BR122024016283A2 - Moléculas de ligação a il27ralfa, seus usos, sequência de ácido nucleico, vetor recombinante viral ou não-viral, célula hospedeira, kits, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas biologicamente ativas compreendendo um anticorpo de domínio único (sdAb) que se liga especificamente ao domínio extracelular de IL27Rα humano, composições compreendendo tais anticorpos e métodos de uso dos mesmos.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório Norte-americano No. 63/061.562, depositado em 5 de agosto de 2020, Pedido Provisório Norte-americano No. 63/078.745, depositado em 15 de setembro de 2020, e Pedido Provisório Norte-americano No. 63/135.884, depositado em 11 de janeiro de 2021, cujas descrições estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e é incorporada por re ferência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 15 de setembro de 2021, é denominada 106249-1258380_SL.txt e tem 125.548 bytes de tamanho.

CAMPO DE INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a moléculas biologicamente ativas compreendendo um anticorpo de domínio único que se liga es pecificamente ao domínio extracelular do receptor IL27 alfa (IL27Rα), composições compreendendo tais anticorpos de domínio único e mé todos de uso dos mesmos.

ANTECEDENTES

[004] A citocina IL-27 é uma citocina heterodimérica que consiste em duas subunidades ligadas não covalentemente, p28 e EBI3. A su- bunidade p28 pertence à família de citocinas de feixe de 4 hélices, en quanto EBI3 é a forma mais curta possível de um receptor de citocina solúvel, com dois domínios típicos de ligação a citocinas (Pflanz S, et al., Immunity. 2002 Jun;16(6): 779-90).

[005] O receptor de interleucina-27 (IL27R) é um receptor de ci- tocina tipo I para interleucina-27 (IL27). IL27R é um heterodímero composto pela subunidade IL27Rα e glicoproteína 130 (IL6Rb). A IL27 é expressa por células apresentadoras de antígenos e induz a diferen ciação de diversas populações de células T no sistema imunológico. A ligação ao IL27 o IL27R inicia a sinalização intracelular de várias cina- ses da família Jak que induzem a fosforilação de STAT1 e STAT3. Nas células T ativadas, a IL27 sinaliza predominantemente através de STAT3 [23], enquanto nas células B de memória sinaliza predominan tementeatravés de STAT3. Demonstrou-se que IL27 possui proprie dadespró-inflamatórias e anti-inflamatórias e que a resposta de res-postapró- ou anti-inflamatória é influenciada pelo contexto da célula que expressa o IL27R.

[006] A subunidade IL27Rα (também conhecida como receptor TCCR- ou WSX-1) é a subunidade proprietária do receptor IL27. O IL27Rα maduro (menos peptídeo de sinal) é um polipeptídeo de 604 aminoácidos com um domínio extracelular de 484 aminoácidos. O do mínio extracelular de IL27Rα possui 5 domínios: D1-D5. D1 e D2 são os domínios primários de ligação de citocinas, enquanto os domínios de fibronectina tipo III (Fn3) D3, D4 e D5 estão envolvidos no reconhe cimento de ligantes em uma extensão muito menor. Com base em análises estruturais, os domínios Fn3 não contribuem para a ligação no complexo quando o ligante IL27 está ligado. Enquanto os domínios D1 e D2 são altamente conservados, a sequência dos domínios Fn3 é mais variável.

[007] A IL27 demonstra alta afinidade (nanomolar) pela subuni- dade IL27Ra. O complexo [IL27/IL27Rα] associa-se ao IL27Ra para completar o complexo de sinalização do receptor IL27. A ligação da gp130 ao complexo [IL27/IL27Rα] é muito mais fraca do que a intera ção entre IL-27 e IL-27R. (Pflanz S, et al., J Immunol. 2004 15 de feve reiro; 172(4):2225-31) que é um tanto convencional em relação às su- bunidades compartilhadas do receptor de citocina. O domínio D5 de IL-27R e o domínio D6 de gp130 se aproximam na membrana por causa da forma 'C' de cada receptor. Isso é necessário para o comple xo receptor desencadear a ligação de JAKs nos domínios intracelula res de ambos os receptores.

[008] Embora os anticorpos monoclonais sejam os reagentes mais amplamente utilizados para a detecção e quantificação de proteí nas, os anticorpos monoclonais são moléculas grandes de cerca de 150 kDa e seu tamanho pode potencialmente limitar seu uso em en saios com vários reagentes competindo pelo reconhecimento de epí- topos próximos. Uma classe única de imunoglobulina contendo um domínio de cadeia pesada e sem um domínio de cadeia leve (comu- mente referido como anticorpos de cadeia pesada (HCAbs) está pre sente em camelídeos, incluindo camelos dromedários, camelos bactri- anos, camelos bactrianos selvagens, lhamas, alpacas, vicunhas, e guanacos, bem como peixes cartilaginosos, como tubarões. A região de domínio variável isolada de HCAbs é conhecida como VHH (uma abreviação de “pesado-pesado variável” refletindo sua arquitetura) ou Nanobody® (Ablynx). Anticorpos VHH de domínio único possuem a vantagem do tamanho pequeno (~12-14 kD), aproximadamente um décimo do peso molecular de um anticorpo convencional da classe IgG de mamífero) que facilita a ligação dessas moléculas VHH a de terminantesantigênicos do alvo que podem ser inacessíveis a um IgG monoclonal convencional formato (Ingram et al., 2018). Além disso, os anticorpos de domínio único VHH são frequentemente caracterizados por alta estabilidade térmica, facilitando a distribuição farmacêutica para áreas geográficas onde a manutenção da cadeia de frio é difícil ou impossível. Essas propriedades, particularmente em combinação com métodos simples de descoberta de exibição de fagos que não re querem emparelhamento de cadeia pesada/leve (como é o caso dos anticorpos IgG) e fabricação simples (por exemplo, em sistemas de expressão bacteriana) tornam os anticorpos de domínio único VHH úteis em uma variedade de aplicações, incluindo o desenvolvimento de agentes de imagem e terapêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção fornece polipeptídeos que se ligam especificamente ao IL27Ra.

[0010] A presente invenção fornece polipeptídeos que se ligam especificamente ao domínio extracelular de IL27Ra.

[0011] A presente invenção fornece uma molécula de ligação ao IL27Ra que se liga especificamente ao domínio extracelular de IL27Ra humano (hIL27Ra).

[0012] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Ra compreende um anticorpo de domínio único (sdAb) que se liga especi ficamente ao domínio extracelular do IL27Ra humano.

[0013] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Ra é um sdAb, o sdAb compreendendo um conjunto de CDRs correspon dentes a CDR1, CDR2 e CDR3, conforme mostrado em uma linha da Tabela 1 abaixo.

[0014] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Ra compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 conforme descrito em uma linha da Tabela 1 abaixo, na qual a CDR1, CDR2 e CDR3 po dem cada uma, independentemente, compreender pelo menos 90 % (por exemplo, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) de identidade de sequência ou tem 0, 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos, alterações opcionalmente conservadoras de aminoá- cidos, em relação à sequência descrita em uma linha da Tabela 1 abaixo.

[0015] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Ra consiste em, opcionalmente consiste essencialmente em, ou opcio nalmente compreende um anticorpo de domínio único (sdAb) com pelo menos 80 %, alternativamente pelo menos 85 %, alternativamente pe lo menos 90 %, alternativamente pelo menos 95 %, alternativamente pelo menos 98 %, alternativamente pelo menos 99 % de identidade (ou sendo idêntico exceto por 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos que são opcio nalmente substituições conservadoras de aminoácidos) ou 100 % de identidade com uma sequência polipeptídica de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2-25, conforme mostrado na Tabela 1 abaixo.

[0016] Em algumas modalidades, os conjuntos anteriores de CDRs são incorporados em uma estrutura VHH humanizada para fornecer moléculas de ligação sdAb IL27Ra "humanizadas".

[0017] A invenção fornece ainda métodos de processos químicos ou recombinantes para a preparação das moléculas de ligação ao IL27Ra da presente invenção.

[0018] A invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam as moléculas de ligação ao IL27Ra. A Tabela 2 abaixo fornece exemplos de sequências de DNA que codificam moléculas de ligação ao IL27Ra conforme descrito neste documento.

[0019] Em algumas modalidades, o IL27Ra é o IL27Ra murino.

[0020] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao IL27Ra compreende um anticorpo de domínio único (sdAb) que se liga especificamente ao domínio extracelular do IL27Ra de camundongo ou murino (mIL27Ra).

[0021] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao IL27Ra é um sdAb, o sdAb compreendendo um conjunto de CDRs cor-respondentes a CDR1, CDR2 e CDR3, conforme mostrado em uma linha da Tabela 3 abaixo.

[0022] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Ra compreende uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 conforme descrito em uma linha da Tabela 3 abaixo, na qual a CDR1, CDR2 e CDR3 po dem cada uma, independentemente, compreender pelo menos 90 % (por exemplo, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) de identidade de sequência ou tem 0, 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos , alterações opcionalmente conservadoras de aminoá- cidos, em relação à sequência descrita em uma linha da Tabela 3 abaixo.

[0023] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Ra consiste em, opcionalmente consiste essencialmente em, ou opcio-nalmente compreende um anticorpo de domínio único (sdAb) com pelo menos 80 %, alternativamente pelo menos 85 %, alternativamente pe lo menos 90 %, alternativamente pelo menos 95 %, alternativamente pelo menos 98 %, alternativamente pelo menos 99 % de identidade (ou sendo idêntico exceto por 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos que opcional mentesão substituições conservadas) ou 100 % de identidade com uma sequência polipeptídica de qualquer uma das SEQ ID NOS: 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170 e 174 con forme mostrado na Tabela 3 abaixo.

[0024] Em algumas modalidades, os conjuntos anteriores de CDRs são incorporados em uma estrutura VHH humanizada para for-necermoléculas de ligação sdAb IL27Rα "humanizadas".

[0025] A invenção fornece ainda métodos de processos químicos ou recombinantes para a preparação das moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção.

[0026] A invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam as moléculas de ligação ao IL27Ra. A Tabela 4 abaixo fornece exemplos de sequências de DNA que codificam moléculas de ligação hIL27Ra conforme descrito na Tabela 3 acima

[0027] A invenção fornece ainda vetores virais e não virais recom- binantes compreendendo um ácido nucleico que codifica as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção ou as CDRs das molécu las de ligação ao IL27Rα da presente invenção.

[0028] A invenção fornece ainda células hospedeiras compreen dendo vetores virais e não virais recombinantes compreendendo um ácido nucleico as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente inven ção ou as CDRs das moléculas de ligação ao IL27Rα da presente in venção.

[0029] A invenção fornece ainda células hospedeiras compreen- dendo vetores virais e não virais recombinantes compreendendo um ácido nucleico, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente inven ção ou as CDRs das moléculas de ligação ao IL27Rα da presente in venção.

[0030] A descrição de outros kits compreendendo as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção.

[0031] Em outro aspecto, a presente invenção fornece construtos para a identificação de células que expressam o IL27Rα em que a mo-lécula de ligação ao IL27Rα é conjugada a um ou mais agentes de imagem, opcionalmente através de um ligante químico ou polipeptídi- co. A invenção fornece ainda métodos de uso do anterior na identifica ção de células que expressam o IL27Rα em um indivíduo, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da molécu la de ligação ao IL27Rα conjugada ao agente de imagem a um indiví duo em necessidade de tratamento e avaliação do sujeito quanto à presença do agente de imagem que é conjugado com a molécula de ligação ao IL27Rα.

[0032] Em outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao IL27Rα que foram modificadas para duração prolongada de ação in vivo, em que a molécula de ligação ao IL27Rα é conjugada a uma ou mais moléculas transportadoras.

[0033] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao IL27Rα compreendendo uma sequência polipeptídica que se liga es-pecificamente ao domínio extracelular do IL27Rα e métodos de uso dos mesmos no isolamento, depleção ou enriquecimento de células que expressam IL27Rα em uma amostra biológica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Introdução

[0034] Para que a presente invenção seja mais facilmente com preendida, certos termos e frases são definidos abaixo, bem como ao longo do relatório descritivo. As definições aqui fornecidas não são li- mitantes e devem ser lidas tendo em vista o conhecimento de alguém versado na técnica.

[0035] Antes que os presentes métodos e composições sejam descritos, deve-se entender que esta descrição não está limitada a de-terminadométodo ou composição descrita, pois tal pode, é claro, vari ar.

[0036] Quando uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre os limites superior e inferior dessa faixa também é especificamente descrito. Ca da intervalo menor entre qualquer valor declarado ou valor intermediá rio em um intervalo declarado e qualquer outro valor declarado ou in termediário nesse intervalo declarado está incluído na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser incluídos ou excluídos independentemente da faixa, e cada faixa em que um, nenhum ou ambos os limites estão incluídos nas faixas menores tam bém está incluída na invenção, sujeita a qualquer limite especificamen teexcluído na intervalo declarado. Onde o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos também estão incluídos na invenção.

[0037] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc nicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que comu- mente entendido por alguém versado na técnica a que pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, alguns métodos e materiais po-tenciais e preferidos são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as pu- blicações são citadas.

[0038] Deve-se notar que, quando usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)"in cluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula"inclui uma pluralidade de tais células e a referência a "o peptídeo"inclui referên cia a um ou mais peptídeos e seus equivalentes, por exemplo, polipep- tídeos, conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.

[0039] As publicações aqui discutidas são fornecidas apenas para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente in venção não tem o direito de anteceder tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas po dem ser diferentes das datas de publicação reais, que podem precisar ser confirmadas de forma independente.

[0040] Será apreciado que ao longo desta descrição é feita refe rência a aminoácidos de acordo com a letra única ou códigos de três letras. Para conveniência do leitor, os códigos de aminoácidos de uma e três letras são fornecidos na Tabela 5 abaixo:

[0041] Métodos padrão em biologia molecular são descritos na lite raturacientífica (veja, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Mole cular Cloning, 3aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; e Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Mo lecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y., que descreve a clonagem em células bacterianas e mutagênese de DNA (Vol. 1), clonagem em células de mamíferos e leveduras (Vol. 2), glicoconjugados e expressão de proteínas (Vol. 3) e bioinformática (Vol. 4)). A literatura científica descreve métodos para purificação de proteínas, incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização, bem como análise química, modificação química, modificação pós-translacional, produção de proteínas de fu são e glicosilação de proteínas (veja, por exemplo, Coligan, e outros (2000) Current Protocols in Protein Science, Vols. 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NY).

Definições

[0042] Salvo indicação em contrário, os seguintes termos desti nam-se a ter o significado estabelecido abaixo. Outros termos são de-finidos em outro lugar ao longo da especificação.

[0043] Ativar: Quando usado neste documento, o termo "ativar" é usado em referência a um receptor ou complexo receptor para refletir um efeito biológico, diretamente e/ou pela participação em uma casca ta de sinalização multicomponente, decorrente da ligação de um ligan- te agonista a um receptor responsivo à ligação do ligante.

[0044] Atividade: Quando usado neste documento, o termo "ativi dade" é usado em relação a uma molécula para descrever uma propri-edade da molécula em relação a um sistema de teste (por exemplo, um ensaio) ou propriedade biológica ou química (por exemplo, o grau de ligação da molécula a outra molécula) ou de uma propriedade física de um material ou célula (por exemplo, modificação do potencial da membrana celular). Exemplos de tais funções biológicas incluem, mas não estão limitadas à atividade catalítica de um agente biológico, a ca-pacidade de estimular a sinalização intracelular, a expressão gênica, a proliferação celular, a capacidade de modular a atividade imunológica, como a resposta inflamatória. "Atividade" é tipicamente expressa como um nível de atividade biológica por unidade de agente testado, como [atividade catalítica]/[mg de proteína], [atividade imunológica]/[mg de proteína], unidades internacionais (UI) de atividade, [fosforilação de STAT5]/[mg de proteína], [proliferação]/[mg de proteína], unidades formadoras de placas (pfu), etc. Quando usado neste documento, o termo atividade proliferativa refere-se a uma atividade que promove proliferação e replicação celular, incluindo divisão celular desregulada, como como o observado em doenças neoplásicas, doenças inflamató rias, fibrose, displasia, transformação celular, metástase e angiogêne- se.

[0045] Administrar/Administração: Os termos "administração" e "administrar" são usados de forma intercambiável neste documento para se referir ao ato de entrar em contato com um indivíduo, incluindo o contato com uma célula, tecido, órgão ou fluido biológico do indiví duo in vitro, in vivo ou ex vivo com um agente (por exemplo, uma mo-lécula de ligação ao IL27Rα ou uma célula modificada que expressa uma molécula de ligação ao IL27Rα, um agente quimioterapêutico, um anticorpo ou uma formulação farmacêutica compreendendo um ou mais dos anteriores). A administração de um agente pode ser conse guida através de qualquer um dentre uma variedade de métodos reco nhecidos na técnica, incluindo, entre outros, administração tópica, inje ção intravascular (incluindo infusão intravenosa ou intra-arterial), inje ção intradérmica, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intracraniana, injeção intratumoral, transdérmi- ca, transmucosa, administração iontoforética, injeção intralinfática, in fusão intragástrica, injeção intraprostática, infusão intravesical (por exemplo, bexiga), inalação (por exemplo, inaladores respiratórios, in cluindo inaladores de pó seco), injeção intraocular, injeção intra abdominal, injeção intralesional, injeção intraovariana, infusão ou inje ção intracerebral, injeção intracerebroventricular (ICVI) e semelhantes. O termo "administração" inclui o contato de um agente com a célula, tecido ou órgão, bem como o contato de um agente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula, tecido ou órgão.

[0046] Afinidade: Quando usado neste documento, o termo "afini dade" refere-se ao grau de ligação específica de uma primeira molécu la (por exemplo, um ligante) a uma segunda molécula (por exemplo, um receptor) e é medida pela constante de dissociação de equilíbrio KD, uma relação entre a constante de taxa de dissociação entre a mo lécula e seu alvo (koff) e a constante de taxa de associação entre a mo lécula e seu alvo (kon).

[0047] Agonista: Quando usado neste documento, o termo "ago- nista" refere-se a um primeiro agente que se liga especificamente a um segundo agente ("alvo") e interage com o alvo para causar ou promo ver um aumento na ativação do alvo. Em alguns casos, os agonistas são ativadores de proteínas receptoras que modulam a ativação celu lar, aumentam a ativação, sensibilizam as células para ativação por um segundo agente ou regulam positivamente a expressão de um ou mais genes, proteínas, ligantes, receptores, vias biológicas, que po dem resultam em proliferação celular ou vias que resultam na parada do ciclo celular ou morte celular, como por apoptose. Em algumas mo dalidades, um agonista é um agente que se liga a um receptor e altera o estado do receptor, resultando em uma resposta biológica que imita o efeito do ligante endógeno do receptor. O termo "agonista" inclui agonistas parciais, agonistas totais e superagonistas. Um agonista po de ser descrito como um "agonista total" quando esse agonista leva a uma resposta biológica substancialmente completa (ou seja, a respos ta associada à interação ligante/receptor de ocorrência natural) induzi da pelo receptor em estudo ou um agonista parcial. Um "superagonis- ta" é um tipo de agonista que pode produzir uma resposta máxima maior do que o agonista endógeno para o receptor alvo e, portanto, possui uma atividade de mais de 100 % do ligante nativo. Um super agonista é tipicamente uma molécula sintética que exibe maior que 110 %, alternativamente maior que 120 %, alternativamente maior que 130 %, alternativamente maior que 140 %, alternativamente maior que 150 %, alternativamente maior que 160 % ou alternativamente maior que 170 % da resposta em um parâmetro quantitativo ou qualitativo avaliável da forma natural da molécula quando avaliada em concentra ções semelhantes em um ensaio comparável. Deve-se notar que os efeitos biológicos associados ao agonista total podem diferir em grau e/ou tipo dos efeitos biológicos dos parciais ou superagonistas. Em contraste com os agonistas, os antagonistas podem se ligar especifi-camente a um receptor, mas não resultam na cascata de sinal tipica-mente iniciada pelo receptor e podem modificar as ações de um ago- nista naquele receptor. Os agonistas inversos são agentes que produ-zem uma resposta farmacológica com direção oposta a de um agonis- ta.

[0048] Antagonista: Quando usado neste documento, o termo "an tagonista" ou "inibidor" refere-se a uma molécula que se opõe à(s) ação(ões) de um agonista. Um antagonista previne, reduz, inibe ou neutraliza a atividade de um agonista, e um antagonista também pode prevenir, inibir ou reduzir a atividade constitutiva de um alvo, por exemplo, um receptor alvo, mesmo quando não há agonista identifica do. Os inibidores são moléculas que diminuem, bloqueiam, impedem, retardam a ativação, inativam, dessensibilizam ou regulam negativa-mente, por exemplo, um gene, proteína, ligante, receptor, via biológica, incluindo uma via de ponto de controle imune ou célula.

[0049] Anticorpo: Quando usado neste documento, o termo "anti corpo" refere-se coletivamente a: (a) uma imunoglobulina glicosilada ou não glicosilada que se liga especificamente à molécula alvo e (b) derivados de imunoglobulina da mesma, incluindo, entre outros, frag-mentos de anticorpo como anticorpos de domínio único. Em algumas modalidades, o derivado de imunoglobulina compete com a imunoglo- bulina da qual foi derivado pela ligação à molécula alvo. O termo anti-corpo não está restrito a imunoglobulinas derivadas de qualquer espé cie particular e inclui murinos, humanos, equinos, camelídeos, anticor pos de peixes cartilaginosos incluindo, mas não limitados a, tubarões. O termo "anticorpo" abrange anticorpos isoláveis de fontes naturais ou de animais após a imunização com um antígeno e também anticorpos modificados, incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos biespecífi- cos, triespecíficos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, enxertados com CDR, folheados, ou anticorpos desimunizados (por exemplo, para remover epítopos de células T), camelizados (no caso de VHHs) ou moléculas compreendendo domí nios de ligação de anticorpos (por exemplo, CDRs) em andaimes não imunoglobulina. O termo "anticorpo"não deve ser interpretado como limitado a qualquer meio particular de síntese e inclui anticorpos de ocorrência natural isoláveis de fontes naturais e também moléculas de anticorpos modificados que são preparados por meios "recombinan- tes", incluindo anticorpos isolados de animais transgênicos que são transgênicos para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir deles, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada com um construto de ácido nucleico que resulta na ex-pressão de um anticorpo, anticorpos isolados de uma biblioteca com-binatória de anticorpos incluindo bibliotecas de exibição de fagos. Em uma modalidade, um "anticorpo" é uma imunoglobulina de mamífero da classe IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, o anti corpo é um "anticorpo de comprimento total" compreendendo domínios variáveis e constantes que fornecem funções de ligação e efetoras. O termo "anticorpo de domínio único" (sdAb), quando usado neste do-cumento, refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em um domínio de anticorpo variável monomérico que é capaz de se ligar es-pecificamente a um antígeno e competir pela ligação com o anticorpo parental do qual é derivado. O termo "anticorpo de domínio único" in clui moléculas scFv e VHH. Quando usado neste documento, o termo "VHH" refere-se a um anticorpo de domínio único derivado do anticor po camelídeo tipicamente obtido da imunização de camelídeos (inclu indo camelos, lhamas e alpacas (veja, por exemplo, Hamers- Casterman, et al. (1993) Nature 363: 446-448). VHHs também são re feridos como anticorpos de cadeia pesada ou Nanobodies® como an ticorpos de domínio único também podem ser derivados de fontes não mamíferas, como VHHs obtidos da imunização de anticorpos IgNAR de peixes cartilaginosos, incluindo, entre outros, tubarões.

[0050] Amostra Biológica: Quando usado neste documento, o ter mo"amostra biológica" ou "amostra" refere-se a uma amostra obtida (ou derivada) de um indivíduo. A título de exemplo, uma amostra bio lógica compreende um material selecionado do grupo constituído por fluidos corporais, sangue, sangue total, plasma, soro, secreções mu cosas, saliva, líquido cefalorraquidiano (CSF), líquido de lavagem broncoalveolar (BALF), fluidos do olho (por exemplo, fluido vítreo, hu mor aquoso), fluido linfático, tecido do nódulo linfático, tecido do baço, medula óssea, tecido tumoral, incluindo enriquecido com imunoglobu- lina ou frações enriquecidas específicas do tipo de célula derivadas de um ou mais desses tecidos.

[0051] Célula IL27Rα: Os termos "célula IL27Rα", "célula que ex pressaIL27Rα", "célula positiva para IL27Rα"e célula "IL27Rα+"são usados de forma intercambiável neste documento para se referir a uma célula que expressa e exibe o antígeno IL27Rα no superfície ex- tracelular da membrana celular. Da mesma forma, os termos "célula negativa para IL27Rα", "células IL27Rα-"são usados de forma inter- cambiável neste documento para descrever células que não expres sam ou exibem o antígeno IL27Rα na superfície celular.

[0052] CDR: Quando usado neste documento, o termo "CDR" ou "região determinante de complementaridade" destina-se a significar os sítios de combinação de antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável de ambos os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia pesada e leve. As CDRs foram descritas por Kabat et al., J. Bi ol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, et al., U.S. Dept. of Health and Human Services publication entitled “Sequências of proteins of immunological interest” (1991) (também aqui referido como “Kabat 1991” ou “Kabat”); por Chothia, et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 (também aqui referido como “Chothia”); e MacCallum, et al. (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745, onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados entre si. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou anticorpos enxertados ou variantes dos mesmos deve estar dentro do escopo do termo conforme definido e usado aqui. No contexto da presente invenção, a menos que especifi cado de outra forma, a numeração das posições CDR é fornecida de acordo com o Kabat ou um híbrido de convenção de numeração de Kabat e Chothia.

[0053] Comparável: Quando usado neste documento, o termo "comparável" é usado para descrever o grau de diferença em duas medições de um parâmetro quantitativo ou qualitativo avaliável. Por exemplo, onde uma primeira medição de um parâmetro quantitativo avaliável e uma segunda medição do parâmetro avaliável não se des viam além de um intervalo que o versado na técnica reconheceria co mo não produzindo uma diferença estatisticamente significativa no efeito entre os dois resultados nas circunstâncias, o duas medições seriam consideradas “comparáveis”. Em alguns casos, as medições podem ser consideradas “comparáveis” se uma medição se desviar da outra em menos de 35 %, alternativamente em menos de 30 %, alter nativamente em menos de 25 %, alternativamente em menos de 20 %, alternativamente em menos de 15 %, alternativamente em menos de 10 %, alternativamente em menos de 7 %, alternativamente em menos de 5 %, alternativamente em menos de 4 %, alternativamente em me nos de 3 %, alternativamente em menos de 2 % ou em menos de 1 %. Em modalidades particulares, uma medição é comparável a um pa drão de referência se ela se desviar em menos de 15 %, alternativa mente em menos de 10 % ou alternativamente em menos de 5 % do padrão de referência.

[0054] Substituição conservadora de aminoácidos: Quando usado neste documento, o termo "substituição conservadora de aminoácidos" refere-se a uma substituição de aminoácidos que altera um determina do aminoácido para um aminoácido diferente com propriedades bio químicas semelhantes (por exemplo, carga, hidrofobicidade e tama nho). Por exemplo, os aminoácidos em cada um dos seguintes grupos podem ser considerados aminoácidos conservativos uns dos outros: (1) aminoácidos hidrofóbicos: alanina, isoleucina, leucina, triptofano, fenilalanina, valina, prolina e glicina; (2) aminoácidos polares: glutami- na, asparagina, histidina, serina, treonina, tirosina, metionina e cisteí- na; (3) aminoácidos básicos: lisina e arginina; e (4) aminoácidos áci dos: ácido aspártico e ácido glutâmico.

[0055] Derivado de: Quando usado neste documento, o termo "de rivado de", no contexto de uma sequência de aminoácidos, significa indicar que o polipeptídeo ou ácido nucleico tem uma sequência base ada na de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência e não pre tende ser limitante quanto à fonte ou método no qual a proteína ou ácido nucleico é produzido. A título de exemplo, o termo “derivado de” inclui homólogos ou variantes de aminoácidos de referência ou se quências de DNA.

[0056] Concentração Eficaz (EC): Quando usados neste documen to, os termos "concentração efetiva" ou sua abreviatura “EC” são usa dos de forma intercambiável para se referir à concentração de um agente em uma quantidade suficiente para efetuar uma alteração em um determinado parâmetro em um sistema de teste. A abreviatura “E” refere-se à magnitude de um determinado efeito biológico observado em um sistema de teste quando esse sistema de teste é exposto a um agente de teste. Quando a magnitude da resposta é expressa como um fator da concentração (“C”) do agente de teste, a abreviatura “EC” é usada. No contexto dos sistemas biológicos, o termo Emax refere-se à magnitude máxima de um determinado efeito biológico observado em resposta a uma concentração de saturação de um agente de teste de ativação. Quando a abreviatura EC é fornecida com um subscrito (por exemplo, EC40, EC50, etc.), o subscrito refere-se à porcentagem do Emáx da resposta biológica observada naquela concentração. Por exemplo, a concentração de um agente de teste suficiente para resul tar na indução de um parâmetro biológico mensurável em um sistema de teste que é 30 % do nível máximo de tal parâmetro biológico men surável em resposta a tal agente de teste, isso é referido como o “EC30” do agente de teste em relação a tal parâmetro biológico. Da mesma forma, o termo "EC100"é usado para denotar a concentração efetiva de um agente que resulta na resposta máxima (100 %) de um parâmetro mensurável em resposta a tal agente. Da mesma forma, o termo EC50 (que é comumente usado no campo da farmacodinâmica) refere-se à concentração de um agente suficiente para resultar na alte ração de metade do máximo (cerca de 50 %) no parâmetro mensurá vel. O termo "concentração de saturação"refere-se à quantidade má ximapossível de um agente de teste que pode se dissolver em um vo lume padrão de um solvente específico (por exemplo, água) sob con dições padrão de temperatura e pressão. Em farmacodinâmica, uma concentração de saturação de um fármaco é tipicamente usada para denotar a concentração suficiente do fármaco de modo que todos os receptores disponíveis sejam ocupados pelo fármaco, e EC50 é a con centração do fármaco para produzir o efeito de metade do máximo.

[0057] Enriquecido: Quando usado neste documento, o termo "en riquecido" refere-se a uma amostra que não é modificada naturalmente de modo que uma espécie (por exemplo, uma molécula ou célula) de interesse esteja presente em: (a) uma concentração maior (por exem plo, pelo menos 3 vezes maior, alternativamente pelo menos 5 vezes maior, alternativamente pelo menos 10 vezes maior, alternativamente pelo menos 50 vezes maior, alternativamente pelo menos 100 vezes maior, ou alternativamente pelo menos 1000 vezes maior) do que a concentração da espécie na amostra inicial, tal como uma amostra bio-lógica (por exemplo, uma amostra na qual a molécula ocorre natural-mente ou na qual está presente após a administração); ou (b) uma concentração maior do que o ambiente em que a molécula foi produzi da (por exemplo, uma bactéria modificada de forma recombinante ou célula de mamífero).

[0058] Domínio extracelular: Quando usado neste documento, o termo "domínio extracelular" ou sua abreviatura "ECD" refere-se à por ção de uma proteína de superfície celular (por exemplo, um receptor de superfície celular) que é externa à membrana plasmática de uma célula. A proteína da superfície celular pode ser uma proteína trans- membranar, uma superfície celular ou proteína associada à membra na.

[0059] Identidade: O termo "identidade", tal como aqui utilizado em referência a sequências polipeptídicas ou de DNA, refere-se à identi dade da sequência de subunidades entre duas moléculas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica (ou seja, o mesmo resíduo de amino- ácido ou nucleotídeo), então as moléculas são idênticas nessa posi ção. A semelhança entre dois aminoácidos ou duas sequências de nu- cleotídeos é uma função direta do número de posições idênticas. Em geral, as sequências são alinhadas de modo que a correspondência de ordem mais alta seja obtida. Se necessário, a identidade pode ser calculada usando técnicas publicadas e programas de computador amplamente disponíveis, como algoritmos BLAST 2.0, descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul, et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. O software para realizar análises BLAST está disponível publicamente no site do National Center for Bi- otechnology Information (NCBI). O algoritmo envolve primeiro a identi-ficação de pares de sequência de alta pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W da sequência de consulta, que cor-respondem ou satisfazem alguma pontuação de limite de valor positivo “T” quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em um banco de dados sequência. T é referido como o limiar de pontua ção de palavras da vizinhança (Altschul, et al., supra). Essas ocorrên cias iniciais de palavra da vizinhança atuam como sementes para ini ciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos que as contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência até onde a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são cal-culadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros “M” (a pontuação de recompensa para um par de resíduos corresponden tes; sempre >0) e “N” (a pontuação de penalidade para resíduos in-compatíveis; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma ma triz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A ex tensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quan do: (a) a pontuação cumulativa do alinhamento cai na quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou (b) o final de qualquer sequência é alcan çado. Os parâmetros do algoritmo BLAST “W”, “T” e “X” determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) funciona de maneira semelhante, mas usa como padrão um tamanho de palavra (“W”) de 28, uma ex pectativa (“E”) de 10, M=1, N=-2 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como pa drão um tamanho de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, (1989) PNAS(USA) 89:10915- 10919).

[0060] Em uma quantidade suficiente para efetuar uma resposta: Conforme usado aqui, a frase "em uma quantidade suficiente para causar uma resposta" é usada em referência à quantidade de um agente de teste suficiente para fornecer uma alteração detectável no nível de um indicador medido antes (por exemplo, um nível de linha de base) e após o aplicação de um agente de teste a um sistema de tes te. Em algumas modalidades, o sistema de teste é uma célula, tecido ou organismo. Em algumas modalidades, o sistema de teste é um sis tema de teste in vitro, como um ensaio fluorescente. Em algumas mo dalidades, o sistema de teste é um sistema in vivo que envolve a me dição de uma alteração no nível de um parâmetro de uma célula, teci do ou organismo que reflete uma função biológica antes e depois da aplicação do agente de teste à célula, tecido ou organismo. Em algu mas modalidades, o indicador reflete a função biológica ou estado de desenvolvimento de uma célula avaliada em um ensaio em resposta à administração de uma quantidade do agente de teste. Em algumas modalidades, o sistema de teste envolve a medição de uma mudança no nível de um indicador de uma célula, tecido ou organismo que refle te uma condição biológica antes e depois da aplicação de um ou mais agentes de teste à célula, tecido ou organismo. O termo "em uma quantidade suficiente para efetuar uma resposta" pode ser suficiente para ser uma quantidade terapeuticamente eficaz, mas também pode ser maior ou menor que uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[0061] Inibidor: Quando usado neste documento, o termo "inibidor" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, impede, retarda a ati-vação de, inativa, dessensibiliza ou regula negativamente, por exem plo, um gene, proteína, ligante, receptor ou célula. Um inibidor também pode ser definido como uma molécula que reduz, bloqueia ou inativa uma atividade constitutiva de uma célula ou organismo.

[0062] Domínio intracelular: Quando usado neste documento, o termo "domínio intracelular" ou sua abreviatura "ICD" refere-se à por ção de uma proteína de superfície celular (por exemplo, um receptor de superfície celular) que está dentro da membrana plasmática de uma célula. O ICD pode incluir toda a porção citoplasmática de uma proteína transmembranar ou proteína associada à membrana, ou pro teína intracelular.

[0063] Isolado: Quando usado neste documento, o termo "isolado" é usado em referência a um polipeptídeo de interesse que, se ocorrer naturalmente, está em um ambiente diferente daquele em que pode ocorrer naturalmente. "Isolado" pretende incluir polipeptídeos que es tão dentro de amostras que são substancialmente enriquecidas para o polipeptídeo de interesse e/ou em que o polipeptídeo de interesse é parcialmente ou substancialmente purificado. Onde o polipeptídeo não ocorre naturalmente, "isolado" indica que o polipeptídeo foi separado de um ambiente no qual foi sintetizado, por exemplo, isolado de uma cultura de células recombinantes compreendendo células modificadas para expressar o polipeptídeo ou por uma solução resultante da fase sólida meios sintéticos.

[0064] Numeração de Kabat: O termo "numeração de Kabat", quando usado neste documento, é reconhecido na técnica e refere-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis do que outros resíduos de aminoácidos (por exemplo, hipervariável) nas regiões de cadeia pesada e leve de imunoglobulinas (Kabat, et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93; Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). O termo "Numeração de Chothia", quando usado neste do cumento, é reconhecido na técnica e refere-se a um sistema de nume ração de resíduos de aminoácidos com base na localização das regi- ões de alça estrutural (Chothia et al. 1986, Science 233:755-758; Chothia & Lesk 1987, JMB 196:901-917; Chothia et al. 1992, JMB 227:799-817). Para os fins da presente invenção, a menos que especi-ficamente identificado, o posicionamento das CDRs 2 e 3 na região variável de um anticorpo segue a numeração de Kabat ou simples-mente"Kabat". O posicionamento de CDR1 na região variável de um anticorpo segue um híbrido de esquemas de numeração de Kabat e Chothia.

[0065] Ligante: Quando aqui utilizado, o termo “ligante” refere-se a uma molécula que se liga especificamente a um receptor e provoca uma alteração no receptor de modo a efectuar uma alteração na acti- vidade do receptor ou uma resposta na célula que expressa esse re ceptor. Em uma modalidade, o termo "ligante" refere-se a uma molécu la ou complexo da mesma que pode atuar como agonista ou antago nista de um receptor. Quando aqui utilizado, o termo “ligante” abrange ligantes naturais e sintéticos. "Ligante" também abrange pequenas mo léculas, peptídeos miméticos de citocinas e anticorpos. O complexo de um ligante e receptor é denominado "complexo ligante-receptor". Um ligando pode compreender um domínio de uma poliproteína ou proteí na de fusão (por exemplo, qualquer domínio de uma proteína de fusão anticorpo/ligante).

[0066] Modular: Quando usados neste documento, os termos "mo dular","modulação" e semelhantes referem-se à capacidade de um agente de teste para causar uma resposta, positiva ou negativa ou di reta ou indiretamente, em um sistema, incluindo um biológico sistema ou via bioquímica. O termo modulador inclui agonistas (incluindo ago- nistas parciais, agonistas totais e superagonistas) e antagonistas.

[0067] Ácido Nucleico: Os termos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleotídeo" e semelhantes são usados neste do-cumento de forma intercambiável para se referir a uma forma poliméri- ca de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou seus análogos. Exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem ácidos nucleicos lineares e circulares, RNA mensageiro (mRNA), DNA complementar (cDNA), polinucleotídeos recombinantes, vetores, sondas, iniciadores e semelhantes.

[0068] Ligado operavelmente: O termo "ligado operavelmente" é usado neste documento para se referir à relação entre moléculas, tipi-camente polipeptídeos ou ácidos nucleicos, que são dispostos em um construto de modo que cada uma das funções das moléculas compo-nentes seja retida, embora o funcionamento a ligação pode resultar na modulação da atividade, positiva ou negativamente, dos componentes individuais do construto. Por exemplo, a ligação operável de uma mo-lécula de polietileno glicol (PEG) a uma proteína tipo selvagem pode resultar em um construto em que a atividade biológica da proteína é diminuída em relação à molécula tipo selvagem, no entanto, os dois são considerados operavelmente vinculado. Quando o termo "opera- velmente ligado" é aplicado à relação de múltiplas sequências de áci dos nucleicos que codificam diferentes funções, as múltiplas sequên cias de ácidos nucleicos quando combinadas em uma única molécula de ácido nucleico que, por exemplo, quando introduzida em uma célula usando tecnologia recombinante, fornece um ácido nucleico que é ca paz de efetuar a transcrição e/ou translação de uma sequência de áci do nucleico particular em uma célula. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência sinal pode ser considerada operavelmente ligada ao DNA que codifica um polipeptídeo se resultar na expressão de uma pré-proteína pela qual a sequência sinal facilita a secreção do polipeptídeo; um promotor ou realçador é considerado operavelmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma é con siderado operavelmente ligado a uma sequência de codificação se es- tiver posicionado de modo a facilitar a translação. Geralmente, no con-texto de moléculas de ácido nucleico, o termo "ligado operavelmente" significa que as sequências de ácido nucleico sendo ligadas são contí-guas e, no caso de um líder secretor ou subdomínios associados de uma molécula, contíguas e em fase de leitura. No entanto, certos ele-mentosgenéticos, como realçadores, podem funcionar à distância e não precisam ser contíguos em relação à sequência à qual fornecem seu efeito, mas, no entanto, podem ser considerados operavelmente ligados.

[0069] Polipeptídeo origem: quando usados neste documento, os termos "polipeptídeo origem" ou "proteína origem" são usados de for ma intercambiável para designar a fonte de um segundo polipeptídeo (por exemplo, um derivado, muteína ou variante) que é modificado em relação a um primeiro polipeptídeo “origem”. Em alguns casos, o poli- peptídeo origem é uma forma de proteína tipo selvagem ou de ocor rência natural. Em alguns casos, o polipeptídeo origem pode ser uma forma modificada de uma proteína de ocorrência natural que é posteri ormente modificada. O termo "polipeptídeo origem" pode referir-se ao próprio polipeptídeo ou composições que compreendem o polipeptídeo origem (por exemplo, formas glicosiladas ou PEGiladas e/ou proteínas de fusão compreendendo o polipeptídeo origem).

[0070] Agonista parcial: Quando usado neste documento, o termo "agonista parcial" refere-se a uma molécula que se liga especificamen te a um determinado receptor e o ativa, mas possui apenas ativação parcial do receptor em relação a um agonista total. Os agonistas par ciais podem apresentar efeitos agonísticos e antagonistas. Por exem plo, quando um agonista total e um agonista parcial estão presentes, o agonista parcial atua como um antagonista competitivo, competindo com o agonista total pela ligação ao receptor, resultando em diminui ção líquida na ativação do receptor em relação ao contato do receptor com o agonista total. na ausência do agonista parcial. Os agonistas parciais podem ser usados para ativar os receptores para produzir uma resposta submáxima desejada em um indivíduo quando estão presentes quantidades inadequadas do ligante endógeno, ou podem reduzir a superestimulação dos receptores quando estão presentes quantidades excessivas do ligante endógeno. A resposta máxima (Emáx) produzida por um agonista parcial é chamada de atividade in trínseca e pode ser expressa em uma escala de porcentagem em que um agonista total produziu uma resposta de 100 %. Um agonista par cial pode ter maior que 10 % mas menor que 100 %, alternativamente maior que 20 % mas menor que 100 %, alternativamente maior que 30 % mas menor que 100 %, alternativamente maior que 40 % mas me nor que 100 %, alternativamente maior superior a 50 % mas inferior a 100 %, alternativamente superior a 60 % mas inferior a 100 %, alterna tivamente superior a 70 % mas inferior a 100 %, alternativamente su perior a 80 % mas inferior a 100 % ou alternativamente superior a 90 % mas inferior de 100 %, da atividade do polipeptídeo de referência quando avaliado em concentrações semelhantes em um determinado sistema de ensaio.

[0071] Polipeptídeo: Quando usados neste documento, os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína", usados de forma intercambiável neste documento, referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados geneticamente e aminoácidos não codificados geneticamente, amino- ácidos quimicamente ou bioquimicamente modificados ou derivados, e polipeptídeos com cadeias principais polipeptídicas modificadas. O termo polipeptídeo inclui proteínas de fusão, incluindo, mas não se li mitando a, proteínas de fusão com uma sequência de aminoácidos heteróloga; proteínas de fusão com sequências líder heterólogas e homólogas; proteínas de fusão com ou sem resíduos de metionina N- terminal; proteínas de fusão com sequências de aminoácidos que faci-litam a purificação, como peptídeos quelantes; proteínas de fusão com proteínas marcadas imunologicamente; proteínas de fusão compreen-dendo um peptídeo com fragmento de polipeptídeo imunologicamente ativo (por exemplo, difteria antigênica ou toxina do tétano ou fragmen tos de toxoide) e semelhantes.

[0072] Receptor: Quando aqui utilizado, o termo "receptor"refere- se a um polipeptídeo com um domínio que se liga especificamente a um ligante cuja ligação do ligante resulta em uma alteração de pelo menos uma propriedade biológica do polipeptídeo. Em algumas moda lidades, o receptor é uma proteína associada à membrana celular que compreende um domínio extracelular (ECD) e um domínio associado à membrana que serve para ancorar o ECD à superfície celular. Em al gumas modalidades de receptores de superfície celular, o receptor é um polipeptídeo transmembrana compreendendo um domínio intrace lular (ICD) e um domínio extracelular (ECD) ligados por um domínio transmembranar tipicamente referido como um domínio transmembra- nar (TM). A ligação de um ligante cognato ao receptor resulta em uma alteração conformacional no receptor resultando num efeito biológico mensurável. Em alguns casos, onde o receptor é um polipeptídeo que abrange a membrana compreendendo um ECD, TM e ICD, a ligação do ligante ao ECD resulta em um efeito biológico intracelular mensurá vel mediado por um ou mais domínios do ICD em resposta à ligação do ligante para o ECD. Em algumas modalidades, um receptor é um componente de um complexo multicomponente para facilitar a sinali zação intracelular. Por exemplo, o ligante pode se ligar a um receptor de superfície celular que não está associado apenas a qualquer sinali zação intracelular, mas após a ligação do ligante facilita a formação de um complexo heteromultimérico (incluindo heterodimérico, heterotrimé- rico, etc.) ou homomultimérico (incluindo homodimérico, homotriméri- co, homotetramérico etc.) que resulta em um efeito biológico mensurá vel na célula, como a ativação de uma cascata de sinalização intrace lular (por exemplo, a via Jak/STAT). Em algumas modalidades, um re ceptor é um polipeptídeo de cadeia única que abrange a membrana compreendendo domínios ECD, TM e ICD em que os domínios ECD, TM e ICD são derivados das mesmas ou diferentes variantes de re ceptores de ocorrência natural ou equivalentes funcionais sintéticos dos mesmos.

[0073] Recombinante: Quando usado neste documento, o termo "recombinante" é usado como um adjetivo para se referir ao método pelo qual um polipeptídeo, ácido nucleico ou célula foi modificado usando tecnologia de DNA recombinante. Uma “proteína recombinan- te” é uma proteína produzida usando tecnologia de DNA recombinante e é frequentemente abreviada com um “r” minúsculo precedendo o nome da proteína para denotar o método pelo qual a proteína foi pro duzida (por exemplo, hormônio de crescimento humano produzido de forma recombinante é comumente abreviado “rhGH”). Da mesma for ma, uma célula é referida como uma "célula recombinante" se a célula foi modificada pela incorporação (por exemplo, transfecção, transdu- ção, infecção) de ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA, mRNA, vetores virais ou não virais, plasmí- deos, cosmídeos e semelhantes) usando tecnologia de DNA recombi- nante. As técnicas e protocolos para tecnologia de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica, como aqueles que podem ser encon trados em Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) e outros manuais padrão de laboratório de biologia molecular.

[0074] Resposta: O termo "resposta", por exemplo, de uma célula, tecido, órgão ou organismo, abrange uma mudança quantitativa ou qualitativa em um parâmetro bioquímico ou fisiológico avaliável (por exemplo, concentração, densidade, adesão, proliferação, ativação, fosforilação, migração, atividade enzimática, nível de expressão gêni- ca, taxa de expressão gênica, taxa de consumo de energia, nível ou estado de diferenciação) onde a alteração está correlacionada com a ativação, estimulação ou tratamento, com ou contato com exógeno agentes ou mecanismos internos, como a programação genética. Em certos contextos, os termos “ativação”, “estimulação” e semelhantes referem-se à ativação celular regulada por mecanismos internos, bem como por fatores externos ou ambientais; enquanto os termos "inibi ção", "regulação negativa" e semelhantes referem-se aos efeitos opos tos. Uma “resposta” pode ser avaliada in vitro, como por meio do uso de sistemas de ensaio, ressonância de plasmônio superficial, atividade enzimática, espectroscopia de massa, tecnologias de sequenciamento de aminoácidos ou proteínas. Uma "resposta" pode ser avaliada in vivo quantitativamente pela avaliação de parâmetros fisiológicos objetivos, como temperatura corporal, peso corporal, volume do tumor, pressão sanguínea, resultados de raios-X ou outra tecnologia de imagem ou qualitativamente por meio de mudanças nos sentimentos subjetivos relatados de bem-estar, depressão, agitação ou dor. Em algumas mo-dalidades, o nível de proliferação de células T humanas primárias ati-vadas por CD3 pode ser avaliado em um ensaio bioluminescente que gera um sinal luminescente que é proporcional à quantidade de ATP presente que é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes na cultura conforme descrito em Crouch, et al. (1993) J. Immunol. Methods 160: 81-8 ou usando ensaios comercialmente dis-poníveis, como os kits CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay ou CellTi- ter-Glo® 3D Cell Viability comercialmente disponibilizados por Prome- ga Corporation, Madison WI 53711 como números de catálogo G9241 e G9681 em conformidade substancial com as instruções fornecidas pelo fabricante. Em algumas modalidades, o nível de ativação de célu- las T em resposta à administração de um agente de teste pode ser de-terminado por métodos de citometria de fluxo conforme descrito como determinado pelo nível de fosforilação de STAT (por exemplo, STAT1, STAT3, STAT5) de acordo com os métodos bem conhecido na técni ca.

[0075] Ligação significativamente reduzida: Quando usado neste documento, o termo "exibe ligação significativamente reduzida" é usa do com relação a uma variante de uma primeira molécula (por exem plo, um ligante ou anticorpo) que exibe uma redução significativa na afinidade por uma segunda molécula (por exemplo, receptor ou antí- geno) em relação à forma origem da primeira molécula. Com relação às variantes de anticorpo, uma variante de anticorpo "exibe ligação significativamente reduzida" se a afinidade do anticorpo variante para um antígeno se a variante se ligar à forma nativa do receptor com uma afinidade inferior a 20 %, alternativamente inferior a cerca de 10 %, alternativamente menos que cerca de 8 %, alternativamente menos que cerca de 6 %, alternativamente menos que cerca de 4 %, alterna tivamente menos que cerca de 2 %, alternativamente menos que cerca de 1 % ou alternativamente menos que cerca de 0,5 % do anticorpo original do qual a variante foi derivada. Da mesma forma, com relação aos ligantes variantes, um ligante variante "exibe ligação significativa mente reduzida" se a afinidade do ligante variante se ligar a um recep tor com uma afinidade inferior a 20 %, alternativamente inferior a cerca de 10 %, alternativamente inferior a cerca de 8 % , alternativamente menos que cerca de 6 %, alternativamente menos que cerca de 4 %, alternativamente menos que cerca de 2 %, alternativamente menos que cerca de 1 % ou alternativamente menos que cerca de 0,5 % do ligante parental do qual o ligante variante foi derivado. Da mesma for ma, com relação aos receptores variantes, um ligante variante "exibe ligação significativamente reduzida" se a afinidade dos receptores va- riantes se ligar a um com uma afinidade inferior a 20 %, alternativa mente inferior a cerca de 10 %, alternativamente inferior a cerca de 8 %, alternativamente menos de cerca de 6 %, alternativamente menos de cerca de 4 %, alternativamente menos de cerca de 2 %, alternati vamente menos de cerca de 1 %, ou alternativamente menos de cerca de 0,5 % do receptor parental do qual o receptor variante foi derivado.

[0076] Molécula(s) pequena(s): O termo "moléculas pequenas" refere-se a compostos químicos (tipicamente compostos farmaceuti- camente ativos) com um peso molecular inferior a cerca de 10kDa, in-ferior a cerca de 2kDa ou inferior a cerca de 1kDa. Moléculas peque nas incluem, mas não estão limitadas a, moléculas inorgânicas, molé culas orgânicas, moléculas orgânicas contendo um componente inor gânico, moléculas compreendendo um átomo radioativo e moléculas sintéticas. O termo "molécula pequena" é um termo bem compreendi do pelos versados nas técnicas farmacêuticas e é normalmente usado para distinguir compostos químicos orgânicos de produtos biológicos.

[0077] Liga-se especificamente: Quando usado neste documento, o termo "liga-se especificamente" refere-se ao grau de afinidade para o qual uma primeira molécula exibe em relação a uma segunda molécu la. No contexto de pares de ligação (por exemplo, ligante/receptor, an- ticorpo/antígeno), diz-se que uma primeira molécula de um par de liga ção se liga especificamente a uma segunda molécula de um par de ligação quando a primeira molécula do par de ligação não se liga em um quantidade significativa a outros componentes presentes na amos tra. Diz-se que uma primeira molécula de um par de ligação se liga es-pecificamente a uma segunda molécula de um par de ligação quando a primeira molécula do par de ligação quando a afinidade da primeira molécula para a segunda molécula é pelo menos duas vezes maior, alternativamente pelo menos cinco vezes maior, alternativamente pelo menos dez vezes maior, alternativamente pelo menos 20 vezes maior, ou alternativamente pelo menos 100 vezes maior que a afinidade da primeira molécula por outros componentes presentes na amostra. Em uma modalidade particular, onde a primeira molécula do par de ligação é um anticorpo, o anticorpo se liga especificamente ao antígeno (ou determinante antigênico (epítopo) de uma proteína, antígeno, ligante ou receptor) se a constante de dissociação de equilíbrio entre anticor po e o antígeno é maior que cerca de 106 M, alternativamente maior que cerca de 108 M, alternativamente maior que cerca de 1010 M, al ternativamente maior que cerca de 1011 M, maior que cerca de 1012 M conforme determinado por, por exemplo, análise de Scatchard (Mun- sen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). Em uma modalidade em que o ligante é um sdAb de ligação ao IL27Rα e o receptor com preende um IL27Rα, o sdAb de ligação ao IL27Rα se liga especifica mente se a constante de dissociação de equilíbrio do sdAb de ligação ao IL27Rα/IL27Rα ECD for maior que cerca de 105 M, alternativamen te maior que cerca de 106 M, alternativamente maior que cerca de 107 M, alternativamente maior que cerca de 108 M, alternativamente maior que cerca de 109 M, alternativamente maior que cerca de 1010 M ou alternativamente maior que cerca de 1011 M. A ligação específica pode ser avaliada usando técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitado a ensaios ELISA de competição, ensaios de ligação de ligantes radioativos (por exemplo, ligação de saturação, gráfico de Scatchard, programas de ajuste de curva não linear e ensaios de liga ção de competição); ensaios de ligação de ligante não radioativo (por exemplo, polarização de fluorescência (FP), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET); ensaios de ligação de ligante em fase líquida (por exemplo, reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) e imunoprecipitação); e fase sólida ensaios de ligação de ligantes (por exemplo, ensaios de placas de poços múlti plos, ensaios de ligação de ligantes em contas, ensaios de ligação de ligantes em colunas e ensaios de filtro)) e ensaios de ressonância de plasmônio superficial (veja, por exemplo, Drescher et al., (2009) Me thods Mol Biol 493:323-343 com instrumentação disponível comerci almente, como Biacore 8K, Biacore 8K+, Biacore S200, Biacore T200 (Cytiva, 100 Results Way, Marlborough MA 01752). Em algumas mo dalidades, a presente invenção fornece moléculas (por exemplo, sdAbs de ligação ao IL27Rα) que se ligam especificamente à isoforma IL27Rα. Quando usado neste documento, a afinidade de ligação de uma molécula de ligação ao IL27Rα para IL27Rα, a afinidade de liga ção pode ser determinada e/ou quantificada por ressonância de plas- mônio superficial ("SPR"). Ao avaliar a afinidade de ligação de uma molécula de ligação ao IL27Rα para IL27Rα, qualquer membro do par de ligação pode ser imobilizado e o outro elemento do par de ligação pode ser fornecido na fase móvel. Em algumas modalidades, o chip sensor no qual a proteína de interesse deve ser imobilizada é conju gado com uma substância para facilitar a ligação da proteína de inte resse, como ácido nitrilotriacético (NTA) chips sensores de ressonân cia de plasmônio superficial derivada (por exemplo, Chip Sensor NTA disponibilizado por Cytiva Global Life Science Solutions USA LLC, Marlborough MA como número de catálogo BR100407), como anticor pos anti-His tag (por exemplo, chips CM5 anti-histidina disponíveis comercialmente na Cytiva, Marlborough MA), proteína A ou biotina. Consequentemente, para avaliar a ligação, é frequentemente necessá rio modificar a proteína para proporcionar a ligação à substância con jugadaà superfície do chip. Por exemplo, o único membro do par de ligação a ser avaliado pela incorporação de um peptídeo quelante compreendendo sequência de poli-histidina (por exemplo, 6xHis (SEQ ID NO: 195) ou 8xHis (SEQ ID NO: 196)) para retenção em um chip conjugado com NTA. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Rα pode ser imobilizada no chip e IL27Rα (ou seu fragmento ECD) ser fornecido na fase móvel. Alternativamente, o IL27Rα (ou seu fragmento ECD) pode ser imobilizado no chip e a molécula de ligação ao IL27Rα ser fornecida na fase móvel. Em qualquer circunstância, deve-se notar que modificações de algumas proteínas para imobiliza çãoem um chip SPR revestido podem interferir nas propriedades de ligação de um ou ambos os componentes do par de ligação a ser ava liado pelo SPR. Nesses casos, pode ser necessário trocar os elemen tosmóveis e ligados do par de ligação ou usar um chip com um agente de ligação que facilite a conjugação não interferente da proteína a ser avaliada. Alternativamente, ao avaliar a afinidade de ligação da molé cula de ligação ao IL27Rα para IL27Rα usando SPR, a molécula de ligação a IL2Rb pode ser derivada pela adição C-terminal de uma se quência poli-His (por exemplo, 6xHis (SEQ ID NO: 195) ou 8xHis (SEQ ID NO: 196)) e imobilizada no chip sensor derivado de NTA e a subuni- dade do receptor IL27Rα para a qual a afinidade de ligação do ligante está sendo avaliada é fornecida na fase móvel. O meio para incorpo ração de uma sequência poli-His no terminal C da molécula de ligação ao IL27Rα produzida por tecnologia de DNA recombinante é bem co nhecido dos versados na técnica relevante da biotecnologia. Em algu mas modalidades, a afinidade de ligação da molécula de ligação ao IL27Rα para um IL27Rα usando SPR está de acordo com os ensina mentos dos Exemplos.

[0078] Indivíduo: Os termos "receptor", "individual", "indivíduo" e "paciente" são usados de forma intercambiável neste documento e re-ferem-se a qualquer indivíduo mamífero para o qual o diagnóstico, tra-tamento ou terapia é desejado, particularmente humanos. "Mamífero" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, zoo-lógicos, esportes ou animais de estimação, como cães, cavalos, gatos, vacas, ovelhas, cabras, porcos, etc. Em algumas modalidades, o ma- mífero é um ser humano.

[0079] Substancialmente puro: Quando usado neste documento, o termo "substancialmente puro" indica que um componente de uma composição é superior a cerca de 50 %, alternativamente superior a cerca de 60 %, alternativamente superior a cerca de 70 %, alternati-vamente superior a cerca de 80 %, alternativamente superior a cerca de 90 %, alternativamente superior a cerca de 95 % do teor total da composição. Uma proteína que é "substancialmente pura" compreende mais que cerca de 50 %, alternativamente mais que cerca de 60 %, alternativamente mais que cerca de 70 %, alternativamente mais que cerca de 80 %, alternativamente mais que cerca de 90 %, alternativa-mente mais que cerca de 95 % do conteúdo total da composição.

[0080] Célula T: Quando usado neste documento, o termo "célula T" ou "célula-T" é usado em seu sentido convencional para se referir a linfócitos que se diferenciam no timo, possuem receptores de antígeno de superfície celular específicos e incluem alguns que controlam a ini-ciação ou supressão de imunidade mediada por células e humoral e outras que lisam células portadoras de antígenos. Em algumas moda-lidades, a célula T inclui, sem limitação, células T CD8+ virgens, célu las T CD8+ citotóxicas, células T CD4+ virgens, células T auxiliares, por exemplo, TH1, TH2, TH9, TH11, TH22, TFH; células T reguladoras, por exemplo, TR1, Tregs, Tregs induzíveis; células T de memória, por exemplo, células T de memória central, células T de memória efetora, células NKT, linfócitos infiltrantes tumorais (TILs) e variantes modifica-das de tais células T, incluindo, entre outras, células CAR-T, TILs mo-dificados de forma recombinante e células modificadas por TCR. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T que expressa a iso-formaIL27Rα referida indistintamente como célula IL27Rα, célula IL27Rα+, célula T IL27Rα ou célula T IL27Rα+).

[0081] Término/Terminal: Quando usado neste documento no con- texto da estrutura de um polipeptídeo, "N-terminal" (ou "amino termi nal") e "C-terminal" (ou "carboxil terminal") referem-se ao extremo ami no e extremidades carboxila do polipeptídeo, respectivamente, en quanto os termos "N-terminal" e "C-terminal" referem-se a posições relativas na sequência de aminoácidos do polipeptídeo em direção ao N-terminal e ao C-terminal, respectivamente, e podem incluem os re síduos no N-terminal e C-terminal, respectivamente. "Imediatamente N-terminal" refere-se à posição de um primeiro resíduo de aminoácido em relação a um segundo resíduo de aminoácido em uma sequência polipeptídica contígua, estando o primeiro aminoácido mais próximo do N-terminal do polipeptídeo. "Imediatamente C-terminal" refere-se à po sição de um primeiro resíduo de aminoácido em relação a um segundo resíduo de aminoácido em uma sequência polipeptídica contígua, es tando o primeiro aminoácido mais próximo do C-terminal do polipeptí- deo.

[0082] Domínio transmembranar: O termo "domínio transmembra- nar" ou "TM" refere-se a um domínio polipeptídico de um polipeptídeo transmembranar (por exemplo, um receptor transmembranar) que, quando o polipeptídeo transmembranar está associado a uma mem brana celular, é o que é embutido na membrana celular e está em liga ção peptídica com o domínio extracelular (ECD) e o domínio intracelu lar (ICD) de um polipeptídeo transmembranar. Um domínio transmem- branar pode ser homólogo (naturalmente associado a) ou heterólogo (não naturalmente associado a) com um ou ambos os domínios extra- celulares e/ou intracelulares. Em algumas modalidades, onde o recep tor é um receptor quimérico compreendendo o domínio intracelular de rivado de um primeiro receptor parental e um segundo domínio extra- celular é derivado de um segundo receptor parental diferente, o domí nio transmembranar do receptor quimérico é o domínio transmembra- nar normalmente associado ao ICD ou ao ECD do receptor parental de w do qual o receptor quimérico é derivado.

[0083] Tratar: Os termos "tratar", "tratando", tratamento" e seme lhantes referem-se a um curso de ação (como o contato do indivíduo com a composição farmacêutica compreendendo um sdAb de ligação ao IL27Rα sozinho ou em combinação com um agente suplementar) que é iniciado com relação a um indivíduo em resposta a um diagnós tico de que o indivíduo está sofrendo de uma doença, distúrbio ou condição, ou um sintoma do mesmo, sendo o curso de ação iniciado de modo a eliminar, reduzir, suprimir, mitigar ou melhorar, temporária ou permanentemente, pelo menos uma das seguintes: (a) as causas subja-centes de tal doença, distúrbio ou condição que aflige um indivíduo; e/ou (b) pelo menos um dos sintomas associados a tal doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, o tratamento inclui um curso de ação realizado em relação a um indivíduo que sofre de uma doença em que o curso de ação resulta na inibição (por exemplo, interrompe o de-senvolvimento da doença, distúrbio ou condição ou melhora um ou mais sintomas associados a eles) da doença no indivíduo.

[0084] Célula Treg ou Célula T Reguladora. Os termos "célula T reguladora", "célula Treg" ou "Treg" são intercambiáveis neste docu-mento para se referir a um tipo de célula T CD4+ que pode suprimir as respostas de outras células T incluindo, entre outras, células T efeto- ras (Teff). As células Treg são tipicamente caracterizadas pela expres são de CD4 (CD4+), a subunidade CD25 do receptor de IL2 (CD25+) e o fator de transcrição forkhead box P3 (FOXP3+) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004). Em alguns casos, o termo “células T CD4+ convencionais” é usado para distinguir células T CD4+ não Treg de Tregs CD4+.

[0085] Variante: Os termos "variante", "variante de proteína" ou "proteína variante" ou "polipeptídeo variante" são usados de forma in- tercambiável neste documento para se referir a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo origem em virtude de pelo menos uma modi-ficação de aminoácido, substituição ou deleção. O polipeptídeo origem pode ser um polipeptídeo natural ou tipo selvagem (WT) ou pode ser uma versão modificada de um polipeptídeo WT. O termo polipeptídeo variante pode se referir ao próprio polipeptídeo, uma composição compreendendo o polipeptídeo ou a sequência de ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante compre ende de cerca de um a cerca de dez, alternativamente cerca de um a cerca de oito, alternativamente cerca de um a cerca de sete, alternati vamente cerca de um a cerca de cinco, alternativamente cerca de um a cerca de quatro, alternativamente de cerca de um a cerca de três alternativamente de uma a duas modificações, substituições ou dele- ções de aminoácidos, ou alternativamente uma modificação, substitui ção ou deleção de um único aminoácido em comparação com o poli- peptídeo origem. Uma variante pode ser pelo menos cerca de 99 % idêntica, alternativamente pelo menos cerca de 98 % idêntica, alterna tivamente pelo menos cerca de 97 % idêntica, alternativamente pelo menos cerca de 95 % idêntica ou alternativamente pelo menos cerca de 90 % idêntica ao polipeptídeo origem do qual o variante é derivada.

[0086] Tipo selvagem: Por "tipo selvagem" ou "WT" ou "nativo" en tende-se aqui uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que é encontrada na natureza, incluindo variações aléli- cas. Uma proteína tipo selvagem, polipeptídeo, anticorpo, imunoglobu- lina, IgG, etc. tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleótidos que não foi modificada pela mão do homem. IL27Rα

[0087] As moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção ligam-se especificamente ao domínio extracelular do IL27Rα. IL27Rα humano

[0088] Em uma modalidade, liga-se especificamente ao domínio extracelular da subunidade humana do receptor IL27Rα (hIL27Rα). O hIL27Rα é expresso como um precursor de 636 aminoácidos compre-endendo uma sequência sinal N-terminal de 32 aminoácidos que é cli-vadapós-translacionalmente para fornecer uma proteína madura de 604 aminoácidos. O precursor ácido hIL27Rα canônico de tamanho natural (incluindo o peptídeo sinal) é um polipeptídeo de 636 aminoá- cidos com a sequência de aminoácidos: MRGGRGAPFWLWPLPKLALLPLLWVLFQRTRPQGSAGPLQCYGVG PLGDLNCSWEPLGDLGAPSELHLQSQKYRSNKTQTVAVAAGRSWV AIPREQLTMSDKLLVWGTKAGQPLWPPVFVNLETQMKPNAPRLGPD VDFSEDDPLEATVHWAPPTWPSHKVLICQFHYRRCQEAAWTLLEPE LKTIPLTPVEIQDLELATGYKVYGRCRMEKEEDLWGEWSPILSFQTPP SAPKDVWVSGNLCGTPGGEEPLLLWKAPGPCVQVSYKVWFWVGG RELSPEGITCCCSLIPSGAEWARVSAVNATSWEPLTNLSLVCLDSAS APRSVAVSSIAGSTELLVTWQPGPGEPLEHVVDWARDGDPLEKLNW VRLPPGNLSALLPGNFTVGVPYRITVTAVSASGLASASSVWGFREEL APLVGPTLWRLQDAPPGTPAIAWGEVPRHQLRGHLTHYTLCAQSGT SPSVCMNVSGNTQSVTLPDLPWGPCELWVTASTIAGQGPPGPILRL HLPDNTLRWKVLPGILFLWGLFLLGCGLSLATSGRCYHLRHKVLPRW VWEKVPDPANSSSGQPHMEQVPEAQPLGDLPILEVEEMEPPPVMES SQPAQATAPLDSGYEKHFLPTPEELGLLGPPRPQVLA (SEQ ID NO:1)

[0089] Para os fins da presente invenção, a numeração dos resí duos de aminoácidos dos polipeptídeos IL27Rα humanos conforme descritos neste documento é feita de acordo com a numeração desta sequência canônica (UniProt Reference No Q6UWB1, SEQ ID NO:1). Os aminoácidos 1-32 da SEQ ID NO:1 são identificados como o peptí- deo sinal de hIL27Rα, os aminoácidos 33-516 da SEQ ID NO:1 são identificados como o domínio extracelular, os aminoácidos 517-537 da SEQ ID NO:1 são identificado como o domínio transmembranar e os aminoácidos 538-636 da SEQ ID NO:1 são identificados como o domí nio intracelular.

[0090] Para fins de geração de anticorpos que se ligam ao ECD de IL27Rα, a imunização pode ser realizada com o domínio extracelular do hIL27Rα. O domínio extracelular de hIL27Rα é um polipeptídeo de 484 aminoácidos da sequência: QGSAGPLQCYGVGPLGDLNCSWEPLGDLGAPSELHLQSQKYRSNK TQTVAVAAGRSWVAIPREQLTMSDKLLVWGTKAGQPLWPPVFVNLE TQMKPNAPRLGPDVDFSEDDPLEATVHWAPPTWPSHKVLICQFHYR RCQEAAWTLLEPELKTIPLTPVEIQDLELATGYKVYGRCRMEKEEDL WGEWSPILSFQTPPSAPKDVWVSGNLCGTPGGEEPLLLWKAPGPC VQVSYKVWFWVGGRELSPEGITCCCSLIPSGAEWARVSAVNATSWE PLTNLSLVCLDSASAPRSVAVSSIAGSTELLVTWQPGPGEPLEHVVD WARDGDPLEKLNWVRLPPGNLSALLPGNFTVGVPYRITVTAVSASGL ASASSVWGFREELAPLVGPTLWRLQDAPPGTPAIAWGEVPRHQLRG HLTHYTLCAQSGTSPSVCMNVSGNTQSVTLPDLPWGPCELWVTAST IAGQGPPGPILRLHLPDNTLRWK (SEQ ID NO:192).

IL27Rα de camundongo

[0091] Em uma modalidade, liga-se especificamente ao domínio extracelular da subunidade do receptor IL27Rα de camundongo ou murino (mIL27Rα). O mIL27Rα é expresso como um precursor de 623 aminoácidos compreendendo uma sequência sinal N-terminal de 24 aminoácidos que é clivada pós-translacionalmente para fornecer uma proteína madura de 599 aminoácidos. O precursor mIL27Rα de ácido canônico de tamanho natural (incluindo o peptídeo sinal de 24 amino- ácidos) é um polipeptídeo de 623 aminoácidos com a sequência de aminoácidos: MNRLRVARLTPLELLLSLMSLLLGTRPHGSPGPLQCYSVGPLGILNCS WEPLGDLETPPVLYHQSQKYHPNRVWEVKVPSKQSWVTIPREQFTM ADKLLIWGTQKGRPLWSSVSVNLETQMKPDTPQIFSQVDISEEATLE ATVQWAPPVWPPQKVLICQFRYKECQAETWTRLEPQLKTDGLTPVE MQNLEPGTCYQVSGRCQVENGYPWGEWSSPLSFQTPFLDPEDVW VSGTVCETSGKRAALLVWKDPRPCVQVTYTVWFGAGDITTTQEEVP CCKSPVPAWMEWAVVSPGNSTSWVPPTNLSLVCLAPESAPCDVGV SSADGSPGIKVTWKQGTRKPLEYVVDWAQDGDSLDKLNWTRLPPG NLSTLLPGEFKGGVPYRITVTAVYSGGLAAAPSVWGFREELVPLAGP AVWRLPDDPPGTPVVAWGEVPRHQLRGQATHYTFCIQSRGLSTVCR NVSSQTQTATLPNLHLGSFKLWVTVSTVAGQGPPGPNLSLHLPDNRI RWKALPWFLSLWGLLLMGCGLSLASTRCLQARCLHWRHKLLPQWI WERVPDPANSNSGQPYIKEVSLPQPPKDGPILEVEEVELQPVVESPK ASAPIYSGYEKHFLPTPEELGLLV (SEQ ID NO:193)

[0092] Para fins da presente invenção, a numeração dos resíduos de aminoácidos dos polipeptídeos de mIL27Rα como aqui descritos é feita de acordo com a numeração desta sequência canônica (UniProt Reference No. O70394, SEQ ID NO:193). Os aminoácidos 1-24 da SEQ ID NO: 193 são identificados como o peptídeo sinal de mIL27Rα, os aminoácidos 23-510 da SEQ ID NO: 193 são identificados como o domínio extracelular, os aminoácidos 511-531 da SEQ ID NO: 193 são identificado como o domínio transmembranar e os aminoácidos 532 623 da SEQ ID NO: 193 são identificados como o domínio intracelular.

[0093] Para fins de geração de anticorpos que se ligam ao ECD de IL27Rα, a imunização pode ser realizada com o domínio extracelular de mIL27Rα. O domínio extracelular do receptor mIL27Rα é um poli- peptídeo de 486 aminoácidos da sequência: TRPHGSPGPLQCYSVGPLGILNCSWEPLGDLETPPVLYHQSQKYHP NRVWEVKVPSKQSWVTIPREQFTMADKLLIWGTQKGRPLWSSVSVN LETQMKPDTPQIFSQVDISEEATLEATVQWAPPVWPPQKVLICQFRY KECQAETWTRLEPQLKTDGLTPVEMQNLEPGTCYQVSGRCQVENG YPWGEWSSPLSFQTPFLDPEDVWVSGTVCETSGKRAALLVWKDPR PCVQVTYTVWFGAGDITTTQEEVPCCKSPVPAWMEWAVVSPGNST SWVPPTNLSLVCLAPESAPCDVGVSSADGSPGIKVTWKQGTRKPLE YVVDWAQDGDSLDKLNWTRLPPGNLSTLLPGEFKGGVPYRITVTAV YSGGLAAAPSVWGFREELVPLAGPAVWRLPDDPPGTPVVAWGEVP RHQLRGQATHYTFCIQSRGLSTVCRNVSSQTQTATLPNLHLGSFKLW VTVSTVAGQGPPGPNLSLHLPDNRIRWK (SEQ ID NO:194)

Moléculas de ligação ao IL27Rα e anticorpos de domínio único

[0094] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao IL27Rα da presente invenção é um anticorpo de domínio único (sdAb). A presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao IL27Rα com-preendendo anticorpos de domínio único (sdAbs) que se ligam especi-ficamente ao domínio extracelular da isoforma humana de IL27Rα (hIL27Rα) que são encontrados em todas as células que expressam IL27Rα.

[0095] Um anticorpo de domínio único (sdAb) é um anticorpo con tendo um único domínio de anticorpo variável monomérico. Como um anticorpo completo, os sdAbs são capazes de se ligar especificamente a um determinante antigênico. Os anticorpos de domínio único VHH de ligação ao hIL27Rα podem ser modificados a partir de anticorpos de cadeia pesada isolados de mamíferos Camelidae (por exemplo, came-los, lhamas, dromedários, alpacas e guanaco) imunizados com o do mínio extracelular de hIL27Rα ou um fragmento imunologicamente ati vo do mesmo. Descrições de sdAbs e VHHs podem ser encontradas em, por exemplo, De Greve et al., (2019) Curr Opin Biotechnol. 61:96 101; Ciccarese, et al., (2019) Front Genet. 10:997: Chanier e Chames (2019) Antibodies(Basileia) 8(1); e De Vlieger, et ai. (2018) Antibodies (Basileia) 8(1). Alternativamente, os anticorpos de domínio único hIL27Rα podem ser modificados a partir de anticorpos de cadeia pe- sada isolados dos anticorpos de cadeia pesada IgNAR isolados de peixes cartilaginosos imunizados com o domínio extracelular de hIL27Rα ou um fragmento imunologicamente ativo do mesmo. Os sdAbs de ligação ao hIL27Rα também podem ser obtidos dividindo os domínios variáveis diméricos de isotipos de imunoglobulina G (IgG) de outras espécies de mamíferos, incluindo humanos, ratos, coelhos imu nizados com o domínio extracelular de hIL27Rα ou um fragmento imu- nologicamente ativo do mesmo. Embora a maioria das pesquisas so bre sdAbs seja atualmente baseada em domínios variáveis de cadeia pesada, sdAbs derivados de cadeias leves também demonstraram se ligar especificamente às proteínas alvo que compreendem a sequência de imunização antigênica. Moller et ai., J Biol Chem. 285(49): 38348 38361, 2010.

[0096] Em algumas modalidades, o sdAb é um VHH. Um VHH é um tipo de sdAb que possui um único domínio monomérico de anticor po variável de cadeia pesada. Semelhante a um anticorpo tradicional, um VHH é capaz de se ligar especificamente a um antígeno específi co. Um VHH exemplar tem um peso molecular de aproximadamente 12-15 kDa, que é muito menor do que os anticorpos tradicionais de mamíferos (150-160 kDa) compostos por duas cadeias pesadas e du as cadeias leves. Os VHHs podem ser encontrados ou produzidos a partir de mamíferos Camelidae (por exemplo, camelos, lhamas, dro medários, alpacas e guanacos) que são naturalmente desprovidos de cadeias leves.

[0097] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao IL27Rα compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 75 %, alter-nativamente 80 %, alternativamente 90 %, alternativamente 95 %, al-ternativamente 98 % ou alternativamente 99 % ou 100 % de identidade com um polipeptídeo de qualquer um dentre SEQ ID NOS:2-25.

[0098] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao IL27Rα compreendendo um polipeptídeo com pelo menos 75 %, alter-nativamente 80 %, alternativamente 90 %, alternativamente 95 %, al-ternativamente 98 % ou alternativamente 99 % ou 100 % de identidade com um polipeptídeo de qualquer um dentre SEQ ID NOS:61-74.

[0099] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao IL27Rα compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 confor me descrito em uma linha da Tabela 1 aqui fornecida. Em algumas modalidades, a CDR1, CDR2 e CDR3 podem cada uma, independen-temente, compreender pelo menos 90 % (por exemplo, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) de identidade de sequência, ou ter 0, 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos, opcional-mentealterações conservadoras de aminoácidos, em relação à se quência descrita em uma linha da Tabela 1 fornecida neste documen to.

[00100] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao IL27Rα compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 confor me descrito em uma linha da Tabela 3 aqui fornecida. Em algumas modalidades, a CDR1, CDR2 e CDR3 podem cada uma, independen temente, compreender pelo menos 90 % (por exemplo, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) de identidade de sequência, ou ter 0, 1, 2 ou 3 alterações de aminoácidos, opcional mentealterações conservadoras de aminoácidos, em relação à se quência descrita em uma linha da Tabela 3 fornecida neste documen to.

Experimental

[00101] Os anticorpos de domínio único da presente invenção fo ram obtidos de camelos por imunização com um domínio extracelular de um receptor IL27Rα. As moléculas de IL27Rα VHH da presente in venção da presente invenção foram geradas substancialmente de acordo com o ensinamento dos Exemplos. Resumidamente, um came- lo foi imunizado sequencialmente com o ECD do IL27Rα humano e IL27Rα de camundongo durante um período de várias semanas por via subcutânea uma composição adjuvante contendo proteínas de fu são produzidas de forma recombinante compreendendo o domínio ex- tracelular do IL27Rα, o domínio de articulação IgG1 humano e o Fc de cadeia pesada de IgG1 humana. Após a imunização, os RNAs extraí dos de uma amostra de sangue de espécies VHH-articulação-CH2- CH3 de tamanho apropriado foram transcritos para gerar sequências de DNA, digeridas para identificar o fragmento de aproximadamente 400 pb compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VHH foi isolado. A sequência isolada foi digerida com endo nucleases de restrição para facilitar a inserção em um vetor de fage- mídeo para in frame com uma sequência que codifica um marcador his e transformada em E. coli para gerar uma biblioteca de fagos. Vários ciclos de bioprospecção da biblioteca de fagos foram conduzidas para identificar VHHs que se ligam ao ECD de IL27Rα (humano ou camun dongo, conforme apropriado). Clones de fagos individuais foram isola dos para ELISA de extrato periplasmático (PE-ELISA) em um formato de placa de 96 poços e a ligação seletiva confirmada por determinação colorimétrica. As moléculas de ligação ao IL27Rα que demonstraram ligação específica ao antígeno IL27Rα foram isoladas e sequenciadas e as sequências analisadas para identificar sequências VHH, CDRs e identificar clonótipos VHH únicos. Quando usado neste documento, o termo "clonótipos"refere-se a uma coleção de moléculas de ligação que se originam da mesma célula progenitora de células B, em particu lar coleção de moléculas de ligação ao antígeno que pertencem à mesma família de linhagem germinativa, têm os mesmos comprimen tos de CDR3 e têm 70 % ou maior homologia na sequência de CDR3. As moléculas VHH que demonstram ligação específica ao antígeno hIL27Rα ECD (VHHs de IL27Rα anti-humano) e as CDRs isoladas de tais VHHs são fornecidas na Tabela 1. As moléculas VHH que de-monstramligação específica ao antígeno mIL27Rα ECD (VHHs de IL27Rα anti-camundongo) e as CDRs isoladas de tais VHHs são for-necidas na Tabela 3. As sequências de ácidos nucleicos que codificam os VHHs da Tabela 1 e 3 são fornecidas nas Tabelas 2 e 4, respecti-vamente.

[00102] Para caracterizar mais completamente as propriedades de ligação e avaliar a afinidade de ligação das moléculas de VHH geradas de acordo com o exposto, exemplos representativos de cada um dos clonótipos de VHH humanos foram submetidos à análise por resso nância de plasmônio superficial em conformidade substancial com o ensinamento de Exemplo 5 aqui. Os resultados desses estudos SPR estão resumidos na Tabela 6 abaixo. ra o antígeno IL27Rα. *Ambas as constantes cinéticas de associação e dissociação podem ser suprimidas em Rmáx>100. Se existente, esse efeito provavelmente é cancelado na relação cinética, ou seja, constante de afinidade.

[00103] Conforme demonstrado pelos dados apresentados na Tabela 6, acima, as moléculas de ligação ao IL27Rα VHH exibiram liga- ção específica ao antígeno e forneceram uma gama de afinidades pa

[00104] Em alguns casos, devido à sequência ou semelhanças es-truturais entre os domínios extracelulares dos receptores IL27Rα de várias espécies de mamíferos, a imunização com um antígeno deriva do de um IL27Rα de uma primeira espécie de mamífero (por exemplo, o hIL27Rα-ECD) pode fornecer anticorpos que se ligam especifica mente a receptores IL27Rα de uma ou mais espécies de mamíferos adicionais. Esses anticorpos são denominados "reativos cruzados". Por exemplo, a imunização de um camelídeo com um antígeno deriva do de humano (por exemplo, o hIL27Rα-ECD) pode gerar anticorpos que apresentam reação cruzada com os receptores murinos e huma nos. A avaliação da reatividade cruzada do anticorpo em relação aos receptores derivados de outras espécies de mamíferos pode ser pron tamente determinada pelo versado na técnica, por exemplo, usando os métodos relacionados à avaliação da afinidade de ligação e/ou ligação específica descritos em outra parte deste documento, como citometria de fluxo ou SPR. Consequentemente, o uso do termo "IL27Rα VHH humano" ou "hIL27Rα VHH" meramente denota que a espécie do antí- geno IL27Rα usada para imunização do camelídeo do qual o VHH foi derivado era o IL27Rα humano (por exemplo, o hIL27Rα, ECD, SEQ ID NO: 192, mas não deve ser entendida como limitante em relação à afinidade de ligação específica do VHH para moléculas hIL27Rα de outras espécies de mamíferos. Da mesma forma, o uso do termo "ca mundongo IL27Rα VHH" ou "mIL27Rα" simplesmente denota que o A espécie do antígeno IL27Rα usada para imunização do camelídeo do qual o VHH foi derivado foi o IL27Rα murino (por exemplo, o mIL27Rα ECD, SEQ ID NO:194), mas não deve ser entendida como limitante em relação à afinidade de ligação específica do VHH para moléculas de IL27Rα de outras espécies de mamíferos.

Formas Modificadas de Anticorpos de Domínio Único SdAbs Enxertado com CDR

[00105] Em algumas modalidades, o sdAb de ligação ao IL27Rα da presente invenção é um sdAb de ligação ao IL27Rα enxertado com CDR. CDRs obtidos de anticorpos, anticorpos de cadeia pesada e sdAbs derivados deles podem ser enxertados em estruturas alternati vas conforme descrito em Saerens, et al. (2005) J. Mol Biol 352:597 607 para gerar sdAbs enxertados com CDR. Em algumas modalida des, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao IL27Rα compreendendo um sdAb de ligação ao IL27Rα enxertado com CDR, o referido sdAb de ligação ao IL27Rα enxertado com CDR compreen dendo um conjunto de CDRs1, 2 e 3 como mostrado em uma linha da Tabela 3 acima.

SdAbs quiméricos e humanizados

[00106] Qualquer região de estrutura pode ser usada com as CDRs conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o sdAb de ligação ao IL27Rα é um sdAb quimérico, no qual as CDRs são derivadas de uma espécie (por exemplo, camelo) e a estrutura e/ou regiões constantes são derivadas de outra espécie (por exemplo, humano ou camundongo). Em modalidades específicas, as regiões estruturais são sequências humanas ou humanizadas. Assim, sdAbs de ligação ao IL27Rα humanizados derivados de VHHs de ligação ao hIL27Rα são considerados dentro do escopo da presente invenção. As técnicas para humanização de anticorpos de domínio único de camelí-deossão bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Vincke, et al. (2009) General Strategy to Humanize a Camelid Single-domain Anti body and Identification of a Universal Humanized Nanobody Scaffold J. Biol. Chem. 284(5)3273-3284.

[00107] Em algumas modalidades, um VHH aqui descrito pode ser humanizado para conter regiões estruturais humanas. Exemplos de linhagens germinativas humanas que podem ser usadas para criar VHHs humanizados incluem, mas não estão limitados a, VH3-23 (por exemplo, UniProt ID: P01764), VH3-74 (por exemplo, UniProt ID: A0A0B4J1X5), VH3-66 (por exemplo, UniProt ID: A0A0C4DH42), VH3- 30 (por exemplo, UniProt ID: P01768), VH3-11 (por exemplo, UniProt ID: P01762) e VH3-9 (por exemplo, UniProt ID: P01782).

Moléculas de Ligação ao IL27Rα Compreendendo Agentes Adici onais

[00108] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao IL27Rα da presente invenção compreende um anticorpo de domínio único IL27Rα (sdAb) conjugado com um ou mais agentes biologica mente ativos adicionais, incluindo, mas não limitado a, agentes tera pêuticos, agentes quimicamente, opticamente ou radioativamente ati vos, incluindo suas combinações. A conjugação de pelo menos um desses agentes biologicamente, quimicamente, opticamente ou radioa tivamente ativos confere propriedades biológicas ou químicas adicio nais ao sdAb de ligação ao IL27Rα, a combinação fornecendo uma molécula de ligação ao IL27Rα possuindo utilidades adicionais ou al ternativas.

[00109] Por exemplo, o agente adicional pode ser uma molécula selecionada dentre um ou mais de: agentes imunomoduladores (por exemplo, imunógenos); moléculas que melhoram a solubilidade aquo sa (por exemplo, polímeros solúveis em água e moléculas hidrofílicas como açúcares); moléculas transportadoras que estendem a meia-vida in vivo (por exemplo, PEGuilação, fusões Fc ou acilação); geração de anticorpos para uso em ensaios de detecção (por exemplo, marcado res de epítopo), aumenta a facilidade de purificação (por exemplo, peptídeos quelantes, como marcadores poli-His); domínios de direcio namento que fornecem molécula de ligação ao IL27Rα de direciona mento seletivo para uma célula ou tipo de tecido específico; agentes terapêuticos (por exemplo, agentes terapêuticos incluindo moléculas pequenas ou agentes polipeptídicos); agentes que dão visibilidade a sensores ópticos ou eletromagnéticos (por exemplo, radionucleotídeos ou agentes fluorescentes). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável ou um ligante não clivável. A utilização de um ligante clivável em uma molécula de ligação ao IL27Rα conforme aqui consi derado facilita a liberação de um agente terapêutico no citoplasma in tracelularapós a internalização da molécula de ligação ao IL27Rα. Um ligante não clivável permitiria a liberação após a digestão da molécula de ligação ao IL27Rα ou poderia ser usado com um agente que não requer liberação do anticorpo (por exemplo, um agente de imagem).

[00110] Em algumas modalidades, em que a molécula de ligação ao IL27Rα compreende um sdAb de ligação ao IL27Rα em associação estável com um agente adicional unido por meio de um ligante. Um ligante é uma ligação covalente entre dois elementos de uma molécula de ligação ao IL27Rα (por exemplo, um polímero VHH e PEG de liga ção ao hIL27Rα). Um ligante pode ser uma ligação covalente, um li- gante químico ou um ligante peptídico. Os ligantes adequados incluem "ligantes flexíveis"que geralmente têm comprimento suficiente para permitir algum movimento entre o sdAb de ligação ao IL27Rα e o(s) agente(s) ligado(s). Exemplos de ligantes químicos incluem aril aceti-leno,oligômeros de etileno glicol contendo 2-10 unidades monoméri- cas, diaminas, diácidos, aminoácidos ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante peptídico. Ligantes peptídicos adequados podem ser facilmente selecionados e podem ter qualquer comprimento adequado, como 1 aminoácido (por exemplo, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20- 30, 30-50 ou mais de 50 ami- noácidos. Ligantes peptídicos adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ligantes peptídicos contendo resíduos de ami- noácidos flexíveis, como glicina e serina. Exemplos de ligantes flexí veis incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina e outros li- gantes flexíveis. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativa-mentenão estruturados e, portanto, podem servir como uma ligação neutra entre os componentes. Outros exemplos de ligantes flexíveis incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-alanina, polí-meros de alanina-serina, polímeros de glicina-serina. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma ligação neutra entre os componentes. Um multímero (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 ou 30 50) de tais sequências de ligantes pode ser ligado para fornecer ligan- tes flexíveis que pode ser usado para conjugar uma sequência de aminoácidos heteróloga com sdAbs de ligação ao IL27Rα descritos neste documento. Em algumas modalidades, os ligantes têm a fórmula (GGGS)n (SEQ ID NO: 197), (GGGSG)n (SEQ ID NO: 198), (GGGGS)n (SEQ ID NO: 199), (GGS)nG (SEQ ID NO: 200), ou (GGSG)n (SEQ ID NO: 201), em que n é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

Agentes Imunomoduladores

[00111] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são operavelmente ligadas ao agente imunomodulador (imunoconjugados). Agentes imunomoduladores que podem ser conjugados ao sdAb de ligação ao hIL27Rα da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, partículas virais inativa- das, toxinas bacterianas inativadas, como toxoide de difteria, tétano, cólera ou moléculas de leucotoxina, bactérias inativadas e células dendríticas. Esses imunoconjugados são úteis para facilitar uma res posta imune contra o IL27Rα ou células que expressam o IL27Rα.

Marcadores Flag

[00112] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são operavelmente ligadas a um marca- dor antigênico, tal como uma sequência FLAG. As sequências FLAG são reconhecidas por anticorpos anti-FLAG biotinilados, altamente es-pecíficos, conforme descrito neste documento (veja, por exemplo, Bla- nar et al. (1992) Science 256:1014 e LeClair, et al. (1992) PNAS-USA 89:8145). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de sdAb de liga ção ao IL27Rα compreende ainda um marcador de epítopo c-myc C- terminal.

Peptídeos Quelantes

[00113] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são operavelmente ligadas a uma ou mais sequências polipeptídicas quelantes de metais de transição. A incorporação de tal domínio quelante de metal de transição facilita a purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) conforme descrito em Smith, et al. Patente Norte-americana No. 4.569.794 concedida em 11 de fevereiro de 1986. Exemplos de poli- peptídeos quelantes de metais de transição úteis na prática da presen te molécula de ligação ao IL27Rα são descritos em Smith, et al. supra e Dobeli, et al. Patente Norte-americana No. 5.320.663 concedida em 10 de maio de 1995, cujos ensinamentos completos são aqui incorpo rados por referência. Polipeptídeos quelantes de metais de transição específicos úteis na prática da presente molécula de ligação ao IL27Rα são polipeptídeos compreendendo 3-6 resíduos contíguos de histidina (SEQ ID NO: 202), como um peptídeo de seis histidina (His)6 (SEQ ID NO: 195) e são frequentemente referidos na técnica como "marcadores His". Além de fornecer uma “alça” de purificação para as proteínas recombinantes ou para facilitar a imobilização em chips sen sores SPR, a conjugação da molécula de ligação h IL27Rα a um pep- tídeo quelante facilita a liberação direcionada a células que expressam IL27Rα de íons de metais de transição como cineticamente inertes ou complexos cineticamente lábeis em substancial acordo com o ensina- mento de Anderson, et al. (Patente Norte=americana No. 5.439.829 emitida em 8 de agosto de 1995 e Hale, J.E (1996) Analytical Bioche-mistry 231(1):46-49. O íon de metal de transição é uma molécula repórter tal como um composto fluorescente ou agente radioactivo, in-cluindo como imagiologia radiológica ou agentes terapêuticos.

Moléculas Transportadoras

[00114] Em algumas modalidades, os sdAbs de ligação ao IL27Rα da presente invenção podem ser conjugados com uma ou mais molé culas transportadoras. Moléculas transportadoras são macromoléculas tipicamente grandes, lentamente metabolizadas, que fornecem estabi-lização e/ou duração prolongada de ação in vivo para distinguir tais moléculas de moléculas transportadoras convencionais usadas na preparação de formulações farmacêuticas conforme descrito abaixo. Exemplos de transportadores in vivo que podem ser incorporados em moléculas de ligação ao IL27Rα, mas não estão limitados a: proteínas (incluindo mas não limitadas a albumina de soro humano); ácidos gra- xos (acilação); polissacarídeos (incluindo mas não limitado a açúcares (ligados a N e O), sefarose, agarose, celulose ou celulose); copolíme- ros de aminoácidos polipeptídicos; acilação ou polissialilação, políme ros de polietileno glicol (PEG).

Polímeros Solúveis em Água

[00115] Em algumas modalidades, o sdAb de ligação ao IL27Rα é conjugado a um ou mais polímeros solúveis em água. Exemplos de polímeros solúveis em água úteis na prática da presente molécula de ligação ao IL27Rα incluem polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG), polissacarídeos (polivinilpirrolidona, copolímeros de etileno gli- col e propileno glicol, poli(poliol oxietilado), álcool poliolefínico, polissa- carídeos, poli-alfa-hidroxiácido, álcool polivinílico (PVA), polifosfazeno, polioxazolinas (POZ), poli(N-acriloilmorfolina) ou uma combinação dos mesmos.

Polietileno Glicol

[00116] Em uma modalidade, a molécula transportadora é um polí mero de polietileno glicol ("PEG"). A conjugação de polímeros de PEG a proteínas (PEGuilação) é um método bem estabelecido para a ex tensão da meia-vida sérica de agentes biológicos. O polipeptídeo PE- Guilado pode ser ainda referido como monopeguilado, dipeguilado, tripegilado (e assim por diante) para denotar um polipeptídeo compre endendo uma, duas, três (ou mais) porções PEG ligadas ao polipeptí- deo, respectivamente. Em algumas modalidades, o PEG pode ser li gado covalentemente diretamente ao sdAb (por exemplo, através de uma cadeia lateral de lisina, grupo sulfidrila de uma cisteína ou amina N-terminal) ou, opcionalmente, empregar um ligante entre o PEG e o sdAb. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao IL27Rα compreende mais de uma molécula de PEG, cada uma das quais está ligada a um resíduo de aminoácido diferente. Em algumas modalida des, o sdAb pode ser modificado pela incorporação de aminoácidos não naturais com cadeias laterais de aminoácidos não naturais para facilitar a PEGilação específica do sítio. Em outras modalidades, os resíduos de cisteína podem ser substituídos em uma ou mais posições dentro do sdAb para facilitar a PEGuilação específica do sítio por meio da cadeia lateral cisteína sulfidrila.

[00117] Em alguns casos, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção possuem um resíduo de glutamina N-terminal ("1Q"). Observou-se que os resíduos de glutamina N-terminais ciclizam espontaneamente para formar piroglutamato (pE) em condições fisio-lógicas ou próximas delas. (Veja, por exemplo, Liu, et al (2011) J. Biol. Chem. 286(13): 11211-11217). Em algumas modalidades, a formação de piroglutamato complica a conjugação de PEG N-terminal, particu-larmentequando a química de aldeído é usada para PEGilação N- terminal. Consequentemente, ao PEGuilar as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção, particularmente quando a química de aldeído deve ser empregada, as moléculas de ligação ao IL27Rα pos-suindo um aminoácido na posição 1 (por exemplo, 1Q) são substituí das na posição 1 por um aminoácido alternativo ou são excluído na posição 1 (por exemplo, des-1Q). Em algumas modalidades, as molé culas de ligação ao IL27Rα da presente invenção compreendem uma substituição de aminoácidos selecionada do grupo Q1E e Q1D.

[00118] PEGs adequados para conjugação a uma sequência poli- peptídica são geralmente solúveis em água em temperatura ambiente e têm a fórmula geral R(O-CH2-CH2)nO-R, onde R é hidrogênio ou um grupo protetor tal como um grupo alquila ou alcanol, e onde n é um número inteiro de 1 a 1000. Quando R é um grupo protetor, geralmente tem de 1 a 8 carbonos. O PEG pode ser linear ou ramificado. Derivados ramificados de PEG, "star-PEGs" e PEGs com múltiplos braços são considerados pela presente invenção.

[00119] Um peso molecular do PEG usado em uma molécula de ligação ao IL27Rα não é restrito a nenhum intervalo específico. O componente PEG de uma molécula de ligação ao IL27Rα pode ter uma massa molecular superior a cerca de 5kDa, superior a cerca de 10kDa, superior a cerca de 15kDa, superior a cerca de 20kDa, superi or a cerca de 30kDa, superior a cerca de 40kDa ou superior a cerca de 50kDa. Em algumas modalidades, a massa molecular é de cerca de 5kDa a cerca de 10kDa, de cerca de 5kDa a cerca de 15kDa, de cerca de 5kDa a cerca de 20kDa, de cerca de 10kDa a cerca de 15kDa, de cerca de 10kDa a cerca de 20kDa, de cerca de 10kDa a cerca de 25kDa ou de cerca de 10 kDa a cerca de 30 kDa. Moléculas de PEG lineares ou ramificadas com pesos moleculares de cerca de 2.000 a cerca de 80.000 daltons, alternativamente cerca de 2.000 a cerca de 70.000 daltons, alternativamente cerca de 5.000 a cerca de 50.000 daltons, alternativamente cerca de 10.000 a cerca de 50.000 daltons, alternativamente cerca de 20.000 a cerca de 50.000 daltons, alternati-vamente 30.000 a cerca de 50.000 daltons, alternativamente cerca de 20.000 a cerca de 40.000 daltons, alternativamente cerca de 30.000 a cerca de 40.000 daltons. Em uma modalidade da molécula de ligação ao IL27Rα, o PEG é um PEG ramificado de 40 kD compreendendo dois braços de 20 kD.

[00120] A presente invenção também considera uma molécula de ligação ao IL27Rα compreendendo mais de uma porção PEG em que os PEGs têm valores de tamanhos diferentes e, portanto, os vários PEGs diferentes estão presentes em proporções específicas. Por exemplo, na preparação de uma molécula de ligação ao IL27Rα PEGi- lada, algumas composições compreendem uma mistura de conjugados de sdAb mono-, di-, tri- e quadra-PEGilados. Em algumas composi ções, a porcentagem de espécies mono-PEGiladas é de 18-25 %, a porcentagem de espécies di-PEGiladas é de 50-66 %, a porcentagem de espécies tri-PEGiladas é de 12-16 % e a porcentagem de espécies quad-PEGiladas até 5 %. Tais composições complexas podem ser produzidas por condições de reação e métodos de purificação conhe cidos na técnica. A cromatografia pode ser usada para resolver fra ções conjugadas, e uma fração é então identificada que contém o con jugado tendo, por exemplo, o número desejado de PEGs ligados, puri ficados livres de sequências de proteínas não modificadas e de conju gados tendo outros números de PEGs ligados.

[00121] A PEGilação ocorre com mais frequência no grupo α-amino no terminal N do polipeptídeo, o grupo épsilon amino na cadeia lateral de resíduos de lisina e o grupo imidazol na cadeia lateral de resíduos de histidina. Como a maioria dos polipeptídeos recombinantes possui um único alfa e vários grupos épsilon amino e imidazol, vários isôme- ros posicionais podem ser gerados dependendo da química do ligante.

[00122] Dois monometoxi PEGs ativados de primeira geração am-plamente utilizados (mPEGs) são succinimdil carbonato PEG (SC- PEG; veja, por exemplo, Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Bio- chem 15:100-114) e carbonato de benzotriazol PEG (BTC-PEG; veja, por exemplo, Dolence, et al. Patente Norte-americana No. 5.650.234), que reagem preferencialmente com resíduos de lisina para formar uma ligação de carbamato, mas também são conhecidos por reagir com resíduos de histidina e tirosina. O uso de um ligante PEG-aldeído tem como alvo um único sítio no terminal N de um polipeptídeo por meio de aminação redutora.

[00123] O PEG pode ser ligado a uma molécula de ligação ao IL27Rα da presente invenção por meio de um grupo reativo terminal (um "espaçador") que medeia uma ligação entre os grupos amino ou carboxila livres de uma ou mais sequências polipeptídicas e polietileno glicol. O PEG tendo o espaçador que pode ser ligado ao grupo amino livre inclui N-hidroxissuccinilimida polietileno glicol, que pode ser pre parado pela ativação do éster de ácido succínico de polietileno glicol com N-hidroxissuccinilimida.

[00124] Em algumas modalidades, a PEGilação do sdAb é facilitada pela incorporação de aminoácidos não naturais com cadeias laterais únicas para facilitar a PEGilação específica do sítio. A incorporação de aminoácidos não naturais em polipeptídeos para fornecer porções fun-cionais para alcançar a PEGilação específica do sítio de tais polipeptí- deos é conhecida na técnica. Veja, por exemplo, Ptacin, et al., Pedido Internacional PCT No. PCT/US2018/045257 depositado em 3 de agos to de 2018 e publicado em 7 de fevereiro de 2019 como Número de Publicação Internacional WO 2019/028419Al.

[00125] A porção PEG de uma molécula de ligação ao IL27Rα PE- Guilada pode ser linear ou ramificada. Derivados ramificados de PEG, "star-PEGs" e PEGs com múltiplos braços são considerados pela pre- sente invenção. Modalidades específicas de PEGs úteis na prática da presente invenção incluem um PEG-aldeído linear de 10 kDa (por exemplo, Sunbright® ME-100AL, NOF America Corporation, One North Broadway, White Plains, NY 10601 EUA), éster de PEG-NHS linear de 10 kDa (por exemplo, Sunbright® ME-100CS, Sunbright® ME-100AS, Sunbright® ME-100GS, Sunbright® ME-100HS, NOF), um PEG-aldeído linear de 20kDa (por exemplo, Sunbright® ME-200AL, NOF, um éster de PEG-NHS linear de 20kDa (por exemplo, Sunbri ght® ME-200CS, Sunbright® ME-200AS, Sunbright® ME-200GS, Sunbright® ME-200HS, NOF), um PEG-aldeído ramificado de 2 braços de 20kDa e o PEG-aldeído de 20 kDA compreendendo duas molécu las de PEG lineares de 10 kDA (por exemplo, Sunbright® GL2- 200AL3, NOF), um éster de PEG-NHS ramificado de 2 braços de 20 kDa, o éster de PEG-NHS de 20 kDA compreendendo duas moléculas de PEG lineares de 10 kDA (por exemplo, Sunbright® GL2-200TS, Sunbright® GL200GS2, NOF), um PEG-aldeído ramificado de 2 bra ços de 40kDa, o aldeído de PEG de 40 kDA compreendendo duas mo léculas de PEG lineares de 20kDA (por exemplo, Sunbright® GL2- 400AL3), um éster de PEG-NHS ramificado de 2 braços de 40kDa, o éster de PEG-NHS de 40 kDA compreendendo duas moléculas PEG lineares de 20kDA (por exemplo, Sunbright® GL2-400AL3, Sunbright® GL2-400GS2, NOF), um PEG-aldeído de 30kDa linear (por exemplo, Sunbright® ME-300AL) e um éster de PEG-NHS de 30kDa linear. Fusões de Fc

[00126] Em algumas modalidades, a molécula transportadora é uma molécula Fc ou uma subunidade monomérica da mesma. Em al gumas modalidades, a molécula Fc dimérica pode ser projetada para possuir uma "modificação knob-into-hole". A modificação knob-into- holeé descrita mais detalhadamente em Ridgway, et al. (1996) Protein Engineering 9(7):617-621 e U.S. Pat. No. 5.731.168, emitida em 24 de março de 1998, Patente Norte-americana N° 7.642.228, emitida em 5 de janeiro de 2010, Patente Norte-americana No. 7.695.936, emitida em 13 de abril de 2010, e Patente Norte-americana No. 8.216.805, emitida em 10 de julho de 2012. A modificação knob-into-hole refere- se a uma modificação na interface entre duas cadeias pesadas de imunoglobulina no domínio CH3, em que: i) em um domínio CH3 de uma primeira cadeia pesada, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral maior (por exemplo, tirosina ou triptofano) criando uma projeção da superfície (“knob”) e ii) em o domínio CH3 de uma segunda cadeia pesada, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral menor (por exemplo, alanina ou treonina), ge rando assim uma cavidade (“hole”) dentro de uma interface no segun do domínio CH3 dentro do qual a cadeia lateral saliente do primeiro domínio CH3 (“knob”) é recebida pela cavidade no segundo domínio CH3. Em uma modalidade, a "modificação knob-into-hole" compreende a substituição de aminoácidos T366W e opcionalmente a substituição de aminoácidos S354C em uma das cadeias pesadas do anticorpo e as substituições de aminoácidos T366S, L368A, Y407V e opcional mente Y349C na outra uma das cadeias pesadas do anticorpo. Além disso, os domínios Fc podem ser modificados pela introdução de resí duos de cisteína nas posições S354 em uma cadeia e Y349 na segun da cadeia, o que resulta em uma ponte dissulfeto estabilizadora entre as duas cadeias pesadas de anticorpos na região Fc (Carter, et al. (Carter, et al. (2001) Immunol Methods 248, 7-15). O formato knob- into-hole é usado para facilitar a expressão de um primeiro polipeptí- deo (por exemplo, um sdAb de ligação ao IL27Rα) em um primeiro monômero Fc com uma modificação "knob" e um segundo polipeptí- deo no segundo monômero Fc possuindo um "hole" modificação para facilitar a expressão de conjugados polipeptídicos heterodiméricos. Domínios de Direcionamento

[00127] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao IL27Rα é fornecida como um componente de uma proteína de fusão multiva lente (por exemplo, bivalente) com uma sequência polipeptídica ("do mínio de direcionamento") para facilitar a ligação seletiva a determina do tipo de célula ou tecido que expressa uma molécula de superfície celular que especificamente liga-se a tal domínio de direcionamento, incorporando opcionalmente um ligante entre a sequência sdAb de li gação ao IL27Rα e a sequência do domínio de direcionamento da pro teína de fusão.

[00128] Em algumas modalidades da molécula de ligação ao IL27Rα, a molécula de ligação ao IL27Rα pode ser direcionada a um tipo de célula particular por incorporação de um domínio de direciona mento na estrutura das moléculas de ligação ao IL27Rα. Quando aqui utilizado, o termo domínio de direcionamento refere-se a uma porção que se liga especificamente a uma molécula expressa na superfície de uma célula alvo. O domínio de direcionamento pode ser qualquer por ção que se liga especificamente a uma ou mais moléculas da superfí cie celular (por exemplo, receptor de células T) expressas na superfí cie de uma célula alvo. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula T IL27Rα+.

[00129] Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento é um ligante para um receptor. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento é um ligante para um receptor expresso na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, o ligante é uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina inclui, mas não está limitada ao grupo que consiste em interleucinas, interferons e derivados funcionais dos mesmos. Em algumas modalidades, a citocina inclui, mas não es tá limitada ao grupo que consiste em IL2, IL3, IL4, IL7, IL9, IL12, IL15, IL18, IL21, IL22, IL23, IL27, IL28, IL34 e versões modificadas ou frag-mentos das mesmas que ligam-se ao seu ligante cognato expresso na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, a citocina inclui, mas não está limitada ao grupo que consiste em interferon alfa, interfe ron a2b, interferon gama ou interferon lambda e versões modificadas ou fragmentos dos mesmos que se ligam ao seu ligante cognato ex presso na superfície de uma célula T.

[00130] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molé cula de ligação multivalente, a molécula de ligação multivalente com preendendo: (a) uma molécula de ligação ao IL27Rα e (b) uma segun damolécula de ligação que se liga especificamente ao domínio extra- celular de uma segunda molécula de superfície celular, em que a mo lécula de ligação ao IL27Rα e a segunda molécula de ligação estão operavelmente ligadas, opcionalmente por meio de um ligante químico ou polipeptídico. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são úteis na preparação das molécu las de ligação multivalentes descritas em Gonzalez, et al. PCT/US2018/021301 publicado como WO 2018/182935 A1 em 4 de outubro de 2018. Em alguns aspectos, a segunda molécula de ligação se liga especificamente ao domínio extracelular de: (i) um componente do receptor de citocina que ativa a via JAK/STAT na célula; (ii) um re ceptor de tirosina cinase; ou (iii) um membro da superfamília TNFR. Em algumas modalidades, a segunda molécula de superfície é uma tirosina cinase selecionada dentre EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, InsR, IGF1R, InsRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSF1R/Fms, cKit, Flt-3/Flk2, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, PTK7/CCK4, TrkA, TrkB, TrkC, Ror1, Ror2, MuSK, Met, Ron, Axl, Mer, Tyro3, Tie1, Tie2, EphA1-8, EphA10, EphB1-4, EphB6, Ret, Ryk, DDR1, DDR2, Ros, LMR1, LMR2, LMR3, ALK, LTK, SuRTK106/STYK1. Em algumas modalidades, a segunda molécula de superfície é um membro da superfamília TNFR e é selecionada dentre TNFR1 (TNFRSF1A), TNFR2 (TNFRSF1B; TNFRSF2), 41-BB (TNFRSF9); AITR (TNFRSF18); BCMA (TNFRSF17), CD27 (TNFRSF7), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), Receptor de Morte 1 (TNFRSF10C), Receptor de Morte 3 (TNFRSF25), Receptor de Mor te 4 (TNFRSF10A), Receptor de Morte 5 (TNFRSF10B), Morte Recep tor -6 (TNFRSF21), Receptor Isca-3 (TNFRSF6B), Receptor Isca 2 (TNFRSF10D), EDAR, Fas (TNFRSF6), HVEM (TNFRSF14), LTBR (TNFRSF3), OX40 (TNFRSF4), RANK (TNFRSF11A), TACI (TNFRSF13B), Troy (TNFRSF19), XEDAR (TNFRSF27), Osteoprote- gerina (TNFRSF11B), receptor TWEAK (TNFRSF12A), receptor BAFF (TNFRSF13C), receptor NGF (TNFRSF16).

[00131] Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento é um polipeptídeo que se liga especificamente a uma molécula de super fície celular associada a uma célula tumoral (por exemplo, um ligante cognato para um receptor de célula tumoral) selecionado do grupo que consiste em GD2, BCMA, CD19, CD33, CD38, CD70, GD2, IL3Ra2, CD19, mesotelina, Her2, EpCam, Muc1, ROR1, CD133, CEA, EGRFRVIII, PSCA, GPC3, Pan-ErbB e FAP.

[00132] Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento da molécula de ligação ao IL27Rα é um anticorpo (conforme definido aci ma para incluir moléculas como VHHs, scFvs, etc.). Exemplos de anti corpos que podem ser incorporados como um domínio de direciona mento de uma molécula de ligação ao IL27Rα incluem, mas não estão limitados ao grupo que consiste em: anticorpos anti-GD2, anticorpos anti-BCMA, anticorpos anti-CD19, anticorpos anti-CD33, anticorpos anti-CD38 , anticorpos anti-CD70, anticorpos anti-GD2 e anticorpos IL3Ra2, anticorpos anti-CD19, anticorpos anti-mesotelina, anticorpos anti-Her2, anticorpos anti-EpCam, anticorpos anti-Muc1, anticorpos anti-ROR1, anticorpos anti-CD133, anticorpos anti-CEA, anticorpos anti-PSMA, anticorpos anti-EGRFRVIII, anticorpos anti-PSCA, anticor pos anti-GPC3, anticorpos anti-Pan-ErbB e anticorpos anti-FAP.

[00133] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno tam bém pode ser ligado a outro anticorpo para formar, por exemplo, um anticorpo biespecífico ou multiespecífico Rótulos

[00134] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção estão operavelmente ligadas a um rótu lo. Em algumas modalidades, o rótulo é incorporado para facilitar o uso como agente de imagem, agente de diagnóstico ou para uso em pro cedimentos de triagem de células. O termo rótulos inclui, mas não está limitado a rótulos fluorescentes, rótulos de enzimas biologicamente ativas, radioisótopos (por exemplo, íons radioativos), rótulos ativos de ressonância magnética nuclear, rótulos luminescentes ou um compos tomagnético. Em uma modalidade, uma molécula de sdAb de ligação ao IL27Rα (por exemplo, um VHH de ligação ao IL27Rα) em associa ção estável (por exemplo, covalente, covalente coordenada) com rótu los de imagem. O termo rótulos de imagem é usado para descrever qualquer um dentre uma variedade de compostos uma assinatura que facilita a identificação, rastreamento e/ou localização do sdAb de liga ção ao IL27Rα (ou seus metabólitos) usando procedimentos de diag nóstico. Exemplos de rótulos de imagem incluem, mas não estão limi tados a, compostos fluorescentes, compostos radioativos e compostos opacos aos métodos de imagem (por exemplo, raios-X, ultrassom). Exemplos de compostos radioativos úteis como rótulos de imagem in cluem, entre outros, tecnécio-99m (99mTc), índio-111(111In), iodo-131 (131I), iodo-123 (123I), iodo-125 (125I), gálio-67 (67Ga) e Lutécio-177 (177Lu), fósforo (32P), carbono (14C), trítio (3H), ítrio (90Y), actínio (225Ac), astatina (211At), rênio (186Re), bismuto (212Bi ou 213Bi) e ródio (188Rh). Agentes Terapêuticos

[00135] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são operavelmente ligadas a um agente terapêutico. Exemplos de agentes terapêuticos incluem moléculas te rapêuticas pequenas (por exemplo, agentes quimioterapêuticos) ou agentes terapêuticos biológicos, incluindo anticorpos, compostos cito- tóxicos ou citostáticos, um radioisótopo, moléculas de origem vegetal, fúngica ou bacteriana ou proteínas biológicas (por exemplo, toxinas de proteínas) ou partículas (por exemplo, nanopartículas ou partículas virais recombinantes, por exemplo, por meio de uma proteína de re vestimento viral), anticorpos terapêuticos, agentes quimioterapêuticos, conforme descrito mais detalhadamente neste documento.

[00136] Em algumas modalidades, o agente terapêutico que pode ser incorporado nas moléculas de ligação ao IL27Rα da presente in venção são emissores de radiação de curto alcance, incluindo, por exemplo, emissores de alta energia de curto alcance. Exemplos de tal radioisótopo incluem um emissor alfa, um emissor beta, um emissor gama ou um emissor beta/gama. Radioisótopos úteis como agentes terapêuticos incluem ítrio 90 (90Y), lutécio-177 (177Lu), actínio-225 (225Ac), astato-211 (211At), rênio-186 (186Re), bismuto-212 (212Bi), bis- muto-213 (213Bi) e ródio-188 (188Rh).

[00137] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são operavelmente ligadas a um agente citotóxico (ou derivado do mesmo), tal maitansinol ou o maitansinoide DM1), um taxano ou uma caliqueamicina, pseudomonas exotoxina A, deBouganina, toxina ricina, toxina diftérica, uma amatoxina, como a- amanitina, saporina, maitansina, maitansinoide, auristatina, antracicli- na, caliqueamicina, irinotecano, SN-38, duocarmicina, pirrolobenzodia- zepina, dímero de pirrolobenzodiazepina, indolinobenzodiazepina e dímero de indolinobenzodiazepina, ou uma variante do mesmo).

Síntese de moléculas de ligação ao IL27Rα:

[00138] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são polipeptídeos. No entanto, em algu mas modalidades, apenas uma porção da molécula de ligação ao IL27Rα é um polipeptídeo, por exemplo, onde a molécula de ligação ao IL27Rα compreende um domínio não peptidil (por exemplo, um conjugado de sdAb de ligação ao PEG IL27Rα, um conjugado de sdAb de ligação ao IL27Rα de radionucleotídeo ou um conjugado sdAb de ligação ao IL27Rα de molécula pequena). O seguinte fornece orienta ção para permitir a fase sólida e a síntese recombinante das porções polipeptídicas (domínios) das moléculas de ligação ao IL27Rα da pre sente invenção. Nas modalidades em que apenas uma porção da mo lécula de ligação ao IL27Rα é um polipeptídeo, será entendido que o(s) domínio(s) peptidil da molécula de ligação ao IL27Rα é um inter mediário no processo que pode sofrer processamento adicional para completar a síntese das moléculas de ligação ao IL27Rα desejadas. Os domínios polipeptídicos das moléculas de ligação ao IL27Rα po dem ser produzidos por metodologia convencional para a construção de polipeptídeos, incluindo sínteses recombinantes ou em fase sólida, conforme descrito em mais detalhes abaixo.

Síntese Química

[00139] Além de gerar polipeptídeos mutantes através da expres são de moléculas de ácido nucleico que foram alteradas por técnicas de biologia molecular recombinante, domínios polipeptídicos de molé culas de ligação ao IL27Rα podem ser sintetizados quimicamente. Os polipeptídeos sintetizados quimicamente são gerados rotineiramente pelos versados na técnica. A síntese química inclui a síntese direta de um peptídeo por meios químicos dos domínios polipeptídicos das mo léculas de ligação ao IL27Rα exibindo as propriedades descritas. Este método pode incorporar aminoácidos naturais e não naturais nas posi- ções desejadas que facilitam a ligação de moléculas específicas (por exemplo, PEG).

[00140] Em algumas modalidades, os domínios polipeptídicos das moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção podem ser pre-parados por síntese química. A síntese química dos domínios polipep- tídicos das moléculas de ligação ao IL27Rα pode prosseguir via fase líquida ou fase sólida. A síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) permite a incorporação de aminoácidos não naturais e/ou modificação do cadeia principal de peptídeos/proteínas. Várias formas de SPPS estão disponíveis para sintetizar os domínios polipeptídicos das molé culas de ligação ao IL27Rα da presente invenção são conhecidas na técnica (por exemplo, Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3 10; e Camarero J.A. et al., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8). No cur so da síntese química, as funções alfa e quaisquer cadeias laterais reativas podem ser protegidas com grupos lábeis em ácido ou lábeis em base que são estáveis sob as condições de ligação de ligações amida, mas podem ser facilmente clivadas sem prejudicar a cadeia peptídica que se formou.

[00141] Na síntese em fase sólida, o aminoácido N-terminal ou C- terminal pode ser acoplado a um material de suporte adequado. Mate riais de suporte adequados são aqueles que são inertes em relação aos reagentes e condições de reação para as reações de condensa ção e clivagem passo a passo do processo de síntese e que não se dissolvem no meio de reação que está sendo usado. Exemplos de ma teriais de suporte comercialmente disponíveis incluem copolímeros de estireno/divinilbenzeno que foram modificados com grupos reativos e/ou polietileno glicol; copolímeros de estireno/divinilbenzeno clorome- tilados; copolímeros de estireno/divinilbenzeno hidroximetilados ou aminometilados; e similar. O acoplamento sucessivo dos aminoácidos protegidos pode ser realizado de acordo com métodos convencionais na síntese de peptídeos, tipicamente em um sintetizador automatizado de peptídeos.

[00142] No final da síntese em fase sólida, o peptídeo é clivado do material de suporte ao mesmo tempo que cliva os grupos protectores da cadeia lateral. O peptídeo obtido pode ser purificado por vários mé-todoscromatográficos, incluindo, mas não limitado a, cromatografia de adsorção hidrofóbica, cromatografia de permuta iônica, cromatografia de distribuição, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e HPLC de fase reversa.

Produção recombinante

[00143] Alternativamente, domínios polipeptídicos de moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante. Na prática típica de produção re- combinante de polipeptídeos, uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo desejado é incorporada a um vetor de expres são adequado para a célula hospedeira na qual a expressão será rea lizada, sendo a sequência de ácido nucleico operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle de expressão codificação pelo vetor e funcional na célula hospedeira alvo. A proteína recombinante pode ser recuperada através da ruptura da célula hospedeira ou do meio celular se uma sequência líder de secreção (peptídeo sinal) for incorporada ao polipeptídeo. A proteína recombinante pode ser purifi cada e concentrada para uso posterior, incluindo incorporação.

Síntese de Sequências de Ácido Nucleico que Codificam a Molé cula de Ligação ao IL27Rα

[00144] Em algumas modalidades, os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα são produzidos por métodos recombi- nantes usando uma sequência de ácido nucleico que codifica os do-mínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα (ou proteína de fusão compreendendo os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα). A sequência de ácido nucleico que codifica os domínios polipeptídicos desejados da molécula de ligação ao IL27Rα pode ser sintetizada por meios químicos usando um sintetizador de oligonucleotídeos.

[00145] As moléculas de ácido nucleico não estão limitadas a se quências que codificam polipeptídeos; algumas ou todas as sequên ciasnão codificantes que se encontram a montante ou a jusante de uma sequência de codificação (por exemplo, a sequência de codifica ção dos domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα) também podem ser incluídas. Aqueles versados na técnica da biologia molecular estão familiarizados com os procedimentos de rotina para isolar moléculas de ácido nucleico. Eles podem, por exemplo, ser ge rados por tratamento de DNA genômico com endonucleases de restri ção, ou pela realização da reação em cadeia da polimerase (PCR). No caso de a molécula de ácido nucleico ser um ácido ribonucleico (RNA), as moléculas podem ser produzidas, por exemplo, por transcrição in vitro.

[00146] As moléculas de ácido nucleico que codificam os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα (e suas fusões) po dem conter sequências de ocorrência natural ou sequências que dife rem daquelas que ocorrem naturalmente, mas, devido à degeneração do código genético, codificam o mesmo polipeptídeo. Essas moléculas de ácido nucleico podem consistir em RNA ou DNA (por exemplo, DNA genômico, cDNA ou DNA sintético, como o produzido por síntese baseada em fosforamidita) ou combinações ou modificações dos nu- cleotídeos dentro desses tipos de ácidos nucleicos. Além disso, as mo-léculas de ácido nucleico podem ser de fita dupla ou de fita simples (ou seja, uma fita de senso ou antissenso).

[00147] As sequências de ácido nucleico que codificam os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα podem ser obtidas de várias fontes comerciais que fornecem síntese personalizada de se-quências de ácido nucleico. As variantes da sequência de aminoácidos das moléculas de ligação ao IL27Rα HUMANO da presente invenção são preparadas pela introdução de alterações de nucleotídeos apro priadas na sequência de codificação com base no código genético que é bem conhecido na técnica. Tais variantes representam inserções, substituições e/ou deleções especificadas de resíduos, conforme ob-servado. Qualquer combinação de inserção, substituição e/ou deleção especificada pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua a atividade biológica desejada conforme defini do neste documento.

[00148] Os métodos para construir uma sequência de DNA que co difica os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα e expressar essas sequências em um hospedeiro adequadamente trans formado incluem, mas não estão limitados a, usar uma técnica de mu- tagênese assistida por PCR. Mutações que consistem em deleções ou adições de resíduos de aminoácidos a domínios polipeptídicos da mo lécula de ligação ao IL27Rα também podem ser feitas com técnicas recombinantes padrão. No caso de uma deleção ou adição, a molécula de ácido nucleico que codifica os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα é opcionalmente digerida com uma endonu clease de restrição apropriada. O fragmento resultante pode ser ex presso diretamente ou modificado adicionalmente, por exemplo, ligan do-o a um segundo fragmento. A ligação pode ser facilitada se as duas extremidades das moléculas de ácido nucleico contiverem nucleotí- deos complementares que se sobreponham, mas também podem ser ligados fragmentos de extremidades rombas. Os ácidos nucleicos ge rados por PCR também podem ser usados para gerar várias sequên cias mutantes.

[00149] Um domínio polipeptídico de moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção pode ser produzido de forma recombi- nante não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, por exemplo, uma sequência sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de clivagem específico no N- terminal ou C-terminal da molécula de ligação ao IL27Rα madura. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vetor ou pode ser uma parte da sequência de codificação que é inserida no vetor. A se quência sinal heteróloga selecionada preferencialmente é aquela que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência sinal é a sequência sinal que está associada nativamente à molécula de ligação ao IL27Rα (ou seja, a sequência sinal de IL27Rα humano). A inclusão de uma sequência sinal depende se é desejado secretar a molécula de ligação ao IL27Rα das células recombinantes nas quais ela é produzida. Se as células escolhidas forem procarióticas, geral menteé preferível que a sequência de DNA não codifique uma se quência sinal. Se as células escolhidas forem eucarióticas, é geral mente preferido que seja codificada uma sequência sinal e mais prefe rencialmente que seja utilizada a sequência sinal de IL-2 tipo selva gem. Alternativamente, podem ser adequadas sequências sinal hete- rólogas de mamífero, tais como sequências sinal de polipeptídeos se gregados da mesma espécie ou espécies relacionadas, bem como lí deres secretores virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex. Quando a célula hospedeira recombinante é uma célula de levedura, como Saccharomyces cerevisiae, a sequência sinal de secreção do fator de acasalamento alfa pode ser empregada para alcançar a se creção extracelular da molécula de ligação ao IL27Rα no meio de cul tura, conforme descrito em Singh, Patente Norte-americana No. 7.198.919 B1.

[00150] No caso do domínio polipeptídico das moléculas de ligação ao IL27Rα a serem expressas deve ser expresso como uma quimera (por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo uma molécula de ligação ao IL27Rα e uma sequência polipeptídica heteróloga), a proteína quimérica pode ser codificada por um híbrido molécula de ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência que codifica a totalidade ou parte dos domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα e uma segunda sequência que codifica a totalidade ou par te do polipeptídeo heterólogo. Por exemplo, os domínios polipeptídicos das moléculas de ligação ao IL27Rα aqui descritos podem ser fundi dos a um marcador de hexa-histidina (SEQ ID NO: 195) para facilitar a purificação da proteína expressa bacteriana ou a um marcador de he- xa-histidina (SEQ ID NO: 195), hemaglutinina ou Fc para facilitar a puri ficação da proteína expressa em células eucarióticas. Por primeiro e segundo, não deve ser entendido como limitante à orientação dos elementos da proteína de fusão e um polipeptídeo heterólogo pode ser ligado no N-terminal e/ou C-terminal dos domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα. Por exemplo, o N-terminal pode estar ligado a um domínio de direcionamento e o C-terminal ligado a um identificador de purificação de hexa-histidina (SEQ ID NO: 195).

[00151] A sequência de aminoácidos completa do domínio polipep- tídico da molécula de ligação ao IL27Rα (ou fusão/quimera) a ser ex pressa pode ser usada para construir um gene retrotraduzido. Um oli- gômero de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o domínio polipeptídico das moléculas de ligação ao IL27Rα pode ser sintetizado. Por exemplo, vários oligonucleótidos pequenos que codifi camporções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e de pois ligados. Os oligonucleotídeos individuais normalmente contêm saliências 5' ou 3' para montagem complementar.

[00152] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio polipeptídico da molécula de ligação ao IL27Rα pode ser "otimizada por códon"para facilitar a expressão em um de-terminado tipo de célula hospedeira. Técnicas para otimização de có- dons em uma ampla variedade de sistemas de expressão, incluindo células hospedeiras de mamíferos, leveduras e bactérias, são bem co-nhecidas na literatura e existem ferramentas online para fornecer se-quências otimizadas de códons para expressão em uma variedade de tipos de células hospedeiras. Veja, por exemplo, Hawash, et al., (2017) 9:46-53 e Mauro e Chappell em Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols, editado por David Hacker (Human Press New York). Além disso, há uma variedade de pacotes de software on-line baseados na web que estão disponíveis gratuita mente para auxiliar na preparação de sequências de ácidos nucleicos otimizadas por códons.

Vetores de Expressão

[00153] Uma vez montada (por síntese, mutagênese dirigida ao sí tio ou outro método), a sequência de ácido nucleico que codifica os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα será inseri da em um vetor de expressão. Uma variedade de vetores de expres são para uso em várias células hospedeiras estão disponíveis e são tipicamente selecionados com base na célula hospedeira para expres são. Um vetor de expressão normalmente inclui, mas não está limitado a, um ou mais dos seguintes: uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento realçador, um promotor e uma se quência de terminação da transcrição. Os vetores incluem vetores vi rais, vetores plasmídicos, vetores integradores e semelhantes. Os plasmídeos são exemplos de vetores não virais. Para facilitar a ex pressão eficiente do polipeptídeo recombinante, a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência polipeptídica a ser expressa é ope- ravelmente ligada a sequências de controle regulatórias transcricionais e translacionais que são funcionais no hospedeiro de expressão esco- lhido.

[00154] Os vetores de expressão normalmente contêm um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Este gene codi fica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas em um meio de cultura seletivo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor con tendo o gene de seleção não sobreviverão no meio de cultura. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, me- totrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios comple xos.

[00155] Os vetores de expressão para o domínio polipeptídico das moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção contêm uma sequência reguladora que é reconhecida pelo organismo hospedeiro e está operavelmente ligada à sequência de ácido nucleico que codifica os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα. Os ter mos "sequência de controle regulador", "sequência reguladora" ou "sequência de controle de expressão" são usados neste documento de forma intercambiável para se referir a promotores, realçadores e ou tros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poli- adenilação). Veja, por exemplo, Goeddel (1990) em Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego CA, USA), a sequência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas do te-cido).Será apreciado pelos versados na técnica que o desenho do ve tor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína dese-jada e semelhantes. Ao selecionar uma sequência de controle de ex-pressão, uma variedade de fatores compreendidos por alguém versa- do na técnica devem ser considerados. Estes incluem, por exemplo, a força relativa da sequência, sua controlabilidade e sua compatibilidade com a sequência de DNA real que codifica a molécula de ligação ao IL27Rα em questão, particularmente no que diz respeito a estruturas secundárias potenciais.

[00156] Em algumas modalidades, a sequência reguladora é um promotor, que é selecionado com base, por exemplo, no tipo de célula em que a expressão é procurada. Os promotores são sequências não transladadas localizadas a montante (5') do códon iniciador de um ge ne estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que con trolam a transcrição e a translação de uma sequência de ácido nuclei- co específica à qual estão operavelmente ligados. Esses promotores normalmente se enquadram em duas classes, induzíveis e constituti vos. Os promotores induzíveis são promotores que iniciam níveis au mentados de transcrição do DNA sob seu controle em resposta a al gumamudança nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura. Um gran de número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais é bem conhecido.

[00157] Um promotor de T7 pode ser usado em bactérias, um pro motor de poliedrina pode ser usado em células de insetos e um cito- megalovírus ou promotor de metalotioneína pode ser usado em células de mamíferos. Além disso, no caso de eucariotos superiores, promoto-resespecíficos de tecido e específicos de tipo de célula estão ampla-mentedisponíveis. Esses promotores são assim denominados por sua capacidade de direcionar a expressão de uma molécula de ácido nu- cleico em um determinado tecido ou tipo de célula dentro do corpo. Aqueles versados na técnica estão bem cientes de numerosos promo-tores e outros elementos reguladores que podem ser usados para di-recionar a expressão de ácidos nucleicos.

[00158] A transcrição de vetores em células hospedeiras de mamí feros pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos a par tir dos genomas de vírus, como vírus polioma, vírus do epitelioma con-tagioso,adenovírus (como adenovírus humano serotipo 5), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário , citomegalovírus, um retro- vírus (como vírus de células-tronco murinas), vírus da hepatite B e, mais preferencialmente, vírus símio 40 (SV40), de promotores heteró- logos de mamíferos, por exemplo, o promotor de actina, PGK (fosfogli- cerato cinase) ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. Os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral SV40.

[00159] A transcrição por eucariotos superiores é frequentemente aumentada pela inserção de uma sequência realçadora no vetor. Os realçadores são elementos de DNA de ação cis, geralmente de 10 a 300 pb, que atuam em um promotor para aumentar sua transcrição. Os realçadores são relativamente independentes de orientação e posi ção, tendo sido encontrados 5' e 3' para a unidade de transcrição, den tro de um íntron, bem como dentro da própria sequência de codifica ção. Muitas sequências realçadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína e insuli na). Tipicamente, no entanto, usar-se-á um potenciador de um vírus de células eucarióticas. Os exemplos incluem o realçador SV40 no lado tardio da origem de replicação, o realçador do promotor inicial de cito- megalovírus, o realçador de polioma no lado tardio da origem de repli- cação e os realçadores de adenovírus. O realçador pode ser emenda do no vetor de expressão em uma posição 5' ou 3' para a sequência de codificação, mas é preferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor. Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas também conterão as sequências necessárias para o tér mino da transcrição e para a estabilização do mRNA. Essas sequên ciasestão comumente disponíveis nas regiões não transladadas 5' e, ocasionalmente, 3' de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. A cons-trução de vetores adequados contendo um ou mais dos componentes listados acima utiliza técnicas padrão.

[00160] Além das sequências que facilitam a transcrição da molécu la de ácido nucleico inserida, os vetores podem conter origens de re- plicação e outros genes que codificam um marcador selecionável. Por exemplo, o gene de resistência à neomicina (neoR) confere resistência a G418 às células nas quais é expresso e, assim, permite a seleção fenotípica das células transfectadas. Exemplos adicionais de genes marcadores ou repórteres incluem beta-lactamase, cloranfenicol acetil- transferase (CAT), adenosina desaminase (ADA), dihidrofolato redu- tase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina cinase (TK), lacZ (que codifica beta- galactosidase) e xantina guanina fosfori- bosiltransferase (XGPRT). Aqueles versados na técnica podem deter minar facilmente se um determinado elemento regulador ou marcador selecionável é adequado para uso em um contexto experimental parti cular. A montagem adequada do vetor de expressão pode ser confir mada por sequenciamento de nucleotídeos, mapeamento de restrição e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospe deiro adequado.

Células Hospedeiras

[00161] A presente invenção fornece ainda células procarióticas ou eucarióticas que contêm e expressam uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio polipeptídico da molécula de ligação ao IL27Rα. Uma célula da presente invenção é uma célula transfectada, ou seja, uma célula na qual uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio po- lipeptídico da molécula de ligação ao IL27Rα, foi introduzida por meio de técnicas de DNA recombinante. A progênie de tal célula também é considerada dentro do escopo da presente invenção.

[00162] As células hospedeiras são tipicamente selecionadas de acordo com sua compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, a toxicidade do produto codificado pelas sequências de DNA desta molécula de ligação ao IL27Rα, suas características de secreção, sua capacidade de dobrar os polipeptídeos corretamente, sua fermentação ou requisitos de cultura, e a facilidade de purificação dos produtos co-dificados pelas sequências de DNA. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui descritos são as células procariotas, leveduras ou eucariotas superiores.

[00163] Em algumas modalidades, os domínios polipeptídicos re- combinantes da molécula de ligação ao IL27Rα ou suas variantes bio-logicamente ativas também podem ser produzidos em eucariotos, co mo células de levedura ou humanas. Células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem células de insetos (exemplos de vetores de bacu- lovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de insetos cultivadas (por exemplo, células Sf9) incluem a série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers (1989) Virology 170:31-39)); células de levedura (exemplos de vetores para expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) e pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)); ou células de mamífero (vetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) e pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187:195)).

[00164] Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são células L de camundongo (L-M[TK-], ATCC#CRL-2648), linha- gem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células HEK293 ou HEK293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão; cé lulas de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO); células de sertoli de camundongo (TM4); células de rim de macaco ( CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim cani no (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI; células MRC 5; FS4 células; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em células de mamíferos, as funções de controle do vetor de expressão são frequentemente fornecidas por elementos reguladores virais. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de polio- ma, Adenovírus 2, citomegalovírus e Vírus Símio 40.

[00165] Os domínios polipeptídicos da molécula de ligação ao IL27Rα podem ser produzidos em um hospedeiro procariótico, como a bactéria E. coli, ou em um hospedeiro eucariótico, como uma célula de inseto (por exemplo, uma célula Sf21) ou células de mamíferos (por exemplo, células COS , células NIH 3T3 ou células HeLa). Estas célu lasestão disponíveis em muitas fontes, incluindo a American Type Culture Collection (Manassas, Va.). Técnicos ou especialistas comuns são capazes de fazer tal determinação. Além disso, se for necessária orientação na seleção de um sistema de expressão, os especialistas podem consultar Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Bio logy, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993) e Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Supl. 1987).

[00166] Em algumas modalidades, os domínios polipeptídicos re- combinantes da molécula de ligação ao IL27Rα podem ser glicosilados ou não glicosilados dependendo do organismo hospedeiro usado para produzir a molécula de ligação ao IL27Rα. Se as bactérias forem esco-lhidas como hospedeiras, então os domínios polipeptídicos do sdAb de ligação ao IL27Rα podem conter um motivo de glicosilação, particu-larmente um motivo de glicosilação ligada a N da sequência Asn-X-Ser (N-X-S) ou Asn-X-Thr (N-X-T), em que X é qualquer aminoácido exce to prolina. Em tais casos, é desejável eliminar tais motivos de glicosila- ção ligados a N modificando a sequência do motivo de glicosilação li gado a N para evitar a glicosilação. Em algumas modalidades, a elimi nação do motivo de glicosilação ligada a N Asn-X-Ser (N-X-S) pode ser alcançada pela incorporação de substituição conservadora de ami- noácidos do resíduo Asn (N) e/ou resíduo Ser (S) do motivo de glicosi- lação ligado a N Asn-X-Ser (N-X-S). Em algumas modalidades, a eli minação do motivo de glicosilação ligada a N Asn-X-Thr (N-X-T) pode ser alcançada pela incorporação de substituição conservadora de ami- noácidos do resíduo Asn (N) e/ou resíduo Thr (T) do motivo de glicosi- lação ligado a N Asn-X-Thr (N-X-T). Em algumas modalidades, a eli minação das células hospedeiras procarióticas As não fornece o me canismo para glicosilação de proteínas recombinantes, ao empregar um sistema de expressão procariótica para produzir um sdAb de liga ção ao IL27Rα Crissrecombinante recombinante, a modificação da se quência para eliminar os sítios de glicosilação ligados a N pode ser evitado.

[00167] Para outros sistemas de expressão adicionais para células procarióticas e eucarióticas, ver os capítulos 16 e 17 de Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Ver, Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Acade mic Press, San Diego, Calif.).

Transfecção

[00168] Os construtos de expressão podem ser introduzidos em cé lulas hospedeiras para, desse modo, produzir os domínios polipeptídi- cos recombinantes da molécula de ligação ao IL27Rα aqui divulgada ou para produzir muteínas biologicamente ativas dos mesmos. O DNA vetorial pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por meio de técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedei ras podem ser encontrados em Sambrook et al. (1989) Molecular Clo ning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) e outros manuais padrão de laboratório de bio logia molecular.

[00169] A fim de facilitar a transfecção das células alvo, a célula al vo pode ser exposta diretamente com o vetor não viral em condições que facilitam a absorção do vetor não viral. Exemplos de condições que facilitam a absorção de ácido nucleico estranho por células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a meios químicos (tais como Lipofectamine®, Thermo-Fisher Scientific), alto teor de sal e campos magnéticos (eletroporação).

Cultura de Células

[00170] As células podem ser cultivadas em meios nutrientes con-vencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as se-quências desejadas. Células hospedeiras de mamíferos podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios disponíveis comercial-mente, como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI 1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme neces sário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insuli- na, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (como clore to de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES ), nu- cleosídeos (como adenosina e timidina), antibióticos, oligoelementos e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suple-mentosnecessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e ficarão evidentes para o versado na técnica.

Recuperação de Proteínas Recombinantes

[00171] Os polipeptídeos de ligação ao IL27Rα produzidos de forma recombinante podem ser recuperados do meio de cultura como um polipeptídeo segregado se for empregada uma sequência líder de se-creção. Alternativamente, os polipeptídeos de ligação ao IL27Rα tam bém podem ser recuperados de lisados de células hospedeiras. Um inibidor de protease, tal como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) pode ser empregado durante a fase de recuperação de lisados celula res para inibir a degradação proteolítica durante a purificação, e anti bióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contami- nantes adventícios.

Purificação

[00172] Várias etapas de purificação são conhecidas na técnica e encontram uso, por exemplo, cromatografia por afinidade. A cromato- grafia por afinidade faz uso de sítios de ligação altamente específicos geralmente presentes em macromoléculas biológicas, separando mo-léculas de acordo com sua capacidade de se ligar a um determinado ligante. As ligações covalentes ligam o ligante a um meio de suporte poroso e insolúvel de uma maneira que apresenta abertamente o li- gante à amostra de proteína, usando assim a ligação específica natu ral de uma espécie molecular para separar e purificar uma segunda espécie de uma mistura. Os anticorpos são comumente usados em cromatografia por afinidade. Etapas de seleção de tamanho também podem ser usadas, por exemplo, cromatografia de filtração em gel (também conhecida como cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia de peneira molecular) é usada para separar proteínas de acordo com seu tamanho. Na filtração em gel, uma solução de pro teína é passada através de uma coluna que é preenchida com resina porosa semipermeável. A resina semipermeável possui uma faixa de tamanhos de poros que determina o tamanho das proteínas que po dem ser separadas com a coluna.

[00173] Os domínios polipeptídicos recombinantes da molécula de ligação ao IL27Rα produzidos pelo hospedeiro transformado podem ser purificados de acordo com qualquer método adequado. Moléculas de ligação ao IL27Rα podem ser isoladas de corpos de inclusão gera dos em E. coli ou de meio condicionado de culturas de mamíferos ou leveduras produzindo uma determinada molécula de ligação ao IL27Rα por meio de troca catiônica, filtração em gel e/ou cromatografia líquida de fase reversa.

[00174] As formas substancialmente purificadas dos polipeptídeos recombinantes podem ser usadas, por exemplo, como agentes tera-pêuticos, conforme descrito neste documento.

[00175] A atividade biológica dos domínios polipeptídicos recombi- nantes da molécula de ligação ao IL27Rα produzida de acordo com o anterior pode ser confirmada por uma ligação de IL27Rα usando pro-cedimentos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a ELISA de competição, ensaios de ligação ao ligante radioativo (por exemplo, ligação de saturação, gráfico de Scatchard, programas de ajuste de curvas não lineares e ensaios de ligação de competição); ensaios de ligação de ligantes não radioativos (por exemplo, polariza ção de fluorescência (FP), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e ensaios de ressonância de plasmônio superfi cial (ver, por exemplo, Drescher et al., Methods Mol Biol 493:323-343 (2009) com instrumentação disponível comercialmente por GE Heal-thcare Bio-Sciences, como o Biacore 8+, Biacore S200, Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences, 100 Results Way, Marlborough MA 01752)); ensaios de ligação ao ligante em fase líquida (por exemplo, reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-qPCR) e imuno- precipitação); e ensaios de ligação ao ligante em fase sólida (por exemplo, ensaios de placas de poços múltiplos, ensaios de ligação ao ligante em conta, ensaios de ligação ao ligante em coluna e ensaios de filtro).

Métodos de Uso Inibição da Atividade de IL27Rα

[00176] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé todo de modular a atividade de células que expressam o IL27Rα pela administração de uma molécula de ligação ao IL27Rα a um indivíduo em uma quantidade suficiente para interferir com a atividade dos re ceptores compreendendo o de IL27Rα. A presente invenção fornece ainda um método de modulação da atividade de células que expres sam o IL27Rα em uma população mista de células compreendendo o contato da referida população de células, in vivo e/ou ex vivo, com uma molécula de ligação ao IL27Rα ou complexo da presente inven ção a uma quantidade suficiente para interferir na atividade dos recep tores que compõem o IL27Rα.

Identificação, Isolamento, Enriquecimento ou Depleção de Células IL27Rα+

[00177] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé todo de uso das moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção útil em um processo para isolamento, enriquecimento ou depleção de células IL27Rα+ de uma amostra biológica compreendendo células IL27Rα+. A amostra biológica pode compreender células de origem sanguínea, como PBMC, células T, células B de origem de cultura ce-lular ou de origem tecidual, como cérebro ou medula óssea. Os pro-cessos adequados para o isolamento, enriquecimento ou depleção de células IL27Rα+ compreendem centrifugação, filtração, seleção de cé-lulasmagnéticas e seleção de células fluorescentes por técnicas bem conhecidas na técnica. A presente invenção fornece ainda um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença, distúrbio ou condição pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um produto celular enriquecido ou esgotado de células IL27Rα+ através do uso de uma molécula de ligação ao IL27Rα con forme descrito aqui.

[00178] Em uma modalidade, o procedimento de rastreamento utili za uma molécula de ligação ao IL27Rα compreendendo um marcador fluorescente para uso no isolamento de FACS ou depleção de células IL27Rα+ de uma amostra. O marcador fluorescente pode ser anexado ao sdAb da molécula de ligação ao IL27Rα diretamente (por exemplo, por conjugação química empregando opcionalmente um ligante) ou indiretamente (por exemplo, por biotinilação do sdAb e ligação ao anti-corpo biotinilado a um conjugado de fluorocromo de estreptavidina). Essas células IL27Rα+ marcadas com fluorescência podem ser sepa-radas de uma população de células mistas usando tecnologia FACS convencional.

[00179] Em uma modalidade alternativa, o procedimento de seleção utiliza moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção (por exemplo, um VHH de ligação ao IL27Rα) são conjugadas a partículas magnéticas que fornecem marcação magnética das células IL27Rα+ para uso em procedimentos de separação magnética de células. Em uma modalidade, o método compreende: (a) conjugação de uma ou mais moléculas de ligação ao IL27Rα da presente invenção (por exemplo, um VHH de ligação ao IL27Rα) a uma partícula magnética; (b) criação de uma mistura por contato da amostra biológica com uma quantidade das partículas magnéticas conjugadas à molécula de liga ção ao IL27Rα; (c) submissão a um campo magnético de modo que as células IL27Rα+ marcadas magneticamente sejam retidas; (d) remo ção das células não marcadas magneticamente da mistura; e (e) re moção do campo magnético permitindo o isolamento das células IL27Rα+.

[00180] O procedimento de seleção de células (por exemplo, FACS ou separação magnética) resulta em dois produtos: (a) uma população de células esgotadas de células IL27Rα+ e (b) uma população de célu las enriquecida para células IL27Rα+. Cada uma dessas populações pode ser posteriormente processada por procedimentos de convenção para identificar subconjuntos de células IL27Rα+ ou IL27Rα- específi cos que podem ser úteis em aplicações clínicas, de diagnóstico ou de pesquisa. Por exemplo, isolamento de subconjuntos específicos de células T IL27Rα+ que também expressam um ou mais dentre CD4, CD8, CD19, CD25 e CD62L, outras iterações do uso de um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a antígenos CD4, CD8, CD19, CD25, e CD62L, respectivamente, por FACS ou separação por campo magnético por técnicas bem conhecidas na técnica.

[00181] Em uma modalidade da molécula de ligação ao IL27Rα po de ser usado para depleção de células que expressam IL27Rα de uma amostra biológica compreendendo células que expressam IL27Rα tais como sangue periférico ou tecido linfoide que pode opcionalmente ser posteriormente processado para isolamento adicional de subconjuntos de células T virgem de IL27Rα+, isolamento de células T de memória IL27Rα+ humanas de uma população de células CD4+ ou CD8+ ou isolamento de células T virgens de IL27RαRA+ humanas de células CD4+ ou CD8+ pré-selecionadas por depleção de células IL27Rα+. Em uma modalidade, a molécula de ligação ao IL27Rα fornece um mé-todo para gerar uma população de células enriquecida para Tregs vir-gens a partir de uma amostra biológica, o método compreendendo a depleção de células IL27Rα+ usando uma molécula de ligação ao IL27Rα da presente invenção conforme descrito acima, opcionalmente compreendendo ainda as etapas de depleção de células CD8+ e/ou CD19+. A população de células esgotadas de IL27Rα+ pode opcio-nalmente ser ainda expandida in vitro para tipos de células particulares na preparação de um produto celular compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do produto celularesgotado em IL27Rα+ que pode ser administrado a um indivíduo que sofre de uma doença, dis túrbio ou condição. A população de células enriquecida com IL27Rα+ pode opcionalmente ser ainda expandida in vitro para a preparação de um produto celular compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz das células IL27Rα+.

Kits

[00182] A presente invenção também contempla kits compreenden-docomposições farmacêuticas de moléculas de ligação ao IL27Rα. Os kits são geralmente na forma de uma estrutura física que abriga vários componentes, conforme descrito abaixo, e podem ser utilizados, por exemplo, na prática dos métodos descritos acima. Um kit da presente invenção pode ser projetado para as condições necessárias para man ter adequadamente os componentes alojados nele (por exemplo, refri-geração ou congelamento). Um kit pode ainda conter um rótulo ou en-carte de embalagem incluindo informações de identificação para os componentes nele contidos e instruções para seu uso. Cada compo nente do kit pode ser colocado dentro de um recipiente individual e to dos os vários recipientes podem estar dentro de uma única embala gem.Rótulos ou encartes de embalagem podem incluir informações do fabricante, como números de lote e datas de validade. O rótulo ou encarte da embalagem pode ser, por exemplo, integrado na estrutura física que abriga os componentes, contido separadamente dentro da estrutura física ou afixado a um componente do kit (por exemplo, uma ampola, seringa ou frasco). Rótulos ou encartes de embalagem podem ser fornecidos em forma física ou em meio legível por computador. Em algumas modalidades, as instruções reais não estão presentes no kit, mas o kit fornece um meio para obter as instruções de uma fonte re mota, por exemplo, por meio de um site da Internet, inclusive por acesso seguro, fornecendo uma senha (ou código escaneável, como um código de barras ou código QR no recipiente da molécula de liga ção ao IL27Rα ou kit compreendendo) em conformidade com os regu lamentos governamentais (por exemplo, HIPAA).

EXEMPLOS

[00183] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a forne cer aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar a presente molécula de ligação ao IL27Rα, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua molécula de ligação ao IL27Rα nem pretendem representar que os experimentos abaixo sejam realizados e, são todos os experimentos que podem ser realizados. Deve ser entendido que descrições exem plares escritas no tempo presente não foram necessariamente realiza das, mas sim que as descrições podem ser realizadas para gerar os dados e similares descritos nelas. Esforços foram feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Variações dos procedimentos particularmente des critos empregados podem se tornar aparentes para os indivíduos ou versados na técnica e espera-se que os versados na técnica possam empregar tais variações conforme apropriado. Consequentemente, pretende-se que a molécula de ligação ao IL27Rα seja praticada de maneira diferente da especificamente descrita neste documento, e que a invenção inclua todas as modificações e equivalentes do assunto citado nas reivindicações anexas a este documento, conforme permiti do pela lei aplicável.

[00184] Salvo indicação em contrário, as partes são partes em pe so, o peso molecular é o peso molecular médio ponderado, a tempera turaé em graus Celsius (°C) e a pressão é igual ou próxima da atmos férica. São usadas abreviaturas padrão, incluindo as seguintes: bp = par(es) de base; kb = quilobase(s); pl = picolitro(s); s ou seg = segun- do(s); min = minuto(s); h ou hr = hora(s); aa = aminoácido(s); kb = qui- lobase(s); nt = nucleotídeo(s); pg = picograma; ng = nanograma; μg = micrograma; mg = miligrama; g = grama; kg = quilograma; dl ou dL = decilitro; μl ou μL = microlitro; ml ou mL = mililitro; l ou L = litro; μM = micromolar; mM = milimolar; M = molar; kDa = quilodalton; i.m. = in- tramuscular(mente); i.p. = intraperitoneal(mente); SC ou SQ = subcu- tânea(mente); QD = diário; BID = duas vezes ao dia; QW = semanal; QM = mensal; HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho; PC = peso corporal; U = unidade; ns = sem significância estatística; PBS = solução salina tamponada com fosfato; PCR = reação em cadeia da polimerase; NHS = N-hidroxissuccinimida; HSA = albumina sérica hu mana; MSA = albumina sérica de camundongo; DMEM = Meio de Ea gle Modificado de Dulbeco; GC = cópia do genoma; EDTA = ácido eti- lenodiaminotetracético; PBMCs = células mononucleares primárias do sangue periférico; FBS = soro bovino fetal; FCS = soro de vitelo fetal; HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico; LPS = lipopolissacarídeo; ATCC = American Type Culture Collection

Exemplo 1. Protocolo de Imunização

[00185] O processo para isolamento dos VHHs anti-hIL27Rα foi ini ciado pela imunização de um camelo com um polipeptídeo correspon dente aos aminoácidos 33-516 de hIL27Rα, (Referência UNIPROT No. Q6UWB1). O processo de isolamento dos VHHs anti-mIL27Rα foi ini-ciado pela imunização de um camelo com o domínio extracelular de 201 aminoácidos do mIL27Rα, aminoácidos 25-510 do precursor do mIL27Rα (Referência UNIPROT No. O70394). Com relação a cada antígeno, a seguinte metodologia foi usada para identificar e isolar os VHHs.

[00186] A sequência de DNA sintético que codifica o antígeno foi inserida no vetor pFUSE_hIgG1_Fc2 (Generay Biotechnology) e trans- fectada na célula hospedeira de mamífero HEK293F para expressão. O antígeno é expresso como uma proteína de fusão Fc que é purifica da usando cromatografia de proteína A. O antígeno foi diluído com 1 x PBS (antígeno total de cerca de 1 mg). A qualidade foi estimada por SDS-PAGE para garantir que a pureza fosse suficiente (>80%) para imunização. O camelo foi aclimatado na instalação por pelo menos 7 dias antes da imunização. A imunização com o antígeno foi realizada utilizando a administração do antígeno uma vez por semana durante um período de 7 semanas. Para a imunização inicial, o imunogênio foi preparado da seguinte forma: 10mL de Adjuvante de Freund completo (CFA) foram adicionados ao almofariz, então 10mL de antígeno em 1 x PBS foram adicionados lentamente ao almofariz com o pilão triturado e a amostra moída até que o antígeno fosse emulsificado até ficar bran co leitoso e difícil de dispersar. Para as seis imunizações subsequen tes (semanas 2-7) no protocolo de imunização, o imunogênio foi pre parado como acima, exceto que o adjuvante incompleto de Freund (IFA) foi usado no lugar do CFA. Pelo menos seis locais no camelo foram injetados subcutaneamente com aproximadamente 2 ml do antí- geno emulsificado para um total de aproximadamente 10 ml por came lo. Ao injetar o antígeno, a agulha é mantida no espaço subcutâneo por aproximadamente 10 a 15 segundos após cada injeção para evitar vazamento da emulsão.

Exemplo 2. Construção de Biblioteca de Fagos

[00187] Uma amostra de sangue foi coletada do camelo três dias após a última injeção no protocolo de imunização. O RNA foi extraído do sangue e transcrito em cDNA. As sequências transcritas reversas de aproximadamente 900 pb que codificam os construtos VH-CH1- articulação-CH2-CH3 foram isoladas dos fragmentos de 700 pb apro-ximadamente desejados que codificam as espécies VHH-articulação- CH2-CH3. Os fragmentos purificados de aproximadamente 700 pb fo ram amplificados por PCR nested. As sequências amplificadas foram digeridas usando Pst1 e Not1. Os fragmentos digeridos com PST1/Not1 de aproximadamente 400 pb foram inseridos em um vetor de fagomídeo pMECS digerido com Pst1/Not1 de modo que a sequên cia que codifica o VHH estivesse em estrutura com uma sequência de DNA que codificasse uma sequência HA/His. As sequências geradas por PCR e o vetor do fagomídeo pMECS foram digeridos com Pst I e Not I, posteriormente, ligados ao pMECS/Nb recombinante. Após a ligação, os produtos foram transformados em células Escherichia coli (E. coli) TG1 por eletroporação. Os transformantes foram enriquecidos em meio de crescimento, seguido de transferência para placas de ágar 2YT + glicose 2%.

Exemplo 3: Isolamento de VHHs Específicos de Antígeno

[00188] A biopaniculação da biblioteca de fagos foi conduzida para identificar VHHs que se ligam a IL27Rα. Uma placa de 96 poços foi revestida com IL27Rα e a biblioteca de fagos foi incubada em cada poço para permitir que VHH reativo a IL27Rα que expressa fagos se ligasse ao IL27Rα na placa. Os fagos ligados não especificamente fo ram lavados e os fagos especificamente ligados foram isolados. Após a seleção, a biblioteca enriquecida de fagos expressando VHH reativo a IL27Rα foi amplificada em células TG1. O processo de biopanicula- ção mencionado acima foi repetido por 2-3 ciclos para enriquecer a biblioteca para VHH seletivo para IL27Rα.

Exemplo 4: Identificação de Anticorpos que Exibem Ligação Es pecífica a IFNgRI:

[00189] Após a conclusão da biopaniculação do Exemplo 3, três placas de 96 poços de clones de fagos individuais foram isoladas a fim de realizar ELISA de extrato periplasmático (PE-ELISA) em placas re-vestidas com IL27Rα para identificar ligantes VHH positivos que ligam seletivamente IFNgR1. Uma placa de 96 poços foi revestida com IL27Rα e PBS nas mesmas condições. Em seguida, os poços foram bloqueados a 37 °C por 1 hora. Em seguida, 100 μl de anticorpos ex traídos foram adicionados a cada poço e incubados por 1 h. Posteri ormente, 100 μl de anticorpo policlonal antimarcador conjugado com HRP foram adicionados a cada poço e incubados a 37 °C por 1 h. As placas foram desenvolvidas com substrato TMB. A reação foi inter rompida pela adição de H2SO4. A absorvência a 450 nm foi lida em um leitor de placas de microtitulação. Anticorpos com absorvência do poço revestido com antígeno pelo menos três vezes maior que o con trole revestido com PBS foram definidos como exibindo ligação especí fica a IL27Rα. Os clones positivos foram sequenciados e as sequên cias analisadas para identificar clonótipos únicos.

Exemplo 5. Avaliação da Afinidade de Ligação Via Ressonância de Plasmônio Superficial

[00190] Um exemplo representativo de cada clonótipo hIL27Rα VHH gerado de acordo com os Exemplos 1-3 foi selecionado para ava liação da ligação via SPR como segue. A avaliação da afinidade de ligação das moléculas de ligação a hIL27Rα correspondentes a SEQ ID NOS 2-27 foi conduzida usando ressonância de plasmônio superfi cial (SPR) de acordo com o procedimento a seguir. Todos os experi mentos foram conduzidos em Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, Polissor- bato 20 (PS20) 0,05% (v/v) e EDTA 3 mM (tampão HBS-EP+) em um instrumento Biacore T200 equipado com um chip sensor derivado de Proteína A (Cytiva). Os ligantes Mono-Fc VHH fluíram a 5 μl/min por tempo variável variando de 18 a 300 segundos, atingindo as cargas de captura listadas nas tabelas abaixo. Após a captura do ligante, as inje-çõesde uma série de diluição de 2 vezes do domínio extracelular do receptor IL27Rα modificado para incorporar uma sequência poli-His C- terminal, tipicamente compreendendo pelo menos cinco concentrações entre 1 μM e 1 nM, foram realizadas em alto desempenho ou modo cinético de ciclo único. A regeneração da superfície foi conseguida flu-indo glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 (60 segundos, 50 μL/min). Os senso- gramas com subtração de tampão foram processados com o software de avaliação Biacore T200 e ajustados globalmente com um modelo de ligação de Langmuir 1:1 (deslocamento em massa definido como zero) para extrair cinética e constantes de afinidade (ka, kd, KD). RMÁX < 100 RU indica densidade de superfície compatível com análise ciné tica. Os valores de Rmáx calculados foram gerados usando a equa ção: Rmáx = Carga (RU) x valência do ligante x (Peso molecular do analisado/Peso molecular do ligante). A atividade de superfície foi de finida como a relação de Rmáx experimental/calculado. Os resultados desses experimentos de afinidade de ligação são fornecidos na Tabela 6.

[00191] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudan ças à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na téc nica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, números de acesso de sequência, patentes e pedidos de patentes aqui citados são aqui incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins.

Claims (15)

1. Molécula de ligação a IL27Rα, caracterizada pelo fato de que se liga especificamente ao domínio extracelular de IL2Rb.

2. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com a reivindi-cação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação a IL2Rb compreende um anticorpo de domínio único (sdAb).

3. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com a reivindi-cação 2, caracterizada pelo fato de que o sdAb compreende uma regi ão determinante de complementaridade 1 (CDR1), uma CDR2 e uma CDR3 conforme mostrado em uma linha da tabela abaixo:

4. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com a reivindi- cação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o sdAb tem pelo menos 80%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 98%, alternativamente pelo menos 99% de identidade ou 100% de identidade com uma sequência polipeptídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-25.

5. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com a reivindi-cação 2, caracterizada pelo fato de que o sdAb compreende uma regi ão determinante de complementaridade 1 (CDR1), uma CDR2 e uma CDR3 conforme mostrado em uma linha da tabela abaixo:

6. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com a reivindi- cação 2, caracterizada pelo fato de que o sdAb tem pelo menos 80%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 98%, alternativamente pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identi dade com uma sequência polipeptídica de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170 e 174.

7. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com a reivindi-cação 3 ou 5, caracterizada pelo fato de que o sdAb é humanizado ou de outra forma compreende CDRs enxertadas em uma estrutura hete- róloga.

8. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compre ende ainda um agente de marcação, um agente de imagem e/ou um agente terapêutico.

9. Molécula de ligação a IL27Rα, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é para uso no isolamento, depleção ou enriquecimento de células IL27Rα+ em uma amostra biológica.

10. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica a molécula de ligação a IL27Rα, como definida em qual quer uma das reivindicações 1 a 8.

11. Vetor recombinante viral ou não viral, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico, como definido na reivindi-cação 10.

12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com-preende um ácido nucleico, como definido na reivindicação 10.

13. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende as mo-léculas de ligação a IL2Rb, como definidas em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 8.

14. Uso de uma molécula de ligação a IL27Rα, como defi nida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fa to de que é na fabricação de um medicamento, composição, kit ou produto.

15. Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revela da ou ilustrada no pedido de patente; e/ou Uso de uma molécula de ligação a IL27Rα da invenção, da sequência de ácido nucleico da invenção, do vetor recombinante viral ou não viral da invenção, ou da célula hospedeira da invenção, sendo o uso na fabricação de um medicamento, composição, kit ou produto; e/ou Composição farmacêutica compreendendo um sdAb de li-gação a IL27Rα da invenção em combinação com um agente suple-mentar; e/ou Composição farmacêutica compreendendo um sdAb de li-gação a IL27Rα da invenção; e/ou Kit compreendendo uma ou mais composições farmacêuti cas de moléculas de ligação a IL27Rα da invenção, opcionalmente contendo um rótulo ou bula incluindo informações de identificação para os componentes nele contidos e instruções para seu uso; e/ou Composição farmacêutica ou formulação farmacêutica compreendendo a molécula de ligação a IL27Rα da invenção, a se-quência de ácido nucleico da invenção, o vetor recombinante viral ou não viral da invenção, ou a célula hospedeira da invenção.