BR112020014848A2 - Anticorpo anti-4-1bb, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso médico do mesmo - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-4-1bb, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o uso médico do mesmo. além disso, são fornecidos um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado que compreende uma região cdr do anticorpo anti-4-1bb, bem como uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-4-1bb humano ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o uso do mesmo como medicamentos anticâncer. em particular, é fornecido o uso de um anticorpo anti-4-1bb humanizado na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças ou condições mediadas pela 4-1bb.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO ANTI4-1BB, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO E USO MÉDICO DO MESMO".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-4-1BB e fragmentos de ligação ao antígeno, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado que compreende as regiões CDR do anticorpo anti-4-1BB e uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-4-1BB B ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e seu uso como um agente anticâncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O câncer é um enorme desafio para a saúde da sociedade humana há muito tempo.

[0003] As terapias tradicionais (tais como cirurgia, quimioterapia e radioterapia) mostraram pouco efeito sobre o tratamento de tumores sólidos disseminados. A imunoterapia tumoral é um ponto de destaque no campo da terapia contra o câncer, na qual a imunoterapia com células T está em uma posição central. A imunoterapia tumoral usa e recruta totalmente células T assassinas em pacientes com tumor para matar tumores. A imunoterapia tumoral pode ser a maneira mais eficaz e segura para o tratamento de tumores. Atualmente, a imunoterapia tumoral tem boas perspectivas para o tratamento de vários tipos diferentes de câncer, incluindo tumores metastáticos disseminados.

[0004] Duas vias de sinalização estão envolvidas em ativação de células T no corpo humano. Além de um primeiro sinal fornecido por peptídeos apresentadores de antígenos do MHC para células T através de células apresentadoras de antígeno (Antigen Presenting Cells, APCs), um segundo sinal, fornecido por uma série de moléculas coestimuladoras, também é necessário para que as células T produzam uma resposta imune normal. Este sistema de via de sinalização dupla desempenha um papel vital no equilíbrio do sistema imune in vivo. Ele regula estritamente as respostas imunes a autoantígenos e não- autoantígenos. Na ausência de um segundo sinal fornecido pelas moléculas coestimuladoras, uma ausência de resposta ou uma resposta imune específica de células T sustentada resultará em tolerância.

[0005] A 4-1BB (também conhecida como CD137, TNFRSF9) é uma proteína transmembrana da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, TNFRS). A 4-1BB humana tem uma proteína de 255 aminoácidos, incluindo uma sequência sinalizadora (resíduos de aminoácidos 1-17), um domínio extracelular (169 aminoácidos) um domínio transmembrana (27 aminoácidos) e um domínio intracelular (42 aminoácidos). A 4-1BB é expressa como um monômero ou um dímero sobre a superfície da célula, e media a transdução de sinal através de trimerização quando de ligação ao seu ligante (4-1BBL).

[0006] A 4-1BB usualmente é dependente de ativação e está amplamente presente em células do sistema imune, incluindo células NK e NKT ativadas, células T reguladoras, células dendríticas (Dendritic Cells, DCs), mastócitos estimulados, células mieloides diferenciadas, monócitos, neutrófilos e eosinófilos. Estudos demonstraram que o início de 4-1BB pode aumentar a proliferação celular, a sobrevivência e a produção de citocinas.

[0007] Anticorpos agonistas contra a 4-1BB aumentam a expressão de moléculas coestimuladoras em diversos modelos e melhoram significativamente a resposta de linfócitos T citolíticos, resultando em eficácia antitumoral, já que respostas de memórias de células T protetoras antitumor duráveis também foram observadas em modelos de tumores com monoterapia e terapia combinada que tem como alvo a 4-1BB.

[0008] Para as necessidades médicas ainda não atendidas associadas à 4-1BB, várias empresas farmacêuticas internacionais estão desenvolvendo ativamente anticorpos monoclonais contra a 4- 1BB. Patentes relacionadas, tais como os documentos WO2000029445, WOZ2005035584, WO2012032433, WO2003049755, WO2017205745A e assim por diante. Até o momento, os anticorpos anti-4-1BB fornecidos pela Bristol-Myers Squibb (BMS) e a Pfizer entraram em ensaios clínicos de Fase I/Il, e produtos similares da Pieris também entraram em ensaios clínicos de Fase |.

[0009] O presente pedido é dirigido ao fornecimento de anticorpos anti-4-1BB com alta afinidade, alta seletividade e alta atividade biológica, e medicamentos, composições e métodos dos mesmos para uso em terapia contra o câncer ao estimular a 4-1BB e sua via para levar à ativação imune.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] O pedido fornece um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende pelo menos uma LCDR selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 8; SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15€ SEQ ID Nº: 16; e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo que compreende pelo menos uma HCDR selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4, SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº:11, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 45.

[0011] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com o presente pedido, a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7 e SEQ ID Nº: 8, respectivamente.

[0012] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com o presente pedido, a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15 e SEQ ID Nº: 16, respectivamente.

[0013] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com o presente pedido, a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 45 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente, ou compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente.

[0014] Em uma modalidade específica do anticorpo anti4-1BB acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com o presente pedido, a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12 e SEQ ID Nº: 13, respectivamente.

[0015] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com o presente pedido, a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende: LCDR1, LCDR2, e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7 e SEQ ID Nº: 8, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2, e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15 e SEQ ID Nº: 16, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende: HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 45 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente; ou

HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12 e SEQ ID Nº: 13, respectivamente.

[0016] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser selecionado a partir de qualquer um dos seguintes: (1) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7, e SEQ ID Nº: 8, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDRS3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 45 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente; ou (2) a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15, e SEQ ID Nº: 16, respectivamente; e a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDRS3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 11, SEQID Nº: 12 e SEQ ID Nº: 13, respectivamente.

[0017] Em uma modalidade específica do presente pedido, a sequência da região variável de cadeia leve de anticorpo é apresentada em SEQ ID Nº: 2; e a sequência da região variável de cadeia pesada de anticorpo é apresentada em SEQ ID Nº: 1.

[0018] Em uma modalidade específica do presente pedido, a sequência da região variável de cadeia leve de anticorpo é apresentada em SEQ ID Nº: 10; e a sequência da região variável de cadeia pesada de anticorpo é apresentada em SEQ ID Nº: 9.

[0019] O pedido também fornece um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende: uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 42, SEQ ID Nº: 43 e SEQ ID Nº: 44, respectivamente; e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 39, SEQ ID Nº: 40 e SEQ ID Nº: 41, respectivamente.

[0020] O presente pedido também fornece um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em que a LCVR da região variável de cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é apresentada em SEQ ID Nº: 38, e a HCVR da região variável de cadeia pesada é apresentada em SEQ ID NO .:37.

[0021] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme descrito acima é um anticorpo de murino ou fragmento do mesmo.

[0022] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região variável de cadeia leve de anticorpo do anticorpo de murino ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende regiões FR de cadeia leve da cadeia «, À de murino ou uma variante das mesmas.

[0023] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo de murino ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende uma região constante de cadeia leve da cadeia K, À de murino ou uma variante das mesmas.

[0024] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região variável de cadeia pesada do anticorpo de murino ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende regiões FR de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 de murino ou uma variante das mesmas.

[0025] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo de murino ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1, I9G2, I9G3, IgG4 de murino ou uma variante das mesmas.

[0026] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme descrito acima é um anticorpo quimérico ou fragmento do mesmo.

[0027] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo quimérico anti-4-1BB ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende uma região constante de cadeia leve capa, lambda humana ou uma variante das mesmas.

[0028] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo quimérico anti-4-1BB ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante das mesmas.

[0029] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme descrito acima é um anticorpo humano ou fragmento do mesmo.

[0030] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme descrito acima é um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo.

[0031] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humano ou fragmento do mesmo conforme descrito acima, a cadeia leve do anticorpo humanizado é apresentada em SEQ ID Nº: 18 ou uma variante da mesma; a variante compreende a partir de O a 10 alterações de aminoácidos na cadeia leve. A sequência da cadeia pesada é apresentada em SEQ ID Nº: 17 ou uma variante da mesma; a variante compreende a partir de O a 10 alterações de aminoácidos na cadeia pesada.

[0032] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humano ou fragmento do mesmo conforme descrito acima, a cadeia leve do anticorpo humanizado é apresentada em SEQ |D Nº: 20 ou uma variante mesma; a variante compreende a partir de O a 10 alterações de aminoácidos na cadeia leve. A sequência da cadeia pesada é apresentada em SEQ ID Nº: 19 ou uma variante da mesma; a variante compreende a partir de O a 10 alterações de aminoácidos na cadeia pesada.

[0033] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti4-1BB humano ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende uma região constante de I9gG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante das mesmas, de preferência compreende uma região constante de I9G1 ou IgG2 humana.

[0034] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme descrito acima é um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.

[0035] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo conforme descrito acima, a região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado ainda compreende regiões FR de cadeia leve de cadeia «, À humana ou uma variante das mesmas.

[0036] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo, a sequência da região FR de cadeia leve da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado é derivada a partir de uma sequência de IGkV3-11 de cadeia leve de linhagem germinativa humana conforme apresentado em SEQ ID Nº: 22; ou derivada a partir de uma sequência de IGKkV4-1 de cadeia leve de linhagem germinativa humana conforme apresentado em SEQ ID Nº: 24.

[0037] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo, a sequência da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado é apresentada em SEQ ID Nº: 30 ou SEQ ID Nº: 36, ou uma variante das mesmas.

[0038] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo, a sequência de cadeia leve do anticorpo humanizado é apresentada em SEQ ID Nº: 18 ou SEQ ID Nº: 20, ou uma variante das mesmas.

[0039] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo, a variante da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado tem, de preferência, a partir de O a 10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) alterações de aminoácidos na região variável de cadeia leve; mais preferivelmente nas posições de aminoácidos 4, 47 e 62 ou qualquer combinação das mesmas; mais preferivelmente uma mutação M4L, P47A, V62I e qualquer combinação das mesmas; mais preferivelmente mutações P47A e V62|, M4L e V62I.

[0040] Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo conforme descrito acima ainda compreende uma região constante de cadeia leve de uma cadeia capa, lambda humana ou uma variante da mesma.

[0041] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado do anticorpo anti- 4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo ainda compreende regiões FR de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou uma variante das mesmas.

[0042] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região FR de cadeia pesada da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo é derivada a partir de uma sequência de IGHV3-30 de cadeia pesada de linhagem germinativa humana conforme apresentado em SEQ ID Nº: 21; ou derivada a partir de uma sequência de IGHV 1-46 de cadeia pesada de linhagem germinativa humana conforme apresentado em SEQ ID Nº:

23.

[0043] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região variável de cadeia pesada de anticorpo humanizado do anticorpo anti- 4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo é apresentada em SEQ ID Nº: 27 ou SEQ ID Nº: 33, ou uma variante da mesma.

[0044] Em uma modalidade específica do presente pedido, a cadeia pesada de anticorpo humanizado do anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo é apresentada em SEQ ID Nº: 17 ou SEQ ID Nº19, ou uma variante da mesma; a variante tem, de preferência, a partir de O a 10 alterações de aminoácidos na região variável de cadeia pesada; mais preferivelmente, tem uma mutação na posição de aminoácido 48, 53, 75, 95 ou 112 ou qualquer combinação das mesmas; mais preferivelmente, tem uma mutação M48|, E53D, ATSS, Y95F, Q112T/R112Q ou qualquer combinação das mesmas; mais preferivelmente E53D, A75S e R112Q; mais preferivelmente M48I, Y95F e Q112T.

[0045] Em uma modalidade específica do presente pedido, o acima anticorpo anti-4-1BB humanizado acima ou fragmento do mesmo ainda compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1, 1gG2, I9G3 ou IgG4 humana ou uma variante das mesmas, de preferência compreende regiões FR de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana, mais preferivelmente compreende regiões FR de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2 humana.

[0046] Em uma modalidade específica do presente pedido, é fornecido um anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada: a cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº. 25, 26, 27, 31, 326 33; e a cadeia leve compreende do uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº. 28, 29, 30, 34, 35 e 36.

[0047] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo conforme descrito acima é apresentada em SEQ ID Nº: 36 e a região variável de cadeia pesada do mesmo é apresentada em SEQ ID Nº:33.

[0048] Em uma modalidade específica do presente pedido, a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo conforme descrito acima é apresentada em SEQ ID Nº: 30 e a região variável de cadeia pesada do mesmo é apresentada em SEQ ID Nº:27.

[0049] Em uma modalidade específica do presente pedido, a cadeia leve do anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo conforme descrito acima é apresentada em SEQ ID Nº: 20 e a cadeia pesada do mesmo é apresentada em SEQ ID Nº: 19.

[0050] Em uma modalidade específica do presente pedido, a cadeia leve do anticorpo anti-4-1BB humanizado ou fragmento do mesmo conforme descrito acima é apresentada em SEQ ID Nº: 18 e a cadeia pesada do mesmo é apresentada em SEQ ID Nº: 17.

[0051] Em uma modalidade específica do anticorpo anti-4-1BB acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o fragmento de ligação ao antígeno de é Fab, Fv, sFv, F(ab')2, anticorpo linear, anticorpo com uma única cadeia, scFv, sdAb, sdFv, Nanocorpo, pepticorpo, anticorpo com domínio e anticorpo multiespecífico (anticorpo biespecífico, diacorpo, triacorpo e tetracorpo, di-scFv em tandem, tri- scFv em tandem).

[0052] O pedido fornece ainda um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete pela ligação à 4-1BB ou epítopo da mesma com o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima.

[0053] O pedido fornece ainda um polinucleotídeo que codifica o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, o polinucleotídeo podendo ser DNA ou RNA.

[0054] O pedido fornece ainda um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo conforme descrito acima, o vetor de expressão podendo ser um vetor viral e o vírus podendo ser um vírus oncolítico.

[0055] O pedido fornece ainda uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão conforme descrito acima.

[0056] Em uma modalidade específica do presente pedido, a célula hospedeira conforme descrito acima é caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma bactéria, de preferência Escherichia coli.

[0057] Em uma modalidade específica do presente pedido, a célula hospedeira conforme descrito acima é uma levedura, de preferência Pichia pastoris.

[0058] Em uma modalidade específica do presente pedido, a célula hospedeira conforme descrito acima é uma célula de mamífero, de preferência uma célula de ovário de hamster chinês (Chinese Hamster Ovary, CHO) ou uma célula de rim embrionário humano (Human Embryonic Kidney, HEK) 293.

[0059] O presente pedido também fornece um anticorpo multiespecífico que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada conforme descrito acima.

[0060] O pedido também fornece um anticorpo com uma única cadeia que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada conforme descrito acima.

[0061] O pedido também fornece um conjugado de anticorpo- fármaco que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, conforme descrito acima. O conjugado de anticorpo-fármaco é formado pela ligação do anticorpo- ligante-fármaco (toxina). Ligantes conhecidos incluem um ligante clivável, ligante não clivável, por exemplo, incluindo, porém sem limitações, SMCC, SPDP e assim por diante; toxinas também são bem conhecidas na técnica, tais como DM1, DM4, MMAE, MMAF e assim por diante.

[0062] O presente pedido também fornece um método para produzir o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende as etapas de expressar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na célula hospedeira, conforme descrito acima, e isolar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula hospedeira.

[0063] O pedido fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0064] O presente pedido fornece ainda o uso de qualquer um ou combinação dos seguintes na preparação de um medicamento: o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com o presente pedido, a composição farmacêutica de acordo com o presente pedido e o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com o presente pedido; em que o medicamento é para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por 4- 1BB ou 4-1BBL; a doença é, de preferência, câncer; e o câncer é, mais preferivelmente, selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tiroide, câncer de esôfago, câncer de colo do útero, sarcoma, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, câncer de vesícula biliar e glioblastoma.

[0065] O presente pedido fornece, além disso, um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por 4- 1BB ou 4-1BBL que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com o presente pedido, ou a composição farmacêutica de acordo com o presente pedido, ou o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com o presente pedido; em que a doença é, de preferência, câncer; e o câncer é, mais preferivelmente, selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tiroide, câncer de esôfago, câncer de colo do útero, sarcoma, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, câncer de vesícula biliar e glioblastoma.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0066] Figura 1: Ensaio ELISA de captura in vitro dos anticorpos de murino, indicando que todos os anticorpos anti-4-1BB de murino a serem testados a partir de cada hibridoma se liga eficientemente à 4- 1BB-his humana.

[0067] Figura 2: Ensaio ELISA dos anticorpos de murino no bloqueio do ligante 4-1BBL. Os resultados mostraram que os anticorpos B1E7 e B1A7 eram do tipo bloqueio de ligante, enquanto que B1IE1I0 e os dois anticorpos de referência não eram do tipo bloqueio.

[0068] Figura 3: Ensaio de ativação de gene repórter 4-1BB dos anticorpos de murino, indicando que a intensidade de ativação foi classificada na ordem de B1E10>referência MOR7480>B1E7>B1A7.

[0069] Figura 4: Ensaio de ativação de função de proliferação de células PBMCs dos dois anticorpos humanizados. Os resultados mostraram que a intensidade de ativação de huB1E7 e huB1E10 foi maior do que aquela da referência MOR7480, em que huB1E7 era relativamente mais forte.

[0070] Figura 5: Ensaio de ativação de gene repórter 4-1BB dos anticorpos humanizados. Os resultados mostraram que a intensidade de ativação foi classificada em uma ordem consistente com aquela para os anticorpos de murino, a qual é B1E10>referência MOR7480>B1E7.

[0071] Figura 6: Curva de crescimento de tumor em camundongos C57BL/6 transgênicos para hu4-1BB transplantados com células cancerosas intestinais MC38 após administração de cada anticorpo anti-4-1BB a ser testado.

[0072] Figura 7: Curva de variação de peso corporal de camundongos C57BL/6 transgênicos para hu4-1BB transplantados com células cancerosas intestinais MC38 após administração de cada anticorpo anti-4-1BB a ser testado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. Terminologia

[0073] Para uma compreensão mais rápida da invenção, determinados termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificamente definido em outra parte neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados aqui têm o significado comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção se refere.

[0074] Conforme usado aqui, o código de uma letra e o código de três letras para aminoácidos são aqueles descritos em J. Biol. Chem., 243, (1968) página 3558.

[0075] Conforme usado aqui, o termo "um anticorpo" se refere à imunoglobulina, a qual é uma estrutura em cadeia com quatro peptídeos formada pela ligação de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas através de ligações de dissulfeto. Diferentes regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina exibem diferentes composições de aminoácidos e ordens de sequência, assim, apresentando diferentes tipos de antigenicidade. Consequentemente, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco categorias, ou os assim denominados isotipos de imunoglobulina, particularmente IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, cujas cadeias pesadas são cadeia yu, cadeia Õ, cadeia y, cadeia y, cadeia a e cadeia e, respectivamente. De acordo com sua composição de aminoácidos da região de dobradiça e o número e localização das ligações de dissulfeto da cadeia pesada, o mesmo tipo de Ig pode ser dividido em diferentes subcategorias, por exemplo, IgG pode ser dividida em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A cadeia leve pode ser dividida em cadeia K ou À considerando diferentes regiões constantes. Cada uma das cinco Igs pode ter uma cadeia K ou À.

[0076] No presente pedido, a região variável de cadeia leve do anticorpo mencionada aqui compreende ainda uma região constante de cadeia leve a qual compreende uma cadeia K, À humana ou de murino ou uma variante da mesma.

[0077] Na presente invenção, a região variável de cadeia pesada do anticorpo mencionada aqui compreende ainda uma região constante da cadeia pesada, a qual compreende IgG1, 2, 3, 4 humana ou de murino ou uma variante das mesmas.

[0078] Próximo do N-término da sequência de cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos, cerca de 110 sequências de aminoácidos variam amplamente, conhecidas como região variável (região V); o restante da sequência de aminoácidos próximo do C-término é relativamente estável, conhecida como região constante (região C). À região variável compreende três regiões hipervariáveis (HyperVariable Regions, HVR) e quatro regiões estruturais (Framework Regions, FRs) que tem uma sequência relativamente conservada. As três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecida como região determinante de complementaridade (Complementarity Determining Region, CDR). Cada região variável de cadeia leve (Light Chain Variable Region, LCVR) e cada região variável de cadeia pesada (Heavy Chain Variable Region, HCVR) é composta por três CDRs e quatro FRs, com a ordem a partir do terminal amino para o terminal carboxila sendo: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Três CDRs de cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; três CDRs de cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a localização dos resíduos de aminoácidos das CDRs na LCVR e HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui correspondem aos critérios de numeração conhecidos de Kabat (LCDR1-3, HCDR2 -3) ou corresponde aos critérios de numeração de Kabat e Chothia (ABM) (HCDR1).

[0079] O termo "anticorpo humano recombinante" inclui anticorpos humanos preparados, expressos, criados ou isolados por meio de métodos recombinantes, e a tecnologia e métodos envolvidos são bem conhecidos na técnica, tais como: (1) um anticorpo isolado a partir de um animal transgênico ou transcromossômico para o gene de imunoglobulina humana (por exemplo, um camundongo) ou um hibridoma preparado a partir do mesmo; (2) um anticorpo isolado a partir de células hospedeiras transformadas que expressam o anticorpo, tal como um transfectoma; (3) um anticorpo isolado a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatória recombinante; e (4) um anticorpo preparado, expresso, criado ou isolado por meio de emenda (splicing) de sequências do gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA ou similar.

[0080] Tal anticorpo humano recombinante compreende uma região variável e uma região constante, tais regiões envolvem sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana específicas codificadas por genes da linhagem germinativa, mas também envolvem rearranjos e mutações subsequentes, tais como aqueles que ocorrem durante maturação do anticorpo.

[0081] O termo "anticorpo de murino" no presente pedido se refere a um anticorpo monoclonal contra 4-1BB humana ou epítopo do mesmo o qual é preparado de acordo com os conhecimentos e habilidades na técnica. Durante a preparação, um indivíduo de teste é injetado com o antígeno 4-1BB e, então, um hibridoma que expressa o anticorpo que tem a sequência ou características funcionais desejadas é separado. Em uma modalidade específica do presente pedido, o anticorpo 4-1BB de murino ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região constante de cadeia leve de cadeia «, À de murino ou uma variante da mesma ou compreende ainda uma região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de murino ou uma variante da mesma.

[0082] O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos que têm regiões variáveis e constantes com sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos do presente pedido podem incluir resíduos de aminoácidos que não são codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio específica in vitro ou mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano" não inclui um anticorpo em que sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (tal como linhagem germinativa de camundongo) foram enxertadas em uma sequência estrutural humana (isto é, "anticorpo humanizado").

[0083] O termo "anticorpo humanizado", também conhecido como anticorpo com CDRs enxertadas, se refere a um anticorpo gerado por meio de enxertia de sequências de CDR de murino em uma região estrutural de região variável de um anticorpo humano. O anticorpo humanizado supera a forte resposta do anticorpo induzida pelo anticorpo quimérico que porta uma grande quantidade de componentes da proteína de murino. Para evitar a diminuição da atividade juntamente com uma diminuição da imunogenicidade, a região variável do anticorpo humano é submetida a uma retromutação mínima para manter a atividade.

[0084] O termo "anticorpo quimérico" é um anticorpo formado pela fusão da região variável de um anticorpo de murino com a região constante de um anticorpo humano; o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imune induzida por anticorpos de murino. Para estabelecer um anticorpo quimérico, primeiro é estabelecido o anticorpo monoclonal de murino específico secretor de hibridoma, um gene da região variável é clonado a partir de células de hibridoma de camundongo e, em seguida, um gene da região constante de um anticorpo humano é clonado conforme desejado, o gene da região variável de camundongo é ligado ao gene da região constante humana para formar um gene quimérico que pode ser inserido em um vetor humano e, finalmente, a molécula de anticorpo quimérico é expressa no sistema industrial eucariota ou procariota. A região constante de um anticorpo humano é selecionada a partir da região constante de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante da mesma, de preferência a região constante de cadeia pesada de IgG2 ou IgG4 humana ou uma de IgG1 que não tem atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity, ADCC) após mutação de aminoácidos.

[0085] Conforme usado aqui, "fragmento de ligação ao antígeno" se refere a um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2 com atividade de ligação ao antígeno, bem como um fragmento Fv, um fragmento sFv que se liga à 4-1BB humana. O fragmento Fv é um fragmento de anticorpo mínimo que porta todos os sítios de ligação ao antígeno e compreende uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, mas sem a região constante. Em geral, o anticorpo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL e é capaz de formar uma estrutura necessária para a ligação ao antígeno. Além disso, diferentes ligantes podem ser usados para conectar as regiões variáveis de dois anticorpos para formar um polipeptídeo, denominado anticorpo com uma única cadeia ou Fy com uma única cadeia (sFv).

[0086] Conforme usado aqui, "ligação a 4-1BB" se refere à capacidade de interagir com a 4-1BB ou um epítopo da mesma, o qual pode ser de origem humana. O termo "sítio de ligação ao antígeno", conforme usado aqui, se refere a sítios tridimensionais descontínuos no antígeno reconhecidos pelo anticorpo ou pelo fragmento de ligação ao antígeno do presente pedido.

[0087] O termo "epítopo" se refere aos locais sobre um antígeno que se ligam especificamente a uma imunoglobulina ou anticorpo. O epítopo pode ser formado por aminoácidos adjacentes ou por aminoácidos não adjacentes que foram trazidos para estarem mais próximos em virtude de dobramento terciário de uma proteína. O epítopo formado por aminoácidos adjacentes é, tipicamente, retido após exposição a solventes desnaturantes, enquanto que o epítopo formado pelo dobramento terciário é, tipicamente, perdido após tratamento com solventes desnaturantes. Os epítopos incluem, tipicamente, pelo menos 3-15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos para determinar o epítopo ligado a um dado anticorpo são bem conhecidos na técnicay incluindo ensaios de imunotransferência e imunoprecipitação, e assim por diante. Métodos para determinar a conformação espacial de um epítopo incluem métodos conhecidos no campo e as técnicas descritas aqui, tais como cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional.

[0088] Os termos "se liga especificamente a" e "se liga seletivamente a", conforme usado aqui, se referem à ligação de um anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo se liga a um antígeno predeterminado ou seu epítopo em uma constante de dissociação em equilíbrio (Ko) de aproximadamente menos de 10” M ou mesmo menos e a afinidade do anticorpo pela ligação ao antígeno predeterminado ou seu epítopo é pelo menos duas vezes maior do que aquela por antígenos não específicos (tal como BSA) que não o antígeno predeterminado (ou seu epítopo) ou antígenos intimamente relacionados, conforme medido em um instrumento por meio de técnicas de ressonância plasmônica de superfície (Surface Plasmon Resonance, SPR), em que a 4-1BB humana recombinante ou epítopo da mesma é usado como um analito e o anticorpo é usado como um ligante. O termo "um anticorpo que reconhece o antígeno" pode ser usado aqui de forma alternada com o termo "anticorpo de ligação específica".

[0089] O termo "reação cruzada" se refere à capacidade do anticorpo do presente pedido de se ligar à 4-1BB de uma espécie diferente. Por exemplo, um anticorpo do presente pedido que se liga à 4-1BB humana também pode se ligar à 4-1BB de outra espécie. À reatividade cruzada é medida por meio de detecção da reatividade específica com antígenos purificados em ensaios de ligação (por exemplo, ELISA e SPR) ou através de detecção da ligação ou interação funcional com células que expressam 4-1BB fisiologicamente. Métodos para determinar a reatividade cruzada incluem ensaios de ligação padrão, conforme descrito aqui, tais como análise de ressonância plasmônica de superfície ou citometria de fluxo.

[0090] Os termos "inibição" ou "bloqueio" são usados de forma alternada e abrangem inibição/bloqueio parcial e total. De preferência, a inibição/bloqueio de 4-1BB reduz ou altera o nível normal ou o tipo de atividade que é gerado quando de ligação à 4-1BB sem inibição ou bloqueio. Inibição e bloqueio também se destinam a incluir uma diminuição mensurável da afinidade de ligação pela 4-1BB quando contatado com um anticorpo anti-4-1BB comparado com a afinidade de ligação pela 4-1BB na ausência de anticorpo anti-4-1BB.

[0091] O termo "inibição de crescimento" (por exemplo, envolvendo células) se destina a incluir qualquer redução mensurável no crescimento celular.

[0092] O termo "indução de uma resposta imune" e "aumento de uma resposta imune" são usados alternadamente e se referem à resposta imune ao estímulo de um determinado antígeno (isto é, passiva ou adaptativa). O termo "indução", em relação à CDC ou ADCC, se refere à estimulação de um mecanismo específico para matar células diretamente.

[0093] Conforme usado aqui, o termo "ADCC", a saber, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, se refere a células que expressam receptores Fc que matam diretamente células alvo revestidas por um anticorpo através de reconhecimento do segmento Fc do anticorpo. A função efetora ADCC do anticorpo pode ser reduzida ou eliminada via modificação do segmento Fc na IgG. À modificação se refere a mutações da região constante de cadeia pesada de anticorpos, tais como mutações selecionadas a partir de N297A, L234A, L235A em IgG1; quimeras de IgG2/4; mutações F235E ou L234A/E235A em IgG4.

[0094] Métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígenos são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor, Capítulos 5-8 e 15. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com 4-1BB humana, ou fragmentos da mesma, e os anticorpos resultantes podem ser renaturados, purificados e sequenciados usando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por meio de métodos convencionais. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é geneticamente modificado para adicionar uma ou mais regiões estruturais humanas (FRs) a CDRs não derivadas de seres humanos. As sequências de linhagem germinativa de FR humanas podem ser obtidas a partir da ImMunoGeneTics (IMGT) através do site http://imgt.cines.ff”º ou da The Immunoglobulih' FactsBook, 2001ISBNO012441351.

[0095] O anticorpo manipulado ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser preparado e purificado usando métodos convencionais. Por exemplo, o cDNA que codifica as sequências de cadeia pesada (SEQ ID Nº: 17) e cadeia leve (SEQ ID Nº: 18) pode ser clonado e recombinado em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina recombinado pode, então, transfectar estavelmente células CHO. Como um método mais recomendado bem conhecido na técnica, um sistema de expressão de mamífero pode resultar na glicosilação de anticorpos, tipicamente na extremidade N- terminal altamente conservada na região Fc. Clones estáveis podem ser obtidos através da expressão de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno humano. Os clones positivos podem ser expandidos em um meio de cultura isento de soro para a produção de anticorpos em biorreatores. O meio de cultura no qual um anticorpo foi secretado pode ser coletado e purificado por meio de técnicas convencionais. O anticorpo pode ser submetido à filtração e concentração usando técnicas comuns. Misturas solúveis e multímeros podem ser efetivamente removidos através de técnicas comuns, incluindo peneiras moleculares ou troca iônica. O produto obtido pode ser imediatamente congelado, por exemplo, a -70ºC, ou pode ser liofilizado.

[0096] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal. Anticorpo monoclonal ou mAb, conforme usado aqui, se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone incluindo, porém sem limitações, qualquer clone eucariota, procariota ou fago. Os anticorpos monoclionais e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser recombinados, por exemplo, por meio de tecnologias de hibridoma, tecnologias recombinantes, tecnologias de exibição em fagos, tecnologias sintéticas (por exemplo, enxertia de CDR) ou outras tecnologias conhecidas na técnica.

[0097] "Administração" e "tratamento", quando de referência a um animal, ser humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, se refere ao contato de um agente farmacêutico, terapêutico, agente diagnóstico ou composição exógena com o animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de pesquisa e experimentais. O tratamento de uma célula abrange o contato de um reagente com a célula, bem como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Administração" e "tratamento" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, agente diagnóstico, composição de ligação ou outra célula. "Tratamento", quando de aplicação a seres humanos, veterinária ou de pesquisa, se refere a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, aplicações de pesquisa e diagnóstico.

[0098] "Tratar" significa administrar um agente terapêutico (tal como uma composição que compreende qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção) interna ou externamente a um indivíduo que está sofrendo, que se suspeita estar sofrendo ou que tenha tendência a sofrer de um ou mais sintomas da doença para a qual uma atividade terapêutica é conhecida. Tipicamente, o agente terapêutico é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintomas da doença no no indivíduo ou população tratada, seja ao induzir a regressão ou inibir a progressão de tal(ais) sintoma(s) em qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma específico da doença (também denominada como "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar de acordo com fatores tais como o estado patológico, idade e peso do indivíduo e a capacidade do medicamento de obter uma resposta desejada no indivíduo. Pode-se avaliar se um sintoma da doença foi aliviado através de qualquer medida clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde especializados para avaliar a gravidade ou o estado de progressão deste sintoma. Embora uma modalidade do presente pedido (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de manufatura) possa não ser eficaz para aliviar os sintomas da doença de interesse em todos os indivíduos, ele deve aliviar os sintomas da doença alvo de interesse em um número estatisticamente significativo de indivíduos, conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, tal como o t-teste de Student, o teste de qui-quadrado, o U-teste de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal-Wallis (teste H), o teste de Jonckheere-Terpstra e o teste de Wilcoxon.

[0099] "Quantidade eficaz" abrange uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal de uma condição médica. Quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um indivíduo ou animal em particular pode variar dependendo de fatores tais como a condição a ser tratada, a saúde geral do indivíduo, a via e dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais ou efeitos tóxicos significativos.

[0100] "Exógeno" se refere a substâncias que são produzidas fora de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto. "Endógeno" se refere a substâncias produzidas dentro de uma célula, organismo ou corpo humano, dependendo do contexto.

[0101] "Identidade" se refere à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeos ou entre dois polipeptídeos. Quando uma posição nas duas sequências a serem comparadas é ocupada pela mesma subunidade de monômero de base ou aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então, as moléculas são homólogas nesta posição. A percentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições coincidentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de posições a ser comparado *x 100. Por exemplo, se 6 de 10 posições em duas sequências forem coincidentes ou homólogas quando as sequências forem alinhadas de maneira ideal, as duas sequências compartilharão 60% de identidade. Em geral, a comparação é feita quando duas sequências são alinhadas para fornecer a percentagem de identidade máxima.

[0102] Conforme usado aqui, as expressões "célula", "linhagem de células" e "cultura de células" são usadas de forma alternada e todas de tais designações incluem sua progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária em questão e culturas da mesma derivadas sem considerar o número de passagens. Deve ser entendido também que toda progênie pode não ser precisamente idêntica quanto ao teor de DNA em virtude de mutações deliberadas ou aleatórias. A progênie mutante obtida por meio de triagem, a qual tem a mesma função ou atividade biológica que a célula originalmente transformada, também é considerada. Onde designações distintas são pretendidas, isto ficará evidente a partir do contexto.

[0103] "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância a seguir pode ocorrer, mas não necessariamente ocorre, e a descrição inclui casos em que o evento ou circunstância ocorre ou não. Por exemplo, "compreende opcionalmente 1-3 regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo" significa que a região variável de cadeia pesada do anticorpo com a sequência específica pode estar, mas não necessariamente, presente.

[0104] "Composição farmacêutica" se refere a uma mistura que contém um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos de acordo com a presente invenção ou um sal ou profármaco fisiológica/farmaceuticamente aceitável do mesmo com outros componentes químicos, bem como componentes adicionais, tais como veículos e excipientes fisiológica/farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica visa promover a administração a um organismo, facilitando a absorção do ingrediente ativo e, deste modo, exercendo um efeito biológico.

[0105] A seguir, o presente pedido é ainda descrito com referência a exemplos; no entanto, o escopo do presente pedido não se limita aos mesmos. Nos exemplos da presente invenção, onde condições específicas não são descritas, os experimentos são, em geral, conduzidos sob condições convencionais, conforme descrito em Antibodies, A Laboratory Manual e Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor, ou sob condições propostas pelo fabricante do material ou produto. Onde a fonte dos reagentes não é fornecida especificamente, os reagentes são reagentes convencionais comercialmente disponíveis. Exemplo 1: Preparação de Anticorpos

[0106] A biblioteca de anticorpos monoclonais anti-4-1BB humana foi produzida por meio de imunização de camundongos. Camundongos fêmeas da linhagem Balb/C e A/J de oito semanas de idade (Comparative Medical Center de Yangzhou University, número de licença produção animal: SCXK (Su) 2017-007) foram usados nos experimentos. Ambiente de alimentação: nível SPF. Após compra dos camundongos, os animais foram mantidos no laboratório por uma semana com um ciclo de 12/12 horas de claro/escuro, em uma temperatura de 20 a 25ºC e a uma umidade de 40 a 60%.

[0107] O antígeno para imunização foi a proteína recombinante 4- 1BB humana com o marcador Fc (4-1BB-Fc humana) adquirida a partir da Acro Biosystems, Cat. Nº Ht41B-H5258: expressa em HEK293, AA Glh 25-GIn 186 (http://wWww.acrobiosystems.cn/P150-Human 4- 1BB %7CTNFRSF9 ProteinC-Fc TagHEK293 expressed.html; Número de Acesso tNP 001552.2). O antígeno foi emulsionado com adjuvante de Freund (SIGMA, Cat. Nº: F5881/F5506): a primeira imunização foi realizada com adjuvante completo de Freund e as imunizações de reforço restantes foram realizadas com adjuvante incompleto de Freund. A proporção de antígeno para adjuvante foi de 1:1 e foram injetados 25 ug de proteína/200 ul/camundongo para cada imunização. O antígeno emulsionado foi inoculado por meio de injeção subcutânea em múltiplos locais (geralmente 6-8 locais nas costas) e uma injeção em um único local na planta dos pés nos dias 0, 21, 35 e 49 (primeira imunização e 3 imunizações de reforço). A última imunização de reforço foi realizada 3 dias antes de fusão de esplenócitos através de injeção intraperitoneal (IP) de 50 ug de proteína/camundongo da solução de antígeno formulada com soro fisiológico.

[0108] Nos dias 42 e 56, amostras de sangue foram coletadas dos camundongos imunizados e o antissoro foi isolado. Os soros dos camundongos foram submetidos ao método ELISA descrito no Exemplo 2 para determinar a titulação sérica de anticorpos nos camundongos e determinar a atividade neutralizante no bloqueio da ligação 4-1BB/4- 1BBL.

[0109] Após a quarta imunização, os camundongos com maior titulação sérica de anticorpos e com maior atividade no bloqueio de 4- 1BB/4-1BBL foram selecionados para fusão de esplenócitos. Os linfócitos de baço foram fundidos com células de mieloma Sp2/0 (ATCCE CRL-8287TY) usando o procedimento de fusão mediado por PEG otimizado e, em seguida, as células fundidas foram colocadas em placas com 96 cavidades e cultivadas em meio HAT durante 10 a 14 dias até ser observado o crescimento de células de hibridoma. Cerca de duas semanas após a fusão celular, a reatividade de ligação do meio de cultura de hibridoma à proteína 4-1BB recombinante foi detectada por meio de um ensaio ELISA indireto descrito no Exemplo 2 e o sobrenadante de células de hibridoma positivo foi capaz de reconhecer e se ligar à proteína 4-1BB recombinante.

[0110] As células de hibridoma positivas para 4-1BB identificadas pela triagem primária foram selecionadas, transferidas para uma nova placa com 96 cavidades e numeradas de acordo com a posição da placa de fusão. Depois de cultura adicional durante 3-4 dias, os sobrenadantes da cultura foram coletados e foram submetidos a um ensaio ELISA indireto ELISA descrito no Exemplo de Teste 1 para confirmar as cavidades positivas novamente. Depois que o meio de cultura foi coletado, o meio foi reabastecido. Para as cavidades positivas, os sobrenadantes foram coletados novamente para o triagem funcional com base em células 3-4 dias depois para selecionar células de hibridoma secretoras de anticorpo anti4-1BB ativado.

Procedimentos rápidos para triagem funcional foram como segue: coletar linhagens celulares com repórter 4-1BB (HEK293F-H4-1BB- NFKB) os quais estavam na fase de crescimento logarítmico e cultivar em placas com 96 cavidades em uma proporção volumétrica de 20 ul/cavidade (que compreende aproximadamente 10.000 células). Adicionar anticorpo secundário específico para Fc de camundongo (concentração final de 15 nM para ligação cruzada do anticorpo no sobrenadante) e 60 ul de sobrenadante celular ou solução de anticorpo a ser testado, incubar durante 5 horas, medir a atividade de luciferase com o ONE-Glo'"Y Luciferase Assay System (Promega, E6120) e selecionar células de hibridoma primárias nas quais o anticorpo anti-4- 1BB foi ativado de acordo com os valores medidos.

No experimento, os anticorpos Urelumab (BMS) e MOR7480 (Pfizer) foram usados como referências positivas e hlgG foi usada como uma referência negativa.

Os dados de triagem dos 17 principais hibridomas foram mostrados na tabela abaixo.

Tabela 1. Dados de triagem de hibridoma E Ea es Es E as [5 O [O Fe sa

[0111] As três células de hibridoma originais foram, de preferência,

diluídas de forma limitada através de dois ciclos de subclonagem para obter as linhagens celulares monoclonais (B1E10, B1E7 e B1A7) as quais foram, então, clonadas e sequenciadas. Os RNAs celulares totais foram obtidos por meio de técnicas de extração de RNA convencionais e, em seguida, os produtos de PCR das regiões variáveis de anticorpo monoclonal foram obtidos por meio de reação em cadeia de polimerase e transcrição inversa (RT-PCR). Os produtos de PCR foram separados e recuperados em gel de agarose e depois foram clonados em um vetor gênico e transformados em Escherichia coli Várias colônias transformadas foram aleatoriamente selecionadas e foram submetidas à amplificação por PCR para amplificar a região variável do anticorpo monoclonal para sequenciamento gênico.

[0112] As sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve do mAb B1E10 de murino eram as seguintes: B1E10 HCVR

EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFGDYYMYWVRQTPEKRLE

WVATISDGGSYTYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLDLQMSHLKSEDTAM YYCARYYSKALYAMDYWGRGTSVTVS SEQ ID Nº: 1 B1E10 LCVR

DIVLTASPASLAVSLGQRATLSCRASKSVSTSGFSYIHWYQQKPGQP

PKLLIYTASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHS RELPLTFGAGTKLEVK SEQ ID Nº: 2

[0113] Ele compreende as seguintes sequências de CDR: Tabela 2. Sequências de CDR

[0114] As sequências da região variável de cadeia pesada e leve do mAb B1E7 de murino eram as seguintes: B1E7 HCVR

EVAQLQQASGAELVRAGSSVEMSCKASGYTFTSYGLNWVKQRPGOGL

EWIGYINPGSGYTKYNEKFEGKTTLTVDKSSSTVYMQLRSLTSEDSA VYFCARWGLGRNWNFAVWGTGTTVTVSS SEQ ID Nº: 9 B1E7 LCVR

DIVLTASPASLAVSLGARATMSCRASESVDSYGNTFMHWYQQKPGQ

PPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEADDVATYYCQQ SNEDPLTFGSGTKLEIK SEQ ID Nº: 10

[0115] Ele compreende as seguintes sequências de CDR: Tabela 3. Sequências de CDR

[0116] As sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve do mAb B1A7 de murino eram as seguintes: B1A7 HCVR

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGL

EWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTATY YCAQMTSSVFAYWGQGTLVTVSA SEQ ID Nº: 37 B1A7 LCVR

DIVLTQSPDSLAVSLGOQRATISCRASESVDSYGHSFMHWYQQKPGQ

PPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINVVEADDVATYYCHQ SYEEPWTFGGGTTLELEK SEQ ID Nº: 38

[0117] Ele compreende as seguintes sequências de CDR:

Tabela 4. Sequências de CDR HCDR1 GFSLSTSGMGVG SEQ ID Nº: 39 HCDR2 HIWWDDVKRYNPALKS SEQ ID Nº: 40 HCDR3 MTSSVFAY SEQ ID Nº: 41 LCDR1 RASESVDSYGHSFMH SEQ ID Nº: 42 LCDR2 RASNLES SEQ ID Nº: 43 LCDR3 HQSYEEPWT SEQ ID Nº: 44 Exemplo 2: Identificação e Triagem de Anticorpos Por Meio do Ensaio ELISA

1. Ensaio de ligação através ELISA indireto in vitro:

[0118] A proteína 4-1BB-Fc humana foi diluída para uma concentração de 2 ug/ml com tampão de carbonato, pH de 9,6, e adicionada a uma placa de microtitulação com 96 cavidades em um volume de 100 ul/cavidade e colocada em uma incubadora a 37ºC durante duas horas. A placa foi lavada uma vez com PBST (PBS que contém Tween-20 a 0,05%, pH de 7,4), solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (Skim Milk Powder, Bright Dairy) diluída com PBST foi adicionada a 200 ul/cavidade e incubada a 37ºC durante duas horas ou a 4ºC durante a noite (16-18 horas) para bloqueio. Uma vez terminado o bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com tampão PBST.

[0119] Os soros de camundongo de teste (ou anticorpos, sobrenadantes da cultura celular) foram diluídos em várias concentrações com solução de diluição da amostra que contém NHS a 5% (leite desnatado a 2,5% em PBST) (isto é, a concentração final de IgG humana normal é de 1 mg/ml), incubados em temperatura ambiente durante 40 minutos, adicionados à placa de microtitulação a 100 ul/cavidade e incubados a 37ºC durante 40 minutos. Após incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de anticorpo secundário anti-camundongo marcado com HRP (Jackson Immuno Research, cattt 115-036-071) diluído com PBST foram adicionados e incubados a 37ºC durante 40 minutos. A placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de substrato cromogênico TMB (Huzhou Innoreagents Biotechnology Co., Ltd.) adicionados, incubados em temperatura ambiente durante 10-15 minutos no escuro e 50 ul/cavidade de H2SOs a IM adicionados para finalizar a reação. À absorbância foi lida a 450 nm sob um leitor de microplacas (Beijing Prang New Technology Co., Ltda., Modelo DNM-9602) e os dados resultantes foram analisados.

2. Ensaio de Ligação Via ELISA de Captura /n Vitro:

[0120] O anticorpo secundário IgG de cabra anticcamundongo (Jackson Immuno Research, cattt 115-006-071) foi diluído para uma concentração de 2 ug/ml com tampão PBS, pH de 7,4, adicionado a uma placa de microtitulação com 96 cavidades a 100 ul/cavidade e colocado em uma incubadora a 37ºC durante duas horas. A placa foi lavada uma vez com PBST, 200 ul/cavidade de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (Skim Milk Powder, Bright Dairy) diluída com PBST adicionados e incubados a 37ºC durante duas horas ou a 4ºC durante a noite (16- 18 horas) para bloqueio. Após o término do bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com PBST.

[0121] Os soros de camundongo de teste foram diluídos em várias concentrações com solução de diluição de amostra de NHS a 5 % (leite desnatado a 2,5%5º em PBST), incubados em temperatura ambiente durante 40 minutos, adicionados à placa a 100 ul/cavidade e incubados a 37ºC durante 40 minutos. Após incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade da proteína 4-1BB-his biotinilada

(Sinobiological, Beijing %& 10041-H08H) diluída com a solução de diluição de amostra adicionados e incubados a 37ºC durante 40 minutos. Após incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de estreptavidina marcada com HRP (Jackson Immuno Research, cattt 016-030-084) diluída com PBST adicionados e incubados a 37ºC durante 40 minutos. A placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de substrato cromogênico TMB (Huzhou Innoreagents Biotechnology Co., Ltda.) adicionados, incubados em temperatura ambiente durante 10-15 minutos no escuro e 50 ul/cavidade de H2SO. a IM adicionados para finalizar a reação. A absorbância foi lida a 450 nm sob um leitor de microplacas (Beijing Prang New Technology Co., Ltda., Modelo DNM-9602) e os dados resultantes foram analisados. Os resultados do ELISA de captura de três anticorpos de camundongo de hibridoma e o anticorpo de referência MOR7480 da Pfizer e o anticorpo de referência Urelumab da BMS foram mostrados na Figura 1. Os valores de EC5o foram mostrados na tabela abaixo. Tabela 5. Valores de EC5so

3. Bloqueio da Ligação de 4-1BB a 4-1BBL Pelos Anticorpos Através do Ensaio ELISA:

[0122] O ligante 4-1BB (isto é, membro da superfamília do ligante do fator de necrose tumoral 9, TNFSF9) é capaz de se ligar à 4-1BB na superfície da célula T e pode ativar a função imune da célula T como um sinal coestimulador positivo. Neste ensaio, os anticorpos anti4-1BB humanos selecionados foram testados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação da proteína 4-1BB humana ao ligante 4-1BB humano através de um ensaio de bloqueio in vitro.

[0123] Especificamente, a proteína 4-1BB-his humana foi revestida em uma placa com 96 cavidades, anticorpos anti-4-1BB humanos (ou soros de camundongo) adicionados e incubados e a proteína 4-1BBL- Fc humana foi adicionada, incubada e lavada. A quantidade de ligação de 4-1BBL-Fc à 4-1BB revestida no fundo da placa foi determinada por um anticorpo secundário anti-lgG humano anti-lgG de cabra marcado com HRP (Jackson Immuno Research, cat. f1109-036-098) e os valores de ICs5so dos anticorpos 4-1BB no bloqueio do epítopo ativo de 4-1BB foram calculados.

[0124] A proteína 4-1BB-his foi diluída para uma concentração de 2 pg/ml com um tampão de carbonato, pH de 9,6, e adicionada a uma placa de microtitulação com 96 cavidades em um volume de 100 ul/cavidade e colocado em uma incubadora a 37ºC durante duas horas. A placa foi lavada uma vez com PBST, 200 ul/cavidade de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (Skim Milk Powder, Bright Dairy) diluída com PBST adicionados e incubados a 37ºC durante duas horas ou a 4ºC durante a noite (16-18 horas) para bloqueio. Após o término do bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com PBST.

[0125] Os soros de camundongo de teste ou os anticorpos e o controle interno 4-1BBL foram diluídos para várias concentrações com uma solução diluente de amostra (leite desnatado em PBST a 2,5%), adicionados a uma placa a 100 ul/cavidade e incubados em uma incubadora a 37ºC durante 40 minutos. Após incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de proteína 4-1BBL-Fc a 0,8 ng/ml (Acro, H41L-H5257) diluída com uma solução de diluição de amostra adicionados e incubados a 37ºC durante 40 minutos. Após incubação, a placa foi lavada 4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de anticorpo secundário anti-lgG humano de cabra marcado com HRP (Jackson Immuno Research, cat. %4109-036-098) diluído com PBST adicionados e incubados a 37ºC durante 40 minutos. A placa foi lavada

4 vezes com PBST, 100 ul/cavidade de substrato cromogênico TMB adicionados (Huzhou Innoreagents Biotechnology Co. Ltda), incubados em temperatura ambiente durante 10-15 minutos no escuro e 50 ul/cavidade de H2SO,a a 1M adicionados para finalizar a reação. À absorbância foi lida a 450 nm sob um leitor de microplacas (Beijing Prang New Technology Co., Ltda., Modelo DNM-9602) e os dados resultantes foram analisados. Os resultados dos três anticorpos de camundongo de hibridoma e o anticorpo de referência da Pfizer no bloqueio de 4-1BBL foram mostrados na Figura 2 e os valores de EC5so foram mostrados na tabela abaixo. Tabela 6. Valores de EC5o [| Jeveo[ ater [ev Juanes [uowraso [551]

[0126] Conforme pode ser visto a partir da tabela, tanto B1E7 como B1A7 bloqueiam efetivamente o epítopo de 4-1BBL, enquanto que B1E10, MOR7480 e Urelumab não podem bloquear a ligação ao 4- 1BBL. Exemplo 3: Construção e Expressão de Anticorpos Quiméricos Recombinantes Anti-4-1BB

[0127] Mutações de aminoácidos sítio dirigidas foram introduzidas na região FR (região estrutural) da região variável de cadeia pesada (VH) e na região variável de cadeia leve (VL) dos anticorpos de murino B1E10 e B1E7 do presente pedido, respectivamente. De acordo com diferentes combinações de mutações de aminoácidos, foram concebidas diferentes cadeias pesadas e leves de anticorpos humanizados e plasmídeos com diferentes combinações de cadeias leves e pesadas foram transfectados para dentro das células para produzir anticorpos humanizados.

[0128] O vetor de cadeia pesada foi concebido da seguinte forma:

peptídeo sinalizador + sequência da região variável de cadeia pesada mutante + sequência da região constante de IgG1 humana. O vetor de cadeia leve foi concebido da seguinte forma: peptídeo sinalizador + sequência da região variável de cadeia leve mutante + sequência constante da região capa humana. As sequências acima foram inseridas no vetor pCEP4, respectivamente. Após confirmação dos plasmídeos vetoriais, os plasmídeos foram extraídos e submetidos a sequenciamento para verificação. Os plasmídeos validados foram transfectados para células 293F humanas com PEI. Células 293F cultivadas continuamente foram cultivadas em meio isento de soro (Shanghai Aupmaxi, OPM-293CDO03) até atingir a fase de crescimento logarítmico e usadas para transfecção celular. Foram dissolvidos 21,4 ug do plasmídeo que compreende a cadeia leve de anticorpo humanizado e 23,6 ug do plasmídeo que compreende a cadeia pesada de anticorpo humanizado em 10 ml de meio de soro reduzido Opti- MEM?º | (GIBCO, 31985-070), bem misturados e depois 200 ug de PEI adicionados, misturados, incubados em temperatura ambiente durante min e adicionados a 50 mL de células. Condições de cultura de células: 5% de CO,, 37ºC, 125 rom/min. Durante a cultura, o material suplementar foi adicionado nos dias 1 e 3, até que a viabilidade celular fosse inferior a 70% e os sobrenadantes celulares foram coletados e centrifugados. O meio de cultura celular centrifugado foi carregado em uma coluna de afinidade para purificação de anticorpos e lavado com tampão de fosfato, eluído com tampão de glicina-ácido clorídrico (pH de 2,7, GIy-HCI a 0,1 M), neutralizado com ácido clorídrico e Tris a 1 M, pH de 9,0 e dialisado contra tampão de fosfato para finalmente obter os anticorpos quiméricos purificados CRB1E10 e ChB1E7.

Exemplo 4: Ensaio Repórter em Células /n Vitro de Anticorpos Anti- 4-1BB

[0129] A linhagem de células estável HEK293F-h4-1BB-NFKB

(Shanghai ChemPartner Chemistry) foi descongelada com meio DMEM/FBS e as células passadas foram semeadas em uma placa com 96 cavidades a 4 x 10º células por cavidade. Cada anticorpo (incluindo os anticorpos de teste, o anticorpo de referência, o controle de IgG negativo e assim por diante) foi misturado com anti-F(ab')2 em uma proporção, diluído em série e incubado a 37ºC durante 0,5 horas em uma incubadora para cultura de células. Os anticorpos foram, então, adicionados à placa com as células, incubados durante 5 horas na incubadora, 100 ul de tampão de detecção adicionados para lise das células e incubados em temperatura ambiente durante 10 minutos no escuro. As leituras de fluorescência foram medidas com o instrumento Envision e as curvas de concentração de atividade foram representadas. Os resultados dos três anticorpos de murino obtidos no ensaio repórter in vitro foram mostrados na Figura 3. O valor de leitura do repórter para B1E10 foi mais forte do que aquele para a referência MORZ7480 da Pfizer; enquanto que o valor para B1E7 foi um pouco mais fraco do que a referência. Exemplo 5: Afinidade e Cinética de Ligação /n Vitro dos Anticorpos Recombinantes

[0130] Biacore é um método bem conhecido para a detecção objetiva da afinidade e cinética de proteínas. Os presentes inventores analisaram a afinidade e cinética de ligação características de anticorpos 4-1BB a serem testados no presente pedido via Biacore T200 (GE).

[0131] Os anticorpos anti-4-1BB recombinantes a serem testados do presente pedido foram ligados covalentemente ao chip CM5 (GE) por meio do método de acoplamento de amina NHS padrão com um kit disponível a partir da Biacore. Em seguida, uma série de concentrações de gradiente da proteína 4-1BB His humana (SinoBiological, Beijing tt 10041-H08H) diluída no mesmo tampão foi injetada em uma vazão de ul/min. A regeneração foi realizada com os reagentes de regeneração fornecidos no kit. A cinética de ligação antígeno-anticorpo foi acompanhada durante 3 minutos e a cinética de dissociação foi acompanhada durante 10 minutos. Os dados resultantes foram analisados usando o modelo de ligação a 1:1 (Langmuir) com o software BlAevaluation, disponível a partir da GE. Os valores de ka (kon), kd (koff) e Kp dos anticorpos quiméricos determinados por este método foram mostrados na tabela abaixo. Tabela 7. Parâmetros cinéticos dos anticorpos Anticorpos a serem Exemplo 6: Humanização de Anticorpos de Camundongo

[0132] No presente exemplo, duas linhagens (B1E10 e B1E7) que têm a atividade funcional mais forte dentre os anticorpos de murino resultantes foram humanizadas. Com base na estrutura típica do anticorpo de murino VH/VLCDR obtido, as sequências das regiões variáveis de cadeias leve e pesada foram alinhadas com aquelas descritas no banco de dados de anticorpos Germline para obter um modelo de linhagem germinativa humana com alta homologia.

[0133] A região estrutural da cadeia leve de linhagem germinativa humana foi derivada do gene de cadeia leve x humana e o modelo da cadeia leve de linhagem germinativa humana usado no presente pedido foram, de preferência, IGKV3-11*01 (para B1E10) e IGKV4-1*01 (para B1E7). A região estrutural de cadeia pesada de linhagem germinativa humana foi derivada da cadeia pesada humana e os modelos de cadeia pesada de linhagem germinativa humana usados no presente pedido foram, de preferência, IGHV3-30*01 (para B1E10) e IGHV1-46*01 (para B1E7).

Modelo de cadeia pesada de linhagem germinativa humana IGHV3-30*01 (SEQ ID Nº: 21):

QVALVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGL EWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCAR Modelo de cadeia leve de linhagem germinativa humana IGKV3-11*01 (SEQ ID Nº: 22):

EIVLTAOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP Modelo de cadeia pesada de linhagem germinativa humana IGHV1-46*01 (SEQ ID Nº: 23):

QVALVASGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGOGL EWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT

AVYYCAR Modelo de cadeia leve de linhagens germinativa humana IGKV4-1*01 (SEQ ID Nº: 24):

DIVMTQOSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPG QPPKLLIYNWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYC QQYYSTP

[0134] As regiões CDR do anticorpo de murino foram enxertadas no modelo humanizado selecionado como um substituto para as regiões variáveis humanizadas e depois recombinadas com a região constante de IgG. Em seguida, com base na estrutura tridimensional do anticorpo de murino, os resíduos de incorporação, os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR e os resíduos que exercem uma influência importante na conformação de VL e VH, foram submetidos à retromutação. Além disso, para o anticorpo B1E10, o resíduo de aminoácido quimicamente instável nas regiões CDR foi otimizado, isto é, HCDR2: TISDGGSYTYYPDNVKG (SEQ ID Nº: 4) foi otimizado como: TISEGGSYTYYPDNVKG (SEQ ID Nº: 45). Uma serie de moléculas humanizadas foi obtida.

[0135] A sequência da região variável de cadeia pesada dos dois anticorpos é mostrada em SEQ ID Nº: 25-27 e SEQ ID Nº: 31-33, respectivamente; as sequências da região variável de cadeia leve são apresentadas em SEQ ID Nº“: 28-30 e SEQ |D Nº: 34-36, respectivamente.

huB1E10-VH-a (SEQ |D Nº: 25):

EVOLVESGGGVYVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYYMYWVRQAPGKGL EWVATISEGGSYTYYPDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARYYSKALYAMDYWGRGTLVTVSS huB1E10-VH-b (SEQ |D Nº: 26):

EVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYYMYWVRQAPGKGL EWVATISEGGSYTYYPDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARYYSKALYAMDYWGOQGTLVTVSS huB1E10-VH-c (SEQ ID Nº: 27):

EVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYYMYWVRQAPGKGL EWVATISEGGSYTYYPDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARYYSKALYAMDYWGRGTLVTVSS huB1E10-VL-a (SEQ ID Nº: 28):

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGFSYIHWYQQAKPGQA PRLLIYTASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSR

ELPLTFGQGTKLEVK huB1E10-VL-b (SEQ ID Nº: 29):

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGFSYIHWYQQKPGQP PRLLIYTASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSR

ELPLTFGQAGTKLEVK huB1E10-VL-c (SEQ ID Nº: 30):

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGFSYIHWYQQKPGQP PRLLIYTASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHS

RELPLTFGQGTKLEVK huB1E7-VH-a (SEQ ID Nº: 31):

EVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYGLNWVRQAPGQOGL EWIGYINPGSGYTKYNEKFEGRTTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTA

VYFCARWGLGRNWNFAVWGTGTLVTVSS huB1E7-VH-b (SEQ ID Nº: 32):

EVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYGLNWVRQAPGOGL EWMGYINPGSGYTKYNEKFEGRTTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTA

VYFCARWGLGRNWNFAVWGTGTLVTVSS huB1E7-VH-c (SEQ ID Nº: 33):

EVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYGLNWVRQAPGOGL EWMGYINPGSGYTKYNEKFEGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA

VYYCARWGLGRNWNFAVWGQGTLVTVSS huB1E7-VL-a (SEQ ID Nº: 34):

DIVLTASPDSLAVSLGERATINCRASESVDSYGNTFMHWYQQKPGQ PPKLLIYRASNLESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQ

SNEDPLTFGQGTKLEIK huB1E7-VL-b (SEQ ID Nº: 35):

DIVLTASPDSLAVSLGERATINCRASESVDSYGNTFMHWYQQKPGQ PPKLLIYRA SNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQSNEDPLTF

GQAGTKLEIK huB1E7-VL-c (SEQ ID Nº: 36):

DIVMTQOSPDSLAVSLGERATINCRASESVDSYGNTFMHWYQQKPGQ PPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQ SNEDPLTFGQGTKLEIK

[0136] Após um teste de expressão em pequena escala para as combinações acima de cada cadeia leve e pesada (conforme descrito no Exemplo 3), uma comparação do número de retromutações e uma avaliação abrangente, a molécula de anticorpo huB1E10 humanizada (com cadeia pesada VH-c e cadeia leve VL-c) e a molécula de anticorpo huB1E7 (com cadeia pesada VH-c e cadeia leve VL-c) foram finalmente selecionadas. As sequências intactas das cadeias leve e pesada (subtipo IgG1) destes anticorpos são apresentadas em SEQ ID Nº: 17-

20.

huB1E10 HC

EVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYYMYWVRQAPGKGL EWVATISEGGSYTYYPDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARYYSKALYAMDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY

PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº: 17 huB1E10 LC

EIVLTASPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGFSYIHWYQQKPGQP PRLLIYTASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHS RELPLTFGQGTKLEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF

YPREAKVQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº: 18 huB1E7 HC

EVOLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYGLNWVRQAPGQGL EWMGYINPGSGYTKYNEKFEGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCARWGLGRNWNFAVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQOSSGLYS LSSVVTVPSSNFGTAQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCP APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK SEQ ID Nº: 19 huB1E7 LC

DIVMTQOSPDSLAVSLGERATINCRASESVDSYGNTFMHWYQQKPGQ PPKLLIYR ASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQSNEDPLT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº: 20 Exemplo 7: Ensaio Funcional de Ativação de Células PBMCs /n Vitro

[0137] A viabilidade celular na presença de anticorpos anti-4-1BB foi detectada por meio de um ensaio de proliferação de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humanas frescas.

[0138] PBMCs humanas frescas foram isoladas de sangue fresco contendo heparina anticoagulante por meio de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll. Várias concentrações de anticorpo anti- 4-1BB por diluição em gradiente e anticorpo anti-CD3 a 3 ug/mL foram revestidas em placas para ELISA e incubadas a 4ºC durante a noite. À placa foi lavada no dia seguinte, células mononucleares de sangue periférico adicionadas em uma densidade de 2 x 10º/cavidade e incubadas em uma incubadora a 37ºC, 5% de CO» durante 7 dias. Após incubação, a proliferação de PBMCs foi detectada com um kit CCK-8. Os valores de ODa450o foram detectados e os valores de ECso foram calculados a partir dos valores de ODaso.

[0139] Como um resultado, conforme mostrado na Figura 4, os anticorpos humanizados huB1E7 e huB1E10 (ambos são de subtipo I9G1) mostraram maior eficiência na ativação da proliferação de PBMCs comparado com o anticorpo de referência MOR7480, em que huB1E7 mostrou uma função de ativação mais forte. Exemplo 8: Dados de Atividade dos Anticorpos Humanizados

[0140] Um ensaio de atividade repórter in vitro foi realizado para os anticorpos humanizados (os procedimentos foram conforme descrito no Exemplo 4). Os resultados foram mostrados na Figura 5. Consistente com a tendência apresentada nos anticorpos de murino, o huB1E10 mostrou uma atividade aumentada de ativação do repórter quando comparado com o anticorpo de referência MOR7480, enquanto que o huB1E7 mostrou uma atividade mais fraca do que a referência. Esta tendência foi inconsistente com o que foi observado para a atividade de proliferação de PBMCs.

[0141] Foi realizado um ensaio cinético de afinidade in vitro para os anticorpos humanizados (os procedimentos foram conforme descrito no Exemplo 5) e os resultados foram mostrados na tabela abaixo: Tabela 8. Ensaio de Cinética de Afinidade [amenos somas [iv [raro | 100 |

[0142] Os resultados mostraram que ambos os anticorpos humanizados huB1E7 e huB1E10 mantiveram a atividade de ligação à 4-1BB, em que a afinidade de huB1E10 foi quase duas vezes maior do que aquela do anticorpo de referência MOR7480 e a afinidade de huB1E7 foi um pouco mais fraca.

Exemplo 9: Inibição do Crescimento de Células Tumorais em Camundongos Transgênicos Por Anticorpos Anti-4-1BB

[0143] Camundongos transgênicos hu4-1BB C57BL/6 (fêmeas) foram alojados em um ambiente de instalação de SPF no Animal Center da Beijing Biotech Co., Ltda. usando uma gaiola de ventilação independente com IVC. Os camundongos foram submetidos a 3-7 dias de alimentação adaptativa antes do experimento. Temperatura: 20-26ºC; Umidade: 40-70%; Iluminação: ciclo de 12/12 horas de claro/escuro.

[0144] Células MC38 foram adquiridas a partir da Shanghai Shunran Biotechnology Co., Ltda. e as células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal bovino inativado a 10% (meio Eagle modificado por Dulbecco) em uma incubadora a 37ºC, 5% de CO?2.

[0145] As células foram subcultivadas a cada 3 a 4 dias, quando se aproximavam da confluência completa. Os camundongos homozigotos humanizados para hu4-1BB foram inoculados subcutaneamente no flanco direito com uma concentração de 5 x 106/ml de células tumorais MC38 ressuspensas em PBS a 0,1 ml/camundongo e um total de 50 camundongos foram inoculados.

[0146] Os volumes tumorais foram medidos duas vezes com paquímetro e os diâmetros longos e curtos dos tumores foram medidos. O volume do tumor foi calculado da seguinte forma: volume do tumor (mm?) = 0,5 x (diâmetro longo x diâmetro curto?).

Taxa de inibição relativa de tumor TGI (%): TGI% = (1-T/C) x 100%

[0147] TIC % significa a taxa relativa de aumento do tumor, isto é, a porcentagem de volume do tumor ou peso do tumor do grupo de tratamento em relação ao grupo de controle em um determinado momento. T e C são o volume do tumor (TV) ou o peso do tumor (TW) do grupo de tratamento e do grupo controle com I9G1 em um momento específico, respectivamente.

[0148] Quando o volume médio do tumor atingiu 140 mm?, os camundongos com um volume moderado de tumor foram selecionados e aleatoriamente designados para cada grupo experimental de acordo com o volume do tumor. A administração de medicamentos foi iniciada no dia do agrupamento. O regime de dosagem específico é mostrado na tabela a seguir. Após a última administração, o peso corporal e o crescimento tumoral dos animais foram observados por 9 dias e o experimento foi encerrado. Durante a observação, o volume do tumor e o peso corporal do animal foram medidos duas vezes por semana e os valores medidos foram registrados, conforme mostrado na Tabela 10. Ao final do experimento, o tumor foi removido dos camundongos e pesado. Os animais foram sacrificados e os tumores foram fotografados. Tabela 9. Regime de dosagem Grupo fármaco de a Dosagem Di Frequência de Nímero este feamundanges) (mg/kg)? tração administração doses 1 branco (666) 6 - injeçãoi.p. 03d 6 2 huB1E10-l9G1 6 10 injeção i.p. 03d 6 3 huB1E10-lgG2 6 10 injeção i.p. 03d 6 4 MOR7480-lgG2 6 10 injeção i.p. 03d 6 huB1E7-l9G1 6 10 injeção i.p. 03d 6

[0149] Os resultados do teste farmacológico foram mostrados na Tabela 10, Figura 6 e Figura 7. A eficácia do subtipo huB1E10-l9G2 de anticorpo foi próxima do agente de referência MOR7480 da Pfizer na mesma dosagem, enquanto que a eficácia do subtipo huB1E10-Ig9G1 foi significativamente aprimorada, embora sem efeito significativo sobre o peso corporal dos camundongos.

[0150] O anticorpo huB1E7-Ig9G1 mostrou eficácia significativamente mais potente, em que 2 de 6 camundongos portadores de tumor mostraram eliminação completa de tumores.

Tabela 10. Volume do tumor nos camundongos (mm?) Dias após inoculação ETF e E) Grupo Animal No. FEET ke) 32328 | 125,9 | 2057 | 3674 | 4834 | s773 | 13667 11417 | 14589 Q3DX6 : : á : : : : : [nc [ra [as [36 [im [16 [1 [as [o | [o [a [re [5 [6 [59 [6 [73 [ou] [sm nda e a | eis [|

EXRIMEADICDIDIDICI 32332 | 1592 | 2688 | 1934 | 189,9 | 1430 2 32359 | 1346 | 2042 | 485,0 | 429,0 | 5461 | 610.0 | 8169 | 7296 B1E10-19G1 [nata [10 [am [om Jan [2 [0 [2 [| mg/kg, i.p., 3DX6

ECNENCNNADINICICIEAS [sm sds e e n/a a Valor CV | 224% | 234% | 44,0% | 48,9% | 69,7% | 91,8% | 1264% | 120,5% [76 [Jose [oo [as [os [ 0500 [ oa [ os | 0,991 0,320 | 0,026 | 0,011 | 0,002 0,011 32344 | 134,9 | 2101 | 1742 | 1851 | 1467 | 1101 G3 B1E10-I962 32348 329,0 | 308,3 | 6168 | 9612 10 mg/kg, i.p., 03DX6 32362 | 1094 | 292,3 | 481,7 | 4241 | 5716 | 7121 | 11309 | 11703

[an Te see EEE] ENINNIDIDIDDTITC: [Gs [1 a [e [5 [7 [21 [2] [7s To aos [ez [as | osm | ns | nes [eso | [ras 100 [om [0406 [omo [oo [ 005 | 0x0 [ox |

ESSCIDIDIDIDIDIDITE “ MORT7480-lgG2 ETSNIDNDINDITIT: mg/kg, i.p., 03DX6 ENSINO: ENrNNNTINIDTIcI: [36 fase [om [os Jos [ 005 | eme [ oca | [ras 305 [9506 [0m0 [one [00 [ 000 | oms | 00x | [Car [105 [1618 [ama] 153 [00 [ua [17 [00 | EXMIDCMIDIDNDITIT:

EXSCICIDADIDICIDSES Sam [me [2a [128 [201 [100] 103 [ 107 | 00 | B1E7-1961 o [ma [ms e = a nfs e) 10 mg/kg, ip, Q3DX6

ENIINDTINNNIT

ETNENENNSESENCSNNNS [36 [o [asa [om [oso [105 | 100] 1700 | 105 | [Fra [os [om [oo [000 [900 [mo [ oma | 0x0 |

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que: a região variável de cadeia pesada de anticorpo compreende: (1) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente; ou (1) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 45 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente; ou (II) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12 e SEQ ID Nº: 13, respectivamente; ou (IV) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 39, SEQ ID Nº: 40 e SEQ ID Nº: 41, respectivamente; e/ou a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende: (1) LOCDR1I, LCDR2e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7e SEQ ID Nº: 8, respectivamente; ou (11) LCDR1I, LCDR2e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15e SEQ ID Nº: 16, respectivamente; ou (Il) LCDR1I, LCDR2e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 42, SEQ ID Nº: 43e SEQ ID Nº: 44, respectivamente.

2. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em (1) a (IV): (1) uma região variável de cadeia pesada que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4 e SEQ ID Nº: 5, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR?2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7 e SEQ ID Nº: 8, respectivamente;

(Il) uma região variável de cadeia pesada que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 45 € SEQID Nº 5; e uma região variável de cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR?2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 7e SEQ ID Nº: 8, respectivamente; (Ill) uma região variável de cadeia pesada que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 12 e SEQ ID Nº: 13, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR?2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 156 SEQ ID Nº: 16, respectivamente; (IV) uma região variável de cadeia pesada que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 39, SEQ ID Nº: 40 e SEQ ID Nº: 41, respectivamente; e uma região variável de cadeia leve que compreende LCDR1, LCDR?2 e LCDR3 conforme apresentado em SEQ ID Nº: 42, SEQ ID Nº: 43 e SEQ ID Nº: 44, respectivamente.

3. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a região variável de cadeia pesada é apresentada em SEQ ID Nº: 1 e a região variável de cadeia leve é apresentada em SEQ ID Nº: 2; ou a região variável de cadeia pesada é apresentada em SEQ ID Nº: 9e a região variável de cadeia leve é apresentada em SEQ ID Nº: 10; ou a região variável de cadeia pesada é apresentada em SEQ ID Nº: 37 e a região variável de cadeia leve é apresentada em SEQ ID Nº: 38.

4. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo de murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo.

5. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região estrutural de cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é derivada a partir de uma cadeia pesada mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 21 e SEQ ID Nº: 23; e/ou a região estrutural de cadeia leve é derivada a partir de uma cadeia leve mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 22 e SEQ ID Nº: 24.

6. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em (1) a (V): (1) uma região variável de cadeia pesada, a qual é mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 25-27 e SEQ ID Nº: 31-33; e/ou uma região variável de cadeia leve, a qual é mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 28-30 e SEQ ID Nº: 34-36; (1l) uma região variável de cadeia pesada, a qual é mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 25-27, e/ou uma região variável de cadeia leve, a qual é mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 28-30;

(Ill) uma região variável de cadeia pesada, a qual é mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 31-33, e/ou uma região variável de cadeia leve, a qual é mostrada como a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 34-36; (IV) uma região variável de cadeia pesada, a qual é apresentada em SEQ ID Nº: 27, e/ou uma região variável de cadeia leve, a qual é apresentada em SEQ ID Nº:30; e (V) uma região variável de cadeia pesada, a qual é apresentada em SEQ ID Nº: 33, e/ou uma região variável de cadeia leve, a qual é apresentada em SEQ ID Nº:36.

7. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em (1) a (V): (Il) uma cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme apresentado em SEQ ID Nº: 17 ou uma sequência variante da mesma, SEQ ID Nº: 19 ou uma sequência variante da mesma; e/ou uma cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID Nº: 18 ou uma sequência variante da mesma, SEQ ID Nº: 20 ou uma sequência variante da mesma; (1l) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com (I), em que a sequência variante compreende O a 10 alterações de aminoácidos na região variável de cadeia leve e/ou compreende O a 10 alterações de aminoácidos na região variável de cadeia pesada;

(Ill) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com (I) ou (Il), em que:

uma sequência variante de SEQ ID Nº: 17 compreende qualquer uma das mutações nas posições 53, 75 e 112 ou qualquer combinação das mesmas; e/ou uma sequência variante de SEQ ID Nº: 18 compreende qualquer uma das mutações nas posições 47 e 62 ou uma combinação das mesmas; e/ou uma sequência variante de SEQ ID Nº: 19 compreende qualquer uma das mutações nas posições 48, 95 e 112 ou qualquer combinação das mesmas; e/ou uma sequência variante de SEQ ID Nº: 20 compreende qualquer uma das mutações nas posições 4 e 62 ou uma combinação das mesmas;

(IV) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com (Ill), em que:

uma sequência variante de SEQ ID Nº: 17 compreende qualquer uma das mutações E53D, A75S e R112Q ou qualquer combinação das mesmas; e/ou uma sequência variante de SEQ ID Nº: 18 compreende qualquer uma das mutações P47A e V62!| ou uma combinação das mesmas; e/ou uma sequência variante de SEQ ID Nº: 19 compreende qualquer uma das mutações M48|l, Y95F e Q112T ou qualquer combinação das mesmas; e/ou uma sequência variante de SEQ ID Nº: 20 compreende qualquer uma das mutações M4L e V62! ou uma combinação das mesmas;

(V) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer um de (11) a (IV), em que a mutação em SEQ ID Nº: 17 é E53D.

8. Anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende uma região estrutural de cadeia pesada de I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou uma variante das mesmas; de preferência compreende uma região estrutural de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana; mais preferivelmente compreende uma região estrutural de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2 humana.

9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compete com o anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 pela ligação à 4-1BB ou um epítopo da mesma.

10. Anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Anticorpo com uma única cadeia caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

12. Conjugado de anticorpo-fármaco caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

13. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 9, o anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico como definido na reivindicação 10, o anticorpo com uma única cadeia como definido na reivindicação 11, o anticorpo conforme definido no conjugado de anticorpo-fármaco como definido na reivindicação 12, de preferência, o polinucleotídeo é DNA ou RNA.

14. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13, de preferência o vetor de expressão é um vetor viral, mais preferivelmente o vetor de expressão é um vetor viral oncolítico.

15. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor de expressão como definido na reivindicação 14, de preferência, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, de levedura, de mamífero, mais preferivelmente a célula hospedeira é Escherichia coli, Pichia pastoris, uma célula de ovário de hamster Chinês ou uma célula de rim embriônico humano 293.

16. Método para preparar um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: expressar o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15;e isolar o anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula hospedeira.

17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende: qualquer um ou qualquer combinação selecionada a partir do grupo que consiste no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9,0 anticorpo biespecífico ou multiespecífico como definido na reivindicação 10, o anticorpo com uma única cadeia como definido na reivindicação 11, o conjugado de anticorpo-fármaco como definido na reivindicação

12, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13 e o vetor de expressão como definido na reivindicação 14; e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

18. Uso de qualquer um dos seguintes caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento ou uma composição farmacêutica: o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o anticorpo biespecífico ou multiespecífico como definido na reivindicação 10, o anticorpo com uma única cadeia como definido na reivindicação 11, o conjugado de anticorpo-fármaco como definido na reivindicação 12, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13 e o vetor de expressão como definido na reivindicação 14, ou qualquer combinação dos mesmos, em que: o medicamento ou a composição farmacêutica é para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por 4- 1BB ou mediada por 4-1BBL; de preferência, a doença é câncer; de preferência, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tiroide, câncer de esôfago, câncer de colo do útero, sarcoma, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, câncer de vesícula biliar e glioblastoma.

19. Método para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediada por 4-1BB ou mediada por 4-1BBL caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um indivíduo uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1a, o anticorpo biespecífico ou multiespecífico como definido na reivindicação 10, o anticorpo com uma única cadeia como definido na reivindicação 11, o conjugado de anticorpo-fármaco como definido na reivindicação 12, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13, o vetor de expressão como definido na reivindicação 14 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 17, ou qualquer combinação dos mesmos,

de preferência, a doença é câncer;

mais preferivelmente, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tiroide, câncer de esôfago, câncer de colo do útero, sarcoma, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, câncer de vesícula biliar e glioblastoma.

2.0 B1E1I0 B1E7 s ' .* + B1A7 8 —* Urelumabe SS PKR — MOR7480 L x V oO Oo 05 NO ,

0.0 =] 10º 10? 10º 10? 10º Concentração de antígeno huCD137-his (ng/ml) Fig 1

0.8 B1E10 6 B1E7 ' — B1A7 gs * — Urelumabe < 0.4 We o + SS — MOR7480 Ss v CD137L a 02 N o A

0.0 Es o 1 2 3 4 5 Concentração de anticorpo/ligante (ng/ml) Fig 2

S 9000 õ S — migG 8 — B1A7 2 6000 — B1EIO 8 ++ B1E7 ã 3000 — MOR7480 à = —s é * a

MH 10º 10º 402 10% 10 100 18 Concentração de anticorpo (ug/ml) Fig 3 - 2.0 É, a EB 3 ug/ml = AB 1 ug/ml m & 1.0 OO 0.3 uog/mL Ss EA 0.1 ugme 8 os & a n | a E 0.03 pg/ml SS oo Ho a AH 0.01 ug/mL o & sã es SO o -0.5º SO O Pv e Ss S A oO NR. PP & * 2 EX ?

O S O Fig 4 e huB1IE7 " m huB1EIO o " Fi 10000 à MOR7480 3 - o ke) 8 5000 ã o

0.0001 0.01 1 100 Concentração de anticorpo (ug/ml) Fig 5 2100 —-G] contos embranco -1.Pp. Q3DX6 G2 BIE10-I9G1 10mg/kg.i.p. Q3DX6 1800 —-G3 BIE10-I9G2 10mg/kg.i.p. Q3DX6 —-G4 MORT7480-IgG2 10mg/Kkg.i.p.. Q3DX6 1500 —G5 BIE7-I9G1 10mg/kg.i.p.. Q3DX6 E 1200 õ í 900 | ] 8 E e O

Ê Í 3 Pr S 3 . Í I : L | 1 i 0 3 6 9 2 15 18 21 24 27 Dias após agrupamento Fig 6

—4—G1 controle em tranco -,|.p., BDX6 —M-G2 B1E10-I8G1 10mg/Kkg,i.p. A3DX6 —4-G3 B1E10-IgG2 10mg/Kkg,i.p., 03DX6 —-G4 MORT7480-Ig9G2 10mg/kg,i.p..Q3DX6 = 23 | —%- G5B1E7-1310mg/Kkg,i.p. 3DX6

E :: 8 Us É 3 Je au Í às JE T Í | o E 8 NS ox oo q o [. 18 o Fi u 21 28 Dias após agrupamento Fig7