BR112020023746A2

BR112020023746A2 - anticorpo, composição farmacêutica, método para tratar câncer, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, processo para a produção de um anticorpo e reagente de diagnóstico

Info

Publication number: BR112020023746A2
Application number: BR112020023746-9A
Authority: BR
Inventors: Ye Liu; Tong Zhang; Zuobai Wang; Kang Li
Original assignee: Beigene, Ltd.
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2021-02-17
Also published as: TW202016133A; US20240409655A1; MX2024013960A; EP3797123A4; ZA202006931B; US20210214452A1; AU2019272384A1; US12103974B2; CN112566935B; CN112566935A; MX2020012567A; JP2024056938A; EA202092460A1; JP2021524256A; EP3797123A1; JP7489922B2; WO2019223733A1; SG11202011024WA; KR20210013708A; CA3100766A1

Abstract

“ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO E REAGENTE DE DIAGNÓSTICO”. A presente divulgação fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a OX40 humana (ACT35, CD134 ou TNFRSF4), uma composição farmacêutica que compreende o referido anticorpo e o uso do anticorpo ou da composição para o tratamento de uma doença, como o câncer. Em particular, o anticorpo anti-OX40 da presente invenção não interfere com a ligação do ligante OX40 ao seu receptor.

Description

“ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO E REAGENTE DE DIAGNÓSTICO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] São divulgados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à OX40 humana, uma composição que compreende o referido anticorpo, bem como métodos de uso para o tratamento de câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A OX40 (também conhecida como ACT35, CD134, ou TNFRSF4) é uma glicoproteína transmembranar do tipo I de aproximadamente 50 KD, e um membro da super-família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFRSF) (Croft, 2010; Gough e Weinberg, 2009). A OX40 humana madura é composta por 249 resíduos de aminoácidos (AA), com uma cauda citoplasmática de 37 AA e uma região extracelular de 185 AA. O domínio extracelular da OX40 contém três domínios completos e um incompleto rico em cisteína (CRDs). O domínio intracelular de OX40 contém um motivo QEE relacionado à sinalização conservado, que medeia a ligação a vários fatores associados a TNFR (TRAF), incluindo TRAF2, TRAF3 e TRAF5, permitindo que a OX40 se ligue a quinases intracelulares (Arch e Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017).

[003] A OX40 foi inicialmente descoberta em células T CD4+ de rato ativadas, e homólogos murinos e humanos foram subsequentemente clonados a partir de células T (al-Shamkhani et al., 1996; Calderhead et al., 1993). Além da expressão em células T CD4+ ativadas, incluindo células T auxiliares (Th) 1, células Th2, células Th17, bem como células T regulatórias (Treg), a expressão de OX40 também foi encontrada na superfície de células T CD8+ ativadas, células T natural killer (NK), neutrófilos e células NK (Croft, 2010).

Em contraste, a baixa expressão de OX40 é encontrada em células T CD4+ e CD8+ naïve, bem como na maioria das células T de memória em repouso (Croft, 2010; Soroosh et al., 2007). A expressão superficial de OX40 nas células T naïve é transitória. Após a ativação do TCR, a expressão de OX40 nas células T aumenta muito em 24 horas e com picos em 2 ~ 3 dias, persistindo por 5 ~ 6 dias (Gramaglia et al., 1998).

[004] O ligante para OX40 (OX40L, também conhecido como gp34, CD252 ou TNFSF4) é o único ligante para OX40. Semelhante a outros membros do TNFSF (superfamília do fator de necrose tumoral), OX40L é uma glicoproteína do tipo II, que contém 183 AA com um domínio intracelular de 23 AA e um domínio extracelular de 133 AA (Croft, 2010; Gough e Weinberg, 2009).

OX40L forma naturalmente um complexo de trímero homomérico na superfície da célula. O trímero de ligante interage com três cópias de OX40 na interface monômero-monômero do ligante principalmente através das regiões CRD1, CRD2 e CRD3 parcial do receptor, mas sem o envolvimento de CRD4 (Compaan e Hymowitz, 2006). A OX40L é expressa principalmente em células apresentadoras de antígenos ativados (APC), incluindo células B ativadas (Stuber et al., 1995), células dendríticas convencionais maduras (DCs) (Ohshima et al., 1997), DCs plasmocitoides (pDCs) (Ito et al., 2004), macrófagos (Weinberg et al., 1999) e células de Langerhans (Sato et al., 2002). Além disso, a OX40L foi encontrada como sendo expressa em outros tipos de células, como células NK, mastócitos, subconjuntos de células T ativadas, bem como células endoteliais vasculares e células musculares lisas (Croft, 2010; Croft et al., 2009).

[005] A trimerização de OX40 via ligação por OX40L trimérica ou dimerização por anticorpos agonísticos contribuem para o recrutamento e acoplamento de moléculas adaptadoras TRAF2, TRAF3 e/ ou TRAF5 ao seu motivo QEE intracelular (Arch e Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017). O recrutamento e acoplamento de TRAF2 e TRAF 3 podem ainda levar à ativação de ambas as vias canônicas NF-κB1 e NF-κB2 não canônicas, que desempenham papéis importantes na regulação da sobrevivência, diferenciação, expansão, produção de citocinas e funções efetoras das células T (Croft, 2010; Gramaglia et al., 1998; Huddleston et al., 2006; Rogers et al., 2001; Ruby e Weinberg, 2009; Song et al., 2005a; Song et al., 2005b; Song et al., 2008).

[006] Em tecidos normais, a expressão de OX40 é baixa e ocorre principalmente em linfócitos de órgãos linfóides (Durkop et al., 1995). No entanto, a suprarregulação da expressão de OX40 em células do sistema imunológico tem sido frequentemente observada em modelos animais e pacientes humanos com condições patológicas (Redmond e Weinberg, 2007), como doenças autoimunes (Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Szypowska et al., 2014) e cânceres (Kjaergaard et al., 2.000; Vetto et al., 1997; Weinberg et al., 2000). Notavelmente, o aumento da expressão de OX40 está associado a uma sobrevida mais longa em pacientes com câncer colorretal e melanoma cutâneo e se correlaciona inversamente com a ocorrência de metástases à distância e características tumorais mais avançadas (Ladanyi et al., 2004; Petty et al., 2002; Sarff et al., 2008). Também foi demonstrado que o tratamento com anticorpo anti-OX40 pode induzir eficácia antitumoral em vários modelos de camundongos (Aspeslagh et al., 2016), indicando o potencial de OX40 como um alvo imunoterapêutico. No primeiro ensaio clínico em doentes com câncer, conduzida por Curti et al., evidência de eficácia anti-tumoral e a ativação de células T específicas de tumor foi observada com um anticorpo monoclonal anti-OX40 agonístico, indicando que anticorpos OX40 têm utilidade no impulsionamento de respostas de células T antitumorais (Curti et al., 2013).

[007] O mecanismo de ação de anticorpos anti-OX40 agonísticos na mediação da eficácia anti-tumoral tem sido estudada principalmente em modelos de tumor de camundongo (Weinberg et al., 2000). Até recentemente, o mecanismo de ação dos anticorpos anti-OX40 agonísticos em tumores era atribuído à sua capacidade de desencadear uma via de sinalização coestimuladora em células T efetoras, bem como aos efeitos inibitórios na diferenciação e funções das células Treg (Aspeslagh et al., 2016; Ito et al., 2006; St Rose et al., 2013; Voo et al., 2013). Estudos recentes revelaram que em ambos os modelos de tumores animais e pacientes com câncer, Tregs que se infiltram no tumor expressam níveis mais elevados de OX40 do que as células T efetoras (tanto CD4+ e CD8+) e Tregs periférica (Lai et al, 2016.; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016). Portanto, os efeitos secundários pelos quais os anticorpos anti-OX40 desencadeiam respostas antitumorais dependem de suas funções efetoras mediadas por Fc na depleção de células Treg OX40+ intratumorais por meio de citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC) e/ ou fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) (Aspeslagh et al., 2016; Bulliard et al., 2014; Marabelle et al., 2013a; Marabelle et al., 2013b; Smyth et al., 2014). Este trabalho demonstra que o anticorpos anti-OX40 agonísticos com a função efetora mediada por Fc poderia preferencialmente esgotar Tregs intra-tumorais e melhorar as proporções de células T efetoras CD8+ para Tregs no microambiente tumoral (TME), resultando na melhoria das respostas imunes anti-tumorais, aumento da regressão do tumor e melhora da sobrevida (Bulliard et al., 2014; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b). Com base nestes resultados, existe uma necessidade médica não satisfeita de desenvolver anticorpos anti-OX40 agonísticos com ambas as atividades agonísticas e as funções efetoras mediadas por Fc.

[008] Até à data os anticorpos anti-OX40 agonísticos na clínica são na sua maioria anticorpos ligante-competitivos que bloqueiam a interação de OX40-OX40L (por exemplo, WO 2016/196228 A1). Uma vez que a interação OX40-OX40L é essencial para aumentar a imunidade antitumoral eficaz, o bloqueio de OX40-OX40L restringe a eficácia desses anticorpos ligante- competitivos. Portanto, os anticorpos agonistas de OX40 que se ligam especificamente a OX40, embora não interfiram com o OX40 interagindo com OX40L, têm utilidade no tratamento de câncer e distúrbios autoimunes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] A presente divulgação é dirigida a anticorpos anti-OX40 agonísticos e fragmentos de ligação ao antígeno da mesma que ativa OX40 e induz a sinalização em células imunes, assim, promovendo assim, a imunidade anti-tumoral.

[0010] Em uma forma de realização, a divulgação fornece anticorpos monoclonais que se ligam a OX40 humana ou fragmentos de ligação ao antígeno da mesma. Em um aspecto, o anticorpo da presente divulgação não compete com OX40L, ou interfere na ligação de OX40 ao seu ligante OX40L.

[0011] A presente divulgação abrange as seguintes formas de realização.

[0012] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à OX40 humana e compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR (Região Determinante da Complementaridade de Cadeia Pesada) 1 da SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 24, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR (Região Determinante da Complementaridade de Cadeia Leve) 1 de SEQ ID NO: 25, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 19, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 18, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO: 6, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 19, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8; (iii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de

SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 13, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO: 6, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 7, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 4, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO: 6, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 7, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8.

[0013] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 28; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 22; (iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 11.

[0014] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 26, 28, 20, 22, 14, 16, 9, e/ ou 11 foram inseridos, excluídos ou substituídos.

[0015] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 28; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 22; (iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 16; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 11.

[0016] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que é um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano modificado por engenharia genérica, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento Fab, um fragmento Fab’ ou um fragmento F(ab’)2.

[0017] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que possui atividade agonista de OX40.

[0018] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga à OX40 humana em um epítopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em H153 a D170 de OX40 humana.

[0019] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga à OX40 humana em um epítopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em H153, T154, I165, E167 e D170 de OX40 humana.

[0020] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a OX40 humana em um epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em H153, I165 e E167 de OX40 humana. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a OX40 humana em um epítopo compreendendo um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em H153, I165 e E167 de OX40 humana.

[0021] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga à OX40 humana em ou dentro da SEQ ID NO: 30.

[0022] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga à OX40 humana em uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) igual ou superior a 7,28 nM, 9,47 nM, 13,5 nM ou 17,1 nM, conforme medido pela ressonância de plasmon de superfície (SPR).

[0023] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0024] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem glicosilação reduzida ou nenhuma glicosilação ou está hipofucosilado.

[0025] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende estruturas GlcNac bissectantes aumentadas.

[0026] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o domínio Fc é de uma IgG1.

[0027] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o domínio Fc é de uma IgG4.

[0028] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o

IgG4 tem uma substituição S228P (de acordo com o sistema de numeração EU).

[0029] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o IgG4 tem substituições S228P e R409K (de acordo com o sistema de numeração da UE).

[0030] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que tem uma ou mais das seguintes propriedades: (i) é capaz de reagir de forma cruzada com cyno OX40; (ii) não interfere na interação OX40-OX40L; (iii) é capaz de estimular uma das células T, particularmente em uma EC50 igual ou superior a 0,06 ng/ ml; (iv) é capaz de ativar células T CD4+, particularmente, conforme medido em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR); (v) é capaz de mediar ADCC, particularmente conforme medido em um ensaio ADCC baseado na liberação de lactato desidrogenase (LDH); (vi) é capaz de esgotar Tregs CD4+; (vii) é capaz de aumentar a razão Teff CD8+/ Treg; ou (viii) é capaz de mediar a regressão parcial do tumor em um modelo de tumor animal.

[0031] Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0032] Um método de tratamento de câncer, compreendendo a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0033] O método em que o câncer inclui, mas não se limita a, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer de pele, mesotelioma, linfoma,

leucemia, mieloma, sarcoma e etc.

[0034] O método em que o anticorpo ou a composição farmacêutica é administrado em combinação com outro agente terapêutico.

[0035] O método em que o agente terapêutico é paclitaxel ou um agente de paclitaxel, docetaxel, carboplatina, topotecano, cisplatina, irinotecano, doxorrubicina, lenalidomida, 5-azacitidina.

[0036] O método em que o agente terapêutico é um agente paclitaxel, lenalidomida ou 5-azacitidina.

[0037] Um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0038] Um vetor que compreende o ácido nucleico.

[0039] Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico.

[0040] Um processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende cultivar a célula hospedeira e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a partir da cultura.

[0041] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso no tratamento ou redução da probabilidade de: câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer de pele, mesotelioma, linfoma, leucemia, mieloma e sarcoma.

[0042] Um reagente de diagnóstico compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é marcado.

[0043] O reagente de diagnóstico em que o marcador é selecionado a partir do grupo que consiste em um radiomarcador, um fluoróforo, um cromóforo, um agente de imagem e um íon metálico.

[0044] Em uma forma de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de um grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO:

25.

[0045] Em outra forma de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (HCDRs) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 5; e/ ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (LCDRs) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 8.

[0046] Em outra forma de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (HCDRs) que são HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 24; e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e/ ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (LCDRs) que são LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 25; LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 19; e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0047] Em uma outra forma de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo três regiões de determinação de complementaridade (HCDRs) que são HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; ou HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; ou HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; ou HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e/ ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (LCDRs) que são LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0048] Em outra forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

4, e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0049] Em uma forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0050] Em outra forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0051] Em outra forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0052] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente divulgação ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 26, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 26; e/ ou (b) uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 28.

[0053] Em outra forma de realização, o anticorpo da presente divulgação ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 26, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas ou três substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 26; e/ ou (b) uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições de aminoácidos no aminoácido de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 28. Em outra forma de realização, as substituições de aminoácidos são substituições de aminoácidos conservativas.

[0054] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente divulgação ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; ou (b) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (c) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou (d) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

[0055] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente divulgação é do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em uma forma de realização mais específica, o anticorpo da presente divulgação compreende o domínio Fc de IgG1 humana de tipo selvagem (também referida como IgG1wt ou huIgG1 humana) ou IgG2. Em outra forma de realização, o anticorpo da presente divulgação compreende um domínio Fc da IgG4 humana com substituições S228P e/ ou R409K (de acordo com o sistema de numeração EU).

[0056] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente divulgação se liga a OX40 com uma afinidade de ligação (KD) de 1 x 10-6 M a 1 x 10-10 M. Em outra forma de realização, o anticorpo da presente divulgação se liga a OX40 com uma afinidade de ligação (KD) de cerca de 1 x 10-6 M, cerca de 1 x 10-7 M, cerca de 1 x 10-8 M, cerca de 1 x 10-9 M ou cerca de 1 x 10-10 M.

[0057] Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-OX40 humana da presente invenção mostra uma atividade de ligação entre espécies para OX40 de cinomolgus.

[0058] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-OX40 da presente divulgação se liga a um epítopo de OX40 humana fora da interface de interação OX40-OX40L. Em outra forma de realização, o anticorpo anti-OX40 da presente divulgação não compete com a ligação do ligante OX40 à OX40. Em ainda outra forma de realização, o anticorpo anti-OX40 da presente divulgação não bloqueia a interação entre OX40 e seu ligante OX40L.

[0059] Os anticorpos da presente divulgação são agonísticos e aumentam significativamente a resposta imune. A invenção fornece um método para testar a capacidade agonística de anticorpos anti-OX40. Em uma forma de realização, o anticorpo da presente divulgação podem estimular significativamente células T primárias para produzir IL-2 em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR).

[0060] Em uma forma de realização, os anticorpos da presente divulgação têm fortes funções efetoras mediadas por Fc. Os anticorpos medeiam a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células-alvo OX40Hi, como células T reguladoras (células Treg) por células NK. Em um aspecto, a divulgação fornece um método de avaliação da depleção in vitro mediada por anticorpo anti-OX40 de subconjuntos de células T específicos com base em diferentes níveis de expressão de OX40.

[0061] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente divulgação não bloqueiam a interação OX40-OX40L. Além disso, os anticorpos anti-OX40 exibem atividade anti-tumoral dependente da dose in vivo, como mostrado em animais modelos. A atividade dependente da dose é diferenciada do perfil de atividade dos anticorpos anti-OX40 que bloqueiam a interação OX40-OX40L.

[0062] A presente divulgação refere-se a ácidos nucleicos isolados que compreendem sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno. Em uma forma de realização, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de nucleotídeos VH de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 27 ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 27, e codifica a região VH do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação. Alternativamente ou adicionalmente, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de nucleotídeos VL de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 29 ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 29 e codifica a região VL do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação.

[0063] Em outro aspecto, a presente divulgação se refere a uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0064] Em ainda outro aspecto, a presente divulgação se refere a um método de tratamento de uma doença em um sujeito, que compreende a administração do anticorpo OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica do anticorpo OX40 em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um sujeito em necessidade. Em outra forma de realização, a doença a ser tratada pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é câncer ou uma doença autoimune.

[0065] A presente divulgação diz respeito ao uso do anticorpo ou ao fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica do anticorpo OX40 para o tratamento de uma doença, tal como câncer ou doenças autoimunes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0066] A Figura 1 é um diagrama esquemático de construções OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 e OX40-His. OX40 ECD: domínio extracelular de OX40. N: N-terminal. C: C-terminal.

[0067] A Figura 2 mostra as uma determinação de afinidade de anticorpos anti-OX40 purificado quimérico (ch445) e humanizado (445-1, 445-2, 445-3 e 445-3 IgG4) por ressonância de plasmon de superfície (SPR).

[0068] A Figura 3 demonstra a determinação de ligação de OX40 por citometria de fluxo. Células Hut78/ OX40 OX40 positivas foram incubadas com vários anticorpos anti-OX40 (anticorpos ch445, 445-1, 445-2, 445-3 e 445- 3 IgG4) e submetidos a análise de FACS. O resultado é mostrado pela intensidade média de fluorescência (MFI, eixo Y).

[0069] A Figura 4 mostra a ligação de anticorpos OX40 por citometria de fluxo. As células Hut78/ OX40 e Hut78/ cynoOX40 foram coradas com anticorpo 445-3 e intensidade média de fluorescência (MFI, mostrada no eixo Y) foi determinada por citometria de fluxo.

[0070] A Figura 5 representa a determinação de afinidade de um 445-3 Fab contra OX40 tipo selvagem e mutantes pontuais por ressonância de plasmon de superfície (SPR).

[0071] A Figura 6 mostra as interações detalhadas entre o anticorpo 445-3 e seus epítopos em OX40. O anticorpo 445-3 e OX40 são representados em cinza claro e preto, respectivamente. As ligações de hidrogênio ou ponte de sal, empilhamento pi-pi e interação de Van der Waals (VDW) são indicados com linhas tracejadas, duplas e contínuas, respectivamente.

[0072] A Figura 7 demonstra que o anticorpo 445-3 não interfere com a ligação de OX40L. Antes da coloração das células HEK293/ OX40L, a proteína de fusão OX40-IgG2a de camundongo (OX40-mIgG2a) foi pré-

incubada com IgG humana (+HuIgG), anticorpo 445-3 (+445-3) ou anticorpo 1A7.gr1 (+1A7.gr1, ver US 2015/0307617), a uma razão molar de 1: 1. A ligação de OX40L ao complexo OX40-mIgG2a/ anticorpo anti-OX40 foi determinada por co-incubação de células HEK293/ OX40L e complexo OX40-mIgG2a/ anticorpo anti-OX40 seguido por reação com Ab secundário anti-IgG de camundongo e citometria de fluxo. Os resultados foram apresentados em média ± DP de duplicatas. Significância estatística: *: P < 0,05; **: P < 0,01.

[0073] A Figura 8 mostra o alinhamento estrutural do Fab OX40/ 445-3 com o complexo OX40/ OX40L relatado (código PDB: 2HEV). A OX40L é mostrada em branco, 445-3 Fab, mostrado em cinza e OX40 é mostrada em preto.

[0074] As Figuras 9A-B mostram que um anticorpo anti-OX40 445- 3 induz a produção de IL-2 em conjunto com a estimulação por TCR. células Hut78/ OX40 OX40 positivas (Figura 9A) foram co-cultivadas com uma célula apresentadora de antígeno artificial (APC) linhagem (HEK293/ OS8Baixa-FcγRI) na presença de anticorpos anti-OX40 durante a noite e produção de IL-2 foi usada como leitura para a estimulação de células T (Figura 9B). IL-2 no sobrenadante da cultura foi detectada por ELISA. Os resultados são apresentados em média ± DP de triplicatas.

[0075] A Figura 10 indica que anticorpos anti-OX40 aumentam as respostas de MLR. As células dendríticas (DC) diferenciadas in vitro foram co- cultivadas com células T CD4+ alogênicas na presença de anticorpos anti-OX40 (0,1-10 μg/ ml) durante 2 dias. IL-2 no sobrenadante foi detectado por ELISA.

Todos os testes foram realizados em quadruplicatas e os resultados apresentados como média ± DP. Significância estatística: *: P < 0,05; **: P < 0,01.

[0076] A Figura 11 demonstra que um anticorpo anti-OX40 445-3 induz ADCC. O ensaio de ADCC foi realizado utilizando células NK92MI/ CD16V como as células efetoras e células Hut78/ OX40 como as células alvo na presença de anticorpos anti-OX40 (0,004- 3 μg/ ml) ou controles. Números iguais de células efetoras e células alvo foram co-cultivadas por 5 horas antes de detectar a liberação de lactato desidrogenase (LDH). A porcentagem de citotoxicidade (eixo Y) foi calculada com base no protocolo do fabricante, conforme descrito no Exemplo 12. Os resultados são apresentados em média ± DP de triplicatas.

[0077] As Figuras 12A-12C mostram que o anticorpo anti-OX40 445-3 em combinação com células NK aumenta as razões de células T efetoras CD8+ para Tregs em PBMCs ativados in vitro. PBMCs humanas foram pré- ativadas por PHA-L (1 μg/ ml) e, em seguida co-cultivadas com células NK92MI/ CD16V na presença de anticorpos anti-OX40 ou controle. As percentagens de diferentes subconjuntos de células T foram determinadas por citometria de fluxo.

As razões de células T efetoras CD8+ para Tregs foram calculadas posteriormente. A Figura 12A mostra a razão de células T CD8+/ Total. A Figura 12B é a razão Treg/ célula T total. A Figura 12C mostra a razão CD8+/ Treg. Os dados são apresentados como média ± DP de duplicatas. As significâncias estatísticss entre 445-3 e 1A7.gr1 nas concentrações indicadas são mostrados.

*: P < 0,05; **: P < 0,01.

[0078] As Figuras 13A-13B mostram que o anticorpo anti-OX40 445-3, mas não 1A7.gr1, revela a atividade antitumoral dependente da dose no modelo singênico de câncer colorretal MC38 em camundongos humanizados OX40. Células de carcinoma do cólon murino MC38 (2 x 107) foram implantadas subcutaneamente em camundongos transgênicos para OX40 humanas fêmeas.

Após a aleatorização de acordo com o volume do tumor, os animais foram injetados via intraperitoneal com anticorpos anti-OX40 ou isotipo controle, uma vez por semana durante três vezes, conforme indicado. A Figura 13A compara doses crescentes do anticorpo 445-3 com doses crescentes de anticorpo

1A7.gr1 e a redução do crescimento do tumor. A Figura 13B apresenta dados para todos os camundongos tratados com aquela dose específica. Os dados são apresentados como volume médio do tumor ± erro padrão da média (SEM) com 6 camundongos por grupo. Significância estatística: *: P < 0,05 vs controle de isotipo.

[0079] As Figuras 14A-14B são uma tabela de alterações de aminoácidos que foram feitas nos anticorpos OX40.

DEFINIÇÕES

[0080] A menos que especificamente definido em outro lugar neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente entendido por um técnico no assunto.

[0081] Tal como aqui utilizado, incluindo nas reivindicações em anexo, as formas singulares de palavras tais como “um”, “uma” e “o/ a” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite outra forma correspondente.

[0082] O termo “ou” é usado para significar e é usado indistintamente com o termo “e/ ou”, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0083] O termo “agente anticâncer”, tal como aqui utilizado, refere- se a qualquer agente que pode ser usado para tratar um distúrbio proliferativo celular, como câncer, incluindo, mas não se limitando a, agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes de direcionamento anticâncer e agentes imunoterapêuticos.

[0084] O termo “OX40” refere-se a uma glicoproteína transmembranar tipo I de aproximadamente 50 KD, um membro da superfamília de receptores de fator de necrose tumoral. A OX40 também é conhecida como ACT35, CD134 ou TNFRSF4. A sequência de aminoácidos de OX40 humana, (SEQ ID NO: 1) também pode ser encontrada no número de acesso NP_003318 e a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína OX40 tem um número de acesso: X75962.1. O termo “ligante OX40” ou “OX40L” refere-se ao único ligante de OX40 e é intercambiável com gp34, CD252 ou TNFSF4.

[0085] Os termos “administração”, “administrar”, “tratar” e “tratamento” aqui, quando aplicados a um animal, humano, sujeito experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, significam o contato de um produto farmacêutico exógeno, terapêutico, agente de diagnóstico ou composição com o animal, humano, sujeito, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. O tratamento de uma célula envolve o contato de um reagente com a célula, bem como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. O termo “administração” e “tratamento” também significa tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composto de ligação ou por outra célula. O termo “sujeito” aqui inclui qualquer organismo, preferencialmente um animal, mais preferencialmente um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, cão, gato, coelho) e mais preferencialmente um humano. O tratamento de qualquer doença ou distúrbio refere-se, em um aspecto, a melhorar a doença ou distúrbio (isto é, retardar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos). Em outro aspecto, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” refere-se a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo paciente. Em ainda outro aspecto, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” refere-se a modular a doença ou distúrbio, tanto fisicamente, (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente, (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. Em ainda outro aspecto, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” refere-se à prevenção ou retardamento do início ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio.

[0086] O termo “sujeito” no contexto da presente divulgação é um mamífero, por exemplo, um primata, de preferência um primata superior, por exemplo, um humano (por exemplo, um paciente com, ou em risco de ter, um distúrbio aqui descrito).

[0087] O termo “afinidade”, tal como aqui utilizado, refere-se à força de interação entre o anticorpo e o antígeno. Dentro do antígeno, a região variável do “braço” do anticorpo interage por meio de forças não covalentes com o antígeno em vários locais; quanto mais interações, mais forte é a afinidade.

[0088] O termo “anticorpo”, tal como aqui utilizado, refere-se a um polipeptídeo da família das imunoglobulinas que pode se ligar a um antígeno correspondente não covalentemente, reversivelmente e de uma maneira específica. Por exemplo, um anticorpo IgG de ocorrência natural é um tetrâmero compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs organizadas do terminal amino ao terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico.

[0089] O termo “anticorpo” inclui, mas não está limitado a, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id). Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo/ classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).

[0090] Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-OX40 compreendem pelo menos um local de ligação ao antígeno, ou, pelo menos, uma região variável. Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-OX40 compreendem uma fragmento de ligação ao antígeno a partir de um anticorpo OX40 aqui descrito. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-OX40 é isolado ou recombinante.

[0091] O termo “anticorpo monoclonal” ou “mAb” ou “Mab” aqui significa uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, as moléculas de anticorpo compreendidas na população são idênticas na sequência de aminoácidos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menores quantidades. Em contraste, as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) incluem tipicamente uma infinidade de diferentes anticorpos com diferentes sequências de aminoácidos em seus domínios variáveis, particularmente suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que são frequentemente específicas para diferentes epítopos. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser obtidos por métodos conhecidos dos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Kohler et al., Nature 1975 256: 495-497; Patente US No. 4,376,110; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992;

Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988; e Colligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY

1993. Os anticorpos aqui divulgados podem ser de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e qualquer subclasse dos mesmos, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Títulos elevados de anticorpos monoclonais podem ser obtidos na produção in vivo, onde células dos hibridomas individuais são injetadas intraperitonealmente em camundongos, tais como camundongos Balb/c primários para produzir fluido de ascite contendo altas concentrações dos anticorpos desejados. Os anticorpos monoclonais de isotipo IgM ou IgG podem ser purificados a partir de tais fluidos de ascite, ou a partir de sobrenadantes de cultura, usando métodos de cromatografia em coluna bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0092] Em geral, a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma “cadeia leve” (cerca de 25 kDa) e uma “cadeia pesada” (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsável pelo reconhecimento do antígeno. A porção carboxi- terminal da cadeia pesada pode definir uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Normalmente, as cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. Além disso, as cadeias pesadas humanas são normalmente classificadas como α, δ, ε, γ ou μ e definem os isotipos do anticorpo como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região “D” de cerca de 10 mais aminoácidos.

[0093] As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/ pesada

(VL/ VH) formam o local de ligação do anticorpo. Assim, em geral, um anticorpo intacto possui dois locais de ligação. Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois locais de ligação são, em geral, os mesmos.

[0094] Normalmente, os domínios variáveis de ambas as cadeias pesada e leve compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas de “regiões determinantes de complementaridade (CDRs)”, que estão localizadas entre regiões de estrutura relativamente conservadas (FR). As CDRs são geralmente alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo a ligação a um epítopo específico. Em geral, do N-terminal ao C-terminal, os domínios variáveis da cadeia leve e pesada compreendem FR-1 (ou FR1), CDR-1 (ou CDR1), FR- 2 (FR2), CDR-2 (CDR2), FR-3 (ou FR3), CDR-3 (CDR3) e FR-4 (ou FR4). As posições das CDRs e regiões estruturais podem ser determinadas usando várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia e AbM (ver, por exemplo, Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29: 205-206 (2001); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227: 799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J. Mol.

Biol., 273: 927-748 (1997)). As definições de locais de combinação de antígeno também são descritas a seguir: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28: 219-221 (2000); e Lefranc, MP, Nucleic Acids Res., 29: 207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203: 121-153 (1991); e Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996). Em um esquema de numeração combinado de Kabat e Chothia, em algumas formas de realização, as CDRs correspondem aos resíduos de aminoácidos que fazem parte de um CDR de Kabat, um CDR de Chothia ou ambos. Por exemplo, as CDRs correspondem aos resíduos de aminoácidos 26-35 (HC CDR1), 50-65 (HC CDR2) e 95-102 (HC CDR3) em uma VH, por exemplo, uma VH de mamífero, por exemplo, uma VH humana; e resíduos de aminoácidos 24-34 (LC CDR1), 50-56 (LC CDR2) e 89-97 (LC CDR3) em uma VL, por exemplo, uma VL de mamífero, por exemplo, uma VL humana.

[0095] O termo “região hipervariável” significa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de um “CDR” (ou seja, VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 no domínio variável da cadeia leve e VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 no domínio variável da cadeia pesada) Ver, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (definindo as regiões CDR de um anticorpo por sequência); ver também Chothia e Lesk (1987) J. Mol.

Biol. 196: 901-917 (definindo as regiões CDR de um anticorpo por estrutura). O termo resíduos de “estrutura” ou “FR” significa aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável aqui definidos como resíduos de CDR.

[0096] Salvo indicado de outra forma, um “fragmento de ligação ao antígeno” significa fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, ou seja, fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno ligado pelo anticorpo de comprimento total, por exemplo, fragmentos que retêm uma ou mais regiões CDR. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem, mas não se limitam a fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples, por exemplo, Fv de cadeia simples (ScFv); nanocorpos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0097] Um anticorpo “especificamente se liga” a uma proteína alvo, quer dizer que o anticorpo exibe ligação preferencial àquele alvo, em comparação com outras proteínas, mas esta especificidade não requer especificidade de ligação absoluta. Um anticorpo é considerado “específico” para o alvo pretendido se sua ligação for determinante da presença da proteína alvo em uma amostra, por exemplo, sem produzir resultados indesejados, como falsos positivos. Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, úteis na divulgação atual, se ligarão à proteína alvo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, de preferência pelo menos 10 vezes maior, mais preferencialmente pelo menos 20 vezes maior, e mais preferencialmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com proteínas não-alvo. Diz-se que um anticorpo aqui se liga especificamente a um polipeptídeo compreendendo uma dada sequência de aminoácidos, por exemplo, a sequência de aminoácidos de uma molécula OX40 humana, se se ligar a polipeptídeos que compreendem essa sequência, mas não se ligar a proteínas sem essa sequência.

[0098] O termo “anticorpo humano” aqui significa um anticorpo que compreende apenas sequências de proteínas de imunoglobulina humana. Um anticorpo humano pode conter cadeias de carboidratos murinos se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Da mesma forma, “anticorpo de camundongo” ou “anticorpo de rato” significa um anticorpo que compreende apenas sequências de proteína de imunoglobulina de camundongo ou de rato, respectivamente.

[0099] O termo “anticorpo humanizado” significa formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos), bem como anticorpos humanos. Esses anticorpos contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. O prefixo “hum”, “hu”, “Hu” ou “h” é adicionado às designações de clones de anticorpo quando necessário para distinguir anticorpos humanizados de anticorpos parentais de roedores. As formas humanizadas de anticorpos de roedor geralmente compreenderão as mesmas sequências de CDR dos anticorpos parentais de roedor, embora certas substituições de aminoácidos possam ser incluídas para aumentar a afinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado, remover uma modificação pós-tradução ou por outras razões.

[00100] O termo “sequência de linhagem germinal humana correspondente” refere-se à sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de região variável humana ou subsequência que compartilha a identidade de sequência de aminoácidos determinada mais alta com uma sequência de aminoácidos de região variável de referência ou subsequência em comparação com todas as outras sequências de aminoácidos de região variável conhecidas codificadas por sequências de região variável de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. A sequência da linhagem germinativa humana correspondente também pode se referir à sequência de aminoácidos de região variável humana ou subsequência com a identidade de sequência de aminoácidos mais alta com uma sequência de aminoácidos de região variável de referência ou subsequência em comparação com todas as outras sequências de aminoácidos de região variável avaliadas. A sequência da linhagem germinativa humana correspondente pode ser apenas regiões estruturais, regiões determinantes de complementaridade apenas, regiões estruturais e determinantes complementares, um segmento variável (conforme definido acima) ou outras combinações de sequências ou subsequências que compreendem uma região variável. A identidade de sequência pode ser determinada usando os métodos descritos neste documento, por exemplo,

alinhando duas sequências usando BLAST, ALIGN ou outro algoritmo de alinhamento conhecido na técnica. O ácido nucleico da linhagem germinativa humana correspondente ou sequência de aminoácidos pode ter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com o ácido nucleico de região variável de referência ou a sequência de aminoácidos.

[00101] O termo “constante de dissociação de equilíbrio (KD, M)” refere-se à constante de taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividida pela constante de taxa de associação (ka, tempo-1, M-1). As constantes de dissociação de equilíbrio podem ser medidas usando qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos da presente divulgação geralmente terão uma constante de dissociação de equilíbrio inferior a cerca de 10-7 ou 10-8 M, por exemplo, inferior a cerca de 10-9 M ou 10-10 M, em alguns aspectos, inferior a cerca de 10-11 M, 10-12 M ou 10-13 M.

[00102] Os termos “câncer” ou “tumor” neste documento têm o significado mais amplo conforme entendido na técnica e se referem à condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. No contexto da presente divulgação, o câncer não está limitado a determinado tipo ou localização.

[00103] O termo “terapia de combinação” refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma condição ou distúrbio terapêutico descrito na presente divulgação. Tal administração abrange a co-administração desses agentes terapêuticos de uma maneira substancialmente simultânea. Tal administração também engloba a co- administração em múltiplos, ou em recipientes separados (por exemplo, cápsulas, pós, líquidos e) para cada ingrediente ativo. Pós e/ ou líquidos podem ser reconstituídos ou diluídos para uma dose desejada antes da administração.

Além disso, tal administração também abrange o uso de cada tipo de agente terapêutico de maneira sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Em qualquer dos casos, o regime de tratamento proporcionará efeitos benéficos da combinação de drogas no tratamento das condições ou distúrbios aqui descritos.

[00104] No contexto da presente divulgação, quando é feita referência a uma sequência de aminoácidos, o termo “substituição conservativa” significa a substituição do aminoácido original por um novo aminoácido que não altera substancialmente as propriedades químicas, físicas e/ ou funcionais do anticorpo ou fragmento, por exemplo, sua afinidade de ligação para OX40.

Especificamente, subestações conservativas comuns de aminoácidos são mostradas na tabela a seguir e são bem conhecidas na técnica.

Substituições de Aminoácidos Conservativas Exemplificativas Resíduo de Códigos de uma e três letras Substituição Conservativa aminoácido original Alanina A ou Ala Gly; Ser Arginina R ou Arg Lys; His Asparagina N ou Asn Gln; His Ácido aspártico D ou Asp Gln; Asn Cisteína C ou Cys Ser; Ala Glutamina Q ou Gln Asn Ácido glutâmico E ou Glu Asp; Gln Glicina G ou Gly Ala Histidina H ou His Asn; Gln Isoleucina I ou Ile Leu; Val Leucina L ou Leu Ile; val Lisina K ou Lys Arg; His Metionina M ou Met Leu; Ile; Tyr Fenilalanina F ou Phe Tyr; Met; Leu Prolina P ou Pro Ala Serina S ou Ser Thr Treonina T ou Thr Ser

Resíduo de Códigos de uma e três letras Substituição Conservativa aminoácido original Triptofano W ou Trp Tyr; Phe Tirosina Y ou Tyr Trp; Phe Valine V ou Val Ile; Leu

[00105] Exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequências são os algoritmos BLAST, que está descrito em Altschul et al, Nuc.

Acids Res. 25: 3389-3402,1977; e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequência de alta pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que combinam ou satisfazem alguma pontuação de limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra da vizinhança. Esses acertos iniciais de palavras vizinhas atuam como valores para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos que as contenham. Os acertos de palavras são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência, na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. Pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos incompatíveis; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos da palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou o final de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLAST usa como padrão um comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas.

[00106] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787, 1993). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor que cerca de 0,2, mais preferencialmente menor que cerca de 0,01, e mais preferencialmente menor que cerca de 0,001.

[00107] A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, (1988), que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos podem ser determinadas usando Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444-

453, (1970), algoritmo que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG usando uma matriz BLOSUM62 ou uma matriz PAM250 e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[00108] O termo “ácido nucleico” é aqui utilizado indistintamente com o termo “polinucleotídeo” e refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros na forma de cadeia simples ou dupla. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos de estrutura modificados ou ligações, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e que são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de referência.

Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2-O-metil ribonucleotídeos, peptídeo-ácidos nucleicos (PNAs).

[00109] O termo “operacionalmente ligado” no contexto de ácidos nucleicos refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeo (por exemplo, DNA). Normalmente, refere-se à relação funcional de uma sequência reguladora da transcrição para uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor ou sequência intensificadora está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, as sequências regulatórias da transcrição do promotor que estão operacionalmente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, têm ação cis. No entanto, algumas sequências reguladoras da transcrição, como intensificadores, não precisam ser fisicamente contíguas ou localizadas em estreita proximidade com as sequências de codificação cuja transcrição elas aumentam.

[00110] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, que incluem um anticorpo anti-OX40 aqui descrito, formulado juntamente com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Conforme usado neste documento, o termo “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. O excipiente pode ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, retal, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).

[00111] As composições aqui divulgadas podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e de infusão), dispersões ou suspensões, lipossomas e supositórios. Uma forma adequada depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições adequadas típicas estão na forma de soluções injetáveis ou de infusão. Um modo adequado de administração é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Em algumas formas de realização, o anticorpo é administrado por infusão intravenosa ou injeção. Em certas formas de realização, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00112] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, tal como aqui utilizado, refere-se à quantidade de um anticorpo que, quando administrado a um sujeito para o tratamento de uma doença, ou pelo menos um dos sintomas clínicos de uma doença ou distúrbio, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença, distúrbio ou sintoma. A “quantidade terapeuticamente eficaz” pode variar com o anticorpo, a doença, distúrbio e/ ou sintomas da doença ou distúrbio, gravidade da doença, distúrbio e/ ou sintomas da doença ou distúrbio, a idade do sujeito a ser tratado, e/ ou o peso do sujeito a ser tratado.

Uma quantidade apropriada em qualquer caso pode ser evidente para os técnicos no assunto ou pode ser determinada por experiências de rotina. No caso de terapia de combinação, a “quantidade terapeuticamente eficaz” refere- se à quantidade total dos objetos de combinação para o tratamento eficaz de uma doença, distúrbio ou condição.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00113] A presente divulgação fornece anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, que se ligam especificamente à OX40 humana. Além disso, a presente divulgação fornece anticorpos que têm características farmacocinéticas desejáveis e outros atributos desejáveis e, portanto, podem ser usados para reduzir a probabilidade de ou tratar o câncer.

A presente divulgação fornece ainda composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos e métodos de preparação e uso de tais composições farmacêuticas para a prevenção e tratamento de câncer e distúrbios associados.

ANTICORPOS ANTI-OX40

[00114] A presente divulgação fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a OX40. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente divulgação incluem, mas não estão limitados a, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, gerados conforme descrito, abaixo.

[00115] A presente divulgação fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a OX40, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) compreendem um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 20 ou 26 (Tabela 3). A presente divulgação também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a OX40, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma VH CDR tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das VH CDRs listadas na Tabela 3.

Em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que especificamente se ligam a OX40, em que os referidos anticorpos compreendem (ou, em alternativa, consistem em) uma, duas, três, ou mais VH CDR tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das VH CDRs listadas na Tabela 3.

[00116] A presente divulgação fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que especificamente se ligam a OX40, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 22 ou 28 (Tabela 3). A presente divulgação também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a OX40, em que os referidos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma VL CDR tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das VL CDRs listadas na Tabela 3. Em particular, a invenção fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que especificamente se ligam a OX40, os referidos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem (ou, em alternativa, consistem em) uma, duas, três ou mais VL CDR tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das VL CDRs listadas na Tabela 3.

[00117] Outros anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente divulgação incluem aminoácidos que foram mutados, embora tenham pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de percentual de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela 3. Em alguns aspectos, inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões CDR em comparação com as regiões CDR representadas na sequência descrita na Tabela 3.

[00118] Outros anticorpos da presente divulgação incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos foram mutados; ainda tem pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de percentual de identidade com as sequências descritas na Tabela 3.

Em alguns aspectos, inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis em comparação com as regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 3, embora retendo substancialmente a mesma atividade terapêutica.

[00119] A presente divulgação também fornece sequências de ácido nucleico que codificam VH, VL, a cadeia pesada de comprimento total e a cadeia leve de comprimento total dos anticorpos que se ligam especificamente a OX40. Essas sequências de ácido nucleico podem ser otimizadas para expressão em células de mamíferos.

IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS E ANTICORPOS QUE SE LIGAM AO MESMO EPÍTOPO

[00120] A presente divulgação fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a um epítopo de OX40 humana. Em certos aspectos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno podem se ligar ao mesmo epítopo de OX40.

[00121] A presente invenção também fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao mesmo epítopo tal como os anticorpos anti-OX40 descritos na Tabela 3. Anticorpos adicionais e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo podem, portanto, ser identificados com base na sua capacidade de competição cruzada (por exemplo, para inibir competitivamente a ligação de, de uma maneira estatisticamente significativa) com outros anticorpos em ensaios de ligação. A capacidade de um anticorpo de teste em inibir a ligação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente divulgação a OX40 demonstra que o anticorpo de teste pode competir com esse anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo pela ligação a OX40. Assim, um anticorpo pode, sem estar ligado a qualquer teoria, ligar-se ao mesmo ou a um epítopo relacionado (por exemplo, um epítopo estruturalmente semelhante ou espacialmente proximal) em OX40 como o anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo com os quais compete. Em um determinado aspecto, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em OX40 que os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente divulgação é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado. Esses anticorpos monoclonais humanos ou humanizados podem ser preparados e isolados como aqui descrito.

ALTERAÇÃO ADICIONAL DA ESTRUTURA DA REGIÃO FC

[00122] Em ainda outros aspectos, a região Fc é alterada pela substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo parental.

O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em, por exemplo, US Pat. Nos. 5,624,821 e 5,648,260, ambos por Winter et al.

[00123] Em outro aspecto, um ou mais resíduos de ácidos aminados pode ser substituído por um ou mais resíduos de aminoácido diferentes de forma que o anticorpo alterou a ligação a C1q e/ ou reduziu ou aboliu a citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esta abordagem é descrita em, por exemplo, US Pat. No. 6,194,551 de Idusogie et al.

[00124] Em ainda outro aspecto, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para, desse modo, alterar a capacidade do anticorpo de fixar o complemento. Esta abordagem é descrita, por exemplo, na Publicação

PCT WO 94/29351 de Bodmer et al. Em um aspecto específico, um ou mais aminoácidos de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente divulgação são substituídos por um ou mais resíduos de aminoácidos alotípicos, para a subclasse IgG1 e o isotipo kappa. Os resíduos de aminoácidos alotípicos também incluem, mas não estão limitados a, região constante da cadeia pesada das subclasses IgG1, IgG2 e IgG3, bem como a região constante da cadeia leve do isotipo kapa, conforme descrito por Jefferis et al., MAbs. 1: 332-338 (2009).

[00125] Em outro aspecto, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcγ modificando um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, na Publicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, os locais de ligação na IgG1 humana para FcγRI, FcγRII, FcγRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (ver Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, 2001).

[00126] Em ainda outro aspecto, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (ou seja, o anticorpo não tem ou tem glicosilação reduzida). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o “antígeno”. Essas modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais locais de glicosilação na sequência do anticorpo.

Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar a glicosilação nesse local. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tal abordagem é descrita em, por exemplo, US Pat. Nos. 5,714,350 e 6,350,861 por Co et al.

[00127] Adicionalmente, ou alternativamente, pode ser feito um anticorpo que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado com quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo com estruturas de GlcNac bissectantes aumentadas. Foi demonstrado que tais padrões de glicosilação alterados aumentam a capacidade ADCC dos anticorpos. Essas modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser utilizadas como células hospedeiras nas quais expressam anticorpos recombinantes para assim produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 de Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de modo que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exibam hipofucosilação. A publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve uma linhagem celular CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida de anexar fucose a carboidratos ligados a Asn (297), resultando também na hipofucosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (ver também Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740).

A publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al., descreve linhagens celulares projetadas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)), de modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares projetadas exibam estruturas de GlcNac bissectantes aumentadas que resulta em aumento da atividade ADCC os anticorpos (ver também Umana et al., Nat. Biotech. 17: 176- 180, 1999).

[00128] Em outro aspecto, se uma redução de ADCC for desejada, a subclasse de anticorpo humano IgG4 mostrou em muitos documentos anteriores ter apenas ADCC modesto e quase nenhuma função efetora de CDC (Moore G L, et al. 2010 MAbs, 2: 181-189). Por outro lado, IgG4 natural foi considerado menos estável em condições de estresse, como em tampão ácido ou sob temperatura crescente (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30: 105-108; Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37: 9266-9273; Aalberse et al.

2002 Immunol, 105: 9-19). ADCC reduzido pode ser alcançado ligando operacionalmente o anticorpo a IgG4 manipulado com combinações de alterações para ter a ligação FcγR reduzida ou nula ou atividades de ligação C1q, reduzindo ou eliminando assim funções efetoras de ADCC e CDC.

Considerando as propriedades físico-químicas do anticorpo como uma droga biológica, uma das propriedades intrínsecas menos desejáveis de IgG4 é a separação dinâmica de suas duas cadeias pesadas em solução para formar semianticorpo, o que leva a anticorpos bi-específicos gerados in vivo por meio de um processo chamado “Troca de braço Fab” (Van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science, 317: 1554-157). A mutação de serina em prolina na posição 228 (sistema de numeração EU) pareceu inibitória para a separação da cadeia pesada de IgG4 (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30: 105-108; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105: 9-19). Alguns dos resíduos de aminoácidos na dobradiça e na região γFc foram relatados como tendo impacto na interação do anticorpo com os receptores Fcγ (Chappel S M, et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9036-9040; Mukherjee, J. et al., 1995 FASEB J, 9: 115-119; Armor, K. L. et al.

1999 Eur J Immunol, 29: 2613-2624; Clynes, R. A. et al, 2000 Nature Medicine, 6: 443-446; Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol, 25: 21-50). Além disso, algumas isoformas de IgG4 que ocorrem raramente na população humana também podem induzir diferentes propriedades físico-químicas (Brusco, A. et al.

1998 Eur J Immunogenet, 25: 349-55; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105: 9-19).

Para gerar anticorpos OX40 com baixo ADCC, CDC e instabilidade, é possível modificar a dobradiça e a região Fc da IgG4 humana e introduzir uma série de alterações. Estas moléculas Fc de IgG4 modificadas podem ser encontradas em

SEQ ID NOs: 83-88, Patente US No. 8,735,553 de Li et al.

PRODUÇÃO DE ANTICORPO OX40

[00129] Os anticorpos anti-OX40 e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo podem ser produzidos por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a, expressão recombinante, síntese química e digestão enzimática de tetrâmeros de anticorpo, enquanto os anticorpos monoclonais de comprimento total podem ser obtidos por, por exemplo, hibridoma ou produção recombinante. A expressão recombinante pode ser a partir de quaisquer células hospedeiras apropriadas conhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, etc.

[00130] A divulgação fornece ainda polinucleotídeos que codificam os anticorpos descritos neste documento, por exemplo, polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou segmentos compreendendo as regiões determinantes de complementaridade como aqui descritas. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácido nucleico com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 21 ou 27. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo que codifica as regiões variáveis da cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de ácido nucleico com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 17, 23 ou 29.

[00131] Os polinucleotídeos da presente divulgação podem codificar a sequência de região variável de um anticorpo anti-OX40. Eles também podem codificar uma região variável e uma região constante do anticorpo. Algumas das sequências de polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende regiões variáveis de ambas a cadeia pesada e a cadeia leve de um dos anticorpos anti-OX40 exemplificados. Alguns outros polinucleotídeos codificam dois segmentos polipeptídicos que, respectivamente, são substancialmente idênticos às regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um dos anticorpos murinos.

[00132] Também são fornecidos na presente divulgação os vetores de expressão e células hospedeiras para a produção de anticorpos anti- OX40. A escolha do vetor de expressão depende das células hospedeiras pretendidas nas quais o vetor será expresso. Normalmente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências regulatórias (por exemplo, intensificadores) que estão operacionalmente ligados aos polinucleotídeos que codificam uma cadeia de anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, um promotor induzível é empregado para prevenir a expressão de sequências inseridas, exceto sob o controle de condições de indução. Os promotores indutíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico.

As culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições de não indução, sem desviar a população para sequências de codificação cujos produtos de expressão são melhor tolerados pelas células hospedeiras. Além dos promotores, outros elementos reguladores também podem ser necessários ou desejados para a expressão eficiente de um anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno. Esses elementos incluem tipicamente um códon de iniciação ATG e local de ligação ao ribossomo adjacente ou outras sequências. Além disso, a eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de intensificadores apropriados para o sistema celular em uso (ver, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153: 516, 1987). Por exemplo, o intensificador de SV40 ou intensificador de CMV pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamífero.

[00133] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de anticorpos anti-OX40 podem ser procarióticas ou eucarióticas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os polinucleotídeos da presente divulgação. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, como Bacillus subtilis, e outras enterobacteriaceae, como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, também se pode fazer vetores de expressão, que normalmente contêm sequências controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores controlam tipicamente a expressão, opcionalmente tendo uma sequência de operador, e têm sequências de sítio de ligação ao ribossoma e semelhantes, para iniciar e completar a transcrição e tradução. Outros micróbios, como levedura, também podem ser empregados para expressar polipeptídeos anti-OX40. Células de inseto em combinação com vetores de baculovírus também podem ser usadas.

[00134] Em outros aspectos, células hospedeiras de mamífero são usadas para expressar e produzir os polipeptídeos anti-OX40 da presente divulgação. Por exemplo, pode ser uma linhagem celular de hibridoma que expressa genes de imunoglobulina endógena ou uma linhagem celular de mamífero que abriga um vetor de expressão exógeno. Estes incluem qualquer célula humana ou animal mortal normal ou imortal normal ou anormal. Por exemplo, uma série de linhagens celulares hospedeiras adequadas capazes de secretar imunoglobulinas intactas foram desenvolvidas, incluindo as linhagens celulares CHO, várias linhagens celulares COS, células HEK 293, linhagens celulares de mieloma, células B transformadas e hibridomas. O uso de cultura de células de tecido de mamífero para expressar polipeptídeos é discutido geralmente em, por exemplo, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, NY, 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir sequências controle de expressão, como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador (ver, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49-68, 1986), e os locais de informação de processamento necessários, tais como locais de ligação ao ribossomo, locais de splice de RNA, locais de poliadenilação, e sequências terminadoras da transcrição. Estes vetores de expressão geralmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os promotores adequados podem ser constitutivos, específicos do tipo de célula, específicos do estágio e/ ou moduláveis ou reguláveis. Promotores úteis incluem, mas não estão limitados a, o promotor de metalotioneína, o principal promotor tardio de adenovírus constitutivo, o promotor de MMTV indutível de dexametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRP polIII, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV indutível por tetraciclina (tal como o promotor precoce imediato de CMV humano), o promotor de CMV constitutivo e combinações de promotores- intensificadores conhecidas na técnica.

MÉTODOS DE DETECÇÃO E DIAGNÓSTICO

[00135] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente divulgação são úteis em uma variedade de aplicações, incluindo, mas não se limitando a, métodos para detecção de OX40. Em um aspecto, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são úteis para detectar a presença de OX40 em uma amostra biológica. O termo “detecção”, conforme usado neste documento, inclui detecção quantitativa ou qualitativa. Em certos aspectos, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido. Em outros aspectos, tais tecidos incluem tecidos normais e/ ou cancerosos que expressam

OX40 em níveis mais elevados em relação a outros tecidos.

[00136] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para detectar a presença de OX40 em uma amostra biológica. Em certos aspectos, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo anti-OX40 sob condições permissivas para a ligação do anticorpo ao antígeno e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e o antígeno.

A amostra biológica pode incluir, sem limitação, amostras de urina ou sangue.

[00137] Também está incluído um método de diagnóstico de um distúrbio associado à expressão de OX40. Em certos aspectos, o método compreende o contato de uma célula de teste com um anticorpo anti-OX40; determinar o nível de expressão (tanto quantitativa quanto qualitativamente) de OX40 na célula de teste por meio da detecção da ligação do anticorpo anti-OX40 ao polipeptídeo OX40; e comparar o nível de expressão na célula de teste com o nível de expressão de OX40 em uma célula controle (por exemplo, uma célula normal da mesma origem de tecido que a célula de teste ou uma célula que não expressa OX40), em que um nível mais alto de expressão de OX40 na célula de teste em comparação com a célula controle indica a presença de um distúrbio associado à expressão de OX40.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[00138] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente divulgação são úteis em uma variedade de aplicações, incluindo, mas não se limitando a, métodos para o tratamento de uma desordem ou doença associada a OX40. Em um aspecto, o distúrbio ou doença associada a OX40 é um câncer.

[00139] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método de tratamento de câncer. Em certos aspectos, o método compreende a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno. O câncer pode incluir,

sem limitação, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer de pele, mesotelioma, linfoma, leucemia, mieloma e sarcoma.

[00140] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração de bolus e infusão de pulso são contemplados neste documento.

[00141] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção seriam formulados, doseados e administrados de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, a programação da administração, e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com as vias de administração conforme descritas aqui, ou cerca de 1 a 99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/ clinicamente determinada como apropriada.

[00142] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da gravidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, e a critério do médico assistente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 µg/ kg a 100 mg/ kg de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 µg/ kg a 100 mg/ kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, todas as semanas ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

TERAPIA DE COMBINAÇÃO

[00143] Em um aspecto, os anticorpos OX40 da presente divulgação podem ser usados em combinação com outros agentes terapêuticos. Outros agentes terapêuticos que podem ser usados com os anticorpos OX40 da presente divulgação incluem: mas não estão limitados a, um agente quimioterápico (por exemplo, paclitaxel ou um agente de paclitaxel; (por exemplo, Abraxane®), docetaxel; carboplatina; topotecano; cisplatina; irinotecano, doxorrubicina, lenalidomida, 5-azacitidina, ifosfamida, oxaliplatina, pemetrexed dissódico, ciclofosfamida, etoposido, decitabina, fludarabina, vincristina, bendamustina, clorambucil, busulfano, gemcitabina, melfalano, pentostatina, mitoxantrona, pemetrexedo dissódico), inibidor de tirosina quinase (por exemplo, inibidor de EGFR (por exemplo, erlotinibe), inibidor de multiquinase (por exemplo, MGCD265, RGB-286638), agente de direcionamento de CD-20 (por exemplo, rituximabe, ofatumumabe, RO5072759 LFB-R603), agente de direcionamento de CD52 (por exemplo, alemtuzumab), prednisolona, darbepoetina alfa, lenalidomida, inibidor de Bcl-2 (por exemplo, oblimersen sódico), inibidor de aurora quinase (por exemplo, MLN8237, TAK-901), inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe), agente de direcionamento de CD- 19 (por exemplo, MEDI-551, MOR208), inibidor de MEK (por exemplo, ABT-348), inibidor de JAK-2 (por exemplo, INCB018424), inibidor de mTOR (por exemplo, temsirolimus, everolimus), inibidor de BCR/ ABL (por exemplo, imatinibe), antagonista do receptor ET-A (por exemplo, ZD4054), agonista do receptor 2 TRAIL (TR-2) (por exemplo, CS-1008), inibidor de HGF/ SF (por exemplo, AMG 102), EGEN-001, inibidor de quinase 1 tipo Polo (por exemplo, BI 672).

COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[00144] Também são fornecidas composições, incluindo formulações farmacêuticas, compreendendo um anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno, ou polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam um anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno. Em certas formas de realização, as composições compreendem um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a OX40, ou um ou mais polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a OX40.

Estas composições podem compreender ainda veículos adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica.

[00145] As formulações farmacêuticas de um anticorpo OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito neste documento, são preparadas pela mistura de tal anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno tendo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A.

Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregues e incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menores que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ ou tensoativos não iônicos, tais como polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos ainda incluem aqui agentes de dispersão de droga intersticiais tais como glicoproteínas solúveis de hialuronidase ativa neutras (sHASEGP), por exemplo, glicoproteas de hialuronidase Ph-20 solúveis em humanos, tais como rHuPH20 (Hylenex®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplificativas e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Patentes US Nos. US 7,871,607 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[00146] Formulações de anticorpos liofilizados exemplificativos são descritos na Patente US No. 6,267,958. As formulações aquosas de anticorpo incluem aquelas descritas na Patente US No. 6,171,586 e WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de acetato de histidina.

[00147] Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.

[00148] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-OX40

[00149] Os anticorpos monoclonais anti-OX40 foram gerados com base na tecnologia de fusão de hibridoma convencional (de StGroth e Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35: 1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378: 1) com pequenas modificações. Os anticorpos com alta atividade de ligação em ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e ensaio de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) foram selecionados para posterior caracterização.

Proteínas recombinantes de OX40 para ensaios de imunização e ligação

[00150] O cDNA que codifica para OX40 humana de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) foi sintetizado pela Sino Biological (Pequim, China) com base na sequência do GenBank (Nº de Acesso: X75962.1).

A região de codificação do peptídeo sinal e domínio extracelular (ECD) consistindo no aminoácido (AA) 1-216 de OX-40 (SEQ ID NO: 2) foi amplificado por PCR e clonado in-house em vetores de expressão desenvolvidos internamente com C-terminal fundido com o domínio Fc de IgG2a de camundongo, o domínio Fc da cadeia pesada de IgG1 humana de tipo selvagem ou um marcador His, que resultou em três plasmídeos de expressão de proteína de fusão recombinante, OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 e OX40-His, respectivamente. A apresentação esquemática das proteínas de fusão OX40 é mostrada na Figura 1. Para a produção de proteína de fusão recombinante, os plasmídeos de expressão OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 e OX40-His foram transientemente transfectados em células 293G e foram cultivadas durante 7 dias em uma incubadora com CO2 equipada com agitador rotativo. O sobrenadante contendo a proteína recombinante foi coletado e depurado por centrifugação. Os OX40-mIgG2a e OX40-huIgG1 foram purificados usando uma coluna de Proteína A (Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences). OX40-His foi purificado usando coluna de Ni sepharose (Cat: 17-5318-02, GE Life Science).

As proteínas OX40-mIgG2a, OX40-huIgG e OX40-His foram dialisadas contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenadas em freezer a -80 °C em pequenas alíquotas.

Linhagens celulares de expressão estável

[00151] Para gerar linhagens celulares estáveis que expressam OX40 humana de comprimento completo (OX40) ou OX40 de cinomolgo (cynoOX40), estes genes foram clonados no vector retroviral pFB- Neo (Cat: 217561, Agilent, EUA). A transdução retroviral foi realizada com base em um protocolo descrito anteriormente (Zhang et al., 2005). As células HuT78 e HEK293 eram transduzidas retroviralmente com vírus contendo OX40 humana ou cynoOX40, respectivamente, para gerar linhagens celulares HuT78/OX40, HEK293/OX40 e HuT78/cynoOX40.

Imunização, fusão de hibridoma e clonagem

[00152] Camundongos Balb/c de oito a doze semanas de idade (de HFK BIOSCIENCE CO., LTD, Pequim, China) foram imunizados intraperitonealmente com 200 µL de antígeno de mistura contendo 10 µg de OX40-mIgG2a e Imuno-Adjuvante de Anticorpo Rápido (Cat: KX0210041, KangBiQuan, Pequim, China). O procedimento foi repetido em três semanas.

Duas semanas após a 2ª imunização, os soros de camundongos foram avaliados quanto à ligação de OX40 por ELISA e FACS. Dez dias após a triagem de soro, os camundongos com títulos séricos de anticorpos anti-OX40 mais altos receberam reforço via injeção por i.p. com 10 µg de OX40-mIgG2a. Três dias após o reforço, os esplenócitos foram isolados e fundidos à linhagem celular de mieloma murino, células SP2/0 (ATCC, Manassas VA), usando as técnicas padrão (Somat Cell Genet, 1977 3: 231).

Avaliação da atividade de ligação de OX40 de anticorpos por ELISA e FACS

[00153] Os sobrenadantes de clones de hibridoma foram inicialmente rastreados por ELISA conforme descrito em (Methods in Molecular Biology (2007) 378: 33-52) com algumas modificações. Resumidamente, a proteína OX40-His foi revestida em placas de 96 poços a 4 °C durante a noite.

Após lavagem com PBS/ Tween-20 a 0,05%, as placas foram bloqueadas por PBS/ BSA a 3% durante 2 horas à temperatura ambiente. Subsequentemente, as placas foram lavadas com PBS/ 0,05% de Tween-20 e incubadas com os sobrenadantes das células em temperatura ambiente durante 1 hora. O anticorpo IgG anti-camundongo ligado a HRP (Cat: 115035-008, Jackson ImmunoResearch Inc, Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ fragmente specific) e substrato (Cat: 00-4201-56, eBioscience, EUA) foram usados para desenvolver o sinal de absorbância de cor no comprimento de onda de 450 nm, que foi medido usando um leitor de placas (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices/ PHERAstar, BMG LABTECH). Os clones parentais positivos foram obtidos na triagem de fusão com ELISA indireto. Os clones positivos em ELISA foram ainda verificados por FACS usando células HuT78/OX40 e HuT78/cynoOX40 descritas acima. Células que expressam OX40 (10 5 células/ poço) foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma ELISA-positivos, seguido pela ligação com anticorpos anti-IgG de camundongo eFluor® 660 (Cat: 50-4010-82, eBioscience, USA). A fluorescência celular foi quantificada por meio de citômetro de fluxo (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, EUA).

[00154] Os meios condicionados dos hibridomas que mostraram sinais positivos em ambos os testes ELISA e FACS foram submetidos a ensaios funcionais para identificar anticorpos com boa atividade funcional em ensaios baseados em células imunes humanas (ver seções a seguir). Os anticorpos com as atividades funcionais desejadas foram posteriormente subclonados e caracterizados.

Subclonagem e adaptação de hibridomas para meio livre de soro ou com baixo teor de soro

[00155] Após a triagem primária por ELISA, FACS e ensaios funcionais como descritos acima, os clones de hibridoma positivos foram subclonados pela diluição limitante para garantir a clonalidade. Os principais subclones de anticorpo foram verificados por ensaios funcionais e adaptados para crescimento no meio CDM4MAb (Cat: SH30801.02, Hyclone, EUA) com FBS a 3%.

Expressão e purificação de anticorpos monoclonais

[00156] As células de hibridoma que expressam os melhores clones de anticorpo foram cultivadas em meio CDM4MAb (Cat: SH30801.02, Hyclone) e incubou-se em uma incubadora de CO2 durante 5 a 7 dias a 37 °C.

O meio condicionado foi coletado por centrifugação e filtrado pela passagem de uma membrana de 0,22 μm antes da purificação. Os anticorpos murinos nos sobrenadantes foram aplicados e ligados a uma coluna de Proteína A (Cat: 17- 5438-02, GE Life Sciences) seguindo o guia do fabricante. O procedimento geralmente rendeu anticorpos com pureza acima de 90%. Os anticorpos purificados por afinidade por Proteína A foram dialisados contra PBS ou, se necessário, purificados adicionalmente usando uma coluna HiLoad 16/60 Superdex 200 (Cat: 28-9893-35, GE Life Sciences) para remover agregados. As concentrações de proteína foram determinadas medindo a absorbância a 280 nm. As preparações de anticorpos finais foram armazenados em alíquotas em um congelador a -80 °C.

EXEMPLO 2: CLONAGEM E ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-OX40

[00157] Os clones de hibridoma murino foram colhidos para preparar RNAs celulares totais usando o kit Ultrapure RNA (Cat: 74104, QIAGEN, Alemanha) com base no protocolo do fabricante. Os cDNAs de 1ª cadea foram sintetizados usando um kit de síntese de cDNA da Invitrogen (Cat: 18080-051) e amplificação por PCR do VH e VL dos anticorpos de hibridoma foi realizada usando um kit de PCR (Cat: CW0686, CWBio, Pequim, China). Os oligo primers usados para clonagem de cDNAs de anticorpos de região variável de cadeia pesada (VH) e de região variável de cadeia leve (VL) foram sintetizados pela Invitrogen (Pequim, China) com base nas sequências relatadas anteriormente (Brocks et al. 2001 Mol Med 7: 461) Os produtos de PCR foram usados diretamente para o sequenciamento ou subclonados no vetor de clonagem pEASY-Blunt (Cat: CB101 TransGen, China), em seguida, sequenciados por Genewiz (Pequim, China). As sequências de aminoácidos das regiões VH e VL foram deduzidas dos resultados da sequenciamento de DNA.

[00158] Regiões determinantes de complementaridade (CDR) dos anticorpos murinos foram definidos com base no sistema de Kabat

(Wu e Kabat 1970 J. Exp Med 132: 211-250) por anotação da sequência e pelo programa de computador de análise de sequência. As sequências de aminoácidos de um clone representativo de topo Mu445 (VH e VL) foram listadas na Tabela 1 (SEQ ID NOs: 9 e 11). As sequências de CDR de Mu445 foram listadas na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 3-8).

Tabela 1. Sequências de aminoácidos das regiões VH e VL de Mu445

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYIIHWVKQKPGQGLEWIGYINPY S NDGTRYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEYSSLTSEDSAVYYCARGYYGSSYAM E DYWGQGTSVTVSS

Q Mu4 I 45V D

H N

O : 9

S DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYDTSTLYS E GVPSRFSGSGSGTDYFLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEKK Q

I Mu4

D 45V

N L

O : 1 1 Tabela 2. Sequências de CDR (aminoácidos) das regiões VH e VL do anticorpo monoclonal de camundongo Mu445 Anticorpo SEQ ID NO CDR Sequência SEQ ID NO: 3 HCDR1 (Kabat) SYIIH SEQ ID NO: 4 HCDR2 (Kabat) YINPYNDGTRYNEKFKG SEQ ID NO: 5 HCDR3 (Kabat) GYYGSSYAMDY Mu445 SEQ ID NO: 6 LCDR1 (Kabat) SASQGISNYLN SEQ ID NO: 7 LCDR2 (Kabat) DTSTLYS SEQ ID NO: 8 LCDR3 (Kabat) QQYSKLPYT EXEMPLO 3: HUMANIZAÇÃO DO ANTICORPO OX40 ANTI-HUMANO DE MURINO 445 Humanização e modificação por engenharia genética de anticorpos

[00159] Para a humanização de Mu445, os genes IgG da linhagem germinativa humana foram pesquisados em busca de sequências que compartilham altos graus de homologia com as sequências de cDNA de regiões variáveis de Mu445 por comparação de sequência contra o banco de dados de genes de imunoglobulina humana em IMGT. Os genes IGHV e IGKV humanos que estão presentes em repertórios de anticorpos humanos com altas frequências (Glanville et al., PNAS 106: 20216-20221 de 2009) e altamente homólogos a Mu445 foram selecionados como modelos para humanização.

[00160] A humanização foi realizada por enxerto de CDR (Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering, Methods and Protocols, Vol 248: Humana Press) e os anticorpos humanizados foram projetados como formato de tipo selvagem de IgG1 humana usando um vetor de expressão desenvolvido internamente. Na primeira rodada de humanização, mutações de resíduos de aminoácidos murinos para humanos em regiões de estrutura foram guiados pela análise da estrutura em 3D simulada, e os resíduos de estrutura de murino com importância estrutural para manter as estruturas canônicas da CDR foram retidos na primeira versão do anticorpo humanizado 445 (ver 445-1, Tabela 3). Os seis CDRs de 445-1 têm Sequências de Aminoácidos de HCDR1 (SEQ ID NO: 3), HCDR2 (SEQ ID NO: 13), HCDR3 (SEQ ID NO: 5) e LCDR1 (SEQ ID NO: 6), LCDR2 (SEQ ID NO: 7), e LCDR3 (SEQ ID NO: 8). A região variável de cadeia pesada de 445-1 tem uma sequência de aminoácidos de (VH) SEQ ID NO: 14 que é codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, e a região variável de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos de (VL) SEQ ID N o: 16, que é codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17. Especificamente, LCDRs de Mu445 (SEQ ID NO: 6-8) foram enxertados na estrutura do gene variável de linhagem germinativa humana IGVK1-39 com dois resíduos de estrutura murina (I44 e Y71) retidos (SEQ ID NO: 16). HCDR1 (SEQ ID NO: 3), HCDR2 (SEQ ID NO: 1 3) e HCDR3 (SEQ ID NO: 5) foram enxertados na estrutura do gene IGHV1-69 variável de linhagem germinativa humano com duas estruturas murinas (L70 e S72) de resíduos retidos (SEQ ID NO: 14). Nas variantes de humanização 445 (445-1), apenas a metade N-terminal de Kabat HCDR2 foi enxertada, pois apenas a metade N-terminal foi prevista como importante para a ligação ao antígeno de acordo com a estrutura 3D simulada.

[00161] O 445-1 foi construído como um anticorpo de comprimento completo humanizado usando vetores de expressão desenvolvidos internamente que contêm regiões constantes de uma IgG1 de tipo selvagem humana (IgG1wt) e cadeia kappa, respectivamente, com locais de subclonagem de fácil adaptação. O anticorpo 445-1 foi expresso por cotransfecção das duas construções acima em células 293G e purificado usando uma coluna de proteína A (Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences). O anticorpo purificado foi concentrado para 0,5 a 10 mg/ mL em PBS e armazenado em alíquotas em congelador a -80 °C.

[00162] Usando o anticorpo 445-1, várias alterações de único aminoácido foram feitas, convertendo os resíduos de murino retidos na região de estrutura do VH e VL para resíduos correspondentes da linhagem germinativa humana, tais como I44P e Y71F na VL e L70I e S72A na VH. Além disso, várias modificações de único aminoácidos foram feitas nas CDRs para reduzir o risco de isomerização potencial e aumentar o nível de humanização. Por exemplo, as alterações de T51A e D50E foram feitas em LCDR2 e as alterações D56E, G57A e N61A foram feitas em HCDR2. Todas as alterações de humanização foram feitas usando primers contendo mutações em posições específicas e um kit de mutagênese dirigida ao local (Cat: AP231-11, TransGen, Beijing, China). As mudanças desejadas foram verificadas por sequenciamento.

[00163] As alterações de aminoácidos no anticorpo 445-1 foram avaliadas quanto à sua ligação a OX40 e estabilidade térmica. O anticorpo 445-2 compreendendo HCDR1 de SEQ ID NO: 3, HCDR2 de SEQ ID NO: 18, HCDR3 de SEQ ID NO: 5, LCDR1 de SEQ ID NO: 6, LCDR2 de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 de SEQ ID NO: 8) (ver Tabela 3) foi construído a partir da combinação de mudanças específicas descritas acima. Na comparação dos dois anticorpos,

os resultados mostraram que ambos os anticorpos 445-2 e 445-1 exibiram afinidade de ligação comparável (ver abaixo na Tabela 4 e na Tabela 5).

[00164] Começando com o anticorpo 445-2, várias alterações de aminoácidos adicionais na região de estrutura da VL foram feitas para melhorar ainda mais a afinidade de ligação/ cinética, por exemplo, a alteração de aminoácidos G41D e K42G. Além disso, várias alterações de único aminoácido nas CDR de ambas as VH e VL foram feitas, a fim de diminuir o risco de imunogenicidade e aumentar a estabilidade térmica, por exemplo, S24R em LCDR1 e A61N em HCDR2. As alterações resultantes mostraram atividades de ligação melhoradas ou estabilidade térmica em comparação com 445-2.

[00165] Os anticorpos 445 humanizados foram ainda manipulados introduzindo alterações de aminoácido específicas em CDRs e regiões estruturais para melhorar as propriedades moleculares e biofísicas para uso terapêutico em humanos. As considerações incluíram a remoção de modificações pós traducionais deletérias, estabilidade ao calor melhorada (Tm ), hidrofobicidade de superfície e pontos isoeletrônica (PIS), mantendo a atividade de ligação.

[00166] O anticorpo monoclonal humanizado, 445-3, compreendendo HCDR1 de SEQ ID NO: 3, HCDR2 de SEQ ID NO: 24, HCDR3 de SEQ ID NO: 5, LCDR1 de SEQ ID NO: 25, LCDR2 de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 de SEQ ID NO: 8 (ver Tabela 3), foi construído a partir do processo de maturação descrito acima e caracterizado em detalhes. O anticorpo 445-3 também foi feito em uma versão de IgG2 (445-3 IgG2) compreendendo o domínio Fc da cadeia pesada de tipo selvagem de IgG2 humana e uma versão de IgG4 compreendendo o domínio Fc de IgG4 humana com mutações S228P e R409K (445-3 IgG4). Os resultados mostraram que 445-3 e 445-2 exibiram afinidade de ligação comparável (ver Tabela 4 e Tabela 5).

Tabela 3. sequências de anticorpos 445 Anticorpo SEQ ID NO SEQUÊNCIA SEQ ID NO: HCDR1

SYIIH 3 (Kabat) SEQ ID NO: HCDR2

YINPYNDGTRYNQKFQG 13 (Kabat) SEQ ID NO: HCDR3

GYYGSSYAMDY 5 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR1

SASQGISNYLN 6 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR2

DTSTLYS 7 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR3 445-1 QQYSKLPYT 8 (Kabat)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWM SEQ ID NO:

VH GYINPYNDGTRYNQKFQGRVTLTS 14

DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA RGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSA SQGISNYLNWYQQKPGKAIKLLIYD SEQ ID NO:

VL TSTLYSGVPSRFSGSGSGTDYTLTI 16

SSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFG

GGTKVEIK SEQ ID NO: HCDR1

SYIIH 445-2 3 (Kabat) SEQ ID NO: HCDR2 YINPYNEGTRYAQKFQG

Anticorpo SEQ ID NO SEQUÊNCIA 18 (Kabat) SEQ ID NO: HCDR3

GYYGSSYAMDY 5 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR1

SASQGISNYLN 6 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR2

DASTLYS 19 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR3

QQYSKLPYT 8 (Kabat)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWM SEQ ID NO:

VH GYINPYNEGTRYAQKFQGRVTLTA 20

VL ASTLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI 22

SSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFG

GGTKVEIK SEQ ID NO: HCDR1

SYIIH 3 (Kabat) SEQ ID NO: HCDR2

YINPYNEGTRYNQKFQG 445-3 24 (Kabat) SEQ ID NO: HCDR3

GYYGSSYAMDY 5 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR1 RASQGISNYLN

Anticorpo SEQ ID NO SEQUÊNCIA 25 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR2

DASTLYS 19 (Kabat) SEQ ID NO: LCDR3

QQYSKLPYT 8 (Kabat)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWM SEQ ID NO:

VH GYINPYNEGTRYNQKFQGRVTLTA 26

DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA RGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA SQGISNYLNWYQQKPDGAIKLLIYD SEQ ID NO:

VL ASTLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI 28

SSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFG

GGTKVEIK EXEMPLO 4: CINÉTICA DE LIGAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPOS ANTI-OX40 POR SPR

[00167] Os anticorpos anti-OX40 foram caracterizados quanto à sua cinética de ligação e afinidade por ensaios SPR usando BIAcore™ T-200 (GE Life Sciences). Resumidamente, o anticorpo IgG anti-humano foi imobilizado em um chip biossensor CM5 ativado (Cat: BR100530, GE Life Sciences). Um anticorpo com a região Fc de IgG humana fluiu sobre a superfície do chip e capturado pelo anticorpo IgG anti-humano. Em seguida, uma diluição em série da proteína OX40 recombinante com um marcador de His (Cat: 10481- H08H, Sino Biological) foi fluída sobre a superfície do chip e as mudanças nos sinais de ressonância de plasmon de superfície foram analisadas para calcular as taxas de associação (ka) e taxas de dissociação (kd) usando o modelo de ligação um-para-um de Langmuir (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences).

A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão kd/ ka.

Os resultados dos perfis de ligação determinados por SPR de anticorpos anti- OX40 estão resumidos na Figura 2 e Tabela 4. O perfil de ligação com KD médio do anticorpo 445-3 (9,47 nM) foi ligeiramente melhor do que o anticorpo 445-2 (13,5 nM) e 445-1 (17,1 nM), e semelhante ao de ch445. O perfil de ligação de 445-3 IgG4 foi semelhante ao 445-3 (com IgG1 Fc), indicando que a mudança em Fc entre IgG4 e IgG1 não alterou a ligação específica do anticorpo 445-3.

Tabela 4. Afinidades de ligação de anticorpos anti-OX40 por SPR Parâmetros de teste ch445* 445-1 445-2 445-3 445-3 IgG4 ka (M-1s-1) 1,74 x 105 1,56 x 105 2,76 x 105 1,82 x 105 1,61 x 105 kd (s-1) 1,43 x 10-3 2,77 x 10-3 3,90 x 10-3 1,67 x 10-3 1,61 x 10-3 Teste 1 KD (nM) 8,26 17,8 14,2 9,16 10,0 KA (M-1) 1,22 x 108 0,56 x 108 0,71 x 108 1,09 x 108 1,00 x 108 ka (M-1s-1) 2,65 x 105 2,37 x 105 2,06 x 105 1,63 x 105 _ kd (s-1) 1,67 x 10-3 3,89 x 10-3 2,64 x 10-3 1,59 x 10-3 _ Teste 2 KD (nM) 6,3 16,4 12,8 9,77 _ KA (M-1) 1,59 x 108 0,61 x 108 0,78 x 108 1,03 x 108 _ KD (nM) 7,28 17,1 13,5 9,47 10,0 Significar KA (M-1) 1,41 x 108 0,59 x 108 0,75 x 108 1,06 x 108 1,00 x 108 *ch445 é compreendido por domínios variáveis Mu445 fundidos a regiões constantes IgG1wt/ kappa humana EXEMPLO 5: DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-OX40 A OX40 EXPRESSOS EM CÉLULAS HUT78

[00168] Para avaliar a atividade de ligação de anticorpos anti- OX40 para ligar OX40 expresso na superfície de células vivas, células HuT78 foram transfectadas com OX40 humana como descrito no Exemplo 1 para criar uma linhagem de expressão de OX40. As células HuT78/OX40 vivas foram semeadas em placas de 96 poços e foram incubadas com uma diluição em série de vários anticorpos anti-OX40. FITC de cabra anti-IgG humana (Cat: A0556, Beyotime) foi usado como um anticorpo secundário para detectar a ligação do anticorpo à superfície celular. Os valores de EC50 para a ligação dependente da dose à OX40 humana foram determinados ajustando os dados de resposta à dose ao modelo logístico de quatro parâmetros com GraphPad Prism. Como mostrado na Figura 3 e Tabela 5, os anticorpos OX40 tiveram alta afinidade para OX40. Também foi descoberto que os anticorpos OX40 da divulgação atual tinham um nível superior relativamente mais alto de intensidade de fluorescência medido por citometria de fluxo (ver a última coluna da Tabela 5), indicando uma dissociação mais lenta do anticorpo de OX40, que é o perfil de ligação mais desejável.

Tabela 5. EC50 de ligação dependente da dose de variantes 445 humanizadas a OX40 EC50 (µg/ ml) Top (MFI) Anticorpo Teste 1 Teste 2 Média Média ch445 0,321 0,277 0,299 725 445-1 0,293 0,278 0,285 525 445-2 0,323 0,363 0,343 620 445-3 0,337 0,319 0,328 910 445-3 IgG4 0,263 N/ D 0,263 892 EXEMPLO 6: DETERMINAÇÃO DA REATIVIDADE CRUZADA DE ANTICORPOS ANTI-OX40

[00169] Para avaliar a reatividade cruzada de anticorpo 445- 3 para OX40 humana e de cinomolgo (cyno) macaco, células que expressam OX40 humana (Hut78/OX40) e cyno OX40 (Hut78/cynoOX40) foram semeadas em placa de 96 poços e incubadas com uma série de diluições de anticorpos OX40. FITC de cabra anti-IgG humana (Cat: A0556, Beyotime) foi usado como um anticorpo secundário para a detecção. Os valores de EC50 para a ligação dependente da dose a OX40s nativos humanos e de macaco cinomolgo foram determinados ajustando os dados de resposta à dose ao modelo logístico de quatro parâmetros com GraphPad Prism. O resultado é mostrado na Figura 4 e Tabela 6 abaixo. O anticorpo 445-3 reage de forma cruzada com ambos OX40 humana e de macaco cinomolgo, com valores EC50 semelhantes, como mostrado abaixo.

Tabela 6. EC50 do anticorpo 445-3 que se liga a OX40 humana e de macaco cinomolgo Linhagem celular EC50 (µg/ ml) de 445-3 Top (MFI) HuT78/OX40 0,174 575 HuT78/cynoOX40 0,171 594 EXEMPLO 7: CO-CRISTALIZAÇÃO E DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DE OX40 COM UM 445-3 FAB

[00170] Para entender o mecanismo de ligação de OX40 a anticorpos da presente divulgação, a estrutura de co-cristal de OX40 e Fab do 445-3 foram resolvidas. Mutações nos resíduos T148 e N160 foram introduzidas para bloquear a glicosilação de OX40 e para melhorar a heterogeneidade da proteína. O DNA que codifica a OX40 humana mutante (resíduos M1-D170 com os dois locais mutados, T148A e N160A) foi clonado em um vetor de expressão com a inclusão de um marcador hexa-His, e esta construção foi transitoriamente transfectada em células 293 G para proteína expressão a 37 °C por 7 dias. As células foram colhidas e o sobrenadante foi recolhido e incubado com resina de afinidade com His a 4 °C durante 1 hora. A resina foi enxaguada três vezes com um tampão contendo 20 mM de Tris, pH 8,0, 300 mM de NaCl e 30 mM de imidazol. A proteína OX40 foi então eluída com um tampão contendo 20 mM de Tris, pH 8,0, 300 mM de NaCl e 250 mM de imidazol, seguido por purificação adicional com Superdex 200 (GE Healthcare) em um tampão contendo 20 mM de Tris, pH 8,0, 100 mM de NaCl.

[00171] As sequências de codificação da cadeia pesada e da cadeia leve do 445-3 Fab foram clonadas em um vetor de expressão com a inclusão de um marcador hexa-His no C-terminal da cadeia pesada, e estas foram transitoriamente co-transfectadas nas células 293G para expressão de proteína a 37 °C por 7 dias. As etapas de purificação do 445-3 Fab foram as mesmas usadas para a proteína OX40 mutante acima.

[00172] OX40 e 445-3 Fab purificadas foram misturadas com uma razão molar de 1: 1 e incubadas durante 30 minutos sobre gelo, seguido por purificação adicional com Superdex 200 (GE Healthcare) em um tampão contendo 20 mM de Tris, pH 8,0, 100 mM de NaCl. O pico do complexo foi recolhido e concentrado a aproximadamente 30 mg/ ml.

[00173] A varredura de co-cristal foi realizada misturando o complexo de proteínas com a solução de reservatório em uma proporção de volume de 1: 1. Os co-cristais foram obtidos a partir de gotas suspensas cultivadas a 20 °C por difusão de vapor com uma solução de reservatório contendo 0,1 M de HEPES, pH 7,0, 1% de PEG 2,000 MME e 0,95 M de succinato de sódio.

[00174] Laços de nylon foram usados para colher os co- cristais e os cristais foram imersos em solução de reservatório suplementada com glicerol a 20% por 10 segundos. Os dados de difração foram coletados no BL17U1, Xangai Synchrotron Radiation Facility, e foram processados com o programa XDS. A fase foi resolvida com o programa PHASER usando uma estrutura de IgG Fab (cadeias C e D de PDB: 5CZX) e a estrutura de OX40 (cadeia R de PDB: 2HEV) como modelo de busca de substituição molecular. A interface gráfica Phenix.refine foi usada para realizar o corpo rígido, TLS e refinamento restrito contra dados de raios-X, seguido pelo ajuste com o programa COOT e refinamento adicional no programa Phenix.refine. A coleta de dados de raio X e refinamento estão resumidos na Tabela 7.

Tabela 7. Coleta de dados e estatísticas de refinamento Coleção de dados Beamline BL17U1, SSRF Grupo espacial P 31 2 1 Dimensões da célula (Å) a=183,96 b=183,96 c=79,09 Ângulos (°) α=90,00 β=90,00 γ=120,00 Resolução (Å) 159,3-2,55 (2,63-2,55) Número total de reflexões 988771 (81305) Número de reflexões únicas 50306 (4625) Completude (%) 99,9 (99,9) Redundância média 19,7 (17,6) Rmergea 0,059 (0,962) I/ sigma (I) 29,4 (3,5) Fator Wilson B (Å) 73,9

Refinamento Resolução (Å) 60,22-2,55 Número de reflexões 50008 comprimentos de ligação rmsd (Å) 0,010 ângulos de ligação rmsd (°) 0,856 Rtrabalhob (%) 19,27 Rlivrec (%) 21,60 Fatores de proteína B médios 97,10 Gráfico de Ramachandran (%) Favorecido 96,34 Permitido 3,48 Pontos fora da curva 0,17

Os valores entre parênteses referem-se ao shell de maior resolução. aRmerge = ∑ ∑𝑖|𝐼(ℎ)𝑖 − 〈𝐼(ℎ)〉|⁄∑ ∑𝑖|𝐼(ℎ)𝑖 |, onde 〈𝐼(ℎ)〉 é a intensidade média do equivalente. bR trabalho = ∑|𝐹𝑜 − 𝐹𝑐|⁄∑|𝐹𝑜|, onde Fo e Fc são as amplitudes dos fatores de estrutura observados e calculados, respectivamente.

cR livre = ∑|𝐹𝑜 − 𝐹𝑐|⁄∑|𝐹𝑜|, calculado usando um conjunto de dados de teste, 5% do total de dados selecionados aleatoriamente a partir das reflexões observadas.

EXEMPLO 8: IDENTIFICAÇÃO DE EPITOPO DE ANTICORPO 445-3 POR SPR

[00175] Guiados pela estrutura de co-cristal do OX40 e do anticorpo 445-3Fab, selecionamos e geramos uma série de mutações únicas na proteína OX40 humana para identificar ainda os epítopos principais dos anticorpos anti-OX40 da presente divulgação. As mutações de ponto único foram feitas em uma construção de fusão OX40/IgG1 humana com um kit de mutagênese dirigida ao local (Cat: AP231-11, TransGen). As mutações desejadas foram verificadas por sequenciamento. A expressão e preparação dos mutantes OX40 foram alcançadas por transfecção em células 293G e purificadas usando uma coluna de proteína A (Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences).

[00176] A afinidade de ligação dos mutantes pontuais OX40 a um 445-3 Fab foi caracterizada por ensaios de SPR usando BIAcore 8K (GE Life Sciences). Resumidamente, mutantes OX40 e OX40 do tipo selvagem foram imobilizados em um chip biossensor CM5 (Cat: BR100530, GE Life Sciences) usando EDC e NHS. Em seguida, uma diluição em série de 445-3 Fab em tampão HBS-EP+ (Cat: BR-1008-26, GE Life Sciences) foi fluida sobre a superfície do chip usando um tempo de contato de 180 s e um tempo de dissociação de 600 s a 30 µl/ min. As mudanças nos sinais de ressonância de plasmon de superfície foram analisadas para calcular as taxas de associação (ka) e taxas de dissociação (kd) usando o modelo de ligação Langmuir um-para- um (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão kd/ ka. A quantidade de mudanças KD do mutante foi calculada como a razão do KD do mutante/ KD do WT. Os perfis de identificação de epítopo determinados por SPR estão resumidos na Figura 5 e na Tabela 8. Os resultados indicaram que a mutação dos resíduos H153, I165 e E167 para alanina em OX40 reduziu significativamente a ligação do anticorpo 445-3 a OX40, e a mutação dos resíduos T154 e D170 para alanina teve redução moderada da ligação do anticorpo 445-3 a OX40.

[00177] As interações detalhadas entre o anticorpo 445-3 e os resíduos H153, T154, I165, E167 e D170 de OX40 são mostradas na Figura

6. A cadeia lateral de H153 em OX40 foi cercada por uma pequena bolsa de 445- 3 na interação de interface, que formam ligações de hidrogênio com pesadaS31 e pesadaG102 e empilhamento pi-pi com pesadaY101. A cadeia lateral de E167 formou ligações de hidrogênio com pesadaY50 e pesadaN52, enquanto D170 formou uma ligação de hidrogênio e uma ponte salina com pesadaS31 e pesadaK28, respectivamente, que pode ainda estabilizar o complexo. Interações de Van der Waals (VDW) entre T154 e pesadaY105, I165 e pesadaR59 contribuíram para uma elevada afinidade do anticorpo 445-3 para OX40.

[00178] Em conclusão, os resíduos H153, I165 e E167 de OX40 foram identificados como resíduos importantes para interagir com o anticorpo 445-3. Além disso, os aminoácidos T154 e D170 de OX40 também são resíduos de contato importantes para o anticorpo 445-3. Estes dados indicaram que os epítopos do anticorpo 445-3 são resíduos H153, T154, I165, E167 e D170 de OX40. Estes epítopos residem na sequência HTLQPASNSSDAICEDRD (SEQ ID NO: 30) com os resíduos de contato importantes em negrito e sublinhadas.

Tabela 8. Identificação de Epítopo de Anticorpo 445-3 Determinada por

SPR Mutantes KD de Mutante/ KD de WT H153A Nenhuma ligação foi detectada T154A 8 Q156A 1,9 S161A 1,1

Mutantes KD de Mutante/ KD de WT S162A 0,6 I165A 28 E167A 135 D170A 8

[00179] Impacto significativo: Nenhuma ligação foi detectada, ou o valor do KD de Mutante/ KD de WT era maior do que 10. Impacto moderado: KD de Mutante/ KD de WT foi avaliado entre 5 e 10. Impacto não significativo: O valor de KD de Mutante/ KD de WT foi menor que 5.

EXEMPLO 9: O ANTICORPO ANTI-OX40 445-3 NÃO BLOQUEIA A INTERAÇÃO OX40- OX40L.

[00180] Para determinar se o anticorpo 445-3 interfere com a interação OX40-OX40L, foi estabelecido um ensaio de citometria de fluxo baseado em células. Neste ensaio, o anticorpo 445-3, o anticorpo de referência 1A7.gr1, huIgG controle ou meio sozinho foram pré-incubados com uma proteína de fusão de OX40 humana com IgG2a Fc murino (OX40-mIgG2a). O complexo de anticorpo e proteína de fusão foi então adicionado a células HEK293 que expressam OX40L. Se um anticorpo OX40 não interferir com a interação OX40- OX40L, então o complexo anticorpo OX40-OX40 mIgG2a ainda se ligará à superfície da OX40L, e esta interação é detectável usando um anticorpo secundário Fc anti-camundongo.

[00181] Como mostrado na Figura 7, o anticorpo 445-3, mesmo em alta concentração, não reduziu a ligação de OX40 a OX40L, indicando que 445-3 não interfere com a interação OX40-OX40L. Isso indica que 445-3 não se liga no local de ligação de OX40L ou se liga perto o suficiente para impedir estericamente a ligação de OX40L. Em contraste, o anticorpo controle positivo, 1A7.gr1 bloqueia completamente a ligação de OX40 a OX40L, conforme mostrado na Figura 7.

[00182] Além disso, a estrutura de co-cristal de OX40 no complexo com 445-3 Fab foi resolvida e alinhada com o complexo OX40/ OX40L (código PDB: 2HEV), como mostrado na Figura 8. O trímero de ligante OX40 interage com OX40 principalmente através de CRD1 (domínio rico em cisteína), regiões CRD2 e CRD3 parciais da OX40 (Compaan e Hymowitz, 2006), enquanto o anticorpo 445-3 interage com OX40 apenas através da região CRD4.

Em resumo, o anticorpo 445-3 e o trímero OX40L se ligam em diferentes regiões respectivas de OX40 e o anticorpo 445-3 não interfere com a interação OX40/ OX40L. Este resultado está correlacionado com os dados de mapeamento de epítopo descritos nos exemplos acima. O CRD4 de OX40 está nos aminoácidos 127-167 e o epítopo do anticorpo 445-3 se sobrepõe parcialmente a esta região.

A sequência da CRD4 de OX40 (aminoácidos 127-167) é mostrada abaixo, e a sobreposição parcial do epítopo 445-3 está em negrito e sublinhado: PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICE (SEQ ID NO: 31).

EXEMPLO 10: ATIVIDADE AGONÍSTICA DE ANTICORPOS 445 ANTI-OX40 -3

[00183] Para investigar as funções agonísticas do anticorpo 445-3, uma linhagem de célula T positiva para OX40, HuT78/OX40 foi co- cultivada com uma linhagem celular apresentadora de antígeno artificial (APC) (HEK293/ OS8baixo-FcγRI) na presença ou ausência de 445-3 ou 1A7.gr1 durante a noite e a produção de IL-2 foi usada como leitura para a estimulação de células T. Em células HEK293/ OS8baixo-FcγRI, os genes que codificam o anticorpo OKT3 anti-CD3 ligado à membrana (OS8) (conforme divulgado na Patente US No. 8,735,553) e FcγRI humano (CD64) foram co-transduzidos de forma estável em células HEK293. Uma vez que a ativação imune induzida por anticorpo anti- OX40 depende da reticulação do anticorpo (Voo et al., 2013), FcγRI em HEK293/ OS8baixo-FcγRI fornece a base para a reticulação mediada por anticorpo anti- OX40 de OX40 mediante o envolvimento duplo de anticorpo anti-OX40 para ambos OX40 e FcγRI. Como mostrado na Figura 9, o anticorpo 445-3 anti-OX40 foi altamente potente no aumento da sinalização de TCR de um modo dependente da dose com EC50 a 0,06 ng/ ml. Atividades ligeiramente mais fracas do Ab1A7.gr1 de referência também foram observadas. Em contraste, o controle de IgG humana (10 μg/ mL) ou branco não mostrou efeito sobre a produção de IL-2.

EXEMPLO 11: ANTICORPO 445-3 ANTI-OX40 PROMOVEU RESPOSTAS IMUNES NO ENSAIO DE REAÇÃO MISTA DE LINFÓCITOS (MLR)

[00184] Para determinar se o anticorpo 445-3 pode estimular a ativação de células T, um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) foi estabelecido como descrito anteriormente (Tourkova et al., 2001). Em resumo, as DCs maduras foram induzidas a partir de células mieloides CD14+ derivadas de PBMC humanas por cultura com GM-CSF e IL-4, seguido por estimulação com LPS. Em seguida, as DCs tratadas com mitomicina C foram co-cultivadas com células T CD4+ alogênicas na presença de anticorpo 445-3 anti-OX40 (0,1- 10 μg/ ml) por 2 dias. A produção de IL-2 na co-cultura foi detectada por ELISA como a leitura da resposta MLR.

[00185] Como mostrado na Figura 10, o anticorpo 445-3 promoveu significativamente a produção de IL-2, indicando a capacidade de 445- 3 em ativar células T CD4+. Em contraste, o anticorpo de referência 1A7.gr1 mostrou atividades significativamente (P < 0,05) mais fracas no ensaio de MLR.

EXEMPLO 12: ANTICORPO 445-3 ANTI-OX40 MOSTROU ATIVIDADE ADCC

[00186] Um ensaio ADCC baseado na liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi estabelecido para investigar se o anticorpo 445-3 poderia matar células alvo que expressam OX40Hi. A linhagem celular NK92MI/CD16V foi gerada como células efetoras por co-transdução de genes CD16v158 (alelo V158) e FcRγ em uma linhagem celular NK, NK92MI (ATCC, Manassas VA). Uma linhagem de células T expressando OX40, HuT78/OX40,

foi usada como as células alvo. Números iguais (3 x 104) de células alvo e células efetoras foram co-cultivadas durante 5 horas na presença de um anticorpo anti- OX40 (0.004 a 3 μg/ ml) ou controle Abs. A citotoxicidade foi avaliada por liberação de LDH usando o kit CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI). A lise específica foi calculada pela fórmula mostrada abaixo.

% de lise específica Experimento − Espontâneo do Efetor − Espontâneo do Alvo = Alvo Máximo − Espontâneo do Alvo × 100

[00187] Conforme mostrado na Figura 11, o anticorpo 445-3 mostrou alta potência em matar alvos OX40Hi via ADCC de uma maneira dependente ed dose (EC50: 0,027 μg/ mL). O efeito ADCC do anticorpo 445-3 foi semelhante ao do anticorpo controle 1A7.grl. Em contraste, o 445-3 com formato IgG4 Fc com mutações S228P e R409K (445-3-IgG4) não mostrou quaisquer efeitos ADCC significativos, em comparação com IgG humana controle ou branco. Os resultados são consistentes com as descobertas anteriores de que IgG4 Fc é fraco ou silencioso para ADCC (An Z, et al. mAbs 2009).

EXEMPLO 13: O ANTICORPO 445-3 ANTI-OX40 ESGOTA PREFERENCIALMENTE TREGS CD4+ E AUMENTA AS RAZÕES TEFF CD8+/ TREG IN VITRO

[00188] Foi demonstrado em vários modelos de tumores animais que o anticorpos anti-OX40 pode esgotar Tregs OX40Hi que se infiltram em tumor e aumenta as razões de células T CD8+ para Tregs (Bulliard et al,

2014.; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b).

Consequentemente, a resposta imune foi aumentada, levando à regressão do tumor e melhorando a sobrevida.

[00189] Dado o fato de que Tregs CD4+ Foxp3+ ativadas in vitro ou intratumorais expressam preferencialmente OX40 do que outros subconjuntos de células T (Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016), um ensaio baseado em PBMC humano foi estabelecido para investigar a capacidade do anticorpo 445-3 de matar células OX40Hi, particularmente Tregs. Em resumo, PBMCs foram pré-ativadas por 1 dia por PHA-L (1 µg/ mL) para a indução da expressão de OX40 e foram usados como células alvo. Células efetoras NK92MI/ CD16V (como descritas no Exemplo 12, 5 x 104) foram depois co- cultivadas com um número igual de células alvo na presença de anticorpos anti- OX40 (0,001 a 10 μg/ ml) ou placebo, durante a noite. As porcentagens de cada subconjunto de células T foram determinadas por citometria de fluxo. Como mostrado nas Figuras 12A e 12B, o tratamento com anticorpo 445-3 induziu um aumento na porcentagem de células T CD8+ e uma diminuição na porcentagem de Tregs CD4+ Foxp3+ de uma maneira dependente de dose. Como resultado, as razões de células T CD8+ para Tregs foram muito melhoradas (Figura 12 C).

Resultados mais fracos foram obtidos com o tratamento 1A7.gr1. Este resultado demonstra as aplicações terapêuticas de 445-3 na indução da imunidade antitumoral, aumentando as funções das células T CD8+, mas limitando a tolerância imunológica mediada por Treg.

EXEMPLO 14: O ANTICORPO ANTI-OX40 445-3 EXERCE ATIVIDADE ANTITUMORAL

DEPENDENTE DE DOSE EM UM MODELO DE TUMOR DE CAMUNDONGO

[00190] A eficácia do anticorpo anti-OX40 445-3 foi mostrada em um modelo de tumor de camundongo. Células de tumor do cólon de murinho MC38 foram implantadas subcutaneamente em camundongos transgênicos C57 para OX40 humana (Biocytogen, Beijing, China). Após a implantação das células tumorais, os volumes tumorais foram medidos duas vezes por semana e calculados em mm3 usando a fórmula: V = 0,5 (a x b2) onde a e b eram os diâmetros longo e curto do tumor, respectivamente. Quando os tumores atingiram um volume médio de aproximadamente 190 mm3 de tamanho, os camundongos foram alocados aleatoriamente em 7 grupos e injetados intraperitonealmente com o anticorpo 445-3 ou 1A7.gr1 uma vez por semana durante três semanas. A IgG humana foi administrada como controle de isotipo.

A regressão parcial (RP) foi definida como o volume do tumor menor que 50% do volume inicial do tumor no primeiro dia de dosagem em três medições consecutivas. A inibição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada usando a seguinte fórmula: % 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑡) − (𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑡0) = 100 𝑥 (1 − ( )) (𝑝𝑙𝑎𝑐𝑒𝑏𝑜 𝑡) − (𝑝𝑙𝑎𝑐𝑒𝑏𝑜 𝑡0) tratado t = volume do tumor tratado no tempo t tratado t0 = volume do tumor tratado no tempo 0 placebo t = volume do tumor placebo no tempo t placebo t0 = volume do tumor placebo no tempo 0

[00191] Os resultados demonstraram que o 445-3 tinha eficácia antitumoral dependente de dose como uma injeção intraperitoneal com doses de 0,4 mg/ kg, 2 mg/ kg e 10 mg/ kg. A administração de 445-3 resultou em 53% (0,4 mg/ kg), 69% (2 mg/ kg), e 94% (10 mg/ kg) de inibição do crescimento do tumor, e resultou em 0% (0,4 mg/ kg), 17% (2 mg/ kg) e 33% (10 mg/ kg) de regressão parcial da linha de base. Em contraste, nenhuma regressão parcial pelo anticorpo 1A7.gr1 foi observada. Os dados in vivo indicam que o anticorpo 445-3 que não bloqueia o ligante é mais adequado para terapia anti- tumoral do que o anticorpo bloqueador OX40-OX40L 1A7.gr1 (Figura 13A e 13B, Tabela 9).

Tabela 9. A eficácia de 445-3 e 1A7.gr1 em um modelo de camundongo com tumor de cólon MC38 murino Taxa de Dose QW Volume médio do TGI no dia Tratamento N regressão (mg/ kg) tumor no dia 21 (mm3) 21 (%) parcial 0,4 6 0% 953 53 445-3 2 6 17% 696 69 10 6 33% 280 94 1A7.gr1 0,4 6 0% 886 57

Taxa de Dose QW Volume médio do TGI no dia Tratamento N regressão (mg/ kg) tumor no dia 21 (mm3) 21 (%) parcial 2 6 0% 1163 41 10 6 0% 1030 49 EXEMPLO 15: ALTERAÇÕES DE AMINOÁCIDOS DE ANTICORPOS ANTI-OX40

[00192] Vários aminoácidos foram escolhidos para alteração para melhoria dos anticorpos OX40. Mudanças de aminoácidos foram feitas para melhorar a afinidade ou para aumentar a humanização. Os conjuntos de primers de PCR foram projetados para as alterações de aminoácidos apropriadas, sintetizados e usados para modificar os anticorpos anti-OX40. Por exemplo, a alteração de K28T na cadeia pesada e S24R na cadeia leve resultou em um aumento de 1,7 vezes para o EC50 determinado por FACS em relação ao anticorpo 445-2 original. A alteração de Y27G na cadeia pesada e S24R na cadeia leve resultou em um aumento de 1,7 vezes para o KD determinado por Biacore em relação ao anticorpo 445-2 original. Essas mudanças estão resumidas nas Figuras 14A-14B.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por se ligar especificamente à OX40 humana e compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR (Região Determinante da Complementaridade da Cadeia Pesada) 1 de SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 24, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR (Região Determinante da Complementaridade da Cadeia Leve) 1 de SEQ ID NO: 25, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 19, e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO: 8; (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 18, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO: 6, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 19, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8; (iii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 13, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO: 6, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 7, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 de SEQ ID NO: 3, (b) uma HCDR2 de SEQ ID NO: 4, (c) uma HCDR3 de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 de SEQ ID NO: 6, (e) uma LCDR2 de SEQ ID NO: 7, e (f) uma LCDR3 de SEQ ID NO: 8.

2. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 28; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 22; (iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 11.

3. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez aminoácidos dentro da SEQ ID NO: 26, 28, 20, 22, 14, 16, 9 e/ ou 11 terem sido inseridos, deletados ou substituídos.

4. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 28;

(ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 22; (iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 16; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a SEQ ID NO: 11.

5. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano modificado por engenharia genética, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento Fab, um fragmento Fab’, ou um fragmento F(ab’)2.

6. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por possuir atividade agonista de OX40.

7. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se ligar a OX40 humana em um epítopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em H153 a D170 de OX40 humana.

8. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se ligar a OX40 humana em um epítopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em H153, T154, I165, E167 e D170 de OX40 humana.

9. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se ligar a OX40 humana em um epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em H153, I165 e E167 de OX40 humana.

10. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se ligar a OX40 humana em ou dentro da SEQ ID NO: 30.

11. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ter citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

12. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ter glicosilação reduzida ou nenhuma glicosilação ou estar hipofucosilado.

13. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender estruturas GlcNac bissectantes aumentadas.

14. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo domínio Fc ser de uma IgG1.

15. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo domínio Fc ser de uma IgG4.

16. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela IgG4 ter uma substituição

S228P (de acordo com o sistema de numeração EU).

17. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela IgG4 ter substituições S228P e R409K (de acordo com o sistema de numeração EU).

18. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por ter uma ou mais das seguintes propriedades: (i) ser capaz de reagir de forma cruzada com cyno OX40; (ii) não interferir na interação OX40-OX40L; (iii) ser capaz de co-estimular células T para produzir IL-2; (iv) ser capaz de co-ativar células T CD4+, particularmente, conforme medido em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR); (v) ser capaz de mediar ADCC, particularmente conforme medido em um ensaio ADCC baseado na liberação de lactato desidrogenase (LDH); (vi) ser capaz de esgotar Tregs CD4+; (vii) ser capaz de aumentar a razão Teff CD8+/ Treg; ou (viii) ser capaz de mediar a regressão parcial de tumores em um modelo de tumor animal.

19. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

20. MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER, caracterizado por compreender a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer de pele, mesotelioma, linfoma, leucemia, mieloma e sarcoma.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser administrado em combinação com outro agente terapêutico.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo agente terapêutico ser paclitaxel ou um agente de paclitaxel, docetaxel, carboplatina, topotecano, cisplatina, irinotecano, doxorrubicina, lenalidomida ou 5-azacitidina.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo agente terapêutico ser um agente de paclitaxel, lenalidomida ou 5- azacitidina.

25. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por codificar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

26. VETOR, caracterizado por compreender o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 25.

27. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 25 ou o vetor, conforme definido na reivindicação 26.

28. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 27, e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a partir da cultura.

29. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por ser para uso no tratamento ou redução da probabilidade de: câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer de pele, mesotelioma, linfoma, leucemia, mieloma e sarcoma.

30. REAGENTE DE DIAGNÓSTICO, caracterizado por compreender o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, o qual é marcado.

31. REAGENTE DE DIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo marcador ser selecionado a partir do grupo que consiste em um radiomarcador, um fluoróforo, um cromóforo, um agente de imagem e um íon metálico.