BR112022017853B1 - MICRORGANISMO DE Corynebacterium glutamicum, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MICRORGANISMO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS L DE CADEIA RAMIFICADA USANDO O MESMO - Google Patents
MICRORGANISMO DE Corynebacterium glutamicum, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MICRORGANISMO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS L DE CADEIA RAMIFICADA USANDO O MESMO Download PDFInfo
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Abstract
MICRORGANISMOS COM PRODUTIVIDADE APRIMORADA DE AMINOÁCIDOS L DE CADEIA RAMIFICADA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS L DE CADEIA RAMIFICADA USANDO OS MESMOS. A presente invenção refere-se a: um microrganismo Corynebacterium sp. com produtividade aprimorada de aminoácidos L de cadeia ramificada, compreendendo um novo polinucleotídeo representado pela fórmula geral 1 de X-Z-Y-Z' em que a sequência do transposon Y é inserida nas sequências derivadas de microorganismos X e Z; e um método para produção de aminoácidos L de cadeia ramificada com alta eficiência cultivando o microrganismo Corynebacterium sp
Description
[001] O presente pedido refere-se a microrganismos com produtividade aprimorada de aminoácidos L de cadeia ramificada incluindo um novo polinucleotídeo e um método para produzir aminoácidos L de cadeia ramificada usando os mesmos.
[002] Os aminoácidos L são unidades estruturais básicas de proteínas e são utilizados como materiais importantes para matérias-primas farmacêuticas e aditivos alimentares, ração animal, suplementos nutricionais, pesticidas, bactericidas, etc. Em particular, aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) são um termo genérico para L- valina, L-leucina e L-isoleucina, os quais são aminoácidos essenciais. Os aminoácidos de cadeia ramificada são conhecidos por terem um efeito antioxidante e um efeito de promoção direta da síntese de proteínas nas células musculares.
[003] Enquanto isso, os aminoácidos de cadeia ramificada são produzidos principalmente por microrganismos do gênero Escherichia ou do gênero Corynebacterium, e são conhecidos por serem biossintetizados a partir do ácido 2- cetoisocaproico como precursor, após passar por várias etapas do ácido pirúvico (patentes coreanas n° 10-0220018 e 10-0438146). No entanto, a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada pelo microrganismo apresenta um problema na medida em que é difícil realizar a produção industrial em larga escala.
[004] Os presentes inventores fizeram grandes esforços para preparar microrganismos que têm produtividade aprimorada de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo um novo polinucleotídeo e, como resultado, confirmaram que a produtividade de aminoácidos L pode ser aprimorada em um microrganismo do gênero Corynebacterium no qual o polinucleotídeo é introduzido, completando assim o presente pedido.
[005] Um objetivo do presente pedido é fornecer um microrganismo do gênero Corynebacterium para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo uma sequência polinucleotídica.
[006] Outro objetivo do presente pedido é fornecer uma composição para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo uma sequência polinucleotídica.
[007] Ainda outro objetivo do presente pedido é fornecer um método para produzir aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo: cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium; e recuperação de aminoácidos L de cadeia ramificada do meio ou de uma cultura do mesmo.
[008] Ainda outro objetivo do presente pedido é fornecer um método para aumentar a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo: adicionar uma sequência polinucleotídica a um microrganismo.
[009] Ainda outro objetivo do presente pedido é fornecer uma utilização da sequência polinucleotídica para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada.
[0010] Além disso, outro objetivo do presente pedido é fornecer uma utilização do microrganismo para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada.
[0011] Ao cultivar um microrganismo para produzir aminoácidos L de cadeia ramificada incluindo o novo polinucleotídeo do presente pedido, aminoácidos L de cadeia ramificada podem ser produzidos com alta eficiência. Além disso, os aminoácidos preparados podem ser aplicados a vários produtos, tais como alimentos humanos ou aditivos alimentares, produtos farmacêuticos, bem como alimentos para animais ou aditivos para alimentos para animais.
[0012] Doravante, o presente pedido será descrito em detalhes. Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada no presente documento pode ser aplicada a outras descrições e modalidades em relação a recursos comuns. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados no presente documento se enquadram no escopo da presente revelação. Ademais, o escopo da presente revelação é limitado pela descrição específica descrita abaixo.
[0013] Além disso, aqueles versados na técnica podem ser capazes de reconhecer ou confirmar, usando apenas experimentação convencional, muitos equivalentes aos aspectos particulares da invenção descritos no presente documento. Além disso, pretende-se também que estes equivalentes sejam incluídos no presente pedido.
[0014] Um aspecto do presente pedido fornece um microrganismo do gênero Corynebacterium para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo uma sequência polinucleotídica.
[0015] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo”, que é um polímero de nucleotídeos composto de monômeros de nucleotídeos conectados em uma cadeia longa por uma ligação covalente, é uma fita de DNA que tem pelo menos um certo comprimento.
[0016] Para os fins do presente pedido, o polinucleotídeo refere-se a um polinucleotídeo envolvido no aumento da produção ou produção de aminoácidos, especificamente aminoácidos de cadeia ramificada, mais especificamente aminoácidos incluindo leucina, valina e isoleucina, porém sem limitação aos mesmos.
[0017] Além disso, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo representado por X-Z-Y-Z' [Fórmula Geral 1], na Fórmula Geral 1 acima, X pode ser SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais com o mesmo, Y pode ser um transposon, Z pode ser uma sequência de 0 a nésima sequência da SEQ ID NO: 5, e Z' pode ser uma sequência da n+1ésima sequência da SEQ ID NO: 5 a 188, a última sequência da SEQ ID NO: 5, em que a 188a sequência da SEQ ID NO: 5 pode ser qualquer uma selecionada a partir de A (adenina), T (timina), G (guanina) e C (citosina) como “N”, especificamente A (adenina) ou G (guanina), porém sem limitação às mesmas.
[0018] O n refere-se a um número natural incluindo “0”. Acima, quando n é 0, isso significa que Y está ligado ao lado 3' imediatamente após X. Além disso, Z e Z' podem ser SEQ ID NO: 5 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais, porém sem limitação à mesma.
[0019] Além disso, na Fórmula Geral 1 acima, Y é um transposon e pode consistir na SEQ ID NO: 3, que é inserida a jusante da nésima sequência da SEQ ID NO: 5, podendo ser inserida em qualquer posição nas sequências de Z e Z'. Especificamente, Z e Z', que são sítios nos quais Y é inserido, são sítios presentes em uma posição a montante de um gene-alvo no qual Y pode ser inserido para aumentar a expressão do gene-alvo, e endogenamente, Z e Z' estão ligados entre si para constituir um a montante, porém sem limitação ao mesmo. Estes Z e Z' são uma sequência contínua, constituindo uma parte de uma posição a montante inserida para aumentar a expressão do gene-alvo, e Y está posicionado na extremidade 3' de Z (na extremidade 3' de X quando ligado a 0ésima sequência de Z) e na extremidade 5' de Z', de modo que possam ser separados em Z e Z' um do outro. Por exemplo, Z e Z' consistem na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 e têm um total de 188 sequências nucleotídicas: i) quando o transposon Y é inserido a jusante da primeira sequência, a primeira sequência nucleotídica da extremidade 5' na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 torna-se Z, e 187 sequências nucleotídicas excluindo uma sequência nucleotídica a partir da extremidade 5' na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 tornam-se Z'. Além disso, ii) quando o transposon Y é inserido a jusante da 11a sequência, as 11 sequências nucleotídicas da extremidade 5' na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 tornam-se Z, e 177 sequências nucleotídicas excluindo 11 sequências nucleotídicas da extremidade 5' na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 tornam-se Z'. Além disso, iii) quando o transposon Y é inserido a jusante da 187a sequência, as 187 sequências nucleotídicas da extremidade 5' na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 tornam-se Z, e uma sequência nucleotídica excluindo 187 sequências nucleotídicas da extremidade 5' tornam-se Z', mas a descrição acima é apenas um exemplo e, portanto, não está limitada a mesma.
[0020] Especificamente, quando o transposon Y é inserido na sequência nucleotídica após a 11a sequência nucleotídica, a sequência nucleotídica Z pode ser SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais. Além disso, na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5, Z', que consiste em 177 sequências nucleotídicas excluindo 11 sequências nucleotídicas da extremidade 5', pode ser SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais, porém sem limitação à mesma. A última sequência da SEQ ID NO: 4 pode ser qualquer uma selecionada a partir de A (adenina), T (timina), G (guanina) e C (citosina) como “N”, especificamente A (adenina) ou G (guanina), porém sem limitação às mesmas.
[0021] O polinucleotídeo pode ser aquele em que X pode ser SEQ ID NO: 1 e/ou uma sequência nucleotídica que tem uma homologia ou identidade de pelo menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % ou mais com a mesma, e Z e Z‘ podem ser SEQ ID NO: 5 e/ou uma sequência nucleotídica que tem uma homologia ou identidade de pelo menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % ou mais com a mesma, em que a sequência polinucleotídica tendo homologia ou identidade pode ser aquela na faixa acima, excluindo uma sequência que tem 100 % de identidade, ou pode ser uma sequência que tem menos de 100 % de identidade.
[0022] Para os fins do presente pedido, o polinucleotídeo refere-se a um que pode servir para aumentar a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, desde que o transposon Y seja inserido em uma sequência derivada de um microrganismo incluindo X, Z e Z'.
[0023] Além disso, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais com a mesma pode ser adicionalmente incluída na extremidade 3' de Z', porém sem limitação a mesma. Especificamente, o polinucleotídeo não está limitado, desde que seja uma sequência derivada de microrganismos, incluindo SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais na extremidade 3' de Z'.
[0024] Em um exemplo, entre a sequência polinucleotídica representada pela Fórmula Geral 1 acima, a sequência incluindo a sequência de X-Z-Z sem Y, que é um transposon, e a sequência adicionada à extremidade 3' de Z' pode corresponder à sequência a montante de NCgl2472, porém sem limitação a mesma.
[0025] Especificamente, a sequência polinucleotídica representada pela Fórmula Geral 1 acima pode ser SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17, porém sem limitação.
[0026] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” refere-se a um grau de parentesco entre duas sequências nucleotídicas dadas e pode ser expresso como uma porcentagem.
[0027] Os termos homologia e identidade podem ser frequentemente usados de modo intercambiável entre si.
[0028] A homologia ou identidade de sequência de sequências conservadas de polinucleotídeos pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com uma penalidade por lacuna predefinida estabelecida pelo programa a ser usado. Substancialmente, se espera que sequências homólogas ou idênticas hibridizem com tudo ou pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de todo o comprimento das sequências sob condições altamente rigorosas ou moderadas. Os polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons em polinucleotídeos de hibridização também são considerados.
[0029] Se quaisquer duas sequências de polinucleotídeos têm uma homologia, semelhança ou identidade pode ser, por exemplo, determinada por um algoritmo de computador conhecido, como o programa “FASTA”, usando parâmetros padrão (Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444). Alternativamente, pode ser determinada através do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), que é realizado com o uso do programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (versão 5.0.0 ou versões da mesma) (pacote de programa GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; e CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (NCBI - National Center for Biotechnology Information).
[0030] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com o uso, por exemplo, do programa de computador GAP, tal como Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443 conforme revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Em suma, o programa GAP define a homologia, similaridade ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados de modo similar (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na menor das duas sequências. Parâmetros predefinidos para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, edições, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358 (1979) (ou EDNAFULL matriz de substituição (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade por abertura de lacuna de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas de extremidade. Portanto, o termo “homologia” ou “identidade”, conforme usado no presente documento, representa relação entre sequências.
[0031] Adicionalmente, o polinucleotídeo do presente pedido pode sofrer várias modificações na região de codificação dentro do escopo que não altera a sequência polinucleotídica, devido à degenerescência dos códons ou em consideração aos códons preferidos em um organismo no qual o polinucleotídeo deve ser expresso. Além disso, o polinucleotídeo do presente pedido pode incluir uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, qualquer sequência polinucleotídica que pode hibridizar com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência nucleotídica sob condições rigorosas, de modo que pelo menos um nucleotídeo é substituído por outro nucleotídeo na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3, e tem uma atividade promotora sem limitação. As “condições rigorosas” se referem às condições sob as quais a hibridização específica entre polinucleotídeos é permitida. Tais condições são especificamente descritas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al.). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir condições que, sob as quais, os genes que têm uma alta homologia ou identidade de 40 % ou mais, especificamente 70 % ou mais, 80 % ou mais, 85 % ou mais, 90 % ou mais, mais especificamente 95 % ou mais, muito mais especificamente 97 % ou mais, e ainda mais especificamente 99 % ou mais, são hibridizados um com o outro e os genes que têm uma homologia ou identidade inferior do que as homologias ou identidades anteriores não são hibridizados uns com os outros ou condições de lavagem de hibridização de Southern, isto é, lavar uma vez, especificamente duas ou três vezes a uma concentração salina e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1 xSSC, 0,1 % SDS, especificamente 60 °C, 0,1xSSC, 0,1 % de SDS e, mais especificamente, 68 °C, 0,1xSSC, 0,1 % de SDS.
[0032] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora disparidades entre bases sejam possíveis dependendo da estringência da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo que podem hibridizar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, adenina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Portanto, o polinucleotídeo do presente pedido pode incluir fragmentos de nucleotídeos isolados complementares à sequência inteira, bem como sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes a elas.
[0033] Especificamente, os polinucleotídeos que têm uma homologia ou identidade podem ser detectados com o uso das condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização em um valor Tm de 55 °C sob as condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser de 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não se limita ao mesmo, e pode ser ajustado adequadamente por elementos versados na técnica, dependendo do propósito do mesmo.
[0034] A estringência apropriada para hibridizar polinucleotídeos depende da quantidade de polinucleotídeos e do grau de complementação, e essas variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
[0035] Conforme usado no presente documento, o termo “microrganismo contendo um polinucleotídeo” refere-se a um microrganismo que tem produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada naturalmente ou um microrganismo ao qual a produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada é conferida a uma cepa parental sem produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada incluindo o polinucleotídeo de X-Z-Y-Z’ [Fórmula Geral 1], porém sem limitação ao mesmo. Especificamente, no microrganismo, o polinucleotídeo é representado pela Fórmula Geral X-Z-Y-Z\ na Fórmula Geral 1 acima, X é SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais, Y é um transposon e Z e Z' podem ser SEQ ID NO: 5 ou uma sequência que tem uma homologia de 90 % ou mais.
[0036] Para os propósitos do presente pedido, o microrganismo pode ser qualquer microrganismo capaz de produzir aminoácidos de cadeia ramificada incluindo o polinucleotídeo.
[0037] No presente pedido, o “microrganismo capaz de produzir aminoácidos de cadeia ramificada” pode ser usado de forma intercambiável com “microrganismo que produz aminoácidos de cadeia ramificada” e “microrganismo que tem produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada”.
[0038] Conforme usado no presente documento, o termo “aminoácido de cadeia ramificada” se refere a um aminoácido com um grupo alquila ramificado na cadeia lateral e inclui valina, leucina e isoleucina. Especificamente, no presente pedido, o aminoácido de cadeia ramificada pode ser um aminoácido L de cadeia ramificada e o aminoácido L de cadeia ramificada pode ser L-valina ou L-leucina, porém sem limitação aos mesmos.
[0039] Conforme usado no presente documento, o termo “aminoácidos de cadeia ramificada produtores de microrganismos” inclui todos os microrganismos do tipo selvagem, ou microrganismos geneticamente modificados natural ou artificialmente, que podem ser um microrganismo no qual um mecanismo específico é enfraquecido ou aprimorado devido à inserção de um gente estranho, ou aprimoramento ou inativação da atividade de um gene endógeno, e pode ser um microrganismo no qual ocorre mutação genética ou a atividade é aprimorada para a produção de aminoácidos de cadeia ramificada desejados. Para efeitos do presente pedido, o microrganismo produtor de aminoácidos de cadeia ramificada é caracterizado por a produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada desejada ser aumentada pela inclusão do polinucleotídeo e, especificamente, pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium. Especificamente, no presente pedido, um microrganismo que produz aminoácidos de cadeia ramificada ou um microrganismo que tem produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada pode ser um microrganismo no qual parte de um gene em uma via de biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada é aprimorada ou enfraquecida, ou em que parte de um gene em uma via de degradação de aminoácidos de cadeia ramificada é aprimorada ou enfraquecida, porém sem limitação a isso.
[0040] Conforme usado no presente documento, o termo “microrganismo do gênero Corynebacterium para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada” pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium que tem produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada naturalmente ou por modificação. Especificamente, no presente pedido, o microrganismo do gênero Corynebacterium que tem produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada pode se referir a um microrganismo do gênero Corynebacterium que contém o polinucleotídeo do presente pedido ou é transformado com um vetor que contém um gene que codifica o polinucleotídeo, tendo assim produtividade aprimorada de aminoácidos de cadeia ramificada. O “microrganismo do gênero Corynebacterium que tem produtividade aprimorada de aminoácidos de cadeia ramificada” pode se referir a um microrganismo cuja produtividade de aminoácidos de cadeia ramificada é aprimorada em comparação com a de uma cepa parental antes da transformação ou um microrganismo não modificado. O “microrganismo não modificado” pode se referir a uma cepa natural em si, um microrganismo que não contém o polinucleotídeo do presente pedido ou um microrganismo que não é transformado com um vetor que contém o gene que codifica o polinucleotídeo e a proteína-alvo.
[0041] No presente pedido, o “microrganismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis, etc., porém sem limitação aos mesmos.
[0042] Outro aspecto do presente pedido fornece uma composição para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo a sequência polinucleotídica.
[0043] A composição para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada significa uma composição capaz de produzir aminoácidos L de cadeia ramificada pelo polinucleotídeo do presente pedido. Por exemplo, a composição inclui o polinucleotídeo e pode incluir adicionalmente, sem limitação, uma constituição capaz de operar o polinucleotídeo. O polinucleotídeo pode estar em uma forma incluída em um vetor para permitir a expressão de um gene operacionalmente ligado em uma célula hospedeira introduzida.
[0044] Ainda outro aspecto do presente pedido fornece um método para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo: cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium em um meio; e recuperação de aminoácidos L de cadeia ramificada a partir do meio ou de uma cultura do mesmo.
[0045] No método acima, a etapa de cultivar o microrganismo pode ser realizada por um método de cultura em lote conhecido, método de cultura contínuo, método de cultura em lote descontínuo alimentada, etc, mas não se limita particularmente aos mesmos. Em particular, no que diz respeito às condições de cultura, o pH da cultura pode ser ajustado a um pH adequado (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente pH 6 a 8 e mais especificamente pH 6,8) usando um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amoníaco) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), mas não está particularmente limitado aos mesmos. Adicionalmente, oxigênio ou uma mistura gasosa que contém oxigênio pode ser injetado na cultura a fim de manter um estado aeróbico. A temperatura da cultura pode ser mantida em 20 °C a 45 °C, especificamente em 25 °C a 40 °C, e o cultivo pode ser realizado por cerca de 10 a 160 horas, mas a cultura não está limitada ao acima. Os aminoácidos produzidos pela cultura podem ser secretados no meio ou podem permanecer nas células.
[0046] Além disso, como fonte de carbono para o meio de cultura a ser utilizado, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) pode ser usado sozinho ou em combinação, porém sem limitação a isso. Como fonte de nitrogênio, compostos orgânicos contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de maceração de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) podem ser usados sozinhos ou em combinação, porém sem limitação aos mesmos. Como fonte de fósforo, di- hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, sais contendo sódio correspondentes dos mesmos, etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, porém sem limitação. Além disso, os materiais que promovem o crescimento essencial, tais como outros sais de metal (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas podem ser contidos no meio.
[0047] No método para recuperar os aminoácidos produzidos na etapa de cultivo da presente revelação, os aminoácidos desejados podem ser coletados a partir da solução cultivada com o uso de um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização e HPLC podem ser usados, e os aminoácidos desejados podem ser coletados do meio ou do microrganismo usando um método apropriado conhecido na técnica.
[0048] Adicionalmente, a etapa de recuperação pode incluir adicionalmente um processo de purificação, e pode ser realizado com o uso de um método apropriado conhecido na técnica. Desse modo, os aminoácidos recuperados podem estar em um estado purificado ou na forma de uma solução de fermentação microbiana que contém os aminoácidos (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
[0049] Adicionalmente, para efeitos do presente pedido, o microrganismo contendo o polinucleotídeo que tem uma atividade promotora é caracterizado por a produção de aminoácidos de cadeia ramificada incluindo valina, leucina ou isoleucina ser aumentada. Isso é significativo na medida em que a produção de aminoácidos de cadeia ramificada pode ser aumentada através do polinucleotídeo que tem uma atividade promotora do presente pedido, em comparação com a cepa de tipo selvagem do gênero Corynebacterium que não pode produzir aminoácidos de cadeia ramificada ou pode produzir o mesmo em uma quantidade muito reduzida.
[0050] Ainda outro aspecto do presente pedido fornece um método para aumentar a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, incluindo: adicionar a sequência polinucleotídica a um microrganismo.
[0051] Ainda outro aspecto do presente pedido fornece uma utilização da sequência polinucleotídica para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada.
[0052] Além disso, outro aspecto do presente pedido fornece uma utilização do microrganismo para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada.
[0053] O “aumento na produção de aminoácidos L de cadeia ramificada” refere-se a um aumento na produtividade de aminoácidos L de cadeia ramificada que permite a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada com alto rendimento, em comparação com um microrganismo antes de incluir a sequência polinucleotídica, ou seja, um microrganismo não modificado.
[0054] O “polinucleotídeo” e “aminoácidos L de cadeia ramificada” são os mesmos descritos acima.
[0055] Doravante, o presente pedido será descrito em detalhes por meio de Exemplos. No entanto, esses exemplos são dados apenas para fins ilustrativos, e o escopo da invenção não se destina a ser limitado a ou por esses Exemplos.
[0056] A fim de selecionar cepas mutantes com produtividade de valina aumentada, a cepa produtora de valina de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (patente coreana n° 10-1117022) foi semeada em um meio nutriente contendo ágar e cultivada a 30 °C durante 36 horas. Centenas de colônias assim obtidas foram irradiadas com UV à temperatura ambiente para induzir uma mutação aleatória no genoma da cepa.
[0057] O experimento de titulação de fermentação das cepas, nas quais a mutação aleatória foi induzida, foi realizado a fim de selecionar cepas mutantes com produtividade aumentada de L-valina em relação à Corynebacterium glutamicum KCCM11201P usada como cepa parental. Cada colônia foi subcultivada em meio nutriente e, em seguida, cada cepa foi semeada em um balão com defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de produção e cultivado a 30 °C durante 72 horas a 200 rpm com agitação. Depois disso, a concentração de L-valina foi analisada usando HPLC, e a concentração analisada de L-valina é mostrada na Tabela 1 abaixo. <Meio Nutriente (pH 7,2)> Glicose 10 g, Extrato de Carne 5 g, Polipeptona 10 g, Cloreto de Sódio 2,5 g, Extrato de Levedura 5 g, Agar 20 g, Ureia 2 g (com base em 1 l de água destilada) <Meio de Produção (pH 7,0)> Glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, Proteína de Soja 2,5 g, Sólidos de Maceração de Milho 5 g, Ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4-7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina -HCl 1 mg, Pantotenato de Cálcio 2 mg, Nicotinamida 3 mg, CaCO3 30 g (com base em 1 l de água destilada) TABELA 1
[0058] Com referência à Tabela 1, em comparação com a cepa KCCM11201P de controle, a cepa C10 com o maior aumento na produção de valina foi selecionada.
[0059] Os principais genes da cepa C10 com maior produtividade de valina foram sequenciados e comparados com os da cepa KCCM11201P e a cepa de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum ATCC14067. Como resultado, foi confirmado que a cepa C10 continha um transposon em uma posição específica.
[0060] Especificamente, na C10, foi confirmado que o transposon representado pela SEQ ID NO: 3 foi inserido na extremidade 3' da 11a sequência da SEQ ID NO: 5.
[0061] Nos exemplos seguintes, tentou-se determinar se o transposon inserido na posição específica afeta a produção de aminoácidos de cadeia ramificada dos microrganismos do gênero Corynebacterium, isto é, valina, isoleucina e leucina.
[0062] A fim de inserir o transposon representado pela SEQ ID NO: 3 em Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, foi preparado um vetor que contém uma mutação-alvo. Em detalhes, o DNA genômico da cepa C10 foi extraído usando um mini kit de extração de DNA Total G-spin (íntron, n° de cat. 17045) de acordo com o protocolo fornecido no kit, e o DNA genômico foi utilizado como molde para realizar a PCR. As condições de PCR são as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 5 minutos e depois 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos; recozimento a 55 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 150 segundos, seguida de polimerização a 72 °C durante 7 minutos, e um produto de PCR de 1485 pb foi obtido usando o iniciador 1 da SEQ ID NO: 8 e iniciador 2 da SEQ ID NO: 2 (doravante no presente documento referido como “fragmento 1 introduzido por mutação”).
[0063] O fragmento 1 introduzido por mutação obtido foi tratado com a enzima de restrição XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) e, em seguida, ligado a um vetor pDZ (patente coreana n° 10-0924065 e Publicação Internacional n° WO 2008-033001), que foi tratado com a mesma enzima de restrição, utilizando T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA). O gene preparado foi transformado em E. coli DH5α, e então selecionado em um meio LB contendo canamicina. O DNA foi obtido usando um kit de purificação de DNA plasmídeo DNA-spin (iNtRON), e o vetor pDZ- PNCgl2472(Tn) contendo o fragmento 1 introduzido por mutação foi preparado. TABELA 2
[0064] Em seguida, o pDZ-PNCgl2472(Tn) foi transformado no Corynebacterium glutamicum KCCM11201P por recombinação homóloga no cromossomo (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). A cepa introduzida com o vetor no cromossomo por recombinação homóloga foi selecionada em um meio contendo 25 mg/l de canamicina. Em seguida, uma cepa na qual o transposon da SEQ ID NO: 3 foi inserido na extremidade 3' da 11a sequência da SEQ ID NO: 5 foi confirmado por PCR usando o iniciador 1 da SEQ ID NO: 8 e iniciador 2 da SEQ ID NO: 9 com base no transformante Corynebacterium glutamicum em que a recombinação secundária foi completada. A cepa recombinante Corynebacterium glutamicum KCCM11201P-PNCgl2472-Tn foi denominada CA08-1533 e depositada com o n° de acesso KCCM12707P.
[0065] A avaliação do frasco foi realizada para comparar a produtividade de valina das cepas produtoras de valina, Corynebacterium glutamicum KCCM11201P e CA08-1533. Cada cepa foi subcultivada em um meio nutriente e, em seguida, cada cepa foi semeada em um frasco com defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de produção e cultivado a 30 °C durante 72 horas a 200 rpm com agitação. Depois disso, a concentração de L-valina foi analisada usando HPLC, e a concentração analisada de L-valina é mostrada na Tabela 3 abaixo. <Meio Nutriente (pH 7,2)> Glicose 10 g, Extrato de Carne 5 g, Polipeptona 10 g, Cloreto de Sódio 2,5 g, Extrato de Levedura 5 g, Agar 20 g, Ureia 2 g (com base em 1 l de água destilada) <Meio de Produção (pH 7,0)> Glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, Proteína de Soja 2,5 g, Sólidos de Maceração de Milho 5 g, Ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4-7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina -HCl 1 mg, Pantotenato de Cálcio 2 mg, Nicotinamida 3 mg, CaCO3 30 g (com base em 1 l de água destilada) TABELA 3 PRODUTIVIDADE DE L-VALINA DE KCCM11201P E CA08-1533
[0066] Como resultado, foi confirmado que a produtividade de L-valina da cepa CA08-1533 foi aumentada em 7,4 % em comparação com KCCM11201P.
[0067] A fim de examinar se o efeito do aumento da produtividade de L- valina também é mostrado em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-valina, um tipo de mutação (ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, junho de 2014, Volume 19, edição 3, páginas 45-467) foi introduzido em um Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo selvagem para preparar uma cepa que tem produtividade de L-valina melhorada.
[0068] Em detalhes, o DNA genômico da cepa Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo selvagem foi extraído usando um mini kit de extração de DNA Total G-spin (íntron, n° de cat. 17045) de acordo com o protocolo fornecido no kit. O DNA genômico foi usado como molde para realizar a PCR. Para construir um vetor para introduzir a mutação A42V no gene ilvN, um conjunto de iniciador do iniciador 3 (SEQ ID NO: 10) e iniciador 4 (SEQ ID NO: 11) e um conjunto de iniciador do iniciador 5 (SEQ ID NO: 12) e iniciador 6 (SEQ ID NO: 13) foram usados para obter fragmentos de DNA (A, B), respectivamente. As condições de PCR são as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 5 minutos e depois 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos; recozimento a 55 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 60 segundos, seguida de polimerização a 72 °C durante 7 minutos.
[0069] Como resultado, foram obtidos fragmentos A e B, cada um com um polinucleotídeo de 537 pb. A PCR sobreposta foi realizada com base nesses dois fragmentos como modelo usando o iniciador 3 da SEQ ID NO: 10 e iniciador 6 da SEQ ID NO: 13. Um produto de PCR de 1044 pb foi obtido (doravante no presente documento referido como “fragmento 2 introduzido por mutação”).
[0070] O fragmento 2 introduzido por mutação obtido foi tratado com a enzima de restrição XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA), e então ligado a um vetor pDZ, que havia sido tratado com a mesma enzima de restrição, usando T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA). O gene preparado foi transformado em E. coli DH5α, e então selecionado em um meio LB contendo canamicina. O DNA foi obtido usando um kit de purificação de DNA plasmídeo DNA-spin (iNtRON). O vetor para a introdução da mutação A42V no gene ilvN foi denominado pDZ-ilvN(A42V). TABELA 4
[0071] Em seguida, o pDZ-ilvN(A42V) foi transformado em Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo selvagem por recombinação homóloga no cromossomo (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). A cepa introduzida com o vetor no cromossomo por recombinação homóloga foi selecionada em um meio contendo 25 mg/l de canamicina.
[0072] O fragmento do gene foi amplificado com base no transformante Corynebacterium glutamicum, no qual a recombinação secundária foi completada por PCR usando o iniciador 3 da SEQ ID NO: 10 e iniciador 6 da SEQ ID NO: 13, e a cepa introduzida por mutação foi confirmada por análise de sequenciamento. A cepa recombinante foi denominada Corynebacterium glutamicum CJ7V.
[0073] Por fim, uma cepa transformada com pDZ-PNCgl2472(Tn) foi preparada da mesma maneira que no Exemplo 3-1 com base em Corynebacterium glutamicum CJ7V e denominada CJ7V-PNCgl2472-Tn. Especificamente, em CJ7V- PNCgl2472-Tn, foi confirmado que o transposon representado pela SEQ ID NO: 3 foi inserido na extremidade 3' da 11a sequência da SEQ ID NO: 5.
[0074] A fim de comparar a produtividade de L-valina das cepas preparadas, as cepas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 3-1 e, em seguida, a concentração de L-valina foi analisada e as concentrações de L-valina analisadas são mostradas na Tabela 5 abaixo. TABELA 5 PRODUTIVIDADE DE L-VALINA DE CJ7V E CJ7V-PNCgl2472-Tn
[0075] Como resultado, foi confirmado que a produtividade de L-valina da cepa CJ7V-NCgl2472(Tn) foi aumentada em 9,4 % em comparação com CJ7V.
[0076] A fim de examinar se o efeito do aumento da produtividade da L- valina também é mostrado em outras cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-valina, um tipo de mutação (ilvN(A42V)) foi introduzido em um Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem para preparar uma cepa que tem produtividade de L-valina, e a cepa recombinante foi denominada Corynebacterium glutamicum CJ8V.
[0077] A fim de inserir o transposon representado pela SEQ ID NO: 3 no Corynebacterium glutamicum CJ8V, foi preparado um vetor que contém uma mutação-alvo. Em detalhes, o DNA genômico da cepa C10 foi extraído usando um mini kit de extração de DNA Total G-spin (intron, n° de cat. 17045) de acordo com o protocolo fornecido no kit, e o DNA genômico foi utilizado como molde para realizar a PCR. As condições de PCR são as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 5 minutos e depois 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos; recozimento a 55 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 150 segundos, seguida de polimerização a 72 °C durante 7 minutos, e um produto de PCR de 1082 pb (fragmento A') foi obtido usando o iniciador 1 da SEQ ID NO: 8 e iniciador 7 da SEQ ID NO: 14. Além disso, o DNA genômico da cepa ATCC13869 foi extraído usando um mini kit de extração de DNA Total G-spin (intron, n° de cat. 17045) de acordo com o protocolo fornecido no kit, e o DNA genômico foi utilizado como molde para realizar a PCR. As condições de PCR são as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 5 minutos e depois 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos; recozimento a 55 °C durante 30 segundos; e alongamento de polimerização a 72 °C durante 150 segundos, seguido de alongamento a 72 °C durante 7 minutos, e um produto de PCR de 328 pb (fragmento B') foi obtido usando o iniciador 2 da SEQ ID NO: 9 e iniciador 8 da SEQ ID NO: 15. A PCR sobreposta foi realizada com base nesses dois fragmentos como modelo usando o iniciador 1 (SEQ ID NO: 8) e iniciador 2 (SEQ ID NO: 9). Um produto de PCR de 1390 pb foi obtido (doravante no presente documento referido como “fragmento 3 introduzido por mutação”).
[0078] O fragmento 3 introduzido por mutação obtido foi tratado com a enzima de restrição XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) e, em seguida, ligado a um vetor pDZ (patente coreana n° 10-0924065 e Publicação Internacional n° WO 2008-033001), que foi tratado com a mesma enzima de restrição, utilizando T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA). O gene preparado foi transformado em E. coli DH5α, e então selecionado em um meio LB contendo canamicina. O DNA foi obtido usando um kit de purificação de DNA plasmídeo DNA-spin (iNtRON), e o vetor pDZ- PNCgl2472(Tn)-1 contendo o fragmento 3 introduzido por mutação foi preparado. As sequências de iniciador usadas são mostradas na Tabela 6 abaixo. TABELA 6
[0079] O pDZ-PNCgl2472(Tn)-1 foi transformado na cepa produtora de L-valina, Corynebacterium glutamicum CJ8V, por recombinação homóloga no cromossomo da mesma maneira que no Exemplo 3-1, e denominada CJ8V- PNCgl2472-Tn-1. Especificamente, em CJ8V-PNCgl2472-Tn-1, foi confirmado que o transposon representado pela SEQ ID NO: 3 foi inserido na extremidade 3' da 11a sequência da SEQ ID NO: 5.
[0080] A fim de confirmar a produtividade de L-valina da cepa CJ8V- PNCgl2472-Tn-1 preparada acima, a cepa foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 3-1 para analisar a concentração de L-valina e a concentração de L-valina analisada é mostrada na Tabela 7 abaixo. TABELA 7 PRODUTIVIDADE DE L-VALINA DE CJ8V E CJ8V-PNCgl2472-Tn
[0081] Como resultado, foi confirmado que a produtividade de L-valina da cepa CJ8V-PNCgl2472-Tn-1 foi aumentada em 8,7 % em comparação com CJ8V.
[0082] O pDZ-PNCgl2472(Tn)-1 e pDZ-PNCgl2472(Tn) foram transformados em cepas produtoras de L-leucina de Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (patente coreana n° 10-1851898) e KCCM11662P (patente coreana n° 10-1796830) por recombinação homóloga no cromossomo (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), respectivamente. As cepas introduzidas com o vetor no cromossomo por recombinação homóloga foram selecionadas em meio contendo 25 mg/l de canamicina. Em seguida, as cepas nas quais o transposon foi inserido no cromossomo foram confirmadas por PCR utilizando o iniciador 1 da SEQ ID NO: 8 e iniciador 2 da SEQ ID NO: 9 com base nos transformantes de Corynebacterium glutamicum nos quais a recombinação secundária foi completada. As cepas recombinantes foram denominadas Corynebacterium glutamicum KCCM11661P-PNCgl2472-Tn e KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1, respectivamente.
[0083] O experimento da titulação de fermentação foi realizado para comparar a produtividade de leucina de Corynebacterium glutamicum KCCM11661P- PNCgl2472-Tn-1 e KCCM11662P-PNCgl2472-Tn. Cada cepa foi subcultivada em um meio nutriente e, em seguida, cada cepa foi semeada em um frasco com defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de produção e cultivado a 30 °C durante 72 horas a 200 rpm com agitação. Depois disso, a concentração de L-leucina foi analisada usando HPLC, e a concentração analisada de L-leucina é mostrada na Tabela 7 abaixo. <Meio Nutriente (pH 7,2)> Glicose 10 g, Extrato de Carne 5 g, Polipeptona 10 g, Cloreto de Sódio 2,5 g, Extrato de Levedura 5 g, Agar 20 g, Ureia 2 g (com base em 1 l de água destilada) <Meio de Produção (pH 7,0)> Glicose 50 g, (NH4)2SO4 20 g, Sólidos de Maceração de Milho 20 g, KH2PO4 1 g, MgSO47H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1 mg, CaCO3 15 g (com base em 1 l de água destilada) TABELA 8 PRODUTIVIDADE DE L-LEUCINA DE KCCM11661P, KCCM11661P- PNCgl2472-Tn, KCCM11662P E KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1
[0084] Como resultado, foi confirmado que a produtividade de L-leucina das cepas KCCM11661P-PNCgl2472-Tn e KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1 foi aumentada em cerca de 10 % em comparação com KCCM11661P e KCCM11662P, respectivamente.
[0085] Foi preparada uma cepa na qual a cepa produtora de L-isoleucina de Corynebacterium glutamicum KCCM11248P (patente coreana n° 10-1335789) foi inserida por recombinação homóloga no cromossomo da mesma maneira que no Exemplo 3-1 acima, e a cepa foi nomeada KCCM11248P-PNCgl2472-Tn-1.
[0086] A cepa KCCM11248P-PNCgl2472-Tn-1 foi cultivada da seguinte maneira para avaliar a produtividade de isoleucina.
[0087] Cada cepa foi semeada em um frasco com defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semeadura e cultivado a 30 °C durante 20 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, 1 ml da solução de cultura de sementes foi semeado em um frasco com defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado a 30 °C durante 48 horas a 200 rpm com agitação. As composições do meio de sementes e meio de produção são mostradas abaixo. <Meio de Inoculação (pH 7,0)> Glicose 20 g, Peptona 10 g, Extrato de Levedura 5 g, Ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO47H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1000 μg, Cálcio Pantotenato 2000 μg, Nicotinamida 2000 μg (com base em 1 l de água destilada) <Meio de Produção (pH 7,0)> Glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, Proteína de Soja 2,5 g, Sólidos de Maceração de Milho 5 g, Ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4-7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1000 μg, Pantotenato de Cálcio 2000 μg, Nicotinamida 3000 μg, CaCO3 30 g (com base em 1 l de água destilada).
[0088] Após a conclusão da cultura, a concentração de L-isoleucina foi medida por HPLC. As concentrações medidas de L-lisina são mostradas na Tabela 9 abaixo. TABELA 9 PRODUTIVIDADE DE L-ISOLEUCINA DE KCCM11248P E KCCM11248P- PNCgl2472-Tn-1
[0089] Como resultado, foi confirmado que a produtividade de L- isoleucina da cepa KCCM11248P-PNCgl2472-Tn foi aumentada em cerca de 34 % em comparação com KCCM11248P.
[0090] A partir do supracitado, uma pessoa versada na técnica à qual o presente pedido pertence poderá entender que o presente pedido pode ser incorporado a outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais do presente pedido. Nesse sentido, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são para fins ilustrativos apenas e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo do presente pedido. Pelo contrário, o presente pedido destina-se a abranger não apenas as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem estar incluídas no espírito e no escopo do presente pedido, conforme definido pelas reivindicações anexas. N.° DE DEPÓSITO INSTITUIÇÃO DEPOSITÁRIA: KOREAN CULTURE CENTER OF MICROORGANISMS (AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL) N° de Acesso: KCCM12707P Data de Depósito: 20200427
Claims (4)
1. Microrganismo de Corynebacterium glutamicum para a produção de ami- noácidos L de cadeia ramificada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência polinucleotídica representada pela SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17.
2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 é uma sequência derivada de um microrganismo que contém a mesma.
3. Composição para a produção de aminoácidos L de cadeia ramificada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o microrganismo, como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Método para produzir aminoácidos L de cadeia ramificada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium, como definido na rei-vindicação 1 ou 2, em um meio; e recuperar aminoácidos L de cadeia ramificada do meio ou de uma cultura do mesmo.
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| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
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