BR112021012630A2 - Poxvírus modificado, método para produzir o poxvírus modificado e composição - Google Patents

Abstract

POXVÍRUS MODIFICADO, MÉTODO PARA PRODUZIR O POXVÍRUS MODIFICADO E COMPOSIÇÃO. A presente invenção está no campo dos vírus oncolíticos. A invenção fornece novos poxvírus que são manipulados para serem defeituosos na função codificada pelo locus M2L (ou seja, função m2). Esses poxvírus carecem de uma atividade de ligação funcional m2 para pelo menos um dos, ou ambos, antígenos coestimuladores, CD80 e CD86. Os referidos poxvírus oncolíticos são preferencialmente vírus vaccinia com uma deleção total ou parcial do locus M2L. A presente invenção também se refere às células e composições compreendendo tais poxvírus e o uso das mesmas no tratamento de doenças proliferativas, como cânceres e na prevenção de doenças (vacinação, especialmente no campo veterinário). Mais precisamente, a invenção fornece uma alternativa aos vírus oncolíticos existentes que são amplamente usados em viroterapia. Os poxvírus com defeito em m2 são particularmente úteis para a expressão de polipeptídeos imunomoduladores, tais como anticorpos anti-CTLA-4, com o objetivo de estimular ou melhorar a resposta imune.

Description

“POXVÍRUS MODIFICADO, MÉTODO PARA PRODUZIR O POXVÍRUS MODIFICADO E COMPOSIÇÃO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção está no campo dos vírus oncolíticos. A invenção fornece novos poxvírus que são projetados para serem defeituosos na função codificada pelo locus M2L (ou seja, função m2). Esses poxvírus carecem de uma atividade de ligação funcional m2 a pelo menos um, ou ambos, antígenos coestimuladores, CD80 e CD86. Os referidos poxvírus oncolíticos são de preferência vírus vaccinia com uma deleção total ou parcial do locus M2L. A presente invenção também refere-se às células e composições compreendendo tais poxvírus e o uso das mesmas no tratamento de doenças proliferativas, como cânceres e na prevenção de doenças (vacinação, especialmente no campo veterinário). Mais precisamente, a invenção fornece uma alternativa aos vírus oncolíticos existentes que são amplamente usados em viroterapia. Os poxvírus com defeito em m2 são particularmente úteis para a expressão de polipeptídeos imunomoduladores, tais como anticorpos anti-CTLA-4, com o objetivo de estimular ou melhorar a resposta imune.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A cada ano, câncer é diagnosticado em mais de 12 milhões de indivíduos em todo o mundo. Nos países industrializados, aproximadamente uma em cada cinco pessoas morre de câncer. Embora exista um grande número de quimioterápicos, eles são frequentemente ineficazes, especialmente contra tumores malignos e metastáticos que se estabelecem em um estágio muito inicial da doença.

[003] A viroterapia oncolítica vem emergindo há duas décadas com base em vírus competentes para replicação para destruir células cancerosas (Russell et al., 2012, Nat. Biotechnol. 30 (7): 658-70). Numerosos estudos pré-clínicos e clínicos estão atualmente em andamento para avaliar em vários tipos de câncer o potencial terapêutico de vírus oncolíticos armados com uma variedade de genes terapêuticos.

[004] Genes terapêuticos são geralmente inseridos no genoma viral dentro de genes não essenciais para reter o fenótipo oncolítico. A inserção no locus J2R (tk) é amplamente utilizada no estado da técnica, na medida em que também facilita a identificação de vírus recombinantes na presença de BUdR (Mackett et al., 1984 J. of Virol., 49: 857–64; Boyle et al., 1985, Gene 35, 169–177). No entanto, outros loci também foram propostos, por exemplo, no fragmento Hind F, no locus M2L (Smith et al., 1993, Vaccine 11(1) : 43-53 ; Guo et al., 1990, J. Virol. 64: 2399-2406; Bloom et al., 1991, J. Virol. 65(3): 1530-42; Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54: 5552-5; McLaughlin et al., 1996, Cancer Res. 56: 2361-67) e locus A56R (codificante da hemaglutinina (HA)).

[005] Os Poxvírus e especialmente vírus vaccinia (VV) forneceram vários candidatos oncolíticos promissores (De Graaf et al., 2018, doi.org/10.1016/j.cytogfr.2018.03.006), como JX594 (Sillajen/Transgene), GL- ONC1 (Genelux), TG6002 (Transgene) e vvDD-CDSR (Universidade de Pittsburg). Esses VV oncolíticos se originam de diferentes cepas de VV com diversas modificações genômicas e expressão de vários genes terapêuticos. A cepa JX-594 (cepa Wyeth) atenuada por meio da deleção do gene J2R viral (que codifica a timidina quinase (tk)) e ainda armado com GM-CSF está atualmente sob avaliação clínica em um ensaio clínico randomizado de Fase III em carcinoma hepatocelular (Parato et al., 2012, Molecular Therapy 20 (4): 749-58). O GL-ONC1 foi gerado inserindo três cassetes de expressão, respectivamente, no lugar dos loci F14.5L, J2R e A56R do genoma da cepa viral parental Lister. Na mesma linha, TG6002, um J2R (tk) e I4L (locus I4L codifica uma ribonucleotídeo redutase (rr-))-VV defeituosa (cepa Copenhagen) que codifica a enzima FCU1 que converte a 5-fluorocitosina não tóxica (5-FC)

em 5-fluorouracila (5-FU) citotóxica está sendo avaliado em alguns ensaios clínicos. A deleção dupla tk- e rr- restringe a replicação do vírus em células contendo um grande pool de nucleosídeos(nucleotídeos), tornando o TG6002 incapaz de se replicar em células em repouso (Foloppe et al., 2008, Gene Ther.

15: 1361-71; WO2009/065546). O vvDD-CDSR está sendo atualmente testado em pacientes com tumores cutâneos e subcutâneos refratários. Ele foi projetado por deleção dupla dos genes que codificam tk (locus J2R) e fator de crescimento do vírus vaccinia (vgf) e armado com um gene de citosina desaminase (CD) para a conversão de 5-FC em 5-FU e um gene do receptor de somatostatina (SR) para imagem in vivo.

[006] Inicialmente, pensava-se que a oncólise direta era o único mecanismo pelo qual os vírus oncolíticos exerciam seus efeitos antitumorais.

Apenas recentemente, foi reconhecido que o sistema imunológico desempenha um papel crítico no sucesso da viroterapia (Chaurasiya et al., 2018, Current Opinion in Immunology 51: 83-90). No entanto, a maioria dos vírus desenvolveu mecanismos de autodefesa por meio de um repertório de proteínas envolvidas na evasão e modulação imunológica destinadas a bloquear muitas das estratégias empregadas pelo hospedeiro para combater infecções virais (Smith e Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28 (3): 149-85). Além disso, as células tumorais também desenvolveram um mecanismo de exaustão de células T para escapar do sistema imunológico do hospedeiro, que é caracterizado pela suprarregulação de receptores inibitórios; CTLA-4 (para proteína-4 associada a linfócitos T citotóxicos; também conhecida como CD152) e PD-1 (para proteína de morte celular programada–1) e seus ligantes PD-L1 e PD-L2, sendo os mais documentados. Esses receptores imunossupressores servem como pontos de verificação (checkpoints) imunológicos, atuando em diferentes níveis de imunidade das células T. CTLA-4 inibe estágios iniciais de ativação de células T no linfonodo e também estimula Treg indesejáveis, enquanto PD-1 atua em um estágio posterior.

[007] Mais especificamente, uma ativação de células T envolve a interação de ligantes coestimuladores, como CD80 (também designado B7-1) e CD86 (também designado B7.2), presentes na superfície da APC (células apresentadoras de antígenos) com receptores presentes na superfície de células T, como CD28, CTLA-4 e PDL-1. O CD80 é o ligante para esses 3 receptores de superfície celular, enquanto o CD86 se liga ao CD28 e ao CTLA-

4. O receptor de CD28 é expresso constitutivamente em células T em repouso e a ligação de CD28 aos ligantes CD80 e CD86 coestimuladores fornece um sinal estimulador positivo para células T, induzindo-as a proliferar e secretar IL- 2 e inibindo a apoptose por meio do aumento da expressão de Bcl-XL (Chen, 2004, Nat. Rev. Immunol. 4: 336–347). Em contraste, CTLA-4 ou PD-L1 desempenham um papel na regulação negativa de células T após a ativação inicial das células T (para CTLA-4) ou em um estágio posterior (para PD-L1).

Especificamente, após a ligação com ligantes coestimuladores, CD80 e CD86, o CTLA-4 atua em cis nas células T ativadas para se opor ao sinal coestimulador fornecido pelas interações de CD28 com CD80 e CD86, e está envolvido na produção de IL-10. Além disso, o CTLA-4 é expresso constitutivamente em um subconjunto de células T reguladoras (Treg) imunossupressoras. Por outro lado, a ligação de CD80 ao PD-L1 na superfície de células T reguladoras demonstrou aumentar a proliferação dessas células imunossupressoras (Yi, 2011, J Immunol. 186: 2739-2749). O CTLA-4 foi identificado em 1987 (Brunet et al, 1987, Nature 328:. 267-70) e é codificado pelo gene CTLA4 (Dariavach et al., Eur J. Immunol. 18: 1901-5). A sequência de ácido nucleico completa do CTLA-4 pode ser encontrada sob o Nº de Acesso do GenBank: Ll 5006.

[008] Tem havido um interesse crescente no bloqueio de tais pontos de verificação imunossupressores como um meio de resgatar células T antitumorais esgotadas. Um grande número de anticorpos antagonistas foi desenvolvido durante a última década (Kahn et al., 2015, J. Oncol. Doi:

10.1155/2015/847383) e vários foram aprovados pelo FDA, dos quais o primeiro era contra CTLA-4 (por exemplo Ipilimumabe/Yervoy, Bristol-Myers Squibb) e PD-1 (pembrolizumabe/Keytruda desenvolvido pela Merck e Nivolumabe/Optivo desenvolvido pela BMS). Embora os tratamentos convencionais se baseiem na administração de anticorpos aos pacientes, a vetorização por vírus ou vetores plasmidiais está agora sendo considerada para entregar esses anticorpos diretamente às células tumorais (consulte, por exemplo, o documento WO2016/008976). Por exemplo, um tk- e rr- VV armado com anti-PD-1 mostrou induzir o controle do crescimento tumoral no modelo de camundongo MCA-205 (Kleinpetter et al., 2016, OncoImmunology 5 (10): e1220467).

[009] No entanto, devido à natureza complexa dessas moléculas que interagem com a imunidade e vetores virais e ao risco de desencadear eventos em cascata, estudos pré-clínicos e até mesmo clínicos podem ser difíceis de ser implementados.

[010] Portanto, ainda há uma necessidade de desenvolver vírus oncolíticos adicionais, composições e métodos para distribuição de polipeptídeos terapêuticos, tais como anticorpos antagonistas direcionados a pontos de verificação para aumentar as respostas imunes adaptativas antitumorais em pacientes com câncer.

PROBLEMA TÉCNICO E SOLUÇÃO PROPOSTA

[011] Inesperadamente, os inventores identificaram que os sobrenadantes de células infectadas com o vírus vaccinia (VV) interagem com os ligantes CD80 e CD86 coestimuladores, ao passo que os sobrenadantes de células infectadas com o vírus vaccinia Ankara modificado (MVA) atenuado carecem desta propriedade. Os inventores atribuíram as propriedades de ligação de CD80 e CD86 à proteína M2 codificada pelo locus VV M2L. Antes da invenção, M2 foi relatado como uma proteína retida no retículo endoplasmático agindo como um inibidor da via NFκb (Hinthong et al., 2008, Virology 373 (2): 248-62) e envolvida na remoção do revestimento do vírus (Baoming Liu et al., 2018, J. Virol. 92 (7) e02152-17). Além do VV, os inventores identificaram a existência de ortólogos de M2 em vários poxvírus replicativos.

[012] A presente invenção ilustra a capacidade da proteína M2 de se ligar ao CD80 e CD86 e impactar três vias imunossupressoras; respectivamente, i) bloquear as interações de CD80 e CD86 com CD28; ii) promover a interação de CD80 com PD-L1; e iii) desencadear uma sinalização reversa para as células CD80/CD86–positivas.

[013] No contexto da presente invenção, os inventores geraram um vírus vaccinia que é defeituoso para a função m2. Quando armado com um polipeptídeo imunomodulador, como um anticorpo anti-CTLA-4, sua expressão inibe os sinais imunossupressores mediados por CTLA-4 e espera-se que a ausência de m2 permita redirecionar a resposta das células T aos sinais imunoestimuladores mediados por CD28 ao passo que um vírus vaccinia positivo para M2L interferiria negativamente com tais sinais positivos mediados por CD28 devido à ligação de m2 aos ligantes coestimuladores CD80 e CD86.

[014] De maneira importante e surpreendente, espera-se que os poxvírus descritos na presente invenção estimulem ou melhorem a resposta imune, especialmente a resposta mediada por linfócitos, contra um antígeno devido à ausência de síntese de uma proteína m2 funcional nas células infectadas, enquanto que em um poxvírus convencional (M2L-positivo), a proteína m2 viral produzida se ligaria a ligantes coestimuladores CD80 e CD86 e, assim, evitaria as vias positivas mediadas por CD28. Além disso, os poxvírus descritos na presente invenção exibem uma propensão aumentada para serem aceitos pelo sistema imunológico do hospedeiro, uma vez que carecem de uma proteína envolvida na evasão imunológica do vírus; cujo recurso fornece uma vantagem competitiva sobre os poxvírus M2-positivos. A presente invenção oferece um produto único que combina oncólise para matar células em divisão e atividades imunoestimulatórias, por exemplo, para interromper a exaustão imunológica associada ao câncer, melhorando assim as capacidades terapêuticas do vírus oncolítico.

[015] Este problema técnico é resolvido pelo fornecimento de exemplos de realização, conforme definido nas reivindicações. Outros aspectos, características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição dos exemplos de realização presentemente preferidas da invenção. Estes exemplos de realização são fornecidos para fins de divulgação.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[016] A divulgação refere-se a poxvírus, especialmente poxvírus oncolíticos, que foram projetados para ser defeituosos para a proteína m2 codificada pelo locus M2L e métodos de geração e uso de tais vírus. Conforme divulgado no presente documento, foram gerados e isolados poxvírus defeituosos para a função m2 codificada pelo locus M2L, opcionalmente em combinação com outra(s) inativação(ões) funcional(ais) do locus codificante de tk e/ou locus codificante de rr. Os vírus vaccinia defeituosos em m2 projetados para expressarem um anticorpo anti-CTLA4 também são contemplados.

[017] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um poxvírus modificado cujo genoma compreende no contexto nativo (tipo selvagem) um locus M2L que codifica uma proteína poxviral m2 funcional e que é modificado para ser defeituoso para a referida função m2; em que a referida proteína poxviral m2 funcional é capaz de se ligar a ligantes coestimuladores CD80 ou CD86, ou ambos os ligantes coestimuladores CD80 e CD86, e em que a referida função m2 defeituosa é incapaz de ligar os referidos ligantes coestimuladores CD80 e CD86.

[018] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado é gerado ou obtido de um Chordopoxvirinae, de preferência selecionado a partir do grupo de gêneros que consiste em Avipoxvírus, Capripoxvírus, Leporipoxvírus, Molluscipoxvírus, Orthopoxvírus, Parapoxvírus, Suipoxvírus, Cervidpoxvírus e Yatapoxvírus. Em um exemplo de realização preferido, o referido poxvírus modificado é um membro do Orthopoxvírus, de preferência selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da vaccinia (VV), varíola bovina (CPXV), varíola de guaxinim (RCN), varíola de coelho, varíola de macaco, varíola equina, volepox, varíola de gambá, varíola menor (smallpox) e varíola de camelos; com preferência específica para um vírus vaccinia modificado.

[019] Em um exemplo de realização, a incapacidade de ligação aos referidos ligantes coestimuladores CD80 e CD86 se origina de uma lesão genética dentro do locus M2L ou de uma interação anormal que prejudica a função m2 direta ou indiretamente. A(s) referida(s) lesão(ões) genética(s) incluem deleção parcial ou total e/ou uma ou mais mutação(ões) não silenciosa(s) (que se traduz em uma mudança de resíduo(s) de aminoácido(s)) dentro da sequência codificante de m2 ou nos elementos reguladores que controlam a expressão de M2L, de preferência levando à síntese de uma proteína m2 defeituosa ou à falta de síntese de m2. A referida lesão genética é preferencialmente uma deleção parcial ou total do locus M2L.

[020] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado é adicionalmente modificado em uma região diferente do locus M2L; em particular no locus J2R (resultando em um poxvírus modificado defeituoso para ambas as funções, m2 e tk) ou no locus/loci I4L/F4L (resultando em um poxvírus modificado defeituoso para ambas as funções, m2 e rr). De preferência, o poxvírus modificado é adicionalmente modificado nos loci J2R e

I4L/F4L, resultando em um poxvírus modificado defeituoso para atividades m2, tk e rr.

[021] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado é oncolítico.

[022] Em um exemplo de realização, o referido poxvírus modificado é recombinante. O referido poxvírus modificado é preferencialmente projetado para expressar pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeos antigênicos, polipeptídeos com função de modulação de pool de nucleosídeos(nucleotídeos) e polipeptídeos imunomoduladores. O referido polipeptídeo imunomodulador é desejavelmente selecionado a partir do grupo que consiste em citocinas, quimiocinas, ligantes e anticorpos ou qualquer combinação dos mesmos. Em um exemplo de realização preferido, o referido poxvírus modificado é defeituoso para atividades m2, tk e rr e codifica um anticorpo anti-CTLA-4. Em outro exemplo de realização preferido, o referido poxvírus modificado é defeituoso para atividades m2, tk e rr e codifica um anticorpo anti-PD-L1.

[023] De acordo com outro aspecto, é fornecido um método para produzir o poxvírus modificado compreendendo as etapas de a) preparar uma linhagem de células produtoras, b) transfectar ou infectar a linhagem de células produtoras preparada com o poxvírus modificado, c) cultivar a linhagem de células transfectadas ou infectadas sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus, d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da referida linhagem de células produtoras e opcionalmente; e) purificar o referido vírus recuperado.

[024] De acordo com outro aspecto, é fornecida uma posição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do poxvírus modificado e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição desejavelmente compreende de aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 pfu,

vantajosamente de aproximadamente 104 pfu a aproximadamente 1011 pfu, preferivelmente de aproximadamente 105 pfu a aproximadamente 1010 pfu; e mais preferencialmente de aproximadamente 106 pfu a aproximadamente 109 pfu de poxvírus modificado. A composição é preferencialmente formulada para administração intravenosa ou intratumoral.

[025] Em outro aspecto, a composição é para uso no tratamento ou prevenção de uma doença proliferativa selecionada a partir do grupo que consiste em cânceres, bem como doenças associadas a um aumento da atividade de osteoclastos, como artrite reumatoide e osteoporose e doenças cardiovasculares, tal como reestenose. O câncer a ser tratado ou prevenido é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em câncer renal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, carcinoma do ducto biliar, câncer endometrial, câncer pancreático e câncer de ovário. O poxvírus modificado e a composição são para uso como terapia autônoma ou em conjunto com uma ou mais terapias adicionais, de preferência selecionadas a partir do grupo que consiste em cirurgia, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia com toxinas, imunoterapia, terapia com citocinas, terapia do câncer direcionada, terapia gênica, terapia fotodinâmica e transplante.

[026] Em outro aspecto, o poxvírus ou composição modificada é para uso para estimular ou melhorar uma resposta imune.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[027] A Figura 1 ilustra ensaios de ELISA competitivo de CD80/CTLA4 (1A) e CD86/CTLA4 (1B) realizados com os sobrenadantes coletados de células aviárias DF1 não infectadas (linha pontilhada) ou infectadas com VV tipo selvagem (diamante), ou Yervoy (triângulo invertido). A ligação de proteínas B7-Fc marcadas com His (His-tagged) ao CTLA4-Fc imobilizado foi realizada usando um anticorpo anti-His-tag conjugado com HRP.

[028] A Figura 2 ilustra o ensaio ELISA competitivo de CD80/CTLA4 realizado com os sobrenadantes coletados de células HeLa infectadas com MVA (MVA), vírus vaccinia da cepa Copenhagen (Cop VV), cepa Western Reserve (WR VV), cepa Wyeth (Wyeth VV), varíola do guaxinim (RCN), varíola do coelho (RPX), varíola bovina (CPX), varíola aviária (FPV) e pseudocowpox (PCPV) e o sobrenadante de células HeLa não infectadas (controle negativo).

[029] A Figura 3 ilustra um Western blot realizado em SDS-PAGE não redutor com sobrenadantes de células CEF não infectadas (Sup.cells) ou infectadas com MVA (Sup.MVA) ou com vírus vaccinia Copenhagen (Sup.VV) coletados diretamente ou concentrados 20 vezes (x20) e sondado com fusões de CD86 humano com fragmento Fc (hCD86-Fc), CD80 humano com fragmento Fc (hCD80-Fc) e CTLA4 humano com fragmento Fc (hCTLA4-Fc). A detecção foi realizada com um anticorpo conjugado anti-Fc.

[030] A Figura 4 ilustra um ensaio ELISA competitivo testando a interação de CD80 biotinilado e CD86 biotinilado com seus receptores cognatos, CD28/CD86, CD28/CD80, CTLA4/CD80 e PDL1/CD80, respectivamente. Os sobrenadantes coletados a partir de células CEF infectadas com MVA (MVA) e vírus vaccinia da cepa Copenhagen (VV) são comparados com o sobrenadante de células CEF não infectadas (CEF) (controlo negativo) e anticorpo Yervoy (10 µg/mL). A reatividade de PD1 humano recombinante (hPD1), CD80 humano (hCD80) e CTLA4 humano (hCTLA4) todos a 10 µg/mL foi usada como controle positivo para competir com a interação PDL1/CD80. A detecção das proteínas B7 biotiniladas ligadas foi realizada usando estreptavidina conjugada com HRP.

[031] A Figura 5A ilustra a abordagem experimental usada para identificar o “fator de interferência (IF)” por cromatografia de afinidade com fusão CD86-Fc imobilizada e a Figura 5B fornece a sequência do IF capturado em células CEF infectadas com VV.

[032] A Figura 6 ilustra o ELISA competitivo para CD80/CTLA4 realizado com os sobrenadantes coletados de células HeLa ou DF1 não infectadas (HeLa ou DF1) como controles negativos ou infectadas com um vírus vaccinia Copenhagen com dupla deleção (tk- rr-) (VVTG18277) ou vírus vaccinia Copenhagen com tripla deleção (tk- rr- m2-) (COPTG19289). A ligação de proteínas CD80-Fc marcadas com His (His-tagged) ao CTLA4-Fc imobilizado foi monitorada usando um anticorpo anti-His-tag conjugado com HRP.

[033] A Figura 7 ilustra a atividade oncolítica do vírus vaccinia tk- rr- m2- (COPTG19289) e sua contraparte tk- rr- (VVTG18277) quatro dias após a infecção de células LOVO (A) e HCT116 (B) em diferentes MOI (de 10 -1 a 10- 4). As células com tratamento simulado (mock) são usadas como controle negativo.

[034] A Figura 8 ilustra a expressão de luciferase em camundongos C57BL/6 implantados por via subcutânea com tumores B16F10.

O vírus VVTG18277 e COPTG19289 (107 pfu) foram injetados intratumoralmente no dia 0, 3, 6, 10 e 14 e as amostras de tumor foram coletadas no dia 1, 2, 6, 9, 13 e 16 para avaliação da atividade da luciferase por grama do tumor (RLU/g de tumor). Três camundongos foram incluídos por ponto de tempo.

[035] A Figura 9 ilustra a atividade antitumoral em camundongos Balb/c implantados subcutaneamente com tumores CT26. 10 7 pfu de VVTG18277 (quadrado), COPTG19289 (triângulo) ou Mock (círculo) foram injetados intratumoralmente em D0, D3, D6, D10 e D14 (10 camundongos/grupo). O crescimento do tumor foi acompanhado duas vezes por semana (camundongos foram mortos quando o volume do tumor atingiu 2000 mm3).

[036] A Figura 10 ilustra a atividade antitumoral em camundongos Swiss Nude implantados subcutaneamente com tumores HT116.

Os camundongos (10 camundongos/grupo) receberam uma única injeção por via intravenosa a D10 quando do tumor atingiu 100 a 200 mm 3 de 105 (A) ou 107 (B) pfu de VVTG18277 (círculo), COPTG19289 (quadrado) ou Mock (diamante). Foi feito um acompanhamento do crescimento tumoral duas vezes por semana.

[037] A Figura 11 ilustra o efeito do sobrenadante de células infectadas por poxvírus M2 defeituoso na reação de linfócitos mistos (MLR).

PBMCs foram purificadas a partir de dois doadores diferentes e cultivadas na presença de sobrenadantes obtidos de CEF infectado (MOI 0,05) com COPTG19289 (tk-, rr- e m2-), VVTG18 058 (tk- rr-) ou MVAN33 (tipo selvagem).

Os sobrenadantes da cultura foram coletados 48h após a infecção e concentrados cerca de 20 vezes. Estes sobrenadantes concentrados foram adicionados à cultura de PBMCs (20 μL em 200 μL), quer não diluído ou diluído 10 ou 100 vezes para se obter uma “concentração de sobrenadante” final de 2, 0,2 e 0,02 vezes, respectivamente. A quantidade de IL-2 secretada no meio de cultura de PBMCs foi medida por ELISA. A medição de IL-2 foi feita em triplicatas para cada amostra testada. As medições foram normalizadas por divisão da média da concentração de IL-2 das três réplicas de uma dada amostra pela média da concentração de IL-2 das três repetições de PBMC incubadas com meio.

[038] A Figura 12 ilustra o efeito no volume tumoral fornecido pelo COPTG19289 defeituoso em M2 em um modelo de camundongo humanizado. Camundongos imunodeficiente NOD/Shi-scid/IL-2R γ nulos (CLG) foram humanizados com células-tronco humanas CD34+ e enxertados com células de carcinoma colorretal humano 116-HCT (5x106 células injetadas S.C.

no flanco de um camundongo; representando D0). Doze dias após o implante

(D12), os camundongos receberam uma injeção IV única de COPTG19289 (TD) ou a contraparte VVTG18058 m2 + homóloga (DD) em doses de 10 6 pfu (A) ou 105 pfu (B). Os camundongos tratados com veículo foram usados como controles negativos. O crescimento do tumor foi monitorado ao longo de 60 dias após a implantação de células. O crescimento tumoral médio em mm 3 está representado para cada grupo em função do número de dias após a injeção das células.

[039] A Figura 13 ilustra o efeito sobre a sobrevivência fornecida pelo COPTG19289 M2–defeituoso no modelo de camundongo humanizado NCG-CD34+ descrito acima. Doze dias após o implante do tumor (D12), os camundongos receberam uma injeção IV única de COPTG19289 (TD) ou a contraparte VVTG18058 m2+ homóloga (DD) em doses de 106 pfu (A) ou 105 pfu (B). Os camundongos tratados com veículo foram usados como controles negativos. A sobrevida dos camundongos foi monitorada ao longo de 90 dias após a implantação das células. A sobrevivência (porcentagem) é dada para cada grupo em função do número de dias após a injeção de células.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES GERAIS

[040] Uma série de definições que ajudará na compreensão da invenção é fornecida na presente invenção. No entanto, a menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente pedido têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto ao qual a presente invenção pertence. Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência em sua totalidade.

[041] Conforme utilizado em todo o relatório descritivo, os termos “um” e “uma” são utilizados no sentido de “pelo menos um”, “pelo menos um primeiro”, “um ou mais” ou “uma variedade” dos referidos componentes ou etapas, a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma variedade de células, incluindo misturas destas.

[042] O termo “um ou mais” refere-se a um ou a um número acima de um (por exemplo, 2, 3, 4, etc.).

[043] O termo "e/ou" sempre que utilizado no presente, inclui o significado de "e", "ou" e “toda ou qualquer outra combinação dos elementos ligados pelo referido termo".

[044] O termo “cerca de” ou “aproximadamente”, conforme utilizado no presente, significa dentro de 20%, preferencialmente dentro de 10%, e mais preferencialmente dentro de 5% de um dado valor ou intervalo.

[045] Tal como utilizado na presente invenção, quando usado para definir produtos e composições, os termos “compreender” (e qualquer forma de compreender, tal como “compreende” e “compreendendo”), “ter” (e qualquer forma de ter, tal como “tem” e “tendo”), “incluir” (e qualquer forma de incluir, como “inclui” e “incluindo”) ou “conter” (e qualquer forma de conter, como “contém” e “contendo”) são termos abertos e não excluem elementos ou etapas de métodos adicionais não citados. Assim, um polipeptídeo “compreende” uma sequência de aminoácidos quando a sequência de aminoácidos for pelo menos uma parte da sequência de aminoácidos final do polipeptídeo. “Consistindo em” significa excluir outros componentes ou etapas de qualquer significado essencial. Dessa forma, uma composição consistindo dos componentes recitado não excluiria a existência de contaminantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis. Um polipeptídeo “consistindo em” uma sequência de aminoácidos refere-se à presença de tal sequência de aminoácidos com opcionalmente apenas alguns resíduos de aminoácidos adicionais e não essenciais. No entanto, é preferido que o polipeptídeo não contenha quaisquer aminoácidos, mas a sequência de aminoácidos recitada.

Na presente descrição, o termo “compreendendo” (especialmente quando se refere a uma sequência específica) pode ser substituído por “consistindo em”, se necessário.

[046] No contexto da presente invenção, os termos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polinucleotídeo” e “sequência de nucleotídeos” são usados indistintamente e definem um polímero de qualquer comprimento de qualquer um dos polidesoxirribonucleotídeos (DNA) (por exemplo, cDNA, genômico DNA, DNA plasmidial, vetores, genomas virais, DNA isolado, sondas, iniciadores (primers) e qualquer mistura dos mesmos) ou polirribonucleotídeos (RNA) (por exemplo, mRNA, RNA antissenso, siRNA) ou polirribo-polidesoxirribonucleotídeos mistos. Eles abrangem polinucleotídeos de fita simples (única) ou dupla, lineares ou circulares, naturais ou sintéticos, modificados ou não modificados.

[047] O termo “polipeptídeo” deve ser entendido como um polímero de pelo menos nove resíduos de aminoácidos ligados por meio de ligações peptídicas, independentemente de seu tamanho e da presença ou não de componentes pós-tradução (por exemplo, glicosilação). Nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos compreendidos em um polipeptídeo. Como uma indicação geral, o termo refere-se a polímeros curtos (tipicamente designados na técnica como peptídeo) e polímeros mais longos (tipicamente designados na técnica como polipeptídeo ou proteína). Este termo abrange polipeptídeos nativos, polipeptídeos modificados (também designados derivados, análogos, variantes ou mutantes), fragmentos polipeptídicos, multímeros polipeptídicos (por exemplo, dímeros), polipeptídeos de fusão entre outros. O termo também se refere a um polipeptídeo recombinante expresso a partir de uma sequência polinucleotídica que codifica o referido polipeptídeo.

Tipicamente, isso envolve a tradução do ácido nucleico codificante em uma sequência de mRNA e sua tradução pela maquinaria ribossomal da célula à qual a sequência polinucleotídica é distribuída.

[048] O termo “identidade” refere-se a uma correspondência de aminoácido para aminoácido ou nucleotídeo para nucleotídeo entre duas sequências de polipeptídeo ou ácido nucleico. A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas (gaps) que precisam ser introduzidas para o alinhamento ideal e o comprimento de cada lacuna. Vários programas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis na técnica para determinar a porcentagem de identidade entre sequências de aminoácidos, como, por exemplo, o programa BLAST disponível no NCBI ou ALIGN em Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, Supl., 3: 482-9), ou o algoritmo de Needleman e Wunsh (J.Mol. Biol. 48,443-453, 1970). Os programas para determinar a identidade entre sequências de nucleotídeos também estão disponíveis em bancos de dados especializados (por exemplo, Genbank, programas do Wisconsin Sequence Analysis Package, BESTFIT, FASTA e GAP). Os versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo sobre as sequências a serem comparadas. Para fins ilustrativos, “pelo menos 70%” significa 70% ou mais (incluindo 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, enquanto “pelo menos 80% de identidade” significa 80% ou mais (incluindo 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% e “pelo menos 90%” 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%).

[049] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “isolado” refere-se a um componente (por exemplo, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vírus, vetor, etc.), que é removido de seu ambiente natural (isto é,

separado de (pelo menos) outro(s) componente(s) com o qual está naturalmente associado ou encontrado na natureza). Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos é isolada quando é separada de sequências normalmente associadas a ela na natureza (por exemplo, dissociada de um genoma), mas pode ser associada às sequências heterólogas.

[050] O termo “obtido de”, “originário” ou “originar” e qualquer equivalente do mesmo é usado para identificar a fonte original de um componente (por exemplo, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vírus, vetor, etc.), mas o termo não se destina a limitar o método pelo qual o componente é feito, que pode ser, por exemplo, por síntese química ou por meios recombinantes.

[051] Conforme usado neste documento, o termo “célula hospedeira” deve ser entendido amplamente, sem qualquer limitação em relação à organização particular em tecido, órgão ou células isoladas. Essas células podem ser de um único tipo de células ou um grupo de diferentes tipos de células, como linhagens celulares em cultura, células primárias e células em divisão. No contexto da invenção, o termo “células hospedeiras” refere-se mais particularmente a células eucarióticas e, notavelmente, a células de mamíferos (por exemplo, humanas ou não humanas), bem como a células capazes de produzir os poxvírus descritos na invenção. Este termo também inclui células que podem ser ou foram receptoras dos poxvírus aqui descritos, bem como a progênie de tais células.

[052] O termo “sujeito” geralmente se refere a um organismo para o qual qualquer poxvírus, composição e método da invenção é(são) necessário(s) ou pode(m) ser benéfico(s). Normalmente, o organismo é um mamífero, particularmente um mamífero selecionado a partir do grupo que consiste em animais domésticos, animais de fazenda, animais esportivos e primatas. De preferência, o sujeito é um ser humano que foi diagnosticado como portador ou em risco de ter uma doença proliferativa, como um câncer.

Os termos “sujeito” e “pacientes” podem ser usados de forma indistinta quando se referem a um organismo humano e abrangem indivíduos masculinos e femininos. O sujeito a ser tratado pode ser um recém-nascido, criança, jovem adulto, adulto ou um idoso.

[053] O termo “tratamento” (e qualquer forma de tratamento, como “tratando”, “tratar”), tal como utilizado na presente invenção, abrange a profilaxia (por exemplo, medida preventiva em um sujeito em risco de ter a condição patológica a ser tratada) e/ou terapia (por exemplo, em um sujeito diagnosticado como tendo a condição patológica), eventualmente em associação com modalidades terapêuticas convencionais. O resultado do tratamento é retardar, curar, melhorar ou controlar a progressão da condição patológica alvo. Por exemplo, um sujeito é tratado com sucesso para um câncer se após a administração de um poxvírus aqui descrito, o sujeito mostra uma melhora observável de seu estado clínico.

[054] O termo “administração” (ou qualquer forma de administração, como “administrado”), conforme utilizado na presente invenção, refere-se à entrega a um sujeito de um agente terapêutico, como o poxvírus aqui descrito.

[055] O termo “combinação” ou “associação”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer arranjo possível de vários componentes (por exemplo, um poxvírus e uma ou mais substâncias eficazes na terapia anticâncer). Tal arranjo inclui a mistura dos referidos componentes, bem como combinações separadas para administrações concomitantes ou sequenciais. A presente invenção abrange combinações compreendendo concentrações molares iguais de cada componente, bem como combinações com concentrações muito diferentes. Compreende-se que a concentração ótima de cada componente da combinação pode ser determinada pelo especialista versado no assunto.

“POXVÍRUS COM DEFEITO EM M2”

[056] Em um aspecto, a presente invenção provê um poxvírus modificado cujo genoma compreende no contexto nativo (tipo selvagem) um locus M2L que codifica uma proteína poxviral m2 funcional e que é modificado para ser defeituoso para a referida função m2; em que a referida proteína poxviral m2 funcional é capaz de se ligar a ligantes coestimuladores CD80 ou CD86, ou ambos os ligantes coestimuladores CD80 e CD86, e em que a referida função m2 defeituosa é incapaz de ligar aos referidos ligantes coestimuladores CD80 e CD86.

[057] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “poxvírus” ou “poxviral” refere-se a qualquer vírus Poxviridae atualmente identificado ou posteriormente identificado que é infeccioso para uma ou mais células de mamíferos (por exemplo, células humanas) e cujo genoma compreende no contexto nativo (ou seja, tipo selvagem) um locus M2L que codifica uma assim chamada proteína M2 funcional. O termo “vírus”, conforme usado no contexto de poxvírus ou qualquer outro vírus aqui mencionado, abrange o genoma viral, bem como a partícula viral (genoma encapsulado e/ou envelopado).

[058] Os poxvírus são uma ampla família de DNA vírus contendo um genoma de fita dupla. Como a maioria dos vírus, os poxvírus desenvolveram mecanismos de autodefesa por meio de um repertório de proteínas envolvidas na evasão e modulação imunológica destinada a bloquear muitas das estratégias empregadas pelo hospedeiro para combater infecções virais (Smith e Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28 (3): 149-85). Normalmente, o genoma do poxvírus codifica mais de 20 modificadores de resposta do hospedeiro que permitem ao vírus manipular as respostas imunes do hospedeiro e, assim, facilitar a replicação, disseminação e transmissão do vírus. Estes incluem fatores de crescimento, proteínas antiapoptóticas, inibidores da via NF-κB e sinalização de interferon e reguladores negativos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

[059] Para orientação geral, o genoma do vírus vaccinia (VV) tipo selvagem compreende um locus M2L cuja sequência codificante codifica uma proteína chamada m2 produzida durante o estágio inicial do ciclo de vida do vírus. Ela é secretada ou está localizada no retículo endoplasmático (RE) e provavelmente é glicosilada (Hinthong et al., 2008, Virology 373: 248-262).

Embora sua função ainda esteja sob investigação, ela está envolvida na remoção do núcleo e na replicação do DNA viral (Liu et al., 2018, J. Virol., Doi/10.1128/JVI.02152-17), mas é dispensável para a replicação viral in vitro (Smith, 1993, Vaccine 11: 43-53). Além disso, sua função de regulação negativa do fator de transcrição NF-κB celular via inibição da fosforilação Erk1 está agora bem estabelecida (Gedey et al., 2006, J. Virol. 80: 8676-85) sugerindo, portanto, que m2 está envolvida na resposta antiviral do hospedeiro durante a infecção por poxvírus. O locus “M2L” do VV está presente na terceira parte 5' do genoma do VV tipo selvagem; especificamente, a sequência codificante está localizada entre a posição 27324 e a posição 27986 do genoma do VV Copenhagen (Cop). O produto do gene codificado por Cop M2L é uma proteína de 220 aminoácidos (tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1; também divulgada na Uniprot sob o número de acesso: P21092) e composta por um polipeptídeo maduro com 203 resíduos de aminoácidos incluindo 8 resíduos Cys e um peptídeo sinal longo de 17 resíduos de aminoácidos N-terminais também possuindo um resíduo Cys.

[060] O genoma do poxvírus no contexto nativo é um DNA de fita dupla de aproximadamente 200 kb e tem o potencial de codificar cerca de 200 proteínas com diferentes funções, incluindo um locus M2L. A sequência genômica e as fases de leitura aberta (ORFs) codificadas são bem conhecidas.

O poxvírus modificado da invenção compreende um genoma que foi modificado pelas mãos do homem para ser pelo menos defeituoso para a função m2 codificada por um locus M2L nativo, e pode compreender ainda uma ou mais modificações adicionais, tais como aquelas descritas na presente invenção.

IDENTIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE UM LOCUS M2L DENTRO DE UM GENOMA DE

POXVÍRUS

[061] A determinação se um determinado poxvírus compreende ou não no contexto nativo um locus M2L que codifica uma proteína m2 funcional está ao alcance do versado na técnica usando a informação fornecida na presente invenção e o conhecimento geral na técnica. A escolha particular da tecnologia de ensaio não é crítica e está ao alcance dos versados na técnica adaptar qualquer uma dessas metodologias convencionais à determinação se um poxvírus candidato compreende um locus M2L que codifica uma proteína m2 funcional.

[062] Em um exemplo de realização, um locus M2L pode ser identificado em um determinado poxvírus por hibridização ou técnicas de PCR usando a informação fornecida no presente documento e projetando sondas ou iniciadores apropriados para rastrear a sequência genômica do poxvírus. Para orientação geral, os ensaios de hibridização são tipicamente baseados em sondas oligonucleotídicas derivadas das informações de sequência de nucleotídeos (nt) conhecidas aqui apresentadas para o locus M2L a ser detectado com ácidos nucleicos extraídos de células infectadas ou contendo tal poxvírus candidato, sob condições adequadas para hibridização. A sonda de oligonucleotídeo é um pedaço curto de RNA ou DNA de fita simples (geralmente de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento) que é projetada para ser complementar (ou seja, ter pelo menos 80% de identidade) com a sequência M2L alvo. As sondas são preferencialmente marcadas para permitir a detecção (por exemplo, sondas marcadas com radioatividade, fluorescência ou enzimaticamente). A hibridização é geralmente realizada em condições rigorosas, permitindo que apenas híbridos específicos sejam formados.

[063] Em outro exemplo de realização alternativo, a presença de um locus M2L no genoma de um determinado poxvírus pode ser identificada com base na sequência de aminoácidos do produto do gene codificado. Por exemplo, a presença de um locus M2L pode ser identificada por análise de tradução da sequência genômica e pesquisa blast das sequências de aminoácidos das fases de leitura abertas (ORFs) codificadas em bancos de dados disponíveis contra as proteínas poxvirais m2 conhecidas, como Cop VV m2 (SEQ ID NO: 1) ou a proteína tipo gp-120 do vírus mixoma (SEQ ID NO: 2) para pesquisar a presença de uma ORF codificada exibindo pelo menos 40%, desejavelmente pelo menos 50%, de preferência, pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80% e como uma preferência absoluta pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2.

[064] Alternativamente ou adicionalmente, as sequências de aminoácidos das ORFs codificadas pelo genoma do poxvírus podem ser alinhadas contra bancos de dados disponíveis. O poxvírus candidato é considerado como compreendendo um locus M2L se codificar uma chamada família de polipeptídeos m2 que dá um resultado após a pesquisa em bancos de dados de domínio (por exemplo, Gene3D, PANTHER, Pfam, PIRSF, PRINTS, ProDom, PROSITE, SMART, SUPERFAMILY ou TIGRFAMs) que é o mesmo que o resultado da proteína VV m2 (referenciado na Uniprot sob o número de acesso P21092; também divulgado aqui como SEQ ID NO: 1).

Portanto, um poxvírus candidato é identificado como compreendendo um locus M2L se ele codificar um polipeptídeo que, quando submetido a uma análise Blast usando os bancos de dados citados acima, é atribuído na Uniprot um motivo PFAM n° PF04887 ou um motivo Interpro n° IPR006971.

FUNCIONALIDADE DA PROTEÍNA M2 CODIFICADA.

[065] Uma proteína m2 funcional, conforme utilizada na presente invenção, refere-se à capacidade da referida proteína de se ligar aos ligantes CD80 e/ou CD86 coestimuladores, seja in vitro ou in vivo. A capacidade de um poxvírus em codificar um polipeptídeo m2 funcional pode ser avaliada por técnicas de rotina. Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de uma proteína ao seu alvo são conhecidos no estado da técnica, incluindo, por exemplo, ensaios Biacore™, calorimetria, fluorometria, interferometria de biocamada, imunoblot (por exemplo, Western blot), RIAs, citometria de fluxo e ELISAs. A escolha particular da tecnologia de ensaio não é crítica e está ao alcance dos versados na técnica adaptar qualquer uma dessas metodologias convencionais para determinar se uma proteína m2 candidata liga-se a ligantes CD80 e/ou CD86 coestimuladores.

[066] Por exemplo, os sobrenadantes de células infectadas com o poxvírus candidato podem ser usados para sondar CD80 ou CD86 imobilizados na placa (ELISA) ou exibidos na superfície celular (FACS). Os ensaios de ELISA competitivos em formato sanduíche (consulte a seção Exemplo) são particularmente apropriados devido ao fato de que não há necessidade de gerar uma proteína recombinante marcada para obter um resultado. Por exemplo, as placas de ELISA podem ser revestidas com um ligante de interesse (por exemplo, CD86-Fc) antes de adicionar a amostra a ser testada (por exemplo, um sobrenadante de células infectadas com um poxvírus). Se a amostra compreender um polipeptídeo M2, ele se ligará ao ligante revestido. Em seguida, um ligante de detecção é adicionado, o qual geralmente é marcado para ser detectado, por exemplo, pela ação de uma enzima que converte a substância de marcação em um produto colorido que pode ser medido usando um leitor de placa (por exemplo, CTLA4-Fc com um His-tag reconhecido por anticorpos anti–His-tag acoplados a HRP (para peroxidase de rábano). Uma redução da detecção cromogênica na presença de uma amostra candidata em comparação com nenhuma amostra ou uma amostra de controle negativo é indicativo de que a amostra contém um polipeptídeo M2 competindo com o ligante de detecção pela ligação. Pode-se também proceder de forma contrária, por exemplo, usando CTLA-4-Fc como ligante revestido e CD80-Fc-His-tag como ligante de detecção.

[067] “Defeituoso para a função m2” ou “função m2 defeituosa”, conforme utilizado na presente invenção, pretende significar a incapacidade de uma proteína m2 de se ligar a ligantes coestimuladores CD80 e/ou CD86 de maneira in vitro ou in vivo. Esta incapacidade pode originar-se de uma lesão genética dentro do locus M2L nativo que impede a atividade de ligação normal da proteína m2 codificada. Assim, a inativação funcional pode resultar de uma ou mais mutação(ões) no locus M2L. Tal mutação é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em inserções, deleções e alterações de base na sequência codificante ou nas sequências regulatórias que controlam a expressão da proteína m2. Alternativamente, a inativação funcional pode ocorrer pela interação anormal da proteína m2 com um ou mais produtos gênicos diferentes que se ligam a ou de outra forma impedem a atividade funcional da referida proteína m2.

[068] Para orientação geral, os inventores identificaram de fato um locus M2L (que codifica uma proteína m2 funcional ou seu ortólogo) em uma grande variedade de poxvírus, conforme descrito a seguir; mais especificamente em sete cepas de vírus vaccinia, em sete cepas de vírus mixoma, em 4 cepas de vírus da varíola de macaco, em várias cepas de vírus da varíola bovina, em oito cepas de vírus da varíola, bem como em uma variedade de outros poxvírus incluindo, mas não se limitando a, de vírus da varíola de cavalo, vírus Taterapox, Camelpox, Raccoonpox, Shunkpox, Yokapox, vírus do fibroma de coelho, vírus de Murmansk pox (Murmansk pox),

Eptesipox, caríola de veado (Deerpox), Tanapox, vírus cotia e Volepox. Para fins ilustrativos, os ortólogos da proteína M2 codificados de varíola equina (horsepox), vírus Varíola, varíola de macacos (monkeypox), varíola de camelos (camelpox), varíola bovina (cowpox) exibem mais de 90% de identidade com a proteína Cop m2 de referência (como representado pela SEQ ID NO: 1) e aqueles dos vírus mixoma, Skunk, Cotia e Volepox mostram, respectivamente, 50%, 74%, 70% e 72% de identidade de sequência com a proteína CopVV m2, conforme ilustrado na Tabela 1.

[069] A Tabela 1 fornece uma visão geral dos números de acesso do Genbank para as sequências genômicas de vários poxvírus compreendendo um locus M2L no contexto nativo e uma indicação da identidade de aminoácidos de sua proteína m2 em relação à proteína Cop m2 (número de acesso da Uniprot P21092 e SEQ ID NO: 1). % de identidade de Gênero Nome do Poxvírus Referência no Genbank proteína Vírus vaccinia AAA48004.1 100 Vírus da varíola do coelho AAS49736.1 100 (rabbitpox) Vírus da varíola equina ABH08137.1 99 (Horsepox) Vírus da varíola bovina ADZ29155.1 e 99 e 92 (cowpox) SNB53780.1 Vírus da varíola do macaco AAY97225.1 98 (Monkeypox) ortopoxvírus Varíola maior AAA60767.1 97 Vírus Taterapox ABD97599.1 97 Vírus da varíola de camelos AAL73736.1 96 (Camelpox) Vírus da varíola de guaxinim AKJ93661.1 75 (Raccoonpox) Vírus Skunkpox AOP31509.1 74 Vírus Volepox AOP31720.1 72 Não classificado Vírus Cotia AFB76918.1 70 Vírus Yokapox AEN03759.1 60 Centapoxvírus Vírus de Murmansk AST09387.1 58 (Murmansk pox) Leporipoxvírus Vírus do fibroma de coelho AAF18030.1 50

% de identidade de Gênero Nome do Poxvírus Referência no Genbank proteína Vírus mixoma AAF15042.1 50 Não classificado Vírus Eptesipox ASK51372.1 34 Vírus Tanapox ABQ43480.1 32 Yatapoxvírus Vírus da doença semelhante CAC21247.1 29 a Yaba Não classificado Vírus da varíola do cervo ABI99004.1 28 Cervidpoxvírus (deerpox) (W-1170-84) Vírus da varíola do cervo Não classificado (deerpox) (Varíola de veado- AUI80579.1 28 de-cauda-branca)

[070] Por razões de clareza, a nomenclatura do gene aqui usada para designar o locus M2L do poxvírus e a proteína m2 codificada é a do vírus vaccinia (e mais especificamente a da cepa Copenhagen). Ela também é usada na presente divulgação para outros poxvírus contendo genes M2L e proteínas m2 funcionalmente equivalentes àquelas aqui referidas, a menos que indicado de outra forma. De fato, o gene e a respectiva nomenclatura do produto gênico podem ser diferentes de acordo com as famílias, gêneros e cepas de poxvírus, mas as correspondências entre o vírus vaccinia e outros poxvírus estão geralmente disponíveis na literatura. Para fins ilustrativos, equivalentes do gene M2L do VV são designados M154L no genoma do mixoma, CPXV040 ou P2L no genoma da varíola bovina, O2L no genoma da varíola do macaco, RPXV023 no genoma da varíola do coelho e O2L ou Q2L no genoma do vírus da varíola.

[071] No entanto, o genoma de alguns poxvírus, como o vírus vaccinia atenuado MVA (vírus vaccinia Ankara modificado) e o vírus pseudovaríola bovina (PCPV), no contexto nativo, carece de um locus M2L (Antoine et al., 1998, Virology 244 (2) 365-96) devido às grandes deleções genômicas que ocorreram durante o processo de atenuação. No contexto da invenção, o termo “poxvírus” não inclui poxvírus que, no contexto nativo, têm deleção(ões) genômica(s) ou mutação(ões) que abrangem o locus M2L (ou equivalente) que, portanto, carece de um polipeptídeo m2 ou codifica uma proteína m2 não funcional, como vírus da pseudovaríola bovina (PCPV), vírus MVA e NYVAC.

[072] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado da presente invenção é gerado ou obtido de um Chordopoxvirinae, de preferência selecionado a partir do grupo de gêneros que consiste em Avipoxvírus, Capripoxvírus, Leporipoxvírus, Molluscipoxvírus, Orthopoxvírus, Parapoxvírus, Suipoxvírus, Cervidpoxvírus e Yatapoxvírus. As sequências genômicas desses poxvírus estão disponíveis na técnica, principalmente em bancos de dados especializados, como Genbank ou Refseq.

[073] Em um exemplo de realização preferido, o poxvírus modificado é gerado ou obtido a partir de um Ortopoxvírus. Embora qualquer Ortopoxvírus possa ser usado, ele é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em vírus vaccinia (VV), varíola bovina (cowpox) (CPXV), varíola do guaxinim (RCN), varíola do coelho (rabbitpox), varíola do macaco (monkeypox), varíola equina (horsepox), Volepox, Skunkpox, vírus da varíola (varíola menor) e varíola do camelo (camelpox). É particularmente preferido um vírus vaccinia. Qualquer cepa de vírus vaccinia é apropriada no contexto da presente invenção (exceto MVA) incluindo, sem limitação, as cepas Western Reserve (WR), Copenhagen (Cop), Lister, LIVP, Wyeth, Tashkent, Tian Tan, Brighton, Ancara, LC16M8, LC16M0, etc., com uma preferência específica para as cepas Lister, WR, Copenhagen e Wyeth. As suas sequências genômicas estão disponíveis na literatura e no Genbank (por exemplo, sob os números de acesso AY678276 (Lister), M35027 (Cop), AF095689 1 (Tian Tan) e AY243312.1 (WR). Esses vírus também podem ser obtidos a partir de coleções de vírus (por exemplo, ATCC VR-1354 para WR, ATCC VR-1536 para Wyeth e ATCC VR-1549 para Lister).

[074] Em outro exemplo de realização, o poxvírus modificado é gerado ou obtido a partir do gênero Leporipoxvírus, com uma preferência para o vírus mixoma (cujas sequências genômicas são divulgadas no Genbank sob o número de acesso: NP_051868.1). O locus ortólogo M2L no vírus mixoma é designado locus M154L e codifica uma proteína chamada gp120-like que possui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e exibe 50% de identidade com a proteína m2 codificada pela cepa Cop (SEQ ID NO: 1).

FUNÇÃO M2 DEFEITUOSA

[075] Conforme descrito acima, a incapacidade de uma proteína m2 para se ligar a ligantes coestimuladores CD80 e/ou CD86 pode se originar de uma lesão genética no locus M2L ou de uma interação anormal que prejudica a função m2 direta ou indiretamente. Especificamente, uma “função m2 defeituosa” refere-se a uma capacidade reduzida em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mesmo a incapacidade total de ligação ao CD80 (por exemplo, humano) e CD86 (por exemplo, humano) em comparação com uma proteína m2 nativa (por exemplo, como uma encontrada em sobrenadantes de células infectadas com um poxvírus positivo para m2) conforme medido por um ensaio convencional, tal como um ensaio ELISA competitivo.

[076] Um poxvírus modificado pode ser projetado de modo a ser defeituoso para a função m2 por uma série de maneiras conhecidas pelos versados na técnica usando técnicas moleculares convencionais. Em um exemplo de realização preferido, o poxvírus modificado compreende pelo menos uma lesão genética no locus M2L nativo que resulta na expressão suprimida da proteína m2 pelo vírus. Tais lesões genéticas incluem deleção parcial ou total e/ou uma ou mais mutações não silenciosas (que se traduzem em uma mudança de resíduo(s) de aminoácido(s)) dentro da sequência codificante m2 ou nos elementos reguladores controlando a expressão M2L. A(s) referida(s) lesão(ões) genética(ões) conduz(em) preferencialmente à síntese de uma proteína m2 defeituosa (incapaz de assegurar a atividade da proteína nativa como descrito acima) ou à ausência de síntese de m2 (nenhuma proteína). Por exemplo, a referida lesão genética é uma deleção parcial ou total do locus M2L, por exemplo, uma deleção parcial que se estende desde a montante das sequências codificante m2 até pelo menos 100 códons da sequência codificante m2. Alternativamente, ou em combinação, o locus M2L pode ser modificado por mutação pontual (por exemplo, introdução de um códon de parada dentro da sequência codificante), mutação de alteração da Fase de Leitura (frameshift mutation) (de modo a modificar a fase de leitura), mutação de inserção (por inserção de um ou mais nucleotídeo(s) que interrompem a sequência codificante) ou por deleção ou substituição de um ou mais resíduos envolvidos ou responsáveis pela função de ligação ao CD80 e/ou CD86 ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, um ácido nucleico estranho pode ser introduzido na sequência codificante para interromper a fase de leitura aberta de m2. Além disso, o promotor do gene pode ser deletado ou mutado, inibindo assim a expressão de M2L. Um versado na técnica, com base na presente divulgação, determinaria prontamente se uma modificação particular inativa funcionalmente m2, comparando a proteína m2 tipo selvagem e mutada quanto à sua capacidade de se ligar a CD80 e/ou CD86, conforme ilustrado na seção do Exemplo.

OUTRAS MODIFICAÇÕES DE POXVÍRUS

[077] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado da presente invenção é adicionalmente modificado em uma região diferente do locus M2L. Várias modificações adicionais podem ser contempladas no contexto da invenção.

[078] Uma ou mais modificação(ões) adicional(ais) abrangida(s) pela presente invenção afeta(m), por exemplo, a atividade oncolítica (por exemplo, a replicação melhorada em células em divisão), segurança (por exemplo, seletividade para o tumor), e/ou a imunidade induzida por vírus em comparação com um poxvírus sem tais modificações. Modificações exemplares referem-se preferencialmente a genes virais envolvidos no metabolismo do DNA, virulência do hospedeiro ou via do IFN (veja, por exemplo, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11 (5): 595-608).

[079] Um gene particularmente adequado para ser interrompido é o locus codificante de timidina quinase (tk) (J2R; número de acesso do Genbank AAA48082). A enzima tk está envolvida na síntese de desoxirribonucleotídeos. A tk é necessária para a replicação viral em células normais, uma vez que essas células geralmente têm baixa concentração de nucleotídeos, ao passo que é dispensável em células em divisão que contêm alta concentração de nucleotídeos. Além disso, os vírus defeituosos de tk são conhecidos por terem uma seletividade aumentada para células tumorais. Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado é ainda modificado no locus J2R (preferência para modificação resultando em uma expressão suprimida da proteína tk viral), resultando em um poxvírus modificado defeituoso para funções m2 e tk (poxvírus m2- tk-). A deleção parcial ou completa do referido locus J2R, bem como a inserção de ácido nucleico estranho no locus J2R, são contempladas no contexto da presente invenção para inativar a função tk. Tal poxvírus m2- tk- modificado é desejavelmente oncolítico.

[080] Alternativamente ou em combinação com, os poxvírus modificados podem ser adicionalmente modificados, no(s) locus(loci) I4L e/ou F4L (preferências para modificação que leva a uma expressão reprimida da ribonucleotídeo redutase (rr) viral), resultando em um poxvírus modificado deficiente para ambas as funções m2 e rr (poxvírus defeituoso em m2 e rr). No contexto natural, esta enzima catalisa a redução de ribonucleotídeos em desoxirribonucleotídeos que representam uma etapa crucial na biossíntese de DNA. A enzima viral é semelhante em estrutura de subunidade à enzima de mamífero, sendo composta por duas subunidades heterólogas, designadas R1 e R2 codificadas respectivamente pelos locus I4L e F4L. As sequências para os genes I4L e F4L e sua localização no genoma de vários poxvírus estão disponíveis em bancos de dados públicos (vide, por exemplo, o documento WO2009/065546). No contexto da invenção, o poxvírus pode ser modificado no gene I4L (que codifica a subunidade grande r1) ou no gene F4L (que codifica a subunidade pequena r2) ou ambos para fornecer um poxvírus defeituoso rr-.

por exemplo, por deleção parcial ou completa dos referidos locus/loci I4L e/ou F4L. Tal poxvírus m2- rr- modificado é desejavelmente oncolítico.

[081] Também é fornecido um poxvírus adicionalmente modificado nos loci J2R e I4L/F4L (vírus defeituoso triplo com modificações nos loci M2L, J2R e I4L; loci M2L, J2R e F4L ou loci M2L, J2R, I4L e F4L), resultando em um poxvírus modificado defeituoso para atividades m2, tk e rr (poxvírus m2-, tk- e rr-). Tal poxvírus modificado tk- rr- e m2- é desejavelmente oncolítico.

[082] Em um exemplo de realização preferido, tais poxvírus defeituosos duplos e triplos originam-se preferencialmente de um Ortopoxvírus, ou um Leporipoxvírus como descrito acima em conexão com o poxvírus defeituoso em m2. É particularmente preferido um vírus vaccinia oncolítico diferente de MVA, com uma preferência específica para as cepas Lister, WR, Copenhagen, Wyeth. O VV defeituoso para atividades tk e m2 e para atividades tk, rr e m2 são particularmente preferidos, especialmente para uso para estimular ou melhorar uma resposta imune (por exemplo, uma resposta mediada por linfócitos contra um antígeno ou epítopo do mesmo) ou para uso no tratamento de uma doença proliferativa, como descrito na presente invenção.

[083] Outras modificações adicionais adequadas incluem aquelas que resultam na expressão suprimida de um ou mais produtos gênicos virais selecionados a partir do grupo que consiste na hemaglutinina viral

(A56R); o inibidor de serina protease (B13R/B14R), a proteína de ligação ao complemento 4b (C3L), o gene que codifica VGF e o(s) gene(s) modulador(es) de interferon (B8R ou B18R). Outra modificação adequada compreende a inativação do locus F2L resultando em expressão reprimida do dUTPase viral (trifosfatase desoxiuridina) envolvida em manter a fidelidade da replicação de DNA e proporcionando o precursor para a produção de TMP pela timidilato- sintase (documento WO2009/065547).

[084] Quanto ao M2L, a nomenclatura do gene aqui utilizada é a da cepa Cop VV. Ele também é usado aqui para os genes homólogos de outros poxviridaes, a menos que indicado de outra forma, e a correspondência entre Copenhagen e outros poxvírus está disponível para o especialista no assunto.

[085] Em outro exemplo de realização, o poxvírus modificado da presente invenção é oncolítico. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “oncolítico” refere-se à capacidade de um poxvírus de se replicar seletivamente em células em divisão (por exemplo, uma célula proliferativa, como uma célula cancerosa) com o objetivo de retardar o crescimento e/ou lisar a referida célula em divisão, seja in vitro ou in vivo, enquanto mostra nenhuma ou mínima replicação em células que não se dividem (por exemplo, normais ou saudáveis). A “replicação” (ou qualquer forma de replicação, como “replicar” e “replicando”, etc.) significa a duplicação de um vírus que pode ocorrer no nível do ácido nucleico ou, de preferência, no nível da partícula viral infecciosa. O termo “infeccioso” (ou qualquer forma de infeccioso, como infectante, infectar, etc.) denota a capacidade de um vírus de infectar e entrar em uma célula hospedeira ou sujeito. Normalmente, um poxvírus oncolítico contém um genoma viral empacotado em uma partícula viral (genoma encapsulado e/ou envelopado), embora este termo, no contexto da invenção, também possa abranger o genoma viral (por exemplo, DNA genômico) ou parte dele.

POXVÍRUS RECOMBINANTE COM M2 DEFEITUOSO

[086] Em um exemplo de realização, os poxvírus modificados da presente invenção são recombinantes.

[087] O termo “recombinante”, conforme usado na presente invenção, indica que o poxvírus é projetado para expressar pelo menos um ácido nucleico estranho (exógeno) (também chamado de gene, transgene ou ácido nucleico recombinante). No contexto da invenção, o “ácido nucleico estranho” que é inserido no genoma do poxvírus não é encontrado ou expresso por um genoma do poxvírus de ocorrência natural. No entanto, o ácido nucleico estranho pode ser homólogo ou heterólogo ao sujeito no qual o poxvírus recombinante é introduzido. Mais especificamente, pode ser de origem humana ou não (por exemplo, de origem bacteriana, levedura ou viral, exceto poxviral).

Vantajosamente, o referido ácido nucleico recombinante codifica um polipeptídeo ou é uma sequência de ácido nucleico capaz de se ligar, pelo menos parcialmente, (por hibridização) a um ácido nucleico celular complementar (por exemplo, DNA, RNA, miRNA) presente em uma célula doente com o objetivo de inibir um gene envolvido na referida doença. Tal ácido nucleico recombinante pode ser um gene nativo ou porção(ões) do mesmo (por exemplo, cDNA), ou qualquer variante deste obtido por mutação, deleção, substituição e/ou adição de um ou mais nucleotídeos.

[088] Em um exemplo de realização, o ácido nucleico recombinante codifica um polipeptídeo que é de interesse terapêutico ou profilático (ou seja, um polipeptídeo de interesse terapêutico) quando administrado apropriadamente a um sujeito, levando a um efeito benéfico sobre o curso ou sintoma da condição patológica a ser tratada. Um grande número de polipeptídeos de interesse terapêutico pode ser considerado. Em um exemplo de realização preferido, o poxvírus modificado aqui descrito é projetado para expressar pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeos antigênicos (por exemplo, um antígeno vacinal ou associado a tumor), polipeptídeos com função moduladora do pool de nucleosídeos(nucleotídeos) e polipeptídeos imunomoduladores. Um poxvírus modificado recombinante que codifica um produto de gene detectável também pode ser útil no contexto da invenção. Os termos “manipulado”, modificado” e “projetado”, conforme usados na presente divulgação, referem-se à inserção de um ou mais ácidos nucleicos estranhos (ou exógenos) no genoma viral em um locus adequado (por exemplo, no lugar do locus J2R) sob o controle de elementos reguladores apropriados para permitir a expressão do referido ácido nucleico estranho na célula ou organismo hospedeiro.

POLIPEPTÍDEOS IMUNOMODULADORES

[089] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado aqui descrito é projetado para expressar pelo menos um polipeptídeo imunomodulador. O termo “polipeptídeo imunomodulador” refere-se a um polipeptídeo direcionado a um componente de uma via de sinalização que pode estar envolvida na modulação de uma resposta imune direta ou indiretamente.

“Modular” uma resposta imune refere-se a qualquer alteração em uma célula do sistema imune ou na atividade de tal célula (por exemplo, uma célula T). Tal modulação inclui estimulação ou supressão do sistema imunológico que pode se manifestar por um aumento ou diminuição no número de vários tipos de células, um aumento ou diminuição na atividade dessas células ou quaisquer outras alterações que podem ocorrer dentro do sistema imunológico. De preferência, esse polipeptídeo é capaz de regular negativamente, pelo menos parcialmente, uma via inibitória (antagonista) e/ou de regular positivamente, pelo menos parcialmente, uma via estimuladora (agonista); em particular, a via imunológica existente entre uma célula apresentadora de antígeno (APC) ou uma célula cancerosa e uma célula T efetora.

[090] O polipeptídeo imunomodulador para ser expresso pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção pode atuar em qualquer etapa da imunidade mediada por células T, incluindo seleção clonal de células antígeno-específicas, ativação de células T, proliferação, tráfego para locais de antígeno e inflamação, execução direta da função efetora e sinalização por meio de citocinas e ligantes de membrana. Cada uma dessas etapas é regulada pelo contrapeso de sinais estimulatórios e inibitórios que ajustam a resposta.

[091] Os polipeptídeos imunomoduladores adequados e métodos para usá-los são descritos na literatura. Polipeptídeos imunomoduladores exemplares incluem, sem limitação, citocinas, quimiocinas, ligantes e anticorpos ou qualquer combinação dos mesmos. A presente invenção abrange um poxvírus modificado e preferencialmente oncolítico que codifica mais de um polipeptídeo imunomodulador (por exemplo, uma citocina e um anticorpo; uma citocina e um ligante; duas citocinas; dois anticorpos de ponto de verificação imunológico; uma citocina, um ligante e um anticorpo; um anticorpo e duas citocinas; etc.).

[092] Em um exemplo de realização, o polipeptídeo imunomodulador a ser expresso pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção é uma citocina, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL -36, IFNα, IFNγ e fator estimulador de colônia de granulócitos - macrófagos (GM-CSF).

[093] Em outro exemplo de realização, o polipeptídeo imunomodulador a ser expresso pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção é uma quimiocina, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em ΜΙΡΙα, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 e CCL21.

[094] Em outro exemplo de realização, o polipeptídeo imunomodulador a ser expresso pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção pode ser selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em peptídeos (por exemplo, ligantes de peptídeo), domínios solúveis de receptores naturais e anticorpos. Particularmente apropriados no contexto da invenção são os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína de ponto de verificação imune, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em CD3, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40, PD1, PDL1, CTLA4, Tim- 3, BTLA, Lag-3 e Tigit.

[095] O termo “liga-se especificamente” refere-se à capacidade de uma especificidade de ligação e afinidade para um alvo ou epítopo particular, mesmo na presença de uma população heterogênea de outras proteínas e produtos biológicos. Assim, sob condições de ensaio designadas, o anticorpo liga-se preferencialmente ao seu alvo e não se liga em uma quantidade significativa a outros componentes presentes em uma amostra teste ou sujeito. De preferência, tal anticorpo mostra ligação de alta afinidade ao seu alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação igual ou inferior a 1x10-6 M (por exemplo, pelo menos 0,5x10-6, 1x10-7, 1x10-8, 1x10-9, 1x10-10, etc). Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de um anticorpo ao seu alvo são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs e citometria de fluxo.

[096] No contexto da invenção, “anticorpo” (“Ab”) é usado no sentido mais amplo e abrange anticorpos de ocorrência natural e aqueles desenvolvidos pelo homem; incluindo anticorpos sintéticos, monoclonais, policlonais, bem como anticorpos de comprimento total (completos) e fragmentos, variantes ou fusões dos mesmos, desde que tais fragmentos, variantes ou fusões retenham propriedades de ligação à proteína alvo. Esses anticorpos podem ser de qualquer origem; humana ou não humana (por exemplo, anticorpo de roedor ou camelídeo) ou quimérico. Um anticorpo não humano pode ser humanizado por métodos recombinantes para reduzir sua imunogenicidade no homem. O anticorpo pode derivar de qualquer um dos isotipos bem conhecidos (por exemplo, IgA, IgG e IgM) e qualquer subclasse de IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Além disso, ele pode ser glicosilado, parcialmente glicosilado ou não glicosilado. A menos que o contexto indique o contrário, o termo “anticorpo” também inclui um fragmento de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos mencionados acima e inclui um fragmento monovalente e um divalente e anticorpos de cadeia única. O termo anticorpo também inclui anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico), desde que exiba a mesma especificidade de ligação que o anticorpo parental.

Está dentro da habilidade do especialista rastrear as propriedades de ligação de um anticorpo candidato.

[097] Para fins ilustrativos, os anticorpos de comprimento total são glicoproteínas compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada que é composta de três domínios CH1, CH2 e CH3 (eventualmente com uma dobradiça entre CH1 e CH2). Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve que compreende um domínio CL. As regiões VH e VL compreendem três regiões hipervariáveis, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR, do inglês complementarity determining regions), intercaladas com quatro regiões conservadas denominadas regiões ‘estruturais’ ou ‘arcabouço’ (FR, do inglês Framework Region) na seguinte ordem: FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. As regiões CDR das cadeias pesadas e leves são determinantes para a especificidade de ligação. Conforme utilizado na presente invenção, um “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo não humano (por exemplo, murino, camelo, rato, etc.) cuja sequência de proteína foi modificada para aumentar a sua semelhança com um anticorpo humano (ou seja, produzido naturalmente em humanos). O processo de humanização é bem conhecido no estado da técnica e é normalmente realizado substituindo um ou mais resíduos das regiões FR para se parecerem com a sequência de imunoglobulina humana, enquanto a grande maioria dos resíduos das regiões variáveis (especialmente das CDRs) não é modificada e corresponde aos resíduos de uma imunoglobulina não humana. Um “anticorpo quimérico” compreende um ou mais elemento(s) de uma espécie e um ou mais elemento(s) de outra espécie, por exemplo, um anticorpo não humano compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de um imunoglobulina humana.

[098] Exemplos representativos de fragmentos de ligação ao antígeno são conhecidos no estado da técnica, incluindo Fab, Fab', F (ab') 2, dAb, Fd, Fv, scFv, ds-scFv e diacorpo (diabody). Um fragmento de anticorpo particularmente útil é um anticorpo de cadeia única (scFv) compreendendo os dois domínios de um fragmento Fv, VL e VH, que são fundidos juntos, eventualmente com um ligante para fazer uma única cadeia de proteína.

[099] Em um exemplo de realização, o anticorpo a ser expresso pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo de cadeia única que se liga especificamente a uma molécula na superfície de uma célula T e, de preferência, a um receptor imunossupressor envolvido na regulação da ativação de célula T. Além da capacidade de ligação, esse anticorpo é ainda capaz de inibir a atividade biológica do referido receptor imunossupressor.

[100] Exemplos de realização particularmente preferidos são dirigidos a um poxvírus oncolítico preferencialmente modificado que expressa um anticorpo antagonista que se liga especificamente a PD-L1 ou CTLA-4 e, preferencialmente, inibe a atividade biológica de tal receptor, nomeadamente através da inibição da interação com o(s) ligante(s) coestimulador(es) CD80 e/ou CD86.

[101] Em um exemplo de realização preferido, o anticorpo antagonista a ser expresso pelo poxvírus modificado recombinante descrito na presente invenção é um anticorpo anti-CTLA-4 que se liga especificamente a um CTLA-4 de mamífero (por exemplo, CTLA-4 humano) e inibe sua capacidade de entregar um sinal imunossupressor (por exemplo, bloqueando a ligação de CTLA-4 aos ligantes CD80 e CD86).

[102] Com um poxvírus convencional carregando o locus M2L em seu genoma, o anticorpo anti-CTLA-4 expresso atuará inibindo o sinal imunossupressor mediado por CTLA-4, mas a proteína M2 produzida in situ irá interagir com ligantes CD80 e CD86, reduzindo ou inibindo assim o sinal coestimulatório mediado por CD28. Em contraste, o poxvírus modificado (isto é, defeituoso em m2) que expressa anti-CTLA-4 descrito na presente invenção que não possui a função m2 será capaz de inibir o sinal imunossupressor mediado por CTLA-4 e redirecionar a resposta imune para sinais coestimuladores mediados por CD28.

[103] Diversos anticorpos anti CTLA-4 estão disponíveis na técnica (consulte, por exemplo, aqueles descritos na US 8.491.895, e documentos WO2000/037504, WO2007/113648, WO2012/122444 e WO2016/196237, entre outros) e vários deles foram aprovados na última década pelo FDA ou estão em desenvolvimento clínico avançado. Exemplos representativos de anticorpos anti-CTLA-4 utilizáveis na presente divulgação são, por exemplo, ipilimumabe comercializado pela Bristol Myer Squibb como Yervoy® (vide, por exemplo, as Patentes US 6.984.720; US 8.017.114), MK- 1308 (Merck), AGEN-1884 (Agenus Inc.; WO2016/196237) e tremelimumabe (AstraZeneca; US 7.109.003 e US 8.143.379) e anticorpos anti-CTLA4 de cadeia única (veja, por exemplo, os documentos WO97/20574 e

WO2007/123737).

[104] Os exemplos de realização preferidos são direcionados a (i) um poxvírus modificado (e preferencialmente oncolítico) com uma preferência por um vírus vaccinia oncolítico defeituoso para ambas as funções m2 e tk (resultante de mutações de inativação em ambos os loci M2L e J2R), e codificando um anticorpo anti-CTLA-4; (ii) um poxvírus modificado (e preferencialmente oncolítico) com uma preferência por um vírus vaccinia oncolítico, defeituoso para atividades m2 e rr (resultante de mutações de inativação em ambos os locus M2L e os genes I4L e/ou F4L) que codificam um anticorpo anti-CTLA-4 e (iii) um poxvírus modificado (e preferencialmente oncolítico) com preferência por um vírus vaccinia oncolítico, defeituoso para atividades m2, tk e rr (resultante de mutações inativadoras nos loci M2L, J2R e I4L/F4L) que codifica um anticorpo anti-CTLA-4.

[105] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumabe.

[106] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é tremelimumabe.

[107] Outro exemplo preferido de polipeptídeos imunomoduladores adequados para expressão pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção é representado por um anticorpo que se liga especificamente ao PDL-1 (ligante de morte programada-1) e inibe sua atividade biológica. A formação de um complexo receptor/ligante PD-1/PD-L1 leva à inibição das células T CD8+ e, portanto, à inibição de uma resposta imune. PD-L1 é um dos dois ligantes de glicoproteína de superfície celular para PD-1 (sendo o outro PD-L2) que regula negativamente a ativação de células T e a secreção de citocinas após a ligação a PD-1. A sequência PD-L1 humana completa pode ser encontrada sob o Nº de Acesso do GenBank: Q9NZQ7.

[108] Os anticorpos antagonistas anti-PD-L1 estão disponíveis na técnica de vários fornecedores, como Merck, sigma Aldrich e Abcam e alguns foram aprovados pelo FDA ou estão em desenvolvimento clínico avançado.

Exemplos representativos de anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis na presente divulgação são, por exemplo, BMS-936559 (em desenvolvimento pela Bristol Myer Squibb também conhecido como MDX-1105; documento WO2013/173223), atezolizumabe (em desenvolvimento pela Roche; também conhecido como TECENTRIQ®; US8.217.149), durvalumabe (AstraZeneca; também conhecido como EVIFINZI™; WO2011/066389), MPDL3280A (em desenvolvimento pela Genentech/Roche), bem como avelumabe (desenvolvido pela Merck e PF sob o nome comercial Bavencio; WO2013/079174), STI-1014 (Sorrento; WO2013/181634) e CX-072 (Cytomx; WO2016/149201). As sequências de nucleotídeos correspondentes podem ser clonadas ou isoladas de acordo com técnicas padrão com base na informação divulgada na literatura disponível.

[109] Os exemplos de realização preferidos são direcionados a (i) um poxvírus modificado (e preferencialmente oncolítico) com uma preferência por um vírus vaccinia oncolítico defeituoso para ambas as funções m2 e tk (resultante de mutações de inativação em ambos os loci M2L e J2R), e codificando um anticorpo anti-PD-L1; (ii) um poxvírus modificado (e preferencialmente oncolítico) com uma preferência por um vírus vaccinia oncolítico, defeituoso para atividades m2 e rr (resultante de mutações de inativação em ambos os locus M2L e os genes I4L e/ou F4L) que codificam um anticorpo anti-PD-L1 e (iii) um poxvírus modificado (e preferencialmente oncolítico) com preferência por um vírus vaccinia oncolítico, defeituoso para atividades m2, tk e rr (resultante de mutações inativadoras nos loci M2L, J2R e I4L/F4L) que codifica um anticorpo anti-PD-L1.

[110] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-PD-L1 é atezolizumabe.

[111] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-PD-L1 é durvalumabe.

[112] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-PD-L1 é avelumabe.

[113] Outros exemplos de realização são direcionados a (i) um poxvírus modificado e preferencialmente oncolítico com uma preferência por um vírus vaccinia oncolítico defeituoso para a função m2 e tk (resultante de mutações de inativação em ambos os loci M2L e J2R) que codificam um anticorpo anti-CTLA-4 e um anticorpo anti-PD-L1; (ii) um poxvírus modificado e preferencialmente oncolítico com uma preferência por um vírus vaccinia oncolítico, defeituoso para atividades m2 e rr (resultante de mutações de inativação no locus M2L e genes I4L e/ou F4L) que codificam um anticorpo anti-CTLA-4 e um anticorpo anti-PD-L1 e (iii) um poxvírus modificado e preferencialmente oncolítico, com preferência para um vírus vaccinia oncolítico, defeituoso para atividades m2, tk e rr (resultante de mutações de inativação nos loci M2L, J2R e I4L/F4L) que codificam um anticorpo anti-CTLA-4 e um anticorpo anti-PD-L1.

[114] Em certos exemplos de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumabe e o anticorpo anti-PD-L1 é avelumabe.

POLIPEPTÍDEOS ANTIGÊNICOS

[115] O termo “antigênico” refere-se à capacidade de induzir ou estimular uma resposta imune mensurável em um sujeito no qual o poxvírus recombinante aqui descrito que codifica o polipeptídeo qualificado como antigênico foi introduzido. A resposta imune estimulada ou induzida contra o polipeptídeo antigênico expresso pelo referido poxvírus recombinante pode ser humoral e/ou celular (por exemplo, produção de anticorpos, citocinas e/ou quimiocinas envolvidas na ativação de células imunes efetoras). A resposta imune estimulada ou induzida geralmente contribui para um efeito protetor no sujeito administrado. Uma grande variedade de ensaios biológicos diretos ou indiretos está disponível na técnica para avaliar a natureza antigênica de um polipeptídeo in vivo (animais ou seres humanos) ou in vitro (por exemplo, em uma amostra biológica). Por exemplo, a capacidade de um determinado antígeno de estimular a imunidade inata pode ser realizada, por exemplo, por medição das células NK/NKT (por exemplo, representatividade e nível de ativação), bem como, citocinas relacionadas com IFN e/ou cascatas produtoras de quimiocinas, ativação de TLRs (para receptor semelhante a Toll) e outros marcadores de imunidade inata (Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5 (1), e8761; Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol.

38, 2964-2968). A capacidade de um determinado antígeno de estimular uma resposta imune mediada por células pode ser realizada, por exemplo, por quantificação de citocinas produzidas por células T ativadas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+ usando bioensaios rotineiros (por exemplo, caracterização e/ou quantificação de células T por ELISpot, por citometria de fluxo de parâmetros múltiplos, ICS (para coloração de citocina intracelular), por análise de perfil de citocina usando tecnologias multiplex ou ELISA), por determinação da capacidade proliferativa de células T (por exemplo, ensaios de proliferação de células T por Ensaio de incorporação de timidina [3H]), por ensaio de capacidade citotóxica para linfócitos T antígeno- específicos em um sujeito sensibilizado ou por identificação de subpopulações de linfócitos por citometria de fluxo e por imunização de modelos animais apropriados, conforme descrito na presente invenção.

[116] É contemplado que o termo polipeptídeo antigênico engloba antígeno nativo, bem como fragmento (por exemplo, epítopos, domínios imunogênicos, etc.) e sua variante, desde que tal fragmento ou variante seja capaz de ser o alvo de uma resposta imune. Os polipeptídeos antigênicos preferidos para uso na presente invenção são antígenos associados a tumores. Está dentro do escopo do versado na técnica selecionar um ou mais polipeptídeos antigênicos que são apropriados para o tratamento de uma condição patológica particular.

[117] Em um exemplo de realização, o(s) polipeptídeo(s) antigênico(s) codificado(s) pelo poxvírus modificado recombinante é(são) antígeno(s) de câncer (também chamados de antígenos associados a tumor ou TAA) que está(estão) associado(s) e/ou serve(m) como marcador(es) de câncer. Os antígenos de câncer abrangem várias categorias de polipeptídeos, por exemplo, aqueles que são normalmente silenciosos (ou seja, não expressos) em células saudáveis, aqueles que são expressos apenas em níveis baixos ou em certos estágios de diferenciação e aqueles que são expressos temporalmente, como antígenos embrionários e fetais, como bem como aqueles resultantes da mutação de genes celulares, como oncogenes (por exemplo, oncogene ras ativado), proto-oncogenes (por exemplo, família ErbB) ou proteínas resultantes de translocações cromossômicas.

[118] Numerosos antígenos associados a tumor são conhecidos no estado da técnica. Antígenos tumorais exemplares incluem, sem limitação, antígeno colorretal associado (CRC), antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno específico da próstata (PSA), família de antígenos BAGE, GAGE ou MAGE, p53, antígenos de mucina (por exemplo, MUC1), HER2/neu, p21ras, hTERT, Hsp70, iNOS, tirosina quinase, mesotelina, c-erbB-2, alfa fetoproteína, AM-1, entre muitos outros, e qualquer epítopo imunogênico ou variante do mesmo.

[119] Os antígenos associados a tumor também podem abranger neoepítopos/antígenos que surgiram durante o processo de carcinogênese em uma célula cancerosa e compreendendo um ou mais mutação(ões) de resíduos de aminoácidos em relação a um antígeno tipo selvagem correspondente.

Normalmente, ele é encontrado em células ou tecidos de câncer obtidos de um paciente, mas não em uma amostra de células ou tecidos normais obtidos de um paciente ou indivíduo saudável.

[120] Os antígenos associados a tumor também podem abranger antígenos codificados por organismos patogênicos que são capazes de induzir uma condição maligna em um sujeito (especialmente sujeito infectado cronicamente), como vírus tumorais de RNA e DNA (por exemplo, papilomavírus humano (HPV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite B (HBV), vírus Epstein Barr (EBV), etc.) e bactérias (por exemplo, Helicobacter pilori).

[121] Em outro exemplo de realização, o(s) polipeptídeo(s) antigênico(s) codificado(s) pelo poxvírus modificado recombinante é(são) antígeno(s) vacinal(ais) que, quando administrado(s) a um sujeito humano ou animal, objetivam proteger terapeuticamente ou profilaticamente o sujeito contra doenças infecciosas. Numerosos antígenos de vacina são conhecidos no estado da técnica. Antígenos de vacina exemplares incluem, mas não estão limitados a, antígenos celulares, antígenos virais, bacterianos ou parasitários.

Os antígenos celulares incluem a glicoproteína mucina 1 (MUC1). Os antígenos virais incluem, por exemplo, antígenos dos vírus da hepatite A, B, C, D e E, vírus da imunodeficiência (por exemplo, HIV), vírus da herpes, citomegalovírus, varicela zoster, papilomavírus, vírus Epstein Barr, vírus da influenza, vírus para-influenza, vírus coxsakie, picornavírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, rinovírus, vírus da rubéola, papovírus, vírus da caxumba, vírus do sarampo e vírus da raiva. Alguns exemplos não limitativos de antígenos de HIV incluem gp120 gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef tat, nef. Alguns exemplos, não limitantes, de antígenos do vírus do herpes humana incluem gH, gL gM gB gC gK gE ou gD ou proteína precoce imediata, como ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 de HSV1 ou HSV2. Alguns exemplos não limitantes de antígenos de citomegalovírus incluem gB. Alguns exemplos não limitantes de derivados do vírus Epstein Barr (EBV) incluem gp350. Alguns exemplos não limitantes de antígenos do vírus varicela zoster incluem gp1, 11, 111 e IE63.

Alguns exemplos não limitantes de antígenos do vírus da hepatite C incluem proteína env E1 ou E2, proteína central, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7. Alguns exemplos não limitantes de antígenos do papilomavírus humano (HPV) incluem L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7. Os antígenos derivados de outros patógenos virais, como vírus sincicial respiratório (por exemplo, proteínas F e G), vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, flavivírus (por exemplo, vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus da encefalite transmitida por carrapato, vírus da encefalite japonesa) e vírus da gripe (por exemplo, proteínas HA, NP, NA ou M) também podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Os antígenos bacterianos incluem, por exemplo, antígenos de Mycobacteria causadora da TB, lepra, pneumococci, bacilos Gram negativos aeróbicos, Mycoplasma, Staphyloccocus, Streptococcus, Salmonellae, Chlamydiae, Neisseriae e semelhantes. Os polipeptídeos antigênicos parasitas incluem, por exemplo, antígenos da malária, leishmaniose, tripanossomíase, toxoplasmose, esquistossomose e filariose.

MODULADORES DO POOL DE NUCLEOSÍDEOS

[122] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado descrito na presente invenção carrega em seu genoma um ou mais genes recombinantes com função moduladora de pool de nucleosídeos. Exemplos representativos incluem, sem limitação, citidina desaminase e notavelmente citidina desaminase de levedura (CDD1) ou citidina desaminase humana (hCD) (vide o documento WO2018/122088); polipeptídeos que atuam nas vias metabólicas e imunológicas (por exemplo, adenosina desaminase e notavelmente a adenosina desaminase humana huADA1 ou huADA2; vide o documento EP17306012.0); polipeptídeos atuando na via apoptótica;

endonucleases (como enzimas de restrição, CRISPR/Cas9) e RNAs alvo- específicos (por exemplo, miRNA, shRNA, siRNA).

PRODUTOS GENÉTICOS DETECTÁVEIS

[123] Normalmente, esse polipeptídeo é detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos ou outros meios físicos e, portanto, pode permitir a identificação do poxvírus recombinante dentro de uma célula hospedeira ou sujeito. Exemplos não limitantes de produtos de genes detectáveis adequados incluem mCherry, Emerald, luciferase de vaga-lume e proteínas verde fluorescente (GFP e sua versão aprimorada e-GFP) detectáveis por meios fluorescentes, bem como beta-galactosidase detectável por meios colorimétricos.

EXPRESSÃO DO GENE RECOMBINANTE

[124] A sequência de nucleotídeos que codifica polipeptídeos de interesse terapêutico, como aqueles citados acima, pode ser facilmente obtida por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR, clonagem de cDNA, síntese química) usando dados de sequência acessíveis na técnica e as informações fornecidas neste documento. Por exemplo, métodos para clonar anticorpos, fragmentos e análogos dos mesmos são conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies - A Laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY). A molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser isolada do hibridoma de produção (por exemplo, Cole et al. Em Monoclonal antibodies and Cancer Therapy; Alan Liss pp77-96), bibliotecas de genes de imunoglobulina ou de qualquer fonte disponível ou a sequência de nucleotídeos pode ser gerada por síntese química.

[125] Além disso, o ácido nucleico recombinante pode ser otimizado para fornecer expressão de alto nível em uma determinada célula hospedeira ou sujeito. De fato, foi observado que os padrões de uso de códons preferenciais (codon usage) de organismos são altamente não aleatórios e o uso de códons pode ser marcadamente diferente entre diferentes hospedeiros.

Por exemplo, o gene terapêutico pode ser de origem bacteriana, viral ou eucariota inferior e, portanto, ter um padrão de uso preferencial de códon (codon usage) inadequado para expressão eficiente em células eucarióticas superiores (por exemplo, humanas). Normalmente, a otimização do códon é realizada substituindo um ou mais códons “nativos” (por exemplo, bacteriano, viral ou de levedura) correspondendo a um códon raramente usado no organismo hospedeiro por um ou mais códons que codificam o mesmo aminoácido que é mais frequentemente usado. Não é necessário substituir todos os códons nativos correspondentes a códons usados com pouca frequência, uma vez que a expressão aumentada pode ser alcançada mesmo com substituição parcial.

[126] Além da otimização do uso do códon (codon usage), a expressão na célula hospedeira ou sujeito pode ainda ser melhorada por meio de modificações adicionais da(s) sequência(s) nucleotídica(s) recombinante (s).

Por exemplo, várias modificações podem ser consideradas de modo a evitar o agrupamento de códons raros e não ótimos presentes em áreas concentradas e/ou para suprimir ou modificar elementos de sequência “negativos” que se espera que influenciem negativamente os níveis de expressão. Esses elementos de sequência negativa incluem, sem limitação, as regiões com conteúdo de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%); Alongamentos de sequência ricos em AT ou ricos em GC; sequências de repetição direta ou invertida instáveis; Estruturas secundárias de RA; e/ou elementos reguladores criptográficos internos, como TATA-box internos, chi-sites, sítios de entrada de ribossomo e/ou sítios doadores/aceptores de splicing.

[127] De acordo com a presente invenção, cada uma de uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante está operacionalmente ligada a elementos reguladores adequados para a sua expressão em uma célula hospedeira ou sujeito. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “elementos reguladores” ou “sequência reguladora” refere-se a qualquer elemento que permite, contribui ou modula a expressão do(s) ácido(s) nucleico(s) codificante(s) em uma determinada célula hospedeira ou sujeito, incluindo replicação, duplicação, transcrição, splicing, tradução, estabilidade e/ou transporte do(s) ácido(s) nucleico(s) ou seu(s) derivado(s) (ou seja, mRNA). Conforme usado neste documento, “operacionalmente ligado” significa que os elementos sendo ligados são dispostos de modo que funcionem em conjunto para os fins pretendidos. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico se o promotor efetua a transcrição desde o início da transcrição até o terminador da referida molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira permissiva.

[128] Será compreendido por aqueles versados na técnica que a escolha das sequências regulatórias pode depender de fatores como o próprio ácido nucleico, o vírus no qual é inserido, a célula hospedeira ou sujeito, o nível de expressão desejado, etc. O promotor é de especial importância. No contexto da invenção, ele pode ser de expressão constitutiva da molécula de ácido nucleico em muitos tipos de células hospedeiras ou específicas para certas células hospedeiras (por exemplo, sequências regulatórias específicas do fígado) ou reguladas em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos (por exemplo por temperatura, aditivo nutritivo, hormônio, etc.) ou de acordo com a fase de um ciclo viral (por exemplo, tardio ou precoce). Pode-se também usar promotores que são reprimidos durante a etapa de produção em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos, a fim de otimizar a produção de vírus e contornar a toxicidade potencial do(s) polipeptídeo(s) expresso(s).

[129] Os promotores de poxvírus são particularmente adaptados para a expressão do gene recombinante pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção. Exemplos representativos incluem, sem limitação, os promotores de vaccinia 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15 (1): 18-28), TK, p28, p11, pB2R, pA35R e K1L, bem como promotores sintéticos, tais como os descritos em Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; e Kumar e Boyle, 1990, Virology 179: 151-8), bem como promotores quiméricos precoces/tardios.

[130] Os versados na técnica apreciarão que os elementos reguladores que controlam a expressão da(s) molécula(s) de ácido nucleico inserida(s) no genoma do poxvírus podem compreender ainda elementos adicionais para a iniciação, regulação e/ou terminação adequada da transcrição (por exemplo, sequências de terminação da transcrição poliA), transporte de mRNA (por exemplo, sequências de sinal de localização nuclear), processamento (por exemplo, sinais de splicing) e estabilidade (por exemplo, íntrons e sequências 5' e 3' não codificantes), tradução (por exemplo, um iniciador Met, sequências líderes tripartidas, sítios de ligação de ribossomo IRES, peptídeos de sinal, etc).

[131] Quando apropriado, pode ser vantajoso que o polipeptídeo recombinante inclua elementos reguladores adicionais para facilitar sua expressão, tráfego e atividade biológica. Por exemplo, um peptídeo sinal pode ser incluído para facilitar a secreção da célula infectada. O peptídeo sinal é tipicamente inserido no N-terminal da proteína imediatamente após o iniciador Met. A escolha de peptídeos de sinal é ampla e está acessível aos versados na técnica. Também pode ser considerada a adição de um domínio transmembrana para facilitar a ancoragem do(s) polipeptídeo(s) codificado(s) em uma membrana adequada (por exemplo, a membrana plasmática) das células infectadas. O domínio transmembrana é tipicamente inserido no C- terminal da proteína imediatamente antes ou próximo ao códon de parada.

Uma vasta variedade de domínios transmembranares está disponível na técnica (veja, por exemplo, o documento WO99/03885).

[132] Como um exemplo adicional, um peptídeo marcador (tag) (tipicamente uma sequência peptídica curta capaz de ser reconhecida por antissoros ou compostos disponíveis) também pode ser adicionado para a posterior expressão, tráfego ou purificação do produto do gene codificado. Uma vasta variedade de peptídeos marcadores (tags) pode ser usada no contexto da invenção incluindo, sem limitação, PK tag, octapeptídeo FLAG, MYC tag, HIS tag (geralmente um trecho de 4 a 10 resíduos de histidina) e e-tag (US

6.686.152). O(s) peptídeo(s) marcador(es) podem ser posicionados independentemente no N-terminal da proteína ou alternativamente no C- terminal ou, alternativamente, internamente ou em qualquer uma dessas posições quando vários marcadores são empregados. Os peptídeos marcadores (tags) podem ser detectados por ensaios de imunodetecção usando anticorpos anti-tag.

[133] Como outro exemplo, a glicosilação pode ser alterada de modo a aumentar a atividade biológica do produto do gene codificado. Essas modificações podem ser realizadas, por exemplo, por mutação de um ou mais resíduos dentro do(s) sítio(s) de glicosilação. Os padrões de glicosilação alterados podem aumentar a capacidade da ADCC dos anticorpos e/ou da afinidade para o seu alvo.

[134] Outra abordagem que pode ser buscada no contexto da presente invenção é o acoplamento do produto do gene recombinante codificado pelo poxvírus modificado aqui descrito a um agente externo, tal como um agente citotóxico e/ou um agente de marcação. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “agente citotóxico” refere-se a um composto que é diretamente tóxico para as células (por exemplo, impedindo sua reprodução ou crescimento), como toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos.

Conforme utilizado na presente invenção, “um agente de marcação” refere-se a um composto detectável. O agente de marcação pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores de isótopos radioativos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a modificação química de um composto de substrato que é detectável. O acoplamento pode ser realizado por fusão genética entre o polipeptídeo terapêutico e o agente externo.

[135] A inserção do(s) ácido(s) nucleico(s) recombinante(s) (equipados com elementos reguladores apropriados) no genoma do poxvírus é feita por meios convencionais, usando enzimas de restrição apropriadas ou, de preferência, por recombinação homóloga.

[136] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para gerar o poxvírus modificado descrito na presente invenção, e particularmente um poxvírus recombinante e oncolítico, por recombinação homóloga entre um plasmídeo de transferência compreendendo o ácido nucleico recombinante (com seus elementos reguladores) flanqueado em 5' e 3' com sequências virais respectivamente presentes a montante e a jusante do sítio de inserção e um genoma viral. Em um exemplo de realização, o referido método compreende uma etapa de geração do referido plasmídeo de transferência (por exemplo, por métodos convencionais de biologia molecular) e uma etapa de introdução do referido plasmídeo de transferência em uma célula hospedeira adequada, nomeadamente juntamente com um genoma de poxvírus (por exemplo, um vírus com M2L inativado) compreendendo a sequência de flanqueamento presente no plasmídeo de transferência. De preferência, o plasmídeo de transferência é introduzido na célula hospedeira por transfecção e o vírus por infecção.

[137] O tamanho de cada sequência viral flanqueadora pode variar. Ela geralmente tem pelo menos 100 pb e no máximo 1500 pb, com uma preferência de aproximadamente 150 a 800 pb em cada lado do ácido nucleico recombinante, vantajosamente de 180 a 600 pb, preferencialmente de 200 a 550 pb e mais preferencialmente de 250 a 500 pb.

[138] A(s) molécula(s) de ácido nucleico recombinante pode(m) ser inserida(s) independentemente em qualquer local do genoma do poxvírus e a inserção pode ser realizada por técnicas rotineiras de biologia molecular bem conhecidas no estado técnica. Vários sítios de inserção podem ser considerados, por exemplo, em um gene viral não essencial, em uma região intergênica ou em uma porção não codificante do genoma do poxvírus. O locus J2R é particularmente apropriado no contexto da invenção. Conforme descrito acima, após a inserção do(s) ácido(s) nucleico(s) estranho(s) no genoma do poxvírus, o locus viral no sítio de inserção pode ser deletado pelo menos parcialmente, por exemplo, resultando na expressão suprimida do produto do gene viral codificado pelo gene viral total ou locus parcialmente deletado e um vírus defeituoso para a referida função do vírus.

[139] Em certos exemplos de realização, a identificação do poxvírus modificado pode ser facilitada pelo uso de um gene de seleção e/ou detectável. Em exemplos de realização preferidos, o plasmídeo de transferência compreende ainda um marcador de seleção com uma preferência específica para o gene GPT (que codifica uma guanina fosforibosil transferase) permitindo o crescimento em um meio seletivo (por exemplo, na presença de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina) ou um gene detectável codificante de um produto gênico detectável, como GFP, e-GFP ou mCherry. Além disso, o uso de uma endonuclease capaz de fornecer uma quebra de fita dupla na referida seleção ou gene detectável também pode ser considerado. A referida endonuclease pode estar na forma de uma proteína ou pode ser expressa por um vetor de expressão.

[140] A recombinação homóloga que permite gerar o poxvírus modificado é preferencialmente realizada em células hospedeiras apropriadas (por exemplo, células HeLa ou CEF).

PRODUÇÃO DE POXVÍRUS

[141] Tipicamente, o poxvírus modificado da invenção é produzido em uma linhagem de células hospedeira adequada usando técnicas convencionais, incluindo a cultura da célula hospedeira transfectada ou infectada em condições adequadas de modo a permitir a produção e recuperação de partículas poxvirais infecciosas.

[142] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para produzir o poxvírus modificado aqui descrito. De preferência, o referido método compreende as etapas de a) preparar uma linhagem de células produtora, b) transfectar ou infectar a linhagem de células produtora preparada com o poxvírus modificado, c) cultivar a linhagem de células produtora transfectada ou infectada sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus (por exemplo, partículas infecciosas de poxvírus), d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da referida linhagem de células produtora e, opcionalmente, e) purificar o referido vírus recuperado.

[143] Em um exemplo de realização, a célula produtora é uma célula de mamífero (por exemplo, humana ou não humana) selecionada a partir do grupo que consiste em células HeLa (por exemplo, ATCC-CRM-CCL-2 TM ou ATCC-CCL-2.2 TM), HER96, PER- C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17) e linhagens de células de hamster, como BHK-21 (ATCC CCL-10) ou uma célula aviária, como uma das descritas nos documentos WO2005/042728, WO2006/108846, WO2008/129058, WO2010/130756, WO2012/001075, etc), bem como um fibroblasto de embrião de galinha primário (CEF) preparado a partir de embriões de galinha obtidos de ovos fertilizados.

[144] As células produtoras são preferencialmente cultivadas em um meio apropriado que pode, se necessário, ser suplementado com soro e/ou fator(es) de crescimento adequado(s) ou não (por exemplo, um meio quimicamente definido de preferência livre de produtos derivados de animais ou humanos). Um meio apropriado pode ser facilmente selecionado por aqueles versados na técnica dependendo das células produtoras. Esses meios estão disponíveis comercialmente. As células produtoras são preferencialmente cultivadas a uma temperatura compreendida entre +30ºC e +38ºC (mais preferencialmente a aproximadamente 37ºC) durante entre 1 e 8 dias antes da infecção. Se necessário, várias passagens de 1 a 8 dias podem ser feitas para aumentar o número total de células.

[145] Na etapa b), as células produtoras são infectadas pelo poxvírus modificado sob condições apropriadas usando uma multiplicidade de infecção multiplicidade de infecção (MOI, do inglês Multiplicity Of Infection) apropriada para permitir a infecção produtiva das células produtoras. Para fins ilustrativos, uma MOI apropriada varia de 10-3 a 20, com uma preferência específica para uma MOI que compreende de 0,01 a 5 e mais preferencialmente de 0,03 a 1. A etapa de infecção é realizada em um meio que pode ser igual ou diferente do meio utilizado para a cultura de células produtoras.

[146] Na etapa c), as células produtoras infectadas são então cultivadas em condições apropriadas bem conhecidas pelos versados na técnica até que a progênie do vírus da varíola (por exemplo, partículas de vírus infecciosas) seja produzida. A cultura de células produtoras infectadas também é preferencialmente realizada em um meio que pode ser igual ou diferente do meio usado para cultura de células produtoras e/ou para a etapa de infecção, a uma temperatura entre + 32ºC e + 37ºC, por 1 a 5 dias.

[147] Na etapa d), o poxvírus produzido na etapa c) é coletado do sobrenadante da cultura e/ou das células produtoras. A recuperação das células produtoras pode exigir uma etapa que permita a ruptura da membrana da célula produtora para permitir a liberação do vírus. A ruptura da membrana celular produtora pode ser induzida por várias técnicas bem conhecidas dos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a congelamento/descongelamento, lise hipotônica, sonicação, microfluidização, alto cisalhamento (também chamado de alta velocidade) homogeneização ou alta homogeneização de pressão.

[148] O poxvírus recuperado pode então ser pelo menos parcialmente purificado antes de ser distribuído em doses e usado de acordo com a presente invenção. Um grande número de etapas e métodos de purificação está disponível na técnica, incluindo, por exemplo, clarificação, tratamento enzimático (por exemplo, endonuclease, protease, etc.), etapas cromatográficas e de filtração. Métodos apropriados estão descritos na técnica (veja, por exemplo, os documentos WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).

[149] Em um exemplo de realização, a presente invenção também provê uma célula infectada com o poxvírus modificado descrito na presente invenção.

COMPOSIÇÃO

[150] A presente invenção também fornece uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do poxvírus modificado descrito na presente invenção (agente ativo) e um veículo farmaceuticamente aceitável. Essa composição pode ser administrada uma ou várias vezes e através da mesma via ou de vias diferentes.

[151] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” corresponde à quantidade de poxvírus modificado que é suficiente para produzir um ou mais resultados benéficos. Essa quantidade terapeuticamente eficaz pode variar em função de vários parâmetros, em particular o modo de administração; o estado da doença; a idade e o peso do sujeito; a capacidade do sujeito de responder ao tratamento; do tipo de tratamento simultâneo; da frequência do tratamento; e/ou necessidade de prevenção ou terapia. Quando o uso profilático está em causa, a composição da invenção é administrada em uma dose suficiente para prevenir ou atrasar o início e/ou estabelecimento e/ou recidiva da doença proliferativa (como câncer), especialmente em um sujeito em risco. Para uso “terapêutico”, a composição é administrada a um sujeito com diagnóstico de doença proliferativa (como câncer) com o objetivo de tratar a doença, eventualmente em associação com um ou mais modalidades terapêuticas convencionais. Em particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aquela quantidade necessária para causar uma melhoria observável do estado clínico em relação ao estado inicial ou ao longo do estado esperado se não for tratado, por exemplo, redução no número de tumores; redução no tamanho do tumor, redução no número ou extensão da metástase, aumento no tempo de remissão, estabilização (ou seja, sem agravamento) do estado da doença, atraso ou desaceleração da progressão ou gravidade da doença, melhora ou paliação do estado da doença, sobrevida prolongada, melhor resposta ao tratamento padrão, melhora na qualidade de vida, redução da mortalidade, etc. Por exemplo, técnicas rotineiramente usadas em laboratórios (por exemplo, citometria de fluxo, histologia, imagens médicas) podem ser usadas para realizar a vigilância do tumor.

[152] Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode ser a quantidade necessária para causar o desenvolvimento de uma resposta imune eficaz não específica (inata) e/ou específica (adaptativa). Normalmente, o desenvolvimento de uma resposta imune, em particular a resposta de células T, pode ser avaliada in vitro, em modelos animais adequados ou usando amostras biológicas coletadas do sujeito (ELISA, citometria de fluxo, histologia, etc.). Pode-se também usar vários anticorpos disponíveis de modo a identificar diferentes populações de células imunes envolvidas na resposta antitumoral que estão presentes nos indivíduos tratados, tais como células T citotóxicas, células T citotóxicas ativadas, células assassinas naturais (natural killers) e células assassinas naturais ativadas. Uma melhora do estado clínico pode ser facilmente avaliada por qualquer medição clínica relevante normalmente usada por médicos ou outro pessoal de saúde qualificado.

[153] O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” se destina a incluir todos e quaisquer transportadores, solventes, diluentes, excipientes, adjuvantes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de absorção e semelhantes compatíveis com a administração em mamíferos e em indivíduos humanos em particular.

Exemplos não limitantes de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, NaCl, soluções salinas normais, Ringer lactato, solução de sacarídeo (por exemplo, glicose, trealose, sacarose, dextrose, etc.), alcoóis, óleos, gelatinas, carboidratos, tais como lactose, amilose ou amido, ésteres de ácidos graxos, hidroximetilcelulose e semelhantes, bem como outras soluções salinas aquosas fisiologicamente equilibradas (vide, por exemplo, a edição mais atual de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins).

[154] Em um exemplo de realização, a composição é formulada de forma adequada para garantir a estabilidade do agente ativo de poxvírus modificado sob as condições de fabricação e armazenamento de longo prazo (ou seja, por pelo menos 6 meses, com preferência por pelo menos dois anos) em congelamento (por exemplo entre -70ºC e -10ºC), temperatura refrigerada (por exemplo, 4ºC) ou ambiente (por exemplo, 20-25ºC). Essas formulações geralmente incluem um veículo líquido, como soluções aquosas.

[155] Vantajosamente, a composição é adequadamente tamponada para uso humano, de preferência em pH fisiológico ou ligeiramente básico (por exemplo, de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9 com uma preferência específica para um pH compreendido entre 7 e 8 e mais particularmente próximo de 7,5). Os tampões adequados incluem, sem limitação, TRIS (tris (hidroximetil) metilamina), TRIS-HCl (tris (hidroximetil) metilamina-HCl), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinoetanossulfônico), tampão fosfato (por exemplo, PBS), ACES (Ácido N-(2-acetamido)- aminoetanossulfônico), PIPES (Piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico)), MOPSO (ácido 3-(N-Morfolino)-2-hidroxipropanossulfônico), MOPS (ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico), TES (ácido 2- {[tris(hidroximetil)metil]amino}etanossulfônico), DIPSO (ácido 3-[bis(2- hidroxietil)amino]-2-hidroxipropano-1-sulfônico), MOBS (ácido 4-(N- morfolino)butanossulfônico), TAPSO (ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]- 2-hidroxipropanossulfônico), HEPPSO (ácido 4-(2-Hidroxietil)-piperazina-1-(2- hidroxi)-propanossulfônico), POPSO (ácido 2-hidroxi-3-[4-(2-hidroxi-3- sulfopropil)piperazin-1-il]propano-1-sulfônico), TEA (trietanolamina), EPPS (ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-3-propanossulfônico), e TRICINE (N- [Tris(hidroximetil)-metil]-glicina).

[156] De preferência, o referido tampão é selecionado a partir de TRIS-HCl, TRIS, Tricina, HEPES e tampão fosfato compreendendo uma mistura de Na2HPO4 e KH2PO4 ou uma mistura de Na2HPO4 e NaH2PO4..

[157] O referido tampão (em particular aqueles mencionados acima e notavelmente TRIS-HCl) está preferencialmente presente numa concentração de 10 a 50 mM.

[158] Pode ser benéfico incluir também na formulação um sal monovalente de modo a assegurar uma pressão osmótica apropriada. O referido sal monovalente pode ser selecionado notavelmente a partir de NaCl e KCl, preferencialmente o referido sal monovalente é NaCl, preferencialmente em uma concentração de 10 a 500 mM.

[159] A composição também pode ser formulada de modo a incluir um crioprotetor para proteger o poxvírus modificado a baixa temperatura de armazenamento. Os crioprotetores adequados incluem, sem limitação, sacarose (ou sacarose), trealose, maltose, lactose, manitol, sorbitol e glicerol, de preferência em uma concentração de 0,5 a 20% (peso em g/volume em L, referido como p/v). Por exemplo, a sacarose está preferencialmente presente em uma concentração de 5 a 15% (p/v).

[160] A composição de poxvírus modificada, e especialmente a composição líquida da mesma, pode ainda compreender um agente quelante farmaceuticamente aceitável para melhorar a estabilidade. O agente quelante farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado, notavelmente, a partir de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'- ácido tetra-acético (BAPTA), ácido etilenoglicol tetra-acético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA) e ácido 2,3-dimercapto-1-propanossulfônico (DMPS). O agente quelante farmaceuticamente aceitável está preferencialmente presente em uma concentração de pelo menos 50 µM com uma preferência específica para uma concentração de 50 a 1000 µM. Preferencialmente, o referido agente quelante farmaceuticamente aceitável é EDTA presente em uma concentração próxima de 150 µM.

[161] Os compostos adicionais podem ainda estar presentes para aumentar a estabilidade da composição de poxvírus modificada. Tais compostos adicionais incluem, sem limitação, álcool–C2-C3 (desejavelmente em uma concentração de 0,05 a 5% (volume/volume ou v/v)), glutamato de sódio (desejavelmente em uma concentração inferior a 10 mM), tensoativo não iônico (US 7.456.009, US2007-0161085), como Tween 80 (também conhecido como polissorbato 80) em baixa concentração, abaixo de 0,1%. Verificou-se que sais divalentes como MgCl2 ou CaCl2 induzem a estabilização de vários produtos biológicos no estado líquido (vide Evans et al. 2004, J Pharm Sci. 93: 2458-75 e US 7.456.009). Verificou-se que os aminoácidos, em particular histidina, arginina e/ou metionina, induzem a estabilização de vários vírus no estado líquido (veja o documento WO2016/087457).

[162] A presença de polímeros de alto peso molecular, como dextrano ou polivinilpirrolidona (PVP) é particularmente adequada para composições liofilizadas obtidas por um processo envolvendo secagem a vácuo e liofilização e a presença desses polímeros auxilia na formação do bolo (cake) durante o congelamento, secagem (vide, por exemplo, os documentos WO03/053463; WO2006/085082; WO2007/056847; WO2008/114021 e WO2014/053571).

[163] De acordo com a presente invenção, a formulação da composição também pode ser adaptada ao modo de administração assegurar a distribuição adequada ou liberação retardada/controlada in vivo. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de etileno vinila, poli-hidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poli-ortoésteres e ácido polilático e polietileno glicol. (veja, por exemplo, J. R. Robinson em “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978; WO01/23001; WO2006/93924; WO2009/53937).

[164] Para fins ilustrativos, as formulações tamponadas com Tris (Tris-HCl pH8) compreendendo sacarose 5% (p/v), glutamato de sódio 10 mM e NaCl 50 mM são adaptadas para a preservação da composição aqui descrita de -20ºC a 5ºC.

DOSAGEM.

[165] Em um exemplo de realização preferido, a composição é formulada em doses individuais, contendo cada dose de cerca de 103 a 1012 pv (partículas virais), iu (unidade infecciosa) ou pfu (unidades formadoras de placas) das poxvírus modificados, dependendo da técnica quantitativa utilizada.

A quantidade de vírus presente em uma amostra pode ser determinada por técnicas de titulação de rotina, por exemplo, contando o número de placas após a infecção de células permissivas (por exemplo, células HeLa) para obter um título de unidades formadoras de placa (pfu), medindo a absorbância de A260 (títulos de vp), ou ainda por imunofluorescência quantitativa, por exemplo, usando anticorpos antivírus (títulos de iu). O refinamento adicional dos cálculos necessários para adaptar a dosagem apropriada para um sujeito ou grupo de sujeitos pode ser feito rotineiramente por um médico, à luz das circunstâncias relevantes. Como orientação geral, as doses individuais que são adequadas para a composição de poxvírus compreendem de aproximadamente 10 3 a aproximadamente 1012 pfu, vantajosamente de aproximadamente 104 pfu a aproximadamente 1011 pfu, de preferência de aproximadamente 105 pfu a aproximadamente 1010 pfu; e mais preferencialmente de aproximadamente 106 pfu a aproximadamente 109 pfu e, notavelmente, doses individuais de aproximadamente 106, 5x106, 107, 5x107, 108 ou 5x108 pfu são particularmente preferidas.

ADMINISTRAÇÃO

[166] Qualquer uma das vias de administração convencionais é aplicável no contexto da invenção, incluindo as vias parenterais, tópica ou mucosais. As vias parenterais destinam-se à administração como injeção ou infusão e abrangem as vias sistêmica e local. Os tipos de injeção parenteral que podem ser usados para administrar a composição de poxvírus incluem intravenosa (em uma veia), intravascular (em um vaso sanguíneo), intra-arterial (em uma artéria como a artéria hepática), intradérmica (na derme), subcutânea (sob a pele), intramuscular (no músculo), intraperitoneal (no peritônio) e intratumoral (no tumor ou sua vizinhança próxima) e também por escarificação. A administração pode ser na forma de uma dose única em bolus ou pode ser, por exemplo, por uma bomba de perfusão contínua. As administrações na mucosa incluem, sem limitação, via oral/alimentar, intranasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal ou intrarretal. A administração tópica também pode ser realizada usando meios transdérmicos (por exemplo, adesivo e semelhantes). De preferência, a composição de poxvírus modificada é formulada para administração intravenosa ou intratumoral no tumor ou em sua vizinhança próxima).

[167] As administrações podem usar seringas e agulhas convencionais (por exemplo, agulhas de injeção Quadrafuse) ou qualquer composto ou dispositivo disponível na técnica capaz de facilitar ou melhorar a entrega do poxvírus modificado ao sujeito (por exemplo, eletroporação para facilitar a administração intramuscular). Uma alternativa é o uso de um dispositivo de injeção sem agulha (por exemplo, dispositivo Biojector™). Os adesivos transdérmicos também podem ser considerados.

[168] A composição descrita na presente invenção é adequada para uma única administração ou uma série de administrações. Também é possível proceder por meio de ciclos sequenciais de administrações que se repetem após um período de descanso. Os intervalos entre cada administração podem ser de três dias a cerca de seis meses (por exemplo, 24h, 48h, 72h, semanalmente, a cada duas semanas, mensal ou trimestral, etc.). Os intervalos também podem ser irregulares. As doses podem variar para cada administração dentro do intervalo descrito acima. Um esquema terapêutico preferido envolve 2 a 10 administrações semanais, possivelmente seguidas por 2 a 15 administrações em intervalos mais longos (por exemplo, 3 semanas) da composição de poxvírus.

MÉTODOS PARA USAR O POXVÍRUS DEFEITUOSO EM M2 E A COMPOSIÇÃO DA

INVENÇÃO

[169] Em outro aspecto, a composição descrita na presente invenção é para uso no tratamento ou prevenção de uma doença proliferativa de acordo com os exemplos de realização aqui descritos. Consequentemente, a invenção também provê um método de tratamento que compreende a administração da referida composição a um sujeito com tal necessidade (de preferência um sujeito que sofre de câncer) em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir tal doença, bem como um método para inibir o crescimento de células tumorais compreendendo a administração da composição ao sujeito.

No contexto da invenção, os métodos e o uso descritos na presente invenção objetivam retardar, curar, melhorar ou controlar a ocorrência ou a progressão da doença proliferativa.

[170] Conforme usado no presente documento, o termo “doença proliferativa” abrange um amplo grupo de várias doenças resultantes do crescimento e disseminação celular descontrolados, incluindo câncer, bem como doenças associadas a um aumento da atividade osteoclástica (por exemplo, artrite reumatoide, osteoporose, etc.) e doenças cardiovasculares (por exemplo, restenose que resulta da proliferação das células musculares lisas da parede dos vasos sanguíneos). A divisão e o crescimento celular desregulados podem resultar na formação de tumores malignos que invadem os tecidos vizinhos e também podem metastizar para partes distantes do corpo através do sistema linfático ou corrente sanguínea. O termo “câncer” pode ser usado indistintamente com qualquer um dos termos “tumor”, “malignidade”, “neoplasia”, etc., e pretende incluir de qualquer tipo de tecido, órgão ou célula, qualquer estágio de malignidade (por exemplo, de uma pré-lesão ao estágio IV) e abrange tumores sólidos e tumores transmitidos pelo sangue, bem como cânceres primários e metastáticos.

[171] Exemplos representativos de cânceres que podem ser tratados usando a composição e métodos da invenção incluem, sem limitação, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia e mais particularmente câncer ósseo, câncer gastrointestinal, câncer de fígado, câncer pancreático,

câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer de orofaringe, câncer de laringe, carcinoma de glândula salivar, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de cabeça ou pescoço, câncer de pele, câncer de células escamosas, melanoma, câncer uterino, câncer cervical, carcinoma endometrial, câncer vulvar, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de próstata, câncer do sistema endócrino, sarcoma de tecidos moles, câncer de bexiga, câncer de rim, glioblastoma e vários tipos de sistema nervoso central (SNC), etc. Em um exemplo de realização, os métodos e uso de acordo com da presente invenção é para o tratamento de um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata hormônio refratário), câncer de mama (por exemplo, câncer de mama metastático), câncer colorretal, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de fígado (por exemplo, hepatocarcinoma), câncer gástrico, carcinoma do ducto biliar, câncer endometrial, câncer de pâncreas e câncer de ovário.

[172] Normalmente, a administração da composição aqui descrita fornece um benefício terapêutico para o sujeito tratado que pode ser evidenciado por uma melhora observável do estado clínico em relação ao estado basal ou ao longo do estado esperado se não for tratado. Uma melhora do estado clínico pode ser facilmente avaliada por qualquer medição clínica relevante normalmente usada por médicos ou outro pessoal de saúde qualificado. No contexto da invenção, o benefício terapêutico pode ser transitório (por um ou alguns meses após a interrupção da administração) ou sustentado (por vários meses ou anos). Como o curso natural do estado clínico pode variar consideravelmente de um sujeito para outro, não é necessário que o benefício terapêutico seja observado em cada sujeito tratado, mas em um número significativo de sujeitos (por exemplo, diferenças estatisticamente significativas entre dois grupos podem ser determinadas por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como um teste paramétrico de Tukey, o teste de Kruskal-Wallis, o teste U de Mann e Whitney, o teste t de Student, o teste de Wilcoxon, etc.).

[173] Por exemplo, um benefício terapêutico em um sujeito que sofre de câncer pode ser evidenciado, por exemplo, por uma redução no número do tumor, uma redução do tamanho do tumor, uma redução no número ou extensão das metástases, um aumento no comprimento de remissão, uma estabilização (ou seja, não piora) do estado da doença, uma diminuição da taxa de progressão da doença ou na sua gravidade, uma sobrevida prolongada, uma melhor resposta ao tratamento padrão, uma melhora dos marcadores substitutos da doença, uma melhora na qualidade de vida, redução da mortalidade e/ou prevenção da recorrência da doença, etc.

[174] As medições apropriadas, como testes de sangue, análise de fluidos biológicos e biópsias, bem como técnicas de imagens médicas, podem ser usadas para avaliar um benefício clínico. Elas podem ser realizadas antes da administração (valor/linha basal) e em vários momentos durante o tratamento e após a interrupção do tratamento. Essas medições são avaliadas rotineiramente em laboratórios médicos e hospitais e um grande número de kits está disponível comercialmente (por exemplo, imunoensaios, ensaios quantitativos de PCR).

[175] Um exemplo de realização preferido é direcionado a uma composição compreendendo um poxvírus modificado, desejavelmente um poxvírus oncolítico modificado e de preferência um vírus vaccinia oncolítico (por exemplo, da cepa Copenhagen) com uma preferência específica para um vírus vaccinia oncolítico que codifica um anticorpo anti-CTLA-4 como descrito na presente invenção para uso no tratamento de um sujeito com câncer, e de preferência um câncer renal, um câncer colorretal, um câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), um melanoma e um câncer de ovário.

[176] Em outro exemplo de realização, o poxvírus modificado ou composição aqui descrita é para uso para aumentar uma resposta imune adaptativa antitumoral ou para aumentar ou prolongar uma resposta antitumoral.

[177] Em outro aspecto, o poxvírus modificado ou composição do mesmo é usado ou administrado para estimular ou melhorar uma resposta imune no sujeito tratado. Consequentemente, a presente invenção também abrange um método para estimular ou melhorar uma resposta imune que compreende a administração da composição ao sujeito com tal necessidade, em uma quantidade suficiente de acordo com os exemplos de realização aqui descritos, de modo a estimular ou melhorar a imunidade do sujeito. A resposta imune estimulada ou melhorada pode ser específica (isto é, direcionada a epítopos/antígenos) e/ou não específica (inata), humoral e/ou celular, notavelmente uma resposta de células T mediada por CD4 + ou CD8+. A capacidade da composição aqui descrita em estimular ou melhorar uma resposta imune pode ser avaliada in vitro (por exemplo, usando amostras biológicas coletadas do sujeito) ou in vivo usando uma variedade de ensaios diretos ou indiretos que são padrão na técnica (vide. por exemplo, Coligan et al., 1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health ou edições subsequentes). Os citados acima em relação à natureza antigênica de um polipeptídeo também são apropriados.

[178] Em particular e em comparação com um poxvírus convencional (positivo para m2), o poxvírus modificado ou a composição aqui descrita também é útil para qualquer um dos seguintes fins ou qualquer combinação dos mesmos: - para estimular ou melhorar uma resposta imune mediada por linfócitos (especialmente contra um polipeptídeo antigênico);

- para estimular ou melhorar a atividade da APC; - para estimular ou melhorar uma resposta antitumoral; - para estimular ou melhorar a via de sinalização de CD28; - para melhorar a eficácia terapêutica fornecida pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção em um sujeito tratado ou um grupo de sujeitos tratados; e/ou - para reduzir a toxicidade fornecida pelo poxvírus modificado aqui descrito em um sujeito tratado ou um grupo de sujeitos tratados.

TERAPIA COMBINADA

[179] Em um exemplo de realização, o poxvírus modificado, composição ou métodos da invenção são usados como terapia independente.

Em outro exemplo de realização, eles podem ser usados ou realizados em conjunto com uma ou mais terapias adicionais, em particular terapia(s) padrão de cuidado(s) que são apropriadas para o tipo de câncer que aflige o sujeito tratado. As terapias padrão de tratamento para diferentes tipos de câncer são bem conhecidas pelos versados na técnica e geralmente divulgadas na Rede do Câncer e diretrizes de prática clínica. Tais terapias adicionais são selecionadas a partir do grupo que consiste em cirurgia, radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia com toxinas, imunoterapia, terapia com citocinas, terapia do câncer direcionada, terapia genética, terapia fotodinâmica e transplante, etc.

[180] Essa(s) terapia(s) anticâncer adicionais é(são) administrada(s) ao sujeito de acordo com a prática padrão antes, depois, simultaneamente ou de uma maneira intercalada com o poxvírus modificado ou composição aqui descrita. A administração concomitante de duas ou mais terapias não requer que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo ou pela mesma via, desde que exista uma sobreposição no período de tempo durante o qual a composição e a terapia adicional anticâncer estão exercendo efeito terapêutico. A administração simultânea inclui a administração da composição de poxvírus modificada no mesmo dia (por exemplo, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 horas) como o outro agente terapêutico. Embora qualquer ordem seja contemplada pela presente invenção, é preferido que a composição de poxvírus modificada seja administrada ao sujeito antes do outro agente terapêutico.

[181] Em exemplos de realização específicos, o poxvírus modificado ou a composição aqui descrita podem ser usados em conjunto com a cirurgia. Por exemplo, a composição pode ser administrada após ressecção cirúrgica parcial ou total de um tumor (por exemplo, por aplicação local dentro da zona excisada, por exemplo).

[182] Em outros exemplos de realização, o poxvírus modificado ou a composição aqui descrita podem ser usados em associação com radioterapia. Os versados na técnica podem formular prontamente protocolos e parâmetros de radioterapia apropriados (vide, por exemplo, Perez e Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2a Ed. JB Lippincott Co; usando adaptações e modificações apropriadas como será prontamente evidente para aqueles qualificados na área). Os tipos de radiação que podem ser usados notavelmente no tratamento do câncer são bem conhecidos no estado da técnica e incluem feixes de elétrons, fótons de alta energia de um acelerador linear ou de fontes radioativas, como cobalto ou césio, prótons e nêutrons. As faixas de dosagem dos radioisótopos variam amplamente e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo de radiação emitida e da captação pelas células neoplásicas. Doses regulares de raios-X por períodos prolongados de tempo (3 a 6 semanas), ou altas doses únicas são contempladas pela presente invenção.

[183] Em certos exemplos de realização, o poxvírus modificado ou a composição aqui descrita podem ser usados em conjunto com a quimioterapia. Exemplos representativos de agentes quimioterápicos adequados atualmente disponíveis para o tratamento de câncer incluem, sem limitação, agentes alquilantes, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, derivados de platina, inibidores de receptores de tirosina quinase, ciclofosfamidas, antimetabólitos, agentes de dano ao DNA e agentes antimitóticos. Exemplos representativos de agentes quimioterápicos adequados atualmente disponíveis para o tratamento de doenças infecciosas incluem, entre outros antibióticos, antimetabólitos, antimitóticos e drogas antivirais (por exemplo, interferon alfa).

[184] Em outros exemplos de realização, o poxvírus modificado ou a composição descrita na presente invenção podem ser usados em conjunto com imunoterapêuticos, como anticorpos antineoplásicos, bem como siRNA e polinucleotídeos antissenso.

[185] Em outros exemplos de realização, o poxvírus modificado ou a composição aqui descrita podem ser usados em conjunto com um adjuvante. Exemplos representativos de adjuvantes adequados incluem, sem limitação, ligantes TLR3 (Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88 (10): 5242-55), ligantes TLR9 (por exemplo, Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 1163- 74; Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127; Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8 (1): 60-6; EP 1 162 982; US 7.700.569 e US

7.108.844) e inibidores de PDE5, como sildenafil (US 5.250.534, US 6.469.012 e EP 463 756).

[186] Em exemplos de realização adicionais, o poxvírus modificado ou a composição aqui descrita pode ser usado de acordo com uma abordagem de reforço inicial que compreende administrações sequenciais de uma composição de iniciação (priming) e uma composição de reforço (boost). Normalmente, as composições de iniciação e de reforço usam diferentes vetores que codificam pelo menos um domínio antigênico em comum, com pelo menos um sendo o poxvírus modificado descrito na presente incenção. Além disso, as composições de imunização inicial e reforço podem ser administradas no mesmo local ou em locais alternativos pela mesma via ou por diferentes vias de administração.

[187] Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos e das reivindicações. Os exemplos a seguir são incorporados para ilustrar exemplos de realização preferidos da invenção. No entanto, à luz da presente divulgação, aqueles versados na técnica devem compreender que podem ser feitas mudanças nos exemplos de realização específicos que são divulgados sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

EXEMPLOS MATERIAL E MÉTODOS PROTEÍNAS E VÍRUS

[188] As proteínas de fusão Fc recombinantes (humana e murina) com ou sem um marcador histidina (His-Tag) em seu C-terminal foram solicitadas na R&D Systems. CD80-Fc e CD86-Fc humanos foram biotinilados internamente usando éster N-hidroxisuccinimida do ácido Biotinamidohexanoil- 6-aminohexanóico (Sigma).

[189] Vários vírus vaccinia foram usados: - vaccinia tipo selvagem (cepas Copenhagen, Wyeth e Western Reserve); - Vírus vaccinia com deleção dupla (cepa Copenhagen) defeituoso para as atividades de timidina quinase e ribonucleotídeo redutase (tk-; rr-; descrito no documento WO2009/065546).

- Vírus vaccinia com deleção tripla (cepa Copenhagen) defeituoso para as atividades tk-, rr- e m2-. O vírus com deleção tripla foi gerado a partir do vírus com deleção dupla tk-rr- por recombinação homóloga específica na fase de leitura aberta do locus M2L como descrito a seguir.

[190] Além do vírus vaccinia, todos os poxvírus testados, a menos que especificado de outra forma, eram cepas tipo selvagem.

DELEÇÃO DE M2L NO VÍRUS VACCINIA RR-, TK-

[191] Para estudos in vivo, vírus vaccinia com deleção dupla (tk- rr-) e tripla (tk-rr- m2-) foram manipulados para codificar a luciferase no locus J2R sob o promotor p11K7.5.

[192] A deleção do gene M2L introduzida no genoma VV abrange 64 nucleotídeos a montante da ORF de m2 e os 169 primeiros códons da ORF de m2. A deleção foi realizada por recombinação homóloga usando um plasmídeo de transferência de origem PUC18. Este plasmídeo de transferência continha um braço esquerdo (nt26980 a 27479 de Acesso do genoma VV M35027) e um braço direito (nt28051 a 28550) separados por um cassete de expressão que codifica a fusão de marcadores de seleção proteína verde fluorescente aprimorada/xantina-guanina fosforibosil transferase (EGFP/GPT) sob controle do promotor de pH5R do vírus vaccinia. O plasmídeo resultante foi transfectado por eletroporação em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) infectados pelo vírus vaccinia que codifica a luciferase (rr -; tk -/luciferase) usando o Nucleofactor Amaxa. O vírus recombinante foi isolado por seleção EGFP/GPT. A deleção de M2L e a inserção do cassete EGFP/GPT foram confirmadas por análise de PCR. O cassete de seleção EGFP/GPT foi removido passando o vírus recombinante em CEFs sem seleção. Um estoque de pesquisa primária foi produzido em CEFs. A deleção do gene M2L foi verificada por PCR e sequenciamento.

[193] O vírus foi produzido em CEF após infecção a MOI 0,05 e três dias de incubação. Três dias após as infecções, a coleta bruta contendo células infectadas e o sobrenadante da cultura foi recuperado e armazenado a -20ºC até o uso. Antes da purificação, esta suspensão foi homogeneizada para liberação das partículas virais. Grandes detritos celulares foram então eliminados por filtração profunda. A suspensão viral clarificada foi subsequentemente concentrada e diafiltrada com o tampão de formulação usando filtração de fluxo tangencial e filtros de microfiltração de fibra oca.

Finalmente, o vírus purificado foi adicionalmente concentrado usando o mesmo sistema de filtração de fluxo tangencial, dividido em alíquotas e armazenado a - 80ºC até o uso.

ENSAIO ELISA PARA LIGAÇÃO DE B7

[194] Placas de noventa e seis poços (placa imune Nunc Medisorp) foram revestidas, durante a noite a 4ºC, com 100 µL de 0,5 µg/mL de proteínas B7, CTLA4 ou CD28 em tampão de revestimento (carbonato de Na a 50 mM pH 9,6). As microplacas foram lavadas com PBS/Tween20 a 0,05% e saturadas com 200 µL de solução de bloqueio (PBS; Tween20 a 0,05%; Leite em pó desnatado a 5% (Biorad)). Todas as preparações e diluições de anticorpos foram feitas em solução de bloqueio. Cem µL de amostras foram adicionados a cada poço em triplicatas e em diluições seriadas de duas vezes para alguns experimentos (curvas de ligação). As microplacas foram então incubadas com 100 µL de anti-Flag-HRP (Sigma) diluído 10.000 vezes. As microplacas foram então incubadas com 100 μL/poço de 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) e a reação foi interrompida com 100 mL de H2SO4 2M. A absorbância foi medida a 450 nm com um leitor de placas (TECAN Infinite M200PRO). Os valores de absorbância foram transferidos para o software GraphPadPrism para análise e representação gráfica.

ELISA COMPETITIVO

[195] As condições experimentais e a solução, não especificadas de outra forma, eram idênticas às descritas acima. Para os ensaios competitivos CTLA4/CD80, CD28/CD80 e PDL1/CD80, 100 µL de CTLA4, CD28 e PDL1 foram revestidos a 0,25 (CTLA4) ou 1 µg/mL (CD28 e PD-L1). As amostras foram adicionadas e diluídas (diluição em série de duas vezes) em solução de bloqueio contendo concentração constante de CD80 (50, 250 ou 500 ng/mL para CTLA4, CD28 e PD-L1 respectivamente). Para ensaios competitivos de CD86/CTLA4 e CD28/CD86, 100 µL de CD86 ou CD28 foram revestidos a 0,25 (CD86) ou 2 µg/mL (CD28). As amostras foram adicionadas e diluídas (diluição seriada de duas vezes) em solução de bloqueio contendo concentração constante de CTLA4 (100 ng/mL) ou CD86 (500 ng/mL), respectivamente. Tanto anti-His-tag–HRP (Qiagen) a 1/2000 quanto estreptavidina HRP (Southern Biotech) a 1/1000 foram usados como reagentes conjugados. As placas foram posteriormente tratadas e os resultados analisados, conforme descrito acima.

WESTERN BLOT

[196] Vinte e cinco microlitros de amostras foram preparadas em tampão LaemmLi contendo 5% de β-mercaptoetanol (BME) (condição redutora) ou não (condição não redutora). Após a eletroforese no critério TGX 4-15% de gel sem corante (BioRad), as proteínas foram transferidas para membrana PVDF (Transblot Turbo System). O sistema IBind Flex Western (Invitrogen) foi usado para as incubações e lavagens de proteínas/anticorpos. Os blots foram sondados com 2,5 µg/mL de CD80-Fc, CD86-Fc, CTLA4-Fc ou anti-Flag-HRP a 1/1000. Para CD80-Fc, CD86-Fc e CTLA4-Fc, um anti-Fc Humano HRP (Betil) a 1/3000 foi usado como anticorpo conjugado. A solução 1X iBind Flex foi usada para bloquear, diluir os anticorpos, lavar e umedecer o cartão iBind Flex.

Os imunocomplexos foram detectados utilizando os reagentes da Amersham ECL Prime Western Blotting. A quimioluminescência foi registrada com um dispositivo Molecular Imager ChemiDOC XRS (Biorad).

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

[197] Os sobrenadantes de CEF infectadas (MOI 0,05) por MVA ou vírus vaccinia Copenhagen foram coletados 72 horas após a infecção. Os sobrenadantes foram centrifugados e filtrados em filtros de 0,2 µm para remover a maioria dos detritos celulares e vírus vaccinia. Os sobrenadantes tratados suplementados com 0,05% de Tween 20 foram então concentrados ~ 20 vezes usando o concentrador vivaspin20 com cut-off de 30.000 MWCO (Sartorius). As esferas magnéticas de estreptavidina (GE Healthcare) foram revestidas com um anticorpo monoclonal biotinilado irrelevante (chCXIIG6), CTLA4-Fc-Biot ou CD86-Fc-Biot. Quatro mL de sobrenadantes concentrados (MVA e vírus vaccinia Copenhagen) foram incubados com 24 µL de grânulos de chCXIIG6-estreptavindina para remover a ligação inespecífica. Os fluxos desta primeira incubação foram divididos em 2 partes iguais e incubados com grânulos de estreptavidina CTLA4-Fc-Biot ou grânulos de estreptavidina CD86- Fc-Biot para produzir os quatro seguintes braços: sobrenadante MVA + esferas CTLA4 (MVA A4); sobrenadante MVA + esferas CD86 (MVA CD); Vírus vaccinia + esferas de CTLA4 em sobrenadante (VV A4) e vírus vaccinia + esferas de CD86 (VV CD86). As esferas foram extensivamente lavadas com PBS, Tween20 a 0,05% seguido por PBS e as proteínas ligadas foram eluídas duas vezes com 50 µL de ácido acético 0,1 M neutralizado imediatamente por adição de 4 µL de Tris Base 2M. As duas eluições foram então agrupadas antes da análise de MS.

PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS PARA DIGESTÃO

[198] Dez ou 20 µL da amostra foram evaporados e submetidos à redução por solubilização em 10 µL de DTT 10 mM em NH4HCO3 a 25 mM (1H a 57ºC). Resíduos de cisteína reduzidos foram alquilados em 10 µL de 55 mM de iodoacetamida em 25 mM de NH4HCO3 30 min à temperatura ambiente no escuro. A tripsina (12,5 ng/mL; Promega V5111) diluída no momento do uso em 25 mM de NH4HCO3 foi adicionada à amostra em uma proporção de 1:100 (enzima/proteína) a um volume final de 30 μL e incubada por 5 horas a 37ºC. A atividade da tripsina é inibida pela acidificação com 5 µL de H2O/TFA 5%.

ANÁLISE DE MS/MS

[199] As amostras foram analisadas em um sistema nanoUPLC (nanoAcquity, Waters) acoplado a um espectrômetro de massa híbrido quadrupolo-Orbitrap (Q-Exative plus, Thermo Scientific, San Jose, CA). O sistema UPLC foi equipado com uma pré-coluna Symmetry C18 (20 х 0,18 mm, tamanho de partícula de 5 µm, Waters, Milford, EUA) e uma coluna de separação ACQUITY UPLC® BEH130 C18 (75 µm × 20 0 mm, tamanho de partícula de 1,7 µm, Waters). O sistema de solventes consistia em 0,1% de ácido fórmico em água (solvente A) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (solvente B). Dois µL de cada amostra foram injetados. Os peptídeos foram capturados durante 3 min a 5 µL/min com 99% A e 1% B. A eluição foi realizada a 60ºC a uma velocidade de fluxo de 400 nL/min, usando um gradiente linear de 79 minutos de 1-35% B. Para minimizar o efeito residual (carry-over), uma lavagem da coluna (50% ACN durante 20 min.) foi incluída entre cada amostra, além de uma injeção de branco apenas com solvente, que foi realizada após cada amostra.

[200] O Q-Exative Plus foi operado no modo de íon positivo com a temperatura da fonte ajustada para 250ºC e a voltagem do spray para 1,8 kV.

Os espectros de varredura completa de MS (300-1800 m/z) foram adquiridos em uma resolução de 140.000 em m/z 200, um tempo máximo de injeção de 50 ms e um valor alvo de AGC de 3 x 106 cargas com a opção de massa bloqueada sendo habilitada (445,12002 m/z). Até 10 precursores mais intensos por varredura completa foram isolados usando uma janela de 2 m/z e fragmentados usando dissociação colisional de maior energia (HCD, energia de colisão normalizada de 27eV) e exclusão dinâmica de precursores já fragmentados foi definida para 60 segundos. Os espectros de MS/MS foram adquiridos com uma resolução de 17.500 a m/z 200, um tempo máximo de injeção de 100 ms e um valor alvo de AGC de 1 x 10 5. O sistema foi totalmente controlado pelo software XCalibur (v3.0.63; Thermo Fisher Scientific) INTERPRETAÇÃO DE DADOS DE MS/MS

[201] Os dados de MS/MS foram pesquisados contra um banco de dados de Gallus gallus e vírus vaccinia Uniprot, derivado de banco de dados alvo-isca (target-decoy database) combinado (01-04-2018, contendo 33939 sequências alvo mais o mesmo número de sequências de isca invertidas) usando Mascot (versão 2.5.1, Matrix Science, Londres, Inglaterra). As proteínas alvos hCTLA4, hCD86 e hCXIIG6 e alvo-isca foram adicionadas manualmente ao banco de dados. O banco de dados incluindo contaminantes comuns (queratinas humanas e tripsina suína) e foi criado usando uma caixa de ferramentas de geração de banco de dados interna (http://msda.u- strasbg.fr). Os seguintes parâmetros foram aplicados: uma clivagem perdida por tripsina e modificações variáveis (oxidação da metionina (+16 Da), carbamidometilação da cisteína (+57 Da), foram considerados. A janela de busca foi definida para 25 ppm para íons precursores e 0,07 Da para fragmentos de íons. Os arquivos de resultados do Mascot (.dat) foram importados para o software Proline (http://proline.profiproteomics.fr/) e as proteínas foram validadas em uma classificação bastante igual a 1, 1% FDR em correspondências de espectro de peptídeo com base em e-valor ajustado, pelo menos 1 peptídeo específico por proteína, 1% FDR em conjuntos de proteínas e pontuação Mudpit modificada por Mascot.

REAÇÃO DE LINFÓCITOS MISTOS (MLR)

[202] A capacidade do vírus m2- de ativar linfócitos foi avaliada em ensaios de MLR. As células CEF foram infectadas (MOI 0,05) por COPTG19289, VVTG18058 ou MVAN33 e os sobrenadantes da cultura foram coletados 48h após a infecção e concentrados ~ 20 vezes usando o concentrador vivaspin 20 com valor de cut-off de 30000 MWCO (Sartorius). Os sobrenadantes concentrados foram adicionados (20 µL em 200 µL) não diluídos ou diluídos 10 e 100 vezes para produzir uma “concentração de sobrenadante” final de 2, 0,2 e 0,02 vezes, respectivamente.

[203] Sangue de diferentes doadores saudáveis foi adquirido no Etablissement Français du sang (EFS Grand Est, 67065 Strasbourg). As PBMCs foram purificadas pelo método Ficoll-Paque (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare) e ressuspensas em cerca de 1x107 células/mL em meio RPMI suplementado com 20% de SBF (soro bovino fetal) e 10% de DMSO e armazenados a -150ºC até o uso. As PBMCs foram descongeladas a 37ºC, ressuspensas em meio RMPI com 10% de SBF e centrifugadas 5 minutos a 300 g. As células coletadas foram ressuspensas em meio RMPI + SBF a 10% e a concentração de células foi ajustada para 3x10 6 células/mL. Cem µL de PBMCs de dois doadores diferentes foram misturados em um poço de uma microplaca de 96 poços em triplicatas. Vinte μL de sobrenadantes de células infectadas descritos acima foram adicionados a cada poço e as microplacas foram incubadas 72 horas a 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2.

[204] Os sobrenadantes da cultura da MLR foram então coletados e a Interleucina-2 humana (IL-2) medida por ELISA usando o kit IL- 2*-2ELISA MAX™ deluxe Set (BioLegend). As medições foram normalizadas por divisão da média da concentração de IL-2 das três réplicas de uma dada amostra pela média da concentração de IL-2 das três repetições de PBMCs incubadas com meio.

EXPERIMENTOS IN VIVO EM CAMUNDONGOS NCG -34+ HUMANIZADOS

HUMANIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS

[205] A cepa de camundongo imunodeficiente (NCG) NOD/Shi- scid/IL-2Rγnull foi fornecida pela Taconic. Animais de quatro semanas de idade foram tratados por via intraperitoneal com busulfano (quimioablação) e injetado por via intravenosa (I.V.) no dia seguinte com células-tronco humanas CD34+ (50.000 células por camundongo). Quatorze semanas após a injeção de células, o nível de enxerto foi monitorado por análise de células CD45+ humanas entre leucócitos sanguíneos totais por citometria de fluxo. A taxa de humanização foi definida como a razão de hCD45 circulante/CD45 total (mCD45 + hCD45).

FENÓTIPO IMUNOLÓGICO DE LINFÓCITOS T

[206] O sangue (100 μ L) foi coletado do seio retro-orbital 2 dias antes do enxerto do tumor. Populações de linfócitos humanos, CD45 + CD3+, CD3+CD4+ e CD3+CD8+ foram avaliados por citometria de fluxo (Attune NXT, Lifetechnologies) usando anticorpos direcionados contra hCD45 (Ref 56 3879; BD), CD4 (Ref 130-092-373; Miltenyi), CD3 (Ref 130- 1 09- 462; Miltenyi) e CD8 (Ref 130-09 6 - 561; Miltenyi), bem como um marcador amarelo de células vivas/mortas (Ref L34968; Thermofisher). Resumidamente, as amostras de sangue foram incubadas com os vários anticorpos durante 30 min a 4ºC. Em seguida, os glóbulos vermelhos foram lisados usando tampão de lise de alto rendimento (HYL250; Thermo Fischer Scientific) em temperatura ambiente (RT) por 15 min, seguido diretamente por análise de citometria de fluxo (Attune NxT, Life technologies).

TRATAMENTO COM VÍRUS ONCOLÍTICOS

[207] Células de carcinoma colorretal humano HCT-116 foram adquiridas da ATCC (CCL-247 TM), cultivadas em meio 5A de McCoy suplementado com 10% de SBF + penicilina/estreptomicina e separadas com tripsina a 37ºC por 10 min. Após a lavagem, as células foram ressuspensas em PBS estéril a 5 x 107 células/mL e 100 μL da suspensão celular (5x106 células) foram injetados por via subcutânea no flanco de um dos camundongos.

Quando o volume tumoral médio quase atingiu 70 mm 3, os camundongos foram randomizados em cinco grupos (5 camundongos/grupo) com base em sua taxa de humanização e tamanho do tumor: - Grupo 1 recebeu veículo

- Grupo 2 recebeu 105 pfu de VV TG18058 - Grupo 3 recebeu 106 pfu de VV TG18058 - Grupo 4 recebeu 105 pfu de COPTG19289 - Grupo 5 recebeu 106 pfu de COPTG19289

[208] Para cada grupo, uma única injeção intravenosa (IV) de 100 μL da reparação viral foi realizada no dia da randomização, definida como D0. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto a sinais inesperados de angústia. O peso corporal e o volume tumoral foram monitorados 3 vezes por semana. Os diâmetros do tumor foram medidos usando um paquímetro. Os volumes do tumor (em mm 3) foram calculados de acordo com a seguinte fórmula: Volume = 1/2 (comprimento x largura 2). Os animais foram sacrificados quando o volume do tumor superior a 1.500 mm 3 ou quando a perda de peso corporal foi superior a 25%.

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DA CAPACIDADE DA PROTEÍNA M2 DO VÍRUS VACCINIA DE INTERFERIR COM A VIA COESTIMULATÓRIA MEDIADA POR B7 E CARACTERIZAÇÃO

DE SUAS PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO

OS SOBRENADANTES DE CÉLULAS INFECTADAS COM O VÍRUS VACCINIA INIBEM A INTERAÇÃO DE CTLA4 COM CD80 OU CD86

[209] Dois ensaios foram configurados para monitorar quantitativamente as atividades de bloqueio de CD80/CTLA4 e CD86/CTLA4 fornecidas pelos diferentes vírus candidatos. Nestes ensaios, CTLA4 humano (hCTLA4) foi imobilizado em placa de ELISA e hCD80 tagged solúvel ou hCD86 foram adicionados. Neste cenário, qualquer molécula competitiva que se liga ao parceiro imobilizado ou solúvel irá induzir uma diminuição do sinal (ensaio competitivo). O anticorpo anti-hCTLA4 Ipilimumabe (Yervoy) e o sobrenadante de DF1 não infectadas (linhagem de células de galinha disponível; por exemplo, da ATCC® CRL-12208) foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. Surpreendentemente, como Yervoy que interage com hCTLA-4 revestido, todos os sobrenadantes de células infectadas pelo vírus vaccinia (cepas Copenhagen, Wyeth e Western Reserve) foram considerados competitivos na forma de resposta à dose com os ensaios de CD80/CTLA4 e CD86/CTLA4 (Figuras 1A e 1B), enquanto o sobrenadante das células DF1 não infectadas não teve qualquer efeito. De maneira interessante, os sobrenadantes de DF1 infectados pelo vírus vaccinia Ankara modificado (MVA) não estavam produzindo qualquer inibição das interações hCTLA4/hCD80 e hCTLA4/hCD86, indicando que esta capacidade de interferência não é conservada neste vírus que perdeu seis fragmentos genômicos (deleções I a VI) durante seu processo de atenuação (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que algo nos sobrenadantes VV interferiu na ligação de CTLA-4 com CD80 e CD86.

[210] Para descartar qualquer artefato envolvendo células ou componentes do meio, diferentes linhagens de células de diferentes origens (linhagens de células tumorais primárias e humanas) foram testadas e um método de competição FACS também foi testado.

[211] A análise de competição FACS foi realizada usando uma linhagem de células humana (isto é, KM-H2, de linfoma de Hodgkin) exibindo hCD80 e hCD86 naturalmente em sua superfície. A ligação de CTLA4-Fc recombinante solúvel às células KM-H2 foi mostrada usando um anticorpo anti- Fc conjugado com fluorocromo. Quando coincubados com CTLA-4-Fc, os sobrenadantes de células infectadas por vírus vaccinia competiram com CTLA- 4-Fc pela ligação às células KM-H2 em contraste marcado a células MVA- infectadas que se comportam como o controle negativo (dados não mostrados).

[212] O ELISA competitivo foi realizado usando sobrenadantes de células HeLa (em vez de DF1) infectadas com diferentes poxvírus para avaliar sua capacidade de interferir com a ligação de CTLA4 ao CD80 ou

CD86. Várias cepas do vírus vaccinia (Wyeth, WR e Copenhagen) foram testadas, bem como outros ortopoxis (por exemplo, varíola do coelho, varíola bovina, MVA), avipox (varíola das aves) e vírus parapox (vírus da pseudovaríola bovina). As células HeLa não infectadas são usadas como controle negativo. Neste experimento de triagem, células HeLa foram infectadas com diferentes poxvírus em um alto MOI (MOI 1) para garantir uma infecção ótima e os sobrenadantes resultantes foram coletados e testados avaliando sua capacidade de inibir a ligação de CTLA4-Fc a CD80 (representado como OD450nm). Conforme ilustrado na Figura 2, todos os sobrenadantes de células infectadas com as três cepas do vírus vaccinia ou com vírus da varíola do guaxinim (RCN), varíola do coelho (RPX) e varíola bovina (CPX) foram capazes de interferir com a ligação de hCTLA4 a hCD80.

Esses resultados indicam que um fator secretado durante a infecção com esses poxvírus estava interferindo na via CTLA4-B7. O novo fator desconhecido envolvido nesta atividade inibitória foi denominado “fator de interferência” (FI). Novamente, os sobrenadantes de células infectadas com MVA e alguns outros poxvírus, como o vírus pseudovaríola bovina (PCPV) e o fowlpoxvirus (FPV), não exibiram qualquer inibição das interações CTLA4/CD80-CD86 como as células HeLa não infectadas (HeLa).

O “FATOR DE INTERFERÊNCIA” ESTÁ PRESENTE NOS SOBRENADANTES DO VÍRUS VACCINIA, MAS NÃO NOS SOBRENADANTES MVA

[213] Para descobrir com qual molécula presente nos sobrenadantes infectados com VV, o IF estava interagindo, um Western blot dos sobrenadantes de CEF (também designado CEP) não infectado ou infectado com MVA ou vírus vaccinia foi sondado com os três componentes do ensaio ELISA descrito acima (nomeadamente hCD80, hCD86 e hCTLA4). As CEFs foram escolhidas por serem permissivas tanto ao vírus vaccinia quanto ao MVA que produzem, ou não, o IF, respectivamente. Cada proteína usada para a sondagem por Western blot foi uma fusão com uma parte Fc que permite, entre outras coisas, sua dimerização e sua detecção com o mesmo anticorpo conjugado anti-Fc. Cada sobrenadante foi usado como tal ou concentrado 20 vezes (x20). Os blots apresentados na Figura 3 demonstraram inequivocamente que uma molécula grande de cerca de 200 kDa estava presente apenas nos sobrenadantes infectados com vírus vaccinia e destacados com hCD80 e hCD86, mas não com hCTLA4 (pelo menos nestas condições de imunotransferência). Esta banda é facilmente detectada mesmo em sobrenadantes não concentrados. A reatividade com hCD80-Fc e hCD86- Fc foi perdida em condições de redução (sem detecção de qualquer banda), indicando que as ligações dissulfeto intra e/ou inter são necessárias para manter a estrutura do IF e a interação com CD80 e CD86 (dados não mostrados). Em contraste marcante, nenhuma banda foi destacada nos sobrenadantes de MVA.

CARACTERIZAÇÃO DAS PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO: “FATOR DE INTERFERÊNCIA” PRESENTE NO SOBRENADANTE DO VÍRUS VACCINIA INIBE A LIGAÇÃO DE CD80 E CD86 A CTLA4 E CD28, MAS POTENCIALIZA A LIGAÇÃO DE CD80 COM PD-L1

[214] Como discutido acima, CD80 e CD86 são antígenos de coestimulação importantes envolvidos na regulação da resposta de células T adaptativas. Como CD80 e CD86 estão envolvidos em várias interações moleculares com resultados negativos (CTLA4 para ambos, e PD-L1 para CD80 apenas) e positivos (CD28) em termos de resposta imune, diferentes ELISAs foram configurados para decifrar o efeito do IF em cada uma dessas 5 interações específicas. Os sobrenadantes não diluídos de CEF infectados com vírus vaccinia não recombinante (VV) foram testados nestes diferentes ensaios e comparados com o sobrenadante de CEF infectado com MVA e o anticorpo anti-hCTLA4 Yervoy (10 µg/mL). Os sobrenadantes de células CEF não infectadas são usados como controle negativo. Conforme ilustrado na Figura 4,

o sobrenadante VV inibiu a interação de CD80 e CD86 com CTLA4 (como evidenciado por uma diminuição impressionante da absorbância a OD450nm) de forma semelhante a Yervoy (como esperado devido à ligação de Yervoy ao seu alvo CTLA-4 que impede o acesso ao CD80 e, portanto, ligação CTLA4/CD80). Em notável contraste, os sobrenadantes de células infectadas com MVA não tiveram efeito (mesma absorbância que o controle CEF negativo). Além disso, os sobrenadantes VV também foram capazes de abolir a interação positiva de CD80 ou CD86 com CD28 (forte diminuição da absorbância em OD450nm em relação à absorbância medida com o sobrenadante de células CEF não infectadas). Em contraste, os sobrenadantes de células infectadas com MVA e Yervoy (como esperado para um anticorpo que tem como alvo apenas o receptor CTLA4) não tiveram efeito (mesma absorbância que o controle negativo). Esses resultados confirmam a presença de um “IF” nos sobrenadantes de células infectadas com VV, enquanto o genoma de MVA não produz tal fator.

[215] Surpreendentemente, a interação PD-L1/CD80 foi aumentada pela presença de sobrenadantes do vírus vaccinia (forte aumento da absorbância de OD450nm em relação ao controle negativo) reforçando a sinalização imunossupressora mediada por PDL1. Em contraste, os sobrenadantes de CEF infectados com Yervoy e MVA não tiveram impacto em PDL1/CD80 (mesma absorbância do controle não infectado). Como esperado, hCD80, hCTLA4 e hPD1 recombinantes aboliram esta interação. Este resultado indica que os sítios de ligação IF e CTLA4 em CD80 não estão completamente sobrepostos. Deve-se notar que a interação CD80/PD-L1 foi recentemente envolvida para a sobrevivência de Treg.

[216] Estes resultados destacam as propriedades imunossupressoras melhoradas exibidas pelo polipeptídeo poxviral m2. De fato, m2 empurra em direção às vias imunossupressoras bloqueando

CD80/CD28, CD86/CD28 e potencializando as vias PDL1-CD80, enquanto CTLA4-Fc inibe essas três vias, incluindo a interação imunossupressora PDL1- CD80.

IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA POXVIRAL M2 COMO SENDO O FATOR DE INTERFERÊNCIA

[217] Com base no peso molecular aparente de aproximadamente 200 kDa e no fato de que o IF não estava presente nos sobrenadantes infectados com MVA, os 37 genes que são diferentes entre a cepa Copenhagen do vírus vaccinia e o MVA foram investigados para um candidato potencial sem encontrar nenhum óbvio. Nenhuma proteína de cerca de 200 kDa pôde ser identificada. A maior proteína codificada, dentre esses genes 37 candidatos, é a subunidade da RNA polimerase dependente de DNA rpo147 (J6R) com uma massa teórica de 147 kDa, portanto inferior aos 200 kDa observados. Com base na estrutura primária, não havia candidata de proteína viral óbvia que pudesse ser ligada ao IF.

[218] Portanto, uma abordagem experimental para identificar o IF foi tentada usando uma cromatografia de afinidade (vide o esquema da Figura 5A) para capturar o IF. Um sobrenadante concentrado 20 vezes de CEF infectado com vírus vaccinia (infectado com VV) foi carregado nesta cromatografia de afinidade. Um sobrenadante concentrado 20 vezes de células infectadas com MVA (infectadas com MVA) foi processado em paralelo. Os sobrenadantes de VV e MVA foram submetidos a CTLA4 imobilizado (controles negativos) ou fusão CD86-Fc imobilizado antes de serem eluídos com ácido.

As diferentes eluições dos braços de cromatografia de afinidade foram analisadas por MS/MS (espectrometria de massa) após digestão tripsica. Os dados m/z obtidos foram usados para sondar em bancos de dados de frango (Gallus gallus) e do vírus vaccinia. Uma correspondência (hit) foi obtida apenas a partir do sobrenadante CEF infectado com vaccinia incubado com grânulos revestidos com CD86 que cobre 75% (incluindo o peptídeo sinal) ou 82% (sem o sinal do peptídeo) da proteína m2 do vírus vaccinia codificada pelo locus M2L (Figura 5B onde a sequência coberta pelos peptídeos detectados está indicada em negrito). Este resultado está totalmente de acordo com a ausência do locus M2L no genoma do MVA e com o fato de que m2 tem um peptídeo sinal predito que o torna uma proteína secretada putativa.

[219] No entanto, a proteína m2 tem um peso molecular calculado de apenas 25 kDa e foi relatado que migra em SDS-PAGE em condições redutoras como uma proteína de 35 kDa (Hinthong et al. 2008) que está longe da massa de 200 kDa do IF observada no SDS-PAGE. No entanto, até onde sabemos, o comportamento da proteína m2 em SDS-PAGE em condições não redutoras não foi documentado. Portanto, hipotetizamos que o IF poderia ser um complexo homo ou heteromultimérico envolvendo a proteína m2 de VV com ligações de dissulfeto entre subunidades, resultando em uma massa aparente no SDS-PAGE de aproximadamente 200 kDa.

EXEMPLO 2 POXVÍRUS COM DEFEITO EM M2 NÃO PRODUZ MAIS O IF CONSTRUÇÃO DE POXVÍRUS COM DELEÇÃO DE M2L

[220] O envolvimento de m2 no IF foi investigado adicionalmente pela exclusão do gene M2L em um genoma do vírus vaccinia. Especificamente, o locus M2L foi interrompido em um vírus vaccinia com dupla deleção (DD) que expressa a luciferase (ou seja, tk-, rr- descrito no documento WO2009/065546 e designado VVTG18277), resultando em um vírus recombinante com tripla deleção (TD) (ou seja, tk-, rr-, m2-) expressando a luciferase (COPTG19289) como descrito acima. A deleção parcial de M2L que se estende de 64 nucleotídeos a montante da ORF de m2 até os 169 primeiros códons resultou em uma expressão suprimida da proteína m2 (m2-) e não teve impacto significativo na replicação do vírus em CEF em comparação com a cepa parental (dados não mostrado).

VÍRUS COM M2L DELETADO NÃO PRODUZ MAIS IF

[221] Os sobrenadantes obtidos após a infecção de células humanas HeLa e aviária DF1 com os vírus DD e TD foram estudados por ELISA competitivo como antes. Como mostrado na Figura 6, o sobrenadante coletado após a infecção com o vírus da vaccinia com deleção de M2L COPTG19289 não foi mais capaz de inibir as interações CTLA4/CD80 (conforme evidenciado pela mesma absorbância medida nas células HeLa ou DF1 não infectadas), ao contrário o vírus DD parental (VVTG18277) que mostrou uma forte diminuição na medição de absorbância em comparação com os controles negativos.

[222] Além disso, quando submetido ao Western blotting conforme descrito acima, o grande complexo que migra a 200 kDa detectado usando sondas CD80-Fc ou CD86-Fc não foi mais detectado com o sobrenadante do vírus com deleção de M2L (dados não mostrados). Esses resultados confirmaram que m2 é, pelo menos, parte do FI.

EXEMPLO 3 POXVÍRUS RECOMBINANTE DEFEITUOSO EM M2

[223] A construção do vírus vaccinia oncolítico tk-rr-m2- expressando luciferase (gene inserido no locus J2R) é descrita acima.

ATIVIDADE ONCOLÍTICA

[224] Células LOVO (ATCC CCL-229) e HT116 (ATCC® CCL- 247), de carcinoma de cólon foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de células de 8 . 105 células/poço. As placas foram incubadas por 4 horas, 37ºC, 5% de CO2, antes da infecção. As células foram infectadas com o vírus tk- rr- m2-, COPTG19289, ou com o vírus tk- rr-, VVTG18277, ambos expressando luciferase em um intervalo de MOI de 10-1 a 10-4 partículas por célula. A viabilidade celular foi determinada por exclusão de azul de tripano usando um contador de células (Vi-Cell, Beckman coulter) 96 horas após a infecção (D4). A quantificação da % de sobrevida celular para LOVO (Figura 7A) e HCT116 (Figura 7B) demonstrou que a potência oncolítica fornecida pelo vírus COPTG19289 defeituoso em m2 era comparável àquela obtida com o VVTG18277 ‘m2 positivo’ em ambas as células LOVO e HCT116.

Especificamente, as células LOVO foram lisadas após infecção por VVTG18277 e COPTG19289 em MOI de 10-1 e 10-2, enquanto 80% da viabilidade celular foi observada em uma MOI baixa de 10 -3 e totalmente preservado em MOI de 10-4. A atividade oncolítica viral foi ainda maior em células HCT116 uma vez que nenhuma viabilidade celular (0%) pôde ser detectada em MOI de 10-1, 10-2 e 10-3; e menos de 50% das células eram viáveis em MOI de 10-4. O tratamento simulado (mock) não teve efeito sobre as células e foi usado para determinar a viabilidade de 100% das células LOVO e HCT116.

[225] Esta ausência de discrepância entre vírus com deleção dupla e tripla foi confirmada em outras linhagens de células tumorais, incluindo melanoma B16F10 (ATCC® CCL-6475), carcinoma de cólon murino CT26WT (ATCC CRL-2638) e células de adenocarcinoma de cólon murino MC38WT (disponível em Kerafast e Cellosaurus CVCL_B288). Ambos os vírus vaccinia foram oncolíticos nestas três linhagens de células em MOI de 10 -1 e em B16F10 e MC38WT em MOI de 10-2, enquanto foram parcialmente oncolíticos em CT26WT.

[226] Em conclusão, o vírus defeituoso em m2 recombinante mostrou uma atividade oncolítica comparável à de sua contraparte positiva em m2, o que sustenta o fato de que o comprometimento do locus M2L não afetou adversamente a atividade oncolítica em linhagens de células tumorais

EXPRESSÃO DO TRANSGENE IN VIVO

[227] A expressão da luciferase gerada a partir do vírus vaccinia tk- rr- m2- oncolítico (COPTG19289) foi avaliada em camundongos C57BL/6 implantados com tumores B16F10 após injeção subcutânea e em comparação com aquela obtida com o vírus tk- rr- VVTG18277. Cada vírus (107 pfu) foi injetado intratumoralmente no dia 0, 3, 6, 10 e 14 e as amostras de tumor foram coletadas no dia 1, 2, 6, 9, 13 e 16 para avaliação da atividade da luciferase por grama do tumor (RLU/g de tumor). Conforme ilustrado na Figura 8, para ambos os vírus, uma forte atividade de luciferase foi detectada nos primeiros dias (D1 e D2) após a injeção de vírus e diminuiu depois disso. No entanto, a expressão da luciferase atingiu o nível de fundo 13 dias após a infecção de VVTG18277 enquanto um nível de expressão fraco, mas persistente foi medido após a infecção com COPTG19289, que foi mantida ao longo do tempo (D9, D13 e D16).

ATIVIDADE ANTITUMORAL

[228] A atividade antitumoral fornecida pelo vírus vaccinia oncolítico tk- rr- m2- (COPTG 19289) foi testada em três modelos de tumor, B16F10, CT26 e HT116, respectivamente.

[229] Em um primeiro cenário, camundongos C57BL/6 (10 camundongos/grupo) foram implantados com tumores B16F10 por injeção subcutânea. Quando os tumores atingiram um volume de 25-100 mm3, o tumor de cada animal foi medido e os camundongos foram randomizados e injetados por via intratumoral com 107 pfu de COPTG19289, VVTG18277 ou veículo MOCK (controle negativo) nos dias D0, D3, D6, D10 e D14. A sobrevida dos animais e o crescimento tumoral foram seguidas duas vezes por semana (camundongos são mortos quando o volume do tumor atingiu 2.000 mm 3 ou mais). Não há diferenças drásticas entre os dois grupos tratados com VV.

Notavelmente, vários animais exibiram um crescimento lento do tumor em ambos os grupos. Em contraste, o crescimento tumoral foi muito rápido em animais tratados com Mock atingindo 2.000 mm3 em 24 dias, resultando na morte de todos os camundongos no D24. A sobrevida dos camundongos foi melhorada pelo tratamento com o vírus vaccinia. Especificamente, neste experimento, a sobrevivência de 50% foi obtida no D23 para camundongos tratados com o VVTG18277 tk- rr- e no D28 para camundongos tratados com o COPTG19289 tk- rr- m2-. Para maior clareza, as curvas de sobrevida corresponderam entre os dois grupos de VV, exceto que 2 dos 10 camundongos injetados morreram poucos dias depois (dados não mostrados).

[230] A atividade antitumoral também foi avaliada em camundongos Balb/c implantados com tumores CT26 por injeção subcutânea.

Quando os tumores atingiram um volume de 25-100 mm3, os tumores foram medidos individualmente e os camundongos foram randomizados (D0) antes de receberam injeções intratumorais do vírus vaccinia oncolítico tk- rr- m2- (COPTG19289) ou VVTG18277 tk- rr- ou veículo MOCK (10 camundongos/grupo). Cinquenta μL correspondente a 107 pfu de cada preparação de vírus vaccinia (ou preparação simulada (mock)) foram injetados no tumor em D0, D3, D6, D10 e D14. O crescimento do tumor foi acompanhado duas vezes por semana e os camundongos foram mortos quando o volume do tumor atingiu 2000 mm3 ou mais. Conforme ilustrado na Figura 9, o volume do tumor em animais tratados com simulação aumentou rapidamente para atingir

2.000 mm3 no D28, enquanto o crescimento do tumor foi atrasado nos grupos tratados com VV, com um volume de tumor abaixo de 1000 mm3 apenas no vírus vaccinia tk- rr- m2-.

[231] A atividade antitumoral também foi avaliada em camundongos Swiss Nude (10 camundongos/grupo) implantados com tumores HT116 por injeção subcutânea. Duas doses diferentes de vírus vaccinia foram injetadas por via intravenosa 10 dias após a implantação do tumor, respectivamente 105 e 107 pfu. O crescimento do tumor foi acompanhado duas vezes por semana e os camundongos foram mortos quando o volume do tumor atingiu 2000 mm3 ou mais. Como esperado, o volume do tumor em animais com tratamento simulado (mock) aumentou rapidamente para atingir 2000 mm 3 ou mais 45 dias após a implantação do tumor, enquanto que o crescimento do tumor foi atrasado nos grupos tratados com 10 5 pfu de VV. Notavelmente, o crescimento do tumor foi completamente inibido nos dois grupos injetados com 107 pfu de vírus , conforme ilustrado na Figura 10.

[232] Em conclusão, a modificação do locus M2L no VV para tornar o vírus vaccinia incapaz de produzir a proteína M2 imunossupressora não tem impacto sobre a atividade oncolítica, efeito antitumoral e expressão do transgene.

EXEMPLO 4 ENSAIO DE REAÇÃO DE LINFÓCITOS MISTOS (MLR)

[233] Os sobrenadantes obtidos de células CEF infectadas com COPTG19289 (tk-, rr- e m2-), ou VVTG18058 (tk-, rr-) ou MVAN33 foram avaliados em um ensaio MLR quanto à capacidade de ativar linfócitos. Os sobrenadantes de cultura foram coletados 48h após a infecção (MOI 0,05) e foram concentrados cerca de 20 vezes.

[234] PBMCs foram purificadas por Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) a partir de sangue coletado de doadores saudáveis. Mais especificamente, 3x105 PBMCs de 2 doadores diferentes foram misturados em microplacas de 96 poços. Os sobrenadantes concentrados foram adicionados à cultura de PBMCs (20 µL em 200 µL) não diluídos ou diluídos a 10 ou 100 vezes para produzir uma “concentração de sobrenadante” final de 2, 0,2 e 0,02 vezes, respectivamente, e foram cultivados por 72h a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2. A adição de meio RPMI foi usada como controle negativo. A secreção de IL-2 foi quantificada em sobrenadantes de cultura por ELISA (IL- 2*-2ELISA MAX deluxe Set kit da BioLegend) como um marcador de ativação de linfócitos. As medições foram normalizadas por divisão da média da concentração de IL-2 das três réplicas de uma dada amostra pela média da concentração de IL-2 das três repetições de PBMCs incubadas com meio.

[235] O controle negativo representa um estado de ativação de linfócitos normalizados de 1. Conforme ilustrado na Figura 11, as PBMCs incubadas na presença de sobrenadantes de células infectadas com MVA e COPTG19289 (tk- rr- m2-; TD) induziram a ativação de linfócitos, atingindo um valor próximo a um quando diluídas 10 ou 100 vezes, e acima de 1 quando testadas não diluídas. Em contraste marcante, os sobrenadantes infectados com VVTG18058 (tk- rr-; DD) mostraram uma inibição clara da ativação de linfócitos em todas as diluições testadas, confirmando a atividade imunossupressora do vírus que codifica M2.

EXEMPLO 5 ATIVIDADE ANTITUMORAL EM CAMUNDONGOS NCG-CD34+ HUMANIZADOS

[236] A atividade antitumoral fornecida pelo vírus m2 - COPTG19289 foi avaliada na cepa camundongo imunodeficiente (NCG) humanizado NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull com células-tronco humanas CD34 + e enxertados com células de carcinoma colorretal humano HCT-116 (5x10 6 células injetadas S.C. no flanco do camundongo representando o D0).

Doze dias após implante (D12), os camundongos receberam uma única injeção I.V. de COPTG19289 (tk- rr- m2-; TD) ou sua contraparte m2 + VVTG18058 (tk - rr-; DD) em doses de 10 5 pfu ou 10 6 pfu. Os camundongos tratados com veículo foram usados como controles negativos. O crescimento do tumor e a sobrevida dos camundongos foram monitorado s ao longo de pelo menos 60 dias após a implantação das células.

[237] Tal como ilustrado nas Figuras 12 A e B, o volume tumoral aumentou muito rapidamente no grupo de camundongos tratados com veículo. Em contraste, o crescimento tumoral foi claramente inibido nos camundongos tratados com COPTG19289 m2 - (TD) ou VVTG18058 m2+ (DD), qualquer que fosse a dose injetada, mas surgiram problemas de toxicidade dependente da dose para alguns animais; assim, impedindo o monitoramento do crescimento tumoral durante o período de 60 dias. Na dose de 10 6, ambos os vírus retardaram o crescimento tumoral com, aproximadamente, a mesma eficiência (Figura 12A), mas uma menor toxicidade foi observada com o vírus COPTG19289 TD em comparação com o vírus DD VVTG18058. Deve ser notado que animais tratados com TD era um livres de tumor em 5 cinco dias pós implantação das células e o estado livre de tumor permaneceu por mais de 85 dias. Na dose de 10 5, o vírus DT (COPTG19289) mostrou um efeito antitumoral melhorado sobre o vírus DD (VVTG18058), Figura 12B. Mais especificamente, o crescimento tumoral foi claramente inibido em 5/5 animais no grupo TD versus 2/5 no grupo DD. Além disso, uma toxicidade reduzida foi observada no grupo TD em comparação com o grupo DD.

[238] A comparação da sobrevida dos camundongos confirmou o efeito antitumoral melhorado fornecido pelo m2 - COPTG19289 (TD) em comparação com o m2 + VVTG18058 (DD) após uma única injeção I.V. de10 6 pfu (Figura 13A) ou 10 5 pfu (Figura 13B). Mais especificamente, 100% dos animais tratados com veículo morreram em 52 dias, ao passo que a sobrevida é claramente prolongada pelo tratamento com VVTG18058 (DD) e ainda mais prolongada pelo tratamento com COPTG19289 (TD).

Por exemplo, 50% de sobrevida (Figura 13A) foi estimada aos 52 dias para o grupo de controle negativo, 54 dias para o grupo tratado com DD - 10 6 pfu e 70 dias para o grupo tratado com TD - 10 6 pfu.

[239] Além disso, nas doses de 10 5 pfu, a sobrevida de 50% foi de 52 e 80 dias para os vírus DD e TD, respectivamente.

[240] Estes resultados ilustram o interesse terapêutico melhorado fornecido pelo poxvírus com defeito em m2 no tratamento de patologias como cânceres.

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US 8.143.379

US 8.217.149

US 8.491.895

US2007-016108

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. POXVÍRUS MODIFICADO, caracterizado pelo genoma compreender no contexto nativo (tipo selvagem) um locus M2L que codifica uma proteína poxviral m2 funcional e que está modificado para ser defeituoso para a referida função m2; em que a referida proteína poxviral m2 funcional é capaz de se ligar a ligantes coestimuladores CD80 ou CD86, ou ambos os ligantes coestimuladores CD80 e CD86, e a referida função m2 defeituosa é incapaz de se ligar aos referidos ligantes coestimuladores CD80 e CD86.

2. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo poxvírus modificado ser gerado ou obtido a partir de um vírus Chordopoxvirinae, de um modo preferido selecionado a partir do grupo de gêneros consistindo em Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvírus, Suipoxvirus, Cervidpoxvirus e Yatapoxvirus.

3. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo poxvírus modificado ser um membro de Orthopoxvirus, de preferência selecionado a partir do grupo que consiste em vírus vaccinia (VV), varíola bovina (CPXV), varíola do guaxinim (raccoonpox - RCN), varíola do coelho (rabbitpox), varíola do macaco (monkeypox), varíola equina (horsepox), Volepox, Skunkpox, vírus da varíola (ou varíola menor) e varíola do camelo (camelpox).

4. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo poxvírus modificado ser um vírus vaccinia, preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste nas cepas Western Reserve (WR), Copenhagen (Cop), Lister, LIVP, Wyeth, Tashkent, Tian Tan, Brighton, Ancara, LC16M8, LC16M0, etc., com uma preferência específica para as cepas WR, Copenhagen e Wyeth.

5. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pelo poxvírus modificado ser um membro do gênero Leporipoxvirus, com preferência pelo vírus mixoma.

6. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela incapacidade para se ligar aos referidos ligantes CD80 e CD86 coestimuladores ser originada a partir de uma lesão genética no locus M2L ou a partir de uma interação anormal que prejudica a função m2, seja diretamente ou indiretamente.

7. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas referidas lesão genéticas incluírem supressão parcial ou total e/ou uma ou mais mutações não silenciosas, dentro da sequência codificante de m2 ou nos elementos reguladores que controlam a expressão de M2L, preferencialmente levando à síntese de uma proteína m2 defeituosa ou à ausência de síntese de m2.

8. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida lesão genética ser uma deleção parcial ou total do locus M2L.

9. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo poxvírus modificado ser adicionalmente modificado em uma região diferente do locus M2L.

10. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo poxvírus modificado ser adicionalmente modificado no locus J2R, resultando em um poxvírus modificado deficiente para ambas as funções, m2 e tk.

11. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo poxvírus modificado ser adicionalmente modificado no(s) locus(loci) I4L e/ou F4L, resultando em um poxvírus modificado deficiente para ambas as funções, m2 e rr.

12. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo poxvírus modificado ser adicionalmente modificado nos loci J2R e I4L/F4L, resultando em um poxvírus modificado deficiente para as atividades m2, tk e rr.

13. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser oncolítico.

14. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser recombinante.

15. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo poxvírus modificado ser manipulado para expressar pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeos antigênicos, polipeptídeos possuindo função de modulação do pool de nucleosídeos(nucleotídeos) e polipeptídeos imunomoduladores.

16. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo referido polipeptídeo imunomodulador ser selecionado a partir do grupo que consiste em citocinas, quimiocinas, anticorpos e ligantes ou qualquer combinação dos mesmos.

17. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo referido anticorpo se ligar especificamente a uma proteína de ponto de verificação imune, de um modo preferido, selecionada partir do grupo que consiste em CD3, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40, PD1, PDL1, CTLA-4, Tim-3, BTLA, Lag-3 e Tigit.

18. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo poxvírus modificado expressar um anticorpo antagonista que se liga especificamente ao PD-L1 ou CTLA4.

19. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo poxvírus modificado ser defeituoso para as atividades m2, tk e rr; e codificar um anticorpo anti-CTLA-4, com preferência para o anticorpo ipilimumabe ou tremelimumabe.

20. POXVÍRUS MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo poxvírus modificado ser defeituoso para as atividades m2, tk e rr; e codificar um anticorpo anti-PD-L1, com preferência para o anticorpo atezolizumabe, durvalumabe ou avelumabe.

21. MÉTODO PARA PRODUZIR O POXVÍRUS MODIFICADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por compreender as etapas de a) preparar uma linhagem de células produtoras, b) transfectar ou infectar a linhagem de células produtoras preparada com o poxvírus modificado, c) cultivar a linhagem de células transfectadas ou infectadas sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus, d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da referida linhagem de células produtoras e, opcionalmente; e) purificar o referido vírus recuperado.

22. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do poxvírus modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

23. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por compreender de aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 pfu, vantajosamente de aproximadamente 104 pfu a aproximadamente 1011 pfu, de preferência de aproximadamente 10 5 pfu a aproximadamente 1010 pfu; e mais preferencialmente de aproximadamente 106 pfu a aproximadamente 109 pfu do poxvírus modificado e, notavelmente, doses individuais de aproximadamente 106, 5x106, 107, 5x107, 108 ou 5x108 pfu.

24. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada por ser formulada para a administração intravenosa ou intratumoral.

25. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada por ser para uso no tratamento ou prevenção de uma doença proliferativa selecionada a partir do grupo que consiste em cânceres, bem como doenças associadas a um aumento da atividade de osteoclastos, como a artrite reumatoide e osteoporose, e doenças cardiovasculares, tal como a restenose.

26. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo referido câncer ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer renal, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, carcinoma do ducto biliar, câncer endometrial, câncer pancreático e câncer de ovário.

27. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada por ser usada para estimular ou melhorar uma resposta imune e, especialmente: - para estimular ou melhorar uma resposta imune mediada por linfócitos (especialmente contra um polipeptídeo antigênico); - para estimular ou melhorar a atividade da APC; - para estimular ou melhorar uma resposta antitumoral; - para estimular ou melhorar a via de sinalização de CD28; - para melhorar a eficácia terapêutica fornecida pelo poxvírus modificado descrito na presente invenção em um sujeito tratado ou um grupo de sujeitos tratados; e/ou - para reduzir a toxicidade fornecida pelo poxvírus modificado aqui descrito em um sujeito tratado ou um grupo de sujeitos tratados.

28. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, caracterizada por ser para uso como terapia independente ou conjunta (combinada) com uma ou mais terapias adicionais, de preferência selecionadas a partir do grupo que consiste em cirurgia,

radioterapia, quimioterapia, crioterapia, terapia hormonal, terapia com toxinas,

imunoterapia, terapia com citocinas, terapia do câncer direcionada, terapia gênica, terapia fotodinâmica e transplante.