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BR122019023055B1 - Método para aumento da eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado - Google Patents

Método para aumento da eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado Download PDF

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BR122019023055B1
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plants
nitrogen
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BR122019023055-2A
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David Panik
Basia Judith Vinocur
Hagai Karchi
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Evogene Ltd
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Abstract

método para aumento da eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, construto de ácido nucleico isolado, polipeptídeo isolado, método para cultivo de uma safra, fornece métodos para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta expressando na planta um polinucleotídeo exógeno, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% homóloga à seq id nº: 387, 1-386, 388-469, 763-3704 e 3705; ou um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo, pelo menos, 80% idêntico à seq id nº: 602, 470-601, 603-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 ou 6047; também é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada de um grupo consistindo da seq id nº: 387, 1-386, 388-469, 763-3704 e 3705, que pode ser utilizado para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA
[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se aos novos polinucleotídeos e polipeptídeos que podem aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção (por exemplo, produção de sementes/grãos, produção de óleo), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção de fibra, qualidade e/ou comprimento da fibra, resistência ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.
[002] Uma abordagem comum para promover o crescimento da planta era, e continua sendo, o uso dos nutrientes naturais, bem como de nutrientes sintéticos (fertilizantes). Deste modo, os fertilizantes são o combustível por trás da "revolução verde", diretamente responsáveis pelo aumento excepcional do rendimento das culturas nos últimos 40 anos e considerados como a despesa geral número um da agricultura. Dos três macronutrientes fornecidos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio (K)], o nitrogênio frequentemente atua como elemento limitador da taxa no crescimento da planta e todas as áreas de cultura têm uma dependência fundamental dos fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio. O nitrogênio normalmente precisa ser reposto todo ano, particularmente para os cereais, que compreendem mais da metade das áreas cultivadas em todo o mundo. Por exemplo, fertilizantes inorgânicos a base de nitrogênio, tal como o nitrato de amônio, nitrato de potássio ou ureia, tipicamente correspondem a 40% dos custos associados às culturas, tais como o milho e o trigo.
[003] O nitrogênio é um macronutriente essencial para a planta, responsável pela biossíntese de ácidos nucleicos e aminoácidos, grupos prostéticos, hormonas da planta, defesas químicas da planta, etc. Além disso, o nitrogênio frequentemente atua como um elemento limitador da taxa de crescimento da planta e todas as culturas de campo possuem uma dependência fundamental de nitrogênio inorgânico. Deste modo, o nitrogênio é translocado para o broto, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a etapa rápida de desenvolvimento da planta, e, por conseguinte, até que floresça. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o volume de seu nitrogênio orgânico durante o período da germinação do grão e até que floresça. Uma vez que a fertilização da planta ocorre, os grãos começam a se formarem e a se tornarem o receptáculo principal do nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode ser, então, redistribuído a partir das folhas e do caule que serviram como compartimentos de armazenagem até a formação do grão.
[004] Como o fertilizante se esgota rapidamente na maioria dos tipos de solo, este deve ser fornecido às culturas em crescimento duas ou três vezes durante a época de crescimento. Além disso, a baixa eficiência no uso do nitrogênio (NUElnitrogen use efficiency) das principais culturas (por exemplo, na faixa de somente 30-70%) afeta de modo negativo as despesas de investimento do fazendeiro por conta do excesso de fertilizante aplicado. Além disso, os usos excessivos e ineficientes de fertilizantes são os principais fatores responsáveis por problemas ambientais, tais como eutrofização das águas subterrâneas, de lagos, rios e mares e poluição por nitrato em água potável, o que pode causar metemoglobinemia, poluição por fosfato, poluição atmosférica e similares. Contudo, a despeito do impacto negativo dos fertilizantes no meio ambiente e dos limites de uso de fertilizantes que foram controlados por lei em vários países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente, a fim de apoiar a produção de alimentos e de fibras devido ao rápido crescimento populacional e aos recursos limitados da terra. Por exemplo, estima-se que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizantes a base de nitrogênio sejam utilizadas em todo o mundo por ano.
[005] O aumento da eficiência no uso do nitrogênio pelas plantas deve viabilizar o cultivo das culturas com um investimento mais baixo em fertilizantes, ou, alternativamente, o cultivo em solos de qualidade inferior e, assim, ter um impacto econômico significativo tanto nos sistemas desenvolvidos de agricultura quanto nos sistemas em desenvolvimento.
[006] O aprimoramento genérico da eficiência no uso de fertilizantes (FUE 1 fertilizer use efficiency) nas plantas pode ser gerado ou através da reprodução tradicional ou por engenharia genética.
[007] Tentativas de geração de plantas com FUE melhorada foram descritas no N° de Pedido de Patente Americano 20020046419, de Choo, et al.; N° de Pedido de Patente Americano 2005010879, de Edgerton et al.; N° de Pedido de Patente Americano 20060179511, de Chomet et al.; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).
[008] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:7833-8) descreve plantas transgênicas Dofl que apresentam um crescimento melhorado sob condições de baixo nível de nitrogênio.
[009] O N° de Patente Americano 6.084.153, de Good et al. divulga o uso de um promotor sensível ao estresse para controlar a expressão da Alanina Aminotransferase (AlaAT 1 Alanine Amine Transferase) e das plantas de canola transgênica com resistência à seca e deficiência de nitrogênio melhorada quando comparadas às plantas de controle.
[0010] O crescimento contínuo da população mundial e o déficit de disponibilidade de terra cultivável para a agricultura afetam o rendimento das plantas e dos produtos relacionados às plantas. A escassez global no suprimento de água, a desertificação, as condições de estresse abiótico (ABSlabiotic stress) (por exemplo, salinidade, seca, inundação, temperatura subaproveitada e poluição química tóxica) e/ou o nitrogênio limitado e as fontes de fertilizantes causam danos substanciais às plantações agrícolas, tais como alterações principais no metabolismo da planta, morte celular e diminuição no crescimento da planta e na produtividade da cultura.
[0011] A seca é um fenômeno gradual que envolve períodos de tempo anormalmente seco que duram o suficiente para produzir desequilíbrios hidrológicos sérios, como danos à cultura, diminuição do suprimento de água e aumento da susceptibilidade a diversas doenças.
[0012] A salinidade, níveis elevados de sal, afeta um em cada cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, p.ex., trigo, milho, arroz, batatas e soja, consegue tolerar o excesso de sal. Os efeitos prejudiciais do sal sobre as plantas resulta tanto da deficiência de água, que leva ao estresse osmótico (semelhante ao estresse causado pela seca), quanto do efeito do excesso de íons de sódio sobre processos bioquímicos importantes. Assim como o congelamento e a seca, quantidades elevadas de sal causam déficit de água; e a presença de níveis elevados de sal torna difícil para as raízes das plantas extraírem água de seu ambiente. Dessa forma, a salinação dos solos que são utilizados para a produção agrícola é um problema significativo e crescente em regiões que dependem principalmente da agricultura e é piorada pela utilização e fertilização excessivas e pela falta de água, tipicamente causada pela mudança climática e pelas demandas da população crescente.
[0013] As temperaturas subótimas afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta durante todo o seu ciclo de vida. Dessa forma, baixas temperaturas reduzem a taxa de germinação e temperaturas elevadas resultam na necrosa da folha. Além disso, plantas maduras expostas ao excesso de calor podem experimentar o choque de calor, que pode surgir em vários órgãos, incluindo as folhas e, principalmente, os frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse causado pelo calor. O calor também danifica as estruturas celulares, incluindo as organelas e o citoesqueleto e prejudica a função da membrana. O choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada pela expressão de proteínas de choque de calor, p.ex., as chaperonas, que estão envolvidas no rearranjo das proteínas desnaturadas pelo calor. O dano causado pela alta temperatura ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse causado pela seca e, raramente, ocorre sob boas condições de irrigação. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de frio excessivo, p.ex., temperaturas baixas, mas acima do ponto de congelamento, afetam as culturas de origem tropical, como a soja, o arroz, o milho e o algodão. O dano típico causado pelo frio inclui o emurchecimento, a necrosa, a clorosa ou perda de íons das membranas celulares. Condições de luz excessiva, que ocorrem sob condições atmosféricas claras subsequentes às noites frias do final do verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o frio pode levar a perdas de produção e à qualidade inferior do produto através do amadurecimento tardio do milho.
[0014] A deficiência de nutrientes causa adaptações da arquitetura da raiz, particularmente notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro de áreas ricas em nutrientes para aumentar a absorção dos nutrientes. A deficiência de nutrientes causa, também, a ativação de caminhos metabólicos da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição como pela ativação de mudanças da arquitetura. A engenharia da expressão dos genes desencadeados pode fazer com que a planta mostre as mudanças em sua arquitetura e o metabolismo melhorado, também, sob outras condições.
[0015] Além disso, é amplamente conhecido que as plantas geralmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raízes mais profundas que permitem o acesso à umidade localizada em camadas mais profundas do solo. O desencadeamento desse efeito permitirá às plantas acessarem os nutrientes e a água localizados em horizontes mais profundos do solo, particularmente, aqueles prontamente dissolvidos na água, como os nitratos.
[0016] A produção é afetada por diversos fatores, como o número e o tamanho dos órgãos da planta, a arquitetura da planta (p.ex., o número de ramificações), o comprimento estabelecido dos grãos, o número de grãos cheios, o vigor (p.ex., a muda), a taxa de crescimento, o desenvolvimento da raiz, a utilização de água, nutrientes (p.ex., o nitrogênio) e fertilizantes e a tolerância ao estresse.
[0017] Culturas como as do milho, arroz, trigo, canola e soja respondem por mais da metade da ingestão calórica total humana, seja através do consumo direto de sementes ou através do consumo de produtos de carne de animais criados com sementes processadas ou forragem. As sementes também são uma fonte de açúcares, proteínas, óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A capacidade de aumentar a produção da planta, seja através do aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a celulose ou a composição da lignina, aumento da resistência do caule, aumento do tamanho do meristema, mudança do padrão de ramificação da planta, firmeza das folhas, aumento da eficiência da fertilização, aumento da taxa de acúmulo de matéria seca da semente, modificação do desenvolvimento da semente, melhora do enchimento da semente ou o aumento do teor de óleo, amido ou proteína nas sementes teria muitas aplicações na utilização agrícola e não-agrícola como na produção biotecnológica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.
[0018] Estudos demonstraram que adaptações na planta a condições ambientais adversas são traços genéticos complexos de natureza poligênica. Meios convencionais de cultura e melhoras de horticulturas utilizam técnicas de melhoramento seletivas para identificar plantas que apresentem características desejáveis. No entanto, o melhoramento seletivo é tedioso, consome tempo e apresenta resultado imprevisível. Além disso, recursos germoplasmáticos limitados para melhora da produção e a incompatibilidade nos cruzamentos entre espécies de plantas distantemente relacionadas representam problemas significativos encontrados no melhoramento convencional. Avanços na engenharia genética permitiram que o homem modificasse o germoplasma das plantas pela expressão de genes de interesse nas plantas. Essa tecnologia tem a capacidade de gerar culturas ou plantas com traços econômicos, agronômicos ou horticulturas melhorados.
[0019] A publicação WO N° 2004/104162 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas geradas deste modo.
[0020] A publicação WO N° 2004/111183 divulga sequências de nucleotídeos para regular a expressão do gene em tricomas e estruturas de plantas e métodos utilizando os mesmos.
[0021] A publicação WO N° 2004/081173 divulga novas sequências e estruturas regulatórias derivadas da planta e métodos de utilização de tais sequências para direcionar a expressão das sequências de polinucleotídeo exógeno nas plantas.
[0022] A publicação WO N° 2005/121364 revela polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento de fibras vegetais e método de uso dos mesmos, a fim de aumentar a qualidade das fibras, a produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibras.
[0023] A publicação WO N° 2007/049275 revela polipeptídeos isolados, polinucleotídeos que codificam os mesmos, plantas transgênicas que expressam os mesmos e método de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso de fertilizantes, a tolerância ao estresse abiótico da planta e biomassa.
[0024] A publicação WO N° 2007/020638 revela métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou a biomassa em plantas e plantas geradas desse modo.
[0025] A publicação WO N° 2008/122980 revela estruturas de genes e métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento e biomassa de plantas.
[0026] A publicação WO N° 2008/075364 revela polinucleotideos envolvidos no desenvolvimento da fibra da planta e métodos de uso dos mesmos.
[0027] A publicação WO N° 2009/083958 revela métodos para aumentar a eficiência no uso de água, eficiência no uso de fertilizantes, tolerância ao estresse biótico/abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.
[0028] A publicação WO N° 2009/141824 revela polinucleotídeos isolados e métodos para uso dos mesmos para aumentar a utilidade da planta.
[0029] A publicação WO N° 2009/013750 revela genes, estruturas e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e/ou produção em plantas geradas desse modo.
[0030] A publicação WO N° 2010/020941 revela métodos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico, produção e biomassa em plantas e em plantas geradas desse modo.
[0031] A publicação WO N° 2010/076756 divulga polinucleotideos isolados para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou eficiência no uso do nitrogênio de uma planta.
[0032] A publicação W02010/100595 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.
[0033] A publicação WO N° 2010/049897 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso do nitrogênio.
[0034] A publicação W02010/143138 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água.
[0035] A publicação WO N° 2011/080674 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta, biomassa, taxa de crescimento, vigor, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico de plantas e eficiência no uso do nitrogênio.
[0036] A publicação W02011/015985 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos para aumentar as qualidades desejáveis da planta.
[0037] A publicação W02011/135527 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos isolados e métodos de uso dos mesmos para aumentar a produção da planta e/ou características agrícolas.
SUMÁRIO
[0038] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo, pelo menos, 80% idêntico à ID SEQ. N° [Identificação de Sequência N°] 470-762, 3706-5858, 58605910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 ou 6047, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[0039] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 37066046 e 6047, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[0040] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 ou 3705, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[0041] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 e 3705, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[0042] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga à sequência de aminoácido estabelecida na ID SEQ. 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 ou 6047, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0043] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 3706-6046 e 6047.
[0044] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, 80% idêntica à ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 ou 3705, caracterizado pela sequência de ácido nucleico ser capaz de aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0045] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 e 3705.
[0046] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[0047] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, 80% homóloga à ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 ou 6047, caracterizado pela sequência de aminoácido ser capaz de aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0048] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polipeptídeo isolado, compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 3706-6046 e 6047.
[0049] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polinucleotídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[0050] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula de planta que expressa de forma exógena o polipeptideo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[0051] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 37066046 e 6047.
[0052] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 e 3705.
[0053] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotideo consiste na sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-469, 7633704 e 3705.
[0054] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 37066046 e 6047.
[0055] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula da planta forma parte de uma planta.
[0056] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta que expressa o polinucleotideo exógeno sob estresse abiótico.
[0057] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o estresse abiótico é selecionado de um grupo consistindo de salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, inundação, etiolação, baixa temperatura, temperatura elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.
[0058] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a produção compreende a produção de semente ou a produção de óleo.
[0059] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma planta transgênica compreendendo a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[0060] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção o, o método compreende, ainda, o cultivo da planta que expressa o polinucleotideo exógeno sob condições limitantes de nitrogênio.
[0061] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado.
[0062] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é heterólogo à célula hospedeira.
[0063] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de cultivo de uma cultura, o método compreendendo a semeadura de sementes e / ou o plantio de mudas de uma planta transformada com o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção ou a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas seleccionadas a partir de, pelo menos, uma característica seleccionada a partir do grupo consistindo em: aumento da eficiência no uso de nitrogênio, aumento da tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação a uma planta não transformada, aumentando, desse modo, a colheita.
[0064] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem de base genética idêntica.
[0065] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta não transformada é uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.
[0066] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta não transformada é cultivada sob condições de cultivo idênticas.
[0067] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui apresentam o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual o presente pedido de patente de invenção refere-se. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste das aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o quadro reivindicatório da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0068] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são descritas aqui, apenas como exemplos, com referência aos desenhos anexos. Agora, com referência específica aos desenhos em detalhes, enfatiza- se que as particularidades mostradas são exemplares e para os propósitos de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. Nesse sentido, a descrição que acompanha os desenhos torna aparente àqueles com habilidade na técnica como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticadas.
[0069] A Figura 1 é uma ilustração esquemática de um plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 6052) e o GUSintron (pQYN 6669) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; MCS - Sitio de clonagem múltipla; RE -qualquer enzima de restrição; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter da GUS (sequência codificadora e intron). As sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no vetor enquanto substituíam o gene repórter GUSintron.
[0070] A Figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 6052) (pQFN ou pQFNc) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB [right border] - borda direita do T-DNA; LB [left border] - borda esquerda do T-DNA; MCS [multiple cloning site]- Local de clonagem múltipla; RE [restriction enzyme] - qualquer enzima de restrição; NOS pro [nopaline synthase promoter] - promotor da nopalina sintase; NPT-II [neomycin phosphotransferase] = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter [nopaline synthase terminator] = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação). As sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no MCS do vetor.
[0071] As Figuras 3A-F são imagens que descrevem a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas transgênicas de forma exógena expressando o polinucleotideo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção quando cultivadas em placas de ágar transparentes sob condições normais (Figuras 3A-B), estresse osmótico (15% de PEG. Figs. 3CD) ou limitação de nitrogênio (Figuras 3E-F). Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparente por 17 dias (7 dias de viveiro e 10 dias após a transplantação). As placas foram fotografadas a cada 3-4 dias iniciando no dia 1 após a transplantação Fig. 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar quando cultivadas sob condições normais (padrão). Fig. 3B -Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3A na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3C - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de Agar, cultivadas sob condições altamente osmóticas (PEG 15%). Fig. 3D - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3C na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas. Fig. 3E - Uma imagem de uma fotografia de plantas tiradas depois de 10 dias após a transplantação em placas de ágar, cultivadas sob condições de baixo teor de nitrogênio. Fig. 3F - Uma imagem da análise da raiz das plantas mostradas na Fig. 3E na qual os comprimentos das raízes medidas são representados por setas.
[0072] A Figura 4 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI modificado contendo o Promotor de Raiz (pQNa RP, ID SEQ. N° 6064) utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção. RB -borda direita do T- DNA; LB - borda esquerda do T-DNA; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene da neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); MCS (locais de clonagem múltiplas) do vetor utilizado para clonar as sequências do polinucleotídeo isolado de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[0073] A Figura 5 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQYN.
[0074] A Figura 6 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFN.
[0075] A Figura 7 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQFYN.
[0076] A Figura 8 é uma ilustração esquemática do plasmídeo pQXNc, que é um plasmídeo binário modificado pGI utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção. RB - T-DNA borda direita; LB - T-DNA borda esquerda; NOS pro = promotor de nopalina sintase; NPT-II gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador de nopalina sintase; RE = qualquer enzima de restrição; sinal de Poli-A (sinal de poliadenilação); 35S - o promotor 35S (pqfnc; ID SEQ. N° 6048). As sequências de polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção foram clonadas no MCS (local de clonagem múltipla) do vetor.
DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS
[0077] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a novos polinucleotídeos e polipeptideos, estruturas de ácido nucleico compreendendo os mesmos, células hospedeiras empressando os mesmos, plantas trangênicas empressando os mesmos de forma exógena e, mais particularmente, mas não exclusivamente a métodos de uso dos mesmos para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.
[0078] Antes de explicar, pelo menos, uma aplicação do presente pedido de patente de invenção detalhadamente, deve-se compreender que o presente pedido de patente de invenção não está, necessariamente, limitado pelos Exemplos. O presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticado ou realizado de várias maneiras.
[0079] Os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para gerar estruturas de ácido nucleico, plantas transgênicas e para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.
[0080] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para identificar os polinucleotídeos e polipeptídeos que aumentam a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção (p.ex., produção de semente, produção de óleo), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, desenvolvimento da fibra (p.ex., produção, comprimento e/ou qualidade da fibra), tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta. Genes que afetam a característica de interesse foram identificados (Tabela 1, Exemplo 1) com base nos perfis de expressão de genes de diversos tecidos e ecotipos de Arabidopsis, Algodão, Arroz, Sorgo, Cevada, Milho e Tomate (Tabelas 3-64; Exemplos 3-14) e na homologia com genes conhecidos por afetar a característica de interesse e utilizando os perfis de expressão digital em tecidos e condições específicas. Os polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos (p.ex., ortólogos) tendo a mesma função também foram identificados (Tabela 2, Exemplo 2). Plantas transgénicas sobre- expressando os polinucleotídeos identificados foram tidas como expoentes de aumento da biomassa (p.ex., aumento do peso fresco e seco, aumento da área de lâmina foliar, aumento do número de folhas, aumento do diâmetro e da área da roseta, aumento da cobertura da raiz e comprimento da raiz), aumento da produção (p.ex., aumento da produção de semente, índice de colheira e peso de 1000 sementes), aumento do vigor, p.ex., aumento da taxa de crescimento (p.ex., taxa de crescimento da área foliar, cobertura da raiz, comprimento da raiz, número de folhas, diâmetro e ára daroseta), florescimento precoce e surgimento de inflorescência em ambas as condições de crescimento ideal (normal) e sob condições de crescimento limitantes de nitrogênio (p.ex., condição de estresse abiótico, como estresse por deficiência de nutrientes) (Tabelas 66-93; Exemplos 18-20). No conjunto, estes resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos do presente pedido de patente de invenção para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção (p.ex., produção de semente, produção de óleo), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta.
[0081] Assim, de acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotideo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 37065858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 e 6047, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[0082] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de fertilizante" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de um ou mais minerais e porções orgânicas absorvidas pela planta, tais como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.
[0083] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de fertilizante" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.
[0084] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso de nitrogênio (NUE)" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que leva(m) a um aumento na produção da planta, biomassa, vigor e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada. O processo metabólico pode ser a captação, propagação, absorção, acúmulo, realocação (dentro da planta) e utilização de nitrogênio absorvido pela planta.
[0085] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições limitantes de nitrogênio" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (p.ex., concentração) de nitrogênio (isto é, amônia ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo normal da planta, crescimento, reprodução e/ou viabilidade.
[0086] A NUE e FUE melhorada da planta são traduzidas no campo em quantidade semelhantes de colheita da produção, enquanto implementam menos fertilizantes, ou produções melhoradas adquiridas pela implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Assim, NUE ou FUE melhorada tem um efeito direto na produção de planta no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção afetam positivamente a produção de planta, produção de semente e biomassa de planta. Além disso, o benefício da NUE melhorada de planta certamente melhorará a qualidade da cultura e constituintes bioquímicos da semente tais como produção de proteína e produção de óleo.
[0087] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da planta" refere-se ao montante (p.ex., conforme determinado por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por plantas ou por estação de crescimento. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo.
[0088] É importante observar que a produção da planta pode ser afetada por vários parâmetros, incluindo, mas não se limitando à biomassa da planta; vigor da planta; taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de sementes ou grãos; qualidade da semente ou grão; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos colhidos (p.ex., sementes ou partes vegetais da planta); número de flores (florzinhas) por panícula (expressado como uma proporção do número de sementes preenchidos sobre o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho dos órgãos colhidos por planta e por área; número de plantas por área de crescimento (densidade); número de órgãos colhidos em campo; área total da folha; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuição/alocação de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos coletáveis (por exemplo, sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [como aumento do diâmetro do caule, espessura ou melhoria das propriedades físicas (por exemplo, elasticidade)].
[0089] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção de semente" refere-se ao número ou ao peso das sementes por planta, sementes por vagem ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, a produção de semente pode ser afetado pelas dimensões da semente (p.ex., comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), pelo número de sementes (cheias) e pela taxa de enchimento da semente e pelo teor de óleo da semente. Portanto, o aumento de produção de semente por planta pode afetar o benefício econômico que alguém pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou época de cultivo; e o aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas cultivadas em uma determinada área.
[0090] O termo "semente" (também referido como "grão" ou "núcleo"), conforme utilizado aqui, refere-se a uma planta embriônica pequena confinada em uma cobertura chamada de revestimento de semente (normalmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas gimnosperma e angiosperma que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.
[0091] A expressão "teor de óleo", conforme utilizada aqui, refere-se à quantidade de lipídeos de um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a porção vegetal da planta (teor de óleo vegetal) e é expressa como um percentual de peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso úmido (para a porção vegetal).
[0092] Deve-se observar que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (p.ex., semente, parte vegetal), bem como a massa ou tamanho do tecido de produção de óleo por planta ou por período de crescimento.
[0093] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser atingido aumentando o tamanho/massa de tecido(s) de uma planta, que compreende o óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado aumentando a produção, a taxa de crescimento, a biomassa e o vigor da planta.
[0094] Conforme utilizada aqui, a expressão "biomassa da planta" refere-se à quantidade (p.ex., medida em gramas de tecido secado pelo ar) de um tecido produzido a partir da planta em um período de cultivo, que também pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento da biomassa da planta pode ocorrer em toda a planta ou em partes dela como partes acima do nível do solo (passível de colheita), biomassa vegetal, raízes e sementes.
[0095] Conforme utilizada aqui, a expressão "taxa de crescimento" refere-se ao aumento do tamanho do órgão/tecido da planta por período (pode ser medido em cm2 por dia).
[0096] Conforme utilizada aqui, a expressão "vigor da planta" refere- se à quantidade (medida pelo peso) ou tecido produzido pela planta em um determinado período. Portanto o aumento do vigor pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por período de cultivo ou por área de cultivo. Além disso, o vigor prematuro (semente e/ou muda) resulta em melhor posição no campo.
[0097] Melhorar o vigor precoce é um objetivo importante de modernos programas de reprodução de arroz em cultivares de arroz temperado e tropical. Raízes longas são importantes para fixação adequada do solo em arroz pré-germinado. Quando o arroz é diretamente semeado em campos alagados e onde as plantas devem emergir rapidamente através da água, brotos mais longos são associados com vigor. Onde a semeadura de perfuração é praticada, mesocótilos e coleóptilos mais longos são importantes para bom surgimento das mudas. A habilidade de projetar vigor precoce nas plantas seria de grande importância na agricultura. P.ex., baixo vigor precoce tem sido uma limitação na introdução do milho (Zea mays L.) híbrido com base no germoplasma do Cinturão do Milho na Atlântica Europeia.
[0098] Deve-se observar que uma produção de planta pode ser determinada sob estresse (p.ex., estresse abiótico, condições limitantes de nitrogênio) e/ou condições de não estresse (normal).
[0099] Conforme utilizada aqui, a expressão "condições de não estresse" refere-se às condições de crescimento (p.ex., água, temperatura, ciclos claro-escuro, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutriente tal como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não significativamente vão além das condições climáticas diárias e outras abióticas que as plantas podem encontrar e que permitem o crescimento ideal, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta em qualquer estágio em seu ciclo de vida (p.ex., em uma planta de cultura da semente para uma planta madura e de volta para a semente novamente). Os técnicos no assunto estão cientes das condições normais do solo e climáticas para uma dada planta em uma dada localização geográfica. Deve ser notado que enquanto as condições de não estresse podem incluir algumas variações suaves das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta cesse o crescimento sem a capacidade de retomar o crescimento.
[00100] A expressão "estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, o crescimento, a reprodução e/ou a viabilidade da planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambiental subótimas como, p.ex., salinidade, privação de água, inundação, congelamento, temperatura baixa ou elevada, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Histórico.
[00101] A expressão "tolerância ao estresse abiótico", conforme utilizada aqui, refere-se à capacidade de uma planta de resistir a um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.
[00102] As plantas são submetidas a uma gama de desafios ambientais. Diversos desses, incluindo estresse salino, estresse osmótico geral, estresse árido e estresse de congelamento, têm a habilidade de impactar a planta total e disponibilidade de água celular. Não é de surpreender, então, as respostas da planta a essa coleção de estresses são relacionados. Zhu (2002) Ann. Rev. Planta Biol. 53: 247-273 et al. Observe que "a maioria dos estudos na sinalização de estresse hídrico focou no estresse salino primariamente porque as respostas da planta ao sal e estiagem estão intimamente relacionadas e os mecanismos se sobrepõem". Muitos exemplos de respostas similares e caminhos para esse conjunto de estresses foram documentados. For exemplo, os fatores de transcrição de CBF demonstraram condicionamento de resistência ao sal, congelamento e estiagem (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). O gene Arabidopsis rd29B é induzido em resposta ao estresse de sal e desidratação, um processo que é mediado amplamente através de um processo de transdução de sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada de fatores de transcrição que se ligam a um elemento a montante dentro do promotor rd29B. Em Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman mostraram que uma proteína cinase dependente do cálcio (McCDPK1) é induzida pela exposição aos estresses de estiagem e sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). A cinase induzida por estresse também demonstraram fosforilar um fator de transcrição, provavelmente alterando sua atividade, embora os níveis transcritos do fator de transcrição alvo não sejam alterados em resposta ao estresse de sal ou estiagem. Similarmente, Saijo et al. demonstraram que uma proteína cinase dependente de calmodulina induzida por sal/estiagem de arroz (OsCDPK7) conferiu tolerância elevada ao sal e estiagem para o arroz quando superexpressa (Saijo et al. (2000) Planta J. 23: 319-327).
[00103] A exposição à desidratação evoca estratégias similares de sobrevivência em plantas, assim como o estresse de congelamento (vide, p.ex., Yelenosky (1989) Planta Physiol 89: 444-451) e o estresse de estiagem induz tolerância de congelamento (vide, p.ex., Siminovitch et al. (1982) Planta Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Plant 188: 265-270). Além da indução de proteínas de aclimatação fria, estratégias que permitem que as plantas sobrevivam em baixas condições de água podem incluir, p.ex., área de superfície reduzida, ou produção de óleo ou cera da superfície. Em outro exemplo, o teor de soluto elevado da planta previne a evaporação e a perda de água devido ao calor, estiagem, salinidade, osm6tico e similares, portanto provendo uma melhor tolerância aos estresses acima.
[00104] Será entendido que alguns caminhos envolvidos na resistência a um estresse (conforme descrito acima), também serão envolvidos em resistência a outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou homólogos. Certamente, aos caminhos de resistência estão relacionados, não idênticos e portanto, nem todos os genes que controlam a resistência a um estresse controlarão a resistência a outros estresses. Não obstante, se uma resistência de condições de gene a um desses estresses, estaria evidente ao especialista na técnica o teste para resistência a esses estresses relacionados. Os métodos de avaliação da resistência ao estresse também São fornecidos na seção de Exemplos a seguir.
[00105] Conforme utilizada aqui, a expressão "eficiência no uso da água (WUE)" refere-se ao nível de matéria orgânica produzido por unidade de água consumida pela planta, isto é, o peso seco de uma planta em relação à utilização de água da planta, p.ex., a biomassa produzida por transpiração unitária.
[00106] Deve-se observar que um ABST melhorado conferirá às plantas vigor melhorado também em condições de não estresse, resultando em culturas que possuem biomassa e/ou produção melhorada, p.ex., fibras alongadas para a indústria de algodão, teor de óleo mais alto.
[00107] O termo "fibra" é normalmente inclusivo de células de condução de parede espessa, tais como vasos e traqueídeos e para fibrilar agregados de muitas células de fibra individual. Por isso, o termo "fibra" refere-se a (a) células de condução e não condução de parede espessa do xilema; (b) fibras de origem extraxylary, incluindo aquelas de floema, casca, tecido do solo e epiderme; e (c) fibras dos caules, folhas, raízes, sementes e flores ou inflorescências (tais como aquelas de Sorghum vulgare utilizadas na fabricação de escovas e vassouras).
[00108] Exemplos de planta que produz fibra, incluem, entre outros, culturas agrícolas tais como algodão, árvore de seda de algodão (Paina, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, winterfat, balsa, quenafe, rosala, juta, sisal abacá, linho, milho, cana-de-açúcar, cânhamo, rami, paina, fibra de coco, bambu, musgo espanhol e Agave spp. (p.ex., sisal).
[00109] Conforme utilizada aqui, a expressão "qualidade da fibra" refere-se a pelo menos um parâmetro de fibra que é agricolamente desejado, ou requerido na indústria de fibra (também descrito adiante). Exemplos de tais parâmetros incluem, entre outros, comprimento da fibra, resistência da fibra, adequação da fibra, peso da fibra por comprimento da unidade, proporção de maturidade e uniformidade (também descrito adiante).
[00110] A qualidade da fibra de algodão (gaze) é tipicamente medida de acordo com o comprimento, resistência e delicadeza da fibra. Consequentemente, a qualidade da gaze é considerada mais alta quando a fibra é mais longa, mais forte e mais fina.
[00111] Conforme utilizada aqui, a expressão "produção da fibra" refere-se à quantidade ou qualidade das fibras produzidas da planta que produz fibra.
[00112] Conforme utilizado aqui, o termo "aumento" refere-se a, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 3%, pelo menos, cerca de 4%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80% de aumento na eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta comparada a uma planta nativa ou planta do tipo selvagem [isto é, uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) do presente pedido de patente de invenção, p.ex., um planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições (p.ex., idênticas) de crescimento].
[00113] A expressão "expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno", conforme utilizada aqui, refere-se à regulação ascendente do nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno dentro da planta, introduzindo o polinucleotídeo exógeno em uma planta ou célula da planta e expressando-o por meios recombinantes, conforme também descrito logo abaixo.
[00114] Conforme utilizado aqui, "expressar" refere-se à expressão no mRNA e, opcionalmente, no nível de polipeptídeo.
[00115] Conforme utilizada aqui, a expressão "polinucleotídeo exógeno" refere-se a uma sequência de ácido nucleico heterólogo que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta (p.ex., uma sequência de ácido nucleico de espécies diferentes) ou na qual a superexpressão na planta é desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta em uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNAIribonucleic acid) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve-se observar que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucleico endógena da planta.
[00116] O termo "endógeno", conforme utilizado aqui, refere-se a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula da mesma.
[00117] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo consiste das ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 58605910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 e 6047.
[00118] As sequências homólogas incluem ambas as sequências, ortólogas e parálogas. O termo "parálogo" refere-se às duplicações de gene dentro do genoma de uma espécie conduzindo aos genes parálogos. O termo "ortólogo" refere-se aos genes homólogos em diferentes organismos devido à relação ancestral.
[00119] Uma opção para identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledônias é a realização de uma pesquisa de explosão recíproca. Isso pode ser feito através de uma primeira explosão, envolvendo explodir a sequência de interesse contra qualquer base de dados da sequência, tal como a base de dados do NCBI publicamente disponível que pode ser encontrada em: http://www [Http://World Wide Web 1 Protocolo de Transferência de Hipertexto:Rede Mundial de Computadores / Internet] (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se forem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse seria detonada novamente, p.ex., os 28.469 clones de cDNA de comprimento total de Oryza Sativa Nipponbare disponível em NCBI. Os resultados da explosão podem ser filtrados. As sequências de comprimento total dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então detonadas de volta (segunda explosão) contra as sequências do organismo das quais a sequência de interesse é derivada. Os resultados das primeira e segunda explosões são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultando na maior pontuação (melhor acerto) na primeira explosão identifica na segunda explosão a sequência de consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Utilizando o mesmo racional, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de grandes famílias de sequência, o programa ClustalW pode ser utilizado [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore de união vizinha (http://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda na visualização do agrupamento.
[00120] A homologia (por exemplo, percentual de homologia, identidade + similaridade) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia que calcule o alinhamento de sequência em pares.
[00121] A identidade (p.ex., percentual de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software para comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN ou o BlastP do National Center of Biotechnology Information [NCBI □ Centro Nacional de Informação de Biotecnologia], tal como utilizando parâmetros padrões.
[00122] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a identidade é uma identidade global, ou seja, uma identidade sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção e não apenas sobre partes respectivas.
[00123] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o termo "homologia" ou "homólogo" refere-se à identidade de duas ou mais sequências de ácido nucleico; ou identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos; ou a identidade de uma sequência de aminoácidos para uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando a mesma.
[00124] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a homologia é uma homologia global, ou seja, uma homologia sobre toda a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção e não apenas sobre partes respectivas.
[00125] O grau de homologia ou de identidade entre duas ou mais sequências pode ser determinado usando várias ferramentas de comparação de sequências conhecidas. Na sequência há uma descrição não limitante de tais ferramentas, que podem ser utilizadas juntamente com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[00126] Alinhamento global em pares foi definido por S. B. Needleman e C. D. Wunsch, "A general method applicable to the search of similarities in the amino acid sequence of two proteins" Journal of Molecular Biology, 1970, páginas 443-53, volume 48).
[00127] Por exemplo, ao começar com uma sequência polipeptidica e comparar com outras sequências polipeptídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html) pode ser utilizado para encontrar o alinhamento ideal (incluindo as lacunas) de duas sequências juntamente com seus comprimentos totais - um "Alinhamento global". Os parâmetros padrões para o algoritmo de Needleman-Wunsch (EMBOSS-6.0.1) incluem: gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.
[00128] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os parâmetros utilizados com a ferramenta EMBOSS- 6.0.1 (para a comparação proteína-proteína) incluem: gapopen=8; gapextend=2; datafile= EBLOSUM62; brief=YES.
[00129] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia utilizando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00130] Ao começar com uma sequência polipeptidica e comparar a sequências polinucleotidicas, o algoritmo OneModel FramePlus (Halperin, E., Faigler,S. e Gill-More,R. (1999) - FramePlus: aligning DNA to protein sequences. Bioinformatics, 15, 867-873) (disponível em http://www(ponto)biocceleration(ponto) com/Products(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões: model=frametp2n.model mode=local.
[00131] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os parâmetros usados com o algoritmo OneModel FramePlus são model=frame+p2n.model, mode=qglobal.
[00132] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo OneModel FramePlus é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00133] Ao começar com uma sequência polinucleotídica e comparar com outras sequências polinucleotídicas, o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de NeedlemanWunsch (disponível em http://emboss(ponto)sourceforge(ponto)net/apps/cvs/emboss/ap ps/needle(ponto)html) pode ser utilizado com os seguintes parâmetros padrões. (EMBOSS-6.0.1) gapopen=10; gapextend=0.5; datafile= EDNAFULL; brief=YES.
[00134] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os parâmetros usados com o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de NeedlemanWunsch são gapopen=10; gapextend=0.2; datafile= EDNAFULL; brief=YES.
[00135] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch para a comparação de polinucleotídeos com polinucleotídeos é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00136] De acordo com algumas aplicações, as determinações do grau de homologia requerem adicionalmente o emprego do algoritmo de SmithWaterman (para a comparação proteína-proteína ou comparação nucleotídeo- nucleotídeo).
[00137] Os parâmetros padrões para o algoritmo GenCore 6.0 SmithWaterman incluem: modelo =sw.model.
[00138] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o limite utilizado para determinar a homologia usando o algoritmo de Smith-Waterman é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00139] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a homologia global é realizada sobre as sequências pré- selecionadas por homologia local para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (p.ex., 60% de identidade sobre 60% do comprimento da sequência) antes da realização da homologia global para o polipeptídeo ou polinucleotídeo de interesse (p.ex., 80% de homologia global sobre toda a sequência). Por exemplo, as sequências homólogas são selecionadas usando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn agindo como filtros para o primeiro estágio e a agulha (pacote EMBOSS) ou o alinhamento Estrutura+algorítmico para o segundo estágio. A identidade local (alinhamentos Blast) é definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências porque utiliza tão somente um filtro para a fase de alinhamento global. A filtragem padrão do pacote Blast não foi utilizada (estabelecendo o parâmetro "-F F").
[00140] No segundo estágio, os homólogos são definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica principal.
[00141] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, duas formas distintas para a descoberta do alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou nucleotídica são utilizadas:
[00142] Entre duas proteínas (seguindo o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS-6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões listadas aqui: Qualificadores padrões (Obrigatórios): [-asequence] sequência Nome do arquivo da sequência e formato opcional, ou referência (entrada EUA).
[00143] [-bsequence] seciallNome do arquivo da(s) sequência(s) e formato opcional, ou referência (entrada EUA). -gapopenflutuante [10,0 para qualquer sequência]. A penalidade da lacuna aberta é uma classificação tomada quando uma lacuna é criada. O melhor valor depende da escolha da matriz de comparação. O valor padrão pressupõe que você está usando a matriz EBLOSUM62 para as sequências de proteína e a matriz EDNAFULL para as sequências nucleotídicas.
[00144] (número de vírgula flutuante de 1,0 a 100,0)
[00145] gapextend flutuante 0,5 para qualquer sequência]. A penalidade pela extensão da lacuna, é adicionada à penalidade da lacuna padrão para cada base ou resíduo na lacuna. Esta é o tempo pelo qual a lacuna é penalizada. Normalmente espera-se poucas lacunas grandes e não muitas lacunas pequenas, assim a penalidade sobre a extensão da lacuna deveria ser menor que a penalidade da lacuna. Uma exceção se dá quando uma ou mais sequências são lidas sozinhas com possíveis erros de seqüência em cujo caso você esperaria muitas lacunas de base simples. Pode-se obter este resultado estabelecendo a penalidade por lacuna aberta para zero (oumuito baixa) e usando a penalidade de extensão da lacuna para controlar a classificação da lacuna. (número de vírgula flutuante de 0,0 a 10,0). [-outfile]alinhamento [*.needle] Nome do arquivo de alinhamento de saída Qualificadores Adicionais (Opcional): datafile matrixf [EBLOSUM62 para proteína, EDNAFULL para DNA]
[00146] Este é um arquivo de arranjo de classificação utilizado ao comparar as sequências. Por padrão, este é o arquivo 'EBLOSUM62' (para proteínas) ou o arquivo 'EDNAFULL' (para as sequências nucleicas) Estes arquivos são encontrados no diretório 'data' da instalação EMBOSS. Qualificadores Avançados (Espontâneos):
[00147] [no]brief booleano [Y] Breve identidade e similaridade. Qualificadores Associados:
[00148] "-asequence" Qualificadores Associados.
[00149] sbeginl inteiro Inicia a sequência a ser utilizada.
[00150] -sendl inteiro Finaliza a sequência a ser utilizada.
[00151] sreversel booleano Reverso (se DNA).
[00152] saskl booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter.
[00153] snucleotidel booleano A sequência é nucleotídica.
[00154] sproteínal booleano A sequência é de proteína.
[00155] -slowerl booleano Faz minúsculas.
[00156] supperl booleano Faz maiúsculas.
[00157] -sformatl cadeia Formato de sequência de entrada.
[00158] sdbnamel cadeia Nome da base de dados.
[00159] -sidl cadeia Nome da entrada.
[00160] ufol cadeia Recursos UFO.
[00161] fformatl cadeia Formato dos Recursos.
[00162] fopenfilel cadeia Nome do arquivo dos recursos.
[00163] "-bsequence" Qualificadores Associados.
[00164] sbegin2 inteiro Iniciacada sequência a ser utilizada.
[00165] send2 inteiro Finaliza cada sequência a ser utilizada.
[00166] sreverse2 booleano Reverso (se DNA).
[00167] sask2 booleano Pede para iniciar/finalizar/reverter.
[00168] -snucleotide2 booleano A sequência é nucleotídica.
[00169] sproteina2 booleano A sequência é de proteína.
[00170] slower2 booleano Faz minúsculas.
[00171] supper2 booleano Faz maiúsculas.
[00172] sformat2 cadeia Formato de sequência de entrada.
[00173] -sdbname2 cadeia Nome da base de dados.
[00174] sid2 cadeia Nome da entrada.
[00175] ufo2 cadeia Recursos UFO.
[00176] fformat2 cadeia Formato dos Recursos.
[00177] -fopenfile2 cadeia Nome do arquivo dos recursos.
[00178] "-outfile" Qualificadores Associados.
[00179] aformat3 cadeia Formato dos Alinhamentos.
[00180] -aextension3 cadeia Extensão do nome do arquivo.
[00181] -adirectory3 cadeia Diretório de Saída.
[00182] aname3 cadeia Nome do arquivo de base.
[00183] awidth3 inteiro Largura do alinhamento.
[00184] aaccshow3 booleano Mostra o número de acesso no cabeçalho.
[00185] adesshow3 booleano Mostra a descrição no cabeçalho.
[00186] ausashow3 booleano Mostra o USA completo no alinhamento.
[00187] aglobal3 booleano Mostra a sequência completa no alinhamento. Qualificadores Gerais:
[00188] auto booleano Desliga as solicitações.
[00189] stdout booleano Escreve o primeiro arquivo para a saída padrãos.
[00190] -filtro booleano Lê o primeiro arquivo a partir da entrada padrão, escreve o primeiro arquivo para a saída padrão.
[00191] Opções booleano Solicita os valores padrão e adicionais.
[00192] debug booleano Escreve a saída de depuração do programa .dbg
[00193] verbose booleano Registra algumas/todas as opções de linha de comando.
[00194] help booleano Registra as opções de linha de comando.
[00195] Maiores informações sobre os qualificadores:
[00196] associados e gerais podem ser encontradas com -
[00197] help -verbose.
[00198] -warning booleano Registra as advertências.
[00199] -error booleano Registra os erros.
[00200] fatal booleano Registra os erros fatais.
[00201] help booleano Registra as opções de linha de comando. Maiores informações sobre os qualificadores: associados e gerais podem ser encontradas com - help -verbose. -warning booleano Registra as advertências. -error booleano Registra os erros. fatal booleano Registra os erros fatais. die booleano Registra as mensagens de expiração do programa.
[00202] Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (seguindo o filtro rblastn) Aplicação de GenCore 6.0 OneModel utilizando a estrutura+algoritmo com os seguintes parâmetros: model=frame+p2n.model mode=qglobal -q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permanece inalterado a partir das opções padrões:
[00203] Uso: om -model=<model fname> [-q=]query [-db=]database [options].
[00204] model=<model fname> Especifica o modelo que quer executar. Todos os modelos fornecidos pela Compugen estão localizados no diretório $CGNROOT/models/.
[00205] Parâmetros válidos de linha de comando: dev=<dev name> Seleciona o dispositivo a ser utilizado pela aplicação.
[00206] Os dispositivos válidos são: bic - Bioccelerator (válido para SW, XSW, FRAMEN2P, e modelos FRAME P2N).
[00207] xlg - BioXL/G (válido para todos os modelos, exceto XSW). xlp - BioXL/P (válido para SW, FRAME+N2P, e modelos FRAME P2N).
[00208] xlp - BioXL/H (válido para SW, FRAME+N2P, e modelos FRAME P2N).
[00209] soft - Dispositivo do software (para todos os modelos). - q=<query> Define o conjunto de consultas. As consultas podem ser um arquivo de sequência ou uma referencia à base de dados.
[00210] Você pode especificar uma consulta pelo nome ou por número de acesso. O formato é detectado automaticamente.
[00211] Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -qfmt
[00212] Se uma consulta não for especificada, o programa solicita uma.
[00213] Se o conjunto de consultas for uma referência à base de dados, um arquivo de saída é produzido para cada sequência na consulta.
[00214] -db=<database name> Escolha o conjunto de base de dados. O conjunto de base de dados pode ser um arquivo de sequência ou uma referência à base de dados. O formato da base de dados é detectado automaticamente. Entretanto, pode-se especificar um formato usando o parâmetro -dfmt.
[00215] qacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma consulta for especificada usando os números de acesso.
[00216] dacc Adiciona este parâmetro à linha de comando se uma base de dados for especificada usando os números de acesso.
[00217] dfmt/-qfmt=<formattype> Escolhe o tipo do formato da base de dados/consulta.
[00218] Os formatos possíveis são: fasta - fasta com o tipo de sequência autodetectada. fastap - sequência de proteína fasta.
[00219] fastan - sequência nucleica fasta.
[00220] gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado.
[00221] gcg - formato gcg, o tipo é autodetectado.
[00222] gcg9seqp - sequência de proteína de formato gcg9.
[00223] gcg9seqn - sequência nucleica de formato gcg9.
[00224] nbrf - sequência nbrf, o tipo é autodetectado.
[00225] nbrfp - sequência de proteína nbrf.
[00226] nbrfn - sequência nucleica nbrf.
[00227] embl - formato embl e swissprot.
[00228] genbank - formato genbank (nucleico).
[00229] blast - formato blast.
[00230] nbrf gcg - sequência nbrf gcg, o tipo é autodetectado. nbrf gcgp - sequência de proteína nbrf-gcg.
[00231] nbrfgcgn - sequência nucleica nbrf-gcg.
[00232] raw - sequência raw ascii, o tipo é autodetectado.
[00233] rawp - sequência de proteína raw ascii.
[00234] rawn - sequência nucleica raw ascii.
[00235] pir - formato pir codata, o tipo é autodetectado.
[00236] Profile - perfil gcg (válido somente para -qfmt
[00237] em SW, XSW, FRAME P2N e FRAME+ P2N).
[00238] out=<out fname> O nome do arquivo de saída.
[00239] suffix=<name> O sufixo do nome do arquivo de saída.
[00240] gapop=<n> Penalidade sobre a abertura de lacuna. Este parâmetro não é válido para a FRAME+.
[00241] Para a FrameSearch o padrão é 12,0. Para outras pesquisas o padrão é 10,0.
[00242] gapext=<n> Penalidade por extensão de lacuna. Este parâmetro não é válido para FRAME+.
[00243] Para a FrameSearch o padrão é 4,0. Para outros modelos: o padrão para as pesquisas de proteína é 0,05 e o padrão para as pesquisas nucleicas é 1,0.
[00244] ggapop=<n> A penalidade pela abertura de uma lacuna na sequência de consultas. O padrão é 10,0. Válido para XSW.
[00245] ggapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna na sequência de questões. O padrão é 0,05. Válido para XSW.
[00246] start=<n> A posição na sequência de consulta para iniciar a pesquisa.
[00247] end=<n> A posição na sequência de consulta para interromper a pesquisa.
[00248] qtrans Realiza uma pesquisa traduzida, relevante para uma consulta nucleica contra uma base de dados de proteína.
[00249] A consulta nucleica é traduzida para seis estruturas de leitura e um resultado é fornecido para cada estrutura. Válido para o SW e XSW.
[00250] Nota: as opções "-qtrans" e "-dtrans" são mutuamente exclusivas.
[00251] matrix=<matrix file> Especifica a matriz de comparação a ser utilizada na pesquisa. A matriz deve estar em formato BLAST. Se o arquivo da matriz não for localizado em $CGNROOT/tables/matrix, especifique o caminho completo como o valor do -matrix parameter.
[00252] trans=<transtab name> Tabela de tradução. A localização padrão para a tabela é $CGNROOT/tables/trans.
[00253] onestrand Restringe a pesquisa para somente a vertente superior da consulta/base de dados da sequência nucleica.
[00254] list=<n> O tamanho máximo da lista de acertos de saída.
[00255] O padrão é 50.
[00256] docalign=<n> O número das linhas de documentação precedente a cada alinhamento. O padrão é 10.
[00257] -thr score=<score name> A classificação que coloca um limite à exibição dos resultados. Classificações menores que o valor mínimo de -thr min ou maiores que o valor -thr max não são mostradas. As opções válidas são: qualidade.
[00258] Escore.
[00259] Escore.
[00260] thr max=<n> O limite mais alto da classificação. Resultados maiores que o valor -thr max não são mostrados. -thr min=<n> O menor limite da classificação. Resultados menores que o valor -thrmin não são mostrados.
[00261] -align=<n> O número de alinhamentos registrados no arquivo de saída.
[00262] -noalign Não exibe o alinhamento.
[00263] Nota: os parâmetros "-align" e "-noalign" são mutuamente exclusivos.
[00264] -outfmt=<format name> Especifica o tipo de formato de saída. O formato padrão é PFS. Os valores possíveis são: PFS - Formato de texto PFS FASTA - formato de texto FASTA BLAST - formato de texto BLAST
[00265] nonorm Não realiza a normalização da classificação.
[00266] norm=<norm name> Especifique o método de normalização. As opções válidas são: log - normalização do algoritmo.
[00267] std - normalização padrão.
[00268] stat - Método estatístico de Ervilharson
[00269] Nota: os parâmetros "-nonorm" e "-norm" não podem ser utilizados juntos.
[00270] Nota: Parâmetros -xgapop, -xgapext, -fgapop, -fgapext, - ygapop, -ygapext, -delop e -delext se aplicam somente a FRAME+.
[00271] xgapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). O padrão é 12,0.
[00272] -xgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir um codão (triplo). O padrão é 4,0.
[00273] ygapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 12,0.
[00274] -ygapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir um aminoácido. O padrão é 4,0.
[00275] -fgapop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. O padrão é 6,0.
[00276] fgapext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao inserir uma base de DNA. O padrão é 7,0.
[00277] delop=<n> A penalidade para a abertura de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. O padrão é 6,0.
[00278] delext=<n> A penalidade para a extensão de uma lacuna ao excluir uma base de DNA. O padrão é 7,0.
[00279] -silent Nenhuma saída para a tela é produzida.
[00280] host=<host name>0 nome do organizador sobre o qual o servidor funciona. Por padrão, a aplicação usa um organizador especifico no arquivo $CGNROOT/cgnhosts.
[00281] wait Não acesse o segundo plano quando o dispositivo estiver ocupado. Esta opção não é relevante para o pseudodispositivo Parseq ou Soft.
[00282] -batch Execute o trabalho em segundo plano. Quando esta opção for especifica, o arquivo "$CGNROOT/defaults/batch.defaults"
[00283] é utilizado para escolher o comando batch. Se o arquivo não existir, o comando "at now" é utilizado para executar o trabalho.
[00284] Nota: os parâmetros "-batch" e "-wait" são mutuamente exclusivos.
[00285] -version Imprime o número de versão do software.
[00286] -help Exibe esta mensagem de ajuda. Para ajuda mais específica digite: "om -model=<model fname> -help".
[00287] De acordo com algumas aplicações, a homologia é uma homologia local ou uma identidade local.
[00288] As ferramentas de algoritmo local incluem, mas não são limitadas ao software BlastP, BlastN, BlastX ou TBLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI), FASTA e o algoritmo de Smith-Waterman.
[00289] Uma pesquisa tblastn permite a comparação entre uma sequência de proteína e as traduções de seis estruturas de uma base de dados de nucleotídeos. Pode ser uma maneira bastante produtiva de encontrar regiões codificadas de proteína homóloga em sequências de nucleotídeos não anotadas, tais como as etiquetas de sequências expressas [EST's □ expressed sequence tags] e projetos de registros do genoma [HTG □ draft genome records], localizados nas bases de dados BLAST est e htgs, respectivamente.
[00290] Os parâmetros padrões para o blastp incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: e-5; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filter - regiões de baixa complexidade.
[00291] Ferramentas de alinhamento local que podem ser utilizadas incluem, mas não são limitadas ao algoritmo tBLASTX, que compara os produtos de tradução conceitual de seis estruturas de uma sequência de consultas de nucleotídeos (ambas as vertentes) contra uma base de dados de sequência de proteína. Os parâmetros padrões incluem: Sequências de alvo máximo: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3: Correspondências máximas em uma faixa de consulta: 0; Parâmetros de classificação: Matriz - BLOSUM62; filtros e camuflagem: Filter - regiões de baixa complexidade.
[00292] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistente de ID SEQ N°: 470-762, 37065858, 25 5860-5910, 5912, 5914-5923, 59256046 e 6047.
[00293] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado ao expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo de, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5 59145923, 5925-6046 e 6047, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[00294] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptideo consistindo na sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. 470762, 3706-6046 ou 6047.
[00295] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta é efetuado ao expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 3706-6046 e 6047, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[00296] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 470-762, 37066046 e 6047, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[00297] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido estabelecida pela ID SEQ. N° 470762, 3706-6046 e 6047.
[00298] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucléico que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 e 3705.
[00299] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica sequência de ácido nucleico selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N° 1-469, 7633704 e 3705, aumentando, desta forma, a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
[00300] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo da ID SEQ. N°: 1-469, 763-3704 e 3705.
[00301] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela ID SEQ. N° 1469, 763-3704 ou 3705.
[00302] Conforme utilizado aqui, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de ácido nucléico de fita simples ou dupla que é isolado e fornecido na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotideo complementar (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeo e/ou uma sequência polinucleotideo composta (p.ex., uma combinação das sequências acima).
[00303] O termo "isolado(a)" refere-se a pelo menos parcialmente separado(a) do ambiente natural, p.ex., de uma célula da planta.
[00304] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotídeo complementar" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa de RNA mensageiro utilizando a transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Essa sequência pode ser amplificada subsequentemente in vivo ou in vitro utilizando uma polimerase de DNA dependente de DNA.
[00305] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência genômica de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e, dessa forma, representa uma porção contígua de um cromossomo.
[00306] Conforme utilizada aqui, a expressão "sequência de polinucleotídeo composta" refere-se a uma sequência que seja pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. A sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção, bem como algumas sequências intrônicas interpostas entre si. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinais entrelaçados preservadas. Essas sequências intrônicas podem incluir, ainda, elementos reguladores da expressão cis- atuantes.
[00307] As sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos do presente pedido de patente de invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos dessas modificações de sequências incluem, mas não se limitam a um teor de G/C alterado de uma abordagem mais cuidadosa do que aquela comumente encontrada nas espécies de plantas de interesse e à remoção de códons atipicamente encontrados nas espécies de plantas comumente chamada de otimização de códons.
[00308] A expressão "otimização de códons" refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para a utilização dentro de um gene estrutural ou fragmento dele que aborde a utilização do códon dentro da planta de interesse. Portanto, um gene otimizado ou sequência de ácido nucleico refere-se a um gene no qual a sequência de nucleotídeo de um gene nativo ou que ocorra naturalmente tenha sido modificado a fim de utilizar códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. Tipicamente, a sequência de nucleotídeo é examinada no nível do DNA e na região de codificação otimizada para expressão na espécie vegetal determinada utilizando qualquer procedimento adequado, p.ex., conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão de utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do códon, pode ser calculado descobrindo primeiramente o quadrado do desvio proporcional de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de plantas altamente expressos, seguido por um cálculo do quadrado do desvio médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn -Yn) /Yn] 2/N, onde Xn refere-se à frequência de utilização do códon n em genes de plantas altamente expressos, onde Yn refere-se à frequência de utilização do códon n no gene e interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela de utilização de códons de genes altamente expressos de dicotiledôneas está compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc AcID's Res. 17:477-498).
[00309] Um método para otimizar a sequência de ácido nucleico de acordo com a utilização preferido do códon para um tipo de célula de planta particular é baseado na utilização direto, sem realizar quaisquer cálculos estatísticos extras, de Tabelas de otimização de códons como aquelas disponíveis online na Base de Dados de utilização de Códons através do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences 1 Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (http://www (ponto) kazusa (ponto) ou (ponto) jp/codon/). A Base de Dados de utilização de Códons contém tabelas de utilização de códons para diversas espécies diferentes, com cada Tabela de utilização de códons tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.
[00310] Utilizando as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos de cada aminoácido em uma espécie particular (p.ex., arroz), uma sequência de nucleotídeo que ocorre naturalmente codificando uma proteína de interesse para ter o códon otimizado para aquela espécie de planta particular. Isso é efetuado substituindo os códons que possam ter uma incidência estatística baixa no genoma da espécie particular com códons correspondentes, em relação a um aminoácido, que sejam estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir sítios de restrição existentes, para criar novos em uniões potencialmente úteis (terminais 5' e 3' para adicionar o peptídeo sinal ou cassetes de terminação, sítios internos que possam ser utilizados para cortar e reunir segmentos para produzir uma sequência de comprimento total correta), ou para eliminar sequências de nucleotídeo que possam afetar negativamente a estabilidade ou a expressão do mRNA.
[00311] A sequência de nucleotídeo codificador que ocorre naturalmente pode, já, antes de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponda a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta particular. Portanto, a otimização do códon da sequência de nucleotídeo nativa podem compreender a determinação quais códons, dentro da sequência de nucleotídeo nativo, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta particular e modificar esses códons de acordo com uma tabela de utilização de códons da planta particular para produzir um derivado do códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeo modificado pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização do códon da planta desde que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeo modificado seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente ou nativo. A estrutura de genes sintéticos alterando a utilização do códon é descrita, p.ex., no Pedido de Patente PCT (Patent Cooperation Treaty 1 Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes) 93/07278.
[00312] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotideo exógeno é um RNA não codificador.
[00313] Conforme utilizada aqui, a expressão "RNA não codificador" refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Exemplos dessas moléculas de RNA não codificador incluem, mas não se limitam a um RNA antisenso, um pré- miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA que interage com Piwi (piRNA).
[00314] Exemplos não limitantes de polinucleotídeos de RNA não codificador são apresentados nas ID SEQ. N° 215, 257, 258 e 469.
[00315] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção abrange as sequências de ácido nucleico descritas acima, fragmentos delas, sequências hibridizantes encontradas nelas, sequências homólogas delas, sequências codificando polipeptídeos semelhantes com diferentes utilizações de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações, como exclusão, introdução ou substituição de um ou mais nucleotídeos, ocorrendo naturalmente ou induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.
[00316] O presente pedido de patente de invenção fornece um polinucleotideo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo das ID SEQ. N° 1469, 763-3704 e 3705.
[00317] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de ácido nucleico é capaz de aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[00318] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste das ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 e 3705.
[00319] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo isolado é estabelecido pelas ID SEQ. N° 1469, 763-3704 ou 3705.
[00320] O presente pedido de patente de invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N°: 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 59256046 e 6047.
[00321] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a eficiência no uso de fertilizante (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio), teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor, produção da fibra, qualidade da fibra e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[00322] O presente pedido de patente de invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo das ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 58605910, 5912, 25 5914-5923, 5925-6046 e 6047.
[00323] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira.
[00324] O presente pedido de patente de invenção fornece um polipeptídeo isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, ou, digamos, 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-5 6046 e 6047.
[00325] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos é selecionado do grupo que consiste das ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046, 6047, 5859, 5911, 5913 e 5924.
[00326] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polipeptideo é estabelecido pelas ID SEQ. N° 470-762, 37065858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046, 6047, 5859, 5911, 5913 e 5924.
[00327] O presente pedido de patente de invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e de polipeptídeos apresentando mutações, como exclusões, introduções ou substituições de um ou mais aminoácidos, ocorrendo naturalmente ou induzido pelo homem, seja aleatoriamente ou da forma objetivada.
[00328] O termo "planta", conforme utilizado aqui, abrange planta integrais, ancestrais e progênies das plantas e partes da planta, incluindo as sementes, os brotos, os caules, as raízes (incluindo os tubérculos) e células, tecidos e órgãos da planta. A planta pode estar em qualquer forma, incluindo culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular as monocotiledôneas e as dicotiledôneas, incluindo uma forragem ou leguminosa forrageira, planta ornamental, cultura alimentar, árvore ou arbusto selecionado da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Bucha frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lótus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseupontosuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinífera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, cenouras, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linho, couve crespa, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilhas, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma grama perene e uma cultura forrageira. Alternativamente, algas e outras nãoViridiplantae podem ser utilizadas para os métodos do presente pedido de patente de invenção.
[00329] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta utilizada pelo método do presente pedido de patente de invenção é uma planta de cultura como o arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana-de-açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linho, lupinus, colza, tabaco, choupo e algodão.
[00330] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é uma planta dicotiledônea.
[00331] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é uma planta monocotiledônia.
[00332] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, apresenta-se uma célula vegetal expressando de forma exógena o polinucleotideo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e/ou o polipeptideo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.
[00333] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção dentro da planta é afetada pela transformação de uma ou mais células da planta com o polinucleotideo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivando a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.
[00334] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma estrutura de ácido nucleico na célula da planta que inclua o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e pelo menos um promotor para orientar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Detalhes adicionais de abordagens de transformação adequadas são apresentadas abaixo.
[00335] Conforme mencionado, a estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, compreende uma sequência promotora e o polinucleotídeo isolado do presente pedido de patente de invenção.
[00336] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotideo isolado está operacionalmente ligado à sequência promotora.
[00337] Uma sequência de ácido nucleico codificadora é "operacionalmente ligada" a uma sequência reguladora (p.ex., o promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador sobre a sequência codificadora ligada a ela.
[00338] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que fica a montante do sítio da inicial transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (p.ex., qual porção de uma planta) e/ou quando (p.ex., em que estágio ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.
[00339] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo isolado e/ou à célula hospedeira.
[00340] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor heterólogo" refere-se a um promotor de uma espécie diferente ou da mesma espécie, mas de um lócus de gene diferente, a partir da sequência de plinucleotídeo isolado.
[00341] Qualquer sequência adequada de promotor pode ser utilizada pela estrutura de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, um promotor específico do tecido ou induzível ao estresse abiótico.
[00342] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor é um promotor de planta, que é adequado para expressão do polinucleotídeo exógeno em uma célula de planta.
[00343] Promotores constitutivos adequados incluem, p.ex., o promotor CaMV 35S [ID SEQ. N° 6048 (pQFNC); ID SEQ. N° 6049 (PJJ 35S para Brachypodium); ID SEQ N°. 6050 (Odell et al., Nature 313:810812, 1985)], promotor Arabidopsis At6669 (ID SEQ. N° 6051; vide Publicação PCT N° W004081173A2 ou o novo promotor At6669 (ID SEQ. N° 6052); milho Ubi 1 (milho poliubiquitina1, ID SEQ. N° 6053; Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992; Taylor et al., Plant Cell Rep 12:491495, 1993); actina-1 do arroz (ID SEQ. N° 6054, McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (ID SEQ N° 6055, de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); promotor Ubi 1 (ID SEQ. N° 6056); RBCS promoter (ID SEQ N°: 6057); Ciclofilina do arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histone H3 de milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actin 2 (An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos são incluídos nas Patentes Norte-Americanas N° 5.659.026, 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597: 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.
[00344] Promotores específicos de tecidos adequados incluem, mas não se limitam a promotores específicos de folhas [p.ex., AT5G06690 (Thioredoxin) (expressão elevada, ID SEQ. N° 6058), AT5G61520 (AtSTP3) (expressão rebaixada, ID SEQ. N° 6059) descrita em Buttner et al 2000 Plant, Cell e Environment 23, 175-184, ou os promotores descritos em Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:9586-9590, 1993; bem como, Arabidopsis STP3 (AT5G61520) promotor (Buttner et al., Plant, Cell e Environment 23:175-184, 2000)], promotores preferidos de semente [p.ex., Napin (originados da Brassica napus e caracterizados por uma atividade promotora especifica de semente; Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309; ID SEQ. N° 6060 a partir de genes específicos de sementes (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Moi. Biol. 14: 633, 1990), arroz PG5a (US 7.700.835), desenvolvimento precoce de sementes Arabidopsis BAN (ID SEQ. N° 6061, US 2009/0031450 Al), desenvolvimento tardio da semente Arabidopsis ABI3 (ID SEQ. N° 6062) (Ng et al., Plant Molecular Biology 54: 25-38, 2004), Albumina de castanha do Brasil (Ervilharson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), leguminosas (Eliis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143): 32332 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de endosperma [p.ex., trigo LMW e HMW, glutenina-1 (Thomas e Flavell, The Plant Cell 2:1171-1180, 1990; Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo a, b e g gliadinas (EMBO3:1409-15, 1984), promotor ltrl da cevada, cevada Bl, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), Cevada DOF (hena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Cevada SS2 (Guerin e Carbonero Plant Physiology 114: 1 55-62, 1997), Trigo Tarp60 (Kovalchuk et al., Plant Mol Biol 71:81-98, 2009), Cevada D-hordeína (DHor) e B-hordein (B-Hor) (Agnelo Furtado, Robert J. Henry e Alessandro Pellegrineschi (2009)], promotor Sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina de arroz NRP33, globulina de arroz Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885889, 1998), arroz alfaglobulina de arroz REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucose de arroz PP (Trans Res 6:15768, 1997), Família do gene de milho ESR (Plant J 12:235-46, 1997), gama- kafirina de sorgo (PMB 32:1029-35, 1996)], promotores específicos embrionários [p.ex., arroz OSH1 (Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93: 81178122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:25771, 1999), arroz oleosina (Wu et at, J. Biochem, 123:386, 1998)] e promotores de flor- específicos [p.ex., AtPRP4, chalene sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240245; 1989), Arabidopsis apetala-3 (Tilly et al., Desenvolvimento 125:164757, 1998), Arabidopsis APETALA 1 (AT1G69120, AP1) (ID SEQ N°: 6063) (Hempel et al., Desenvolvimento 124:3845-3853, 1997)] e promotores de raiz [p.ex., o promotor ROOTP [ID SEQ. N° 6064]; promotores do arroz ExpB5 e cevada ExpBl (Won et al. Mol. Cells 30: 369- 376, 2010); promotor Arabidopsis monoterpeno sintase (AT3G25820) (Chen et al., Plant Phys 135:1956-66, 2004); promotor Arabidopsis Phol (ID SEQ N°: 6065, Hamburger et al., Plant Cell. 14: 889-902, 2002), que também é ligeiramente induzida por estresse Pi].
[00345] Promotores induzíveis pelo estresse abiótico incluem, mas não se limitam a promotores induzíveis pelo sal como o RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis pela seca como o gene promotor rabl7 (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), o gene promotor rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997 e o gene promotor Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis pelo calor como o promotor hsp80 do tomate (Patente Norte-Americana N° 5.187.267).
[00346] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode incluir, ainda, um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor ponte, que pode se propagar tanto em E. coli (onde a estrutura compreenda um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) quanto pode ser compatível com a propagação nas células. A estrutura de acordo com o presente pedido de patente de invenção pode ser, p.ex., um plasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.
[00347] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizado para transformar de maneira estável ou transitória as células da planta. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e, como tal, representa um traço transitório.
[00348] Existem vários métodos para introduzir genes estranhos, tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol, Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).
[00349] Os métodos do princípio de causa da integração estável de DNA exógeno em DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: A transferência genética mediada pelo Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.
[00350] Absorção direta do DNA: Paszkowski et al., em Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J. e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção direta de DNA nos protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Absorção de DNA induzida pelo breve choque elétrico de células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923- 926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pela utilização de sistemas de micropipetas: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de partículas de fibras de vidro ou carboneto de silício de culturas celulares, embriões ou tecido caloso, Patente Norte-Americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinante, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715- 719.
[00351] O sistema Agrobacterium inclui a utilização de vetores plasmidiais que contenham segmentos definidos de DNA que se integram no DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido vegetal variam dependendo da espécie da planta e do sistema de entrega do Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante tecidual que oferece uma boa fonte para o início da diferenciação de toda a planta. Vide, p.ex., Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega do Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de dicotiledôneas transgênicas.
[00352] Existem vários métodos de transferência direta de DNA para células vegetais. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é injetado de forma mecânica diretamente nas células utilizando micropipetas muito pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é absorvido em microprojéteis como os cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos vegetais.
[00353] Após a transformação estável, a propagação vegetal é realizada. O método mais comum de propagação vegetal é pela semente. A regeneração pela propagação de sementes, no entanto, apresenta a deficiência de que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na cultura, uma vez que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas normas Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma crescerá com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos da planta transgênica matriz. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que proporciona a reprodução rápida, consistente das plantas transformadas.
[00354] A micropropagação é um processo de cultivo de plantas de nova geração a partir de um pedaço de tecido que tenha sido retirado de uma planta matriz selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas que tenham o tecido preferido expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que forem produzidas são geneticamente idênticas à planta original e apresentam todas as suas características. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica ou transformada original. As vantagens da clonagem de plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e a uniformidade das plantas produzidas.
[00355] A micropropagação é um procedimento de múltiplos estágios que requer a alteração do meio de cultura ou das condições de cultivo entre os estágios. Dessa forma, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura tecidual inicial; estágio dois, multiplicação da cultura tecidual; estágio três, diferenciação e formação da planta; e estágio quarto, cultura e fortalecimento em estufa. Durante o estágio um, a cultura tecidual inicial, a cultura tecidual é estabelecida e certificada como sendo livre de contaminantes. Durante o estágio dois, a cultura tecidual inicial é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para atender aos objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em plântulas individuais. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para fortalecimento, onde a tolerância das plantas à luz é gradativamente aumentada de forma que ela possa ser cultivada no ambiente natural.
[00356] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitória de células de folhas, de células meristemáticas ou de toda a planta.
[00357] A transformação transitória pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus modificados de plantas.
[00358] Vírus que demonstraram ser úteis para a transformação de hospedeiros de plantas incluem o CaMV, o vírus mosaico do tabaco (TMV I tabaco mosaic virus), vírus mosaico do bromo (BMV I brome mosaic virus) e o Vírus Mosaico Comum do Feijoeiro (BV ou BCMV I feijão common mosaic virus). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na Patente Norte-Americana N° 4.855.237 (vírus mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67.553 (TMV), Solicitação Japonesa Publicada No 6314693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas pseudovirais para utilização na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas na WO 87/06261.
[00359] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o vírus utilizado para transformação transitória é avirulento e, dessa forma, é incapaz de causar sintomas graves como a taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas anelares, enrolamento da folha, amarelamento, estrias, formação de vesículas, formação de tumor e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorra naturalmente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação do vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando ao aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese dirigidas conforme descrito, p.ex., por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).
[00360] Cepas virais adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis, como, p.ex., da Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC 1 American Type Culture Collection) ou pelo isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos vegetais infectados pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, conforme descrito, p.ex., por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Acredita-se que rapidamente, os tecidos de uma planta infectada contenham uma concentração elevada de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flores, são trituradas em uma solução tampão (p.ex., solução tampão fosfato) para produzir uma seiva infectada com vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.
[00361] A estrutura de vírus de RNA da planta para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeo exógeno não-viral em plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:7376; e Patente Norte-Americana N° 5.316.931.
[00362] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao vírus propriamente dito. Alternativamente, o vírus pode primeiramente ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a estrutura do vetor viral desejado com o DNA estranho. Então, o vírus pode ser extraído do plasmídeo. Se o vírus for um vírus do DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral que é, então, replicado pela bactéria. A transcrição e a tradução desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá capsular o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é, geralmente, clonado como um cDNA e introduzido em um plasmídeo. Então, o plasmídeo é utilizado para fazer todas as estruturas. Então, o vírus de RNA é produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsula o RNA viral.
[00363] Em uma aplicação, um polinucleotídeo viral de uma planta é fornecido, no qual a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência foi excluída de um polinucleotídeo viral, uma proteína de revestimento viral não nativa da planta codificando a sequência e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da proteína de revestimento não nativa que codifica a sequência, capaz de se expressar no hospedeiro da planta, no envoltório do polinucleotídeo viral recombinante da planta e garantindo uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta, foi introduzido. Alternativamente o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela introdução da sequência de polinucleotídeo não nativo dentro dele, de forma que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou de expressar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos no hospedeiro da planta e incapaz de recombinar uns com ou outros e com os promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeo não nativas (estranhas) podem ser introduzidas adjacentes ao promotor subgenômico viral nativo da planta ou o promotor subgenômico viral nativo e o promotor subgenômico viral não nativo da planta, se houver mais de uma sequência de polinucleotídeo for incluída. As sequências de polinucleotídeo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.
[00364] Em uma segunda aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na primeira aplicação, exceto que a proteína de revestimento nativa que codifica a sequência é colocada adjacente a um dos promotores genômicos da proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.
[00365] Em uma terceira aplicação, um polinucleotídeo viral de planta recombinante é fornecido, no qual o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foi(ram) inserido(s) no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos introduzidos são capazes de transcrever ou de expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinar uns com ou outros e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeo não nativas podem ser introduzidas adjacentes aos promotores subgenômicos virais não nativos da planta de forma que as sequências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir o produto desejado.
[00366] Em uma quarta aplicação, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é fornecido, como na terceira aplicação, de forma que a sequência codificadora da proteína de revestimento nativa seja substituída por uma sequência codificadora da proteína de revestimento não nativa.
[00367] Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta para produzir um vírus da planta recombinante. O polinucleotídeo virai recombinante da planta ou o vírus da planta recombinante é utilizado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo viral recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.
[00368] Técnicas para inoculação de vírus para plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado e Agrawa, eds. "Principies e Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York.
[00369] Além do exposto acima, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto permitindo, dessa forma, a expressão de cloroplasto.
[00370] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. Primeiro, as células das plantas são tratadas quimicamente de forma a reduzir o número de cloroplastos por célula para aproximadamente uma. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de bombardeamento de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula do polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de forma a serem integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Com essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão do polinucleotídeo que é derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável que serve, pelos procedimentos de seleção sequencial, para verificar se todas ou se substancialmente todas as cópias dos genomas do cloroplasto, após essa seleção, incluirão o polinucleotídeo exógeno. Detalhes adicionais relacionados a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte- Americanas N° 4.945.050 e 5.693.507 que são incorporadas aqui por referência. Dessa forma, um polipeptídeo pode ser produzindo pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e se integra à membrana interna do cloroplasto.
[00371] Uma vez que os processos que aumentam a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, teor de óleo, produção, produção de semente, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos genes que agem aditivamente ou em sinergia (vide, p.ex., em Quesda et al., Planta Physiol. 130:951-063, 2002), o presente pedido de patente de invenção também prevê a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma planta hospedeira única para, desta forma, alcançar efeito superior no teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.
[00372] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se múltiplas estruturas de ácido nucléico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode, então, ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.
[00373] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada cointroduzindo-se, em uma única célula da planta, uma única estrutura de ácido nucléico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos. Essa estrutura pode ser desenhada com uma única sequência promotora que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências diferentes de polinucleotídeo exógeno. A fim de permitir a cotradução dos polipeptídeos diferentes codificados pelo RNA mensageiro policistrônica, as sequências de polinucleotídeos podem ser interligadas através de uma sequência do local interno de entrada do ribossomo (IRES I internal ribosome entry site) que facilita a tradução das sequência de polinucleotideo posicionadas a jusante da sequência do IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônico transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida tanto no terminal 5' que tem o cap quanto nas duas sequências internas do IRES da molécula de RNA policistrônico para, assim, produzir todos os diferentes polipeptídeos na célula. Alternativamente, a estrutura pode incluir diversas sequências promotoras, cada uma ligada a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.
[00374] A célula da planta transformada com a estrutura, incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes, pode ser regenerada em uma planta madura utilizando os métodos descritos acima.
[00375] Alternativamente, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada introduzindo diferentes estruturas de ácido nucleico, incluindo polinucleotídeos exógenos diferentes, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem, então, ser cruzadas e a progênie resultante selecionada para obter traços superiores de tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso de fertilizante, crescimento, biomassa, produção e/ou vigor, utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas.
[00376] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, o cultivo da planta expressando o polinucleotideo exógeno sob estresse abiótico.
[00377] Exemplos não limitantes de condições de estresse abiótico incluem salinidade, estresse osmótico, seca, privação de água, excesso de água (p.ex., inundação, encharcamento), etiolação, baixa temperatura (p.ex., estresse ao frio), alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférico e irradiação UV.
[00378] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método ainda compreendendo o crescimento da planta expressando o polinucleotideo exógeno em condições limitantes do fertilizante (p.ex., condições limitantes de nitrogênio). Os exemplos não limitantes incluem o crescimento da planta nos solos com baixo teor de nitrogênio (40-50% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais), ou mesmo em deficiência de nitrogênio severa (0 a 10% de nitrogênio do teor presente em condições normais e ideais).
[00379] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção abrange plantas que expressam de forma exógena o(s) polinucleotídeo(s), as estruturas de ácido nucléico e/ou o(s) polipeptídeo(s) do presente pedido de patente de invenção.
[00380] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou de toda a planta, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, como ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao polipeptídeo, Ensaio Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA I enzymelinked immuno sorbent assay), radioimunoensaios (RIA 1 radio-immuno-assays), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e outros métodos semelhantes.
[00381] Métodos para determinar o nível do RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno na planta são bem conhecidos na técnica e incluem, p.ex., análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR 1 reverse transcription polymerase chain reaction) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização in situ para RNA.
[00382] As informações e anotações da sequência não cobertas pelos presentes ensinamentos podem ser aproveitados em favor do melhoramento clássico. Assim, os dados da subsequência daqueles polinucleotídeos descritos acima podem ser utilizados como marcadores para seleção assistida pelo marcador (MAS 1 marker assisted selection), na qual um marcador é utilizado para seleção indireta de um determinante ou determinantes genético(s) de um traço de interesse (p.ex., biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção, tolerância ao estresse abiótico, eficiência no uso da água, eficiência no uso do nitrogênio e/ou eficiência no uso de fertilizantes). Os dados do ácido nucléico dos presentes ensinamentos (sequência de DNA ou RNA) podem conter ou estar ligados a sítios polimórficos ou a marcadores genéticos no genoma como o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP 1 restriction fragment length polymorphism), microsatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP 1 single nucleotide polymorphism), impressão genética (DFP 1 DNA fingerprinting), polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP 1 amplified fragment length polymorphism), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado e qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou de RNA.
[00383] Exemplos de seleções assistidas do marcador incluem, mas não se limitam à seleção de um traço morfológico (p.ex., um gene que afete a forma, a coloração, a esterilidade masculina ou a resistência como a presença ou a ausência de aresta, coloração da bainha da folha, altura, cor do grão, aroma do arroz); seleção de um traço bioquímico (p.ex., um gene que codifique uma proteína que possa ser extraída e observada; p.ex., isozimas e proteínas de reserva); seleção de um traço biológico (p.ex., (raças patogênicas ou biotipos de insetos baseados no patógeno hospedeiro ou a interação com o parasita hospedeiro pode ser utilizada como um marcador desde que a constituição genética de um organismo possa afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).
[00384] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos acima podem ser utilizados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de forma segura e eficiente em termos de custo.
[00385] Linhagens vegetais que expressam de forma exógena o polinucleotídeo ou o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção são triadas para identificar aquelas que mostram o maior aumento da característica desejada da planta.
[00386] Portanto, de acordo com uma aplicação adicional do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de avaliação de uma característica de uma planta, o método compreendendo: (a) expressar em uma planta ou em uma parte respectiva a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção (descrita acima); e (b) avaliar uma característica de uma planta em comparação com uma planta do tipo selvagem do mesmo tipo (p.ex, uma mesma espécie, p.ex., tendo o mesmo genótipo, exceto se não transformada com as biomoléculas reivindicadas); avaliando, assim, a característica da planta.
[00387] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para crescimento de uma colheita, compreendendo a semeadura de sementes e/ou plantio de mudas de uma planta transformada com os polinucleotídeos exógenos do presente pedido de patente de invenção, por exemplo, os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, uma característica selecionada do grupo constituído por aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento de tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade em comparação com uma planta não transformada.
[00388] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipetídeo, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polipetídeo definido nas ID SEQ. N° 470-762, 3706-5858, 5860-5910, 5912, 5914-5923, 5925-6046 ou 6047, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, uma característica selecionada do grupo constituído por aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento de tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação com uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.
[00389] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método de cultivo de uma colheita compreende a semeadura de sementes e/ou o plantio de mudas de uma planta transformada com um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucleico pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 81%, pelo menos, cerca de 82%, pelo menos, cerca de 83%, pelo menos, cerca de 84%, pelo menos, cerca de 85%, pelo menos, cerca de 86%, pelo menos, cerca de 87%, pelo menos, cerca de 88%, pelo menos, cerca de 89%, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos, cerca de 91%, pelo menos, cerca de 92%, pelo menos, cerca de 93%, pelo menos, cerca de 94%, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98%, pelo menos, cerca de 99%, p.ex., 100% idêntica ao polipetídeo definido nas ID SEQ. N° 1-469, 763-3704 ou 3705, caracterizado pela planta ser derivada de plantas selecionadas com, pelo menos, uma característica selecionada do grupo constituído por aumento da eficiência no uso do nitrogênio, aumento de tolerância ao estresse abiótico, aumento da biomassa, aumento da taxa de crescimento, aumento do vigor, aumento da produção e aumento da produção ou qualidade da fibra e aumento do teor de óleo em comparação com uma planta não transformada, aumentando, desta forma, a colheita.
[00390] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo) sobre a tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, conforme detalhado abaixo e na seção Exemplos a seguir.
[00391] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (isto é, expressando o transgene) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma condição de estresse abiótico, como privação de água, temperatura subótima (baixa temperatura, temperatura elevada), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, uma condição de estresse causada pelo sal, estresse osmótico, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.
[00392] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que plantas transgênicas com tolerância a concentrações elevadas de sal apresentem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em condições com níveis elevados de sal. O estresse por sal pode ser efetuado de muitas maneiras como, p.ex., irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas hidroponicamente em uma solução de cultivo hiperosmótica (p.ex., solução de Hoagland), ou submetendo as plantas à cultura em meio de crescimento hiperosmótico [p.ex., meio de Murashige-Skoog (meio MS) a 50%]. Como diferentes plantas variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, na solução de crescimento ou no meio de crescimento pode ser ajustada de acordo com as características específicas do cultivar ou variedade específica da planta, de forma a infligir um efeito leve ou moderado sobre a fisiologia e/ou morfologia das plantas (para conhecer as diretrizes com relação à concentração apropriada, consulte, Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editors) Marcel Dekker Inc., New York, 2002 e a referência lá contida).
[00393] Por exemplo, o teste de tolerância à salinidade pode ser realizado irrigando as plantas em diferentes estágios de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (p.ex., 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaC1) aplicadas de baixo e de cima para garantir uma dispersão regular do sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são, frequentemente, monitoradas até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos apareçam nas plantas do tipo selvagem. Dessa forma, a aparência fenotípica externa, o grau de emurchecimento e o sucesso geral para atingir a maturidade e a progênie da produção são comparados entre as plantas de controle e as transgênicas.
[00394] Os parâmetros de tolerância quantitativos medidos incluem, mas não estão limitados ao peso úmido e seco médio, à taxa de crescimento, ao tamanho da folha, à cobertura foliar (área foliar geral), ao peso das sementes geradas, ao tamanho médio das sementes e ao número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem maior biomassa do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.
[00395] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios com cloreto de sódio e manitol) são realizados para determinar se um fenótipo de estresse osmótico era específico do cloreto de sódio ou se era um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. As plantas tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para experimentos de germinação sob estresse salino e osmótico, o meio é suplementado, p.ex., com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaC1 ou com 100 mM, 200 mM NaC1, 400 mM de manitol.
[00396] Ensaio de tolerância à seca/Ensaio osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobrevida à planta depois de privação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo osmólito sorbitol não-iônico no meio pode ser realizado. Plantas de controle e transgênicas são germinadas e cultivadas em placas de ágar em plantas por 4 dias, depois do que elas são transferidas para placas contendo 50 mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento do crescimento, então, tanto as plantas de controle quanto as transgênicas são comparadas, medindo o peso da planta (úmida e seca), a produção e pelas taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração.
[00397] Inversamente, telas secas baseadas no solo são realizadas com plantas superexpressando os polinucleotídeos detalhados acima. Sementes de plantas Arabdopsis de controle, ou de outras plantas transgênicas superexpressando o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção são germinadas e transferidas para vasos. O estresse à seca é obtido depois que a irrigação é interrompida, acompanhada pela colocação dos vasos em papel absorvente para melhorar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são comparadas umas com as outras quando a maioria das plantas de controle desenvolvem emurchecimento grave. As plantas recebem água novamente depois de obter uma fração significativa das plantas de controle exigindo emurchecimento grave. As plantas são classificadas em comparação com os controles em relação a cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevida) após a reirrigação.
[00398] Tolerância ao estresse por frio - Para analisar o estresse por frio, plantas maduras (25 dias de idade) são transferidas para câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas são devolvidas à estufa. Duas semanas depois, os danos causados pelo período de resfriamento, resultando no retardamento do crescimento e em outros fenótipos, são comparados entre as plantas tanto de controle quanto transgênicas, medindo o peso da planta (úmida e seca) e comparando as taxas de crescimento medidas como o tempo para a floração, o tamanho da planta, a produção e parâmetros semelhantes.
[00399] Tolerância ao estresse por calor - A tolerância ao estresse por calor é alcançada expondo as plantas a temperaturas acima de 34 °C por um determinado período. A tolerância da planta é examinada depois de, transferir as plantas de volta para 22 °C para recuperação e avaliação depois de 5 dias em relação aos controles internos (plantas não-transgênicas) ou plantas não expostas nem ao estresse por frio nem ao estresse por calor.
[00400] Eficiência no uso da água - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração unitária. Para analisar a WUE, o teor de água relativo da folha pode ser medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW 1 fresh weight) é registrado imediatamente; então, as folhas são colocadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TW 1 turgid weight) é registrado. O peso seco (DW 1 dry weight) total é registrado depois da secagem das folhas a 60 °C a um peso constante. O teor relativo de água (RWC 1 relative water content) é calculado de acordo com a seguinte Fórmula I: Fórmula I RWC = [(FW - DW) / (TW - DW)] x 100
[00401] Eficiência no uso de fertilizantes - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em placas de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, p.ex., nos Exemplos 18-20 abaixo e em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci EUA. 2004; 101:7833-8). As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos, o teor de óleo, etc. Semelhantemente, ao invés de fornecer nitrogênio em quantidades limitantes, fosfato ou potássio podem ser adicionados em concentrações crescentes. Novamente os mesmos parâmetros medidos são os mesmos listados acima. Dessa forma, a eficiência no uso do nitrogênio (NUE), a eficiência da utilização do fosfato (PUE I phosphate use efficiency) e a eficiência da utilização de potássio (KUE I potassium use efficiency) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de se desenvolverem sob condições de restrição de nutrientes.
[00402] Eficiência no uso do nitrogênio - Para analisar se as plantas transgênicas (p.ex., plantas Arabidopsis) são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-3 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-10 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permite-se que as plantas cresçam por 25 dias adicionais ou até a produção de semente. Então, as plantas são analisadas quanto ao seu tamanho geral, tempo para a floração, produção, teor de proteína do broto e/ou do grão/semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho geral da planta madura, seu peso úmido e seco, o peso das sementes geradas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status do nitrogênio da planta e o grau de verdura da folha está altamente correlacionado), o teor de aminoácidos e de proteína total das sementes ou de outras partes da planta como as folhas ou os brotos o teor de óleo. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou que exibem níveis maiores dos parâmetros medidos do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas eficientes na utilização do nitrogênio.
[00403] Ensaio de eficiência no uso do nitrogênio utilizando plântulas - O ensaio é realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com pequenas modificações ("Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation e growth under low-nitrogen conditions" Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 7833-7838). Brevemente, as plantas transgênicas que são cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige- Skoog] suplementadas com um agente de seleção são transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: O meio MS no qual a concentração de nitrogênio combinada (NH4NO3 e KNO3) era de 0,75 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou de 6-15 mM (concentração de nitrogênio adequada). Permitiu-se que as plantas crescessem por 30-40 dias adicionais e, então, foram fotografadas, removidas individualmente do Ágar (o broto sem as raízes) e pesadas imediatamente (peso fresco) para análise estatística posterior. Estruturas para as quais somente sementes T1 estão disponíveis são semeadas em meio seletivo e pelo menos 20 mudas (cada uma representando um evento de transformação independente) são cuidadosamente transferidas para o meio limitante de nitrogênio. Para estruturas nas quais sementes T2 estão disponíveis, eventos de transformação diferentes são analisadas. Geralmente, 20 plantas selecionadas aleatoriamente de cada evento são transferidas para o meio limitante de nitrogênio e permite-se que elas cresçam por 3-4 semanas adicionais e são pesadas individualmente no final daquele período. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle cultivadas paralelamente sob as mesmas condições. Plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor ou plantas transgênicas carregando o mesmo promotor mas sem um gene repórter são utilizadas como controle.
[00404] Determinação do nitrogênio - O procedimento para a determinação da concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolve o método de digestão de persulfato de potássio para converter o N orgânico em NO3- (Purcell e King 1996 Argon. J. 88:111-113), a redução mediada de Cd-modificada de NO3- a NO2- (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito pelo ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são medidos a 550 nm em relação a uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.
[00405] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam o percentual de sementes de plantas transgênicas que poderiam completar o processo de germinação ao percentual de sementes das planas de controle que são tratadas da mesma maneira. Condições normais são consideradas, p.ex., incubações a 22 °C sob ciclos diários de 22 horas de luz e 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e do vigor da muda é realizada entre 4 e 14 dias após o plantio. O meio basal é o meio MS a 50% (Murashige e Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).
[00406] A germinação também é verificada em condições desfavoráveis como o frio (incubação a temperaturas inferiores a 10 °C ao invés de 22 °C) ou utilizando soluções para inibição da semente que contenham concentrações elevadas de um osmólito como o sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaC1).
[00407] O efeito do transgene sobre o vigor, a taxa de crescimento, a biomassa, a produção e/ou o teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.
[00408] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento dos parâmetros de crescimento como a área de folha, o comprimento das fibras, o diâmetro da roseta, o peso fresco da planta e parâmetros semelhantes por período.
[00409] Taxa de crescimento -A taxa de crescimento pode ser medida utilizando a análise digital de plantas cultivadas. Por exemplo, as imagens das plantas cultivadas em estufa com base no terreno podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença da área da roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre as amostras.
[00410] A avaliação da taxa de crescimento pode ser realizada medindo a biomassa produzida da planta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por período (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha).
[00411] A área de crescimento relativo pode ser calculada utilizando a Fórmula II. Fórmula II: Área da taxa de crescimento relativo = Coeficiente de regressão da área ao longo do ciclo de tempo.
[00412] Assim, a taxa da área de crescimento relativo está em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento do comprimento está em unidades de 1/dia.
[00413] Produção de semente -A avaliação da produção de semente por planta pode ser realizada medindo a quantia (peso ou tamanho) ou quantidade (isto é, o número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8-16 plantas e dividido pelo número de plantas.
[00414] Por exemplo, as sementes totais de 8-16 plantas podem ser coletadas e pesadas utilizando, p.ex., uma balança analítica, e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. A produção de semente por área de cultivo pode ser calculado da mesma maneira levando em consideração a área de cultivo determinada para uma única planta. O aumento da produção de semente por área de cultivo pode ser alcançado aumentando a produção de semente por planta, e/ou aumentando o número de plantas capazes de serem cultivadas em uma determinada área.
[00415] Além disso, a produção de semente pode ser determinado através do peso de 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado como segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e uma fotografia é tirada. Cada amostra é pesada e, então, utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra é calculado.
[00416] As 1000 sementes pesadas podem ser calculadas utilizando a Fórmula III: Fórmula III: Peso de 1000 Sementes = número de sementes na amostra/peso da amostra X 1000
[00417] O Índice de Colheita pode ser calculado utilizando a Fórmula IV. Fórmula IV: Índice de colheita = Produção médio da semente por planta / Peso seco médio.
[00418] Concentração de proteína no grão - O teor de proteína no grão (g de proteína no grão m-2) é estimado como o produto da massa do grão N (g de N do m-2) multiplicado pela taxa de conversão de N/proteína de k-5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína no grão é estimada como a relação do teor de proteína no grão por massa unitária do grão (g de proteína no grão kg-1 do grão).
[00419] Comprimento das fibras - O comprimento das fibras pode ser medido utilizando um fibrógrafo. O sistema de fibrógrafo foi utilizado para computar o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". A média da metade superior (UHM 1 upper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição das fibras. O fibrógrafo mede o comprimento em comprimentos de envergadura em um determinado ponto percentual (http://www (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).
[00420] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o aumento da produção de milho pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes itens: aumento do número de plantas por área de cultivo, aumento do número de espigas por planta, aumento do número de fileiras por espiga, número de grãos por fileira da espiga, o peso do grão, o peso de mil grãos (peso por 1000), comprimento/diâmetro da espiga, aumento do teor de óleo por grão e aumento do teor de amido por grão
[00421] Conforme mencionado, o aumento da produção da planta pode ser determinado por vários parâmetros. Por exemplo, o aumento da produção de arroz pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento do peso por mil grãos (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de amido por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00422] Semelhantemente, o aumento da produção da soja pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, aumento do teor de proteínas pro semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00423] O aumento da produção da canola pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de vagens por planta, número de sementes por vagem, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de 1000 sementes (peso por 1000), redução da dilaceração das vagens, aumento do teor de óleo por semente, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00424] O aumento da produção do algodão pode ser manifestado por um aumento de um ou mais dos seguintes itens: número de plantas por área de cultivo, número de cápsulas por planta, número de sementes por cápsula, aumento da taxa de enchimento da semente, aumento no peso de mil sementes (peso por 1000), aumento do teor de óleo por semente, melhora do comprimento das fibras, resistência das fibras, entre outros. Um aumento na produção também pode resultar na arquitetura modificada, ou pode ocorrer por causa da arquitetura modificada.
[00425] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetal da planta. Brevemente, os lipídeos (óleo) podem ser removidos da planta (p.ex., semente) moendo o tecido da planta na presença de solventes específicos (p.ex., hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator continuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos como a Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR 1 nuclear magnetic resonance), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Vide, p.ex., Conway TF. e Earíe FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Online)]; a Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NI near infrared), que utiliza a absorção de energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) pela amostra; e um método descrito no W0/2001/023884, que é baseado na extração de óleo com solvente, evaporando o solvente em uma corrente gasosa que forma partículas de óleo e direcionando uma luz para a corrente de gás e nas partículas de óleo, que forma uma luz refletida detectável.
[00426] Dessa forma, o presente pedido de patente de invenção é de alto valor agrícola para promover a produção de culturas comercialmente desejadas (p.ex., biomassa de um órgão vegetal como a madeira do choupo, ou de um órgão reprodutor como o número de sementes ou a biomassa da semente).
[00427] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes delas podem ser processadas para produzir um alimento, uma ração, proteína ou preparação de óleo, como para animais ruminantes.
[00428] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um aumento do teor de óleo, podem ser utilizadas para produzir óleo vegetal (extraindo o óleo da planta).
[00429] O óleo vegetal (incluindo o óleo da semente e/ou o óleo da porção vegetal) produzido de acordo com o método do presente pedido de patente de invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com a utilização pretendido. Produtos exemplares incluem ração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradável, produto alimentício misturado, óleo edível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, salgadinhos, cosméticos e matéria- prima para processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados no óleo vegetal incluem rações animais, produtos alimentícios humanos como salgadinhos extrudados, pães, como um agente de ligação aos alimentos, rações para aquacultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras alimentícias nutricionais, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas e cereais.
[00430] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o óleo compreende um óleo de semente.
[00431] De acordo com algumas aplicações ddo presente pedido de patente de invenção , o óleo compreende um óleo da porção vegetal (o óleo da porção vegetal da planta).
[00432] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula de planta forma uma parte da planta.
[00433] De acordo com outra aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um alimento ou ração, compreendendo as plantas ou uma parte respectiva do presente pedido de patente de invenção.
[00434] Conforme utilizado aqui, o termo "aproximadamente" refere-se a ± 10%.
[00435] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "apresentando" e suas conjugações significam "incluindo, mas não se limitando a".
[00436] O termo "consiste de" significa "incluindo e limitado(a) a".
[00437] O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicado.
[00438] Conforme utilizada aqui, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural, exceto se o contexto claramente especificar o contrário. P.ex., o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas deles.
[00439] Ao longo do presente pedido, várias aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser apresentadas em formato variado. Deve-se compreender que a descrição em formato variado é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser considerada como uma limitação inflexível do escopo do presente pedido de patente de invenção. Portanto, a descrição de uma variedade deve ser considerada como tendo especificamente revelado todas as subvariações possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela variação. Por exemplo, a descrição de uma variação como a de 1 a 6 deve ser considerada como tendo especificamente revelado subvariações como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela variação, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independente da amplitude da variação.
[00440] Sempre que uma variação numérica for indicada no presente documento, isso significa incluir qualquer numeral citado (fracional ou integral) dentro da variação indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/varia de" um primeiro número indicado "a" a um segundo número indicado são utilizadas aqui intercambiavelmente e significam incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionais e integrais entre eles.
[00441] Conforme utilizado aqui, o termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, mas não se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidas, ou prontamente desenvolvidas a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.
[00442] Deve-se observar que determinadas características do presente pedido de patente de invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, também podem ser apresentadas em combinação em uma única aplicação. Inversamente, várias características do presente pedido de patente de invenção, que são, para propósitos de brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser apresentadas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou da forma apropriada em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Determinadas características descritas no contexto de várias aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.
[00443] Várias aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção são delineados acima e, conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.
EXEMPLOS
[00444] Agora faz-se referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção de forma não limitante.
[00445] Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente documento e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Essas técnicas são explicadas minuciosamente na literatura. Vide, p.ex., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1-111 Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme definidas nas Patentes Norte-Americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes, vide, p.ex., as Patentes Norte-Americanas N° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Proteína Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência como se totalmente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais são apresentadas ao longo do presente documento. Acredita-se que os procedimentos descritos nessas obras sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas nelas são incorporadas aqui por referência.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS E DE BIOINFORMÁTICA EM GERAL
[00446] Extração de RNA -Tecidos cultivados em diversas condições de crescimento (conforme descrito abaixo) foram amostrados e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [http://www (ponto) invitrogen (ponto) com/content (ponto)cfm?pageid=469]. Aproximadamente 30-50 mg de tecido foram coletados das amostradas. Os tecidos pesados foram triturados utilizando pilão e almofariz em nitrogênio líquido e ressuspensos em 500g1 de Reagente TRIzol. Ao lisado homogeneizado, 100g1 de clorofórmio foram adicionados seguidos por precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol a 75%. O RNA foi eluído em 30g1 de água livre de RNase. As amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza como minikit RNeasy da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante (QIAGEN Inc, CA EUA). Para conveniência, cada tipo de tecido com informações de expressão de microarranjo recebeu uma Identificação do conjunto da expressão.
[00447] Análise de correlação - foi realizada para genes selecionados, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, nos quais os parâmetros caracterizados (parâmetros medidos de acordo com as Identidades de correlação) foram utilizados como "eixo X" para a correlação com o transcriptoma do tecido que foi utilizado como "eixo Y". Para cada gene e parâmetro medido, foi calculado um coeficiente de correlação "R", utilizando a correlação de Ervilharson junto de um valor-p para a significância da correlação. Quando o coeficiente de correlação (R) entre os níveis de uma expressão de gene em um determinado tecido e um desempenho fenotípico através de ecotipos/variedade/híbrido é alto em valor absoluto (entre 0,5-1), há uma associação entre o gene (especificamente o nível de expressão desse gene) e a característica fenotípica (p.ex., aumento na produção, taxa de crescimento, eficiência no uso do nitrogênio, tolerância ao estresse abiótico e semelhantes). EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM A EFICIÊNCIA NO USO DE NITROGÊNIO (NUE), EFICIÊNCIA NO USO DE FERTILIZANTE (FUE), PRODUÇÃO, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, BIOMASSA, TEOR DE ÓELO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO (ABST) E/OU EFICIÊNCIA NO USO DA ÁGUA (WUE) EM PLANTAS
[00448] Os presentes inventores identificaram polinucleotídeos cuja regulação ascendente de expressão respectiva em plantas aumenta a eficiência no uso do nitrogênio (NUE), a eficiência no uso de fertilizantes (FUE), a produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, a qualidade e/ou quantidade de grãos), a taxa de crescimento, o vigor, a biomassa, o teor de óleo, a produção de fibra, a qualidade da fibra, o comprimento da fibra, a tolerância ao estresse abiótico (ABST) e/ou eficiência no uso da água (WUE), de uma planta.
[00449] Todo os conjuntos de dados da sequência de nucleotídeos utilizados aqui foram originados a partir das bases de dados disponíveis publicamente ou de sequências obtidas utilizando a tecnologia Solexa (p.ex., cevada e sorgo). Os dados da sequência de 100 espécies diferentes de planta foram introduzidos em uma base de dados abrangente, única. Outras informações na expressão de gene, anotação de proteína, enzimas e caminhos também foram incorporadas. As principais bases de dados utilizadas incluem: Genomas
[00450] Genoma de Arabidopsis [Genoma TAIR, versão 6 (http://www (ponto) Arabidopsis (ponto) org/)]; Genoma de arroz [estrutura IRGSP 4.0 (http://rgp (ponto) dna (ponto) affrc (ponto) go (ponto) jp/IRGSP/)]; Choupo [Populus trichocarpa, liberação 1.1 de JGI (liberação conjunta v1.0) (http://www (ponto) genome (ponto) jgi-psf (ponto) org/)]; Brachypodium [conjunto 4x JGI, http://www (ponto) brachpodium (ponto) org)]; Soja [DOE-JGI SCP, versão Glyma0 (http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; Uva [Consórcio Público Franco-Italiano para Caracterização do Genoma de Videiras (http://www (ponto) genoscope (ponto) ens (ponto) fir /)]; Mamona [TIGR/J, Instituto Craig Venter, conjunto 4x [(http://msc (ponto) jevi (ponto) org/rcommunis]; Sorgo [DOE-JGI SCP, versão Sbil [http://www (ponto) phytozome (ponto) net/)]; Milho [http://milhosequence (ponto) org/]; Pepino [http://cucumber (ponto) genomics (ponto) org (ponto) cn/page/cucumber/index (ponto) jsp] Tomate [http://solgenomics (ponto) net/tomato/] Mandioca [http://www (ponto) phytozome (ponto) net/cassava (ponto) php]
[00451] Sequências expressas de EST e mRNA foram extraídas seguintes bases de dados: GenBank (http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/ Genbank/); RefSeq (Http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov/RefSeq/); TAIR (Http://www (ponto) Arabidopsis (ponto) org/); Bases de dados de proteínas e caminhos Uniprot [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/].
[00452] AraCyc [http://www (ponto) Arabidopsis (ponto) org/biocyc/index (ponto) jsp].
[00453] ENZYME [http://expasy (ponto) org/enzyme/].
[00454] Os conjuntos de dados de microarranjos foram baixados de:
[00455] Dados de microarranjos de propriedade exclusiva (VideWO2008/122980 e Exemplos 3-10 abaixo). Informações de QTL e SNPs
[00456] Gramene [http://www (ponto) gramene (ponto) org/qt1/]. Panzea [http://www (ponto) panzea (ponto) org/index (ponto) html].
[00457] Soja QTL: [http://www (ponto) soybeanbreederstoolbox(ponto) com/].
[00458] Conjunto da Base de Dados - foi elaborado para constituir uma base de dados ampla, rica, detalhada, confiável e fácil de analisar, compreendendo sequências genômicas de mRNA, EST's, DNA, publicamente disponíveis, dados de várias culturas, bem como dados de expressão genética, anotação e caminho de proteínas, dados de QTL's e outras informações relevantes.
[00459] O conjunto de bases de dados compreende uma caixa de ferramentas de aprimoramento, estruturação, anotação genético e ferramentas de análise que permitem construir uma base de dados sob medida para cada projeto de descoberta genética. As ferramentas de aprimoramento e estruturação genético(a) permitem detectar confiavelmente variantes reunidas e transcritos antisenso, gerando a compreensão de vários resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD de analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [vide, p.ex., "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 37985; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002] e comprovaram ser mais eficientes na genômica vegetal, também.
[00460] Conjunto genético e agrupamento EST - Para o agrupamento genético e o agrupamento de organismos com dados disponíveis da sequência genômica (Arabidopsis, arroz, mamona, uva, brachypodium, choupo, soja, sorgo), foi utilizada a versão genômica (GANG) do LEADS. Essa ferramenta permite o agrupamento mais preciso de sequências de ESTs e mRNA no genoma e prevê a estrutura genética, bem como, eventos alternativos de agrupamento e transcrição antisenso.
[00461] Para organismos sem dados completos de sequência genômica disponível, o software de agrupamento "expressed LEADS" foi aplicado.
[00462] Anotação genética -Genes e proteínas previstos foram anotados conforme segue: A busca de comparação de sequências [http://blast (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] contra todos os UniProt da planta [http://www (ponto) uniprot (ponto) org/] foi realizada. Estruturas de leitura abertas de cada transcrito putativo foram analisadas e o ORF mais longo com o número maior de homólogos foi selecionado como a proteína prevista do transcrito. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [http://www (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/interpro/].
[00463] A comparação contra proteínas das bases de dados AraCyc e ENZYME foi utilizada para mapear os transcritos previstos com os caminhos da AraCyc.
[00464] As proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando o algoritmo de comparação [http://www (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov /Blast (ponto) cgi] para validar a exatidão da sequência de proteínas prevista e para a detecção eficiente de ortólogos.
[00465] Perfil da expressão genética - Diversas fontes de dados foram exploradas quanto ao perfil da expressão genética, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (veja abaixo). De acordo com o perfil da expressão genética, uma análise de correlação foi realizada para identificar genes que são corregulados sob diferentes estágios de desenvolvimento e condições ambientais e associados com diferentes fenótipos.
[00466] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis publicamente foram baixados dos sites TAIR e NCBI GEO, renormalizados e integrados na base de dados. O perfil de expressão é um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para a produção.
[00467] Um resumo digital do perfil de expressão foi compilado para cada agrupamento de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros da sequência compreendendo o agrupamento. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil virtual da expressão com base nas sequências EST que formam o agrupamento genético. A ferramenta apresenta o perfil da expressão de um agrupamento em termos de anatomia da planta (p.ex., o tecido/órgão no qual o gene é expresso), o estágio de desenvolvimento (os estágios de desenvolvimento nos quais um gene pode ser encontrado) e o perfil de tratamento (apresenta as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, como seca, frio, infecção por patógeno, etc.). Dada a distribuição aleatória de ESTs nos diferentes agrupamentos, a expressão digital apresenta um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento apresentar um total de N ESTs para conter X ESTs de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade, leva-se em consideração o seguinte: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs das bibliotecas envolvidas e relacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis representando a espécie. Desse modo, agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse indicando uma expressão especializada.
[00468] Recentemente, a precisão desse sistema foi demonstrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosaquencing) em: XVII Conferência de Genomas Vegetais e Animais, San Diego, CA. A análise transcriptômica com base na abundância relativa de EST's nos dados foi realizada pelo pirosaquenciamento 454 de cDNA representando o mRNA do melão. Quatorze amostras de cDNA de fita dupla obtidas de dois genótipos, dois tecidos de frutas (polpa e casca) e quatro estágios desenvolvimentais foram sequenciados. O pirosaquenciamento por GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de amostras de cDNA não normalizadas e purificadas renderam 1.150.657 etiquetas de sequências expressas (ESTs) que se agruparam em 67.477 unigenes (32.357 singletons e 35.120 contigs). A análise dos dados obtidos contra a Base de Dados Genômica de Cucurbitáceas [http://www (ponto) icugi (ponto) org/] confirmou a exatidão do sequenciamento e do agrupamento. Padrões de expressão de genes selecionados encaixaram bem seus dados de qRT-PCR (reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa).
[00469] No geral, 215 genes foram identificados como tendo um grande impacto na eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, qualidade e/ou quantidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água quando sua expressão respectiva é aumentada em plantas. Os genes idênticos, seus polinucleotídeos curados e sequências de polipeptídeos, bem como suas sequências atualizadas, de acordo com a base de dados GenBank, são resumidos na Tabela 1, abaixo. Tabela 1
[00470] Polinucleotideos identificados para aumentar a eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção de fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta.
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Tabela 1: "Polip." = polipeptídeo; "Polin." = polinucleotideo. EXEMPLO 2 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS QUE AUMENTAM A EFICIÊNCIA NO USO DO NITROGÊNIO, EFICIÊNCIA NO USO DE FERTILIZANTES, PRODUÇÃO, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO E/OU EFICIÊNCIA NO USO DA ÁGUA EM PLANTAS.
[00471] Os conceitos de ortologia e paralogia foram recentemente aplicados às caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações do genoma completo. Os ortólogos e parálogos constituem dois principais tipos de homólogos: O primeiro evoluiu de um ancestral comum por especialização e os últimos são relacionados por eventos de duplicação. Supõe-se que parálogos decorrentes de eventos de duplicação antiga tendem a ter divergido na função enquanto verdadeiros ortólogos são mais propensos a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo.
[00472] Para investigação e identificação adicionais de ortólogos putativos dos genes que afetam a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produção (p.ex., produção de sementes, produção de óleo, qualidade e/ou quantidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água, todas as sequências foram alinhadas utilizando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básica BLAST(/Basic Local Alignment Search Tool/). Sequências suficientemente semelhantes fora tentativamente agrupadas. Estes ortólogos putativos foram ainda organizados sob um Filograma - um diagrama de ramificação (árvore) assumido como uma representação das relações evolutivas entre os táxons biológicos. Grupos ortólogos putativos foram analisados quanto a sua concordância com o filograma e, em casos de divergências, esses grupos ortólogos foram divididos adequadamente.
[00473] Dados de expressão foram analisados e as bibliotecas EST foram classificadas utilizando um vocabulário fixo de termos personalizadas, tais como estágios de desenvolvimento (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão semelhante, através do desenvolvimento com regulação ascendente na fase específica, como na fase de estocagem de grãos) e/ou órgão da planta (por exemplo, genes que mostram o perfil de expressão similar em seus órgãos com regulação ascendente em órgãos específicos, como a semente). As anotações de todos os ESTs agrupadas a um gene foram analisadas estatisticamente por comparação da sua frequência no conjunto em relação a sua abundância na base de dados, permitindo a estrutura de um perfil de expressão numérica e gráfica de tal gene, o que é denominado "digital expression". A lógica de utilizar estes dois métodos complementares com métodos de estudos de associação fenotípica de QTL's, SNPs e expressão fenotípica baseia-se na suposição de que os verdadeiros ortólogos tendem a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo. Estes métodos proporcionam diferentes conjuntos de indicações sobre as semelhanças funcionais entre dois genes homólogos, semelhanças no nível da sequência de aminoácidos - idênticos nos domínios proteicos e similaridade em perfis de expressão.
[00474] A pesquisa e identificação de genes homólogos envolve o rastreio de informação de sequência disponível, por exemplo, em bases de dados públicas que incluem, mas não se limitam à Base de Dados de DNA do Japão (DDBJ 1 DNA Database of Japan), Genbank e a Base de Dados de Sequência de Ácido Nucleico do Laboratório de Biologia Nuclear (EMBL 1 European Molecular Biology Laboratory) ou suas versões ou a base de dados MIPS. Um número de diferentes algoritmos de pesquisa têm sido desenvolvidos, incluindo, mas não se limitando ao conjunto de programas referidos como programas de BLAST. Há cinco implementações de BLAST, três projetadas para consultas de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e duas projetadas para consultas de sequência de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Tais métodos envolvem o alinhamento e a comparação das sequências. O algoritmo BLAST calcula a percentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística de similaridade entre as duas sequências. O software para a realização de análise BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Outros destes tipos de software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. A GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimizam o número de lacunas.
[00475] Os genes homólogos podem pertencer à mesma família genética. A análise de uma família genética pode ser realizada utilizando a análise de similaridade de sequência. Para realizar esta análise pode-se utilizar programas padrões para alinhamentos múltiplos, por exemplo, o Clustal W. Uma árvore de Agrupamento de Vizinhos [Neighbor Joining] das proteínas homólogas dos genes de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizada para fornecer uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A identidade da sequência pode ser calculada usando um programa de alinhamento conforme descrito abaixo. Espera-se que outras plantas tenham um gene funcional semelhante (ortólogo) ou de uma família de genes semelhantes e tais genes fornecerão o mesmo fenótipo preferido como os genes aqui apresentados. Vantajosamente, estes membros da família podem ser úteis nos métodos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção. Exemplos de outras plantas inlcuem, mas não se limitando a cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Milho (Zea mays), Algodão (Gossypium), Canola (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorgo bicolor), Soja (Glycine max), Girassol (Helianthus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum) e Trigo (Triticum aestivum).
[00476] As análises acima mencionadas para uma homologia de sequência são preferivelmente realizadas em uma sequência de comprimento total, mas podem também basear-se em uma comparação de certas regiões, tais como os domínios conservados. A identificação de tais domínios também seria boa dentro do âmbito de conhecimento de um especialista na técnica e envolveria, por exemplo, um formato legível para computador dos ácidos nucleicos de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informações publicamente disponíveis sobre os domínios de proteínas, motivos conservados e caixas Esta informação está disponível na base de dados PRODOM (http://www (ponto) biochem (ponto) ucl (ponto) ac (ponto) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (ponto) html), PIR (http://pir (ponto) Georgetown (ponto) edu/) ou Pfam (http://www (ponto) sanger (ponto) ac (ponto) uk/Software/Pfam/). Programas de análise de sequências desenvolvidos para pesquisa de motivo podem ser utilizados para a identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados conforme mencionados acima. Programas de computador preferidos incluem, mas não estão limitados a, MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.
[00477] Um especialista na técnica pode utilizar as sequências homólogas fornecidas aqui para encontrar sequências similares em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídios, proteínas e enzimas que têm substituições de aminoácidos, deleções e/ou inserções em relação à proteína não modificada em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante à proteína não modificada a partir da qual são derivadas. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (modificações conservadoras, tais como hidrofobicidade semelhante, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar uma estrutura ou quebrar estruturas helicoidais ou estruturas de 3 folhas). Tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (vide, p.ex., Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Os homólogos de um aminoácido englobam ácidos nucleicos com substituição de nucleotídeo, deleções e/ou inserções em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e que têm atividade biológica e funcional semelhante ao ácido nucleico não modificado a partir da qual são derivadas.
[00478] Os polinucleotídeos e polipeptídeos com uma homologia significativa aos genes identificados descritos na Tabela 1 (Exemplo 1, acima) foram identificados a partir das bases de dados, utilizando o software BLAST com os algoritmos Blastp e tBlastn como filtros para a primeira fase e a agulha (pacote EMBOSS) ou alinhamento FRAME+ algoritmo para a segunda fase. A identidade local (alinhamentos Blast) foi definida com um corte bastante permissivo - 60% de Identidade em um intervalo de 60% dos comprimentos de sequências porque utiliza tão somente um filtro para a fase de alinhamento global. A filtragem padrão do pacote Blast não foi usada (estabelecendo o parâmetro "-F F").
[00479] No segundo estágio, os homólogos foram definidos com base na identidade global de, pelo menos, 80% para a sequência polipeptídica genética principal.
[00480] Duas formas distintas para encontrar o alinhamento global ideal para as sequências de proteína ou de nucleotídeos foram utilizadas neste pedido.
[00481] Entre duas proteínas (após o filtro blastp): Algoritmo EMBOSS- 6.0.1 de Needleman-Wunsch com os seguintes parâmetros modificados: gapopen=8 gapextend=2. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.
[00482] Entre uma sequência de proteína e uma sequência nucleotídica (após o filtro rblastn): Aplicativo GenCore 6.0 OneModel, utilizando o algoritmo Frame+ com os seguintes parâmetros: model=frametp2n.model mode=gglobal - q=protein.sequence -db= nucleotide.sequence. O restante dos parâmetros permaneceu inalterado a partir das opções padrões descritas acima.
[00483] As sequências de polipeptídeos de consulta foram as ID SEQ N°: 470-762 (que são codificadas pelos polinucleotídeos da ID SEQ N°: 1469, apresentadas na Tabela 1, acima) e as sequências ortólogas e homólogas identificadas tendo, pelo menos, 80% da identidade da sequência global são fornecidas na Tabela 2, abaixo. Espera-se que estes genes homólogos (p.ex., ortólogos) aumentem a NUE, produção, produção de sementes, produção de óleo, teor de óleo, taxa de crescimento, produção de fibra, qualidade da fibra, biomassa, vigor e/ou ABST de uma planta. Tabela 2
[00484] Homólogos dos genes/polipeptídeos identificados para aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, produção de sementes, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta.
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[00485] Tabela 2: São fornecidos polipeptídeos e polinucleotideos homólogos dos genes identificados na Tabela 1 e seus genes clonados, os quais podem aumentar a eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, produção de sementes, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta. A homologia foi calculada como % de identidade sobre as sequências de alinhamento. As sequências de consultas foram as sequências de polipeptídeos da ID SEQ N°: 70-762 e as sequências em questão são sequências de polipeptídeos ou sequências de polinucleotídeos que foram dinamicamente transpostas em todos os seis quadros de leitura identificados no banco de dados com base em identidade maior que 80% com relação às sequências de polipetídeos da consulta. "Polip." = polipeptídeo; "Polin" - polinucleotídeo; "Algor." = Algoritmo; "globlastp" - homologia global utilizando blastp; "glotblastn" - homologia global utilizando tblastn. "Hom." - homólogo.
[00486] O resultado da abordagem genômica funcional descrita aqui é um conjunto de genes com estimativas elevadas de melhoria da eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, produção de sementes, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, produção da fibra, qualidade da fibra, comprimento da fibra, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta, aumentando sua expressão.
[00487] Embora estime-se que cada gene tenha seu próprio impacto, espera-se que a modificação do modo de expressão de mais de um gene ou produto de gene (RNA, polipeptídeo) forneça um efeito aditivo ou sinérgico sobre uma característica desejada (p.ex., eficiência no uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizante, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso de água de uma planta). Ao alterar a expressão de cada gene descrito aqui, o gene sozinho ou o conjunto de genes aumenta a produção global e/ou outros traços agrícolas importantes e, deste modo, espera-se aumentar a produtividade agrícola. EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE ARABIDOPSIS 44K.
[00488] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade comparando entre fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arabidopsis, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent(ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 44.000 genes transcrições de Arabidopsis. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com NUE, os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, várias características de plantas de 14 ecotipos Arabidopsis diferentes foram analisadas. Dentre elas, dez ecotipos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisando utilizando teste de correlação Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais
[00489] Tecidos de Arabidopsis analisados - Dois tecidos de plantas [folhas e caules] crescendo em dois níveis diferentes de fertilização de nitrogênio (1,5 mM de Nitrogênio ou 6 mM de Nitrogênio) foram amostrados e RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 3 abaixo. Tabela 3
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Tabela 3.
[00490] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Arabidopsis em diferentes níveis de fertilização de nitrogênio - 10 acessos de Arabidopsis em 2 lotes repetitivos, cada um contendo 8 plantas por lotes, foram cultivadas na estufa. O protocolo de cultivo utilizado foi o seguinte: sementes esterilizadas na superfície foram semeadas em tubos Eppendorf contendo meio de sal basal Murashige-Skoog x 0,5 e cultivadas a 23 'C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas no escuro por 10 dias. Então, mudas de tamanho semelhante foram cuidadosamente transferidas para potes preenchidos com uma mistura de perlita e turfa em uma proporção de 1:1. As condições limitantes de nitrogênio constantes foram alcançadas irrigando as plantas com uma solução contendo nitrogênio orgânico a 1,5mM na forma de KNO3, suplementado com CaCl2 a 2mM, KH2PO4 a 1,25mM, MgSO4 a 1,50mM, KC1 a 5 mM, H3B03 a 0,01 mM, e microelementos, enquanto condições normais de irrigação foram alcançadas aplicando uma solução de nitrogênio inorgânico a 6mM também na forma de KNO3, suplementado com CaC12 a 2mM, KH2PO4 a 1,25 mM, MgSO4 a 1,50 mM, H3B03 a 0,01 mM e microelementos. Para acompanhar o crescimento da planta, bandejas foram fotografadas no dia que as condições limitantes foram iniciadas e subsequentemente a cada 3 dias por cerca de mais 15 dias. A área de planta de roseta foi então determinada a partir das fotos digitais. O software ImageJ foi utilizado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotos digitais [Http://rsb (ponto) info (ponto) nih (ponto) gov/ij/] utilizando scripts exclusivos projetados para analisar o tamanho da área da roseta a partir de plantas individuais como uma função do tempo. O sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Java com base no programa de processamento de imagem, que foi desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde Dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]). Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00491] Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 4, abaixo. Tabela 4 Parâmetros correlacionados à Arabidopsis (vetores)
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[00492] Tabela 4 "N" = Nitrogênio nas concentrações anotadas; "gr." = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "t50" = tempo onde 50% das plantas floresceram; "gr./unidade SPAD" = biomassa da planta expressa em gramas por unidade de nitrogênio na planta medida por SPAD. "DW" = peso seco da planta; "Nível N / DW" = nível de nitrogênio da planta medido em unidade SPAD por biomassa de planta [gr.; "DW/ nível N" biomassa de planta por planta [gr.]/unidade SPAD; Avaliação de NUE, parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor - Dez ecotipos de Arabidopsis foram cultivados em bandejas, cada um contendo 8 plantas por lote, em uma estufa com condições de temperatura controladas por cerca de 12 semanas. As plantas foram irrigadas com concentração diferente de nitrogênio conforme descrito acima dependendo do tratamento aplicado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. A maioria dos parãmetros escolhido foi analisada pela formação de imagem digital. Formação de Imagem Digital - Ensaio na Estufa
[00493] Um sistema de aquisição de imagem, que consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 400D) anexada com uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S) colocada em uma montagem de alumínio personalizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas plantadas dentro de uma estufa controlada pelo ambiente. O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 e 3 dias começando no dia 9 a 12 até o dia 16 a 19 (respectivamente) a partir do transplante.
[00494] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, Java com base no programa de processamento de imagem, que foi desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde Dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em Http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida, dados de saída de processamento foram salvos para arquivos de textos e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00495] Análise de folha -Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da lâmina foliar, o diâmetro de roseta e a área da roseta.
[00496] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativo (RGR) da área da lâmina foliar (Fórmula V), número da folha (Fórmula VI), área da roseta (Fórmula VII), diâmetro da roseta (Fórmula VIII), cobertura do lote (Fórmula IX) e Área Relativa de Pecíolo (Fórmula X) foram calculadas conforme a seguir: Fórmula V Taxa de crescimento relativo da área da lâmina foliar = coeficiente de regressão da área da folha ao longo do tempo. Fórmula VI Taxa de crescimento relativo do número da folha da planta = coeficiente de regressão do número da folha da planta ao longo do tempo. Fórmula VII Taxa de crescimento relativo da área de roseta = coeficiente de regressão da área de roseta ao longo do tempo. Fórmula VIII Taxa de crescimento relativo do diâmetro da roseta = coeficiente de regressão do diâmetro da roseta ao longo do tempo. Fórmula IX Taxa de crescimento relativo da cobertura de lote = coeficiente de regressão do lote. Fórmula X Área Relativa de Pecíolo = [(lâmina foliar*número de folha)/Roseta.
[00497] Produção de semente e peso de 1000 sementes - No final do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram coletadas e medidas a fim de medir a produção de semente por planta em termos do peso de semente total por planta (gr.). Para o cálculo de peso de 1000 sementes, um peso médio de 0,02 gramas foi medido a partir de cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00498] Peso seco e produção de semente - No final do experimento, a planta foi colhida e deixada para secar a 30 °C em uma câmara de secagem. A biomassa foi separada das sementes, pesada e dividida pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 30 °C em uma câmara de secagem.
[00499] Índice de Colheita -O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV, conforme descrito acima.
[00500] T50 dias para floração - Cada uma das repetições foi monitorada para a data de floração. Os dias floração foram calculados a partir da data de semeadura até 50% dos lotes floridos.
[00501] Nível de nitrogênio na planta - O teor de clorofila das folhas é um bom indicador do estado do nitrogênio na planta uma vez que o grau de verdor da folha está altamente correlacionado a esse parâmetro. O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote. Com base nessa medição, os parâmetros, tais como proporção entre produção de semente por unidade de nitrogênio [produção de semente/nível N = produção de semente por planta [gr.]/unidade SPAD], planta DW por unidade de nitrogênio [DW/nível N = biomassa da planta por planta [gr.]/unidade SPAD], e nível de nitrogênio por grama de biomassa [nível N/DW = unidade SPAD/ biomassa de planta por planta (gr.)] foram calculados.
[00502] Porcentagem de redução na produção de semente - mede a quantidade de sementes obtidas em plantas quando cultivadas em condições limitantes de nitrogênio comparado à produção de semente produzida em níveis normais de nitrogênio expressos em %. Resultados Experimentais
[00503] 10 diferentes acessos de Arabidopsis (ecotipos) foram cultivados e caracterizados por 37 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos na Tabela 5 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma (Tabela 3) e os parâmetros medidos foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 5 Parâmetros medidos em acessos de Arabidopsis
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[00504] Tabela 5 São fornecidos os parâmetros medidos sob vários tratamentos em vários ecotipos (acessos de Arabidopsis). EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE DOS PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO, BIOMASSA E/OU VIGOR UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE GENOMA TOTAL DE ARABIDOPSIS 44K
[00505] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando-se o fenátipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo Arabidopsis thaliana, produzida pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 40.000 genes e transcrições A. thaliana projetados com base nos dados da base de dados TIGR ATH1, v.5, e bases de dados Arabidopsis MPSS (Universidade do Delaware). Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados aos componentes de produção, biomassa ou vigor, várias características da planta de 15 ecotipos diferentes Arabidopsis foram analisadas. Dentre elas, nove ecotipos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de corrrelação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais
[00506] Tecidos Analisados de Arabidopsis - Cinco tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento, incluindo raiz, folha, flor em antese, semente em 5 dias após a floração (DAF 1 days after flowering) e semente em 12 DAF, representando diferentes características de planta, foram provados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 6 abaixo. Tabela 6 Tecidos utilizados para conjuntos de expressão de transcrição de Arabidopsis
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[00507] Tabela 6: São providos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão de Arabidopsis (A-E). DAF [days after flowering] = dias após floração.
[00508] Avaliação dos parãmetros relacionados aos componentes de produção e vigor - Oito dos nove ecotipos de Arabidopsis foram utilizados em cada um dos 5 blocos repetitivos (nomeados A, B, C, D e E), cada um contendo 20 plantas por lote. As plantas foram cultivadas em uma estufa em condições controladas em 220C e fertilizante N:P:K (20:20:20; proporções em peso) [nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)] foi adicionado. Durante esse tempo, os dados foram coletados, documentados e analisados. Dados adicionais foram coletados através do estágio de semeadura das plantas cultivadas em uma cultura de tecido em placas de ágar transparente de cultivo vertical. A maioria dos parâmetros escolhidos foi analisada pela formação de imagem digital.
[00509] Imagem Digital em Cultura de Tecido - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório foi utilizado para capturar imagens de brotos cortados em placas de ágar quadradas. O sistema de aquisição de imagem consiste em uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (lâmpadas de 4x150 Watts) e localizada em uma sala escura.
[00510] Imagem Digital em Estufa - O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias, começando no dia 7 até o dia 30. A mesma câmera anexada a uma lente de 24 mm de comprimento focal (Canon série EF), colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar as imagens de plantas cortadas maiores em banheiras brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As banheiras brancas eram de forma quadrada com medições de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, as banheiras foram colocadas no pé da montagem de ferro, evitando a luz solar direta e fundição de sombras. Esse processo foi repetido a cada 3 a 4 dias por até 30 dias.
[00511] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P43.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, Java com base no programa de processamento de imagem, que foi desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e está livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 6 Mega Pixels (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia I Joint Photographic Experts Group) de baixa compressão. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00512] Análise da folha -Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3 a 4 plantas representativas foram escolhidas de cada lote dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e foi introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tirada e os vários parâmetros (tais como área total da folha, comprimento laminar, etc.) foram calculados a partir das imagens. A circularidade da lâmina foi calculada como largura laminar dividida pelo comprimento laminar.
[00513] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecotipos foram cultivados em placas de ágar transparentes. As placas foram fotografadas a cada 3 dias, começando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento das raízes foi documentado (vide exemplos nas Figs. 3A-F). A taxa de crescimento das raízes foi calculada de acordo com a Fórmula XI. Fórmula XI: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do curso do tempo.
[00514] Análise da taxa de crescimento vegetativo - foi calculada de acordo com as Fórmulas V-X acima. A análise foi finalizada com a aparência de plantas sobrepostas.
[00515] Para comparação entre ecótipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando o estágio de desenvolvimento da planta conforme representado pelo número de folhas verdadeiras. Nos casos onde as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e no dia 13), apenas a maior amostra foi escolhida e adicionada à comparação de Anova.
[00516] Análise de sementes em síliquas - No dia 70, 15 a 17 síliquas foram coletados a partir de cada lote nos blocos D e E. Os síliquas escolhidos eram de cor marrom clara, mas ainda intacta. Os síliquas foram abertos na sala de fotografia e as sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro, uma Fig. digital de alta resolução foi tirada para cada lote. Utilizando as imagens, o número de sementes por siliqua foi determinado.
[00517] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes dos lotes dos blocos A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 grama foi medido para cada amostra, as sementes foram espalhadas em uma bandeja d vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00518] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento, todas as sementes dos lotes dos blocos A-C foram coletadas. As sementes de Columbia de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-Hexano (Cat N° 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como o solvente. A extração foi realizada por 30 horas em calor médio de 50 °C. Uma vez que a extração tenha finalizado, o nHexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35 UC e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizada para criar uma curva de calibração para a RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando a RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra- Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.
[00519] Análise de comprimento de siliqua - No dia 50 desde a semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostrados no bloco A. Os síliquas escolhidos eram da cor verde-amarelo e foram coletados a partir de partes inferiores de um caule da planta cultivada. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento do síliqua.
[00520] Peso seco e produção de semente - No dia 80 desde a semeadura, as plantas dos blocos A-C foram colhidas e deixadas secar a 30 UC em uma câmara de secagem. O peso da biomassa e semente de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da parte vegetativa acima da terra (excluindo raízes) após secar a 30 UC em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (g).
[00521] Produção de óleo - A produção de óleo foi calculada utilizando a Fórmula XII. Fórmula XII: Produção de óleo de semente = Produção de semente por planta (gr.) * % de Óleo na semente.
[00522] Índice de colheita (semente) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV (descrita acima). Resultados Experimentais
[00523] Nove diferentes ecótipos de Arabidopsis foram cultivados e caracterizados por 18 parâmetros (nomeados como vetores). A Tabela 7 descreve os parâmetros correlacionados de Arabidopsis. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 8-9) e uma análise de correlação subsequente foi realizada. Os resultados foram, então, integrados ao banco de dados. Tabela 7 Parâmetros correlacionados à Arabidopsis (vetores)
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Tabela 7. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Arabidopsis (ID de Correlação N° 1-18). Abreviações: Cm = centímetro(s); g = grama(s); mg = miligrama(s).
[00524] Os valores caracterizados são resumidos nas Tabelas 8 e 9 abaixo. Tabela 8 Parâmetros medidos em ecótipos de Arabidopsis
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[00525] Tabela 8. São fornecidos os valores para cada um dos parâmetros medidos nos ecotipos de Arabidopsis: 15 = produção de semente por planta (g); 16 = produção de óleo por planta (mg); 12 =% de óleo por semente; 11 = peso de 1000 sementes (g); 5 = matéria seca por planta (g); 17 = índice de colheita; 10 = área total da folha por planta (cm); 13 = sementes por síliqua; 14 = comprimento do síliqua (cm). Tabela 9 Parâmetros adicionais medidos em ecótibos de Arabidoosis
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[00526] Tabela 9: São fornecidos os valores para cada um dos parâmetros medidos nos ecotipos de Arabidopsis: 6 = Taxa de crescimento vegetal (cm2/dia) até 8 folhas genuínas; 3 = crescimento relativo da raiz (cm/dia) (dia 13); 2 = Comprimento da raiz no dia 7 (cm); 1 = Comprimento da raiz no dia 13 (cm); 4 = peso fresco por planta (g) no estágio de fixação; 9. = comprimento da lâmina (cm); 8 = Largura da lâmina (cm); 18 = Comprimento/largura da folha; 7= Circularidade da lâmina. EXEMPLO 5 DESENVOLVIMENTO DA FIBRA DA PLANTA NA PRODUÇÃO DE ALGODÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ALGODÃO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTíDEO DE ALGODÃO
[00527] A fim de produzir uma análise de correlação de expressão de gene de alta produtividade, os presentes inventores utilizaram o microarranjo de oligonucleotídeo de algodão projetado e produzido por "Comparative Evolutionary Genomics of Cotton [Genômica Evolutiva Comparativa do Algodão]" [http://cottonevolution (ponto) info/). Esse Microarranjo de Oligonucleotídeo de Algodão é composto de 12,006 oligonucleotídeos de Tecnologias Integradas de DNA (IDT Integrated DNA Technologies) derivados de um conjunto de mais de 180,000 Gossypium ESTs sequenciados a partir de 30 bibliotecas de cDNA. Para detalhes adicionais, vide PCT/IL2005/000627 e PCT/IL2007/001590, os quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência. Tabela 10
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[00528] Tabela 10. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de algodão. "5d" = 5 dias após antese; "10d" = 10 dias após antese; "15d" = 15 dias após antese. "DPA [days-post-anthesis]" = dias após antese.
[00529] A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e o comprimento da fibra, fibras de 8 linhas de algodão diferentes foram analisadas. Essas fibras foram selecionadas apresentando uma qualidade de fibra muito boa e alto índice de filaça (tipos de Pima, originados a partir de outras espécies de algodão, nomeada G. barbadense), níveis diferentes de qualidade e índice de filaça a partir de várias linhas de G. hirsutum: boa qualidade e alto índice de filaça (tipo Acala), e baixa qualidade e baixo índice de filaça (tipo Tamcot, e variedades antigas). Um resumo do comprimento da fibra das diferentes linhas é fornecido na Tabela 11 abaixo. Procedimentos Experimentais
[00530] Extração de RNA -Estágios de desenvolvimento da fibra, representando diferentes características da fibra, em 5, 10 e 15 DPA, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima.
[00531] Avaliação do comprimento da fibra - O comprimento da fibra das linhas de algodão foi medido utilizando a fibrografia. O sistema de fibrografia foi utilizado para calcular o comprimento em termos de comprimento "Médio da Metade Superior". A média da metade superior (UHMtupper half mean) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição de fibra. A fibrografia mede o comprimento em comprimentos do vão em um dado ponto porcentual em www (ponto) cottoninc (ponto) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length]. Resultados Experimentais
[00532] Oito linhas diferentes de algodão foram cultivadas e seus comprimentos de fibra foram medidos. Os valores de UHM das fibras estão resumidos na Tabela 11 abaixo. O R ao quadrado foi calculado para cada um dos genes. Tabela 11 Resumo do comprimento da fibra das 8 diferentes linhas de algodão.
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[00533] Tabela 11: São apresentadas as médias e desvios padrões (STD) de 8 linhas diferentes de algodão. EXEMPLO 6 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARROZ UTILIZANDO UM MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE ARROZ 44K
[00534] Para produzir uma análise de expressão diferencial das plantas de arroz sujeitas às condições limitantes de nitrogênio comparada às condições normais (não limitantes) de nitrogênio, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Arroz, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo da matriz representa cerca de 44,000 genes e transcrições de arroz. Procedimentos Experimentais
[00535] Avaliação das plantas de arroz cultivadas em diferentes níveis de fertilização de nitrogênio - Cinco acessos de arroz foram cultivados em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 10 plantas, em uma estufa com rede em condições semi-hidropônicas. Em poucas palavras, o protocolo de cultivo foi o seguinte: As sementes do arroz foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculite e turfa em uma proporção de 1:1. As condições limitantes de nitrogênio constantes foram alcançadas irrigando as plantas com uma solução contendo nitrogênio inorgânico a 0,8mM na forma de KNO3, suplementado com KH2PO4 a 1mM, MgSO4 a 1mM, K2SO4 a 3,6 mM e microelementos, enquanto níveis normais de nitrogênio foram alcançadas aplicando uma solução de nitrogênio inorgânico a 8mM também na forma de KNO3, com KH2PO4 a 1mM, MgSO4 a 1mM e microelementos.
[00536] Tecidos do arroz analisados - Todas as 5 variedades de arroz selecionados foram agrupadas em 1 lote por cada tratamento. Dois tecidos [folhas e raízes] crescendo em dois níveis diferentes de fertilização de nitrogênio, 0,8 mM de Nitrogênio (condições limitantes de nitrogênio) ou 8 mM de Nitrogênio (condições normais de nitrogênio) foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme resumido na Tabela 12 abaixo. Tabela 12 Conjuntos de expressão de transcriptoma de arroz.
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Tabela 12. EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 44K
[00537] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de empressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de cevada, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 47.500 genes e transcrições de cevada. Para definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, várias características de plantas de 25 diferentes acessos de cevada foram analisados. Dentre elas, 13 acessos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) htmll. Procedimentos Experimentais
[00538] Tecidos de cevada analisados - Cinco tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento [meristema, flor, espigueta, caule e folha] que representam diferentes características da planta foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 13 abaixo. Tabela 13 Conjuntos de expressão de transcriptoma de cevada
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Tabela 13.
[00539] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 25 acessos de cevada em 4 blocos repetitivos (chamados A, B, C e D), cada um contendo 4 plantas por lote foram cultivados em estufa com rede. As plantas foram fenotipadas em uma base diária, seguindo o descritor padrão de cevada (Tabela 14, abaixo). A colheita foi conduzida enquanto 50% das espigas foram secados para evitar liberação espontânea das sementes. As plantas foram separadas para a parte vegetativa e espigas, delas, 5 espigas foram debulhadas (grãos foram separados das glumas) para análise adicional de grão tal como medição do tamanho, contagem do grão por espigão e produção de grão por espigão. Todo o material foi secado no forno e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características de semente (peso e tamanho) utilizando varredura e análise da imagem. O sistema de análise de imagem incluiu um computador pessoal (processador Intel P43.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, os dados analisados foram salvos como arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS). Tabela 14 Descritores padrões da cevada
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Tabela 14.
[00540] Grãos por espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. O número total de grãos das 5 espigas que foram manualmente debulhadas foi contado. O grão médio por espiga foi calculado dividindo o número total do grão pelo número de espigas.
[00541] Tamanho médio do grão (cm) - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Os grãos totais de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram digitalizados e as imagens foram analisadas utilizando o sistema de formação de imagem digital. A digitalização do grão foi feita utilizando o digitalizador Brother (modelo DCP-135), na resolução de 200 dpi e analisada com o software Imagem J. O tamanho médio do grão foi calculado dividindo o tamanho total do grão pelo número total do grão.
[00542] Peso médio do grão (mg) - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Os grãos totais das 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram contados e pesados. O peso médio foi calculado dividindo o peso total pelo número total do grão.
[00543] Produção de grão por espiga (g) - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. Os grãos totais de 5 espigas que foram manualmente debulhadas foram pesados. A produção de grão foi calculada dividindo o peso total pelo número da espiga.
[00544] Análise do comprimento da espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. As cinco espigas escolhidas por planta foram medidas utilizando fita métrica excluindo as arestas.
[00545] Análise do número de espigas - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletadas. As espigas por planta foram contadas.
[00546] Pontuação do hábito de cultivo - No estágio de cultivo 10 (inicialização), cada uma das plantas foi pontuada para sua natureza de hábito de cultivo. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.
[00547] Pilosidade de folhas basais - No estágio de cultivo 5 (revestimento da folha fortemente ereta; fim de perfilhamento), cada um das plantas foi pontuada para sua natureza de pilosidade da folha antes da última. A escala que foi utilizada foi 1 para natureza prostrada até 9 para ereta.
[00548] Altura da planta - No estágio da colheita (50% das espigas foram secados), cada um das plantas foi medida por sua altura utilizando fita métrica. A altura foi medida do nível do solo para o topo da espiga mais longa excluindo as arestas.
[00549] Dias para floração -Cada uma das plantas foi monitorada para data de floração. Dias de floração foram calculados a partir da data da semeadura até a data da floração.
[00550] Pigmentação do caule - No estágio de cultivo 10 (inicialização), cada uma das plantas foi pontuada por sua cor do caule. A escala que foi utilizada foi 1 para verde até 5 para roxo total.
[00551] Peso seco vegetal e produção de espiga - No final do experimento (50% das espigas foram secados), todas as espigas e material vegetativo dos lotes dentro dos blocos A-D foram coletados. O peso da biomassa e espigas de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de plantas.
[00552] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (excluindo raízes) após secar a 70 DC no forno por 48 horas; Produção de espiga por planta = peso total da espiga por planta (g) após secar a 30UC no forno por 48 horas.
[00553] Índice de colheita (para cevada) - o índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XIII.
[00554] Fórmula XIII: Índice de colheita = peso seco médio da espiga por planta/(peso seco médio vegetal por planta + peso seco médio da espiga por planta). Tabela 15 Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores)
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Tabela 15. Resultados Experimentais
[00555] 13 diferentes acessos de cevada foram cultivados e caracterizados por 13 parâmetros, conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 16 e 17 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de expressão de transcriptoma (Tabela 13) e os parâmetros médios foi conduzida. Em seguida, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 16 Parâmetros medidos de ID' s de correlação em acessos de cevada
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[00556] Tabela 16. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de cevada, de acordo com as identificações de correlação (ID's de Correlação) a seguir: 6 = Espigas por planta; 10 = Dias para floração; 3 = Peso dos grãos; 5 = Comprimento da espiga; 2 = Tamanho dos grãos; 1 = Grãos por espiga; 7 = Hábito de cultivo. Tabela 17 Acessos de cevada, parâmetros medidos adicionais (linhas 713)
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[00557] Tabela 17. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros medidos em acessos de cevada, de acordo com as identificações de correlação (ID's de Correlação) a seguir: 8 = Pilosidade de folhas basais; 9 = Altura da planta; 4 = Produção de grãos por espiga; 11 = Pigmentação do caule; 12 = Peso seco vegetal; 13 = Indice de colheita. EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE CEVADA E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE CEVADA 60K
[00558] Para produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de Cevada, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 60.000 genes e transcrições de Cevada. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA e os parâmetros relacionados à produção ou vigor, várias características de planta de 15 diferentes acessos de Cevada foram analisadas. Dentre elas, 10 acessos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisando utilizando o teste de correlação Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html]. Procedimentos Experimentais
[00559] Tecidos de cevada analisados - Quatro tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [folha, meristema, ponta da raiz e raiz adventícia], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme resumido na Tabela 18 abaixo. Tabela 18 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada
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[00560] Tabela 18. São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de Cevada.
[00561] Avaliação dos parâmetros relacionados aos componentes de produção e vigor de Cevada - 15 acessos de Cevada em 5 lotes repetitivos, cada um contendo 5 plantas por lote, foram cultivadas na estufa de rede. Três tratamentos diferentes foram aplicados: as plantas foram fertilizadas e regadas regularmente durante o crescimento da planta até a colheita (conforme recomendado para o crescimento comercial, as plantas foram irrigadas de 2 a 3 vezes por semana, e a fertilização foi dada nos primeiros 1,5 meses do período de crescimento) ou com baixo Nitrogênio (80% por cento menos Nitrogênio) ou sob estresse devido à seca (ciclos de seca e re-irrigação foram conduzidos ao longo de todo o experimento, total de 40% menos de água dadas no tratamento a seco). As plantas foram fenotipadas diariamente de acordo com parâmetros listados na Tabela 19 abaixo. A colheita foi realizada enquanto todas as espigas eram secas. Todo o material foi seco em estufa e as sementes foram debulhadas manualmente a partir das espigas antes da medição das características da semente (peso e tamanho) utilizando varredura e análise de imagem. O sistema de análise de imagem inclui um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Java com base no programa de processamento de imagem, que foi desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde Dos Estados Unidos e livremente disponível na internet [Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00562] Produção de Grão (gr.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes foram coletadas. O total de grãos a partir de todas as espigas que foram debulhadas manualmente foi pesado. A produção de grão foi calculada por lote ou por planta.
[00563] Análise do comprimento e largura da espiga - No final do experimento, o comprimento e largura das cinco espigas escolhidas por planta foram medida utilizando fita métrica, excluindo as aristas.
[00564] Análise do número de espigas - As espigas por planta foram contadas.
[00565] Altura da planta -Cada uma das plantas foi medida quando a sua altura, utilizando fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo mais distante da espiga excluindo as aristas em dois pontos de tempo no crescimento Vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita.
[00566] Peso da espiga - O peso da biomassa e espigas de cada unidade foi separado, medido e divido pelo número de plantas.
[00567] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 70Q0 na estufa por 48 horas em dois pontos de tempo no crescimento Vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita.
[00568] Espigueta por espiga = número de espiguetas por espiga foi contado.
[00569] Proporção Raiz/Broto - A proporção Raiz/Broto é calculada utilizando a Fórmula XIV. Fórmula XIV: Proporção Raiz/Broto = peso total da raiz na colheita/peso total da parte vegetal acima do solo na colheita. N° Total de Perfilhos - todos os perfilhos foram contados por unidade em dois pontos de tempo no crescimento Vegetal (30 dias após semeadura) e na colheita.
[00570] Porcentagem de perfilhos reprodutivos - o número de perfilhos reprodutivos excluindo uma espiga na colheita foi divido pelo número total de perfilhes.
[00571] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote.
[00572] FW da raiz (gr.), comprimento da raiz (cm) e N° de raízes laterais - 3 plantas por unidade foram selecionadas para medição do peso da raiz, comprimento da raiz e para contagem do número de raízes laterais formadas.
[00573] FW do Broto (peso fresco) - peso de 3 plantas por vaso foi registrado em diferentes pontos de tempo.
[00574] Área Média de Grão (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00575] Comprimento e Largura Média do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento e largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00576] Perímetro Médio do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00577] Data de descrição - o dia no qual o estágio de inicialização foi observado foi registrado e o número de dias a partir da semeadura até a descrição foi calculado.
[00578] Teor relativo de água - o peso fresco (FW 1 fresh weight) de três folhas de três plantas de cada um dos diferentes ID's das sementes foi registrado de imediato; em seguida, as folhas foram embebidas por 8horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro e o peso túrgido (TWlturgid weight) foi registrado. O peso seco total (DWIdry weight) foi registrado após secagem das folhas a 60°C a um peso constante. O teor relativo da água (RWCIrelative water content) foi calculado de acordo com a Fórmula I acima.
[00579] Índice de Colheita (para cevada) - O índice de colheita é calculado utilizando a Fórmula XIII acima.
[00580] Taxa de crescimento relativo: as taxas de crescimento relativo (RGR 1 relative growth rate) da Altura da Planta (Fórmula XV abaixo), SPAD (Fórmula XVI) e número de perfilhes (Fórmula XVII) foram calculadas conforme segue: Fórmula XV: Taxa de crescimento relativo da altura da planta = coeficiente de regressão da altura da planta ao longo do tempo. Fórmula XVI: Taxa de crescimento relativo de SPAD = coeficiente de regressão das medidas de SPAD ao longo do tempo. Fórmula XVII: Taxa de crescimento relativo do Número de perfilhos - coeficiente de regressão do Número de perfilhos ao longo do tempo.
[00581] Proporção de Seco/Normal: Representa a proporção para o parâmetro específico dos resultados de condição Seca divididos pelos resultados das condições Normais (manutenção de fenótipo em seco em comparação às condições normais). Tabela 19 Parâmetros correlacionados à Cevada (vetores)
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[00582] Tabela 19. São fornecidos os parâmetros correlacionados à Cevada. "TP [time point]" = ponto de tempo; "DW" = peso seco; "FW" = peso fresco; "Baixo N" = Baixo Nitrogênio; "Teor relativo de água [por cento] Proporção de Seca/Normal" - manutenção de fenótipo sob condições de seca em comparação às condições normais.
Resultados experimentais
[00583] 15 acessos diferentes de Cevada foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros, conforme descrito acima. A Tabela 19 descreve os parâmetros correlacionados à Cevada. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 20 a 29 abaixo. A análise de correlação subsequente entre os vários conjuntos de transcriptoma e os parâmetros médios foi conduzida. A seguir, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 20 Parâmetros medidos dos ID's de correlação em acessos de Cevada sob condições de Seca
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[00584] Tabela 20. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) de cultivo sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 21 Parãmetros medidos dos ID's de correlação nos acessos de Cevada adicionais sob condições de Seca
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[00585] Tabela 21. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) de cultivo sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 22 Parâmetros adicionais medidos dos ID's de correlação nos acessos de Cevada sob condições de Seca
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[00586] Tabela 22. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) de cultivo sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 23 Parâmetros adicionais medidos dos ID's de correlação nos acessos adicionais de Cevada sob condições de Seca
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[00587] Tabela 23. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) de cultivo sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 24 Parâmetros medidos dos ID's de correlação nos acessos de Cevada sob condicões normais
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[00588] Tabela 24. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 25 Parâmetros medidos dos ID's de correlação nos acessos adicionais de Cevada sob condições normais
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[00589] Tabela 25. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 26 Parâmetros adicionais medidos dos ID's de correlação nos acessos de Cevada sob condições normais
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[00590] Tabela 26. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 27 Parâmetros medidos dos ID's de correlação nos acessos adicionais de Cevada sob condições de Baixo N.
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[00591] Tabela 27. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 28 Parâmetros medidos dos ID's de correlação nos acessos adicionais de Cevada sob condições de Baixo N.
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[00592] Tabela 28. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 29 Parâmetros adicionais medidos dos ID's de correlação nos acessos de Cevada sob condições de Baixo N.
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[00593] Tabela 29. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos nos acessos de Cevada (linha) sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO, NUE E ABST MEDIDOS EM CAMPOS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K
[00594] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo de planta e o nível de expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de sorgo, produzida pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de sorgo. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção, ABST e NUE, várias características de planta de 17 diferentes híbridos de sorgo foram analisadas. Dentre elas, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação de Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00595] Correlação de variedades de Sorgo através de ecotipos cultivados sob condições regulares de cultivo, graves condições de seca e condições de baixo nitrogênio. Procedimentos Experimentais
[00596] 17 variedades de Sorgo foram cultivadas em 3 lotes repetitivos, em campo. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi o seguinte: 1. Condições regulares de cultivo: as plantas de sorgo foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (370 litros por m2, fertilização de 14 unidades de 21% de ureia por período de cultivo inteiro).
[00597] 2. Condições de Seca: sementes de sorgo foram semeadas no solo e cultivadas em condição normal até cerca de 35 dias a partir da semeadura, por volta do estágio V8 (oito folhas verdes são totalmente expandidas, inicialização não iniciada ainda). Nesse ponto, a irrigação foi interrompida, e estresse de seca severa foi desenvolvido.
[00598] 3. Condições de fertilização de baixo nitrogênio: as plantas de sorgo foram fertilizadas com 50% menos quantidade de nitrogênio no campo do que a quantidade de nitrogênio aplicada no tratamento de cultivo regular. Todos os fertilizantes foram aplicados antes da floração.
[00599] Tecidos de Sorgo analisados - todos os 10 híbridos de sorgo selecionados foram amostrados para cada tratamento. Os tecidos [folha, meristema da flor e flor] das plantas cultivados sob condições normais, grave estresse de seca e condições de baixo nitrogênio foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 30 abaixo. Tabela 30 Conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo em experimentos de campo
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[00600] Tabela 30: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de sorgo. Folha = a folha abaixo da flor; Meristema de flor = meristema apical seguindo iniciação da panícula; Flor = a flor no dia da antese.
[00601] Os parãmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área Média do Grão (cm2) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00602] Comprimento Médio do Grão (cm) - No final do período de cultivo, os grãos foram separados da 'Cabeça' da Planta. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma dos comprimentos dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00603] Área Média da Cabeça (cm2) - No final do período de cultivo, 5 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da 'cabeça' foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de 'Cabeças'.
[00604] Comprimento Médio da Cabeça (cm) - No final do período de cultivo, 5 'Cabeças' foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento da 'Cabeça' (eixo mais longo) foi medido a partir daquelas imagens e foi dividido pelo número de 'cabeças'.
[00605] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, software de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard 1 padrão do Grupo Conjunto de Especialistas em Fotografia) de baixa compressão. Em seguida, os dados de saída de processamento de imagem para área de semente e comprimento de semente foram salvos para arquivos de texto e analisados utilizando o software JMP de análise estatística (Instituto SAS).
[00606] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 5 plantas por lote ou pela medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00607] Peso Total da Semente por Cabeça (g) - No final do experimento ('Cabeças' da planta), as cabeças dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 5 cabeças foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as cabeças adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por cabeça foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de cabeças por lote (com base no lote). No caso das 5 cabeças, o peso total dos grãos de 5 cabeças foi dividido por 5.
[00608] Cabeça FW por grama da Planta - No final do experimento (quando as cabeças foram colhidas), o total de cabeças e 5 cabeças selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As cabeças (total e 5) foram pesadas (gr.) separadamente e o peso fresco médio por planta foi calculado para o total de cabeças (Cabeça FW /Planta gr. com base no lote) e para 5 cabeças (Cabeça FW /Planta gr. com base em 5 plantas).
[00609] Altura da Planta - As plantas foram caracterizadas com relação à altura durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação à sua altura utilizando uma fita de medição. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da folha mais longa.
[00610] Número de folhas da planta - As plantas foram caracterizadas com relação ao número de folhas durante o período de cultivo em 5 pontos no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas com relação ao seu número de folhas contando todas as folhas de 03 plantas selecionadas por lote.
[00611] Taxa de Crescimento Relativo - foi calculada utilizando as Fórmulas XV (acima) e VI (acima).
[00612] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram feitas por lote.
[00613] Peso fresco vegetal e Cabeças - No final do experimento (quando a inflorescências estava seca), toda a inflorescência e material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. O peso da biomassa e cabeças de cada lote foi separado, medido e dividido pelo número de cabeças.
[00614] Peso fresco = peso total da porção vegetal acima do solo (excluindo as raízes) após secagem a 70 'C em forno por 48 horas.
[00615] Índice de Colheita (HI) (Sorgo) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmulas XVIII. Fórmulas XVIII: Índice de colheita = peso seco médio do grão por Cabeça / (peso seco médio vegetal por Cabeça + peso seco médio da Cabeça).
[00616] Cabeças FW / (Cabeças FW + Plantas FW) - O peso fresco total das cabeças e suas respectivas biomassas de planta foram medidos no dia da colheita. O peso das cabeças foi dividido pela soma dos pesos das cabeças e plantas. Resultados Experimentais
[00617] 17 diferentes híbridos de sorgo foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros (Tabela 31). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 32-36) e uma análise de correlação subsequente foi conduzida. Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 31 Parâmetros correlacionados ao Soro() (vetores)
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[00618] Tabela 31. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores). "g" = gramas; "SPAD" = níveis de clorofila; "FW" = Peso fresco da Planta; "DW" = Peso seco da Planta; "normal" = condições de cultivo padrão; "DPS" = dias após a semeadura; "Baixo N" = Baixo Nitrogênio. Cabeça - FW /Planta g. (com base em 5 plantas) = o peso fresco das cabeças colhidas foi divido pelo número de cabeças que foram fenotipadas; "Baixo N" = condições de baixo nitrogênio; "Área Média do Grão de Taxa Inferior" = área do grão da fração inferior dos grãos. Tabela 32 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob condições normais
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parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 33 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo sob condições normais de cultivo
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[00619] Tabela 33: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 34 Parâmetros medidos em acessos de Sorgo sob condições de baixo nitrogênio
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[00620] Tabela 34: São tornecictos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 35 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Sorgo sob condições de cultivo de baixo nitrogênio
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[00621] Tabela 35: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 36 Parâmetros medidns em acessos de Sorno snh condições de seca
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[00622] Tabela 36: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE SORGO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À BIOMASSA, NUE E ABST MEDIDOS SOB CONDIÇÕES SEMI-HIDROPÔNICAS UTILIZANDO MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE SORGO 44K.
[00623] Parâmetros relacionados ao vigor do Sorgo sob condições de baixo nitrogênio, 100 mM NaC1, baixa temperatura (10 ± 2° C) e condições normais de cultivo - Dez híbridos de Sorgo foram cultivados em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa de rede sob condições semihidropônicas. Em suma, o protocolo de cultivo deu-se conforme segue: as sementes de Sorgo foram semeadas em tabuleiros cheios com uma mistura de vermiculite e turfa na proporção de 1:1. Após a germinação, os tabuleiros foram transferidos para a solução de alta salinidade (100 rnM NaC1, além da solução Completa de Hogland), em baixa temperatura (10 2°C, na presença da solução Completa de Hogland), solução de baixo nitrogênio (a quantia de nitrogênio total foi reduzida em 90% a partir da solução Completa de Hogland (ou seja, a uma concentração final de 10% a partir da solução Completa de Hogland, quantia final de 1,2 mM N) ou em solução de cultivo Normal [solução Completa de Hogland contendo 16 mM N, a 28 ± 2 °C]. As plantas foram cultivadas a 28 2 °C.
[00624] A solução Completa de Hogland consiste de: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 - 0,12 gramas/litro, KH2PO4 0,172 gramas/litro e 0,01% (volume/volume) dos microelementos de "Super coratina" (Ferro-EDDHA [etilenodiamina-N,N'-bis(ácido 2- hidroxifenilacético)] - 40,5 gramas/litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro, e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deverá ser 6,5-6,8].
[00625] Tecidos de Sorgo analisados - Todos os 10 híbridos de Sorgo selecionados foram amostrados para cada tratamento. Três tecidos [folhas, meristemas e raízes] cultivados em 100 mM NaC1, em baixa temperatura (10 2°C), baixo nitrogênio (1,2 mM N) ou sob condições Normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 37 abaixo. Tabela 37 Conjuntos de expressão de transcriptoma de Sorgo sob condições semi- hidropônicas
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[00626] Tabela 37: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma do Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2 °C; NaCl = 100 mM NaCl; baixo nitrogênio 1,2 mM de Nitrogênio; condições Normais = 16 mM de Nitrogênio. Resultados Experimentais
[00627] 10 diferentes híbridos de Sorgo foram cultivados e caracterizados pelos seguintes parâmetros: "Número de folhas" = número de folhas por planta (média de cinco plantas), "Altura da Planta" = altura da planta [cm] (média de cinco plantas), "Raiz DW/Planta" - peso seco da raiz por planta (média de cinco plantas); "Broto DW/Planta" - peso seco do broto por planta (média de cinco plantas) (Tabela 38); A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 39-42 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi conduzida. Os resultados foram, então, integrados à base de dados. Tabela 38 Parâmetros correlacionados ao Sorgo (vetores)
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[00628] Tabela 38: São fornecidos os parâmetros correlacionados ao Sorgo. Condições de frio = 10 ± 2 °C; NaC1 = 100 mM NaCl; baixo nitrogênio = 1,2 mM de Nitrogênio; condições Normais = 16 mM de Nitrogênio; * TP-1-2-3 refere-se aos períodos de tempos 1, 2 e 3. Tabela 39 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de cultivo de baixo nitrogênio
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[00629] Tabela 39: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 40 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de salinidade (100 mM NaC1)
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[00630] Tabela 40: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições de cultivo 100 mM NaCl. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 41 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de frio
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[00631] Tabela 41: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob cultivo sob condições de frio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 42 Acessos de Sorgo, parâmetros medidos sob condições de cultivo regular
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[00632] Tabela 42: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) sob condições de cultivo regular. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 11 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO E NUE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 60K
[00633] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade, comparando o fenátipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de milho, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de milho.
[00634] Correlação de híbridos de milho através de ecotipos cultivados sob condições de cultivo regulares. Procedimentos Experimentais.
[00635] 12 híbridos de milho foram cultivados em 3 lotes repetidos, em campo. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação [485 m3 de água por dunam (1000 m2), 30 unidades de uran 21% fertilização por todo o período de crescimento]. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com estresse e os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, os 12 híbridos diferentes de milho foram analisados. Dentre elas, 10 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisando utilizando o teste de correlação Pearson [http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00636] Tecidos de Milho analisados - Todos os 10 híbridos de milho selecionados foram amostrados por 3 períodos de tempo (TP2 = V6-V8, TP5 R1-R2, TP6=R3-R4). Quatro tipos de tecidos de planta [Espiga, folha indicada na Tabela 43 como "folha", parte distal do grão e entrenó] cultivados sob condições normais foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 43 abaixo. Tabela 43 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
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Tabela 43: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho Folha = a folha abaixo da espiga principal; Meristema de flor = meristema apical após iniciação da flor masculina; Espiga = a flor feminina no dia da antese. Grão Distal = milho desenvolvendo grão a partir da área extrema do sabugo, Grão Basal = milho desenvolvendo grãos a partir da área basal do sabugo; Entrenós = entrenós localizados acima e abaixo da espiga principal na planta. TP = período de tempo.
[00637] Os parâmetros a seguir foram coletados utilizando um sistema de imagem digital: Área do Grão (cm2) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00638] Comprimento do Grão e Largura do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento/ou largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00639] Área da Espiga (cm2) - No final do período de crescimento, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00640] Comprimento e Largura da Espiga (cm) - No final do período de crescimento, 5 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento e largura da espiga (eixo mais longo) foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00641] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos para arquivos de textos e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00642] Os parâmetros adicionais foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00643] Peso Normalizado do Grão por planta (gr.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos AC foram coletadas. Seis espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de espigas lote (com base na unidade). No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.
[00644] FW da Espiga (gr.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para total (FW da Espiga por lote) e para 6 (FW da Espiga por planta).
[00645] Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.
[00646] Número de folha por planta - As plantas foram caracterizadas pelo número de folha durante o período de cultivo em 5 vezes no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas por seu número de folha contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.
[00647] Taxa de Crescimento Relativo foi calculada utilizando as Fórmulas V-XI, XV-XVII (descritas acima).
[00648] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram tiradas por lote. Os dados foram tirados após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS).
[00649] Peso Seco por planta - No final do experimento (quando a inflorescência for seca) todo material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado.
[00650] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 70°C em uma câmara de secagem por 48 horas.
[00651] Índice de Colheita (HI) (Milho) - O índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula XIX. Fórmula XIX: Índice de Colheita = Peso seco médio do grão por Espiga / (Peso seco vegetal médio por Espiga + Peso seco médio da Espiga)
[00652] Porcentual Preenchido da Espiga [%] - foi calculado como a porcentagem da área da Espiga com grãos fora da espiga total.
[00653] Diâmetro do sabugo [cm] - O diâmetro do sabugo sem grãos foi medido utilizando uma régua.
[00654] Número de Fileira do Núcleo por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado. Resultados Experimentais
[00655] 12 diferentes híbridos de milho foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros. Os parâmetros correlacionados estão descritos na Tabela 44 abaixo. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 45-46) e uma análise de correção subsequente foi realizada. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 44 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)
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[00656] Tabela 44. SPAD 46DPS e SPAD 54DPS: Nível de Clorofila após 46 e 54 dias após a semeadura (DPS). "FW" = peso fresco; "DW" = peso seco. Tabela 45 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob condições normais
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[00657] Tabela 45. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de milho (ID de Semente) sob condições de cultivo regulares. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 46 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Milho sob condições de cultivo regulares
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[00658] Tabela 46. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob condições de cultivo regulares. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 12 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE COM PARÂMETROS RELACIONADOS À PRODUÇÃO E NUE QUANDO CULTIVADO SOB FERTILIZAÇÃO DE NITROGÊNIO REDUZIDO UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE MILHO 60K
[00659] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre o fenótipo da planta e o nível de expressão do gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotideo de milho, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem. (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotideo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de milho. Correlação de híbridos de milho através de ecótipos cultivados sob condições de baixo nitrogênio. Procedimentos Experimentais
[00660] 12 híbridos de milho foram cultivados em 3 lotes repetidos, em campo. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (485 m3 de água por dunam, 30 unidades de fertilização a 21% de uran por todo o período de cultivo) ou com 50% de fertilização comercial para produzir tratamento de baixo N. Para definir as correlações entre os níveis da expressão de RNA com NUE e os parâmetros relacionados aos componentes de produção ou vigor, os 12 diferentes híbridos de milho foram analisados. Dentre elas, 11 híbridos englobando a variação observada foram selecionados para a análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parãmetros caracterizados foi analisada utilizando o teste de correlação Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00661] Tecidos de Milho analisados - Todos os 10 híbridos de milho selecionados foram amostrados por tratamento (condições de baixo N e normais), em três períodos de tempo (TP2 = V6-V8 (seis a oito folhas são visíveis, fase de crescimento rápido e determinação de fileira do núcleo iniciados), TP5 = R1-R2 (bolha sedosa), TP6 = R3-R4 (massa leitosa). Quatro tipos de tecidos de planta [Espiga, folha indicada na Tabela 47 como folha, parte distal do grão e entrenó] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 47 abaixo. Tabela 47 Conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
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[00662] Tabela 47: São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho Folha = a folha abaixo da espiga principal; Meristema de flor = meristema apical após iniciação da flor masculina; Espiga = a flor feminina no dia da antese. Grão Distal = milho desenvolvendo grãos a partir da área extrema do sabugo, Grão Basal = milho desenvolvendo grãos a partir da área basal do sabugo; Entrenós = entrenós localizados acima e abaixo da espiga principal na planta.
[00663] Os parâmetros a seguir foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00664] Produção de Semente por planta (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. 6 espigas foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de espigas por lote (com base na unidade). No caso das 6 espigas, o peso total dos grãos de 6 espigas foi dividido por 6.
[00665] Peso da Espiga por lote (gr.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas separadamente. As plantas com (total e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e a espiga média por planta foi calculada para Peso da Espiga por lote (total de 42 plantas por lote).
[00666] Altura da planta e altura da espiga - As plantas foram caracterizadas pela altura na colheita. Em cada medição, 6 plantas foram medidas por sua altura utilizando uma fita métrica. A altura foi medida a partir do nível do solo até o topo da planta abaixo do cabelo do milho. A altura da espiga foi medida a partir do nível do solo até o local onde a espiga principal está localizada.
[00667] Número de folha por planta - As plantas foram caracterizadas pelo número de folha durante o período de cultivo em 5 vezes no tempo. Em cada medição, as plantas foram medidas por seu número de folha contando todas as folhas de 3 plantas selecionadas por lote.
[00668] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada 64 dias após a semeadura. As leituras de medição de SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Sete medições por folha foram tiradas por lote. Os dados foram tirados após uma vez por semanas após a semeadura.
[00669] Peso Seco por planta - No final do experimento (quando a inflorescência for seca) todo material vegetal dos lotes dentro dos blocos A-C foi coletado.
[00670] Peso seco = peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raizes) após secagem a 70°C em uma câmara de secagem por 48 horas; Comprimento da Espiga da Espiga Preenchida [cm] - foi calculado como o comprimento da Espiga com grãos fora da espiga total.
[00671] Comprimento e largura da Espiga [cm] - foi calculado como o comprimento e largura da Espiga no preenchido. A medição foi realizada em 6 plantas por cada lote.
[00672] Número de Fileira do Núcleo por Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado.
[00673] Largura do caule [cm] - O diâmetro do caule foi medido no entrenó localizado abaixo da espiga principal. A medição foi realizada em 6 plantas por cada lote.
[00674] Índice de área da folha [LAI I leaf area index] = área total de folha de todas as plantas em um lote. A medição foi realizada utilizando um medidor da área foliar.
[00675] NUE [kg/kg]- é a proporção entre a produção total de grão por N total aplicado no solo.
[00676] NUpE [kg/kg]- é a proporção entre a biomassa de planta total por N total aplicado no solo.
[00677] Produção/largura do caule [kg/cm] - é a proporção entre as produções de grão totais e a largura do caule.
[00678] Produção/LAI [kg] - é a proporção entre as produções de grão totais e o índice da área de folha total. Resultados Experimentais
[00679] 11 híbridos diferentes de milho foram cultivados e caracterizados por diferentes parâmetros. Tabela 48 descreve os parâmetros correlacionados ao Milho. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP (Tabelas 49-50) e uma análise de correção subsequente foi realizada. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 48 Parâmetros correlacionados ao Milho (vetores)
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[00680] Tabela 48. "cm" = centímetros "mm" = milímetros; "kg" = quilogramas; SPAD em R1-R2 e SPAD R3-R4: Nível de clorofila após estágios precoce e tardio de preenchimento de grão; "NUE" = eficiência no uso do nitrogênio; "NUpE" = eficiência na ingestão do nitrogênio; "LAI" = área de folha; "N" = nitrogênio; Baixo N = sob condições de baixo nitrogênio; "Normal" - sob condições normais; "dunam" = 1000 m2. Tabela 49 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob fertilização normal
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[00681] Tabela 49. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob fertilização de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 50 Parâmetros medidos em acessos de Milho sob fertilização de baixo nitrogênio
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[00682] Tabela 50: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Milho (ID de Semente) sob fertilização de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 13 PRODUÇÃO DE MICROARRANJOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE TRANSCRIPTOMA DE MILHO 60K
[00683] Genes sob exibição diferencial associados à Eficiência no Uso do Nitrogênio Agronômico. Dois híbridos comerciais de milho e 2 linhas puras de milho foram cultivadas em 5 lotes repetitivos no campo em seis regimes de fertilização de N diferentes. As sementes de milho foram plantadas e as plantas foram cultivadas no campo utilizando fertilização comercial e protocolos de irrigação (485 m3 de irrigação por dunam, 30 unidades de 21% de uran (fertilização N) por todo o período de cultivo - condições normais de 100% de Nitrogênio). Além disso, o restante dos 5 tratamentos de Nitrogênio incluíram: 140% de Normal, 50%, 30%, 10% e 0%. A fim de definir a associação entre os níveis de expressão de RNA com os Parâmetros relacionados aos componentes de produção, biomassa e NUE, vários índices incluindo NUE Agronômico, 2 híbridos de milho e 1 linha pura de milho foram selecionados para análise de expressão de RNA. Os genes regulados para baixo ou para cima em determinada fertilização de N com parâmetros mais altos de NUE Agronômico ou produção ou biomassa foram considerados como associados ao NUE Agronômico, NUE e produção.
[00684] Tecidos de Milho analisados - No total, 3 milhos foram amostrados em estágio de desenvolvimento V12 (cabelo) e estágio de desenvolvimento R3 (leitoso). Os tecidos da planta [folhas, entrenós inferiores e superiores, flor] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 51 abaixo. Tabela 51 Conjuntos de expressão de transcriotoma de milho
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[00685] Tabela 51 : São fornecidos os conjuntos de expressão de transcriptoma de milho
[00686] Os parâmetros a seguir foram coletados ou por amostragem de 6 plantas por lote ou por medição do parâmetro através de todas as plantas dentro do lote.
[00687] Peso do grão (produção) por planta (Kg.) - No final do experimento, todas as espigas dos lotes foram coletadas. Todas as espigas do lote foram separadamente debulhadas e os grãos foram pesados, todas as espigas adicionais foram debulhadas juntas e também pesadas. O peso médio do grão por espiga foi calculado dividindo o peso total do grão pelo número total de espigas por lote (com base na unidade).
[00688] NUE Agronômico (Eficiência no Uso do Nitrogênio Agronômico) - O coeficiente de NUE Agronômico mede a habilidade da planta de usar eficientemente cada unidade adicional de Nitrogênio adicionada como fertilizante e foi calculado utilizando a fórmula a seguir: Fórmula XX: NUE Agronômico = Produção por planta (Kg.) X Fertilização de Nitrogênio O% Fertilização de Nitrogênio Produção por planta (Kg.) Fertilizante
[00689] Peso da Espiga por planta (gr.) - No final do experimento (quando as espigas foram colhidas) total e 6 espigas selecionadas por lotes dentro dos blocos foram coletadas separadamente. As espigas coletadas (total ou e 6) foram pesadas (gr.) separadamente e divididas pelo número de planta a fim de obter o peso médio da espiga por planta.
[00690] Peso Seco Médio - No final do experimento (quando a inflorescência for seca) todo material vegetal dos lotes foi coletado e as 6 plantas de cada lote foram pesadas.
[00691] Largura do sabugo [cm] - A largura do sabugo sem grãos foi medida utilizando um paquímetro.
[00692] Matéria seca total = peso total da parte vegetal acima da terra (incluindo as espigas, excluindo as raízes).
[00693] Espiga Preenchida/Integral - foi calculado como o comprimento da Espiga com grãos fora do comprimento da espiga total.
[00694] Número de Fileira da Espiga - O número de fileiras em cada espiga foi contado.
[00695] Largura do caule [cm] - O diâmetro do caule foi medido no entrenó localizado abaixo da espiga principal. A medição foi realizada em 6 plantas por cada lote.
[00696] Índice de área da folha [LAI] = área total de folha de todas as plantas em um lote. A medição foi realizada utilizando um medidor da área foliar.
[00697] Peso de 1000 grãos -No final do experimento, todas as sementes de todos os lotes foram coletadas e medidas e o peso de 1000 foi calculado.
[00698] Área do Grão (cm2) -No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área de grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00699] Comprimento do Grão e Largura do Grão (mm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do comprimento /ou largura dos grãos (eixo mais longo) foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00700] Perímetro do Grão (cm) - No final do período de crescimento, os grãos foram separados da espiga. Uma amostra de -200 grãos foi pesada, fotografada e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A soma do perímetro do grão foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de grãos.
[00701] Área da Espiga (cm2) -No final do período de crescimento, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área da espiga foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00702] Área do Grão Preenchido da Espiga (cm2) - No final do período de crescimento, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. A área do grão preenchido da espiga foi área da espiga com grãos fora da área da espiga total e foi medida a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00703] Comprimento, largura e perímetro da Espiga (cm) - No final do período de crescimento, 6 espigas foram fotografadas e as imagens foram processadas utilizando o sistema de processamento de imagem descrito abaixo. O comprimento, largura e perímetro da espiga foram medidos a partir daquelas imagens e foi dividida pelo número de Espigas.
[00704] Um sistema de processamento de imagem foi utilizado, consistindo em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 Ghz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37, programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponível na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888x2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão. Em seguida, dados de saída de processamento de imagem para área da semente e comprimento da semente foram salvos para arquivos de textos e analisados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). EXEMPLO 14 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE TOMATE E ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE ALTA PRODUTIVIDADE UTILIZANDO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE TOMATE 44K
[00705] A fim de produzir uma análise de correlação de alta produtividade entre fenótipos relacionados à NUE e expressão de gene, os presentes inventores utilizaram um microarranjo de oligonucleotídeo de tomate, produzido pela Agilent Technologies [http://www (ponto) chem (ponto) agilent (ponto) com/Scripts/PDS (ponto) asp?1Page=50879]. O oligonucleotídeo do arranjo representa cerca de 44.000 genes e transcrições de tomate. A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA com os parâmetros relacionados ao vigor ou componentes de produção, ABST e NUE, várias características de planta de 18 diferentes variedades de tomate foram analisadas. Dentre elas, 10 variedades englobando a variação observada foram selecionadas para análise de expressão de RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foi analisada utilizando teste de correlação de Pearson [Http://www (ponto) davidmlane (ponto) com/hyperstat/A34739 (ponto) html].
[00706] Correlação de variedades de tomate através de ecótipos cultivados sob condições com baixo Nitrogênio, seca e cultivo regular Procedimentos Experimentais:
[00707] 10 variedades de tomate foram cultivadas em 3 blocos repetitivos, cada um contendo 6 plantas por lote foi cultivado em estufa com rede. Resumidamente, o protocolo de cultivo foi como segue: 1. Condições de cultivo regular: variedades de tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 litros/m2 de água por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção comercial de tomate).
[00708] 2. Condições de fertilização de baixo nitrogênio: variedades de tomate foram cultivadas sob condições normais (4-6 litros/m2 por dia e fertilizadas com NPK como recomendado nos protocolos para produção comercial de tomate) até o estágio de floração. Nesse momento, a fertilização com nitrogênio foi interrompida.
[00709] 3. Estresse por Seca: uma variedade de tomate foi cultivada sob condições normais (4-6 litros/m2 por dia) até o estágio de floração. Nesse momento, a irrigação foi reduzido para 50% comparado às condições normais. As plantas foram fenotipadas em uma base diária seguindo o descritor padrão de tomate (Tabela 53). A colheita foi conduzida enquanto 50% dos frutos estavam vermelhos (maduros). As plantas foram separadas para a parte vegetativo e frutos, deles, 2 nós foram analisados para parâmetros adicionais de inflorescencência tais como tamanho, número de flores, e preso de inflorescência. O peso fresco de todo material vegetativo foi medido. Os frutos foram separados por cor (vermelho vs. verde) e de acordo com o tamanho do fruto (pequeno, médio e grande). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS). Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 53 abaixo.
[00710] Tecidos de Tomate analisados - Dois tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento [flor e folha], representando diferentes características da planta, foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Para conveniência, cada tipo de tecido da informação da expressão da microarranjo recebeu um ID de Conjunto, conforme resumido na Tabela 52 abaixo. Tabela 52 Conjuntos de expressão de transcriptoma de tomate
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[00711] Tabela 52: São fornecidos os números de identificação (ID) de cada um dos conjuntos de expressão do tomate.
[00712] A Tabela 53 fornece os parâmetros correlacionados do tomate (Vetores). A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores foram resumidos nas Tabelas 5459 abaixo. Uma análise de correlação subsequente foi conduzida. Os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 53 Parâmetros correlacionados ao Tomate (vetores)
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[00713] Tabela 53. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao tomate. "gr." = gramas; "FW" = peso fresco; "NUE" = eficiência no uso do nitrogênio; "RWC" = teor relativo de água; "NUpE" = eficiência na ingestão do nitrogênio; "SPAD" = níveis de clorofila; "HI" = índice de colheita (peso vegetal dividido sobre a produção); "SLA" = área de folha específica (área de folha dividida pelo peso seco da folha).
[00714] Produção do Fruto (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todos os frutos dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletados. Os frutos totais foram contados e pesados. O peso médio dos frutos foi calculado dividindo o peso total do fruto pelo número de frutos.
[00715] Produção/SLA e Produção/área total da folha - A produção de fruto dividida pela área específica da folha ou a área total da folha forneceu a medida de um equilíbrio produtivo e processo vegetal.
[00716] Peso fresco da planta (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelhos)], todas as plantas dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. O peso fresco foi medido (gramas).
[00717] Peso de inflorescência (gramas) - No final do experimento [quando 50% dos frutos estavam maduros (vermelho)], duas inflorescências dos lotes dentro dos blocos A-C foram coletadas. O peso da inflorescência (g) e número de flores por inflorescência foram contados.
[00718] SPAD - O teor de clorofila foi determinado utilizando um medidor de clorofila Minolta SPAD 502 e a medição foi realizada no momento da floração. As leituras do medidor SPAD foram feitas em folha nova totalmente desenvolvida. Três medições por folha foram por lote.
[00719] Eficácia na utilização cia agua (WUE) - pode ser terminada como a biomassa produzida por transpiração da unidade. Para analisar a WUE, o teor de água relativo à folha foi medido em plantas de controle e transgênicas. O peso fresco (FW) foi imediatamente gravado; então as folhas foram encharcadas por 8 horas em água destilada à temperatura ambiente no escuro, e o peso inchado (TW) foi gravado. O peso seco total (DW) foi gravado após secar as folhas a 60 DC em um peso constante. O teor de água relativo (RWC) foi calculado de acordo com a Fórmula I a seguir [(FW - DW/TW - DW) x 100], conforme descrito acima.
[00720] As plantas que mantiveram o teor de água relativo alto (RWC) comparado às linhas de controle foram consideradas mais tolerantes à seca do que aquelas que exibiram teor de água relativo reduzido. Resultados Experimentais Tabela 54 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de Seca
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[00721] Tabela 54: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Sorgo (ID de Semente) de cultivo sob condições de seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 55 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de Seca
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[00722] Tabela 55: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID de Semente) sob condições de Seca. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 56 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo nitrogênio
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[00723] Tabela 56: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID de Semente) sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 57 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo nitrogênio
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[00724] Tabela 57: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID de Semente) sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 58 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições normais
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[00725] Tabela 58: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID de Semente) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 59 Parâmetros adicionais medidos em acessos de Tomate sob condições normais
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[00726] Tabela 59: São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (ID de Semente) sob condições normais de cultivo. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental.
[00727] Correlação de características precoces de vigor através da coleta de ecotipos de Tomate sob condições de cultivo de baixo nitrogênio, 300 mM NaCl e normais - Dez híbridos de tomate foram cultivados em 3 lotes repetitivos, cada um contendo 17 plantas, em uma estufa de rede sob condições semi- hidropônicas. Em poucas palavras, o protocolo de cultivo foi o seguinte: As sementes do tomate foram semeadas em bandejas preenchidas com uma mistura de vermiculite e turfa em uma proporção de 1:1. Após a germinação, as bandejas foram transferidas à solução de alta salinidade (300 mM de NaC1 além da solução de Hoagland completa), solução de baixo nitrogênio (a quantidade de nitrogênio total foi reduzida em 90% da solução de Hoagland completa, quantidade final de 0,8 mM N), solução de temperatura fria (Hoagland Completa em 10°C), ou solução de crescimento Normal (Hoagland Completa contendo solução de 8mM N, a 28 ± 2°C). As plantas foram cultivadas em 28 ± 2°C.
[00728] Solução de Hoagland completa consiste de: KNO3 - 0,808 gramas/litro, MgSO4 -0,12 gramas/litro, KH2PO4 - 0,172 gramas/litro e 0,01 % (volume/volume) de microelementos de 'Super coratin' (FerroEDDHA [etilenodiamina-N,N'-bis(ácido 2- hidroxifenilacetico)]- 40,5 gramas/Litro; Mn - 20,2 gramas/litro; Zn 10,1 gramas/litro; Co 1,5 gramas/litro; e Mo 1,1 gramas/litro), o pH da solução deve ser de 6.5 -6.8].
[00729] Tecidos de Tomate analisados - Todas as 10 variedades de Tomate selecionadas foram amostradas por cada tratamento. Três tecidos [folhas, meristemas e flores] foram amostrados e o RNA foi extraído, conforme descrito acima. Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de microarranjo recebeu um ID de conjunto, conforme sumarizado na Tabela 60 abaixo. Tabela 60 Conjuntos experimentais de transcriptoma de Tomate
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[00730] Tabela 60. São fornecidos os conjuntos experimentais de transcriptoma de Tomate
[00731] Parâmetros relacionados ao vigor do tomate - após 5 semanas de cultivo, as plantas foram colhidas e analisadas por número de folha, altura da planta, níveis de clorofila (unidades SPAD, índices diferentes de eficiência no uso do nitrogênio (NUE) e biomassa da planta. Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS). Os parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 61, abaixo. Tabela 61 Parâmetros correlacionados ao Tomate (vetores)
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[00732] Tabela 61. São fornecidos os parâmetros correlacionados ao tomate. "NUE" = eficiência no uso do nitrogênio; "DW" = peso seco; "cm" = centímetro. Resultados experimentais
[00733] 10 variedades diferentes de Tomate foram cultivadas e caracterizadas por diferentes parâmetros conforme descrito acima. A média para cada um dos parâmetros medidos foi calculada utilizando o software JMP e os valores estão resumidos nas Tabelas 62-64 abaixo. A análise de correlação subsequente foi realizada. A seguir, os resultados foram integrados à base de dados. Tabela 62 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de baixo nitrogênio
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[00734] Tabela 62. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (linha) sob condições de cultivo de baixo nitrogênio. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 63 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições normais
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[00735] Tabela 63. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (linha) sob condições de cultivo normais. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. Tabela 64 Parâmetros medidos em acessos de Tomate sob condições de salinidade
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[00736] Tabela 64. São fornecidos os valores de cada um dos parâmetros (conforme descrito acima) medidos em acessos de Tomate (linha) de cultivo sob condições de salinidade. As condições de cultivo são especificadas na seção de procedimento experimental. EXEMPLO 15 CLONAGEM DE GENE E GERAÇÃO DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO DA PLANTA
[00737] Para validar seu papel no aumento da produção, os genes selecionados foram superexpressos nas plantas, conforme segue. Estratégia de Clonagem
[00738] Os genes selecionados a partir daqueles apresentados nos Exemplos 1-14 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, os quadros de leitura aberta de comprimento total (ORF's ► open reading frame) foram identificados. Os grupos EST e, em alguns casos, as sequências de mRNA, foram analisados para identificar o quadro de leitura aberta total comparando os resultados de diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de planta.
[00739] A fim de clonar os cDNA's de comprimento total, uma transcrição reversa (RT 1 reverse transcription) seguida pela reação de cadeia polimerase (PCR; RT-PCR) foi realizada no RNA total extraído das folhas, raízes ou outros tecidos da planta, cultivados sob condições de estresse ou normais/limitantes. A extração total de RNA, produção de cDNA e amplificação de PCR foram realizadas utilizando protocolos padrões descritos em outro lugar (Sambrook J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2' Ed. Frio Spring Harbor Laboratory Press, New York.) que são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Os produtos de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR (Qiagen).
[00740] Geralmente, 2 conjuntos de iniciadores foram preparados para a amplificação de cada gene, via PCR aninhados (se necessário). Ambos os conjuntos de iniciadores foram utilizados para amplificação no cDNA. No caso de nenhum produto ser obtido, uma reação de PCR aninhada foi realizada. O PCR aninhado foi realizado pela amplificação do gene utilizando iniciadores externos e, em seguida, utilizando o produto de PCR produzido como um modelo para uma segunda reação de PCR, onde o conjunto interno de iniciadores foi utilizado. De modo alternativo, um ou dois dos iniciadores internos foi(ram) utilizado(s) para amplificação de 25 genes, ambos na primeira e segunda reações de PCR (significando que apenas 2-3 iniciadores foram designados para um gene). Para facilitar a clonagem adicional de cDNA's, uma extensão de 8-12 pares de base (bplbase pairs) foi adicionada ao 5' de cada iniciador interno. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a) o local de restrição não existe na sequência de cDNA; e (b) os locais de restrição nos iniciadores direto e reversos foram projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na direção do sentido no vetor binário utilizado para transformação.
[00741] Os produtos de PCR foram digeridos com endonucleases de restrição (New England BioLabs Inc.), de acordo com os locais designados nos iniciadores. Cada produto de PCR digerido foi inserido em um vetor de cópia alto pUC19 (New England BioLabs Inc.), ou em plasmídeos originados desse vetor. Em alguns casos, o produto de PCR não digerido foi inserido no pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) ou diretamente no vetor binário. Os produtos digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado foram ligados utilizando uma enzina de ligase T4 DNA (Roche, Suíça).
[00742] O sequenciamento dos genes inseridos foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, após confirmar as sequências dos genes clonados, o cDNA clonado foi introduzido em um vetor binário pGI modificado contendo o promotor At6669 (p.ex., pQFNc) e o terminador NOS (ID SEQ N°: 6066) através de digestão com endonucleases de restrição apropriados.
[00743] Diversas sequências de DNA dos genes selecionados foram sintetizadas via GeneArt [http://www (ponto) geneart (ponto) com/]. O DNA sintético foi projetado em sílica. Os locais de enzimas de restrição adequados foram adicionados às sequências clonadas na extremidade 5' e na extremidade 3' para permitir clonagem posterior no vetor binário desejado.
[00744] O vetor plasmideo pPI foi construído inserindo uma sequência de sinal poli-(A) sintético originado do vetor de plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acesso GenBank N° U47295; nucleotídeos 4658-4811) no local de restrição HindIII do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Acesso GenBank N° U12640). O pGI é similar ao pPI, mas o gene original na coluna vertebral é o gene GUSIntron e não o GUS.
[00745] O vetor pGI modificado [p.ex., pQFN, pQFNc, pQYN 6669, pQNaRP, pQFYN 25 ou pQXNc] é uma versão modificada do vetor pGI, no qual o cassete é invertido entre as bordas esquerda e direita, de modo que o gene e seu promotor correspondente estejam próximos à borda direita e o gene NPTII esteja próximo à borda esquerda.
[00746] At6669, a nova sequência do promotor Arabidopsis thaliana (ID SEQ N°: 3714) foi inserida no vetor binário pGI modificado, a montante dos genes clonados, seguido pela ligação do DNA e extração do plasmídeo binário das colônias E. coli positivas, conforme descrito acima.
[00747] As colônias foram analisadas por PCR, utilizando os iniciadores que cobrem a inserção, que são projetados para abranger o promotor e o gene introduzido. Os plasmídeos positivos foram identificados, isolados e sequenciados.
[00748] Nos casos em que DNA genômico foi clonado, os genes foram amplificados por PCR direto no DNA genômico extraído do tecido foliar, utilizando o kit DNAeasy (Qiagen Cat. N° 69104). Os genes selecionados clonados pelos presentes inventores são fornecidos na Tabela 65 abaixo. Tabela 65 Genes clonados em plasmídeos com alto número de cópias ou em vetores binários e iniciadores utilizados para clonagem dos genes
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[00749] Tabela 65. "Polin." Polinucleotídeo; "Polip." polipeptídeo. Para clonagem de cada gene, pelo menos, 2 iniciadores foram utilizados: Diretos (Fwd) ou Reversos (Rev). Em alguns casos, 4 iniciadores foram utilizados: Diretos externos (EF 1 external forward), reversos externos (ER 1 external reverse), diretos aninhados (NFInested forward) ou reversos aninhados (NRInested reverse). As sequências dos iniciadores utilizados para clonagem dos genes são fornecidas na listagem de sequência. Alguns genes foram sinteticamente produzidos via GeneArt (marcados como "GA"). EXEMPLO 16 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS AGROBACTERIUM TUMEFACIENS COM VETORES BINÁRIOS ABRIGANDO GENES PUTATIVOS
[00750] Os vetores binários descritos acima foram utilizados para transformar as células Agrobacterium. Duas estruturas binárias adicionais, tendo apenas o promotor At6669 ou sem promotor adicional, foram utilizadas como controles negativos.
[00751] Os vetores binários foram introduzidos em células competentes Agrobacterium tumefaciens GV301, ou LB4404 (cerca de 109 células/mL), por eletroporação. A eletroporação foi realizada utilizando um eletroporador MicroPulser (Biorad), 0,2 cm de cadinhos (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). As células tratadas foram cultivadas em meio líquido LB a 28 DC por 3 horas, então colocadas sobre ágar LB suplementado com gentamicina (50 mg/L; para cepas Agrobacterium GV301) ou estreptomicina (300 mg/L; para cepa Agrobacterium LB4404) e canamicina (50 mg/L) a 28°C por 48 horas. As colônias Abrobacterium, que são desenvolvidas nos meios seletivos, foram ainda analisadas por PCR, utilizando os iniciadores projetados para abranger a sequência inserida no plasmídeo pPI. Os produtos de PCR resultantes foram isolados e sequenciados, conforme descrito no Exemplo 15 acima, para verificar que as sequências de polinucleotideo corretas do presente pedido de patente de invenção foram devidamente introduzidas às células Agrobacterium. EXEMPLO 17 TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSIS THALIANA COM OS POLINUCLEOTÍDEOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO
[00752] Plantas Arabidopsis thaliana Columbia (plantas TO) foram transformadas, utilizando o procedimento de Imersão Floral descrito por Clough e Bent, 1998 (Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43) e por Desfeux et al., 2000 (Female Reproductive Tissues Are the Primary Target of Agrobacterium-Mediated Transformation by the Arabidopsis Floral-Dip Methed. Plant Physiol, Julho 2000, Vol. 123, pp. 895-904), com pequenas modificações. Em resumo, as plantas To foram semeadas em vasos de 250 ml, preenchidas com mistura de cultivo com base em turfa úmida. Os vasos foram cobertos com folhas de alumínio e uma redoma de plástico, mantidos a 4°C por 3-4 dias, então, descobertos e incubados em uma câmara de cultivo a 18-24°C em 16/8 horas de ciclos claro/escuro. As plantas To estavam prontas para transformação seis dias antes da antese.
[00753] Colônias únicas de Agrobacterium carregando as estruturas binárias foram geradas, conforme descrito nos Exemplos 15-16 acima. As colônias foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas a 28°C por 48 horas sob agitação vigorosa e, depois, centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os peletes compreendendo as células Agrobacterium foram ressuspensos em um meio de transformação contendo meio de cultura de concentração média (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); 0,044gM de benzilamino purina (Sigma); 112 gg/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma); 5% de sacarose e 0,2 ml/L de Silwet L77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada com pH de 5,7.
[00754] A transformação de plantas To foi realizada invertendo cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de modo que o tecido de planta acima do solo é submerso por 3-5 segundos. Cada planta To inoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja de plástico, então coberta com redoma plástica limpa para manter umidade e foi mantida no escuro à temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e transformação. As plantas transformadas (transgênicas) foram então cobertas e transferidas para uma estufa para recuperação e maturação. As plantas To transgênicas foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas até as síliquas ficarem marrons e secas. As sementes foram colhidas a partir das plantas e mantidas à temperatura ambiente até a semeadura.
[00755] Para geração de plantas transgênicas TI. e T2 abrigando os genes, as sementes coletadas das plantas To transgênicas foram esterilizadas na superfície por imersão em 70% de etanol por 1 minuto, seguido por imersão em 5% de hipoclorito de sódio e 0,05% de triton por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície foram totalmente lavadas em água estéril destilada e, então, colocadas nas placas de cultura contendo meio de cultura de concentração média Murashige-Skoog (Duchefa); 2% de sacarose; 0,8% de ágar de planta; 50 mM de canamicina e 200 mM de carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C por 48 horas, então, transferidas a uma sala de cultivo a 25°C por uma semana adicional de incubação. As plantas T1 Arabidopsis vitais foram transferidas para as placas de cultura fresca por outra semana de incubação. Seguindo a incubação, as plantas T1 foram removidas das placas de cultura e das placas de cultura e plantadas na mistura de cultivo contida em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram deixadas crescer em uma estufa para maturidade. As sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e crescidas para maturidade como as plantas T2 nas mesmas condições conforme utilizadas para cultura e crescimento das plantas T1. EXEMPLO 18 AVALIAÇÃO DE NUE DE ARABIDOSIS TRANSGÊNICA SOB CONDIÇÕES DE BAIXO NITROGÊNIO OU NITROGÊNIO NORMAL UTILIZANDO ENSAIOS IN VITRO (CULTURA DE TECIDO) Ensaio 1: cultivo de planta sob níveis de concentração de nitrogênio baixo e favorável
[00756] Sementes esterilizadas de superfície foram semeadas em meio basal [50% de meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8% de ágar de planta como agente de solidificação] na presença de Canamicina (utilizada como agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4°C e, então, cultivadas a 25°C em ciclos diários de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão por 7 a 10 dias. Nesse ponto de tempo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosamente transferidas para placas contendo meio de MS (15 mM N) para tratamento de concentração de nitrogênio normal e 0,75 mM de nitrogênio para tratamento de concentração de baixo nitrogênio. Para experimentos realizados em linhas T2, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (réplicas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo de cada invenção, pelo menos, quatro a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura. Para experimentos realizados em linhas T1, cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (réplicas) foram plantadas. No total, para linhas T1, 20 eventos independentes foram avaliados. As plantas que expressam polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção foram comparadas à medição média das plantas de controle (vetor vazio ou gene repórter GUS no mesmo promotor) utilizada no mesmo experimento.
[00757] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada a uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EF-S), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpada de iluminação de 4 x 150 Watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizada para capturar imagens de plântulas vistas em placas de ágar.
[00758] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3 a 4 dias, começando no dia 1 até o dia 10 (vide, p. ex. as imagens nas Figuras 3A- B). Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste em um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em http://rsbweb Semelhantemente, o efeito do gene introduzido em acúmulo de biomassa, sob condições ideais, foi determinado comparando o peso seco e fresco das plantas e daquele das plantas de controle (contendo um vetor vazio ou gene repórter GUS no mesmo promotor). A partir de cada estrutura criada, 3 a 5 eventos de transformação independentes foram examinados em replicados.
[00759] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem vigor melhorado à planta ou arquitetura melhorada à raiz, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene sobre um controle, os dados foram analisados pelo teste t de Student e o valor-p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos se p 0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA). Resultados experimentais
[00760] Os genes apresentados nas Tabelas a seguir foram clonados na regulação de um promotor constitutivo (At6669). A avaliação do efeito de transformação em uma planta de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de número diferente de eventos de transformação. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido. Os resultados obtidos nesses segundos experimentos também foram significativamente positivos. O evento com valor p <0.1 foi considerado estatisticamente significativo.
[00761] Os genes apresentados nas Tabelas 66-69 mostraram uma melhora significativa no NUE da planta visto que produziram biomassa de planta maior (peso fresco e seco da planta; área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) em geração T2 (Tabelas 66-67) ou geração T1 (Tabelas 6869) quando cultivadas sob condições de cultivo de nitrogênio limitantes, comparadas às plantas de controle que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver maior quantidade de nitrogênio do solo. Tabela 66 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T2)
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[00762] Tabela 66: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 67 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T9)
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[00763] Tabela 67: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 68 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T1)
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[00764] Tabela 68 "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = de aumento; "Val-p" - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 69 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração T1)
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[00765] Tabela 69: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor-p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00766] Os genes listados nas Tabelas 70-71 melhoraram a taxa de crescimento relativo da planta (taxa de crescimento relativo da área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz) quando cultivados sob condições de cultivo de nitrogênio limitantes, comparados às plantas de controle (geração T1 e T2) que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas. As plantas que apresentam taxa de crescimento rápido mostram um estabelecimento melhor da planta em solo sob condições de nitrogênio deficientes. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz foi medida. Tabela 70 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada da planta sob condicões deficientes de nitrogênio (aeracão
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[00767] Tabela 70: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 71 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada da planta sob condições deficientes de nitrogênio (geração Ti)
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[00768] Tabela 71: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00769] Os genes listados nas Tabelas 72-75 melhoraram a NUE da planta quando cultivadas em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Esses genes produziram biomassa de planta maior (peso fresco e seco da planta; área foliar, cobertura da raiz e comprimento da raiz) quando cultivadas sob condições de cultivo de nitrogênio padrão, comparado àquelas plantas de controle que foram cultivadas sob condições de cultivo idênticas em geração T2 (Tabelas 72-73) ou geração T1 (Tabelas 74-75). A biomassa maior da planta nessas condições de cultivo indica a alta capacidade da planta de melhor metabolizar o nitrogênio presente no meio. As plantas que produzem biomassa de raiz maior têm melhores possibilidades de absorver maior quantidade de nitrogênio do solo. Tabela 72 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T2)
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[00770] Tabela 72: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 73 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T2)
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[00771] Tabela 73: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 74 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T1)
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[00772] Tabela 74: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 75 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T1)
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[00773] Tabela 75: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00774] Os genes listados nas Tabelas 76-77 melhoraram a taxa de crescimento relativo da planta (RGR da área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz) quando cultivadas em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Esses genes produziram plantas que cresceram mais rápido que as plantas de controle quando cultivadas sob condições de cultivo de nitrogênio padrão. O crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área foliar, comprimento da raiz e cobertura da raiz foi medida. Tabela 76 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada da planta sob condições de cultivo de nitrogênio padrão (geração T2)
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[00775] Tabela 76: “CONT” - Controle significativo Tabela 77 Genes mostrando a taxa de crescimento melhorada da planta sob condições de nitrogênio padrão (geração T1)
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[00776] Tabela 77: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. EXEMPLO 19 AVALIAÇÃO DE NUE, PRODUÇÃO E TAXA DE CRESCIMENTO DE PLANTA DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA EM FERTILIZAÇÃO DE BAIXO NITROGÊNIO OU NORMAL EM ENSAIO DE ESTUFA
[00777] Ensaio 1: Eficiência no uso do nitrogênio: Produção de semente, biomassa de planta e taxa de crescimento de planta em concentração de nitrogênio ótima e limitada em condições de estufa (maturação de semente de estufa) - Esse ensaio acompanha a produção de semente, a formação de biomassa e o crescimento de área da roseta de plantas cultivadas na estufa em condições de crescimento de nitrogênio (ótima) nãolimitantes e limitantes. As sementes de Arabidopsis Transgênica foram semeadas em meios de ágar suplementados com meio de MS e agente de seleção (Canamicina), As sementes transgênicas T2 foram, então, transplantadas para 1,7 bandejas preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo condições limitantes de nitrogênio, as quais foram atingidas pela irrigação das plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementado com 1mM de KH2PO4, 1mM de MgSO4, 3,6 mM de KC1, 2 mM de CaC12 e microelementos, enquanto níveis normais de nitrogênio foram alcançadas aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3, com 1mM de KH2PO4, 1mM de MgSO4, CaC12 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até as sementes ficarem maduras. As sementes foram colhidas, extraídas e pesadas. A biomassa de planta restante (o tecido acima do solo) também foi colhida, e pesada imediatamente ou seguindo a secagem no forno a 50°C por 24 horas.
[00778] Cada estrutura foi validada em sua geração T2, As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por um vetor vazio carregando o promotor At6669 e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.
[00779] As plantas foram analisadas por seu tamanho total, taxa de crescimento, tempo de floração, produção de semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (HI - produção de semente/matéria seca). 0 desempenho das plantas transgênicas foi comparado às plantas de controle cultivadas em paralelo em condições de crescimento idênticas. As plantas transgênicas falsas que expressam o gene repórter uidA (GUSIntron) ou sem nenhum gene, no mesmo promotor, foram utilizadas como controle.
[00780] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene do presente pedido de patente de invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados de cada estrutura.
[00781] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de 55 mm de comprimento focal (Canon série EFS), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpada de 4 x 150 Watts) foi utilizada para capturar imagens das amostras de plantas.
[00782] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando do dia 1 após o transplante até o dia 15. A mesma câmara, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi usada para capturar as imagens de plantas maiores vistas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas são de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litros. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição de sombras.
[00783] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizados na internet em Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group padrão). Em seguida, dados de análise foram salvos para arquivos de textos e processados utilizando o software de análise estatística JMP (instituto SAS).
[00784] Análise de folha -Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, a área da roseta, o diâmetro de roseta e a área da lâmina foliar.
[00785] Taxa de crescimento vegetativo: a taxa de crescimento relativo (RGR) do número da folha [Fórmula VI (descrita acima)], área da roseta [Fórmula VII (descrita acima)], cobertura do lote [Fórmula IX (descrita acima)] e índice de colheita [Fórmula IV (descrita acima)] foram calculadas conforme a seguir: Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes foram coletadas. As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.
[00786] Peso seco e produção de semente - Por volta do 80° dia, as plantas foram colhidas e deixadas para secar a 30 DC em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada lote foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada lote. Peso seco - peso total da parte vegetal acima da terra (excluindo as raízes) após secagem a 30°C em uma câmara de secagem; Produção de semente por planta = peso total da semente por planta (gr.), peso de 1000 sementes (o peso de 1000 sementes) (gr.).
[00787] O índice de colheita (HI) foi calculado utilizando a Fórmula IV, conforme descrito acima.
[00788] Porcentagem de óleo em sementes - No final do experimento, todas as sementes de cada lote foram coletadas. As sementes de 3 lotes foram misturadas à terra e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n- Hexano (Cat N° 080951 Biolab Ltd.) foram utilizadas como solvente. A extração foi realizada por 30 horas em fogo médio a 50 °C. Uma vez finalizada a extração, o n-Hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35 °C Oe condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação obtida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F, Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J, (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizado para criar uma curva de calibração para RMN de Baixa Ressonância. O teor de óleo de todas as amostras foi determinado utilizando o RMN de Baixa Ressonância (MARAN Ultra - Oxford Instrument) e seu pacote de software MultiQuant.
[00789] Análise de comprimento de Síliqua - No dia 50 da semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada lote foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas foram de cor verde-amarela e foram coletadas a partir das partes inferiores de um caule de planta cultivado. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.
[00790] Análise estatística -Para identificar os genes que conferem tolerância significativamente melhorada aos estresses abióticos, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados pelo teste t de Student e os resultados foram considerados significativos se o valor-p fosse menor que 0.1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).
[00791] Tabelas 78-87 resumem os fenótipos observados das plantas transgênicas que expressam de forma exógena as estruturas de gene utilizando ensaios de maturação da semente na estufa (GH-SM) em condições de baixo nitrogênio (Tabelas 78-82) ou de nitrogênio normal (Tabelas 83-87). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diferentes números de eventos. O evento com valor p <0.1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 78 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669
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[00792] Tabela 78: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." - % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 79 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669
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[00793] Tabela 79: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 80 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669
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[00794] Tabela 80: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 81 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669
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[00795] Tabela 81: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 82 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições de cultivo de baixo nitrogênio sob regulação do promotor At6669
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[00796] Tabela 82: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 83 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00797] Tabela 83: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 84 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00798] Tabela 84: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 85 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00799] Tabela 85: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." - % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 86 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00800] Tabela 86: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." - de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). Tabela 87 Genes mostrando o desempenho melhorado da planta em condições normais de cultivo sob regulação do promotor At6669
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[00801] Tabela 87: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Os transgenes estavam sob regulação transcricional do novo promotor At6669 (ID SEQ N°: 6052). EXEMPLO 20 AVALIAÇÃO DE PRODUÇÃO, NUE E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICA SOB FERTILIZAÇÃO NORMAL E BAIXA EM ENSAIOS DE ESTUFA
[00802] Ensaio 2: Eficiência no Uso de Nitrogênio medida até o estágio de peneiração: biomassa da planta e taxa de crescimento da planta em concentração de nitrogênio ideal e limitada sob condições da estufa - Esse ensaio segue a formação da biomassa da planta e o crescimento da área de roseta de plantas cultivadas em estufa sob condições de cultivo limitantes e não limitantes de nitrogênio. As sementes transgênicas de Arabidopsis foram semeadas em meio de ágar suplementado com ;-2 de meio MS e um agente de seleção (Canamicina). As mudas transgênicas T2 foram, então, transplantadas para bandejas de 1,7 litro preenchidas com turfa e perlita em uma proporção de 1:1. As bandejas foram irrigadas com um a solução contendo condições limitantes de nitrogênio que foram obtidas irrigando as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementadas com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3,6 mM de KC1, 2 mM de CaC12 e microelementos, enquanto níveis normais de nitrogênio foram obtidos aplicando uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaC12 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas em estufa até peneiração. A biomassa da planta (o tecido acima da terra) foi pesada indiretamente após colher a roseta (peso fresco da planta [FW]). Em seguida, as plantas foram secadas em um forno a 50 UC por 48 horas e pesadas (peso seco da planta [DW]).
[00803] Cada estrutura foi validada em sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com uma estrutura conformada por um vetor vazio carregando o promotor At6669 e o marcador selecionável foram utilizadas como controle.
[00804] As plantas foram analisadas com relação ao seu tamanho total, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. O desempenho das plantas transgênicas foi comparado para controlar as plantas cultivadas em paralelo nas mesmas condições. As plantas transgênicas falsas expressando o gene repórter uidA (GUSIntron) ou sem nenhum gene, no mesmo promotor foram utilizadas como controle.
[00805] O experimento foi planejado na distribuição de lote aleatório aninhado. Para cada gene do presente pedido de patente de invenção, três a cinco eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada estrutura.
[00806] Imagem Digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) anexada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (Canon série EFS), montada em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), o qual inclui 4 unidades de luz (lâmpadas 4 x 150 Watts) foi utilizado para capturar imagens de amostras de planta.
[00807] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias, começando no dia 1 após transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma montagem de ferro personalizada, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores encerradas em cubas brancas em uma estufa controlada pelo ambiente. As cubas eram de formato quadrado e incluem bandejas de 1,7 litro. Durante o processo de captura, as cubas foram colocadas abaixo da montagem de ferro, enquanto evitavam a luz solar direta e fundição das sombras.
[00808] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, consistindo de um computador pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento de imagem com base em Java, desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e livremente disponibilizado na internet em http://rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em um formato JPEG de baixa compressão (Joint Photographic Experts Group standard). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software JMP de análise estatística (instituto SAS). Análise da Folha -Utilizando a análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número da folha, área de roseta, diâmetro da roseta, e área da lâmina foliar.
[00809] Taxa de crescimento vegetal: a taxa de crescimento relativa (RGR) do número de folha (Fórmula VI, descrita acima), área da roseta (Fórmula VII descrita acima) e cobertura de lote (Fórmula IX, descrita abaixo) foram calculados utilizando as fórmulas Indicadas.
[00810] Peso seco e fresco da planta - Por volta do dia 80 a partir da semeadura, as plantas foram colhidas e diretamente pesadas para determinação do peso fresco da planta (FW) e deixadas secar a 50 UC em uma câmara de secagem por cerca de 48 horas antes da prensagem para determinar o peso seco da planta (DW).
[00811] Análises Estatísticas - Para identificar os genes que conferem uma significativa melhoria na tolerância ao estresse abiótico e na eficiência no uso de nitrogênio, os resultados obtidos a partir de plantas transgênicas foram comparados àqueles obtidos a partir de plantas de controle quando cultivadas sob condições de cultivo idênticas. Para identificar os genes e estruturas de alto desempenho, os resultados dos eventos testados de transformação independentes foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando teste t de Student e os resultados são considerados significativos se o valor p for menor que 0,1. O pacote de software JMP estatístico foi utilizado (Versão 5.2.1, Instituto SAS Inc., Cary, NC, EUA).
[00812] Os genes listados nas Tabelas 88-89 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração limitantes de nitrogênio. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética e biomassa maiores (peso fresco, peso seco, número de folhas, diâmetro da roseta, área de roseta e cobertura de lote) quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio (estresse por deficiência de nutriente), comparado às plantas de controle cultivadas em condições de cultivo idênticas. Tabela 88 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições de cultivo limitantes de nitrogênio
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[00813] Tabela 88: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 89 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições de cultivo limitantes de nitrogênio
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[00814] Tabela 89: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00815] Os genes listados na Tabela 90 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração limitantes de nitrogênio. Estes genes produziram plantas com desenvolvimento mais rápido quando cultivadas sob condições de cultivo limitantes de nitrogênio, em comparação com plantas de controle cultivadas sob condições idênticas, conforme medido pela taxa de crescimento do número de folhas, diâmetro da roseta e cobertura do lote. Tabela 90 Genes mostrando o desempenho melhorado de crescimento da roseta em condições de cultivo limitantes de nitrogênio
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[00816] Tabela 90: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." - % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00817] Os genes listados nas Tabelas 91-92 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Esses genes produziram plantas maiores com uma área fotossintética maior e biomassa melhorada (peso fresco, peso seco, número de folhas, diâmetro da roseta, área de roseta e cobertura de lote) quando cultivadas sob condições de nitrogênio padrão, comparado às plantas de controle cultivadas em condições de cultivo idênticas. Tabela 91 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições de cultivo de nitrogênio padrão
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[00818] Tabela 91: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que O, 01, p<0,1 foi considerado como significativo. Tabela 92 Genes mostrando a produção de biomassa melhorada da planta em condições de cultivo de nitrogênio padrão .
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[00819] Tabela 92: "CONT" - Controle;" - Média; "96 Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00820] Os genes listados na Tabela 93 melhoraram a NUE da planta quando cultivada em níveis de concentração de nitrogênio padrão. Estes genes produziram plantas com desenvolvimento mais rápido quando cultivadas sob condições de cultivo limitantes de nitrogênio, em comparação com plantas de controle cultivadas sob condições idênticas, conforme medido pela taxa de crescimento do número de folhas, diâmetro da roseta e cobertura do lote. Tabela 93 Genes mostrando o desempenho melhorado de crescimento da roseta em condições de cultivo de nitrogênio padrão
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[00821] Tabela 93: "CONT" - Controle; "Méd." - Média; "% Aum." = % de aumento; "Val-p" - valor p; L significa que o valor-p é menor que 0,01, p<0,1 foi considerado como significativo.
[00822] Embora o presente pedido de patente de invenção tenha sido descrito em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos especialistas na técnica. Consequentemente, ele destina-se a abranger todas essas alternativas, modificações e variações que recaem no espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.
[00823] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo estão incorporados em sua totalidade por referência no referido relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado aqui por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência no presente pedido de patente não deverá ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior ao presente pedido de patente de invenção. Na medida em que os títulos da seção são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims (9)

1. Método para aumento da eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico como definida pela SEQ ID NO: 421, codificando o polipeptídeo definido pela sequência de aminoácido definida pela SEQ ID NO: 636, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica o referido polipeptídeo definido pela SEQ ID NO: 636, aumentando, desse modo, a eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.
2. Construto de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico como definida pela SEQ ID NO: 421 , codificando um polipeptídeo definido pela sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 636, ou uma sequência degenerada da mesma codificando o referido polipeptídeo definido pela SEQ ID NO: 636, e um promotor para direcionar a transcrição da referida sequência de ácido nucleico em uma célula de planta, em que o referido promotor não é nativamente associado com o referido polinucleotídeo isolado.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácidos nucleicos é selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 421 e 167.
4. Construto de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 421 e 167.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de compreender, ainda, o cultivo da planta que superexpressa o referido polinulceotídeo sob estresse abiótico.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, caracterizado pelo fato de que o referido estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo em salinidade, estresse osmótico, seca, falta de água, inundação, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade por metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, caracterizado pelo fato de que o referido estresse abiótico é deficiência de nitrogênio.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 e 7, caracterizado pelo fato de que a produção compreende a produção de semente.
9. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, o cultivo da planta que superexpressa o referido polinucleotídeo sob condições limitantes de nitrogênio.
BR122019023055-2A 2011-11-28 2012-11-27 Método para aumento da eficiência no uso de nitrogênio, produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construto de ácido nucleico isolado BR122019023055B1 (pt)

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