BR122024010958A2 - Cepa de lactobacillus paracasei kbl385, composições alimentar, de aditivo alimentar e farmacêuticas, bem como usos de uma composição compreendendo a cepa para prevenir ou tratar doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias - Google Patents

Abstract

“CEPA DE LACTOBACILLUS PARACASEI KBL385, COMPOSIÇÕES ALIMENTAR, DE ADITIVO ALIMENTAR E FARMACÊUTICAS, BEM COMO USOS DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO A CEPA PARA PREVENIR OU TRATAR DOENÇAS INTESTINAIS, DOENÇAS ALÉRGICAS, DOENÇAS AUTOIMUNES OU DOENÇAS INFLAMATÓRIAS” A presente invenção pertence a: uma nova cepa probiótica derivada do ser humano que é Lactobacillus paracasei KBL382, Lactobacillus paracasei KBL384 ou Lactobacillus paracasei KBL385; e um uso da cepa para melhorar a saúde intestinal e tratar ou prevenir doenças intestinais. A cepa de acordo com a presente invenção tem excelentes funções anti-inflamatórias e imunomoduladoras, tem um excelente efeito de fortalecimento sobre as junções apertadas da parede do trato intestinal, suprime a perda de peso induzida por enterite e redução do comprimento do cólon, exibindo, desse modo, um efeito terapêutico para enterite e alivia significativamente os sintomas de dermatite atópica. Portanto, a cepa pode ser útil como um material probiótico para realçar os efeitos anti-inflamatórios, fortalecer a imunidade, melhorar as funções de saúde intestinal e aliviar as doenças alérgicas.

Description

[001] Dividido do BR 11 2020 022749 8, depositado em 09/05/2019.

Campo da Técnica

[002] A presente invenção se refere a cepas de Lactobacillus paracasei e ao uso das mesmas. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma composição alimentar funcional saudável para o alívio de sintomas alérgicos, melhoria da imunorregulação, alívio de sintomas inflamatórios, alívio de dermatite atópica e melhoria da saúde intestinal; e uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças alérgicas, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, dermatite atópica e/ou doenças intestinais, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei, células microbianas da referida cepa, culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

Fundamentos da Técnica

[003] Probióticos se referem a microrganismos e aos produtos resultantes dos mesmos tendo atividades antibacterianas e atividades enzimáticas para ajudar no equilíbrio dos microrganismos intestinais. Além disso, probióticos são também definidos como bactérias vivas na forma de uma única cepa ou cepas múltiplas para melhorar a flora intestinal quando fornecidos ao ser humano ou animais na forma de células secas ou produtos de fermentação. Probióticos devem habitar o intestino humano, se não patogênico e não tóxico e sobreviver bastante tempo até que eles cheguem no intestino. Além disso, probióticos devem manter a viabilidade e atividades até que eles sejam consumidos no alimento liberado, ser sensíveis aos antibióticos usados para prevenir infecção e não devem ter têm plasmídeos resistentes a antibióticos. Também, probióticos devem ser resistentes a ácidos, enzimas e bile no ambiente intestinal.

[004] Estes probióticos podem incluir, por exemplo, Bacillus sp. que tem uma excelente capacidade de produzir enzimas digestivas tais como amilase, protease, lipase, celulase e fosfatase, Lactobacillus sp. que produz ácido láctico e bactérias fotossintéticas que previnem o mau cheiro por via de usar as substâncias causadoras de mau cheiro (tais como amônia, sulfeto de hidrogênio e aminas) remanescentes nas fezes de animais de criação em processo metabólico.

[005] Em particular, Bacillus sp. e Lactobacillus sp. são conhecidos como probióticos muito úteis porque eles incluem cepas que produzem várias substâncias antibacterianas. Estas bactérias ácido-lácticas produzem peptídeos antimicrobianos chamados Bacteriocina, que têm mecanismos antibacterianos que não são relacionados ao mecanismo de resistência a antibióticos. Bacteriocinas têm características polimórficas de modo que seus pesos moleculares, propriedades bioquímicas e faixas e mecanismos antimicrobianos para o hospedeiro variem consideravelmente. Klaenhammer define bacteriocina como uma proteína ou complexo proteico que tem atividade antibacteriana direta contra espécies próximas a bactérias produtoras de bacteriocina.

[006] Enquanto isso, a síndrome do intestino irritável (IBS) é um sintoma caracterizado por dor abdominal e/ou irritações associadas com movimento intestinal alterado ou hábitos intestinais, tais sintomas não podem ser explicados com anormalidade anatômica ou bioquímica. Os sintomas comuns de IBS também incluem urgência urinária, distensão abdominal e sensação de movimento intestinal incompleto. Consequentemente, IBS pode ser classificada como transtornos gastrointestinais funcionais compreendendo condições tais como distensão abdominal funcional, dor torácica não cardíaca, dispepsia não ulcerativa e constipação crônica ou diarreia. Em particular, no caso de IBS, visto que os sintomas relacionados afetam tanto o bem-estar quanto o aspecto funcional normal dos pacientes, a doença tem um grande impacto na morbidez e na qualidade de vida, além de dor e desconforto abdominais.

[007] Doença inflamatória intestinal (IBD) é uma condição em que a inflamação crônica anormal no intestine repete a melhoria e a recidiva, compreendendo todas as doenças intestinais inflamatórias, tais como doença de Crohn, colite ulcerativa ou doença de Behcet, mas não se limita a estes. Muitas pesquisas foram conduzidas no campo de desenvolvimento de fármacos para tratar IBS e IBD. A este respeito, vários antidepressivos são comumente usados, ainda que a eficácia dos mesmos em testes clínicos seja moderada e a utilidade clínica dos mesmos seja limitada devido a efeitos colaterais significativos. Medicações serotonérgicas também demonstraram ter eficácia contra sintomas globais de IBS. Entretanto, a aplicação destas medicações foi restringida em vários modos devido a vários problemas de segurança recentes. Consequentemente, existe interesse crescente no desenvolvimento de um novo agente terapêutico para IBS.

[008] Enquanto isso, alergia é um fenômeno bioquímico que exibe uma resposta única e alterada a uma substância estranha (antígeno, alérgeno). A substância estranha que causa os sintomas é chamada alérgeno, enquanto as doenças decorrentes destes sintomas são chamadas doenças alérgicas. Alergia é um processo patológico no organismo vivo resultante da reação antígeno-anticorpo. Em geral, existem quatro tipos de alergias dependendo do período até desencadear a reação e do envolvimento do complemento. O Tipo 1, entre estes, é o tipo anafilático (tipo imediato) em que órgãos alvos são principalmente órgãos digestivos, pele e pulmões e os sintomas comuns incluem alergia gastrointestinal, urticária, atrofodermatite, rinite alérgica e asma brônquica, etc. O mecanismo patológico do Tipo 1 é conhecido como segue: quando antígenos contatam anticorpos IgE ligados à superfície de mastócitos e leucócitos basofílicos, as células alvos são ativadas para secretar transmissores químicos tais como histamina, leucotrieno e PAF e depois vasos sanguíneos e músculos lisos são contraídos. Tal mecanismo pode ser frequentemente combinado com o Tipo 4 (tipo retardado). Em outras palavras, tal anafilaxia e reação alérgica podem surgir devido a uma variedade de mudanças nos mastócitos, etc. A ativação dos mastócitos, o que leva à desgranulação, é causada pela ligação de antígeno, anti-IgE, lectina, etc. a receptores Fc, estimulação de anafilatoxina, etc. ou outros fármacos tais como ionóforo de cálcio, composto 48/80, codeína e hormônio adrenocorticotrópico sintético.

[009] Mastócitos e basófilos no sangue são conhecidos como as principais células no corpo, causadoras de muitas doenças alérgicas tais como rinite alérgica, dermatite alérgica, asma, alergia alimentar e choque anafilático. Estas células têm receptores (FcRI) para IgE em suas superfícies que é um anticorpo que causa alergia e as células são estimuladas pelas substâncias causadoras de alergia (antígeno, alérgeno) para secretar suas próprias substâncias causadoras de alergia fora das células (Kim K et al, Eur J Pharmacol, 581:191 - 203, 2008).

[010] Entre as doenças alérgicas, dermatite atópica, como amplamente conhecido ao público, é uma doença de pele recorrente crônica que afeta recém- nascidos ou crianças e pode persistir até a idade adulta. Semelhante à asma ou rinite alérgica, a dermatite atópica é uma doença inflamatória da pele associada com a infiltração local de linfócito T que produz IL-4 e IL-5. IL-4 controla o desenvolvimento do fenótipo T auxiliar 2 (Th2), resultando na superprodução de imunoglobulinas (Ig) e eosinofilia e aumento de níveis séricos de IgE . 80 a 90 % dos indivíduos que foram positivos ao teste da pele com respeito a alérgenos alimentares e inalantes apresentaram dermatite atópica.

[011] Existem diferentes tratamentos para tratar ou prevenir doenças alérgicas incluindo dermatite atópica, mas nenhum tratamento eficaz foi descoberto ainda. Alguns tratamentos com base em fármacos são conhecidos, mas mesmo uma administração de curto prazo do fármaco para o tratamento desenvolveria uma tolerância e uma administração de longo prazo poderia causar efeitos colaterais graves e assim, tais tratamentos com base em fármacos de doenças alérgicas foram evitados recentemente. Sob as circunstâncias, sem que o tratamento tenha qualquer efeito óbvio e absoluto, sintomas irritantes tais como coceira e vermelhidão da pele além da alergia frequentemente não melhoram.

[012] Os documentos WO 96/29083 e EP 554418 divulgam dois tipos de cepas de Lactobacillus que formam colônias no intestino, isto é, Lactobacillus plantarum 299v (DSM 6595) e Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 (DSM 6594), etc. O documento EP 415941 divulga um método para preparar uma composição de nutrientes, compreendendo tratar a papa de aveia com enzimas antes de misturá-la com lactobacilos. A Patente dos EUA No 7195906 divulga uma cepa de Bifidobacterium isolada do trato gastrointestinal humano ressecado e lavado para o tratamento de doenças inflamatórias, especialmente inflamação gastrointestinal tal como IBD e IBS.

[013] Entretanto, nenhuma cepa tendo excelentes efeitos sobre melhorar a saúde intestinal, por exemplo, tratamento de IBD e IBS e sobre aliviar os sintomas alérgicos foi encontrada ainda e de modo a encontrar cepas tendo tais efeitos, muitas instituições de pesquisa estão trabalhando para isto.

[014] Sob as circunstâncias, os presente inventores triaram uma variedade de cepas com base no fato de que um efeito de melhoria da saúde de probióticos não ser atributo geral de gênero e espécie mas sim específico de cepa (Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London Ontario, Canada, 2002) e identificaram uma nova cepa tendo excelentes efeitos sobre a imunorregulação, atividades anti-inflamação, alívio de alergia, melhoria da saúde intestinal e tratamento de doenças intestinais. Depois, a presente invenção foi concluída confirmando-se os efeitos superiores destas cepas.

Sumário da Invenção

[015] O propósito da presente invenção é fornecer uma nova cepa útil para a melhoria da saúde intestinal, tratamento ou prevenção de doenças intestinais, melhoria da imunorregulação, tratamento ou prevenção de doenças autoimunes, alívio de sintomas alérgicos, alívio de sintomas inflamatórios, alívio e tratamento de dermatite atópica.

[016] De modo a obter o propósito, a presente invenção fornece uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511 BP).

[017] Também, a presente invenção fornece uma composição alimentar ou composição de aditivo alimentar compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[018] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças intestinais, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[019] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças alérgicas, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[020] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP), uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[021] A presente invenção também fornece um método para tratar doenças intestinais, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[022] A presente invenção também fornece um método para tratar doenças alérgicas, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[023] A presente invenção também fornece um método para tratar doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP), uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[024] A presente invenção também fornece uma composição para o uso de prevenir ou tratar doenças intestinais, compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[025] A presente invenção também fornece uma composição para o uso de prevenir ou tratar doenças alérgicas, compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[026] A presente invenção também fornece uma composição para o uso de prevenir ou tratar doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[027] A presente invenção também fornece o uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP), uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa, para preparar um fármaco preventivo ou terapêutico para doenças intestinais.

[028] A presente invenção também fornece o uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa, para preparar um fármaco preventivo ou terapêutico para doenças alérgicas.

[029] A presente invenção também fornece o uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa, para preparar um fármaco preventivo ou terapêutico para doenças autoimunes ou doenças inflamatórias.

Breve Descrição dos Desenhos

[030] A FIG. 1 ilustra o resultado confirmando o efeito de controlar as citocinas inflamatórias por uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 e uma cepa KBL385 da presente invenção em PBMC.

[031] A FIG. 2 ilustra o resultado confirmando o efeito de controlar a expressão gênica de marcadores de diferenciação de célula T por uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 e uma cepa KBL385 da presente invenção em PBMC.

[032] A FIG. 3 ilustra o resultado da observação da mudança no nível de expressão de citocinas, (A) IL-2, (B) IFN-Y, (C) IL-4, (D) IL-13, (E) IL-17A e (F) IL-10, de acordo com a administração de uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 e uma cepa KBL385 da presente invenção, em linhagens de célula PBMC de modo que células T sejam ativadas por adição de anticorpo anti-CD3.

[033] A FIG. 4 ilustra o resultado confirmando os efeitos sobre aliviar a enterite através (A) da mudança no peso corpóreo, (B) da mudança no comprimento do cólon, (C) da mudança no comprimento do cólon e mudança no peso do ceco, (D) manchamento com H&E de tecidos do cólon e (E) da mudança no nível de MPO (mieloperoxidase) nos tecidos do cólon depois de administrar cada uma de uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 e uma cepa KBL385 da presente invenção a modelos de camundongo que a enterite foi induzida.

[034] A FIG. 5 ilustra o resultado da observação do efeito de fortalecer as junções apertadas de uma cepa KBL382 e uma cepa KBL385 da presente invenção através da mudança no nível de expressão da genes relacionados à junção apertada da parede do trato intestinal, (A) ZO1, (B) Claudin3 e (C) MUC4.

[035] A FIG. 6 ilustra o resultado de comparar os efeitos de (A) recuperar o comprimento do cólon e (B) melhorar a perda de peso corpóreo por uma cepa KBL382 da presente invenção e infliximabe, um anticorpo para tratar enterite, que está disponível no mercado, de modo a confirmar o efeito de aliviar a enterite pela cepa KBL382 da presente invenção.

[036] A FIG. 7 ilustra o resultado da observação (A) da medição do escore de dermatite, (B) do efeito de alívio da coceira, (C) do efeito de redução da espessura da pele e (D) do efeito de redução da concentração de IgE no sangue pela administração de uma cepa KBL382 da presente invenção a modelos animais nos quais a dermatite atópica foi induzida, de modo a confirmar o efeito de aliviar os sintomas atópicos pela cepa KBL382.

Descrição Detalhada da Invenção e Melhores Modos para Realizar a Invenção

[037] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente relatório descritivo significam os mesmos como entendido por um técnico no assunto. Em geral, a nomenclatura usada no presente relatório descritivo é bem conhecida na técnica e é comumente usada.

[038] A presente invenção confirmou um efeito imunorregulador de microrganismos derivados do corpo humano e descobriram cepas de Lactobacillus paracasei tendo um excelente efeito de imunorregulação, isto é, KBL382 (No de Acesso KCTC13509BP), KBL384 (No de Acesso KCTC13510BP) e cepa KBL385 (No de Acesso KCTC13511BP). A análise de 16s rDNA da referida cepa demonstra que a referida cepa é uma nova cepa que nunca foi conhecida ao público.

[039] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma nova cepa probiótica de KBL382 de Lactobacillus paracasei, de KBL384 de Lactobacillus paracasei ou de KBL385 de Lactobacillus paracasei e as referidas cepas são caracterizadas por compreender sequências de 16s rDNA das SEQ ID NOs: 1 a 3, respectivamente, como abaixo.

[040] <SEQ ID NO: 1> sequência de 16s rDNA de uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei >KBL382 GCAGGTGGCGGGTGCTATACATGCAGTCGACGAGπCTCGπGATGATCGGTGCπGCACC GAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAA GTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTC TTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCrATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCrAGTTG GTGAGGTAATGGCrCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCAC ATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAA TGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCnTCGGGTCGTAAAAC TCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCA GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGUATC CGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTΠTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCG GCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACΠGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGA ACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC TGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGAπAGATACC CTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGπGGAGGGTπCCGCCCTTOXGTGC CGCAGCTAACGCAπAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTπAAπCGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGπTCCCCTTCGGGGGCA AAATGACAGGTGGTGCATGGπGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG CAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTrAGπGGGCACTCTAGTAAGACTGC CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGG GCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAAT CTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGπCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTAGGGAGCGA GCGTCTAAGTGGCTCACGCCT

[041] <SEQ ID NO: 2> sequência de 16s rDNA de uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei >KBL384 GCCAGTGGGGGGGGTGCTATACATGCAGTCGAACGAGΠCTCGTTGATGATCGGTGCTTGC ACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCF TAAGTGGGGGATAACAiπGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATG GTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTA GTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGG CCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC ACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTA AAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCA ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCC CTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGT GGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGC GGCrGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCrCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGA TACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGHTCCGCCCTTCA GTGCCGCAGCTAACGCAKAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTC AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGiπAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCπCGGG GGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGA CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGΠGCGAGACCGCGAGGTCAAGC TAATCTCTTAAAGCCAπCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGA ATCGCTAGTAArCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTπAGGGAGC GAGCCGTCTAAGGTGAACCAAAGΠTG

[042] <SEQ ID NO: 3> sequência de 16s rDNA de uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei >KBL385 GCAGTTGGGGGGGAGCTATACATGCAGTCGACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCAC CGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTA AGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTT CTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTT GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCA CATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACA ATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAA CTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGKGCCGGCGTGACGGTATCCAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGΠAT CCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTC GGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGG AACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGG CTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTG CCGCAGCTAACGCAπAAGCATTCCGCCFGGGGAGTACGACCGCAAGGπGAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAA GAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGC AAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCπATGACTAGTTGCCAGCAπTAGπGGGCACTCTAGTAAGACTG CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGπGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAA TCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCΠTAGGGAGCGA GCCGTCTAAGTGTACAAAGTT

[043] A presente invenção também confirmou que uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 e uma cepa KBL385, todas têm um efeito de fortalecimento sobre a junção apertada da parede do trato intestinal além de efeitos anti-inflamatórios e imunorreguladores e que a administração de uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 e uma cepa KBL385 a modelos animais nos quais a enterite foi induzida aliviou acentuadamente a perda de peso corpóreo e a redução do comprimento do cólon devido à enterite. Além disso, a mesma também confirmou que a administração da cepa KBL382, entre as cepas acima, a modelos animais nos quais a dermatite atópica foi induzida melhorou acentuadamente o escore de dermatite, aliviou os sintomas de coceira, diminuiu a espessura da pele e melhorou acentuadamente a concentração de IgE no sangue devido à reação alérgica.

[044] Consequentemente, em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a uma composição alimentar ou composição de aditivo alimentar compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em células microbianas de uma cepa KBL382, uma cepa KBL384 ou uma cepa KBL385, culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[045] A referida composição alimentar ou composição de aditivo alimentar pode ser prontamente utilizada como o alimento eficaz para a melhoria da saúde intestinal e prevenção de doenças intestinais, por exemplo, como ingredientes principais ou ingredientes secundários de alimento, aditivos alimentares, composição alimentar funcional saudável ou bebidas funcionais, mas não se limita a estes.

[046] A referida composição alimentar ou composição de aditivo alimentar pode ser prontamente utilizada como o alimento eficaz para o alívio de sintomas alérgicos, por exemplo, como ingredientes principais ou ingredientes secundários de alimento, aditivos alimentares, composição alimentar funcional saudável ou bebidas funcionais, mas não se limita a estes.

[047] Além disso, a referida composição alimentar ou composição de aditivo alimentar pode ser prontamente utilizada como o alimento eficaz para o alívio de doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, por exemplo, como ingredientes principais ou ingredientes secundários de alimento, aditivos alimentares, composição alimentar funcional saudável ou bebidas funcionais, mas não se limita a estes.

[048] O termo “alimento” se refere a um produto natural ou artificial compreendendo pelo menos um nutriente e mais preferivelmente, se refere a um produto que se torna comestível através de certo processamento, usualmente abrangendo todos os alimentos, aditivos alimentares, alimentos funcionais de saúde e bebidas funcionais.

[049] O alimento que pode compreender a referida composição alimentar de acordo com a presente invenção como um aditivo pode incluir, por exemplo, diferentes tipos de alimento, bebidas, goma de mascar, chá, complexo vitamínico e alimento funcional. Além disso, o alimento da presente invenção inclui alimento nutricional especial (por exemplo, leite modificado, alimento para bebês), produtos de carne processada, produtos de carne de peixe, tofu, muk, macarrões (por exemplo, ramen, macarrões asiáticos), produtos de panificação, suplemento alimentar de saúde, produtos condimentados (por exemplo, molho de soja, pasta de soja, pasta de pimenta vermelha, pasta mista), molhos, confeitaria (por exemplo, lanches), doces, chocolates, gomas de mascar, sorvetes, produtos lácteos (por exemplo, leite fermentado, queijo), outro alimento processado, Kim-chi, alimento salgado (por exemplo, diferentes tipos de Kim-chi, alimento em conserva), bebidas (por exemplo, suco de frutas, suco de vegetais, leite de soja, bebidas fermentadas) e temperos naturais (por exemplo, caldo em pó para ramen), mas não se limita a estes. Os referidos alimentos, bebidas ou aditivos alimentares podem ser preparados em maneiras convencionais.

[050] O termo “alimentos funcionais de saúde” é um grupo de alimentos ao qual valor é adicionado de modo que a função do mesmo seja exercida e expressada para o propósito predeterminado usando-se técnicas físicas, bioquímicas ou de bioengenharia a estes ou um alimento processado designado de modo que as funções de ajuste in vivo da composição alimentar relevante tal como ajuste do ritmo em profilaxia, prevenção de doença e recuperação da doença sejam suficientemente expressadas. Tal alimento funcional pode compreender aditivos de suplemento alimentar que são cientificamente aceitáveis em termos alimentares e podem compreender adicionalmente portadores, excipientes e diluentes adequados, que são comumente usados na fabricação dos mesmos.

[051] O termo “bebidas funcionais”, como usado na presente invenção, coletivamente se referem aos produtos de bebida para aliviar a sede ou para apreciar o sabor. Não existe nenhuma limitação particular a estes, exceto compreendendo a composição para a melhoria ou a prevenção dos referidos sintomas de doença intestinal como ingredientes essenciais com a proporção indicada e vários agentes flavorizantes ou carboidratos naturais podem estar contidos nesta como ingredientes adicionais como em bebidas comuns.

[052] Além do acima, o alimento compreendendo a composição alimentar de acordo com a presente invenção para a melhoria dos referidos sintomas de doença intestinal ou a prevenção dos mesmos pode conter vários nutrientes, vitaminas, minerais (eletrólito), agentes flavorizantes tais como agentes flavorizantes sintéticos e agentes flavorizantes naturais, agentes corantes e enchedores (queijo, chocolate, etc.), ácido péctico e sais do mesmo, ácido algínico e sais do mesmo, ácidos orgânicos, agentes espessantes coloidais protetivos, agentes ajustadores de pH, agentes estabilizantes, preservantes, glicerina, álcool, agentes carbonizantes como usado em bebidas carbonatadas e semelhantes e cada um dos ingredientes acima podem ser usados sozinhos ou em combinação entre si.

[053] No alimento compreendendo a composição alimentar de acordo com a presente invenção, a composição da presente invenção pode ser compreendida em uma quantidade de 0,001 % em peso a 100 % em peso e preferivelmente 1 % em peso a 99 % em peso, com base no peso total do alimento; no caso de bebidas, a mesma pode ser compreendida em uma quantidade de 0,001 g a 10 g e preferivelmente 0,01 g a 1 g, com base em 100 mL. Para a entrada de longo prazo para o propósito de saúde e higiene ou para o propósito de controle de saúde, entretanto, a quantidade pode ser abaixo da faixa mencionada acima; e visto que os ingredientes eficazes não têm nenhum problema em termos de perfil de segurança, eles podem ser usados em uma quantidade acima da faixa e eles não são limitados à faixa de quantidade mencionada acima.

[054] A composição alimentar de acordo com a presente invenção pode compreender a cepa KBL382, cepa KBL384 ou cepa KBL385 sozinha ou em combinação com o portador aceitável ou pode ser preparada na forma da composição adequado para o consumo por ser humano ou animais. Isto é, a composição pode ser adicionada ao alimento que não contém nenhuma bactéria probiótica ou algumas bactérias probióticas. Por exemplo, os microrganismos que podem ser usados em combinação com a cepa de acordo com a presente invenção na preparação do alimento da presente invenção devem ser adequados para o consumo por ser humano ou animais e ter atividades probióticas para inibir bactérias patogênicas e nocivas ou para melhorar o equilíbrio dos microrganismos no trato intestinal mamífero, após a entrada, mas não se limita a estes. Tais microrganismos probióticos podem incluir, por exemplo, leveduras tais como Saccharomyces, Candida, Pichia e Torulopsis, fungos tais como Aspergillus, Rhizopus, Mucor e Penicillium e bactérias pertencentes ao gênero de Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Propionibacterium, Enterococcus e Pediococcus. Microrganismos probióticos adequados especificamente podem incluir, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactococcus lactis ou Pediococcus acidilactici. Preferivelmente, a composição alimentar de acordo com a presente invenção pode compreender ainda uma mistura de microrganismos probióticos tendo excelentes atividades probióticas e efeitos superiores sobre o realce da imunidade para realçar ainda mais os efeitos dos mesmos. Os portadores que podem ser incluídos na composição alimentar da presente invenção podem incluir, por exemplo, extensores, aditivos com alto teor de fibras, agentes encapsulantes e lipídeos, que são amplamente bem conhecidos na técnica. A cepa de Lactobacillus paracasei na presente invenção pode estar na forma liofilizada ou encapsulada ou na forma de suspensões de cultura ou pós secos.

[055] A composição da presente invenção pode ser também fornecida na forma de um aditivo para ração compreendendo a referida cepa ou uma ração compreendendo a mesma.

[056] O aditivo para ração da presente invenção pode estar na forma de formulação seca ou líquida e compreender ainda outros microrganismos não patogênicos além da referida cepa de KBL382, KBL384 ou KBL385. Os microrganismos que podem ser adicionados ao aditivo para ração podem incluir, por exemplo, Bacillus subtilis que podem produzir protease, lipase e enzimas de conversão de açúcar, a cepa Lactobacillus tendo uma atividade fisiológica e degradabilidade de compostos orgânicos sob condições anaeróbicas tal como no estômago da vaca, fungos filamentosos tal como Aspergillus oryzae que apresentam efeitos sobre o aumento do peso de animais de criação, produção de leite e digestibilidade da ração (Slyter, L. L. J. Animal Sci,1976, 43. 910 - 926) e levedura tal como Saccharomyces cerevisiae (Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, 735 - 739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211).

[057] O aditivo para ração da presente invenção pode compreender adicionalmente pelo menos um agente enzimático além da referida cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei ou cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei. Os agentes enzimáticos adicionais podem estar em uma forma seca ou líquida e podem incluir, por exemplo, enzimas esteatolíticas tais como lipase, fitase para produzir fosfato e fosfato de inositol degradando-se o ácido fítico, amilase, isto é, uma enzima para hidrolisar a ligação de a-1,4-glicosídeo incluído em, por exemplo, amido e glicogênio, fosfatase, isto é, uma enzima para hidrolisar éster de ácido fosfórico orgânico, carboximetilcelulase para degradar celulose, xilase para degradar xilose, maltase para hidrolisar maltose em duas moléculas de glicose e enzimas de produção de açúcar tal como invertase para produzir a mistura de glicose- frutose hidrolisando-se a sacarose.

[058] No uso da cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei ou cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei da presente invenção como aditivos para ração, os ingredientes brutos para a ração, tais como amendoins, ervilhas, beterrabas, polpa, subprodutos de grão, pó de vísceras de animais e pó de farinha de peixe, incluindo vários grãos e proteína de soja, podem ser usados. Eles podem ser processados ou não e podem ser usados sem limitação. O processamento pode incluir, mas não se limita a este, um tal processo que os ingredientes brutos da ração são carregados e podem ser comprimidos sob pressão contra uma saída dada e para proteínas, a extrusão pela qual as proteínas são degeneradas para aumentar a disponibilidade pode ser preferivelmente usada. A extrusão tem vantagens de desnaturar proteínas através de tratamento térmico e destruir fatores antienzima. Além disso, para proteínas de soja, a digestibilidade das mesmas pode ser melhorada através de extrusão para inativar antinutrientes tal como um inibidor de tripsina, um dos inibidores de protease que estão presentes em sojas. Além disso, a extrusão pode promover a melhoria da digestibilidade por protease, realçar o valor nutricional das proteínas de soja.

[059] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças intestinais, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em células microbianas de uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei, culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[060] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças alérgicas, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em células microbianas de uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei, culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[061] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em células microbianas de uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei, culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[062] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser fornecida em uma forma de bactérias vivas, cepa seca, culturas da referida cepa, lisados da referida cepa ou uma composição em combinação com um portador ou meio farmaceuticamente aceitável. Os portadores ou meios que podem ser usados aqui podem incluir solvente, um dispersante, um revestimento, um realçador, uma formulação de liberação controlada (isto é, formulação de liberação sustentada) ou pelo menos um excipiente inerte incluindo amido, poliol, grânulos, celulose microfina, celulose microcristalina tal como Celphere, pérolas de Celphere, diluente, lubrificante, aglutinante, desintegrante e semelhantes. O comprimido da composição acima pode ser, se desejado, revestido por uma técnica aquosa ou não aquosa padrão. Os exemplos do portador farmaceuticamente aceitável e do excipiente para o uso como o portador inerte farmaceuticamente aceitável e dos referidos ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, um aglutinante, um enchedor, um desintegrante, um lubrificante, um agente antimicrobiano e um agente de revestimento, mas não se limita a estes.

[063] A presente invenção pode ser caracterizada em que as referidas doenças intestinais são selecionadas a partir do grupo consistindo em distensão abdominal, desconforto abdominal, diarreia infecciosa causada por microrganismos patogênicos, gastroenterite, doenças inflamatórias intestinais, síndrome da intestinite neurogênica, síndrome do intestino irritável, crescimento excessivo de microrganismos no intestino delgado e diarreia alimentar intestinal e as doenças também incluem aquelas causadas por dano da função de barreira do intestino.

[064] A doença inflamatória intestinal (IBD) pode incluir doença de Crohn, a lesão intestinal que acompanha a doença de Behcet, colite ulcerativa, úlcera retal hemorrágica e pouchite e se refere a um grupo de doenças incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa. Colite ulcerativa apenas afeta o cólon. Inflamação e úlcera da colite ulcerativa são limitadas às duas camadas mais internas, mucosa e submucosa das quatro camadas do cólon. Inflamação e úlcera da doença de Crohn podem ser difundidas completamente por todas as camadas da parede intestinal tanto no intestino delgado quanto grosso.

[065] Enquanto isso, a síndrome do intestino irritável é uma condição crônica que acompanha não apenas desconforto e dor abdominais persistentemente recorrentes tais como distensão abdominal, mas também mudanças no hábito intestinal tal como diarreia e constipação. Os sintomas podem ser exacerbados por fatores psicológicos ou circunstâncias sociais estressantes.

[066] Na presente invenção, as doenças alérgicas podem incluir dermatite atópica, urticária, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, asma, alergia alimentar e choque anafilático, mas não se limita a estas.

[067] Na presente invenção, doenças autoimunes podem incluir, por exemplo, artrite reumatoide, lúpus, esclerodermia sistêmica, dermatite atópica, psoríase, artrite psoriática, asma, síndrome de Guilian-Barre, miastenia gravis, dermatomiosite, polimiosite, esclerose múltipla, encefalomielite autoimune, poliarterite nodosa, tireoidite de Hashimoto, esclerose múltipla, arterite temporal, diabetes juvenil, alopecia areata, pênfigo, estomatite aftosa, anemia hemolítica autoimune, granulomatose de Wegener, síndrome de Sjogren, doença de Addison, doença de Crohn e doença de Behcet, mas não se limita a estas.

[068] Além disso, doenças inflamatórias da presente invenção coletivamente se referem a condições tendo inflamação como uma lesão principal e podem incluir, por exemplo, edema, conjuntivite, periodontite, rinite, otite média, sinusite crônica, faringolaringite, amidalite, bronquite, pneumonia, úlcera gástrica, gastrite, colite, gota, eczema, acne, dermatite atópica, dermatite de contato, dermatite seborreica, espondilite anquilosante, febre reumática, fibromialgia, osteoartrite, artrite psoriática, artrite reumatoide, periartrite do ombro, tendinite, tenossinovite, miosite, hepatite, cistite, nefrite, síndrome de Sjogren, miastenia gravis, sepse, vasculite, bursite, arterite temporal e esclerose múltipla, mas não se limita a estas.

[069] É conhecido que doenças autoimunes podem ser prevenidas ou tratadas por uma ativação de células T reguladoras (Treg) ou diferenciação em células T. Treg, um tipo de célula T CD4+, desempenha um papel em regular o sistema imune e controlar doenças autoimunes mantendo-se a tolerância a autoantígenos. Um fator de transcrição chamado Foxp3 está especificamente envolvido no desenvolvimento, manutenção e função de células T reguladoras, regulando a resposta imune através da secreção das citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-β.

[070] Além disso, é conhecido que quando a taxa de diferenciação de células T em células Th1, células Th2 e células Th17 é baixa e a taxa de diferenciação de células T em células Treg é alta, a resposta inflamatória pode ser eficazmente suprimida.

[071] Células Th1, células Th2 e células Th17 diferenciadas de células T esplênicas são conhecidas como associadas com a expressão dos fatores de transcrição e citocinas seguintes: No caso de células Th1, T-bet, IFN-Y e IL-12; no caso de células Th2, GATA3 e IL-5; no caso de células Th17, RORYt, IL-17.

[072] A presente invenção pode ser caracterizada em que os efeitos resultantes da cepa da presente invenção para aliviar, tratar ou prevenir doenças autoimunes ou doenças inflamatórias podem ser induzidos por pelo menos um selecionado a partir dos mecanismos seguintes: i) supressão da expressão ou secreção de pelo menos uma selecionada a partir do grupo consistindo nas citocinas inflamatórias IL-6, TNF, IL-1b, IL-8, IL-2, IFN- Y, IL-4, IL-13 e IL-17A; ii) aumento da expressão ou secreção da citocina anti-inflamatória e imunorreguladora IL-10; e iii) aumento da expressão de Treg envolvida em atividades anti-inflamatórias e imunorregulação.

[073] O termo ‘tratar’, a menos que mencionado de outro modo, se refere a reverter ou aliviar as doenças ou condições usadas com o referido termo ou um ou mais sintomas das mesmas, inibindo a progressão das mesmas ou prevenindo as mesmas. O termo ‘tratamento’ como usado na presente invenção se refere a uma ação de ‘tratar’ como definido acima. Consequentemente, tratamento ou regime terapêutico de doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias em mamíferos podem incluir um ou mais dos seguintes: (1) Inibir o desenvolvimento de doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, (2) Prevenir a difusão das doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, (3) Aliviar as doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, (4) Prevenir a recidiva das doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, e (5) Paliar os sintomas das doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias

[074] Uma composição da presente invenção para prevenir ou tratar doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias pode compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei, uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei sozinha ou em combinação com pelo menos um de portadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[075] Na presente invenção, o termo “quantidade eficaz” significa uma quantidade que é alta o bastante para fornecer um efeito desejado mas é baixa o bastante para impedir efeitos colaterais graves sob julgamento médico. A quantidade de microrganismos administrados ao corpo pela composição da presente invenção pode ser apropriadamente ajustada em consideração da via de administração e do alvo de administração.

[076] A composição da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo uma vez ou mais por dia. Dosagem unitária significa unidades fisicamente separadas adequadas para a administração unitária a indivíduos humanos e outros mamíferos e cada unidade compreende um portador farmacêutico adequado e uma quantidade predeterminada dos microrganismos da presente invenção para fornecer um efeito terapêutico. A unidade de dosagem para administração oral a um paciente adulto preferivelmente contém 0,001 g ou mais do microrganismo da presente invenção e a dosagem oral da composição da presente invenção é de 0,001 g a 10 g e preferivelmente de 0,01 g a 5 g por dose. A quantidade farmaceuticamente eficaz do microrganismo da presente invenção é de 0,01 g a 10 g/dia. Entretanto, a dosagem varia dependendo da severidade da doença do paciente e dos microrganismos e ingredientes auxiliares eficazes usados juntamente. Além disso, a dosagem diária total pode ser dividida em vários tempos e continuamente administrada conforme necessário. Consequentemente, as faixas de dosagem acima não limitam o escopo da presente invenção de modo algum.

[077] Além disso, o termo “farmaceuticamente aceitável” como usado acima se refere a uma composição que é fisiologicamente aceitável e não causa uma reação alérgica tal como transtorno gastrointestinal, tontura ou reação similar quando administrada a um ser humano.

[078] Uma composição da presente invenção pode ser formulada usando métodos conhecidos na técnica de modo que liberação rápida, sustentada ou retardada dos ingredientes ativos, depois de administrada a um mamífero, possa ser fornecida. As formas de dosagem podem ser pós, grânulos, comprimidos, emulsões, xaropes, aerossóis, cápsulas de gelatina moles ou duras, soluções para injeção estéreis ou pós estéreis. Além disso, a composição da presente invenção para prevenir ou tratar doenças intestinais pode ser administrada por intermédio de várias vias, incluindo administração oral, transdérmica, subcutânea, intravenosa ou intramuscular. A dosagem dos ingredientes ativos pode ser apropriadamente selecionada dependendo de vários fatores tais como a via de administração, a idade do paciente, sexo, peso e a severidade do paciente. A composição da presente invenção para prevenir ou tratar doenças gastrointestinais pode ser administrada em combinação com um composto conhecido tendo o efeito de prevenir ou tratar os sintomas das doenças intestinais.

[079] A composição farmacêutica da presente invenção, em particular, pode ser fornecida em uma forma de dosagem unitária oral de uma formulação de revestimento entérico. O termo “revestimento entérico”, como usado aqui, compreende qualquer revestimento farmaceuticamente aceitável conhecido que pode permanecer no estômago sem se degradar pelo ácido gástrico e pode suficientemente desintegrar no trato intestinal para liberar os ingredientes ativos neste. O “revestimento entérico” da presente invenção se refere a um revestimento que pode ser mantido por 2 horas ou mais quando um suco gástrico artificial tal como uma solução de HCl de pH 1 é contatada a este a 36 °C a 38 °C e subsequentemente pode degradar, preferivelmente em um suco intestinal artificial tal como uma solução tampão de KH2PO4 de pH 6,8 em 30 minutos.

[080] O revestimento entérico da presente invenção é revestido em um núcleo em uma quantidade de cerca de 16 mg a 30 mg, preferivelmente de 16 mg a 20 mg ou 25 mg ou menos. Quando a espessura do revestimento entérico da presente invenção é 5 μm a 100 μm e preferivelmente 20 μm a 80 μm, resultados satisfatórios podem ser obtidos como um revestimento entérico. O material do revestimento entérico pode ser adequadamente selecionado a partir de materiais poliméricos conhecidos. Os materiais poliméricos adequados são listados em vários documentos conhecidos [L. Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3a ed., 1986, páginas 365 ~ 373; H. Sucker et al., Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, páginas 355 - 359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4a ed., Vol. 7, páginas 739 ~ 742 e 766 ~ 778, (SpringerVerlag, 1971); e Remington’s Pharmaceutical Sciences, 13a ed., páginas 1689 ~ 1691 (Mack Publ., Co., 1970)] e derivados de éster de celulose, éteres de celulose, um copolímero de resina acrílica e metilacrilato e um copolímero de derivados de ácido maleico e ácido ftálico pode ser incluído neste.

[081] O revestimento entérico da presente invenção pode ser preparado usando um método de revestimento entérico convencional em que uma solução de revestimento entérico é pulverizada sobre um núcleo. Os solventes adequados usados para o processo de revestimento entérico são álcoois tal como etanol, cetonas tal como acetona, solventes de hidrocarboneto halogenado tal como diclorometano (CH2Cl2) e solventes mistos destes solventes. Um amaciante tal como ftalato de di-n- butila ou triacetina é adicionado à solução de revestimento em uma razão de 1 :cerca de 0,05 a cerca de 0,3 (material de revestimento:amaciante). É apropriado realizar o processo de pulverização continuamente e é possível ajustar a quantidade de pulverização em consideração das condições de revestimento. A pressão de pulverização pode ser variavelmente ajustada e resultados satisfatórios podem ser obtidos geralmente com uma pressão de pulverização de cerca de 1 bar a cerca de 1,5 bar.

[082] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso da referida cepa ou composição para a prevenção ou tratamento de doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias e ao uso da referida cepa ou composição para preparar um agente terapêutico para doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias.

[083] Especificamente, a presente invenção se refere a uma composição para o uso de prevenir ou tratar doenças intestinais, compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[084] Além disso, a presente invenção se refere a uma composição para o uso de prevenir ou tratar doenças alérgicas, compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[085] Além disso, a presente invenção se refere a uma composição para o uso de prevenir ou tratar doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa.

[086] A presente invenção também se refere ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa, para preparar um fármaco preventivo ou terapêutico para doenças intestinais.

[087] Além disso, a presente invenção se refere ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa, para preparar um fármaco preventivo ou terapêutico para doenças alérgicas.

[088] Além disso, a presente invenção se refere ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa, para preparar um fármaco preventivo ou terapêutico para doenças autoimunes ou doenças inflamatórias.

[089] O termo ‘prevenção’, como usado aqui, é associado com prevenir, retardar, impedir ou inibir doenças para reduzir as mesmas.

[090] O termo ‘tratamento’, como usado aqui, é associado com o cuidado de um indivíduo sofrendo de doenças de modo a melhorar, curar ou reduzir os sintomas das doenças ou reduzir ou parar a progressão das doenças.

[091] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para prevenir ou tratar doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz da referida cepa ou da referida composição a um indivíduo em necessidade de prevenção ou tratamento das referidas doenças ou em necessidade de alívio da saúde intestinal, reações alérgicas, nível diminuído de imunidade ou reações inflamatórias.

[092] Especificamente, a presente invenção fornece um método para tratar doenças intestinais, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[093] Além disso, a presente invenção fornece um método para tratar doenças alérgicas, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[094] Além disso, a presente invenção fornece um método para tratar doenças autoimunes ou doenças inflamatórias, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em uma cepa KBL382 de Lactobacillusparacasei (No de Acesso KCTC13509BP), uma cepa KBL384 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13510BP) ou uma cepa KBL385 de Lactobacillus paracasei (No de Acesso KCTC13511BP), culturas da referida cepa, lisados da referida cepa e extratos da referida cepa a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[095] Visto que a composição farmacêutica usada para o método para prevenir ou tratar as referidas doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias e o método de administração da mesma foram descritos acima, os teores de sobreposição entre a composição e o método serão omitidos aqui para evitar complexidade excessiva do presente relatório descritivo.

[096] Enquanto isso, o referido indivíduo ao qual a composição para prevenir ou tratar as referidas doenças intestinais, doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias pode ser administrada inclui todos os animais incluindo o ser humano. Por exemplo, o indivíduo pode ser um animal tal como cão, gato ou camundongo.

[097] Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhe através dos exemplos. Estes exemplos são apenas para ilustrar a presente invenção e estará evidente àqueles técnicos no assunto que o escopo da presente invenção não deve ser interpretado como sendo limitado por estes exemplos.

Exemplo 1. Triagem de cepas probióticas com função imunorreguladora

[098] Cepas probióticas tendo uma função imunorreguladora foram triadas usando a linhagem de célula THP-1 monocítica de leucemia e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Cepas derivadas do intestino humano ou vagina, respectivamente, foram semeadas às duas linhagens celulares acima de modo que a razão da linhagem celular:cepa foi 1:100 e a razão de IL-10, uma citocina principal indicando controle de inflamação, para IL-6, um citocina principal indicando uma reação inflamatória (IL-10/IL-6) e a razão de IL-10 para IFN-Y, uma citocina principal indicando reação autoimune (IL-10/IFN-Y) foram medidas. Um total de 23 cepas foi usado para a triagem como segue: duas cepas de Lactobacillus gasseri, uma cepa de Lactobacillus reuteri, cinco cepas de Lactobacillus rhamnosus, duas cepas de Lactobacillus fermentuma, quatro cepas de Lactobacillus paracasei, quatro cepas de Lactobacillus salivarius, uma cepa de Lactobacilus plantaruma, duas cepas de Lactobacillus acidophilus e duas cepas de Lactococcus lactis.

[099] Como um resultado da triagem, os valores de IL-10/IL-6 mais altos foram mostrados nas três cepas de Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 e KBL385. Em particular, entre as três cepas de Lactobacillus paracasei, KBL382 teve o valor de IL- 10/IL-6 mais alto de 2,22 na linhagem de célula THP-1 e o valor de IL-10/IFN-Y foi 9 em células mononucleares do sangue periférico, mostrando um efeito imunorregulador muito alto. A Tabela 1 abaixo mostra os resultados do valor de IL- 10/IL-6 e valor de IL-1 0/IFN-Y medidos para três cepas de Lactobacillus paracasei das vinte e três cepas probióticas usadas na presente triagem. Consequentemente, três cepas de Lactobacillus paracasei KBL382, KBL384 e KBL385 foram prognosticadas como tendo um alto efeito sobre melhorar a saúde intestinal e experimentos adicionais foram conduzidos nestas cepas.

Exemplo 2. Verificação do efeito das cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei sobre a expressão da citocina inflamatória e regulação da diferenciação de célula T (teste in vitro)

[0100] De modo a verificar o efeito imunorregulador das referidas cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei, a capacidade de gerar citocinas envolvidas na imunorregulação foi confirmada na linhagem de célula THP-1 tratada com as cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei, enquanto se o gene marcador de diferenciação de célula T foi expressado foi confirmada em PBMC tratada com as cepas KBL382 e KBL385 de Lactobacillus paracasei.

[0101] Primeiro, a linhagem de célula THP-1 foi semeada sobre cada poço de uma placa de 24 poços por 1 x 105 células, diferenciadas em macrófagos maduros e depois a solução de cultura foi substituída. Depois de 3 horas, um poço foi tratado com LPS em uma concentração de 1 μg/mL como um controle positivo e os outros poços foram tratados com a cepa KBL382, KBL384 ou KBL385 de Lactobacillus paracasei, cada um por 1 x 107 células com base no número de bactérias viáveis; depois de 24 horas, a solução de cultura foi coletada e a quantidade de cada citocina foi medida usando o kit de inflamação humana Cytometric Bead Array (CBA) BD (Cat No 551811) de acordo com o método do fabricante. Como um controle negativo (Cont), o poço foi tratado com tampão de PBS e o mesmo procedimento experimental foi realizado. Como um resultado, como mostrado na FIG. 1, a medição mostrou que um grupo de linhagens de célula THP-1 tratadas com cepas KBL382 e KBL385 de Lactobacillus paracasei teve uma quantidade significativamente mais baixa de citocinas inflamatórias IL-6, TNF, IL-1b e IL-8 do que o grupo tratado com LPS. No caso do tratamento com a cepa KBL384, foi confirmado que IL-6 foi significativamente mais baixa do que o grupo de teste tratado com LPS, mas TNF, IL-1b e IL-8 não foram diferentes significativamente do grupo tratado com LPS. No caso de IL-10, nenhum aumento ou diminuição significativo foi observado nos grupos tratados com a KBL382, KBL384 e KBL385 em comparação ao grupo tratado com LPS, mas foi observado que o aumento global no nível de IL-10 foi induzido em comparação ao grupo de controle negativo. Portanto, foi concluído que cepas KBL382 e KBL385 de Lactobacillus paracasei foram eficazes para suprimir significativamente a geração de citocinas inflamatórias em células THP-1 e o experimento subsequente foi conduzido para verificar o padrão de diferenciação de célula T.

[0102] De modo a confirmar o efeito das cepas KBL382 e KBL385 sobre a diferenciação de célula T, células PBMC foram semeadas sobre cada poço de uma placa de 24 poços por 5 x 105 células e depois a cepa KBL382 ou KBL385 de Lactobacillus paracasei foi adicionada por 5 x io6 células. Como um controle, E. coli (E. coli 0157 EC4115) foi adicionada a cada poço por 5 x 106 células com base no número de células viáveis ou LPS foi adicionada em uma concentração de 500 ng/mL. E. coli é conhecida aumentar a expressão dos genes T-bet, GATA3 e RORYt, que são marcadores de célula efetora de células T relacionadas à resposta inflamatória, enquanto LPS é conhecida aumentar a expressão do gene FOXP3, um marcador de células Treg relacionadas à regulação da inflamação. O grupo de teste de célula PBMC preparado sob as condições acima foi incubado por 5 dias e depois as células foram obtidas e coletadas. De modo a confirmar o nível de expressão gênica, primeiro, o Kit Total RNA Extraction (Intron) easy-spinTM (isento de DNA) foi usado para extrair o RNA e depois o Kit High Capacity RNA-to-cDNA (ThermoFisher) foi usado para sintetizar o cDNA. Uma PCR em tempo real foi conduzida no cDNA sintetizado com o kit Rotor-Gene SYBR Green PCR (Qiagen) usando um equipamento Rotor-Gene® Q (Qiagen) de acordo com o método do fabricante e a expressão do mRNA de T-bet que é o gene marcador de Th1 (marcador de célula efetora), GATA3 que é o gene marcador de Th2, RORYt que é o gene marcador de Th17 e FOXP3 que é o gene marcador de célula Treg foram medidas. Neste momento, o nível de expressão de genes B2M foi medido como um controle interno para corrigir o nível de expressão gênica relativo entre cada grupo de teste. A sequência de base do iniciador usado para confirmar a expressão de cada gene é como segue. B2M Dianteiro: 5’-CCA GCA GAG AAT GGA AAG TC-3’’(SEQ ID NO. 4) Reverso: 5’-GAT GCT TCT TAC ATG TCT CG-3’ (SEQ ID NO. 5) T-bet Dianteiro: 5’-CCC CAA GGA ATT GAC AGT TG-3’ (SEQ ID NO. 6) Reverso: 5’-GGG AAA CTA AAG CTC ACA AAC-3’ (SEQ ID NO. 7) GATA3 Dianteiro: 5’-CTG CAA TGC CTG TGG GCT C-3’ (SEQ ID NO. 8) Reverso: 5’-GAC TGC AGG GAC TCT CGC T-3’ (SEQ ID NO. 9) RORYt Dianteiro: 5’-AAG AGE CAT CGC CAA AGC AT-3’ (SEQ ID NO. 10) Reverso: 5’-TCC ACA TGC TGG CTA CAC UM-3’ (SEQ ID NO. 11) FOXP3 Dianteiro: 5’-TCA AGC AGE GCC AGG CG-3’ (SEQ ID NO. 12) Reverso: 5’-CAG GAG CCC TTG TCG GAT-3’ (SEQ ID NO. 13)

[0103] Como um resultado, como mostrado na FIG. 2, foi confirmado que as cepas KBL382 e KBL385 de Lactobacillus paracasei, comparado a E. coli, mantiveram o nível de expressão dos genes T-bet, GATA3 e RORYt, que são marcadores de célula efetora de células T inflamatórias, em um nível significativamente baixo, mas mRNA significativamente aumentado de FOXP3, um marcador de células Treg para manter a homeostase imunológica similarmente a LPS.

Exemplo 3. Verificação do efeito de cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei sobre a imunorregulação de célula T (teste in vitro)

[0104] Enquanto isso, de modo a verificar o efeito imunorregulador de célula T por cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei, o nível de expressão das citocinas inflamatórias foi verificado quando células T foram ativadas em células PBMC e depois seguido pelo tratamento com as referidas cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei.

[0105] Células PBMC foram semeadas sobre cada poço de uma placa de 96 poços por 2 x 105 células com um anticorpo anti-CD3 (1 μg/mL, ebioscience) para ativar células T e depois uma cepa KBL382, KBL384 ou KBL385 de Lactobacillus paracasei foi adicionada por 1 x 107 células para ser “bactérias:PBMC = 50:1”, com base no número de células viáveis. Como um controle, K12 de Escherichia coli (ATCC 10798) foi adicionada a cada poço por 1 x 107 células com base no número de células viáveis. Depois de incubar o grupo de teste de células PBMC ativadas por células T preparadas sob as condições acima por 3 dias, o sobrenadante foi coletado e a quantidade de cada citocina foi medida usando o kit de inflamação humana Cytometric Bead Array (CBA) BD (Cat No 551811) de acordo com o método do fabricante.

[0106] Como um resultado, como mostrado na FIG. 3, nas linhagens de célula PBMC de modo que células T fossem ativadas por adição de um anticorpo anti-CD3, todas as cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei significativamente diminuíram a expressão de IL-2, que é uma citocina de Th1, IL-4 e IL-13, que são respectivamente citocinas de IFNY e Th2 e IL-17A, que é uma citocina de Th17, em comparação ao grupo de teste tratado apenas com a cepa adicionada de E. coli e PBS, enquanto a citocina anti-inflamatória IL-10 foi acentuadamente aumentada em todas as três cepas de Lactobacillus paracasei usadas no experimento, em comparação ao grupo de teste tratado apenas com PBS; foi confirmado que especialmente a cepa KBL 382, entre as três, aumentou significativamente IL-10 em comparação ao grupo adicionado de E. coli. Os resultados do experimento como acima levaram a uma conclusão de que todas as cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei significativamente diminuíram as citocinas inflamatórias de células T e aumentaram as citocinas anti-inflamatórias.

Exemplo 4. Verificação do efeito de cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei sobre efeitos de alívio da enterite (teste in vivo)

[0107] O presente exemplo foi para confirmar se as cepas KBL382, KBL384 e KBL385 de Lactobacillus paracasei mostraram os efeitos de melhoria da função intestinal mesmo in vivo. Para esta finalidade, camundongos C57BL/6 foram divididos em grupos de 10 camundongos cada e depois alimentados com água de torneira com DSS a 2 % dissolvida nesta por 9 dias e induzindo, desse modo, a enterite. Ao mesmo tempo, os camundongos no grupo de controle foram oralmente administrados com 200 μL de PBS diariamente e os camundongos no grupo de teste foram diariamente fornecidos por intermédio de uma administração oral com 200 μL de cada uma das cepas KBL382, KBL384 ou KBL385 de Lactobacillus paracasei que foi diluído em PBS para ser 2 x 1010 CFU/mL de modo que a quantidade de administração diária possa ser ajustada para 4 x 109 CFU. Depois, durante os 9 dias em que a enterite foi induzida por DSS, as mudanças de peso corpóreo dos camundongos no grupo de controle e grupo de teste foram medidas diariamente e no 9o dia depois que DSS foi fornecida, os camundongos foram submetidos a autópsias para medir o comprimento do cólon.

[0108] Como um resultado, como mostrado na FIG 4, foi confirmado que com respeito às mudanças de peso corpóreo, os grupos tratados com as cepas KBL382, KBL384 e KBL385, todos mostraram um efeito significativo sobre aliviar a perda de peso, em comparação aos camundongos no grupo de controle sem nenhum tratamento; com respeito à mudança no comprimento do cólon, a amplitude da diminuição no comprimento do cólon foi significativamente melhorada em todos os grupos de três cepas, em comparação aos camundongos no grupo de controle.

[0109] Além disso, manchamento com H&E foi realizado para medir o grau de inflamação nos grupos de teste de cepas KBL382 e KBL385 e níveis de Mieloperoxidase (MPO) foram medidos nos tecidos. Depois da autópsia, de modo a examinar as lesões do cólon por manchamento com H&E, a parte distal do cólon foi fixada em solução de formalina neutra a 10 % e depois espécimes teciduais de parafina foram cortadas com uma espessura de 5 μm, manchadas com hematoxilina & eosina e observadas com um microscópio óptico. Além disso, para a medição de MPO, o tecido do cólon foi, primeiro, colocado em tampão de RIPA ao qual um inibidor de protease foi adicionado e foi rompido com um homogeneizador. Depois de centrifugar o tecido rompido a 4 °C. em 15,000 x g por 10 minutos, MPO foi medido usando o sobrenadante de acordo com o protocolo do kit ELISA (Hycult Biotech, MPO, Mouse, cat. HK210-02).

[0110] Como um resultado, como mostrado na FIG. 4, foi confirmado através dos resultados do manchamento com H&E, que todos os grupos de teste que as duas cepas, KBL382 e KBL385, foram administradas, aliviaram a inflamação em comparação ao grupo de controle e o nível of MPO foi levemente diminuído no grupo de teste de KBL385 e diminuiu significativamente no grupo de teste de KBL382. Usando os tecidos do cólon assim obtidos foram usados para confirmar o efeito de fortalecimento sobre a junção apertada da parede do trato intestinal.

Exemplo 5. Efeitos das cepas KBL382 e KBL385 de Lactobacillus paracasei sobre o fortalecimento da junção apertada da parede do trato intestinal

[0111] De modo a verificar os efeitos das cepas KBL382 e KBL385 de Lactobacillus paracasei sobre o fortalecimento da junção apertada da parede do trato intestinal, os níveis de expressão de mRNA de genes envolvidos na junção apertada da parede do trato intestinal foram comparados e medidos nas células isoladas do tecido do cólon do camundongo isolado no Exemplo 4. Para verificar a quantidade de expressão gênica, RNA foi primeiro extraído dos tecidos usando o Kit Total RNA Extraction (Intron) easy-spinTM (isento de DNA) e depois o cDNA foi sintetizado com o Kit High Capacity RNA-to-cDNA (ThermoFisher). O kit Rotor-Gene SYBR Green PCR (Qiagen) foi usado para medir in vivo o nível de expressão de mRNA de zonula occluden-1 (ZO-1), Claudin3 e MUC-4, que são as proteínas marcadoras da junção apertada da parede do trato intestinal, usando um Rotor-Gene® Q (Qiagen). O nível de expressão do gene hipoxantina-guanina fosforribosil-transferase (HPRT) foi medido como um controle para normalizar o nível de expressão gênica relativo entre cada grupo de teste. O iniciador usado para confirmar a expressão é preparado para ser capaz de se ligar especificamente a cada gene como segue. Zo-1 Fw: 5’-ACC CGA AAC TGA TGC TGT GGA TAG-3’ (SEQ ID NO. 14) Rw: 5’-AAA TGG CCG GGC AGA AGE TGT GTA-3’ (SEQ ID NO. 15) Claudin3 Fw: 5’-CAG ACG TCC GTC AGT TTT CG-3’ (SEQ ID NO. 16) Rw: 5’-CAT GGC TGC TGG AGE TGA AC-3’ (SEQ ID NO. 17) MUC-4 Fw: 5’-GTC TCC CAT CAC GGT TCA GT-3’ (SEQ ID NO. 18) Rw: 5’-TGT CAT TCC ACA CTC CCA GA-3’ (SEQ ID NO. 19) HPRT Fw: 5’-TTA TGG ACA GGA CTG AAA GAC-3’’ (SEQ ID NO. 20) Rw: 5’-GCT TTA ATG TAA TCC AGC AGG T-3’’ (SEQ ID NO. 21)

[0112] Como um resultado, como mostrado na FIG. 5, foi descoberto que os níveis dos três genes medidos nos camundongos dosados com as cepas KBL382 e KBL385 foram aumentados em comparação ao grupo de controle dosado com apenas PBS e deste modo a junção apertada da parede do trato intestinal foi recuperada; consequentemente, as referidas cepas podem ser usadas para tratar a doenças tais como IBD e IBS.

Exemplo 6. Comparação dos efeitos de alívio da enterite entre um anticorpo terapêutico para enterite e KBL382

[0113] Infliximabe (nome do produto, Remicade) é um fármaco terapêutico de anticorpo recombinante usado como uma injeção para doenças autoimunes tais como artrite reumatoide, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, doença de Crohn em adultos, doença de Crohn em crianças, psoríase e artrite psoriática. O propósito deste estudo foi confirmar a diferença no efeito sobre o alívio dos sintomas de doença intestinal in vivo entre a cepa KBL 382 e o infliximabe.

[0114] Para a comparação dos efeitos, depois de dividir os camundongos C57BL/6 em grupos de oito camundongos, os camundongos foram alimentados com água de torneira com DSS a 2 % dissolvida nesta por 9 dias, induzindo a enterite. Ao mesmo tempo, 200 μL de PBS foi oralmente administrado aos camundongos no grupo de controle diariamente, enquanto 200 μL da cepa KBL382 diluída em PBS para ser 2 x io10 CFU/mL foi oralmente administrado aos camundongos no grupo de teste diariamente de modo que a quantidade de administração diária possa ser ajustada para 4 x 109 CFU. Ao grupo de administração de anticorpo terapêutico, o anticorpo infliximabe foi administrado uma vez no Dia 3 para ser uma dose de 5 mg/kg por camundongo.

[0115] Mais tarde, durante os 9 dias em que a enterite foi induzida por DSS, as mudanças de peso corpóreo dos camundongos no grupo de controle e grupo de teste foram medidas diariamente e no 9o dia depois que DSS foi fornecida, os camundongos foram submetidos a autópsias para medir o comprimento do cólon.

[0116] Como um resultado, como mostrado na Fig. 6(A), com respeito à mudança no comprimento do cólon, foi confirmado que a amplitude da diminuição no comprimento do cólon foi significativamente melhorada nos grupos que a cepa KBL382 foi tratada e que infliximabe foi administrado, comparado aos camundongos no grupo de controle. Foi confirmado que o efeito de melhorar o comprimento do cólon do grupo que a cepa KBL382 foi tratada foi similar ou um pouco mais alto do que o grupo que infliximabe foi administrado.

[0117] Com respeito à mudança nos pesos corpóreos, como mostrado na Fig. 6(B), o efeito sobre a diminuição do peso corpóreo foi significativamente melhorado nos grupos que a cepa KBL382 foi tratada e que infliximabe foi administrado, comparado aos camundongos no grupo de controle sem nenhum tratamento. Foi confirmado que o efeito de aliviar a perda de peso inicial durante cinco dias depois da administração foi superior no grupo que infliximabe foi administrado sobre o grupo que a cepa KBL382 foi tratada, mas, mais tarde, o efeito de melhoria por infliximabe foi diminuído, enquanto o efeito do grupo tratado com cepa KBL382 sobre a perda de peso foi aumentado, mostrando efeitos similares entre os dois grupos até o 9o dia. Consequentemente, com respeito ao uso da referida cepa para o tratamento de doenças inflamatórias intestinais e síndrome do intestino irritável, foi confirmado que um efeito terapêutico similar aos anticorpos terapêuticos comercialmente disponíveis pode ser esperado.

Exemplo 7. Efeitos de KBL382 sobre o alívio de condições atópicas

[0118] De modo a verificar o efeito sobre o alívio atópico da cepa KBL382, o modelo de camundongo NC/Nga, um modelo animal de doença de pele atópica, foi usado.

[0119] Depois de dividir os camundongos NC/Nga em grupos de nove camundongos, o dorso de cada camundongo foi depilado da orelha inferior até a cauda superior e os camundongos foram deixados por 24 horas. Depois, um unguento compreendendo extrato de Dermatophagoides farinae (DFE), um antígeno de ácaro da poeira doméstica (HDM), foi aplicado uma vez ou duas vezes por semana por sete semanas sobre a porção depilada de modo que cada camundongo possa ser tratado com 100 mg de DFE e induzindo, desse modo, a dermatite atópica. A partir da terceira semana de indução de dermatite, 200 μL de PBS foi oralmente administrado aos camundongos no grupo de controle diariamente; cada uma da cepa KBL382 e cepa KBL365 de Lactobacillus rhamnosus, que foi diluída em 200 μL de PBS para ser pelo menos 1 x 109 CFU/camundongo, foi oralmente administrada aos camundongos no grupo de teste por 200 μL diariamente. Depois, durante quatro semanas de administração das bactérias, os escores de dermatite dos camundongos no grupo de controle e grupo de teste foram medidos semanalmente e na 4a semana depois da administração das bactérias, o tempo de coçar e a espessura da pele do camundongo e a concentração de IgE no sangue depois de conduzir autópsias dos camundongos foram medidos. 7-1. Avaliação do escore de dermatite

[0120] Para avaliar as lesões de pele induzidas por DFE, o escore de dermatite foi medido através do método seguinte. Condições da pele foram monitoradas tirando-se imagens por 4 semanas em intervalos de uma semana a partir da 3a semana desde que a cepa foi administrada. Quatro indicadores de secura, edema, eritema/hemorragia e erosão/escoriação da pele foram verificados. O escore total foi avaliado com 0 pontos para nenhuma lesão, 1 ponto para suave, 2 pontos para moderada e 3 pontos para severa.

[0121] Como um resultado, como mostrado na FIG. 7(A), o escore de dermatite foi significativamente reduzido no grupo dosado com a cepa KBL382, comparado ao grupo de controle (negativo) onde a dermatite atópica foi induzida e ao grupo que a cepa KBL365 foi administrada. Como um resultado, o efeito de aliviar o escore de dermatite atópica de acordo com a entrada da cepa KBL382 foi verificado. 7-2 Efeitos sobre o alívio dos sintomas de coceira

[0122] De modo a verificar o efeito de aliviar a coceira de acordo com a administração de cepa KBL382 nos modelos de camundongo sofrendo de dermatite atópica induzida por DFE, o número de coçadas foi medido para o camundongo durante 10 minutos depois de 4 semanas da administração da cepa.

[0123] Como um resultado, como pode ser observado na FIG. 7(B), pareceu que o número de coçadas foi significativamente reduzido no grupo de teste que KBL382 foi administrada, em comparação ao grupo com administração de PBS, o que confirmou que os sintomas de coceira de dermatite atópica foram aliviados pela administração da cepa KBL382. 7-3. Diminuição da espessura da pele

[0124] De modo a verificar o efeito de diminuir a espessura da pele depois da administração de KBL382 a modelos de camundongo sofrendo de dermatite atópica induzida por DFE, a espessura da orelha do camundongo e a espessura da pele dorsal foram medidas com calibres quatro semanas depois que a cepa foi administrada e o alívio do sintoma de edema devido à dermatite atópica foi observado. Como um resultado, como pode ser observado na FIG. 7(C), foi observado que no grupo de teste dosado com KBL382, as espessuras da orelha e pele foram significativamente reduzidas, em comparação ao grupo de controle e ao grupo administrado com KBL365. 7-4. Diminuição na Concentração de IgE no Sangue

[0125] Foi descoberto qeu a concentração de IgE em pacientes tendo dermatite atópica aumentou principalmente conforme a severidade clínica de dermatite atópica aumentou (Matsumoto M, J. Immunol. 1999). Assim, a concentração de IgE, um fator hematológico representativo aparecendo como dermatite atópica surge, foi medida coletando-se o sangue três semanas depois que a cepa foi administrada, separando-se o soro do mesmo e usando-se o Mouse IgE ELISA Set (Cat No 555248, BD OptEIA™). Como um resultado, como mostrado na FIG. 7(D), foi descoberto que a concentração de IgE no sangue foi significativamente diminuída no grupo de teste que KBL382 foi oralmente administrada, que indicou o efeito do tratamento de dermatite atópica depois da entrada de KBL382.

[0126] Os aspectos específicos da presente invenção foram descritos em detalhe acima e é óbvio àqueles técnicos no assunto que estes aspectos específicos são apenas as modalidades preferidas e o escopo da presente invenção não é limitado desse modo. Portanto, o escopo da presente invenção é substancialmente definido pelas reivindicações seguintes, com equivalentes às reivindicações. Nome da Organização Depositária: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology No de Acesso: KCTC13509BP Data de Acesso: 20180417 Nome da Organização Depositária: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology No de Acesso: KCTC13510BP Data de Acesso: 20180417 Nome da Organização Depositária: Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology No de Acesso: KCTC13511 BP Data de Acesso: 20180417

Aplicabilidade Industrial

[0127] As cepas de Lactobacillus paracasei KBL382 (No de Acesso KCTC13509BP), Lactobacillus paracasei KBL384 (No de Acesso KCTC13510BP) e Lactobacillus paracasei KBL385 (No de Acesso KCTC13511BP) de acordo com a presente invenção têm excelentes funções anti-inflamatórias e imunomoduladoras funções, têm um excelente efeito de fortalecimento sobre a junção apertada da parede do trato intestinal, suprimem a perda de peso induzida por enterite e redução do comprimento do cólon, exibindo, desse modo, um efeito terapêutico para enterite e enfraquecem a reação alérgica de células e significativamente aliviam os sintomas de dermatite atópica e fornecendo, desse modo, melhoria das doenças alérgicas. Portanto, uma única cepa pode obter realce de efeitos anti-inflamatórios, fortalecimento da imunidade, melhoria das funções de saúde intestinal e alívio de doenças alérgicas e assim pode ser útil como um material probiótico. Texto Livre da Listagem de Sequências

[0128] Um arquivo eletrônico da Listagem de Sequências anexa

Claims (15)

1. Cepa CARACTERIZADA pelo fato de que é de Lactobacillus paracasei KBL385 com No de Acesso KCTC13511 BP.

2. Cepa, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita cepa compreende a sequência de 16s rDNA da SEQ ID NO: 3.

3. Composição alimentar CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa.

4. Composição de aditivo alimentar CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa.

5. Composição alimentar, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição é uma composição alimentar funcional saudável para a melhoria da saúde intestinal.

6. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças intestinais CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que as ditas doenças intestinais são selecionadas a partir do grupo que consiste em distensão abdominal, desconforto abdominal, diarreia infecciosa causada por microrganismos patogênicos, gastroenterite, doenças inflamatórias intestinais, síndrome da intestinite neurogênica, síndrome do intestino irritável, crescimento excessivo de microrganismos no intestino delgado e diarreia alimentar intestinal.

8. Composição alimentar, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição é uma composição alimentar funcional saudável para melhorar sintomas alérgicos.

9. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças alérgicas CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita doença alérgica é dermatite atópica, urticária, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, asma, alergia alimentar ou choque anafilático.

11. Composição alimentar, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição é uma composição alimentar funcional saudável para aliviar doenças autoimunes ou doenças inflamatórias.

12. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de doenças autoimunes ou doenças inflamatórias CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa.

13. Uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparar um fármaco para prevenir ou tratar doenças intestinais.

14. Uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparar um fármaco para prevenir ou tratar doenças alérgicas.

15. Uso de uma composição compreendendo pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste na cepa, como definida na reivindicação 1 ou 2, culturas da dita cepa, lisados da dita cepa e extratos da dita cepa, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparar um fármaco para prevenir ou tratar doenças autoimunes ou doenças inflamatórias.