BRPI0411103B1 - método, e, método de obtenção e isolamento de um autoanticorpo de um fluido biológico contendo anticorpo ou de um extrato de fluido biológico contendo anticorpo - Google Patents

Abstract

"método, métodos de obtenção e isolamento de um autoanticorpo de um fluido biológico contendo anticorpo ou de um extrato de fluido biológico contendo anticorpo, e de tratamento de uma doença autoimune, e, produto". a especificidade de ligação de pelo menos uma proteína de plasma suspensa ou dissolvida em um meio líquido é alterada pela exposição da proteína a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica suficiente para alterar sua especificidade de ligação. uma proteína mascarada tal como um autoanticorpo pode ser recuperada do sangue ou de produtos de sangue ou extratos pela oxidação da proteína para alterar sua especificidade de ligação.

Description

“MÉTODO, E, MÉTODO DE OBTENÇÃO E ISOLAMENTO DE UM AUTOANTICORPO DE UM FLUIDO BIOLÓGICO CONTENDO ANTICORPO OU DE UM EXTRATO DE FLUIDO BIOLÓGICO CONTENDO ANTICORPO”

O presente pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 60/476.607, depositado em 09 de junho de 2003. O pedido provisório é incorporado como referência aqui. CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um método de alteração de uma especificidade de ligação de uma proteína de plasma que tem uma especificidade de ligação que pode ser alterada por reações de oxidaçãoredução. A presente invenção também se refere a um método de obtenção de anticorpos pelo desmascaramento dos autoanticorpos naturalmente presentes no sangue, plasma ou soro de indivíduos normais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O termo doença autoimune refere-se a um grupo de doenças em que o sistema imune, equivocadamente, ataca as células, tecidos e órgãos do corpo de uma pessoa. Tipicamente, as doenças autoimunes envolvem ligação de anticorpo dos componentes próprios do corpo, tais como proteínas e lipídeos comuns. Os anticorpos que se ligam a auto-compostos (ou, mais tipicamente, a compostos que são tão comuns que são encontrados em cada organismo) são referidos como autoanticorpos. Como um exemplo, ligação de autoanticorpo de fosfolipídeos e/ou proteínas de plasma de ligação a fosfolipídeo está associada com doenças tais como lupus eritematoso sistêmico (SLE), veia profunda e trombose arterial recorrente, embolismos pulomonares, aborto espontâneo recorrente, trombocitopenia, coréia, epilepsia, livedo, hipertensão pulmonar idiopática, condições reumatológicas e um hospedeiro de doenças de colágeno. Outras doenças associadas com

Petição 870180138220, de 05/10/2018, pág. 10/15 ² :> : : < ·: ?

• · · · ··· · · · . , .

• _ * * * · · ·· ··· • · ·····«···· · · autoanticorpos incluem esclerose múltipla, doença de Crohn, lupus discóide eritematoso, tiroidite de Hashimoto, psoríase, diabetes e artrite reumatoide.

Há cerca de 80 diferentes doenças autoimunes, e, como um grupo, estas doenças afetam milhões de pessoas.

Uma teoria convencional referente à etiologia de doenças autoimunes tem sido aquela que estas doenças são causadas por uma sobreprodução de autoanticorpos no indivíduo adoentado, possivelmente devido a uma sobreexpressão de um gene que codifica tais autoanticorpos. De acordo com esta teoria, o sangue de um indivíduo afetado contém um nível (10 elevado do autoanticorpo particular que causa a doença, enquanto que o sangue de um indivíduo normal não contém nenhum autoanticorpo ou somente uma quantidade trivial. Esta teoria é suportada por ensaios convencionais, em que autoanticorpos abundantes podem ser detectados no sangue, ou e produtos de sangue tais como plasma ou soro, de indivíduos 15 tendo uma doença autoimune, enquanto que somente zero ou uma quantidade mínima de autoanticorpos podem ser detectados no sangue ou nos produtos do sangue de indivíduos que não têm uma doença autoimune.

A presente invenção é baseada na descoberta notável, relatada

aqui, de que o sangue de indivíduo s normais de fato contém um número significativo de autoanticorpos, em uma ampla variedade de tipos e especificidades. É possível se detectar e isolar estes autoanticorpos do sangue ou de um produto do sangue de um indivíduo normal se o sangue ou produto do sangue for tratado por oxidação, por exemplo, com um agente oxidante ou corrente elétrica, de acordo com um método descrito aqui. Esta verificação de autoanticorpos em quantidades significativas em sangue normal não é previamente relatada e, para o melhor do conhecimento dos inventores, a existência de tais autoanticorpos em quantidades significativas em sangue normal era completamente desconhecida antes da presente invenção.

Sem se estar limitado a qualquer teoria, é evidente que se os autoanticorpos podem ser obtidos pela manipulação de sangue normal tirado de pessoas que não têm qualquer sintoma de doença autoimune, então deve ser que o sistema imune de pessoas normais rotineiramente cria e circula estes autoanticorpos, mas de alguma forma em que eles são mascarados ou 5 bloqueados, ou de outra forma evitando que tenham quaisquer efeitos nocivos.

A verificação de que autoanticorpo em quantidades significativas em indivíduos normais aumenta o questionamento do porquê dos autoanticorpos não serem detectados em ensaio padrão (tipicamente 0 baseados na ligação de um anticorpo no seu antígeno correspondente) e do porquê os autoanticorpos não causarem sintomas de doenças em indivíduos normais.

Com base em experimentos mais remotos descritos aqui, uma explanação de tentativa inicial de como o sangue normal poderia conter 15 autoanticorpos sem tais anticorpos sendo detectados através de procedimentos de triagem ordinários e sem tais anticorpos que causam doença, foi que autoanticorpos em indivíduos normais foram de alguma forma seqüestrados após serem produzidos. Por exemplo, o seqüestro pode estar na forma de macromoléculas tais como lipoproteínas de baixa ou alta densidade (LDL, 20 HDL) ou algum outro tipo de micropartículas, vesículas ou micelas que podem ter a habilidade de manter autoanticorpos cordonados e separados dos outros componentes da corrente sangüínea. Sob esta teoria, uma doença autoimune pode ser ativada, não pela produção de autoanticorpos per se, mas por colapso, disrupção ou perda de formação das mocromoléculas, 25 micropartículas, vesículas ou micelas que sequestram os autoanticorpos. Estas teoria parecia suportada pelos experimentos iniciais em que os autoanticorpos foram obtidos a partir de amostras de sangue ou soro após manipulação razoavelmente drástica das amostras incluindo agitação e aquecimento.

Em experimentos posteriores, descritos aqui, contudo, foi •

♦ · ·« * · ·* · • ·· •

• · • · · · • · · • · · • · · ' · · · como • ·♦ · mostrado que métodos mais simples da presente invenção, tais exposição de sangue ou produto de sangue a um agente oxidante ou corrente elétrica CC, podem ser suficientes para se obter autoanticorpos a partir de sangue normal, e de que o processo é reversível. Além disso, foi verificado que autoanticorpos podem ser obtidos por tratamento de produtos Ivlg comerciais, que estariam livres de qualquer tipo de entidade seqüestrante macromolecular. Com base nestes experimentos, uma teoria mais provável de a uma

como o sangue normal pode conter autoanticorpos sem tais anticorpos sendo detectados através de procedimento de triagem ordinários e sem tais 0 anticorpos que causam doenças, é que os autoanticorpos circulam livremente juntamente com outros anticorpos mas que o sítio de ligação de antígeno de autoanticorpos é de alguma forma bloqueado ou inativado em indivíduos normais. Sob esta teoria, doença autoimune pode ser acionada por oxidação para desbloquear o sítio de ligação de antígeno de autoanticorpos. Além do 15 mais, esta teoria sugere um mecanismo mais geral pelo qual a especificidade de ligação de certas proteínas no plasma podem ser alteradas.

Um uso prático imediato da verificação que forma a base da presente invenção é que ele permite um suprimento quase ilimitado de autoanticorpos a serem obtidos, os quais podem ser usados como padrões em ^20 kits diagnósticos para a diagnose de laboratório de doenças autoimunes e outras doenças relacionadas a aPL. Previamente, a coleta de grandes quantidades de autoanticorpos para uso comercial tem sido difícil porque pensava-se que os autoanticorpos tinham que ser obtidos a partir de indivíduos que têm uma doença autoimune ou que fossem positivos para 25 autoanticorpos em ensaios padrão. A quantidade de tal sangue que pode ser obtida a partir de flebotomia de pacientes individuais ou sangue agrupado a partir de um grupo de pacientes conhecidos como positivos no teste para autoanticorpos é limitada. Outros métodos de obtenção de autoanticorpos, tais como triagem de coleções de fago como descrito na Patente U.S. 5.885.793, podem ser difíceis e com muito gasto de tempo.

O teste das amostras de sangue quanto à presença ou ausência de anticorpos mascarados podem ter valor diagnósticos importantes pois ode prever quais anticorpos podem aparecer subseqüentemente à tensão oxidativa 5 em indivíduos particulares.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

É objeto da presente invenção fornecer um método de alteração de uma especificidade de ligação de uma proteína de plasma que

tem uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma alteração em seu estado redox.

É outro objeto da presente invenção fornecer um método de obtenção de autoanticorpos a partir de sangue, plasma ou soro de indivíduos normais.

É outro objeto da presente invenção fornecer um método de tratamento de um indivíduo tendo uma doença autoimune pela administração ao indivíduo de um antioxidante suficiente para desativar autoanticorpos no dito indivíduo.

É outro objeto da presente invenção fornecer um método de tratamento de um indivíduo tendo uma doença autoimune pela desativação de ^20 autoanticorpos do dito indivíduo fora do corpo.

É outro objeto da presente invenção fornecer um produto compreendendo um fluido biológico ou extrato contendo proteína de um fluido biológico que foi exposto a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica CC suficiente para alterar a especificidade de ligação de pelo menos uma proteína contida nela.

É outro objeto da presente invenção fornecer uma amostra de sangue, plasma ou soro de uma ou mais pessoas que são negativas no teste quanto à presença de autoanticorpos em ensaios clínicos de rotina e que forma tratadas de forma que o sangue, plasma ou soro subseqüentemente • · ·

t) demonstrasse a presença de autoanticorpos.

Estes e outros objetos são alcançados por um método de alteração de uma especificidade de ligação de pelo menos uma proteína de circulação em um fluido biológico ou em um extrato contendo proteína de um fluido biológico, a proteína circulante tendo um sítio de ligação com uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança em um estado redox da proteína, pela exposição da proteína no fluido biológico ou extrato a uma agente oxidante ou a uma corrente elétrica (CC) para efetuar a alteração da especificidade de ligação da proteína de circulação.

Os objetos são também alcançados por um método compreendendo as etapas de fornecer uma composição compreendendo pelo menos uma proteína de plasma suspensa ou dissolvida em um meio líquido, a proteína de plasma tendo uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança no estado redox, e expor a composição a um agente oxidante ou a um potencial elétrico CC suficiente para efetuar a alteração da especificidade de ligação da proteína de plasma.

Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de obtenção de autoanticorpos ou outras proteínas de circulação mascaradas a partir de um fluido biológico ou de um extrato de um fluido biológico pela exposição do autoanticorpo ou de outra proteína circulante mascarada no fluido biológico ou extrato a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica CC suficiente para alterar a especificidade de ligação do autoanticorpo ou de outra proteína de circulação mascarada de forma que o autoanticorpo ou a outra proteína de circulação mascarada se tome capaz de se ligar a um antígeno ou ligando, desta forma se tomando detectável e recuperável a partir do fluido biológico ou extrato, e recuperar o autoanticorpo ou outra proteína circulante mascarada do fluido biológico.

Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença autoimune pela administração a um

4( • · * · ♦ · • · e° ^r20 • - - - - indivíduo tendo uma doença autoimune de uma quantidade de um antioxidante suficiente para desativar os autoanticorpos no indivíduo. Um tratamento de uma pessoa tendo uma doença autoimune pode incluir tratamento fora do corpo do sangue para reduzir as proteínas não mascaradas e as substituir por proteínas mascaradas.

Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de triagem de um fluido biológico ou extrato de um indivíduo normal para determinar quais autoanticorpos são mascarados e assim construir um perfil de anticorpo potencial de autoanticorpos que podem causar doença autoimune naquele indivíduo se expostos ou não mascarados por oxidação ou uma força eletromotriz.

Como um exemplo particular mas não limitante, sangue, plasma ou soro, ou um extrato de sangue, tal como uma mistura de imunoglobulina, podem ser expostos a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica CC para efetuar a alteração da especificidade de ligação de pelo menos um autoanticorpo contido no sangue, plasma, soro ou extrato, de forma que o autoanticorpo se tome detectável em e recuperável a partir do sangue, plasma, soro ou extrato.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma tabela que lista os anticorpos de antifosfolipídeos particulares (aPL) que foram avalizado pelo formato de ensaio imunossorbente ligado a enzima doméstico (ELISA) usado em muitos dos Exemplos descritos abaixo.

A Figura 2 é uma tabela que sumariza os resultados do ensaio 25 aPL para uma amostra de sangue a partir de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de operação dos Exemplos.

A Figura 3 é uma tabela compósita que sumariza os resultados do ensaio de aPL de amostra de sangue a partir de sete indivíduos normais • · ···

-¼ ♦ · · aPL-negativos, incubados de acordo com o método descrito na seção' de abertura dos Exemplos.

A Figura 4 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio aPL para uma amostra de soro de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com a característica de que células vermelhas de sangue de cavalo (RBC) foram substituídas por RBC humanas no procedimento.

A Figura 5 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL de uma incubação de uma amostra de soro realizada de acordo com 110 um método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com a exceção de que o soro do cavalo foi substituído por soro humano.

A Figura 6 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos 15 Exemplos, com a exceção de que a incubação foi realizada à temperatura ambiente (22°C).

A Figura 7 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal,

incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com a característica de que contas (de plástico) Degalan de 0,7 mm foram usadas como o sólido particulado na mistura de incubação.

A Figura 8 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos

Exemplos, com a exceção de que a mistura de incubação foi mantida estacionária, ao invés de ser mexida ou balançada.

A Figura 9 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos

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Exemplos, com a característica adicional de que a mistura de incubação foi aquecida a 56°C por 30 minutos.

A Figura 10 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com a característica de que um meio de crescimento de cultura bacteríana de um diferente fornecedor (Becton Dickinson, Sparks, Md) foi usado ao invés do meio de crescimento de cultura bacteríana de Biomerieux.

A Figura 11 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio •10 de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com a característica de que a incubação ocorreu sob condições anaeróbicas.

A Figura 12 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos

Exemplos, com a característica de que células K562 (uma linhagem de células de tumor humana) foram usadas ao invés de RBC.

A Figura 13 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, com a exceção de que o meio de crescimento de cultura de bactérias foi substituído com um meio de cultura de células usado para o crescimento de células humanas.

A Figura 14 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio 25 de aPL para uma amostra de sangue em cordão a partir de mãe e bebê aPLnegativo normal.

A Figura 15 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo aPL-negativo normal, incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos . * ,· . · ··* ·♦·. *·· · ·

Exemplos, com a característica de que nitroprusida de sódio (SNP) foi usada em lugar de RBC na mistura de incubação.

A Figura 16 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de atividade anticoagulante de lupus para uma amostra de sangue incubada de acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos. A amostra de sangue foi obtida a partir de um indivíduo cujo sangue é negativo para anticoagulante de lupus antes da conversão em soro pelo processo da presente invenção.

A Figura 17 é uma tabela listando outros tipos de •10 autoanticorpos que foram identificados nas amostras de sangue que são incubadas de acordo com método descrito na seção de abertura dos Exemplos. Os anticorpos listados foram identificados por microscopia de imunofluorescência.

A Figura 18 é um gráfico que mostra o perfil do espalhador frontal (tamanho) e do espalhador lateral (granularidade) da população de monócitos de células como definidas para células brancas do sangue humanas isoladas por gradiente de densidade por citometria de fluxo.

As Figuras 19 A - D são histogramas de citometria de fluxo

mostrando atividade de monócitos de vários soros. Nos histogramas, a atividade do anticorpo, se presente, é medida por mudanças nos valores de canal médios (escala log) ao longo do eixo horizontal. A Figura 19A mostra a reatividade de monócito de soro humano normal agrupado (NHS). A Figura

19B mostra a atividade de monócito de um soro a partir de um indivíduo normal. A Figura 19C mostra a atividade de monócito de uma amostra de sangue a partir de um indivíduo mostrado na Figura 19B que foi tratado de acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos. A Figura 19D mostra a atividade de monócito de soros de controle positivo.

A Figura 20 é uma tabela que sumariza os resultados do teste de anticorpo-anti-nuclear (ANA) de várias amostras usando um ensaio de

A6
triagem RELISA®.	11	P : :·: : . *: ·: ? * : v g

A Figura 21 é uma tabela que sumariza os resultados de ensaio de aPL para uma amostra de Ivlg que foi incubada com hemina em um tampão tris.

A Figura 22 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, aCL, aPE, e aPC (como medido por densidade óptica, OD) detectada em uma série de preparações de Ivlg que foram incubadas com hemina, como uma função da quantidade de soro humano (em μΐ) adicionado às preparações.

A Figura 23 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, Q10 aCL, aPE, e aPC (como medido por densidade óptica, OD) detectada em uma série de preparações de soro humano diluído que foram incubadas com hemina, como uma função da quantidade de soro humano (em μΐ) adicionado às preparações.

A Figura 24 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, aCL, aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectadas em uma série de preparações de Ivlg que foram incubadas com hemina e Vitamina C, como uma função da quantidade de Vitamina C (em pg) adicionada às preparações.

A Figura 25 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, aCL, aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectadas em uma série de preparações de Ivlg que foram incubadas com hemina solubilizada com NaOH, hematoporfirina IX solubilizada com DMSO (hplX), hplX solubilizado em NaOH, NaOH sozinho, DMSO sozinho, e hemina solubilizada em DMSO.

A Figura 26 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS (conforme medido por densidade óptica, OD) detectada em uma série de preparações de IvIG que foram incubadas com quantidades crescentes de hemina e quantidade aumentadas de hemina e hemopexina (hpx).

A Figura 27 mostra as Western blots obtidas para três lisatos • · · · ·*» «·· ·«· de célula com IvUIg tratados com hemina e Ivlg não tratados usados como anticorpos primários, juntamente com uma mancha em que o conjugado rotulado com HRP anti-humano foi usado como um controle.

As Figuras 28A e 28B são gráficos que mostram a quantidade de aPS, aCL, aPE, e aPC independentes de aPL e dependentes de aPL (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectados em uma série de preparações de Ivlg em que eletrodos conectados a uma bateria de 9 volts foram imersos em uma solução salina tamponada com fosfato contendo o Ivlg por 2 minutos.

|10 A Figura 29 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, aCL, aPE, e aPC (conforme medida por múltiplos da média, MoMs) detectados em uma série de preparações Ivlg em que eletrodos conectados a uma bateria de 6 volts foram imersos em uma solução salina tamponada com fosfato contendo Ivlg por 60 segundos.

A Figura 30 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, aCL, aPE, e aPC (conforme medida por múltiplos da média, MoMs) detectados em uma série de preparações Ivlg em que eletrodos conectados a uma bateria de 6 volts foram imersos em uma solução salina tamponada com fosfato contendo Ivlg, como uma função do tempo de imersão.

As Figuras 31 A, 31B e 31C são gráficos mostrando a quantidade aCL, aPE, e aPS, respectivamente (conforme medida por múltiplos da média, MoMs) detectados em soluções de controle antes e após a exposição por 240 segundos a eletrodos conectados a uma bateria de 6 volts.

A Figura 32 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS e aCL, respectivamente (conforme medida por múltiplos da média, MoMs) detectados no soro diluído com PBS de um paciente aPS e aCL positivo. No experimento, os eletrodos de grafite conectados a uma bateria de 6 volts foram imersos no soro diluído por uma quantidade variável de tempo.

A Figura 33 é um gráfico que mostra a quantidade de aPS, » ··» • · · • · · * · · · aCL, aPE, e aPC (conforme medida por múltiplos da mécliã/ívlõMs^ *

• · · - · · * _t; ·· ?····· · • · f'···· « · . . · · ! · · respectivamente, detectados no soro diluído com PBS de um paciente aPEpositivo. No experimento, os eletrodos de grafite conectados a uma bateria de 6-volts foram imersos no soro diluído para uma quantidade variável de tempo.

A Figura 34 é um gráfico que mostra a quantidade de aPs, aCL e aPE, (conforme medida por densidade óptica, OD), respectivamente, detectados no soro diluído com PBS de um paciente aPE-positivo. No experimento, o plasma bovino adulto (ABP) a 10% usado na determinação de ligação aPL dependente de proteína foi tratado pela imersão de eletrodos de |1O grafite conectados a uma bateria de 6 volts no ABP por uma quantidade variável de tempo.

MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de alteração da especificidade de ligação de pelo menos uma proteína de plasma ou proteína 15 circulante em um fluido biológico ou extrato de um fluido biológico.

Como usados aqui, os termos proteína circulante e proteína de plasma são usados para fazer referência a uma proteína naturalmente encontrada no sistema de circulação de animais. Exemplos de proteínas circulantes incluem anticorpos e outras proteínas de plasma. Deve ser 20 entendido que o método da presente invenção não é para ser aplicado universalmente para todas as proteínas de plasma ou proteínas circulantes, mas, ao invés, se aplica a qualquer proteína de plasma ou proteína circulante que tem a propriedade de ter uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança no estado redox da proteína. A verificação pelo 25 inventor de que há proteínas circulantes, tais como autoanticorpos, que têm esta propriedade forma uma base da presente invenção. Exemplos de proteínas não-anticorpos que foram verificadas ter uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança no estado redox incluem kininogênio e protrombina e/ou glicoproteína de beta 2.

···· · · · · · • ί ·** 2 * · · ·

Ο termo proteína circulante mascarada * e * nõvanféntê · • · ·· aproveitado pela presente invenção para designar e descrever uma proteína circulante que, em indivíduos normais, está presente no sangue, mas não é detectável por ensaios de ligação convencionais baseados na ligação receptor5 ligando porque seu sítio de ligação está, no indivíduo normal ou em uma amostra tomada do indivíduo normal, mascarado ou bloqueado ou de outra forma não permitido de se ligar a um antígeno, e que, quando uma amostra contendo a proteína circulante mascarada for tratada pela alteração de seu estado redox, tal como por exposição a um agente oxidante ou corrente 10 elétrica de acordo com um método da presente invenção, se toma capaz de se ligar a um antígeno, e desta forma se toma detectável em uma amostra. Um exemplo de uma proteína circulante mascarada é um autoanticorpo. Como verificado pelo presente inventor, os autoanticorpos circulam em quantidades significativas em sangue normal, mas eles não são detectáveis em ensaios 15 convencionais baseados na ligação anticorpo-antígeno. Como discutido aqui, um autoanticorpo se toma detectável e recuperável quando o autoanticorpo é submetido a condições de oxidação-redução suficientes para alterar sua especificidade de ligação. Autoanticorpos que foram desmascarados pela

oxidação incluem anticorpos anti-fosfolipídeo, anti-nucleolares (associados com escleroderma), anti-laminas (muito brilho em poros nucleares), antimitocondriais (citoplásmicos), e anti-centríolo. Além disso, também foi verificado que o sangue, soro ou amostras de Ivlg que inicialmente eram negativas no teste para HVC (vírus da hepatite C) e positivos no teste para HCV após um tratamento de acordo com a presente invenção, sugerindo que 25 indivíduos normais têm anticorpos anti-HCV mascarados em sua circulação.

O termo alteração da especificidade de ligação de uma proteína refere-se a um processo por meio do qual uma proteína é trocada ou alterada, tal como por oxidação ou redução, de forma que ela se tome capaz de fazer ligação específica de um antígeno ou ligando a que não tinha ⁵ F’ i ΰ Η 1 1 i Ú ϊ:

previamente sido capaz de especificamente se ligai' ou se torne* *incâpa*z· dê * fazer uma ligação específica de um antígeno ou ligando a que não tinha previamente sido capaz de especificamente se ligar. O termo desmascaramento refere-se a um processo em que a especificidade de ligação de uma proteína circulante mascarada é alterada de forma que a proteína se tome detectável por um ensaio de ligação com base na especificidade de ligação alterada.

O termo autoanticorpo” refere-se a qualquer anticorpo de ocorrência natural produzido pelo sistema imune de um animal e que se liga a 10 um autoantígeno, isto é, a um composto ou antígeno produzido pelo próprio animal.

O termo fluido biológico inclui qualquer fluido corpóreo que contém proteínas circulantes, incluindo plasma, soro e todo o sangue integral, saliva, urina, fluidos de lactação e outras secreções. O termo extrato contendo proteína de um fluido biológico refere-se a qualquer preparação que é coletada ou separada de um fluido biológico, tal como frações de imunoglobulina. Sangue, soro ou plasma que pode ser usado na presente invenção pode ser obtido de forma fresca a partir de um indivíduo, ou pode

ser obtido a partir de tais fontes como preparações de plasma ou sangue em agrupadas obtidas a partir de bancos de sangue ou outras instalações de coleta de sangue. Para os propósitos da presente invenção, o sangue, soro ou plasma pode também ser de coletas que são fora da validade ou de outra forma verificadas estarem fora do padrão para bancos de sangue ou instalações de coleta de sangue. Embora esta descrição esteja focalizada no sangue, plasma 25 ou soro humano, o processo idêntico da presente invenção pode ser aplicado a um sangue de animal e deve resultar na obtenção de anticorpos de animal análogos para os propósitos relacionados à medicina veterinária. Preferivelmente, sangue ou soro usado no método da presente invenção é diluído para reduzir o efeito de quaisquer antioxidantes que podem estar contidos no sangue, plasma ou soro.

No método da presente invenção, a especificidade de ligação de pelo menos uma proteína circulante ou proteína de plasma em um fluido biológico é alterada pela exposição da proteína a um oxidante ou a uma corrente elétrica. Por exemplo, a especificidade de ligação de uma proteína circulante mascarada pode ser alterada de forma que a proteína seja desmascarada, isto é, de forma que ela seja capaz de se ligar a um antígeno ao qual não era capaz de se ligar antes do método ser realizado. Uma proteína que teve sua especificidade de ligação alterada pode então ser isolada e (10 recuperada por qualquer método de separação com base em na ligação específica.

Se um agente oxidante for usado para realizar o método da presente invenção, o agente oxidante pode ser qualquer composto que é capaz de alterar o estado redox de uma molécula biológica. Mais especificamente, o 15 agente oxidante é uma molécula que tem a capacidade de ser reduzida agindo como um receptor de elétrons para outras moléculas que agem como doadoras de elétrons. Exemplos de agentes oxidantes incluem, mas não estão limitados a, hemina, clorofila, ou outros compostos de anel contendo um metal oxidante forte, e KMnO₄. Tipicamente, quando um agente oxidante for usado, uma 20 mistura do fluido biológico ou extrato e do agente oxidante deve ser incubada por um período de tempo, tipicamente por cerca de um dia ou durante a noite. O agente oxidante deve ser usado em uma concentração suficiente o bastante para alterar a especificidade de ligação de uma proteína que tem uma especificidade de ligação alterável, mas não em uma concentração que possa 25 destruir a proteína. No caso de autoanticorpos, foi verificado que diferentes tipos de autoanticorpos podem interagir diferentemente com diferentes antioxidantes. Por exemplo, para o desmascaramento de autoanticorpos aPC, os resultados são pobres com hemina e muito pobres com KMnO₄.

Se uma corrente elétrica CC for usada para realizar o método

da presente invenção, o método pode ser realizado*por qu&(júêr*ttieíicr de* *·* fornecimento de corrente elétrica, tal como pela imersão de eletrodos positivos e negativos em uma solução condutora contendo a amostra a ser tratada. Tipicamente, uma solução contendo um fluido biológico pode ser 5 exposta a um potencial elétrico de uma grandeza suficiente e de uma duração suficiente para alterar a especificidade de ligação de uma proteína tendo uma especificidade de ligação alterável. Foi verificado que resultados positivos podem ser obtidos pela exposição de uma solução a um potencial elétrico de 6 - 24 volts por poucos segundos até poucos minutos. Como discutivo nos ilO exemplos, uma exposição prolongada a uma corrente elétrica pode resultar na reversibilidade da alteração da especificidade de ligação.

Tentativas de se produzirem resultados positivos usando-se uma corrente AC não têm tido sucesso.

Se estar ligado a uma teoria específica, é preferido, no caso de um autoanticorpo, que o autoanticorpo seja exposto ao agente oxidante ou corrente elétrica em uma quantidade ou por um tempo suficiente para oxidar um sítio de ligação de antígeno em uma porção Fab do autoanticorpo.

Se uma proteína particular de interesse for aquela que tem uma

especificidade de ligação que pode ser alterada pela mudança de seu estado redox, e a eficácia de qualquer conjunto de condições para alteração da especificidade de ligação da proteína particular de interesse pode ser prontamente determinada por ELISA ou outros ensaios ligando-receptor. Tais ensaios podem ser realizados antes e após uma proteína ser submetida a condições redox para ver se o processo alterou a especificidade de ligação da proteína. Por exemplo, o melhor agente oxidante para recuperar um autoanticorpo específico pode ser prontamente determinado por experimentação simples.

Um outro aspecto da presente invenção é a possibilidade de tratamento de um indivíduo tendo uma doença autoimune, ou pela φιο ·₂ο

·· . ζ ·· ·· ·· ♦ · • · · j ··· · · ί · Ζ administração ao indivíduo de uma quantidade dé um* anfioxidattte suficiente* para desativar autoanticorpos no indivíduo ou pela retirada de uma amostra de sangue do indivíduo, pela exposição da amostra de sangue a um antioxidante ou corrente elétrica suficiente para desativar autoanticorpos na dita amostra de sangue, e pelo retomo da amostra de sangue ao indivíduo.

Um outro aspecto da presente invenção é um método de triagem de um fluido biológico ou extrato de um indivíduo normal para determinar quais autoanticorpos são mascarados e assim construir um perfil de anticorpo potencial de autoanticorpos que podem causar a doença autoimune naquele indivíduo se expostos ou não mascarados por oxidação ou força eletromotriz. Por exemplo, em termos gerais, uma amostra de sangue, plasma ou soro de um indivíduo pode ser avaliada para determinar uma quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra. Após, uma amostra de sangue, plasma ou soro do indivíduo pode ser tratada pela exposição da amostra a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica CC, e a amostra de sangue, plasma ou soro do indivíduo pode ser avaliada para determinar uma quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra tratada. Após, a quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra antes da etapa de tratamento pode ser comparada(o) com a quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra após a etapa de tratamento.

Foi verificado que as amostras de sangue, plasma, soro ou Ivlg não tratadas e as amostras de sangue, plasma, soro ou Ivlg tratadas de acordo com o método da presente invenção podem ser liofilizadas e transportadas ou armazenadas. Quando as amostras são reconstituídas, elas retêm sua atividade respectiva.

EXEMPLOS

Na descrição da presente invenção, os seguintes exemplos são dados para ilustrar as aplicações específicas da presente invenção, incluindo o melhor modo conhecido para realizar a invenção. Os exemplos são

• · · ♦ * * I · ’ · apresentados em ordem cronológica aproximada e* asSim, ‘mostram·-uma' *·* progressão no entendimento de componentes e procedimentos requeridos para alcançar os efeitos da presente invenção. Estes exemplos específicos não são voltados para limitar o escopo da presente invenção descrita neste pedido.

Com relação a cada um dos Exemplos 1-17 descritos aqui, a não ser que de outra forma especificado, o seguinte procedimento foi tipicamente usado: Uma amostra de 10 ml de sangue completo ou de 5 ml de soro ou plasma de um indivíduo aPL-negativo e 4-5 ml de células vermelhas do sangue de um mamífero foram adicionadas a um frasco contendo 30 ml de ilO um meio de crescimento de cultura bacteriana da marca Biomerieux (contendo pelo menos os seguintes ingredientes: água destilada, caldo de digestão de feijão soja - caseína, extrato de levedura, dextrose; sacarina; hemina; menadiona (vitamina K3); HCI piridoxal (vitamina B6); e polianetolsulfonato de sódio (SPS) e carvão vegetal. Então, a mistura foi 15 incubada com agitação e chacoalhamento, a 37°C por um período de 18 - 22 horas. Após a incubação e centrifugação, uma amostra do sangue ou soro incubada/RBC foi testada quanto à presença de anticorpos de antifosfolipídeos (aPL) usando um formato aPL ELISA doméstico compreensivo que fornece 24 resultados de teste de aPL separados. O 20 procedimento de teste é descrito em mais detalhes nas seguintes publicações, incorporadas aqui como referência: Wagenknecht DR, et al., The Evolution, Evaluation and Interpretation of Antiphospholipid Antibody Assays, Clinicai Immunology Newsletter, Vol. 15, No. 2/3 (1995) pp. 28-38 and Mclntyre JA, et al., Frequency and Specificities of Antiphospholipid Antibodies (aPL) in

Volunteer Blood, Immunobiology 207(1): 59-63, 2003.

A Figura 1 mostra as 24 especificidades de aPL separadas que foram testadas pelo uso do formato aPL ELISA doméstico compreensivo. Quatro especificidades foram avaliadas, 1) aPS = antifosfatidilserina, 2) aCL = anticardiolipina, 3) aPE = antifosfatidiletanolamina, e 4) =

·· · · · · ; ί I * antifosfatidilcolina. Para cada uma destas especificidades de aPL* tfêSÍStftipos * de imunoglobulina foram pesquisados, IgG, IgA e IgM. Cada especificidade e cada isotipo foram avaliados na presença (dependente) e ausência (independente) de um suplemento de diluente tampão, 10% de plasma bovino adulto (ABP), que contém as proteínas de plasma de ligação com fosfolipídeo) ou 1% de albumina de soro bovino, (BSA, que é desprovido de proteínas de plasma de ligação com fosfolipídeo), respectivamente. A diluição final das amostras de sangue dos indivíduos foi entre 1/50 e 1/100.

Os resultados nas 24 especificidades de aPL obtidos para

vários experimentos descritos aqui são dados nas figuras em anexo. As verificações positivas/negativas são expressas em múltiplos das médias (MoM) com base nas amostras de plasma de teste de 775 doadores de sangue normais, como descrito em Mclntyre JA, Immunobiology, acima. A presença de +++ indica forte atividade de anticorpo. Os marcadores de + e ++ indicam baixa e intermediária atividade de anticorpo, respectivamente. As figuras também fornecem os valores de faixa normal para cada especificidade de aPL e combinação de isotipos.

Um resultado positivo na coluna indicado como proteína de ligação aPL dependente significa que o anticorpo de antifosfolipídeo (aPL) 70 está realmente se ligando a uma proteína de plasma que inicialmente se ligou aos fosfolipídeo particular indicado. Proteínas de plasma que tipicamente podem estar ligadas por PS e CL incluem as seguintes: beta₂-glicoproteína I, protrombina, proteína C, proteína S, anexina V, e componentes complementares Fator H e C4 (ver, por exemplo, Mclntyre, J.A., 25 Wagenknecht DR, and Faulk, W.P., Antiphospholipid Antibodies: Discovery, definition, detection and disease. Prog. Lipid Res. 42(3): 176-237, na página 182). A natureza fisiológica da ligação de proteína de plasma não é conhecida precisamente para todos os fosfolipídeos, mas tal ligação é ensinada incluir mudanças conformacionais na estrutura de proteína de plasma, desta forma • · · · » » * *(* c expondo epitopos novos ou ocultos que então * sãô alVdj^dôS* pelos* ’· autoanticorpos do indivíduo. Proteínas de plasma que tipicamente podem estar ligadas por PE de fosfolipídeo incluem as seguintes: quininogênios de alto e baixo peso molecular, e fator IX e precalicreína. As duas últimas 5 proteínas podem ser detectadas e virtude de sua fidelidade na ligação a quininogênio de alto peso molecular. As proteínas de plasma que se ligam a PC não foram ainda definidas. Em certos experimentos, aPL independentes de proteína de plasma são observados (ver Figura 3). Uma possível explicação para esta atividade é que ela representa a presença de proteínas de plasma de |10 ligação com fosfolipídeo residuais que estão presentes na amostra de sangue original.

Exemplo 1

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento descrito acima. Os resultados do 15 ELISA de aPL são mostrados na Figura 2. Como mostrado na Figura 2, a amostra de sangue incubada mostra uma presença dramática de atividade e autoanticorpo, em comparação com sangue normal e não tratado mostrado na coluna de normais. Em particular, forte atividade de autoanticorpo é mostrada

na categoria dependente de proteína para aPS (IgG_, aCL (todos isotipos), e aPE (IgG). Pouca ou nenhuma atividade de autoanticorpo de aPC IgG foi uma descoberta característica nos exemplos iniciais e nos procedimentos em que hemina foi usada como o agente oxidante. Este resultado indica que autoanticorpos para PC, especialmente do isotipo IgG são diferentes e talvez não se tomem ativados da mesma forma que fazem os outros. Nos últimos experimentos, foi verificado que níveis significativos de um aPC podem ser detectados em amostras que foram tratadas com KMnO₄ (dados não mostrados).

Exemplo 2

As amostras de sangue retiradas de 7 indivíduos saudáveis foram incubadas e testadas de acordo com o procêdimênto*desôrittr arama· ·Είη *·* particular, os sangues de todos os 7 indivíduos foram retirados dentro de um período de 20 minutos e incubados por 20 horas em condições idênticas. A Figura 3 é uma tabela compósita que mostra faixa de uma soroconversão de 5 aPL para estas sete amostras. Estes resultados mostram que há variações nos níveis de aPL detectados bem como nos isotipos presentes dentre os diferentes indivíduos. Contudo, como mostrado pela invenção, cada indivíduo tinha anticorpos de aPL que podem ser detectados após a incubação.

Exemplo 3

Em um primeiro experimento, uma amostra de soro de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima. Na mistura de incubação, células vermelhas de sangue de cavalo (RBC) foram usadas ao invés de RBC humano. Os resultados do ELISA de aPL são mostrado na Figura 4. Como mostrado na Figura 4, uma atividade de aPL significativa foi obtida, particularmente com relação a aPS (IgG e IgM) e aCL (IgA e IgM).

Em um segundo experimento, soro de cavalo, ao invés de soro humano, foi incubado com RBC humano e testado de acordo com o

procedimento básico descrito acima. Os resultados do ELISA de aPL são mostrados na Figura 5. Como mostrado na Figura 5, uma atividade de aPL não foi obtida. (O ensaio ELISA usado neste experimento utilizou sondas de anticorpo rotuladas com fosfatase alcalina específica para anticorpo humano para detectar aPL, se a amostra incubada que continha aPL de cavalo é desconhecida).

Os resultados mostrados sumarizados nas Figuras 4 e 5 inequivocamente demonstram que todos aPL que são obtidos durante o processo de soroconversão da presente invenção se originam do soro humano e não são liberados do RBC humano, pois o primeiro experimento usa RBC de cavalo, que são desprovidos de anticorpos humanos, em lugar de RBC • · · · • · · • * * humano, e ainda mostra resultados positivos,* entfuarito qtico^gúnd®* ’·* experimento usa soro de cavalo na presença de RBC humano e mostra resultados negativos.

Exemplo 4

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a exceção de que a incubação foi realizada à temperatura ambiente (22°C), ao invés de em uma temperatura elevada. A Figura 6 mostra que a amostra não se submeteu à soroconversão quando incubada à temperatura ambiente. Estes resultados sugerem que o processo de soroconversão pode ser sensível à temperatura.

Exemplo 5

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a característica de que contas (de plástico) Degalan de 0,7 mm foram usadas como o sólido particulado na mistura de incubação ao invés de carvão vegetal. Uma vez que o carvão vegetal foi usado em experimentos iniciais mostrando soroconversão, este experimento foi realizado para determinar se o carvão vegetal exerce um papel específico na soroconversão. A Figura 7 mostra que a amostra exibiu soroconversão mesmo quando contas de plástico foram usadas em lugar de carvão vegetal. Estes resultados sugerem que o papel do carvão vegetal é mecânico ao invés de químico, in natura, e que qualquer sólido particulado, tal como contas de plástico, resina ou vidro, podem ser usado. Se estar limitado a qualquer teoria particular, pode ser teorizado que o componente particulado age como um abrasivo na membrana de RBC, provavelmente causando a liberação do íon de NO do RBC, ou por interação com a proteína RBC AE1 / Banda 3 ou com as moléculas de transição de hemoglobina SNO ou ambas. A possibilidade de abrasão mecânica é suportada pela observação no Exemplo 6, em que os resultados

• · · • · · • · · · * · negativos do ensaio são mostrados para uma mis*tura *de ihcubfaçáô qtreiíão* é* balançada ou chacoalhada. Os sólidos particulados podem também servir como uma função mecânica de auxílio de liberação de autoanticorpo.

Exemplo 6

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a exceção de que a mistura de incubação foi mantida estacionária, ao invés de ser chacoalhada ou balançada. A Figura 8 mostra que a amostra não se submeteu à soroconversão quando ela foi mantida estacionária. Estes resultados 10 sugerem que o movimento pode facilitar a interação entre as partículas sólidas e RBC. As condições de incubação estacionária não facilitaram a liberação de aPL, embora uma pequena quantidade de movimento, tal como produzido por transporte das amostras para o incubador, pode produzir pequenas quantidades de liberação de aPL.

Exemplo Ί

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a característica adicional de que, após a incubação e remoção de RBC e de

carvão mineral por centrifugação, a mistura de incubação foi aquecida até 56°C por 30 minutos. A Figura 9 mostra que a quantidade de aPL detectada foi significativamente aumentada por este procedimento.

Exemplo 8

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a característica adicional de que um meio de crescimento de cultura bacteríana de um diferente fornecedor (Becton Dickinson, Sparks, MD) foi usado no lugar do meio de crescimento de cultura bacteríana da Biomwerieux. A Figura 10 mostra que a amostra exibiu soroconversão no meio de Becton Dickinson, indicando que o método da presente invenção não é dependente do meio de

·· · ·· • · ·· • · «· crescimento de cultura bacteriana de uma fonte particular. ·

Exemplo 9

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a 5 característica adicional de que a incubação ocorreu sob condições anaeróbicas (sob nitrogênio) ao invés de sob condições aeróbicas (na presença de oxigênio e CO₂). A Figura 11 mostra que a amostra exibiu soroconversão mesmo sob condições anaeróbicas e que o método da presente invenção não é dependente de um ambiente aeróbico.

Exemplo 10

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com a característica adicional de que as células K562 (uma linhagem celular com tumor hematopoiética humana) foram usadas ao invés de células vermelhas do sangue. Além disso, somente 11,3 milhões de células K562 estavam presentes no meio de cultura, comparado a 3-4 ml de RBC compactada tipicamente usadas no método da presente invenção. A Figura 12 mostra que a amostra exibiu soroconversão.

Outros experimentos têm mostrado que as amostras que são incubadas com outros tipos de células isolados, linfócitos, monócitos e neutrófilos tipicamente não exibem uma soroconversão de aPL. Em particular, célula brancas do sangue das séries linfóide e mielóide não suportaram uma liberação de aPL, nem uma linhagem celular de linfócitos B de porco designados como LI4 (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que hemoglobina pode ser um componente chave na mistura de incubação, uma vez que células K562 e RBC contêm hemoglobina, enquanto que lifócitos, monócitos e neutrófilos não.

Exemplo 11

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descritô acima, Vóm a «exceção* *·* de que o meio de crescimento de cultura de bactérias foi substituído com um meio de cultura de bactérias usado para crescer células humanas: RPMI. A Figura 13 mostra que a soroconversão não ocorreu. Este experimento mostra a importância de algum ingrediente no meio de cultura de bactérias para o propósito da presente invenção. Embora RPMI seja um meio de cultura projetado para células humanas, ele não suporta liberação de aPL quando substituído por caldo de frasco. A listagem e as comparações dos ingredientes nos dois caldos de frasco de microbiologia diferente com RPMI mostram que o RPMI não tem hemina e menadiona (uma provitamina K feita pelo homem) chamada vitamina K3. É sabido que hemina é um quelante de porfirina de ferro (Fe+++) derivado de RBC, e menadiona é uma vitamina solúvel em gordura. Isto indica que as reações de redox podem exercer um papel na liberação de autoanticorpos.

Exemplo 12

Uma amostra de sangue de cordão de placenta foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima. O sangue de cordão de placenta foi retirado após o nascimento do bebê, mas antes da placenta ser destacada da parede uterina. Nem o sangue da mãe nem o sangue ^^20 do cordão do bebê mostraram a presença de aPL em ensaios de laboratório convencionais. Quando processado de acordo com a presente invenção descrita aqui, anticorpo de aPL forte foi demonstrado estar presente nas amostras de sangue do cordão, como mostrado na Figura 14. Os anticorpos foram somente IgG, uma observação que é compatível com anticorpos de origem materna. Como a mãe transporta IgG para o feto antes do nascimento, este experimento parece indicar que os autoanticorpos matemos mascarados transportados para o feto por meio de receptores de Fcy especializados no trofoblasto (FcyRn) permanecem mascarados pelo feto no sangue fetal. Como o sangue da mãe e o sangue do cordão foram mostrados ser aPL-negativos

antes da soroconversão pelo método da presente invenção, e cbftíô úãt) tíavía* *·* imunoglobulinas de IgM ou IgA detectadas, estas verificações suportam a contenção de que os IgG aPL observados no sangue de cordão subseqüentes à soroconversão são matemos de origem. Também é de interesse que o trofoblasto que expressa o FcyRn não expressa antígenos de HLA.

Exemplo 13

Uma amostra de plasma de um indivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima; com a característica de que nitroprusida de sódio (SNP, 200 micromolar) foi usada 10 no lugar de RBC na mistura de incubação. A Figura 15 mostra que a amostra exibiu soroconversão.

Como SNP é um doador de óxido nítrico (NO) potente, estes resultados fornecem evidência de suporte de que o radical NO está envolvido na liberação de autoanticorpo e também suportam a teoria de que RBC e 15 particulados sólidos fazem um papel de fornecer a doação de NO- das RBC.

Outras reações mediadas por radicais livres fora da nitroprusida de sódio podem também causar a liberação de autoanticorpos.

Exemplo 14

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada de acordo com o procedimento básico descrito acima e testada quanto à atividade anticoagulante de lupus. O anticoagulante ou inibidor de lupus é outro tipo de aPL e é tipicamente detectável somente por ensaios de laboratório funcionais. Os resultados na Figura 16 mostram um forte anticoagulante de lupus (LA) no sangue soroconvertido retirado de um 25 indivíduo negativo inibidor de lupus e processados pelo método da presente invenção. Enquanto inicialmente corrigido pela adição de plasma normal ao caldo soroconvertido no ensaio dRWT, a incubação por 1-2 horas resultou na nova aparição do inibidor. Este espaço de tempo é proposto como o tempo que leva para os anticorpos não mascarados ou LA se ligarem às proteínas de • · · · • · ··· · · * * · · · * « • · * * *« u

• · • « plasma de ligação com fosfolipídeos relevantes Introduzidas pelv estado» da* ·· · *

• · mistura. Também há a possibilidade de deficiências de fator de coagulação uma vez que uma mistura 1:1 fornece níveis suficientes de fatores de coagulação para corrigir os tempos de coagulação em uma amostra deficiente 5 de fator. O tempo de protrombina diluída (dPT) não corrigiu na presença de plasma normal e prolongação aumentada de tempos de coagulação foi observada após a incubação com plasma normal, o que é indicativo de um forte inibidor de lupus.

Exemplo 15

As amostras de sangue de cinco indivíduos normais foram incubadas de acordo com o procedimento básico descrito acima e testadas quanto à microscopia de fluorescência quanto à presença de outros tipos de autoanticorpos. As amostras de soro e plasma destes cinco indivíduos foram negativas antes do processamento de acordo com os ensinamentos da presente 15 invenção. A Figura 17 lista especificidades de autoanticorpos adicionais identificadas pelo uso da linhagem de células Hep-2. Identificadas foram antinucleolares (associados com escleroderma), anti-laminas (muito brilho em poros nucleares), anti-mitocondriais (citoplásmicos), e anti-centríolo. Os ' resultados mostram que autoanticorpos liberados pelo método da presente invenção podem também ser detectados por diferente metodologia de detecção, microscopia de fluorescência, como oposto pelo teste baseado em

ELISA. Os resultados confirmam que muitos tipos de autoanticorpos além de aPL são mascarados no sangue de indivíduos cujo soro e plasma são negativos no teste para estes anticorpos nas análises de laboratório de rotina.

Destes resultados, pode ser esperado que muitas especificidades de autoanticorpos podem ser verificadas testando-se sangues processados pela presente invenção.

Exemplo 16

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubada *

de acordo com o procedimento básico descrito* acifna *e testaâa «quanto *à «

» «

reatividade usando-se citometria de fluxo e anticorpos IgG anti-humanos conjugados fluorescentes. Um teste comparativo foi feito com soros humanos normais agrupados não tratados (NHS), com soro do mesmo indivíduo normal usado com a presente invenção e com soros de humanos de controle positivos. (O sangue tratado não mostrou nenhuma auto-reatividade com linfócitos e neutróíilos; estes dado não são mostrados). A Figura 18 mostra um perfil de

espalhador dianteiro (tamanho) e um perfil de espalhador lateral (granularidade) da população de células de monócitos de indivíduos normais como definido por citometria de fluxo. Esta população de células de monócitos foi confirmada mostrando-se a reatividade com anticorpos monoclonais CD 14. A Figura 19A mostra a reatividade anti-monócito com

NHS. A reatividade média mostrada é 743,20 em uma escala linear. A Figura

19B mostra a reatividade autoanti-monócito do soro de um indivíduo normal;

este indivíduo não tem atividade de anticorpo para monócitos autólogos. A reatividade do meio mostrada é 737.00. A Figura 19C mostra a atividade de autoanti-monócito de uma amostra de sangue do indivíduo mostrado na Figura 19B após ser tratada de acordo com o método da presente invenção. O valor médio mostrado é 864,00, indicando atividade autoanti-monócito forte.

Apesar do fato de que o plasma processados de acordo com os ensinamentos da presente invenção foi usado em uma diluição de 1/8, ele mostrou mais reatividade com monócitos do que os soros de controle positivos não diluídos. Assim, este exemplo mostra que as amostras de sangue ou soro processadas de acordo com o método da presente invenção liberam autoanticorpos que especificamente alvejam monócitos. Os mesmos resultados foram documentados para quatro amostras adicionais de outros indivíduos quando processadas de acordo com os ensinamentos da presente invenção.

Exemplo 17

Testes comparativos quanto à presença de anticorpos anti· ·· · * · » · : ·*· '·: » · ? x **· j j · · j ·· nucleares (ANA) usando um ensaio de triagem *RELTSA ftfram realimdôe* V em soro de sangue de cordão não tratado; sangue do cordão incubado de acordo com o método da presente invenção, sem balanço; sangue de cordão tratado de acordo com o método da presente invenção, com balanço; soro não

tratado de um doador saudável ANA-negativo (identificado como ACS) e soro do mesmo doador saudável ANA-negativo que foi incubado de acordo com o método da presente invenção. Como mostrado na Figura 20, uma quantidade significativa de ANA foi identificada em amostras de sangue do cordão e de soro que foram tratadas pelo método da presente invenção. Dos resultados nas Figuras 16 e 17, pode ser esperado que muito mais especificidades de autoanticorpo sejam encontradas testando-se sangues processados pela presente invenção.

Exemplo 18

Para entender o papel de células vermelhas do sangue no fenômeno de liberação de autoanticorpo, experimentos foram designados para substituir as células vermelhas do sangue com ingredientes mais simples que podem imitar a ação das células vermelhas do sangue. No presente

experimento, as células vermelhas do sangue e carvão vegetal foram substituídos com nitroprusida de sódio (SNP) e cloreto férrico. Esta substituição foi feita porque a nitroprusida de sódio é um potente produtor de óxido nítrico, e é conhecido que RBC são carreadoras de NO. Cloreto férrico (solução de carga de FeC13, 25 uM) foi adicionado como um substituto para o ferro na hemoglobina.

Frascos de cultura contendo o meio de crescimento de cultura bacteriana e 5 ml de plasma ou soro humano e concentrações variadas de nitroprusida de sódio (SNP, 200 pm) e cloreto férrico exógeno (concentração final de 4,1 pm) foi usado em lugar de células vermelhas do sangue e carvão mineral, foram incubadas a 37°C e então aquecidas a 56°C por 30 minutos. As amostras mostraram soroconversão de aPL, mas somente IgG (dados não

Os resultados sugerem que NO pode estar envolvido no mostrados).

* « • · · • « · « • V ·· • · • ··« • · · desmascaramento do anticorpo, e sugerem que a ação mecânica de um material em fase sólida no frasco de cultura rompe as células vermelhas do 5 sangue e libera NO. Altemativamente, a liberação ou modificação de NO pode possibilitar que a molécula de hemoglobina participe em reações redox.

Exemplo 19

Em um esforço para determinar se o efeito de desmascaramento de autoanticorpos foi devido à quebra de estruturas '10 macromoleculares contendo autoanticorpos dentro do soro ou sangue ou se foi devido a mudanças diretas na especificidade de ligação de anticorpos por si próprios, uma série de experimentos foram realizados nos quais imunoglobulina intravenosa (Ivlg) comercial foi substituída para o plasma ou soro humano. Ivlg comercial é uma fração precipitada de álcool de plasma 15 agrupada de múltiplos doadores, tipicamente de 1.000 - 10.000 doadores.

Tipicamente, Ivlg contém primariamente IgG, e é desprovido de IgA, IgM e outras proteínas de plasma. Quando Ivlg não tratada é testada quanto à presença de autoanticorpos pelo teste ELISA, os resultados do teste são I negativos. Por causa de sua maneira de preparação, Ivlg é também livre de 20 micelas de proteína, vesículas ou outras estruturas macromoleculares.

Portanto, se Ivlg foram positivas no teste quanto à presença de autoanticorpos após um tratamento de incubação, chegar-se-ia à conclusão de que os autoanticorpos foram obtidos por uma alteração de anticorpos IgG já presentes na preparação de Ivlg e não pela quebra das estruturas ou vesículas 25 que escondem os autoanticorpos.

Nos exemplos que se seguem, a preparação comercial de Ivlg usada foi Ivlg liofilizada (Immune Globulin Intravenous (Human) GammarPI.V., Aventis Behring, Kankakee, Illinois).

Uma preparação comercial de 5 gramas de Ivlg liofllizada foi

• ······· · · · · · reconstituída em solução salina estéril tamponadá com fosfato 1Ô0*·* *·’ mg/ml). 1,7 ml da solução de Ivlg reconstituída foram adicionados a um frasco de cultura contendo o meio de crescimento de cultura bacteriana (sem células vermelhas do sangue ou carvão mineral) e foi incubada a 37°C por 20 horas. A mistura incubada mostrou soroconversão e a presença de aPL IgG (dados não mostrados). (Como esperado, somente IgG foi detectado, nem IgA

nem IgM).

Em experimentos similares, autoanticorpos foram detectados

em uma mistura que foi incubada à temperatura ambiente em um frasco com ^10 agitação, mas os resultados não foram tão bons quanto a 37°C (resultados não

mostrados).

O aquecimento da mistura do meio de crescimento de cultura

de bactéria Ivlg acima de 37°C não resultou em outros aumentos nos autoanticorpos.

Como um controle, Ivlg do frasco foi testado quanto aPL e outros autoanticorpos, e os resultados foram negativos.

Exemplo 20

No Exemplo 19, é mostrado que autoanticorpos podem ser | obtidos pela incubação de uma preparação de Ivlg comercial em um meio de 20 crescimento de cultura bacteriana. A próxima etapa foi tentar determinar quais os ingredientes no meio de crescimento de cultura bacteriana que exercem um papel na produção de autoanticorpos detectáveis.

Primeiro, Ivlg em um caldo de soja tríptica a 2% (TSB), (que contém peptonas em uma relação de 17 para 3 de produto digerido 25 pancreática de caseína para produto digerido de papaia de soja, respectivamente) (o restante sendo água) foi incubado a 37°C por 20 horas com agitação. A mistura incubada foi testada quanto à presença de aPL, e o resultado foi negativo.

Depois, Ivlg foi incubada em uma tubo de teste em caldo de • · ♦ • · · soja, nitroprusida de sódio (SNP) e hemina (umâ prütopbrfirfnâ^tcTfttefLtfo · ferro (férrico)) a 37°C por 20 horas com agitação. As quantidades usadas foram 60 microlitros de Ivlg, 5 microlitros de SNP e 5 microlitros de hemina em um total de 1 ml de caldo de soja. A mistura incubada positiva no teste quanto à presença de aPL, particularmente aPS (15 MoM) e aPE (41 MoM) (dados não mostrados).

Exemplo 21

Uma série de experimentos foram conduzidos para determinar

se a incubação com hemina sozinha seria suficiente para causar a aparição de autoanticorpos em Ivlg ou no plasma ou soro.

Ivlg liofilizada reconstituída (em uma concentração de 100 mg/ml) foi adicionada a e incubada em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) com hemina por 20 horas a 37°C. As quantidades usadas foram

300 μΐ de solução de Ivlg e 5 μΐ de uma solução de hemina (75 ug) e um volume total de 1 ml.

Como mostrado na Figura 21, a mistura incubada mostrou quantidades significativas de aPS e aPE IgG, e, em uma menor extensão, AcL

Quando o soro ou plasma foram incubados com hemina sob condições similares, nenhum autoanticorpo foi detectado.

Exemplo 22

O fato de que resultados positivos quanto à presença de autoanticorpos podem ser obtidos quando Ivlg foi incubado com hemina, enquanto que resultados negativos foram obtidos quando soro ou plasma foi 25 incubado com hemina, sugeriu que o soro ou plasma pode conter substâncias que inibem ou interferem no processo de obtenção de autoanticorpos.

Em uma série de experimentos, Ivlg foi incubada em um tampão Tris com hemina, por 20 horas a 37°C, similar ao processo do Exemplo 21, com a característica adicional de que uma quantidade aumentada de soro humano foi adicionada às bateladas antes dá incrtbaÇão. Catfá báfèlàtfa em separado foi testada quanto à presença de autoanticorpos de aPS, aCL, aPE e aPC, e os resultados são mostrados na Figura 22. Os resultados mostrados na Figura 22 demonstram que quantidades crescentes de soro não tiveram um efeito inibidor na liberação de anticorpos antifosfolipídeo. Resultados similares foram mostrados com a substituição de soro por plasma (dados não mostrados). Uma possível explicação para estes resultados é que hemina, que contém uma molécula de ferro no estado férrico e que é

conhecida como um agente oxidante ativo, pode agir para oxidar um sítio de ligação de certas moléculas de imunoglobulina de forma que o sítio de ligação alterado seja capaz de se ligar a autoantígenos.Este processo pode ser inibido por substâncias, talvez antioxidantes, no sangue.

Exemplo 23

Soro humano (do inventor) foi diluído 1/10 em um tampão

Tris. Em uma série de experimentos, este soro diluído, em bateladas de 1 ml, foi incubado com quantidades aumentadas de hemina, especificamente, 0 μΐ, μΐ, 25 μΐ e 50 μΐ. (Previamente, foi verificado que a hemina por si só não

era suficiente para causar a liberação de autoanticorpos do sangue ou soro, embora fosse suficiente para causar tal liberação de Ivlg. Portanto, o propósito de diluição do soro era diluir o efeito de quaisquer substâncias interferentes encontradas no sangue, tais como antioxidantes). As bateladas foram testadas quanto à presença de autoanticorpos de aPS, aCL, aPE e aPC, e os resultados são mostrados na Figura 23. Os resultados mostrados na

Figura 23 demonstram que nenhuma quantidade significativa de 25 autoanticorpos foi detectada no soro diluído quando 0 ou 10 μΐ de hemina são adicionados, quantidades significativas são detectadas com 25 μΐ de hemina.

Por uma razão desconhecida, as quantidades de autoanticorpos detectados foram menores que 50 μΐ de hemina.

Exemplo 24

A próxima série de experimentos íbi* ·*desígn^da· ·pára * · ’ determinar se um antioxidante, tal como Vitamina C, que está presente no sangue, inibiría a liberação de autoanticorpos. Em uma série de experimentos, Ivlg foi incubada em um tampão Tris com hemina, com a característica 5 adicional de que uma quantidade aumentada de ácido ascórbico (Vitamina C) foi adicionada ao tampão contendo hemina e deixado misturar por 30 minutos antes da adição do Ivlg e antes da incubação. Como mostrado na Figura 24, houve cerca de 78% de inibição de liberação de aPE induzida por hemina com • 1 mg de Vitamina C, uma quantidade que representa uma concentração ^^10 fisiológica de Vitamina C. Há uma curva bifásica com liberação de aPS, que aumenta a possibilidade da Vitamina C, em baixas concentrações, aja como um agente oxidante, mas se tome um agente antioxidante (redutor) em altas concentrações.

Exemplo 25

A próxima série de experimentos foi designada para determinar se o veículo em que a hemina é dissolvida tem um impacto nos resultados obtidos e se o átomo de ferro na hemina é necessário. Em uma

série de experimentos, Ivlg foi incubada em um tampão Tris com hemina, ou cm outros aditivos. Em particular, em um exemplo, a hemina foi solubilizada com NaOH. Em outro exemplo, foi solubilizada com DMSO. Em outros exemplos, hematoprofirina IX (hpIX), que é a mesma molécula que a henina, mas sem o Ferro (Fe+++), foi usada no lugar de hemina e foi solubilizada com NaOH ou DMSO Em outros exemplos, NaOH e DMSO foram testados como controles (sem hemina ou hpIX). Como mostrado na Figura 25, o uso 25 de hemina foi solubilizada com NaOH produziu resultados positivos quanto à presença de autoanticorpos, enquanto que hemina + DMSO, hpIX + NaOH, hpIX + DMSO, NaOH sozinho, e DMSO sozinho não produziram resultados positivos.

Exemplo 26

Para também se estabelecer que a fiemina estava cãusándv-a

oxidação de anticorpos, quantidades equimolares de hemopexina (Hpx) foram adicionadas à mistura de Ivlg PBS hemina. Hpx é uma molécula antioxidante com uma afinidade de ligação extraordinariamente alta para ferro. Hpx

lioflizado comprado da SciPac (Kent, Inglaterra) foi reconstituído em PBS a 10 mg/ml. Mostrados na Fig. 26 são os dados redox de aPS resultantes da adição de concentrações aumentadas de hemina à IvIgG contada com a adição de concentrações equimolares de Hpx. Como há uma interação de ligação 1:1 entre hemina e Hpx, o Hpx não foi capaz de negar a capacidade redox do íon férrico presente na hemina.

Exemplo 27

Para ilustrar a ampla faixa e atividade de autoanticorpos que podem ser obtidos por um tratamento de oxidação de Ivlg, uma série de

Western blots foram ajustadas usando-se lisatos de célula a partir de 3 15 linhagens de célula diferentes usando Ivlg tratada com hemina ou Ivlg não tratada como anticorpos primários e usando um conjugado rotulado com HRP anti-humano como um controle (HRP = peroxidase de raiz forte). As manchas

são mostradas na Figura 27. O lisato B é uma linhagem de células de linfócito chamada Raja de um paciente com um linfoma. O lisato T é uma linhagem de células derivadas de linfócito chamada Jurkat de um paciente leucêmico. O lisato U87MG é uma linhagem de células de blasto de glioblastoma (câncer no cérebro). Os lisatos reduzidos foram passados no gel em uma concentração de 50 mg/ml. Para se obter a preparação de Ivlg tratada com hemina, 75 pg de hemina foram combinados'com 1 ml de PBS contendo

6 mg de IvIgG. A incubação foi por 20 horas a 37 graus. Na Figura 27, a mancha em que a Ivlg tratada com hemina foi usada como os anticorpos primários é rotulada Teste IgG; a mancha em que Ivlg não tratada foi usada como os anticorpos primários é rotulada Controle, e a mancha na qual o conjugado rotulado com HRP anti-humano foi aplicada sem anticorpos

primários é rotulada Secundária”. As preparações dè ÔgG tratadas* eõm’·* *·* hemina e não tratadas foram diluídas 1/1000, respectivamente. O conjugado rotulado com HRP anti-humano foi usado em juma diluição de 1/5000.

Estes dados claramente mostram que a Ivlg tratada com hemina tem atividade abundante em relação aos componentes celulares humanos em comparação com IvIgG não tratada e ao controle conjugado, que não têm.

Exemplo 28

O próximo experimento foi realizado para determinar se os agentes oxidantes, exceto hemina, e, em particular, agentes oxidantes que não contêm ferro, seriam eficazes no desmascaramento de autoanticorpos. Uma mistura de 25 μg de permanganato de potássio (KMnO₄) em uma concentração de 100 μΜ, e 2 mg de Ivlg em um volume total de 1 ml de solução salina tamponada cm fosfato foi incubada durante a noite a 37°C. Na mistura incubada, aPC e aPS podem se detectados. aCL foi usualmente detectado, mas não aPE (dados não mostrados). Foi mais tarde determinado que uma razão do aPE não ser detectado é porque o KMnO₄ altera o antígeno de fosfolipídeo de PE usado no teste ELISA.

I Exemplo 29

Após se mostrar que os autoanticorpos podem ser desmascarados por reações de oxidação, a próxima questão foi se os métodos eletroquímicos, tais como uma força eletromotriz de uma bateria, pode alcançar o mesmo efeito.

Ivlg foi dissolvida em uma solução salina tamponada cm fosfato, e, em experimentos separados, eletrodos de aço galvanizado, cobre, ou aço inoxidável foram conectados aos terminais positivo e negativo de uma bateria de 9 Volts e foram submersos na solução por 1- 2 minutos. Durante este período, borbulhamento foi notado na solução e a solução de PBS mudou de cor (azul quando os fios de cobre foram usados, marrom quando fios de

aço inoxidável foram usados e verde quando • ······· · ♦ · · · fios tle aÇo galvaÂi2àUd*fofãfrÍ * usados). Como mostrado nas Figuras 28A e 28B, a solução tratada foi positiva no teste quanto à presença de autoanticorpos aPS, aCL, aPE, e aPC, em um teste dependente de aPL, e positiva quanto à presença de autoanticoipos aPS, aCL, aPE, e aPC em um teste independente de aPL.

Exemplo 30

Para evitar a interação de metais com a solução e, desta forma, determinar o efeito somente de uma corrente elétrica, eletrodos de grafite

foram usados nos lugar dos eletrodos de metal. Grafite é inerte, mas é capaz de passar elétrons em soluções condutoras sem participação de nas reações.

Ivlg foi dissolvida em uma solução salina tamponada cm fosfato, e os eletrodos de grafite conectados aos terminais positivo e negativo de uma bateria de 6-Volts foram submersos na solução por 60 segundos.

Como mostrado na Figura 29, a solução tratada foi positiva no teste quanto à presença de autoanticorpos aPS, aPE, e aPC.

Exemplo 31

Nos experimentos que envolvem a aplicação de corrente elétrica a soluções de Ivlg em solução salina tamponada com fosfato, um aumento significativo no pH foi notado, possivelmente devido à formação de

NaOH. De forma a manter as reações nos níveis de pH fisiológico, um meio de cultura de células, RMPI, foi substituído com a solução salina tamponada com fosfato.

A próxima série de experimentos foi realizada para determinar os efeitos do tempo de exposição à corrente elétrica no desmascaramento de 25 autoanticorpos. Ivlg foi dissolvida em RMPI, um meio de cultura de células e eletrodos de grafite conectado aos terminais positivo e negativo de uma bateria de 6-Volts foram submersos na solução por uma quantidade de tempo variável. Como mostrado na Figura 30, a liberação máxima d aPL dependente foi obtida após 60 segundos de exposição à corrente. Curiosamente, entre 2

* · · · · · minutos e 4 minutos, a quantidade de aPL diminuiu‘ou dfcsaparecêtf.*· ·

Exemplo 32

Como o experimento prévio tinha mostrado que os anticorpos de aPL podem ser obtidos de Ivlg após a exposição a uma 5 corrente elétrica, mas que os anticorpos de aPL desapareceram após outra exposição à corrente, a próxima questão foi se o desmascaramento de autoanticorpos pode ser revertido por uma corrente elétrica. Isto é, pode um soro de controle positivo ser tratado de forma que os autoanticorpos não

sejam mais detectáveis.

Em experimentos separados, um soro de controle positivo de aCL, em uma diluição de 1:400, um soro de controle positivo de aPE, em uma diluição de 1:750, e aPS em uma diluição de 1:400 foram expostos a uma corrente elétrica pela imersão de eletrodos de grafite conectados aos terminais positivo e negativo de uma bateria de 6-Volts por até 240 segundos. Como 15 mostrado nas Figuras 31A - 31C, cada soro de controle se tomou negativo para sua respectiva especificidade.

Exemplo 33

Com base nos resultados do Exemplo 32, a próxima questão que foi feita foi ser os autoanticorpos de um paciente tendo uma doença 20 autoimune podem ser remascarados se o soro do paciente foi exposto a uma corrente elétrica. O soro de um paciente tendo elevados níveis de aPS e aCL foi diluído 1/400 com uma solução salina tamponada com fosfato (a diluição em PBS foi em uma quantidade que alcançaria um valor de OD de 1,000 em 10-15 minutos) e eletrodos de grafite conectados aos terminais positivo e 25 negativo de uma bateria de 6-Volts foram submersos na solução por uma quantidade variável de tempo. Como mostrado na Figura 32, a quantidade de aCL e aPS detectável nas amostras do soro do paciente autoimune diminuiu significativamente após 30 segundos e não foi mais detectada após 2 minutos. Estes experimentos foram repetidos para anticorpos de outros pacientes e o

99 • ·* • ·· • · · mesmo resultado foi obtido (dados não mostrados).

Exemplo 34

Em um experimento anterior, uma amostra de sangue de um paciente que tinha uma IgA aPE de título muito específica e alta foi exposta a hemina em um frasco de cultura microbiológica de rotina, Foi observado que após a exposição à hemina, a IgA aPE desapareceu, e a emergência de IgG aPS, aCL e mais espetacularmente, IgG aPE foi detectada no ELISA de aPL. No tempo, uma explanação para este fenômeno não foi prontamente aparente.

Com a verificação de um processo de desmascaramento mais rápido usando corrente elétrica, se tomou possível confirmar os resultados prévios com outro paciente que tem um alto aPE. Neste experimento, o soro de um paciente que tem um alto aPE foi diluído em PBS por 1/75 e eletrodos de grafite conectados aos terminais positivo e negativo de uma bateria de 6Volts foram submersos na solução por uma quantidade variável de tempo. Como mostrado na Figura 33, o aPE se tomou indetectável (mascarado) dentro de 30 segundos de aplicação de uma corrente CC de 6-volts, com um desmascaramento concomitante e detecção de um aPS e aCL IgG. aPL novamente desmascarado teve pico em tomo de 30 segundo somente para se tomar mascarado novamente após 2-4 minutos de exposição.

Um importante aspecto técnico englobado pelo experimento acima foi que o aPE do paciente foi tratado separado do diluente de proteína de plasma usado no ensaio, no presente caso, 10% de plasma bovino adulto (ABP). Em outros experimentos não mostrados, os soros dos pacientes diluídos foram expostos a condições de EMF de 6-volts antes da adição das proteínas de plasma usadas no diluente no ELISA. O aspecto importante destes experimentos foi mostrar que os efeitos de EMF foram sendo aplicados aos anticorpos dos pacientes e não a mudanças de EMF nas proteínas de plasma usadas no diluente.

Estes dados experimentais suportam as observações de que as

• · · ♦ ·«♦ · · φ reações redox estão determinando a aparição è o •de^parêcimeiÃo ·Ββ diferentes especificidades de anticorpos. O que também foi aprendido destes experimentos é que os efeitos redox parecem estar limitados ao(s) sítio(s) de ligação de anticorpo, a porção Fab da molécula de anticorpo. Isto é porque os conjugados rotulados com anticorpo anti-humano heterólogos usados no ELISA não são afetados conforme os conjugados continuam a reconhecer os diferentes alvos de cadeia pesada de anticorpo (porções Fc) das moléculas de

anticorpo. Assim, como o anticorpo humano não é consumido ou destruído por redox, a explicação mais plausível é que o sítio de ligação de anticorpo na porção Fab da molécula de anticorpo contém elétrons acessíveis que podem participar no processo de oxidação / redução.

Exemplo 35

Os próximos experimentos foram realizados para ver se as proteínas de plasma, exceto autoanticorpos, podem ter sua especificidade de 15 ligação alterada por oxidação / redução. Nestes experimentos, uma solução de plasma bovino adulto a 10% (ABP), a mesma solução contendo proteínas de ligação de fosfolipídeo que tinham sido usadas para determinar a ligação de

aPL dependente de proteína, foi exposta a uma corrente elétrica de uma bateria de 6 volts por um período de tempo variável. As amostras de ABP tratadas foram então usadas nos ensaios ELISA com soros de paciente aPS-, aCL e aPE-positivo para ver se o tratamento do ABP afetaria o resultado do

ELISA. Como mostrado na Figura 34, no tempo zero (ABP não tratado), os soros dos pacientes positivos fornecem a resposta de aPL em ABP que é rotineiramente vista. Conforme o ABP a 10% é exposto a oxidação-redução (EMF) no tempo, a quantidade de aPL detectado diminui, e, após 2 minutos, o soro positivo em aPE não é mais positivo. Estes resultados indicam que as proteínas de plasma que são responsáveis pela reatividade de aPL no paciente são alteradas pela exposição à corrente elétrica. Por exemplo, como kininogênio é a proteína de plasma responsável para fornecer um sinal de

ELISA positivo para reações dependentes de aPE*(o kminOgênío·se 4íga*w*** *·’ PE, então o anticorpo se liga ao kininogênio, o aPE, contudo, não vai se ligar a PE ou kininogênio independentemente), isto mostra que o kininogênio na amostra de ABP está sendo alterado pela exposição a redox. aCL é também 5 negativo em exposição por 240 segundos, e este soro do paciente requer ou protrombina e/ou beta2 glicoproteína (ou ambas podem estar envolvidas) para a produção de um sinal positivo no ELISA de aPL, estas duas proteínas devem também ser alteradas pelas reações redox. As mesmas duas proteínas

de plasma são envolvidas no exemplo de aPS.

Obviamente, muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos. Portanto, deve ser entendido que, dentro do escopo das reivindicações em anexo, a presente invenção pode ser praticada de outra forma que conforme especificamente descrito aqui.

Claims (19)

1. Método, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

fornecer uma composição compreendendo pelo menos um autoanticorpo do plasma suspenso ou dissolvido em um meio líquido, e expor a composição a um agente oxidante ou a um potencial elétrico CC.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio líquido é sangue integral, soro ou plasma diluído ou não diluído.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição compreende imunoglobulina intravenosa (Ivlg) suspensa ou dissolvida em um meio líquido.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o autoanticorpo do plasma é um anticorpo de isotipo IgG, IgA ou IgM.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o autoanticorpo do plasma é um autoanticorpo de isotipo IgG, IgA ou IgM.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o autoanticorpo do plasma é um autoanticorpo do plasma diferente de um anticorpo.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente oxidante é hemina.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente oxidante é KMnO4.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente oxidante é clorofina.

10. Método, caracterizado pelo fato de compreender as etapas

Petição 870180138220, de 05/10/2018, pág. 11/15 de:

fornecer uma composição compreendendo um fluido biológico ou extrato de um fluido biológico, em que o fluido biológico ou extrato de um fluido biológico contém pelo menos um autoanticorpo do plasma, expor a composição a um agente oxidante ou a um potencial elétrico suficiente para efetuar a alteração da especificidade de ligação do dito autoanticorpo do plasma, desta forma desmascarando o autoanticorpo do plasma, e detectar o autoanticorpo do plasma na composição ou recuperar o autoanticorpo do plasma da composição.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito fluido biológico é sangue integral, soro, plasma ou sangue de cordão de placenta diluído ou não diluído.

12. Método de obtenção e isolamento de um autoanticorpo de um fluido biológico contendo anticorpo ou de um extrato de fluido biológico contendo anticorpo, o dito fluido biológico ou extrato contendo autoanticorpos que, antes do método ser realizado, não são capazes de se ligar a um autoantígeno e portanto não são detectáveis por um ensaio baseado na ligação receptor-ligando, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

expor o fluido biológico ou extrato a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica de CC, e recuperar o autoanticorpo do fluido biológico.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito fluido biológico é sangue integral, soro ou plasma diluído ou não diluído.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o extrato contendo anticorpo de um fluido biológico é imunoglobulina intravenosa (Ivlg).

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado

Petição 870180138220, de 05/10/2018, pág. 12/15 pelo fato de que o agente oxidante é hemina ou clorofila.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente oxidante é KMnCb.

17. Método, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

avaliar uma amostra de sangue, plasma ou soro de um indivíduo para determinar uma quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra, tratar uma amostra de sangue, plasma ou soro de um indivíduo pela exposição da amostra a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica CC, avaliar uma amostra de sangue, plasma ou soro de um indivíduo para determinar uma quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra tratada, e comparar a quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra não tratada com a quantidade e/ou tipo de autoanticorpos detectáveis na amostra tratada.

18. Método, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

prover uma composição compreendendo pelo menos um autoanticorpo do plasma suspenso ou dissolvido em um meio líquido, o autoanticorpo do plasma tendo uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança no seu estado redox, e expor a composição a um agente oxidante ou a um potencial elétrico.

19. Método, caracterizado pelo fato de que as etapas de:

prover uma composição compreendendo pelo menos um autoanticorpo do plasma suspenso ou dissolvido em um meio líquido, o autoanticorpo do plasma possuindo uma especificidade de ligação que pode

Petição 870180138220, de 05/10/2018, pág. 13/15 ser alterada por uma mudança no seu estado redox, e expor a composição a um agente oxidante ou um potencial elétrico suficiente para efetuar a alteração da especificidade de ligação de dito autoanticorpo do plasma, e

5 detectar o autoanticorpo do plasma ossuindo uma especificidade de ligação alterada.