e são armazenadas a menos do que 0° C.

[0111] Este processo de fabricação produzirá microesferas impregnadas com DIM com diâmetros de 50 a 1000 mícrons. A recuperação neste processo de produção pode ser limitada a 50 % devido a alguma precipitação do polímero no agitador. As microesferas de DIM são peneiradas para remover as microesferas com diâmetros maiores do que 500 mícrons para resultar em microesferas com uma distribuição de tamanho final de 50 a 500 mícrons. As microesferas esferas são depois peneiradas para remover aquelas com diâmetros menores do que 50 mícrons, deixando as

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39/48 microesferas com diâmetros entre 500 e 500 mícrons. As 2 gramas resultantes de microesferas são novamente secadas em um liofilizador, autoclavadas para esterilizar e recolocadas em suspensão a uma concentração de 1,0 ml de microesferas em 5 ml de solução salina fisiológica estéril. Os 5 ml de suspensão de microesferas conterão aproximadamente 250 mg de DIM, adequados para o uso terapêutico em um único procedimento de UAE.

11. EXEMPLO 6: USO DE DIM ORAL, REALÇADO NA ABSORÇÃO PARA O TRATAMENTO DE LEIOMIOMAS EM UMA MULHER [0112] A aplicação de formulações oralmente ativas de DIM ou derivados sintéticos de DIM é ilustrada pelo seguinte exemplo clínico de tratamento bem sucedido de uma condição de miomatos.

[0113] Uma mulher de 44 anos de idade foi sintomática de leiomioma uterino, experimentando menstruações dolorosas com hemorragia excessiva, frequência de urinação e incapacidade para exercícios devido à fadiga. O exame físico pelo seu ginecologista revelou uma massa pélvica direita visível na inspeção do abdômen e palpável com exame físico suave. O seu exame pélvico revelou distorção visível e palpável do colo do útero devido ao tecido de leiomioma protuberante. A apalpação bimanual revelou um útero claramente ampliado com um contorno irregular compatível com leiomiomas múltiplos. Um teste de sangue indicou anemia branda. A histerectomia foi fortemente sugerida. A indivíduo iniciou a terapia com cápsulas de DIM, formuladas para a absorção realçada como descrito no Exemplo 1. Uma dose de 120 mg de formulação de DIM, dada três vezes ao dia, liberando 30 mg de DIM real por dose, foi usada. Depois de dois meses de uso de DIM, o indivíduo retornou ao seu médico descrevendo fluxo menstrual normal com níveis normais de desconforto e energia melhorada. O seu exame físico repetido incluiu um exame abdominal normal sem nenhuma massa pélvica visível ou palpável. O seu exame pélvico repetido mostrou um colo do útero de aparência normal e um útero palpável de tamanho muito reduzido.

12. EXEMPLO 7: USO DE DIM ORAL, REALÇADO NA ABSORÇÃO PARA REDUZIR O TAMANHO DE LEIOMIOMAS UTERINOS

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40/48 [0114] O tratamento clínico e estudo de laboratório estão sendo usados para demonstrar os benefícios terapêuticos de DIM oral para indivíduos com leiomioma associados com uma produção reduzida de metabólitos de 4-hidróxi estrogênio. Os resultados esperados são melhoras clínicas nos sintomas e redução do tamanho do leiomioma documentado em sonogramas em série. O tratamento clínico, usando DIM oral formulado para a absorção realçada de acordo com o Exemplo 1, tem demonstrado redução significativa do tamanho de leiomioma demonstrado pela avaliação de ultra-som pélvico em série.

[0115] Mulheres com leiomiomas uterinos foram selecionadas com base nas descobertas de sonogramas uterinos anormais mostrando leiomioma mensuráveis documentados em mais do que uma ocasião. Três indivíduos foram prosseguidos para fornecer uma coleta de urina de referência de 12 horas e começaram a tomar DIM absorvível de 150 a 450 mg [37,5 a 112 mg de DIM real] duas vezes ao dia por 3 a 6 meses. Duas mulheres completaram a participação em um estudo preliminar, completando períodos de 2 e 6 meses de tratamento. O Indivíduo A foi uma mulher de 46 anos de idade multípara com períodos menstruais regulares, tomando reposição de hormônio da tireóide para corrigir hipotireoidismo primário e não usando nenhuma outra medicação. O Indivíduo B foi uma mulher de 50 anos de idade não tomando nenhuma medicação com períodos regulares.

[0116] Depois do consentimento informado, um pré tratamento de ultra-som foi obtido para cada indivíduo. Cada indivíduo forneceu um espécime de urina de 12 ou 24 horas que foi congelado. O Indivíduo A começou a tomar 2 cápsulas duas vezes ao dia de DIM realçado na absorção (BioResponse, LLC, Boulder CO) fornecendo DIM a 100 mg/kg por dose. O Indivíduo B tomou 3 cápsulas duas vezes ao dia de DIM realçado na absorção (BioResponse, LLC, Boulder CO) fornecendo DIM a 150 mg/kg por dose. Depois de 2 meses de tratamento, o Indivíduo A foi reavaliado pelo mesmo técnico de ultra-som usando o mesmo equipamento e na mesma fase do seu ciclo menstrual. Uma urina de pós tratamento também foi obtida, coletada no mesmo ponto no ciclo menstrual como a amostra de urina de referência. Similarmente, o Indivíduo B foi reavaliado depois de 6 meses de tratamento usando DIM realçado na absorção

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41/48 (BioResponse-DIM). Ele tomou uma dose mais alta duas vezes ao dia fornecendo 150 mg/kg/dose. A sua reavaliação incluiu ultra-sonografia pélvica a seguir de uma série de 3 avaliações de ultra-som pélvico no pré tratamento todas realizadas com o mesmo equipamento. Como o Indivíduo A, o Indivíduo B forneceu uma amostra de urina antes e depois do tratamento com DIM.

[0117] Os dados de ultra-som pélvico foram analisados usando uma fórmula matemática para calcular o volume de pré tratamento e pós tratamento de leiomioma individual com base no diâmetro mais amplo e no diâmetro perpendicular a este medidos em centímetros (cm). Um cálculo do volume do tumor individual foi realizado, tratando cada tumor como uma massa ovóide, usando a fórmula: V = 4/3 π (H/2)2(L/2), onde V = volume em centímetros cúbicos (cm³), H = altura do tumor em centímetros (cm) e L = comprimento do tumor em centímetros (cm). Este método forneceu volumes de tumor individuais em centímetros cúbicos (cm³). Os resultados para os volumes de tumor no pré e pós tratamento com porcentagem de redução a seguir do tratamento de 2 meses do Indivíduo A e do tratamento de 6 meses do Indivíduo B são apresentados nas Tabelas 6 e 7 e Figuras 1A-B. A redução percentual média no volume de tumor foi de 33,5 % para o Indivíduo A. A redução média no volume de tumor foi de 78,6 % para o Indivíduo B.

Tabela 6: Volumes de Tumor de Leiomioma no Indivíduo “A” Antes e Depois do Tratamento com DIM

Número de Identificação do Tumor Indivíduo “A”	Volume do Tumor no Pré Tratamento com DIM (cm³)	Volume do Tumor no Pós Tratamento com DIM (cm³)	Diminuição Percentual no Volume do Tumor
Tumor 1	22,39327	3,783001	83,10653
Tumor 2	116,8987	114,4901	2,060378
Tumor 3	62,83185	53,20497	15,32167

Tabela 7: Volumes de Tumor de Leiomioma no Indivíduo “B” Antes e Depois do Tratamento com DIM

Número de Identificação do Tumor Indivíduo “A”

Volume do Tumor no Pré Tratamento com DIM (cm³)

Volume do Tumor no Pós Tratamento com DIM (cm³)

Diminuição Percentual no Volume do

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			Tumor
Tumor 1	19,8836635	5,57528	71,9605
Tumor 2	3,591364	1,876578	47,74749
Tumor 3	9,91067762	6,093643	38,51437
Tumor 4	1,88495559	0,884882	53,05556
Tumor 5	2,11848065	0,796394	62,40732

[0118] As amostras de urina foram testadas no Bradlow/Sepkovic Laboratory, Hackensack University Medical Center, Hackensack, NJ. A técnica utilizada foi um ensaio de cromatografia a gás- espectrometria de massa (GCMS) estabelecido para estradiol (E2), estrona (E1), 2-hidróxi estrona (2OH-E1), 4-hidróxi estrona (4OH-E1), 16-hidróxi estrona (16OH-E1) e estriol (E3) na urina (Michnovicz et al., 1997, J Natl Cancer Inst. 89(10): 718-23). O procedimento envolveu a incubação durante a noite com glicuronidase para glicouroídes e análise subsequente pela derivatização e determinação de GCMS de nanograma por mililitro de urina por 24 horas (ng/ml/24 horas). a análise de laboratório é esperada mostrar um aumento na 2-hidróxi estrona e uma diminuição na 16-hidróxi estrona, como medida no pré tratamento quando comparada com as amostras de urina no pós tratamento. Uma diminuição na 4hidróxi estrona seria compatível com a inibição das características de metabolismo do estrogênio de leiomiomas (Liehr et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA. 92: 9220-4). Os resultados antes e depois de tratamento com DIM são apresentados na Tabela 8, mostrando os metabólitos de interesse como uma porcentagem dos metabólitos de estrogênio totais medidos e como relações das quantidades de 2OH-E1 para 16OHE1 (2OH-E1/16OH-E1) determinadas para cada amostra. A comparação dos resultados revelou aumentos relacionados com tratamento grandes em 2OH-E1 e a relação 2OH-E1/16OH-E1 em ambos os Indivíduos. O Indivíduo A mostrou uma redução relacionada com o tratamento em 16OH-E1 e o Indivíduo B, tratado com uma dose mais alta, mostrou uma redução relacionada com o tratamento em 4OH-E1. Os metabólitos de estrogênio 2OH-E1 não são promotores do crescimento e estrogênios mais fracos comparados com 160HE1 e 40H-E1.

Tabela 8: Porcentagem ou Relação de Metabólitos de Estrogênio Medidos

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Indivíduo (Dose e Duração)	Metabólito de Estrogênio ou Relação de Metabólito	Antes do DIM	Depois do DIM
“A” (200 mg/dia de DIM, Tomados por 2 Meses)	2OH-Estrona (2OH-Ei)	4 %	8,3 %
4OH-Estrona (4OH-Ei)	0,4 %	0,7 %
16OH-Estrona (16OH-Ei)	8,4 %	4,9 %
2OH-Ei/16OH-Ei	0,5	1,7
“B” (300 mg/dia de DIM, Tomados por 6 Meses)	2OH-Estrona (2OH-Ei)	2,5 %	35 %
4OH-Estrona (4OH-E1)	2,5	1,7 %
2OH-Ei/16OH-Ei	0,3	9,5

[0119] Em conclusão, o tratamento preliminar de mulheres com DIM oral resultou em uma redução compatível do tamanho do leiomioma intra-uterino. Diferente do uso de agonistas de GnRN injetados (Flierman et al., 2005, BJOG. 112: 638-42) ou progestinas de ação longa (Venkatachalam et al., 2004, J Obstet Gynaecol. 24: 798800), a redução no volume do leiomioma observado com tratamento com DIM não foi associado com amenorréia, hipo-estrogenemia, calores súbitos ou outros efeitos colaterais relatados.

[0120] Outro estudo clínico esperado, controlado com placebo de DIM oral em indivíduos com Leiomioma selecionados será usado para estabelecer ainda mais a utilidade de métodos relacionados com DIM de tratamento de leiomioma.

13. EXEMPLO 8: CULTURA DE ÓRGÃO DE TECIDO DE LEIOMIOMA UTERINO TRATADO COM DIM E/OU ANTAGONISTAS DE EGF [0121] Um estudo in vitro dos efeitos de DIM e inibidores de EGFR será empreendido. Um protocolo para estabelecer a atividade e sinergismo de DIM, e/ou Gefitinib (Iressa®, ZD1839 [Astra Zeneca]) e outros inibidores de EGFR, com base na exposição de culturas primárias de tecido de leiomioma, é planejado. Estes estudos utilizarão crescimento sustentado de tecido de leiomioma com esteróide sexual em cultura de órgão como um modelo pré-clínico. Iressa^® é um EGFR-TKI (inibidor da tirosina quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico) oralmente ativo que

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44/48 bloqueia os caminhos da transdução de sinal que possam contribuir para o crescimento de leiomioma. Outros inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) a serem testados incluem CI 1033 [Parke-Davis Pharmaceutical Research (Ann Arbor, MI)], um inibidor de tirosina quinase de quinazolina diferente de Iressa e PKI 166 [Novartis Pharma, AG (Basel)], um antagonista de EGFR que não quinazolina. Os efeitos de DIM sozinho e em combinação com um antagonista de EGFR no crescimento da célula de leiomioma são avaliados usando o ensaio de EVA/PCD (morte celular apoptótica/programada ex vivo) (Rational Therapeutics Cancer Evaluation Laboratories, Long Beach, CA) que anteriormente mostrou correlacionar-se com resposta, tempo e sobrevivência em indivíduos com certos tumores.

[0122] As curvas de dose-resposta são interpoladas para fornecer 50 % de concentrações letais (LC(50)). O grau de sinergia (pelo efeito mediano) e classificações Z normalizadas (classificações brutas convertidas em atividade relativa distribuída em torno da média) são depois computadas.

[0123] As interações favoráveis são previstas para combinações de DIM com antagonistas do receptor de EGF. As culturas de Leiomioma serão analisadas quanto aos aumentos sinergísticos na morte celular relacionada com a apoptose com combinações de DIM e inibidores de EGFR. Estes estudos de cultura de leiomioma primários podem sustentar interações sinergísticas e de modo possível clinicamente benéficas de DIM e inibidores de EGFR.

[0124] O tecido de leiomioma será obtido no momento da cirurgia de mulheres que consentiram em ser doadoras de seu tecido de mioma a seguir da histerectomia ou miomectomia utilizando o Institutional Review Board. Amostras frescas de tecido de leiomioma serão iniciadas na cultura de órgão seguindo protocolos estabelecidos nos laboratórios da Rational Therapeutics, Long Beach, CA. As técnicas publicadas de cultura de tecido para miométrio uterino normal e tecido de leiomioma incluem aquelas descritas por Horiuchi et al. (Horiuchi et al., 2000, Mol Hum Reprod. 6: 523-8) e Arici et al. (Arici et al., 2003, Am J Obstet Gynecol. 188(1): 76-83). As condições de cultura incluirão as seguintes:

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45/48 • tecido de mioma mais estrogênio • tecido de mioma mais estrogênio e progesterona • tecido de mioma, estrogênio, progesterona e DIM • tecido de mioma, estrogênio, progesterona e Iressa • tecido de mioma, estrogênio, progesterona, DIM e Gefitinib (Iressa, AstraZeneca, UK) • tecido de mioma, estrogênio, progesterona, DIM e CI 1033 [Parke-Davis Pharmaceutic Research (Ann Arbor, MI)] • tecido de mioma, estrogênio, progesterona, DIM e PKI 166 [Novartis Pharma, AG (Basel, Suíça)] • tecido de mioma, estrogênio, progesterona, DIM e Silibinin (LKT Labs, St. Paul, MN) • tecido de mioma, estrogênio, progesterona, DIM e EGCG (LKT Labs, St. Paul, MN) • tecido de mioma, estrogênio, progesterona, DIM e Evodiamina (Sigma, St. Louis, MO) [0125] As culturas serão submetidas ao ensaio de morte celular de EVA padronizado realizado pela Rational Therapeutics e classificadas de acordo com as taxas de apoptose. As amostras de sobrenadante serão congeladas e subsequentemente testadas no Bradlow/Sepkovic Laboratory, Hackensack University Medical Center, Hackensack, NJ quanto aos metabólitos de estrogênio. O método de análise para os sobrenadantes utilizarão um ensaio de cromatografia a gás-espectrometria de massa (GCMS) estabelecido para os níveis de 2-hidróxi, 16-hidróxi e 4-hidróxi estrona em ng/ml de sobrenadante (Xu et al., 2002, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 780: 315-30).

14. EXEMPLO 9: EXPERIMENTO IN VIVO EM CORDONIZ JAPONESA PARA DEMONSTRAR A PREVENÇÃO DE LEIOMIOMAS USANDO DIM

Introdução:

[0126] O modelo de animal de crescimento monitorado da cordoniz japonesa (Coturnix coturnix japonica) será usado para demonstrar a utilidade de DIM ou de um indol relacionado com DIM, para a prevenção e tratamento de leiomiomas

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46/48 espontâneos. Similar aos leiomiomas em seres humanos, tumores do músculo liso do oviduto e do ligamento dos ovidutos estão entre os tumores benignos mais comuns observados em espécies aviárias (Foster et al., 1989, Poult Sci. 68: 1447-53). O propósito deste experimento é demonstrar a atividade anti-leiomioma de indóis relacionados com DIM na cordoniz japonesa que é amplificada pelo tratamento combinado com inibidores de EGFR e/ou antioxidantes de carotenóides. Os resultados são diretamente aplicáveis aos seres humanos e uma variedade de espécies economicamente importantes de aves.

Métodos:

[0127] Os métodos experimentais para a manutenção de cordoniz, alimentação, avaliação e amostragem de tecido de oviduto seguem técnicas publicadas (Sahin et al., 2004, Nutr Cancer. 50: 181-9). 200 a 300 cordonizes japonesas de 6 meses de idade (Coturnix coturnix japonica) serão usadas no estudo. Os grupos de 30 a 40 aves serão designadas para os seguintes Grupos Experimentais Grupos:

1. Grupo de Controle: Dieta Basal (17 % de proteína bruta e 12,4 mJ/kg de energia metabolizável)

2. Grupo de DIM Dose Baixa: Dieta Basal mais DIM Formulado (DIM formulado como no Exemplo 1)

3. Grupo DIM de Dose Alta: Dieta Basal mais DIM Formulado

4. DIM de Dose Baixa mais Licopeno: Dieta Basal mais DIM Formulado mais Licopeno

5. DIM Dose Baixa mais Silibinina: Dieta Basal mais DIM Formulado mais Silibinina

6. DIM Dose Baixa mais Evodiamina: Dieta Basal mais DIM Formulado mais Evodiamina [0128] As aves receberão dieta suplementada de acordo com as seguintes faixas de dose.

Tabela 9

Grupo Experimental	Número (n)	DIM (mg/kg/dieta)	Licopeno (mg/kg/diet a)	Silibinina (mg/kg/diet a)	Evodiamina (mg/kg/diet a)
Dose Baixa	Dose Alta

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Controle	(30-40)
Apenas DIM (Dose Baixa)	(30-40)	(25-50)
Apenas DIM (Dose Alta)	(30-40)		(100-200)
DIM e Licopeno	(30-40)	(25-50)		(100-200)
DIM e Silibinina	(30-40)	(25-50)			(100 -300)
DIM e Evodiamina	(30-40)	(25-50)				(25-100)

[0129] No final de 270 a 300 dias de tratamento, as aves serão abatidas e a presença ou ausência e o diâmetro dos leiomiomas no músculo liso do oviduto serão registrados. O tecido do músculo liso tumoroso e normal circundante será examinado histologicamente. a presença e aspecto dos leiomiomas serão comparados entre os grupos. O músculo liso tumoroso e normal circundante serão tingidos usando imuno-histoquímica quanto a presença e níveis de Akt fosforilado e marcadores da ativação capa b de NF usando técnicas publicadas (Hapman et al., 2004, J Clin Endocrinol Metab. 89: 5683-93).

Resultados Esperados:

[0130] Menos e menores leiomiomas são esperados ser encontrados nos grupos tratados com DIM e DIM mais inibidor de EGFR de cordoniz. Os níveis reduzidos de Akt fosforilado e marcadores da ativação de capa b de NF serão encontrados no músculo liso e leiomiomas de aves tratadas versus de controle.

Debate:

[0131] Os leiomiomas do útero representam um problema de saúde principal no mundo desenvolvido e interferem com a reprodução e postura de ovos em espécies aviárias comerciais. O tratamento com indóis relacionados com DIM, com ou sem EGFR e/ou antioxidantes de carotenóides, fornece um novo método para a prevenção e tratamento não cirúrgico de leiomiomas e tumores benignos do músculo liso relacionado.

[0132] A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas formas de realização específicas descritas que são intencionadas como ilustrações únicas de aspectos individuais da invenção e métodos e componentes funcionalmente

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48/48 equivalentes estão dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e aqui descritas tornar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente e desenhos anexos. Tais modificações são intencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. [0133] Várias referências são aqui citadas, a divulgação das quais são incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de 3,3' diindolilmetano (DIM) ou 2-(Indol-3-ilmetil)-3,3’diindolilmetano (LTR), caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratar leiomioma em um indivíduo.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DIM é usado.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o LTR é usado.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DIM ou indol relacionado com DIM é colocado em suspensão como micropartículas em uma matriz carreadora de amido.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado oralmente.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado intra-arterialmente.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado vaginalmente.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é injetado diretamente no tecido do mioma.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o leiomioma é um leiomioma uterino.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o leiomioma é um leiomioma extra-uterino.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um aviário.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o leiomioma é um leiomioma de oviduto.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que

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2/2 ainda compreende um antagonista de EGFR.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o antagonista de EGFR é gefitinib.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o antagonista de EGFR é silibinina, (-)-epigalocatequina-3-galato ou resveratrol.