BR112020022516A2

BR112020022516A2 - processo para degomagem enzimática de óleo

Info

Publication number: BR112020022516A2
Application number: BR112020022516-9A
Authority: BR
Inventors: Ying Zha; Arjen Sein; Willem Bijleveld
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2021-02-09
Also published as: WO2019215078A1; EP3790946B1; CN112424326A; US11999923B2; EA202092612A1; US20210371770A1; UA126992C2; EP3790946A1; AR114877A1; CA3097285A1

Abstract

processo para degomagem enzimática de óleo. a presente invenção se refere a um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo, o qual compreende incubar o óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase a1, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da seq id no: 1.

Description

“PROCESSO PARA DEGOMAGEM ENZIMÁTICA DE ÓLEO” Campo

[0001] A presente invenção se refere a um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios em um óleo de triacilglicerídeo com o uso de uma enzima que tem atividade de fosfolipase A1. Antecedentes

[0002] Óleos vegetais brutos obtidos a partir de métodos de prensagem ou extração de solvente são uma mistura complexa de triacilgliceróis, fosfolipídios, esteróis, tocoferóis, ácidos graxos livres, metais-traço e outros compostos secundários. Em processamento de óleo de soja, a semente da soja pode ser primeiramente floculada antes da extração de hexano para obter um óleo de floco. Em outro processo comumente conhecido, a semente é primeiramente tratada por um expansor antes da extração, resultando em um óleo de expansor. O último geralmente resulta em um maior rendimento de óleo, porém também a um maior teor de fosfolipídio. Durante a preparação de outros óleos, como óleo de canola ou colza, as sementes são primeiramente prensadas, resultando em uma fração de óleo prensado. A torta de prensa pode ser adicionalmente tratada com um solvente para produzir uma fração de óleo extraído e as duas frações combinadas são conhecidas como óleo bruto para canola, colza ou girassol.

[0003] É desejável remover os fosfolipídios, os ácidos graxos livres e os metais-traço para produzir um óleo comestível de alta qualidade. Os processos mais comumente usados na indústria são degomagem aquosa ou a úmido, degomagem ácida, refino cáustico e degomagem ou refino enzimático. Em geral, a remoção de fosfolipídios gera a maioria das perdas associadas à degomagem de óleos vegetais. Já que a maioria das moléculas de fosfolipídio possuem tanto um grupo funcional hidrofílico quanto uma porção química lipofílica que consiste em um glicerol com duas cadeias de ácido graxo, elas tendem a ser excelentes emulsificantes naturais. Portanto, é desejável hidrolisar fosfolipídios em suas formas liso- ou fósforo (glicerofosfato) e então reduzir a propriedade emulsificante. Os principais fosfolipídios em óleos vegetais são fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidil inositol (PI) e ácido fosfatídico (PA).

[0004] Vários processos são conhecidos para a degomagem enzimática ou para o refino enzimático de óleos vegetais, com o uso de enzimas com atividade de fosfolipase, como atividade de fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase C ou fosfatidil inositol fosfolipase C.

[0005] O documento WO9705219 revela um processo para reduzir o teor de componentes contendo fósforo em óleos vegetais com o uso de uma mistura de enzimas fosfolipase de Aspergillus niger, que compreende uma atividade de fosfolipase A2 e / ou fosfolipase A1 e uma atividade de lisofosfolipase.

[0006] O documento EP0575133 ensina sobre uma enzima fosfolipase A1 (PLA1) de uma cepa de Aspergillus oryzae e uma cepa de Aspergillus niger e sobre o uso dessas fosfolipases para preparar lisofosfolipídios de um substrato de fosfolipídio, por exemplo, derivado de animais, plantas e microrganismos. O documento EP0575133 revela que a atividade residual da PLA1 de A. niger, após um tratamento térmico a 70 °C, era apenas cerca de trinta por cento (30 %)

da atividade residual após um tratamento térmico a 50 °C e 60 °C. A PLA1 de A. oryzae não exibiu nenhuma atividade após um tratamento térmico a 70 °C. O documento EP0575133 não ensina um processo para degomagem enzimática de um óleo comestível.

[0007] O documento US20160289658 revela um derivado de fosfolipase de Talaromyces leycettanus. Essa fosfolipase mostrou uma termoestabilidade relativamente alta e mostrou uma maior atividade a 70 °C do que a preparação enzimática comercial Lecitase Ultra.

[0008] O documento WO2011/051322 revela uma fosfolipase de Aspergillus fumigatus, que hidrolisou fosfolipídios em óleo de soja a uma temperatura de 55 °C e 60 °C.

[0009] Há uma necessidade de um processo aprimorado para reduzir o teor de fosfolipídios em um óleo de tricacilglicerídeo com o uso de fosfolipases que são ativas em uma ampla faixa de temperatura. Sumário

[0010] A presente invenção se refere a um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo, o qual compreende incubar o óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1, em que a fosfolipase A1 compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1. Constatou-se que a fosfolipase A1 que tem pelo menos 80 % de identidade com o aminoácido maduro da SEQ ID NO: 1 era capaz de reduzir pelo menos 85 % dos fosfolipídios originalmente presentes em um óleo de triacilglicerídeo em uma ampla faixa de temperatura de 55 °C a 70 °C em 4 h. Uma fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento é uma fosfolipase A1 que hidrolisa pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou pelo menos 90 % da quantidade de fosfolipídios intactos originalmente presentes em um óleo de triacilglicerídeo quando incubado com o óleo em uma quantidade de 0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo a uma temperatura dentre 55 °C, 60 °C, 65 °C e 70 °C por 4 h. Definições

[0011] Um “polipeptídeo maduro” é definido no presente documento como um polipeptídeo em sua forma final e é obtido após a tradução de um mRNA em polipeptídeo e modificações pós-traducionais do dito polipeptídeo. Modificações pós- traducionais incluem processamento de terminal N, truncamento de terminal C, glicosilação, fosforilação e remoção de sequência líder, como peptídeos de sinal, propriedades e/ou pré-propriedades por clivagem.

[0012] Um fosfolipídio também é indicado como um glicerofosfolipídio. Um fosfolipídio como usado no presente documento é um fosfolipídio “intacto” e compreende uma cadeia principal de glicerol que compreende dois ácidos graxos e um ácido fosfórico. Um fosfolipídio também é indicado como diacilglicerídeo que compreende um grupo fosfato.

[0013] Um lisofosfolipídio é uma cadeia principal de glicerol que compreende apenas um grupo acila (ácido graxo) e um grupo fosfato. Um lisofosfolipídio pode ser formado após a remoção de um grupo acila a partir de fosfolipídios pela ação de uma fosfolipase A1 e / ou uma fosfolipase A2.

[0014] A terminologia óleo de triacilglicerídeo e óleo de triglicerídeo é usada de modo alternado no presente documento. Um triglicerídeo é um éster derivado de glicerol e três ácidos graxos. Um óleo de triacilglicerídeo pode ser um óleo comestível e / ou um óleo usado como um biodiesel.

[0015] Identidade de sequência ou homologia de sequência é usada intercambiavelmente no presente documento. Para determinar a percentagem de homologia de sequência ou identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos. A identidade de sequência é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências ao longo da região alinhada relatada. O percentual de identidade de sequência entre as duas sequências de aminoácidos ou entre as duas sequências de nucleotídeos pode ser determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas dentre as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os propósitos da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I. e Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp.276—

277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Os parâmetros opcionais usados têm uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos. Após o alinhamento pelo programa NEEDLE, conforme descrito acima, a percentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada do seguinte modo: Número de posições correspondentes no alinhamento apresentando um aminoácido idêntico ou nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é etiquetada na saída do programa como “identidade mais longa”.

[0016] As sequências de proteínas reveladas no presente documento podem ser adicionalmente usadas como uma "sequência de consulta", para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas com o uso dos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403—10. Pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas BLAST de proteínas são realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da invenção. Para obter alinhamentos com lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Quando são usados os programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser usados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Consulte a página principal (homepage) do Centro Nacional de Informação em Biotecnologia em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0017] O termo “variante” pode se referir a polipeptídeos ou ácidos nucleicos. As variantes incluem substituições, inserções, deleções, truncamentos, transversões e/ou inversões, em uma ou mais localizações relativas a uma sequência de referência. As variantes podem ser feitas, por exemplo, por mutagênese de saturação de sítio, mutagênese de varredura, mutagênese de inserção, mutagênese aleatória, mutagênese de sítio dirigido e evolução dirigida, bem como várias outras abordagens de recombinação conhecidas a uma pessoa versada na técnica. Os genes variantes de ácidos nucleicos podem ser sintetizados artificialmente por técnicas conhecidas na técnica. Descrição detalhada

[0018] A presente invenção se refere a um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo, o qual compreende incubar o óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1. Um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1 pode ser um polipeptídeo que é capaz de reduzir, ou reduz, pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou pelo menos 90 % dos fosfolipídios originalmente presentes no óleo quando a fosfolipase A1 é incubada com o óleo em uma quantidade de 0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo a uma temperatura de 55 °C, 60 °C, 65 °C e / ou 70 °C por 4 h, por exemplo, em processo como revelado no presente documento.

[0019] O polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 em um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo como revelado no presente documento pode ser um polipeptídeo que é capaz de reduzir, ou reduz, pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 % ou pelo menos 85 % de fosfolipídios originalmente presentes no óleo quando a fosfolipase A1 é incubada com o óleo em uma quantidade de 0,1 – 0,4, como 0,2 – 0,3, ou 0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo a uma temperatura de 55 °C, 60 °C, 65 °C e / ou 70 °C por 4 h. O óleo pode compreender adicionalmente 500 ppm de ácido cítrico e 3 % em peso de água.

[0020] Surpreendentemente, constatou-se que um polipeptídeo que tem uma atividade de fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento foi capaz de reduzir, ou reduz, pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou pelo menos 90 %, por exemplo, de 85 % a 99 %, como de 86 % a 98 %, como de 87 % a 97 %,

como de 88 % a 96 %, como entre 89 % e 95 %, como entre 90 %, e 94 % de fosfolipídios originalmente presentes em um óleo a uma ampla faixa de temperatura dentre 55 °C e 70 °C. Uma fosfolipase A1 como revelado no presente documento pode ser incubada com o óleo a uma faixa de temperatura de 55 °C a 70 °C durante um período de 4 h.

[0021] Em uma modalidade, um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos como revelado no presente documento é um processo em que a quantidade de fosfolipídios intactos que é reduzida é de pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou pelo menos 90 %, por exemplo, de 85 % a 99 %, como de 86 % a 98 %, como de 87 % a 97 %, como de 88 a 96 %, como de 89 % a 95 %, como de 90 % a 94 % da quantidade de fosfolipídios intactos originalmente presentes no óleo. Surpreendentemente, constatou-se que a quantidade de fosfolipídios intactos foi reduzida a uma temperatura de 55 °C, 60 °C, 65 °C e / ou a uma temperatura de 70 °C após incubar o óleo com uma fosfolipase A1 em uma quantidade de 0,1 a 0,4 mg de proteína ativa / kg de óleo, como 0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo após 4 h de incubação.

[0022] Os componentes de fósforo, como fosfolipídios, lisofosfolipídios e ésteres de fosfato podem ser determinados com o uso de 31P-RMN e / ou HPLC, por exemplo, como revelado na seção de materiais e métodos.

[0023] Um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 como usado no presente documento é uma fosfolipase A1 de acordo com a classificação enzimática E.C. 3.1.1.32. A fosfolipase A1 é uma enzima que cliva um fosfolipídio na posição SN1, formando um lisofosfolipídio e um ácido graxo.

Uma fosfolipase A1 como usado no presente documento também pode clivar um lisofosfolipídio na posição SN1, formando um glicerofosfato e um ácido graxo. A terminologia “fosfolipase A1” e “polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1” é usada de modo alternado no presente documento. Um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 como revelado no presente documento não tem atividade de fosfolipase A2.

[0024] A incubação de um óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento compreende converter fosfolipídios no óleo em lisofosfolipídios, e ácidos graxos livres. A incubação de um óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento pode compreender adicionalmente converter fosfolipídios e/ou lisofosfolipídios no óleo em lisofosfolipídios e / ou glicerofosfatos, e ácidos graxos livres.

[0025] A incubação de um óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento pode ser realizada a um valor de pH de 2 a 8, por exemplo, de 3 a 7, por exemplo, de 4 a 6.

[0026] A incubação de um óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 pode ser realizada na presença de um ácido. Consequentemente, um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo como revelado no presente documento compreende adicionar um ácido de tal modo que a quantidade de ácido no óleo seja de 100 a 1000 ppm de ácido, como de 200 a 900 ppm de ácido, por exemplo, de 300 a 800 ppm de ácido, por exemplo, de 400 a 600 ppm de ácido. Um ácido adequado usado em um processo como revelado no presente documento pode compreender ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido tartárico e / ou ácido succínico, e qualquer mistura adequada dos mesmos.

[0027] Usualmente água está presente em um processo como revelado no presente documento. Um processo como revelado no presente documento pode compreender adicionalmente adicionar água ao óleo, por exemplo, uma quantidade de água é adicionada de tal modo que uma quantidade de 0,5 a 5 % em peso, como uma quantidade de 1 a 4 % em peso, como uma quantidade de 2 a 3 % em peso de água está presente no óleo em um processo como revelado no presente documento.

[0028] A incubação de um óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 pode ser realizada a uma temperatura de 40 °C a 75 °C, por exemplo, uma temperatura de 45 °C a 70 °C como uma temperatura de 50 a 65 °C.

[0029] Um período adequado para incubar um óleo comestível com uma fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento é de 0,5 a 10 h, como de 1 a 8 h, ou de 2 a 6 h.

[0030] O óleo é incubado com uma quantidade adequada de fosfolipase A1. Uma quantidade adequada de fosfolipase é tal que pelo menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % ou pelo menos 95 % da quantidade de fosfolipídios intactos originalmente presentes em um óleo de triacilglicerídeo seja reduzida após 4 horas de incubação a uma temperatura de 55 °C a 70 °C. Por exemplo, uma quantidade de 0,02 a 3 mg de proteína PLA1 ativa / kg de óleo, por exemplo, entre 0,05 a

1 mg de proteína PLA1 ativa / kg de óleo, por exemplo, entre 0,1 a 0,8 mg de proteína PLA1 ativa / kg de óleo, por exemplo, de 0,15 a 0,5 mg de proteína PLA1 ativa / kg de óleo, por exemplo, de 0,2 a 0,4 mg de proteína PLA1 ativa / kg de óleo.

[0031] Uma fosfolipase A1 pode ser derivada de qualquer organismo adequado, por exemplo, de fungos. Fungos adequados incluem fungos filamentosos, como Aspergillus, Talaromyces, Trichoderma, e levedura, como Pichia, Saccharomyces, por exemplo, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Talaromyces emersonii, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae. Um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 pode ser derivado de Aspergillus niger.

[0032] Uma fosfolipase A1 usada em um processo como revelado no presente documento pode compreender um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1, como pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1. Um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 pode compreender ou conter a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1 compreende ou contém aminoácidos 30 a 298 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO:1 também pode compreender ou conter aminoácidos 29 a 297 da SEQ ID NO: 1, por exemplo, aminoácidos 28 a 296 da SEQ ID NO: 1, por exemplo, aminoácidos 31 a 298 da SEQ ID NO: 1, por exemplo, aminoácidos 32 a 297 da SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos maduros também pode compreender um ou mais aminoácidos adicionais no terminal C da SEQ ID NO: 1.

[0033] Uma fosfolipase A1 usada em um processo como revelado no presente documento pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou um polipeptídeo variante.

[0034] Uma fosfolipase A1 pode ser produzida em qualquer célula hospedeira adequada útil para produzir um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 como revelado no presente documento, por exemplo, uma célula procariótica ou eucariótica. Uma célula hospedeira eucariótica pode ser uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

[0035] Uma célula fúngica pode ser, por exemplo, uma célula de levedura ou uma célula de fungo filamentoso, por exemplo, uma célula de Saccharomyces sp. Pichia, Aspergillus sp. Trichoderma sp., como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride. As técnicas de biologia molecular conhecidas por uma pessoa versada são realizadas de acordo com Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 2001.

[0036] Uma célula hospedeira útil para produzir uma fosfolipase A1 como revelado no presente documento é cultivada em um meio de fermentação adequado que permite a expressão da fosfolipase A1. Uma pessoa versada na técnica sabe como realizar um processo para preparar um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 dependendo da célula hospedeira usada. Um meio de fermentação adequado usualmente compreende um carbono e uma fonte de nitrogênio. Usualmente, um meio de fermentação tem um valor de pH entre 4 e 8. Uma temperatura adequada em que uma célula hospedeira é cultivada está usualmente entre 25 e 60 °C. A fosfolipase A1 pode ser recuperada a partir do meio de fermentação por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por centrifugação, filtração e / ou ultrafiltração.

[0037] Uma fosfolipase A1 em um processo como revelado no presente documento pode ser uma composição que compreende a fosfolipase A1 como revelado no presente documento, por exemplo, uma composição aquosa ou uma composição sólida que compreende uma fosfolipase A1 como revelado no presente documento. Uma composição pode ser um caldo de fermentação, como um caldo de fermentação a partir do qual células e / ou outros componentes foram removidos, por exemplo, por centrifugação, filtração ou ultrafiltração.

[0038] Uma fosfolipase A1 também pode ser uma fosfolipase A1 pura ou isolada, isto é, um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1 que é removido de pelo menos um componente, por exemplo, outro material de polipeptídeo com o qual é naturalmente associado.

[0039] Fosfolipídios em um óleo de triacilglicerídeo compreendem ácido fosfatídico (PA), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidil inositol (PI), e fosfatidilcolina (PC). Surpreendentemente, constatou-se que o teor ou a quantidade desses quatro fosfolipídios foi reduzida em um processo como revelado no presente documento.

[0040] Em uma modalidade, um processo como revelado no presente documento compreende uma etapa de adicionar um ácido ao óleo. Um ácido adequado que pode ser adicionado ao óleo compreende ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido tartárico e / ou ácido succínico e qualquer mistura adequada do mesmo.

[0041] Ainda em qualquer outra modalidade, um processo como revelado no presente documento compreende adicionar um cáustico ao óleo. Um cáustico adequado pode ser, por exemplo, hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio, silicato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de cálcio, bicarbonato de sódio, amônia, citrato de sódio ou qualquer combinação adequada do mesmo.

[0042] A adição de um ácido, água e / ou cáustico pode ser realizada durante qualquer etapa adequada em um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo como revelado no presente documento. A adição de ácido, água e / ou cáustico pode ser realizada antes, durante ou após a incubação do óleo com a fosfolipase. Preferencialmente, a adição de ácido, água e / ou cáustico é realizada antes da incubação do óleo com uma fosfolipase A1. A adição de cáustico pode ser realizada antes ou após a adição de ácido, por exemplo, a adição de cáustico pode ser realizada após adicionar o ácido.

[0043] Um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo como revelado no presente documento pode compreender adicionalmente uma etapa de precondicionar o óleo na presença de um ácido e / ou um cáustico. Um ácido e / ou um cáustico é / são como definido no presente documento acima. O precondicionamento compreende incubar o óleo na presença de um ácido e / ou um cáustico a uma temperatura de 50 °C a 75 °C, por exemplo, uma temperatura de 55 °C a 70 °C. O precondicionamento pode ser realizado durante 1 min a 2 h, por exemplo, de 5 min a 1 h, por exemplo, de 10 min a 40 min.

[0044] Em uma modalidade, um processo como revelado no presente documento compreende adicionalmente incubar o óleo com uma enzima que tem atividade de fosfolipase C, uma enzima que tem atividade de fosfatidilinositol (PI)-fosfolipase C e / ou uma enzima que tem atividade de fosfolipase A2.

[0045] Uma fosfolipase C (PLC) pode ser uma enzima de número de classificação enzimática EC 3.1.4.3 que cliva fosfolipídios entre o grupo fosfato e o grupo glicerol, resultando em um diglicerídeo e um composto de fosfato como fosfato de colina ou fosfato de etanolamina. Uma PLC é conhecida, por exemplo, a partir dos documentos WO2005/086900, WO2012/062817 ou WO2016/162456. Uma PLC pode ser um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, a qual também é revelada na p. 196 do documento WO2005/086900. Uma fosfolipase C pode ser um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[0046] Uma fosfolipase C também pode ser uma fosfatidilinositol fosfolipase C (PI-PLC). Uma PI-PLC tem uma preferência por clivar fosfatidilinositol e também pode agir em outros fosfolipídios como fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. A PI-PLC bacteriana pertence à classificação enzimática EC 4.6.1.13. Uma enzima PI-PLC adequada é, por exemplo, revelada no documento WO2011/046812. Uma PI-PLC adequada pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, a qual corresponde à SEQ ID NO: 8 revelada no documento WO2011/046812. Uma fosfatidil inositol fosfolipase C pode ser um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

[0047] Uma fosfolipase A2 (PLA2) libera ácidos graxos do segundo grupo carbono de glicerol e pertence à classificação enzimática EC 3.1.1.4. A PLA2 pode ser, por exemplo, PLA2 de pâncreas de porco, a qual pode ser expressa em um organismo anfitrião adequado, por exemplo, uma espécie de Aspergillus, como Aspergillus niger.

[0048] Um processo como revelado no presente documento pode compreender adicionalmente separar componentes contendo fósforo do óleo. A separação dos componentes contendo fósforo pode ser realizada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por centrifugação. Os componentes contendo fósforo compreendem fosfolipídios, lisofosfolipídios e glicerofosfatos.

[0049] Qualquer óleo de triacilglicerídeo adequado pode estar presente ou ser usado em um processo para reduzir os fosfolipídios em um óleo comestível em um processo como revelado no presente documento. Um óleo de triacilglicerídeo pode ser um óleo comestível bruto ou um óleo comestível degomado com água. O óleo bruto, também chamado óleo não degomado, se refere a um óleo prensado ou extraído. O óleo pode ser um óleo vegetal ou de planta, óleo animal, óleo de peixe ou óleo de algas. Um óleo vegetal pode ser qualquer óleo adequado, por exemplo, óleo de soja, óleo de colza, óleo de canola, óleo de girassol, óleo de palma, óleo de palmiste, óleo de coco, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de farelo de arroz, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de nozes, como óleo de amêndoa, noz, amendoim ou uma mistura dos mesmos. Um processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo também pode ser indicado como uma degomagem de óleo ou como um processo de refino de óleo.

[0050] Um óleo vegetal bruto pode compreender entre 1 e 2000 ppm, como entre 1 e 1000 ppm de fósforo atômico. A quantidade de fósforo atômico é indicativa da quantidade de fosfolipídios.

[0051] Também é revelado no presente documento um óleo de triacilglicerídeo que compreende um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com uma sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1. Um óleo de triacilglicerídeo pode ser obtenível por um processo como revelado no presente documento. Todas as modalidades reveladas no presente documento acima para um processo como revelado no presente documento são aplicáveis para o óleo de triacilglicerídeo como revelado no presente documento.

[0052] Um óleo como revelado no presente documento pode compreender adicionalmente um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C, um polipeptídeo que tem atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C (PI-PLC) e / ou um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A2. Um óleo como revelado no presente documento pode compreender adicionalmente um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C que tem pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, um polipeptídeo que tem atividade de fosfatidil inositol fosfolipase C que tem pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e / ou uma fosfolipase A2 de pâncreas de porco.

FIGURA

[0053] Figura 1. Apresentação esquemática do plasmídeo pGBTOPPLA-1 usado para a expressão da enzima PLA1 de A. niger.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS Técnicas de biologia molecular

[0054] As técnicas de biologia molecular conhecidas por uma pessoa versada são realizadas de acordo com Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 2001. A reação de cadeia de polimerase (PCR) é realizada em um termociclo com DNA polimerase de Alta Fidelidade para Phusion (Finnzymes OY, Aspoo, Finlândia) de acordo com as instruções do fabricante. Enzimas

[0055] Purifine® PLC/PI-PLC é uma mistura de enzimas que compreende uma fosfolipase C (SEQ ID NO 3) e uma fosfatidilinositol fosfolipase C (SEQ ID NO: 4). Purifine® 3G é uma mistura de enzimas que compreende uma fosfolipase C (SEQ ID NO: 3), uma fosfatidilinositol fosfolipase C (SEQ ID NO: 4) e uma fosfolipase A2 (PLA2 de pâncreas de porco) que estão comercialmente disponíveis junto à DSM.

[0056] Lecitase Ultra da Novozymes, uma fosfolipase A de Fusarium oxysporum, era da Sigma Aldrich.

[0057] Rohalase PL XTRA, uma fosfolipase A de Aspergillus fumigatus, foi obtida junto à AB Enzymes. Construção de cepa

[0058] Uma cepa de A. niger (depositada no Instituto CBS sob o número de depósito CBS 513.88) que compreende uma deleção do gene que codifica glicoamilase (glaA) e uma deleção do gene pepA foi construída de acordo com a abordagem como descrito no documento EP 0 635 574 B1 e van den Hombergh et al. (1997) Eur J Biochem. 247(2): 605-13), respectivamente. Subsequentemente, uma cepa de A. niger deficiente em oxalato foi construída a partir da cepa de A. niger que compreende ΔglaA, ΔpepA, de acordo com a abordagem descrita no documento WO2004/070022, resultando em um A. niger que compreende uma deleção do gene glaA, pepA e oahA (ΔglaA, ΔpepA, ΔoahA). Construção de PLA1 produzindo cepas de Aspergillus niger

[0059] A enzima PLA1 de A. niger (com uma sequência de codificação como mostrada na SEQ ID NO: 2, e uma sequência de proteínas como mostrado na SEQ ID NO: 1) foi selecionada para expressão enzimática na cepa de A. niger (ΔglaA, ΔpepA, ΔoahA).

[0060] O gene que codifica PLA1 foi produzido por síntese genética e clonado em um vetor de expressão pGBTOP-12 de A. niger com o uso das técnicas descritas nos documentos WO 98/46772 e WO 99/32617, sob o controle do promotor de glicoamilase, produzindo um vetor de expressão pGBTOPPLA-1 de A. niger (Figura 1), com o uso das mesmas técnicas descritas nos documentos WO 98/46772 e WO 99/32617.

[0061] Cepas que produzem enzima para a enzima PLA1 foram construídas por cotransformação da cepa de A. niger (ΔglaA, ΔpepA, ΔoahA), com o gene marcador selecionável amdS contendo o vetor pGBAAS-1 e o vetor pGBTOPLA-1, e por seleção subsequente de transformantes. O procedimento de transformação e contrasseleção (como descrito nos documentos WO98/46772 e WO99/32617), sucedido pela seleção de cepas,

resultou em cepas (multicópia) produtoras de proteína PLA1. Dentre todos os transformantes de pGBTOPPLA-1, 1 cepa produtora de enzima de alta cópia no background (ΔglaA, ΔpepA, ΔoahA) foi selecionada, adicionalmente submetida à réplica de placas para obter um inóculo de cepa única e denominada cepa PLA1-1. A cepa PLA1-1 foi usada como a respectiva cepa produtora de PLA1 em experimentos subsequentes. Fermentações de frasco de agitação de A. niger para produção de PLA1

[0062] Esporos de PLA1-1 de A. niger frescos foram preparados. Quatro frascos de agitação de 100 ml com 20 ml de meio de fermentação 1 (10 % em p/v de Sólidos de Milhocina, 1 % em p/v de glicose.H2O, 0,1 % em p/v de NaH2PO4.H2O, 0,05 % em p/v de MgSO4.7H2O, 0,025 % em p/v de Basildon, pH 5,8) em frascos de agitação de 500 ml com defletor foram inoculados com 107 esporos. Essas preculturas foram incubadas a 34 °C e 170 rpm por 16-24 horas. A partir das preculturas, 10-15 ml foram usados para inoculação de 500 ml frascos de agitação com 100 ml de meio de fermentação 2 (15 % em p/v de maltose, 6 % em p/v de bacto-soytone, 1,5 % em p/v de (NH4)2SO4, 0,1 % em p/v de NaH2PO4.H2O, 0,1 % em p/v de MgSO4.7H2O, 0,1 % em p/v de L-arginina, 8 ‰ em p/v de Tween-80, 2 ‰ de p/v de Basildon, 2 % em p/v de MES pH 5,1) a 34 °C e 170 rpm. Após sete dias de cultivo, as células foram exterminadas adicionando-se 3,5 g/l de benzoato de sódio e mantendo-as a 30 °C por seis horas. Subsequentemente, 10 g/l de CaCl2 e 45 g/l de Perlite C25 foram adicionados ao caldo de cultura. A filtração foi realizada em uma etapa com o uso de tecido filtrante e filtros DE60/EKS P e K250 (Pall).

A torta de filtro remanescente no filtro foi lavada com 1,1 l de água milliQ estéril. A filtração estéril subsequente foi realizada com o uso de 0,22 m de GP Express PLUS Membrane (Millipore). O filtrado que compreende PLA1 foi usado nos exemplos. Ensaio de atividade de fosfolipase A1 (PLA1)

[0063] As soluções a seguir foram preparadas: 1) Solução de substrato: 1 g de L-α-fosfatidilcolina de gema de ovo (Sigma P3556, Zwijndrecht, Holanda) em solução de Triton X-100 a 2 %. 2) tempão de acetato 0,2 M, pH 4,5 3) Solução de parada: HCl 1 M

[0064] Uma mistura de solução 1 de 500 µl e solução 2 de 300 µl foi equilibrada a 37 °C. A reação foi iniciada adicionando-se 100 µl de solução enzimática com atividade entre 0,05-1,0 U/ml. Após 10 min de incubação a 37 °C, a reação foi interrompida adicionando-se 100 µl da solução 3. Uma medição em branco foi adicionalmente feita incubando-se o substrato sem amostra por 10 minutos a 37 °C. Após adicionar 100 µl do reagente de parada, 100 µl de amostra foram adicionados. A quantidade de ácido graxo livre formado na amostra e no branco foi determinada seguindo as instruções descritas no inserto de pacote do kit de diagnóstico NEFA- HR da série Wako HR (2) (http://www.wakodiagnostics.com/r_nefa.html). A atividade é calculada como a seguir: = ΔFFA = FFA em amostra – FFA em branco (µmol/ml) Vt = volume total após interromper a reação

(1 ml) Vs = volume de amostra (0,1 ml) t = tempo de incubação (10 minutos) df = fator de diluição de amostra

[0065] 1 U é definida como a quantidade de enzima que libera um micromol de ácido graxo livre por minuto sob as condições do teste. Ensaio de atividade de fosfolipase C (PLC)

[0066] A solução de substrato consistia em pNP-nitrofenil fosforilcolina a 10 mM (artigo N83020 da Melford Laboratories Ltd, Ipswich, Reiuno Unido), tampão de MOPS a 100 mM, pH 7,3, Triton X-100 a 0,2 % e ZnSO4 a 1 mM. Uma mistura de 40 µl de amostra (com atividade entre 0,03 - 0,1 U/ml) e 960 µl de solução de substrato foi incubada a 37 °C por 30 min. A reação foi interrompida adicionando-se 1000 µl de reagente de parada contendo TRIS 1 M e EDTA a 50 mM ajustada a um pH 10 com NaOH 0,5 M. Um branco foi feito adicionando-se o reagente de parada antes da amostra de enzima. A densidade óptica (OD) de amostras e brancos foram medidos a 405 nm.

[0067] A calibração foi realizada preparando-se soluções de pNP de respectivamente 0 - 0,5 - 1,0 - 2,0 - 2,9 - 4,0 mM no tampão mencionado acima. 40 µl de cada solução padrão foram misturados com 960 µl de substrato e 1000 µl de reagente de parada. A OD de cada solução foi medida a 405 nm. Com o uso de regressão linear, a inclinação da linha de calibração foi calculada.

[0068] A atividade foi calculada com o uso da fórmula a seguir: = ∗inclinação

Abs = (Aamostra - Abranco) df = fator de diluição de amostra inclinação = inclinação da curva de calibração de p-nitro-fenol (ml/µmol) t = tempo de ensaio de incubação (30 min)

[0069] Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que libera 1 µmol de p-nitrofenol por minuto sob as condições do teste (pH 7,3, 37 °C). Ensaio de atividade de fosfatidil-inositol fosfolipase (PI- PLC)

[0070] A solução de substrato consistia em Mio-inositol- 1-fosfato de 4-metilumbeliferila a 20 mM, N-metil-morfolina (BioSynth M-5717, Bruxelas, Bélgica) dissolvida em tampão de fosfato de Na a 200 mM, pH 7,5, contendo também Triton X-100 a 0,1 %. 140 µl de substrato foram equilibrados a 37 °C. A reação foi iniciada adicionando-se 10 µl de amostra com atividade entre 0,2 e 1,0 U/ml. Durante a incubação a 37 °C, a alteração na absorção foi medida a 380 nm contra um branco de amostra. A inclinação (deltaOD/tempo) da parte linear da curva é usada como uma medida para a atividade.

[0071] A calibração foi realizada preparando-se soluções de 4-Metilumbeliferona de respectivamente 0 – 1,0 - 2,0 - 3,0 – 4,0 - 5,0 mM em tampão de fosfato a 200 mM. 10 µl de cada solução padrão foram misturados com 140 µl de substrato. A OD de cada solução foi medida a 380 nm. Com o uso de regressão linear, a inclinação da linha de calibração foi calculada.

[0072] A atividade foi calculada com o uso da fórmula a seguir: U/ml = (ΔAbs/minamostra - ΔAbs/minbranco) x df/S ΔAbs/minamostra = alteração de absorbância por min de amostra ΔAbs/minbranco = alteração de absorbância por min de branco de tampão df = fator de diluição de amostra S = inclinação de curva de calibração de 4- Metilumbeliferona [ml/µmol]

[0073] Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que libera 1 µmol de 4-metilumbeliferona de Mio- inositol-1-fosfato de 4-metilumbeliferila a 18,7 mM durante um minuto a pH 7,5 e 37 °C. Determinação quantitativa de teor de fosfolipídios, lisofosfolipídios e glicerofosfato com o uso de 31P RMN

[0074] 500-1000 mg de óleo foram pesados precisamente em um frasco adequado, e aproximadamente 10 g de acetona fria foram adicionados e misturados completamente. A mistura de óleo-acetona foi mantida a 4 °C por pelo menos 30 min e então centrifugada por 10 min a 3000 rpm, sendo que posteriormente a fase líquida foi descartada. O pélete é ressuspenso em 500 µl de tampão (contendo 25 g de L-1 ácido desoxicólico, 5,84 g de L-1 EDTA e 10,9 g de L-1 TRIS, tamponados com o uso de KOH a pH 9,0) e 50 µl de uma solução padrão interna (contendo 10 g de L-1 tri-isopropilfosfato em tampão de extração) foram adicionados.

[0075] Espectros de 1D P31 RMN foram registrados em um espectrômetro Bruker Avance III HD, operando a uma frequência 31P de 161,97 MHz equipado com uma criossonda resfriada por nitrogênio, a uma temperatura de amostra de 300K. Um programa de pulso descontínuo inverso (ZGIG) com desacoplamento de próton Waltz16 foi usado, registrando 4 varreduras simuladas, e 128 varreduras por espectro, com ouso de um pulso de 90 graus. Um tempo de aquisição de 3,37 s e um tempo de espera de relaxação de 11,5 s foram usados.

[0076] As concentrações de analito foram calculadas em relação a tri-isopropilfosfato.

[0077] Um fator de correção foi aplicado para corrigir a relaxação incompleta de colinafosfato e etanolaminafosfato. Determinação quantitativa de diacilglicerol (DAG) em óleos

[0078] As classes de lipídio neutro foram separadas com cromatografia líquida de alta eficiência de fase normal (HPLC), e os diglicerídeos presentes goram determinados com um detector evaporativo de espalhamento de luz (ELSD). Esse método foi modificado a partir do método AOCS oficial Cd 11d-96. O teor é expresso com percentual (% em peso). EXEMPLO 1. Degomagem de óleo de soja e colza bruto a 55-70 °C com o uso de PLA1

[0079] Dois óleos de soja brutos dos processadores de semente de óleo norte-americanos e dois óleos de colza de processadores de semente de óleo europeus foram usados. 10 g de óleo foram pesados em um frasco e aquecidos a 70 °C, sendo que posteriormente ácido cítrico (como solução a 50 %) foi adicionado no óleo até que a concentração final de ácido cítrico em óleo fosse de 500 ppm. O frasco que contém óleo condicionado por ácido cítrico foi incubado a 70 °C por pelo menos 30 min.

[0080] Após a incubação, a temperatura foi ajustada e mantida a 55, 60, 65 e 70 °C. Quando a temperatura estava estável, PLA1 produzida como descrito acima (0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo (1,25 de unidade de PLA / g)) e água foram misturadas no óleo com o uso de Ultra Turrax. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso. A reação ocorreu por 4 horas enquanto o óleo foi mantido misturado com um agitador magnético a 800 ppm. As amostras foram obtidas após 4h de incubação e o teor de fosfolipídio (PL), isto é, ácido fosfatídico (PA), fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fosfatidil inositol (PI), analisado com o uso de 31P-RMN como descrito acima.

[0081] Os resultados das Tabelas 1 a 4 abaixo mostram que uma PLA1 como revelado no presente documento reduziu o teor dos quatro fosfolipídios PA, PC, PE e PI. Mais de 85 % da quantidade total de fosfolipídios (PL) originalmente presentes no óleo foram hidrolisados a temperatura de 55°C, 60 °C, 65 °C e 70°C após 4 horas de reação.

[0082] Tabela 1. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto antes e após incubação com fosfolipase A1. Óleo de soja bruto A

PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 207,0 901,0 603,2 499,7 2211,0 55 °C, 4h 15,5 28,7 18,7 19,6 82,4 60 °C, 4h 18,5 47,3 20,0 27,7 113,5 65 °C, 4h 17,9 46,3 21,6 26,1 111,9 70 °C, 4h 31,6 81,4 23,8 43,7 180,5

[0083] Tabela 2. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto antes e após incubação com fosfolipase A1.

Óleo de soja bruto B PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 179,9 450,5 374,0 285,1 1289,5 55 °C, 4h 14,7 21,4 17,7 13,4 67,2 60 °C, 4h <10 15,2 19,0 <10 34,2 65 °C, 4h 19,3 27,8 19,3 17,5 83,9 70 °C, 4h 18,2 29,7 21,4 17,5 86,7

[0084] Tabela 3. Teor de fosfolipídio em óleo de colza bruto antes e após a incubação com fosfolipase A1. Óleo de colza bruto A PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 477,4 762,3 334,0 444,2 2017,9 55 °C, 4h 43,7 29,2 29,8 21,2 123,8 60 °C, 4h 49,3 41,3 31,0 24,2 145,8 65 °C, 4h 58,8 42,2 29,7 24,2 154,9 70 °C, 4h 63,5 53,4 22,0 32,7 171,5

[0085] Tabela 4. Teor de fosfolipídio em óleo de colza bruto antes e após a incubação com fosfolipase A1. Óleo de colza bruto B PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 500,9 350,1 247,3 235,0 1333,2 55 °C, 4h 18,5 <10 18,2 <10 36,7 60 °C, 4h 24,2 <10 16,0 <10 40,3 65 °C, 4h 27,7 11,0 18,2 <10 56,8

Óleo de colza bruto B PA PC PE PI PL Total 70 °C, 4h 84,4 26,3 13,7 17,6 142,0 EXEMPLO 2. Comparação de desempenho entre PLA1 e fosfolipase A comercial a 55 °C

[0086] Óleo de soja bruto e óleo de soja degomado com água de processadores de semente de óleo norte-americanos foram usados. 10 g de óleo foram pesados em um frasco e aquecidos a 70 °C, sendo que posteriormente ácido cítrico (como solução a 50 %) foi adicionado no óleo até que a concentração final de ácido cítrico em óleo fosse de 500 ppm. O frasco que continha óleo condicionado por ácido cítrico foi incubado a 70 °C por pelo menos 30 min, e subsequentemente a temperatura foi ajustada e mantida a 55 °C.

[0087] Quando a temperatura estava estável, 25 ppm de PLA1 produzidos como descrito acima e água foram misturados no óleo com o uso de Ultra Turrax. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0088] Antes da incubação, o óleo que foi tratado com ácido cítrico e ajustado a 55 °C como descrito acima com fosfolipase A Lecitase Ultra e fosfolipase A Rohalase PL XTRA, NaOH 2M foi primeiramente adicionado no óleo até que uma concentração final de 138 ppm de NaOH em óleo fosse alcançada. Então, 25 ppm das enzimas comerciais e água foram misturados no óleo com o uso de Ultra Turrax, a concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0089] Após 4h de incubação a 55 °C durante mistura com um agitador magnético a 800 ppm, amostras foram obtidas e o teor de fosfolipídio, isto é, ácido fosfatídico (PA), fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fosfatidil inositol (PI), o teor de lisofosfolipídio, isto é, liso-PA (LPA), liso-PC (LPC), liso-PE (LPE) e liso-PI (LPI), e o teor de glicerofosfato, isto é, glicerol-PA (GPA), glicerol-PC (GPC), glicerol-PE (GPE) e glicerol- (GPI), foram determinados com o uso de 31P-RMN como descrito acima.

[0090] Os resultados das Tabelas 5 e 6 mostram que a PLA1 como revelado no presente documento alcançou um nível inferior de fosfolipídios PA, PC, PE e PI após 4 horas de reação em óleo de soja bruto e degomado com água, a 55°C com 25 ppm de dosagem do que as duas enzimas comerciais Lecitase Ultra e Rohalase PL XTRA, sob suas condições de reação ideais. Além disso, os resultados das Tabelas 5 e 6 mostram que a PLA1 como revelado no presente documento mostra atividade de liso-fosfolipase e converte todos os 4 lisofosfolipídios em glicerofosfato em óleo de soja bruto e degomado com água em uma maior quantidade do que as duas enzimas comerciais, Lecitase Ultra e Rohalase PL XTRA a 55°C. Já que a capacidade de emulsificação de glicerofosfato é menor que lisofosfolipídio, converter lisofosfolipídio em glicerofosfato pode melhorar, portanto, a eficiência de separação de óleo-goma na etapa de centrifugação.

[0091] Tabela 5. Teor de fosfolipídio, lisofosfolipídio e glicerofosfato em óleo de soja bruto antes e após a incubação com diferentes fosfolipases a 55 °C por 4 h Óleo de Soja Bruto

PL PA PC PE PI Total LPA LPC LPE LPI GPA GPC GPE GPI µmol / 100 g de óleo

Óleo de Soja Bruto

PL PA PC PE PI Total LPA LPC LPE LPI GPA GPC GPE GPI tempo 0 250 561 543 344 1699 106 132 83 < < < < < PLA1 < 57 < < 57 204 478 389 265 140 228 164 87 Lecita se® Ultra < 101 52 149 302 257 525 403 173 57 62 73 < Rohala se® PL XTRA 114 201 163 121 599 245 517 382 255 < 48 < <

[0092] Tabela 6. Teor de fosfolipídio, lisofosfolipídio e glicerofosfato em óleo de soja degomado com água antes e após a incubação com diferentes fosfolipases a 55 °C por 4 h Óleo de soja degomado com água

PL PA PC PE PI Total LPA LPC LPE LPI GPA GPC GPE GPI µmol / 100 g de óleo tempo 0 123 191 134 100 547 < 59 < < < < < < PLA1 < < < < 0 93 148 99 71 41 72 48 < Lecitase < < < 52 52 107 179 110 75 < < < < ® Ultra Rohalase ® PL < < < < 0 96 155 97 85 < < < <

XTRA EXEMPLO 3. Comparação de desempenho entre PLA1 e fosfolipase A comercialmente disponível em óleo de soja bruto a uma temperatura de 55, 60 e 65 °C

[0093] Óleo de soja bruto de processadores de semente de óleo norte-americanos foi usado. 10 g de óleo foram pesados em um frasco e aquecidos a 70 °C, sendo que posteriormente ácido cítrico (como solução a 50 %) foi adicionado no óleo até que a concentração final de ácido cítrico em óleo fosse de 500 ppm. O frasco que continha óleo condicionado por ácido cítrico foi incubado a 70 °C por pelo menos 30 min.

[0094] Após incubação, a temperatura foi ajustada e mantida a 55 °C, 60 °C e 65 °C. Quando a temperatura estava estável, PLA1 (0,25 mg de proteína ativa / kg de óleo) produzida como descrito acima e água foram misturadas no óleo com o uso de Ultra Turrax. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0095] Para a comparação com Lecitase Ultra e Rohalase PL XTRA, NaOH 2M foi primeiramente adicionado no óleo condicionado por ácido cítrico até que uma concentração final de 138 ppm de NaOH em óleo fosse alcançada, para obter a condição ideal para essas enzimas. Subsequentemente, Lecitase Ultra ou Rohalase PL XTRA (0,25 mg de proteína ativa / kg de óleo) e água foram misturadas no óleo com o uso de Ultra Turrax. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0096] A reação ocorreu por 4 horas enquanto o óleo foi mantido misturado com um agitador magnético a 800 ppm. As amostras foram obtidas após 4h de incubação e o teor de fosfolipídio, isto é, ácido fosfatídico (PA), fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fosfatidil inositol (PI), analisado com o uso de 31P-RMN como descrito acima.

[0097] Os resultados das Tabelas 7 a 9 abaixo mostram que a PLA1 de A. niger como revelado no presente documento alcançou um nível inferior de fosfolipídios PA, PC, PE e PI a 55°C, 60 °C, 65 °C após 4 horas de reação em óleo de soja bruto do que as enzimas comerciais Lecitase Ultra e

Rohalase PL XTRA sob suas condições de reação ideais.

[0098] Tabela 7. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto antes e após a incubação com diferentes fosfolipases por 4 h Óleo de soja bruto, 55 °C PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 215 506 459 315 1495 PLA1 14 20 18 13 65 Lecitase® < 101 52 149 302 Ultra Rohalase® 22 68 42 35 167

PL XTRA < : não detectado

[0099] Tabela 8. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto antes e após a incubação com diferentes fosfolipases por 4 h Óleo de soja bruto, 60 °C PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 215 506 459 315 1495 PLA1 < 15 19 < 34 Lecitase® 101 448 406 295 1250 Ultra Rohalase® 23 71 48 31 174

PL XTRA <: não detectado

[0100] Tabela 9. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto antes e após a incubação com diferentes fosfolipases por 4 h Óleo de soja bruto, 65 °C PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 215 506 459 315 1495 PLA1 19 28 19 17 84 Rohalase® 25 84 46 34 189

PL XTRA EXEMPLO 4. Comparação de desempenho entre PLA1 e fosfolipase A comercialmente disponível em óleo de soja degomado com água a uma temperatura de 55, 60 e 65 °C

[0101] Óleo de soja degomado com água de processadores de semente de óleo norte-americanos foi usado. 10 g de óleo foram pesados em um frasco e aquecidos a 70 °C, sendo que posteriormente ácido cítrico (como solução a 50 %) foi adicionado no óleo até que a concentração final de ácido cítrico em óleo fosse de 500 ppm. O frasco que contém óleo condicionado por ácido cítrico foi incubado a 70 °C por pelo menos 30 min.

[0102] Após incubação, a temperatura foi ajustada e mantida a 55 °C, 60 °C e 65 °C. Quando a temperatura estava estável, PLA1 (0,25 mg de proteína ativa / kg de óleo) produzida como descrito acima e água foram misturadas no óleo com o uso de Ultra Turrax. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0103] Para a comparação com Lecitase Ultra e Rohalase

PL XTRA, NaOH 2M foi primeiramente adicionado no óleo condicionado por ácido cítrico até que uma concentração final de 138 ppm de NaOH em óleo fosse alcançada, para obter a condição ideal para essas enzimas. Subsequentemente, Lecitase Ultra ou Rohalase PL XTRA (0,25 mg de proteína ativa / kg de óleo) e água foram misturadas no óleo com o uso de Ultra Turrax. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0104] A reação ocorreu por 4 horas enquanto o óleo foi mantido misturado com um agitador magnético a 800 ppm. As amostras foram obtidas após 4h de incubação e o teor de fosfolipídio, isto é, ácido fosfatídico (PA), fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fosfatidil inositol (PI), foi determinado com o uso de 31P-RMN como descrito acima.

[0105] Os resultados das Tabelas 10 a 12 mostram que a PLA1 como revelado no presente documento alcançou um nível inferior de fosfolipídios PA, PC, PE e PI em óleo de soja degomado com água, a 55-65 °C, após 4 horas de reação do que a enzima comercial Lecitase Ultra, enquanto Rohalase® PL XTRA também resultou em um baixo nível de fosfolipídios a60ᵒC e 65 °C, sob as condições de reação ideais das três enzimas.

[0106] Tabela 10. Teor de fosfolipídio em óleo de soja degomado com água antes e após a incubação com diferentes fosfolipases por 4 h Óleo soja degomado com água, 55 °C PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 228 132 155 146 661

Óleo soja degomado com água, 55 °C PA PC PE PI PL Total PLA1 25 < 9 < 34 Lecitase® 18 < 15 20 53 Ultra Rohalase® 26 < 11 < 36

PL XTRA <: não detectado

[0107] Tabela 11. Teor de fosfolipídio em óleo de soja degomado com água antes e após a incubação com diferentes fosfolipases por 4 h Óleo soja degomado com água, 60 °C PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo tempo 0 228 155 146 132 661 PLA1 46 < 12 < 58 Lecitase® 30 79 67 57 232 Ultra Rohalase® 22 < 11 < 33

PL XTRA <: não detectado

[0108] Tabela 12. Teor de fosfolipídio em óleo de soja degomado com água antes e após a incubação com diferentes fosfolipases por 4 h Óleo soja degomado com água, 65 °C PA PC PE PI PL Total µmol / 100 g de óleo

Óleo soja degomado com água, 65 °C PA PC PE PI PL Total tempo 0 228 155 146 132 661 PLA1 58 17 14 14 102 Lecitase® 188 62 90 78 418 Ultra Rohalase® 20 < < < 20

PL XTRA <: não detectado EXEMPLO 5: Degomagem com o uso de combinação de PLC/PIPLC e PLA1

[0109] Óleo de soja bruto e óleo de colza como revelado no Exemplo 1 foram usados. 10 g de óleo foram pesados em um frasco, o qual foi aquecido a 70 °C. Para precondicionamento, o ácido cítrico (solução a 50 %) foi adicionado no óleo, a concentração final de ácido cítrico em óleo era de 500 ppm. Esse óleo foi incubado a 70°C por pelo menos 30 min, sendo que posteriormente NaOH foi adicionado a uma concentração em 138 ppm de NaOH. Após o precondicionamento, a temperatura foi ajustada e mantida a 55°C.

[0110] Uma mistura de PLA1 produzida como revelado acima e Purifine PLC/PI-PLC foi adicionada juntamente a água no óleo, e misturadas com o uso de Ultra Turrax. A dosagem de PLA1 é de 0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo, e a dosagem de Purifine PLC/PI-PLC é de 0,013 U-PLC/g de óleo e 0,05 U- PI-PLC/g de óleo, a concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0111] A reação foi realizada por 4 horas, enquanto o óleo foi mantido misturado com um agitador magnético a 800 rpm. Após 2 h e 4 h de incubação a 55 °C, as amostras foram obtidas para determinação do teor de fosfolipídio, a saber, ácido fosfatídico (PA), fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fosfatidil inositol (PI), e os produtos de reação com o uso de análise de 31P-RMN; diglicerídeo (DAG) foi analisado com o uso de HPLC.

[0112] Os resultados das Tabelas 13 e 14 mostram que, com o uso de PLA1 simultaneamente a PLC/PI-PLC, o teor de fosfolipídio intacto pode ser adicionalmente reduzido em comparação ao uso de PLC/PI-PLC individualmente. Após 4 horas de reação de PLA1+PLC/PI-PLC, > 90 % dos fosfolipídios foram hidrolisados. A formação de diglicerídeo (DAG) é reduzida quando PLA1 é usada simultaneamente a PLC/PI-PLC, porém a redução é limitada a 5-15 % do DAG total formado sem precondicionamento.

[0113] Tabela 13. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto antes e após a incubação a 55 °C com fosfolipase C, PI-PLC e fosfolipase A1 Óleo de soja bruto PA PC PE PI PL Total delta-DAG µmol / 100 g de óleo % em p/p tempo 0 210 547 455 328 1541 2 h PLC/PI-PLC, sem precondicionamento 187 ≤ 116 ≤ 303 0,76 PLC/PI-PLC + PLA1, sem precondicionamento 65 ≤ ≤ ≤ 65 PLC/PI-PLC, com precondicionamento 188 50 195 ≤ 433 0,63 PLC/PI-PLC + PLA1, com precondicionamento ≤≤ 61 48 ≤ 109 4 h PLC/PI-PLC + PLA1, sem precondicionamento ≤≤ ≤ ≤ ≤ ≤ 0,68

Óleo de soja bruto PA PC PE PI PL Total delta-DAG µmol / 100 g de óleo % em p/p PLC/PI-PLC + PLA1, com precondicionamento ≤≤ 41 50 ≤ 91 0,12 ≤ : não detectado

[0114] Tabela 14. Teor de fosfolipídio em óleo de colza bruto antes e após a incubação a 55 °C com fosfolipase C e fosfolipase A1 Óleo de colza bruto PA PC PE PI PL delta- Total DAG µmol / 100 g de óleo % em p/p tempo 0 524 718 345 404 1992 2 h PLC/PI-PLC, sem precondicionamento 563 222 286 ≤ 1070 0,71 PLC/PI-PLC + PLA1, sem precondicionamento 327 0 70 ≤ 397 PLC/PI-PLC, com precondicionamento 584 354 301 72 1312 0,55 PLC/PI-PLC + PLA1, com precondicionamento 191 49 42 ≤ 282 4 h PLC/PI-PLC + PLA1, sem precondicionamento 233 ≤ ≤ ≤ 233 0,68 PLC/PI-PLC + PLA1, com precondicionamento 98 ≤ 60 ≤ 158 0,44 ≤ : não detectado EXEMPLO 6: Refino com o uso de Purifine® 3G e PLA1

[0115] Dois óleos de soja brutos de processadores de semente de óleo norte-americanos foram usados. 10 g de óleo foram pesados em um frasco, o qual foi aquecido a 60 °C.

[0116] Purifine® 3G e PLA1 de A. niger produzidas como revelado acima foram adicionadas juntamente ou em ordem sequencial com água no óleo. Após a adição das enzimas, a mistura de óleo foi misturada com o uso de Ultra Turrax. Quando Purifine® 3G e a PLA1 foram adicionadas juntamente, nenhum precondicionamento foi feito. Quando adicionadas em ordem sequencial, primeiramente Purifine® 3G foi incubada por 2 horas, sendo que posteriormente 500 ppm de ácido cítrico foram adicionados e subsequentemente PLA1 foi adicionado.

[0117] A dosagem de Purifine® 3G era de 0,013 U-PLC/g de óleo e 0,05 U-PI-PLC/g de óleo (150-200 ppm), enquanto a dosagem de PLA1 era de 0,28 ou 0,56 mg de proteína ativa / kg de óleo. A concentração final de água em óleo era de 3 % em peso.

[0118] A reação foi realizada por 4 horas, enquanto o óleo foi mantido misturado com um agitador magnético a 800 rpm. Após 2 h e 4 h de incubação a 60 °C, as amostras foram obtidas para determinação do teor de fosfolipídio (PL), a saber, ácido fosfatídico (PA), fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fosfatidil inositol (PI), e os produtos de reação com o uso de análise de 31P-RMN como revelado acima. O diglicerídeo (DAG) foi analisado com o uso de HPLC revelada acima.

[0119] Os resultados das Tabelas 15 e 16 mostram que, com o uso de Purifine® 3G em combinação com PLA1, uma maior quantidade de fosfolipídios era hidrolisada em comparação ao uso de Purifine® 3G individualmente. Em alguns casos (por exemplo, óleo de soja bruto C), nenhum precondicionamento foi necessário para a combinação para alcançar um baixo nível de fósforo, enquanto, em alguns outros casos (por exemplo,

óleo de soja bruto D), a adição de ácido antes de PLA1 foi necessária para alcançar um baixo nível de fósforo. A formação de diglicerídeo (DAG) foi reduzida quando PLA1 é usada em combinação com Purifine® 3G, isto é, 5-15 % menos DAG em comparação ao DAG total formado após a incubação com Purifine ® 3G individualmente.

[0120] Tabela 15. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto C antes e após a incubação a 60 °C com Purifine® 3G e PLA1. Sem precondicionamento na aplicação. Óleo de soja bruto C PA PC PE PI PL delta- Total DAG µmol / 100 g de óleo % em p/p tempo 328 1067 775 592 2763 0 0 2 h Purifine® 3G 242 90 356 160 847 1,16 Purifine® 3G + PLA1 (0,28 mg de proteína 96 < 57 < 152 1,01 ativa / kg de óleo) Purifine® 3G + PLA1 (0,56 mg de proteína 59 < < < 59 0,91 ativa / kg de óleo) 4 h Purifine® 3G + PLA1 (0,28 mg de proteína 53 < < < 53 1,01 ativa / kg de óleo) Purifine® 3G + PLA1 (0,56 mg de proteína < < < < 0 0,86 ativa / kg de óleo) <: não detectado

[0121] Tabela 16. Teor de fosfolipídio em óleo de soja bruto D antes e após a incubação a 60 °C com Purifine® 3G e PLA1 (0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo em todos os experimentos)

Óleo de soja bruto D PA PC PE PI PL delta Total -DAG µmol / 100 g de óleo % em p/p tempo 376 571 591 308 1846 0 2 h Purifine® 3G 222 119 228 < 569 0,56 Purifine® 3G + PLA1 adicionadas 252 69 191 64 576 0,50 juntamente Purifine® 3G + 500 ppm de ácido cítrico+PLA1 245 74 217 72 609 0,52 adicionados em ordem sequencial 4 h Purifine® 3G 159 78 162 < 399 0,63 Purifine® 3G + PLA1 adicionadas 199 < 128 < 327 0,62 juntamente Purifine® 3G + 500 ppm de ácido cítrico+PLA1 < < < < < 0,58 adicionados em ordem sequencial < : não detectado

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para reduzir uma quantidade de fosfolipídios intactos em um óleo de triacilglicerídeo caracterizado por compreender incubar o óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1 compreende aminoácidos 30 a 298 da SEQ ID NO: 1.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos 85 % da quantidade de fosfolipídios intactos são reduzidos.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é capaz de reduzir pelo menos 85 % da quantidade de fosfolipídios intactos originalmente presentes no óleo quando a fosfolipase A1 é incubada com o óleo em uma quantidade de 0,28 mg de proteína ativa / kg de óleo a uma temperatura de 55 °C, 60 °C, 65 °C e/ou 70 °C por 4 h.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os fosfolipídios compreendem ácido fosfatídico, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol e / ou fosfatidilcolina.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de adicionar um ácido ao óleo.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de adicionar água ao óleo.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de adicionar um cáustico ao óleo.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de adicionar ácido, água e / ou cáustico é realizada antes de incubar o óleo com a fosfolipase.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender adicionalmente incubar o óleo com um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C, um polipeptídeo que tem atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C e / ou um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A2.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender adicionalmente separar componentes contendo fósforo do óleo.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende um óleo bruto ou óleo degomado com água.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o óleo compreende um óleo vegetal, óleo de algas, óleo animal ou óleo de peixe.

14. Óleo de triacilglicerídeo caracterizado por compreender um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A1, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80 % de identidade com a sequência de aminoácidos maduros da SEQ ID NO: 1.

15. Óleo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender adicionalmente um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C, um polipeptídeo que tem atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C e / ou um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A2.