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BR112021004829A2 - conjugado de anticorpo anti-b7h3-análogo de exatecano e uso medicinal do mesmo - Google Patents

conjugado de anticorpo anti-b7h3-análogo de exatecano e uso medicinal do mesmo Download PDF

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BR112021004829A2
BR112021004829A2 BR112021004829-4A BR112021004829A BR112021004829A2 BR 112021004829 A2 BR112021004829 A2 BR 112021004829A2 BR 112021004829 A BR112021004829 A BR 112021004829A BR 112021004829 A2 BR112021004829 A2 BR 112021004829A2
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BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
group
cancer
formula
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Application number
BR112021004829-4A
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English (en)
Inventor
Hua Ying
Ling Zhang
Ting Zhang
Lei Zhang
Jianyan XU
Weikang Tao
Original Assignee
Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd
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Publication date
Application filed by Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd filed Critical Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.
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Abstract

São descritos pela presente invenção um conjugado de análogo de anticorpo anti-B7H3-exatecano, um método de preparação do mesmo e um uso medicinal antitumor do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGADO DE ANTICORPO ANTI-B7H3-ANÁLOGO DE EXATECANO E USO MEDICINAL DO MESMO".
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a um conjugado de anticorpo anti-B7H3-análogo de exatecano, um método para preparar o mesmo, uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, e um uso do mesmo na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por B7H3, especialmente uma sua utilização na preparação de um fármaco anticâncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A resposta imune mediada por células T desempenha um papel extremamente importante nos processos antitumorais de um organismo. No entanto, a ativação e proliferação de células T requer não apenas um sinal de antígeno reconhecido pelo TCR, mas também um segundo sinal fornecido por moléculas coestimulatórias. As moléculas da família B7 pertencem à superfamília das imunoglobulinas de moléculas coestimulatórias. Cada vez mais estudos têm mostrado que as moléculas desta família desempenham um importante papel regulador na função imunológica normal e no estado patológico de um organismo.
[0003] B7H3 é um membro da família B7 e é uma proteína transmembrana do tipo I, que contém um peptídeo sinal no terminal amino, uma região variável tipo imunoglobulina extracelular (IgV) e região constante (IgC), uma região transmembrana, e uma região da cauda citoplasmática com 45 aminoácidos (Tissue Antigens. Agosto de 2007; 70 (2): 96-104). B7H3 tem dois tipos de variantes de emenda, B7H3a e B7H3b. O domínio extracelular de B7H3a consiste em dois domínios de imunoglobulina de IgV-IgC (também conhecido como
2IgB7H3), e o domínio extracelular de B7H3b consiste em quatro domínios de imunoglobulina de IgV-IgC-IgV-IgC (também conhecido como 4IgB7H3).
[0004] A proteína B7H3 não é expressa ou é pobremente expressa em tecidos e células normais, mas altamente expresso em vários tecidos tumorais e está intimamente relacionado com a progressão do tumor, sobrevivência do paciente e prognóstico. Foi clinicamente relatado que o B7H3 é superexpresso em muitos tipos de câncer, especialmente no câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer epitelial do trato urinário, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário e câncer de pâncreas (Lung Cancer. Novembro de 2009; 66 (2): 245-249; Clin Cancer Res. 15 de agosto de 2008; 14 (16): 5150-5157). Além disso, também foi relatado na literatura que, no câncer de próstata, o nível de expressão de B7H3 está positivamente correlacionado com malignidade patológica clínica (tal como volume tumoral, invasão extraprostática ou pontuação de Gleason), e também está associado a progressão do câncer (Cancer Res. 15 de agosto de 2007; 67 (16): 7893-7900). Da mesma forma, no glioblastoma multiforme, a expressão de B7H3 está inversamente associada à sobrevida livre de eventos, e no câncer pancreático, a expressão de B7H3 está associada a metástases linfonodais e progressão patológica. Portanto, o B7H3 é considerado um novo marcador tumoral e potencial alvo terapêutico.
[0005] Atualmente, existem estratégias terapêuticas específicas para o alvo B7H3 para estudos pré-clínicos. Por exemplo, os anticorpos direcionados a B7H3 murino aumentarão as células T CD8-positivas infiltrativas em tumores e inibirão o crescimento do tumor (Mod Pathol. 3 de agosto de 2010; 23 (8): 1104-1112). Além disso, o pedido de patente WO 2008/066691 mostra que os anticorpos que reconhecem a variante B7H3, B7-H3a, exibiram um efeito antitumoral in vivo no adenocarcinoma. Em estudos clínicos, um fármaco de anticorpo B7H3 murino conjugado com I131 radioativo inibiu significativamente o crescimento de neuroblastoma em pacientes [J Neufooocol 97(3): 409-18 (2010)]. No entanto, os projetos atualmente em estudo são anticorpos humanizados que foram modificados pela humanização de anticorpos murinos. Os anticorpos humanizados na imunização apresentam maior risco de imunogenicidade, o que é um fator desfavorável em aplicação humana.
[0006] A tecnologia de exibição de fago refere-se à fusão de uma proteína exógena ou polipeptídeo com uma proteína de revestimento de fago, de modo a expressar uma proteína exógena na superfície das partículas de fago. A biblioteca de anticorpos de fago é uma biblioteca de anticorpos estabelecida pela combinação de tecnologia de exibição de fago, tecnologia de amplificação de PCR e tecnologia de expressão de proteína por meio de meios técnicos abrangentes.
[0007] A maior vantagem da biblioteca de anticorpos de fago é preparar um anticorpo totalmente humanizado, mimetizando os três processos de produção de anticorpos in vivo sem imunização animal. Além disso, a biblioteca de anticorpos de fago tem as seguintes vantagens: 1) a unificação de genótipo e do fenótipo é alcançada; além disso, o método experimental é simples e rápido; o método tradicional de produção de anticorpos por tecnologia de hibridoma leva vários meses, enquanto que a tecnologia de biblioteca de anticorpos leva apenas algumas semanas; 2) O produto expresso é um anticorpo totalmente humanizado e o anticorpo é expresso principalmente na forma de fragmentos ativos Fab e scFv. Com o peso molecular pequeno, o anticorpo expresso tem vantagens óbvias na penetrabilidade do tecido em comparação com o anticorpo intacto; 3) A capacidade de análise é grande; a tecnologia de hibridoma é usada para selecionar entre milhares de clones, enquanto que a tecnologia de biblioteca de anticorpos pode ser usada para selecionar dentre milhões ou mesmo centenas de milhões de moléculas; portanto, anticorpos mais diversificados serão obtidos; 4) ampla aplicação; sistema de expressão procariótica é usado, o que leva a uma vantagem mais óbvia na produção em grande escala (Curr Opin Biotechnol. Dezembro de 2002; 13 (6): 598-602; Immunotechnology, 2013, 48(13) 48(13): 63-73).
[0008] Conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) possibilitam a combinação de um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo com uma citotoxina biologicamente ativa através de um ligante quimicamente estável, tirando vantagem total da especificidade de ligação do anticorpo aos antígenos de superfície de células normais ou células tumorais e a alta eficiência da citotoxina, enquanto evitando a baixa eficácia do anticorpo e o efeito colateral tóxico da citotoxina. Isso significa que, em comparação com os fármacos quimioterápicos convencionais, os conjugados de anticorpo-fármaco podem se ligar com precisão às células tumorais e reduzir o efeito nas células normais.
[0009] Atualmente, uma variedade de fármacos ADC têm sido usada na clínica ou pesquisas clínicas. Por exemplo, Kadcyla é um fármaco ADC formado por trastuzumabe direcionado a Her2 e DM1. Ao mesmo tempo, também existem pedidos de patente que relatam anticorpos e fármacos ADC direcionados a B7H3, tais como WO 2008100934, WO 2012147713, WO 2014061277, WO 2015184203 e WO 2016044383.
[00010] Existem vários tipos de pequenas moléculas citotóxicas usadas no conjugado de anticorpo-fármaco, um dos quais são os derivados de camptotecina, que mostram efeito antitumoral inibindo a topoisomerase I. Documentos relatando o uso do derivado de camptotecina, exatecano (nome químico: (1S, 9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H, 12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7]imidazo[1,2-b]quinolina-10,13 (9H, 15H)-diona) em conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) compreende WO 2014057687, Clinical Cancer Research (2016) 22 (20): 5097-5108, e Cancer Sci ( 2016) 107: 1039-1046. No entanto, maior desenvolvimento de fármacos ADC com melhor eficácia ainda é necessário.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00011] A presente invenção refere-se a um ADC de anticorpo anti-B7H3 e um uso do mesmo, e fornece um fármaco de ADC formado conjugando um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno a um análogo de exatecano citotóxico, em que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno liga-se à sequência de aminoácido ou estrutura tridimensional da região extracelular de B7H3.
[00012] Portanto, o objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: em que: Y é selecionado do grupo consistindo em -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- e -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-;
Ra e Rb são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila; ou, Ra e Rb juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R1 é selecionado do grupo consistindo em halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; ou, Ra e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; m é um número inteiro de 0 a 4; n é 1 a 10, opcionalmente selecionado de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; n pode ser um número inteiro ou um decimal; L é uma unidade de ligante; Pc é um anticorpo anti-B7H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00013] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado de ligante-fármaco fornecido de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: as cadeias pesadas HCDR1, HCDR2 e HCDR3 representadas por sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 8, 9 e 10 respectivamente, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s)
de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 representadas por SEQ ID Nºs: 8, 9 e 10 respectivamente; e as cadeias leves LCDR1, LCDR2 e LCDR3 representadas por sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 11, 12 e 13 respectivamente, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 representadas por SEQ ID Nºs: 11, 12 e 13 respectivamente.
[00014] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, a região FR de cadeia leve sobre a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é derivada da sequência de cadeia leve da linha germinativa humana ou a sequência mutante da mesma, e/ou a região FR de cadeia pesada sobre a região variável de cadeia pesada é derivada da sequência de cadeia pesada de linha germinativa humana ou a sequência mutante da mesma.
[00015] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve selecionada do seguinte:
[00016] a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é representada por SEQ ID Nº: 6 ou tem pelo menos 95% identidade de sequência com SEQ ID Nº: 6, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é representada por SEQ ID Nº: 7 ou tem pelo menos 95% identidade de sequência com SEQ ID Nº: 7.
[00017] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante de anticorpo; a região constante de cadeia pesada da região constante de anticorpo é derivada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano ou tem pelo menos 95% identidade de sequência com eles, a região constante de cadeia leve da região constante de anticorpo é derivada de um anticorpo humano κ, cadeia λ ou tem pelo menos 95% identidade de sequência com eles; e preferivelmente, a sequência de aminoácido da região constante de cadeia pesada é derivada de IgG1 humano ou tem pelo menos 95% identidade de sequência com ele.
[00018] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, Pc é um anticorpo de comprimento total; em que o anticorpo de comprimento total é selecionado do grupo consistindo em: • anticorpo h1702 consistindo na sequência de cadeia pesada representada por SEQ ID Nº: 14 e a sequência de cadeia leve representada por SEQ ID Nº: 15, e • anticorpo h1702DS consistindo na sequência de cadeia pesada representada por SEQ ID Nº: 14 e a sequência de cadeia leve representada por SEQ ID Nº: 16.
[00019] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab', F(ab')2, anticorpos de cadeia única (scFv), regiões V dimerizadas (anticorpo duplo), regiões V estabilizadas de dissulfeto (dsFv), e fragmento de ligação aos antígenos de peptídeos contendo CDRs.
[00020] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, R1 é uma haloalquila ou C3-6 cicloalquila.
[00021] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, R2 é um átomo de hidrogênio.
[00022] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, R1 é uma C3-6 cicloalquila; e R2 é um átomo de hidrogênio.
[00023] Em algumas modalidades da presente invenção, o conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável,
[00024] em que: Y é -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-; Ra e Rb são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio e alquila; R1 é uma haloalquila ou C3-6 cicloalquila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila ou C3-6 cicloalquila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma C3-6 cicloalquila; m é 0 ou 1.
[00025] Em algumas modalidades da presente invenção, o conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável,
[00026] em que: Y é -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-; Ra e Rb são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio e alquila;
R1 é uma C3-6 cicloalquila; R2 é um átomo de hidrogênio; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma C3-6 cicloalquila; m é 0.
[00027] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, Y é selecionado do grupo consistindo em: e , preferivelmente e , e mais preferivelmente .
[00028] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o terminal O de Y é conectado à unidade de ligante L.
[00029] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, n é 2 a 8, preferivelmente 5 a 9, e mais preferivelmente 7,5; e exemplos não limitantes incluem 3, 4, 5, 6, 7,2, 7,5, 8, 8,5, 9.
[00030] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, a unidade de ligante -L- é -L1-L2-L3-L4-, L1 é , e s1 é um número inteiro de 2 a 8; L2 é uma ligação química; L3 é um resíduo de tetrapeptídeo; L4 é -NR5(CR6R7)t-, R5, R6 e R7 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e t é 1 ou 2.
[00031] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o terminal L1 da unidade de ligante -L- é conectado ao ligante, e o terminal L4 da unidade de ligante -L- é conectado a Y.
[00032] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o resíduo de tetrapeptídeo de L3 é um resíduo de aminoácido composto de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em fenilalanina (E), glicina (G), valina (V), lisina (K), citrulina, serina (S), ácido glutâmico (E) e ácido aspártico (N), e preferivelmente um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG (glicina-glicina-fenilalanina-glicina).
[00033] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, -L-Y- é uma estrutura como segue: L2 é uma ligação química; L3 é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG;
R1 é uma haloalquila ou C3-6 cicloalquila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila ou C3-6 cicloalquila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma C3-6 cicloalquila; R5, R6 e R7 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila; s1 é um número inteiro de 2 a 8; m é um número inteiro de 0 a 4.
[00034] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, -L-Y- é selecionado do grupo consistindo em:
e .
[00035] Em algumas modalidades da presente invenção, o conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvatoé um conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato: em que:
W é selecionado do grupo consistindo em C1-8 alquila, C1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) selecionado(s) do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1-8 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada independentemente opcionalmente também substituída por um ou mais substituinte(s) selecionado(s) do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; L2 é selecionado do grupo consistindo em -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- e uma ligação química, p1 é um número inteiro de 1 a 20, e preferivelmente 1 a 6; L3 é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, o aminoácido pode ser substituído ou não substituído, quando substituído, o(s) grupo(s) de substituinte pode(m) ser substituído(s) em qualquer ponto de conexão disponível, o(s) grupo(s) de substituinte é(são) um ou mais grupo(s) independentemente selecionados do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; R1 é selecionado do grupo consistindo em halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, heterociclila, arila e heteroarila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R4 e R5 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila;
R6 e R7 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila; m é um número inteiro de 0 a 4; n é 1 a 10, que pode ser um número inteiro ou um decimal; Pc é um anticorpo anti-B7H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00036] Em algumas modalidades da presente invenção, o conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvatoé um conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-Lb-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato: em que: s1 é um número inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 5; R1, R2, R5~R7, m e n são como definido na fórmula (Pc-La-Y-Dr).
[00037] Em algumas modalidades da presente invenção, no conjugado ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o conjugado de ligante-fármaco é selecionado do grupo consistindo em:
e ;
[00038] em que Pc e n são como definido na fórmula (Pc-L-Y-Dr).
[00039] Conjugados de ligante-fármaco típicos de fórmula (Pc-L-Y-Dr) da presente invenção incluem, porém, não são limitados a, os seguintes conjugados de ligante-fármaco: Exemplo Fórmula de estrutura de ADC Nº.
ADC-1
ADC-2 ADC-3
[00040] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato dos mesmos;
[00041] em que, n pode ser um número inteiro diferente de zero ou decimal de 0 a 10, preferivelmente n é um número inteiro ou decimal de 1 a 10; mais preferivelmente n é 2 a 8, que pode ser um número inteiro ou um decimal; e mais preferivelmente n é 3 a 8, que pode ser um número inteiro ou um decimal.
[00042] A presente invenção também fornece um método para preparar o conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, compreendendo a seguinte etapa de: Pc é acoplado com o composto de fórmula (La-Y-Dr) após redução para obter o composto de fórmula (Pc-La-Y-Dr); o agente de redução é preferivelmente TCEP; em que: Pc é um anticorpo anti-B7H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; W, L2, L3, R1, R2, R5~R7, m e n são como definido na fórmula (Pc-La-Y-Dr).
[00043] Outra modalidade fornece outro método, em que o composto de fórmula La-Y-Dr é um composto de fórmula Lb-Y-Dr:
ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,
[00044] em que R1, R2, R5~R7, s1 e m são como definido na fórmula Pc-Lb-Y-Dr.
[00045] Em uma modalidade preferida da presente invenção, no método para preparar o conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou (Pc-Lb-Y-Dr) ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, o composto de fórmula (La-Y-Dr) ou o composto de fórmula (Lb-Y-Dr) é selecionado do grupo consistindo em: , ,
, , e .
[00046] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado de ligante-fármaco ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvatode acordo com a presente invenção, e um ou mais veículo(s), diluente(s) ou excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is).
[00047] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um uso do conjugado de ligante-fármaco ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente invenção na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por B7H3; a doença ou distúrbio mediado por B7H3 é um câncer com expressão elevada de B7H3.
[00048] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um uso do conjugado de ligante-fármaco ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente invenção na preparação de medicamentos para o tratamento ou prevenção de um tumor, em que o câncer é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de rim, câncer uretral, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer do endométrio, câncer de glândula salivar, câncer do esôfago, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma, câncer de faringe, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, leucemia, câncer nos ossos, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer pancreático e linfoma.
[00049] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um método para tratar e/ou prevenir um tumor compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de ligante-fármaco ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente invenção, em que o tumor é preferivelmente um câncer relacionado à expressão elevada de B7H3.
[00050] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um método para tratar ou prevenir um câncer compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de ligante-fármaco ou o sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente invenção, em que o câncer é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical,
câncer de pulmão, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de rim, câncer uretral, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer do endométrio, câncer de glândula salivar, câncer do esôfago, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma, câncer de faringe, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, leucemia, câncer nos ossos, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer pancreático e linfoma. • composto ativo pode ser formulado em uma forma adequada para administração por qualquer rotina apropriada, e o composto ativo é preferivelmente na forma de uma dose unitária, ou em uma forma em que o paciente pode se autoadministrar em uma única dose. A forma da dose unitária do composto ou composição da presente invenção pode ser comprimido, cápsula, selo, ampola, pó, grânulo, pastilha, supositório, pó regenerador ou preparação líquida.
[00051] A dosagem do composto ou composição usada no método terapêutico da presente invenção geralmente variará de acordo com a severidade da doença, o peso do paciente, e a eficácia relativa do composto. Contudo, como um guia geral, uma adequada dose unitária pode ser 0,1 a 1000 mg.
[00052] Além do composto ativo, a composição farmacêutica da presente invenção pode também compreender um ou mais auxiliaries incluindo carga (diluente), aglutinante, agente umectante, desintegrante, excipiente e similares. Dependendo do modo de administração, a composição pode compreender 0,1 a 99% por peso do composto ativo.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00053] Figura 1: O efeito de endocitose de anticorpo B7H3 sobre células U87MG.
[00054] Figura 2A-2F: Os resultados do efeito inibitório do presente ADC sobre a proliferação de várias células tumorais. Figura 2A é os resultados teste do efeito inibitório de vários ADCs sobre a proliferação de células A498; Figura 2B é os resultados teste do efeito inibitório de vários ADCs sobre a proliferação de células Calu-6; Figura 2C é os resultados teste do efeito inibitório de vários ADCs sobre a proliferação de células U87; Figura 2D é os resultados teste do efeito inibitório de vários ADCs sobre a proliferação de células A375; Figura 2E é os resultados teste do efeito inibitório de vários ADCs sobre a proliferação de células Detroit562; e Figura 2F é os resultados teste do efeito inibitório de vários ADCs sobre a proliferação de células CHOK1.
[00055] Figura 3: O efeito inibitório de ADC-8 (1 mpk, 3 mpk) e ADC-5 (1 mpk, 3 mpk) da presente invenção sobre tumor de xenoenxerto de U87MG em camundongos nus após injeção intraperitoneal no Exemplo de Teste 7.
[00056] Figura 4: O efeito inibitório de ADC-2 (1 mpk, 3 mpk) e ADC-1 (1 mpk, 3 mpk) da presente invenção sobre tumor de xenoenxerto de Detroit 562 em camundongos nus após injeção intraperitoneal no Exemplo de Teste 8.
[00057] Figura 5A: A taxa de inibição de proliferação de ADC-4, ADC-6 e ADC-7 da presente invenção em células Detroit562 no Exemplo de Teste 9.
[00058] Figura 5B: A taxa de inibição de proliferação de ADC-4, ADC-6 e ADC-7 da presente invenção em células Calu-6 no Exemplo de Teste 9.
[00059] Figura 5C: A taxa de inibição de proliferação de ADC-4, ADC-6 e ADC-7 da presente invenção em células CHOK1 no Exemplo de Teste 9.
[00060] Figura 6: Resultados teste de estabilidade de plasma de ADC-4 da presente invenção no Exemplo de Teste 10.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Termos
[00061] A menos que de outro modo especificado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui são consistentes com o entendimento comum daqueles versados na técnica à qual pertence a presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais preferidos são descritos aqui. Ao descrever e proteger a presente invenção, os seguintes termos são usados de acordo com as seguintes definições.
[00062] Quando um nome comercial é usado na presente invenção, o requerente pretende incluir as preparações, o fármaco genérico e os ingredientes ativos do produto sob o nome comercial.
[00063] A menos que de outro modo estabelecido, os termos usados na especificação e nas reivindicações têm os significados descritos abaixo.
[00064] O termo "fármaco" refere-se a um fármaco citotóxico, que é representado pelo Dr, sendo uma molécula química que pode atrapalhar fortemente o crescimento normal das células tumorais. Em princípio, todos os fármacos citotóxicos podem matar células tumorais em uma concentração suficientemente alta. No entanto, pode causar apoptose de células normais e efeitos colaterais graves ao matar células tumorais devido à falta de especificidade. Este termo inclui toxinas, tais como, toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, radioisótopos (por exemplo, radioisótopos de At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e Lu), fármacos tóxicos, quimioterápicos, antibióticos e enzimas nucleolíticas, e preferivelmente fármacos tóxicos.
[00065] O termo "unidade de ligação (ou fragmento de ligação)"
refere-se a um fragmento estrutural químico ou ligação, que é ligado a um ligante em uma extremidade e ligado a um fármaco na outra extremidade, ou ligado a um fármaco por meio de outros ligantes. As modalidades preferidas da presente invenção são representadas por L e L1 a L4, em que a extremidade L1 é ligada ao ligante, e a extremidade L4 é ligada ao fármaco (Dr) através da unidade estrutural Y.
[00066] O ligante, incluindo unidade de extensão, unidade espaçadora e unidade de aminoácido, pode ser sintetizado por métodos conhecidos na técnica, tais como, aqueles descritos em US 2005-0238649A1. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação do fármaco na célula. Por exemplo, um ligante lábil de ácido (por exemplo, hidrazona), um ligante sensível à protease (por exemplo, sensível à peptidase), um ligante lábil à luz, um ligante de dimetila ou um ligante contendo dissulfeto (Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992); Patente Norte-Americana No. 5.208.020) podem ser usados.
[00067] O termo "conjugado de ligante-fármaco" significa que um ligante é ligado a um fármaco biologicamente ativo por meio de uma unidade de ligação estável. Na presente invenção, o "conjugado de ligante-fármaco" é preferivelmente um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC), o que significa que um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é ligado a um fármaco tóxico biologicamente ativo por meio de uma unidade de ligação estável.
[00068] Os códigos de três letras e os códigos de uma letra para aminoácidos usados na presente invenção são como descritos em J. biol. Chem, 243, p3558 (1968).
[00069] O termo "anticorpo" refere-se à imunoglobulina, uma estrutura de cadeia de quatro polipeptídeos conectados juntos por ligação de dissulfeto de intercadeia entre duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Diferentes regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulinas exibem diferentes sequências e constituintes de aminoácidos, apresentando, portanto, diferente antigenicidade. Assim, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco tipos, ou chamados de isotipos de imunoglobulina, a saber, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, com correspondente cadeia pesada μ, δ, γ, α e ε, respectivamente. De acordo com os constituintes de aminoácido da região de articulação e o número e localização das ligações de dissulfeto da cadeia pesada, o mesmo tipo de Ig pode ainda ser dividido em diferentes subtipos, por exemplo, IgG pode ser dividido em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A cadeia leve pode ser dividida em cadeia κ ou λ com base em diferentes regiões constantes. Cada cinco tipos de Ig pode ter uma cadeia κ ou λ.
[00070] A sequência de cerca de 110 aminoácidos adjacentes ao terminal N das cadeias pesadas ou cadeias leves do anticorpo é altamente variável, assim chamada de região variável (região Fv). O resto da sequência de aminoácido adjacente ao terminal C é relativamente estável, assim chamada de região constante. A região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões de estrutura relativamente conservadora (FR). As três regiões hipervariáveis, que determinam a especificidade do anticorpo, são também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDR). Cada região variável da cadeia leve (LCVR) ou cada região variável da cadeia pesada (HCVR) consiste em três regiões CDR e quatro regiões FR, com ordem sequencial do terminal amino ao terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As três regiões CDR da cadeia leve referem-se a LCDR1, LCDR2, e LCDR3; e as três regiões CDR da cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2, e HCDR3. O número e a localização dos resíduos de aminoácidos de CDR nas regiões LCVR e HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção obedecem aos critérios de numeração de Kabat conhecidos (LCDR1-3, HCDR2-3), ou obedecem aos critérios de numeração de Kabat e Chotia (HCDR1).
[00071] O termo "anticorpo totalmente humanizado" é também conhecido como "anticorpo monoclonal totalmente humanizado", em que região variável e região constante do anticorpo são ambas de origem humana, eliminando imunogenicidade e efeitos colaterais. O desenvolvimento do anticorpo monoclonal passou por quatro etapas, a saber: anticorpo monoclonal de murino, anticorpo monoclonal quimérico, anticorpo monoclonal humanizado e anticorpo monoclonal totalmente humanizado. As tecnologias relacionadas de preparação de anticorpo totalmente humanizado incluem principalmente tecnologia de hibridoma humano, tecnologia de linfócitos B transformados por EBV, tecnologia de exibição de fago, tecnologia de preparação de anticorpo transgênico de camundongo, tecnologia de preparação de anticorpo de célula B única e similares. O "anticorpo totalmente humanizado" da presente invenção é obtido pela tecnologia de exibição de fago. A tecnologia de exibição de fago inclui a construção de biblioteca de anticorpos humanos em fagos de fita única natural, isolando células B de PBMC humano, baço, tecido de nódulos linfáticos ou rastreio de anticorpos por imunização de camundongos transgênicos que expressam a cadeia leve e pesada de anticorpos humanos.
[00072] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de ligação específica ao antígeno. Foi demonstrado que fragmentos de anticorpo de comprimento total podem ser usados para atingir a função de ligação com um antígeno. Os exemplos de fragmentos de ligação no termo "fragmento de ligação a antígeno" incluem (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente composto de domínio VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab conectados por uma ligação de dissulfeto na região de articulação; (iii) fragmento Fd, consistindo em domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv, consistindo em domínios VH e VL de anticorpo de um braço; (v) domínio único ou fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546) composto de domínio VH; e (vi) uma região determinante complementar isolada (CDR) ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas opcionalmente conectadas por um ligante sintético. Além disso, embora o domínio VL e o domínio VH do fragmento Fv sejam codificados por dois genes separados, eles podem ser conectados por um ligante sintético usando métodos recombinantes, gerando assim uma única cadeia de proteína na qual uma molécula monovalente formou-se pelo emparelhamento de domínio VL e VH (referida como Fv de cadeia única (scFv); veja, por exemplo, Bird et al. (1988) Science: 242: 423-426, e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Este anticorpo de cadeia única também se destina a ser incluído no termo "fragmento de ligação ao antígeno" do anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e rastreados para fragmentos funcionais usando o mesmo método que para um anticorpo intacto. Os sítios de ligação a antígenos podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante ou por ruptura enzimática ou química de uma imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isotipos, por exemplo, anticorpo IgG (por exemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.
[00073] Fab é um fragmento de anticorpo obtido pelo tratamento de uma molécula de anticorpo IgG com uma papaína (que cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H). O fragmento Fab tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação ao antígeno, em que cerca de metade do lado de terminal N da cadeia H e toda a cadeia L estão ligados por meio de uma ligação de dissulfeto.
[00074] F(ab')2 é um fragmento de anticorpo obtido por digestão da parte a jusante das duas ligações de dissulfeto na região de articulação de IgG com pepsina, que tem um peso molecular de cerca de 100.000 e tem atividade de ligação ao antígeno e compreende duas regiões Fab que são ligadas na posição de articulação.
[00075] Fab' é um fragmento de anticorpo obtido pela clivagem da ligação de dissulfeto na região de articulação de F(ab')2 acima, que tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação ao antígeno.
[00076] Além disso, Fab' pode ser produzido pela inserção de DNA que codifica o fragmento de Fab' do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou eucariótica que é então introduzido em um procariota ou eucariota para expressar Fab'.
[00077] O termo "anticorpo de cadeia única", "Fv de cadeia única" ou "scFv" refere-se a uma molécula compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (ou região; VH) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (ou região; VL) conectados por um ligante. Tais moléculas de scFv podem ter a estrutura geral de NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL-COOH. Um ligante adequado na técnica anterior consiste em sequência de aminoácido GGGGS repetida ou variante da mesma, por exemplo, usando uma variante com 1-4 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros ligantes que podem ser usados na presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
[00078] O termo "CDR" refere-se a uma das seis regiões hipervariáveis dentro do domínio variável de um anticorpo que contribui principalmente para a ligação ao antígeno. Uma das definições mais comumente usadas para as seis CDRs é fornecida por Kabat E. A. et al. (1991) Sequences of protein of immunological interest. Publicação NIH 91-3242. Como usado aqui, a definição de Kabat de CDR se aplica apenas a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável da cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ou L1, L2, L3), bem como, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H2, CDR H3 ou H2, H3).
[00079] O termo "estrutura de anticorpo" refere-se a uma porção do domínio variável VL ou VH, que serve como uma estrutura para a alça de ligação ao antígeno (CDR) do domínio variável. Essencialmente, é um domínio variável sem CDR.
[00080] O termo "epitopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio de um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. Os epitopos tipicamente incluem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos ou não contíguos em uma conformação espacial única. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
[00081] Os termos "ligação específica", "ligação seletiva", "ligar seletivamente" e "ligar especificamente" referem-se à ligação de um anticorpo a um epitopo em um antígeno predeterminado. Normalmente, o anticorpo se liga com uma afinidade (KD) de menos do que cerca de 10-7 M, tal como, menos do que cerca de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou menos.
[00082] O termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de DNA e uma molécula de RNA. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou dupla, porém, é preferivelmente um DNA de fita dupla. Um ácido nucleico é "efetivamente ligado" quando é colocado em relação funcional com outra sequência de ácido nucléico.
Por exemplo, se um promotor ou realçador afeta a transcrição de uma sequência de codificação, o promotor ou realçador é efetivamente ligado à sequência de codificação.
[00083] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual foi ligada. Em uma modalidade, o vetor é um "plasmídeo" que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual o segmento de DNA adicional pode ser ligado. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, em que um segmento adicional de DNA pode ser ligado ao genoma viral. Os vetores descritos aqui são capazes de se autorreplicar em uma célula hospedeira na qual foram introduzidos (por exemplo, um vetor bacteriano tendo uma origem de replicação bacteriana e um vetor epissomal de mamífero) ou podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, portanto, são replicados juntos com o genoma do hospedeiro (por exemplo, um vetor de mamífero não epissomal).
[00084] Os métodos para a produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica, tais como, Cold Spring Harbor Antibody Technical Guide, Capítulos 5-8 e 15. O fragmento de ligação ao antígeno também pode ser preparado por métodos convencionais. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção são geneticamente modificados para adicionar um ou mais regiões FR humanas em regiões CDR não humanas. A(s) sequência(s) da linha germinativa de FR humana pode(m) ser obtida(s) alinhando os bancos de dados de genes de linhas germinativas de variáveis de anticorpos humanos IMGT e o software MOE do site ImMunoGeneTics (IMGT) em http://imgt.cines.fr ou do Journal of Immunoglobulins 20011SBN012441351.
[00085] O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir células bacterianas, microbianas, vegetais ou animais. Bactérias suscetíveis a serem transformadas incluem membros da Enterobacteriaceae, tais como, cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como, Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Adequados micro-organismos incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhagens de células hospedeiras de animais adequadas incluem células CHO (linhagem de células de ovário de hamster chinês) e células NS0.
[00086] O anticorpo modificado ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser preparado e purificado por métodos convencionais. Por exemplo, sequência(s) de cDNA que codifica(m) uma cadeia pesada e uma cadeia leve pode(m) ser clonada(s) e recombinada(s) em um vetor de expressão de GS. O vetor de expressão de imunoglobulina recombinante pode ser transfectado de forma estável em células CHO. Como uma tecnologia existente mais recomendada, os sistemas de expressão de mamíferos podem resultar na glicosilação de anticorpos, particularmente no sítio de terminal N altamente conservado da região Fc. Os clones positivos são amplificados em meio livre de soro em um biorreator para a produção de anticorpos. O meio de cultura contendo o anticorpo secretado pode ser purificado por técnica convencional. Por exemplo, a purificação é realizada usando uma coluna A ou G Sepharose FF que contém um tampão ajustado. Os componentes não especificamente ligados são removidos por eluição. O anticorpo ligado é eluído por um método de gradiente de pH, e os fragmentos de anticorpo são detectados por SDS-PAGE e coletados. O anticorpo pode ser filtrado e concentrado por um método convencional. Os agregados solúveis e multímeros também podem ser removidos por métodos convencionais, tal como, exclusão por tamanho ou permuta iônica. O produto resultante precisa ser congelado imediatamente, tal como, a -70°C, ou liofilizado.
[00087] O termo "peptídeo" refere-se a um fragmento de composto entre aminoácido e proteína, consistindo em duas ou mais moléculas de aminoácidos conectadas entre si através de ligações peptídicas. Peptídeos são fragmentos estruturais e funcionais de proteínas. Hormônios, enzimas e similares são essencialmente peptídeos.
[00088] O termo "sacarídeo" refere-se a uma macromolécula biológica composta por três elementos de C, H e O, que pode ser dividida em monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.
[00089] O termo "sonda fluorescente" refere-se a um tipo de molécula fluorescente com fluorescência característica na região ultravioleta-visível-infravermelho próximo. A propriedade de fluorescência (excitação e emissão de comprimentos de onda, intensidade, tempo de vida e polarização, etc.) da sonda fluorescente pode variar sensivelmente de acordo com as propriedades do ambiente, tais como, polaridade, índice de refração, viscosidade, etc. Interação não covalente entre a sonda fluorescente e ácido nucleico (DNA ou RNA), proteína ou outra estrutura macromolecular possibilita a alteração de umas ou mais propriedades fluorescentes, que podem ser usadas para estudar a propriedade e o comportamento da substância macromolecular.
[00090] O termo "fármaco tóxico" refere-se a uma substância que inibe ou interrompe o funcionamento das células e/ou causa morte ou destruição celular. Fármacos tóxicos incluem toxinas e outros compostos que podem ser usados no tratamento de tumores.
[00091] O termo "alquila" refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático saturado, que é um grupo de cadeia linear ou ramificada compreendendo 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente uma alquila tendo 1 a 12 átomos de carbono, mais preferivelmente uma alquila tendo 1 a 10 átomos de carbono, e mais preferivelmente uma alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono (tendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono). Exemplos não limitantes incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, sec-butila, n-pentila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, 1-etilpropila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, n-hexila, 1-etil-2-metilpropila, 1,1,2-trimetilpropila, 1,1-dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 2-etilbutila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 2,3-dimetilbutila, n-heptila, 2-metilhexila, 3-metilhexila, 4-metilhexila, 5-metilhexila, 2,3-dimetilpentila, 2,4-dimetilpentila, 2,2-dimetilpentila, 3,3-dimetilpentila, 2-etilpentila, 3-etilpentila, n-octila, 2,3-dimetilhexila, 2,4-dimetilhexila, 2,5-dimetilhexila, 2,2-dimetilhexila, 3,3-dimetilhexila, 4,4-dimetilhexila, 2-etilhexila, 3-etilhexila, 4-etilhexila, 2-metil-2-etilpentila, 2-metil-3-etilpentila, n-nonila, 2-metil-2-etilhexila, 2-metil-3-etilhexila, 2,2-dietilpentila, n-decila, 3,3-dietilhexila, 2,2-dietilhexila, e vários isômeros ramificados dos mesmos.
Mais preferivelmente, o grupo alquila é uma alquila inferior tendo 1 a 6 átomos de carbono, e exemplos não limitantes incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, sec-butila, n-pentila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, 1-etilpropila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, n-hexila, 1-etil-2-metilpropila, 1,1,2-trimetilpropila, 1,1-dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 2-etilbutila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 2,3-dimetilbutila e similares.
A alquila pode ser substituída ou não substituída.
Quando substituídos, o(s) grupo(s) de substituinte pode(m) ser substituído(s) em qualquer ponto de conexão disponível.
O(s) grupo(s) de substituinte é(são) preferivelmente um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila,
cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio, heterocicliltio e oxo. • termo "heteroalquila" refere-se a uma alquila contendo um ou mais heteroátomo(s) selecionado(s) do grupo consistindo em N, O e S, em que a alquila é como definido acima. I. O termo "alquileno" refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático ramificado ou linear saturado tendo dois resíduos derivados da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo átomo de carbono ou dois diferentes átomos de carbono do alcano origem. O alquileno é um grupo linear ou ramificado tendo 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente 1 a 12 átomos de carbono, e mais preferivelmente 1 a 6 átomos de carbono (tendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono). Exemplos não limitantes de alquileno incluem, porém, não são limitados a, metileno (-CH2-), 1,1-etileno (-CH(CH3)-), 1,2-etileno (-CH2CH2)-, 1,1-propileno (-CH(CH2CH3)-), 1,2-propileno (-CH2CH(CH3)-), 1,3-propileno (-CH2CH2CH2-), 1,4-butileno (-CH2CH2CH2CH2-), 1,5-pentileno (-CH2CH2CH2CH2CH2-), e similares. O alquileno pode ser substituído ou não substituído. Quando substituídos, o(s) grupo(s) de substituinte pode(m) ser substituído(s) em qualquer ponto de conexão disponível. O(s) grupo(s) de substituinte é(são) preferivelmente um ou mais grupos independentemente opcionalmente selecionados do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heteroalcóxi, cicloalquiltio, heterocicliltio e oxo.
[00092] O termo "alcóxi" refere-se a um grupo -O-(alquil) ou -O-(cicloalquila não substituída), em que a alquila e cicloalquila são como definido acima. Exemplos não limitantes de alcóxi incluem metóxi, etóxi, propóxi, butóxi, ciclopropilóxi, ciclobutilóxi, ciclopentilóxi, ciclo-hexilóxi. O alcóxi pode ser opcionalmente substituído ou não substituído. Quando substituídos, o(s) grupo(s) de substituinte é(são)
preferivelmente um ou mais grupo(s) independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicliltio.
[00093] O termo "cicloalquila" refere-se a um grupo substituinte de hidrocarboneto monocíclico ou policíclico saturado ou parcialmente insaturado tendo 3 a 20 átomos de carbono, preferivelmente 3 a 12 átomos de carbono, mais preferivelmente 3 a 10 átomos de carbono, e mais preferivelmente 3 a 8 átomos de carbono (tendo 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono). Exemplos não limitantes de cicloalquila monocíclica incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentenila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo-hexadienila, ciclo-heptila, ciclo-heptatrienila, ciclooctila e similares. Cicloalquila policíclica inclui uma cicloalquila tendo um anel espiro, anel fundido ou anel em ponte.
[00094] O termo "heterociclila" refere-se a um grupo hidrocarboneto monocíclico ou policíclico, saturado ou parcialmente insaturado de 3 a 20 membros, em que um ou mais átomos de anel são heteroátomos selecionados do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um número inteiro de 0, 1 ou 2), porém, excluindo -O-O-, -O-S- ou -S-S- no anel, com os átomos de anel restantes sendo átomos de carbono. Preferivelmente, a heterociclila tem 3 a 12 átomos de anel em que 1 a 4 átomos são heteroátomos (1, 2, 3 ou 4 heteroátomos); e mais preferivelmente, 3 a 10 átomos de anel (tendo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 átomos de anel). Exemplos não limitantes de heterociclila monocíclica incluem pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, homopiperazinila e similares. Heterociclila policíclica inclui uma heterociclila tendo um anel espiro, anel fundido ou anel em ponte.
[00095] O termo "heterociclila espiro" refere-se a um grupo de heterociclila policíclica de 5 a 20 membros com anéis individuais conectados através de um átomo compartilhado (denominado um átomo espiro), em que um ou mais átomos de anel são heteroátomos selecionados do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um número inteiro de 0 a 2), com os átomos de anel restantes sendo átomos de carbono, onde os anéis podem conter uma ou mais ligações duplas, porém, nenhum dos anéis tem um sistema de π-elétron completamente conjugado. A heterociclila espiro é preferivelmente uma heterociclila espiro de 6 a 14 membros, e mais preferivelmente uma heterociclila espiro de 7 a 10 membros. De acordo com o número dos átomos espiro compartilhados entre os anéis, a heterociclila espiro pode ser dividida em uma heterociclila monoespiro, heterociclila diespiro ou heterociclila poliespiro, e a heterociclila espiro é preferivelmente uma heterociclila monoespiro ou heterociclila diespiro, e mais preferivelmente uma heterociclila monoespiro de 4 membros/4 membros, 4 membros/5 membros, 4 membros/6 membros, 5 membros/5 membros, ou 5 membros/6 membros. Exemplos não limitantes de heterociclila espiro incluem:
O N .
[00096] O termo "heterociclila fundida" refere-se a um grupo heterociclila policíclica de 5 a 20 membros, em que cada anel no sistema compartilha um par adjacente de átomos com outro anel, em que um ou mais anéis podem conter uma ou mais ligações duplas, porém nenhum dos anéis tem um sistema π-elétron completamente conjugado, e em que um ou mais átomos de anel são heteroátomos selecionados do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um número inteiro de 0, 1 ou 2), com os átomos de anel restantes sendo átomos de carbono. a heterociclila fundida é preferivelmente uma heterociclila fundida de 6 a 14 membros, e mais preferivelmente uma heterociclila fundida de 7 a 10 membros (7, 8, 9 ou 10 membros). De acordo com o número de anéis de membros, a heterociclila fundida pode ser dividida em heterociclila fundida bicíclica, tricíclica, tetracíclica ou policíclica, e a heterociclila fundida é preferivelmente uma heterociclila fundida bicíclico ou tricíclica, e mais preferivelmente uma heterociclila fundida bicíclico de 5 membros/5 membros ou 6 membros. Exemplos não limitantes de heterociclila fundida incluem:
O H N N N N N O N H H H N N O N N N N N N N O O
H e .
[00097] O termo "heterociclila" refere-se a um grupo heterociclila policíclica de 5 a 14 membros, em que cada dois anéis no sistema compartilham dois átomos desconectados, em que os anéis podem ter uma ou mais ligações duplas, mas nenhum dos anéis tem um sistema π-elétron completamente conjugado, e em que um ou mais átomos do anel são heteroátomos selecionados do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um número inteiro de 0, 1 ou 2), com os átomos de anel restantes átomos de carbono. A heterociclila em ponte é preferivelmente uma heterociclila em ponte de 6 a 14 membros, e mais preferivelmente uma heterociclila em ponte de 7 a 10 membros (7, 8, 9 ou 10 membros). De acordo com o número de anéis de membros, a heterociclila em ponte pode ser dividida em uma heterociclila em ponte bicíclica, tricíclica, tetracíclica ou policíclica, e a heterociclila em ponte é preferivelmente uma heterociclila em ponte bicíclica, tricíclica ou tetracíclica, e mais preferivelmente uma heterociclila em ponte bicíclica ou tricíclica. Exemplos não limitantes de heterociclila em ponte incluem: .
[00098] O anel heterociclila pode ser fundido ao anel de arila, heteroarial ou cicloalquila, em que o anel ligado à estrutura de origem é heterociclila. Exemplos não limitantes do mesmo incluem:
H H H O N N N N O O S
[00099] e similares.
[000100] A heterociclila pode ser opcionalmente substituída ou não substituída. Quando substituída, o(s) grupo(s) de substituinte é preferivelmente um ou mais grupo independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio, heterocicliltio e oxo.
[000101] O termo "arila" refere-se a um anel monocíclico de totalmente-carbono de 6 a 14 membros ou um anel fundido policíclico (isto é, cada anel do sistema compartilha um par adjacente de átomos de carbono com outro anel no sistema) tendo um sistema π-elétron conjugado, preferivelmente uma arila de 6 a 10 membros (6, 7, 8, 9 ou 10 membros) arila, por exemplo, fenila e naftila, e preferivelmente fenila. O anel arila pode ser fundido ao anel de heteroarila, heterociclila ou cicloalquila, em que o anel ligado à estrutura de origem é anel arila. Exemplos não limitantes do mesmo incluem:
H H O N N N N N O O O O O H H H N N N N
N N S N O O e .
[000102] A arila pode ser substituída ou não substituída. Quando substituída, o grupo de substituinte é preferivelmente um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicliltio.
[000103] O termo "heteroarila" refere-se a um sistema heteroaromático de 5 a 14 membros tendo de 1 a 4 heteroátomos (1, 2, 3 ou 4 heteroátomos) selecionados do grupo consistindo em O, S e N. A heteroarila é preferivelmente uma heteroarila de 5 a 10 membros (5, 6, 7, 8, 9 ou 10 membros), mais preferivelmente uma heteroarila de 5 ou 6 membros, por exemplo furila, tienila, piridila, pirrolila, N-alquilpirrolila, pirimidinila, pirazinila, imidazolila, tetrazolila e similares. O anel heteroarila pode ser fundido ao anel de arila, heterociclila ou cicloalquila, em que o anel ligado à estrutura de origem é anel heteroarila. Exemplos não limitantes do mesmo incluem:
O H N N N N N N O N N N O N H
N N N N S N S e .
[000104] A heteroarila pode ser opcionalmente substituída ou não substituída. Quando substituída, o grupo de substituinte é preferivelmente um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio,
alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicliltio.
[000105] O termo "grupo de proteção amino" refere-se a um grupo que evita que um grupo amino reaja quando outras partes da molécula são sujeitas a uma reação, e pode ser facilmente removido. Exemplos não limitantes incluem 9-fluorenilmetiloxicarbonila, terc-butoxicarbonila, acetila, benzila, alila, p-metoxibenzila e similares. Estes grupos podem ser opcionalmente substituídos por um a três substituintes (um, dois ou três substituintes) selecionados do grupo consistindo em halogênio, alcóxi e nitro. O grupo de proteção amino é preferivelmente 9-fluorenilmetiloxicarbonila.
[000106] O termo "haloalquila" refere-se a um grupo alquila substituída por um ou mais halogênios, em que a alquila é como definida acima.
[000107] O termo "alquila deuterada" refere-se a um grupo alquila substituído por um ou mais átomo de deutério(s), em que a alquila é como acima definido.
[000108] O termo "hidroxialquila" refere-se a um grupo alquila substituído por um ou mais hidróxis, em que a alquila é como acima definido.
[000109] O termo "hidróxi" refere-se a um grupo -OH.
[000110] O termo "halogênio" refere-se a flúor, cloro, bromo ou iodo.
[000111] O termo "amino" refere-se a um grupo -NH2.
[000112] O termo "nitro" refere-se a um grupo -NO2.
[000113] O termo "ciano" refere-se a um grupo -CN.
[000114] O termo "amida" refere-se a um grupo -C(O)N(alquil) ou -C(O)N(cicloalquil), em que a alquila e cicloalquila são como acima definidas.
[000115] O termo "alcoxicarbonila" refere-se a um grupo
-C(O)O(alquil) ou -C(O)O(cicloalquil), em que a alquila e cicloalquila são como acima definidas.
[000116] A presente invenção também compreende os compostos de fórmula (I) em várias formas deuteradas. Cada um dos átomos de hidrogênio disponível ligado ao átomo de carbono pode ser independentemente substituído por um átomo de deutério. Aqueles versados na técnica podem sintetizar um composto de fórmula (I) em uma forma deuterada com referência às literaturas de referência. O composto de fórmula (I) em forma deuterada pode ser preparado empregando materiais brutos deuterados comercialmente disponíveis, ou eles podem ser sintetizados por técnicas convencionais com reagentes deuterados incluindo, porém não limitados a, borano deuterado, borano trideuterado em tetra-hidrofurano, hidreto de alumínio de lítio deuterado, iodoetano deuterado, iodometano deuterado e similares.
[000117] "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância descrito posteriormente pode, porém não precisa, ocorrer, e tal descrição inclui a situação em que o evento ou circunstância ocorre ou não ocorre. Por exemplo, "a heterociclila opcionalmente substituída por uma alquila" significa que um grupo alquila pode estar, porém não precisa estar, presente, e tal descrição inclui a situação da heterociclila sendo substituída por uma alquila e a heterociclila não sendo substituída por uma alquila.
[000118] "Substituída" refere-se a um ou mais átomo de hidrogênios em um grupo, preferivelmente até 5, e mais preferivelmente 1, 2 ou 3 átomos de hidrogênio, independentemente substituídos por um número correspondente de substituintes. Nem é preciso dizer que os substituintes só existem em sua posição química possível. A pessoa versada na técnica é capaz de determinar se a substituição é possível ou impossível por meio de experimentos ou teoria sem esforço excessivo. Por exemplo, a combinação de amino ou hidróxi com hidrogênio livre e átomos de carbono com ligações insaturadas (tal como olefínicas) pode ser instável.
[000119] O termo "composição farmacêutica" refere-se à mistura de um ou mais dos compostos descritos aqui ou sais ou profármacos fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis do mesmo com outros componentes químicos, e outros componentes tais como veículos e excipientes fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis. O propósito da composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo, que é favorável à absorção do ingrediente ativo a fim de mostrar atividade biológica.
[000120] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" ou "sal farmacêutico" refere-se a um sal do conjugado de ligante-fármaco da presente invenção ou um sal do composto da presente invenção, que é seguro e eficaz em mamíferos e tem a atividade biológica desejada. O conjugado de ligante-fármaco da presente invenção contém pelo menos um amino, de modo que ele possa formar um sal com um ácido. Exemplos não limitantes de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem cloridrato, bromidrato, iodidrato, sulfato, bissulfato, citrato, acetato, succinato, ascorbato, oxalato, nitrato, sorbato, hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, salicilato, hidrogenocitrato, tartarato, maleato, fumarato, formiato, benzoato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato.
[000121] O termo "solvato" refere-se a um solvato farmaceuticamente aceitável formado por um conjugado de ligante-fármaco da presente invenção com uma ou mais moléculas de solvente. Exemplos não limitantes de moléculas de solvent incluem água, etanol, acetonitrila, isopropanol, DMSO, acetato de etila.
[000122] O termo "carga de fármaco" refere-se ao número médio de fármacos citotóxicos carregados em cada ligante no composto de fórmula (I), e pode também ser expresso como a relação do número de fármaco para o número de anticorpo. A carga de fármaco pode variar de 0 a 12, preferivelmente de 1 a 10 fármacos citotóxicos (D) por ligante (Pc). Em uma modalidade da presente invenção, a carga de fármaco é expressa como n, também conhecida como valor DAR, e os valores exemplares podem ser uma média de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10. O número médio de fármacos por molécula de ADC após a reação de acoplamento pode ser determinado por métodos convencionais, tais como espectroscopia de UV/visível, espectrometria de massa, teste de ELISA e caracterização de HPLC.
[000123] Em uma modalidade da presente invenção, o fármaco citotóxico é conjugado com o amino N-terminal e/ou o ε-amino de resíduos de lisina do ligante por meio de uma unidade de ligação. Normalmente, o número de moléculas de fármaco conjugadas ao anticorpo em uma reação de acoplamento será menor do que o máximo teórico.
[000124] Os seguintes métodos não limitantes podem ser usados para controlar a carga dos conjugados ligante-fármaco citotóxico: (1) controlar a relação molar do reagente de ligação para o anticorpo monoclonal, (2) controlar o tempo de reação e a temperatura, (3) selecionar diferentes reagentes de reação.
[000125] A preparação de composições farmacêuticas convencionais pode ser encontrada na Farmacopeia Chinesa.
[000126] O termo "veículo" usado na composição da presente invenção refere-se a um sistema que pode alterar a forma como um fármaco entra no corpo humano e sua distribuição, controlar a taxa de liberação do fármaco e liberar o fármaco ao órgão-alvo. Os sistemas de liberação e direcionamento de veículos de fármaco podem reduzir a degradação e a perda de fármaco, reduzir os efeitos colaterais e melhorar a biodisponibilidade. Por exemplo, os tensoativos poliméricos que podem ser usados como veículos podem ser automontados para formar várias formas de agregados devido à sua estrutura anfifílica única. Exemplos preferidos incluem micelas, microemulsões, géis, cristais líquidos, vesículas e semelhantes. Estes agregados têm a capacidade de encapsular moléculas de fármacos, embora tenham boa permeabilidade à membrana, e podem ser usados como um excelente veículo de fármacos.
[000127] O termo "excipiente" é um adjuvante em uma formulação farmacêutica diferente do fármaco principal, que também pode ser referido como um adjuvante, tal como adesivos, cargas, desintegrantes, lubrificantes em comprimidos; partes da matriz nas preparações semissólidas, pomadas e cremes; conservantes, antioxidantes, agentes aromatizantes, fragrâncias, cossolventes, emulsificantes, solubilizantes, reguladores de pressão osmótica, corantes em preparações líquidas e similares.
[000128] O termo "diluente", também conhecido como carga, é principalmente destinado a aumentar o peso e o volume do comprimido. A adição de diluente garante um determinado volume, reduz o desvio de dose dos componentes principais, e melhora o perfil de compressão do fármaco. Quando o comprimido contém um componente oleoso, um absorvente é adicionado para absorver a substância oleosa, mantendo assim o estado "seco" para facilitar a formação do comprimido. Por exemplo, o diluente inclui amido, lactose, sais inorgânicos de cálcio, celulose microcristalina e similares.
[000129] A composição farmacêutica pode estar na forma de uma solução aquosa injetável estéril. Veículos ou solventes aceitáveis que podem ser usados são água, solução de Ringer ou solução isotônica de cloreto de sódio. A formulação injetável estéril pode ser uma microemulsão de óleo em água injetável estéril, em que o ingrediente ativo é dissolvido na fase de óleo. Por exemplo, o ingrediente ativo é dissolvido em uma mistura de óleo de soja e lecitina. A solução de óleo é então adicionada a uma mistura de água e glicerina, e processada para formar uma microemulsão. A solução injetável ou microemulsão pode ser introduzida na corrente sanguínea de um paciente por injeção em bolus local. Alternativamente, a solução e microemulsão são preferivelmente administradas de forma que mantenha uma concentração circulante constante do composto da presente invenção. Para manter essa concentração constante, um dispositivo de administração intravenosa contínua pode ser usado. Um exemplo de tal dispositivo é Deltec CADD-PLUS. TM. Bomba de injeção intravenosa de 5400.
[000130] A composição farmacêutica pode ser na forma de uma suspensão aquosa ou oleosa injetável estéril para administração intramuscular e subcutânea. Tal suspensão pode ser formulada com dispersantes adequados ou agentes umectantes e agentes de suspensão, como descrito acima de acordo com técnicas conhecidas. A formulação injetável estéril também pode ser uma solução injetável estéril ou suspensão preparada em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, uma solução preparada em 1,3-butanodiol. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser facilmente usados como solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer mistura de óleos fixos incluindo mono- ou di-glicerídeo sintético pode ser empregada. Além disso, ácidos graxos, tal como ácido oleico, também podem ser empregados na preparação de uma injeção.
[000131] A presente invenção refere-se a uma ramificação de ligante clivável com uma estrutura específica e uma substância ativa com uma estrutura específica, e um composto conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) uma ramificação ligante, uma substância ativa e um anticorpo.
Este ADC é um complexo formado pela ligação de uma substância tóxica a um anticorpo por meio de um espaçador. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é degradado no corpo para liberar moléculas ativas, apresentando assim um efeito antitumoral. II. Método de Síntese
[000132] A fim de obter o objetivo da presente invenção, a presente invenção aplica a seguinte solução técnica.
[000133] Um método para preparar o composto de fórmula (Pc-La-Y-Dr), compreende a seguinte etapa de:
[000134] Pc é acoplado com o composto de fórmula (La-Y-Dr) após redução para obter o composto de fórmula (Pc-La-Y-Dr); o agente de redução é preferivelmente TCEP, particularmente, é preferível reduzir a ligação de dissulfeto no anticorpo;
[000135] em que:
[000136] Pc, W, L2, L3, R1, R2, R5~R7, m e n são como definidos na fórmula (Pc-La-Y-Dr).
[000137] Os detalhes de uma ou mais modalidades da presente invenção são mencionados na especificação abaixo. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo. Por meio do relatório descritivo e das reivindicações, outras características, objetivos e vantagens da presente invenção serão evidentes. No relatório descritivo e reivindicações, a menos que o contexto indique claramente de outro modo, a forma singular inclui o referente no plural. A menos que de outro modo especificado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui são consistentes com o entendimento comum daqueles versados na técnica à qual pertence a presente invenção. Todas as patentes e publicações citadas na especificação são incorporadas aqui por referência. Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar mais completamente as modalidades preferidas da presente invenção. Estas modalidades não devem ser interpretadas como limitando o escopo da presente invenção de forma alguma, e o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações.
[000138] Os métodos experimentais nos exemplos da presente invenção para os quais as condições específicas não são indicadas foram indicados de acordo com condições convencionais ou as condições recomendadas pelos fabricantes de materiais ou produtos. Os reagentes para os quais fontes específicas não são indicadas são reagentes convencionais adquiridos no mercado.
[000139] As estruturas dos compostos são identificadas por ressonância magnética nuclear (RMN) ou espectroemtria de massa (EM). RMN é determinada por uma máquina Bruker AVANCE-400. Os solventes para determinação são dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6), clorofórmio deuterado (CDCl3) e metanol deuterado (CD3OD), e o padrão interno é tetrametilsilano (TMS). Os desvios químicos são fornecidos em 10-6 (ppm).
[000140] A EM é determinada por um espectrômetro de massa FINNIGAN LCQAd (ESI) (fabricante: Thermo, tipo: Finnigan LCQ advantage MAX).
[000141] UPLC é determinada por um cromatógrafo líquido/espectrômetro de massa Waters Acquity UPLC SQD.
[000142] A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) é determinada em um cromatógrafo líquido de alta pressão Agilent 1200DAD (coluna cromatográfica Sunfire C18 150 × 4,6 mm), e um cromatógrafo líquido de alta pressão Waters 2695-2996 (coluna cromatográfica Gimini C18 150 × 4,6 mm).
[000143] UV-HPLC é determinada em um espectrofômetro Thermo nanodrop2000 UV.
[000144] As taxas de inibição de proliferação e valores IC50 são determinados por um leitor de microplaca PHERA starFS (BMG Co., Alemanha).
[000145] Placa de sílica-gel Yantai Huanghai HSGF254 ou Qingdao GF254 é usada como a placa de cromatografia em sílica-gel em camada fina (TLC). A dimensão da placa de sílica-gel usada na TLC é de 0,15 mm a 0,2 mm, e a dimensão da placa de sílica-gel usada na purificação do produto é de 0,4 mm a 0,5 mm.
[000146] Sílica-gel Yantai Huanghai de 200 a 300 malhas é geralmente usada como um veículo para cromatografia em coluna.
[000147] Os materiais de partida conhecidos da presente invenção podem ser preparados pelos métodos conhecidos na técnica, ou podem ser adquiridos na ABCR GmbH & Co. KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc., Dari chemical Company etc.
[000148] A menos que de outro modo estabelecido, as reações são realizadas sob atmosfera de argônio ou atmosfera de nitrogênio.
[000149] "Atmosfera de argônio" ou "atmosfera de nitrogênio" significa que um balão de reação é equipado com um balão de argônio ou nitrogênio (cerca de 1 L).
[000150] "Atmosfera de hidrogênio" significa que um balão de reação é equipado com um balão de hidrogênio (cerca de 1 L).
[000151] A reação de hidrogenação pressurizada é realizada em um instrumento de hidrogenação Parr 3916EKX e um gerador de hidrogênio Qinglan QL-500 ou instrumento de hidrogenação HC2-SS.
[000152] Nas reações de hidrogenação, o sistema de reação é geralmente aspirado e preenchido com hidrogênio, e a operação acima é repetida três vezes.
[000153] O reator de micro-ondas CEM Discover-S 908860 é usado em reações de micro-ondas.
[000154] A menos que de outro modo estabelecido, a solução da reação refere-se a uma solução aquosa.
[000155] A menos que de outro modo estabelecido, a temperatura de reação da reação é a temperatura ambiente.
[000156] Temperatura ambiente de 20°C a 30°C é a temperatura de reação mais adequada.
[000157] Preparação do tampão PBS (pH = 6,5) nos exemplos: 8,5 g de KH2PO4, 8,56 g de K2HPO4,3H2O, 5,85 g de NaCl e 1,5 g de EDTA são fixados em frasco de 2 L, a mistura é submetida à ultrassonicação para dissolver completamente, e bem agitada para fornecer o tampão.
[000158] O sistema eluente em cromatografia em coluna e o sistema de solvente de desenvolvimento em cromatografia em camada fina para purificação dos compostos incluem: A: sistema diclorometano e isopropanol, B: sistema diclorometano e metanol, C: sistema éter de petróleo e acetato de etila. A relação do volume do solvente é ajustada de acordo com a polaridade dos compostos, e uma pequena quantidade de reagente ácido ou alcalino, tal como a trietilamina também pode ser adicionada para ajuste.
[000159] Alguns dos compostos da presente invenção são caracterizados por Q-TOF LC/EM. Em relação ao Q-TOF LC/EM,
Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer e Agilent 1290-Infinity UHPLC (Agilent Poroshell 300SB-C8 5 μm, coluna 2,1 × 75 mm) são usados. Exemplo 1
[000160] N-((1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3, 9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b] quinolin-1-il)-1-hidroxiciclopropano-1-carboxamida 1
[000161] 1 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado ao metanossulfonato de exatecano 1b (2,0 mg, 3,76 μmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente "EP0737686A1"), e a solução foi resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. Uma gota de trietilamina foi adicionada gota a gota, e a solução de reação foi agitada até ficar clara. Ácido 1-hidroxiciclopropilcarboxílico 1a (1,4 mg, 3,7 μmol, preparado de acordo com o método conhecido descrito em "Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984") e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (3,8 mg, 13,7 μmol) foram adicionados sucessivamente à solução de reação. Após a conclusão da adição, a solução de reação foi agitada a 0 a 5°C durante duas horas. 5 mL de água foram adicionados à solução de reação para interromper bruscamente a reação, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mL×3). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio saturada (5 mL×2), secadas sobre sulfato de sódio anidroso e filtradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento de sistema de solvente B para obter o produto do título 1 (1,6 mg, produção: 82,1%).
[000162] MS m/z (ESI): 520,2 [M+1].
[000163] 1 H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,90-7,84 (m, 1H), 7,80-7,68 (m,1H), 5,80-5,70 (m, 1H), 5,62-5,54 (m, 2H), 5,44-5,32 (m, 2H), 5,28-5,10 (m, 2H), 3,40-3,15 (m, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,23 (t, 1H), 2,06-1,75 (m, 2H), 1,68-1,56 (m, 1H), 1,22-1,18 (m, 2H), 1,04-0,98 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). Exemplo 2
[000164] (S)-2-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-1,2,3,9,10,12,13,15-octaidrobenzo[de]pirano[3',4':6,7]indoli zino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxiacetamida 2-A
[000165] (R)-2-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-1,2,3,9,10,12,13,15-octaidrobenzo[de]pirano[3',4':6,7]indoli zino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxiacetamida 2-B
[000166] 2 mL de etanol e 0,4 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados a 1b (4 mg, 7,53 μmol). A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. 0,3 mL de N-metilmorfolina foi adicionado gota a gota, e a solução de reação foi agitada até ficar clara. Ácido 2-ciclopropil-2-hidroxiacético 2a (2,3 mg, 19,8 μmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente "WO2013106717"), 1-hidroxibenzotriazol (3 mg, 22,4 μmol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (4,3 mg, 22,4 μmol) foram adicionados sucessivamente à solução de reação. Após a conclusão da adição, a solução de reação foi agitada a 0 a 5°C durante uma hora. O banho de gelo-água foi removido, e a solução de reação foi aquecida para 30°C e agitada durante duas horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o composto bruto resultante 2 foi purificado por cromatografia líquida de alta performance (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 * 250 mm; fase móvel: A-água (10 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila, eluição gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto do título (1,5 mg, 1,5 mg).
[000167] MS m/z (ESI): 534,0 [M+1].
[000168] Composto 2-B com configuração única (tendo tempo de retenção menor)
[000169] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,06 minutos, pureza: 88% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000170] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,37 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,56 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,32-5,29 (m, 1H), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34-1,28 (m, 1H), 0,86 (t, 3H), 0,50-0,39 (m, 4H).
Composto 2-A com configuração única (tendo tempo de retenção maior)
[000171] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,10 minutos, pureza: 86% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000172] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,35 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,58-5,53 (m, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,37 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 3,62 (t, 1H), 3,20-3,15 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,25-2,16 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,21-1,14 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,47-0,35 (m, 4H). Exemplo 3 (S)-N-((1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-1,2,3,9,10,1 2,13,15-octaidrobenzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)- 3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropanamida 3-A (R)-N-((1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-1,2,3,9,10,1 2,13,15-octaidrobenzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)- 3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropanamida 3-B
[000173] 2 mL de etanol e 0,4 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados a 1b (5,0 mg, 9,41 μmol), e a solução foi resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. 0,3 mL de N-metilmorfolina foi adicionado gota a gota, e a solução de reação foi agitada até ficar clara. Ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropiônico 3a (4,1 mg, 28,4 μmol, fornecedor: Alfa), 1-hidroxibenzotriazol (3,8 mg, 28,1 μmol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (5,4 mg, 28,2 μmol) foram adicionados sucessivamente à solução de reação. Após a conclusão da adição, a solução de reação foi agitada a 0 a 5°C durante 10 minutos. O banho de gelo-água foi removido, e a solução de reação foi aquecida para 30°C e agitada durante 8 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o composto bruto resultante 3 foi purificado por cromatografia líquida de alta performance (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 * 250 mm; fase móvel: A-água (10 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila, eluição gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida para obter os produtos do título (1,5 mg, 1,5 mg).
[000174] MS m/z (ESI): 561,9 [M+1]. Composto com configuração única (tendo tempo de retenção menor)
[000175] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,11 minutos, pureza: 88% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000176] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,94 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,61-5,55 (m, 1H), 5,45-5,23 (m, 3H), 5,15-5,06 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,26-2,20 (m, 1H), 2,16-2,08 (m, 1H), 2,02-1,94 (m, 1H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H). Composto com configuração única (tendo tempo de retenção maior)
[000177] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,19 minutos, pureza: 90% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmols de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000178] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,97 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,63-5,55 (m, 1H), 5,45-5,20 (m, 3H), 5,16-5,07 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,22-2,14 (m, 1H), 2,04-1,95 (m, 2H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H).
Exemplo 4 1-(((S)-7-benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,9,12,15- pentaoxo-2,5,8,11,14-pentaazaicosil)óxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de] pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1-carboxamida 4 Etapa 1 1-((2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)acetamido)metóxi)ciclop ropano-1-carboxilato de benzila 4c
[000179] 1-Hidroxiciclopropano-1-carboxilato de benzila 4a (104 mg, 0,54 mmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente "US2005/20645") e (2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)acetamido)metil acetato 4b (100 mg, 0,27 mmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente "CN105829346A") foram adicionados a um frasco de reação, seguidos pela adição de 5 mL de tetraidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água, seguido pela adição de terc-butóxido de potássio (61 mg, 0,54 mmol). O banho de gelo-água foi removido, e a solução de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 10 minutos. 20 mL de água gelada foram adicionados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (5 mL×2) e clorofórmio (5 mL × 5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas. Os resíduos resultantes foram dissolvidos em 3 mL de 1,4-dioxano e em seguida adicionados com 0,6 mL de água, bicarbonato de sódio (27 mg, 0,32 mmol) e 9-fluoreno metil cloroformiato (70 mg, 0,27 mmol), e a solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mL × 3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), secada sobre sulfato de sódio anidroso e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel com desenvolvimento de sistema de solvente B para obter o produto do título 4c (100 mg, produção: 73,6%).
[000180] MS m/z (ESI): 501,0 [M+1]. Etapa 2 Ácido 1-((2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)acetamido)metóxi)ciclo- propano-1-carboxílico 4d
[000181] 4c (50 mg, 0,10 mmol) foi dissolvido em 3 mL de um solvente misto de tetraidrofurano e acetato de etila (V:V = 2:1), seguido pela adição de paládio sobre carbono (25 mg, conteúdo: 10%). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução de reação foi filtrada através de celite, e a massa filtrante foi enxaguada com tetraidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título 4d (41 mg, produção: 100%).
[000182] MS m/z (ESI): 411,0 [M+1].
Etapa 3 (2-(((1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,1 3,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoli n-1-il)carbamoil)ciclopropóxi)metil)amino)-2-oxoetil)carbamato de (9H-Fluoren-9-il)metil 4e
[000183] 1b (7 mg, 0,013 mmol) foi adicionado a um frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. Uma gota de trietilamina, 4d (7 mg, 0,017 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (7 mg, 0,026 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada sob um banho de gelo durante 35 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (5 mL × 3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL), secada sobre sulfato de sódio anidroso e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento de sistema de solvente B para obter o produto do título 4e (8,5 mg, produção: 78,0%).
[000184] MS m/z (ESI): 828,0 [M+1]. Etapa 4 1-((2-Aminoacetamido)metóxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1-carboxamida 4f
[000185] 4e (4 mg, 4,84 μmol) foi dissolvido em 0,2 mL de diclorometano, seguido pela adição de 0,1 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, que foi repetida duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados à polpa, e a camada superior de hexano foi vertida, que foi repetida três vezes. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 4f (2,9 mg), que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação.
[000186] MS m/z (ESI): 606,0 [M+1]. Etapa 5 1-(((S)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,9,12,15- pentaoxo-2,5,8,11,14-pentaazaicosil)óxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de] pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1-carboxamida 4
[000187] O composto bruto 4f (2,9 mg, 4,84 μmol) foi dissolvido em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. Ácido (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-dioxo-1H-pirrol-1-il)hexanamido)acetamido)acetami do)-3-fenilpropiônico 4g (2,7 mg, 5,80 μmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente "EP2907824") em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (2,7 mg, 9,67 μmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada sob um banho de gelo durante 30 minutos. O banho de gelo foi removido, e a solução de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 15 minutos. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alta performance (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 * 250 mm; fase móvel: A-água (10 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila, eluição gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto do título 4 (2 mg, produção: 39,0%).
[000188] MS m/z (ESI): 1060,0 [M+1].
[000189] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,01 (d, 1H), 8,77 (t, 1H), 8,21 (t, 1H), 8,08-7,92 (m, 2H), 7,73 (d, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 4H), 6,98 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,61 (q, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,32 (t, 1H), 5,12 (q, 2H), 4,62 (t, 1H), 4,52 (t, 1H), 4,40-4,32 (m, 1H), 3,73-3,47 (m, 8H), 3,16-3,04 (m, 2H), 2,89 (dd, 1H), 2,69-2,55 (m, 2H), 2,37-2,23 (m, 4H), 2,12-1,93 (m, 4H), 1,90-1,74 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 1,33-1,11 (m, 5H), 0,91-0,81 (m, 4H). Exemplo 5 N-((2R,10S)-10-benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-oxa- 5,8,11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1-il)hexanamida 5-A N-((2S,10S)-10-benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4 -metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-oxa- 5,8,11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1-il)hexanamida 5-B
Etapa 1 2-ciclopropil-2-hidroxiacetato de benzila 5a
[000190] 2a (1,3 g, 11,2 mmols, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente "WO2013/106717") foi dissolvido em 50 mL de acetonitrila, e em seguida adicionado com carbonato de potássio (6,18 g, 44,8 mmol), brometo de benzila (1,33 mL, 11,2 mmols) e iodeto de tetrabutilamônio (413 mg, 1,1 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 48 horas, e filtrada através de celite. A massa filtrante foi enxaguada com acetato de etila (10 ml), e os filtrados foram combinados e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel com desenvolvimento de sistema de solvente C para obter o produto do título 5a (2 g, produção: 86,9%). Etapa 2 10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazaunde- can-11-oato de benzila 5b
[000191] 5a (120,9 mg, 0,586 mmol) e 4b (180 mg, 0,489 mmol) foram adicionados a um frasco de reação, seguidos pela adição de 4 mL de tetraidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. terc-Butóxido de potássio (109 mg, 0,98 mmol) foi adicionado e o banho de gelo-água foi removido. A solução de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 40 minutos. 10 mL de água gelada foram adicionados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (20 mL × 2) e clorofórmio (10 mL × 5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas. Os resíduos resultantes foram dissolvidos em 4 mL de dioxano e em seguida adicionados com 2 mL de água, bicarbonato de sódio (49,2 mg, 0,586 mmol) e 9-fluoreno metil cloroformiato (126 mg, 0,49 mmol), e a solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante duas horas. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mL × 3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), secada sobre sulfato de sódio anidroso e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel com desenvolvimento de sistema de solvente C para obter o produto do título 5b (48 mg, produção: 19%).
[000192] MS m/z (ESI): 515,0 [M+1]. Etapa 3 Ácido 10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazaundecan-11 -oico 5c
[000193] 5b (20 mg, 0,038 mmol) foi dissolvido em 4,5 mL de um solvente misto de tetraidrofurano e acetato de etila (V:V = 2:1), seguido pela adição de paládio sobre carbono (12 mg, conteúdo: 10%, seco). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução de reação foi filtrada através de celite, e a massa filtrante foi enxaguada com acetato de etila. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto
5c (13 mg), que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação.
[000194] MS m/z (ESI): 424,9 [M+1]. Etapa 4 (2-(((1-ciclopropil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dio- xo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il)amino)-2-oxoetóxi)metil)amino)-2-oxoetil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila 5d
[000195] 1b (10 mg, 18,8 μmol) foi adicionado a um frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. Uma gota de trietilamina, composto bruto 5c (13 mg, 30,6 μmol) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (16,9 mg, 61,2 μmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada sob um banho de gelo durante 40 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mL × 3). As fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL × 2), secada sobre sulfato de sódio anidroso e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento de sistema de solvente B para obter o produto do título 5d (19 mg, produção: 73,6%).
[000196] MS m/z (ESI): 842,1[M+1] Etapa 5 2-((2-Aminoacetamido)metóxi)-2-ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9 -hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de] pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)acetamida 5e
[000197] 5d (19 mg, 22,6 μmol) foi dissolvido em 2 mL de diclorometano, seguido pela adição de 1 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante duas horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 1 mL de tolueno foi adicionado e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, que foi repetida duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados aos resíduos para polpa, e o sobrenadante foi vertido após repouso. O sólido foi retido. Os resíduos sólidos foram concentrados sob pressão reduzida por uma bomba de óleo até a secura para obter o produto do título bruto 5e (17 mg), que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação.
[000198] MS m/z (ESI): 638,0 [M+18]. Etapa 6 N-((2R,10S)-10-benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4 -metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-oxa- 5,8,11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1-il)hexanamida 5-A
[000199] N-((2S,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluor o-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[ de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-pent aoxo-3-oxa-5,8,11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hid ro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 5-B
[000200] O composto bruto 5e (13,9 mg, 22,4 μmol) foi dissolvido em 0,6 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. 4g (21,2 mg, 44,8 μmol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (18,5 mg, 67,3 μmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada sob um banho de gelo durante 10 minutos. O banho de gelo foi removido, e a solução de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante uma hora para obter composto 5. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alta performance (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 * 250 mm; fase móvel: A-água (10 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila, eluição gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida para obter os produtos do título (2,4 mg, 1,7 mg).
[000201] MS m/z (ESI): 1074,4 [M+1].
[000202] Composto 5-A com configuração única (tendo tempo de retenção menor):
[000203] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,14 minutos, pureza: 85% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmols de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000204] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,60 (t, 1H), 8,51-8,49 (d, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,15 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 3H), 4,74-4,62 (m, 2H), 4,54-4,40 (m, 2H), 3,76-3,64 (m ， 4H), 3,62-3,48 (m, 2H), 3,20-3,07 (m, 2H), 3,04-2,94 (m, 2H), 2,80-2,62 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 2H), 1,93-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5H), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4H).
[000205] Composto 5-B com configuração única (tendo tempo de retenção maior):
[000206] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,16 minutos, pureza: 89% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000207] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,68-8,60 (m, 1H), 8,58-8,50 (m, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,94 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,13 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 3H), 4,78-4,68 (m, 1H), 4,60-4,40 (m, 2H), 3,76-3,58 (m, 4H), 3,58-3,48 (m,
1H), 3,20-3,10 (m, 2H), 3,08-2,97 (m, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,13 (m, 2H), 2,13-2,04 (m, 2H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5H), 0,91-0,79 (m, 3H), 0,53-0,34 (m, 4H). Exemplo 6 N-((2S,10S)-10-benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro-6,9,12,15-tetraoxo-3-oxa-5,8, 11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) hexanamida 6-A N-((2R,10S)-10-benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-di oxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino- [1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro-6,9,12,15-tetraoxo-3-oxa-5,8, 11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)- hexanamida 6-B
Etapa 1 3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropanoato de benzila 6a
[000208] 3a (1,80 g, 12,5 mmols) foi dissolvido em 100 mL de acetonitrila, e em seguida adicionado com carbonato de potássio (5,17 g, 37,5 mmols), brometo de benzila (4,48 mL, 37,5 mmols) e iodeto de tetrabutilamônio (231 mg, 0,63 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi aquecida para 60°C e agitada durante 5 horas. A solução de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel com desenvolvimento de sistema de solvente C para obter o produto do título 6a (980 mg, produção: 33,5%).
[000209] 1 H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,43-7,36 (m, 5H), 5,34 (s, 2H), 4,53 (s, 1H), 3,44 (s, 1H). Etapa 2 1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-10-(trifluorometil)-2,9-dioxa-4,7-diazaunde can-11-oato de benzila 6b
[000210] 4b (63 mg, 0,17 mmol) e 6a (80 mg, 0,34 mmol) foram adicionados a um frasco de reação, seguidos pela adição de 3 mL de tetraidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. terc-Butóxido de potássio (38 mg, 0,34 mmol) foi adicionado e o banho de gelo-água foi removido. A solução de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 20 minutos. 10 mL de água gelada foram adicionados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (20 mL × 2) e clorofórmio (10 mL × 5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas, e os resíduos resultantes foram dissolvidos em 2 mL de dioxano. 0,4 mL de água, bicarbonato de sódio (19 mg, 0,23 mmol) e 9-fluoreno metil cloroformiato (49 mg, 0,19 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mL × 3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), secada sobre sulfato de sódio anidroso e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel com desenvolvimento de sistema de solvente C para obter o produto do título 6b (51 mg, produção: 55,3%).
[000211] MS m/z (ESI): 559,9 [M+18]. Etapa 3 Ácido 1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-10-(trifluorometil)-2,9-dioxa-4,7-diazaun- decan-11-oico 6c
[000212] 6b (15 mg, 0,28 mmol) foi dissolvido em 3 mL de um solvente misto de tetraidrofurano e acetato de etila (V:V = 2:1), seguido pela adição de paládio sobre carbono (15 mg, conteúdo: 10%). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução de reação foi filtrada através de celite, e a massa filtrante foi enxaguada com tetraidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 6c (13 mg).
[000213] MS m/z (ESI): 452,9 [M+1]. Etapa 4 (2-((((3-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]qui- nolin-1-il)amino)-1,1,1-trifluoro-3-oxopropan-2-il)óxi)metil)amino)-2-oxo etil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila 6d
[000214] 1b (10 mg, 18,8 μmol) foi adicionado a um frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. Uma gota de trietilamina, 6c (13 mg, 28,7 μmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (11 mg, 39,7 μmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada sob um banho de gelo durante 30 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mL × 3). A fase orgânica foi combinada, lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL × 2), secada sobre sulfato de sódio anidroso e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento de sistema de solvente B para obter o produto do título 6d (16 mg, produção: 97,8%).
[000215] MS m/z (ESI): 870,0[M+1]. Etapa 5 2-((2-Aminoacetamido)metóxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)-3,3,3-trifluoropropanamida 6e
[000216] 6d (16 mg, 18,4 μmol) foi dissolvido em 0,6 mL de diclorometano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante duas horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, que foi repetida duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados aos resíduos para polpa, e o sobrenadante foi vertido após repouso por um tempo para reter o sólido, que foi repetido três vezes. Os resíduos sólidos foram concentrados sob pressão reduzida por uma bomba de óleo até a secura para obter o produto do título bruto 6e (12 mg), que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação.
[000217] MS m/z (ESI): 647,9 [M+1].
Etapa 6 N-((2S,10S)-10-Benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro-6,9,12,15-tetraoxo-3-oxa-5,8, 11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)- hexanamida 6-A N-((2R,10S)-10-Benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexaidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro-6,9,12,15-tetraoxo-3-oxa-5,8, 11,14-tetraaza-hexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) hexanamida 6-B
[000218] O composto bruto 6e (12 mg, 18,5 μmol) foi dissolvido em 1,0 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada para 0 a 5°C sob um banho de gelo-água. 4g (14 mg, 29,6 μmol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (15 mg, 54,2 μmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada sob um banho de gelo durante 30 minutos. O banho de gelo foi removido, e a solução de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante uma hora para obter composto 6. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alta performance (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19 * 250 mm; fase móvel: A-água (10 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila, eluição gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida para obter os produtos do título (2,7 mg, 2,6 mg).
[000219] MS m/z (ESI): 1102,0 [M+1].
[000220] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção menor):
[000221] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,18 minutos, pureza: 91% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000222] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,97 (d, 1H), 8,85-8,76 (m, 1H), 8,37-8,27 (m, 1H), 8,12-8,02 (m, 1H), 8,02-7,95 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,10 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,37-5,25 (m, 3H), 5,23-5,13 (m, 1H), 4,81-4,68 (m, 2H), 4,51-4,41 (m, 1H), 3,78-3,45 (m, 6H), 3,21-3,13 (m, 1H), 3,02-2,93 (m, 1H), 2,77-2,63 (m, 2H), 2,45-2,29 (m, 3H), 2,24-2,05 (m, 3H), 2,04-1,93 (m, 5H), 1,90-1,75 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 0,90-0,78 (m, 5H).
[000223] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção maior):
[000224] Análise de UPLC: tempo de retenção: 1,23 minutos, pureza: 90% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 μm 2,1 * 50 mm, fase móvel: A-água (5 mmol de NH4OAc), B-acetonitrila).
[000225] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,05 (d, 1H), 8,97-8,88 (m, 1H), 8,35-8,27 (m, 1H), 8,11-8,03 (m, 1H), 8,02-7,95 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,29-7,13 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,54 (s, 1H), 5,64-5,55 (m, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,36-5,20 (m, 3H), 4,92-4,85 (m, 1H), 4,82-4,72 (m, 2H), 4,52-4,42 (m, 1H), 3,77-3,48 (m, 6H), 3,21-3,14 (m, 1H), 3,03-2,95 (m, 1H), 2,79-2,65 (m, 2H), 2,47-2,28 (m, 3H), 2,25-2,05 (m, 3H), 2,05-1,94 (m, 5H), 1,91-1,76 (m, 2H), 1,52-1,37 (m, 4H), 0,92-0,77 (m, 5H). Exemplo 7 - Preparação de anticorpos relacionados e proteínas de detecção dos mesmos Exemplo 7-1. Antígeno de B7H3 e proteína de detecção
[000226] A sequência de B7H3 humana representada por SEQ ID Nº: 1 foi usada como o modelo para B7H3 da presente invenção, e a sequência de aminoácido do antígeno e proteína de detecção envolvidas na presente invenção foram designadas. A menos que de outro modo especificado, o seguinte antígeno de B7H3 é B7H3 humano.
• Sequência de aminoácido de comprimento total de B7H3 humano: B7H3 (SEQ ID Nº: 1):
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDA TLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRT ALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAP ISKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTG NVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSS VTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLN LIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQR VRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPISKPSMTLEPNKDLRPGD TVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVH SVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVT VGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTAL QPLKHSDSKEDDGQEIA
[000227] Nota:
[000228] A porção sublinhada dupla é o peptídeo de sinal (Peptídeo de sinal: 1-28);
[000229] A porção sublinhada é o domínio extracelular de B7H3 (Domínio extracelular: 29-466), em que 29-139 é domínio de tipo 1 V similar a Ig, e 145-238 é domínio de tipo 1 C2 similar a Ig; 243-357 é domínio de tipo 2 V similar a Ig, e 363-456 é domínio de tipo 2 C2 similar a Ig;
[000230] A porção pontilhada é a porção de domínio de transmembrana (Domínio de transmembrana: 467-487);
[000231] A porção itálica é o domínio intracelular (Domínio citoplásmico: 488-534). • Sequência de aminoácido de comprimento total de B7H3 de camundongo (SEQ ID Nº: 2)
MLRGWGGPSVGVCVRTALGVLCLCLTGAVEVQVSEDPVVALVDTDA TLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYSNRT ALFPDLLVQGNASLRLQRVRVTDEGSYTCFVSIQDFDSAAVSLQVAA PISKPSMTLEPNKDLRPGNMVTITCSSYQGYPEAEVFWKDGQGVPLT GNVTTSQMANERGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAH GSVTITGQPLTFPPEALWVTVGLSVCLVVLLVALAFVCWRKIKQSCEE ENAGAEDQDGDGEGSKTALRPLKPSENKEDDGQEIA
[000232] Nota:
[000233] A porção sublinhada dupla é o peptídeo de sinal (Peptídeo de sinal: 1-28);
[000234] A porção sublinhada é o domínio extracelular de B7H3 (Domínio extracelular: 29-248), em que 29-139 é domínio de tipo V similar a Ig, e 145-238 é domínio de tipo C2 similar a Ig;
[000235] A porção pontilhada é a porção de domínio de transmembrana (Domínio de transmembrana: 249-269);
[000236] A porção itálica é o domínio intracelular (Domínio citoplásmico: 270-316). • Antígeno de B7H3 humano para triagem e detecção (SEQ ID Nº: 3)
[000237] Isto é um produto comercial (R&D cat# 1949-B3-050/CF, abreviado como 2Ig-B7H3), e a sequência é como segue:
LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQL VHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFT CFVSIRDFGSAAVSLQVAAPISKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQ GYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGAN GTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTG-HHHHHH
[000238] Nota:
[000239] A porção sublinhada é a região extracelular de B7H3;
[000240] A porção itálica é o marcador His-tag. • Antígeno de B7H3 humano para detecção (SEQ ID Nº: 4)
[000241] Isto é um produto comercial (SinoBiological cat#
11188-H08H, abreviado como 4Ig-B7H3), e a sequência é como segue:
LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQL VHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFT CFVSIRDFGSAAVSLQVAAPISKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQ GYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGAN GTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGT DATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYAN RTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQV AAPISKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVP LTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDA HGSVTITGQPMT-HHHHHH
[000242] Nota: A porção sublinhada é a região extracelular de B7H3;
[000243] A porção itálica é o marcador His-tag. • Antígeno de B7H3 de camundongo para triagem e detecção (SEQ ID Nº: 5)
[000244] Isto é um produto comercial (R&D cat# 1397-B3-050/CF), e a sequência é como segue:
VEVQVSEDPVVALVDTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQL VHSFTEGRDQGSAYSNRTALFPDLLVQGNASLRLQRVRVTDEGSYT CFVSIQDFDSAAVSLQVAAPISKPSMTLEPNKDLRPGNMVTITCSSYQ GYPEAEVFWKDGQGVPLTGNVTTSQMANERGLFDVHSVLRVVLGA NGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPLTF-HHHHHH
[000245] Nota: A porção sublinhada é a região extracelular de B7H3;
[000246] A porção itálica é o marcador His-tag. Exemplo 7-2. Preparação de anticorpo totalmente humanizado
2.1 Triagem de sequência positiva
[000247] As células B foram isoladas de PBMC humano, tecidos do baço e linfonodo, e RNA foi extraído para construir biblioteca de anticorpos de fago de cadeia única naive (capacidade 3,2×1010). A biblioteca de fago de cadeia única naive construída foi empacotada para formar partículas de fago, e em seguida submetida a varredura pelo método de fase líquida.
O fago foi ligado ao B7H3 biotinilado em fase líquida, e em seguida separado por contas magnéticas de estreptavidina.
A fim de obter sequências positivas que podem se ligar cruzadamente a B7H3 humano (R&D cat # 1949-B3-050/CF) e B7H3 de camundongo (R&D cat # 1397-B3-050/CF), respectivamente, B7H3 humano biotinilado e B7H3 de camundongo biotinilado foram usados para a varredura alternada separadamente. 2 µg/ml de B7H3 humano biotinilado foram usados na primeira rodada de varredura. 2 µg/ml de B7H3 de camundongo biotinilado foram usados na segunda rodada de varredura. 0,5 µg/ml de B7H3 humano biotinilado foi usado na terceira rodada de varredura.
Após três rodadas de varredura, 500 monoclones foram escolhidos e empacotados em fago para o teste ELISA de fago.
A atividade de ligação do fago monoclonal a B7H3 humano (R&D cat # 1949-B3-050/CF) e B7H3 de camundongo (R&D cat # 1397-B3-050/CF) foi testada separadamente.
Placa ELISA foi revestida com 1 μg/ml de B7H3 humano ou B7H3 de murino, e adicionada com sobrenadante de fago diluído a 1:1 com tampão de bloqueio, e em seguida detectada com HRP anti-M13. Os clones com valor de OD450 ELISA de mais que 0,5, e com relações de valores de OD450 ELISA para a ligação a B7H3 de humano ou camundongo para valores de OD450 ELISA para a ligação a 1% de BSA maiores que 2,0 foram sequenciados e a sequência específica 1702 foi obtida (também chamados de h1702 na presente invenção, os anticorpos h1702 e h1702DS referidos na presente invenção são os mesmos que h1702 e h1702-1 do pedido de patente PCT/CN2018/081249, todos os conteúdos do pedido de patente PCT/CN2018/081249 são incorporados na presente invenção)
2.2 Construção de anticorpo monoclonal intacto
[000248] A sequência específica 1702 foi obtida por triagem de biblioteca de fago, e o processo para construir o anticorpo monoclonal intacto da mesma foi como segue.
[000249] Com base na sequência de anticorpo de cadeia única obtida por sequenciamento, os iniciadores foram designados para construir o fragmento de gene VH/VK/VL de cada sequência de anticorpo de cadeia única por PCR. A região variável de cadeia pesada de 1702 foi obtida. ➢ sequência variável de cadeia pesada de 1702
QVQLVQSGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVRQAPGKGL EWVAVISYDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLILQMNSLRAEDTAV YYCARSARLYASFDYWGQGALVTVSS
[000250] SEQ ID Nº: 6 ➢ sequência variável de cadeia leve de 1702
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAP RMLIYNTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHV DRDIWVFGGGTKLTVL
[000251] SEQ ID Nº: 7
[000252] Nota: A ordem é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. As porções itálicas na sequência são sequências FR, e as porções sublinhadas são as sequências CDR.
[000253] As sequências CDR na cadeia leve e cadeia pesada de cada anticorpo são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1 Sequências de região CDR de cada cadeia leve e pesada Anticorpo Cadeia pesada Cadeia leve
GFIFSSSA SGSVSTSHY HCDR1 LCDR1 SEQ ID Nº: 8 SEQ ID Nº: 11
ISYDGSNK NTN 1702 HCDR2 LCDR2 SEQ ID Nº: 9 SEQ ID Nº: 12
ARSARLYASFDY AIHVDRDIWV HCDR3 LCDR3 SEQ ID Nº: 10 SEQ ID Nº: 13
[000254] A região variável de anticorpo foi em seguida homologamente recombinada com o fragmento de gene de região constante (CH1-FC/CL) para construir o anticorpo intacto VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL.
[000255] A sequência de anticorpo de 1702 de comprimento total intacto construída é como segue.
[000256] Sequência de aminoácido de 1702 de cadeia pesada (IgG1): (SEQ ID Nº: 14)
QVQLVQSGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVRQAPGKGLE WVAVISYDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLILQMNSLRAEDTAVY YCARSARLYASFDYWGQGALVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000257] Sequência de aminoácido de 1702 de cadeia leve: Lamada (SEQ ID Nº: 15)
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAP RMLIYNTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHV DRDIWVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSILSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[000258] Para melhorar ainda mais a estabilidade do anticorpo, os aminoácidos de sequência de cadeia leve de 1702 foram mutados. A mutação específica envolve que o primeiro resíduo de aminoácido Q no terminal N da cadeia leve (SEQ ID Nº: 15) foi substituído por D, o primeiro resíduo de aminoácido S no terminal C foi excluído, a fim de obter um anticorpo monoclonal 1702DS mais estável e uniforme (também denominado h1702DS na presente invenção).
[000259] A sequência de cadeia pesada de 1702DS após modificação de mutação é SEQ ID Nº: 14, e a sequência de aminoácido de cadeia leve é como segue: (SEQ ID Nº: 16).
DTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAP RMLIYNTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHV DRDIWVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSILSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC
2.3 Expressão e purificação de anticorpo totalmente humanizado
[000260] Os plasmídeos que expressam a cadeia leve e pesada do anticorpo respectivamente foram transfectados em células HEK293E em uma relação de 1,5:1. O sobrenadante foi coletado após 6 dias, e os detritos foram removidos por centrifugação em alta velocidade, e a purificação foi realizada por uma coluna de Proteína A. A coluna foi enxaguada com PBS até que a leitora de A280 caísse para a linha de base. A proteína alvo foi eluída com um eluente acídico de pH 3,0-pH 3,5, e neutralizada com Tris-HCl a 1 M (pH 8,0-9,0). A amostra eluída foi devidamente concentrada e também purificada por cromatografia em gel Superdex200 (GE) que havia sido equilibrada por PBS para remoção do agregado. O pico do monômero foi coletado e empacotado para o uso posterior. Exemplos de preparação de conjugado de anticorpo B7H3-fármaco Exemplo 8 ADC-1
[000261] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 mM, 0,347 mL, 3,47 μmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada por PBS de anticorpo 1702DS (solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5; 7,3 ml, 13,8 mg/ml, 0,681 μmol) a 37°C. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada para 25°C em um banho de água, e diluída para 14,0 ml. 3,3 ml da solução foram levados para a seguinte reação.
[000262] Composto 4 (3,0 mg, 2,75 μmol) foi dissolvido em 0,15 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 3,3 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessanilizada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada por PBS do produto exemplar ADC-1 de fórmula FADC-1 (1,35 mg/mL, 13 mL), que foi armazenado a 4 °C.
[000263] O valor médio calculado por UV-HPLC: n = 7,50.
Exemplo 9 ADC-2
[000264] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 mM, 0,050 mL, 0,50 μmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada por PBS de anticorpo 1702DS (solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5; 1,0 ml, 13,8 mg/ml, 0,093 μmol) a 37°C. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada para 25°C em um banho de água, e diluída para 2,0 ml. 1,15 ml da solução foram levados para a seguinte reação.
[000265] Composto 5 tendo tempo de retenção menor, o composto 5-A (1,29 mg, 1,02 μmol) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 1,15 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessanilizada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada por PBS do produto exemplar ADC-2 de fórmula FADC-2 (2,63 mg/mL, 2,4 mL), que foi armazenado a 4°C.
[000266] O valor médio calculado por UV-HPLC: n = 7,24.
Exemplo 10 ADC-3
[000267] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 mM, 0,347 mL, 3,47 μmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada por PBS de anticorpo 1702DS (solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5; 7,3 ml, 13,8 mg/ml, 0,681 μmol) a 37°C. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada para 25°C em um banho de água, e diluída para 14,0 ml. 3,3 ml da solução foram levados para a seguinte reação.
[000268] Composto 6-o composto tendo tempo de retenção maior (3,0 mg，2,75 μmol) foi dissolvido em 0,15 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 3,3 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessanilizada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5, contendo EDTA a 0,001 M ) para obter a solução tamponada por PBS do produto exemplar ADC-3 de fórmula FADC-3 (1,28 mg/mL, 13 mL), que foi armazenado a 4°C.
[000269] O valor médio calculado por UV-HPLC: n = 7,58.
Exemplo 11 ADC-4
[000270] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 73,7 μL, 740 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada por PBS de anticorpo 1702DS (solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5; 10,0 mg/ml, 2,14 mL, 144,60 nmol) a 37°C. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada para 25°C em um banho de água.
[000271] Composto 5-tendo tempo de retenção menor, o composto 5-A (3,0 mg, 2793 nmol) foi dissolvido em 150 μl de DMSO, e em seguida adicionado à solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessanilizada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5, contendo EDTA a 0,001 M ) para obter a solução tamponada por PBS do produto exemplar ADC-4 de fórmula FADC-2 (1,28 mg/mL, 13,0 mL), que foi armazenado a 4 °C.
[000272] O valor médio calculado por UV-Vis: n = 6,87.
Exemplo 12 ADC-5
[000273] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 30,1 μL, 300 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada por PBS de anticorpo 1702DS (solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5; 10,0 mg/ml, 0,89 mL, 60,14 nmol) a 37°C. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada para 25°C em um banho de água.
[000274] Composto 5-tendo tempo de retenção menor, o composto 5-A (1,02 mg, 950 nmol) foi dissolvido em 100 μl de DMSO, e em seguida adicionado à solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessanilizada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5, contendo EDTA a 0,001 M ) para obter a solução tamponada por PBS do produto exemplar ADC-5 de fórmula FADC-2 (1,94 mg/mL, 3,5 mL), que foi armazenado a 4°C.
[000275] O valor médio calculado por UV-Vis: n = 6,11.
[000276] De acordo com os procedimentos de reação acima e meios técnicos convencionais no campo, as condições de reação foram ajustadas para obter produtos exemplares de fórmula FADC-2 com valores n de 2,97 e 4,8 respectivamente: ADC-6 (n = 2,97); ADC-7 (n = 4,8).
Exemplo 13 ADC-8
[000277] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 30,1 μL, 300 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada por PBS de anticorpo 1702DS (solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5; 10,0 mg/ml, 0,89 mL, 60,14 nmol) a 37°C. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada para 25°C em um banho de água.
[000278] Composto 4 (1,0 mg, 943 nmol) foi dissolvido em 100 μl de DMSO, e em seguida adicionado à solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25°C durante 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessanilizada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada por PBS a 0,05 M com pH = 6,5, contendo EDTA a 0,001 M ) para obter a solução tamponada por PBS do produto exemplar ADC-8 de fórmula FADC-1 (1,47 mg/mL, 4,5 mL), que foi armazenado a 4°C.
[000279] O valor médio calculado por UV-Vis: n = 6,33. Ensaio Biológico Exemplo de Teste 1. Teste Biacore para afinidade de anticorpo
[000280] A afinidade de reação de anticorpo anti-B7H3 e B7H3-ADC para antígeno de 2Ig-B7H3 humano e antígeno de 4Ig-B7H3 humano foi determinada usando um instrumento Biacore, GE.
[000281] Um chip biossensor de Proteína A (Cat. # 29127556, GE)
foi usado para capturar por afinidade uma certa quantidade de anticorpo/ADC a ser testado. O antígeno 2Ig-B7H3 humano diluído em série (Cat. # 1949-B3-050/CF, R&D) e o antígeno 4Ig-B7H3 humano (Cat. # 11188-H08H, Sino Biological) fluíram através da superfície do chip. O sinal de reação em tempo real foi detectado pelo instrumento Biacore (Biacore T200, GE) para obter as curvas de associação e dissociação. Após a conclusão de cada ciclo de dissociação, o biochip foi lavado e regenerado com solução de regeneração de glicina-ácido hidroclórico (pH 1,5) (Cat. # BR-1003-54, GE). O tampão usado no experimento foi solução de tampão HBS-EP (pH 7,4) (Cat. # BR-1001-88, GE).
[000282] Os dados experimentais foram ajustados com o software BIAevaluation versão 4.1 GE em um modelo de Langmuir (1: 1) para obter valores de afinidade. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Afinidade de reação entre anticorpo h1702 e vários antígenos (unidade: M) Anticorpo 2Ig-B7H3 4Ig-B7H3 Humano Humano h1702 7,97E-7 8,55E-9 ADC-2 7,55E-9
[000283] Conclusão: O anticorpo h1702 tem uma forte afinidade com antígenos. Ao mesmo tempo, o teste de afinidade Biacore com 2Ig-B7H3 humano e 4Ig-B7H3 humano mostra que a afinidade de ADC é semelhante à do anticorpo nu. Exemplo de Teste 2. Teste de endocitose in vitro
[000284] Neste experimento, o efeito de endocitose do anticorpo foi avaliado com base na intensidade do sinal de fluorescência do anticorpo intracelular. O anticorpo B7-H3 e Fc de IgG anti-humano de APC (Biolegend, 409306) foram misturados em uma relação molar de
1:2 e incubados no gelo durante 15 minutos. A mistura de anticorpo foi incubada com 2 × 105 células U87MG (astroblastoma de cérebro humano, banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Catálogo # TCHu138) no gelo durante 30 minutos, e o excesso de anticorpo foi removido por lavagem. As células foram transferidas para um meio pré-aquecido a 37°C, e incubadas a 37°C durante 0, 15, 30, 60 e 120 minutos respectivamente. As células foram centrifugadas e novamente suspensas na solução de eluição do anticorpo (glicina a 0,05 M, NaCl a 0,1 M, pH 2,45). Após incubar durante 7 minutos em temperatura ambiente, a solução de eluição do anticorpo foi removida por lavagem, e o sinal de fluorescência intracelular foi lido usando BD Verse (resultados mostrados na Figura 1). Os resultados mostram que o h1702 foi eficientemente endocitado nas células após se ligar às células U87MG. Exemplo de Teste 3. Avaliação de T1/2 sobre ratos SD
[000285] 4 ratos SD (adquiridos de Shanghai JieSiJie Laboratory Animal Co., Ltd., Metade macho e metade fêmea) foram mantidos em ciclo claro/escuro ajustado a 12/12 horas, com temperatura constante de 24 ± 3°C, umidade de 50-60%, e acesso livre a alimentos e água. No dia do experimento, ratos SD foram injetados com o anticorpo de agente de teste B7H3/ADC respectivamente na veia da cauda em uma dose de 3 mg/kg e um volume de injeção de 5 ml/kg.
[000286] O ponto de tempo para a coleta de sangue: No primeiro dia de administração, o sangue foi retirado da veia do fundo ocular em 5 min, 8 h, 24 h (Dia 2), Dia 3, Dia 5, Dia 8, Dia 11 e Dia 15 após administração, a cada 200 μL (equivalente a 100 μL de soro). As amostras de sangue coletadas foram deixadas em repouso em temperatura ambiente durante meia hora até a coagulação, e em seguida centrifugadas a 10.000 × g a 4°C durante 10 minutos. O sobrenadante foi coletado e imediatamente armazenado a -80°C.
[000287] A concentração do anticorpo B7H3 no soro foi medida por ELISA, e a análise de PK foi realizada. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3. T1/2 de anticorpo B7H3 em ratos SD Modo de Agente de Teste T1/2 (±SD médio, hora) Administração h1702 IV (3 mg/kg) 185±17
[000288] Os resultados mostram que a meia-vida de h1702 da presente invenção em ratos é de cerca de 185 horas (7,7 dias). Exemplo de Teste 4. Estabilidade química do anticorpo B7H3
[000289] A modificação química após preparação do anticorpo é um dos motivos mais comuns que levam ao problema de estabilidade do produto, principalmente o alto grau de modificação de desaminação, oxidação ou isomerização em alguns aminoácidos da região CDR. Essas modificações devem ser evitadas ou reduzidas. 500 μg do anticorpo a ser testado foram dissolvidos em 500 μl de PBS (pH 7,4), e submetidos a banho de água a 40°C. As amostras foram colhidas nos dias 0, 10, e 20 respectivamente para os experimentos de hidrólise enzimática. 100 μg de amostras foram coletados em diferentes momentos e dissolvidos em 100 μl de His-HCl a 0,2 M (tampão de cloridrato de histidina) e Gua-HCl a 8 M (pH 6,0, tampão de cloridrato de citrulina). 3 μl de 0,1 g/mL de DTT (ditiotreitol) foram adicionados, e submetidos a banho de água a 50°C durante uma hora. As amostras foram ultra-filtradas duas vezes com solução a 0,02 M de His-HCl (pH 6,0), e 3 μL de 0,25 mg/mL de tripsina (invitrogen, CAT # 25200-072) foram adicionados. A mistura foi submetida à enzimólise durante a noite a 37°C em um banho de água. LC-MS foi realizada usando Agilent 6530 Q-TOF, e os sítios de modificação potenciais foram analisados por espectrometria de massa (os resultados são mostrados na Tabela 4). Os resultados mostram que o anticorpo B7H3 h1702 da presente invenção não apresenta tendência significativamente aumentada para desamidação, oxidação ou heterogeneidade, indicando que o anticorpo possui excelente estabilidade física e química. Tabela 4. Estabilidade química de vários anticorpos Cadeia Dia Amostra leve/cadeia Sítio/modificação Dia 0 Dia 20 10 pesada LC M48/oxidação 2,82% 2,9% 2,83% h1702 M34/oxidação 3,52% 3,46% 3,38%
HC M83/oxidação 0,98% 1,01% 0,01%
[000290] Exemplo de Teste 5. Estabilidade de anticorpo h1702DS
[000291] A estabilidade de h1702 e h1702DS foi testada por SEC, método teste de CE-SDS não redutor (pH 9,0) e método teste IEX.
[000292] Teste de SEC: Cromatografia Waters e2695 e coluna SEC Xbridge BEH 200A foram usados. 50 μg de anticorpo foram carregados e eluídos com a fase móvel de PBS em gradiente constante.
[000293] Método de CE-SDS NR: As amostras foram processadas usando o kit Beckman SDS-MW Analysis. 100 μg de proteína foram adicionados com uma solução de tampão, e aquecidos para desnaturar. Os dados foram coletados usando aparato de eletroforese capilar PA800.
[000294] Método de IEX: Foram usados a cromatografia Waters Acquity H-Class e a coluna Thermo MAbPac SCX-10. 50 μg do anticorpo foram carregados, e foi aplicado um gradiente linear, utilizando o kit de tampão de gradiente de pH de CX-1 como a fase móvel. Sinal ultravioleta em um comprimento de onda de 280 nm foi coletado. Tabela 5 Comparação da estabilidade de h1702 e h1702DS SEC CE-SDS (pH9,0) IEX h1702 100% 71,21% 40,5% h1702DS 100% 94,67% 86,21% Exemplo de Teste 6: Teste de proliferação celular in vitro
[000295] Neste experimento, o efeito de inibição de B7H3-ADC sobre a proliferação celular foi avaliado com base em IC50 pela detecção do conteúdo de ATP intracelular.
[000296] Células U87MG (astroblastoma de cérebro humano, banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Catálogo # TCHu138), células Calu-6 (células de câncer de pulmão, ATCC, Catálogo # ATCC® HTB-56™), células Detroit562 (células de carcinoma faríngeo humano, ATCC, Catálogo # ATCC® CCL-138™) e células A498 (células de câncer de rim, ATCC, Catálogo # ATCC® HTB-44™) foram cultivadas em meio EMEM contendo 10% de FBS, e passadas duas a 3 vezes por semana com uma relação de passagem de 1:3 ou 1:6. Preparação do meio EMEM: meio MEM (GE, CAT # SH30024,01), NEAA (sigma, CAT # M7145-100ML) e solução de piruvato de sódio (sigma, CAT # S8636-100ML).
[000297] A-375 (células de melanoma, ATCC, Catálogo # ATCC® CRL-1619™) foi cultivada em meio DMEM (GE, SH30243,01) contendo 10% de FBS, e passada duas a 3 vezes por semana com uma relação de passagem de 1:3 ou 1:6.
[000298] CHO-K1 (que não expressa B7H3 humano, ATCC, Catálogo # ATCC® CCL-61™) foi cultivada em meio F12 (Gibco, 11765-054) contendo 10% de FBS, e passada duas a 3 vezes por semana com uma relação de passagem de 1:4 ou 1:6.
[000299] Para passagem, o meio foi removido e a camada celular foi lavada com 5 mL de 0,25% de tripsina, em seguida, a tripsina foi removida e as células foram digeridas durante 3 a 5 minutos em uma incubadora. Em seguida, as células foram novamente suspensas pela adição de meio fresco. As células foram contadas, e a suspensão celular foi formulada para a densidade correspondente (células U87MG: 500 células/cavidade; células A-498: 500 células/cavidade; células A-375: 300 células/cavidade; células Calu-6: 800 células/cavidade; células detroit562: 2.000 células/cavidade; e células CHO-K1: 500 células/cavidade).
[000300] 180 μL de suspensão de células foram adicionados a uma placa de 96 cavidades e 200 μL de meio foram adicionados à periferia da placa de 96 cavidades. A placa foi incubada durante 24 horas em uma incubadora (37°C, 5% de CO2).
[000301] As amostras a serem testadas foram diluídas com PBS ou DMSO em uma relação de 3 vezes para 9 concentrações (a concentração inicial de cada ADC foi de 500 nM). As amostras foram adicionadas à placa, que foi incubada durante 6 dias na incubadora (37°C, 5% de CO2). 90 μl de reagente CellTiter-Glo foram adicionados a cada cavidade da placa de 96 cavidades, e a placa foi deixada descansar no escuro em temperatura ambiente durante 10 minutos. O valor do sinal de quimioluminescência foi lido no Victor3, e os dados foram processados pelo software GraphPad. Os valores medidos de IC50 são mostrados na Tabela 6 e Figuras 2A a 2F. Tabela 6. Efeito de inibição do ADC da presente invenção sobre proliferação celular A498 Calu-6 U87 A375 Detroit562 CHOK1 ADC-2 418,9* 70,6 49,1 33,3 31,6 >500 ADC-3 13,1 1,91 3,78 1,51 1,89 36,8 ADC-1 196,6 26,54 29 23,72 26,9 >500
*A unidade é nM. Exemplo de Teste 7: Avaliação de eficácia do ADC da presente invenção sobre tumor de xenoenxerto de U87MG de astroblastoma de cérebro humano em camundongos nus I. Objetivo do teste
[000302] Camundongos nus BALB/c foram usados como o animal teste para avaliar a eficácia do composto de ADC da presente invenção sobre tumor de xenoenxerto de U87MG de astroblastoma de cérebro humano em camundongos nus. II. Materiais e fármacos de teste
1. Fármacos de teste
[000303] ADC-5 (1mpk, 3mpk)
[000304] ADC-8 (1mpk, 3mpk)
[000305] Em branco: Solução de tampão de PBS (pH 7,4)
[000306] 2. Método de formulação: Solução de tampão de PBS (pH 7,4).
[000307] 3. Animais de teste
[000308] Camundongos nus BALB/c (SPF, fêmeas), adquirido de Shanghai JieSiJie Laboratory Animal Co.,Ltd. III. Processo de teste
[000309] Camundongos nus BALB/c (fêmeas, 6 a 7 semanas de idade) para teste foram inoculados subcutaneamente com células U87MG de astroblastoma de cérebro humano (como definido acima). No dia 10 após a inoculação, os animais foram agrupados aleatoriamente em 8 animais por grupo (D0), e os fármacos foram administrados por injeção intraperitoneal uma vez por semana por 3 vezes. O volume do tumor e peso corporal foram medidos 2 a 3 vezes por semana, e os dados foram gravados. A fórmula de cálculo de volume de tumor (V) é como segue: V＝1/2×a×b2
[000310] em que:
[000311] a e b representam comprimento e largura respectivamente.
[000312] Volume relativo (RTV) = VT/V0
[000313] Taxa de inibição de tumor (%) = (CRTV−TRTV)/CRTV (%)
[000314] em que V0 e VT representam o volume do tumor no início do teste e no fim do teste, respectivamente. CRTV e TRTV representam o volume relativo de tumor do grupo de controle (em branco) e o grupo teste no fim do teste, respectivamente. IV. Resultados de Teste
[000315] Administração de injeção intraperitoneal (i.p.) foi realizada uma vez por semana por 3 vezes. No dia 18 da observação, a taxa de inibição de tumor de ADC-8 1mpk atingiu 39,22% (P<0,01); a taxa de inibição de tumor de ADC-8 3mpk atingiu 80,24% (P<0,0001); a taxa de inibição de tumor de ADC-5 1mpk atingiu 27,53% (P<0,05); e a taxa de inibição de tumor de ADC-5 3mpk atingiu 55,88% (P<0,0001). No dia 22 (D22) da observação, a taxa de inibição de tumor de cada grupo de administração foi também melhorada, a taxa de inibição de tumor de ADC-8 1mpk atingiu 47,7% (P<0,0001); a taxa de inibição de tumor de ADC-8 3mpk atingiu 89,8% (P<0,0001); a taxa de inibição de tumor de ADC-5 1mpk atingiu 40,6% (P<0,0001); e a taxa de inibição de tumor de ADC-5 3mpk atingiu 63,3% (P<0,0001).
[000316] Durante a administração, os animais em cada grupo mostraram peso corporal normal, sugerindo que o ADC não tinha nenhum efeito colateral óbvio. Os resultados de teste são mostrados na Tabela 7 e Figura 3. Os anticorpos testados podem efetivamente inibir o desenvolvimento de tumor de xenoenxerto de U87MG em camundongos nus apresentando tumor de uma maneira dependente de dose.
Tabela 7. Eficácia do ADC da presente invenção sobre tumor de xenoenxerto de U87MG em camundongos nus apresentando tumor (D22) Grupo volume de tumor médio (mm3) Volume relativo de tumor Taxa de inibição de tumor (%) D0 SEM D18 SEM D22 SEM D18 SEM D22 SEM D18 D22 controle em 167 18 2041 288 2907 328 12,01 0,97 17,76 1,63 - - branco ADC-8 1mpk 168 18 1264 222 1599 271 7,30 0,91 9,19 0,99 39,22** 47,7*** ADC-8 3mpk 168 17 409 73 448 89 2,37 0,32 2,55 0,37 80,24*** 89,8*** ADC-5 1mpk 168 16 1397 81 1795 111 8,71 0,70 11,25 1,02 27,53* 40,6*** ADC-5 3mpk 168 16 842 42 1172 80 5,30 0,42 7,55 0,95 55,88*** 63,3*** vs em branco: * p<0,05, ** p<0,01, ***p<0,001 Exemplo de Teste 8: Avaliação de eficácia do ADC da presente invenção em tumor de enxerto Detroit 562 de célula metastática de fluido pleural de carcinoma de faringe humano em camundongos nus I. Objetivo do Teste
[000317] Camundongos nus BALB/c foram usados como o animal teste para avaliar a eficácia do composto de ADC da presente invenção em tumor de enxerto Detroit 562 de célula metastática de fluido pleural de carcinoma de faringe humano em camundongos nus. II. Materiais e fármacos de teste
1. Fármacos de teste
[000318] ADC-1 (1mpk, 3mpk)
[000319] ADC-2 (1mpk, 3mpk)
[000320] ADC de controle negativo (3 mpk): conjugado de ligante-toxina formado acoplando um não-B7H3 alvo com um composto de referência (Exemplo 58 em pedido de patente "CN104755494A").
[000321] 2. Método de formulação: os fármacos foram todos diluídos e formulados com PBS.
[000322] 3. Animais de teste
[000323] Camundongos nus BALB/c, adquiridos de Changzhou Cavens Laboratory Animal Co.,Ltd. III. Processo de Teste
[000324] Camundongos nus BALB/c (fêmeas, 6 a 7 semanas de idade) para teste foram inoculados subcutaneamente com células Detroit 562 de célula metastática de fluido pleural de carcinoma de faringe humano. No dia 10 após a inoculação, os animais foram agrupados aleatoriamente com 8 animais por grupo (D0), e os fármacos foram administrados por injeção intraperitoneal uma vez por semana por 3 vezes. O volume do tumor e peso corporal foram medidos 2 a 3 vezes por semana, e os dados foram gravados. A fórmula de cálculo de volume de tumor (V) é como segue: V＝1/2×a×b2
[000325] em que:
[000326] a e b representam comprimento e largura, respectivamente.
[000327] Volume relativo (RTV) = VT/V0
[000328] Taxa de inibição de tumor (%) = (CRTV−TRTV)/CRTV (%)
[000329] em que V0 e VT representam o volume do tumor no início do teste e no fim do teste, respectivamente. CRTV e TRTV representam o volume relativo de tumor do grupo de controle (controle negativo) e o grupo teste no fim do teste, respectivamente. IV. Resultados de teste
[000330] Administração de injeção intraperitoneal foi realizada uma vez por semana por 3 vezes. No dia 28 da observação, a taxa de inibição de tumor de ADC-1 1 mg/kg (1mpk) atingiu 40,85%; a taxa de inibição de tumor de ADC-1 3 mg/kg (3mpk) atingiu 62,55% (P<0,05); a taxa de inibição de tumor de ADC-2 1 mg/kg (1mpk) atingiu 44,26%;
e a taxa de inibição de tumor de ADC-2 3 mg/kg (3mpk) atingiu 72,27% (P<0,01).
[000331] Durante a administração, os animais em cada grupo mostram pesos corporais normais, sugerindo que o ADC não tinha nenhum efeito colateral óbvio. Os resultados de teste são mostrados na Tabela 8 e Figura 4. Os anticorpos testados podem efetivamente inibir o desenvolvimento de tumor de xenoenxerto de Detroit 562 em camundongos nus apresentando tumor, e mostram uma maneira dependente de dose. Tabela 8. Eficácia do ADC da presente invenção sobre tumor de xenoenxerto de Detroit 562 em camundongos nus apresentando tumor (D28) Grupo Taxa de inibição volume de tumor volume de tumor médio Volume relativo de de tumor (%) no médio (mm3) (mm3) tumor dia 28 Dia 0 SEM Dia 28 SEM Dia 28 SEM Controle Negativo 182,70 6,79 1317,99 223,20 7,47 1,46 - ADC-1 1mpk 182,46 6,45 784,30 136,27 4,42 0,80 40,85 ADC-1 3mpk 182,60 6,38 501,07 123,58 2,80 0,68 62,55* ADC-2 1mpk 182,65 6,53 738,73 152,08 4,16 0,87 44,26 ADC-2 3mpk 182,59 6,50 381,48 105,76 2,07 0,58 72,27** Exemplo de Teste 9: Proliferação celular in vitro de ADCs com várias cargas de fármaco
[000332] A eficácia de compostos de ADC de fórmula FADC-2, ADC-4 (n = 6,87), ADC-6 (n = 2,97) e ADC-7 (n = 4,8) foi determinada em teste de proliferação celular in vitro de acordo com os procedimentos experimentais iguias ao Exemplo de Teste 6.
[000333] O valor de IC50 medido e taxa de inibição máxima são mostrados na Tabela 9 e Figuras 5A, 5B e 5C. FADC-2 com vários valores de DAR mostra um efeito na inibição de proliferação celular, e o efeito de inibição é positivamente correlacionado com o valor de DAR, enquanto anticorpo nu não mostra nenhum efeito na inibição de proliferação celular. Tabela 9 ADC Calu-6 (como CHOK1 (como Detroit562 definido acima) definido acima) Taxa de Taxa de Taxa de IC50 inibição IC50 inibição IC50 inibição (nM) máxima (nM) máxima (nM) máxima (%) (%) (%) ADC-6 80,4 81,59 321,5 64,60 >500 2,15 ADC-7 38,9 87,45 148,1 77,62 >500 -2,05 ADC-4 15,9 94,64 53,6 84,44 >500 9,09 h1702DS >500 -2,77 >500 0,99 >500 12,62 Exemplo de Teste 10: Estabilidade plasmática
[000334] Amostra de ADC-4 foi completamente misturada com plasma humano, plasma de macaco (Shanghai Medicilon Inc.) e 1% de solução de PBS de BSA (Sigma) (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) respectivamente a uma concentração final de 100 μg/ml, e filtrada para esterilização. A mistura foi incubada em um banho de água a 37°C, e o dia de início de incubação foi gravado como Dia 0. As amostras foram coletadas no Dia 7, Dia 14 e Dia 21 para detecção de toxina livre.
[000335] As amostras coletadas em diferentes pontos de tempo foram resfriadas para a temperatura ambiente, e bem misturadas por vórtice. 25 μl de amostras foram adicionados a uma placa de 96 cavidades. 50 μL de solução de trabalho de padrão interno (100 ng/mL de camptotecina em acetonitrila) e 150 μl de acetonitrila foram adicionados. A solução foi agitada em vórtice durante 5 minutos, e centrifugada durante 10 minutos (4000 rpm). 5 μl da solução foram retirados para análise de LC/MS/MS (Applied Biosystems, Inc., USA).
[000336] Os resultados são mostrados na Figura 6. ADC-4 é bastante estável em plasma humano, plasma de macaco e 1% de solução de PBS de BSA.
A taxa de liberação de toxina livre não excedeu 2%, e tornou-se estável no dia 14.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: caracterizado pelo fato de que: Y é selecionado do grupo consistindo em -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- e -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-; Ra e Rb são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila; ou, Ra e Rb juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R1 é selecionado do grupo consistindo em halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; ou, Ra e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
m é um número inteiro de 0 a 4; n é 1 a 10, que é um decimal ou número inteiro; L é uma unidade de ligante; Pc é um anticorpo anti-B7H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
2. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: as cadeias pesadas HCDR1, HCDR2 e HCDR3 representadas pela sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, 9 e 10, respectivamente, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 representadas por SEQ ID Nº: 8, 9 e 10, respectivamente; e as cadeias leves LCDR1, LCDR2 e LCDR3 representadas pela sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11, 12 e 13 respectivamente, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 representadas por SEQ ID Nº: 11, 12 e 13, respectivamente.
3. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a região FR de cadeia leve sobre a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é derivada da sequência de cadeia leve da linha germinativa humana ou da sequência mutante da mesma, e/ou a região FR de cadeia pesada sobre a região variável de cadeia pesada é derivada da sequência de cadeia pesada de linha germinativa humana ou da sequência mutante da mesma.
4. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve: em que a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é representada por SEQ ID Nº: 6 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID Nº: 6, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é representada por SEQ ID Nº: 7 ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID Nº: 7.
5. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-B7H3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante de anticorpo; a região constante de cadeia pesada da região constante de anticorpo é derivada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com eles, a região constante de cadeia leve da região constante de anticorpo é derivada de um anticorpo humano κ, cadeia λ ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com eles; e preferivelmente, a sequência de aminoácido da região constante de cadeia pesada é derivada de IgG1 humano ou tem pelo menos 95% de identidade de sequência com ele.
6. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que Pc é um anticorpo de comprimento total, em que o anticorpo de comprimento total é selecionado do grupo consistindo em:
o anticorpo h1702 consistindo na sequência de cadeia pesada representada por SEQ ID Nº: 14 e a sequência de cadeia leve representada por SEQ ID Nº: 15, e o anticorpo h1702DS consistindo na sequência de cadeia pesada representada por SEQ ID Nº: 14 e a sequência de cadeia leve representada por SEQ ID Nº: 16.
7. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab', F(ab')2, anticorpos de cadeia única (scFv), regiões V dimerizadas (anticorpo duplo), regiões V estabilizadas de dissulfeto (dsFv), e fragmentos de ligação ao antígeno de peptídeos contendo CDRs.
8. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que n é 2 a 8, preferivelmente 5 a 9, e n é um decimal ou número inteiro.
9. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: Y é -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-; Ra e Rb são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio e alquila; R1 é uma haloalquila ou C3-6 cicloalquila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila ou C3-6 cicloalquila;
ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma C3-6 cicloalquila; m é 0 ou 1.
10. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que Y é selecionado do grupo consistindo em: e .
11. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o terminal O de Y é conectado à unidade de ligante L.
12. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a unidade de ligante -L- é -L1-L2-L3-L4-, L1 é , e s1 é um número inteiro de 2 a 8; L2 é uma ligação química; L3 é um resíduo de tetrapeptídeo; L4 é -NR5(CR6R7)t-, R5, R6 e R7 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e t é 1 ou 2.
13. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o terminal L1 da unidade de ligante -L- é conectado a Pc, e o terminal L4 da unidade de ligante -L- é conectado a Y.
14. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o resíduo de tetrapeptídeo de L3 é um resíduo de aminoácido composto de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico, e preferivelmente um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG.
15. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que -L-Y- é uma estrutura como segue: L2 é uma ligação química; L3 é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG; R1 é uma haloalquila ou C3-6 cicloalquila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila ou C3-6 cicloalquila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma C3-6 cicloalquila; R5, R6 e R7 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila; s1 é um número inteiro de 2 a 8; m é um número inteiro de 0 a 4.
16. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que -L-Y- é selecionado do grupo consistindo em:
e .
17. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, que é um conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato: caracterizado pelo fato de que: W é selecionado do grupo consistindo em C1-8 alquila, C1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomos selecionados do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1-8 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada independentemente opcionalmente também substituída por um ou mais substituintes selecionados do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; L2 é selecionado do grupo consistindo em
-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- e uma ligação química, e p1 é um número inteiro de 1 a 20; L3 é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, o aminoácido pode ser substituído ou não substituído, quando substituído, o(s) grupo(s) de substituinte pode(m) ser substituído(s) em qualquer ponto de conexão disponível, o(s) grupo(s) de substituinte é(são) um ou mais grupos independentemente selecionados do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; R1 é selecionado do grupo consistindo em halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, heterociclila, arila e heteroarila; R2 é selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R1 e R2 juntamente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R4 e R5 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila; R6 e R7 são idênticos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila; m é um número inteiro de 0 a 4; n é 1 a 10, que é um decimal ou número inteiro; Pc é um anticorpo anti-B7H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
18. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr)
ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com reivindicação 17, que é um conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-Lb-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato: caracterizado pelo fato de que: s1 é um número inteiro de 2 a 8; R1, R2, R5~R7, m e n são como definidos na reivindicação
17.
19. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo em:
e em que Pc e n são como definidos na reivindicação 1.
20. Conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo em:
e em que, n é como definido na reivindicação 1.
21. Método para preparar um conjugado de ligante-fármaco de fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte etapa de: Pc é acoplado com um composto de fórmula (La-Y-Dr) após redução para obter o composto de fórmula (Pc-La-Y-Dr); em que: Pc é um anticorpo anti-B7H3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; W, L2, L3, R1, R2, R5~R7, m e n são como definidos na reivindicação 17.
22. Método, de acordo com reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula La-Y-Dr é um composto de fórmula Lb-Y-Dr: ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1, R2, R5~R7, s1 e m são como definidos na reivindicação
18.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (La-Y-Dr) ou o composto de fórmula (Lb-Y-Dr) é selecionado do grupo consistindo em: ,
,
,
,
e
.
24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, e um ou mais veículo(s), diluente(s) ou excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is).
25. Uso do conjugado de anticorpo-fármaco ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou composição farmacêutica, como definida na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que é na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por B7H3.
26. Uso, de acordo com reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio mediado por B7H3 é um câncer com expressão elevada de B7H3.
27. Uso do conjugado de ligante-fármaco ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou composição farmacêutica, como definida na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que é na preparação de medicamentos para o tratamento ou prevenção de um tumor.
28. Uso do conjugado de ligante-fármaco ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou composição farmacêutica, como definida na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que é na preparação de medicamentos para o tratamento e/ou prevenção de um câncer, em que o câncer é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pulmão, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de rim, câncer uretral, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer do endométrio, câncer de glândula salivar, câncer do esôfago, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma, câncer de faringe, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, leucemia, câncer nos ossos, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer pancreático e linfoma.
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