BR112020006879A2 - composição para gerar um ou mais anticorpos anti-ctla-4 ou fragmentos dos mesmos em um sujeito, e, métodos para tratar uma doença em um sujeito e para aumentar uma resposta imune em um sujeito em necessidade do mesmo - Google Patents

Abstract

É divulgada aqui uma composição incluindo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo que tem como alvo CTLA-4. A divulgação também fornece um método de prevenção e/ou tratamento de doenças, tal como câncer, em um sujeito usando a composição da invenção.

Description

COMPOSIÇÃO PARA GERAR UM OU MAIS ANTICORPOS ANTI- CTLA-4 OU FRAGMENTOS DOS MESMOS EM UM SUJEITO, E,

MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA EM UM SUJEITO E PARA AUMENTAR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM SUJEITO EM

NECESSIDADE DO MESMO Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório dos EUA nº 62/569.470, depositado em 6 de outubro de 2017, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Campo Técnico

[002] A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes para gerar um ou mais anticorpos sintéticos, incluindo anticorpos direcionados a uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (por exemplo, CTLA-4 e seus fragmentos funcionais), in vivo, e um método de prevenção e/ou tratamento de câncer e outras condições em um indivíduo, administrando a referida composição. Fundamentos

[003] O CTLA-4 é um participante importante no esgotamento das células T CD8 que ocorre em condições imunológicas crônicas, como infecção viral crônica e câncer, tanto em modelos experimentais quanto em humanos. Essas características e funções conhecidas do CTLA-4 o tornam um alvo atraente para a modulação imunológica em ambientes terapêuticos e de vacina. As terapias convencionais de anticorpos direcionados ao CTLA-4 são muito caras de fabricar, e o custo elevado dessas terapias impõe um ônus financeiro significativo ao paciente.

[004] Assim, existe uma necessidade na técnica de composições e métodos aprimorados e econômicos que tenham como alvo moléculas de ponto de verificação imune, como CTLA-A, para o tratamento de câncer e outras condições. Breve descrição dos desenhos

[005] A Figura 1, compreendendo a Figura 1A até a Figura IB, ilustra diagramas esquemáticos do projeto de CTLA-4 DMAb anti- camundongo. A Figura 1A representa um diagrama da orientação das regiões de anticorpo. A Figura IB representa um diagrama de modificações que foram feitas no CTLA-4 DMAb original.

[006] A Figura 2, compreendendo a Figura 2A até a Figura 2D, representa resultados experimentais exemplares que demonstram a expressão e ligação de CTLA-4 DMAbs anti-camundongo de camundongo. A Figura 2A representa dados exemplares que demonstram os níveis de IgG de camundongo secretado para o DMAb indicado de células HEK293T transfectadas. A Figura 2B representa dados exemplares que demonstram uma análise de Western blot de IZgG de camundongo de lisados (esquerda) e sobrenadantes (direita). Bandas vermelhas indicam a escada, bandas verdes indicam IgG do camundongo. A Figura 2C representa dados exemplares que demonstram a ligação de 9D9 ou sobrenadantes purificados de células transfectadas à proteína CTLA-4 de camundongo. A ICsº é indicada na legenda da figura. As curvas individuais das replicatas biológicas são mostradas. A Figura 2D representa dados exemplares que demonstram a concentração sérica de IZG de camundongo anti-CTLA-4 de camundongos C57BI / 6 injetados com 100 ug do DMAb indicado. As barras de erro indicam média + SD para estudos in vitro e média + SEM para estudos in vivo. Figura 2A e 2C, n = pelo menos 2 replicatas biológicas. Figura 2D, n=5 camundongos por grupo.

[007] A Figura 3, compreendendo a Figura 3A até a Figura 3D, representa os resultados experimentais exemplares que demonstram a atividade antitumoral do DMAb anti-CTLA-4 nos modelos de tumor SalN e CT26. A Figura 3A representa o esboço do estudo do tumor para administração de DMAb usando o modelo profilático de tumor SalN em camundongos A / J (em cima) e os níveis séricos de IZG de camundongo anti- CTLA-4 desses camundongos (em baixo). 400 ug de DMAb foram administrados por IM-EP 4 dias antes da implantação das células tumorais. À Figura 3B ilustra dados exemplares demonstrando as medições do volume do tumor e a análise de sobrevivência dos camundongos descritos em 3A. À Figura 3C representa o esboço do estudo do tumor para administração de DMAb usando o modelo terapêutico de tumor CT26 em camundongos Balb/c (em cima) e os níveis séricos de IgG de camundongo anti-CTLA-4 desses camundongos (em baixo). 400 ug de DMAb foram administrados por IM-EP 3 dias após o implante de células tumorais CT26. A Figura 3D representa os dados exemplares demonstrando as medições do volume do tumor e a análise de sobrevivência dos camundongos descritos em 3C. Barras de erro indicam média +SEM. N = 10 camundongos por grupo. É mostrado um representante de dois experimentos independentes.

[008] A Figura 4, compreendendo a Figura 4A a Figura 4D, representa os resultados experimentais exemplares que demonstram a eficácia do anticorpo 9D9 recombinante no modelo de tumor SalN. A Figura 4A representa o esboço do estudo do tumor para tratamento com anticorpos. À Figura 4B representa os níveis séricos de IZG de camundongo anti-CTLA-4 desses camundongos. À Figura 4C representa os dados exemplares demonstrando as medições de volume do tumor dos camundongos descritos em 4B. A Figura 4C representa uma análise de sobrevivência dos camundongos descritos em 4B.

[009] A Figura 5 representa os resultados experimentais exemplares demonstrando que CTLA-4 DMAb anti-camundongo induz memória imune e proteção contra redesafio de tumores.

[0010] A Figura 6, compreendendo a Figura 6A até a Figura 6C, representa os resultados experimentais exemplares que demonstram a eficácia do CTLA-4 DMAb anti-camundongo de camundongo quando administrado em um momento anterior. A Figura 6A representa o esboço do estudo do tumor para administração de dMAB. A Figura 6B representa os dados exemplares que demonstram as medições do volume tumoral dos camundongos após a administração precoce do CTLA-4 DMAb anti- camundongo. A Figura 6C representa uma análise de sobrevivência dos camundongos após a administração precoce do CTLA-4 DMAb anti- camundongo.

[0011] A Figura 7, compreendendo a Figura 7A a Figura 7D, representa os resultados experimentais exemplares que demonstram que o CTLA-4 DMAb anti-camundongo induz a infiltração de células T em tumores. A Figura 7A representa o esboço do estudo do tumor para administração de dMAB. A Figura 7B representa a coloração imunofluorescente de tumores para infiltração de células T. A Figura 7C representa uma quantificação dos números de células T CD8 + e CD3 + por HPF. A Figura 7D representa uma quantificação dos tipos de TILs presentes.

[0012] A Figura 8, compreendendo a Figura 8A até a Figura 8D, representa os resultados experimentais exemplares que demonstram a expressão e ligação de CTLA-4 DMAbs anti-humanos humanos. A Figura 8A representa os dados exemplares que demonstram os níveis de IZG humana secretados para o DMAb indicado de células HEK293T transfectadas. À Figura 8B representa um western blot exemplar de IZG humana de lisados (esquerda) e sobrenadantes (direita). À Figura 8C representa os dados exemplares que demonstram a concentração sérica de I82G humana ao longo do tempo em camundongos Balb / c injetados com 400 ug de DMAb indicado por IM-EP. A Figura 8D representa os dados exemplares que demonstram a ligação de ipi-DMAb e treme-DMAb purificados do soro de camundongo à proteína CTLA-4 humana por ELISA. As curvas de camundongos individuais são mostradas. Para experimentos in vitro, as barras de erro indicam média +

SD. Para experimentos in vivo, as barras de erro indicam média + SEM. Figura 8A, n = 2 replicatas biológicas. Figura 8C, n = 5 camundongos por grupo. Figura 8D, n = 3 camundongos por grupo.

[0013] A Figura 9 representa os resultados experimentais exemplares que demonstram a eficiência de anticorpos para depleção de CD4 e CD8.

[0014] A Figura 10, compreendendo a Figura 10A a Figura 10D, representa os resultados experimentais exemplares que demonstram a funcionalidade de CTLA-4 DMAbs anti-humanos humanos. A Figura 10A representa os dados exemplares que demonstram a coloração citométrica de fluxo de PBMCs CD3 + CD8-CD25 + humanas para CTLA-4 com os anticorpos indicados, com ou sem estimulação com PMA / ionomicina. À Figura 10B representa a quantificação da coloração representada na Figura 10A, para 3 doadores individuais. A Figura 10C representa uma ilustração do bioensaio de bloqueio de CTLA-4. A Figura 10D representa os resultados do bioensaio descrito na Figura 10C. As Unidades de Luciferase Relativa (RLU) são representadas graficamente em relação à RLU de nenhum poço de controle de anticorpos. IDi-DMAb e treme-DMAb foram purificados do soro de camundongo. As barras de erro indicam + SD. Para a Figura 10D, as curvas indicam ajuste não linear de 4 parâmetros.

[0015] A Figura 11 representa os resultados de experimentos exemplares que demonstram a administração de CTLA-4 anti-humano usando DNA (expressão e ligação in viro).

[0016] A Figura 12 representa os resultados de experimentos exemplares, demonstrando sinergia da vacina com mTERT DNA + anticorpo recombinante aCTLA-4.

[0017] A Figura 13 representa os resultados de experimentos exemplares, demonstrando sinergia da vacina com mTERT DNA + aCTLA-4 DMAb. Descrição Detalhada

[0018] A presente invenção refere-se a composições compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes que codifica um anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. A composição pode ser administrada a um indivíduo em necessidade da mesma para facilitar a expressão in vivo e a formação de um anticorpo sintético.

[0019] Em particular, os polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve expressos das sequências de ácidos nucleicos recombinantess podem se reunir no anticorpo sintético. O polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que o conjunto resulta no anticorpo sintético capaz de se ligar ao antígeno, sendo mais imunogênico em comparação com um anticorpo não agrupado como descrito aqui e capaz de provocar ou induzir uma resposta imune contra o antígeno.

[0020] Além disso, esses anticorpos sintéticos são gerados mais rapidamente no indivíduo que os anticorpos produzidos em resposta à resposta imune induzida por antígeno. Os anticorpos sintéticos são capazes de se ligar e neutralizar efetivamente uma variedade de antígenos. Os anticorpos sintéticos também são capazes de proteger efetivamente contra e/ou promover a sobrevivência da doença.

[0021] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que pode ser usada para aumentar ou aprimorar uma resposta imune, isto é, criar uma resposta imune mais eficaz, administrando um inibidor de ponto de verificação, como um anticorpo sintético ou projetado direcionado para CTLA-4 (por exemplo, MAb projetado na forma de plasmídeos de DNA sintético; "DMAb").

[0022] No que diz respeito ao MAb projetado na forma de plasmídeos de DNA sintético, a presente invenção refere-se a composições compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes que codifica um anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. A composição pode ser administrada a um indivíduo em necessidade da mesma para facilitar a expressão in vivo e a formação de um anticorpo sintético. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos aqui descritas. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos compreende a sequência que codifica a sequência de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 1,2,3, 4, 5, 6, ou uma variante da mesma ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de RNA transcrita de uma sequência de DNA aqui descrita. Por exemplo, em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de RNA transcrita por uma sequência de DNA que codifica a sequência de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou uma variante da mesma ou um fragmento da mesma.

[0023] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos codifica uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos para um aminoácido sequência de ácido selecionada do grupo SEQ ID NOs: 1,2, 3,4, 5, 6. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos codifica um fragmento de uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,6.

[0024] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de nucleotídeos a uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma ou mais de SEQ ID NOs: 1, 2,3,4,5,6. Em uma modalidade,

a sequência de nucleotídeos é um fragmento de uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de nucleotídeos a uma ou mais sequências de nucleotídeoss que codificam uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 2,3,4,5,6.

[0025] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos cerca de 80% de identidade em todo o comprimento de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 7,8,9, 10, 11 e 12.

[0026] Em alguns casos, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com uma composição desejada compreendendo um antígeno, como TERT, para produzir um efeito sinergético; enquanto que, em outros casos, os anticorpos podem ser administrados separadamente da composição que compreende o antígeno. Em alguns casos, os anticorpos da invenção compreendem uma sequência de DNA que codifica esse anticorpo, que inclui pelo menos as regiões variáveis da imunoglobulina.

[0027] A composição da presente invenção pode aumentar a resposta imune ao antígeno da vacina no indivíduo, aumentando a resposta das células T CD8* , em comparação com a vacina que não inclui inibidores do ponto de verificação. Esse aumento da resposta das células T CD8* possui atividade citolítica e secreta a interferon gama da citocina (IFN-y).

[0028] As composições aqui fornecidas também podem incluir um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0029] Os aspectos da invenção também incluem métodos para aumentar uma resposta imune em um indivíduo em necessidade da mesma, administrando qualquer uma das composições aqui fornecidas ao indivíduo. Os métodos para aumentar uma resposta imune também podem incluir uma etapa de eletroporação. Definições

[0030] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado compreendido comumente por versados na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, controlará. Métodos e materiais exemplares são descritos no presente documento, embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou testes da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalidades. Os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante.

[0031] Os termos "compreende(m)", "“inclui(em)", "ter", "tem", "pode", "contém(êm)", e as variantes destes, conforme usado neste documento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares "uma", "um" e "a/0" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. A presente divulgação também contempla outras modalidades "compreendendo", "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" modalidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.

[0032] "Anticorpo" pode significar um anticorpo das classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos, fragmentos ou derivados dos mesmos, incluindo Fab, F (ab)2, Fd e anticorpos de cadeia única, e seus derivados. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de mamíferos, um anticorpo policlonal, um anticorpo purificado de afinidade ou suas misturas, que apresenta especificidade suficiente de ligação a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada destes.

[0033] "Antígeno" refere-se à proteínas que têm a capacidade de gerar uma resposta imune em um hospedeiro. Um antígeno pode ser reconhecido e ligado por um anticorpo. Um antígeno pode se originar de dentro do corpo ou do ambiente externo.

[0034] "CDRs" são definidas como as sequências de aminoácidos da região determinante da complementaridade de um anticorpo que são as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existem três CDRs de cadeia pesada e três de cadeia leve (ou regiões CDR) na porção variável de uma imunoglobulina. Assim, "CDRs", conforme usado neste documento, refere-se a todas as três CDRs de cadeia pesada ou a todas as três CDRs de cadeia leve (ou a todas as CDRs de cadeia pesada e todas as cadeias leves, se apropriado). A estrutura e a dobragem de proteínas do anticorpo podem significar que outros resíduos são considerados parte da região de ligação ao antígeno e devem ser entendidos por um versado. Ver, por exemplo, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.

[0035] "Fragmento de anticorpo" ou "fragmento de um anticorpo", conforme aqui utilizado de forma intercambiável, refere-se a uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o sítio de ligação ao antígeno ou a região variável. A porção não inclui os domínios constantes da cadeia pesada (isto é, CH2, CH3 ou CHA, dependendo do isotipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, entre outros, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab-SH, fragmentos F (ab) 2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacorpos, moléculas de cadeia única Fv (scFv), polipeptídeos de cadeia única contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia única contendo as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia única contendo as três CDRs da região variável da cadeia pesada.

[0036] "Adjuvante", como usado aqui, significa qualquer molécula adicionada à vacina aqui descrita para aumentar a imunogenicidade do antígeno.

[0037] "Inibidor de ponto de verificação”, conforme usado aqui, significa inibidores ou moléculas que bloqueiam os pontos de verificação imunes, como comumente entendido no campo da imunoterapia para câncer. Mais comumente, os inibidores do ponto de verificação são anticorpos que bloqueiam esses pontos de verificação imunes.

[0038] "Sequência de codificação" ou "ácido nucleico de codificação", conforme aqui utilizado, pode se referir ao ácido nucleico (molécula de RNA ou DNA) que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, conforme estabelecido neste documento. A sequência de codificação também pode compreender uma sequência de DNA que codifica uma sequência de RNA. A sequência de codificação pode ainda incluir sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligados a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero ao qual o ácido nucleico é administrado. A sequência de codificação pode ainda incluir sequências que codificam peptídeos de sinal.

[0039] "Complemento" ou "complementar", como usado aqui pode significar que um ácido nucleico pode ter uma base de Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou pareamento de base de Hoogsteen entre os nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico.

[0040] "Corrente constante", como aqui utilizado para definir uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células que definem o referido tecido, durante a duração de um pulso elétrico administrado ao mesmo tecido. O pulso elétrico é administrado a partir dos dispositivos de eletroporação aqui descritos. Esta corrente permanece com uma amperagem constante no referido tecido durante a vida de um pulso elétrico, porque o dispositivo de eletroporação aqui fornecido possui um elemento de realimentação, preferivelmente tendo realimentação instantânea. O elemento de feedback pode medir a resistência do tecido (ou células) durante toda a duração do pulso e fazer com que o dispositivo de eletroporação altere sua produção de energia elétrica (por exemplo, aumente a tensão), de modo que a corrente no mesmo tecido permaneça constante durante todo o pulso elétrico (ligado a ordem dos microssegundos) e de pulso para pulso. Em algumas modalidades, o elemento de feedback compreende um controlador.

[0041] "Feedback de corrente" ou "feedback", conforme usado neste documento, pode ser usado de forma intercambiável e pode significar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação fornecidos, que compreendem medir a corrente no tecido entre os eletrodos e alterar a saída de energia fornecida pelo dispositivo EP de acordo, para manter a corrente em um nível constante. Esse nível constante é predefinido pelo usuário antes do início de uma sequência de pulsos ou tratamento elétrico. O feedback pode ser realizado pelo componente de eletroporação, por exemplo, controlador, do dispositivo de eletroporação, pois o circuito elétrico nele é capaz de monitorar continuamente a corrente no tecido entre os eletrodos e comparar essa corrente monitorada (ou corrente no tecido) com uma corrente predefinida e continuamente faz ajustes na produção de energia para manter a corrente monitorada em níveis predefinidos. O loop de feedback pode ser instantâneo, pois é um feedback de loop fechado analógico.

[0042] "Corrente descentralizada", conforme usado aqui, pode significar o padrão de correntes elétricas entregues dos vários arranjos de eletrodos de agulha dos dispositivos de eletroporação aqui descritos, em que os padrões minimizam, ou preferivelmente eliminam, a ocorrência de estresse térmico relacionado à eletroporação em qualquer área do tecido eletroporado.

[0043] "Eletroporação", "eletropermeabilização," ou "potenciamento eletrocinético" ("EP"), tal como utilizado intercambialmente aqui pode se referir à utilização de um pulso de campo elétrico transmembrana para induzir caminhos microscópicos (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que —biomoléculais como plasmídeos, oligonucleotídeos, siRNA, medicamentos, fons e água passem de um lado da membrana celular para o outro.

[0044] "Anticorpo endógeno", conforme usado neste documento, pode se referir a um anticorpo que é gerado em um indivíduo ao qual é administrada uma dose eficaz de um antígeno para indução de uma resposta imune humoral.

[0045] "Mecanismo de feedback", conforme usado neste documento, pode se referir a um processo executado por software ou hardware (ou firmware), cujo processo recebe e compara a impedância do tecido desejado (antes, durante e/ou após o fornecimento de pulso de energia) com um valor presente, preferivelmente corrente, e ajusta o pulso de energia entregue para atingir o valor predefinido. Um mecanismo de feedback pode ser realizado por um circuito de loop fechado analógico.

[0046] "Fragmento" pode significar um fragmento polipeptídico de um anticorpo que é função, ou seja, pode se ligar ao alvo desejado e ter o mesmo efeito pretendido que um anticorpo de comprimento total. Um fragmento de um anticorpo pode ser 100% idêntico ao comprimento total, exceto pela ausência de pelo menos um aminoácido do terminal N e/ou C, em cada caso com ou sem peptídeos de sinal e/ou metionina na posição 1. Os fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais,

95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais por cento do comprimento do anticorpo de comprimento total específico, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento de um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao anticorpo e compreende adicionalmente um peptídeo sinal de metionina ou sinal heterólogo de terminal N que não está incluído no cálculo da identidade percentual. Os fragmentos podem ainda compreender uma metionina e/ou um peptídeo sinal do terminal N, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IZE ou IgG. A metionina e/ou peptídeo sinal do terminal N pode estar ligada a um fragmento de um anticorpo.

[0047] Um fragmento de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo pode ser 100% idêntico ao comprimento total, exceto pela falta de pelo menos um nucleotídeo da extremidade 5' e/ou 3', em cada caso com ou sem sequências que codificam peptídeos de sinal e/ou uma metionina na posição 1. Os fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais por cento do comprimento da sequência de codificação de comprimento total específico, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento que codifica um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao anticorpo e compreende opcionalmente ainda sequência que codifica uma metionina ou peptídeo sinal heterólogo de terminal N que não está incluído no cálculo da identidade percentual. Os fragmentos podem ainda compreender sequências de codificação para uma metionina e/ou um peptídeo sinal do terminal N, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IZE ou IgG. A sequência de codificação que codifica a metionina e/ou peptídeo sinal do terminal N pode ser ligada a um fragmento da sequência de codificação.

[0048] "Construção genética", conforme aqui utilizado, refere-se às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína, como um anticorpo. À construção genética também pode se referir a uma molécula de DNA que transcreve um RNA. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do indivíduo ao qual a molécula de ácido nucleico é administrada. Tal como aqui utilizado, o termo "forma expressável" se refere aos construtos de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operáveis ligados a uma sequência de codificação que codifica uma proteína, de tal modo que quando presente na célula do indivíduo, a sequência de codificação será expressa.

[0049] "Idêntico" ou "identidade", tal como aqui utilizado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeoss, podem significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são as mesmas ao longo de uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada por alinhamento ideal das duas sequências, comparando as duas sequências sobre a região especificada, determinando o número de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade da sequência. Em casos em que as duas sequências são de comprimentos diferentes ou em que o alinhamento produz uma ou mais extremidades espaçadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos da sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar o DNA e o RNA, timina (T) e uracila (U) podem ser considerados equivalentes. A identidade pode ser realizada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de computador, como o BLAST ou BLAST 2.0.

[0050] A "impedância", conforme usada neste documento, pode ser usada ao discutir o mecanismo de feedback e pode ser convertida em um valor atual de acordo com a lei de Ohm, permitindo comparações com a corrente predefinida.

[0051] "Resposta imune", conforme usado aqui, pode significar a ativação do sistema imunológico de um hospedeiro, por exemplo, o de um mamífero, em resposta à introdução de um ou mais ácidos nucleicos e/ou peptídeos. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.

[0052] "Ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo", como usado neste documento pode significar pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados entre si. A representação de uma fita simples também define a sequência da fita complementar. Assim, um ácido nucleico também engloba a fita complementar de uma fita simples representada. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para a mesma finalidade que um determinado ácido nucleico. Assim, um ácido nucleico também engloba substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos dos mesmos. Uma fita simples fornece uma sonda que pode hibridizar para uma sequência alvo sob condições restritivas de hibridização. Assim, um ácido nucleico também engloba uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridização rigorosas.

[0053] Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita dupla, ou podem conter porções das sequências de fita dupla ou de fita única. O ácido nucleico pode ser o DNA, tanto genômico quanto cDNA, RNA ou um híbrido, em que o ácido nucleico pode conter combinações de deoxirribo- e ribo-nucleotídeos e combinações de bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.

[0054] "Operacionalmente ligado", como usado aqui pode significar que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual ele está espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre o promotor e o gene que ele controla no gene do qual o promotor é derivado. Como é conhecido na técnica, a variação nesta distância pode ser adaptada sem perda da função do promotor.

[0055] Um "peptídeo"”, uma "proteína” ou um "polipeptídeo", conforme usado neste documento, pode significar uma sequência de aminoácidos ligados e pode ser natural, sintético ou uma modificação ou combinação de natural e sintético.

[0056] "Promotor", tal como aqui utilizado pode significar uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou potencializar a expressão de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcricionais específicas para potencializar ainda mais a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal do mesmo. Um promotor também pode compreender elementos acentuadores ou repressores distais, que podem ser localizados, tanto quanto milhares de pares de base, a partir do sítio de início da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo viral, bacteriana, fúngica, vegetais, de insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutiva ou diferencialmente em relação à célula, ao tecido ou ao órgão em que a expressão ocorre ou, em relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, tais como estresses fisiológicos, patogênicos, íons metálicos, ou agentes de indução. Exemplos representativos de promotores incluem o promotor do bacteriófago T7, promotor do bacteriófago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor SV40 tardio, promotor SV40 precoce, promotor RSV-LTR, promotor IE de CMV, promotor S V40 precoce ou promotor S V40 tardio e promotor IE de CMV.

[0057] "Peptídeo sinal" e "sequência líder" são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma sequência de aminoácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabelecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências líderes normalmente direcionam a localização de uma proteína. Peptídeos sinal/sequências líderes usados neste documento podem facilitar a secreção da proteína a partir da célula na qual eles são produzidos. Peptídeos sinal/sequências líderes são frequentemente clivados do restante da proteína, frequentemente referidos como a proteína madura, mediante a secreção da célula. Os peptídeos sinal / sequências líderes estão ligados no terminal N da proteína.

[0058] "Condições rigorosas de hibridização”, tal como aqui utilizado pode significar que as condições sob as quais uma primeira sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, sonda) irá hibridizar para uma segunda sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, alvo), tal como em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. Condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. As condições rigorosas podem ser selecionadas para ser de cerca de 5 a 10 ºC menor que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a um pH de força iônica definido. A Tm é a temperatura (força iônica, pH e concentração nucleica definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam para a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições rigorosas podem ser as em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de fon de sódio, tal como uma concentração de aproximadamente 0,01-1,0 M de íons de sódio (ou outros sais) a um pH de 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30 ºC para sondas curtas (por exemplo, aproximadamente 10-50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 ºC para sondas longas (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotídeos). Também podem ser alcançadas condições rigorosas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como a formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser hibridização de fundo pelo menos de 2 a 10 vezes. Exemplos de condições de hibridização rigorosas incluem o seguinte: formamida a 50%, SSC 5x e SDS a 1%, incubando a 42ºC, ou SSC 5x, SDS a 1%, incubando a 65ºC, com lavagem em SSC 0,2x e 0,1 % De SDS a 65ºC.

[0059] "Indivíduo" e "paciente", conforme aqui utilizados, referem-se a qualquer vertebrado, incluindo, entre outros, mamíferos (por exemplo, vaca, porco, camelo, lhama, cavalo, cabra, coelho, ovelha, hamsters, porquinho da índia, gato, cachorro, rato e camundongo, um primata não humano (por exemplo, um macaco, como um macaco cinomolgo ou rhesus, chimpanzé, etc.) e um humano). Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser humano ou não humano. O indivíduo ou paciente pode estar passando por outras formas de tratamento.

[0060] "Substancialmente complementar", tal como aqui utilizado, pode significar que a primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridação rigorosas.

[0061] "Substancialmente idêntico(a)", tal como aqui utilizado, pode significar que a primeira e a segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a uma região de 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou em relação aos ácidos nucleicos, se a primeira sequência for substancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.

[0062] "Anticorpo sintético", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que é codificado pela sequência de ácidos nucleicos recombinantes aqui descrita e é gerado em um indivíduo.

[0063] "Tratamento" ou "tratar", tal como aqui utilizado, pode significar proteger um indivíduo de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um indivíduo antes do início da doença. Suprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um indivíduo após a indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um indivíduo após o aparecimento clínico da doença.

[0064] "Variante", tal como aqui utilizado com relação a um ácido nucleico pode significar (1) uma porção ou fragmento de uma sequência de nucleotídeos referenciada; (ii) o complemento de uma sequência de nucleotídeos referenciada ou parte da mesma; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico referenciado ou ao complemento deste; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições restritivas para o ácido nucleico referenciado, seu complemento ou uma sequência substancialmente idêntica ao mesmo.

[0065] "Variante" em relação a um peptídeo ou polipeptídeo pode indicar que o peptídeo ou polipeptídeo difere na sequência de aminoácidos pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas mantém pelo menos uma atividade biológica.

Variante também pode significar uma proteína com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácidos que retém pelo menos uma atividade biológica.

Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, a substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição das regiões carregadas) é reconhecida na técnica como normalmente envolvendo uma pequena alteração.

Estas pequenas alterações podem ser identificadas, em parte, considerando o Índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica.

Kyte et al., J.

Mol.

Biol. 157: 105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga.

É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos semelhantes podem ser substituídos e ainda manter a função proteica.

Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de +2 são substituídos.

À hidrofobicidade dos aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que mantêm a função biológica.

Uma consideração da hidrofobicidade dos aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofobicidade média sítio desse peptídeo, uma medida útil que foi relatada por se correlacionar bem com a antigenicidade e imunogenicidade.

Patente dos EUA nº 4.554.101, incorporada aqui integralmente por referência.

A substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade semelhantes pode resultar em peptídeos que retêm a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica.

As substituições podem ser realizadas com aminoácidos com valores de hidrofilicidade dentro de + 2 um do outro.

O índice do hidrofobicidade e o valor de hidrofiliidade dos aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido.

Consistente com essa observação, as substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica são compreendidas como dependentes da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais desses aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.

[0066] Uma variante pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene total ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento do mesmo. Uma variante pode ser uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo.

[0067] "Vetor", tal como aqui utilizado pode significar uma sequência de ácidos nucleicos que contém uma origem de replicação. Um vetor pode ser um plasmídeo, Dbacteriófago, cromossomo artificial bacteriano —ou cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico de autorreplicação ou um vetor que se integra a um genoma hospedeiro.

[0068] Para a recitação das faixas numéricas neste documento, cada número interveniente entre os mesmos, com o mesmo grau de precisão, é contemplado explicitamente. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para a escala 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são contemplados explicitamente. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.

Composições

[0069] A invenção também inclui novas sequências para uso na produção de anticorpos. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser produzidos em células de mamíferos ou para entrega em vetores de DNA ou RNA, incluindo vetores bacterianos, leveduras, bem como vetores virais.

[0070] A presente invenção refere-se a composições compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes que codifica um anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. À composição, quando administrada a um indivíduo em necessidade, pode resultar na geração de um anticorpo sintético no indivíduo. O anticorpo sintético pode se ligar a uma molécula alvo (isto é, um antígeno, como CTLA+H) presente no indivíduo. Essa ligação pode neutralizar o antígeno, bloquear o reconhecimento do antígeno por outra molécula, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico, e provocar ou induzir uma resposta imune ao antígeno.

[0071] Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo sintético. Em uma modalidade, a composição compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um primeiro anticorpo sintético e uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica um segundo anticorpo sintético. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio de clivagem.

[0072] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um ou mais anticorpos anti-CTLA-H.

[0073] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti-CTLA-4 compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico otimizadas para códons que codificam uma ou mais sequências de aminoácidos, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3,4, 5, 6 ou um fragmento de uma ou mais sequências de aminoácidos, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,6.

[0074] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos cerca de 80% de identidade em todo o comprimento de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 7,8,9, 10,11 e 12.

[0075] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti-CTLA-4 compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA que codificam uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% homóloga a uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 2 ,3,4,5,6 ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% homóloga a uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 2, 3,4, 5, 6. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti- CTLA-4 compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA que codificam uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3,4, 5, 6 ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1,2, 3,4,5,6.

[0076] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti-CTLA-4 compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico otimizadas para códons pelo menos 90% homólogas a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais das SEQ ID NOs: 1,2, 3,4,5,6 ou um fragmento de uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 90% homóloga a uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais das SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,6.

[0077] A composição da invenção pode tratar, prevenir e/ou proteger contra qualquer doença, distúrbio ou condição associada à atividade do

CTLA-4. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra o câncer.

[0078] Em uma modalidade, a composição da invenção é fornecida em combinação com pelo menos um outro agente, como um antígeno. Em uma modalidade, uma combinação pode ser uma formulação única ou pode ser formulações separadas e administrada em sequência (primeiro o antígeno e, em seguida, o anticorpo anti-CTLAH, ou o anticorpo anti-CTLA-4 primeiro e, em seguida, o antígeno). À composição pode aumentar a apresentação do antígeno e a resposta imune geral ao antígeno em um indivíduo. A combinação de antígeno e anticorpo anti-CTLA-4 induz o sistema imunológico mais eficientemente do que uma composição compreendendo apenas o antígeno. Essa resposta imune mais eficiente fornece maior eficácia no tratamento e/ou prevenção de uma doença, como o câncer.

[0079] A composição da invenção pode compreender um inibidor de ponto de verificação. O inibidor do ponto de verificação pode ser um ou mais anticorpos anti-CTLA-4. O antígeno pode ser um ou mais de hTERT, mTERT, PSA, PSMA, STEAP, PSCA e PAP, WTI, tirosinase, NYESO1, PRAME e MAGE. O(s) inibidor(es) de ponto de verificação e o(s) antígeno(s) da composição podem ser administrados juntos ou separadamente ao indivíduo em necessidade, nas formas de ácido nucleico ou polipeptídeo. Em alguns casos, o(s) inibidor(es) do ponto de verificação pode(m) ser administrado(s) separadamente do(s) antígeno(s) da composição.

[0080] A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no indivíduo dentro de pelo menos cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas , 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas ou 96 horas. À composição pode ser administrada antes ou após a administração do(s) antígeno(s) ao indivíduo. Em algumas modalidades, o(s) inibidor(es) do ponto de verificação pode(m) ser administrado(s) pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias , 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 60 dias ou 90 dias antes ou após a administração do(s) antígeno(s) ao indivíduo.

[0081] Ainda em outras modalidades, o(s) inibidor(es) de ponto de verificação pode(m) ser administrado(s) pelo menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas ou 15 semanas antes ou após a administração do(s) antígeno(s) ao indivíduo. Em outras modalidades, o(s) inibidor(es) do ponto de verificação pode(m) ser administrado(s) cerca de 12 horas a cerca de 15 semanas, cerca de 12 horas a cerca de 10 semanas, cerca de 12 horas a cerca de 5 semanas, cerca de 12 horas a cerca de 1 semana, cerca de 12 horas a cerca de 60 horas, cerca de 12 horas a cerca de 48 horas, cerca de 24 horas a cerca de 15 semanas, cerca de 60 horas a cerca de 15 semanas, cerca de 96 horas a cerca de 15 semanas, cerca de 1 dia a cerca de 15 semanas, cerca de 5 dias a cerca de 15 semanas, cerca de 10 dias a cerca de 15 semanas, cerca de 15 dias a cerca de 15 semanas, cerca de 20 dias a cerca de 15 semanas, cerca de 25 dias a cerca de 15 semanas, cerca de 30 dias a cerca de 15 semanas, cerca de 1 semana a cerca de 15 semanas, cerca de 5 semanas a cerca de 15 semanas, ou cerca de semanas a cerca de 15 semanas antes ou após a administração do(s) antígeno(s) ao indivíduo.

[0082] A composição, quando administrada ao indivíduo em necessidade, pode resultar na geração do anticorpo sintético no indivíduo mais rapidamente que na geração de um anticorpo endógeno em um indivíduo ao qual é administrado um antígeno para induzir uma resposta imune humoral. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético pelo menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias antes da geração do anticorpo endógeno no indivíduo ao qual foi administrado um antígeno para induzir uma resposta imune humoral.

[0083] A composição da presente invenção pode ter características necessárias para composições eficazes, tal como ser segura, para que a composição não cause doença ou morte; ser protetora contra doenças; e proporcionar facilidade de administração, poucos efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por dose. À composição pode realizar algumas ou todas essas características combinando o(s) antígeno(s) com o(s) inibidor(es) do ponto de verificação, como um anticorpo anti-CTLAH, como discutido aqui. Inibidores do ponto de verificação

[0084] Os inibidores de ponto de verificação podem ser qualquer antagonista dos vários pontos de verificação imunes e podem ser anticorpos que bloqueiam pontos de verificação imunes. Os anticorpos podem ser uma proteína incluindo um Fab, monoclonal ou policlonal. Os anticorpos também podem ser um construto de expressão de DNA que codifica e pode expressar anticorpos funcionais. A vacina, além de um ou mais antígenos, pode ainda compreender um anticorpo CTLA-4. O anticorpo pode ser um anticorpo sintético constituído por sequência de DNA que codifica pelo menos as regiões variáveis de uma imunoglobulina. Esse anticorpo pode ser gerado identificando ou rastreando o anticorpo aqui descrito, que é reativo ou se liga ao antígeno aqui descrito. O método de identificação ou rastreamento do anticorpo pode usar o antígeno em metodologias conhecidas pelos versados na técnica para identificar ou rastrear o anticorpo. Tais metodologias podem incluir, mas não estão limitadas a, seleção do anticorpo de uma biblioteca (por exemplo, exibição de fagos) e imunização de um animal seguido de isolamento e/ou purificação do anticorpo. Ver, por exemplo, métodos disponíveis em Rajan, S., and Sidhu, S., Methods in Enzymology, vol 502, Chapter One “Simplified Synthetic Antibody Libraries (2012), que é incorporado aqui na sua totalidade.

[0085] Quaisquer anticorpos da invenção também podem ser combinados com um ou mais anticorpos inibidores de ponto de verificação, incluindo anticorpos contra um ou mais de PD-1, PD-L1, LAG-3, GITR, CDA40, OX40, TIM-3, 4-1BB, e outros. Os inibidores do ponto de verificação podem ser um produto conhecido, como, por exemplo, ipilimumabe, tremelimumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, BMS-936559 (Ver ClinicalTrials.gov Identificador NCT02028403), MPDL3280A (Roche, ver ClinicalTrials.gov Identificador NCT02008227), MDX1105-01 (Bristol Myers Squibb, ver ClinicalTrialsgov Identificador NCTO00729664), MEDI4736 (MedImmune, See — ClinicalTrialsgov — Identificador NCTO1693562) e MK-3475 (Merck, ver ClinicalTrials.gov Identificador NCTO02129556). Sequência de ácidos nucleicos recombinantess

[0086] Como descrito anteriormente, a composição pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes. A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode codificar o anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo é descrito em mais detalhes em outras partes deste documento.

[0087] A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ser uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos. A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos.

[0088] A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ser uma sequência de ácidos nucleicos otimizada. Essa otimização pode aumentar ou alterar a imunogenicidade do anticorpo. À otimização também pode melhorar a transcrição e/ou tradução. A otimização pode incluir um ou mais dos seguintes itens: sequência líder de baixo teor de GC para aumentar a transcrição; estabilidade do mRNA e otimização de códons; adição de uma sequência kozak (por exemplo, GCC ACC) para maior tradução; adição de uma sequência líder de imunoglobulina (Ig) que codifica um peptídeo sinal; adição de uma sequência IRES interna e eliminação na medida do possível de motivos de sequência cis de ação (por exemplo, caixas TATA internas). Construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes

[0089] A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais construtos de sequência de ácidos nucleicos recombinantes. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais componentes, que são descritos em mais detalhes aqui.

[0090] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes também pode incluir uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica um sítio de clivagem de protease ou peptidase. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes também pode incluir uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica um sítio de entrada interno do ribossomo (IRES). Um IRES pode ser um IRES viral ou um IRES eucariótico. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma ou mais sequências líderes, nas quais cada sequência líder codifica um peptídeo sinal. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais promotores, um ou mais fÍntrons, uma ou mais regiões de terminação de transcrição, um ou mais códons de iniciação, um ou mais códons de terminação ou parada e/ou um ou mais sinais de poliadenilação. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes também pode incluir uma ou mais sequências de ligante ou tag. A sequência de tags pode codificar uma tag de hemaglutinina (HA). Polipeptídeo de cadeia pesada

[0091] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou pelo menos uma região constante de cadeia pesada (CH). A pelo menos uma região constante da cadeia pesada pode incluir uma região constante da cadeia pesada 1 (CHI), uma região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e uma região constante da cadeia pesada 3 (CH3) e/ou uma região de dobradiça.

[0092] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH e uma região CHI. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH, uma região CHI, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3.

[0093] O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VH. Procedendo do terminal N do polipeptídeo da cadeia pesada, essas CDRs são denotadas "CDRI", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia pesada podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno. Polipeptídeo de cadeia leve

[0094] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de cadeia leve variável (VL) e/ou uma região de cadeia leve constante (CL).

[0095] O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VL. Continuando do terminal N do polipeptídeo da cadeia leve, essas CDRs são denotadas "CDRI1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDRI, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia leve podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno. Sítio de clivagem de protease

[0096] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica um sítio de clivagem de protease. O sítio de clivagem da protease pode ser reconhecido por uma protease ou peptidase. A protease pode ser uma endopeptidase ou endoprotease, por exemplo, mas não se limitando a furina, elastase, HtrA, calpaina, tripsina, quimotripsina, tripsina e pepsina. A protease pode ser furina. Em outras modalidades, a protease pode ser uma protease de serina, uma protease de treonina, protease de cisteína, protease de aspartato, metaloprotease, protease de ácido glutâmico ou qualquer protease que quebra uma ligação peptídica interna (ou seja, não quebra a ligação de peptídeo no terminal N ou terminal OC).

[0097] O sítio de clivagem da protease pode incluir uma ou mais sequências de aminoácidos que promovem ou aumentam a eficiência da clivagem. As uma ou mais sequências de aminoácidos podem promover ou aumentar a eficiência da formação ou geração de polipeptídeos discretos. As uma ou mais sequências de aminoácidos podem incluir uma sequência peptídica 2A. Sequência do ligante

[0098] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma ou mais sequências de ligante. A sequência do ligante pode espacialmente separar ou ligar um ou mais componentes aqui descritos. Em outras modalidades, a sequência de ligante pode codificar uma sequência de aminoácidos que separa espacialmente ou liga dois ou mais polipeptídeos. Promotor

[0099] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais promotores. O um ou mais promotores podem ser qualquer promotor capaz de incitar a expressão genética e regular a expressão genética. Um promotor como este é um elemento de sequência de ação cis necessário para a transcrição por meio de RNA polimerase dependente de DNA. A seleção do promotor usado para direcionar a expressão genética depende da aplicação específica. O promotor pode ser posicionado aproximadamente na mesma distância do início da transcrição no construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes, uma vez que é a partir do sítio de início da transcrição em seu cenário natural. No entanto, a variação nessa distância pode ser acomodada sem perda da função do promotor.

[00100] O promotor pode estar operacionalmente ligado à sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve. O promotor pode ser um promotor mostrado eficaz para expressão em células eucarióticas. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação pode ser um promotor do CMV, um promotor do vírus símio 40 (SV40), como o promotor inicial do SV40 e o promotor posterior do SV40, um promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), um vírus da imunodeficiência humana (HIV ), como o promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência bovina (BIV), um promotor do vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do citomegalovírus (CMV), como o promotor imediato do CMV, vírus Epstein Barr (EBV) ou um promotor do vírus do sarvoma de Rous (RSV). O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, poliedrina humana ou metalotioneína humana.

[00101] O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor indutível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo específico. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento específico. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele, natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na publicação do pedido de patente dos EUA nº US20040175727, cujo conteúdo é aqui incorporado na sua totalidade.

[00102] O promotor pode ser associado a um intensificador. O intensificador pode estar localizado a montante da sequência de codificação. O intensificador pode ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou um intensificador viral como um de CMYVY, FMDV, RSV ou EBV. Os intensificadores da função de polinucleotídeo são descritos nas patentes dos EUA nºs 5.593.972, 5.962.428 e WO94 / 016737, cujos conteúdos está totalmente incorporado por referência. Íntron

[00103] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais íntrons. Cada íntron pode incluir sítios funcionais de doador e aceptor de splice. O íntron pode incluir um intensificador de splicing. O íntron pode incluir um ou mais sinais necessários para um splicing eficiente. Região de terminação de transcrição

[00104] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma ou mais regiões de terminação da transcrição. A região de terminação da transcrição pode estar a jusante da sequência de codificação para proporcionar uma terminação eficiente. A região de terminação da transcrição pode ser obtida do mesmo gene que o promotor aqui descrito ou pode ser obtida de um ou mais genes diferentes. Códon de iniciação

[00105] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais códons de iniciação. O códon de iniciação pode estar localizado a montante da sequência de codificação. O códon de iniciação pode estar in frame com a sequência de codificação. O códon de iniciação pode ser associado a um ou mais sinais necessários para o início eficiente da tradução, por exemplo, mas não limitado a, um sítio de ligação ao ribossomo. Códon de terminação

[00106] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais códons de terminação ou parada. O códon de terminação pode estar a jusante da sequência de codificação. O códon de terminação pode estar in frame com a sequência de codificação. O códon de terminação pode ser associado a um ou mais sinais necessários para a terminação eficiente da tradução. Sinal de poliadenilação

[00107] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais sinais de poliadenilação. O sinal de poliadenilação pode incluir um ou mais sinais necessários para a poliadenilação eficiente do transcrito. O sinal de poliadenilação pode ser posicionado a jusante da sequência de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação S V40, sinal de poliadenilação LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGH), sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento humano (hGH) ou sinal de poliadenilação de B-globina humana. O sinal de poliadenilação S V40 pode ser um sinal de poliadenilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA). Sequência líder

[00108] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir uma ou mais sequências líderes. A sequência líder pode codificar um peptídeo sinal. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina (Ig), por exemplo, mas não limitado a, um peptídeo sinal de IgG e um peptídeo sinal de IgE. Arranjo do construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes

[00109] Como descrito anteriormente, a sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais construtos de sequência de ácidos nucleicos recombinantes, nas quais cada construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais componentes. Os um ou mais componentes são descritos em detalhes anteriormente. Os um ou mais componentes, quando incluídos no construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes podem ser dispostos em qualquer ordem em relação um ao outro. Em algumas modalidades, o um ou mais componentes podem ser dispostos no construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes, como aqui descrito. Arranjo 1

[00110] Em um arranjo, um primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00111] O primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ser colocado em um vetor. O segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ser colocado em um segundo vetor ou em um separado. A colocação do construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes no vetor é descrita em mais detalhes aqui.

[00112] O primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes também pode incluir o promotor, o íntron, a região de terminação da transcrição, o códon de iniciação, o códon de terminação e/ou o sinal de poliadenilação. O primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ainda incluir a sequência líder, na qual a sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada. Por conseguinte, o peptídeo sinal codificado pela sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo da cadeia pesada.

[00113] O segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes também pode incluir o promotor, o códon de iniciação, o códon de terminação e o sinal de poliadenilação. O segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ainda incluir a sequência líder, na qual a sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve. Por conseguinte, o peptídeo sinal codificado pela sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo da cadeia leve.

[00114] Por conseguinte, um exemplo do arranjo 1 pode incluir o primeiro vetor (e, portanto, o primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CHI, e o segundo vetor (e, portanto, o segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL. Um segundo exemplo de arranjo 1 pode incluir o primeiro vetor (e, portanto, o primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada que inclui VH, CHI, região de dobradiça, CH2 e CH3 e o segundo vetor (e, portanto, o segundo construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e

CL. Arranjo 2

[00115] Em um segundo arranjo, o construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. À sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada pode ser posicionada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve. Alternativamente, a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve pode ser posicionada a montante (ou 5 ') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada.

[00116] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ser colocado no vetor como descrito em mais detalhes aqui.

[00117] O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o sítio de clivagem da protease e/ou a sequência do ligante. Se incluída no construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes, a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o sítio de clivagem da protease pode ser posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o sítio de clivagem da protease permite a separação do polipeptídeo da cadeia pesada e do polipeptídeo da cadeia leve em polipeptídeos distintos após a expressão. Em outras modalidades, se a sequência de ligante for incluída no construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes, a sequência de ligante pode ser posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve.

[00118] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes também pode incluir o promotor, o íntron, a região de terminação da transcrição, o códon de iniciação, o códon de terminação e/ou o sinal de poliadenilação. O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um ou mais promotores. O construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir dois promotores, de modo que um promotor possa ser associado à sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo promotor pode ser associado à sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Em ainda outras modalidades, o construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir um promotor que está associado à sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00119] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode ainda incluir duas sequências líderes, nas quais uma primeira sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada e uma segunda sequência líder está localizada a montante (ou 5' ) da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve. Por conseguinte, um primeiro peptídeo sinal codificado pela primeira sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo da cadeia pesada e um segundo peptídeo sinal codificado pela segunda sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo da cadeia leve.

[00120] Por conseguinte, um exemplo do arranjo 2 pode incluir o vetor (e, portanto, a sequência de sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CHl, e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, no qual a sequência de ligação está posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve.

[00121] Um segundo exemplo de arranjo de 2 pode incluir o vetor (e, portanto, o construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CHl e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, no qual a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o sítio de clivagem da protease está posicionado entre a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00122] Um terceiro exemplo de arranjo 2 pode incluir o vetor (e, portanto, a sequência de sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CHI, região de dobradiça, CH2 e CH3 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, em que a sequência ligante está posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve.

[00123] O quarto exemplo do arranjo de 2 pode incluir o vetor (e, portanto, a sequência de sequência de ácidos nucleicos recombinantes) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CHI, região de dobradiça, CH2 e CH3, e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, no qual a sequência de ligação está posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve. Expressão do construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes

[00124] Como descrito anteriormente, o construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode incluir, entre um ou mais componentes, a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve.

[00125] Quando o arranjo 1, como descrito anteriormente, é utilizado, o primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia leve. Quando o arranjo 2, como descrito anteriormente, é utilizado, o construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e do polipeptídeo de cadeia leve.

[00126] Mediante expressão, por exemplo, mas não se limitando a, em uma célula, organismo ou mamífero, o polipeptídeo da cadeia pesada e o polipeptídeo da cadeia leve podem se reunir no anticorpo sintético. Em particular, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que a montagem resulte no anticorpo sintético capaz de se ligar ao antígeno. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de tal modo que a montagem resulta no anticorpo sintético sendo mais imunogênico em comparação com um anticorpo não montado como descrito aqui. Ainda em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que a montagem resulte no anticorpo sintético capaz de provocar ou induzir uma resposta imune contra o antígeno. Vetores

[00127] O constrtuto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes descrito anteriormente pode ser colocado em um ou mais vetores. Os um ou mais vetores podem conter uma origem de replicação. Os um ou mais vetores podem ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Os um ou mais vetores podem ser um vetor cromossômico extra de autorreplicação ou um vetor que se integra ao genoma do hospedeiro.

[00128] Os vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombinantes, qualquer forma de vetor "DNA nu" recombinante e semelhantes. Um "vetor" compreende um ácido nucleico que pode infectar, transfectar, transduzir transitória ou permanentemente uma célula. Será reconhecido que um vetor pode ser um ácido nucleico nu, ou um ácido nucleico complexado com proteína ou lipídeo. O vetor opcionalmente compreende ácidos nucleicos virais ou bacterianos e/ou proteínas e/ou membranas (por exemplo, uma membrana celular, um envelope lipídico viral, etc.). Os vetores incluem, mas não estão limitados a, replicons (por exemplo, replicons de RNA, bacteriófagos) aos quais fragmentos de DNA podem ser anexados e replicados. Os vetores incluem assim, mas não estão limitados a, RNA, DNA ou RNA circular ou linear de autorreplicação autônomo (por exemplo, plasmídeos, vírus e semelhantes, ver, por exemplo, Pat. dos EUA nº 5.217.879) e incluem os plasmídeos de expressão e não expressão. Em algumas modalidades, o vetor inclui DNA linear, DNA enzimático ou DNA sintético. Quando um micro-organismo recombinante ou cultura de células é descrito como hospedando um "vetor de expressão", isso inclui o DNA circular e linear extra-cromossômico e o DNA que foi incorporado no(s) cromossomo(s) hospedeiro(s). Quando um vetor está sendo mantido por uma célula hospedeira, o vetor pode ser replicado de forma estável pelas células durante a mitose como uma estrutura autônoma ou é incorporado ao genoma do hospedeiro.

[00129] Os um ou mais vetores podem ser um construto de expressão heteróloga, que geralmente é um plasmídeo usado para introduzir um gene específico em uma célula alvo. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula, o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve que é codificado pelo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes é produzido pelos complexos ribossômicos do maquinário de transcrição e tradução celular. Os um ou mais vetores podem expressar grandes quantidades de RNA mensageiro estável e, portanto, proteínas. Vetor de expressão

[00130] Os um ou mais vetores podem ser um plasmídeo circular ou um ácido nucleico linear. O plasmídeo circular e o ácido nucleico linear são capazes de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos específica em uma célula em questão apropriada. Os um ou mais vetores compreendendo o construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes podem ser quiméricos, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo em relação a pelo menos um de seus outros componentes. Plasmídeo

[00131] Os um ou mais vetores podem ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfectar células com o construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes. O plasmídeo pode ser útil para introduzir o construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes no indivíduo. O plasmídeo também pode compreender uma sequência reguladora, que pode ser bem adequada para a expressão genética em uma célula na qual o plasmídeo é administrado.

[00132] O plasmídeo também pode compreender uma origem de replicação em mamíferos, a fim de manter o plasmídeo extracromossômica e produzir várias cópias do plasmídeo em uma célula. O plasmídeo pode ser pVAX, pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein-Barr e da região de codificação EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir replicação epissômica de alta cópia sem integração. A espinha dorsal do plasmídeo pode ser pAV0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus do tipo 5 (Ad5) com defeito de replicação.

[00133] O plasmídeo pode ser pSF420 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em Escherichia coli (E.coli). O plasmídeo também pode ser p YES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser utilizado para produção de proteínas em cepas de levedura de Saccharomyces cerevisiae. O plasmídeo também pode ser o sistema de expressão baculovírus completo MAXBAC'Y (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de insetos. O plasmídeo também pode ser pcDNA I ou pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO).

RNA

[00134] Em uma modalidade, o ácido nucleico é uma molécula de RNA. Em uma modalidade, a molécula de RNA é transcrita de uma sequência de DNA aqui descrita. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de RNA é codificada por uma sequência de DNA pelo menos 90% homóloga a uma sequência de DNA que codifica uma das SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,6 ou uma variante da mesma ou uma fragmento do mesmo. Por conseguinte, em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula de RNA que codifica um ou mais dos MAbs ou DMAbs. O RNA pode ser de fita positiva. Por conseguinte, em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser traduzida por células sem a necessidade de nenhuma etapa de replicação intermediária, como a transcrição reversa. Uma molécula de RNA útil com a invenção pode ter um cap 5' (por exemplo, uma 7-metilguanosina). Este cap pode melhorar a tradução in vivo do RNA. O nucleotídeo 5' de uma molécula de RNA útil com a invenção pode ter um grupo trifosfato 5". Em um RNA limitado, isso pode estar ligado a uma 7-metilguanosina por meio de uma ponte de 5' a 5". Uma molécula de RNA pode ter uma cauda 3' poli-A. Também pode incluir uma sequência de reconhecimento de polimerase poli-A (por exemplo, AAUAAA) próxima à sua extremidade 3'. Uma molécula de RNA útil com a invenção pode ser de fita simples. Uma molécula de RNA útil com a invenção pode compreender RNA sintético. Em algumas modalidades, a molécula de RNA é uma molécula de RNA nua. Em uma modalidade, a molécula de RNA é compreendida dentro de um vetor.

[00135] Em uma modalidade, o RNA possui UTRs 5' e 3. Em uma modalidade, a UTR 5' tem entre zero e 3.000 nucleotídeos de comprimento. O comprimento das sequências 5' e 3' UTR a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterado por métodos diferentes, incluindo, mas não limitado a, projetar iniciadores para PCR que emparelham com diferentes regiões das UTRs. Utilizando esta abordagem, um versado na técnica pode modificar os comprimentos de UTR 5' e 3' necessários para alcançar a eficiência ideal de tradução após a transfecção do RNA transcrito.

[00136] As UTRs 5' e 3' podem ser as UTRs 5' e 3' endógenas de ocorrência natural para o gene de interesse. Alternativamente, as sequências de UTR que não são endógenas ao gene de interesse podem ser adicionadas incorporando as sequências de UTR nos iniciadores direto e reverso ou por quaisquer outras modificações do modelo. O uso de sequências UTR que não são endógenas ao gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficiência da tradução do RNA. Por exemplo, sabe-se que elementos ricos em AU nas sequências 3' UTR podem diminuir a estabilidade do RNA. Portanto, UTRs 3' podem ser selecionados ou projetados para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base nas propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.

[00137] Em uma modalidade, a UTR 5' pode conter a sequência Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando um UTR 5' que não é endógeno ao gene de interesse está sendo adicionado por PCR como descrito anteriormente, uma sequência de consenso de Kozak pode ser reprojetada adicionando a sequência UTR 5'. As sequências de Kozak podem aumentar a eficiência da tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parece ser necessário para todos os RNAs para permitir a tradução eficiente. O requisito para sequências de Kozak para muitos RNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades, a UTR 5' pode ser derivada de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável nas células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeo podem ser usados na UTR 3' ou 5' para impedir a degradação por exonuclease do RNA.

[00138] Em uma modalidade, o RNA tem um cap na extremidade 5' e uma cauda poli (A) 3' que determina a ligação ao ribossomo, início da tradução e estabilidade do RNA na célula.

[00139] Em uma modalidade, o RNA é um RNA modificado por nucleosídeo. O RNA modificado por nucleosídeo tem vantagens particulares sobre o RNA não modificado, incluindo, por exemplo, estabilidade aumentada, imunogenicidade inata baixa ou ausente e tradução aprimorada. Vetor circular e linear

[00140] Os um ou mais vetores podem ser um ou mais plasmídeos circulares, que podem transformar uma célula alvo por integração no genoma celular ou existir extracromossômica (por exemplo, plasmídeo replicador autônomo com origem de replicação). O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0 ou provax, ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes.

[00141] Também é aqui fornecido um ácido nucleico linear, ou cassete de expressão linear ("LEC"), que é capaz de ser entregue eficientemente a um indivíduo por eletroporação e expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer espinha dorsal de fosfato. O LEC não pode conter nenhum gene de resistência a antibióticos e/ou um espinha dorsal de fosfato. O LEC pode não conter outras sequências de ácidos nucleicos não relacionadas à expressão genética desejada.

[00142] O LEC pode ser derivado de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes. O plasmídeo pode ser pnP (Puerto Rico / 34) ou pM2 (New Caledonia / 99). O plasmídeo pode ser WLVOO9, pv AX, pcDNA3.0 ou provax, ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinantes.

[00143] O LEC pode ser perM2. O LEC pode ser perNP. O perNP e o perMR podem ser derivados de pNP (Puerto Rico / 34) e pM2 (New Caledonia / 99), respectivamente. Vetores virais

[00144] Em uma modalidade, os vetores virais são aqui fornecidos, os quais são capazes de fornecer um ácido nucleico da invenção a uma célula. O vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia do vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001), e em Ausubel et al. (1997) e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores, incluem, entre outros, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado compreende uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios convenientes de endonucleases de restrição e um ou mais marcadores selecionáveis. (Ver, por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Patente dos EUA n 6.326.193). Os vetores virais, e especialmente os vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserir genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do herpes simplex 1, adenovírus e vírus adenoassociados, e semelhantes. Por exemplo, ver as Patentes US

5.350.674 e 5.585.362. Método de preparação do vetor

[00145] É aqui fornecido um método para a preparação de um ou mais vetores nos quais o construto da sequência de ácidos nucleicos recombinantes foi colocado. Após a etapa final de subclonagem, o vetor pode ser usado para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em grande escala, usando métodos conhecidos na técnica.

[00146] Em outras modalidades, após a etapa final de subclonagem, o vetor pode ser usado com um ou mais dispositivos de eletroporação (EP). Os dispositivos de EP são descritos aqui em mais aqui.

[00147] Os um ou mais vetores podem ser formulados ou fabricados usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, e podem ser fabricados usando uma técnica de fabricação de plasmídeo descrita no pedido provisório dos EUA, nº de série US 60 / 939.792, que foi depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os plasmídeos de DNA aqui descritos podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg /mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além dos descritos no nº de série US 60/939792, incluindo os descritos na patente dos EUA nº 7.238.522, que foi depositada em 3 de julho de 2007. O pedido e a patente mencionados anteriormente, nº de série US 60 / 939.792 e patente dos EUA nº 7.238.522, respectivamente, são incorporados na sua totalidade. Anticorpo

[00148] Como descrito aqui, a sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode codificar o anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo pode se ligar ou reagir ao antígeno, que é descrito em mais detalhes aqui.

[00149] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve "(CDR"), interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pesada e uma estrutura de cadeia leve ("FR") que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como "CDRI1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00150] O anticorpo pode tratar, prevenir e/ou proteger contra doenças, como câncer, no indivíduo administrado uma composição da invenção. O anticorpo, por ligação ao antígeno, pode tratar, prevenir e/ou proteger contra doenças no indivíduo administrado com a composição. O anticorpo pode promover a sobrevivência da doença no indivíduo administrado com a composição. Em uma modalidade, o anticorpo pode proporcionar maior sobrevivência da doença no indivíduo, em relação à sobrevivência esperada de um indivíduo com a doença que não foi administrado com o anticorpo. Em várias modalidades, o anticorpo pode fornecer pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, T%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% , 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou um aumento de 100% na sobrevivência da doença em indivíduos administrados com a composição durante a sobrevida esperada na ausência da composição. Em uma modalidade, o anticorpo pode fornecer proteção aumentada contra a doença no indivíduo sobre a proteção esperada de um indivíduo ao qual não foi administrado o anticorpo. Em várias modalidades, o anticorpo pode proteger contra doenças em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% dos indivíduos administrados com a composição sobre a proteção esperada na ausência da composição.

[00151] A enzima proteolítica papaína cliva preferivelmente as moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F (ab)) compreendem cada um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab'),, que compreende os dois sítios de ligação ao antígeno. Por conseguinte, o anticorpo pode ser o Fab ou F(ab'), O Fab pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada do Fab pode incluir a região VH e a região CHI. A cadeia leve do Fab pode incluir a região VL e a região CL.

[00152] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CHI, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode incluir uma região VL e uma região CL.

[00153] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo amadurecido por afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo de uma espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana.

[00154] O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico, como descrito aqui em mais detalhes. O anticorpo pode ser um anticorpo bifuncional, como também descrito aqui em mais detalhes.

[00155] Como descrito anteriormente, o anticorpo pode ser gerado no indivíduo após a administração da composição ao indivíduo. O anticorpo pode ter uma meia-vida dentro do indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser modificado para prolongar ou reduzir sua meia-vida dentro do indivíduo. Tais modificações são descritas aqui em mais detalhes.

[00156] O anticorpo pode ser desfucosilado como descrito em mais detalhes aqui.

[00157] O anticorpo pode ser modificado para reduzir ou impedir o aumento dependente de anticorpo (ADE) da doença associada ao antígeno, conforme descrito em mais detalhes aqui. Anticorpo biespecífico

[00158] A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode codificar o anticorpo biespecífico, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo biespecífico pode se ligar ou reagir com dois antígenos, por exemplo, dois dos antígenos aqui descritos em mais detalhes. O anticorpo biespecífico pode ser composto por fragmentos de dois dos anticorpos aqui descritos, permitindo assim que o anticorpo biespecífico se ligue ou reaja com duas moléculas alvo desejadas, que podem incluir o antígeno, que é descrito aqui com mais detalhes, um ligante, incluindo um ligante para um receptor, um receptor, incluindo um sítio de ligação ao ligante no receptor, um complexo ligante-receptor e um marcador, incluindo um marcador de câncer. Anticorpo bifuncional

[00159] A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode codificar o anticorpo bifuncional, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo bifuncional pode se ligar ou reagir com o antígeno aqui descrito. O anticorpo bifuncional também pode ser modificado para conferir uma funcionalidade adicional ao anticorpo, além do reconhecimento e ligação ao antígeno. Essa modificação pode incluir, mas não está limitada a, o acoplamento ao fator H ou um fragmento do mesmo. O fator H é um regulador solúvel da ativação do complemento e, portanto, pode contribuir para uma resposta imune por meio da lise mediada por complemento (CML). Extensão da meia-vida do anticorpo

[00160] Como descrito anteriormente, o anticorpo pode ser modificado para prolongar ou reduzir a meia-vida do anticorpo no indivíduo. À modificação pode prolongar ou reduzir a meia-vida do anticorpo no soro do indivíduo.

[00161] A modificação pode estar presente em uma região constante do anticorpo. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região constante do anticorpo que prolonga a meia-vida do anticorpo em comparação com a meia-vida de um anticorpo que não contém as uma ou mais substituições de aminoácidos. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos no domínio CH2 do anticorpo que prolongam a meia-vida do anticorpo em comparação com a meia-vida de um anticorpo que não contém as uma ou mais substituições de aminoácidos.

[00162] Em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante podem incluir a substituição de um resíduo de metionina na região constante por um resíduo de tirosina, um resíduo de serina na região constante por um resíduo de treonina, um resíduo de treonina na região constante com um resíduo de glutamato, ou qualquer combinação dos mesmos, prolongando assim a meia-vida do anticorpo.

[00163] Em outras modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante podem incluir a substituição de um resíduo de metionina no domínio CH2 por um resíduo de tirosina, um resíduo de serina no domínio CH2 por um resíduo de treonina, um resíduo de treonina no domínio CH2 com um resíduo de glutamato, ou qualquer combinação dos mesmos, prolongando assim a meia-vida do anticorpo.

Desfucosilação

[00164] A sequência de ácidos nucleicos recombinantes pode codificar um anticorpo que não é fucosilado (isto é, um anticorpo desfucosilado ou um anticorpo não fucosilado), um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. A fucosilação inclui a adição de fucose de açúcar a uma molécula, por exemplo, a ligação de fucose a N-glicanos, O- glicanos e glicolipídeos. Consequentemente, em um anticorpo desfucosilado, a fucose não está ligada às cadeias de carboidratos da região constante. Por sua vez, esta falta de fucosilação pode melhorar a ligação a FcyRIIla e a atividade citotóxica celular direcionada por anticorpo (ADCC) pelo anticorpo em comparação com o anticorpo fucosilado. Portanto, em algumas modalidades, o anticorpo não fucosilado pode exibir atividade aumentada de ADCC em comparação com o anticorpo fucosilado.

[00165] O anticorpo pode ser modificado de modo a impedir ou inibir a fucosilação do anticorpo. Em algumas modalidades, esse anticorpo modificado pode exibir atividade ADCC aumentada em comparação com o anticorpo não modificado. A modificação pode estar na cadeia pesada, cadeia leve ou uma combinação das mesmas. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia pesada, uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia leve ou uma combinação das mesmas. Resposta ADE reduzida

[00166] O anticorpo pode ser modificado para reduzir ou impedir o aumento dependente de anticorpo (ADE) da doença associada ao antígeno, mas ainda assim neutralizar o antígeno.

[00167] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser modificado para incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem ou impedem a ligação do anticorpo a FeyRla. As uma ou mais substituições de aminoácidos podem estar na região constante do anticorpo. As uma ou mais substituições de aminoácidos podem incluir a substituição de um resíduo de leucina por um resíduo de alanina na região constante do anticorpo, isto é, também conhecido aqui como LA, mutação LA ou substituição LA. As uma ou mais substituições de aminoácidos podem incluir a substituição de dois resíduos de leucina, cada um com um resíduo de alanina, na região constante do anticorpo e também aqui conhecida como LALA, mutação LALA ou substituição LALA. A presença das substituições de LALA pode impedir ou bloquear a ligação do anticorpo a FceyR1a e, assim, o anticorpo modificado não melhora ou causa ADE da doença associada ao antígeno, mas ainda neutraliza o antígeno. Anticorpos monoclonais

[00168] Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos anti- CTLA-H. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais intactos e fragmentos imunologicamente ativos (por exemplo, um fragmento Fab ou (Fab); ), uma cadeia pesada de anticorpo monoclonal ou uma cadeia leve de anticorpo monoclonal.

[00169] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve "(CDR"), interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pesada e uma estrutura de cadeia leve ("FR") que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como "CDRI1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00170] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região

CHI, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode incluir uma região VL e uma região CL. Método de geração do anticorpo sintético

[00171] A presente invenção também refere-se a um método para gerar o anticorpo sintético. O método pode incluir a administração da composição ao indivíduo em necessidade usando o método de administração descrito em mais detalhes aqui. Por conseguinte, o anticorpo sintético é gerado no indivíduo ou in vivo após a administração da composição ao indivíduo.

[00172] O método também pode incluir a introdução da composição em uma ou mais células e, portanto, o anticorpo sintético pode ser gerado ou produzido em uma ou mais células. O método pode ainda incluir a introdução da composição em um ou mais tecidos, por exemplo, mas não limitado a, pele e músculo e, portanto, o anticorpo sintético pode ser gerado ou produzido em um ou mais tecidos. Antígeno do câncer

[00173] As composições e métodos da invenção podem ser utilizados em combinação com um antígeno, ou fragmento ou variante do mesmo.

[00174] Os marcadores são proteínas conhecidas que estão presentes ou são reguladas em relação a certas células cancerígenas. Pela metodologia de geração de antígenos que representam esses marcadores de maneira a quebrar a tolerância a si próprio, uma vacina contra o câncer pode ser gerada. Tais vacinas contra o câncer podem incluir inibidores do ponto de verificação para melhorar a resposta imune.

[00175] Aspectos da presente invenção incluem composições para melhorar uma resposta imune contra um antígeno em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo anticorpo sintético em combinação com um antígeno sintético capaz de gerar uma resposta imune no indivíduo, ou um fragmento ou variante biologicamente funcional. Em algumas modalidades, o antígeno compreende mTERT. Em algumas modalidades, o antígeno compreende hTERT.

[00176] O antígeno sintético pode ser um DNA isolado que codifica para o antígeno. Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno de superfície associado ao tumor. Exemplos ilustrativos de um antígeno de superfície associado a um tumor são CDIO0, CDI19, CD20, CD22, CD33, tirosina- quinase tipo Fms 3 (FLT-3, CD135), proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPGA, proteoglicano de sulfato de condroitina associado ao melanoma), crescimento epidérmico receptor de fator (EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, CD133, IL3R, proteína ativadora de fibroblastos (FAP), CDCPI, Derlinl, Tenascin, frizzled 1-10, antígenos vasculares VEGFR2 (KDR / FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-alfa. (CDI40a), PDGFR-beta. (CD140b) Endoglin, CLECI4, Teml-8 e Tie2. Outros exemplos podem incluir A33, CAMPATH-1 (CDwS52), antígeno carcinoembrionário (CEA), carboanidrase IX (MN / CA IX), CD21, CD25, CD30, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, de2-7 EGFR, EGFRvVIII , EpBCAM, Ep-CAM, proteína de ligação ao folato, G250, tirosina-quinase tipo Fms 3 (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSFIR (CD1I15), HLA-DR, IGFR, receptor de IL-2, IL3R, MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina na superfície celular associado à melanoma), Muc-1, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno específico da próstata (PSA) e TAG-72. Exemplos de antígenos expressos na matriz extracelular de tumores são a tenascina e a proteína ativadora de fibroblastos (FAP).

[00177] Em uma modalidade, o antígeno sintético pode ser selecionado do grupo incluindo: hTERT, PSA, PSMA, STEAP, PSCA e PAP, WTI, tirosinase, NYESO1, PRAME e MAGE. A seguir, alguns exemplos de antígenos do câncer: hTERT

[00178] O hTERT é uma transcriptase reversa da telomerase humana que sintetiza um marcador de TTAGGG no final dos telômeros para evitar a morte celular devido ao encurtamento cromossômico. As células hiperproliferativas com expressão anormalmente alta de hTERT podem ser alvo de imunoterapia. Estudos recentes demonstram que a expressão de hTERT em células dendríticas transfectadas com genes hTERT pode induzir células T citotóxicas CD8 + e provocar células T CD4 + de uma maneira específica de antígeno.

[00179] O hTERT pode ser administrado nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento. antígenos prostáticos

[00180] A seguir, são antígenos capazes de provocar uma resposta imune em um mamífero contra um antígeno da próstata. O antígeno de consenso pode compreender epítopos que os tornam particularmente eficazes, pois podem ser induzidos imunógenos contra células cancerígenas da próstata. O antígeno de consenso de próstata pode compreender o produto de tradução de comprimento total, uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação do mesmo.

[00181] Os antígenos da próstata podem incluir um ou mais dos seguintes itens: antígeno PSA, antígeno PSMA, antígeno STEAP, antígeno PSCA, antígeno da fosfatase ácida prostática (PAP) e outros marcadores conhecidos do câncer de próstata. As proteínas podem compreender sequências homólogas aos antígenos da próstata, fragmentos dos antígenos da próstata e proteínas com sequências homólogas aos fragmentos dos antígenos da próstata.

[00182] Os antígenos da próstata podem ser administrados nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento.

WTI

[00183] O antígeno pode ser o gene supressor de tumor | de Wilm (WTI), um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O WTI é um fator de transcrição contendo no terminal N, um domínio de ligação ao DNA rico em prolina / glutamina e no terminal C, quatro motivos de dedo de zinco. O WT1 desempenha um papel no desenvolvimento normal do sistema urogenital e interage com vários fatores, por exemplo, p53, um supressor de tumores conhecido e a serina protease HtrA2, que cliva o WTI em vários locais após o tratamento com um medicamento citotóxico.

[00184] A mutação do WT1 pode levar à formação de tumores ou câncer, por exemplo, tumor de Wilm ou tumores que expressam WTI. O tumor de Wilm geralmente se forma em um ou ambos os rins antes de metastizar para outros tecidos, por exemplo, mas não se limitando a tecido hepático, tecido do sistema urinário, tecido linfático e tecido pulmonar. Consequentemente, o tumor de Wilm pode ser considerado um tumor metastático. O tumor de Wilm geralmente ocorre em crianças menores (por exemplo, com menos de 5 anos) e em formas esporádicas e hereditárias. Consequentemente, a vacina pode ser utilizada para tratar indivíduos que sofrem do tumor de Wilm. A vacina também pode ser usada para tratar indivíduos com câncer ou tumores que expressam WTI para impedir o desenvolvimento de tais tumores em indivíduos. O antígeno WT1 pode diferir do gene WTI "normal" nativo e, portanto, fornecer terapia ou profilaxia contra um tumor que expressa o antígeno WTI. As proteínas podem compreender sequências homólogas aos antígenos de WTI, fragmentos dos antígenos de WTI e proteínas com sequências homólogas aos fragmentos dos antígenos de WTI.

[00185] Os antígenos de WT1 podem ser administrados nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento. Antígeno da tirosinase

[00186] O antígeno tirosinase (Tyr) é um alvo importante para a depuração imune mediada pela indução (1) de imunidade humoral por meio de respostas de células B para gerar anticorpos que bloqueiam a produção de proteína-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1), retardando assim as células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e suprimir o crescimento do tumor; (2) aumentam o linfócito T citotóxico, como CD8* (CTL), para atacar e matar células tumorais; (3) aumentar as respostas das células T auxiliares; (4) e aumentam as respostas inflamatórias via IFN-y e TFN-a ou todos os itens mencionados anteriormente.

[00187] A tirosinase é uma enzima contendo cobre que pode ser encontrada em tecidos de plantas e animais. A tirosinase catalisa a produção de melanina e outros pigmentos pela oxidação de fenóis como a tirosina. No melanoma, a tirosinase pode se tornar desregulada, resultando no aumento da síntese de melanina. A tirosinase também é alvo do reconhecimento de células T citotóxicas em indivíduos que sofrem de melanoma. Consequentemente, a tirosinase pode ser um antígeno associado ao melanoma.

[00188] O antígeno pode compreender epítopos de proteína que os tornam particularmente eficaz como imunógenos contra os quais respostas imunes anti-Tyr podem ser induzidas. O antígeno de Tyr pode compreender o produto de tradução de comprimento total, uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação do mesmo.

[00189] O antígeno Tyr pode compreender uma proteína de consenso. O antígeno Tyr induz respostas de células T específicas ao antígeno e de anticorpos com alto título tanto sistemicamente contra todas as células relacionadas ao câncer quanto ao tumor. Como tal, uma resposta imune protetora é fornecida contra a formação de tumores por vacinas compreendendo o antígeno de consenso Tyr. Por conseguinte, qualquer usuário pode projetar uma vacina da presente invenção para incluir um antígeno Tyr para fornecer ampla imunidade contra a formação de tumores, metástases de tumores e crescimento de tumores. As proteínas podem compreender sequências homólogas aos antígenos de Tyr, fragmentos dos antígenos de Tyr e proteínas com sequências homólogas aos fragmentos dos antígenos de Tyr.

[00190] Os antígenos de Tyr podem ser administrados nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento. NYESO01

[00191] NY-ESO-1 é um antígeno de testículo de câncer expresso em vários tipos de câncer, onde pode induzir imunidade celular e humoral. Estudos de expressão genética mostraram regulação positiva do gene para NY-ESO-1, CTAGIB, em lipossarcomas mixoides e de células redondas. As proteínas podem compreender sequências homólogas aos antígenos de NYESOI, fragmentos dos antígenos de NYESO!1 e proteínas com sequências homólogas aos fragmentos dos antígenos de NYESOIL.

[00192] Os antígenos de NYESO1 podem ser administrados nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento.

PRAME

[00193] O antígeno do melanoma expresso preferivelmente em tumores (antígeno PRAME) é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene PRAME. Esse gene codifica um antígeno que é expresso predominantemente nos melanomas humanos e que é reconhecido pelos linfócitos T citolíticos. Ele não é expresso em tecidos normais, exceto no testículo. O gene também é expresso em leucemias agudas. Foram observadas cinco variantes de transcrição de splicing alternativamente que codificam a mesma proteína para este gene. As proteínas podem compreender sequências homólogas aos antígenos de PRAME, fragmentos dos antígenos de PRAME e proteínas com sequências homólogas aos fragmentos dos antígenos de PRAME.

[00194] Os antígenos PRAME podem ser administrados nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento.

MAGE

[00195] MAGE significa Antígeno associado ao melanoma e, em particular, antígeno associado ao melanoma 4 (MAGEA4). O MAGE-A4 é expresso em células germinativas masculinas e células tumorais de vários tipos histológicos, como carcinomas gastrointestinais, esofágicos e pulmonares. O MAGE-AA4 se liga a oncoproteína, Gankyrin. Esta ligação específica de MAGE-A4 é mediada pelo seu terminal C. Estudos demonstraram que o MAGE-A4 exógeno pode inibir parcialmente o crescimento independente de adesão das células com superexpressão de Gankyrin in vitro e suprimir a formação de tumores migrados dessas células em camundongos nus. Esta inibição depende da ligação entre MAGE-A4 e Gankyrin, sugerindo que as interações entre Gankyrin e MAGE-A4 inibem a carcinogênese mediada por Gankyrin. É provável que a expressão de MAGE no tecido tumoral não seja uma causa, mas um resultado da gênese do tumor, e os genes MAGE participem do processo imunológico, visando as células tumorais precoces para destruição.

[00196] A proteína do antígeno associado ao melanoma 4 (MAGEA4) pode estar envolvida no desenvolvimento embrionário e na transformação e/ou progressão do tumor. O MAGEA4 é normalmente expresso nos testículos e na placenta. O MAGEAA, no entanto, pode ser expresso em muitos tipos diferentes de tumores, por exemplo, melanoma, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, carcinoma de pulmão e carcinoma de mama. Consequentemente, o MAGEAA4 pode ser um antígeno associado a uma variedade de tumores.

[00197] O antígeno de MAGEA4 pode induzir respostas de anticorpos de células T específicas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é direcionada ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular induzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-y) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF- a). Em outras modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imunossupressão que promovem o crescimento do tumor ou câncer que expressa o antígeno, por exemplo, mas não limitados a fatores que suprarregulam a apresentação de MHC, fatores que suprarregulam as células T reguladoras específicas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL, citocinas, como IL-10 e TFG-B, macrófagos associados a tumores, fibroblastos associados a tumores.

[00198] O antígeno MAGEAA4 pode compreender epítopos de proteína que os tornam particularmente eficaz como imunógenos contra os quais respostas imunes anti-MAGEA4 podem ser induzidas. O antígeno MAGEA4 pode compreender o produto de tradução de comprimento total, uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O antígeno MAGEAA4 pode compreender uma proteína de consenso.

[00199] A sequência de ácidos nucleicos que codifica o antígeno MAGEAA4 consenso pode ser otimizada no que diz respeito à utilização de códons e transcrições de RNA correspondentes. O ácido nucleico que codifica o antígeno consenso MAGEA4 pode ser códon e RNA otimizado para expressão. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o antígeno MAGEAA4 consenso pode incluir uma sequência Kozak (por exemplo, GCC ACC) para aumentar a eficiência da tradução. O ácido nucleico que codifica o antígeno MAGEAA4 consenso pode incluir múltiplos códons de paragem (por exemplo, TGA) para aumentar a eficiência da terminação da tradução.

[00200] Os antígenos MAGE podem ser administrados nos vetores aqui descritos e combinados com inibidores do ponto de verificação em vários esquemas de vacinação, incluindo os no Exemplo, neste documento. Antígeno tumoral

[00201] No contexto da presente invenção, "antígeno tumoral" ou "antígeno do distúrbio hiperproliferativo" ou "antígeno associado a um distúrbio hiperproliferativo" refere-se a antígenos comuns a distúrbios hiperproliferativos específicos, como o câncer. Os antígenos discutidos aqui são meramente incluídos a título de exemplo. A lista não se destina a ser exclusiva e outros exemplos serão facilmente evidentes para os versados na técnica.

[00202] Os antígenos tumorais são proteínas produzidas por células tumorais que provocam uma resposta imunológica, particularmente respostas imunológicas mediadas por células T. A seleção da porção de ligação ao antígeno da invenção dependerá do tipo particular de câncer a ser tratado. Os antígenos tumorais são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, um antígeno associado ao glioma, antígeno carcinoembrionário (CEA), gonadotropina coriônica fi-humana, alfafetoproteína (AFP), AFP reativo à lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN- CA IX, transcriptase reversa da telomerase humana, RUI, RU2 (AS), carboxilesterase intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-ESO-I, LAGE-l a, p53, prostein, PSMA, Her2 / neu, survivina e telomerase, antígeno- 1 do tumor da próstata-carcinoma (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastase de neutrófilos, efrinaB2, CD22, fator de crescimento da insulina (IGF) -I, IGF-II, Receptor de IGF-I e mesotelina.

[00203] Em uma modalidade, o antígeno tumoral compreende um ou mais epítopos de câncer antigênico associados a um tumor maligno. Os tumores malignos expressam inúmeras proteínas que podem servir como antígenos alvo para um ataque imune. Essas moléculas incluem, mas não estão limitadas a, antígenos específicos de tecido, como MART-I, tirosinase e GP 100 em melanoma e fosfatase ácida prostática (PAP) e antígeno prostático específico (PSA) no câncer de próstata. Outras moléculas alvo pertencem ao grupo de moléculas relacionadas à transformação, como o oncogene HER-2 / Neu / ErbB-2. Ainda outro grupo de antígenos alvo são antígenos oncofetais, como o antígeno carcinoembrionário (CEA). No linfoma de células B, a imunoglobulina idiotipo específico de tumor constitui um antígeno de imunoglobulina verdadeiramente específico de tumor que é exclusivo para o tumor individual. Os antígenos de diferenciação de células B, como CDIS9, CD?20 e CD37, são outros candidatos a antígenos alvo no linfoma de células B. Alguns desses antígenos (idiotipo CEA, HER-2, CD1I9, CD20) foram utilizados como alvos para imunoterapia passiva com anticorpos monoclonais com sucesso limitado.

[00204] O tipo de antígeno tumoral referido na invenção também pode ser um antígeno específico do tumor (TSA) ou um antígeno associado ao tumor (TAA). Um TSA é exclusivo das células tumorais e não ocorre em outras células do corpo. Um antígeno associado ao TAA não é exclusivo de uma célula tumoral e também é expresso em uma célula normal sob condições que não induzem um estado de tolerância imunológica ao antígeno. À expressão do antígeno no tumor pode ocorrer em condições que permitem ao sistema imunológico responder ao antígeno. Os TAAs podem ser antígenos que são expressos em células normais durante o desenvolvimento fetal quando o sistema imunológico é imaturo e incapaz de responder ou podem ser antígenos que estão normalmente presentes em níveis extremamente baixos nas células normais, mas que são expressos em níveis muito mais altos nas células tumorais.

[00205] Exemplos não limitantes de antígenos TSA ou TAA incluem o seguinte: Antígenos de diferenciação, como MART-1I/MelanA (MART-D), gp100 (Pmel 17), tirosinase, TRP-1, TRP-2 e antígenos multilinhagem específicos para tumores, como MAGE-Il, MAGE-3, BAGE, GAGE-I, GAGE-2, pl5; antígenos embrionários superexpressos, como CEA; Ooncogenes superexpressos e genes supressores de tumor mutados tais como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorais únicos resultantes de translocações cromossômicas; tais como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL- RAR; e antígenos virais, como os antígenos EBVA do vírus Epstein Barr e os antígenos E6 e E7 do papilomavírus humano (HPV). Outros antígenos grandes baseados em proteínas incluem TSP-180, MAGE-4, MAGE-S, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 724, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDKA, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5ST4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3NCA 27.29BCAA, CA 195, CA 242, CA- 50, CAM43, CD68YP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733)EpCAM, HTegp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOVI8, NB/70K, NY-CO-l, RCASI, SDCCAG16, proteína de ligação a TA-90 V Mac-2 À proteína associada à ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP, e TPS.

Excipientes e outros componentes da composição

[00206] A composição pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. Oo transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser moléculas funcionais, tais como veículos, adjuvantes, transportadores, ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, tals como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos de quinona, vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico,

lipídeos, lipossomas, fons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos.

[00207] O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. O agente facilitador da transfecção é o poli-L-glutamato, e o poli-L-glutamato pode estar presente na composição a uma concentração inferior a 6 mg / ml. O agente facilitador de transfecção também pode incluir agentes ativos de superfície, tais como os complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freunds, análogos de LPS incluindo o lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos da quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, e o ácido hialurônico pode ser administrado em conjunto com a composição. À composição também pode incluir um agente facilitador da transfecção, como lipídeos, lipossomos, incluindo lipossomos de lecitina ou outros lipossomos conhecidos na técnica, como uma mistura DNA-lipossomo (ver, por exemplo, WO09324640), íons cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions ou nanopartículas ou outros agentes facilitadores da transfecção conhecidos. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L- glutamato (LGS) ou lipídeo. A concentração do agente de transfecção na composição é de menos de 4 mg/ml, menos de 2 mg/ml, menos de 1 mg/ml, menos de 0,750 mg/ml, menos de 0,500 mg/ml, menos de 0,250 mg/ml, menos de 0,100 mg/ml, menos de 0,050 mg/ml, ou menos de 0,010 mg/ml.

[00208] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um adjuvante além dos anticorpos inibidores do ponto de verificação da invenção. Os adjuvantes adicionais podem ser outros genes que são expressos em plasmídeo alternativo ou são distribuídos como proteínas em combinação com o plasmídeo anterior na composição. O adjuvante pode ser selecionado do grupo que consiste em: o-interferon (IFN-o), B-interferon (IFN-B), y- interferon, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), quimiocina de atração de célula T cutânea (CTACK), quimiocina expressa por timo epitelial (TECK), quimiocina epitelial associada à mucosa (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80,CD86 incluindo IL-I5 tendo a sequência sinal deletada e opcionalmente incluindo o peptídeo sinal de IgE. O adjuvante pode ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, PD-1, IL-10, IL-12, IL-18 ou uma combinação dos mesmos.

[00209] Outros genes que podem ser úteis como adjuvantes, além dos anticorpos da invenção incluem os que codificam: MCP-1, MIP-la, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GI(ÕYÇCAM-], MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento do fibroblasto, IL- 7, IL-22, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor do TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativa, SAP K, SAP-1, JNK, genes de resposta interferon, NFKB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC 5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, Ligante RANK, Ox40, Ligante Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP? e fragmentos funcionais dos mesmos.

[00210] A composição pode ainda compreender um agente facilitador genético como descrito no nº de série U.S. 021.579 depositado em 1 de abril de 1994, o qual é totalmente incorporado por referência.

[00211] A composição pode compreender DNA em quantidades de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou preferivelmente cerca de O,]l micrograma a cerca de 10 miligramas; ou mais preferivelmente cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas. Em algumas modalidades preferidas, a composição de acordo com a presente invenção compreende cerca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de | a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas, de cerca de | nanograma a 100 miligramas; de cerca de 1 micrograma a cerca de miligramas; de cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 1 miligrama a 2 miligramas, de cerca de 5 nanogramas a cerca de

1.000 microgramas, de cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas, de cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas, de cerca de 1 a 350 microgramas, de 25 a 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas de DNA.

[00212] A composição pode ser formulada de acordo com o modo de administração a ser utilizado. Uma composição farmacêutica injetável pode ser estéril, livre de pirogênio e livre de partículas. Uma formulação ou solução isotônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A composição pode compreender um agente de vasoconstrição. As soluções isotônicas podem incluir solução salina tamponada com fosfato. A composição pode ainda compreender estabilizantes, incluindo gelatina e albumina. Os estabilizantes podem permitir que a formulação seja estável à temperatura da sala ou ambiente por longos períodos de tempo, incluindo LGS ou policátions ou poliânions. Método de vacinação

[00213] A presente invenção também é direcionada a um método para aumentar uma resposta imune em um indivíduo. O aumento da resposta imune pode ser usado para tratar e/ou prevenir doenças no indivíduo. O método pode incluir a administração da vacina aqui divulgada ao indivíduo. O indivíduo que foi administrado com a vacina pode ter uma resposta imune aumentada ou reforçada em comparação com um indivíduo que foi administrado apenas com o antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune pode ser aumentada em cerca de 0,5 vez para cerca de 15 vezes, cerca de 0,5 vez a cerca de 10 vezes ou cerca de 0,5 vez a cerca de 8 vezes. Alternativamente, a resposta imune no indivíduo administrado com a vacina pode ser aumentada em pelo menos cerca de 0,5 vez, pelo menos cerca de 1,0 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2,0 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 3,0 vezes, pelo menos cerca de 3,5 vezes, pelo menos cerca de 4,0 vezes, pelo menos cerca de 4,5 vezes, pelo menos cerca de 5,0 vezes, pelo menos cerca de 5,5 vezes, pelo menos cerca de 6,5 vezes, pelo menos cerca de 7,0 vezes, pelo menos cerca de 7,5 vezes, pelo menos cerca de 8,0 vezes, pelo menos cerca de 8,5 vezes, pelo menos cerca de 9,0 vezes, pelo menos cerca de 9,5 vezes, pelo menos cerca de 10,0 vezes, pelo menos cerca de 10,5 vezes, pelo menos cerca de 11,0 vezes, pelo menos cerca de 11,5 vezes, pelo menos cerca de 12,0 vezes, pelo menos cerca de 12,5 vezes, pelo menos cerca de 12,5 vezes, pelo menos cerca de 13,0 vezes, pelo menos cerca de 13,5 vezes, pelo menos cerca de 14,0 vezes, pelo menos cerca de 14,5 vezes ou pelo menos cerca de 15,0 vezes.

[00214] Ainda em outras modalidades alternativas, a resposta imune no indivíduo administrado com a vacina pode ser aumentada em cerca de 50% a cerca de 1500%, cerca de 50% a cerca de 1000% ou cerca de 50% a cerca de 800%. Em outras modalidades, a resposta imune no indivíduo administrado com a vacina pode ser aumentada em pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 350%, pelo menos cerca de 400%, pelo menos cerca de 450%, pelo menos cerca de 500%, pelo menos cerca de 550%, pelo menos cerca de 600%, pelo menos cerca de 650%, pelo menos cerca de 700% , pelo menos cerca de 750%, pelo menos cerca de 800%, pelo menos cerca de 850%, pelo menos cerca de 900%, pelo menos cerca de 950%, pelo menos cerca de 1000%, pelo menos cerca de 1050%, pelo menos cerca de 1100%, em pelo menos cerca de 1150%, pelo menos cerca de 1200%, pelo menos cerca de 1250%, pelo menos cerca de 1300%, pelo menos cerca de 1350%, pelo menos cerca de 1450% ou pelo menos cerca de 1500%.

[00215] A dose de vacina pode estar entre 1 ug a 10 mg do componente ativo/kg peso corporal/tempo, e pode estar entre 20 ug a 10 mg do componente/kg peso corporal/tempo. À vacina pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses da vacina para tratamento eficaz pode ser 1, 2,3, 4,5,6,7,8,9 ou 10. Método de ditribuição da composição

[00216] A presente invenção também se refere a um método de distribuição da composição ao indivíduo em necessidade. O método de distribuição pode incluir, administrar a composição ao indivíduo. À administração pode incluir, mas não está limitada a, injeção de DNA com e sem eletroporação in vivo, entrega mediada por lipossomas e entrega facilitada por nanopartículas.

[00217] O mamífero que recebe a entrega da composição pode ser humano, primata, primata não humano, vaca, gado, ovelha, cabra, antílope, bisonte, búfalo de água, bisonte, bovídeos, veado, ouriços, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos e frango.

[00218] A composição pode ser administrada por diferentes vias, incluindo via oral, parenteral, sublingual, transdérmica, retal, transmucosa,

tópica, por inalação, via administração bucal, intrapleural, intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, intranasal, intratecal e intra-articular ou combinações das mesmas. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação devidamente aceitável em conformidade com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e a via de administração que é a mais apropriada para um animal particular. A composição pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, "pistolas de bombardeamento de microprojéteis", ou outros métodos físicos tal como eletroporação ("EP"), "método hidrodinâmico", ou ultrassom. Eletroporação

[00219] A administração da composição através de eletroporação pode ser realizada usando os dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para distribuir a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer com que poros reversíveis se formem em membranas de célula, e preferivelmente o pulso de energia é uma corrente constante semelhante a uma entrada de corrente predeterminada por um usuário. O dispositivo de eletroporação pode compreender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodos ou conjunto de alavancas. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos diversos elementos dos dispositivos de eletroporação, incluindo: controlador, gerador de forma de onda de corrente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento de relatório de status, porta de comunicação, componente de memória, fonte de energia e interruptor. À eletroporação pode ser realizada usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, sistema CELLECTRA EP (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) ou eletroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) para facilitar a transfecção de células pelo plasmídeo.

[00220] O componente de eletroporação pode funcionar como um elemento dos dispositivos de eletroporação, e os outros elementos são elementos (ou componentes) separados em comunicação com o componente de eletroporação. O componente de eletroporação pode funcionar como mais de um elemento dos dispositivos de eletroporação, que pode estar em comunicação ainda com outros elementos dos dispositivos de eletroporação separados do componente de eletroporação. Os elementos dos dispositivos de eletroporação existentes como partes de um dispositivo eletromecânico ou mecânico não podem ser limitados, pois os elementos podem funcionar como um dispositivo ou como elementos separados em comunicação um com o outro. O componente de eletroporação pode ser capaz de fornecer o pulso de energia que produz a corrente constante no tecido desejado e inclui um mecanismo de feedback. O conjunto de eletrodos pode incluir uma matriz de eletrodos tendo uma pluralidade de eletrodos em um arranjo espacial, em que o conjunto de eletrodos recebe o pulso de energia do componente de eletroporação e entrega o mesmo ao tecido desejado através dos eletrodos. Pelo menos um entre a pluralidade de eletrodos é neutro durante a distribuição do pulso de energia e mede a impedância no tecido desejado e comunica a impedância ao componente de eletroporação. O mecanismo de feedback pode receber a impedância medida e pode ajustar o pulso de energia entregue pelo componente de eletroporação para manter a corrente constante.

[00221] Uma pluralidade de eletrodos pode fornecer o pulso de energia em um padrão descentralizado. A pluralidade de eletrodos pode fornecer o pulso de energia no padrão descentralizado através do controle dos eletrodos sob uma sequência programada, e a sequência programada é inserida por um usuário no componente de eletroporação. A sequência programada pode compreender uma pluralidade de pulsos entregues em sequência, em que cada pulso da pluralidade de pulsos é entregue por pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância, e em que um pulso subsequente da pluralidade de pulsos é entregue por um diferente de pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância.

[00222] O mecanismo de feedback pode ser executado por hardware ou software. O mecanismo de feedback pode ser executado por um circuito de loop fechado analógico. O feedback ocorre a cada 50 us, 20 us, 10 us ou 1 us, mas é preferivelmente um feedback em tempo real ou instantâneo (isto é, substancialmente * instantâneo “conforme determinado pelas técnicas disponíveis para determinar o tempo de resposta). O eletrodo neutro pode medir a impedância no tecido desejado e comunica a impedância ao mecanismo de feedback, e o mecanismo de feedback responde à impedância e ajusta o pulso de energia para manter a corrente constante em um valor semelhante à corrente predefinida. O mecanismo de feedback pode manter a corrente constante contínua e instantaneamente durante a entrega do pulso de energia.

[00223] Exemplos de dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem facilitar a distribuição da composição da presente invenção, incluem os descritos na Patente dos EUA nºs 7.245.963 por Draghia-Akli et al., Pedido de patente dos EUA 2005/0052630 apresentado por Smith, et al., cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser utilizados para facilitar a entrega da composição incluem os fornecidos no Pedido de patente dos EUA copendente e copropriedade, nº de série 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício em 35 USC 119 (e) a Pedido provisório dos EUA nº de série 60 / 852.149, depositado em 17 de outubro de 2006, e 60 /

978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, todos incorporados neste documento na Íntegra.

[00224] A Patente dos EUA nº 7.245.963 de Draghia-Akli, et al. descreve sistemas de eletrodo modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Os sistemas de eletrodo modular podem compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que fornece uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são entregues por meio de agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula, entre a pluralidade de eletrodos. Todo o conteúdo da patente dos EUA nº 7.245.963 é aqui incorporado por referência.

[00225] O Pedido de patente dos EUA 2005/0052630 apresentado por Smith, et al. descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para facilitar efetivamente a introdução de uma biomolécula nas células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. O aparelho de eletroporação compreende um dispositivo eletrocinético ("dispositivo EKD"), cuja operação é especificada pelo software ou firmware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante programáveis entre eletrodos em uma disposição com base no controle de usuário e na entrada dos parâmetros de pulso e permite o armazenamento e a aquisição de dados de forma de onda corrente. O aparelho de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma disposição de eletrodos de agulha, um canal de injeção central para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. Todo o conteúdo do Pedido de patente dos EUA 2005/0052630 é aqui incorporado por referência.

[00226] Os arranjos e métodos de eletrodo descritos na Patente dos EUA nº 7.245.963 e Pedido de patente dos EUA U.S. 2005/0052630 podem ser adaptados para penetração profunda não apenas nos tecidos tal como o músculo, mas também outros tecidos ou órgãos. Devido à configuração do arranjo dos eletrodos, a agulha de injeção (para fornecer a biomolécula de escolha) também é inserida completamente no órgão alvo e a injeção é administrada perpendicularmente ao problema alvo, na área pré-delineada pelo eletrodos Os eletrodos descritos na Patente dos EUA nº 7.245.963 e Pedido de patente dos EUA 2005/005263 têm preferivelmente 20 mm de comprimento e 21 de bitola.

[00227] Além disso, contemplado em algumas modalidades, que incorporam dispositivos de eletroporação e seus usos, existem dispositivos de eletroporação que são os descritos nas seguintes patentes: Patente dos EUA

5.273.525, emitida em 28 de dezembro de 1993, Patentes dos EUA 6.110.161, emitida em 29 de agosto de 2000, 6.261.281, emitida em 17 de julho , 2001 e

6.958.060, emitida em 25 de outubro de 2005 e patente dos EUA 6.939.862, emitida em 6 de setembro de 2005. Além disso, as patentes que cobrem o assunto em questão fornecido na patente dos EUA 6.697.669, emitida em 24 de fevereiro de 2004, que diz respeito à entrega de DNA usando qualquer um de uma variedade de dispositivos, e a patente dos EUA 7.328.064, emitida em de fevereiro de 2008, desenhada para o método de injeção de DNA, são contempladas aqui. As patentes anteriores são incorporadas por referência na sua totalidade. Terapia contra o câncer

[00228] A invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de câncer, ou de tratamento e prevenção de crescimento ou metástase de tumores. Os aspectos relacionados da invenção fornecem métodos de prevenção, auxílio na prevenção e/ou redução de metástases de células hiperplásicas ou tumorais em um indivíduo.

[00229] Um aspecto da invenção fornece um método de inibição de metástases em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. A invenção fornece ainda um método de inibição de metástases em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de inibição de metástases de qualquer uma das composições aqui descritas.

[00230] Em algumas modalidades de tratamento ou prevenção de câncer, ou de tratamento e prevenção de metástases de tumores em um indivíduo em necessidade, um segundo agente é administrado ao indivíduo, como um agente antineoplásico. Em algumas modalidades, o segundo agente compreende um segundo agente inibidor de metástases, como um antagonista do plasminogênio ou um antagonista da adenosina desaminase. Em outras modalidades, o segundo agente é um agente inibidor da angiogênese.

[00231] As composições da invenção podem ser usadas para prevenir, diminuir, minimizar, controlar e/ou diminuir o câncer em humanos e animais. As composições da invenção também podem ser usadas para diminuir a taxa de crescimento tumoral primário. As composições da invenção, quando administradas a um indivíduo em necessidade de tratamento, podem ser usadas para impedir a disseminação de células cancerígenas. Como tal, as composições da invenção podem ser administradas como parte de uma terapia de combinação com um ou mais medicamentos ou outros agentes farmacêuticos. Quando utilizada como parte da terapia de combinação, a diminuição na metástase e a redução no crescimento do tumor primário proporcionado pelas composições da invenção permitem um uso mais eficaz e eficiente de qualquer terapia farmacêutica ou medicamentosa sendo usada para tratar O paciente. Além disso, o controle de metástases pelas composições da invenção proporciona ao indivíduo uma maior capacidade de concentrar a doença em um local.

[00232] Em uma modalidade, a invenção fornece métodos para prevenir a metástase de tumores malignos ou outras células cancerígenas, bem como reduzir a taxa de crescimento do tumor. Os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições da invenção a um indivíduo diagnosticado com um tumor maligno ou células cancerígenas ou a um indivíduo com um tumor ou células cancerígenas.

[00233] A seguir, são apresentados exemplos não limitativos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos e composições da invenção: Linfoblástico Agudo; Leucemia Mieloide Aguda; Carcinoma Adrenocortical; Carcinoma Adrenocortical Infantil; Câncer de Apêndice; Carcinoma da Célula Basal; Câncer do Duto Biliar Extra-Hepático; Câncer de Bexiga; Câncer nos Ossos; Osteossarcoma e Histiocitoma Fibroso Maligno; Glioma da Haste Cerebral na Infância; Tumor Cerebral Adulto; Tumor Cerebral, Glioma do Tronco Cerebral, Infância; Tumor Cerebral, Tumor Teratoide / Rabdoide Atípico do Sistema Nervoso na Infância; Tumores Embrionais do Sistema Nervoso Central; Astrocitoma Cerebelar; Astrocitoto Cerebral / Glioma Maligno; Craniofaringioma; Ependimoblastoma; Ependimoma; Meduloblastoma; Meduloepitelioma; Tumores Parenquimatosos Pineais de Diferenciação Intermediária; Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Supratentorial e Pineoblastoma; Via visual e glioma hipotalâmico; Tumores cerebrais e da medula espinhal; Câncer de mama; Tumores brônquicos; Linfoma de Burkitt; Tumor Carcinoide; Tumor Carcinoide Gastrointestinal; Tumor Teratoide / Rabdoide Atípico do Sistema Nervoso Central; Tumores Embrionais do Sistema Nervoso Central; Linfoma do Sistema Nervoso Central; Astrocitoma Cerebelar Astrocitoma Cerebral / Glioma Maligno na Infância; Câncer cervical; Cordoma na infância; Leucemia Linfocítica Crônica; Leucemia Mieloide Crônica; Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos; Câncer de Cólon; Câncer Colorretal; Craniofaringioma; Linfoma Cutâneo de Células T; Câncer de Esôfago; Família de Tumores de Ewing; Tumor Extragonal de Células Germinativas; Câncer Extra-Hepático do Duto Biliar; Câncer Ocular Melanoma Intraocular; Câncer de Olho,

Retinoblastoma; Câncer de Vesícula Biliar; Câncer Gástrico (Estômago); Tumor Carcinoide Gastrointestinal; Tumor Estromal Gastrointestinal (GIST); Tumor Extracraniano de Células Germinativas; Tumor de Células Germinativas Extragonadal; Tumor de Células Germinativas Ovariano; Tumor Trofoblástico Gestacional; Glioma; Glioma, Haste Cerebral na Infância; Glioma, Astrocitoma Cerebral da Infância; Glioma, via visual da infância e hipotálamo; Leucemia de Células Peludas; Câncer de Cabeça e Pescoço; Câncer Hepatocelular (Fígado); Histiocitose Celular de Langerhans; Linfoma de Hodgkin; Câncer Hipofaríngeo; Glioma Hipotalâmico e de Via Visual; Melanoma Intraocular; Tumores de Células das Ilhotas; Câncer Renal (Célula Renal); Histiocitose de Células de Langerhans; Câncer de Laringe; Leucemia Linfoblástica Aguda; Leucemia Mieloide Aguda; Leucemia Linfocítica Crônica; Leucemia Mieloide Crônica; Leucemia de Célula Peluda; Câncer de Lábio e Cavidade Oral; Câncer de Fígado; Câncer de Pulmão em Células Não Pequenas; Câncer de Pulmão em Células Pequenas; Linfoma relacionado à AIDS; Linfoma de Burkitt; Linfoma de Células T Cutâneas; Linfoma de Hodgkin; Linfoma não Hodgkin; Linfoma do Sistema Nervoso Central Primário; Macroglobulinemia de Waldenstrom; Histiocitoma Fibroso Maligno de Osso e Osteossarcoma; Meduloblastoma; Melanoma; Melanoma Intraocular (olho); Carcinoma de Células de Merkel; Mesotelioma; Câncer Metastático do Pescoço Escamoso com Primário Oculto; Câncer de Boca; Síndrome da Neoplasia Endócrina Múltipla (Infância); Mieloma Múltiplo / Neoplasia de Células Plasmáticas; Micose;, Fungos; Síndromes Mielodisplásicas; Doenças Mielodisplásicas / Mieloproliferativas; Leucemia Mieloide Crônica; Leucemia Mieloide Aguda de Adulto; Leucemia Mieloide Aguda na Infância; Mieloma Múltiplo; Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos; Câncer de Cavidade Nasal e Seio Paranasal; Câncer Nasofaríngeo; Neuroblastoma; Câncer de Pulmão de Células não Pequenas; Câncer Bucal; Câncer de Cavidade Oral; Câncer Orofaríngeo; Osteossarcoma e Histiocitoma

Fibroso Maligno do Osso; Câncer do Ovário; Câncer Epitelial Ovariano; Tumor de Células Germinativas do Ovário; Tumor Ovariano de Baixo Potencial Maligno; Câncer de Pâncreas; Câncer de Pâncreas, Tumores de Ilhotas; Papilomatose; Câncer de Paratireoide; Câncer Peniano; Câncer Faríngeo; — Feocromocitoma; “Tumores Parenquimatosos Pineais de Diferenciação Intermediária; Pineoblastoma e Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Supratentoriais; Tumor Ptuitário; Neoplasia de Celt Plasmático / Mieloma Múltiplo; Blastoma Pleuropulmonar; Linfoma Primário do Sistema Nervoso Central; Câncer de Próstata; Câncer Retal; Câncer de Células Renais (rim); Pelve Renal e Ureter, Câncer Transitório Celular; Carcinoma do Trato Respiratório Envolvendo o Gene NUT no Cromossomo 15; Retinoblastoma; Rabdomiossarcoma; Câncer de Glândula Salivar; Sarcoma, família de tumores Ewing; Sarcoma, Kaposi; Sarcoma, Tecido Mole; Sarcoma Uterino; Síndrome de Sezary; Câncer de Pele (não melanoma); Câncer de Pele (melanoma); Carcinoma de Pele, Célula de Merkel; Câncer de Pulmão de Células Pequenas; Câncer de Intestino Delgado; Sarcoma de Tecidos Moles; Carcinoma de Células Escamosas, Câncer de Pescoço Escamoso com Primário Oculto, Metastático, Câncer de Estômago (gástrico); Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Supratentorial; Linfoma de Células T Cutâneo; Câncer de Testículo; Câncer de Garganta; Timoma e Carcinoma Tímico; Câncer de Tireoide; Câncer de Células de Transição da Pelve Renal e do Ureter; Tumor Trofoblástico Gestacional; Câncer Uretral; Câncer Uterino Endometrial; Sarcoma Uterinoy Câncer Vaginal; Câncer Vulvar; Macroglobulinemia de Waldenstrom; e Tumor de Wilms.

[00234] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para tratar as metástases do câncer, compreendendo tratar o indivíduo antes, simultaneamente ou posteriormente ao tratamento com uma composição da invenção, com uma terapia complementar para o câncer, como cirurgia, quimioterapia, quimioterapia agente, terapia de radiação ou terapia hormonal ou uma combinação dos mesmos.

[00235] Os agentes quimioterapêuticos incluem agentes citotóxicos (por exemplo, 5-fluorouracila, cisplatinay carboplatinay metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, Vinblastinay oxorrubicina, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), citarabina USP, ciclofosfamida, fosfato sódio de estramucina, altretamina, hidroxiureia, ifosfamida, procarbazina, — mitomicina, — bussulfan, ciclofosfamida, “mitoxantrona, carboplatina, cisplatina, interferon alfa-2a recombinante, paclitaxel, teniposida e estreptozoci), agentes alquilantes citotóxicos (por exemplo, bussulfan, clorambucila, ciclofosfamida, melfalan ou ácido etilenosulfônico), agentes alquilantes (por exemplo, asaley, AZQ, BCNU, bussulfan, bissulfan, carboxiftalatoplatina, CBDCA, CCNU, CHIP, clorambucila, clorozotocina, cisplatina, clomesona, cianomorfololinodoxorrubicina, ciclodisona, ciclofosfamida, “dianidrogalactitol, fluorodopan, hepsulfam, hicantona, ifosfamida, melfalan, metil CCNU, mitomicina C, mitozolamida, mostarda nitrogenada, PCNU, piperazinay piperazinadiona,y —pipobromano, porfiromicina, mostarda com espiro-hidantoína, estreptozotocina, teroxirona, tetraplatina, tiotepa, trietilenemelamina, mostarda com nitrogênio uracila e Yoshi-864), agentes antimitóticos (por exemplo, alocolquicina, Halichondrin M, colchicina, derivados de colchicina, rizizatina, dolastatina 10, maitansina, rizoxina, derivados de paclitaxel, tiocolchicina, tritil cisteína, sulfato de vinblastina e sulfato de vincristina), alcaloides vegetais (por exemplo, actinomicina D, bleomicina, L-asparaginase, idarubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, mitramicina, mitomicina, daunorrubicina, VP-16-213), VM-26, navelbina e taxotere), produtos biológicos (por exemplo, interferon alfa, BCG, G-CSF, GM-CSF e interleucina-2), inibidores da topoisomerase I (por exemplo, camptotecina, derivados da camptotecina e morfolinodoxorrubicina), inibidores da topoisomerase II (por exemplo, mitoxantrona, —amonafida, m-AMSA, derivados de antrapirazol,

pirazoloacridina, bisantreno HCL, daunorrubicina, desoxidoxorrubicina, menogaril, N,N-dibenzil daunomicina, oxantrazol, rubidazona, VM-26 e VP- 16 ) e sintéticos (por exemplo, hidroxiureia, procarbazina, o,p-DDD, dacarbazina, CCNU, BCNU, cis-diaminadicloroplatina, mitoxantrona, CBDCA, levamisol, hexametilmelamina, ácido todo trans-retinoico, gliadel e porfímero sódico).

[00236] Agentes antiproliferativos são compostos que diminuem a proliferação de células. Os agentes antiproliferativos incluem agentes alquilantes, antimetabólitos, enzimas, modificadores da resposta biológica, agentes diversos, hormônios e antagonistas, inibidores de androgênio (por exemplo, flutamida e acetato de leuprolide), antiestrogênios (por exemplo, citrato de tamoxifeno e seus análogos, toremifeno, droloxifeno e roloxifeno). Exemplos adicionais de agentes antiproliferativos específicos incluem, entre outros, levamisol, nitrato de gálio, granisetron, cloreto de sargramostim estrôncio-89, filgrastim, pilocarpina, dexrazoxano e ondansetron.

[00237] Os compostos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes antitumorais, incluindo agentes citotóxicos / antineoplásicos e agentes antiangiogênicos. Agentes citotóxicos / antineoplásicos são definidos como agentes que atacam e matam células cancerígenas. Alguns agentes citotóxicos / antineoplásicos são agentes alquilantes, que alquilam o material genético nas células tumorais, por exemplo, cisplatina, ciclofosfamida, mostarda nitrogenada, trimetileno tiofosforamida, carmustina, bussulfano, clorambucil, belustina, uracila mostarda, clomafazina e dacabazina Outros agentes citotóxicos / antineoplásicos são antimetabólitos para células tumorais, por exemplo, citosina — arabinosídeo, —fluorouracila, “metotrexato, mercaptopuirina, azatioprima e procarbazina. Outros agentes citotóxicos / antineoplásicos são antibióticos, por exemplo, doxorrubicina,y bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, mitramicina, mitomicina, mitomicina C e daunomicina.

Existem inúmeras formulações lipossômicas disponíveis comercialmente para esses compostos. Ainda outros agentes citotóxicos / antineoplásicos são inibidores mitóticos (alcaloides da vinca). Estes incluem vincristina, vinblastina e etoposídeo. Os agentes citotóxicos / antineoplásicos diversos incluem taxol e seus derivados, L-asparaginase, anticorpos antitumorais, dacarbazina, azacitidina,y amsacrina, melfalano, VM-26, ifosfamida, mitoxantrona e vindesina.

[00238] Os agentes antiangiogênicos são bem conhecidos pelos versados na técnica. Os agentes antiangiogênicos adequados para uso nos métodos e composições da invenção incluem anticorpos anti-VEGF, incluindo anticorpos humanizados e quiméricos, aptâmeros anti-VEGF e oligonucleotídeos antissentido. Outros inibidores conhecidos da angiogênese incluem angiostatina, endostatina, interferons, interleucina 1 (incluindo alfa e beta) interleucina 12, ácido retinoico e inibidores teciduais de metaloproteinase-l e -2. (TIMP-1 e -2). Também podem ser utilizadas moléculas pequenas, incluindo topoisomerases como o razoxano, um inibidor da topoisomerase II com atividade antiangiogênica.

[00239] Outros agentes anticancerígenos que podem ser utilizados em combinação com as composições da invenção incluem, entre outros, acivicina; aclarubicina; cloridrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; — altretamina; — ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antracicina; asparaginase; asperlin; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastate; benzodepa; bicalutamida; cloridrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; bussulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina; carmustina; cloridrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucil; cirolemicina; cisplatina, cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina, cloridrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatina;

dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel, doxorrubicina; cloridrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; “duazomicina; edatrexato; cloridrato de eflornitina; elsamitrucina; —enloplatina;y empromato; epipropidina; cloridrato de epirrubicina; erbulozol; cloridrato de esorrubicina; estramustina; estramustina fosfato de sódio; etanidazol; etoposídeo; fosfato de etoposídeo; etoprina; cloridrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracila; flurocitabina; fosquidona; fostriecina de sódio; gencitabina; cloridrato de gencitabina; hidroxiureia; cloridrato de idarrubicina; ifosfamida; imofosina; interleucina Il (incluindo interleucina II recombinante, ou rIL2), interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa- nl; interferon alfa-n3; interferon beta-l a; interferon gama-l b; iproplatina; cloridrato de irinotecano; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; cloridrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; cloridrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; cloridrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogarila; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sódio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; cloridrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; paclitaxel, oxisurano; pegaspargase; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromana; pipossulfano; cloridrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero de sódio; porfiromicina; prednimustina; cloridrato de procarbazina; puromicina; cloridrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimide; safingol; cloridrato de safingol; semustina; sintrazeno; esparfosato de sódio; esparsomicina; cloridrato de espirogermânio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalano sódico; Tegafur; cloridrato de teloxantrona; temoporfina; teniposídeo; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; cloridrato de tubulozol; mostarda de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vimblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartarato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; cloridrato de zorrubicina.

Outros medicamentos anticancerígenos incluem, mas não estão limitados a: 20-epi-1,25 di-hidroxivitamina D3; 5-etiniluracila; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrographolida; inibidores da angiogênese; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética anti-dorsalizante-l; antiandrogênio, carcinoma da próstata; antiestrogênio; antineoplaston; oligonucleotídeos antissentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de apoptose; reguladores de apoptose; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminase; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR / ABL; Dbenzocloros; benzoilstaurosporina; derivados de beta-lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido Dbetulínico; inibidor de bFGF; bicalutamida; Dbisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; Bizelesina; Dbreflate; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; IL-2 canaripox; capecitabina; carboxamida- amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inibidor derivado da cartilagem; carzelesina; inibidores de caseína quinase (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; cloro; sulfonamida cloroquinoxalina; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo da combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptofiina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatame; cipemocina; ocfosfato de citarabina; fator citolítico; citostatina; dacliximabe; decitabina; desidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamila; diaziquona; didemnin B; didox; dietilnorspermina; di-hidro-5-azacitidina; di-hidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomabe; eflornitina; elemeno; emitefur; epirrubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrogênio; antagonistas de estrogênio; etanidazol; fosfato de etoposídeo; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; cloridrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolínio; nitrato de gálio; galocitabina; ganirelix; inibidores de gelatinase; gencitabina; inibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; peptídeos imunoestimulantes; inibidor de receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina; agonistas de interferon; interferons; interleucinas; iobenguano; iododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplacto; irsogladina; isobengazol; iso-homohalicondrina B; itasetron; jasplaquinolida; cahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolstatina; letrozol; fator inibidor da leucemia; interferon alfa de leucócitos; leuprolida + estrogênio + progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo linear de poliamina; peptídeo —dissacarídeo lipofílio; compostos lipofílicos de platina, lissoclinamida 7; lobaplatina;y lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecano; texafirina de lutécio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat;

masoprocol; maspin; inibidores de matrilisina; inibidores de metaloproteinase da matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninase; metoclopramida; Inibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; RNA de fita dupla incompatível; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; fator de crescimento de fibroblastos de mitotoxina-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticorpo monoclonal, gonadotrofina coriônica humana; lipídeo A monofosforila+parede celular sk de microbactéria; mopidamol; inibidor genético de resistência a múltiplos medicamentos; terapia baseada em supressor de tumor múltiplo 1; agente anticancerígeno de mostarda; micaperóxido B; extrato de parede celular de micobactérias; miriaporona; Nr-acetildinalina;y Benzamidas N-substituídas; nafarelina; nagrestip; naloxona + pentazocina; napavina; naftalina; nartograstim; nedaplatina; nemorrubicina; ácido neridrônico; endopeptidase neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante nitroxido; nitrulina; O6-benzilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleotídeos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; indutor de citocina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrônico; — panaxitriol; —“panomifeno; parabactina;y pazelliptina; pegaspargase; peldesina; pentosan polissulfato de sódio; pentostatina; pentrozol; perflubro; perfosfamida; álcool perilílico; fenazinomicina; acetato de fenila; inibidores de fosfatase; picibanila; cloridrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inibidor de ativador do plasminogênio; complexo de platina; compostos de platina; complexo de platina-triamina; porfímero sódico; porfiromicina; prednisona; propil bis- acridona; prostaglandina J2; inibidores de proteassoma; modulador imune baseado em proteína A; inibidor da proteína quinase C; inibidores da proteína quinase C, microalgas; inibidores de proteína tirosina fosfatase; inibidores de fosforilase de nucleosídeo de purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileino de hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf;, raltitrexed; ramosetron; inibidores de ras farnesil-proteína transferase; inibidores de ras; inibidor de ras-GAP; retelliptina desmetilada; etdronato de rênio Re 186; rizoxina; ribozimas; Retinamida RII; Rogletimida; rohitukine; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; Saintopin; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; Miméticos de Sdi 1; semustina; inibidor derivado de senescência 1; oligonucleotídeos sentidos; inibidores de transdução de sinal; moduladores de transdução de sinal; proteína de ligação ao antígeno de cadeia única; sizofurano; sobuzoxano; borocaptato de sódio; fenilacetato de sódio; solverol; proteína de ligação à somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; esqualamina; inibidor de células estaminais; inibidores da divisão de células estaminais; estipiamida; inibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista peptídico intestinal vasoativo superativo; suradista; suramina; swainsonine; glicosaminoglicanos sintéticos; tallimustina; metiodeto de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalano de sódio; tegafur; telurapirio; inibidores de telomerase; temoporfina; temozolomida; teniposídeo; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina;y trombopoietina; trombopoietina mimética; timalfasina; agonista do receptor de timopoietina; timotrinano; hormona estimuladora da tiroide; etiopurpurina de etil estanho; tirapazamina; bicloreto de titanoceno; topsentina; toremifeno; fator de célula tronco totipotente; inibidores da tradução; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosterido; inibidores de tirosina quinase; tirfostinas; Inibidores de UBC; ubenimex; fator inibidor do crescimento derivado do seio urogenital; antagonistas do receptor de uroquinase; vapreotida; variolina B; sistema de vetores; terapia gica de eritritos; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatina; zilascorbe; e estimalâmero de zinostatina.

Em uma modalidade, o medicamento anticancerígeno é 5-

fluorouracila, taxol ou leucovorina.

[00240] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, ao mesmo tempo em que indicam as modalidades particulares da invenção, são providos a título de ilustração apenas. A partir da discussão anterior e nestes exemplos, um versado na técnica pode avaliar as características essenciais da presente invenção e, sem fugir de seu espírito e escopo, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições. Assim, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas no presente documento, serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anteriormente mencionada. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. Exemplos Direcionamento da supressão imune em tumores com bloqueio do ponto de verificação imune usando anticorpos monoclonais de DNA (DMAb

[00241] Aqui é descrita uma nova plataforma para a administração de anticorpos de bloqueio do ponto de verificação imune através do uso de plasmídeos de DNA que codificam IgG. A abordagem de eletroporação CELLECTRA descrita aqui tem sido amplamente usada em ensaios clínicos de vacinas de DNA, tem um perfil de segurança e tolerabilidade favorável e seria mais rápida e econômica para a entrega de mAb em comparação à injeção intravenosa, o que pode ampliar as aplicações que podem ser usadas para anticorpos de ponto de verificação (Trimble et al., 2015, Lancet, 386 (10008): 2078-2088; Tebas et al., 2017, N Engl J Med. publicação eletrônica anterior à impressão). Nestes estudos pré-clínicos, os DMAbs modificados foram eficientes na geração in vivo da expressão de mAbs anti-CTLA-4 e exibiram propriedades do CTLA-4 mAb codificado por IGG. Os DMAbs foram capazes de induzir imunidade antitumoral potente e infiltração de células T CD8 enquanto diminuíam a infiltração de Treg. Esses resultados sugerem que essa tecnologia pode ser usada para novas abordagens terapêuticas atualmente limitadas para mAbs biológicos, como terapias de manutenção.

[00242] Tanto as abordagens de plasmídeo de DNA quanto de distribuição viral foram usadas em modelos pré-clínicos para fornecer mAbs terapêuticos para terapia contra o câncer (Jiang et al., 2006, Clin Cancer Res, 12 (20 Pt 1): 6179-6185; Watanabe et al., 2010, Gene Ther, 17 (8): 1042- 1051; Shi et al., 2006, Cancer Res, 66: 11946-53). No entanto, essas abordagens até agora se concentraram em anticorpos direcionados a antígenos da superfície do câncer ou fatores angiogênicos. Embora vetores virais possam gerar alta expressão, seu uso é limitado a indivíduos soronegativos, eles podem marcar geneticamente pacientes e são difíceis de administrar novamente devido à soroconversão (Hollevoet e Declerck, 2017, J Transl Med. BioMed Central, 15: 131). Aqui, é relatado que a abordagem de DMAb para entrega de pontos de verificação imunes pode resultar em expressão in vivo significativa e prolongada a partir de apenas uma dose única.

[00243] As terapias de combinação de bloqueio de ponto de verificação imune estão mostrando sinergia na clínica para determinadas indicações (Ribas and Wolchok, 2018, American Association for the Advancement of Science, 359:1350-1355). Embora a terapia combinada entre ipilimumabe e nivolumabe seja altamente eficaz em pacientes com melanoma, ela também resulta em ainda mais toxicidade em comparação à monoterapia (Wolchok et al., 2017, N Engl J Med. Massachusetts Medical Society, 377:1345-1356). Infelizmente, era difícil predizer o escopo completo dessa toxicidade usando modelos pré-clínicos de camundongos ou primatas não humanos (Keler et al., 2003, J Immunol. American Association of Immunologists; 171:6251-6259; Selby et al., 2016, PLoS One, 2016;11:20161779). Devido a essa preocupação com a toxicidade, as versões de última geração do ipilimumabe que podem ser ativadas seletivamente nos tumores estão atualmente sendo desenvolvidas e testadas em ensaios clínicos (Arce Vargas et al., 2018, Cancer Cell, 33(4):649-663; Korman et al., 2017, Cancer Res, 77:$8Y09-01). Projetos adicionais estão sendo desenvolvidos para aprimorar a função efetora induzida por esses anticorpos, incluindo mutações Fc que melhoram a ligação ao FceyRIIla humano, bem como versões não fucosiladas com atividade aprimorada de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (Arce Vargas et al., 2018 , Cancer Cell, 33 (4): 649-663; Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103 (11): 4005-4010). Essas importantes melhorias de anticorpos podem fornecer usos expandidos para anticorpos direcionados para CTLA-A4 no futuro (por exemplo, terapia combinada com DMAbs anti-PD1 Ou com vacinas).

[00244] Os materiais e métodos utilizados para as experiências são agora descritos Cultura e transfecção celular

[00245] As células HEK293T, as células tumorais CT26 e SalN foram obtidas da ATCC, que realiza testes e autenticação completos de suas linhas celulares usando abordagens morfológicas, cariotipográficas e baseadas em PCR. Eles foram mantidos em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS). Ambos foram testados rotineiramente quanto à contaminação por Mycoplasma e mantidos em baixa passagem (<20 passagens) em cultura de células. Apenas células SalN ou CT26 abaixo da passagem 5 foram implantadas em camundongos. As células HEK293T foram transfectadas com o reagente de transfecção GeneJammer de acordo com as recomendações do fabricante (Agilent). As células e o meio condicionado foram colhidos 48 horas após a transfecção usando tampão de lise RIPA (Cell Signaling Technology) contendo inibidor de protease livre de EDTA (Roche) para análise western blot. Construção de plasmídeo de DNA

[00246] As sequências de aminoácidos para 9D9, ipilimumabe e tremelimumabe foram obtidas de patentes publicadas ou sequências disponíveis do DrugBank (US9868961B2 para 9D9). A sequência de nucleotídeos para a IZG2b de camundongo (9D9) foi otimizada para o códon para aumentar a expressão em mamíferos, e as sequências de nucleotídeos para a IgGlI humana (ipilimumabe) e IgG2 (tremelimumabe) foram otimizadas para tendências de códon tanto de camundongo quanto humano. Todas as sequências também foram otimizadas para RNA e incluíram uma sequência Kozak. Os plasmídeos foram clonados no plasmídeo pVaxl modificado com um promotor de citomegalovírus humano e sequência de polià do hormônio do crescimento bovino (GenScript). As cadeias pesada e leve foram codificadas no mesmo plasmídeo, separadas por um sítio de clivagem de furina (RGRKRRS; SEQ ID NO: 17) e um peptídeo P2A para garantir a clivagem. Modificações adicionais da sequência para 9D9 foram feitas com base no alinhamento da sequência na sequência da linha germinativa IGHV1-19 * 01 do camundongo e são indicadas na Figura | e na Tabela 1. Tabela 1: Sequências para DMAbs usadas nessas experiências.

6 | Aminsáido | ————>— pMAbdelpilimumabe ===> | 8 | Neeotdoo | ———opopMAbmodt2 ———>—>> | Injeção de DMAb e estudos de tumor em camundongos

[00247] Os camundongos C57B1 / 6, Balb / ce A / J foram adquiridos do Jackson laboratories. Os plasmídeos de DNA foram formulados com 12 unidades da enzima hialuronidase (Sigma-Aldrich) em 30 uL de volume total de injeção. O plasmídeo de DNA formulado foi injetado em um sítio (100 ug) no músculo tibial anterior (TA) ou em 4 locais (100 ug por local) nos músculos TA e músculos quadríceps. Após a injeção do plasmídeo, os músculos foram pulsados com dois pulsos de onda quadrada de corrente constante elétrica de 0,1 Amp, usando o dispositivo CELLECTRA?-3P (Inovio Pharmaceuticals). Para estudos de desafio de tumores, camundongos A /J ou Balb / c foram implantados por via subcutânea com 10 milhões de células tumorais SalN ou 500.000 células tumorais CT26, respectivamente, em PBS no flanco direito. Como os anticorpos humanos são imunogênicos em camundongos imunologicamente competentes, sua expressão foi estudada em camundongos Balb / c que estavam esgotados de células T CD4 + e CD8 + transitoriamente no momento da injeção de DMAb (usando uma injeção de 200 ug do clone GK1.5 e do clone YTS 169.4, BioXCell). Para estudos de tumores, os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram 1,5 cm de diâmetro. Todos os camundongos ainda vivos no final do estudo eliminaram completamente os tumores. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC

[00248] O sangue humano foi obtido de voluntários adultos saudáveis e com consentimento através do núcleo da Wistar Phlebotomy sob o protocolo aprovado pelo Institutional! Review Board (IRB) nº 21801304. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e os estudos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas reconhecidas. O sangue total foi coletado em tubos heparinizados e subsequentemente mergulhado em um volume igual de histopaque 1083 (Sigma-Aldrich). Ensaio de luciferase de bloqueio de CTLA-4

[00249] A ativação das células T após o bloqueio do CTLA-4 foi avaliada usando o Bioensaio de Bloqueio do CTLA-4 (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. O DMAb de ipilimumabe e o tremelimumabe foram purificados de camundongos individuais para este ensaio (n = 3 camundongos para cada DMADb), usando o Nab Protein A / G Spin Kit (ThermoFisher), e foram concentrados usando os Filtros Ultra Centrífugos

Amicon (Millipore Sigma). A atividade da luciferase foi medida usando o leitor de placas Synergy2 (Biotek). Western blot

[00250] A análise de Western blot foi realizada usando reagentes NuPAGE (ThermoFisher Scientific) e membranas de PVDF (Millipore). O tampão de bloqueio Odyssey foi utilizado para bloqueio e incubação de anticorpos. Os anticorpos de detecção (IRDye800RD de cabra anti- camundongo e IRDye800RD de cabra anti-humano) foram diluídos na diluição de 1: 10.000 em tampão de bloqueio Odyssey contendo 0,1% de Tween-20 e 0,01% de SDS. As membranas foram imageadas usando o LiCor Odyssey CLx. O marcador de peso molecular Odyssey One-Color Protein foi usado como escada no canal 680RD (vermelho). Ensaio ELISA

[00251] Para quantificação de anticorpos de IZG humanos em cultura ou no soro de camundongo, as placas Nunc MaxiSorp de 96 poços foram revestidas com 10 ug / mL de fragmento Fc de IgG anti-humano de cabra (Bethyl) durante a noite a 4 ºC. As placas foram bloqueadas com soro fetal de vitela (FCS) a 10% em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Os anticorpos tanto primários quanto secundários foram incubados por 1 hora à temperatura ambiente. As curvas padrão que consistem em uma concentração conhecida de I8G humana (Bethil) foram usadas para quantificação como anticorpo primário em cada placa ELISA. A cadeia leve kappa anti-humana de cabra conjugada com HRP (Bethyl) foi usada a uma diluição de 1: 20.000 para incubação secundária de anticorpos. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-T (0,2% de Tween-20 em PBS) entre incubações de anticorpos. As placas foram desenvolvidas usando o desenvolvimento de SigmaFastOPD (Sigma-Aldrich) por 10 minutos em temperatura ambiente. O desenvolvimento foi interrompido após 10 minutos usando H2SO4 IM. À absorbância (OD 450nm) foi medida usando um leitor de placas Synergy2 na

ODA450 (Biotek).

[00252] A IgG de camundongo foi quantificada em cultura de células usando o mesmo procedimento básico, com os seguintes anticorpos: 10 ug / mL de fragmento Fc de IgG de cabra anti-camundongo para a proteína de revestimento (Bethyl), IZG de camundongo purificado (Bethyl) para a curva padrão e anticorpo de cadeia leve anti-camundongo de cabra conjugada com HRP (Millipore) em uma diluição de 1: 20.000.

[00253] A IgG de camundongo anti-CTLA-4 foi quantificada em cultura de células ou soro de camundongo com um ELISA de ligação usando o mesmo procedimento básico com os seguintes reagentes: 1 ug / mL de proteína CTLA-4 de camundongo para proteína de revestimento (MyBioSource), recombinante 9D9 (BioXCell) para curva padrão e anticorpo de cadeia leve anti-camundongo de cabra conjugado com HRP (Millipore) na diluição de 1: 5.000. Para este ELISA de ligação, as placas foram desenvolvidas por 20 minutos. Coloração por imunofluorescência

[00254] Para coloração por imunofluorescência, os tumores SalN foram colhidos e congelados em O.C.T. (Tissue-Tek) em gelo seco. O tecido congelado foi armazenado a -80 ºC. O tecido foi seccionado em lâminas PermaFrost. O tecido congelado foi fixado com paraformaldeído a 4% (em PBS) por 15 minutos em temperatura ambiente, lavado com PBS e permeabilizado com Triton X-100 a 0,5% por 15 minutos em temperatura ambiente. O tecido foi bloqueado por 1 hora à temperatura ambiente em BSA a 2,5% e soro de cavalo a 5% em PBS. As lâminas foram incubadas em tampões do kit de bloqueio de Avidina / Biotina (Vector Labs) antes da incubação do anticorpo primário. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: CD8a-biotina (Biolegend, clone 53-6.7, 1: 2000) e CD3g-biotina (Biolegend, clone 145-2C11, 1: 2000). O anticorpo primário foi incubado durante a noite a 4 ºC em 2,5% de BSA e 5% de soro de cavalo em PBS em uma câmara umidificada. O kit TSA-Biotina (Perkin Elmer) foi utilizado para amplificação do sinal, seguido de incubação secundária de anticorpos em soro de cavalo a 1% em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente (Streptavidin AFA488, 1: 500). As lâminas foram montadas com Prolong Gold Antifade e imageadas usando um microscópio Zeiss LSM Confocal no University of Pennsylvania Cell and Developmental Biology Microscopy Core. Os números de células CD3 e CD8 foram contados usando o software Fiji / Imagel. Estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)

[00255] As células foram centrifugadas e as PBMCs foram coletadas da camada leucoplaquetária para estimulação com Coquetel de Estimulação Celular contendo uma mistura de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina (eBioscience). As células foram estimuladas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,5 mM de piruvato de sódio, 50 uM de B-mercaptoetanol, 1% de glutamax / glutamina e 0.1U/mL IL-2 (Peprotech). Isolamento TIL do camundongo

[00256] Os tumores SalN de camundongo foram picados usando um bisturi e incubados em uma mistura de enzimas de dissociação tumoral composta por: 170 mg / L de colagenase 1, II e IV (ThermoFisher), 12,5 mg / L de DNAse I (Roche), 25 mg / L de elastase (Worthington) em 50% de RPMI + 10% de FBS e 50% de meio Hyclone L-I15 Leibowitz (ThermoFisher). Os tumores foram incubados nesta mistura com mistura de ponta a ponta por | hora a 37 ºC e depois filtrados duas vezes através de um filtro de 40 um antes do plaqueamento para coloração. Coloração de PBMCs humanas e TILs de camundongos para citometria de fluxo

[00257] Os seguintes anticorpos foram utilizados para a coloração de células T humanas: CD4 BVS10 (OKTA4, 1: 200, biolegend), CD8 ApcCy7 (SK1, 1: 200, biolegend), CD25 APC (BC96, 1: 200, biolegend), CD3 BV650

(SP34-2, 1: 200, biolegend), CD152 PE (1: 100, BD Biosciences) e PE anti- humano (1: 100, biolegend). Os seguintes anticorpos foram utilizados para coloração com TIL de camundongo: CD45 FITC (30-F11, 1: 200, biolegend), FoxP3 APC (FJIK-l6s, 1: 100, ebioscience), CD44 AF700 (IM7, 1: 200, biolegend), CD8 APC-Cy7 (53-6,7, 1: 200, biolegend), CD3 PE-Cy5 (145- 2C11, 1: 100, BD Pharmingen), CD25 PE-Cy7 (PC61.5, 1: 100, ebioscience), CD69 BV605 (H1.2F3, 1: 200, biolegend) e PD-1 BV711 (29F.1A12, 1: 100, biolegend). Primeiro, as células foram lavadas e incubadas com violeta VIVO/MORTO (ThermoFisher) e subsequentemente incubadas com anticorpos de superfície em 1% de FBS em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. As células foram então fixadas e permeabilizadas (BD Biosciences) por 15 minutos a 4 ºC. As células foram então incubadas com anticorpo CD3 (amostras humanas) ou FoxP3 (amostras de camundongo) em tampão de lavagem de fixação / permeabilização por 1 hora a 4 ºC. As amostras foram executadas em um citômetro de fluxo LSRI8 (BD Biosciences) e os dados foram analisados usando o software FlowJo (TreeStar).

[00258] Os resultados das experiências são agora descritos Projeto, expressão e ligação de CTLA-4 DMAbs de camundongo

[00259] O clone CTLA-4 9D9 de camundongo anti-camundongo foi usado para codificar no sistema de expressão de DNA otimizado, com base em sua atividade antitumoral descrita anteriormente (Selby et al., Cancer Immunol Res. 2013; 1: 3242; Arce Vargas et al., 2018, Cancer Cell, 33 (4): 649-663). O projeto deste plasmídeo DMAb foi construído a partir do trabalho anterior do DMAb no espaço de doenças infecciosas e é descrito em detalhes na seção de métodos (Elliot et al., 2017, NPJ Vaccines, 2:18; Patel et al., 2017, Nat. Commun, 8: 637).

[00260] As células HEK293T transfectadas foram capazes de produzir e secretar o anticorpo 9D9 DMAb in vitro, detectado por ELISA e western blot (Figura 2A, B). No entanto, a expressão deste DMAb foi baixa (- 660ng / mL) em comparação com outros DMAbs examinados anteriormente (Elliot et al., 2017, NPJ Vaccines, 2:18; Patel et al., 2017, Nat Commun, 8: 637). Portanto, várias modificações foram projetadas no DMAb para melhorar a expressão, incluindo a modificação do início e do final da sequência da cadeia pesada Figura 1A, B. Enquanto a modificação da sequência final sozinha (mod * 2) apenas melhorou ligeiramente a produção de anticorpos in vitro, a modificação da sequência inicial ou de ambas as sequências melhorou significativamente a produção de anticorpos, com quase uma melhoria de 10 vezes na secreção de anticorpos para a mídia para o mod * 4 (Figura 2B). Essas modificações estruturais não alteraram a ligação à proteína CTLA-4 de camundongo por ELISA, com valores de ICso semelhantes em comparação com 9D9 recombinante (intervalo 36,105-44,25 ng / mL) (Figura 2C).

[00261] Em seguida, a expressão desses DMAbs foi testada em camundongos C57B1 / 6 através da entrega por IM-EP (100 ug) (Figura 2D). Semelhante aos resultados in vitro, o 9D9 DMAb original produziu anticorpo no soro em níveis relativamente baixos (- 1,2 ug / mL de soro) (Figura 2D). Todos os trêê DMAbs modificados expressaram em níveis mais altos, com o mod + 4 produzindo níveis de — 7,9 ug / mL, mais de 6 vezes mais que a sequência DMAb original (Figura 2D). Portanto, essas importantes modificações da estrutura melhoraram bastante a expressão in vitro e in vivo deste DMAb sem alterar a ligação à proteína CTLA-4 de camundongo. Atividade antitumoral do CTLA-4 DMAb anti-camundongo em vários modelos de tumor

[00262] Em seguida, o 9D9 DMAb de expressão mais alta (9D9 DMAb mod +* 4) foi estudado em modelos de desafio de tumores de camundongo. O modelo de fibrossarcoma SalN foi utilizado primeiro, que é um dos primeiros modelos usados para demonstrar imunidade antitumoral do bloqueio de CTLAH (Leach et al., 1996, Science, 271: 1734-1736). À atividade antitumoral do 9D9 DMAb foi comparada com a do anticorpo 9D9 recombinante (Figura 3A). Como os DMAbs demoram alguns dias para serem secretados no tecido muscular, a entrega de DMAb foi iniciada 4 dias antes do 9D9 recombinante. Uma injeção de DNA (400 ug) foi comparada com três injeções de anticorpo 9D9 recombinante, distribuídas com três dias de intervalo (10 ug por injeção). Foram observadas cinéticas de expressão semelhantes (Figura 3A, Figura 4A, B), indicando duração prolongada da expressão do DMAb. Após desafio com células tumorais SalN, tanto o 9D9 DMAb como o 9D9 recombinante foram eficazes na indução da eliminação do tumor em comparação com os grupos de controle (Figura 3B, Figura 4C). Os tumores cresceram em todos os camundongos inicialmente após a implantação; no entanto, após a entrega de DMAb, 8/10 camundongos eliminaram seus tumores (Figura 3B). Após a entrega de 9D9 recombinante, 9/10 camundongos eliminaram completamente seus tumores (Figura 4D). Devido à natureza imunogênica deste tumor, 3/10 camundongos no grupo de controle de IgG de camundongo também eliminaram seus tumores espontaneamente (Figura 4D). Para testar a memória imunológica após a exposição ao DMAb, os camundongos que eliminaram seus tumores foram novamente desafiados 6 meses após o tratamento inicial (Figura 5). 100% dos camundongos que foram tratados anteriormente com anticorpo 9D9 recombinante ou 9D9 DMAb eliminaram os tumores reimplantados (Figura 6). Também é demonstrado que a administração anterior de DMAb (7 dias antes da implantação do tumor) também foi eficaz na indução da eliminação do tumor em 6/10 camundongos (Figura 6A-6C). Em resumo, os DMAbs anti-CTLAA4 exibem níveis prolongados de anticorpos no soro, exibindo um efeito poupador de injeção com atividade antitumoral semelhante em comparação ao mAb recombinante.

[00263] Em seguida, foi testado o impacto de 9D9 DMAb no microambiente do tumor antes da eliminação do tumor no dia 10 (Figura 7A).

Nesse ponto inicial, os tumores de ambos os grupos tinham tamanhos semelhantes. O 9D9 DMAb induziu níveis mais altos de infiltração global de linfócitos (células CD3 +), bem como especificamente a infiltração de células T CD8 +, em comparação com camundongos isotípicos de controle, indicando uma potente capacidade de estimulação imune impulsionada pelo DMAb (Figura 7B, OC). Além disso, as células T CD8 + infiltradas nos tumores tratados com 9D9 DMAb expressaram níveis mais altos de marcadores de ativação, incluindo CD44, CD69 e PDI (Figura 7D). É importante ressaltar que os tumores tratados com o 9D9 DMAb tinham uma proporção significativamente menor de células T reguladoras (CD4 + / CD25 +/ FoxP3 +) (Figura 7E).

[00264] Em seguida, a eficácia deste DMAb foi testada em um cenário terapêutico no modelo de tumor CT26. Para este modelo, a administração de DMA )b foi iniciada 3 dias após a implantação do tumor (Figura 3C). O 9D9 DMA)b exibiu alta expressão nessa cepa de camundongo (Figura 3C) e foi eficaz no controle do crescimento de tumores nesse cenário terapêutico, induzindo a depuração do tumor em 8/10 camundongos (Figura 3D). Esses resultados suportam a versatilidade dessa plataforma DMAb em várias cepas de camundongo e modelos de tumores. Expressão e ligação de CTLA-4 DMAbs humano anti-humanos

[00265] Em seguida, foi testada a produção in vitro e in vivo de DMAbs de ipilimumabe e tremelimumabe clinicamente relevantes (ipi- DMAb e treme-DMAb) (Figura 8). Ambos os DMAbs foram expressos e secretados em níveis muito altos no meio das células transfectadas in vitro (- 14,3 ug / mL para ipicDMAb e — 5,8 ug / mL para treme-DMAb, Figura 8A). Além disso, as cadeias pesadas e leves foram claramente visíveis no lisado e no meio por western blot (Figura 8B).

[00266] A dosagem de 400 ug de DNA formulado nos músculos tibial anterior e quadríceps de camundongos Balb / c demonstrou expressão robusta de ambos os DMAbs, com níveis de expressão de pico potentes de — 85ug / mL para ipi-DMAb e - 58 ug / mL para treme-DMAb (Figura 8C). Estes estudos foram realizados em camundongos sem células T CD4 e CD8 para eliminar a resposta imune anti-humana (Figura 9). Ambos os DMAbs produziram mAb por períodos prolongados de mais de um ano (Figura 8C). É importante ressaltar que o DMAb abrigava no soro dos animais tratados uma ligação robusta ao CTLA-4 humano por ELISA (Figura 8D). Funcionalidade de CTLA-4 DMAbs anti-humano humano

[00267] A funcionalidade do ipi-DMAb e treme-DMAbs foi avaliada utilizando ensaios de células T humanas in vitro (Figura 10). As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de três doadores saudáveis e estimuladas com PMA / ionomicina para induzir a expressão da superfície de CTLA-4 nas células T reguladoras (Figura 10A) (Jago et al., 2004, Clin Exp Immunol, 136: 463 471). Como a expressão da superfície do CD4 é regulada negativamente após a estimulação com PMA / ionomicina, as células T reguladoras (Tregs) foram classificadas como PBMCs CD3 +, CD8 e CD25 +. De maneira semelhante ao anticorpo CTLA- 4 anti-humano de controle positivo, ipi-DMAb e treme-DMAb produzidos in vitro eficientemente corados estimularam Tregs, mas não Tregs não estimulados (Figura 10A, B).

[00268] Um ensaio funcional de ativação de células T foi utilizado para testar a capacidade dos DMAbs em induzir a ativação de células T in vitro. Para este ensaio, as células aAPC / Raji foram coincubadas com células Jurkat que foram transduzidas com um construto que expressa luciferase fora do promotor de IL-2 (Figura 10C). Após bloqueio eficiente da interação CTLA-4 / CD80 / CD86, essas células Jurkat podem ser ativadas e expressar luciferase com eficiência (Figura 10C). Verificou-se que ipi-DMAb, treme-DMAb e o anticorpo de controle positivo aCTLA-4 induziram a expressão de luciferase de maneira dependente da dose (Figura 10D). Como esperado, o anticorpo de controle negativo (9D9) não induziu a expressão de luciferase (Figura 10D). Curiosamente, o treme-DMAb induziu a expressão de luciferase em concentrações mais baixas em comparação com o ipi-DMAb, indicando potencialmente uma função de bloqueio mais potente (Figura 10D). Juntos, esses resultados demonstram que os anticorpos anti-CTLA-4 produzidos pelos plasmídeos de DNA in vivo são funcionais. A funcionalidade desses anticorpos expressos in vivo também foi confirmada (Figura 11). Exemplo 2 Sinergia da vacina de DNA de mTERT com inibidor de ponto de verificação anti-CTLA-4

[00269] O modelo de tumor de camundongo TC-1 foi usado para investigar a sinergia potencial entre uma vacina de DNA de mTERT e um anticorpo recombinante anti-CTLA-4. Conforme representado na Figura 12, o volume do tumor foi reduzido em coortes que receberam a vacina de DNA de mTERT em combinação com o anticorpo anti-CTLA-4 recombinante (clone 9D9), em comparação com camundongos Naive ou camundongos que receberam a vacina de MTERT de DNA sozinha.

[00270] Em outro experimento, o modelo de tumor de camundongo TC-1 foi usado para investigar a sinergia potencial entre uma vacina de DNA de mTERT e um anti-CTLA-4 DMAb. Como mostrado na Figura 13, o volume do tumor foi reduzido nas coortes que receberam a vacina de DNA de mTERT em combinação com 9D9, em comparação com todos os outros grupos (pVax + controle DMAb, mTERT + controle DMAb, pVax + 9D9 DMAD).

[00271] As divulgações de cada patente, pedido de patente e publicações aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00272] Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades específicas, é evidente que outras modalidades e variações desta invenção podem ser concebidas por outros versados na técnica sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção.

As reivindicações anexas se destinam a ser interpretadas para incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para gerar um ou mais anticorpos anti-CTLA-4 ou fragmentos dos mesmos em um sujeito, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um ou mais anticorpos anti-CTLA-4 ou fragmentos dos mesmos.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um domínio de clivagem.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma região de cadeia pesada variável e uma região de cadeia leve variável do anticorpo.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo uma região de cadeia pesada constante e um polipeptídeo compreendendo uma região de cadeia leve constante.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo uma região de cadeia pesada variável; uma região de cadeia pesada constante; um domínio de clivagem; uma região de cadeia leve variável; e uma região de cadeia leve constante.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo codifica uma sequência líder.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 90% de identidade através de todo o comprimento de pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5e6.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 80% de identidade ao longo de todo o comprimento de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 7,8,9, 10,11e 12.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 8, caracterizada pelo fato de que as uma ou mais moléculas de ácido nucleico são engenheiradas para estarem em um vetor de expressão.

10. Composição de acordo com a reivindicação |, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência de nucleotídeo codificando um antígeno.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o antígeno é um antígeno de câncer

12. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Método para tratar uma doença em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito qualquer composição das reivindicações 1-12.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.

15. Método para aumentar uma resposta imune em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar qualquer composição das reivindicações 1-12 ao sujeito.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a administração da composição compreende uma etapa de eletroporação.

17. Método para aumentar uma resposta imune em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar qualquer composição das reivindicações 1-12 ao sujeito.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa subsequente de administração ao sujeito de uma composição compreendendo o antígeno.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de administração compreende a distribuição de eletroporação ao sítio de administração.