BR112020005766A2 - anticorpo il-5, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e aplicação médica do mesmo - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um anticorpo IL-5, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e aplicações médicas dos mesmos. A presente invenção compreende um anticorpo derivado do camundongo contendo uma região CDR do anticorpo IL-5, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, e uma composição farmacêutica compreendendo o dito anticorpo IL-5 e o dito fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, bem como o uso da composição farmacêutica como um fármaco.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO IL-5, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, E APLICAÇÃO MÉDICA DO MESMO".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente revelação refere-se a anticorpos |IL-5 e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo. Além disso, a presente revelação também se refere aos anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados compreendendo as regiões CDR dos anticorpos IL-5, e a presente revelação também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo IL-5 e fragmentos de ligação a antígeno destes, e o seu uso como agente terapêutico e diagnóstico para as doenças relacionadas com a IL-5.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A interleucina-5 (IL-5) é um dos importantes membros da família da interleucina, também conhecido como fator de substituição de células T (TRF), fator de crescimento de células B-ll (BCGF-II), fator de aumento de IgA (IgA-EF) ou fator de diferenciação de eosinófilos (EDF). É uma glicoproteína homodimérica secretada principalmente por células T ajudantes 2 (Th2). A I|L-5 humana consiste de 134 resíduos de aminoácidos, incluindo um peptídeo sinal que consiste de 22 aminoácidos e dois locais de glicosilação. A IL-5 humana tem 70% de identidade com IL-5 murino no nível de aminoácidos. Uma IL-5 ativa está sob a forma de oligodímero, com duas cadeias peptídicas ligadas umas às outras através de ligação(ões) dissulfeto(s) e em uma configuração antiparalela, enquanto os monômeros de I|L-5 não são biologicamente ativos (Adv Immunol. 1994; 57:145—90).

[0003] Os eosinófilos (EOS) estão associados com uma variedade de doenças inflamatórias no pulmão, incluindo doenças alérgicas associadas com reação anafilática. Entre as doenças respiratórias, a asma é uma doença inflamatória crônica, afetando cerca de 300 milhões de pacientes em todo o mundo, com uma morbidade de 10%. Sua patogênese está associada com uma variedade de citocinas, e IL-5 e seu receptor IL-5R desempenham um papel importante na patogênese da asma. Há uma grande quantidade de células inflamatórias infiltrantes no tecido broncopulmonar de pacientes com asma, entre os quais os eosinófilos são mais significativamente aumentados. Muitos estudos têm mostrado que os eosinófilos são uma das células principais, levando a inflamação das vias aéreas na asma (Curr Opin Pulm Med. 2005 Jan; 11(1): 1-6). A IL-5 desempenha um papel extremamente importante na diferenciação, maturação, aderência, infiltração e apoptose dos EOS. Um grande número de estudos com animais e estudos clínicos têm demonstrado que a IL-5 pode ativar células progenitoras de EOS da medula óssea e iniciar a agregação de EOS no sangue periférico e das vias aéreas, levando à inflamação crônica e hiper-responsividade das vias aéreas (J Immunol. 2014 Oct 15; 193(8):4043-52). Além disso, a IL-5 pode prolongar o tempo de sobrevivência de EOS, reforçar a sua resposta de degranulação a fatores estimuladores específicos (como IgA ou IgG), e mediar a atividade quimiotática de eosinófilos (J Asthma Allergy. 3 Nov 2015; 8: 125-34). Aumento da expressão de IL-5 foi detectada em ambos os pacientes com asma e modelos induzidos por antígeno humano brônquico (Greenfeder et al, Respiratory Research, 2: 71-79, 2001). À proteína IL-5 recombinante humana tomada pelos pacientes com asma resultará no aumento do número de eosinófilos, a hiperresponsividade brônquica, e liberação de partículas tóxicas por eosinófilos, indicando que a IL-5 é um fator-chave na patogênese da asma.

[0004] Atualmente, o método mais eficaz para o tratamento da asma é inibir a expressão de alguns dos principais mediadores (incluindo IL-5) na asma através de administração nasal ou oral de esteróis para aliviar a inflamação no pulmão. No entanto, o uso a longo prazo de esteróis tem muitos efeitos colaterais. É, portanto, necessário encontrar novos alvos farmacêuticos para o tratamento da asma. Estudos têm mostrado que, inibindo a ligação de IL-5 ao seu receptor, os anticorpos de I|L-5 podem reduzir significativamente o acúmulo de eosinófilos no pulmão, reduzir o nível de eosinófilos no sangue, tecido e escarro, diminuir a resposta inflamatória mediada por eosinófilos, melhorar a função pulmonar, e apresentam boa eficácia no tratamento de asma de eosinófilos grave e asma recorrente (Drugs. Maio de 2017; 77(7): 777-784). Atualmente, somente anticorpos IL-5 mepolizumabe da GSK e reslizumabe de Teva Pharma estão comercialmente disponíveis. Outros anticorpos contra o alvo de IL-5 estão em fase de pesquisa pré- clínica. As patentes relacionadas são por exemplo, WO2017033121, WO2016040007, WO2015095539, WO2012083370, WO2012158954, WOZ2006046689, WO9621000, WO9535375, etc., no entanto, há ainda uma necessidade de melhoria na eliminação induzida pela |L-5 de eosinófilos e a melhora da função pulmonar. Portanto, é necessário continuar a desenvolver anticorpos com alta seletividade, alta afinidade e boa eficácia para fornecer mais e preferidos regimes de tratamento anti-lIL-5 para a asma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente revelação fornece anticorpos monoclionais ou fragmentos de ligação a antígenos (também conhecida como moléculas de ligação a IL-5) que se ligam especificamente a sequência de aminoácidos da |L-5 ou estrutura tridimensional.

[0006] Em um aspecto, a revelação fornece um anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo ligado à IL- humana, no qual o anticorpo monoclonal compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, onde, (i) região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 16 a 18, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 16 a 18, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 19 a 21, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 19 a 21, respectivamente; ou

(ii) região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 22 a 24, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 22 a 24, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 25 a 27, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ I|D Nº: 25 a 27, respectivamente; ou

(iii) região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 28 a 30, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SE

(iv) região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 34 a 36, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 34 a 36, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 37 a 39, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ I|D Nº: 37 a 39, respectivamente; ou

(v) região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 40 a 42, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 40 a 42, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 43 a 45, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 43 a 45, respectivamente; ou

(vi) região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 34 a 36, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR?2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 34, 82 3 36, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 37 a 39, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e

LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 37 a 39, respectivamente.

[0007] Em algumas modalidades, as variantes do anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno CDRs (incluindo 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve) tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos são aquelas que são obtidas por métodos de maturação de afinidade.

[0008] Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno se ligam a IL-5 com uma afinidade (KD) menor que 108 M, menor que 10º M, menor que 10º M ou menor que 10º M.

[0009] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à IL-5 humana, o anticorpo monoclonal compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, onde: (vii) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 16 a 18, e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 19 a 21; ou (vili) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 22 a 24, e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 25a 27; ou (ix) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 28 a 30, e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 31 a 33; ou

7ITA (x) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 34 a 36, e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 37 a 39; ou (xi) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 40 a 42, e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 43 a 45; ou (xii) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nºs: 34, 82 e 36, e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 37-

39.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal é anticorpo recombinante.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo em anticorpo murino, anticorpo quimérico, anticorpo recombinante de um anticorpo humanizado, ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

[0012] Em algumas modalidades, as sequências da região FR de cadeia leve e pesada na região variável de cadeia leve e pesada do anticorpo humanizado são, respectivamente, derivadas da cadeia leve e pesada da linhagem germinativa humana, ou sequências mutantes das mesmas.

[0013] Em algumas modalidades do anticorpo monoclonal ou do fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 49, 57, 63, 69 ou 75, ou uma variante do mesmo; a variante tem de 1 a 10 mutação(ões) de aminoácidos sobre a região variável da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 49, 57, 63, 69 ou 75.

[0014] Em algumas modalidades do anticorpo monocional ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, a variante tem 1-10 retromutações de aminoácidos na região FR da região variável da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 49, 57, 63, 69 ou 75; de preferência, a mutação é selecionada do grupo consistindo em S49T, V93T e K98S, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 49, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em S49T, V93T e K98T, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 57, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em R38K, M481l, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K e L83F, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 63, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em F291l, R38K, V48I, R, T72A97F E N55V, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 69, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em R38K, M48I, K, V67R68A, R72A, T74K, M81L, L83F e D89E, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 75.

[0015] Em algumas modalidades do anticorpo monoclional ou do fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 50 ou 51, ou compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 58 ou 59, ou compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 64, 65 e 66, ou compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 70, ou 71, ou compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 76 a 79.

[0016] Em algumas modalidades do anticorpo monoclional ou do fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 46, 54, 60, 67 ou 72, ou uma variante do mesmo; a variante tem de 1 a 10 alteração(ões) de aminoácidos sobre a região variável da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 46, 54, 60, 67 ou 72.

[0017] Em algumas modalidades do anticorpo monocional ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, a variante tem 1-10 retromutação(ões) de aminoácidos na região FR da região variável da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 46, 54, 60, 67 ou 72; de preferência, a retromutação é selecionada do grupo consistindo em A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y e Y87F ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 46; ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em A43S, L47M, F71Y e Y87F ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 54, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em E1D, 12T, I57V, V84T e Y86F, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 60, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em M4L, A428S, L45P e L46W, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 67, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em A43S, I148V e F71Y, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 72.

[0018] Em algumas modalidades do anticorpo monoclonal ou do fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 47 ou 48; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 55 ou 56; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 61 ou 62; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 68; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 73 ou 74.

[0019] Em algumas modalidades do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo humanizado compreende: uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 49 a 51, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 46 a 48; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 57 a 59, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 54 a 56; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 63 a 66, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 60 a 62; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 69 a 71, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 67 a 68; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 75 a 79, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº*: 72-74.

[0020] Em algumas modalidades do anticorpo monocional ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo, compreende ainda uma região constante do anticorpo humano, na qual a região constante da cadeia pesada é preferencialmente uma região constante pesada de anticorpos de IgG1, I9G2, IgG3 e IgG4 humana. Com mais preferência, o anticorpo de comprimento completo compreende uma região constante da cadeia pesada do anticorpo humano conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52, e uma região constante da cadeia leve humana, conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53.

[0021] Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab', F(ab') 2, anticorpos de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diabody), região V estabilizada com dissulfetos (dsFv) e um peptídeo compreendendo CDRs.

[0022] A presente revelação também fornece um anticorpo monoclonal isolado ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, que compete para ligação à IL-5 humana com o anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima.

[0023] A presente revelação também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente revelação, e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes, tampões ou excipientes. À quantidade de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contida na unidade dose da composição farmacêutica é preferencialmente de 0,1 a 2000 mg, mais de preferência de 1 a 1000 mg.

[0024] A presente revelação também fornece uma molécula de ácido nucleico isolada, codificando 0 anticorpo monocional ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente revelação.

[0025] A presente revelação também fornece um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico descrita acima.

[0026] A presente revelação também fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante de acordo com a presente revelação, a célula hospedeira sendo selecionado do grupo consistindo em células procarióticas e células eucarióticas, de preferência células eucarióticas, com mais preferência células de mamíferos.

[0027] A presente revelação também fornece um método para a produção de anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente revelação, o método compreende o cultivo da célula hospedeira acima em uma cultura para formar e acumular o anticorpo monoclonal acima ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo e recuperação do anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo da cultura.

[0028] A presente revelação também fornece um método para detectar ou determinar a IL-5 humana, o método compreende o uso do anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

[0029] A presente revelação também fornece um agente de detecção ou determinação da I|L-5 humana, que compreende o anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer um dos acima.

[0030] A presente revelação também fornece um agente de diagnóstico para uma doença associada com a IL-5, o agente de diagnóstico compreende o anticorpo monoclonal acima ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0031] A presente revelação também fornece um método para diagnosticar uma doença associada com a IL-5 humana, o método compreende a detecção ou determinação da IL-5 humana ou células positivas da IL-5 usando o anticorpo monoclonal acima ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

[0032] A presente revelação fornece também o uso do anticorpo monoclonal acima ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo para a preparação de um agente de diagnóstico para uma doença associada com a IL-5 humana.

[0033] A presente revelação também fornece um medicamento para tratar uma doença associada com a IL-5 humana, compreendendo o anticorpo monoclonal acima ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, ou compreendendo a composição farmacêutica acima, ou compreendendo a molécula de ácido nucleico acima.

[0034] A presente revelação também fornece um método para tratar uma doença associada com a IL-5 humana, o método compreende administrar a um indivíduo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, ou a molécula do ácido nucleico acima para prevenir ou tratar a doença associada com a IL-5 humana.

[0035] A presente revelação fornece também o uso do anticorpo monoclonal acima ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo, ou a molécula do ácido nucleico acima para a preparação de um agente terapêutico para uma doença associada com a IL-5 humana.

[0036] A doença ou condição acima é preferencialmente selecionada do grupo consistindo de asma, ataque maligno de asma, pneumonia crônica, rinite alérgica, aspergilose broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatite atópica, dermatite oncocercose, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenterite eosinofílica, infecção por helmintos, doença de Hodgkin, pólipos nasais, síndrome de Loeffler, urticária, bronquite hiperplásica eosinofílica, arterite nodular, sinusite, esofagite eosinofílica, esofagite —eosinofílica alérgica, conjuntivite alérgicay dermatite oncocercose, endometriose e bronquite eosinofílica dependente de esteroides.

[0037] Os anticorpos monoclonais da IL-5 ou fragmentos de ligação a antígeno da presente revelação tem alta especificidade e alta afinidade com a IL-5. Os anticorpos humanizados reduziram muito a imunogenicidade e completamente mantêm a especificidade do anticorpo murino e apresentam alta afinidade e excelentes atividades in vitro e in vivo.

[0038] Os anticorpos monoclonais da IL-5 ou fragmentos de ligação a antígeno da presente revelação têm boa seletividade para simplesmente reconhecer especificamente a IL5.

[0039] Os anticorpos monoclonais da IL-5 ou fragmentos de ligação a antígeno da presente revelação têm boas características dinâmicas metabólicas em ratos, apresentam meia-vida longa e alta biodisponibilidade.

[0040] As moléculas de anticorpo humanizado da IL-5 da presente revelação têm boa estabilidade a longo prazo, nenhuma modificação química anormal óbvia, nenhuma agregação óbvia em alta concentração e alto grau de pureza e estabilidade térmica.

[0041] Além de reduzir a proliferação de eosinófilos, os anticorpos monoclonais da IL-5 ou fragmentos de ligação a antígeno da presente revelação têm boas propriedades para melhorar a função pulmonar.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0042] Figura 1: Os anticorpos anti-IL-5 bloqueiam a ligação da IL- ao receptor da IL-5 no experimento FACS;

[0043] Figura 2: Detecção de especificidade de ligação de anticorpos IL-5 à citocina Th2;

[0044] Figura 3: Anticorpos anti-IL-5 aumentam o valor intermitente respiratório (Penh). G1: grupo controle normal (PBS); G2: grupo modelo (IgG); G3: grupo do anticorpo h1705-008 10mpk; G4: grupo do anticorpo h1705-008 2mpk; G5: grupo do anticorpo h1706-009 10mpk; G6: grupo do anticorpo h1706-009 2mpk; G7: grupo Hu39D10 10mpk; *p<0,05, **<0,01 (em comparação com o grupo G2 por ANOVA /Bonferroni);

[0045] Figura 4A: O nível de eosinófilos BALF no pulmão de ratos com asma; Figura 4B: Escores de espessura da mucosa traqueal de ratos com asma. G1: grupo controle normal; G2: grupo modelo; G3: grupo do anticorpo h1705-008 10mpk; G4: grupo do anticorpo h1705- 008 2mpk; G5: grupo do anticorpo h1706-009 10mpk; G6: grupo do anticorpo h1706-009 2mpk; G7: grupo Hu39D10 10mpk; Figura 4C: Percentagem de eosinófilos BALF no pulmão de ratos com asma;

[0046] A Figura 5A e a Figura 58 mostram a capacidade do mAb IL5 para reduzir o nível de eosinófilos em BALF.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. Terminologia

[0047] A fim de compreender mais facilmente a presente revelação, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. Exceto onde especificado em contrário aqui, todos os outros termos técnicos e científicos usados aqui terão o significado normalmente entendido pelo versado na técnica a que a presente invenção pertence.

[0048] Códigos de três letras e códigos de uma letra para aminoácidos usados na presente revelação são como descritos em J. biol chem, 243, p3558 (1968).

[0049] Como usado aqui, "anticorpo" refereese a uma imunoglobulina, uma estrutura de cadeia de quatro peptídeos ligada entre si pela ligação dissulfeto entre duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Diferentes regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina apresentam diferentes composições de aminoácidos e ordens de classificação, portanto, apresentam diferentes antigenicidade. Por conseguinte, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco tipos, ou chamados de isotipos de imunoglobulinas, ou seja, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, com cadeia pesada 7, y, a, dec, respectivamente. De acordo com a sua composição de aminoácidos da região da dobradiça e o número e a localização das pontes dissulfetos de cadeia pesada, o mesmo tipo de lg ainda pode ser dividido em diferentes subtipos, por exemplo, IgG pode ser dividida em I9G1, IgG2, I9G3 e IgG4. A cadeia leve pode ser dividida em cadeia K ou À, com base em diferentes regiões constantes. Cada um dos cinco tipos de Ig podem ter a cadeia K ou À.

[0050] Na presente revelação, a cadeia leve do anticorpo mencionado na presente revelação compreende ainda uma região constante da cadeia leve, que compreende a cadeia K«, À humana ou de murino ou uma variante destas.

[0051] Na presente revelação, a cadeia pesada do anticorpo mencionado na presente revelação compreende ainda uma região constante da cadeia pesada, que compreende as IgG1, 1g9G2, 1g9G3, IgG4 humana ou de murino ou uma variante das mesmas.

[0052] Cerca de 110 sequências de aminoácidos adjacentes ao N- terminal das cadeias pesada e leve de anticorpos são altamente variáveis, conhecidas como região variável (região FV); o resto das sequências de aminoácidos perto do C-terminal são relativamente estáveis, conhecidas como região constante. A região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVRs) e quatro regiões de estrutura relativamente conservadoras (FRs). As três regiões hipervariáveis que determinam a especificidade do anticorpo são também conhecidas como as regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e cada região variável da cadeia pesada (HCVR) consiste em três regiões CDR e quatro regiões FR, em ordem sequencial do terminal amino ao terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FRA4. As três regiões de CDR da cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e as três regiões CDR da cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a posição de resíduos de aminoácidos de CDR nas regiões LCVR e HCVR do anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui cumprem os critérios de numeração de Kabat conhecidos (LCDR1-3, HCDR1-3).

[0053] O anticorpo da presente revelação compreende anticorpo murino, anticorpo quimérico e anticorpo humanizado, de preferência é anticorpo humanizado.

[0054] O termo "anticorpo murino" na presente revelação refere-se a anticorpo monoclonal de IL-5 anti-humana preparados de acordo com o conhecimento e as habilidades do campo. Durante a preparação, o indivíduo de teste pode ser injetado com antígeno IL-5, e, em seguida, um hibridoma expressando o anticorpo que possui sequência desejada ou características funcionais é isolado. Em uma modalidade preferida da presente revelação, o anticorpo murino da IL-5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda a região constante da cadeia leve da cadeia «, À de murino ou uma variante deste, ou compreende ainda região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, I9G3 ou IgG4 de murino ou uma variante das mesmas.

[0055] O termo "anticorpo quimérico", é um anticorpo ao fundir a região variável do anticorpo murino com região constante de anticorpo humano, e o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imune induzida por anticorpos murinos. Para estabelecer um anticorpo quimérico, um hibridoma secretor de anticorpo monoclonal de murino específico pode ser estabelecido e um gene da região variável é o clonado do hibridoma murino. Então um gene da região constante desejada do anticorpo humano pode ser clonado e conectado com um gene da região variável de murino para formar um gene quimérico que pode ser posteriormente inserido em um vetor de expressão. Finalmente, a molécula de anticorpo quimérico será expressada no sistema eucariótico ou procariótico. Em uma modalidade preferencial da presente revelação, a cadeia leve do anticorpo quimérico da IL-5 inclui ainda uma região constante da cadeia leve derivada da cadeia «, À humana ou uma variante da mesma. A cadeia pesada do anticorpo quimérico da IL-5 compreende ainda uma região constante da cadeia pesada derivada de I9G1, IgG2, I9G3, I9gG4 humana ou uma variante da mesma, de preferência compreende uma região constante da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana, ou compreende uma variante da região constante da cadeia pesada da IgG1, IgG2 ou IgG4 humana com mutação(ões) do aminoácido, como a mutação(ões) YTE ou retromutação(ões).

[0056] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo gerado por sequências CDR de murino enxertadas na estrutura da região variável do anticorpo humano, ou seja, um anticorpo produzido em diferentes tipos de sequências de estrutura de anticorpos da linhagem germinativa humana. Anticorpo humanizado pode superar respostas heterólogas induzidas pelo grande número de componentes de proteínas murina realizadas pelo anticorpo quimérico. Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos cobrindo as sequências de genes do anticorpo da linhagem germinativa ou referências publicadas. Por exemplo, as sequências de DNA da linhagem germinativa de genes da região variável da cadeia leve e pesada podem ser encontradas em banco de dados de sequência de linhagem germinativa humana "VBase" (disponíveis no sitenwww.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, et al. 1991) Sequences of Proteins of Imnmunological Interest, 5º Ed. Para evitar uma diminuição na atividade causada pela diminuição da imunogenicidade, as sequências de estrutura na região variável do anticorpo humano podem ser submetidas a mutações de reversão mínima ou retromutações para manter a atividade. O anticorpo humanizado da presente revelação compreende também o anticorpo humanizado no qual a maturação de afinidade de CDR é realizada por exibição de fagos. Em uma modalidade preferida da presente revelação, a sequência de CDR do anticorpo humanizado da IL-5 é selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nº: 16-21, 22-27, 28-33, 34-39 e 40-45. A estrutura da região variável do anticorpo humano é projetada e selecionada, na qual a sequência da região FR na região variável da cadeia pesada de anticorpos é derivada da sequência da cadeia pesada da linhagem germinativa humana e a sequência da cadeia leve da linhagem germinativa humana. Para evitar uma diminuição na atividade causada pela imunogenicidade diminuída, a região variável do anticorpo humano pode estar sujeita a mutações de reversão mínima (retromutações, isto é, resíduos de aminoácidos da região FR derivados do anticorpo humano são substituídos por resíduos de aminoácidos correspondente ao anticorpo original) para manter a atividade.

[0057] O enxerto do CDR pode resultar na diminuição da afinidade do anticorpo I|L-5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para o antígeno devido à mudança nos resíduos de estrutura contactados com o antígeno. Tais interações podem ser o resultado de mutações altamente somáticas. Portanto, ainda pode ser necessário transferir os aminoácidos doadores de estrutura para a estrutura do anticorpo humanizado. Os resíduos de aminoácidos derivados do anticorpo IL-5 não humana ou o fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos, que estão envolvidos na ligação ao antígeno, podem ser identificados ao verificar a sequência e a estrutura da região variável do anticorpo monoclonal murino. Os resíduos de aminoácidos e na estrutura de CDR doador, que são diferentes dos das linhagens germinativas, podem ser considerados como sendo relacionados. Se não for possível determinar a linhagem germinativa mais estreitamente relacionada, a sequência pode ser comparada com a sequência comum compartilhada entre os subtipos ou com a sequência comum de sequências de murino tendo alta porcentagem de similaridade. Os resíduos de estrutura raros são pensados como sendo o resultado de uma alta mutação em células somáticas, que desempenham um papel importante na ligação.

[0058] Como usado aqui, "fragmentos de ligação ao antígeno" ou "fragmento funcional" refere-se a um ou mais fragmento(s) de anticorpo mantendo a capacidade de ligação ao antígeno (p.ex.

IL-5). Tem sido mostrado que fragmentos de anticorpos de comprimento completo podem ser usados para obter função de ligação com um antígeno.

Os exemplos de fragmentos de ligação no termo "fragmento de ligação ao antígeno" incluem (i) o fragmento Fab, um fragmento monovalente composto do domínio VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação dissulfeto na região de dobradiça; (ili) fragmento Fd, consistindo de domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv, consistindo de domínios VH e VL do anticorpo de um braço; (v) domínio único ou fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature341:544-546) composto de domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade separada (CDR) e (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs separadas opcionalmente ligadas por um ligante sintético.

Além disso, embora o domínio VL e o domínio VH do fragmento Fv sejam codificados por dois genes separados, eles podem ser ligados por um ligante sintético usando métodos recombinantes, gerando assim uma cadeia única de proteína de uma cadeia molecular monovalente formada por emparelhamento do domínio VH e VL (chamado de cadeia única Fv (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988); Science 242: 423- 426 e Huston et al (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci USA85:5879-5883). Este anticorpo de cadeia única também está incluído no termo "fragmento de ligação ao antígeno" do anticorpo.

Tais fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas no campo, e triados para fragmentos funcionais usando o mesmo método que para um anticorpo intacto.

As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por tecnologia de DNA recombinante ou por perturbação enzimática ou química de uma imunoglobulina intacta.

Os anticorpos podem ser na forma de isotipos diferentes, por exemplo, anticorpo IgG (por exemplo, subtipo I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, 1gD, IgE ou IgM.

[0059] Os fragmentos de ligação ao antígeno na presente revelação incluem Fab, F(ab')2, Fab', anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diabody), região V estabilizada com bissulfeto (dsFv) e peptídeo contendo CDR.

[0060] Fab é um fragmento de anticorpo obtido por tratamento de uma molécula de IgG com uma papaína (que cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H). O fragmento Fab tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação ao antígeno, em que cerca de metade do lado N-terminal da cadeia H e toda a cadeia de L são ligadas entre si através de uma ligação dissulfeto.

[0061] O Fab da presente revelação pode ser produzido por tratar o anticorpo —monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente a IL-5 humana e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma com papaína. Além disso, o Fab pode ser produzido pela inserção do DNA de codificação do Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariota e introduzindo o vetor em um procariota ou eucariota para expressar ao Fab.

[0062] F(ab')2 é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de aproximadamente 100.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno e compreendendo duas regiões Fab, que estão ligadas na posição da dobradiça, F(ab')2 é obtido por digerir a parte a jusante das duas pontes dissulfeto na região da dobradiça de IgG com pepsina.

[0063] O F(ab')2 da presente revelação pode ser produzido por tratar o anticorpo monoclonal da presente revelação que reconhece especificamente a IL-5 humana e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma com pepsina. Além disso, o F(ab')2 pode ser produzido pela ligação do Fab' descrito abaixo, através de uma ligação tioéter ou uma ligação dissulfeto.

[0064] Fab' é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno. Fab' é obtida pela clivagem de uma ligação dissulfeto na região da dobradiça do F(ab')2 acima. O Fab' da presente revelação pode ser produzido por tratar o F(ab')2 da presente invenção que reconhece especificamente a IL-5 e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma com um agente de redução, como o ditiotreitol.

[0065] Além disso, o Fab' pode ser produzido pela inserção do DNA de codificação do fragmento Fab' do anticorpo em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariota e introduzindo o vetor em um procariota ou eucariota para expressar ao Fab”.

[0066] O termo "anticorpo de cadeia única", "Fv de cadeia única" ou "scFv" refere-se a uma molécula compreendendo um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (ou região; VH) e um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (ou região; VL) conectados por um ligante. Tais moléculas scFv têm a estrutura geral do NH2-VL-linker-VH-COOH ou NH2-VH-linker-VL-COOH. Um ligante adequado na técnica anterior consiste em sequência de aminoácidos GGGGS repetidos ou variante do mesmo, por exemplo, usando uma variante com 1-4 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Outros ligantes que podem ser usados para a presente revelação são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

[0067] O scFv da presente revelação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente revelação que reconhece especificamente a IL- humana e se liga a sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma, construindo o DNA de codificação do scFv, inserindo o DNA em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariota e, em seguida, introduzindo o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o ScFv.

[0068] Um diabody é um fragmento de anticorpo onde o scFv é dimerizado, e é um fragmento de anticorpo tendo atividade de ligação ao antígeno divalente. Na atividade de ligação ao antígeno divalente, dois antígenos podem ser os mesmos ou diferentes.

[0069] O diabody da presente revelação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente revelação que reconhece especificamente a IL- 5 humana e se liga a sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma, construindo o DNA de codificação do scFv de modo que o comprimento do peptídeo ligador tem 8 ou menos resíduos de aminoácidos, inserindo o DNA em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariota e, em seguida, introduzindo o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o diabody.

[0070] Um dsFv é obtido através da substituição de um resíduo de aminoácido em cada VH e VL com um resíduo de cisteína e, em seguida, conectar o polipeptídeo substituído através de uma ligação dissulfeto entre dois resíduos de cisteína. O resíduo de aminoácido a ser substituído com um resíduo de cisteína pode ser selecionado com base em previsão da estrutura tridimensional do anticorpo de acordo com os métodos conhecidos (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).

[0071] O dsFv da presente revelação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs codificando VH e VL do anticorpo monoclonal da presente revelação que reconhece especificamente a IL- humana e se liga a sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma, construindo o DNA de codificação do dsFv, inserindo o DNA em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariota e, em seguida, introduzindo o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o dsFv.

[0072] Um peptídeo contendo CDR é construído por uma ou mais região(ões) de CDRs de VH e VL. Os peptídeos contendo várias CDRs podem ser unidos, diretamente ou através de um ligante peptídeo adequado.

[0073] O peptídeo contendo CDR da presente revelação pode ser produzido pelas etapas de: construção de um DNA codificando as CDRs de VH e VL do anticorpo monoclonal da presente revelação que reconhece especificamente a IL-5 humana e se liga a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da região extracelular ou estrutura tridimensional da mesma, inserindo o DNA em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariota e, em seguida, introduzindo o vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o peptídeo. O peptídeo contendo CDR também pode ser produzido através de um método de síntese química como método Fmoc ou método tBoc.

[0074] O termo "estrutura de anticorpos" como usado aqui refere- se à parte do domínio variável, VL ou VH, que serve como um arcabouço para os laços de ligação ao antígeno (CDRs) desse domínio variável. Em essência ele é o domínio variável sem as CDRs.

[0075] O termo "diferença de aminoácidos" refere-se a diferenças em uma ou mais posições de aminoácidos ao longo do comprimento de um fragmento de polipeptídeo entre um polipeptídeo e uma variante do mesmo, na qual a variante pode ser obtida pela substituição, inserção ou deleção de um ou mais aminoácidos sobre o polipeptídeo.

[0076] O termo "epitopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um local em um antígeno para o qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente (por exemplo, um local específico na molécula IL-5). Epitopos normalmente incluem, pelo menos, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9,10, 11,12, 13, 14 ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos em uma única conformação terciária. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, ed. G. E. Morris (1996).

[0077] O termo "especificamente se liga a", "seletivamente se liga a" ou "especificamente se liga a" refere-se à ligação de um anticorpo a um epitopo predeterminado em um antígeno. Normalmente, o anticorpo se liga com uma afinidade (KD) menor que cerca de 108 M, por exemplo, menor que 10º M, 10º M ou 10º M ou até menos.

[0078] O termo "KD" refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma determinada interação anticorpo - antígeno. Normalmente, o anticorpo da presente revelação se liga à IL-5 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) menor que 107 M, como menor que 10º M, 10º M ou 10º M ou menor ainda, por exemplo, conforme determinado por técnicas de ressonância de plásmon de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE.

[0079] Quando o termo "competição" é usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, neutralizando proteínas de ligação ao antígeno ou anticorpos neutralizantes) que competem para o mesmo epitopo, significa que a competição ocorre entre as proteínas de ligação ao antígeno, que é determinada pelos seguintes ensaios: uma proteína de ligação ao antígeno a ser testada (por exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional do mesmo) previne ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica entre a proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, um ligante ou anticorpo de referência) e um antígeno comum (por exemplo, um antígeno da IL-5 ou fragmento do mesmo). Inúmeros tipos de ensaios de ligação competitiva estão disponíveis para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outro.

Estes ensaios são, por exemplo, radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição de sanduíche (ver, por exemplo, Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253); EIA de biotina-avidina de fase sólida direta (ver, por exemplo, Kirkland et al, 1986, J.

Immunol. 137: 3614-3619), ensaio de rotulagem direto de fase sólida, ensaio sanduíche de rotulagem direta de fase sólida (ver, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de rotulagem direta com rótulo 1-125 (ver, por exemplo, Morel et al, 1988, Molec.

Immunol. 25: 7-15); EIA de biotina-avidina direta de fase sólida (ver, por exemplo, Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552); e RIA de rotulagem direta (Moldenhauer et al, 1990, Scand.

J.

Immunol. 32: 77-82). Normalmente, o ensaio envolve o uso de um antígeno purificado (ou sobre uma superfície sólida ou sobre uma superfície celular) capaz de ligação a ambas uma proteína de ligação ao antígeno sem rótulo para ser testada e uma proteína de ligação ao antígeno de referência rotulado.

Inibição competitiva é determinada medindo a quantidade de rótulo ligado à superfície sólida ou à célula na presença da proteína de ligação ao antígeno a ser testada.

Geralmente, a proteína de ligação ao antígeno a ser testada está presente em excesso.

Proteínas de ligação ao antígeno identificadas por ensaio competitivo (competindo com a proteína de ligação ao antígeno) incluem: proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epitopo como a proteína de ligação ao antígeno de referência; e as proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a um epitopo que está suficientemente próximo do epitopo ao qual a proteína de ligação ao antígeno de referência se liga, onde os dois epitopos espacialmente interferem uns com os outros para impedir a ligação. Detalhes adicionais sobre os métodos de determinação de ligação competitiva são fornecidos nos Exemplos aqui. Normalmente, quando uma proteína de ligação ao antígeno está presente em excesso ela irá inibir (por exemplo, reduzir), pelo menos, 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60- 65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou mesmo mais da ligação específica entre a proteína de ligação ao antígeno de referência e o antígeno comum. Em alguns casos, a ligação é inibida por, pelo menos, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% ou 97% ou mesmo mais.

[0080] O termo "molécula de ácido nucleico", conforme usado aqui, refere-se a moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla, mas de preferência é o DNA de fita dupla. Um ácido nucleico é "funcionalmente ligado" quando é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou potencializador está ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se esta afeta a transcrição ou expressão da sequência.

[0081] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz transportar outro ácido nucléico à qual está ligada. Em uma modalidade, o vetor é um "plasmídeo" que se refere a um laço de DNA de fita dupla circular no qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, onde os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Os vetores revelados aqui são capazes de autorreplicação na célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, os vetores de bactérias tendo uma origem de replicação de bactérias e vetores de mamíferos episomais), ou podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira, e, assim,

são replicadas junto com genoma hospedeiro (por exemplo, vetores mamíferos não episomais).

[0082] Métodos para a produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Capítulos 5-8 e 15. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com a IL-5 humana ou fragmentos da mesma, e os anticorpos resultantes podem então ser renaturados, purificados e sequenciados para sequências de aminoácidos usando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. Os anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno da presente revelação são projetados para conter uma ou mais região(õdes) FR humana de CDRs derivada de um anticorpo não humano. As sequências da linhagem germinativa FR humana podem ser obtidas alinhando os bancos de dados da linhagem germinativa variável humana do anticorpo humano e o software MOE da ImMunoGeneTics (IMGT) através do seu site http://imgt.cines.fr, The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351.

[0083] O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula em que o vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir células microbianas (por exemplo, bactérias), vegetais ou animais. Bactérias que são susceptíveis de ser transformadas incluem membros de enterobacteriaceae, como, por exemplo, cepas de Escherichia coli ou de Salmonella; Bacilaceae como Bacillus subtilis, Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Microrganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhagens celulares hospedeiras animais adequadas incluem, mas não estão limitadas a, CHO (linhagem celular de ovário de hamster chinês), células HEK (como exemplos não limitantes, células HEK293E) e células NSO0.

[0084] Os anticorpos modificados ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente revelação podem ser preparados e purificados usando métodos conhecidos. Por exemplo, a sequência de cDNA de codificação de uma cadeia pesada e cadeia leve pode ser clonada e modificada em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina — recombinante — pode, então, ser transfectado estavelmente em células CHO. Como um método mais recomendado bem conhecidos na técnica, sistemas de expressão de mamíferos resultarão em glicosilação do anticorpo, normalmente em locais N- terminais altamente conservadores na região Fc. Os clones estáveis podem ser verificados para a expressão de um anticorpo especificamente de ligação à IL-5 humana. Os clones positivos podem ser expandidos em meio de cultura livre de soro em biorreatores para a produção de anticorpos. Meio de cultura, no qual um anticorpo foi secretado, pode ser purificado por técnicas convencionais. Por exemplo, a purificação pode ser realizada na coluna de Sepharose FF da Proteína A ou G que tem sido equilibrada com um tampão ajustado. A coluna é lavada para remover componentes de ligação não específicos e, em seguida, o anticorpo ligado é eluído por gradiente de pH e frações anticorpos são detectados por SDS-PAGE e, em seguida, coletados. Os anticorpos podem ser filtrados e concentrados usando técnicas comuns. Misturas solúveis e polímeros podem ser removidos por técnicas comuns, como a exclusão de tamanho ou de troca iônica. O produto resultante pode ser imediatamente congelado, por exemplo, a -70ºC ou pode ser liofilizado.

[0085] "Administração", "administrando" e "tratamento", em que se aplica a um animal, humano, sujeito experimental, células, tecidos, órgãos ou fluidos biológicos, refere-se ao contato de um agente farmacêutico exógeno, terapêutico, e de diagnóstico, ou composição para fluidos de animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou biológico. "Administração", "administrando" ou "tratamento" pode se referir, por exemplo, para métodos terapêuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de pesquisa e experimentais. Tratamento de uma célula engloba o contato de um reagente com a célula, bem como contato de um reagente para um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Administração", "administrando" ou "tratamento" significa, também, tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, com um reagente, diagnóstico, composição de ligação ou com outra célula. "Tratamento", quando se aplica a um indivíduo humano, veterinário, ou de pesquisa, refere-se ao tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, de investigação e aplicações de diagnóstico.

[0086] "Tratar" significa a administração de um agente terapêutico, como uma composição contendo qualquer anticorpo ou fragmento do mesmo da presente revelação, interna ou externamente a um paciente com um ou mais sintoma(s) de doenças para a qual o agente tenha atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintoma(s) da doença no paciente ou na população a ser tratada, ao induzir a regressão da ou inibindo a progressão de tal(ais) sintoma(s) por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade do agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença em particular (também referido como "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade e peso do paciente, e a capacidade do fármaco para obter uma resposta desejada no paciente. Se um sintoma da doença tem sido atenuado pode ser avaliado por qualquer medida clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde qualificados para avaliar a gravidade ou status da progressão desse sintoma. Enquanto uma modalidade da presente revelação (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) pode não ser eficaz em aliviar o(s) sintoma(s) da doença alvo em cada paciente, ela deveria aliviar o(s) sintoma(s) da doença alvo em um número estatisticamente significante de pacientes como determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como o teste t de Student, teste de qui-quadrado, teste U de Mann e Whitney, teste Kruskal-Wallis (teste H), teste Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.

[0087] "Modificação conservadora" ou "substituição conservativa" refere-se a substituições de aminoácidos em uma proteína com outros aminoácidos tendo características semelhantes (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilidade, conformação de cadeia principal e rigidez, etc), de modo que as mudanças podem frequentemente ser feitas sem alterar a atividade biológica da proteína. Os versados na técnica reconhecerão que, em geral, a substituição de aminoácido simples em regiões não essenciais de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4º Ed.)). Além disso, substituições com aminoácidos estruturalmente ou funcionalmente semelhantes são menos susceptíveis de perturbar a atividade biológica.

[0088] "Quantidade eficaz" engloba uma quantidade suficiente para atenuar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade eficaz significa também uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores como a condição a ser tratada, a condição geral de saúde do paciente, a via e a dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.

[0089] "Exógeno" refere-se a substâncias que são produzidas fora do organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto. "Endógeno" se refere a substâncias que são produzidos dentro de uma célula, organismo, ou corpo humano, dependendo do contexto.

[0090] "Homologia" refere-se à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeo ou entre duas sequências de polipeptídeo. Quando uma posição em ambas as duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade do monômero de aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA está ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição. A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências, dividido pelo número de posições a ser comparadas e, em seguida, multiplicada por

100. Por exemplo, se 6 de 10 posições em duas sequências são correspondidas ou homólogas quando as sequências são perfeitamente alinhadas, então as duas sequências têm 60% de homologia; se 95 de 100 posições em duas sequências são correspondidas ou homólogas, então as duas sequências têm 95% de homologia. Geralmente, a comparação é realizada quando duas sequências são alinhadas para render o máximo de porcentagem de homologia.

[0091] Conforme usado aqui, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usadas de forma intercambiável e todas essas denominações incluem progênies. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem as principais células e culturas do indivíduo derivadas das mesmas sem levar em conta o número de passagens. Também deve ser entendido que as progênies não podem ser precisamente idênticas em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada nas células originalmente transformadas está incluída aqui. Onde denominações distintas são destinadas, serão claramente compreendidas a partir do contexto.

[0092] Como usado aqui, "a reação em cadeia da polimerase" ou "PCR" refere-se a um procedimento ou técnica em que quantidades mínimas de uma parte específica do ácido nucléico, RNA e/ou DNA são amplificadas como descrito em, por exemplo, patente US No. 4.683.195. Geralmente, a informação de sequência sobre as extremidades da região de interesse ou além da região de interesse precisa ser avaliada, de modo que os primers de oligonucleotídeo possam ser desenhados; esses primers poderão ser idênticos ou semelhantes em sequência para fitas opostas ao modelo a ser amplificado. Os nucleotídeos 5' terminais dos dois primers estão em coerência com as extremidades do material a ser amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas a partir do DNA genômico total, e cDNA transcrito de RNA celular total, sequências de bacteriófago ou de plasmídeos etc. Ver em geral Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). O teste PCR usado na presente revelação é considerado para ser um, mas não o único, exemplo de método de reação de polimerase para amplificação de uma amostra do teste do ácido nucleico. O método compreende o uso de sequências de ácidos nucleicos conhecidas como primers e ácido nucleico polimerase para amplificar ou gerar uma parte específica do ácido nucleico.

[0093] "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou situação que se segue pode, mas não necessariamente, ocorre, e a descrição inclui os casos em que o evento ou circunstância faz ou não ocorrer. Por exemplo, "opcionalmente contém regiões variáveis da cadeia pesada de 1-3 anticorpos "significa a região variável da cadeia pesada de anticorpos com uma sequência específica pode estar, mas não precisa estar, presente.

[0094] "Composição farmacêutica" refere-se a uma mistura contendo um ou mais compostos, de acordo com a presente revelação, ou um sal ou profármaco fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável ou do mesmo e outros componentes químicos, como veículos e excipientes — fisiologicamente/farmaceuticamente —* aceitáveis. A composição farmacêutica visa promover a administração a um organismo, facilitando a absorção do ingrediente ativo e, assim, exercendo um efeito biológico.

[0095] Além disso, a presente revelação inclui um agente para o tratamento de doenças associadas com a |L-5 e o agente compreende o anticorpo monoclonal da presente revelação ou fragmento de anticorpo do mesmo como um ingrediente ativo.

[0096] Não há limitação para as doenças associadas com a IL-5, contanto que elas estejam associadas com a IL-5. Por exemplo, as respostas terapêuticas induzidas pelas moléculas da presente revelação podem ser geradas pela ligação a IL-5 humana e, por conseguinte, reprimir ou inibir a estimulação induzida por eosinófilos. Sendo assim, quando nas preparações e formulações adequadas para aplicações terapêuticas, as moléculas da presente revelação são muito úteis para pessoas que sofrem de respostas alérgicas e/ou atópicas ou respostas associadas com eosinófilos, por exemplo, mas não estão limitadas a, asma, ataque maligno de asma, pneumonia crônica, rinite alérgica, aspergilose broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatite atópica, dermatite oncocercose, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenterite eosinofílica, infecção por helmintos, doença de Hodgkin, pólipos nasais, síndrome de Loeffler, urticária, bronquite hiperplásica eosinofílica, arterite nodular, sinusite, esofagite eosinofílica, esofagite eosinofílica alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite oncocercose, endometriose e bronquite eosinofílica dependente de esteroides, e similares. Em uma modalidade preferencial, esse tratamento inibe ou reduz a infiltração de eosinófilos no tecido pulmonar. Os anticorpos ou fragmento do mesmo podem ser administrados a partir de três vezes por dia para uma vez a cada seis meses, e pode ser administrada por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral ou tópica.

[0097] Além disso, a presente revelação refere-se a um método de imunodetecção ou imunoensaio da IL-5, reagentes para imunodetecção ou imunoensaio da IL-5, uma imunodetecção ou imunoensaio de células expressando a IL-5, e um agente de diagnóstico para diagnosticar uma doença associada com a |L-5, que compreende o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao anticorpo da presente revelação especificamente reconhecendo a IL-5 humana e se ligando à sequência de aminoácidos da região extracelular ou da estrutura tridimensional como um ingrediente ativo.

[0098] Na presente revelação, o método de detectar ou determinar a quantidade de IL-5 pode ser qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, isso inclui imunodetecção ou imunoensaio.

[0099] A imunodetecção ou o imunoensaio é um método para detectar ou determinar a quantidade de um anticorpo ou de um antígeno usando um antígeno ou anticorpo rotulado. Exemplos de imunodetecção ou imunoensaio incluem método de anticorpos imunológicos de rotulagem de substâncias radioativas (RIA), ensaio imunoenzimático (EIA ou ELISA), imunoensaio fluorescente (FIA), imunoensaio luminescente, Western Blotting, ensaios físico-químicos, e similares.

[0100] As doenças acima associadas com a I|L-5 podem ser diagnosticadas através da detecção ou determinação das células expressando a IL-5 com o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo da presente revelação.

[0101] A fim de detectar as células expressando o polipeptídeo, um imunoensaio — conhecido pode ser usado, de preferência, imunoprecipitação, coloração de células fluorescentes, coloração imunoistoquímica, e similares são usados. Além disso, um método de coloração com anticorpos fluorescentes com o sistema FMAT8100HTS (Applied Biosystem), e similares pode ser usado.

[0102] Na presente revelação, uma amostra viva usada para detectar ou determinar a IL-5 não é particularmente limitada, contanto que seja susceptível de conter células expressando a IL-5, por exemplo, células de tecidos, sangue, plasma, soro, fluido pancreático, urina, fezes, fluidos de tecidos ou meio de cultura podem ser usados.

[0103] O agente de diagnóstico compreendendo o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo do mesmo da presente revelação pode compreender ainda um agente para realizar a reação antígeno- anticorpo ou um agente de detecção da reação, dependendo do método de diagnóstico desejado. O agente para realizar a reação antígeno- anticorpo inclui tais como tampão e sais. O agente para detecção da reação inclui reagentes comumente usados no método de imunodetecção ou imunoensaio, por exemplo, como um anticorpo secundário rotulado reconhecendo o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo do mesmo ou conjugado compreendendo o mesmo, e um substrato correspondente aos rótulos.

2. Exemplos e Exemplos de Teste

[0104] Os exemplos a seguir são fornecidos para descrever ainda a presente revelação, mas não são destinados a limitar o escopo da revelação. Métodos experimentais para as condições específicas que não são especificamente indicadas geralmente são realizados de acordo com as condições convencionais, ver Molecular Cloning, Laboratory Manual of antibody technology, Cold Spring Harbor Laboratory; ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante dos materiais ou produtos. Reagentes para os quais as fontes não são especificamente indicadas são reagentes comercialmente disponíveis. Exemplo 1. Preparação de antígenos de IL-5 e proteínas para detecção Design e expressão do antígeno de IL-5

[0105] As sequências codificando a IL-5 humana marcadas com His, IL-5 do macaco Rhesus, IL-5 de camundongo, IL-5 de rato ou domínio extracelular do receptor de IL-5Ra humana fundido ao fragmento Fc de IgG1 humana foram inseridos no vetor phr para construir os plasmídeos de expressão, os quais foram, em seguida, transfectados em HEK293. No dia 6 após a transfecção, as amostras foram centrifugadas a 4500 rpm por 10 min e os sobrenadantes de células foram coletados. O sobrenadante contendo IL-5 recombinante ou proteína receptora de IL-5a foi purificada através de coluna de níquel, e a proteína de fusão IL-5-Fc humana recombinante foi purificada usando coluna de cromatografia de afinidade de proteína A. A proteína purificada pode ser usada nos exemplos a seguir. A sequências de proteínas do antígeno são mostradas como segue:

[0106] 1. Sequência de aminoácidos da IL-5 humana com marcador His (rhIL-5-his)

MRMLLHLSLLALGAAY VYAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPV HKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLEKNLSLIKKYIDGOKKKCGEERRR VNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIESHHHHHH

[0107] Observação: O texto em itálico mostra o marcador His6

[0108] SEQ ID Nº:1

[0109] 2. Sequência de aminoácidos da IL-5 do Macaco Cynomolgus com o marcador His

MRMLLHLSLLALGAAY VYAIPTEIPASALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPV HKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIGGOKKKCGEERRR

VNQFLDYLQEFLGVMNTEWIESHHHHHH SEQ ID NO: 2

[0110] Observação: O texto em itálico mostra o marcador His6

[0111] 3. Sequência de aminoácidos da IL-5 de camundongo com o marcador His

MEIPMSTVVKETLTOLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFOGLDILKN QTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDROKEKCGEERRRTROFLDYLQEFLGVMSTE

WAMEGHHHHHH SEQ ID NO: 3

[0112] Observação: O texto em itálico mostra o marcador His6

[0113] 4. Sequência de aminoácidos da IL-5 de rato com o marcador His

MEIPMSTVVKETLIQLSTHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKN QTVRGGTVEILFONLSLIKKYIDGOKEKCGEERRKTRHFLDYLQEFLGVMSTEW

AMEVHHHHHH SEQ ID NO: 4

[0114] Observação: O texto em itálico mostra o marcador His6

[0115] 5. Sequência de aminoácidos do receptor |L-5a humana fundida ao fragmento Fc humano

DLLPDEKISLLPPVNETIKVTGLAQVLLOWKPNPDOEORNVNLEYQVKINAPKE DDYETRITESKCVTILHKGESASVRTILONDHSLLASSWASAELHAPPGSPGTSIV NLICTINTTEDNYSRLRSYOVSLHCTWLVGTDAPEDTOYFLYYRYGSWTEEÇO EYSKDTLGRNIACWEFPRTFILSKGRDWLAVLVNGSSKHSAIRPEDQLFALHAIDO INPPLNVTAEIEGTRLSIQWEKPVSAFPIHCEDYEVKIHNTRNGYLOIEKLMTNAE ISIDDLSKYDVOVRAAVSSMCREAGLWSEWSQOPIY VGNDEHKPLREWIEGRMD EPKSCDKTHTCPPCPAPELLIGGPSVELFPPKPKDTLIMISRTPEVTCVVVYDVSHEDPE VKFENWYVDGVEVHNAK TKPREFOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGO PENNYKTTPPVLDSDGSFIFLYSKLTVDKSRWOQGNVEFSCSVYMHEALHNHYTOKSLSL

SPGK SEO ID NO: 5

[0116] Observação: O texto em itálico mostra o marcador Fc humano. Exemplo 2: Construção e identificação do receptor IL-5a recombinante e linhagens celulares do receptor IL-5a/B

[0117] Para triagem de anticorpos funcionais, a presente revelação construí uma linhagem celular de CHO-S/IL-5a expressando IL-5a e uma linhagem celular de CHO-S/IL-5a/IL-5B expressando ambas IL-5a e IL-5B.

[0118] Especificamente, o gene da 1l-5a humana de comprimento completo (Q01344) foi clonado em um vetor de expressão de células de mamíferos, pTargeT, e o plasmídeo linearizado foi transfectado em células CHO-S através de eletroporação. A triagem foi realizada sob G418 por 2 semanas, seguido por duas rodadas de diluições limitantes. O gene IL-5a expressado na superfície celular foi detectado por FACS, linhagens celulares CHO-S/IL-5a, com alto nível de expressão de IL-5a e foram selecionadas e transfectadas na pcDNA3.1-IL-568 linearizada através da eletroporação. A triagem foi realizada com G418 e zeocina por 2 semanas, seguida por duas rodadas de diluições limitantes. O gene de IL-5a e IL-5B expressados na superfície da célula foram detectados por FACS, e as linhagens celulares de CHO-S/IL-50/ IL-5B com elevada expressão de IL-Sa e IL-5B foram selecionadas. Exemplo 3: Preparação do anticorpo monocilonal murino da IL-5 anti-humana

[0119] Dois grupos de camundongos Balb/c (5 camundongos /Igrupo) e quatro grupos de camundongos SJL (5 camundongos /grupo) foram imunizados com a proteína recombinante rhlL-5-his e adjuvante de Freund CFA (Sigma, LotttSLBQ1109V); ou com IFA (Sigma, LotetSLBJ2845V) em duas doses de 100g/50g/50g (grupo de alta dose) e de 259/12,5 9g/12,59 (grupo de baixa dose), respectivamente. A resposta imune específica para |L-5 foi determinada por titulação sérica de detecção por ELISA, ensaio de bloqueio do ligante-receptor e ensaio de inibição da proliferação de TF-1. Camundongos com melhor resposta imune específica foram selecionados, sacrificados, as células do baço foram coletadas e fundidas com células do mieloma.

[0120] A triagem primária foi realizada usando um ensaio de ligação

ELISA contra a IL-5 humana. As células do hibridoma foram transferidas para placas de 24 poços, e os sobrenadantes foram triadas novamente por ensaio de ligação ELISA contra IL-5 humana, de cynomolgus, ou de camundongo por ensaio de bloqueio baseado em ELISA contra o receptor de IL-5 e ensaio de inibição da proliferação de TF-1. Após essa triagem, os clones positivos obtidos foram submetidos a duas rodadas de subclonagem para obter clones de hibridomas para produção de anticorpos. Os anticorpos obtidos foram purificados por cromatografia de afinidade.

[0121] Os anticorpos purificados foram submetidos aos seguintes testes: SEC-HPLC, detecção de teor de endotoxina, ensaio Biacore para afinidade com várias IL-5, ensaio de bloqueio baseado em FACS contra o receptor da IL-5 e ensaio de inibição da proliferação de TF-1, teste de aderência de eosinófilos, e avaliação de eficácia em modelo de asma do camundongo e modelo de neutralização de cobaia in vivo. As linhagens celulares de hibridoma monoclonal mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 e mAb1779 foram selecionadas por suas excelentes atividades in vitro e in vivo.

[0122] As sequências foram clonadas de hibridoma positivo como segue. As células de hibridomas em fase de crescimento logarítmico foram coletadas, RNAs foram extraídos com Trizol (Invitrogen, Cat No. 15596-018) de acordo com as instruções do fabricante ou kit, e a transcrição reversa foi realizada com kit de transcriptase reversa PrimeScriptTM (Takara, Cat Nº. 2680A). Os cDNAs obtidos por transcrição reversa foram submetidos à amplificação por PCR usando o conjunto de Ig-Primer de camundongo (Novagen, TB326 Rev. B 0503) e os produtos resultantes foram sequenciados. As sequências de aminoácidos correspondentes a sequências de DNA das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do mMAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 e mAb1779 foram obtidas (os resíduos de aminoácidos das

CDRs de VH/VL foram determinados e anotados pelo sistema de numeração de Kabat):

[0123] sequência da região variável da cadeia pesada murina mAb1705

EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSHYYMAW VROQAPKKGLEW VTSISY EGDITY YGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQOMNSLRSEDTATYYCASQTLRESFDY

WGQOGVMVTVSS SEQ ID NO: 6

[0124] sequência da região variável de cadeia leve murina mMAb1705

DIQMTQOSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKIARSPKLVIYGTS NLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDTGIYFCLODKEFPRTFGGGTRLE

LK SEQ ID NO: 7

[0125] sequência da região variável da cadeia pesada murina mMAb1706

EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHY YMAW VROAPKKGLEW VTSINY EGNSAY YGDS VKGREFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATY YCATETLRESLDY

WGQOGVMVTVSS SEQ ID NO: 8

[0126] sequência da região variável de cadeia leve murina mAb1706

DIQMTQOSPSSMSVSLGDRVTITCRASODIGNYLSWYQQKLGKSPKLMIHSA SNLEVGVPSRFSGSRSGSDYSLTINTLESEDPGIYFCLQOHKQFPRTFGGGTKL

ELK SEQ ID NO: 9

[0127] sequência da região variável da cadeia pesada murina mAb1780

QVKLLOSGAALVKPGDSVKMSCKASDYTFTEYLIHWVYKQSQGRSLEWIGYINP YSGGTVYNEKFKSKATLTVDKFSSTAYMEFRRLTFEDSAIY YCARDGGYSDPLD

YWGQGVMVTVSS SEQ ID NO: 10

[0128] sequência da região variável de cadeia leve murina mAb1780

DTVLTQSPALAVSPGERVSISCRASEGLTSYMHWYQQKPGQOQPKLLIYKASNLA

SGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDAATYFCQQNWNDPWTFGGGTKLELK SEQ ID NO: 11

[0129] sequência da região variável da cadeia pesada murina mMAb1773

EVQOLQOQOSLAELVRPGASVTLSCTASGFNIKNTYIHW VKQRPEQGLEWIGRIDPA NGDTKHGPKFOGK ATITADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAIY YCFRYGIYPDHWGQG

TPLIVSS SEQ ID NO: 12

[0130] sequência da região variável de cadeia leve murina mMAb1773

QIVLTOSPALMSASPGEK VIMTCSASSSVNYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTATLAS

GVPARFSGSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWNSYPYTFGGGTKLEIE SEQ ID NO: 13 sequência da região variável da cadeia pesada murina mAb1779

QVKLLQOSGAALVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYFNP NSGGSNYNENFKRKATLTADKSSSTAY LEFSRVTSEDSAIY YCGRRIAWDHW YF

DEWGPGTMVTVSS SEQ ID NO: 14

[0131] sequência da região variável da cadeia leve murina mMAb1779

DIQMTQOSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDVAWYQQKSGRSPOLLVYAASRLO

DGVPSRFSGSGSGTRYFFKISGMQOPEDEADY FCOQGYK TPLTFGSGTKLEIK SEQ ID NO: 15

[0132] As sequências de CDR da pesada cadeia e leve de cada anticorpo são mostradas na Tabela 1. Tabela 1. Sequências de CDR da cadeia pesada e leve de cada anticorpo a Bial POR Ea mMAb1705 | HCDRI1 LCDR1 SEQ ID Nº: 16 SEQ ID Nº: 19

SISYEGDITYYGDSVKG GTSNLEV HCDR2 LCDR2 SEQ ID Nº: 17 SEQ ID Nº: 20

QTLRESFDY LQDKEFPRT HCDR3 LCDR3 SEQ ID Nº: 18 SEQ ID Nº: 21

HYYMA RASQDIGNYLS HCDR1 LCDR1 SEQ ID Nº: 22 SEQ ID Nº: 25

SINYEGNSAYYGDSVKG SASNLEV mAb1706 | HCDR2 LCDR2 SEQ ID Nº: 23 SEQ ID Nº: 26

ETLRESLDY LQHKQFPRT HCDR3 LCDR3 SEQ ID Nº: 24 SEQ ID Nº: 27

EYLIH RASEGLTSYMH HCDR1 LCDR1 SEQ ID Nº: 28 SEQ ID Nº: 31

YINPYSGGTVYNEKFKS KASNLAS mAb1780 | HCDR2 LCDR2 SEQ ID Nº: 29 SEQ ID Nº: 32

DGGYSDPLDY QQNWNDPWT HCDR3 LCDR3 SEQ ID Nº: 30 SEQ ID Nº: 33

NTYIH SASSSVNYIY HCDR1 LCDR1 SEQ ID Nº: 34 SEQ ID Nº: 37

RIDPANGDTKHGPKFQG LTATLAS mAb1773 | HCDR2 LCDR2 SEQ ID Nº: 35 SEQ ID Nº: 38

YGIYPDH QQWNSYPYT HCDR3 LCDR3 SEQ ID Nº: 36 SEQ ID Nº: 39

DYIIH LASEGISNDVA HCDR1 LCDR1 SEQ ID Nº: 40 SEQ ID Nº: 43

YFNPNSGGSNYNENFKR AASRLQD mAb1779 | HCDR2 LCDR2 SEQ ID Nº: 41 SEQ ID Nº: 44

RIAWDHWYFDF QQGYKTPLT HCDR3 LCDR3 SEQ ID Nº: 42 SEQ ID Nº: 45

[0133] Os resultados das atividades do ensaio Biacore são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Atividade in vitro do anticorpo murino da IL-5 Anticorpo Afinidade a HulL-5 (KD (M))

[0134] Os resultados mostram que os anticorpos murinos da presente revelação têm alta afinidade ao antígeno. Exemplo 4: Purificação de proteínas recombinantes relacionadas a IL-5 e purificação de anticorpos de hibridomas e anticorpos recombinantes

[0135] 4.1 Etapas para purificação de proteínas recombinantes IL- 5-Flag-His:

[0136] As amostras foram centrifugadas a alta velocidade para remover impurezas e concentradas para volume adequado. A coluna de afinidade NI-NTA (QIAGEN, Cat No. 30721) foi equilibrada com PBS e lavada com 2-5 volumes de coluna. Os sobrenadantes expressados na célula sem impurezas foram carregados para a coluna, que foi, em seguida, lavada com PBS até que a leitura A280 tivesse caído para a linha de base. Em seguida a coluna foi lavada com PBS para remover a proteína impura. A proteína de interesse foi eluída com tampão de lavagem (20 mM de imidazol) e, então, tampão de eluição (300 mM de imidazol), e o pico eluído foi coletado.

[0137] O eluído coletado foi posteriormente purificado pela troca iônica (coluna Hiload 16/600 superdex 200). A coluna foi equilibrada,

com cerca de 2 volumes de coluna de PBS para garantir o pH de 7,4. O tampão de eluição contendo a proteína de interesse foi concentrado e carregado para a coluna para purificação subsequente. As amostras foram coletadas, identificadas por SDS-PAGE e LC-MS e, em seguida, aliquotadas para uso.

4.2. Purificação de anticorpo expressado por hibridoma e proteínas de fusão Fc

[0138] A amostras de sobrenadante expressado na célula foram centrifugadas a alta velocidade para remover as impurezas e, em seguida, sobrenadantes expressados no hibridoma foram purificados usando coluna de proteína G, a proteína de fusão Fc expressando sobrenadantes foram purificados usando coluna de proteína A. À coluna foi lavada com PBS até que a leitura de A280 tivesse caído para a linha de base. As proteínas de interesse foram eluídas com 100 mM de ácido acético, pH 3,0 e neutralizada com 1 M de Tris-HCI, pH 8,0. As amostras eluídos foram adequadamente concentradas e purificadas ainda por cromatografia em gel Superdex 200 (GE) pré- equilibrada com PBS. Os picos privados de agregados foram coletados e aliquotados para uso. Exemplo 5: Design de humanização de anticorpos monocilonais da IL-5 anti-chumana

[0139] Humanização de anticorpos monoclonais da 1IL-5 anti- humana e murino foi realizada conforme revelado em literaturas na técnica. Resumidamente, as regiões constantes de anticorpos murinos foram substituídas por regiões constantes humanas, as CDRs de anticorpos murinos foram enxertadas sobre o modelo humano compartilhando a maior homologia de FR, e alguns resíduos de aminoácidos na região FR, que têm efeito chave na manutenção da conformação de anticorpos e afetando a ligação do anticorpo ao antígeno, foram retromutadas.

[0140] Alinhando ao banco de dados de genes da linhagem germinativa da região variável de cadeia pesada e leve de anticorpos humanos IMGT, os genes da região variável da cadeia pesada e leve da linhagem germinativa humana que têm alta identidade para sequência de aminoácidos dos anticorpos mMAb-1705, mAb-1706, mMAb1780, mAb1773 e mAb1779 foram selecionados como modelos, respectivamente. As CDRs destes anticorpos murinos foram separadamente enxertadas sobre os modelos correspondentes derivados humanos para formar uma sequência de região variável na ordem de FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Os resíduos de aminoácidos foram determinados e anotados pelo sistema de numeração de Kabat.

Seleção da região FR humana e retromutação de aminoácidos- chave

[0141] Com base na estrutura típica da CDR VH/VL do anticorpo murino obtido, as sequências homólogas de região variável da cadeia leve (VL) e da região variável da cadeia pesada (VH) foram selecionadas a partir do banco de dados da linha germinativa humana. As sequências VH e VL da linhagem germinativa humana resultantes foram classificadas de alta a baixa, com base na homologia FR, as sequências da linhagem germinativa com a maior homologia FR foram selecionadas como principais modelos. As CDRs dos anticorpos murinos foram enxertadas sobre os modelos humanos. E, então, usando o software e baseadas na estrutura tridimensional dos anticorpos murinos, os resíduos embebidos, resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR, e os resíduos que tenham efeitos significativos sobre a conformação da LV e VH foram sujeitos a retromutações. Além disso, os resíduos de aminoácidos quimicamente instáveis foram otimizados para produzir moléculas humanizadas finais.

5.1 Seleção da estrutura humanizada para o clone de hibridoma mAb1705

[0142] IGHV3-23*04 foi selecionado como o modelo para h1705 VH e IGKV1-12*01 foi selecionado como o modelo para VL. As CDRs do mMAb1705 murino foram enxertadas sobre os modelos humanos. Os resíduos embebidos e os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR foram encontrados pelo software e foram submetidos a retromutação. As regiões variáveis da pesada cadeia e leve dos anticorpos humanizados são mostradas na Tabela 3. Tabela 3. Seleção de modelo e design da retromutação para h1705 h1705 VL.1B h1705 VH.1B | S49T, V93T, K98S T69S, F71Y,Y87F

[0143] Observação: "Enxertada" significa as CDRs do anticorpo murino foram enxertadas na sequência da região FR da linhagem germinativa humana. Por exemplo, A438 indica que A na posição 43 da sequência enxertada foi retromutada para S, de acordo com a numeração de sequência natural da sequência de aminoácidos. Tabela 4. Combinação da região variável da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo humanizado h1705 | h1705 VH.1 | h1705 VH.1A h1705 VH.1B h1705 VL.1 h1705-003 h1705-004 h1705-005 h1705 VL.1A | h1705-006 h1705-007 h1705-008 h1705 VL.1B | h1705-009 h1705-010 h1705-011

[0144] Observação: Esta tabela mostra sequências obtidas pela combinação de várias variantes. Por exemplo, h1705-007 indica que o anticorpo murino humanizado h1705-007 compreende duas variantes, ou seja, h1705 VL.1A de cadeia leve e h1705 VH.1A de cadeia pesada, e assim por diante.

[0145] A sequência específica de regiões variáveis de anticorpo humanizado h1705 são as seguintes: > h1705 VL.1 (SEQ ID Nº: 46)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKAPKLLIYGTSNL

EVGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLODKEFPRTFGGGTK VEIK > h1705 VL.1A (SEQ ID Nº: 47)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLE

VGVPSRESGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLODKEFPRTFGGGTK VEIK > h1705 VL.1B (SEQ ID Nº: 48)

DIQMTQOSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLVIYGTSNLE

VGVPSRFSGSRSGSDY TLTISSLQOPEDFATYFCLQDK EFPRTFGGGTK VEIK > h1705 VH.1 (SEQ ID Nº: 49)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAW VROAPGKGLEW VSSISY EGDITY YGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTLRESFDY

WGQOGTLVTVSS > h1705 VH.1A (SEQ ID Nº: 50)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFESHY YMAW VRQAPGKGLEWVSSISY EGDITY YGDS VKGRETISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCASQTLRESFDY

WGQGTLVTVSS > h1705 VH.1B (SEQ ID Nº: 51)

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFESHYYMAW VROAPGKGLEW VTSISY EGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDY WGQGTLVTVSS

[0146] Cada uma das regiões variáveis da cadeia leve acima foi combinada com região constante da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53 para formar as sequências da cadeia leve intacta final. Cada região variável da cadeia pesada foi combinada com as regiões constantes da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52 para formar as sequências de cadeia pesada final.

[0147] Sequência de região constante do anticorpo humanizado

[0148] > Região constante da IgG1 da cadeia pesada:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVYDKK VEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVYVDVSHEDPEVKENWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGEYPSDIA VEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO

KSLSLSPGK SEQ ID NO: 52

[0149] Observação: O texto sublinhado representa a mutação desenhada de M252Y, S254T ou T256E.

[0150] > Região constante kappa da cadeia leve:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQE

SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 53

5.2 Seleção da estrutura humanizada para o clone de hibridoma mAb1706

[0151] IGHV3-23*04 foi selecionado como o modelo para h1706 VH e IGKV1-12*01 foi selecionado como o modelo para VL. As CDRs do mab1706 murino foram enxertadas sobre os modelos humanos. Os resíduos embebidos e os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR foram encontrados pelo software e foram submetidos a retromutação. As regiões variáveis da pesada cadeia e leve dos anticorpos humanizados são mostradas na Tabela 5. Tabela 5. Seleção de modelo e design da retromutação para h1706

[0152] Observação: "Enxertada" significa as CDRs do anticorpo murino foram enxertadas na região FR da linhagem germinativa humana. Por exemplo, A438 indica que A na posição 43 da sequência enxertada foi retromutada para S, de acordo com a numeração de sequência natural da sequência de aminoácidos. Tabela 6. Combinação da região variável da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo humanizado h1706 h1706 VH.1 | h1706 VH.1A | h1706 VH.1B h1706 VL.1 | h1706-002 h1706-003 h1706-004 h1706 VL.1A , h1706-005 h1706-006 h1706-007 h1706 VL.1B | h1706-008 h1706-009 h1706-010

[0153] As sequências específicas das regiões variáveis de anticorpo humanizado h1706 são mostradas como se segue: > h1706 VL.1 (SEQ ID Nº: 54)

DIQMTQOSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKAPKLLIYSASNLE

VGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATY YCLQHKQFPRTFGGGTK VEIK > h1706 VL.1A (SEQ ID Nº: 55)

DIQMTQOSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLLIYSASNLE

VGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCLQOHKQFPRTFGGGTK VEIK > h1706 VL.1B (SEQ ID Nº: 56)

DIQMTQOSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNL

EVGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFATYFCLOHKQFPRTFGGGTKVEIK > h1706 VH.1 (SEQ ID Nº: 57)

EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSHY YMAW VROAPGKGLEW VSSINY EGNSAY YGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQOMNSLRAEDTAVYYCAKETLRESLD

YWGQOGTMVTVSS > h1706 VH.1A (SEQ ID Nº: 58)

EVOLVESGGGLVQOPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAW VRQAPGKGLEW VSSINY EGNSAY YGDS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDY

WGQOGTMVTVSS > h1706 VH.1B (SEQ ID Nº: 59)

EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSHY YMAW VRQAPGKGLEW VTSINY EGNSAY YGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCATETLRESLDY WGQGTMVTVSS

[0154] Cada uma das regiões variáveis da cadeia leve acima foi combinada com região constante da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53 para formar as sequências da cadeia leve intacta final. Cada região variável da cadeia pesada foi combinada com as regiões constantes da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52 para formar as sequências de cadeia pesada final.

5.3 Seleção da estrutura humanizada para o clone de hibridoma mAb1780

[0155] IGHV1-2*02 foi selecionado como o modelo para h1780 VH e IGKV3-11*01 foi selecionado como o modelo para VL. As CDRs do mMAb1780 murino foram enxertadas sobre os modelos humanos. Os resíduos embebidos e os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR foram encontrados pelo software e foram submetidos a retromutação. As regiões variáveis da pesada cadeia e leve dos anticorpos humanizados são mostradas na Tabela 7. Tabela 7. Seleção de modelo e design da retromutação para h1780 VB4T, Y86F L83F oo eee eta R72V, T74K, L83F

[0156] Observação: "Enxertada" significa as CDRs do anticorpo murino foram enxertadas na região FR da linhagem germinativa humana. Por exemplo, E1D indica que E na posição 1 da sequência enxertada foi retromutado para D, de acordo com a numeração de sequência natural da sequência de aminoácidos. Tabela 8. Combinação da região variável da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo humanizado h1780 [rea Tosa [rrmncs [rrmaane |

[0157] As sequências específicas das regiões variáveis de anticorpo humanizado h1780 são mostradas como se segue: > h1780 VL.1 (SEQ ID Nº: 60)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLA SGIPA

RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV YYCQOQNWNDPWTFGGGTKVEIK > h1780 VL.1A (SEQ ID Nº: 61)

DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTS YMHWYQQKPGQOAPRLLIYVKASNL

ASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYY COQNWNDPWTFGGGTK VEIK > h1780 VL.1B (SEQ ID Nº: 62)

DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIVKASNL

ASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCOQNWNDPWTFGGGTK VEIK > h1780 VH.1 (SEQ ID Nº: 63)

EVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHW VRQAPGQGLEWMGYIN PYSGGTVYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPL DYWGQGTMVTVSS

> h1780 VH.1A (SEQ ID Nº: 64)

EVQLVOSGAEVKKPGASVK VSCKASGY TFTEYLIHW VRQOAPGQOGLEWMGYIN PYSGGTVYNEKFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPL

DYWGQGTMVTVSS > h1780 VH.1B (SEQ ID Nº: 65)

EVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTEYLIHW VRQAPGQOGLEWIGYTINP YSGGTVYNEKFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLD

YWGQGTMVTVSS > h1780 VH.1C (SEQ ID Nº: 66)

EVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTEYLIHW VKQAPGOGLEWIGYINP YSGGTVYNEKFKSKATLTVDKSISTAY MEESRLRSDDTAVY YCARDGGYSDPLD YWGQOGTMVTVSS

[0158] Cada uma das regiões variáveis da cadeia leve acima foi combinada com região constante da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53 para formar as sequências da cadeia leve intacta final. Cada região variável da cadeia pesada foi combinada com as regiões constantes da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52 para formar as sequências de cadeia pesada final.

5.4 Seleção da estrutura humanizada para o clone de hibridoma mAb1773

[0159] IGHV3-73*01 foi selecionado como o modelo para h1773 VH e IGKV1-39*01 foi selecionado como o modelo para VL. As CDRs do mMAb1773 murino foram enxertadas sobre os modelos humanos. Os resíduos embebidos e os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR foram encontrados pelo software e foram submetidos a retromutação. As regiões variáveis da pesada cadeia e leve dos anticorpos humanizados são mostradas na Tabela 9. Enquanto isso, a fim de eliminar os locais isomerizados nas regiões de CDR, N localizado em HCDR?2 (RIDPANGDTK HGPKFQG) de h1773 foi substituído por V (ou seja, N55V) para formar uma região variável da cadeia pesada e um anticorpo compreendendo a variante HCDR2 (a sequência de HCDR2 modificada é mostrada como SEQ ID Nº: 82: RIDPAVGDTKHGPKFQG). Tabela 9. Seleção de modelo e design da retromutação para h1773 h1773 VL h1773 VH MAL, A42S, F29I, R72A, T97F h1773 VL.1A h1773 VH1A L45P, L46W + N55V F291, R38K, V48], h1773 VH.1B | R72A, T97F + N55V

[0160] Observação: "Enxertada" significa as CDRs do anticorpo murino foram enxertadas na região FR da linhagem germinativa humana. Por exemplo, M4L indica que M na posição 4 da sequência enxertada foi retromutado para L, de acordo com a numeração de sequência natural da sequência de aminoácidos. Tabela 10. Combinação da região variável da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo humanizado h1773 h1773 VH.1 | h1773 VH.1A | h1773 VH.1B h1773 VL.1 | h1773-002 h1773-003 h1773-004 h1773 VL.1A | h1773-005 h1773-006 h1773-007

[0161] As sequências específicas das regiões variáveis de anticorpo humanizado h1773 são mostradas como se segue: > h1773 VL.1 (SEQ ID Nº: 67)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQOQOKPGKAPKLLIYLTATLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCOQWNSYPYTFGGGTKVEIK > h1773 VL.1A (SEQ ID Nº: 68)

DIQLTQSPSSLSAS VGDRVTITCSASSSVNYIYW YQQKPGKSPKPWIYLTATLASG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCOQWNSYPYTFGGGTK VEIK > h1773 VH.1 (SEQ ID Nº: 69)

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNTYIHWVRQASGKGLEW VGRIDP AVGDTKHGPKFQOGRFTISRDDSKNTAYLQOMNSLKTEDTAVYYCTRYGIYPDHW

GQOGTLVTVSS > h1773 VH.1A (SEQ ID Nº: 70)

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVRQASGKGLEW VGRIDPA VGDTKHGPKEQOGRFTISADDSKNTAY LOMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWG

QGTLVTVSS > h1773 VH.1B (SEQ ID Nº: 71)

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHW VKQASGKGLEWIGRIDPA VGDTKHGPKFQOGRFTISADDSKNTAYLQOMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWG QGTLVTVSS

[0162] Cada uma das regiões variáveis da cadeia leve acima foi combinada com região constante da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53 para formar as sequências da cadeia leve intacta final. Cada região variável da cadeia pesada foi combinada com as regiões constantes da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52 para formar as sequências de cadeia pesada final.

[0163] 5.5 Seleção da estrutura humanizada para o clone de hibridoma mAb1779

[0164] IGHV1-2*02 foi selecionado como o modelo para h1779 VH e IGKV1-33*01 foi selecionado como o modelo para VL. As CDRs do h1779 murino foram enxertadas sobre os modelos humanos. Os resíduos embebidos e os resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR foram encontrados pelo software e foram submetidos a retromutação. As regiões variáveis da pesada cadeia e leve dos anticorpos humanizados são mostradas na Tabela 11.

Tabela 11. Seleção de modelo e design da retromutação para h1779 h1779 VL h1779 VH h1779 VL.1 h1779 VH.1 | Enxertada + D89E h1779 VL.1A | A43S h1779 VH.1A | R72A, T74K + D89E A43S, h1779 VL.1B | 1M48V, h1779 VH.1B | M481, V68A, R72A, T74K + D89E F7IY M481, V68A, R72A, T74K, M81L, h1779 VH.1C 7 L83F + D89E R38K, M481, R67K, V68A, R72A, h1779 VH.1D T74K, M81L, L83F + D89E

[0165] Observação: "Enxertada" significa as CDRs do anticorpo murino foram enxertadas na região FR da linhagem germinativa humana. Por exemplo, A438 indica que A na posição 43 da sequência enxertada foi retromutada para S, de acordo com a numeração de sequência natural da sequência de aminoácidos.

[0166] As moléculas humanizadas desenhadas foram combinadas a várias moléculas, conforme indicado na Tabela 12.

[0167] Tabela 12. Combinação da região variável da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo humanizado h1779 [oras [eo [57 [me [rev]

[0168] As sequências específicas das regiões variáveis de anticorpo humanizado h1779 são mostradas como se segue:

> h1779 VL.1 (SEQ ID Nº: 72)

DIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQ DGVPS

RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATY YCQOQGYKTPLTFGQGTKLEIK > h1779 VL.1A (SEQ ID Nº: 73)

DIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCLASEGISNDVAWY QQKPGKSPKLLIYAASRLQ

DGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATY YCOQGYKTPLTFGQGTKLEIK > h1779 VL.1B (SEQ ID Nº: 74)

DIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCLASEGISNDVAWY QQKPGKSPKLLVYAASRLQ DGVPS

RFSGSGSGTDYTFTISSLQOPEDIATY YCOQGYKTPLTFGOGTKLEIK > h1779 VH.1 (SEQ ID Nº: 75)

EVQOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFN PNSGGSNYNENFKRRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHW

YFDFWGQGTMVTVSS > h1779 VH.1A (SEQ ID Nº: 76)

EVQOLVOSGAEVKKPGASVK VSCKASGY TFTDYTIHWYRQAPGQOGLEWMGYFN PNSGGSNYNENFKRRVTMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHW

YFDFWGQGTMVTVSS >h1779 VH.1B (SEQ ID Nº: 77)

EVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYTIHWYRQAPGQGLEWIGYFNP NSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAY MELSRLRSEDTAVY YCARRIAWDHW Y

FDFWGQGTMVTVSS >h1779 VH.1C (SEQ ID Nº: 78)

EVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQOGLEWIGYFNP NSGGSNYNENFKRRATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVY YCARRIAW DHW Y F

DFWGOGTMVTVSS >h1779 VH.1D (SEQ ID Nº: 79)

EVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYUIIHWVKQAPGQGLEWIGYFNP NSGGSNYNENFKRKATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYF DFWGQGTMVTVSS

[0169] Cada uma das regiões variáveis da cadeia leve acima foi combinada com região constante da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53 para formar as sequências da cadeia leve intacta final. Cada região variável da cadeia pesada foi combinada com as regiões constantes da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52 para formar as sequências de cadeia pesada final.

[0170] Enquanto isso, o anticorpo Hu39D10 contra a IL5 revelada em WO2012083370A1 foi usado como controle positivo na presente revelação, e a sequência da cadeia leve e pesada do mesmo é mostrada na SEQ ID Nº: 80 e SEQ ID Nº: 81, respectivamente.

[0171] Sequência da cadeia pesada de Hu39D10

EVQOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSNSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSN GDTDYNSAIKSRETISRDTSKSTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESK YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVYMHEALHNHY

TQOKSLSLSLGK SEQ ID NO: 80

[0172] Sequência da cadeia leve de Hu39D10

DIQMTOSPSSLSAS VGDRVTITCLASEGISSYLAWYQOOKPGKAPKLLIYGANSLO TGVPSRFESGSGSATDYTLTISSLOPEDFATY YCOOS YKFPNTEGOGTK VEVKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQOWKVDNALQOSGNSQESVT

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 81 Exemplo 6. Preparação de anticorpos quiméricos recombinantes e anticorpos humanizados

[0173] 1. Clonagem molecular de anticorpos quiméricos recombinantes

[0174] As moléculas de anticorpos positivos obtidas por triagem de hibridoma foram sequenciadas para obter as sequências de genes codificando as regiões variáveis. Os primers forward e reverse foram desenhados com base nas sequências obtidas, e o fragmento do gene VH/VK de cada anticorpo foi construído via PCR, usando a sequência do gene como modelo. O fragmento do gene VH/VK foi então submetido a recombinação homóloga com vetor de expressão pHr (compreendendo um peptídeo sinal e fragmento do gene da região constante hlgG1/hkappa (CH1-Fc/CL)) para construir um plasmídeo de expressão de comprimento completo do anticorpo quimérico recombinante VH-CH1-Fe-pHr/VL-CL-pHr para formar cinco anticorpos quiméricos de Ch1705, Ch1706, Ch1780, Ch1773 e Ch1779.

[0175] 2. Clonagem molecular de anticorpos humanizados

[0176] A otimização por códon foi realizada nas sequências de anticorpo humanizado desenhadas para gerar sequências de genes de codificação com o códon de preferência humano. Os primers de PCR foram desenhados para construir o fragmento do gene VH/VK de cada anticorpo e, então, o fragmento do gene VH/VK foi submetido a recombinação homóloga com vetor de expressão pHr (compreendendo um peptídeo sinal e fragmento do gene da região constante hlgG1/hkappa (CH1-Fc/CL)) para construir plasmídeo de expressão de comprimento completo do anticorpo humanizado VH-CH1-Fe-pHr/VL- CL-pHr.

[0177] 3. Expressão e purificação de anticorpos quiméricos recombinantes e anticorpos humanizados

[0178] O plasmídeo expressando a cadeia pesada ou leve de anticorpos foi transfectado em células HEK293E em uma razão de 1:1,2. Após 6 dias, os sobrenadantes de expressão foram coletados, centrifugados a alta velocidade para remover as impurezas, e purificados pela coluna de proteína A. A coluna foi lavada com PBS até que a leitura de A280 tivesse caído para a linha de base. A proteína de interesse foi eluída com tampão de eluição acídico, pH 3,0 a pH 3,5 e neutralizada com 1 M de Tris-HCl, pH 8,0 a 9,0. As amostras eluídas foram “adequadamente concentradas e purificadas ainda por cromatografia em gel Superdex 200 (GE) pré-equilibrada com PBS para remover os agregados. O pico do monômero foi coletado e aliquotado para uso.

[0179] O desempenho e os efeitos benéficos dos anticorpos na presente revelação foram verificados pelos seguintes métodos de ensaio. Avaliação in vitro da atividade biológica Exemplo de teste 1: Ligação de anticorpos IL-5 murinos para IL-5 de diferentes espécies por ensaio Biacore

[0180] A afinidade entre o teste de anticorpos murinos da IL-5 e da IL-5 humana foi determinada usando o instrumento Biacore T200 (GE).

[0181] Moléculas a serem testadas foram capturadas por afinidade por chip biossensor da proteína A e, em seguida, o antígeno (a IL5 recombinante humana, de macaco e de murino preparada no Exemplo 1) fluiu através da superfície do chip, e os sinais de reação foram detectados em tempo real usando instrumento Biacore T200 para obter ligação e curvas de dissociação. Depois que a dissociação de cada ciclo do experimento foi concluída, a chip biossensor foi lavado e regenerado com a solução de regeneração glicina-ácido clorídrico (pH 1,5). Os dados foram ajustados no modelo de Langmuir (1:1), usando o software BlAevaluation versão 4.1 da GE e os valores de afinidade foram obtidos como mostrado na Tabela 13. Tabela 13. Resultados da afinidade de anticorpos IL-5 murinos para IL- de diferentes espécies por ensaio BlAcore antígeno Kp (M) macaco

[0182] Este exemplo demonstra que todos os anticorpos mAb 1705, mAb 1706, mAb 1780, mAb 1773 e mAb 1779 da presente revelação têm alta afinidade para I|L-5 de diferentes espécies (humana, de macaco). Exemplo de teste 2: Afinidade de anticorpos IL-5 humanizados para IL-5 de diferentes espécies por ensaio Biacore

[0183] A afinidade entre o teste de anticorpos IL-5 humanizados e IL-5 humana foi determinada usando o instrumento Biacore T200 (GE).

[0184] Moléculas a serem testadas foram capturadas por afinidade por chip biossensor da proteína A e, em seguida, o antígeno (preparado no Exemplo 1) fluiu através da superfície do chip, e os sinais de reação foram detectados em tempo real usando instrumento Biacore T200 para obter ligação e curvas de dissociação. Depois que a dissociação de cada ciclo do experimento foi concluída, a chip biossensor foi lavado e regenerado com a solução de regeneração glicina-ácido clorídrico (pH 1,5). Os dados foram ajustados no modelo de Langmuir (1:1), usando o software BlAevaluation versão 4.1 da GE e os valores de afinidade foram obtidos como mostrado na Tabela 14. Tabela 14. Resultados da afinidade de anticorpos IL-5 humanizados para IL-5 humana por ensaio BlAcore os | e DC DO os [es [| [|

A E RS

[0185] Os resultados mostram que os anticorpos |L-5 humanizada ainda têm alta afinidade para a I|L-5 humana (como variantes humanizadas para de outros anticorpos murinos, somente os dados exemplares foram fornecidos, exceto para cada variante humanizada de h1705).

Exemplo de teste 3: Anticorpos murinos da IL-5 bloqueiam a ligação entre a IL-5 e o receptor IL-5a por ensaio ELISA

[0186] Para demonstrar a capacidade dos anticorpos I|L-5 prevenir a ligação da IL-5 à região extracelular da proteína receptora de IL-5a expressada de forma recombinante, a placa de ELISA foi revestida com IL-5 (5 ug/ml em PBS), incubada a 37ºC durante 1 hora, o líquido foi descartado e, em seguida, solução de bloqueio a 5% de leite desnatado diluído com PBS foi adicionada a 200 ul/poço, e bloqueado a 37ºC por 2,5 horas em uma incubadora. Após o bloqueio terminar, a solução de bloqueio foi descartada, a placa foi lavada 5 vezes com tampão PBST (PBS contendo 0,05% de Tween-20, pH 7,4), 25 ul de 10 ug/ml de IL- 5Ra (em 1% BSA) que foi identificada com o kit de rotulagem de biotina (Dojindo Chemical, LKO3) foi adicionada, e, em seguida, 25 ul de anticorpo diluído de gradiente que competiu com a IL-5Ra para ligação a IL-5 foi adicionado, e incubado a 37ºC por uma hora. Após a incubação, a solução de reação na placa foi descartada, a placa foi lavada 5 vezes com PBST, polímero de estreptavidina-peroxidase (Sigma, S2438-250UG) diluída a 1:600 com solução de diluição da amostra foi adicionada a 50 ul/poço, e incubada a 37ºC por uma hora. Depois de lavar a placa com PBST por 5 vezes, 50 ul/poço de substrato cromogênico TMB (KPL, 52-00-03) foi adicionado, incubado a temperatura ambiente por 3 a 10 min e 50 ul/poço 1 M H2SO4 foi adicionado para parar a reação. Os valores de absorvância foram lidos a 450 nm com leitor de microplacas NOVOStar. Os valores de IC50 para os anticorpos IL-5 para bloquear a ligação entre a IL-5 e IL-5Ra/B foram calculados. Os resultados são apresentados na Tabela 15, ambos os anticorpos da presente revelação podem efetivamente inibir a ligação da IL-5 ao seu receptor. Tabela 15. Resultados de anticorpos murinos da IL-5 para bloquear a ligação entre a IL-5 e o receptor IL-5a por ELISA Co mens] memo] [enem | oe | om Exemplo de teste 4: Anticorpos IL-5 bloqueiam a ligação entre a IL- e o receptor IL-5 por FACS

[0187] Para identificar os anticorpos IL-5 resultantes que podem bloquear o receptor de I|L-5 na superfície celular, construiu-se a linhagem celular recombinante CHOS, que expressa altamente ambos os receptores de IL-5Ra/B. Este experimento identificou que os anticorpos IL-5 podem prevenir a ligação da I|L-5 ao receptor IL-5a/B recombinante sobre a superfície da linhagem celular CHOS, respectivamente.

[0188] Método em particular: CHO-S-IL-5Ra e B foram cultivadas com CD-CHO contendo 100 ng/ml G418 e 25 ng/ml zeozina, e a concentração durante a cultura de células não era nada mais do que 3 x 108º células/ml. As células IL-SRa/B-CHOS em boa condição foram centrifugadas (1000 rpm, 5 min), lavadas uma vez com FBS a 10% em PBS, contadas, a concentração de células foi ajustada para 4 x 10º células/ml, e 25 ul destas foram adicionados a placa de 96 poços de fundo redondo. Anticorpos a serem testados foram diluídos em solução de PBS contendo FBS a 10%, com uma concentração inicial de 200 ug/ml, e 8 gradientes foram obtidos por diluição 1:10. 25 ul de 100 ng/ml IL-5 rotulada com kit de rotulagem de biotina (Dojindo Chemical, LKO3), foi uniformemente misturado com 50 ul de cada anticorpo diluído, adicionado à placa de 96 poços para que as células fossem adicionadas e incubadas a 4ºC por uma hora. Após a incubação, centrifugado a 4º C (400 g, 5 min), o sobrenadante foi descartado, centrifugado e lavado com 200 ul de PBS pré-arrefecido, repetido duas vezes; anticorpo secundário de PE-avidina diluído a 1:1333 foi adicionado e incubado no escuro a 40ºC por 40 min, o sobrenadante foi descartado depois de ser centrifugado a 4ºC (400g, 5min), 200 ul de PBS pré-arrefecido foi adicionado, as células foram dissociadas, centrifugadas e lavadas a 4ºC, repetido três vezes, e 100 ul de PBS foi adicionado. A placa foi lida no instrumento, e os valores de IC50 para anticorpos IL-5 para bloquear a ligação entre a IL-5 e IL-5Ra/B foram calculados com base nos valores de sinal de fluorescência. Os resultados são mostrados nas Tabelas 16 e Figura 1. Tabela 16. Resultados de anticorpos IL-5 para bloquear a ligação entre a IL-5 e IL-5Ro/B [morm fom fm us fm de 1 Tas

[0189] Os resultados mostram que os anticorpos h1705-008, h1706-009, h1780-017, h1773-007 e h1779-014 demonstraram maior capacidade de bloquear a ligação de IL-5 ao receptor de |L-5 na superfície celular. Exemplo de teste 5: Anticorpos IL-5 inibem a proliferação induzida por IL-5 de células TF1

[0190] A IL-5 pode induzir a proliferação de células TF-1, e anticorpos |L-5 podem impedir a IL-5 de estimular a proliferação de células TF-1.

[0191] Especificamente, as células TF-1 (ATCC, CRL-2003) foram cultivadas em RPMI1640 contendo FBS a 10% e 2 ng/ml rhnGM-CSF (Lianke Bio, Catalog No. 96-AF-300-03-20), incubadas em estufa a 37ºC, CO2 a 5%, com a densidade celular de não mais de 1 x 10º células/ml. Para a detecção dos anticorpos, as células estando em fase de crescimento logarítmico foram lavadas três vezes com PBS por centrifugação a 800 rpm por 5 min, e a densidade celular foi ajustada para 6000 células/poço/90/Ul com RPMI1I640 (FBS: 2%, a |IL-5 recombinante humana: 10 ng/ml). 10 ul de diluições de gradiente de anticorpos a serem testadas foram adicionados a placa de 96 poços e cultivadas por 3 dias. 30 ul de titulação da célula foram adicionados e misturados. Os valores de IC50 foram calculados com base na leitura. Os resultados são mostrados na Tabela 17 abaixo. Tabela 17. Resultados dos anticorpos humanizados da IL-5 inibem a proliferação induzida por IL-5 de células TF1 h1705-008 h1706-009 0,25 | h1705-011 h1780-017 | 0,16 Exemplo de teste 6: Anticorpos de IL5 inibem a aderência de eosinófilos induzida por IL5

[0192] A IL5 pode induzir a diferenciação, maturação, migração e ativação de eosinófilos, causar inflamação respiratória e levar à asma. De acordo com o princípio de que a citocina da IL-5, pode promover a aderência de eosinófilos e ativar eosinófilos, neste exemplo de teste, os efeitos dos anticorpos específicos da IL-5 no bloqueio da via mediada pela IL-5 foram determinados através da coleta e purificação de eosinófilos do sangue periférico humano, e detectando in vitro os efeitos dos anticorpos IL-5 no bloqueio da aderência de eosinófilos mediada por IL5.

[0193] Especificamente, o sangue periférico humano foi diluído 5 vezes com PBS contendo 2 mM EDTA, monócitos e granulócitos foram separados por PercolITM (com gradiente de densidade de 1,088), a camada de eritrócitos contendo granulócitos foi cuidadosamente aspirada, e os eritrócitos foram removidos com tampão de lise de células vermelhas do sangue. As células restantes foram contadas, separação de esferas magnéticas revestidas com anticorpo CD16 humano (Miltenyi, Catalog No. 130-045-701) foi adicionada, incubada por 30 min e fluidas através da coluna de esfera magnética. Efluente de fração de células foi colhido diretamente, que foi composto principalmente de eosinófilos. Os eosinófilos resultantes foram contados e adicionados a uma placa de cultura celular de 96 poços pré-revestidas com anticorpo IgG, cerca de 1 x 10º células por poço, adicionada com a IL-5 humana (20 ng/ml) e diferentes concentrações de moléculas de anticorpo IL-5 (a partir de 10ug/ml, diluída 3 vezes, 10 níveis de concentrações). A placa de cultura celular foi incubada em estufa a 37ºC, CO2 a 5% por 1 he, em seguida, adicionada com 0,3% CTAB para lise das células. Finalmente, o substrato TMB da reação da peroxidase foi adicionado para o desenvolvimento de cor. Os valores de absorção de OD450 foram lidos em leitor de microplacas. O valor de adsorção máximo foi lido no poço apenas adicionado com a IL-5 e o poço não contendo IL-5 nem o fármaco de anticorpo foi definido como o controle de fundo. O valor de inibição de cada concentração dos fármacos de anticorpo em relação ao valor de adsorção máximo foi calculado como = (valor de adsorção máximo - [fármaco de anticorpo])/(valor de adsorção máximo - valor de controle do fundo) x 100%, e o IC50 foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 18: Tabela 18. Anticorpos de IL-5 bloqueiam a aderência de eosinófilos induzida por IL5 Hu39D10 /h1705-008

[0194] Os resultados indicam que os anticorpos humanizados da presente revelação mostram grande capacidade de inibir a aderência de eosinófilos mediada por IL5. Exemplo de teste 7: Avaliação da especificidade de anticorpos humanizados da IL-5 para citocinas Th2

[0195] A IL-5 é uma das citocinas Th2. Para verificar se os anticorpos IL-5 especificamente direciona só a IL-5 sem reatividade cruzada com outras citocinas, 12 tipos de Th2 e citocinas relacionadas, incluindo IL2(R&D, 202-IL-010/CF), IL4R&D, 204-IL-050/CF), |IL- S5(R&D, 205-1L-025/CF), IFNgama, IL6(R&D, 7270-1L-025/CF), ILAR&D, 209-I1L-010/CF), — ILIO(R&D, — 217-I1L-025/CF), — ILI13(R&D,213-ILB- 025/CF), IL25(R&D, 8134-1L-025/CF), ILS31(R&D, 2824-1L-010/CF) e IL3 compartilhando o receptor a com a IL-5 (203-IL-050/CF) e GMCSF (R&D, 215-GM-010/CF), foram usadas no ensaio Fortebio.

[0196] Especificamente, os anticorpos foram capturados usando o Biossensor da Proteína A (PALL Fortebio, 18-5010), o sinal de captura foi gravado e, em seguida, 40 nM de cada citocina foi adicionada e novos sinais de ligação foram registrados. Finalmente, o sinal de ligação para IL-5 foi definido como 100%, e os sinais de ligação entre anticorpos e outras citocinas foram observados. Os resultados são mostrados na Figura 2.

[0197] Os resultados mostram que entre os 12 tipos de citocinas relacionadas, os anticorpos humanizados da IL-5 h1705-008 e h1706- 009 especificamente apenas se ligam a IL-5, e não apresentam reação cruzada com outras citocinas Th2.

Avaliação farmacocinética Exemplo de teste 8: Avaliação farmacocinética de anticorpos humanizados da IL-5 em ratos

[0198] Ratos SD experimentais (fornecidos pelo Sipple-BK Lab Animal Co., Ltd.), 18 machos, foram divididos em 6 grupos, com 3 ratos em cada grupo. Hu39D10, h1705-008 e h1706-009 foram administrados por via intravenosa e subcutânea. Outros 9 ratos SD foram apenas administrados por via intravenosa com h1773-007, h1779-014 ou h1780-017. Para o grupo de administração intravenosa, 0,2 ml de sangue completo foram coletados sem a introdução de anticoagulação antes da administração e 5 min, 8 h, 1d, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d e 28d após a administração. As amostras de sangue foram colocadas a 4ºC por 30 min, centrifugadas a 1000 g por 15 min, os sobrenadantes (soro) foram colocados em tubos EP e armazenados a -80ºC. Para o grupo de administração subcutânea, sangue completo foi coletado antes da administração e 1h, 2h, 4h, 8h, 1d, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d e 28d após a administração. A concentração de anticorpos no soro foi determinada pelo método Elisa.

[0199] Os resultados indicam que as moléculas de anticorpo humanizado da presente revelação têm meia-vida longa e alta biodisponibilidade em ratos.

Tabela 19. Avaliação farmacocinética de anticorpos em ratos a cv a a de | or |-014 |-o17 dosagem Smg/k | 5mg/k | 5mg/k | 5mg/kg | 5mg/k | 5mg/kg | 5mg/k | 5mg/k | 5mg/k A mm jaca om j5o Lam [so dom jm |sm | e % 7 4,2 23 37 43 5 1H 03 0,8

Avaliação biológica in vivo Exemplo de teste 9: Avaliação da eficácia de anticorpos IL-5 em modelo de asma de camundongo induzida por OVA

[0200] Este exemplo de teste é para avaliar a eficácia de anticorpos IL-5 em modelo de asma de camundongo BALB/c induzido por aerossol de ovalbumina (OVA) baseado na resposta inflamatória das vias aéreas e o remodelamento das vias aéreas.

[0201] Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 7 grupos de acordo com o peso corporal, 10 camundongos em cada grupo: grupo controle normal (G1); grupo modelo (G2); grupos de tratamento para o anticorpo h1705-008 (G3 e G4 para duas doses de mpk e 2 mpk, respectivamente) e h1706-009 (G5 e G6 para duas doses de 10 mpk e 2 mpk, respectivamente); e um grupo controle para o anticorpo positivo Hu39D10 (G7, 10 mpk). No dia 1 e dia 14, todos os camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de solução de sensibilização. No dia 28, 29 e 30, seis grupos de camundongos, excluindo o grupo 1, foram desafiados com solução desafiante de aerossol OVA por 30 minutos. Duas horas antes do desafio, o Grupo 2 (G2) foi injetado intraperitonealmente com tampão de fosfato, e os camundongos dos Grupos 3 a 7 (G3-G7) foram injetados intraperitonealmente com diferentes doses de diferentes anticorpos, uma vez ao dia, por três dias consecutivos. Soluções frescas de anticorpo a serem testadas foram preparadas imediatamente antes de cada injeção e todas as injeções foram concluídas dentro de meia hora. Como controle normal, duas horas após a injeção intraperitoneal de tampão de fosfato, os camundongos do Grupo 1 foram desafiados com aerossol PBS por 30 minutos, uma vez ao dia, por três dias consecutivos.

[0202] No dia 31, os animais foram testados para a hiper- responsividade das vias aéreas usando sistema WBP. Todos os animais inalaram spray de metacolina a concentração duplamente crescente de 1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 mg/mL para determinar o valor intermitente de exalação acentuado na concentração correspondente.

[0203] No dia 31, uma hora após o teste de resposta da via aérea com o sistema WBP, uma cânula traqueal com diâmetro de 1,2 mm foi inserida na traqueia e fixada, lavagem pulmonar foi realizada duas vezes, 0,8 ml de tampão fosfato contendo BSA a 1% e 0,6 mM de EDTA foram usados para cada tempo. O volume recuperado do fluido de lavagem foi registrado.

[0204] BALF foi centrifugado a 300g a 4ºC por 5 minutos e o sobrenadante foi retido para análise de citocinas. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas em 1,5 ml de PBS (contendo BSA a 1% e 0,6 MM EDTA) para contagem de células. O número total de células no BALF foi contado com hemocitômetro e ensaio de mancha azul de Tripano. As células foram manchadas, coradas com solução de coloração de Wright durante um minuto e, em seguida, coradas com Giemsa por 7 minutos para distinguir eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos. As células foram contadas sob microscópio óptico.

[0205] Depois de lavagem, os tecidos pulmonares foram coletados, imersos em solução de formaldeído a 10% neutro e, em seguida, fixados em solução de formaldeído a 10% neutro. Os tecidos fixados foram, então, submetidos a inclusão em parafina, aparados, manchados com H&E e pontuados. Os resultados do teste são mostrados na Figura 3 e Figuras 4A e 4B.

[0206] Os resultados mostram que as moléculas de anticorpos h1705-008 e h1706-009 da presente revelação podem melhorar significativamente a função pulmonar em uma forma dose-dependente, enquanto a alta dose (10 mpk) do composto positivo não pode melhorar a função pulmonar (ver Figura 3). Ao mesmo tempo, os dois anticorpos

TU7TA reduzem significativamente o nível de eosinófilos e a espessura da mucosa, e apresentaram maior capacidade de reduzir a quantidade de eosinófilos em comparação com anticorpos positivos na mesma dose (10 mpk) (ver Figuras 4A e 4B). Repetindo o experimento no mesmo tipo de modelo de asma de camundongo, foi verificado, também, que 1 mg/ml de h1705-008, h1706-009 e h1780-017 todos reduziram significativamente o nível de eosinófilos em BalF, quando comparado com o anticorpo positivo (ver Fig. 4C).

Exemplo de teste 10: Avaliação da eficácia in vivo de anticorpos da IL5 na asma aguda induzida por IL5 humana exógena no modelo de cobaia

[0207] Neste exemplo de teste, as cobaias machos foram usadas para estabelecer o modelo de asma aguda induzida pela I|L5, e hu39D10 foi usado como um anticorpo positivo para avaliar se os cinco anticorpos monoclonais humanizados da IL-5 da presente revelação têm efeitos de inibição sobre o aumento induzido pela |L5 de eosinófilos no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) em cobaia. As cobaias foram divididas em 9 grupos, de 8 a 10 em cada grupo: grupo controle normal, grupo modelo, grupo Hu39D10 (1mg/Kkg), grupo h1705-008 (1mg/Kkg), grupo h1706-009 (1mg/Kkg), grupo h1780 -017 (1 mg/kg), grupo h1773-007 (1 mg/kg) e grupo h1779-014 (1mg/kg). No dia 1, as cobaias no grupo modelo e os grupos de administração de fármacos foram injetados intratraquealmente com 100 ul de IL5 humana (contendo 5 ug de antígeno de IL5) para a preparação e o grupo controle normal foi injetado intratraquealmente com PBS. duas horas após a preparação,1 mg/kg de anticorpos monoclonais da IL5 acima (no volume de administração de 5 ml/kg) foram administrados por via intraperitoneal para os grupos de administração de fármacos, o anticorpo IgG correspondente foi administrado ao grupo de modelo, e PBS foi administrado por via intraperitoneal para o grupo controle normal. 24 horas após a injeção intratraqueal, as cobaias foram anestesiadas e o fluido de lavagem broncoalveolar foi extraído. A concentração de células foi ajustada para 5º108/ml, e 15 ul do mesmo caiu sobre a lâmina de vidro, secas e fixadas para coloração HE, e o número total de células e o número de eosinófilos foram contados sob microscópio 400x. O percentual de eosinófilos foi calculado. Os resultados são mostrados nas Figuras 5A e 5B, indicando que todos os cinco anticorpos humanizados da presente revelação podem reduzir significativamente o nível de eosinófilos no BALF. Avaliação da estabilidade Exemplo de teste 11: Estabilidade de anticorpos humanizados anti- IL-5

1. Estabilidade química de anticorpos

[0208] Modificação da desaminação é uma modificação química comum nos anticorpos que podem afetar a estabilidade a longo prazo. Em particular, o elevado grau de modificação de desaminação, oxidação ou isomerização dos aminoácidos parciais nas regiões CDR devem ser geralmente evitados, ou para ser reduzido por mutação. 100 ug de amostras colhidas em vários pontos foram dissolvidas em 100 ul de solução de 0,2 M His-HCI, 8 M Gua-HCI, pH 6,0, adicionado com 3 ul de 0,1g/mL DTT, incubadas em banho de água a 50ºC por uma hora e, em seguida, ultrafiltradas duas vezes com 0,02 M His-HCI pH 6,0. 3 ul de 0,25 mg/mL de tripsina foi adicionado, incubado em banho de água a 37ºC durante a noite para digestão enzimática. Análise LC-MS foi realizada com a Agilent 6530 Q-TOF. Os resultados mostram que a estabilidade química dos anticorpos humanizados da presente revelação era boa, e os anticorpos não mostraram modificação anormal após a reação de aceleração no sistema tampão 529 a 40ºC por um período de um mês.

2. Estudo sobre o grau de agregação de anticorpos sob condição de alta concentração

[0209] A estabilidade dos anticorpos de teste foi avaliada em altas concentrações e diferentes sistemas tampão e diferentes condições de temperatura durante um mês. A estabilidade foi investigada na concentração de 50 mg/ml, em três sistemas tampão de PB9, His e 529, a 40ºC, 25ºC, 4ºC e -8B0ºC com congelamento e descongelamento repetidos. O grau de agregação foi monitorado pela SEC-HPLC. Cromatógrafo Waters e2695 foi usado, com a coluna de Waters Xbridge BEH 200A SEC, e a fase móvel foi PBS (pH foi ajustado para 6,8 com ácido clorídrico diluído). 50 ug de proteína foi carregado e eluição isocrática foi realizada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Observou-se que nenhum dos anticorpos humanizados da IL-5 significativamente agregaram em condições de alta concentração. Após 4 semanas de reação de aceleração a 40ºC, a pureza do monômero de anticorpo foi maior que 95% em todos os três sistemas.

3. Estudo sobre a pureza de anticorpos sob condição de alta concentração

[0210] A estabilidade dos anticorpos de teste foi avaliada em altas concentrações e diferentes sistemas tampão e diferentes condições de temperatura durante um mês. A estabilidade foi investigada na concentração de 50 mg/ml, no sistema His e a 40ºC. A pureza foi monitorada pelo CE-SDS. 100 ug de proteína foi tomada e o tampão de amostra foi adicionado para chegar a 95 ul. Para análise do modo de redução, 5 ul de dimercaptoetano! foi adicionado; para análise do modo de não redução, 5 ul de IAA foi adicionado. Incubado em banho de água a 70ºC por 10 min, centrifugado e o sobrenadante foi carregado. Os dados foram coletados e analisados com o aparelho de electroforese Beckman PA8O0Oplus. Observou-se que as proteínas do anticorpo têm boa estabilidade de pureza sob condições de alta concentração, e após

7TAITA 28 dias de reação de aceleração a 40ºC, a análise CE-SDS mostrou que o principal pico de anticorpos foi somente uma diminuição de 2%.

4. Detecção da estabilidade térmica de diferentes anticorpos por

UNIT

[0211] As amostras foram dissolvidas no tampão correspondente (tampão PBS), e a concentração das amostras foi controlada em cerca de 1 mg/ml. 9 yul foi carregado. Configurações do parâmetro: temperatura inicial 20ºC; incubação Os; taxa de aquecimento 0,3º C/min; placa de espera 5s; temperatura de terminação de 95ºC. Os valores de Tm dos anticorpos foram detectados. Os anticorpos têm alto valor de Tm e apresentam boa estabilidade térmica.

[0212] A invenção descrita acima foi descrita em detalhes com a ajuda de desenhos anexos e exemplos. No entanto, a descrição e os exemplos não devem ser interpretados como limitando o escopo da revelação. As revelações de todas as patente e literaturas científicas citadas aqui são explicitamente incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligando especificamente à I|L-5 humana, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, onde: (i) a região variável da cadeia pesada compreende as regiôeas HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 16 a 18, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 16 a 18, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 19 a 21, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ I|D Nº: 19 a 21, respectivamente; ou (li) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 22 a 24, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 22 a 24, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 25 a 27, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ I|D Nº: 25 a 27, respectivamente; ou (ili)) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 28 a 30, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 28 a 30, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 31 a 33, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 31 a 33, respectivamente; ou

(iv) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 34 a 36, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 34 a 36, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 37 a 39, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 37 a 39, respectivamente; ou

(v) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 40 a 42, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 40 a 42, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 43 a 45, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 43 a 45, respectivamente; ou

(vi) a região variável da cadeia pesada compreende as regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 conforme estabelecido nas sequências de aminoácidos da SEQ ID Nº: 34 a 36, ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região HCDR1, HCDR?2 e HCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 34, 82 e 36, respectivamente; e a região variável da cadeia leve compreende a região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido em sequências de aminoácidos das SEQ ID Nº: 37 a 39, ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença(s) de aminoácidos da região LCDR1, LCDR2 e LCDR3 conforme estabelecido nas SEQ ID Nº: 37 a 39, respectivamente.

2. Anticorpo monoclonal ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo recombinante, preferencialmente selecionado do grupo consistindo em anticorpo murino, anticorpo quimérico e anticorpo humanizado.

3. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 49, 57, 63, 69 ou 75, ou uma variante do mesmo; a variante tem de 1 a 10 mutação(ões) de aminoácidos sobre a região variável da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 49, 57, 63, 69 ou 75.

4. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a variante tem 1-10 retromutações de aminoácidos na região FR da região variável da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 49, 57, 63, 69 ou 75; de preferência, a retromutação é selecionada do grupo consistindo em S49T, V93T e K98S, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ

ID Nº: 49, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em S49T, V93T e K98T, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 57, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em R38K, M481, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K e L83F, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 63, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em F29I, R38K, V48I, R72A, T97F na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 69, e N55V na CDR, ou uma combinação dos mesmos, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em R38K, M48I, R67K, V68A, R72A, T74K, M81L, L83F e D89E, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 75.

5. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 50 ou 51, ou compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 58 ou 59, ou compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 64, 65 e 66, ou compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID Nº: 70, ou 71, ou compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 76 a 79.

6. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 46, 54, 60, 67 ou 72, ou uma variante do mesmo; a variante tem de 1 a 10 alterações de aminoácidos sobre a região variável da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 46, 54, 60, 67 ou 72.

7. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a variante tem 1-10 retromutações de aminoácidos na região FR da região variável da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 46, 54, 60, 67 ou 72; de preferência, a retromutação é selecionada do grupo consistindo em A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y e Y87F ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 46; ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em A43S, L47M, F71Y e Y87F ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 54, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em E1D, 12T, I57V, V84T e Y86F, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 60, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em M4L, A42S, L45P e L46W, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 67, ou a retromutação é selecionada do grupo consistindo em A43S, |48V e F71Y, ou uma combinação dos mesmos na região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 72.

8. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 47 ou 48; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 55 ou 56; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 61 ou 62; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 68; ou compreende uma região variável da cadeia leve da SEQ ID Nº: 73 ou

74.

9. Anticorpo monoclional ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende:

uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 49 a 51, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 46 a 48; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 57 a 59, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 54 a 56; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 63 a 66, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº*: 60 a 62; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 69 a 71, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 67 a 68; ou uma região variável da cadeia pesada selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 75 a 79, e uma região variável da cadeia leve selecionada de qualquer uma das seguintes SEQ ID Nº: 72-74.

10. Anticorpo monocional ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo, e compreende ainda uma região constante do anticorpo humano, de preferência, o anticorpo de comprimento completo compreende uma região constante da cadeia pesada do anticorpo humano conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 52, e uma região constante da cadeia leve humana, conforme estabelecido na SEQ ID Nº: 53.

11. Anticorpo monoclional ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o fragmentos de ligação ao antígeno é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab', F(ab')2, anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diabody), região V estabilizada com dissulfetos (dsFv) e um peptídeo compreendendo CDRs.

12. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compete pela ligação à IL-5 humana com o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes, tampões ou excipientes.

14. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a12.

15. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico isolado como definida na reivindicação 14.

16. Célula hospedeira transformada com o vetor recombinante, como definido na reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo em células procarióticas e células eucarióticas, de preferência células eucarióticas, com mais preferência células de mamíferos.

17. Método para produção de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo da célula hospedeira, como definida na reivindicação 16, em um meio de cultura para formar e acumular o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e recuperação do anticorpo monocilonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da cultura.

18. Método para detectar ou determinar a IL-5 humana, caracterizado pelo fato de que compreende usar o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

19. Agente para detectar ou determinar a IL-5 humana, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

20. Método de tratamento de uma doença associada com a IL-5" humana, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclional, ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 13, ou a molécula de ácido nucleico isolada como definida na reivindicação 14, para tratar a doença associada com a IL-5 humana, a doença é preferencialmente selecionada do grupo consistindo em asma, ataque maligno de asma, pneumonia crônica, rinite alérgica, aspergilose broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatite atópica, dermatite oncocercose, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenterite eosinofílica, infecção por helmintos, doença de Hodgkin, pólipos nasais, síndrome de Loeffler,

urticária, bronquite hiperplásica eosinofílica, arterite nodular, sinusite, esofagite eosinofílica, esofagite eosinofílica alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite oncocercose, endometriose e bronquite eosinofílica dependente de esteroides.

21. Uso do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou composição farmacêutica, como definida na reivindicação 13, ou molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 14, ou uma combinação dos mesmos, caracterizados pelo fato de serem na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença ou condição, na qual a doença ou condição é uma doença associada com a IL-5 humana, a doença ou a condição é preferencialmente selecionada do grupo consistindo em asma, ataque maligno de asma, pneumonia crônica, rinite alérgica, aspergilose broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatite atópica, dermatite oncocercose, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenterite eosinofílica, infecção por helmintos, doença de Hodgkin, pólipos nasais, síndrome de Loeffler, urticária, bronquite hiperplásica eosinofílica, arterite nodular, sinusite, esofagite eosinofílica, esofagite —eosinofílica alérgica, conjuntivite alérgicay dermatite oncocercose, endometriose e bronquite eosinofílica dependente de esteroides.