BR122024010593A2

BR122024010593A2 - Método para produzir um anticorpo biespecífico

Info

Publication number: BR122024010593A2
Application number: BR122024010593-4A
Authority: BR
Inventors: Patrick Engelberts; Esther BREIJ; Rik RADEMAKER; Isil Altintas; David Satijn; Sandra Verploegen; Riemke VAN DIJKHUIZEN RADERSMA; Edward VAN DEN BRINK; Janine Schuurman; Paul Parren
Original assignee: Genmab A/S.
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2024-07-02

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO BIESPECÍFICO Anticorpos biespecíficos direcionados a CD3 e CD20 e usos de tais anticorpos biespecíficos, em particular uso dos mesmos no tratamento de doenças, nas quais é desejada direcionamento específico e morte mediada por célula T de células que expressam CD20.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a anticorpos biespecíficos direcionados a CD3 e CD20 e aos usos de tais anticorpos biespecíficos, em particular uso dos mesmos no tratamento de doenças em que o direcionamento específico e a morte mediada por célula T de células que expressam CD20 são desejados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] CD3 foi conhecida por muitos anos e, portanto, foi objeto de interesse em muitos aspectos. Especificamente anticorpos incitados contra CD3 ou o Complexo Receptor de célula T, do qual CD3 é parte, são conhecidos. Uma caracterização in vitro de cinco anticorpos variantes de função atuadora OKT3 humanizados foi descrita (Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1): 16-26).

[003] O tratamento com o anticorpo monoclonal anti-CD3 hOKT3gama1(Ala-Ala) resulta em respostas de peptídeo C melhoradas e parâmetros clínicos por pelo menos 2 anos depois do início da diabete tipo 1 na ausência de medicações imunossupressivas continuadas (Herold et al., 2005, Diabetes, 54(6): 1763-9).

[004] Os anticorpos de CD3 reativos cruzados com CD3 de macaco cinomolgo e/ou rhesus foram descritos (WO2012162067, WO2008119567).

[005] Um método promissor para melhorar a terapia de anticorpo alvejada é pela liberação de células citotóxicas especificamente para as células cancerosas que expressam antígeno. Este conceito de usar células T para morte eficiente de células de tumor foi descrito em Staerz, et al., 1985, Nature 314: 628-631. Entretanto, os estudos clínicos iniciais foram bastante decepcionantes principalmente devido à baixa eficácia, efeitos adversos graves (tempestade de citocina) e imunogenicidade dos anticorpos biespecíficos (Muller e Kontermann, 2010, BioDrugs 24: 89-98). Avanços no projeto e aplicação de anticorpos biespecíficos têm parcialmente superado a barreira inicial de tempestade de citocina e melhorado a eficácia clínica sem toxicidades limitantes da dose (Garber, 2014, Nat. Rev. Drug Discov. 13: 799-801; Lum e Thakur, 2011, BioDrugs 25: 365-379). Crítico para superar a barreira inicial da tempestade de citocina como descrito para catumaxomab (Berek et al. 2014, Int. J. Gynecol. Cancer 24(9): 1583-1589; Mau-S0rensen et al. 2015, Cancer Chemother. Pharmacol. 75: 1065-1073), foi a ausência ou silenciamento do domínio Fc.

[006] A molécula de CD20 (também chamado antígeno de diferenciação restrita a linfócito B humano ou Bp35) é uma proteína de transmembrana hidrofóbica com um peso molecular de aproximadamente 35 kD localizada nos linfócitos pré-B e B maduros (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287; e Einfield et al., (1988) EMBO J. 7(3): 711-717). CD20 é encontrada na superfície de mais do que 90 % das células B do sangue periférico ou órgãos linfóidicos e é expressa durante o desenvolvimento de célula pré-B precoce e permanece até a diferenciação da célula plasmática. A CD20 está presente tanto nas células B normais assim como nas células B malignas. Em particular, a CD20 é expressa em mais do que 90 % dos linfomas de não Hodgkin (NHL) de célula B (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433), mas não é encontrada nas células tronco hematopoiéticas, células pró-B, células plasmáticas normais, ou outros tecidos normais (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2): 973-979).

[007] Métodos para tratar câncer assim como doenças autoimunes e imunes pelo alvejamento de CD20 são conhecidos na técnica. Por exemplo, o anticorpo de CD20 quimérico rituximab foi usado ou sugerido para o uso no tratamento de cânceres tais como linfoma de não Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica crônica (CLL) e linfoma linfocítico pequeno (SLL). O anticorpo de CD20 monoclonal humano ofatumumab foi usado ou sugerido para o uso no tratamento entre outras várias indicações de CLL, linfoma folicular (FL), neuromielite óptica (NMO), esclerose múltipla difusa e esclerose múltipla remitente-recorrente (RRMS). O anticorpo de CD20 monoclonal humano obinutuzumab foi usado para ou sugerido para o uso no tratamento de CLL. Além disso, o anticorpo de CD20 humanizado ocrelizumab está sendo desenvolvido para RRMS.

[008] Gall et al. (2005 Experimental Hematology 33: 452) descrevem o anticorpo biespecífico CD3xCD20 CD20bi resultante da heteroconjugação química do anticorpo quimérico específico de CD20 Rituximab (Rituxan) ao anti-CD3 (Orthoclone OKT-3).

[009] Stanglmaier et al. (2008 Int. J. Cancer: 123, 1181) descrevem a combinação Bi20/FBTA05 de anticorpo anti-CD3xanti-CD20 trifuncional biespecífico um IgG2a de camundongo específico de CD20 e um IgG2b de rato específico de CD3.

[0010] Wu et al. (2007 Nat Biotechnol. 25: 1290-1297) e WO2011014659 descrevem uma imunoglobulina G tetravalente, específica dupla (CD3 e CD20) (imunoglobulina de domínio variável duplo, DVD-Ig).

[0011] A WO2011090762 descreve a geração de um heterodímero de polipeptídeo CD3xCD20.

[0012] A WO2011028952 descreve entre outros a geração de moléculas biespecíficas CD3xCD20 usando a tecnologia do domínio Fc biespecífico XmAb da Xencor.

[0013] A WO2014047231 descreve REGN1979 e outros anticorpos biespecíficos CD3xCD20 gerados usando a tecnologia FcΔAdp da Regeneron Pharmaceuticals.

[0014] Sun et al. (2015, Science Translational Medicine 7, 287ra70) descrevem um anticorpo biespecífico dependente de célula T anti-CD20/CD3 que alveja célula B construída usando a tecnologia “knobs-into-holes”.

[0015] Anticorpos biespecíficos que se ligam tanto à CD3 quanto à CD20 podem ser úteis em cenários terapêuticos em que o direcionamento específico e a morte mediada por célula T de células que expressam CD20 são desejados, e existe ainda uma necessidade quanto a anticorpos biespecíficos CD3xCD20 mais eficientes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] É um objetivo da presente invenção fornecer novos anticorpos biespecíficos eficientes compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno derivada de um anticorpo de CD3 e uma segunda região de ligação a antígeno derivada de um anticorpo de CD20.

[0017] Os novos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 são úteis em cenários terapêuticos em que o direcionamento específico e a morte mediada por célula T de células que expressam CD20 são desejados. Os novos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 são altamente eficientes em matar células que expressam CD20, incluindo células com baixos números de cópia de CD20, e foi mostrado ser altamente potente na erradicação de células de tumor em modelos de animal. Os novos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 são vantajosos pela indução rápida e morte forte de células em dosagem baixa. Os novos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 são além disso capazes de induzir citotoxicidade tanto nas células T CD4+ quanto nas células T CD8+ o que os tornam adequados para engajar células T para matar tumores positivos em CD20 e outras doenças envolvendo células positivas em CD20. Além disso, os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 são eficientes em esgotar células B de estruturas linfoides. Consequentemente, é um objetivo da presente invenção fornecer um anticorpo biespecífico CD3xCD20 que seja capaz de induzir citotoxicidade tanto em células T CD4+ quanto células T CD8+. É um outro objetivo da presente invenção fornecer um anticorpo biespecífico CD3xCD20 que seja altamente eficiente em matar as células que expressam CD20 tais como células de tumor que expressam CD20. É um outro objetivo da presente invenção fornecer um anticorpo biespecífico CD3xCD20 que seja altamente eficiente em matar cânceres que expressam CD20.

[0018] Estes e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Figura 1: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 às células Daudi (A-F) e Jurkat (G-I). (a) Ligação de bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR e IgG1-7D8, (B) Ligação de bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR e IgG1-2F2, (C) Ligação de bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR e IgG1-RTX, (D) Ligação de bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR e IgG1-11B8, (E) Ligação de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR e IgG1-GA101, (F) Ligação de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR (e IgG1-7D8). Os dados mostrados são médias geométricas de intensidade de fluorescência (geomédia) (A-E) e intensidade de fluorescência média (F) de ligação às células Daudi, como determinado pela citometria de fluxo, para dois experimentos representativos (A-E de um, F do outro). (G) Ligação de bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR (huCLB-T3/4x7D8), bsIgG1- huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR (huCLB-T3/4x2F2), bsIgG1-huCLB- T3/4-FEALxCD20-GA101-FEAR (huCLB-T3/4xGA101), bsIgG1-huCLB- T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR (huCLB-T3/4x11B8) e IgG1-7D8-FEAR bivalente monoespecífico às células Daudi, (H) Ligação de bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2- FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR, bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8- FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR, bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxb12-FEAR e IgG1-huCD3-H1L1-FEAL monoespecífico, bivalente às células Jurkat (I) Ligação de bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20- 7D8-FEAR, bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR. bsIgG1-huCLB- T3/4-FEALxCD20-GA101-FEAR, bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-RTX- FEAR, bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR, bsIgG1-huCLB- T3/4-FEALxCD20-2C6-FEAR, bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxb12-FEAR e IgG1-huCLB-T3/4-FEAL monoespecífico, bivalente às células Jurkat. Os dados mostrados são intensidade de fluorescência média, como determinado pela citometria de fluxo, de um experimento representativo.

[0020] Figura 2: Ligação simultânea dependente da concentração de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (CD3xCD20) às células T e células B. A ligação simultânea do anticorpo biespecífico bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (CD3xCD20) às células B e T no sangue foi analisada pela citometria de fluxo. Os dados mostrados são de um experimento representativo. Os dados mostrados são o número de eventos duplo-positivos (CD19 e CD4 [A] ou CD19 e CD8 [B]), como determinado pelo número de eventos no quadrante superior direito da plotagem de pontos da citometria de fluxo de CD4/CD19 ou a de CD8/CD19. Os símbolos fechados e abertos indicam dados de doadores saudáveis diferentes. IgG1-2F2 (2F2, CD20-específico) e bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR (CD3xb12, específico de CD3) foram incluídos como anticorpos de controle negativo.

[0021] Figura 3: Indução de citotoxicidade IN VITRO pelos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 em linhagens de célula de linfoma de célula B e de leucemia de célula B humanos. (a) células Daudi foram incubadas com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (CD3x7D8), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR (CD3x11B8), os anticorpos monoespecíficos CD20 IgG1-7D8 (7D8), IgG1-7D8-FEAR (7D8-FEAR; com região Fc inativa), IgG1-11B8-F405L ou IgG1-11B8-FEAR (11B8-FEAR; com região Fc inativa), e o anticorpo de controle biespecífico bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxb12-FEAR (CD3xb12) PBMCs foram usadas como células atuadoras. (B) as células Daudi foram incubadas com BsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR (CD3x7D8), o anticorpo monoespecífico CD20 IgG1-7D8-FEAR (7D8-FEAR; com região Fc inativa) e bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxb12-FEAR (CD3xb12), células T purificadas foram usadas como células atuadoras. (C-F) as células Daudi foram incubadas com anticorpos biespecíficos CD3xCD20 com base em dois braços CD3 diferentes (braços Fab huCD3-H1L1-FEAL e huCLB-T3/4-FEAL, representados pelos símbolos abertos e fechados, respectivamente) e quatro braços CD20 diferentes: 7D8 (BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR e BsIgG1- huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR; [C]), 11B8 (BsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-11B8-FEAR e BsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8- FEAR; [D]), GA101 (BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR e BsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-GA101-FEAR; [E]) e 2F2 (BsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR e BsIgG1-huCLB-T3/4- FEALxCD20-2F2-FEAR; [F]). (G-M) Linhagens de célula B diferentes foram usadas como células alvo e incubadas com anticorpos como indicados. Os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 contiveram o braço Fab huCD3-H1L1- FEAL e braços Fab CD20 diferentes (7D8, 11B8, 2F2, GA101 ou RTX) como indicados. O anticorpo de CD3 sozinho foi IgG1-huCD3-H1L1. As células T purificadas foram usadas como células atuadoras. (N) as células Daudi foram incubadas com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (CD3x7D8), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR (CD3x2C6) e bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR (CD3xb12), as células T purificadas foram usadas como células atuadoras. Os dados mostrados são porcentagens médias de lise específica ± S.D de poços em triplicata e os dados para cada gráfico foram obtidos de um experimento representativo.

[0022] Figura 4: Indução dependente da dose de citotoxicidade IN VITRO pelo bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR usando células T totais purificadas (CD3+), células T CD4+ (CD3+CD8-) e células T CD8+ (CD3+CD8+) como células atuadoras. As células Daudi foram incubadas com os subconjuntos de célula T diferentes, como indicado, e uma série de diluição de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR ou os anticorpos de controle IgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR e IgG1-7D8- FEAR (dados não mostrados). Os dados mostrados são porcentagens médias da lise de célula de tumor ± S.E.M. de poços em triplicata (A, B).

[0023] Figura 5: Cinéticas de citotoxicidade dependente de bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR em células Daudi. As células Daudi foram incubadas com bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8- FEAR na presença de células T purificadas isoladas de dois doadores diferentes (A e B). A citotoxicidade foi avaliada depois de 4, 12, 24, 48 e 72 horas de incubação (a) ou depois de 3, 16 e 24 horas de incubação (B). Os dados mostrados são porcentagens de morte de célula ± S.D. de poços em triplicata de células incubadas com bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8- FEAR para diferentes tempos de incubação. Os dados mostrados em A e B são de dois experimentos independentes, usando células T purificadas isoladas de dois doadores diferentes.

[0024] Figura 6: Eficácia da indução de citotoxicidade IN VITRO pelos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 em razões de atuador para alvos diferentes. Um ensaio de citotoxicidade foi realizado usando anticorpos biespecíficos CD3xCD20 diferentes e razões E/T diferentes. Os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 incluíram bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20- 7D8-FEAR (a), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR (B), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR (C), bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR (D) e bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20- 2F2-FEAR (E). Como um controle negativo, bsIG1-huCLB-T3/4-FEALxb12- FEAR foi incluído em uma razão E/T de 10:1. Os dados mostrados são porcentagens médias de lise ± S.D. de poços em triplicata como determinado em um ensaio de citotoxicidade para um experimento representativo. Cada linha representa uma razão E/T diferente (como indicado).

[0025] Figura 7: Atividade citotóxica de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 no modelo de coenxerto Raji-luc em camundongos NOD- SCID. (a) Tamanho de tumor médio em camundongos que foram tratados com veículo (PBS) ou bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR nas doses indicadas. As barras de erro indicam S.E.M. (B) O tamanho de tumor em camundongos individuais depois do tratamento com PBS ou bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR no dia 21 depois da inoculação de tumor. A análise estatística de dados no dia 21 foi realizada usando Kruskal Wallis (comparação múltipla de Dunn como pós-teste). **p<0,01 (C) plotagens de Kaplan-Meier com corte de tamanho de tumor ajustado a 600 mm3. A significância estatística de diferenças na sobrevivência entre os grupos tratados com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR e o grupo de controle tratado com PBS foram avaliados pela análise de Mantel Cox. *p<0,05, **p<0,01, n.s. não significante (D) Tamanho de tumor médio em camundongos que foram tratados com veículo (PBS) ou bsIgG1-huCLB- T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR nas doses indicadas. As barras de erro indicam S.E.M. (E) O tamanho do tumor em camundongos individuais nos diferentes grupos de tratamento no dia 25 depois da inoculação de tumor. A análise estatística foi realizada usando o teste de Kruskal Wallis (comparação múltipla de Dunn como pós-teste) (F) Plotagens de Kaplan-Meier com corte do tamanho de tumor ajustado a 500 mm3. A significância estatística das diferenças entre grupos de tratamento e o grupo de controle de veículo foi analisado pela análise de Mantel Cox. *p<0,05, ** p< 0,01, n.s. não significante. (G) Tamanho de tumor médio em camundongos que foram tratados com veículo (PBS), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR ou bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR nas doses indicadas. As barras de erro indicam S.E.M. (H) Tamanho do tumor em camundongos individuais depois do tratamento com PBS, ou bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR ou bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8- FEAR no dia 20 depois da inoculação de tumor. A análise estatística dos dados no dia 20 foi realizada usando ANOVA de uma via (comparação múltipla de Tukey como pós-teste). *p<0,05, **p<0,01 (I) Plotagens de Kaplan-Meier com corte do tamanho de tumor ajustado a 500 mm3. A significância estatística das diferenças na sobrevivência entre os grupos tratados com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR e o grupo de controle tratado com PBS foram avaliados pela análise de Mantel Cox. *p<0,05, **p<0,01, n.s. não significante.

[0026] Figura 8: Atividade antitumor de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR em um modelo de xenoenxerto Daudi-luc em camundongos HIS. (a) Tamanho de tumor médio no modelo de xenoenxerto de Daudi-luc em camundongos BRGS-HIS depois do tratamento com PBS (controle de veículo), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (mAb2) ou o anticorpo de controle biespecífico bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxb12-FEAR (mAb1) nos níveis de dose indicados. A carga de tumor foi avaliada pela formação de imagem de bioluminescência. As barras de erro indicam S.E.M. (B) A análise estatística foi realizada no dia 21 (o teste de Kruskal Wallis seguido pela comparação múltipla de Dunn pós-teste) ** p< 0,01 (C) A caracterização de populações leucocitárias de leucócito de sangue periférico em camundongos BRGS-HIS que carregam xenoenxerto de Daudi- luc depois do tratamento com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8- FEAR ou o anticorpo biespecífico de controle bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxb12-FEAR, como determinado pela citometria de fluxo no dia 9. As células %hCD45+ representa a porcentagem total de leucócitos humanos em sangue periférico de camundongo. %hCD19+, %hCD3+ e %hCD3+FSChi representam a porcentagem de células B, células T e células T ativadas, respectivamente, dentro da população de leucócitos humanos.

[0027] Figura 9: Estudo dos efeitos de uma dose única de bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR em macacos cinomolgos. As contagens de célula B (células CD19+CD21+) (a) e contagens de célula T (células CD4+ mais CD8+) (B) com o tempo em sangue periférico de macacos cinomolgos tratados com doses diferentes de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR (0,01, 0,1, 1 ou 10 mg/kg). Dias 18 e 11 mostram contagens de célula B e T na pré-dose. As células B (C) e células T (D) como porcentagem da população linfocítica total com o tempo em amostras de linfônodos de macacos cinomolgos tratados com doses diferentes de bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (0,01, 0,1, 1 ou 10 mg/kg). Os níveis plasmáticos de IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y e TNF-α em macacos cinomolgos tratados com doses diferentes de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR (0,01, 0,1, 1 ou 10 mg/kg) (E). O perfil farmacocinético de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR nas amostras de sangue na pré-dose e em vários pontos de tempo depois da dosagem até 70 dias (F). A linha pontilhada mostra o perfil farmacocinético prognosticado de IgG1, usando um modelo de dois compartimentos, com k10 (constante de depuração) a 0,006 h-1, Vc (volume de plasma) 40 ml<kg-1 e 3,5 kg de peso corporal.

[0028] Figura 10: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 à CD20 do tipo selvagem e CD20-AxP expresso em células HEK293F. A ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 (bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR [huCD3x7D8], bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20- 7D8-FEAR [huCLB-T3/4x7D8], bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2- FEAR [huCD3x2F2], bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR [huCLB-T3/4x2F2], bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR [huCD3x11B8], bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR [huCLB- T3/4x11B8], bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR [huCD3xGA101], bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR [huCD3xRTX], bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR [huCD3x2C6]) à CD20 do tipo selvagem (a) e mutante CD20 (CD20-AxP) (B) expresso em células HEK293F foi medida pela citometria de fluxo. Os dados mostrados são intensidades de fluorescência médias de um experimento representativo.

[0029] Figura 11: Ativação de célula T na incubação de PBMC com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR.

[0030] PBMC de doador saudável foram incubadas com bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR ou anticorpos de controle positivo e negativo, e a ativação de célula T foi avaliada medindo-se a expressão de CD69 dentro da população de célula T (células CD28+). Experimentos foram realizados com PBMC isoladas de cinco doadores saudáveis. Os resultados para dois doadores representativos saudáveis são mostrados. As regiões de CDR foram anotadas de acordo com as definições de IMGT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0031] Os termos “CD3 humana” ou “CD3” como aqui usados, se referem à proteína 3 do Grupo de Diferenciação humana que é parte do complexo de proteína do correceptor de célula T e é composta de quatro cadeias distintas. A CD3 também é encontrada em outras espécies, e assim, o termo “CD3” pode ser aqui usado e não é limitado à CD3 humana a menos que contradito pelo contexto. Nos mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3Y (gama) (cadeia de CD3Y humana UniProtKB/Swiss-Prot No P09693, ou CD3Y de macaco cinomolgo UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI7), uma cadeia CD3δ (delta) (CD3δ humana UniProtKB/Swiss-Prot No P04234, ou CD3δ de macaco cinomolgo UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI8), duas cadeias CD3ε (épsilon) (CD3ε humana UniProtKB/Swiss-Prot No P07766; CD3ε de cinomolgo UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI5; ou CD3ε de rhesus UniProtKB/Swiss-Prot No G7NCB9), e uma cadeia CD3Z (zeta) (CD3Z humana UniProtKB/Swiss-Prot No P20963, CD3Z de macaco cinomolgo UniProtKB/Swiss-Prot No Q09TK0). Estas cadeias associam-se com uma molécula conhecida como o receptor de célula T (TCR) e geram um sinal de ativação nos linfócitos T. O TCR e as moléculas de CD3 juntos compreendem o complexo de TCR.

[0032] Os termos “CD20 humana” ou “CD20” se referem à CD20 humana (UniProtKB/Swiss-Prot No P11836) e incluem quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécie de CD20 que são naturalmente expressos pelas células, incluindo células de tumor, ou são expressos nas células transfectadas com o gene de CD20 ou cDNA. Os homólogos de espécie incluem CD20 de macaco rhesus (macaca mulatta; UniProtKB/Swiss-Prot No H9YXP1).

[0033] O termo “anticorpo quimérico” como aqui usado, se refere a um anticorpo em que a região variável é derivada de uma espécie não humana (por exemplo derivada de roedores) e a região constante é derivada de uma espécie diferente, tal como a humana. Os anticorpos quiméricos podem ser gerados pela engenharia de anticorpo. “Engenharia de anticorpo” é um termo usado genericamente para tipos diferentes de modificações de anticorpos, e que é um processo bem conhecido pela pessoa habilitada. Em particular, um anticorpo quimérico pode ser gerado usando-se técnicas de DNA padrão como descritas em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15. Assim, o anticorpo quimérico pode ser um anticorpo recombinante geneticamente ou um enzimaticamente engenheirado. Está dentro do conhecimento da pessoa habilitada gerar um anticorpo quimérico, e assim, a geração do anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser realizada por outros métodos além dos aqui descritos. Anticorpos monoclonais quiméricos para aplicações terapêuticas são desenvolvidas para reduzir a imunogenicidade de anticorpo. Eles podem tipicamente conter regiões variáveis não humanas (por exemplo de murino), que são específicas para o antígeno de interesse, e domínios de cadeia pesada e leve de anticorpo constantes humanos. Os termos “região variável” ou “domínios variáveis” como usados no contexto de anticorpos quiméricos, se referem a uma região que compreende as CDRs e regiões de armação tanto da cadeia pesada quanto leve da imunoglobulina.

[0034] O termo “anticorpo humanizado” como aqui usado, se refere a um anticorpo não humano criado pela engenharia genética, que contém domínios constantes de anticorpo humano e domínios variáveis não humanos modificados para conter um alto nível de homologia de sequência aos domínios variáveis humanos. Isto pode ser obtido pelo enxerto das seis regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) de anticorpo não humano, que juntas formam o sítio de ligação a antígeno, em uma região de armação aceitadora humana homóloga (FR) (ver a WO92/22653 e EP0629240). De modo a reconstituir totalmente a afinidade de ligação e especificidade do anticorpo precursor, a substituição de resíduos de armação do anticorpo precursor (isto é, o anticorpo não humano) nas regiões de armação humanas (retromutações) pode ser requerida. A modelagem de homologia estrutural pode ajudar a identificar os resíduos de aminoácido nas regiões de armação que são importantes para as propriedades de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo humanizado pode compreender sequências de CDR não humanas, primariamente regiões de armação humanas opcionalmente compreendendo uma ou mais retromutações de aminoácido para a sequência de aminoácido não humana, e regiões constantes totalmente humanas. Opcionalmente, modificações de aminoácido adicionais, que não são necessariamente retromutações, podem ser aplicadas para se obter um anticorpo humanizado com características preferidas, tais como afinidade e propriedades bioquímicas.

[0035] O termo “anticorpo humano” como aqui usado, se refere a anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas pela mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não é intencionado a incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie mamífera, tal como um camundongo, foram enxertados nas sequências de armação humana. Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora os procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal podem ser utilizadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de demonstração de fago usando bibliotecas de genes de anticorpo humano.

[0036] Um sistema animal adequado para preparar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos é o sistema de murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicas para a isolação de esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

[0037] Anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos carregando partes do sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo.

[0038] O termo “imunoglobulina” se refere a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas consistindo em dois pares de cadeias de polipeptídeo, um par de cadeias leves (L) de peso molecular baixo e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro interconectadas pelas ligações de dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver por exemplo Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Em resumo, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH ou VH) e uma região constante de cadeia pesada (abreviada aqui como CH ou CH). A região constante de cadeia pesada tipicamente é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL ou VL) e uma região constante de cadeia leve (abreviada aqui como CL ou CL). A região constante de cadeia leve tipicamente é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis na sequência e/ou forma de circuitos estruturalmente definidos), também chamadas de regiões determinadoras de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de armação (FRs). Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). A menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto, as sequências de CDR aqui são identificadas de acordo com as regras IMGT (Brochet X., Nucl Acids Res. 2008; 36: W503- 508 e Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999; 27: 209-212; ver também o endereço http da internet http://www.imgt.org/).

[0039] A menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto, referência às posições de aminoácido nas regiões constantes na presente invenção está de acordo com a numeração EU (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Maio de 1969; 63(1): 78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição. 1991 Publicação NIH No. 91-3242).

[0040] O termo “anticorpo” (Ab) no contexto da presente invenção se refere a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou um derivado de cada um dos mesmos, que tenha a capacidade para ligar especificamente a um antígeno sob condições fisiológicas típicas com uma meia vida de períodos significantes de tempo, tais como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc., ou qualquer outro período funcionalmente definido relevante (tal como um tempo suficiente para induzir, promover, realçar, e/ou modular uma resposta fisiológica associada com a ligação de anticorpo ao antígeno e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade atuadora). As regiões variáveis das cadeias pesada e leve da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (tais como células atuadoras) e componentes do sistema de complemento tal como C1q, o primeiro componente no caminho clássico de ativação de complemento. Como indicado acima, o termo anticorpo aqui, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que são fragmentos de ligação a antígeno, isto é, retêm a capacidade para ligar especificamente ao antígeno. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Os exemplos de fragmentos de ligação a antígeno abrangidos dentro do termo “anticorpo” incluem (i) um fragmento Fab’ ou Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1, ou um anticorpo monovalente como descrito na WO2007059782 (Genmab); (ii) fragmentos F(ab’)2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo essencialmente dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio VH e também chamado anticorpos de domínio (Holt et al; Trends Biotechnol. Nov de 2003; 21(11): 484-90); (vi) camelídeo ou nanocorpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. Jan de 2005; 5(1): 111-24) e (vii) uma região determinadora de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que possibilite que sejam fabricados como uma única cadeia de proteína em que as regiões VL e VH formem par para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), ver por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única são abrangidos dentro do termo anticorpo a menos que de outro modo mencionado ou claramente indicado pelo contexto. Embora tais fragmentos sejam geralmente incluídos dentro do significado de anticorpo, eles coletivamente e cada um independentemente são traços únicos da presente invenção, exibindo propriedades biológicas e utilidades diferentes. Estes e outros fragmentos de anticorpo úteis no contexto da presente invenção, assim como formatos biespecíficos de tais fragmentos, são aqui debatidos mais adiante. Também deve ser entendido que o termo anticorpo, a menos que de outro modo especificado, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipeptídeos semelhantes a anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, e fragmentos de anticorpo retendo a capacidade para especificamente ligar ao antígeno (fragmentos de ligação a antígeno) fornecido por qualquer técnica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de peptídeo, e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isótipo.

[0041] O termo “anticorpo biespecífico” no contexto da presente invenção se refere a um anticorpo tendo duas regiões de ligação a antígeno diferentes definidas por sequências de anticorpo diferentes.

[0042] Quando aqui usado, a menos que contradito pelo contexto, os termos “braço Fab” ou “braço” se referem a um par de cadeia pesada-cadeia leve e é aqui usado intercambiavelmente com “meias moléculas”.

[0043] Quando aqui usado, a menos que contradito pelo contexto, o termo “região Fc” se refere a uma região de anticorpo compreendendo pelo menos uma região de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3.

[0044] Como aqui usado, o termo “isótipo” se refere à classe da imunoglobulina (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.

[0045] O termo “anticorpo monovalente” significa no contexto da presente invenção que uma molécula de anticorpo é capaz de ligação a uma única molécula do antígeno, e assim não é capaz de reticular antígeno.

[0046] Um “anticorpo de CD20” ou “anticorpo anti-CD20” é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente ao antígeno CD20.

[0047] Um “anticorpo de CD3” ou “anticorpo anti-CD3” é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente ao antígeno CD3, em particular CD3ε (épsilon) humano.

[0048] Um “anticorpo de CD3xCD20” ou “anticorpo anti- CD3xCD20” é um anticorpo biespecífico, que compreende duas regiões de ligação a antígeno diferentes, um dos quais se liga especificamente ao antígeno CD20 e um dos quais se liga especificamente ao CD3.

[0049] Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico da invenção é isolado. Um “anticorpo biespecífico isolado”, como aqui usado, é intencionado a se referir a um anticorpo biespecífico que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo um anticorpo biespecífico isolado que especificamente se liga à CD20 e CD3 é substancialmente livre de anticorpos monoespecíficos que especificamente se ligam à CD20 ou CD3).

[0050] O termo “epítopo” significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Epítopos usualmente consistem de agrupamentos de superfície de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidas em que a ligação ao primeiro, mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes. O epítopo pode compreender resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação e outros resíduos de aminoácido, que não são diretamente envolvidos na ligação, tais como resíduos de aminoácido que são eficazmente bloqueados ou cobertos pelo peptídeo de ligação a antígeno especificamente (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da pegada do peptídeo de ligação a antígeno especificamente).

[0051] O termo “anticorpo monoclonal” como aqui usado se refere a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal demonstra uma única especificidade de ligação e afinidade para um epítopo particular. Consequentemente, o termo “anticorpo monoclonal humano” se refere a anticorpos exibindo uma única especificidade de ligação que tem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico ou transcromossômico, tal como um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanos, fundidos a uma célula imortalizada.

[0052] Como aqui usado, o termo “ligação” no contexto da ligação de um anticorpo a um antígeno ou epítopo predeterminados tipicamente é uma ligação com uma afinidade correspondendo a um KD de cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos, ou cerca de 10-11 M ou ainda menos quando determinado por exemplo pela tecnologia de ressonância plasmônica superficial (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligante e o anticorpo como o análito, e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade correspondendo a um KD que é pelo menos dez vezes mais baixo, tal como pelo menos 100 vezes mais baixo, por exemplo pelo menos 1.000 vezes mais baixo, tal como pelo menos 10.000 vezes mais baixo, por exemplo pelo menos 100.000 vezes mais baixo do que a sua afinidade para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) outro que não o antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com que a afinidade é mais baixa é dependente do KD do anticorpo, de modo que quando o KD do anticorpo é muito baixo (isto é, o anticorpo é altamente específico), então a quantidade com que a afinidade para o antígeno é mais baixa do que a afinidade para um antígeno não específico pode ser de pelo menos 10.000 vezes.

[0053] O termo “kd” (s-1), como aqui usado, se refere à constante da taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. O dito valor também é aludido como o valor koff.

[0054] O termo “KD” (M), como aqui usado, se refere à constante do equilíbrio de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.

[0055] Quando aqui usado o termo “interação heterodimérica entre a primeira e segunda regiões CH3” se refere à interação entre a primeira região CH3 e a segunda região CH3 em uma proteína heterodimérica de primeira- CH3/segunda-CH3.

[0056] Quando aqui usado o termo “interações homodiméricas da primeira e segunda regiões CH3” se refere à interação entre uma primeira região CH3 e uma outra primeira região CH3 em uma proteína homodimérica primeira-CH3/primeira-CH3 e a interação entre uma segunda região CH3 e uma outra segunda região CH3 em uma proteína homodimérica segunda- CH3/segunda-CH3.

[0057] O termo “condições redutoras” ou “ambiente redutor” se refere a uma condição ou um ambiente em que um substrato, aqui um resíduo de cisteína na região de dobradiça de um anticorpo, é mais provável de se tornar reduzido do que oxidado.

[0058] A presente invenção também fornece anticorpos biespecíficos compreendendo variantes funcionais das regiões VL, regiões VH, ou uma ou mais CDRs dos anticorpos biespecíficos dos exemplos. Uma variante funcional de uma VL, VH, ou CDR usada no contexto de um anticorpo biespecífico ainda permite que cada braço do anticorpo biespecífico retenha pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) da afinidade e/ou da especificidade/seletividade do anticorpo biespecífico precursor e em alguns casos um tal anticorpo biespecífico pode estar associado com maior afinidade, seletividade e/ou especificidade do que o anticorpo biespecífico precursor.

[0059] Tais variantes funcionais tipicamente retêm identidade de sequência significante ao anticorpo biespecífico precursor. A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/# total de posições x 100), levando-se em conta o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que precisam ser introduzidos para alinhamento ideal das duas sequências. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido pode ser determinada por exemplo usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo ponderado PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).

[0060] Variantes exemplares incluem aquelas que diferem da VH e/ou VL e/ou regiões de CDR das sequências do anticorpo biespecífico precursor principalmente pelas substituições conservativas; por exemplo 10, tal como 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 das substituições na variante são substituições de resíduo de aminoácido conservativas.

[0061] No contexto da presente invenção, as substituições conservativas podem ser definidas pelas substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas na seguinte tabela:

[0062] As classes de resíduo de aminoácido para as substituições conservativas

[0063] No contexto da presente invenção as seguintes notações são, a menos que de outro modo indicado, usadas para descrever uma mutação; i) substituição de um aminoácido em uma dada posição é escrita como por exemplo K409R que significa uma substituição de uma Lisina na posição 409 com uma Arginina; e ii) para variantes específicas os códigos de três ou uma letra específicas são usados, incluindo os códigos Xaa e X para indicar qualquer resíduo de aminoácido. Assim, a substituição de Lisina com Arginina na posição 409 é designada como: K409R, e a substituição de Lisina com qualquer resíduo de aminoácido na posição 409 é designada como K409X. No caso de deleção da Lisina na posição 409 é indicado por K409*.

[0064] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como aqui usado, é intencionado a se referir a uma célula dentro da qual um vetor de expressão foi introduzido, por exemplo um vetor de expressão codificando um anticorpo da invenção. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 ou NS0, e células linfocíticas.

[0065] O termo “tratamento” se refere à administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo biespecífico terapeuticamente ativo da presente invenção com o propósito de aliviar, melhorar, deter ou erradicar (curar) sintomas ou estados de doença.

[0066] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo biespecífico para evocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo ou porção de anticorpo são compensados pelos efeitos terapêuticos benéficos.

[0067] O termo “anticorpo anti-idiotípico” se refere a um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados com o sítio de ligação a antígeno de um anticorpo.

Aspectos adicionais e modalidades da invenção

[0068] Como descrito acima, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo duas regiões de ligação a antígeno diferentes, uma que tem uma especificidade de ligação para CD3 e uma que tem uma especificidade de ligação para CD20.

[0069] Assim, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo (i) um primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno ligando à CD3ε (épsilon) humana, em que a dita primeira região de ligação a antígeno compreende a) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, respectivamente; b) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 54, respectivamente; c) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 73, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X2 da SEQ ID NO: 73 é selecionado de M e P, respectivamente; d) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 74, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X3 da SEQ ID NO: 74 é A, respectivamente; e) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 75, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X4 da SEQ ID NO: 75 é E, respectivamente; f) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 77, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X6 da SEQ ID NO: 77 é selecionado de F, G, I, K, L e N, respectivamente; g) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 78, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X7 da SEQ ID NO: 78 é P, respectivamente; h) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 79, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X8 da SEQ ID NO: 79 é selecionado de A e G, respectivamente; i) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 80, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X8 da SEQ ID NO: 80 é selecionado de M, R e V, respectivamente; ou j) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 58, a sequência DTS, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 59, respectivamente, e (ii) um segundo braço de ligação compreendendo uma segunda região de ligação a antígeno ligando à CD20 humana.

[0070] Com isto, anticorpos biespecíficos com afinidades de ligação variáveis para CD3 épsilon são fornecidos. Em uma modalidade é preferido que a afinidade de ligação para CD3 seja mais baixa do que é para o braço de ligação anti-CD3 precursor. Os dados experimentais mostraram que anticorpos de CD3xCD20 biespecíficos como descritos acima em c) a i) tendo um braço de ligação anti-CD3 com uma substituição que diminuir a afinidade de ligação para CD3 épsilon mantém a potência de morte de tumor do anticorpo anti-CD3xCD20 biespecífico precursor.

[0071] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo (i) um primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno ligando à CD3ε (épsilon) humana, em que a dita primeira região de ligação a antígeno compreende (a) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 54, respectivamente, ou (b) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 58, a sequência DTS, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 59, respectivamente, e (ii) um segundo braço de ligação compreendendo uma segunda região de ligação a antígeno ligando à CD20 humana.

[0072] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo um primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno ligando à CD3ε (épsilon) humana, em que a dita primeira região de ligação a antígeno compreende região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, respectivamente.

[0073] O termo “braço de ligação compreendendo uma região de ligação a antígeno” significa uma molécula de anticorpo ou fragmento que compreende uma região de ligação a antígeno. Assim, o braço de ligação pode ser por exemplo as seis regiões de CDR de VH e VL, as sequências VH e VL, o fragmento Fab ou um anticorpo de meia-molécula (isto é, compreendendo uma cadeia pesada e uma leve).

[0074] Em uma modalidade, a primeira região de ligação a antígeno compreende uma primeira sequência variável de cadeia pesada (VH), e uma primeira sequência variável de cadeia leve (VL), e a segunda região de ligação a antígeno compreende uma segunda sequência variável de cadeia pesada (VH), e uma segunda sequência variável de cadeia leve (VL).

[0075] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo uma primeira sequência variável de cadeia pesada (VH) e uma primeira sequência constante de cadeia pesada (CH), e uma primeira cadeia leve compreendendo uma primeira sequência variável de cadeia leve (VL) e uma primeira sequência constante de cadeia leve (CL), e (ii) o segundo braço de ligação compreende uma segunda cadeia pesada compreendendo uma segunda sequência variável de cadeia pesada (VH) e uma segunda sequência constante de cadeia pesada (CH), e uma segunda cadeia leve compreendendo uma segunda sequência variável de cadeia leve (VL) e uma segunda sequência constante de cadeia leve (CL).

[0076] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, tal como um anticorpo IgG1 tamanho natural, por exemplo um anticorpo IgG1,À (lambda),K (capa) de tamanho natural ou anticorpo IgG1,K (capa), K (capa).

Primeiro braço de ligação

[0077] O primeiro braço de ligação compreende uma primeira região de ligação a antígeno ligando à CD3ε (épsilon) humana, em que a dita primeira região de ligação a antígeno compreende a) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, respectivamente; b) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 54, respectivamente; c) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 73, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X2 da SEQ ID NO: 73 é selecionado de M e P, respectivamente; d) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 74, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X3 da SEQ ID NO: 74 é A; e) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 75, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X4 da SEQ ID NO: 75 é E; f) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 77, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X6 da SEQ ID NO: 77 é selecionado de F, G, I, K, L e N, respectivamente; g) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 78, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X7 da SEQ ID NO: 78 é P; h) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 79, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X8 da SEQ ID NO: 79 é selecionado de A e G, respectivamente; i) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 80, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, em que X8 da SEQ ID NO: 80 é selecionado de M, R e V, respectivamente; ou j) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 58, a sequência DTS, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 59, respectivamente.

[0078] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação compreende uma primeira região de ligação a antígeno ligando à CD3ε (épsilon) humana, em que a dita primeira região de ligação a antígeno compreende (a) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 54, respectivamente, ou (b) região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 58, a sequência DTS, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 59, respectivamente.

[0079] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação compreende uma primeira região de ligação a antígeno ligando à CD3ε (épsilon) humana, em que a dita primeira região de ligação a antígeno compreende região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, respectivamente.

[0080] As seis sequências de CDR como definida em (a) acima são derivadas de um anticorpo de camundongo denotado SP34. Versões humanizadas deste anticorpo foram geradas, e os anticorpos humanizados são denotados huCD3 aqui e são descritos ainda na WO2015001085 (Genmab).

[0081] As seis sequências CDR como definidas em (b) acima são derivadas de huCLB-T3/4. huCLB-T3/4 é uma versão humanizada do anticorpo de murino CD3 CLB-T3/4 (Parren et al., Res Immunol. 1991, 142(9): 749-63, por meio deste incorporada por referência na sua totalidade, incluindo descrições de sequência). Em resumo, as sequências VH e VL de CLB-T3/4 de murino como publicadas em Parren et al. (1991) foram alinhadas aos repertórios VH e VL de ser humano usando o V-QUEST da IMGT. As linhas germinativas humanas mais próximas que foram encontradas foram IGHV3-21*01 para o gene VH e IGKV3- 11*01(+IGKJ4*02) para o gene VL. Todos os resíduos de aminoácido nas sequências VH e VL de murino que diferiram foram substituídas pelo equivalente humano, exceto para aqueles dentro das regiões de CDR de CLB- T3/4. Como nenhuma região J relacionada foi encontrada para a sequência VH, a sequência WGQGTLVTVSS comum foi usada para a região FR4 da cadeia pesada. Ambas as sequências foram clonadas dentro dos vetores de expressão relevantes e expressas pela cotransfecção nas células HEK293F. huCLB-T3/4 tem uma região VH compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 17 (VH huCLB-T3/4) e uma região VL compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 18 (VL huCLB-T3/4). huCLB-T3/4 tem as sequências VH CDR1, CDR2 e CDR3 apresentadas nas SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respectivamente, e as sequências VL CDR1, CDR2 e CDR3 apresentadas na SEQ ID NO: 58, a sequência DTS, e a sequência apresentada na SEQ ID NO: 59, respectivamente.

[0082] Os vários anticorpos huCD3s humanizados e huCLB-T3/4 se ligam à CD3ε (épsilon) humana.

[0083] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira sequência variável de cadeia pesada (VH), em que a dita sequência VH tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VH selecionadas do grupo consistindo em: a) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6; b) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7; c) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8; d) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9; e e) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 17.

[0084] Em uma modalidade, a sequência VH da primeira região de ligação a antígeno é selecionada do grupo consistindo em: a) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6; b) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7; c) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8; d) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9; e) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 17.

[0085] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira sequência VL da primeira região de ligação a antígeno, em que a dita sequência VL tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VL selecionadas do grupo consistindo em: a) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; c) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e d) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 18.

[0086] Em uma modalidade, a sequência VL da primeira região de ligação a antígeno é selecionada do grupo consistindo em: a) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; c) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e d) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 18.

[0087] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende as primeiras sequências VH e VL, em que as ditas sequências VH e VL da primeira região de ligação a antígeno são selecionadas do grupo consistindo em: a) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; c) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; d) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; f) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; g) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; h) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; i) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; j) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; k) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; l) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e m) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 17, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 18.

[0088] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende as primeiras sequências VH e VL, em que as ditas sequências VH e VL da primeira região de ligação a antígeno são selecionadas do grupo consistindo em: a) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 17, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 18

[0089] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende as primeiras sequências VH e VL como apresentadas nas SEQ ID NOs: 17 e 18.

[0090] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas compreende uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência VH é como apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência VL é como apresentada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade os desvios de sequência estão nas sequências de armação e não nas sequências de CDR. Consequentemente, em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10 em que as sequências de CDR são como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, para a cadeia pesada e como apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 para a cadeia leve de modo que as sequências de CDR não são mutadas.

[0091] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descrita compreende uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 95 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 95 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10 em que as sequências de CDR são como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, para a cadeia pesada e como apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 para a cadeia leve de modo que as sequências de CDR não são mutadas.

[0092] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas compreende uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 97 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 97 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 97 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10 em que as sequências de CDR são como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, para a cadeia pesada e como apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 para a cadeia leve de modo que as sequências de CDR não são mutadas.

[0093] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas compreende uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 98 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 98 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 98 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10 em que as sequências de CDR são como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, para a cadeia pesada e como apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 para a cadeia leve de modo que as sequências de CDR não são mutadas.

[0094] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas compreende uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno tendo pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10 em que as sequências de CDR são como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, para a cadeia pesada e como apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5 para a cadeia leve de modo que as sequências de CDR não são mutadas.

[0095] Por meio destes anticorpos biespecíficos da invenção são fornecidos em que as sequências VH e VL podem variar dentro de pelo menos 90 % de identidade de sequência com as sequências precursoras. É preferido que as variantes tenham as mesmas propriedades como os anticorpos precursores. Em certas modalidades as sequências apenas variam nas sequências de armação de modo que as sequências de CDR sejam idênticas às sequências de CDR precursoras.

[0096] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas a primeira região de ligação a antígeno compreende a sequência VH como é apresentada na SEQ ID NO: 6, e a sequência VL como é apresentada na SEQ ID NO: 10.

[0097] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivado de um anticorpo de camundongo.

[0098] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivado de um anticorpo humanizado.

[0099] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivado de um anticorpo de tamanho natural.

[00100] Em uma modalidade, o primeiro braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivado de um anticorpo IgG1,À (lambda) ou IgG1, K (capa) de tamanho natural.

Segundo braço de ligação

[00101] Anticorpos de CD20 adequados para o uso como o segundo braço de ligação nos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são anticorpos de CD20, que se liga a um epítopo na CD20 humana, que não compreende ou requer os resíduos de aminoácido alanina na posição 170 ou prolina na posição 172, mas que compreende ou requer os resíduos de aminoácido asparagina na posição 163 e asparagina na posição 166. Os exemplos de tais anticorpos são os anticorpos denotados 2F2 e 7D8 como descritos na WO2004035607 (Genmab) e o anticorpo denotado 2C6 como descrito na WO2005103081 (Genmab). As sequências de CDR de 2F2, 7D8 e 2C6 são descritas na Tabela 1.

[00102] Outros anticorpos de CD20 adequados para o uso como o segundo braço de ligação nos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são anticorpos de CD20, que se ligam a um epítopo na CD20 humana, que não compreende ou requer os resíduos de aminoácido alanina na posição 170 ou prolina na posição 172. Um exemplo de um tal anticorpo é 11B8 como descrito na WO2004035607 (Genmab). As sequências de CDR de 11B8 são descritas na Tabela 1.

[00103] Outros anticorpos de CD20 adequados para o uso como a segunda região de ligação a antígeno nos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são anticorpos de CD20 com uma taxa de dissociação funcional baixa contanto que os anticorpos são lentamente dissociados de CD20 na ligação.

[00104] A constante de dissociação kd ou taxa koff podem ser determinadas pelo método descrito sob o cabeçalho “Taxas de dissociação de fragmentos F(ab)2 anti-CD20” no Exemplo 5 da WO2004035607. Assim, em uma modalidade, os anticorpos de CD20 têm uma constante de dissociação kd de 1,0 x-4 s-1 ou abaixo, tal como de 8,0 x 10-5 s-1 ou abaixo, tal como na faixa de 8,0 x 10-5 s-1 a 4,0 x 10-5 s-1 como determinado pelo método acima.

[00105] Outros anticorpos de CD20 adequados para o uso como o segundo braço de ligação nos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são anticorpos de CD20 tendo as seis sequências de CDR do anticorpo denotado 11B8 como descrito na WO2004035607. As sequências de CDR de 11B8 são descritas na Tabela 1.

[00106] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma segunda região de ligação a antígeno que se liga à CD20 humana, segunda região de ligação a antígeno esta que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências selecionadas de: (i) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, (ii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 38, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 39, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, (iii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 42, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 43, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 44, ou (iv) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 49, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 50, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 51.

[00107] Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma segunda região de ligação a antígeno compreendendo a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, e a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34.

[00108] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma segunda região de ligação a antígeno que se liga à CD20 humana, segunda região de ligação a antígeno esta que compreende a região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 e as sequências da região variável de cadeia leve (LH) CDR1, CDR2, e CDR3 selecionadas de: (i) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 35, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 36, (ii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 38, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 39, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 35, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 36, (iii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 42, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 43, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 44, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 45, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 46, (iv) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 49, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 50, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 51, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 52, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 53, (v) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 45, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 46, (vi) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 52, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 53, (vii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 38, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 39, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 45, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 46, (viii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 38, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 39, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 52, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 53, (ix) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 42, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 43, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 44, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 35, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 36, (x) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 42, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 43, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 44, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 52, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 53, (xi) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 49, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 50, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 51, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 35, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 36, ou (xii) a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 49, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 50, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 51, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 45, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 46.

[00109] Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades como aqui descritas compreende uma segunda região de ligação a antígeno compreendendo a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 35, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 36.

[00110] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 28.

[00111] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 37, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 28.

[00112] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 40, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 41.

[00113] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 47, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 48.

[00114] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 41.

[00115] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 27, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 48.

[00116] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 37, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 41.

[00117] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 37, e um uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 48.

[00118] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 40, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 28.

[00119] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 40, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 48.

[00120] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 47, e uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 28.

[00121] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 47, e um uma sequência VL que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 41.

[00122] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende as segundas sequências VH e VL, em que as ditas sequências VH e VL de uma segunda região de ligação a antígeno são selecionadas do grupo consistindo em: (i) a sequência VH da SEQ ID NO: 27, e a sequência VL da SEQ ID NO: 28, (ii) a sequência VH da SEQ ID NO: 37, e a sequência VL da SEQ ID NO: 28, (iii) a sequência VH da SEQ ID NO: 40, e a sequência VL da SEQ ID NO: 41, (iv) a sequência VH da SEQ ID NO: 47, e a sequência VL da SEQ ID NO: 48, (v) a sequência VH da SEQ ID NO: 27, e a sequência VL da SEQ ID NO: 41, (vi) a sequência VH da SEQ ID NO: 27, e a sequência VL da SEQ ID NO: 48, (vii) a sequência VH da SEQ ID NO: 37, e a sequência VL da SEQ ID NO: 41, (viii) a sequência VH da SEQ ID NO: 37, e a sequência VL da SEQ ID NO: 48, (ix) a sequência VH da SEQ ID NO: 40, e a sequência VL da SEQ ID NO: 28, (x) a sequência VH da SEQ ID NO: 40, e a sequência VL da SEQ ID NO: 48, (xi) a sequência VH da SEQ ID NO: 47, e a sequência VL da SEQ ID NO: 28, ou (xii) a sequência VH da SEQ ID NO: 47, e a sequência VL da SEQ ID NO: 41.

[00123] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas a segunda região de ligação a antígeno compreende a sequência VH da SEQ ID NO: 27, e a sequência VL da SEQ ID NO: 28.

[00124] Em uma modalidade, o segundo braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivada de um anticorpo humano.

[00125] Em uma modalidade, o segundo braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivada de um anticorpo de tamanho natural.

[00126] Em uma modalidade, o segundo braço de ligação do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas é derivada de um IgG1, K (capa) anticorpo. Formatos de anticorpo biespecíficos

[00127] A presente invenção fornece anticorpos biespecíficos CD3xCD20 que eficientemente promovem a morte mediada por célula T de células de tumor que expressam CD20. Dependendo das propriedades funcionais desejadas para um uso particular, regiões de ligação a antígeno particulares podem ser selecionadas do conjunto de anticorpos ou regiões de ligação a antígeno fornecidas pela presente invenção. Muitos formatos e usos diferentes de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica, e foram revisados por Kontermann; Drug Discov Today, Jul de 2015; 20(7): 838-47 e; MAbs, Mar-Abr de 2012; 4(2): 182-97.

[00128] Um anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção não é limitado a nenhum formato ou método biespecífico particular de produzi-lo.

[00129] Os exemplos de moléculas de anticorpo biespecífico que podem ser usadas na presente invenção compreendem (i) um único anticorpo que tenha dois braços compreendendo regiões de ligação a antígeno diferentes; (ii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade a dois epítopos diferentes, por exemplo, via dois scFvs ligados em tandem por um ligador peptídico extra; (iii) um anticorpo de domínio variável dual (DVD-Ig), onde cada cadeia leve e cadeia pesada contêm dois domínios variáveis em tandem através de uma ligador peptídico curto (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) um fragmento (Fab’)2 biespecífico quimicamente ligado; (v) um Tandab, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única resultando em um anticorpo biespecífico tetravalente que tem dois sítios de ligação para cada um dos antígenos alvos; (vi) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo resultando em uma molécula multivalente; (vii) uma chamada molécula “dock and lock”, com base no “domínio de dimerização e ancoragem” na Cinase de Proteína A, que, quando aplicada aos Fabs, pode produzir uma proteína de ligação biespecífica trivalente consistindo em dois fragmentos Fab idênticos ligados a um fragmento Fab diferente; (viii) uma chamada molécula Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos a ambos terminais de um braço Fab humano; e (ix) um diacorpo.

[00130] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo, um corpo cruzado, ou um anticorpo biespecífico obtido via uma troca controlada de braço Fab (tal como descrita na WO2011131746 (Genmab)).

[00131] Exemplos de classes diferentes de anticorpos biespecíficos incluem, mas não são limitados a (i) moléculas semelhantes a IgG com domínios CH3 complementares para forçar a heterodimerização; (ii) moléculas alvejadoras duplas semelhantes a IgG recombinantes, em que os dois lados da molécula cada um contém o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de pelo menos dois anticorpos diferentes; (iii) moléculas de fusão IgG, em que anticorpos IgG de tamanho natural são fundidos ao fragmento Fab extra ou partes de fragmento Fab; (iv) moléculas de fusão Fc, em que as moléculas Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fundidos aos domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; (v) moléculas de fusão de Fab, em que fragmentos Fab diferentes são fundidos juntos, fundidos aos domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes dos mesmos; e (vi) anticorpos com base em ScFv e diacorpo e cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) em que moléculas Fv de cadeia única diferentes ou diacorpos diferentes ou anticorpos de cadeia pesada diferentes (por exemplo anticorpos de domínio, nanocorpos) são fundidos entre si ou a uma outra proteína ou molécula carregadora fundida aos domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas.

[00132] Os exemplos de moléculas semelhantes a IgG com moléculas de domínio CH3 complementares incluem, mas não são limitados às moléculas Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech; Roche, WO2011069104), as chamadas moléculas Knobs-into-Holes (Genentech, WO9850431), CrossMAbs (Roche, WO2011117329) e as moléculas eletrostaticamente emparelhadas (Amgen, EP1870459 e WO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304), as moléculas LUZ- Y (Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi:10,1074/jbc.M112,397869. Epub 1 de Nov de 2012), moléculas de DIG- corpo e PIG-corpo (Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202), as moléculas de corpo de Domínio Engenheirado de Troca de Filamento (SEEDbody) (EMD Serono, WO2007110205), as moléculas Biclonics (Merus, WO2013157953), moléculas FcΔAdp (Regeneron, WO201015792), moléculas IgG1 e IgG2 biespecíficas (Pfizer/Rinat, WO11143545), moléculas de armação Azymetric (Zymeworks/Merck, WO2012058768), moléculas mAb-Fv (Xencor, WO2011028952), anticorpos biespecíficos bivalent (WO2009080254) e as moléculas DuoCorpo® (Genmab A/S, WO2011131746).

[00133] Os exemplos de moléculas alvejadoras duplas semelhantes a IgG recombinantes incluem, mas não são limitadas às moléculas Dual Targeting (DT)-Ig (WO2009058383), Anticorpo dois em um (Genentech; Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star, WO2008003116), moléculas Zybody (Zyngenia; LaFleur et al. MAbs. Mar-Abr 2013; 5(2): 208-18), métodos com cadeia leve comum (Crucell/Merus, US7.262.028), KÀBodies (NovImmune, WO2012023053) e CovX-body (CovX/Pfizer; Doppalapudi, V.R., et al 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.).

[00134] Os exemplos de moléculas de fusão IgG incluem, mas não são limitados às moléculas de Domínio Variável Duplo (DVD)-Ig (Abbott, US7.612.181), anticorpos de cabeça dupla de domínio dual (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), moléculas biespecíficas semelhantes à IgG (ImClone/Eli Lilly, Lewis et al. Nat Biotechnol. Fev de 2014; 32(2): 191-8), Ts2Ab (MedImmune/AZ; Dimasi et al. J Mol Biol. 30 de out de 2009; 393(3): 672-92) e moléculas BsAb (Zymogenetics, WO2010111625), moléculas HERCULES (Biogen Idec, US007951918), moléculas de fusão de scFv (Novartis), moléculas de fusão de scFv (Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246) e moléculas TvAb (Roche, WO2012025525, WO2012025530).

[00135] Os exemplos de moléculas de fusão de Fc incluem, mas não são limitadas às Fusões ScFv/Fc (Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. Set de 1997; 42(6): 1179-88), moléculas SCORPION (Emergent BioSolutions/ Trubion, Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465); Zymogenetics/BMS, WO2010111625), moléculas da Tecnologia de Realvejamento de Afinidade Dual (Fc-DART) (MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538) e moléculas (ScFv)2-Fab Duais (National Research Center for Antibody Medicine - China).

[00136] Os exemplos de anticorpos de fusão de Fab biespecíficos incluem, mas não são limitados às moléculas F(ab)2 (Medarex/AMGEN; Deo et al J Immunol. 15 de Fev de 1998; 160(4): 1677-86.), moléculas de Ação Dual ou Bis-Fab (Genentech, Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.), moléculas Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics, WO2003074569, WO2005004809), moléculas Biespecíficas Bivalentes (Biotecnol, Schoonjans, J Immunol. 15 de Dez de 2000; 165(12): 7050-7.) e moléculas Fab-Fv (UCB-Celltech, WO 2009040562 A1).

[00137] Os exemplos de anticorpos ScFv, com base em diacorpo e de domínio incluem, mas não são limitados às moléculas Engajadoras de Célula T Biespecífica (BiTE) (Micromet, WO2005061547), moléculas de Diacorpo em Tandem (TandAb) (Affimed) Le Gall et al., Protein Eng Des Sel. Abril de 2004; 17(4): 357-66.), moléculas da Tecnologia de Realvejamento de Afinidade Dual (DART) (MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538), moléculas de Diacorpo de cadeia única (Lawrence, FEBS Lett. 3 de abril de 1998; 425(3): 479-84), Anticorpos semelhantes a TCR (AIT, ReceptorLogics), Fusão de Albumina Sérica Humana ScFv (Merrimack, WO2010059315) e moléculas COMBODY (Epigen Biotech, Zhu et al. Immunol Cell Biol. Ago de 2010; 88(6): 667-75.), nanocorpos de alvejamento dual (Ablynx, Hmila et al., FASEB J. 2010) e anticorpos de domínio apenas de cadeia pesada alvejador dual.

[00138] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico da invenção compreende uma primeira região Fc compreendendo uma primeira região CH3, e uma segunda região Fc compreendendo uma segunda região CH3, em que as sequências da primeira e segunda regiões CH3 são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3. Mais detalhes sobre estas interações e como elas podem ser obtidas são fornecidos na WO2011131746 e WO2013060867 (Genmab), que são por meio deste incorporadas por referência.

[00139] Como aqui descrito ainda, um anticorpo biespecífico CD3xCD20 estável pode ser obtido em alto rendimento usando um método particular com base em um anticorpo de partida homodimérico CD20 e um anticorpo de partida homodimérico CD3 contendo apenas umas poucas, mutações razoavelmente conservativas, assimétricas nas regiões CH3. Mutações assimétricas significam que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 contêm substituições de aminoácido em posições não idênticas.

[00140] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende primeira e segunda cadeias pesadas, em que cada uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas compreende pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e CH3, em que na dita primeira cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondendo a uma das posições selecionadas do grupo consistindo em T366, L368, K370, D399, F405, Y407, e K409 em uma cadeia pesada da IgG1 humana foi substituída, e na dita segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a uma posição selecionada do grupo consistindo em T366, L368, K370, D399, F405, Y407, e K409 em um cadeia pesada da IgG1 humana foi substituída, e em que a dita primeira e a dita segunda cadeias pesadas não são substituídas nas mesmas posições.

[00141] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende primeira e segunda cadeias pesadas, em que (i) o aminoácido na posição correspondendo a F405 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é L na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondendo a K409 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é R na dita segunda cadeia pesada, ou (ii) o aminoácido na posição correspondendo a K409 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é R na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondendo a F405 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é L na dita segunda cadeia pesada.

[00142] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 405, 407 e 409, e a segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 405, 407 e 409, e em que a primeira e segunda regiões Fc não são substituídas nas mesmas posições.

[00143] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 366, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 368, 370, 399, 405, 407 e 409. Em uma modalidade o aminoácido na posição 366 é selecionado de Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val ou Gln.

[00144] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 368, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 370, 399, 405, 407 e 409.

[00145] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 370, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 399, 405, 407 e 409.

[00146] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 399, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 405, 407 e 409.

[00147] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 405, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 407 e 409.

[00148] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 407, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 405, e 409.

[00149] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem uma substituição de aminoácido na posição 409, e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 405, e 407.

[00150] Consequentemente, em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 contêm mutações assimétricas, isto é, mutações em posições diferentes nas duas regiões CH3, por exemplo uma mutação na posição 405 em uma das regiões CH3 e uma mutação na posição 409 na outra região CH3.

[00151] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 405 e 407. Em uma tal modalidade, a dita primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um aminoácido outro que não Phe, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Cys, Lys, ou Leu, na posição 405. Em uma outra modalidade deste, a dita primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um aminoácido outro que não Phe, Arg ou Gly, por exemplo Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 405.

[00152] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um aminoácido outro que não Phe, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Leu, Met, ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma outra modalidade deste, a dita primeira região Fc compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um aminoácido outro que não Phe, Arg ou Gly, por exemplo Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409.

[00153] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma outra modalidade deste, a dita primeira região Fc compreende um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um aminoácido outro que não Phe, Arg ou Gly, por exemplo Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Met, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma outra modalidade, a dita primeira região Fc compreende Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409.

[00154] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405. Em uma outra modalidade, a dita primeira região Fc compreende um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00155] Ainda em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00156] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00157] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00158] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um Thr na posição 350, um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00159] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc compreende um Thr na posição 350, um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc compreende um Ile na posição 350, um Thr na posição 370, um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409.

[00160] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um aminoácido outro que não Phe na posição 405, tal como outro que não Phe, Arg ou Gly na posição 405; ou a dita primeira região CH3 tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407.

[00161] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc tendo um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met na posição 409 e uma segunda região Fc tendo um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407.

[00162] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc tendo um Tyr na posição 407 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met na posição 409 e uma segunda região Fc tendo um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00163] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc tendo um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e uma segunda região Fc tendo um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00164] Em uma outra modalidade, a dita primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr, por exemplo Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp, ou Cys, na posição 407. Em uma outra modalidade, a dita primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407.

[00165] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407.

[00166] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr, por exemplo Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp, ou Cys, na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00167] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00168] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00169] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um aminoácido outro que não Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr, por exemplo Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp, ou Cys, na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00170] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00171] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a dita primeira região Fc tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região Fc tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00172] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a primeira região Fc tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 409, e a segunda região Fc tem (i) um aminoácido outro que não Phe, Leu e Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um aminoácido outro que não Asp, Cys, Pro, Glu ou Gln, por exemplo Phe, Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asn, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 399 ou (iv) um aminoácido outro que não Lys, Arg, Ser, Thr, ou Trp, por exemplo Phe, Leu, Met, Ala, Val, Gly, Ile, Asn, His, Asp, Glu, Gln, Pro, Tyr, ou Cys, na posição 366.

[00173] Em uma modalidade, a primeira região Fc tem um Arg, Ala, His ou Gly na posição 409, e a segunda região Fc tem (i) um Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399, ou (iv) um Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, ou Tyr na posição 366.

[00174] Em uma modalidade, a primeira região Fc tem um Arg na posição 409, e a segunda região Fc tem (i) um Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399, ou (iv) um Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln na posição 366.

[00175] Além das substituições de aminoácido especificadas acima, as ditas primeira e segunda regiões Fc podem conter outras substituições, deleções ou inserções de aminoácido em relação às sequências Fc do tipo selvagem.

[00176] Em uma outra modalidade, o dito primeiro e segundo braços Fab (ou domínios constantes de cadeia pesada) compreendendo a primeira e segunda regiões Fc compreendem, exceto para as mutações especificadas, uma sequência CH3 independentemente selecionada das seguintes: (IgG1m(a)) (SEQ ID NO: 60), (IgG1m(f)) (SEQ ID NO: 61), e (IgG1m(ax) (SEQ ID NO: 62).

[00177] Em uma modalidade, nem a dita primeira nem a dita segunda região Fc compreende uma sequência Cys-Pro-Ser-Cys na região de dobradiça (núcleo).

[00178] Em uma outra modalidade, tanto a dita primeira quanto a dita segunda região Fc compreendem uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de dobradiça (núcleo).

[00179] Em modalidades separadas e específicas, um ou ambos dos braços Fab compreendem uma sequência da região constante de cadeia pesada independentemente selecionada das SEQ ID NOs: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, e 71 (ver a Tabela 1).

[00180] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas, (a) a primeira região de ligação a antígeno compreende a região variável de cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e a região variável de cadeia leve (VL) CDR1, CDR2, e CDR3 tendo as sequências como apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, respectivamente, e (b) a segunda região de ligação a antígeno que se liga à CD20 humana compreende a região VH CDR1 da SEQ ID NO: 32, a região VH CDR2 da SEQ ID NO: 33, a região VH CDR3 da SEQ ID NO: 34, a região VL CDR1 da SEQ ID NO: 35, a região VL CDR2 de DAS, e a região VL CDR3 da SEQ ID NO: 36, respectivamente.

[00181] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas, (a) a primeira região de ligação a antígeno compreende a sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e (b) a segunda região de ligação a antígeno compreende a sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 27, e a sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 28.

[00182] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas a primeira região de ligação a antígeno é um braço Fab derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL, e a segunda região de ligação a antígeno é um braço Fab derivado de IgG1-7D8- FEAR.

[00183] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas o primeiro braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula (isto é, compreendendo uma cadeia pesada e uma leve) derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL, e o segundo braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula derivado de IgG1-7D8-FEAR.

[00184] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas o primeiro braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAR, e o segundo braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula derivado de IgG1- 7D8-FEAL.

Métodos de preparar anticorpos biespecíficos

[00185] Métodos tradicionais tais como os métodos híbridos de hibridoma e conjugação química (Marvin e Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26: 649) podem ser usados na preparação dos anticorpos biespecíficos da invenção. A coexpressão em uma célula hospedeira de dois anticorpos, consistindo em cadeias pesadas e leves diferentes, leva a uma mistura de produtos de anticorpo possíveis além do anticorpo biespecífico desejado, que podem ser depois isolados, por exemplo, pela cromatografia de afinidade ou métodos similares.

[00186] Estratégias favorecendo a formação de um produto funcional biespecífico, na coexpressão de construções de anticorpo diferentes também podem ser usadas, por exemplo, o método descrito por Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155: 219). A fusão de hidridomas de rato e camundongo produzindo anticorpos diferentes leva a um número limitado de proteínas heterodiméricas por causa do emparelhamento de cadeia pesada/leve restrito de espécie preferencial. Uma outra estratégia para promover a formação de heterodímeros sobre homodímeros é uma estratégia “knob-into-hole” em que uma protuberância é introduzida em um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada e uma cavidade correspondente em um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, tal que a protuberância possa ser posicionada na cavidade na interface destas duas cadeias pesadas de modo a promover formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. “Protuberâncias” são construídas substituindo-se cadeias laterais de aminoácido pequenas da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores. “Cavidades” de compensação de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo substituindo-se cadeias laterais de aminoácido grandes com as menores (patente US 5.731.168). A EP1870459 (Chugai) e WO2009089004 (Amgen) descrevem outras estratégias para favorecer a formação de heterodímero na coexpressão de domínios de anticorpo diferentes em uma célula hospedeira. Nestes métodos, um ou mais resíduos que compõem a interface CH3-CH3 em ambos os domínios CH3 são substituídos com um aminoácido carregado tal que a formação de homodímero seja eletrostaticamente desfavorável e a heterodimerização seja eletrostaticamente favorável. A WO2007110205 (Merck) descreve ainda uma outra estratégia, em que diferenças entre os domínios CH3 de IgA e IgG são explorados para promover a heterodimerização.

[00187] Um outro método in vitro para produzir anticorpos biespecíficos foi descrito na WO2008119353 (Genmab), em que um anticorpo biespecífico é formado pela troca do “braço Fab” ou “meia-molécula” (troca de uma cadeia pesada e cadeia leve ligada) entre dois anticorpos IgG4 ou semelhante a IgG4 monoespecíficos na incubação sob condições redutoras. O produto resultante é um anticorpo biespecífico tendo dois braços Fab que podem compreender sequências diferentes.

[00188] Um método preferido para preparar o anticorpo biespecífico CD3xCD20s da presente invenção inclui os métodos descritos na WO2011131746 e WO13060867 (Genmab) compreendendo as seguintes etapas: a) fornecer um primeiro anticorpo compreendendo uma região Fc, a dita região Fc compreendendo uma primeira região CH3; b) fornecer um segundo anticorpo compreendendo uma segunda região Fc, a dita região Fc compreendendo uma segunda região CH3, em que o primeiro anticorpo é um anticorpo de CD3 e o segundo anticorpo é um anticorpo de CD20, ou vice e versa; em que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3; c) incubar o dito primeiro anticorpo junto com o dito segundo anticorpo sob condições redutoras; e d) obter o dito anticorpo biespecífico CD3xCD20.

[00189] Em uma modalidade, o dito primeiro anticorpo junto com o dito segundo anticorpo são incubados sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram a isomerização da ligação de dissulfeto, em que a interação heterodimérica entre os ditos primeiro e segundo anticorpos no anticorpo heterodimérico resultante é tal que nenhuma troca de braço Fab ocorre a 0,5 mM de GSH depois de 24 horas a 37° C.

[00190] Sem estar limitado à teoria, na etapa c), as ligações de dissulfeto da cadeia pesada na região de dobradiças dos anticorpos precursores são reduzidas e as cisteínas resultantes são então capazes de formar ligação de dissulfeto intercadeia pesada com resíduo de cisteínas de uma outra molécula de anticorpo precursora (originalmente com uma especificidade diferente). Em uma modalidade deste método, as condições redutoras na etapa c) compreendem a adição de um agente redutor, por exemplo um agente redutor selecionado do grupo consistindo em: 2- mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutationa, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercapto- etanol, preferivelmente um agente redutor selecionado do grupo consistindo em: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol e tris(2-carboxietil)fosfina. Em uma outra modalidade, a etapa c) compreende restaurar as condições para se tornar não redutora ou menos redutora, por exemplo pela remoção de um agente redutor, por exemplo pela dessalinização.

[00191] Para este método qualquer um dos anticorpos de CD3 e CD20 descritos acima pode ser usado incluindo primeiro e segundo anticorpos de CD3 e CD20, respectivamente, compreendendo uma primeira e/ou segunda região Fc. Os exemplos de tais primeira e segunda regiões Fc, incluindo a combinação de tais primeira e segunda regiões Fc pode incluir qualquer um daqueles descritos acima. Em uma modalidade particular o primeiro e segundo anticorpos de CD3 e CD20, respectivamente, podem ser escolhidos de modo a se obter um anticorpo biespecífico como aqui descrito.

[00192] Em uma modalidade deste método, os ditos primeiro e/ou segundo anticorpos são anticorpos de tamanho natural.

[00193] As regiões Fc do primeiro e segundo anticorpos podem ser de qualquer isótipo, incluindo, mas não limitados a, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em uma modalidade deste método, as regiões Fc tanto do dito primeiro quanto do dito segundo anticorpos são do isótipo IgG1. Em uma outra modalidade, uma das regiões Fc dos ditos anticorpos é do isótipo IgG1 e o outro do isótipo IgG4. Na última modalidade, o anticorpo biespecífico resultante compreende uma região Fc de uma IgG1 e uma região Fc de IgG4 e pode assim ter propriedades intermediárias interessantes com respeito à ativação de funções atuadoras.

[00194] Em uma outra modalidade, uma das proteínas de partida do anticorpo foi engenheirada para não ligar a Proteína A, possibilitando assim separar a proteína heterodimérica da dita proteína homodimérica de partida passando-se o produto em uma coluna de proteína A.

[00195] Como descrito acima, as sequências da primeira e segunda regiões CH3 do anticorpo de partida homodiméricos são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3. Mais detalhes sobre estas interações e como elas podem ser obtidas são fornecidos na WO2011131746 e WO2013060867 (Genmab), que são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade.

[00196] Em particular, um anticorpo biespecífico CD3xCD20 estável pode ser obtido em alto rendimento usando o método da invenção acima com base em dois anticorpos de partida homodiméricos que ligam CD3 e CD20, respectivamente, e contêm apenas umas poucas, mutações assimétricas, razoavelmente conservativas, nas regiões CH3. Mutações assimétricas significam que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 contêm substituições de aminoácido em posições não idênticas.

[00197] Os anticorpos biespecíficos da invenção também podem ser obtidos pela coexpressão de construções codificando o primeiro e segundo polipeptídeos em uma única célula. Assim, em um outro aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um anticorpo biespecífico, o dito método compreendendo as seguintes etapas: a) fornecer uma primeira construção de ácido nucleico codificando um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeira região Fc e uma primeira região de ligação a antígeno de uma primeira cadeia pesada de anticorpo, a dita primeira região Fc compreendendo uma primeira região CH3, b) fornecer uma segunda construção de ácido nucleico codificando um segundo polipeptídeo compreendendo uma segunda região Fc e uma segunda região de ligação a antígeno de uma segunda cadeia pesada de anticorpo, a dita segunda região Fc compreendendo uma segunda região CH3, em que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3, e em que a dita primeira proteína homodimérica tem um aminoácido outro que não Lys, Leu ou Met na posição 409 e a dita segunda proteína homodimérica tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em: 366, 368, 370, 399, 405 e 407, opcionalmente em que as ditas primeira e segunda construções de ácido nucleico codificam as sequências de cadeia leve dos ditos primeiro e segundo anticorpos c) coexpressar as ditas primeira e segunda construções de ácido nucleico em uma célula hospedeira, e d) obter a dita proteína heterodimérica da cultura de célula.

[00198] Assim, a presente invenção também se refere a uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante que produz um anticorpo biespecífico da presente invenção.

[00199] Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo biespecífico é obtido por qualquer um dos métodos de acordo com a presente invenção.

[00200] Os vetores de expressão adequados, incluindo promotores, realçadores, etc., e células hospedeiras adequadas para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os exemplos de células hospedeiras incluem células de levedura, bacterianas e de mamífero, tais como células CHO ou HEK.

[00201] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende primeira e segunda regiões CH3, exceto para as mutações especificadas, compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 60 (IgG1m(a)).

[00202] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que nem a dita primeira nem a dita segunda regiões Fc compreendem uma sequência Cys-Pro-Ser-Cys na região de dobradiça.

[00203] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que tanto a dita primeira quanto a dita segunda regiões Fc compreendem uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de dobradiça.

[00204] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que a primeira e segunda regiões Fc são regiões Fc de anticorpo humano.

[00205] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que as ditas primeira e segunda regiões Fc, exceto para as mutações especificadas, compreendem uma sequência independentemente selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, e 71.

[00206] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que a primeira e segunda regiões de ligação a antígeno compreendem sequências VH de anticorpo humano e, opcionalmente, sequências VL de anticorpo humano.

[00207] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que a primeira e segunda regiões de ligação a antígeno são de anticorpos de cadeia pesada.

[00208] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira região Fc e uma segunda região Fc, em que a primeira e segunda regiões de ligação a antígeno compreendem uma primeira e segunda cadeia leve.

[00209] Em outras modalidades, o método de coexpressão de acordo com a invenção compreende qualquer um dos traços adicionais descritos sob o método in vitro acima.

[00210] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo a primeira e segunda construções de ácido nucleico especificadas aqui acima. Em uma outra modalidade, o vetor de expressão compreende ainda uma sequência de nucleotídeo codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou tanto cadeias leves quanto pesadas de um anticorpo, por exemplo um anticorpo humano.

[00211] Um vetor de expressão no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores cromossômicos, não cromossômicos, e vetores de ácido nucleico sintéticos (uma sequência de ácido nucleico compreendendo um conjunto adequado de elementos de controle de expressão). Os exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, e vetores de ácido nucleico virais (RNA ou DNA). Em uma modalidade, um ácido nucleico codificando anticorpo de CD20 ou um CD3 é compreendido em um vetor nu de DNA ou RNA, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito por exemplo em Sykes e Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compactado (como descrito por exemplo na US 6.077.835 e/ou WO00/70087), um vetor plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18, ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucleico “de mosquito pólvora” minimamente dimensionado (como descrito por exemplo em Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ou como uma construção de vetor de ácido nucleico precipitado, tal como uma construção precipitada com CaPO4 (como descrito por exemplo na WO200046147, Benvenisty e Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), e Coraro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tais vetores de ácido nucleico e o uso dos mesmos são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo US 5.589.466 e US 5.973.972).

[00212] Em uma modalidade, o vetor é adequado para a expressão do anticorpo de CD20 e/ou do anticorpo de CD3 em uma célula bacteriana. Os exemplos de tais vetores incluem vetores de expressão tais como BlueScript (Stratagene), vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vetores pET (Novagen, Madison WI) e similares).

[00213] Um vetor de expressão também pode ou alternativamente ser um vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura pode ser utilizado. Os vetores adequados incluem, por exemplo, vetores compreendendo promotores constitutivos ou indutíveis tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH (revisado em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987), e Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).

[00214] Um vetor de expressão também pode ou alternativamente ser um vetor adequado para a expressão em células de mamífero, por exemplo um vetor compreendendo glutamina sintetase como um marcador selecionável, tal como os vetores descritos em Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10: 169-175.

[00215] Um ácido nucleico e/ou vetor também podem compreender uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de secreção/ localização, que pode alvejar um polipeptídeo, tal como uma cadeia de polipeptídeo nascente, para o espaço periplásmico ou no meio de cultura de célula. Tais sequências são conhecidas na técnica, e incluem peptídeos líder ou de sinal de secreção.

[00216] O vetor de expressão pode compreender ou estar associado com qualquer promotor, realçador, e outros elementos facilitadores de expressão adequados. Os exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão fortes (por exemplo, promotor/realçado IE de CMV humano assim como os promotores RSV, SV40, SL3-3, MMTV, e HIV LTR), sequências de terminação poli (a) eficazes, uma origem de replicação para produto plasmídico na E. coli, um gene de resistência a antibiótico como marcador selecionável, e/ou um sítio de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligador). Os ácidos nucleicos também podem compreender um promotor indutível como oposto a um promotor constitutivo tal como IE do CMV.

[00217] Em uma modalidade, o vetor de expressão codificando os anticorpos de CD20 e/ou CD3 pode ser posicionado na e/ou liberados para a célula hospedeira ou animal hospedeiro via um vetor viral.

[00218] Ainda em um outro aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo a primeira e segunda construções de ácido nucleico especificadas aqui acima.

[00219] Assim a presente invenção também se refere a uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante que produz um anticorpo biespecífico da presente invenção, tal como uma transfectoma.

[00220] O primeiro anticorpo específico de CD20 pode ser expresso em uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante, tal como um transfectoma, que produza um anticorpo da invenção como aqui definido ou um anticorpo biespecífico da invenção como aqui definido. O anticorpo específico de CD3 pode igualmente ser expresso em uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante, tal como um transfectoma, que produz um anticorpo da invenção como aqui definido ou um anticorpo biespecífico da invenção como aqui definido.

[00221] Os exemplos de células hospedeiras incluem células de levedura, bacteriana, vegetal e mamífera, tais como células CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 ou NS0 ou células linfocíticas. Por exemplo, em uma modalidade, a célula hospedeira pode compreender uma primeira e segunda construções de ácido nucleico estavelmente integradas dentro do genoma celular. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma célula compreendendo um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo, ou elemento de expressão linear, que compreende uma primeira e segunda construções de ácido nucleico como especificadas acima.

[00222] Ainda em um outro aspecto, a invenção se refere a um animal não humano ou planta transgênicos compreendendo ácidos nucleicos codificando um ou dois conjuntos de uma cadeia pesada humana e cadeia leve humana, em que o animal ou planta produzem um anticorpo biespecífico da invenção.

[00223] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um hibridoma que produz um anticorpo para o uso em um anticorpo biespecífico da invenção como aqui definido. Ainda em um outro aspecto, a invenção se refere a um animal não humano ou planta transgênicos compreendendo ácidos nucleicos codificando um ou dois conjuntos de uma cadeia pesada humana e cadeia leve humana, em que o animal ou planta produzem um anticorpo para o uso em um anticorpo biespecífico ou um anticorpo biespecífico da invenção.

[00224] Em um aspecto, a invenção se refere a uma construção de ácido nucleico codificando uma ou mais sequências de aminoácido apresentadas na Tabela 1.

[00225] Em um aspecto, a invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo (i) uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de cadeia pesada de um primeiro braço de ligação de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas; (ii) uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de cadeia leve de um primeiro braço de ligação de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas; (iii) uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de cadeia pesada de um segundo braço de ligação de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas; (iv) uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de cadeia leve de um segundo braço de ligação de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas; (v) o ácido nucleico apresentado em (i) e o ácido nucleico apresentado em (ii); (vi) o ácido nucleico apresentado em (iii) e o ácido nucleico apresentado em (iv). (vii) o ácido nucleico apresentado em (i), (ii), (iii) e (iv).

[00226] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas, compreendendo as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira como aqui descrita compreendendo um vetor de expressão como aqui descrito expressando o primeiro anticorpo como aqui descrito e purificar o dito anticorpo do meio de cultura; b) cultivar uma célula hospedeira como aqui descrita compreendendo um vetor de expressão como aqui descrito expressando o segundo anticorpo como aqui descrito e purificar o dito anticorpo do meio de cultura; c) incubar o dito primeiro anticorpo junto com o dito segundo anticorpo sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram a isomerização da ligação de dissulfeto, e d) obter o dito anticorpo biespecífico.

[00227] Em um aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão como definido acima. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica recombinante, procariótica recombinante, ou microbiana recombinante.

Regiões Fc

[00228] Em um aspecto da presente invenção, o anticorpo biespecífico CD3xCD20 de acordo com a presente invenção compreende ainda uma primeira região Fc e uma segunda região Fc que pode ser compreendida em um primeiro e um segundo braços Fab que respectivamente compreendem ainda a primeira e segunda regiões de ligação a antígeno descritas acima (ou vice e versa).

[00229] Em um outro aspecto da presente invenção, o anticorpo biespecífico CD3xCD20 compreende um primeiro e um segundo braços Fab compreendendo uma primeira e uma segunda região de ligação a antígeno, respectivamente. O anticorpo biespecífico CD3xCD20 compreende ainda uma primeira e uma segunda região Fc. Em um aspecto da presente invenção, o anticorpo biespecífico CD3xCD20 compreende o primeiro braço Fab compreendendo a primeira região de ligação a antígeno e a primeira região Fc, e o segundo braço Fab compreendendo a segunda região de ligação a antígeno e a segunda região Fc.

[00230] Em um outro aspecto da presente invenção, o anticorpo biespecífico CD3xCD20 compreende o segundo braço Fab compreendendo a segunda região de ligação a antígeno e a primeira região Fc, e o primeiro braço Fab compreendendo a primeira região de ligação a antígeno e a segunda região Fc.

[00231] A primeira e segunda regiões Fc podem cada uma ser de qualquer isótipo, incluindo, mas não limitados a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e podem compreender uma ou mais mutações ou modificações. Em uma modalidade, cada uma da primeira e segunda regiões Fc é do isótipo IgG4 ou derivada deste, opcionalmente com uma ou mais mutações ou modificações. Em uma modalidade, cada uma da primeira e segunda regiões Fc é do isótipo IgG1 ou derivado deste, opcionalmente com uma ou mais mutações ou modificações. Em uma outra modalidade, uma das regiões Fc é do isótipo IgG1 e a outra do isótipo IgG4, ou é derivada de tais respectivos isótipos, opcionalmente com uma ou mais mutações ou modificações.

[00232] Em uma modalidade, uma ou ambas das regiões Fc compreendem uma mutação removendo o sítio aceitador para a glicosilação ligada a Asn ou é de outro modo manipulado para mudar as propriedades de glicosilação. Por exemplo, em uma região Fc IgG1, uma mutação N297Q pode ser usada para remover um sítio de glicosilação ligado a Asn. Consequentemente, em uma modalidade específica, uma ou ambas regiões Fc compreendem uma sequência IgG1 do tipo selvagem com uma mutação N297Q (SEQ ID NO: 66, ver a Tabela 1).

[00233] Em uma modalidade, uma ou ambas regiões Fc são deficientes na função atuadora. Por exemplo, a(s) região(ões) Fc pode(m) ser de um isótipo IgG4, ou um tipo não IgG4, por exemplo IgG1, IgG2 ou IgG3, que foi mutado tal que a capacidade para mediar funções atuadoras, tais como ADCC, foi reduzida ou mesmo eliminado. Tais mutações por exemplo foram descritos em Dall’Acqua WF et al., J Immunol. 177(2): 1129-1138 (2006) e Hezareh M, J Virol.; 75(24): 12161-12168 (2001). Em uma modalidade, uma ou ambas as regiões Fc compreendem uma sequência IgG1 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 63, ver a Tabela 1).

[00234] O anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção pode compreender modificações na região Fc. Quando um anticorpo biespecífico compreende tais modificações o mesmo pode se tornar um anticorpo biespecífico inerte, ou não ativador. Os termos “inércia”, “inerte” ou “não ativador” como aqui usados, se referem a uma região Fc que pelo menos não é capaz de ligar qualquer um dos receptores FCY, induzem a reticulação mediada por Fc de FcRs, ou induzem a reticulação mediada por FcR de antígenos alvos via duas regiões Fc de anticorpos individuais, ou não são capazes de ligar C1q. A inércia de uma região Fc de um anticorpo de CD3 humanizada ou quimérico é vantajosamente testada usando o anticorpo em um formato monoespecífico.

[00235] Diversas variantes podem ser construídas para tornar a região Fc de um anticorpo inativa para interações com receptores FCY (gama) e C1q para o desenvolvimento de anticorpo terapêutico. Os exemplos de tais variantes são aqui descritos.

[00236] Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que o dito anticorpo medeia a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 99 % ou 100 %, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00237] Assim, aminoácidos na região Fc que desempenha um papel dominante nas interações com C1q e os receptores Fcy podem ser modificados. Os exemplos de posições de aminoácido que podem ser modificadas incluem as posições L234, L235 e P331. Combinações das mesmas, tais como L234F/L235E/P331S, podem causar uma diminuição profunda na ligação à CD64, CD32A, CD16 e C1q humanas.

[00238] Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em pelo menos uma posição correspondendo a L234, L235 e P331, pode ser A, A e S, respectivamente (Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1): 16-26; Oganesyan et al., 2008, Acta Cryst. (D64): 700-4). Também, as substituições de aminoácido L234F e L235E podem resultar nas regiões Fc com interações anuladas com receptores Fcy e C1q (Canfield et al., 1991, J. Exp. Med. (173): 1483-91; Duncan et al., 1988, Nature (332): 738-40). Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235, podem ser F e E, respectivamente. Uma substituição de aminoácido D265A pode diminuir a ligação a todos os receptores Fc gama e impedir ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276): 6591-604). Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondendo a D265 pode ser A. A ligação a C1q pode ser anulada pelas posições de mutação D270, K322, P329 e P331. A mutação nestas posições para D270A ou K322A ou P329A ou P331A pode tornar o anticorpo deficiente na atividade de CDC (Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178-84). Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos em pelo menos uma posição correspondendo a D270, K322, P329 e P331, pode ser A, A, A, e A, respectivamente.

[00239] Um método alternativo para minimizar a interação da região Fc com receptores FCY e C1q é pela remoção do sítio de glicosilação de um anticorpo. A posição de mutação N297 para por exemplo Q, A, ou E remove um sítio de glicosilação que é crítica para interações de receptor IgG-Fc gama. Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondendo a N297, pode ser G, Q, A ou E Leabman et al., 2013, MAbs; 5(6): 896-903). Um outro método alternativo para minimizar a interação da região Fc com receptores FCY pode ser obtido pelas seguintes mutações; P238A, A327Q, P329A ou E233P/L234V/L235A/G236del (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276): 6591-604).

[00240] Alternativamente, as subclasses IgG2 e IgG4 humanas são consideradas naturalmente comprometidos em suas interações com receptores de C1q e Fc gama embora interações com receptores Fcy foram relatadas (Parren et al., 1992, J. Clin Invest. 90: 1537-1546; Bruhns et al., 2009, Blood 113: 3716-3725). As mutações que anulam estas interações residuais podem ser feitas em ambos os isótipos, resultando na redução de efeitos colaterais indesejados associados com ligação FcR. Para IgG2, estes incluem L234A e G237A, e para IgG4, L235E. Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondendo a L234 e G237 em uma cadeia pesada de IgG2 humana, pode ser A e A, respectivamente. Em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondendo a L235 em uma cadeia pesada de IgG4 humana, pode ser E.

[00241] Outros métodos para minimizar ainda mais a interação com receptores Fc gama e C1q nos anticorpos IgG2 incluem aqueles descritos na WO2011066501 e Lightle, S., et al., 2010, Protein Science (19): 753-62.

[00242] A região de dobradiça do anticorpo também pode ser de importância com respeito às interações com receptores de FCY e complemento (Brekke et al., 2006, J Immunol 177: 1129-1138; Dall’Acqua WF, et al., 2006, J Immunol 177: 1129-1138). Consequentemente, as mutações na ou deleção da região de dobradiça pode influenciar funções atuadoras de um anticorpo.

[00243] O termo “reticulação” como aqui usado, se refere à ligação em ponte indireta de braço(s) de anticorpo Fab (monovalente ou bivalentemente) ligados ao antígeno alvo por uma célula que carrega FcR através da ligação à região de anticorpo Fc. Assim, um anticorpo que liga o seu antígeno alvo nas células que carregam antígeno alvo pode reticular esta célula com uma outra célula expressando FcRs.

[00244] O termo “morte não específica” como aqui usado, se refere à morte de células pela função citotóxica de células T ou outras células atuadoras, através da ativação independente de antígeno alvo de tumor das ditas células. Assim, pela morte não específica é intencionado que as células atuadoras, por exemplo células T citotóxicas, são ativadas e induzem a citotoxicidade independente da ligação do alvo de tumor, por exemplo pela ligação do anticorpo ao CD3 e um FcyR.

[00245] Assim, em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira e uma segunda cadeias pesadas de imunoglobulina, em que em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas de imunoglobulina um ou mais aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L, D, N, e P, respectivamente.

[00246] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas um ou mais aminoácidos na posição correspondendo às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L, D, N, e P, respectivamente.

[00247] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas um ou mais aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L e D, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo a N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00248] O termo “aminoácido correspondendo às posições” como aqui usado se refere a um número de posição de aminoácido em uma cadeia pesada da IgG1 humana. Posições de aminoácido correspondentes em outras imunoglobulinas podem ser encontradas pelo alinhamento com a IgG1 humana. A menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto, os aminoácidos das sequências de região constante são aqui numerados de acordo com o índice EU de numeração (descrito em Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest. 5a Edição - US Department of Health and Human Services, publicação NIH No. 91-3242, pp 662, 680, 689). Assim, um aminoácido ou segmento em uma sequência que “corresponde a” um aminoácido ou segmento em uma outra sequência é um que se alinha com o outro aminoácido ou segmento usando um programa de alinhamento de sequência padrão tal como ALIGN, ClustalW ou similar, tipicamente nos ajustes de default e tem pelo menos 50 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % de identidade com uma cadeia pesada da IgG1 humana. É considerado bem conhecido na técnica como alinhar uma sequência ou segmento em uma sequência e determinar deste modo a posição correspondente em uma sequência a uma posição de aminoácido de acordo com a presente invenção.

[00249] No contexto da presente invenção, o aminoácido pode ser definido como descrito acima.

[00250] O termo “o aminoácido não é” ou palavra similar quando da alusão referindo-se aos aminoácidos em uma cadeia pesada deve ser entendido significar que o aminoácido é qualquer outro aminoácido que não o aminoácido específico mencionado. Por exemplo, o aminoácido na posição correspondendo a L234 em uma cadeia pesada da IgG1 humana não é L, significa que o aminoácido pode ser qualquer um dos outros aminoácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente que não L.

[00251] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é D.

[00252] Em uma modalidade, em pelo menos um da primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo a D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é D, e o aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00253] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é de aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00254] O termo “hidrofóbica” como aqui usada em relação a um resíduo de aminoácido, se refere a um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, e Y. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo em; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y.

[00255] O termo “polar” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo em; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00256] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é um aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00257] O termo “alifáticos não carregados” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: A, G, I, L, e V. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, G, I, L, e V.

[00258] O termo “aromático” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: F, T, e W. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; F, T, e W.

[00259] O termo “ácido” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistindo em: D e E. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; D e E.

[00260] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, E, F, G, I, L, T, V, e W.

[00261] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é D.

[00262] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo a D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é D, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00263] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é aminoácido hidrofóbico ou polar.

[00264] Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo em; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y.

[00265] Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo em; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo em; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y.

[00266] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo em; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00267] Em uma outra modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00268] Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, G, I, L, e V.

[00269] Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; F, T, e W.

[00270] Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; D e E.

[00271] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, E, F, G, I, L, T, V, e W.

[00272] Em outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição N297 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é N.

[00273] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo a N297 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é N, e o aminoácido na posição correspondendo à posição P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, é P.

[00274] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição N297 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é N.

[00275] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo a N297 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não é N, e o aminoácido na posição correspondendo à posição P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, é P.

[00276] Em outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L e L, respectivamente.

[00277] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L e L, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00278] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são selecionados do grupo consistindo em; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V.

[00279] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00280] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00281] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo em; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00282] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00283] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L e L, respectivamente.

[00284] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L e L, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00285] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00286] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00287] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo em; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00288] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00289] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00290] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, G, I, e V.

[00291] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; F, T, e W.

[00292] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; D e E.

[00293] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, D, E, F, G, I, T, V, e W.

[00294] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente.

[00295] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00296] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente.

[00297] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00298] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F e E, respectivamente.

[00299] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F e E, respectivamente.

[00300] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas pelo menos os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são A e A, respectivamente.

[00301] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas pelo menos os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são A e A, respectivamente.

[00302] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L, e D, respectivamente.

[00303] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L e D, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00304] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são selecionados do grupo consistindo em; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V, e W, e o aminoácido correspondendo à posição D265 é selecionado do grupo consistindo em; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V, e W.

[00305] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00306] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo em; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00307] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo em; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T, o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo em; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00308] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y, e o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00309] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00310] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo em; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00311] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo em; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T, o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo em; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00312] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y, e o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00313] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00314] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, G, I, L, e V, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, G, I, e V.

[00315] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; F, T, e W.

[00316] Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; D e E.

[00317] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, E, F, G, I, L, T, V, e W, e os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, D, E, F, G, I, T, V, e W.

[00318] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L, e D, respectivamente.

[00319] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, não são L, L, e D, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00320] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00321] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, G, I, L, e V, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, G, I, e V.

[00322] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo em; D e E.

[00323] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondendo à posição D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo em; A, E, F, G, I, L, T, V, e W, e os aminoácidos nas posições correspondendo a L234 e L235 são cada um selecionados do grupo consistindo em; A, D, E, F, G, I, T, V, e W.

[00324] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente.

[00325] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00326] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente.

[00327] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondendo às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00328] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00329] Em uma modalidade particular preferida, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00330] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são A, A, e A, respectivamente.

[00331] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são A, A, e A, respectivamente.

[00332] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, A, Q, e S, respectivamente.

[00333] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, A, Q, e S, respectivamente.

[00334] Em uma modalidade particular, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00335] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00336] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00337] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00338] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00339] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada da IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00340] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende a cadeia leve do domínio constante lambda de IgLC2/IgLC3 humana da SEQ ID NO: 29.

[00341] Diversas variantes de anticorpo foram geradas com uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc. Uma região Fc não ativadora impede o anticorpo de interagir com os receptores Fc presentes nas células sanguíneas, tais como monócitos, ou com C1q para ativar o caminho de complemento clássico. A redução da atividade de Fc foi testada em variantes de anticorpo que contêm combinações diferentes de substituições de aminoácido na região Fc. No máximo cinco substituições de aminoácido foram introduzidas, que incluem as mutações N297Q, L234A, L235A, L234F, L235E, D265A, e P331S. As substituições em uma ou mais destas cinco posições de aminoácido foram introduzidas na armação de IgG1 K409R e/ou F405L. As seguintes variantes da região Fc do anticorpo huCLB-T3/4 foram geradas: N297Q (se refere à substituição N297Q, denominada IgG1-huCLB- T3/4-N297Q), LFLE (se refere às substituições L234F/L235E, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LFLE), LALA (se refere às substituições L234A/L235A, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LALA), LFLENQ (se refere às substituições L234F/L235E/N297Q, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ), LFLEDA (se refere às substituições L234F/L235E/D265A, denominadas IgG1-huCLB- T3/4-LFLEDA), DA (se refere à substituição D265A, denominada IgG1- huCLB-T3/4-DA), DAPS (se refere às substituições D265A/P331S, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-DAPS), DANQ (se refere às substituições D265A/N297Q, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-DANQ), LFLEPS (se refere às substituições L234F/L235E/P331S, denominadas IgG1-huCLB-T3/4- LFLEPS), e LFLEDANQPS (se refere às substituições L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S, denominadas IgG1-huCLB-T3/4- LFLEDANQPS).

[00342] Em particular, nas variantes de anticorpo IgG1-huCD3 uma combinação de três substituições de aminoácido, que inclui as mutações L234F, L235E e D265A e é aludida como LFLEDA ou FEA, foi introduzida nas armações de IgG1 K409R e F405L para gerar anticorpos com uma região Fc não ativadora. A variante de anticorpo não ativadora resultante é denominada com o sufixo “FEAR” ou “FEAL”, respectivamente.

[00343] Em um aspecto, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser modificados na cadeia leve e/ou cadeia pesada para aumentar o nível de produção e/ou rendimento de produção. Em uma modalidade, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser modificados na cadeia leve. Tais modificações são conhecidas na técnica e podem ser realizadas de acordo com os métodos descritos por exemplo em Zheng, L., Goddard, J.-P., Baumann, U., & Reymond, J.-L. (2004). Expression improvement and mechanistic study of the retro-Diels-Alderase catalytic antibody 10F11 by site-directed mutagenesis. Journal of Molecular Biology, 341(3), 807-14.

[00344] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira cadeia pesada e primeira cadeia leve, em que o aminoácido na posição correspondendo à posição T41 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não é T.

[00345] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o aminoácido na posição correspondendo à posição T41 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 é selecionado de H, I, K, L, Q, R e V.

[00346] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o aminoácido na posição correspondendo à posição T41 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 é H, K ou R.

[00347] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o aminoácido na posição correspondendo à posição T41 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve é K.

[00348] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não é F, e uma ou mais das posições de aminoácido correspondendo às posições T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não são T, K e L, respectivamente.

[00349] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não são F, T, K e L, respectivamente.

[00350] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve são L, K, N, e H, respectivamente.

[00351] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, os aminoácidos nas posições correspondendo às posições R23 e A35 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não são R e A, respectivamente.

[00352] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, os aminoácidos nas posições correspondendo às posições R23 e A35 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve são A e P, respectivamente.

[00353] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, R23, A35, R47, D71, A82, D83, S86, I87, e F89 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não são F, R, A, R, D, A, D, S, I, e F, respectivamente.

[00354] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, R23, A35, R47, D71, A82, D83, S86, I87, e F89 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve são L, A, P, T, G, P, E, A, E, e Y, respectivamente.

[00355] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, (i) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não é F, ou (ii) o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não é K, ou (iii) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não é F, e o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve não é K.

[00356] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, (i) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve é L, ou (ii) o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve é N, ou (iii) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve é L, e o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve é N.

[00357] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que o aminoácido na posição correspondendo à posição T41 é selecionado de H, I, K, L, Q, R ou V, tal como selecionado de H, K e R, tal como K. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve tendo os aminoácidos L, K, N, e H, respectivamente, nas posições correspondendo às posições F10, T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que o aminoácido na posição correspondendo à posição R23 é selecionado de A, G, H, K, Q, S, e T, tal como de A e G, e em que o aminoácido na posição correspondendo a A35 é selecionado de I, L, M, P, V, G, F e W, tal como de I, L, M, P, e V.

[00358] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que o aminoácido na posição correspondendo à posição R23 é A ou G, tal como A, e o aminoácido na posição correspondendo à posição A35 é P.

[00359] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, R23, A35, R47, D71, A82, D83, S86, I87, e F89 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 não são F, R, A, R, D, A, D, S, I, e F, respectivamente.

[00360] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que o aminoácido na posição correspondendo à posição R23 é selecionado de A, G, H, K, Q, S, e T, tal como de A e G, em que o aminoácido na posição correspondendo a A35 é selecionado de I, L, M, P, V, G, F e W, tal como de I, L, M, P, e em que os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, R47, D71, A82, D83, S86, I87, e F89 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 são L, T, G, P, E, A, E, e Y, respectivamente.

[00361] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que o aminoácido na posição correspondendo à posição R23 é A ou G, e em que os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, A35, R47, D71, A82, D83, S86, I87, e F89 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 são L, P, T, G, P, E, A, E, e Y, respectivamente.

[00362] Em um aspecto, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser modificados na primeira e/ou segunda cadeias leves para aumentar a afinidade dos anticorpos.

[00363] Em um aspecto, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser modificados na cadeia leve do primeiro e/ou segundo braços de ligação para reduzir a afinidade dos anticorpos. Isto pode ser vantajoso em alguns cenários e conduz para eficácia aumentada. Em particular a baixa afinidade do primeiro braço de ligação (ligação à CD3ε (épsilon) humana) pode ter um impacto sobre a mobilidade das células T em circulação e no sítio de tumor conduzindo assim a melhor entrosamento das células T com as células de tumor, conforme. M0lh0j et al., Molecular Immunology 44 (2007). Em particular isto pode ser útil em formatos biespecíficos, em que os anticorpos de CD3 são usados como um dos braços de ligação. As modificações que conduzem para afinidade de anticorpo reduzida são conhecidas na técnica, ver por exemplo Webster et al. Int J Cancer Suppl. 1988; 3: 13-6.

[00364] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que (i) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 não é F, ou (ii) o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 não é K, ou (iii) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 não é F, e o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 não é K.

[00365] Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção compreende uma cadeia leve constante (LC), em que (i) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 é L, ou (ii) o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 é N, ou (iii) o aminoácido na posição correspondendo à posição F10 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 é L, e o aminoácido na posição correspondendo à posição K55 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 é N.

[00366] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma cadeia leve, em que os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 não são F, T, K e L, respectivamente. Tais modificações servem tanto para aumentar o nível de produção quanto para reduzir a afinidade.

[00367] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende uma primeira cadeia leve, em que os aminoácidos nas posições correspondendo às posições F10, T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 são L, K, N, e H, respectivamente. Tais modificações servem tanto para aumentar o nível de produção quanto para reduzir a afinidade.

[00368] Em um outro aspecto da invenção, mutações nas regiões de CDR de huCD3 foram feitas para otimizar a afinidade de ligação do braço de ligação de CD3, tal como para reduzir a afinidade de ligação do braço de CD3.

[00369] Assim, em uma modalidade, o braço de ligação de CD3 do anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende as seis sequências de CDR selecionadas das sequências de CDR apresentadas na Tabela 2 abaixo.

[00370] Em uma modalidade, as seis sequências de CDR podem ser inseridas em qualquer uma das sequências de armação das VH e VL de huCD3 VH1, VH2, VH3 e VH4, e VL1, VL2, e VL3, respectivamente, substituindo as sequências de CDR de huCD3. Em uma modalidade, as seis sequências da CDR são inseridas nas sequências da armação de huCD3 VH1 e VL1.

[00371] Em uma outra modalidade, o braço de ligação de CD3 compreende as seis sequências de CDR selecionadas da Tabela 2, em que XI da SEQ ID NO: 72 é selecionado de V, H, F, T, P, L, Q, D, K, W, G, A, C e R; X2 da SEQ ID NO: 73 é selecionado de N, A, H, Q, P, F, M, Y, L, W, D, E e C; X4 da SEQ ID NO: 75 é selecionado de Y, Q, W, L, A, I, M, D, T, K, R, G, F, E, V, C e P; X5 da SEQ ID NO: 76 é selecionado de N, L, Y, W, H, M, G, F, K, S, V, R, Q, D, C, E e P; X10 da SEQ ID NO: 81 é selecionado de A, G, R, V, F, E, M, H, N, Y, P, Q, D, K e L; X12 da SEQ ID NO: 83 é selecionado de D, K, Q, G, V, E, T, N, Y, S, P, W, F e M.

[00372] Tais sequências variantes da CDR de huCD3 reduziram a afinidade de ligação comparadas com as sequências da CDR do tipo selvagem de huCD3. As seis sequências de CDR podem ser inseridas em qualquer uma das sequências de armação da VH e VL de huCD3 VH1, VH2, VH3 e VH4, e VL1, VL2 e VL3, respectivamente, substituindo as sequências de CDR de huCD3. Em uma modalidade, as seis sequências de CDR são inseridas nas sequências de armação VH1 e VL1 de huCD3. Em uma outra modalidade, as seis sequências de CDR foram inseridas nas sequências de armação VH1 e VL1 de huCD3, em que o aminoácido T na posição 41 de VL1 (SEQ ID NO: 10) foi mutado para K.

[00373] Em uma outra modalidade, o braço de ligação de CD3 compreende as seis sequências de CDR selecionadas da Tabela 2, em que XII da SEQ ID NO: 72 é selecionado de L, P, Q, D, K, W, S, G, A, C e R; X2 da SEQ ID NO: 73 é selecionado de S, N, G, A, K, V, R, H, Q, P, I, F, M, Y, L, W, D, E e C; X3 da SEQ ID NO: 74 é selecionado de M, W, G, Q, V, T, S, L, P, I, A, K, R e C; X4 da SEQ ID NO: 75 é selecionado de W, L, A, I, M, D, T, K, R, G, F, E, V, C e P; X5 da SEQ ID NO: 76 é selecionado de C, E, P e T: X6 da SEQ ID NO: 77 é selecionado de A, S, V, N, K, L, T, I, P, Q, C, G, Y, W, F, e R; X7 da SEQ ID NO: 78 é selecionado de P, C, S, e T; X8 da SEQ ID NO: 79 é selecionado de A, T, G, L, N, C, P, F, Q, H, R, K, E, W, e Y; X9 da SEQ ID NO: 80 é selecionado de P, L, T, C, A, I, L, Q, V, E, M, K, R, G e P; X10 da SEQ ID NO: 81 é selecionado de E, H, I, M, N, Y, P, Q, D, K e L; XIII da SEQ ID NO: 82 é selecionado de F, Y, I, T, V, M, A, S, N, G, W, E, K, P, R e D; e X12 da SEQ ID NO: 83 é selecionado de G, Y, V, N, T, S, H, E, P, W, F e M.

[00374] Tais sequências variante de CDR de HuCD3 reduziram a afinidade de ligação comparadas com as sequências de CDR do tipo selvagem de huCD3. As seis sequências de CDR podem ser inseridas em qualquer uma das sequências de armação da VH e VL de huCD3 VH1, VH2, VH3 e VH4, e VL1, VL2 e VL3, respectivamente, substituindo as sequências de CDR de huCD3. Em uma modalidade, as seis sequências de CDR são inseridas nas sequências de armação VH1 e VL1 de huCD3. Em uma outra modalidade, as seis sequências de CDR foram inseridas nas sequências de armação VH1 e VL1 de huCD3, em que o aminoácido T na posição 41 de VL1 (SEQ ID NO: 10) foi mutado para K.

[00375] Já em uma outra modalidade, o braço de ligação de CD3 compreende as seis sequências de CDR selecionadas das sequências de CDR apresentadas na Tabela 3 abaixo, em que X2 da SEQ ID NO: 73 é selecionado de M e P; X3 da SEQ ID NO: 74 é A; X4da SEQ ID NO: 75 é E; X6 da SEQ ID NO: 77 é selecionado de F, G, I, K, L, e N; X7 da SEQ ID NO: 78 é P; X8 da SEQ ID NO: 79 é selecionado de UM e G; e X9 da SEQ ID NO: 80 é selecionado de M, R e V.

[00376] Tais sequências variantes da CDR de HuCD3 reduziu a afinidade de ligação comparada com as sequências de CDR do tipo selvagem de huCD3. As seis sequências de CDR podem ser inseridas em qualquer uma das sequências de armação da VH e VL de huCD3 VH1, VH2, VH3 e VH4, e VL1, VL2 e VL3, respectivamente, substituindo as sequências de CDR de huCD3. Em uma modalidade, as seis sequências de CDR são inseridas nas sequências de armação VH1 e VL1 de huCD3. Em uma outra modalidade, as seis sequências de CDR foram inseridas nas sequências de armação de VH1 e VL1 de huCD3, em que o aminoácido T na posição 41 de VL1 (SEQ ID NO: 10) foi mutado para K.

[00377] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o primeiro braço de ligação é derivado de um anticorpo de CD3 tendo um valor de afinidade de ligação (KD) para a CD3 humana épsilon mais alta do que 3,4 x 10-8 M como determinado pela Bio-Layer Interferometry, tal como de 3,5 x 10-8 M a 9,9 x 10-8 M, ou de 1,0 x 10-7 M a 9,9 x 10-7 M como determinado pela Bio-Layer Interferometry.

[00378] Em uma outra modalidade da invenção, um ou ambos dos anticorpos formando parte do anticorpo biespecífico foram engenheirados para reduzir ou aumentar a ligação ao receptor de Fc neonatal (FcRn) de modo a manipular a meia-vida sérica do anticorpo biespecífico. Técnicas para aumentar ou reduzir a meia-vida sérica são bem conhecidos na técnica. Ver por exemplo Dall’Acqua et al. 2006, J. Biol. Chem., 281: 23514-24; Hinton et al. 2006, J. Immunol., 176: 346-56; e Zalevsky et al. 2010 Nat. Biotechnol., 28: 157-9.

[00379] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira cadeia pesada constante (HC) e uma primeira cadeia leve constante (LC), em que as posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 na cadeia pesada da IgG1 humana da SEQ ID NO: 15 tanto da primeira cadeia pesada quanto da segunda cadeia pesada são F, E, e A, respectivamente.

[00380] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira e segunda cadeia pesada constante (HC) e uma primeira e segunda cadeia leve constante (LC), em que as posições correspondendo às posições L234 e L235 na cadeia pesada da IgG1 humana da SEQ ID NO: 15 tanto da primeira cadeia pesada quanto a segunda cadeia pesada são F e E, respectivamente.

[00381] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas o primeiro braço de ligação é um braço Fab derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAR, e o segundo braço de ligação é um braço Fab derivado de IgG1-7D8-FEAL.

[00382] Aqui, huCD3-H1L1 se refere ao anticorpo anti-CD3 SP34 humanizado tendo VH1 e VL1 que são apresentadas na Tabela 1 como SEQ ID Nos: 6 e 10. FEAL se refere às mutações L234F, L235E e D265A e F405L na região constante do anticorpo ao passo que FEAR se refere às mutações L234F, L235E e D265A e K409R na região constante do anticorpo em que as posições de aminoácido corresponde às posições de aminoácido da IgG1 humana. “IgG1” se refere a que as regiões constantes de anticorpo são derivadas da IgG1 humana fora das mutações especificadas. 7D8 se refere ao anticorpo anti-CD20 tendo as sequências VH e VL apresentadas na Tabela 1 como SEQ ID Nos: 27 e 28.

[00383] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas o primeiro braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAR, e o segundo braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula derivado de IgG1- 7D8-FEAL.

[00384] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas o primeiro braço de ligação é um braço Fab derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL, e o segundo braço de ligação é um braço Fab derivado de IgG1-7D8-FEAR.

[00385] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas o primeiro braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula (isto é, compreendendo uma cadeia pesada e uma leve) derivada de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL, e o segundo braço de ligação é um anticorpo de meia-molécula (braço Fab e braço Fc) derivado de IgG1-7D8-FEAR.

[00386] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas compreende uma primeira e segunda cadeia pesada constante (HC) e uma primeira e segunda cadeia leve constante (LC), em que as posições correspondendo às posições L234, L235, e D265 na cadeia pesada da IgG1 humana da SEQ ID NO: 15 tanto da primeira cadeia pesada constante quanto da segunda cadeia pesada constante são F, E, e A, respectivamente, e em que a posição correspondendo a F405 na cadeia pesada da IgG1 humana da SEQ ID NO: 15 da primeira cadeia pesada constante é L, e a posição correspondendo a K409 na cadeia pesada da IgG1 humana da SEQ ID NO: 15 da segunda cadeia pesada constante é R, e em que (i) as posições correspondendo às posições F10, T41, K55, e L97 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia leve constante são L, K, N, e H, respectivamente, ou (ii) a posição correspondendo à posição T41 na cadeia leve lambda da SEQ ID NO: 10 da primeira cadeia constante leve é K. Outras modalidades dos anticorpos biespecíficos

[00387] O anticorpo biespecífico da invenção pode ser de qualquer isótipo. A escolha de isótipo tipicamente será guiada pelas funções atuadoras desejadas, tais como indução de ADCC. Os isótipos exemplares são IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada uma das regiões constantes de cadeia leve ser humanas, capa ou lambda, pode ser usada. A função atuadora dos anticorpos da presente invenção pode ser mudada pela comutação de isótipo, por exemplo, para um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM para vários usos terapêuticos. Em uma modalidade, ambas as regiões Fc de um anticorpo da presente invenção são do isótipo IgG1, por exemplo um IgG1,K. Em uma modalidade, as duas regiões Fc de um anticorpo biespecífico são dos isótipos IgG1 e IgG4, respectivamente. Opcionalmente, a região Fc pode ser modificada na dobradiça e/ou região CH3 como aqui descrito em outro lugar.

[00388] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da invenção é um anticorpo de tamanho natural, preferivelmente um anticorpo IgG1, em particular um anticorpo IgG1,K ou uma variante dos mesmos. Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico da invenção compreende um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única. Fragmentos de anticorpo por exemplo podem ser obtidos pela fragmentação usando técnicas convencionais, e os fragmentos triados quanto à utilidade da mesma maneira como aqui descrito para os anticorpos inteiros. Por exemplo, fragmentos F(ab’)2 podem ser gerados tratando-se um anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab’)2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes de dissulfeto com um agente redutor, tal como ditiotreitol, para produzir fragmentos Fab’. Os fragmentos Fab podem ser obtidos tratando-se um anticorpo com papaína. Um fragmento F(ab’)2 também pode ser produzido pela ligação de fragmentos Fab’ via uma ligação de tioéter ou uma ligação de dissulfeto. Fragmentos de anticorpo também podem ser gerados pela expressão de ácidos nucleicos codificando tais fragmentos nas células recombinantes (ver por exemplo Evans et al., J. Immunol. Met. 184, 123-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico codificando uma porção de um fragmento F(ab’)2 incluiria sequências de DNA codificando o domínio CH1 e a região de dobradiça da cadeia H, seguido por um códon de parada traducional para produzir um tal fragmento truncado de molécula de anticorpo.

[00389] Os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 da invenção também podem ser preparados a partir de anticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única são peptídeos em que as regiões Fv de cadeia pesada e leve são conectadas. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da presente invenção compreende um Fv de cadeia única (scFv) em que as cadeias pesadas e leves no Fv de um anticorpo de CD20 da presente invenção são unidas com um ligador peptídico flexível (tipicamente de cerca de 10, 12, 15 ou mais resíduos de aminoácido) em uma única cadeia de peptídeo. Os métodos de produzir tais anticorpos são descritos por exemplo na US 4.946.778, Pluckthun em ‘The Pharmacology of Monoclonals Antibodies’, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85 5879-5883 (1988) e McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Um anticorpo biespecífico pode ser depois formado a partir de duas VH e VL de um anticorpo de CD20 de cadeia única e um anticorpo de CD3 de cadeia única, ou um anticorpo polivalente formado de mais do que duas cadeias VH e VL.

[00390] Em uma modalidade, uma ou ambas as regiões Fc dos anticorpos monoclonais de CD3 e CD20 para produzir um anticorpo biespecífico da invenção são deficientes da função atuadora.

Conjugados

[00391] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo biespecífico CD3xCD20 ligado ou conjugado a uma ou mais porções terapêuticas, tais como uma citocina, um imunossupressor, uma molécula imunoestimulatória e/ou um radioisótopo. Tais conjugados são aqui aludidos como “imunoconjugados” ou “conjugados de droga”. Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citocinas são aludidas como “imunotoxinas”.

[00392] Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda região Fc é conjugada a uma droga ou uma prodroga ou contém um grupo aceitador para as mesmas. Tal grupo aceitador por exemplo pode ser um aminoácido não natural.

Composições

[00393] Em um outro aspecto, a invenção se refere a uma composição compreendendo um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas.

[00394] Em um outro aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo: - um anticorpo biespecífico CD3xCD20 como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, e - um carregador farmaceuticamente aceitável.

[00395] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um anticorpo biespecífico da presente invenção ou uma combinação de anticorpos biespecíficos diferente da presente invenção.

[00396] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode por exemplo incluir diluentes, enchedores, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween-80), estabilizantes (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteína), preservantes, fixativos de tecido, solubilizantes, e/ou outros materiais adequados para a inclusão em uma composição farmacêutica.

[00397] Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes retardantes de absorção, adequados e similares que sejam fisiologicamente compatíveis com um anticorpo biespecífico da presente invenção. Os exemplos de carregadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, soluções coloidais de carboximetil celulose, goma de tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila, e/ou vários tampões. Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00398] Os anticorpos biespecíficos farmacêuticos da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes queladores de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

[00399] Os anticorpos biespecíficos farmacêuticos da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.

[00400] Os anticorpos biespecíficos farmacêuticos da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via escolhida de administração tais como preservantes, agentes de umectação, agentes emulsificantes, agentes de dispersão, preservantes ou tampões, que podem realçar a vida de prateleira ou eficácia da composição farmacêutica. Os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser preparados com carregadores que protegerão o anticorpo biespecífico contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Tais carregadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biodegradáveis, biocompatíveis tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico sozinhos ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00401] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes por exemplo como enumerados acima, como requerido, seguido pela microfiltração de esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos por exemplo daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00402] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para se obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizadas, ou da amida das mesmas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular que é utilizado, the duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares utilizadas, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[00403] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e modo adequados. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada parenteralmente. “Administrada parenteralmente” como aqui usado significa modos de administração outros que não a administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e incluem injeção e infusão epidérmicas, intravenosas, intramusculares, intraarteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intraperitoneais, intratendinosas, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intraarticulares, subcapsulares, subaracnoides, intraespinhais, intracranianas, intratoráxicas, epidurais e intrasternais.

[00404] Em uma modalidade que a composição farmacêutica é administrada pela injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.

Usos

[00405] Em um aspecto, a invenção se refere ao anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, a composição como aqui descrita, ou a composição farmacêutica como aqui descrita para o uso como um medicamento.

[00406] Em um aspecto, a invenção se refere ao anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, a composição como aqui descrita, ou a composição farmacêutica como aqui descrita para o uso no tratamento de uma doença.

[00407] Em um aspecto, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença compreendendo administrar o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, a composição como aqui descrita, ou a composição farmacêutica como aqui descrita a um sujeito em necessidade das mesmas.

[00408] Em uma modalidade, a doença é malignidade de célula B madura.

[00409] Em uma modalidade, a doença é câncer, tal como NHL ou leucemia de célula B.

[00410] Os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser usados para vários propósitos. Em particular, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser usados para o tratamento de várias formas de câncer, incluindo câncer metastático e câncer refratário.

[00411] Em particular, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser úteis nos cenários terapêuticos em que o direcionamento específico e a morte mediada por célula T de células que expressam CD20 são desejados, e eles podem ser mais eficientes comparados a um anticorpo de CD20 regular em certas tais indicações e cenários.

[00412] Os anticorpos biespecíficos da invenção também têm utilidade adicional em terapia e o diagnóstico de uma variedade de doenças relacionadas com CD20. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem ser usados para evocar in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: inibir o crescimento de e/ou diferenciação de uma célula expressando CD20; matar uma célula expressando CD20; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula expressando CD20 na presença de células atuadoras humanas; mediar CDC de uma célula expressando CD20 na presença de complemento; mediar a apoptose de uma célula expressando CD20; e/ou induzir a translocação em jangadas lipídicas na ligação de CD20.

[00413] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser usados para efetuar as respostas imunes mediadas por célula T, inflamação e remodelagem de microambiente.

[00414] Em uma modalidade particular, os anticorpos biespecíficos são usados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com CD20. Os exemplos de doenças relacionadas com CD20 incluem, entre outras, linfoma de célula B, por exemplo, linfoma de não Hodgkin (NHL), leucemia de célula B e doenças imunes, por exemplo, doenças autoimunes, tais como aquelas listadas abaixo.

[00415] Em uma modalidade os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são usados para o tratamento de NHL ou leucemia de célula B.

[00416] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são usados para o tratamento de NHL ou leucemia de célula B resistentes ao anticorpo de CD20, tal como NHL resistente a rituximab ou ofatumumab ou leucemia de célula B, por exemplo linfoma de célula B não agressivo resistente a rituximab.

[00417] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são usados para o tratamento de leucemia linfoblástica aguda (ALL), tal como ALL recidiva ou refratária.

[00418] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são usados para o tratamento de CLL, tal como CLL recidiva ou refratária.

[00419] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são usados para o tratamento de FL, tal como ou FL recidiva ou refratária.

[00420] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são usados para o tratamento de Granulomatose Linfomatoide de Grau Adulto III; NK Extranodal Tipo Nasal do Adulto/Linfoma de célula T; Linfoma de Célula Grande Anaplástico; Linfoma de Célula T Angioimmunoblástico; Linfoma de Burkitt do Adulto de Estágio II Contíguo; Linfoma de Célula Grande Difuso do adulto de Estágio II Contíguo; Linfoma de Célula Mista Difusa do Adulto de Estágio II Contíguo; Linfoma de Célula Pequena Clivada Difusa do Adulto de Estágio II Contíguo; Linfoma de Célula Grande Imunoblástico do Adulto de Estágio II Contíguo; Linfoma Linfoblástico do Adulto de Estágio II Contíguo; Linfoma Folicular de Grau I Estágio II Contíguo; Linfoma Folicular de Grau I Estágio II Contíguo Linfoma Folicular de Grau 2 Estágio II Contíguo; Linfoma Folicular de Grau 3 Estágio II Contíguo; Linfoma da Célula do Manto de Estágio II Contíguo; Linfoma de Zona Marginal de Estágio II Contíguo; Linfoma Linfocítico Pequeno de Estágio II Contíguo; Linfoma de Não Hodgkin de célula B Cutâneo; Infecção pelo Vírus Epstein-Barr; Linfoma de célula B da Zona Marginal Extranodal de Tecido Linfoide Associado com a Mucosa; Linfoma de Célula T Hepatosplênico; Linfoma Intraocular; Linfoma de célula B da Zona Marginal Nodal; Linfoma de Burkitt do Adulto de Estágio II Não Contíguo; Linfoma de Célula Grande Difuso do Adulto de Estágio II; Linfoma de Célula Mista Difuso do Adulto de Estágio II Não Contínuo; Linfoma de Célula Pequena Clivada Difuso do Adulto de Estágio II Não Contínuo; Linfoma Imunoblástico de Célula Grande do Adulto de Estágio II Não Contínuo; Linfoma Linfoblástico do Adulto de Estágio II Não Contínuo; Linfoma Folicular de Estágio II Grau 1 Não Contínuo; Linfoma Folicular de Estágio II Grau 2 Não Contínuo; Linfoma Folicular de Estágio II Grau 3 Não Contínuo; Linfoma da Célula do Manto de Estágio II Não Contínuo; Linfoma de Zona Marginal de Estágio II Não Contínuo; Linfoma Linfocítico Pequeno de Estágio II Não Contínuo; Linfoma Extranodal Não Cutâneo; Linfoma de Célula T Periférico; Distúrbio Linfoproliferativo Pós-transplante; Leucemia de Célula Pilosa Progressiva, Tratamento Inicial; Linfoma de Burkitt do Adulto Recorrente; Linfoma de Célula Mista Difusa do Adulto Recorrente; Linfoma de Célula Pequena Clivada Difusa do Adulto Recorrente; Granulomatose Linfomatoide Grau III do Adulto Recorrente; Linfoma de Hodgkin do Adulto Recorrente; Linfoma de Célula Grande Imunoblástico do Adulto Recorrente; Linfoma Linfoblástico do Adulto Recorrente; Leucemia/Linfoma de Célula T do Adulto Recorrente; Linfoma de Não Hodgkin de Célula T Cutâneo Recorrente; Linfoma Folicular Grau 1 Recorrente; Linfoma Folicular Grau 2 Recorrente; Linfoma Folicular Grau 3 Recorrente; Linfoma da Célula do Manto Recorrente; Linfoma da Zona Marginal Recorrente; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary Recorrentes; Linfoma Linfocítico Pequeno Recorrente; Leucemia de Célula Pilosa Refratária; Linfoma do Intestino Delgado; Linfoma de Zona Marginal Esplênica; Linfoma de Burkitt de Estágio I do Adulto; Linfoma de Célula Grande Difuso de Estágio I do Adulto; Linfoma de Célula Mista Difuso de Estágio I do Adulto; Linfoma de Célula Clivada Pequena Difuso de Estágio I do Adulto; Linfoma de Hodgkin de Estágio I do Adulto; Linfoma de Célula Grande Imunoblástico de Estágio I do Adulto; Linfoma Linfoblástico de Estágio I do Adulto; Leucemia/Linfoma de Célula T de Estágio I do Adulto; Linfoma de Não Hodgkin do Estágio I Cutâneo de Célula T; Linfoma Folicular de Estágio I Grau 1; Linfoma Folicular de Estágio I Grau 2; Linfoma Folicular de Estágio I Grau 3; Linfoma da Célula do Manto de Estágio I; Linfoma da Zona Marginal de Estágio I; Linfoma Linfocítico Pequeno de Estágio I; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IA; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IB; Linfoma de Hodgkin de Estágio II do Adulto; Leucemia/Linfoma de Célula T de Estágio II do Adulto; Linfoma de Não Hodgkin de Célula T Cutâneo de Estágio II; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IIA; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IIB; Linfoma de Burkitt de Estágio III do Adulto; Linfoma de Célula Grande Difuso de Estágio III do Adulto; Linfoma de Célula Mista Difusa de Estágio III do Adulto; Linfoma de Célula Clivada Pequena Difusa de Estágio III do Adulto; Linfoma de Hodgkin de Estágio III do Adulto; Linfoma de Célula Grande Imunoblástico de Estágio III do Adulto; Linfoma Linfoblástico de Estágio III do Adulto; Leucemia/Linfoma de Célula T de Estágio III do Adulto; Linfoma de Não Hodgkin de Célula T Cutâneo de Estágio III; Linfoma Folicular de Estágio III Grau 1; Linfoma Folicular de Estágio III Grau 2; Linfoma Folicular de Estágio III Grau 3; Linfoma da Célula do Manto de Estágio III; Linfoma da Zona Marginal de Estágio III; Linfoma Linfocítico Pequeno de Estágio III; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IIIA; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IIIB; Linfoma de Burkitt do Adulto de Estágio IV; Linfoma de Célula Grande Difusa do Adulto de Estágio IV; Linfoma de Célula Mista Difusa do Adulto de Estágio IV; Linfoma de Célula Pequena Clivada Difusa do Adulto de Estágio IV; Linfoma de Hodgkin do Adulto de Estágio IV; Linfoma de Célula Grande Imunoblástico do Adulto de Estágio IV; Linfoma Linfoblástico do Adulto de Estágio IV; Leucemia/Linfoma de Célula T do Adulto de Estágio IV; Linfoma de Não Hodgkin de Célula T Cutâneo de Estágio IV; Linfoma Folicular de Estágio IV Grau 1; Linfoma Folicular de Estágio IV Grau 2; Linfoma Folicular de Estágio IV Grau 3; Linfoma da Célula do Manto de Estágio IV; Linfoma da Zona Marginal de Estágio IV; Linfoma Linfocítico Pequeno de Estágio IV; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IVA; Micose Fungoide/Síndrome de Sezary de Estágio IVB; Leucemia Linfocítica Granular Grande de Célula T; Linfoma Testicular; Leucemia de Célula Pilosa Não Tratada; ou Macroglobulinemia de Waldenstrom.

[00421] Em uma modalidade particular, os anticorpos da invenção são usados para tratar ou para prevenir NHL, visto que os anticorpos esgotam as células de tumor de tumor que carregam CD20.

[00422] NHL é o tipo A do linfoma de célula B. Os linfomas, por exemplo, linfomas de célula B, são um grupo de cânceres relacionados que surgem quando um linfócito (uma célula sanguínea) se torna maligno. A função normal de linfócitos é defender o corpo contra invasores: germes, vírus, fungos, até câncer. Existem muitos subtipos e estágios de maturação de linfócitos e, portanto, existem muitos tipos de linfomas. Igual às células normais, os linfócitos malignos podem se mover para muitas partes do corpo. Tipicamente, as células de linfoma formam tumores no sistema linfático: medula óssea, linfônodos, baço e sangue. Entretanto, estas células podem migrar para outros órgãos. Certos tipos de linfoma tenderão a crescer em locais em que a versão normal da célula reside. Por exemplo, é comum para os tumores de NHL foliculares se desenvolver nos linfônodos.

[00423] CD20 é usualmente expresso em níveis elevados nas células B neoplásticas (isto é, tumorigênicas) associadas com NHL. Consequentemente, os anticorpos de ligação de CD20 da invenção podem ser usados para esgotar as células de tumor que carregam CD20 que levam à NHL e, assim, podem ser usados para prevenir ou tratar esta doença.

[00424] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção também podem ser usados para bloquear ou inibir outros efeitos do CD20. Por exemplo, é conhecido que a CD20 é expressa nos linfócitos B e está envolvido na proliferação e/ou diferenciação destas células. Visto que os linfócitos B funcionam como imunomoduladores, CD20 é um alvo importante para a terapia mediada por anticorpo para alvejar os linfócitos B, por exemplo, para inativar ou matar os linfócitos B, envolvidos em distúrbios autoimunes. Tais distúrbios autoimunes incluem, por exemplo, as doenças listadas acima.

[00425] Similarmente, a invenção se refere a um método para matar uma célula de tumor expressando CD20, compreendendo a administração, a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo biespecífico da invenção.

[00426] A presente invenção também se refere a um método para inibir o crescimento e/ou proliferação de uma ou mais células de tumor expressando CD20, compreendendo a administração, a um indivíduo em necessidade do mesmo, de um anticorpo biespecífico da presente invenção.

[00427] A presente invenção também se refere a um método para tratar câncer, compreendendo a) selecionar um sujeito que sofre de um câncer compreendendo células de tumor expressando CD20, e b) administrar ao sujeito o anticorpo biespecífico da presente invenção ou uma composição farmacêutica da presente invenção.

[00428] Também, a invenção se refere ao uso de um anticorpo biespecífico que se liga à CD3 humana e CD20 humana para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, tal como uma das indicações de câncer específicas aqui mencionadas.

[00429] A invenção se refere ainda a um anticorpo biespecífico para o uso no tratamento de câncer, tal como uma das indicações de câncer mencionadas acima.

[00430] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de malignidades de célula B madura. Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de tumores expressando CD20. Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de linfoma de célula B. Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de linfoma de célula B tal como NHL. Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de leucemia linfoblástica de célula B precursora. Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de leucemia linfocítica crônica (CLL) de célula B.

[00431] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de Linfoma Linfocítico Pequeno (SLL).

[00432] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de leucemia prolinfocítica de célula B.

[00433] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de linfoma linfoplasmacítico.

[00434] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de linfoma de célula do manto (MCL).

[00435] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de linfoma folicular (FL), incluindo FL de baixo grau, grau intermediário e alto grau FL.

[00436] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de linfoma de Hodgkin de célula B.

[00437] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de distúrbios imunes em que as células B que expressam CD20 estão envolvidas.

[00438] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de psoríase.

[00439] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de esclerose.

[00440] Em uma modalidade o anticorpo biespecífico é para o uso no tratamento de doença intestinal inflamatória.

[00441] Para os usos mencionados acima é preferido que o anticorpo seja bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR, entretanto o mesmo pode ser qualquer um dos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 aqui descritos.

[00442] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção têm numerosas utilidades em diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo o diagnóstico e tratamento de distúrbios envolvendo células que expressam CD20. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados às células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como aqui usado, o termo “sujeito” é intencionado a incluir seres humanos e animais não humanos que respondem aos anticorpos biespecíficos contra CD3 e CD20. Os sujeitos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios que possam ser corrigidos ou melhorados pela inibição ou controle de células B (normais ou malignas).

[00443] Em um aspecto, a invenção se refere a uma composição de diagnóstico compreendendo um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas.

[00444] Em uma modalidade, a composição de diagnóstico é um diagnóstico complementar que é usado para triar e selecionar aqueles pacientes que beneficiar-se-ão do tratamento com o anticorpo biespecífico.

[00445] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser usados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células de tumor expressando CD20 incluindo, por exemplo, linfoma de célula B, por exemplo, NHL. Os exemplos de doenças tumorigênicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem linfoma de célula B, por exemplo, NHL, incluindo leucemia linfoblástica/linfoma de célula B precursora e neoplasmos de célula B madura, tais como leucemia linfocítica crônica de célula B (CLL)/Linfoma Linfocítico Pequeno (SLL), leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de célula do manto (MCL), linfoma folicular (FL), incluindo FL de baixo grau, grau intermediário e alto grau, linfoma de centro folicular cutâneo, linfoma de célula B de zona marginal (tipo MALT, tipo nodal e esplênico), leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, distúrbio linfoproliferativos pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, melanoma maligno e linfoma de célula grande anaplástico (ALCL).

[00446] Outros exemplos de linfomas de não Hodgkin de célula B são granulomatose linfomatoide, linfoma de efusão primária, linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de célula B mediastinal grande, doenças de cadeia pesada (incluindo doença y, μ e α), linfomas induzidos pela terapia com agentes imunossupressivo, tais como linfoma induzido por ciclosporina, e linfoma induzido por metotrexato.

[00447] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser usados para tratar linfoma de Hodgkin de célula B.

[00448] Os exemplos de distúrbios imunes em que as células B que expressam CD20 estão envolvidas que podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem distúrbios autoimunes, tais como psoríase, artrite psoriática, dermatite, escleroderma sistêmico e esclerose, doença intestinal inflamatória (IBD), doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da angústia respiratória, meningite, encefalite (incuindo síndrome da fadiga crônica/encefalite miálgica (CFS/ME) e síndrome da fadiga crônica/encefalite miálgica (CFS/ME), uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, ateroesclerose, deficiência da adesão leucocitária, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabete de início juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite de complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, trombocitopenias imunomediadas, tais como púrpura trombocitopênica idiopática aguda e púrpura trombocitopênica idiopática crônica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefrite de lúpus, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide (RA), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, HIV, e doenças associadas ao vírus do herpes. Outros exemplos são síndrome da angústia respiratória aguda severa e coriorretinite. Além disso, outras doenças e distúrbios incluem aqueles causados ou mediados pela infecção de Células B com vírus, tais como o vírus Epstein-Barr (EBV).

[00449] Outros exemplos de distúrbios inflamatórios, imunes e/ou autoimunes em que autoanticorpos e/ou atividade de linfócito B excessiva são proeminentes e que podem ser tratadas e/ou prevenidas, incluem os seguintes: vasculites e outros distúrbios de vaso, tais como poliangiíte microscópica, síndrome de Churg-Strauss, e outras vasculites associadas com ANCA, poliarterite nodosa, vasculite crioglobulinêmica essencial, angiíte leucocitoclástica cutânea, doença de Kawasaki, arterite de Takayasu, artrite de célula gigante, púrpura de Henoch-Schonlein, angiíte cerebral primária ou isolada, eritema nodoso, trombangiíte obliterativa, púrpura trombocitopênica trombótica (incluindo síndrome urêmica hemolítica), e vasculites secundárias, incluindo vasculite leucocitoclástica cutânea (por exemplo, secundária à hepatite B, hepatite C, macroglobulinemia de Waldenstrom, neoplasias de célula B, artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, ou lúpus eritematoso sistêmico); outros exemplos são eritema nodoso, vasculite alérgica, paniculite, doença de Weber-Christian, púrpura hiperglobulinêmica, e doença de Buerger; distúrbios de pele, tais como dermatite de contato, dermatose de IgA linear, vitiligo, pioderma gangrenoso, epidermólise bolhosa adquirida, pênfigo vulgar (incluindo penfigoide cicatricial e penfigoide bolhoso), alopecia areata (incluindo alopecia universal e alopecia total), dermatite herpetiforme, eritema multiforme, e urticária autoimune crônica (incluindo edema angioneurótico e vasculite urticarial); citopenias imunomediadas, tais como neutropenia autoimune, e aplasia de célula vermelha pura; distúrbios do tecido conectivo, tais como lúpus do CNS, lúpus eritematoso discoide, síndrome de CREST, doença do tecido conectivo misto, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo de inclusão, amiloidose secundária, crioglobulinemia tipo I e tipo II, fibromialgia, síndrome de anticorpo fosfolipídico, hemofilia secundária, policondrite recidiva, sarcoidose, síndrome do homem duro, e febre reumática; outros exemplos são fasciíte eosinofílica, miosite, e dermatomiosite juvenil; artrites, tais como espondilite anquilosante, artrite crônica juvenil, doença de Still do adulto, e síndrome de SAPHO; outros exemplos são sacroileíte, artrite reativa, doença de Still, e gota; distúrbios hematológicos, tais como anemia aplástica, anemia hemolítica primária (incluindo síndrome da aglutinina fria), anemia hemolítica secundária à CLL ou lúpus eritematoso sistêmico; síndrome de POEMS, anemia perniciosa, e púrpura hiperglobulinêmica de Waldenstrom; outros exemplos são agranulocitose, neutropenia autoimune, doença de Franklin, doença de Seligmann, doença da cadeia μ, síndrome paraneoplástica secundária ao timoma e linfomas, e formação de inibidor do fator VIII; endocrinopatias, tais como poliendocrinopatia, e doença de Addison; outros exemplos são hipoglicemia autoimune, hipotireoidismo autoimune, síndrome da insulina autoimune, de tireoidite de Quervain, e resistência à insulina mediada pelo anticorpo receptor de insulina; distúrbios hepatogastrointestinais, tais como doença celíaca, doença de Whipple, cirrose biliar primária, hepatite ativa crônica, e colangiíte esclerosante primária; um outro exemplo é gastrite autoimune; nefropatias, tais como glomerulonefrite progressiva rápida, nefrite pós-estreptocócica, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite membranosa, e nefrite crioglobulinêmica; um outro exemplo é doença da mudança mínima; distúrbios neurológicos, tais como neuropatias autoimunes, mononeurite multiplex, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, coréia de Sydenham, tabes dorsalis, e síndrome de Guillain-Barré; outros exemplos são mielopatia/paraparesia espástica tropical, miastenia grave, polineuropatia desmielinante inflamatória aguda, e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica; distúrbios cardíaco e pulmonar, tal como alveolite fibrosante alveolite, bronquiolite obliterativa, aspergilose alérgica, fibrose cística, síndrome de Loffler, miocardite, e pericardite; outros exemplos são pneumonite de hipersensibilidade, e síndrome paraneoplástica secundária ao câncer pulmonar; distúrbios alérgicos, tais como asma brônquica e síndrome de hiper-IgE; um outro exemplo é amaurose fugaz; distúrbios oftalmológicos, tais como coriorretinite idiopática; doenças infecciosas, tais como infecção por parvovírus B (incluindo síndrome de hands-and-socks); e distúrbios ginecológicos-obstréticos, tais como aborto recorrente, perda fetal recorrente, e retardo do crescimento intrauterino; um outro exemplo é a síndrome paraneoplástica secundária aos neoplasmos ginecológicos; distúrbios reprodutivos masculinos, tais como síndrome paraneoplástica secundária aos neoplasmos testiculares; e distúrbios derivados de transplante, tais como rejeição a aloenxerto e xenoenxerto, e doença do enxerto-versus-hospedeiro (incluindo a doença do enxerto-versus-hospedeiro crônica).

[00450] Em uma modalidade, a doença é um distúrbio inflamatório, imune e/ou autoimune selecionado de colite ulcerativa, doença de Crohn, diabete de início juvenil, esclerose múltipla, trombocitopenias imuno-mediadas, tais como púrpura trombocitopênica idiopática aguda e púrpura trombocitopênica idiopática crônica, anemia hemolítica (incluindo anemia hemolítica autoimune), miastenia grave, esclerose sistêmica, e pênfigo vulgar.

[00451] Em uma outra modalidade dos métodos de tratamento da presente invenção, a eficácia do tratamento está sendo monitorada durante a terapia, por exemplo em pontos predefinidos no tempo, determinando-se a carga tumoral ou níveis de produção de CD20 nas células de tumor relevantes.

[00452] Os regimes de dosagem nos métodos acima de tratamento e usos são ajustados para fornecer a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. As composições parenterais podem ser formuladas na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.

[00453] As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para os anticorpos biespecíficos dependem da doença ou condição a ser tratada e podem ser determinadas pelas pessoas habilitadas na técnica. Uma faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção é de cerca de 0,001 a 10 mg/kg, tal como de cerca de 0,001 a 5 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,001 a 2 mg/kg, tal como de cerca de 0,001 a 1 mg/kg, por exemplo cerca de 0,001, cerca de 0,01, cerca de 0,1, cerca de 1 ou cerca de 10 mg/kg. Uma outra faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico da presente invenção é de cerca de 0,1 a 100 mg/kg, tal como de cerca de 0,1 a 50 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,1 a 20 mg/kg, tal como de cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo cerca de 0,5, cerca de tal como 0,3, cerca de 1, cerca de 3, cerca de 5, ou cerca de 8 mg/kg.

[00454] Um médico ou veterinário tendo habilidade comum na técnica pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário começariam com doses do anticorpo biespecífico utilizado na composição farmacêutica em níveis mais baixos do que requerido de modo a obter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentando a dosagem até que o efeito desejado fosse obtido. No geral, uma dose diária adequada de um anticorpo biespecífico da presente invenção será aquela quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. A administração por exemplo pode ser parenteral, tal como intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados pela infusão em uma dosagem semanal calculada por mg/m2. Tais dosagens podem, por exemplo, estar fundamentadas nas dosagens de mg/kg fornecidas acima de acordo com o seguinte: dose (mg/kg) x 70:1,8. Tal administração pode ser repetida, por exemplo, 1 a 8 vezes, tal como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados pela infusão contínua lenta em um período longo, tal como mais do que 24 horas, de modo a reduzir os efeitos colaterais tóxicos.

[00455] Em uma modalidade os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em uma dosagem semanal calculada como uma dose fixa por até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes quando dadas uma vez por semana. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, depois de 6 meses ou 12 meses. Tais dosagens fixas, por exemplo, podem estar fundamentadas nas dosagens em mg/kg fornecidas acima, com um peso corporal estimado de 70 kg. A dosagem pode ser determinada ou ajustada medindo-se a quantidade de anticorpo biespecífico da presente invenção no sangue na administração por exemplo tomando-se uma amostra biológica e usando anticorpos anti-idiotípicos que alvejam o antígeno CD20 da região de ligação a antígeno dos anticorpos biespecíficos da presente invenção.

[00456] Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados como terapia de manutenção, tal como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.

[00457] Um anticorpo biespecífico também pode ser administrado profilaticamente de modo a reduzir o risco de desenvolver câncer, retardar o início da ocorrência de um evento na progressão de câncer, e/ou reduzir o risco de recaída quando um câncer está em remissão.

[00458] Os anticorpos biespecíficos da invenção também podem ser administrados na terapia de combinação, isto é, combinados com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Consequentemente, em uma modalidade, o medicamento contendo anticorpo biespecífico é para a combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, tais como um agente citotóxico, quimioterapêutico ou anti- angiogênico.

[00459] Tal administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para a administração simultânea os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições separadas, como apropriado. A presente invenção também fornece assim métodos para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam CD20 como descrito acima, métodos estes que compreendem a administração de um anticorpo biespecífico da presente invenção combinado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descrito abaixo.

[00460] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam CD20 em um sujeito, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico da presente invenção, e opcionalmente pelo menos um agente terapêutico adicional, ou uma ligação de anticorpo a um epítopo CD20 diferente do que o dito anticorpo, a um sujeito em necessidade do mesmo.

[00461] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico da presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional a um sujeito em necessidade do mesmo.

[00462] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor da tirosina cinase (TKI), tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571), ibrutinib (PCI-32765, Imbruvica) ou lapatinib (PTK787/ZK222584).

[00463] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor de tirosina cinase de Bruton (BTK), tal como ibrutinib.

[00464] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor de proteassoma (PI), tal como carfilzomib.

[00465] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um agente imunomodulador (IMID), tal como pomalidomida, talidomida ou lenalidomida.

[00466] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor da fosfoinositida 3-cinase, tal como idelalisib ou duvelisib.

[00467] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor da aurora A cinase, tal como alisertib.

[00468] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um dos inibidores do linfoma de célula B-2 (Bcl-2), tais como venetoclax.

[00469] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado dos inibidores da histona desacetilase (HDAC), tais como panobinostat.

[00470] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas na terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Em uma modalidade, tais agente terapêuticos incluem um ou mais produtos quimioterapêuticos, da classe de agentes alquilantes, antimetabólitos, inibidores mitóticos, antibióticos antitumor, inibidores da topoisomerase ou análogos da platina. Os exemplos de tais agentes quimioterapêuticos são doxorrubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), bleomicina (Blenoxane), carmustina (Gliadel), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar), bendamustina, e clorambucila (Leukeran).

[00471] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser administrados em combinação com clorambucila; CHOP (ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovin, prednisona ou prednisolona); ciclofosfamida e prednisolona; ciclofosfamida, vincristina, e prednisona; ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina, e prednisona; fludarabina e um agente alquilante; EPOCH ajustado na dose (etoposida, prednisolona, vincristina, ciclofosfamida e doxorrubicina); GemOx (gencitabina e oxaliplatina); GDP (gencitabina, dexametasona e cisplatina) ou em combinação com outros regimes multidrogas comuns para NHL, tais como descritos, por exemplo, em Non-Hodgkin’s Lymphomas: Making sense of Diagnosis, Treatment, and Options, Lorraine Johnston, 1999, O’Reilly and Associates, Inc.

[00472] Em uma modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um antimetabólito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gencitabina ou cladribina.

[00473] Em uma outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um agente alquilante, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados da platina, tal como carboplatina.

[00474] Em uma outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um agente antimitótico, tal como taxanos, por exemplo docetaxel, e paclitaxel, e alcaloides vinca, por exemplo vindesina, vincristina, vinblastina e vinorrelbina.

[00475] Em uma outra modalidade, um tal agente terapêutico adicional pode ser selecionado de um inibidor da topoisomerase, tal como topotecano ou irinotecano, ou uma droga citostática, tal como etoposida e teniposida.

[00476] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam CD20 em um sujeito, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico da presente invenção e pelo menos um inibidor da angiogênese, neovascularização, e/ou outro vascularização a um sujeito em necessidade do mesmo

[00477] Os exemplos de tais inibidores da angiogênese são inibidores da urocinase, inibidores da metaloprotease de matriz (tal como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares), inibidores da migração e proliferação de célula endotelial (tal como TNP-470, esqualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistas de fatores de crescimento angiogênicos (tais como os anticorpos ZD6474, SU6668, contra agentes angiogênicos e/ou seus receptores (tais como VEGF (por exemplo bevacizumab), bFGF, e angiopoietina-1), talidomida, análogos de talidomida (tais como CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogênica (tal como angiozima), interferon α (tal como interferon α2a), suramina e agentes similares), inibidores da VEGF-R cinase e outros inibidores da tirosina cinase antiangiogênica (tal como SU011248), inibidores da integrina endotelial-específica/sinalização de sobrevivência (tal como vitaxina e agentes similares), antagonistas/queladores de cobre (tais como tetratiomolibdato, captopril e agentes similares), carboxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E assim como moléculas de nucleotídeo que inibem a angiogênese (tal como VEGF- cDNA antissentido, cDNA que codifica angiostatina, cDNA que codifica p53 e cDNA que codifica receptor 2 de VEGF deficiente).

[00478] Outros exemplos de tais inibidores de angiogênese, neovascularização, e/ou outra vascularização são derivados antiangiogênicos da heparina (por exemplo, heperinase III), temozolomida, NK4, fator inibidor da migração de macrófago, inibidores da ciclooxigenase 2, inibidores do fator 1 indutível por hipoxia, isoflavonas antiangiogênicas da soja, oltipraz, fumagilina e análogos dos mesmos, análogos de somatostatina, polissulfato de pentosana, tecogalan sódico, dalteparina, tunstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticorpos contra outros alvos, tais como anti-integrina alfa-v/beta-3 e anticorpos anti-quininostatina.

[00479] Em uma modalidade, um agente terapêutico para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um imunógeno anticâncer, tal como um antígeno de câncer/antígeno associado a tumor (por exemplo, molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM/TACSTD1), mucina 1 (MUC1), antígeno carcinoembrionário (CEA), glicoproteína 72 associada a tumor (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas virais associadas a câncer (por exemplo, vacinas do vírus do papiloma humano) ou proteínas de choque térmico derivadas de tumor.

[00480] Em uma modalidade, um agente terapêutico para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser uma citocina anticâncer, quimiocina, ou combinação das mesmas. Os exemplos de citocinas e fatores de crescimento adequados incluem IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (por exemplo, INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, ligante Flt3, fator de célula tronco, ancestim e TNFα. As quimiocinas adequadas podem incluir quimiocinas negativas em Glu-Leu-Arg (ELR) tais como IP-10, MCP-3, MIG, e SDF-1α das famílias de quimiocina CXC e C-C humanas. As citocinas adequadas incluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina, e proteínas de fusão de citocina.

[00481] Em uma modalidade, um agente terapêutico para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um regulador do controle do ciclo celular/apoptose (ou “agente regulador”). Um regulador do controle do ciclo celular/apoptose pode incluir moléculas que alvejam e modulam os reguladores do controle do ciclo celular/apoptose tais como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) cinases dependentes de ciclina que superestimulam o ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroxistaurosporina (UCN-01, KW-2401), e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), e (iii) moduladores da telomerase (tais como BIBR1532, SOT-095, GRN163 e composições descritas por exemplo na US 6.440.735 e US 6.713.055). Os exemplos não limitantes de moléculas que interferem com os caminhos apoptóticos incluem ligante indutor da apoptose relacionado com TNF (TRAIL)/ligante da apoptose 2 (Apo-2L), anticorpos que ativam receptores TRAIL, interferon—Y (IFN-Y) e Bcl-2 de antissentido.

[00482] Em uma modalidade, um agente terapêutico para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um agente regulador hormonal, tal como agentes úteis para a terapia antiandrogênica e antiestrogênica. Os exemplos de tais reguladores de agente hormonal são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilstilbestrol, etinil estradiol/estinila, um antiandrogênio (tal como flutaminda/eulexin), uma progestina (tal como caproato de hidróxi-progesterona, medróxi-progesterona/provera, acetato de megestrol/megace), um adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormônio liberador do hormônio luteinizante (e análogos dos mesmos e outros agonistas de LHRH tais como buserelina e goserelina), um inibidor da aromatase (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/ citraden, exemestano) ou um inibidor de hormônio (tal como octreotide/- sandostatina).

[00483] Em uma modalidade, um agente terapêutico para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um inibidor do ponto de checagem imune, tal como moléculas que bloqueiam a atividade de CTLA-4, por exemplo ipilimumab, PD-1, por exemplo pembrolizumab, PD-L1, TIM3, TIGIT, BTLA, VISTA ou LAG-3.

[00484] Em uma modalidade, um agente terapêutico para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico anticâncer ou uma molécula de RNA inibidor anticâncer.

[00485] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são agentes indutores da diferenciação, análogos do ácido retinoico (tais como ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 13-cis e agentes similares), análogos da vitamina D (tais como seocalcitol e agentes similares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor da insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, RON (tal como um anticorpo anti-RON), Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentes similares.

[00486] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são estramustina e epirrubicina.

[00487] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para tratar os distúrbios como descritos acima são uma 17-alil amino geld-anamicina semelhante ao inibidor de HSP90, anticorpos direcionados contra um antígeno de tumor tal como PSA, CA125, KSA, integrinas, por exemplo integrina β1, ou inibidores de VCAM.

[00488] Os exemplos de outros agentes anticâncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para o uso em combinação com um anticorpo biespecífico para tratar os distúrbios como descritos acima são inibidores da calcineurina (tais como valspodar, PSC 833 e outros inibidores de MDR-1 ou p-glicoproteína), inibidores de TOR (tais como sirolimus, everolimus e rapamicina), e inibidores de mecanismos de “retorno de linfócito” (tais como FTY720), e agentes com efeitos sobre a sinalização de célula tal como inibidores da molécula de adesão (por exemplo anti-LFA).

[00489] Já em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em conjunção com radioterapia e/ou transplante autólogo ou alógeno periférico de célula tronco ou medula óssea.

[00490] Ainda em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados de anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-CD19, anticorpos anti- CD20 (por exemplo ofatumumab ou rituximab), anticorpos anti-CD21, anticorpos anti-CD22, anticorpos anti-CD37, anticorpos anti-CD38, anticorpos anti-IL6R, anticorpos anti-IL8, anticorpos anti-IL15, anticorpos anti-IL15R, anticorpos anti-CD4, anticorpos anti-CD11a (por exemplo, efalizumab), anticorpos de integrina anti-alfa-4/beta-1 (VLA4) (por exemplo, natalizumab), e CTLA4-Ig.

[00491] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos que bloqueiam os pontos de checagem imunes, tais como anticorpos anti-CTLA-4 (CD152), anticorpos anti-PD-1 (CD279), anticorpos anti-PD-L1 (CD274), anticorpos anti-LAG-3 (CD223), anticorpos anti-TIM3, anticorpos anti-CEACAM1 (CD66a), anticorpos anti-VISTA, anticorpos anti-TIGIT, anticorpos anti- BTLA (CD272).

[00492] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos agonísticos que sejam específicos para os receptores coestimuladores nas células imunes, tais como anticorpos anti-4-1BB (CD137) (por exemplo urelumab), anticorpos anti-OX40 (CD134), anticorpos anti-CD40, anticorpos anti-CD27.

[00493] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos que esgotam ou polarizam macrófago tipo II, tais como anticorpos anti-CSF-1R (CD115).

[00494] Em uma outra modalidade, os anticorpos biespecíficos podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos que se ligam às moléculas envolvidas na regulagem do sistema imune inato, tais como anticorpos anti-CD47, anticorpos anti-CD200, anticorpos anti-CD200R, anticorpos contra receptores inibidores de célula matadora (KIRs), anticorpos contra receptores CD94/NKG2, anti-CD305 (LAIR1).

[00495] Em uma outra modalidade particular, os anticorpos biespecíficos são administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados de anticorpos anti-CD19, anticorpos anti-CD21, anticorpos anti- CD22, anticorpos anti-CD37, e anticorpos anti-CD38 para o tratamento de doenças malignas.

[00496] Em uma outra modalidade particular, os anticorpos biespecíficos são administrados em combinação com um anticorpo anti- CD20, tal como ofatumumab.

[00497] Ainda em uma outra modalidade particular, os anticorpos biespecíficos são administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados de anticorpos anti-IL6R, anticorpos anti-IL8, anticorpos anti- IL15, anticorpos anti-IL15R, anticorpos anti-CD4, anticorpos anti-CD11a (por exemplo, efalizumab), anticorpos anti-integrina-alfa-4/beta-1 (VLA4) (por exemplo, natalizumab), e CTLA4-Ig para o tratamento de doenças inflamatórias.

[00498] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da invenção é para o uso em combinação com um ou mais outros anticorpos terapêuticos, tais como zanolimumab, daratumumab (Darzalex), ranibizumab, nimotuzumab, panitumumab, hu806, daclizumab (Zenapax), basiliximab (Simulect), infliximab (Remicade), adalimumab (Humira), natalizumab (Tysabri), omalizumab (Xolair), e/ou efalizumab (Raptiva).

[00499] Em uma outra modalidade o anticorpo biespecífico da invenção é para o uso em combinação com um ou mais conjugados de anticorpo-droga (ADCs), por exemplo brentuximab-vedotin (Adcetris), inotuzumab ozogamicina (CMC-544), polatuzumab vedotin (RG7593), coltuximab ravtansina (SAR3419), indatuximab ravtansina (BT-062), inotuzumab ozogamicina (CMC-544), denintuzumab mafodotin (SGN- CD19), polatuzumab vedotin (RG7596) ou um conjugado de anticorpo-droga específico de CD37 (por exemplo IMGN529 ou AGS67E).

[00500] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico da invenção pode ser usado em combinação com um agente anti-inflamatório ou um imunossupressivo. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente anti- inflamatório ou pelo menos um agente imunossupressivo. Em uma modalidade tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes anti- inflamatórios, tais como uma droga esteroidal ou um NSAID (droga anti- inflamatória não esteroidal). Os agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2, tais como celecoxib (Celebrex), NSAIDs tais como ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenaco (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozin (Daypro), e indometacina (Indocin).

[00501] Em uma outra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais DMARDs, tais como metotrexato (Rheumatrex), hidroxicloroquina (Plaquenil), sulfasalazina (Asulfidine), inibidores da síntese de pirimidina, por exemplo, leflunomida (Arava), agentes bloqueadores do receptor de IL-1, por exemplo, anaquinra (Kineret), e agentes bloqueadores de TNF-α, por exemplo, etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade) e adalimumab.

[00502] Em uma outra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes imunossupressivos, tais como ciclosporina (Sandimmune, Neoral) e azatioprina (Imural).

[00503] Em uma modalidade particular, os anticorpos biespecíficos são administrados em combinação com um anticorpo anti-CD25 para o tratamento de pênfigo bolhoso, por exemplo, em pacientes com doença do enxerto-versus-hospedeiro. Radioterapia - cirurgia

[00504] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam CD20 em um sujeito, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico CD3xCD20 da presente invenção, e radioterapia a um sujeito em necessidade do mesmo.

[00505] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de CD3xCD20 biespecífico da presente invenção, e radioterapia a um sujeito em necessidade do mesmo.

[00506] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo biespecífico da presente invenção, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer para ser administrada em combinação com radioterapia.

[00507] A radioterapia pode compreender radiação ou administração associada de produtos radiofarmacêuticos a um paciente. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao paciente sendo tratado (o tratamento com radiação, por exemplo, pode estar na forma de terapia de radiação de feixe externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Os elementos radioativos que podem ser usados na prática de tais métodos incluem, por exemplo, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo- 123, iodo-131, e índio-111.

[00508] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, método este que compreende a administração a um sujeito em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecífico da presente invenção, em combinação com cirurgia.

Usos em diagnóstico

[00509] Assim, em um aspecto, a invenção se refere a uma composição de diagnóstico compreendendo um anticorpo biespecífico CD3xCD20 como aqui definido, e ao seu uso.

[00510] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um kit para detectar a reticulação entre células que expressam CD3 e CD20, em uma amostra derivada de um paciente tal como uma amostra de sangue, amostra de linfônodo ou amostra de medula óssea, compreendendo i) um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas; e ii) instruções para o uso do dito kit.

[00511] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit para o diagnóstico de câncer compreendendo um recipiente compreendendo um anticorpo biespecífico CD3xCD20, e um ou mais reagentes para detectar a reticulação de células que expressam CD20 e células que expressam CD3. Os reagentes podem incluir, por exemplo, rótulos fluorescentes, rótulos enzimáticos, ou outros rótulos detectáveis. Os reagentes também podem incluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para as reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que possa ser visualizado.

[00512] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um método para detectar se a reticulação entre as células que expressam CD3 e CD20 ocorre em uma amostra derivada de um paciente, tal como uma amostra de sangue, amostra de linfônodo ou amostra de medula óssea, na administração de um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas, compreendendo as etapas de: i) contatar a amostra com um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das modalidades como aqui descritas sob condições que permitam a formação de um complexo entre o dito anticorpo biespecífico e as células que expressam CD3 e CD20; e ii) analisar se um complexo foi formado.

[00513] A detecção do complexo pode ser feita pelos métodos conhecidos na técnica, tais como pelo método descrito no Exemplo 5.

[00514] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um anticorpo anti-idiotípico que se liga à primeira região de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas, ou que se liga à segunda região de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas.

[00515] A presente invenção é ilustrada ainda pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Geração de anticorpos humanizados CD3 e variantes de anticorpo não ativadoras Humanização dos anticorpos de CD3

[00516] A humanização de um anticorpo de CD3 SP34 de murino (US8.236.308, aqui descrito como IgG1-CD3) foi realizada pelo Antitope (Cambridge, UK) usando a sua versão melhorada da tecnologia de humanização da linha germinativa (enxerto de CDR) (EP0629240). Usando esta tecnologia, 4 cadeias VH diferentes (SEQ ID NOs: 6, 7, 8, e 9) e 3 cadeias VL diferentes (SEQ ID NOs: 10, 11, e 12) foram planejadas. Combinando-se estas 4 cadeias VH com as 3 VL, 12 anticorpos diferentes foram gerados. As variantes humanizadas são aqui descritas como huCD3. Assim, as variantes humanizadas compreendendo uma VH e uma VL de acordo com a invenção, são descritas como, por exemplo, IgG1-huCD3-H1L1 contanto que a dita variante específica seja do isótipo IgG1, seja um anticorpo humanizado SP34 específico de CD3 e compreenda a sequência VH de aminoácido denominada “H1” e seja definido de acordo com a SEQ ID NO: 6, e a sequência VL de aminoácido denominada “L1” seja definida de acordo com a SEQ ID NO: 10. Assim, H1 se refere à região de cadeia pesada variável VH1, L1 se refere à região de cadeia leve variável VL1, e assim por diante.

[00517] Em particular, as variantes IgG1-huCD3-H1L1 (CD3 humanizada compreendendo a sequência VH1 apresentada na SEQ ID NO: 6 e a sequência VL1 apresentada na SEQ ID NO: 10), IgG1-huCD3-H1L2 (CD3 humanizada compreendendo a sequência VH1 apresentada na SEQ ID NO: 6 e a sequência VL2 apresentada na SEQ ID NO: 11), IgG1-huCD3- H1L3 (CD3 humanizada compreendendo a sequência VH1 apresentada na SEQ ID NO: 6 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12), IgG1- huCD3-H3L3 (CD3 humanizada compreendendo a sequência VH3 apresentada na SEQ ID NO: 8 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12), IgG1-huCD3-H4L1 (a CD3 humanizada compreendendo a sequência VH4 apresentada na SEQ ID NO: 9 e a sequência VL1 apresentada na SEQ ID NO: 10), IgG1-huCD3-H3L1 (a CD3 humanizada compreendendo a sequência VH3 apresentada na SEQ ID NO: 8 e a sequência VL1 apresentada na SEQ ID NO: 10), IgG1-huCD3-H3L3 (a CD3 humanizada compreendendo a sequência VH3 apresentada na SEQ ID NO: 8 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12), e IgG1-huCD3-H4L3 (a CD3 humanizada compreendendo a sequência VH4 apresentada na SEQ ID NO: 9 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12) foram usadas como a primeira região de ligação a antígeno dos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção. Aqui, “IgG1-huCD3”, se não ainda definido se refere a IgG1-huCD3-H1L1.

[00518] Em alguns exemplos o anticorpo de CD3 compreendendo as sequências da região variável de cadeia leve e pesada de huCLB-T3/4 (SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente) foi usado como a primeira região de ligação a antígeno dos anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção. huCLB-T3/4 é uma versão humanizada do anticorpo de CD3 de murino CLB- T3/4 (Parren et al., Res Immunol. 1991, 142(9): 749-63). Ambas as sequências (SEQ ID NOs: 17 e 18) foram clonadas nos vetores de expressão pcDNA3,3 (Invitrogen) relevantes e expressas pela cotransfecção em células HEK293F. O anticorpo de CD3 resultante está descrito como IgG1-huCLB- T3/4.

[00519] Os anticorpos humanizados CD3 são descritos ainda na WO2015001085.

Anticorpos de CD20

[00520] Os anticorpos de CD20 usados como o segundo braço de ligação dos presentes anticorpos biespecíficos são descritos ainda na WO2004035607 (Genmab) e WO2005103081 (Genmab).

Anticorpos de controle

[00521] Os seguintes anticorpos foram usados como anticorpos de controle nos exemplos:

Anticorpos de CD3

[00522] IgG1-CD3 (o anticorpo precursor de CD3 SP34 tendo as sequências VH e VL apresentadas na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente)

[00523] IgG1-huCD3 (H1L1) (tendo as sequências VH e VL apresentadas na SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 10, respectivamente)

[00524] IgG1-huCLB-T3/4

[00525] bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR (anticorpo biespecífico usando como o segundo braço do anticorpo b12 que é um anticorpo específico de gp120 (Barbas, CF. J Mol Biol. 4 de abril de 1993; 230(3): 812-23).

[00526] IgG1-huCD3-H1L1-FEAL

[00527] IgG1-huCLB-T3/4-FEAL

Anticorpos de CD20

[00528] IgG1-7D8 (tendo as sequências VH e VL apresentadas na SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28, respectivamente)

[00529] IgG1-11B8 (tendo as sequências VH e VL apresentadas na SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, respectivamente)

[00530] IgG1-2F2 (tendo as sequências VH e VL apresentadas na SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 28, respectivamente)

[00531] IgG1-RTX (tendo as sequências VH e VL de rituximab)

[00532] IgG1-GA101 (tendo as sequências VH e VL de obinutuzumab, CHEMBL1743048, US8883980, com um domínio Fc de IgG humana do tipo selvagem)

[00533] IgG1-2C6 (tendo as sequências VH e VL apresentadas na SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48, respectivamente).

[00534] IgG1-7D8-FEAR

[00535] IgG1-11B8-FEAR

[00536] IgG1-2F2-FEAR

[00537] IgG1-GA101-FEAR

[00538] IgG1-2C6-FEAR TABELA 4: Quantificação da ligação de anticorpo de CD20 7D8 nas linhagens de célula B diferentes

[00539] A citometria de fluxo quantitativa (QIFIKIT®, Dako; cat. no K0078) foi realizada como descrito (Poncelet e Carayon, 1985, J. Immunol. Met. 85: 65-74), para quantificar a ligação de anticorpo de CD20 7D8 nas linhagens de célula B humanas diferentes usadas nos exemplos, como uma indicação da expressão de CD20. Para esta finalidade, as linhagens de célula B humanas foram incubadas com uma concentração saturante de 7D8, e o número de moléculas 7D8 ligadas foi determinado usando a citometria de fluxo quantitativa.

[00540] O anticorpo 7D8 anti-CD20 humano, que foi engenheirado para expressar um domínio Fc de murino (10 μg/ml, mmIgG1-7D8 (Overdijk et al. 2012, J. Immunol. 189: 3430-3438), foi usado neste ensaio. B-ALL: leucemia linfoblástica aguda de célula B, ABC-DLBCL: Linfoma de célula B grande difusa de célula B ativada, GC-DLBCL: Linfoma de célula B grande difusa de centro germinal, FL: linfoma folicular. *ABC: capacidade de ligação de anticorpo

Exemplo 2 - Geração de anticorpos biespecíficos pela troca de braço Fab induzida por 2-MEA

[00541] Um método in vitro para produzir anticorpos biespecíficos é descrito na WO2008119353 (Genmab) e relatado por van der Neut- Kolfschoten et al. (Science. 14 de setembro de 2007; 317(5844): 1554-7). Aqui, os anticorpos biespecíficos foram formados pela troca de “braço Fab” ou “meia-molécula” (troca de uma cadeia pesada e cadeia leve ligada) entre dois anticorpos semelhante a IgG4 monoespecífico ou IgG4 na incubação sob condições brandamente redutoras. Sem estar limitado à teoria, esta reação de troca de braço Fab foi o resultado de uma reação de isomerização da ligação de dissulfeto em que as ligações de dissulfeto inter cadeia pesada nas regiões de dobradiça de anticorpos monoespecíficos foram reduzidas e as cisteínas livres resultantes formam uma nova ligação de dissulfeto inter cadeia pesada com resíduos de cisteína de uma outra molécula de anticorpo com uma especificidade diferente. Os produtos resultantes foram anticorpos biespecíficos tendo dois braços Fab com sequências diferentes.

[00542] O conhecimento desta troca de braço Fab de IgG4 natural foi adaptada para gerar um método para produzir anticorpos biespecíficos estáveis com base na IgG1 (WO2011131746 (Genmab)). O produto de anticorpo biespecífico gerado por este método descrito abaixo não mais participará na troca de braço Fab de IgG4. A base para este método foi o uso de domínios CH3 complementares, que promovem a formação de heterodímeros sob condições de ensaio específicas. Para permitir a produção de anticorpos biespecíficos por este método, as moléculas de IgG1 que carregam certas mutações no domínio CH3 foram geradas: em uma das mutações T350I, K370T e F405L de anticorpo IgG1 precursor (ou minimamente F405L) no outro anticorpo de IgG1 precursor a mutação K409R.

[00543] Para gerar anticorpos biespecíficos, estes dois anticorpos precursores, cada anticorpo em uma concentração final de 0,5 mg/ml (concentração equimolar), foram incubados com 25 mM de 2- mercaptoetilamina-HCl (2-MEA) em um volume total de 100 μL de Tris- EDTA (TE) a 37°C durante 90 min. A reação de redução é interrompida quando o agente redutor 2-MEA é removido usando-se colunas giratórias (filtros centrífugos Microcon, 30k, Millipore) de acordo com o protocolo do fabricante.

Exemplo 3 - Geração de mutantes para otimizar a produção dos anticorpos humanizados CD3 Geração de plasmídeos huCD3-L1 mutantes

[00544] Diversas variantes de IgG1-huCD3-H1L1 com mutações na cadeia leve L1 foram geradas de modo a melhorar os níveis de produção de IgG1-huCD3-H1L1 em ensaios de transfecção transitórios, conforme a Tabela 5. A seleção de resíduos foi fundamentada nas comparações com as sequências da linha germinativa ou triagem quanto à presença de resíduos raros na sequência em combinação huCD3-L1 com estruturas cristalinas de anticorpos homólogos. As sequências selecionadas foram sintetizadas na GeneArt (Life Technologies, Alemanha). p33L codifica o domínio constante da cadeia leve lambda de IgLC2/IgLC3 humana da SEQ ID NO: 29. p33G1f codifica a região constante de cadeia pesada IgG1m(f) da SEQ ID NO: 15. Expressão transitória nas células Expi293F

[00545] Para um único anticorpo, os plasmídeos codificando cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) foram transitoriamente transfectados em células Freestile Expi293F (Life technologies, USA) usando ExpiFectamina 293 (Life technologies). No total 1,5 μg de plasmídeo codificando HC e 1,5 μg de plasmídeo codificando LC (Tabela 5) foram diluídos em 150 μL de Opti-MEM (Gibco, USA). Para preparar a mistura de transfecção, 8 μL de ExpiFectamina 293 foram diluídos em 150 μL de Opti-MEM e incubados durante 5 minutos na temperatura ambiente. Em seguida, as soluções de DNA/Opti-MEM e ExpiFectamina 293/Opti-MEM foram misturadas, incubadas durante 20 minutos na temperatura ambiente e adicionadas a 2,55 ml de Meio de Expressão Expi293 contendo 7,5 x 106 células Expi293F e 50 U/ml de Pen-Strep. As células foram incubadas a 37°C, 8 % de CO2 e agitadas a 200 rpm. Para realçar a expressão, 21 horas depois da transfecção, 15 μL de mistura realçadora 1 e 150 μL de mistura realçadora 2 foram adicionados. As células foram incubadas durante 4 dias seguidos pela colheita do sobrenadante. Os sobrenadantes foram girados a 3.000xg e esterilizados em filtro em um filtro de 0,2 μm. Os níveis de produção de IgG foram medidos no Octet RED (ForteBio, US) usando sensores de IgG anti-ser humano (ForteBio, USA).

Análise da concentração de IgG

[00546] O anticorpo IgG1-huCD3-H1L1 expresso a 72 μg/ml. Um aumento de 4 vezes na expressão de IgG foi observado para o mutante IgG1- huCD3-H1L1-LT41K (295 μg/ml). Níveis de produção similares foram observados para o mutante IgG1-huCD3-H1L1-LLKNH (311 μg/ml), incluindo a mutação T41K entre outras mutações. As outras mutações nestas construções não apresentaram realce de expressão quando testados individualmente (IgG1-huCD3-H1L1-LF10L, IgG1-huCD3-H1L1-LK55N, IgG1-huCD3-H1L1-LL97H) comparados ao IgG1-huCD3-H1L1.

[00547] Um segundo conjunto de mutações realçadoras de expressão foi observado para a combinação de R23A e A35P. Embora a variante IgG1- huCD3-H1L1-LLTGPEAEY carecendo de R23A e A35P não mostrasse expressão realçada (83 μg/ml), IgG1-huCD3-H1L1-LLAPTGPEAEY contendo as mutações R23A e A35P adicionais mostrou um aumento de 3 vezes na expressão (237 μg/ml). Individualmente, R23A ou A35P não mostraram níveis de produção realçados (56 e 81 μg/ml, respectivamente).

Exemplo 4 - Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 às células Daudi e Jurkat.

[00548] A ligação de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR às linhagens de célula Daudi humana negativa em CD3 positiva em CD20 (American Type Culture Collection, ATCC® CCL-213®, derivada de Linfoma de Burkitt humano) e a Jurkat humana positiva em CD3 negativa em CD20 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ® ACC 282®, derivada de leucemia de célula T aguda) foi analisada pela citometria de fluxo. Além das mutações não ativadoras, L234F, L235E, D265A, em ambos os braços, o anticorpo biespecífico conteve uma mutação F405L em um braço e uma mutação K409R no outro braço.

[00549] As células (1 x 105 células/poço) foram incubadas em placas de poliestireno de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one, cat. no. 650101) com diluições em série de anticorpos (faixa 0,041 a 30 μg/ml em etapas de diluição de 3 vezes [A-E] e 0,00061 a 10 μg/ml em etapas de diluição de 4 vezes [F-I]) em 100 μL de PBS/0,1 % de BSA/0,02 % de azida (a partir daqui designado como tampão de tingimento) a 4°C durante 30 min.

[00550] Depois de lavar duas vezes em tampão de tingimento, as células foram incubadas em 50 μL de anticorpo secundário a 4°C durante 30 min. Como um anticorpo secundário, F(ab’)2 de IgG de cabra anti-ser humano conjugado com R-Ficoeritrina (PE) (cat. no. 109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) diluído 1:200 em tampão de tingimento, foi usado para todos os experimentos. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em tampão de tingimento, recolocadas em suspensão em 30 μL de tampão de tingimento e analisadas em um separador iQue (Intellicyt Corporation, USA) (para a Figura 1A-E) ou recolocadas em suspensão em 100 μL de tampão de tingimento e analisadas em um FACSCANTOII (BD Biosciences) (Figura 1F-I). As curvas de ligação foram analisadas usando a regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando o software GraphPad Prism V75.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

[00551] A Figura 1 A-F mostra que bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR e bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR mostraram ligação dependente da dose às células Daudi, com ligação máxima mais alta do que os anticorpos de CD20 monoespecíficos, bivalentes IgG1- 7D8 e IgG1-2F2. Para bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR e bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-GA101-FEAR, a ligação máxima foi similar àquela dos anticorpos de CD20 bivalentes, monoespecíficos IgG1-11B8, IgG1-RTX e IgG1-GA101. A ligação máxima de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20- 11B8-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR, bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR, e dos anticorpos de CD20 bivalentes, monoespecíficos IgG1-11B8, IgG1-RTX e IgG1-GA101 foi mais baixa do que aquela de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR e anticorpos de CD20 bivalentes, monoespecíficos IgG1-7D8 e IgG1-2F2. A ligação máxima de huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR foi comparável com aquela do anticorpo de CD20 monoespecífico IgG1-7D8.

[00552] A Figura 1G mostra a ligação às células Daudi de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 contendo o braço Fab específico de CD3 huCLB- T3/4. BsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1-huCLB-T3/4- FEALxCD20-2F2-FEAR mostraram ligação comparável ao anticorpo monoespecífico de CD20 IgG1-7D8. Como para os biespecíficos CD3xCD20 contendo o braço Fab específico de CD3 huCD3-H1L1, a ligação para bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR e bsIgG1-huCLB-T3/4- FEALxCD20-GA101-FEAR foi mais baixa do que aquela do anticorpo monoespecífico CD20 IgG1-7D8 e os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 contendo um braço Fab 7D8 ou um 2F2 específicos de CD20.

[00553] A Figura 1H e I mostram a ligação às células Jurkat de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 contendo um braço Fab huCD3-H1L1 ou um huCLB-T3/4 específicos de CD3, respectivamente. Todos os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 com um braço Fab específico de CD3 que se origina de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL mostraram ligação comparável às células Jurkat, independente da origem do braço Fab específico de CD20 (Figura 1H). Similarmente, todos os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 com um braço Fab CD3 obtido de IgG1-huCLB-T3/4-FEAL mostraram ligação comparável (Figura 1G). Os anticorpos específicos de CD3 monoespecíficos, bivalentes precursores, IgG1-huCD3-H1L1 e IgG1-huCLB-T3/4, ligaram às células Jurkat com valores EC50 mais baixos do que os anticorpos biespecíficos CD3xCD20. Exemplo 5 - Ligação simultânea dependente de concentração de bsIgGl- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR às células T e células B

[00554] As células B humanas expressam o antígeno de superfície CD20, mas carece da expressão de CD3. Ao contrário, as células T humanas expressam o antígeno de superfície CD3, mas carece da expressão de CD20. O anticorpo biespecífico bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR reconhece tanto CD3 quanto CD20 e é, portanto, capaz de ligar tanto células B quanto T humanas. A ligação simultânea do anticorpo biespecífico bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR às células B e T foi mostrada incubando-se 100 μL de sangue integral heparinizado de um doador saudável na presença de uma faixa de concentração de anticorpos (faixa de 0,001 a 100 μg/ml em etapas de diluição de 10 vezes, obtidas pela adição de volumes diferentes de anticorpo não diluído à amostra de sangue) a 37°C durante 2 horas. O anticorpo de CD20 2F2 e bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR, que exclusivamente reconhecem CD20 ou CD3 respectivamente, e assim são incapazes de ligar simultaneamente células B e T, foram usados como anticorpos de controle negativo. As células foram lavadas duas vezes em tampão de tingimento (1200 RPM, 3 min.) e incubadas com anticorpos específicos para CD4 (CD4-PE; Becton Dickinson, cat. no. 555347) ou CD8 (CD8-PE; Miltenyi, cat. no. BW135/80) (para identificar os subconjuntos de célula T diferentes) e CD19 (CD19-APC; DAKO, cat. no. C7224) (para identificar células B) durante 30 min a 4°C. Antes da análise, os eritrócitos foram lisados pela adição de 100 μL de tampão de lise de eritrócito (10 mM de KHCO3/0,01 mM de EDTA/155 mM de NH4Cl dissolvidos em dH2O) (KHCO3: Sigma, cat. no. P9144; EDTA: FLUKA, cat. no. 036; NH4Cl: Sigma, cat. no. A-5666). As amostras foram analisadas pela citometria de fluxo, usando um FACSCANTOII equipado com um carregador de placa automatizado (Becton Dickinson). O número de eventos duplo-positivos CD4+CD19+ ou CD8+CD19+, indicativo de ligação simultânea de bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR às células T e B humanas, foi quantificado pela análise de quadrante de CD4/CD19 e CD8/CD19.

[00555] A Figura 2A e 2B mostram que apenas na presença do anticorpo de CD3xCD20 biespecífico, uma população de eventos duplo- positivos CD4+CD19+ e CD8+CD19+, representando dubletes de célula T- célula B, foi observada, indicando que estes anticorpos biespecíficos podem ligar dois tipos de célula simultaneamente. O aparecimento de dubletes foi dependente da concentração de anticorpo e ocorreu para as células T tanto CD4+ (A) quanto CD8+ (B).

Exemplo 6 - Indução de citotoxicidade IN VITRO pelos anticorpos biespecíficos CD3xCD20

[00556] Anticorpos biespecíficos CD3xCD20 diferentes foram testados em um ensaio de citotoxicidade in vitro usando linhagens de célula de tumor como células alvo e células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) ou células T purificadas como células atuadoras.

[00557] Células alvo: As seguintes linhagens de célula de tumor foram usadas: Daudi e Raji (descritas acima), OCI-Ly7 (DSMZ; cat. no. ACC 688; derivada de DLBCL), SU-DHL-4 (DSMZ; cat. no. ACC 495; derivada de DLBCL), RI-1 (DSMZ; cat. no. ACC 585, derivada de DLBCL]), NALM-16 (DSMZ; cat. no. ACC 680; derivada de B-ALL) e WSU-NHL (DSMZ, cat. no. ACC 58; derivada de NHL). As células foram coletadas (5 x 106 células) em RPMI++ (RPMI-1640 [com 25 mM de HEPES e L-glutamina; Lonza, cat. no. BE12-115F], suplementado com 10 % de soro bovino [Gibco; cat. no. 10371-029] e 25.000 unidades de penicilina/25.000 μg de estreptomicina [Lonza; cat. no. 17-603E]), giradas (1.200 RPM, 5 min.), recolocadas em suspensão em 1 ml de RPMI++, 100 μCi de 51Cr (Cromo-51; Perkin Elmer, cat. no. NEZ030002MC) foram adicionados e incubados (banho de água a 37°C, agitando; 1 hora). Depois de lavar as células duas vezes em PBS (1,200 RPM, 5 min.), as células foram recolocadas em suspensão em RPMI++ e contadas pela exclusão em azul de tripano. Uma suspensão de célula de 1 x 105 células/ml foi preparada.

[00558] Células atuadoras: PBMCs frescas foram isoladas de 40 ml de camada leucoplaquetária (Sanquin) usando um gradiente de Ficoll (Lonza; meio de separação de linfócito, cat. no. 17-829E) de acordo com as instruções do fabricante. Depois da recolocação em suspensão das células em RPMI++, as células foram contadas usando solução de Türk para excluir eritrócitos e ajustadas a uma concentração de 10 x 106 células/ml.

[00559] As células T purificadas foram obtidas de uma camada leucoplaquetária, usando o Coquetel de Enriquecimento de Célula T Humana RosetteSep® (Stemcell Technologies, cat. no. 15061) ou a partir de PBMCs usando o kit de isolação de células T Humanas Dynabeads® Untouched® (Invitrogen; cat. no. 11344D), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram lavadas duas vezes em PBS e contadas usando solução de Türk e ajustadas a uma concentração de 1 x 106 células/ml. Ensaio de citotoxicidade: 50 μL de células alvo rotuladas com 51Cr foram adicionadas a uma placa de fundo redondo de 96 poços. Depois da adição de 50 μL de anticorpo (concentrações finais variando de 10 pg/ml a 10 μg/ml) em RPMI++, as células foram incubadas na temperatura ambiente por 10 min.

[00560] 50 μL de células atuadoras (razão de atuador para alvo como indicado), Triton-X-100 (1,7 % de concentração final; para determinar a lise máxima), ou RPMI++ (para determinar a lise de fundo), foram adicionados. As células foram incubadas a 37°C, 5 % de CO2, durante 24 a 48 horas. Depois girando as células (1.200 RPM, 3 min.), 75 μL de sobrenadante foram colhidos em tubos de 1,4 ml (Micronic; cat. no. MP226RN), e contados em um contador gama (Perkin Elmer). A porcentagem de lise específica foi calculada como segue: % de lise específica = (cpm de amostra - cpm de células alvo apenas)/(cpm de lise máxima - cpm de células alvo apenas) x 100. Com = contagens por minuto.

[00561] A Figura 3 mostra que todos os anticorpos biespecíficos contendo um braço Fab específico de CD3 (meia molécula) (derivado de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL ou IgG1-huCLB-T3/4-FEAL) e um braço Fab específico de CD20 (isto é, meia-molécula) (derivado de IgG1-CD20-7D8- FEAR, IgG1-CD20-11B8-FEAR, IgG1-CD20-2F2-FEAR, IgG1-CD20-RTX- FEAR, IgG1-CD20-2C6-FEAR ou IgG1-CD20-GA101-FEAR) são capazes de induzir citotoxicidade nas linhagens de célula B testadas, tanto quando do uso de PBMCs (Figura 3A, 3M) quanto de células T purificadas (Figura 3B- 3L, 3N) como células atuadoras. Os anticorpos bivalentes monoespecíficos com domínios Fc inertes (IgG1-7D8-FEAR, IgG1-11B8-FEAR, IgG1- huCD3-H1L1-FEAL, IgG1-huCLB-T3/4-FEAL) não foram capazes de induzir a citotoxicidade mediada pela célula T ou PBMC nas linhagens de célula B. Isto indica que para os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 a citotoxicidade foi dependente tanto da ligação de CD3 quanto de CD20 pelos anticorpos biespecíficos. Como anteriormente descrito, os anticorpos bivalentes monoespecíficos de CD20 com Fc ativo (IgG1-7D8 e IgG1-11B8- F405L) foram capazes de induzir a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo pelas PBMCs em células Daudi (Figura 3A, 3M). Neste caso, as células atuadoras dominantes são células matadoras naturais (NK). Os anticorpos biespecíficos CD3xC20 foram ativos em concentrações mais baixas do que os anticorpos bivalentes monoespecíficos de CD20. As Figuras 3C-3F mostram que os braços CD3 tanto derivado de IgG1-huCLB- T3/4 quanto de IgG1-huCD3-H1L1 induziram a citotoxicidade com eficácia similar. As Figuras 3G-3M além disso mostram que resultados similares foram obtidos usando as linhagens de célula de tumor obtidas de uma ampla faixa de linhagens de célula B. Estas linhagens de célula foram derivadas de tumores de célula B diferente como indicado na Tabela 4. Esta tabela também mostra os níveis de produção de CD20 nestas linhagens de célula.

Exemplo 7 - Indução de citotoxicidade IN VITRO pelo bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR usando células T CD4+ e CD8+ de sangue periférico humano purificadas como células atuadoras

[00562] Para determinar se bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8- FEAR induziria a atividade citotóxica de células T tanto CD4 quanto CD8, um ensaio de citotoxicidade foi realizado usando os diferentes subconjuntos de célula T como células atuadoras. As células Daudi foram preparadas como células alvo como descrito acima.

[00563] As PBMCs foram isoladas de uma camada leucoplaquetária de um doador saudável usando meio de separação de linfócito, como descrito acima.

[00564] As células T (população de célula T total, populações de célula T CD4+ ou CD8+) foram isoladas das PBMCs usando kits de isolação de célula Dynabeads® Untouched™ Human T Cells, Dynabeads® Untouched® Human CD4 T Cells ou Dynabeads® Untouched® Human CD8 T Cells (Invitrogen, cat. no. 11344D, 11352D e 11348D, respectivamente). Depois da isolação, a pureza de cada fração foi determinada pela citometria de fluxo. As células foram incubadas com anticorpos CD3 (CD3-PER-CP; Becton Dickinson, cat. no. 345766) e CD8 (CD8-APC; Becton Dickinson, cat. no. 555369), para identificar os diferentes subconjuntos de célula T, a 4°C durante 30 min. As amostras foram analisadas pela citometria de fluxo, usando um FACSCANTOII equipado com um carregador de placa automatizado (Becton Dickinson). Uma análise de quadrante de CD3/CD8 foi realizada para quantificar a frequência de eventos CD3+ (população de célula T total), os eventos duplo-positivos CD3+CD8+ (população de célula T CD8+) e os eventos CD3+CD8- (população de célula T CD4+).

[00565] As células T totais foram adicionadas às células Daudi em uma razão de atuador para alvo de 10:1, as células T CD4+ foram adicionadas em uma razão de atuador para alvo de 8:1 e células T CD8+ foram adicionadas em uma razão de atuador para alvo (E/T) de 4:1 ou 8:1 (como indicado) (Figura 4A), e um ensaio de citotoxicidade foi realizado como descrito acima. Para testar se as células T CD4+ inibiram a atividade das células T CD8+, quando adicionadas como células atuadoras, um ensaio de citotoxicidade foi realizado usando apenas células T CD8+ (razão E/T de 4:1) ou células T CD8+ (razão E/T de 4:1) junto com células T CD4+ (razão E/T de 8:1) como células atuadoras (Figura 4B).

[00566] A Figura 4A mostra que bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20- 7D8-FEAR induziu a citotoxicidade dependente de célula T em células Daudi, usando células T totais, células T CD4+ ou células T CD8+ como células atuadoras. Os anticorpos bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR e IgG1-7D8-FEAR, usados como controles negativos aqui, não induziram a citotoxicidade das células Daudi (dados não mostrados), indicando que a citotoxicidade foi dependente do reconhecimento tanto de CD3 quanto de CD20 pela molécula biespecífica. A Figura 4B mostra que a adição de células T CD4+ às células T CD8+, como células atuadoras, não reduzem a eficácia de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR.

[00567] A Tabela 6 mostra que a pureza das frações de célula isoladas foi ~ 90 % ou mais alta. TABELA 6: A pureza dos subconjuntos de célula T, como determinado pela citometria de fluxo.

Exemplo 8 - Cinéticas de indução da citotoxicidade IN VITRO pelo bsIgG1- huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR usando células T purificadas como células atuadoras

[00568] Para determinar as cinéticas da citotoxicidade induzida por bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR in vitro, células Daudi foram incubadas com bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR na presença de células T purificadas, e a citotoxicidade foi avaliada em pontos de tempo diferentes. O ensaio de citotoxicidade foi realizado como descrito acima, com a exceção de que os sobrenadantes foram colhidos não apenas depois de 24 horas, mas em pontos de tempo diferentes variando de 3 a 24 horas depois da incubação.

[00569] A Figura 5 mostra os resultados de dois experimentos independentes, realizados com células T purificadas derivadas de dois doadores diferentes. Usando células T purificadas do primeiro doador, a citotoxicidade dependente da dose foi observada depois de 12 horas, e a citotoxicidade foi ainda mais eficiente depois de 48-72 horas (Figura 5A). Na presença de células T purificadas do segundo doador, bsIgG1-huCLB-T3/4- FEALxCD20-7D8-FEAR foi capaz de induzir a citotoxicidade tão cedo quanto 3 horas depois da incubação, e a eficiência aumentou na incubação de 16-24 horas (Figura 5B).

Exemplo 9 - Eficácia da indução de citotoxicidade IN VITRO pelos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 em diferentes razões de atuador para alvo

[00570] Para determinar a eficiência da indução de citotoxicidade pelos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 contendo braços Fab CD20 que se originam de diferentes anticorpos de CD20, um ensaio de citotoxicidade foi realizado como descrito acima, usando razões de atuador para alvos diferentes. As PBMC foram usadas como células atuadoras, e células Daudi foram usadas como células alvo.

[00571] Como mostrado na Figura 6, mesmo em uma razão E/T entre 10:1 e 25:1, a morte de célula foi observada para os anticorpos biespecíficos CD3xCD20.

Exemplo 10 - Citotoxicidade de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 no modelo de coenxerto Raji-luc em camundongos NOD-SCID

[00572] A eficácia antitumor in vivo de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR e bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR foi avaliada em um modelo de coenxerto Raji-luc subcutâneo. Neste modelo, PBMCs humanas não estimuladas, como uma fonte de células T humanas, foram coinoculadas com células de tumor, análogo ao modelo descrito por Brischwein et al. (Mol. Immunol. 43 (2006), 1129-1143). No dia 0, uma mistura contendo 5 x 106 PBMCs e 5 x 106 células Raji-luc em 200 μL de PBS/0,1 % de BSA foram inoculadas subcutaneamente (s.c.) no flanco direito de cada camundongo (camundongos NOD-SCID fêmeas; NOD.C.B-17-Prkdcscid/J, Charles-River, 6-11 semanas de idade). Dentro de uma hora de injeção, os camundongos foram classificados em grupos de tratamento (4 a 5 camundongos por grupo de tratamento [experimentos mostrados na Figura 7A-F] ou 10 camundongos per grupo de tratamento [experimento mostrado na Figura 7G-I]) e cada grupo foi injetado intravenosamente (i.v.) com uma dose única de 100 a 150 μL de anticorpo (biespecífico) em PBS. Os grupos de tratamento são mostrados na Tabela 7 (para o experimento mostrado na Figura 7A, B, C), Tabela 8 (para o experimento mostrado na Figura 7D, E, F) e Tabela 8.1 (para o experimento mostrado na Figura 7G, H, I). Os volumes de tumor foram determinados pelo menos duas vezes por semana. Os volumes de tumor (mm3) foram calculados a partir de medições com compasso de calibre (PLEXX) como: 0,52 x (comprimento) x (largura)2.

[00573] As células Raji-luc foram geradas transfectando-se a gWIZ luciferase (GTS, San Diego, USA). As células foram descongeladas, cultivadas em RPMI (Lonza, BE12-115F) suplementadas com 10 % de soro bovino doador com ferro (Gibco, cat. no. 10371-029), penicilina/ estreptomicina e piruvato de sódio e 1 μg/ml de puromicina (Sigma, Zwijndrecht, Países Baixos; cat. no. P-8833). As células foram colhidas na fase log e contadas pela exclusão com azul de tripano.

[00574] Para cada estudo, PBMCs humanas foram isoladas de uma camada leucoplaquetária de doador saudável como descrito acima, congeladas e descongeladas antes do uso. Todas células foram lavadas em PBS /0,1 % de BSA, filtradas através de uma peneira de célula e recolocadas em suspensão a uma concentração de 50 x 106 células/ml em PBS/0,1 % de BSA.

[00575] Os resultados são mostrados na Figura 7. BsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR eficientemente reduziu o tamanho do tumor de Raji-luc nas dosagens de 0,05 e 0,5 mg/kg. A 0,005 mg/kg, bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR não afetou o crescimento de tumor (Figura 7A). No dia 21 depois da inoculação de tumor (o último dia todos os grupos de tratamento foram completos), o tamanho de tumor médio nos camundongos que foram tratados com 0,5 mg/kg de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR foi significantemente menor do que nos camundongos que foram tratados com o controle de veículo PBS (Figura 7B) (p<0,01, teste de Kruskal Wallis seguido pelo pós-teste da comparação múltipla de Dunn). A análise de Kaplan-Meier demonstrou que a sobrevivência livre de tumor depois do tratamento com bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR (0,5 e 0,05 mg/kg) foi significantemente melhor do que depois do tratamento com PBS (p<0,01 e p<0,05 para os grupos de tratamento de 0,5 e 0,05 mg/kg, respectivamente, análise de Mantel Cox) (Figura 7C).

[00576] Similarmente, o tratamento com bsIgG1-huCLB-T3/4- FEALxCD20-7D8-FEAR significantemente inibiu o crescimento de tumor nas doses de 0,05 e 0,5 mg/kg (Figura 7D). No dia 25 depois da inoculação de tumor (o último dia todos os grupos de tratamento foram completos), o tamanho de tumor médio nos camundongos que foram tratados com 0,05 e 0,5 mg/kg de bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR foi significantemente menor do que nos camundongos que foram tratados com o controle de veículo (PBS) (p<0,05, teste de Kruskal Wallis seguido pelo pós- teste da comparação múltipla de Dunn) (Figura 7E). A análise de Kaplan- Meier demonstrou que a sobrevivência livre de tumor depois do tratamento com bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR (0,5 e 0,05 mg/kg) foi significantemente melhor do que depois do tratamento com o controle de veículo (PBS) (p<0,01, análise de Mantel Cox) (Figura 7F).

[00577] A Figura 7G mostra que tanto bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR (todas as doses testadas) quanto bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR (0,05 mg/kg) induziram uma demora no crescimento de tumor. No dia 20 depois da inoculação de tumor (o último dia todos os grupos de tratamento foram completos), o tamanho de tumor médio nos camundongos que foram tratados com bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR (0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg) e em camundongos que foram tratados com 0,05 mg/kg de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20- 11B8-FEAR foi significantemente menor do que nos camundongos que foram tratados com controle de veículo (PBS) (p<0,05 para todos os grupos, exceto para o grupo bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR 0,005 μg/kg onde p<0,01; ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de comparação múltipla de Tukey) (Figura 7H). a análise de Kaplan-Meier demonstrou que a sobrevivência livre de tumor em todos os grupos de tratamento, exceto para o bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR a 0,005 mg/kg, foi significantemente melhor do que nos camundongos tratados com controle de veículo (PBS) (p<0,05, análise de Mantel Cox) (Figura 7I).

Exemplo 11 - Atividade antitumor de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR em um modelo de xenoenxerto de camundongo de sistema imune humanizado

[00578] A eficácia antitumor in vivo de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR foi avaliada em camundongos com sistema imune humanizado (HIS) que foram inoculados com células de tumor Daudi-luc humanas (BRGS-HIS-Daudi-luc) (experimentos realizados na Axenis, Paris, França). Neste modelo, as células progenitoras CD34+ hematopoiéticas humanas (~ 1 x 105 células) foram obtidas do sangue do cordão umbilical, e injetadas intra-hepaticamente em camundongos neonatais BALB/c Rag2tm1Fwa IL-2RYC tmlCgn SIRPαNOD (BRGS) como descrito por Legrand et al. (PNAS. 108 (2011), 13224-13229). Depois de 14 semanas, a humanização dos camundongos BRGS foi confirmada pela citometria de fluxo. Subsequentemente, os camundongos foram divididos em três grupos (7 camundongos por grupo), com base na porcentagem de células T CD3+ humanas na população CD45+ humana (29,5 ± 7,5, 28,4 ± 9,4 e 28,3 ± 11,6 para os grupos tratados com PBS, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR e bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR, respectivamente). Na semana 15, 5 x 106 células Daudi-luc em 100 μL de PBS, foram injetadas intravenosamente (i.v.) nos camundongos BRGS-HIS e isto foi indicado como dia 0 no estudo. No dia 3 e 7, os camundongos BRGS-HIS com células Daudi-luc foram injetados i.v. com 1 mg/kg de anticorpo (biespecífico). Os grupos de tratamento são mostrados na Tabela 9. O crescimento de tumor foi avaliado semanalmente (partindo no dia 2) pela formação de imagem com bioluminescência (BLI). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente (i.p) com 100 μL de D-luciferina de vagalume (30 mg/ml; Caliper LifeSciences) e a bioluminescência foi medida usando um Biospace Bioluminescence Imaging System (PerkinElmer). Além disso, uma amostra de sangue foi tirada de cada camundongo individual no dia 9, e a citometria de fluxo foi realizada para determinar a porcentagem das populações de leucócito diferentes (leucócitos humanos totais: população de hCD45+mCD45-; células B: população de hCD3-hCD19+; células T: população de hCD3+hCD19- e células T ativadas: população de hCD3+hCD19-FSChi. Os seguintes anticorpos foram usados para o tingimento: anti-hCD45 clone HI30, rotulado com Alexa Fluor® 700 (BioLegend, cat. no. 304023; diluição final 1:50; anti-mCD45 clone 30-F11, rotulado com aloficocianina (APC)-eFluor® 780 (eBioscience, cat. no. 47-0451-80; diluição final 1:200); anti-hCD3 clone UCHT1, rotulado com eFluor® 450 (eBioscience, cat. no. 48-0038-80; diluição final 1:50), anti-hCD19 clone HIB19 rotulado com ficoeritrina (PE) (Becton Dickinson, cat. no. 561741; diluição final 1:25).

[00579] Os resultados são mostrados na Figura 8. Como pode ser observado da Figura 8A, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR eficientemente reduziu a carga de tumor em uma dose de 1 mg/kg. O anticorpo biespecífico de controle bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR não inibiu o crescimento de tumor. A comparação estatística da carga tumoral no dia 21 (teste de Kruskal Wallis seguido pelo pós-teste da comparação múltipla de Dunn) demonstrou que a carga tumoral no grupo de tratamento de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR foi significantemente mais baixa do que nos animais tratados com veículo (PBS) (p < 0,01). A diferença entre o bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR e grupos de tratamento com veículo não foi significante (Figura 8B).

[00580] Na Figura 8C, as porcentagens de populações de leucócito humano diferente, como determinado pela citometria de fluxo, são indicadas. A porcentagem de leucócitos humanos circulantes (células hCD45+) foi comparável em todos os grupos. Entretanto, a porcentagem de células B humanas em camundongos tratados com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20- 7D8-FEAR foi fortemente reduzida (p = 0,0012, comparada ao grupo de controle de veículo, de acordo com o teste de Mann Whitney). O tratamento com o anticorpo biespecífico de controle bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12- FEAR não afetou a porcentagem de células B humanas. A porcentagem de células T ativadas (população hCD3+FSChi) foi realçada em camundongos tratados com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR, (p=0,0093 comparados com o grupo de controle de veículo, de acordo com a o teste de Mann Whitney). O tratamento com o anticorpo biespecífico de controle bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR não mudou significantemente o número de células T ativadas. Isto indica que a ativação de célula T depois do tratamento com o anticorpo de CD3xCD20 biespecífico foi dependente da ligação tanto de CD3 quanto de CD20 e não da ligação de CD3 sozinho.

Exemplo 12 - Estudo piloto para determinar a farmacologia e farmacocinéticas de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 em macacos cinomolgos

[00581] O perfil de segurança, as farmacocinéticas e a indução da depleção de célula B em macacos cinomolgos por um dos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 de acordo com a invenção, bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR, foram testados de acordo com o estudo descrito abaixo.

[00582] O objetivo deste estudo foi determinar as características farmacocinéticas, efeitos toxicológicos e farmacológicos de bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR em macacos cinomolgos fêmeas (Macaca fascicularis, originados das Ilhas Maurício, com aproximadamente 2 a 3 anos de idade; faixa de peso de 2,5 a 3 kg) a seguir de uma única infusão intravenosa via a veia da cauda. O estudo foi realizado na Charles River Laboratories, Tranent, UK. Os anticorpos IgG1 precursores, IgG1-huCD3- H1L1 e IgG1-7D8, que foram engenheirados para fabricar a molécula biespecífica, foi mostrado ser reativo cruzado com CD3 e CD20 de macaco cinomolgo, respectivamente. Oito macacos cinomolgos fêmeas foram designados para quatro grupos de dose que receberam bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR em uma dose de 0,01, 0,1, 1 ou 10 mg/kg em um volume de dose constante de 10 ml/kg. Um animal de cada grupo de dose foi sacrificado 28 dias depois da dose administrada, ao passo que o segundo animal de cada grupo de dose foi sacrificado quando as contagens de célula B neste animal se recuperaram a um nível que fosse comparável aos valores de pré-dose, como avaliado pela citometria de fluxo (animais recuperados). As práticas e procedimentos adotados durante este estudo foram compatíveis com os Princípios da OECD de Boa Prática de Laboratório como apresentados pelo United Kingdom Department of Health.

[00583] As populações de célula B e T no sangue periférico foram analisadas pela citometria de fluxo, nos pontos de tempo diferentes depois da dosagem. As células B foram identificadas usando os marcadores de superfície de célula CD19 e CD21 (células CD19+CD21+); as células T totais foram avaliadas como a soma de células CD4+ e CD8+. Como mostrado na Figura 9A, a administração de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8- FEAR em níveis de dose de 1 e 10 mg/kg resultou na depleção de células B circulantes para níveis indetectáveis no primeiro ponto de tempo medido (1 dia após a dose). Os níveis de dose de 0,01 e 0,1 mg/kg mostraram apenas depleção parcial ou nenhuma depleção. A depleção de célula B foi mantida até quatro a seis semanas (28 a 42 dias) depois da dosagem no grupo de dose de 1 mg/kg, seguido por uma recuperação dos níveis de célula B atingindo os níveis de pré-dose em 9 semanas (63 dias) após a dosagem. No grupo de dose de 10 mg/kg a recuperação dos níveis de célula B apenas começaram nas semanas 9-10 (70 dias) depois da dosagem. Uma diminuição transitória nos números de célula T circulantes foi observada no dia 1 após a dose em todos os grupos de dose (Figura 9B). os níveis de célula T retornaram para os níveis de pré-dose na medição seguinte no dia 3 e permaneceu constante até o final do experimento.

[00584] Biópsias (aproximadamente 20 mg) foram tiradas dos linfônodos superficiais (inguinal e axilar esquerdo e direito) de todos os animais, nos pontos de tempo diferentes depois da dosagem. As biópsias foram homogeneizadas e a frequência de células B e T, como uma porcentagem da população linfocítica total (identificada com base na dispersão frontal-dispersão lateral (FSC-SSC), foi avaliada pela citometria de fluxo. As células B foram identificadas usando os marcadores de superfície celular CD19 e CD21 (células CD19+CD21+); as células T totais foram avaliadas como a soma de células CD4+ e CD8+. Como mostrado na Figura 9C, a administração de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR resultou na depleção de células B até níveis indetectáveis no primeiro ponto de tempo medido (7 dias após a dose) nos níveis de dose de 1 e 10 mg/kg. A depleção de célula B foi mantida até 7 semanas depois da dosagem nestes grupos de dose seguido por uma recuperação dos níveis de célula B, que ainda não foram completos em 13-14 semanas (84-95 dias) após a dosagem. Os níveis de dose de 0,01 e 0,1 mg/kg induziram a depleção máxima de célula B em 16 dias após a dosagem com recuperação completa observada em 28 dias depois da dosagem (0,01 mg/kg) ou recuperação parcial em 14 semanas (95 dias) após a dose (0,1 mg/kg). Nenhuma mudança maior nas frequências de célula T foram observadas nos linfônodos em qualquer nível de dose (Figura 9D).

[00585] As amostras plasmáticas foram analisadas quanto aos níveis de citocina (IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y e TNF-α) usando métodos analíticos padrão. A administração de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR induziu um aumento transitório nos níveis de citocina plasmática, que pareceu ser dependente de dose (Figura 9E). Todos os níveis de citocina retornaram aos níveis da pré-dose em 24 horas após a dosagem.

[00586] O perfil farmacocinético de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR foi avaliado analisando-se amostras de plasma obtidas na pré-dose e em vários pontos de tempo depois da dosagem até 70 dias. A concentração total de anticorpo biespecífico foi determinada por uma PCR imune. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados pela Análise não Compartimental (Phoenix WinNonLin). Os resultados são mostrados na Tabela 10. Os valores de AUCo, normalizados pela dose (AUCo ,/Dose) indicam um aumento não linear na exposição plasmática. O aumento proporcional superior nestes valores AUCo, indicam depuração mediada pelo alvo de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR. Além disso, o perfil farmacocinético de bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR mostra uma distribuição e depuração inicial mais rápida quando comparado aos anticorpos monoclonais tipo IgG1 típicos dosados em macacos cinomolgos (Figura 9F).

[00587] Além disso, as respostas de anticorpo antidroga (ADA) para bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR em soro cinomolgo foram medidas (dados não mostrados). As respostas de ADA foram observadas em todos os animais exceto para os animais de 10 mg/kg do dia 15 em diante. TABELA 10 Características farmacocinética de bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR em macacos cinomolgos Os dados para cada macaco por grupo de dose são mostrados separadamente (número do macaco indicado acima da coluna).

Exemplo 13 - Identificação de aminoácidos CD20 envolvidos na ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20

[00588] Estudos anteriores indicaram que o resíduo de alanina na posição 170 (A170) e particularmente o resíduo de prolina na posição 172 (P172) na alça extracelular de CD20 são críticos para o reconhecimento de CD20 pelo rituximab (Polyak et al. 2002, Blood 99: 3256-3262; Perosa et al. 2005, Blood 107: 1070-1077). Rituximab perdeu completamente a ligação ao CD20 expresso em HEK293F na introdução das mutações A170S e P172S (“mutação AxP”) no domínio extracelular de CD20. O mAb B1 de camundongo também mostrou ligação fortemente reduzida ao mutante AxP, embora a ligação residual fosse observada. Ao contrário, a ligação de IgG1- 2F2, IgG1-7D8 e IgG1-2C6 à CD20 não foi afetada pela mutação AxP. Entretanto, a mudança dos resíduos de asparagina na posição 163 ou 166 no ácido aspártico (N163D ou N166D, respectivamente) anulou completamente a ligação de IgG1-2C6 e reduziu aquela de IgG1-2F2 e IgG1-7D8 em até 75 %. Um mutante triplo com uma mutação de treonina-para-lisina na posição 159 (T159K), além das mutações N163D e N166D (T159K/N163D/N166D, “mutação KDD”) anulou a ligação de 2F2, 7D8 e 2C6. A mutação KDD apenas teve um efeito modesto sobre a ligação de rituximab e B1 (Teeling et al. 2006, The Journal of Immunology 177: 362-371).

[00589] Para examinar a ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 à CD20 do tipo selvagem (wt), o mutante AxP e o mutante KDD, um vetor de expressão CD20 foi construído amplificando-se a sequência codificadora CD20 usando iniciadores adequados introduzindo sítios de restrição e uma sequência Kozak ideal para a expressão ideal. O fragmento amplificado foi digerido e ligado no vetor de expressão pEE12,4 (Lonza, Slough, UK). Depois da transformação na E. coli, as colônias foram triadas quanto aos insertos e dois clones foram selecionados para sequenciamento para confirmar a sequência correta. A construção foi denominada pEE12,4CD20HS-GA. A mutagênese foi realizada para introduzir as mutações AxP ou KDD nas regiões de alça extracelular de CD20 humana. A mutagênese foi checada pela digestão e sequenciamento da enzima de restrição. As construções foram transitoriamente expressas nas células HEK293F e analisadas 24 horas após a transfecção usando a citometria de fluxo.

[00590] Iniciadores Oligonucleotídicos de PCR: os iniciadores oligonucleotídicos foram sintetizados e quantificados pela Isogen BV (Maarssen, Países Baixos). Os iniciadores foram reconstituídos em água em uma concentração de 100 pmol/μL e armazenados a -20°C até o uso. Um sumário de PCR e iniciadores de sequenciamento é mostrado na Tabela 11.

[00591] Determinação da densidade óptica de ácidos nucleicos: a densidade óptica foi determinada usando um Ultrospec 2100 pro Classic (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida pela análise da OD260nm, onde uma unidade OD260nm = 50 μg/ml. A solução de referência foi idêntica à solução usada para dissolver os ácidos nucleicos.

[00592] Isolação de DNA plasmídico a partir da cultura de E. coli: O DNA plasmídico foi isolado de culturas da E. coli usando kits da Qiagen (Westburg BV, Leusden, Países Baixos), de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação de plasmídeo ‘volumosa’ um kit Hi-Speed Plasmid Maxi ou um kit Hi-Speed plasmid Midi foram usados (Qiagen). Para uma preparação de plasmídeo em escala pequena (isto é, 2 ml de cultura de E. coli) um Kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) foi usado e o DNA eluído em 50 μL de TE (Tris-HCl 10 mM de pH 8,0, EDTA 1 mM).

[00593] Amplificação pela PCR: As reações de PCR foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante para o Pfu-Turbo© Hotstart DNA Polymerase (Stratagene, Amsterdam, Países Baixos). Cada 20 ml de reação conteve 1 x tampão de reação de PCR, 200 mM de dNTPs mistos, 6,7 pmol de cada iniciador de avançado e reverso, aproximadamente 1 ng de DNA padrão e 1 unidade de Pfu-Turbo© Hotstart DNA polymerase. As reações de PCR foram realizadas em um Termociclador 96 de gradiente T (Biometra GmbH, Goettingen, Alemanha) usando um programa de 30 ciclos de: +95°C durante 2 min, seguido por 30 ciclos de: +95°C durante 30 s; recozimento: um gradiente de 45-65°C durante 30 s e extensão: +72°C durante 2 min, seguido por uma etapa de extensão final a 72°C por 10 min e armazenagem subsequente a 4°C. As reações completadas foram analisadas pela eletroforese em gel de agarose.

[00594] Eletroforese em gel de agarose: A eletroforese em gel de agarose foi realizada de acordo com Sambrook (Molecular Cloning Laboratory Manual, 3a edição) usando géis de 50 ml, em tampão 1 x Tris/ácido acético/EDTA (TAE). O DNA foi visualizado pela inclusão de brometo de etídio no gel e observação sob luz UV. As imagens de gel foram registradas por uma câmera CCD e um sistema de análise de imagem (GeneGnome; Syngene, Cambridge, UK).

[00595] Digestões com enzima de restrição: As enzimas de restrição foram fornecidas pela New England Biolabs (Beverly, MA) e usadas de acordo com as recomendações do fornecedor. No geral, 100 ng foram digeridos com 5 unidades de enzima(s) em tampão apropriado em um volume final de 10 ml. Os volumes de reação foram aumentados como apropriado. As digestões foram incubadas na temperatura recomendada pelo fabricante por um mínimo de 60 min.

[00596] Para fragmentos que requerem digestões duplas com enzimas de restrição que têm tampão incompatível ou exigências de temperatura, as digestões foram realizadas sequencialmente de modo a oferecer condições favoráveis para cada enzima por sua vez.

[00597] Tratamento com fosfatase alcalina: fosfatase alcalina de camarão (USB, Cleveland, OH) foi usada de acordo com as recomendações do fornecedor. A fosfatase alcalina remove grupos 5’-fosfato das extremidades de fragmentos de DNA prevenindo a autoligação. Isto é, de relevância particular quando a auto-religação de um fragmento de DNA resultaria em um vetor competente de replicação. A enzima é ativa na maioria dos tampões de enzima de restrição e foi adicionada como apropriado. Depois da digestão, a enzima foi inativada elevando-se a temperatura para 70°C por 15 min.

[00598] Purificação pela PCR e produtos de reação da enzima de restrição: A purificação foi realizada usando o kit mini-elute PCR Purification (fornecido pela Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as amostras de DNA foram diluídas em 5 volumes de tampão de ligação I (Qiagen) e carregadas em uma coluna de mini-eluição dentro de um tubo de centrífuga de Eppendorf. A montagem foi centrifugada em uma microcentrífuga de bancada. A coluna foi lavada duas vezes com tampão II (Qiagen): A seguir da aplicação de tampão, a montagem foi centrifugada e o fluxo foi descartado. A coluna foi secada pela centrifugação na ausência de tampão adicionado. O DNA foi eluído pela adição de tampão de elução à coluna e o eluído coletado pela centrifugação. O DNA isolado foi quantificado pela espectroscopia de UV e a qualidade avaliada pela eletroforese em gel de agarose.

[00599] Isolação de fragmentos de DNA a partir do gel de agarose: Onde apropriado (isto é, quando fragmentos múltiplos foram presentes), as amostras de DNA digeridas foram separadas pela eletroforese em gel e o fragmento desejado excisado do gel e recuperado usando o kit de extração em gel QIAEX II (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as faixas de DNA foram excisadas do gel de agarose e fundidas em um tampão apropriado a +55°C. A resina QIAEX II foi adicionada e incubada durante 5 min. A resina QIAEX II foi granulada por uma etapa de centrifugação curta (1 min, 14000 g, temperatura ambiente) e lavada duas vezes com 500 μL de tampão de lavagem PE (cat. no. 19065, Qiagen). O grânulo final foi secado em uma capela e o DNA foi eluído com o volume apropriado de TE e na temperatura apropriada (dependendo do tamanho do DNA).

[00600] Ligação de fragmentos de DNA: As ligações foram realizadas com o kit Quick Ligation (New England Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada ligação, o DNA vetorial foi misturado com um excesso molar de aproximadamente três vezes de DNA inserido tal que a quantidade total de DNA foi mais baixa do que 200 ng em 10 μL, com volume ajustado com água como apropriado. A isto foram adicionados 10 μL de 2 x Tampão Quick Ligation e 1 μL de Quick T4 DNA Ligase e a mistura de ligação foi incubada na temperatura ambiente durante 5-30 min.

[00601] Transformação de DNA em bactérias: As amostras de DNA foram usadas para transformar as células de E. coli competentes em One Shot DH5α-T1R (Invitrogen, Breda, Países Baixos) usando o método do choque térmico de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 1 a 5 μL de solução de DNA (tipicamente 2 μL de mistura de ligação de DNA) foram adicionados a uma alíquota de células bacterianas competentes em transformação e a mistura incubada em gelo durante 30 min. As células foram depois submetidas a choque térmico pela transferência para um banho de água a 42°C durante 30 segundos seguido por uma incubação adicional em gelo durante 5 min. As células foram deixadas recuperar pela incubação em um meio de cultura não seletivo (SOC) com agitação a 37°C por 1 hora e foram subsequentemente espalhadas sobre placas de ágar contendo agente seletivo apropriado (ampicilina a 50 μg/ml). As placas foram incubadas a +37°C durante 16-18 horas ou até que as colônias de bactérias se tornassem evidente.

[00602] Triagem de colônias bacterianas pela PCR: As colônias bacterianas foram triadas quanto à presença de vetores contendo as sequências desejadas usando a técnica da triagem de colônia pela PCR. 20 μL de mistura de reação pela PCR contendo 0,5 volume de Mistura HotStarTaq Master (Qiagen), 4 pmol dos iniciadores avançado e reverso e completados com água foi adicionado a um tubo PCR. Uma colônia foi levemente tocada com uma ponta de pipeta de 20 μL, uma vez tocada em 2 ml de LB em um tubo de cultura (para cultivar bactérias contendo o plasmídeo correspondente) e recolocadas em suspensão na mistura de PCR de 20 μL. A PCR foi realizada em um Tgradient Thermocicler 96 (Biometra) usando um programa de 35 ciclos de: +95°C durante 15 min, seguido por 35 ciclos de: +94°C durante 30 s, recozimento: 55°C durante 30 s e extensão: +72°C durante 2 min, seguido por uma etapa de extensão final a 72°C durante 10 min e armazenagem subsequente a 4°C. As reações completadas foram analisadas pela eletroforese em gel de agarose. Ver a Tabela 11 quanto aos detalhes de pares de iniciador usados para a PCR de colônia.

[00603] Sequenciamento de DNA: as amostras de DNA Plasmídico foram enviadas para a AGOWA (Berlin, Alemanha) para a análise de sequência. As sequências foram analisadas usando o pacote de software VetorNTI (Informax, Frederick, MD, USA).

[00604] Mutagênese: A mutagênese foi realizada, usando o kit de Mutagênese Loco-Dirigida QuikChange® XL (Cat 200517-5, Lote 1120630, Stratagene Europe) de acordo com as instruções do fabricante.

[00605] As reações de mutagênese foram concentradas usando precipitação com etanol e transformadas em células da E. coli competentes em DH5α-TIR de uma dose ou eletroporadas em Células Competentes em Eletroporação ElectroTen-Blue®. As colônias foram checadas pela PCR de colônia e digestão de restrição antes da transfecção.

[00606] Transfecção de célula HEK293F: As células HEK293F foram obtidas da Invitrogen e transfectadas de acordo com as instruções do fabricante, usando 293fectina.

[00607] Ligação de Anticorpo Anti-CD20: As células HEK293F foram absorvidas em tampão de tingimento (PBS suplementado com 0,1 % de BSA e 0,02 % de NaN3) e adicionadas às placas de fundo redondo (1-3 x 105/poço em 100 μL). Depois, 50 μL de anticorpo biespecífico CD3xCD20 foi adicionado, em diluições em série (0,0015-10 μg/ml, diluições de três vezes) (4°C, 30 min).

[00608] Depois de lavar duas vezes em tampão de tingimento, as células foram incubadas em 50 μL de anticorpo secundário a 4°C durante 30 min. Como um anticorpo secundário, IgG F(ab’)2 de cabra anti-ser humano conjugado à R-Ficoeritrina (PE) foi usada, como descrito acima. Em seguida, as células foram lavadas uma vez em tampão de tingimento, recolocadas em suspensão em 150 μL de tampão de tingimento e analisadas em um citômetro de fluxo (FACSCanto-720, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) e 10.000 eventos por amostra foram adquiridos em taxa de fluxo alta. As curvas de ligação foram analisadas usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando o software GraphPad Prism V75.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

[00609] Todos os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 ligaram eficientemente às células HEK293F que expressam CD20 WT (Figura 10A). Como mostrado na Figura 10B e Tabela 12, bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR e bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-2C6-FEAR ligaram eficientemente ao mutante AxP. Similarmente, bsIgG1-huCLB-3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1- huCLB-3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR e bsIgG1-huCLB-3/4-FEALxCD20- 11B8-FEAR mostrou ligação eficiente para CD20-AxP. Como esperado, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR perdeu completamente a ligação ao mutante AxP, como foi mostrado anteriormente para o anticorpo precursor IgG1-RTX. BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR mostrou ligação enormemente reduzida para CD20-AxP.

[00610] BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR, bsIgG1- huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR e bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-2C6-FEAR, assim como bsIgG1-huCLB-3/4-FEALxCD20- 7D8-FEAR e bsIgG1-huCLB-3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR perderam a ligação à CD20 na introdução das mutações KDD (Tabela 12), confirmando que estes anticorpos biespecíficos que se ligam monovalentemente à CD20, mostram características de ligação comparáveis aos anticorpos precursores IgG1-7D8, IgG1-2F2 e IgG1-2C6, respectivamente. BsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-11B8-FEAR e bsIgG1-huCLB-3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR perderam parcialmente a ligação à CD20 quando a mutação KDD foi presente. Tabela 12: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 aos mutantes de CD20.

[00611] A ligação de anticorpos biespecíficos CD3xCD20 aos mutantes de CD20 expressos em células HEK293F foi determinada pela citometria de fluxo. Os números indicam a porcentagem de ligação aos mutantes de CD20, em relação à ligação à CD20 do tipo selvagem, a 10 μg/ml. A porcentagem de ligação foi calculada pela seguinte formula: (ligação MFI ao mutante de CD20)/(ligação MFI à CD20 wt) x 100 %

Exemplo 14 - Determinação da afinidade de ligação de CD3 usando Interferometria de Bio-Camada

[00612] Para determinar a afinidade dos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 para CD3, a Interferometria de Bio-Camada foi realizada em um ForteBio Octet HTX. Biossensores de Captura de Fc Anti-Ser Humano (AHC) (ForteBio, Portsmouth, UK; cat no. 18-5060) foram carregados durante 600 s com os anticorpos biespecíficos CD3xCD20 (1 μg/ml), visando uma resposta de carga de 1 nm. Depois de uma linha de base (200 s), a associação (1000 s) e dissociação (2000 s) de CD3ε27-GSKa solúvel foram determinadas usando concentrações variando entre 1 nM e 1000 nM. A proteína CD3ε27-GSKa consiste do peptídeo CD3ε humano (aa1-27) fundido ao término N de uma LC capa (SEQ ID NO: 402). Para os cálculos, a massa molecular teórica de CD3ε27-GSKa com base na sequência de aminoácido foi usada, isto é, 27,1 kDa. Os experimentos foram realizados sob condições de agitação (1000 rpm) a 30°C.

[00613] Os dados foram analisados com o Software ForteBio Data Analysis v8.1, usando o modelo 1:1 e um ajuste global completo com tempo de associação de 1000 s e tempo de dissociação de 200 s. os traços de dados foram corrigidos pela subtração de uma curva de referência (anticorpos biespecíficos CD3xCD20 sem CD3ε27-GSKa), o eixo Y foi alinhado nos últimos 10 s da linha de base, e correção interetapa assim como filtração de Savitzky-Golay foram aplicados. Os traços de dados com uma resposta mais baixa do que 0,05 nm foram excluídos da análise.

[00614] As constantes de dissociação no equilíbrio (KD) dos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 foram todos dentro de 2 vezes da KD da molécula de IgG1-huCD3-H1L1-FEAL precursora. Tabela 13: Constantes de dissociação no equilíbrio (KD), taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (kdis) para anticorpos biespecíficos CD3xCD20 selecionados

Exemplo 15 - BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR induz a ativação de célula T na presença de células B

[00615] A capacidade dos anticorpos biespecíficos CD3xCD20 para induzir a ativação de células T, na presença de células B, foi testada incubando-se PBMC com bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR. A ativação de célula T foi avaliada medindo-se a expressão de CD69.

[00616] PBMC, isoladas de doadores saudáveis como descrito acima, foram adicionadas às placas de cultura de 96 poços de fundo redondo (Greiner bio-one, cat 650180; 100.000 células/poço) e incubadas com bsIgG1-huCD3- H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR diluídas em RPMI++ (concentração de anticorpo final 0,1 a 1000 ng/ml). O volume final em cada poço foi de 100 μL. IgG1-huCD3-H1L1-FEAL e IgG1-huCLB-T3/4-FEAL, ambos dos quais são anticorpos de IgG1 bivalentes específicos de CD3 com domínios Fc inativos, assim como o anticorpo de controle de isótipo IgG1-b12-FEAL foram incluídos como anticorpos de controle negativo. IgE-huCLB-T3/4, um anticorpo de IgE específico de CD3 bivalente que é conhecido induzir a ativação de células T, e IgG1-huCLB-T3/4-F405L, um anticorpo de IgG1 específico de CD3 bivalente com um domínio Fc ativo, foram incluídos como anticorpos de controle positivo. As PBMC foram incubadas com anticorpos (37°C, 5 % de CO2) durante 16-24 horas.

[00617] Para avaliar a ativação de célula T, PBMC foram lavadas duas vezes em tampão de tingimento e recolocadas em suspensão em tampão de tingimento (volume final de 50 μL) contendo anticorpo CD69 de camundongo anti-ser humano rotulado com APC (BD Pharmingen, cat 340560; diluição final 1:100) e anticorpo CD28 de camundongo anti-ser humano rotulado com PE (Milteny Biotech, cat 130-092-921; diluição final 1:40). Depois de 30 minutos a 4°C, as células foram lavadas duas vezes. As células foram recolocadas em suspensão em 150 μL de tampão de tingimento e analisadas usando um FACS Canto II (BD). A intensidade de fluorescência média de APC (CD69) foi avaliada dentro da população de células positivas de CD28. A CD28 foi usada como um marcador para identificar células T.

[00618] Como mostrado na Figura 11, bsIgG1-huCD3-H1L1- FEALxCD20-7D8-FEAR induziu a ativação dependente da dose de células T, como indicado por um aumento na expressão de CD69 em células T de sangue periférico. A ativação de célula T também foi observada depois da incubação com os anticorpos de controle positivos IgE-huCLB-T3/4 e IgG1- hu-CLB3/4-F405L. Ao contrário, os anticorpos de controle negativo IgG1- huCD3-H1L1-FEAL, IgG1-huCLB-T3/4-FEAL e IgG1-b12-FEAL não induziram a expressão de CD69.

Claims

1. Método para produzir um anticorpo biespecífico compreendendo um primeiro braço de ligação compreendendo (i) uma primeira cadeia pesada compreendendo uma primeira sequência variável de cadeia pesada (VH) e uma primeira sequência constante de cadeia pesada (CH), e uma primeira cadeia leve compreendendo um primeira sequência variável de cadeia leve (VL) e uma primeira sequência constante de cadeia leve (CL), e (ii) um segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada compreendendo uma segunda sequência variável de cadeia pesada (VH) e uma segunda sequência constante de cadeia pesada ( CH), e uma segunda cadeia leve compreendendo uma segunda sequência variável de cadeia leve (VL) e uma segunda sequência constante de cadeia leve (CL), em que, (i) o primeiro braço de ligação compreende uma primeira região de ligação ao antígeno que se liga ao CD3ε humano (épsilon), em que a referida primeira região de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH conforme estabelecido na SEQ ID NO:6, e uma sequência VL conforme estabelecido na SEQ ID NO:10, e (ii) o segundo braço de ligação compreendendo uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga ao CD20 humano, em que a referida segunda região de ligação ao antígeno compreende a sequência VH conforme estabelecido na SEQ ID NO:27 e a sequência VL conforme estabelecida na SEQ ID NO:27 :28, e em que, (iii) as referidas sequências constantes de cadeia pesada são sequências de IgG1 humana, em que tanto na primeira como na segunda cadeia pesada os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E e A, respectivamente , e em que o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na referida primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na referida segunda cadeia pesada, sendo as referidas posições de aminoácidos numeradas de acordo com a numeração da UE, e (iv) em que as regiões constantes da cadeia leve são regiões constantes da cadeia leve humana e o anticorpo biespecífico compreende um domínio constante da cadeia leve lambda de SEQ ID NO:29; caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de a) fornecer um primeiro anticorpo cultivando uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo: (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada do referido primeiro braço de ligação; (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve do referido primeiro braço de ligação; e purificar o referido primeiro anticorpo a partir do meio de cultura; b) fornecer um segundo anticorpo através do cultivo de uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo: (iii) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de cadeia pesada do referido segundo braço de ligação; (iv) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve do referido segundo braço de ligação; e purificar o referido segundo anticorpo a partir do meio de cultura; c) incubar o referido primeiro anticorpo juntamente com o referido segundo anticorpo sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram isomerização por ligação dissulfeto, e d) obtenção do referido anticorpo biespecífico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende a adição de um agente redutor.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende a adição de um agente redutor selecionado do grupo constituído por: 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutationa, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercaptoetanol.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende a adição de um agente redutor selecionado do grupo constituído por: 2- mercaptoetilamina, ditiotreitol e tris(2-carboxietil)fosfina.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende restaurar as condições para se tornarem não redutoras ou menos redutoras, por exemplo, pela remoção de um agente redutor.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é removido por dessalinização.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo anticorpos são anticorpos completos.