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BR112020005212A2 - conjugado de anticorpo, kit, composição farmacêutica, e, métodos de tratamento ou prevenção e de diagnóstico de uma doença ou condição. - Google Patents

conjugado de anticorpo, kit, composição farmacêutica, e, métodos de tratamento ou prevenção e de diagnóstico de uma doença ou condição. Download PDF

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BR112020005212A2
BR112020005212A2 BR112020005212-4A BR112020005212A BR112020005212A2 BR 112020005212 A2 BR112020005212 A2 BR 112020005212A2 BR 112020005212 A BR112020005212 A BR 112020005212A BR 112020005212 A2 BR112020005212 A2 BR 112020005212A2
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BR
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cdr
nos
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region
Prior art date
Application number
BR112020005212-4A
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Inventor
Ryan Stafford
Alice Yam
Xiaofan Li
Gang Yin
Toni Kline
Cristina Abrahams
Venita De Almeida
Original Assignee
Sutro Biopharma, Inc.
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Filing date
Publication date
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Abstract

A presente descrição refere-se a conjugados de anticorpos com especificidade de ligação pelo receptor alfa de folato (FOLR1) e suas isoformas e homólogos, e a composições que compreendem os conjugados de anticorpos, incluindo composições farmacêuticas. As cadeias leves variáveis são aquelas de trastuzumab. Além disso, são providos métodos para produção dos conjugados de anticorpos e composições, bem como métodos de utilização dos conjugados de anticorpos e composições, tais como em métodos terapêuticos e diagnósticos. Os conjugados de anticorpos compreendem um aminoácido não natural em um sítio selecionado a partir do grupo que consiste em HC-F404, HC-K121, HC-Y180, HC-F241, HC-221, LC-T22, LC-S7, LC-N152, LC-K42, LC-E161, LC-D170, HC-S136, HC-S25, HC-A40, HC-S119, HC-S190, HC-K222, HC-R19, HC-Y52 ou HC-S70, de acordo com o esquema de numeração Kabat, Chothia ou EU.

Description

1 / 202 CONJUGADO DE ANTICORPO, KIT, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO E DE
DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO Campo da invenção
[001] Neste pedido de patente, são providos conjugados de anticorpos com especificidade de ligação pelo receptor alfa de folato (FolRα ou FOLR1) e composições compreendendo os conjugados de anticorpos, incluindo composições farmacêuticas, métodos de produção dos conjugados e métodos de utilização dos conjugados e composições para terapia. Os conjugados e composições são úteis em métodos de tratamento e prevenção de proliferação celular e câncer, métodos de detecção de proliferação celular e câncer e métodos de diagnóstico de proliferação celular e câncer. Os conjugados e composições são igualmente úteis em métodos de tratamento, prevenção, detecção e diagnóstico de doenças autoimunes, doenças infecciosas e condições inflamatórias. Fundamentos da invenção
[002] Os receptores de folato, ou proteínas de ligação ao folato (FBPs), incluem glicoproteínas de cadeia única e contribuem para a atualização de folatos e outros e outros compostos in vivo. Elwood, 1989, J. Biol. Chem. 264:14893-14901. Certos receptores de folato são glicoproteínas de cadeia única com um sítio de alta afinidade de ligação por folato e outros compostos como metotrexato. Elwood, p. 14893. O gene FOLR1 humano codifica o receptor de folato adulto, um polipeptídeo de 30 kDa com aproximadamente 257 aminoácidos e três sítios potenciais de glicosilação N- ligada. Elwood, p. 14893; Lacey et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:715-720. Genes e polipeptídeos homólogos foram identificados em dezenas de espécies.
[003] A glicoproteína madura do receptor de folato tem aproximadamente 42 kDa de tamanho e sua participação foi observada na
2 / 202 internalização de folatos e antifolatos nas células. Elwood et al., 1997, Biochemistry 36:1467-1478. A expressão foi observada no cerebelo e células renais humanas, juntamente com linhagens celulares de cânceres humanos. Elwood et al., 1997, p. 1467. Além da internalização de folato, um receptor de folato demonstrou ser um cofator significativo para entrada celular de vírus, especialmente os vírus Marburg e Ebola. Chan et al., 2001, Cell 106:117-126. Devido a essas propriedades de internalização, propôs-se o receptor de folato como alvo de agentes diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, agentes diagnósticos e terapêuticos foram ligados ao folato para internalização em células que expressam o receptor de folato. Ver, por exemplo, Leamon, 2008, Curr. Opin. Investig. Drugs 9:1277-1286; Paulos et al., 2004, Adv. Drug Del. Rev. 56:1205-1217.
[004] O receptor alfa de folato (FolRα ou FOLR1) é uma glicoproteína ligada ao glicosilfosfatidilinositol da superfície celular com alta afinidade por folatos. Exceto por níveis baixos no rim e no pulmão, a maioria dos tecidos normais não expressão FOLR1, mas níveis elevados de FOLR1 foram encontrados em câncer epitelial seroso e endometrioide do ovário, adenocarcinoma endometrial, no subtipo carcinoma pulmonar de não pequenas células (CPNPC) do adenocarcinoma e câncer de mama triplo- negativo (CMTN). A expressão de FOLR1 é mantida em focos metastáticos e carcinomas recorrentes de pacientes com câncer de ovário, e a expressão de FOLR1 expressão foi observada após a quimioterapia em câncer epitelial e do endométrio ovariano. Essas propriedades, junto com a expressão altamente restrita de FOLR1 em tecidos normais, tornam FOLR1 um alvo altamente promissor para terapia contra câncer. Assim, o receptor de folato provê um alvo potencial para diagnóstico e terapia de cânceres e condições inflamatórias. Novos anticorpos são necessários para ligação específica e atingir esses receptores de folato.
[005] Há necessidade de métodos melhorados para modular a
3 / 202 regulação imune do receptor alfa de folato (FOLR1) e dos processos de sinalização a jusante ativados pelo receptor alfa de folato (FOLR1). Além disso, dada a expressão específica do receptor alfa de folato (FOLR1) em células transformadas pelo câncer e carcinoma e menor expressão em tecido não cancerígeno, há necessidade agentes terapêuticos melhorados que possa atingir especificamente células e tecidos com superexpressão do receptor alfa de folato (FOLR1). Conjugados de anticorpos contra FOLR1 poderiam ser utilizados para entrega de porções terapêuticas ou diagnósticas de carga útil (payload) e atingir células que expressam receptor alfa de folato para o tratamento ou diagnóstico de tais doenças. Sumário da invenção
[006] A presente invenção provê conjugados de anticorpos que se ligam seletivamente ao receptor alfa de folato (FOLR1). Os conjugados de anticorpos compreendem um anticorpo que se liga ao receptor alfa de folato (FOLR1) anexado a uma ou mais porções de carga útil. O anticorpo pode ser anexado à carga útil diretamente por uma ligação covalente ou indiretamente por meio de um ligador (linker). Anticorpos contra o receptor alfa de folato (FOLR1) são descritos detalhadamente no presente, como são porções de carga útil úteis e ligadores úteis.
[007] Em outro aspecto, são providas composições que compreendem os conjugados de anticorpos. Em algumas modalidades, as composições são composições farmacêuticas. Qualquer composição farmacêutica adequada pode ser utilizada. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição para administração parenteral. Em um aspecto adicional, são providos kits que compreendem os conjugados de anticorpos ou as composições farmacêuticas.
[008] Em outro aspecto, são aqui providos métodos de utilização dos conjugados do anticorpo anti-FOLR1. Em algumas modalidades, os métodos são métodos para entrega de uma ou mais porções de carga útil a uma célula
4 / 202 ou tecido alvo com expressão do receptor alfa de folato. Em algumas modalidades, os métodos são métodos de tratamento. Em algumas modalidades, os métodos são métodos diagnósticos. Em algumas modalidades, os métodos são métodos analíticos. Em algumas modalidades, os conjugados de anticorpos são usados para tratar uma doença ou condição. Em alguns aspectos, a doença ou condição é selecionada dentre um câncer, doença autoimune e infecção.
[009] Em algumas modalidades, os conjugados de anticorpos ligam- se ao receptor alfa de folato humano. Em algumas modalidades, os conjugados de anticorpos também se ligam a homólogos do receptor alfa de folato humano. Em alguns aspectos, os conjugados de anticorpos também se ligam a homólogos do receptor alfa de folato de macaco cinomolgo e/ou de camundongo. Breve descrição das figuras
[0010] A Figura 1 fornece uma comparação entre os sistemas de numeração de Kabat e Chothia para CDR-H1. Adaptado de Martin A.C.R. (2010). Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Em R. Kontermann & S. Dübel (Eds.), Antibody Engineering, vol. 2 (pp. 33-51). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.
[0011] As Figuras 2-4 fornecem alinhamentos das sequências de VH (SEQ ID NOs: 308-366) dos anticorpos variantes aqui providos. As CDRs de acordo com Chothia estão destacadas e as CDRs de acordo com Kabat estão enquadradas.
[0012] A Figura 5 fornece alinhamentos das sequências de VL (SEQ ID NOs: 367-369) do trastuzumabe e os anticorpos variantes aqui providos. As CDRs de acordo com Chothia estão destacadas e as CDRs de acordo com Kabat estão enquadradas.
[0013] A Figura 6 é um gráfico ilustrando a mudança do peso corporal em camundongos implantados com células KB de carcinoma
5 / 202 cervical, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0014] A Figura 7 (A, B) são gráficos ilustrando curvas de crescimento tumoral e tamanho tumoral no Dia 25 em camundongos implantados com células KB de carcinoma cervical, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0015] A Figura 8 é um gráfico de dispersão (scatter plot) ilustrando o tamanho tumoral final no Dia 31 em camundongos implantados com células KB de carcinoma cervical, após o tratamento com uma dose única de dois diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 aqui descritos.
[0016] A Figura 9 é um gráfico ilustrando a mudança do peso corporal em camundongos implantados com células KB de carcinoma cervical, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0017] A Figura 10 (A, B) são gráficos ilustrando curvas de crescimento tumoral e tamanho tumoral no Dia 21 em camundongos implantados com células KB de carcinoma cervical, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0018] A Figura 11 é um gráfico de dispersão ilustrando o tamanho tumoral final no Dia 36 em camundongos implantados com células KB de carcinoma cervical, após o tratamento com uma dose única de três diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 aqui descritos.
[0019] A Figura 12 é um gráfico ilustrando a mudança do peso corporal em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0020] A Figura 13 (A, B) são gráficos ilustrando curvas de
6 / 202 crescimento tumoral e tamanho tumoral no Dia 24 em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0021] A Figura 14A é um gráfico ilustrando curvas de crescimento tumoral em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0022] A Figura 14B é um gráfico de dispersão ilustrando o tamanho tumoral no Dia 21 em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, após o tratamento com uma dose única de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 aqui descritos.
[0023] A Figura 15 inclui gráficos ilustrando a ligação de diferentes anticorpos contra FOLR1 a células 293T transformadas que expressam isoformas diferentes do receptor de folato (hFOLR1, hFOLR2).
[0024] A Figura 16 inclui gráficos ilustrando a atividade citotóxica de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 em células 293T transformadas que expressam estavelmente isoformas diferentes do receptor de folato (hFOLR1, hFOLR2).
[0025] A Figura 17 é um gráfico ilustrando a mudança do peso corporal em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido várias doses de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0026] A Figura 18 (A, B, C) inclui curvas de crescimento tumoral e gráfico de dispersão com tamanho tumoral no Dia 21 em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido várias doses de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0027] A Figura 19 (A, B, C, D) inclui gráficos ilustrando o tamanho
7 / 202 tumoral em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido várias doses de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0028] A Figura 20 é um gráfico ilustrando o atraso no crescimento do tumor em camundongos implantados com células Igrov1 de câncer de ovário, depois de terem recebido várias doses de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 conforme aqui descritos.
[0029] A Figura 21 (A, B, C) inclui gráficos de crescimento tumoral, um gráfico de dispersão ilustrando o tamanho tumoral no Dia 29 e um gráfico ilustrando inibição do crescimento tumoral no Dia 29 em animais portadores de tumores Igrov1 estabelecidos, tratados com uma dose única de um conjugado fármaco-anticorpo contra FOLR1 exemplar, com ou sem carboplatina.
[0030] A Figura 22 (A, B) inclui um gráfico de crescimento tumoral e um gráfico de dispersão ilustrando o tamanho tumoral no Dia 31 em animais portadores de tumores OVCAR3 estabelecidos.
[0031] A Figura 23 (A-G) inclui curvas de crescimento tumoral de vários modelos de xenoenxerto do endométrio de pacientes aos quais foi administrado um conjugado fármaco-anticorpo contra FOLR1 exemplar.
[0032] A Figura 24 (A, B) inclui curvas de crescimento tumoral e um gráfico de dispersão do tamanho tumoral de animais com tumores MC38-hFOLR1 em resposta ao tratamento com um conjugado fármaco- anticorpo contra FOLR1 exemplar, Avelumabe ou uma combinação de ambos.
[0033] A Figura 25 (A, B) inclui curvas de crescimento tumoral e um gráfico de sobrevida de Kaplan-Meier de animais com tumores MC38-hFOLR1 em resposta ao tratamento com um conjugado fármaco- anticorpo contra FOLR1 exemplar, Avelumabe ou uma combinação de ambos.
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[0034] A Figura 26 é um gráfico ilustrando o perfil farmacocinético plasmático de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 em camundongos Beige SCID.
[0035] A Figura 27 é um traçado de LC/MS de pequenas moléculas detectadas no plasma de camundongos tratados com veículo ou com ADC Moléculas 1 ou 17.
[0036] A Figura 28 inclui um gráfico ilustrando a estabilidade plasmática (conforme medida pela relação fármaco-anticorpo, ou DAR) de um conjugado fármaco-anticorpo contra FOLR1 representativo administrado a camundongos Beige SCID.
[0037] A Figura 29 inclui gráficos ilustrando a estabilidade plasmática (conforme medida pela relação fármaco-anticorpo, ou DAR) de vários conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1, conforme testados em PBS, no plasma de macaco cinomolgo ou plasma humano.
[0038] A Figura 30 inclui gráficos ilustrando a atividade citotóxica de ADC Molécula 4 e ADC Molécula 21 em várias células na presença do respectivo anticorpo nu (naked antibody) como competidor.
[0039] A Figura 31 é um gráfico ilustrando a mudança do peso corporal em ratos que receberam várias doses dos catabólitos de conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 aqui descritos.
[0040] A Figura 32 é um gráfico ilustrando a estabilidade de um conjugado fármaco-anticorpo contra FOLR1 representativo (ADC) em comparação a um ADC comparador conforme testada no plasma de macaco cinomolgo, plasma humano e em PBS.
[0041] A Figura 33 inclui gráficos ilustrando a atividade citotóxica dos catabólitos de um conjugado fármaco-anticorpo contra FOLR1 representativo (ADC) aqui descrito, quando comparado àquela de um ADC comparador em células com níveis variáveis de PgP e na presença um inibidor específico de PgP.
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[0042] A Figura 34 é um gráfico ilustrando os níveis no tumor e plasma do catabólito de um conjugado fármaco-anticorpo contra FOLR1 representativo (ADC) aqui descrito, em comparação àqueles de um ADC comparador, medidos em camundongos com tumores Igrov1 estabelecidos.
[0043] A Figura 35 (A, B) inclui uma curva de crescimento tumoral e um gráfico de dispersão ilustrando o tamanho tumoral no Dia 21 para diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 (ADC) conforme aqui descritos.
[0044] A Figura 36 é um gráfico ilustrando o perfil farmacocinético plasmático de diferentes conjugados fármaco-anticorpo contra FOLR1 em camundongos Beige SCID. Descrição detalhada das modalidades
1. Definições
[0045] A menos que definidos outra forma, a intenção é que todos os termos da técnica, anotações e outra terminologia científica neste relatório descritivos tenham os significados comumente entendidos pelos versados na técnica ao qual pertence essa invenção. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são definidos por uma questão de clareza e/ou referência rápida, e a inclusão de tais definições no presente não deve necessariamente interpretada como representativa de uma diferença com aquilo que em gel é entendido na técnica. As técnicas e procedimentos descritos ou citados são em geral bem entendidos e empregados comumente nas metodologias convencionais usadas pelos versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas e descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Quando apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são em geral conduzidos de acordo com protocolos e condições definidos pelo fabricante a menos que anotado de
10 / 202 outra forma.
[0046] Neste relatório descritivo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem os referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0047] O termo “aproximadamente” indica e abrange um valor indicado e uma faixa acima e abaixo daquele valor. Em certas modalidades, o termo “aproximadamente” indica o valor designado ± 10%, ± 5% ou ± 1%. Em certas modalidades, o termo “aproximadamente” indica o valor designado ± um desvio padrão daquele valor.
[0048] O termo “combinações do mesmo” inclui todas as possíveis combinações de elementos aos quais o termo se refere. Por exemplo, uma frase afirmando que “se α2 é A, então α3 não é D; α5 não é S; ou α6 não é S; ou combinações do mesmo” inclui as seguintes combinações quando α2 é A: (1) α3 não é D; (2) α5 não é S; (3) α6 não é S; (4) α3 não é D; α5 não é S; e α6 não é S; (5) α3 não é D e α5 não é S; (6) α3 não é D e α6 não é S; e (7) α5 não é S e α6 não é S.
[0049] Os termos “receptor alfa de folato” e “receptor 1 de folato” são usados alternadamente no presente. O receptor alfa de folato é igualmente conhecido pelos sinônimos, incluindo FOLR1, FolRα, proteína de ligação ao folato, FBP, proteína de ligação ao folato adulta, Folbp1, FR-alfa, FRα, FBP a células KB e antígeno MOv18 associado ao tumor de ovário, entre outros. A menos que especificado de outra forma, os termos incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas do receptor alfa de folato humano que são expressas naturalmente por células ou que são expressas por células transfectadas com um gene do receptor alfa de folato ou FOLR1. As proteínas do receptor alfa de folato incluem, por exemplo, receptor alfa de folato humano (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, as proteínas do receptor alfa de folato incluem receptor alfa de folato do macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, as proteínas do receptor alfa de folato
11 / 202 incluem receptor alfa de folato murino (SEQ ID NO: 3).
[0050] O termo “imunoglobulina” refere-se a uma classe de proteínas relacionadas estruturalmente em geral compreendendo dois pares de cadeias polipeptídicas: um par de cadeias leves (L) e um par de cadeias pesadas (H). Em uma “imunoglobulina intacta”, todas essas quatro cadeias estão interconectadas por ligações dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver, por exemplo, Paul, Fundamental Immunology 7a ed., Cap. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. Resumidamente, cada cadeia pesada compreende tipicamente uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada compreende tipicamente três domínios, abreviados CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende tipicamente uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende tipicamente um domínio, abreviado CL.
[0051] O termo “anticorpo” descreve um tipo de molécula de imunoglobulina é usado neste relatório descritivo em seu sentido mais amplo. Um anticorpo inclui especificamente anticorpos intactos (por exemplo, imunoglobulinas intactas) e fragmentos de anticorpos. Os anticorpos compreendem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno. Um exemplo de domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno formado por um dímero VH-VL. Um “anticorpo contra receptor alfa de folato”, “anticorpo anti-receptor alfa de folato”, “Ab contra receptor alfa de folato”, “anticorpo específico contra receptor alfa de folato”, “Ab anti- receptor alfa de folato”, “anticorpo contra FOLR1”, “anticorpo contra FolRα”, “anticorpo anti-FOLR1”, “anticorpo anti-FolRα”, “Ab contra FOLR1”, “Ab contra FolRα”, “anticorpo específico contra FOLR1”, “anticorpo específico contra FolRα”, “Ab anti-FolRα” ou “Ab anti-FOLR1” é um anticorpo, como aqui descrito, que se liga especificamente ao receptor alfa
12 / 202 de folato ou FOLR1. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ao domínio extracelular do receptor alfa de folato (FOLR1).
[0052] As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade (“regiões hipervariáveis (HVRs);” também denominadas “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs)) intercaladas com regiões que são mais conservadas. As regiões mais conservadas são denominadas regiões de arcabouço (FRs). Cada VH e VL em geral compreende três CDRs e quatro FRs, dispostas na seguinte ordem (do N-terminal para o C-terminal): FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. As CDRs estão envolvidas na ligação ao antígeno e influenciam a especificidade pelo antígeno e a afinidade de ligação do anticorpo. Ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[0053] A cadeia leve de qualquer espécie vertebrada pode ser designada a um de dois tipos, denominados kappa e lambda, tendo por base a sequência do domínio constante.
[0054] A cadeia pesada leve de qualquer espécie vertebrada pode ser designada a uma de cinco classes (ou isotipos) diferentes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Essas classes são também designadas α, δ, ε, γ, e µ, respectivamente. As classes IgG e IgA são divididas ainda em subclasses com base em diferenças na sequência e função. Os humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
[0055] Os limites da sequência de aminoácidos de uma CDR podem ser determinados pelo técnico no assunto utilizando qualquer um de vários esquemas de numeração conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al., supra (esquema de numeração de “Kabat”); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948 (esquema de numeração de “Chothia”); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 (esquema de numeração de “Contact”);
13 / 202 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 (esquema de numeração de”IMGT”); e Honegge e Plückthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70 (esquema de numeração de “AHo”), cada um aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[0056] A Tabela 1 fornece as posições de CDR-L1, CDR-L2, CDR- L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 conforme identificadas pelos esquemas de Kabat e Chothia. Para CDR-H1, a numeração dos resíduos é fornecida usando os esquemas de numeração de Kabat e Chothia. Tabela 1. Resíduos em CDRs de acordo com os esquemas de numeração de Kabat e Chothia. CDR Kabat Chothia L1 L24-L34 L24-L34 L2 L50-L56 L50-L56 L3 L89-L97 L89-L97 H1 (Numeração de Kabat) H31-H35B H26-H32 ou H34* H1 (Numeração de Chothia) H31-H35 H26-H32 H2 H50-H65 H52-H56 H3 H95-H102 H95-H102 * O C-terminal de CDR-H1, quando numerado usando a convenção da numeração de Kabat, varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da CDR, como ilustrado na Figura 1.
[0057] A menos que especificado de outra forma, neste relatório descritivo, o esquema de numeração usado para identificação de uma CDR específica é o esquema de numeração de Kabat/Chothia. Quando os resíduos abrangidos pelos dois esquemas de numeração divergirem (por exemplo, CDR-H1 e/ou CDR-H2), o esquema de numeração é especificado como de Kabat ou Chothia. Por conveniência, CDR-H3 é, às vezes, aqui referida como de Kabat ou Chothia. No entanto, isso não pretende implicar que diferenças existam em sequências, e o técnico no assunto pode confirmar facilmente se as sequências são iguais ou diferentes examinando as sequências.
[0058] As CDRs podem ser designadas, por exemplo, utilizando um software de numeração de anticorpos, como Abnum, disponível em www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, e descrito em Abhinandan e Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
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[0059] O “esquema de numeração EU” é em geral usado na referência a um resíduo em um anticorpo região constante da cadeia pesada (por exemplo, como relatado em Kabat et al., supra). A menos que afirmado de outra forma, usa-se o esquema de numeração EU para se referir a resíduos nas regiões constantes de cadeias pesadas do anticorpo aqui descritas.
[0060] Um “fragmento de anticorpo” compreende uma porção de um anticorpo intacto, tal como a região de ligação ao antígeno ou variável de um anticorpo intacto. Os fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab’, fragmentos scFv (sFv) e fragmentos scFv-Fc.
[0061] Os fragmentos “Fv” compreendem um dímero não covalentemente ligado de um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
[0062] Os fragmentos “Fab” compreendem, além dos domínios variáveis da cadeia pesada e da leve, o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab podem ser gerados, por exemplo, por métodos recombinantes ou por digestão com papaína de um anticorpo completo.
[0063] Os fragmentos “F(ab’)2” contêm dois fragmentos Fab’ unidos, próximo da região de dobradiça, por ligações dissulfeto. Os fragmentos F(ab’)2 podem ser gerados, por exemplo, por métodos recombinantes ou por digestão com papaína de um anticorpo intacto. Os fragmentos F(ab’) podem dissociados, por exemplo, por tratamento com ß-mercaptoetanol.
[0064] Os fragmentos “Fv de cadeia única” ou “sFv” ou “scFv” de anticorpos compreendem um domínio VH e um domínio VL em uma única cadeia polipeptídica. O VH e o VL são em geral ligados por um ligador peptídico. Ver Plückthun A. (1994). Em algumas modalidades, o ligador é SEQ ID NO: 377. Em algumas modalidades, o ligador é SEQ ID NO: 378. Antibodies from Escherichia coli. Em Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.),
15 / 202 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, Nova York, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[0065] Os fragmentos “scFv-Fc” compreendem um scFv anexado a um domínio Fc. Por exemplo, um domínio Fc pode ser anexado ao C-terminal do scFv. O domínio Fc pode seguir o VH ou VL, dependendo da orientação dos domínios variáveis no scFv (ou seja, VH-VL ou VL-VH). Qualquer domínio Fc adequado, conhecido na técnica ou aqui descrito, pode ser utilizado. Em alguns casos, o domínio Fc compreende um domínio Fc de IgG1. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG1 compreende SEQ ID NO: 370, ou uma parte da mesma. SEQ ID NO: 370 fornece a sequência de CH1, CH2 e CH3 da região constante de IgG1 humana.
[0066] O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos. Uma população de anticorpos substancialmente homogêneos compreende anticorpos que são substancialmente semelhantes e que se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por variantes que podem surgir normalmente durante a produção do anticorpo monoclonal. Tais variantes estão geralmente presentes apenas em quantidades mínimas. Um anticorpo monoclonal é obtido tipicamente por um processo que inclui a seleção de um único anticorpo dentre uma pluralidade de anticorpos. Por exemplo, o processo seletivo pode ser a seleção de um único clone dentre uma pluralidade de clones, tais como um pool de clones em hibridoma, clones em fagos, clones em leveduras, clones bacterianos ou outros clones de DNA recombinante. O anticorpo selecionado pode ser alterado mais, por exemplo, para melhorar a afinidade pelo alvo (“maturação por afinidade”), humanizar o anticorpo, melhorar sua produção em cultura celular e/ou reduzir sua imunogenicidade em um indivíduo.
[0067] O termo “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma parte da cadeia pesada e/ou cadeia leve é derivada de uma fonte ou
16 / 202 espécie em particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie diferente.
[0068] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado é geralmente uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) na qual resíduos de uma ou mais CDRs são substituídos por resíduos de uma ou mais CDRs de um anticorpo não humano (anticorpo doador). O anticorpo doador pode ser qualquer anticorpo não humano adequado, tal como um anticorpo de camundongo, rato, coelho, galinha ou primata não humano tendo uma especificidade, afinidade ou efeito biológico desejado. Em alguns casos, resíduos selecionados da região de arcabouço do anticorpo receptor são substituídos pelos resíduos correspondentes da região de arcabouço do anticorpo doador. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Tais modificações podem ser feitas para refinar mais a função do anticorpo. Para detalhes adicionais, ver Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596, cada um destes aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[0069] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos correspondente àquela de um anticorpo produzido por um humano ou uma célula humana, ou derivado de uma fonte não humana que utiliza um repertório de anticorpos humanos ou de sequências codificadoras de anticorpos humanos (por exemplo, obtidas de fontes humanas ou projetadas de novo). Anticorpos humanos excluem especificamente anticorpos humanizados.
[0070] Um “anticorpo isolado” é aquele que foi separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes do
17 / 202 ambiente natural podem incluir enzimas, hormônios e outros materiais proteináceos ou não proteináceos. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é purificado até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna, por exemplo, com o uso de um sequenciador com tubo cônico de centrífuga. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é purificado até a homogeneidade por eletroforese em gel (por exemplo, SDS-PAGE) sob condições redutoras ou não redutoras, com detecção por coloração com Coomassie ou prata. Um anticorpo isolado inclui um anticorpo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não está presente. Em alguns aspectos, um anticorpo isolado é preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[0071] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é purificado até pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% em peso. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é purificado até pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% em volume. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é fornecido em uma solução compreendendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% a 100% em peso. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado é fornecido em uma solução compreendendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ao 100% em volume.
[0072] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, neste relatório descritivo, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca, que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. A afinidade
18 / 202 pode ser determinada, por exemplo, utilizando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR), como um instrumento Biacore®. Em algumas modalidades, a afinidade é determinada a 25°C.
[0073] Em relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, os termos “ligação específica”, “liga-se especificamente a”, “específico para”, “liga-se seletivamente” e “seletivo para” um antígeno em particular (por exemplo, um alvo polipeptídico) ou um epítopo em um antígeno em particular significam a ligação cuja diferença com uma interação não específica ou não seletiva pode ser mensurada. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação à ligação de uma molécula controle. A ligação específica pode também ser determinada por competição com uma molécula controle que imita o sítio de ligação do anticorpo no alvo. Nesse caso, a ligação específica é indicada se a ligação do anticorpo ao alvo é inibida pela competição com a molécula controle.
[0074] O termo “kd” (s-1), neste relatório descritivo, refere-se à constante da taxa de dissociação de uma determinada interação anticorpo- antígeno. Esse valor é igualmente referido como o valor koff.
[0075] O termo “ka” (M-1×s-1), neste relatório descritivo, refere-se à constante da taxa de associação de uma determinada interação anticorpo- antígeno. Esse valor é igualmente referido como o valor kon.
[0076] O termo “KD” (M), neste relatório descritivo, refere-se à constante de dissociação no equilíbrio de uma determinada interação anticorpo-antígeno. KD = kd/ka.
[0077] O termo “KA” (M-1), neste relatório descritivo, refere-se à constante de associação no equilíbrio de uma determinada interação anticorpo-antígeno. KA = ka/kd.
[0078] Um anticorpo com “afinidade maturada” é aquele com uma um ou mais alterações em uma ou mais CDRs ou FRs que resultam em afinidade melhorada do anticorpo por seu antígeno, quando comparado a um
19 / 202 anticorpo original que não possui a(s) alteração(ões). Em uma modalidade, um anticorpo com afinidade maturada tem afinidade em nível nanomolar ou picomolar pelo antígeno alvo. Anticorpos com afinidade maturada podem ser produzidos utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, Marks et al. (Bio/Technology, 1992, 10:779-783, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência) descrevem maturação da afinidade por embaralhamento dos domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de CDR e/ou arcabouço (framework) é descrita, por exemplo, por Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91:3809-3813); Schier et al., Gene, 1995, 169:147-155; Yelton et al., J. Immunol., 1995, 155:1994-2004; Jackson et al., J. Immunol., 1995, 154:3310-33199; e Hawkins et al, J. Mol. Biol., 1992, 226:889-896, cada um destes aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[0079] Quando usado no contexto de dois ou mais anticorpos, o termo “compete com” ou “compete de modo cruzado com” indica que os dois ou mais anticorpos competem pela ligação a um antígeno (por exemplo, receptor alfa de folato ou FOLR1). Em um ensaio exemplar, FOLR1 é revestido sobre uma placa e deixado ligar-se a um primeiro anticorpo, depois do que, um segundo anticorpo marcado é adicionado. Se a presença do primeiro anticorpo reduzir a ligação do segundo anticorpo, então os anticorpos competem. Em outro ensaio exemplar, um primeiro anticorpo é revestido sobre uma placa e deixado ligar-se ao antígeno e, então, o segundo anticorpo é adicionado. O termo “compete com” também inclui combinações de anticorpos quando um anticorpo reduz a ligação de outro anticorpo, mas em que nenhuma competição é observada quando os anticorpos os anticorpos são adicionados na ordem inversa. No entanto, em algumas modalidades, o primeiro e o segundo anticorpo inibem um ao outro, independentemente da ordem na qual são adicionados. Em algumas modalidades, um anticorpo reduz a ligação de outro anticorpo a seu antígeno em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo
20 / 202 menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%.
[0080] O termo “epítopo” significa uma parte de um antígeno capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos frequentemente consistem em resíduos de aminoácidos acessíveis e/ou cadeias laterais de açúcar acessíveis pela superfície e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Epítopos conformacionais e não conformacionais se distinguem pelo fato de a ligação do primeiro, mas não a do último ser perdida na presença de solventes desnaturantes. Um epítopo pode compreender resíduos de aminoácidos que estão diretamente envolvidos na ligação, e outros resíduos de aminoácidos que não estão diretamente envolvidos na ligação. O epítopo ao qual se liga um anticorpo pode ser determinado por técnicas conhecidas para determinação de epítopos tais como, por exemplo, testes da ligação do anticorpo a variantes do receptor alfa de folato (FOLR1) com mutações pontuais diferentes.
[0081] O percentual de “identidade” entre uma sequência polipeptídica e uma sequência de referência é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas (gaps), se necessário, para alcançar o percentual máximo de identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinar o percentual de identidade da sequência de aminoácidos pode ser realizado de várias maneiras que estão ao alcance do técnico no assunto, por exemplo, com o uso de programas de computador disponíveis publicamente, tais como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA ou MUSCLE. Os versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências em comparação.
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[0082] Uma “substituição conservadora” ou uma “substituição conservadora de aminoácido” refere-se à substituição de um aminoácido por um aminoácido química ou funcionalmente semelhante. Tabelas para substituição conservadora fornecendo aminoácidos semelhantes são bem conhecidas na técnica. Sequências de polipeptídeos com tais substituições são conhecidas como “variantes conservadoramente modificadas”. Tais variantes conservadoramente modificadas acrescentam-se a e não excluem variantes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos. A título de exemplo, os grupos de aminoácidos fornecidos nas Tabelas 2-4 são, em algumas modalidades, considerados substituições conservadoras entre si. Tabela 2. Grupos de aminoácidos selecionados que são considerados substituições conservadoras entre si, em certas modalidades. Resíduos ácidos DeE Resíduos básicos K, R e H Resíduos hidrofílicos sem carga S, T, N e Q Resíduos alifáticos sem carga G, A, V, L e I Resíduos não polares sem carga C, M e P Resíduos aromáticos F, Y e W Resíduos contendo grupo alcoólico SeT Resíduos alifáticos I, L, V e M Resíduos associados a cicloalquenila F, H, W e Y Resíduos hidrofóbicos A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y Resíduos com carga negativa DeE Resíduos polares C, D e, H, K, N, Q, R, S e T Resíduos com carga positiva H, K e R Resíduos pequenos A, C, D, G, N, P, S, T e V Resíduos muito pequenos A, G e S Resíduos envolvidos em formação de curva A, C, D e, G, H, K, N, Q, R, S, P e T Resíduos flexíveis Q, T, K, S, G, P, D e R Tabela 3. Grupos de aminoácidos selecionados adicionais que são substituições conservadoras entre si, em certas modalidades. Grupo 1 A, S, e T Grupo 2 DeE Grupo 3 NeQ Grupo 4 ReK Grupo 5 I, L e M Grupo 6 F, Y e W Tabela 4. Outros grupos de aminoácidos selecionados que são considerados substituições conservadoras entre si, em certas modalidades. Grupo A AeG Grupo B DeE Grupo C NeQ
22 / 202 Grupo D R, K e H Grupo E I, L, M, V Grupo F F, Y e W Grupo G SeT Grupo H CeM
[0083] Substituições conservadoras adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2a ed. (1993) W. H. Freeman & Co., Nova York, NY. Um anticorpo gerado efetuando uma ou mais substituições conservadoras e resíduos de aminoácidos em um anticorpo original é referido como uma “variante conservadoramente modificada”.
[0084] O termo “aminoácido” refere-se aos vinte aminoácidos comuns naturais. Os aminoácidos naturais incluem alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C); ácido glutâmico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), Glicina (Gly; G); histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) e valina (Val; V).
[0085] Os aminoácidos naturalmente codificados são os aminoácidos proteinogênicos conhecidos pelos versados na técnica. Eles incluem os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e os menos comuns pirrolisina e selenocisteína. Os aminoácidos naturalmente codificados incluem variantes pós-traducionais dos 22 aminoácidos naturais, tais como aminoácidos prenilados, aminoácidos isoprenilados, aminoácidos miristoilados, aminoácidos palmitoilados, aminoácidos glicosilados N- ligados, aminoácidos glicosilados O-ligados, aminoácidos fosforilados e aminoácidos acilados.
[0086] O termo “aminoácido não natural” refere-se a um aminoácido que não é um aminoácido proteinogênico, nem uma variante do mesmo modificada após a tradução. Em particular, o termo refere-se a um
23 / 202 aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína, nem variantes dos mesmos modificadas após a tradução.
[0087] O termo “conjugado” ou “conjugado de anticorpo” refere-se a um anticorpo ligado a uma ou mais porções de carga útil. O anticorpo pode ser qualquer anticorpo aqui descrito. A carga útil pode ser qualquer carga útil aqui descrita. O anticorpo pode ser ligado diretamente à carga útil via uma ligação covalente, ou o anticorpo pode ser ligado à carga útil indiretamente por meio de um ligador. Tipicamente, o ligador é covalentemente ligado ao anticorpo e também covalentemente ligado à carga útil. O termo “conjugado fármaco-anticorpo” ou “ADC” refere-se a um conjugado em que pelo menos uma carga útil é uma porção terapêutica tal como um fármaco.
[0088] O termo “carga útil” refere-se a uma porção molecular que pode ser conjugada a um anticorpo. Em modalidades específicas, as cargas úteis são selecionadas a partir do grupo que consiste em porções terapêuticas e porções de marcação.
[0089] O termo “ligador” refere-se a uma porção molecular que é capaz de formar pelo menos duas ligações covalentes. Tipicamente, um ligador é capaz de formar pelo menos um ligação covalente com um anticorpo e pelo menos outra ligação covalente com uma carga útil. Em certas modalidades, um ligador pode formar mais de uma ligação covalente com um anticorpo. Em certas modalidades, um ligador pode formar mais de uma ligação covalente com uma carga útil ou pode formar ligações covalentes com mais de uma carga útil. Depois que um ligador forma uma ligação com um anticorpo ou uma carga útil, ou com ambos, a estrutura restante, ou seja, o resíduo do ligador depois que uma ou mais ligações covalentes são formadas, pode ainda ser aqui referido como um “ligador”. O termo “precursor de ligador” refere-se a um ligador com um ou mais grupos reativos capazes de formar uma ligação covalente com um anticorpo ou carga útil, ou ambos. Em algumas modalidades, o ligador é um ligador clivável. Por exemplo, um
24 / 202 ligador clivável pode ser aquele que é liberado por uma função bio-lábil, e que pode projetado ou não projetado. Em algumas modalidades, o ligador é um ligador não clivável. Por exemplo, um ligador não clivável pode ser aquele que é liberado quando da degradação do anticorpo.
[0090] “Tratar” ou “tratamento” de qualquer doença ou transtorno refere-se, em certas modalidades, a melhora de uma doença ou transtorno existente em um indivíduo. Em outra modalidade, “tratar” ou “tratamento” inclui melhorar pelo menos um parâmetro físico, o que pode ser indiscernível para o indivíduo. Em ainda outra modalidade, “tratar” ou “tratamento” inclui modular a doença ou o transtorno, quer física (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível) ou fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em ainda outra modalidade, “tratar” ou “tratamento” inclui retardar ou impedir o início da doença ou transtorno.
[0091] Neste relatório descritivo, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou composição que, quando administrada a um indivíduo, é eficaz para tratar uma doença ou transtorno. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade eficaz refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou composição que, quando administrada a um indivíduo, é eficaz para prevenir ou melhorar uma doença ou a progressão da doença ou resulta em melhora de sintomas.
[0092] Neste relatório descritivo, o termo “inibe o crescimento” (por exemplo, ao se referir a células, tais como células tumorais) destina-se a incluir qualquer diminuição mensurável no crescimento de células (por exemplo, crescimento de células tumorais) quando em contato com um anticorpo contra um receptor alfa de folato (FOLR1), em comparação ao crescimento das mesmas células não em contato com um anticorpo contra FOLR1. Em algumas modalidades, o crescimento pode ser inibido em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou
25 / 202 100%. A diminuição no crescimento celular pode ocorrer por uma variedade de mecanismos, incluindo, mas não limitado a, internalização do anticorpo, apoptose, necrose e/ou atividade mediada por função efetora.
[0093] Neste relatório descritivo, o termo “indivíduo” significa um mamífero. Indivíduos exemplares incluem, entre outros, humanos, macacos, cães, gatos, camundongos, ratos, vacas, cavalos, camelos, aves, cabras e ovelhas. Em certas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é portador de uma doença que pode ser tratada ou diagnosticada com um anticorpo aqui provido. Em algumas modalidades, a doença é carcinoma gástrico, carcinoma colorretal, carcinoma de células renais, carcinoma cervical, carcinoma pulmonar de não pequenas células, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de mama triplo-negativo, câncer de endométrio, câncer de próstata e/ou um câncer de origem epitelial.
[0094] Em algumas estruturas químicas aqui ilustradas, certos substituintes, grupos químicos e átomos são representados com uma linha curva/ondulada (por exemplo, ) que cruza uma ligação ou ligações para indicar o átomo através do qual os substituintes, grupos químicos e átomos são ligados. Por exemplo, em algumas estruturas, tais como, mas não limitadas a, , ou , essa linha curva/ondulada indica os átomos na cadeia principal (backbone) de um conjugado ou na estrutura ligador-carga útil aos quais a entidade química ilustrada está ligada. Em algumas estruturas, tais como, mas não limitadas a, , essa linha curva/ondulada indica os átomos no anticorpo ou
26 / 202 fragmento de anticorpo, bem como os átomos na cadeia principal de um conjugado ou na estrutura ligador-carga útil aos quais a entidade química ilustrada está ligada.
[0095] O termo “sítio-específica” refere-se a uma modificação de um polipeptídeo em uma localização predeterminada da sequência no polipeptídeo. A modificação é em um único resíduo, previsível do polipeptídeo com pouca ou nenhuma variação. Em modalidades específicas, um aminoácido modificado é introduzido naquela localização da sequência, por exemplo, por recombinação ou sinteticamente. Do mesmo modo, uma porção pode ser ligada “especificamente a um sítio” a um resíduo em uma localização da sequência em particular no polipeptídeo. Em certas modalidades, um polipeptídeo pode compreender mais de uma modificação sítio-específica.
2. Conjugados
[0096] São aqui providos conjugados de anticorpos contra o receptor alfa de folato (FOLR1 ou FolRα). Os conjugados compreendem um anticorpo contra FOLR1 covalentemente ligado diretamente ou indiretamente, por meio de um ligador a uma carga útil. Em certas modalidades, o anticorpo é ligado a uma carga útil. Em modalidades adicionais, o anticorpo é ligado a mais de uma carga útil. Em certas modalidades, o anticorpo é ligado a duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou more cargas úteis.
[0097] A carga útil pode ser qualquer carga útil considera útil pelo profissional qualificado. Em certas modalidades, a carga útil é uma porção terapêutica. Em certas modalidades, a carga útil é uma porção diagnóstica, por exemplo, um marcador. Cargas úteis adequadas são descritas nas seções e exemplos abaixo.
[0098] O ligador pode ser qualquer ligador capaz de formar pelo menos uma ligação com o anticorpo e pelo menos uma ligação com uma carga útil. Ligadores úteis são descritos nas seções e exemplos abaixo.
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[0099] Nos conjugados aqui providos, o anticorpo pode ser qualquer anticorpo com especificidade de ligação pelo receptor alfa de folato (FOLR1 ou FolRα). O FOLR1 pode ser de qualquer espécie. Em certas modalidades, o FOLR1 é um FOLR1 de vertebrado. Em certas modalidades, o FOLR1 é um FOLR1 de mamífero. Em certas modalidades, o FOLR1 é o FOLR1 humano. Em certas modalidades, o FOLR1 é o FOLR1 de camundongo. Em certas modalidades, o FOLR1 é o FOLR1 de cinomolgo.
[00100] Em certas modalidades, o anticorpo contra o receptor alfa de folato (FOLR1 ou FolRα) compete com um anticorpo aqui descrito pela ligação. Em certas modalidades, o anticorpo contra FOLR1 liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo aqui descrito.
[00101] O anticorpo é tipicamente uma proteína compreendendo múltiplas cadeias polipeptídicas. Em certas modalidades, o anticorpo é um heterotetrâmero que compreende duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve pode ser ligada a uma cadeia pesada por uma ligação covalente dissulfeto. Cada cadeia pesada pode ser ligada à outra cadeia pesada por uma ou mais ligações covalentes dissulfeto. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve podem também ter uma ou mais ligações dissulfeto entre as cadeias. Tal qual é sabido pelos versados na técnica, cada cadeia pesada tipicamente compreende um domínio variável (VH) seguido por alguns domínios constantes. Cada cadeia leve tipicamente compreende um domínio variável em uma ponta (VL) e um domínio constante. Tal qual é sabido pelos versados na técnica, os anticorpos tipicamente têm afinidade seletiva por suas moléculas alvo, ou seja, antígenos.
[00102] Os anticorpos aqui providos podem ter qualquer forma de anticorpo conhecida pelos versados na técnica. Podem ser completes ou fragmentos. Os anticorpos completos exemplares incluem IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM etc. Os fragmentos exemplares
28 / 202 incluem Fv, Fab, Fc, scFv, scFv-Fc etc.
[00103] Em certas modalidades, o anticorpo do conjugado compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das sequências de CDR aqui descritas. Em certas modalidades, o anticorpo do conjugado compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) aqui descrito. Em certas modalidades, o anticorpo do conjugado compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) aqui descrito. Em certas modalidades, o anticorpo do conjugado compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) aqui descrito e um domínio variável da cadeia leve (VL) aqui descrito. Em certas modalidades, o anticorpo do conjugado compreende um domínio variável da cadeia pesada pareado com um domínio variável da cadeia leve aqui descrito (par VH-VL).
[00104] Em certas modalidades, o conjugado de anticorpo pode ser formado a partir de um anticorpo que compreende um ou mais grupos reativos. Em certas modalidades, o conjugado de anticorpo pode ser formado a partir de um anticorpo compreendendo todos os aminoácidos naturalmente codificados. Os versados na técnica reconhecerão que diversos aminoácidos naturalmente codificados incluem grupos reativos capazes de conjugação com uma carga útil ou com um ligador. Esses grupos reativos incluem cadeias laterais de cisteína, cadeias laterais de lisina e grupos amino-terminal. Nessas modalidades, o conjugado de anticorpo pode compreender uma carga útil ou ligador ligado ao resíduo de um grupo reativo do anticorpo. Nessas modalidades, o precursor da carga útil ou o precursor de ligador compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação com um grupo reativo do anticorpo. Os grupos reativos típicos incluem grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, mas não limitados a, p-nitrofenil éster), ésteres ativados (incluindo, mas não limitados a, N-hidroxissuccinimida, p-nitrofenil éster e aldeídos). Os grupos reativos especialmente úteis incluem maleimida e succinimida, por exemplo, N-hidroxissuccinimida, para formação de ligações com cadeias laterais de cisteína e lisina. Grupos reativos adicionais são
29 / 202 descritos nas seções e exemplos abaixo.
[00105] Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende um ou mais aminoácidos modificados com um grupo reativo, como aqui descrito. Tipicamente, o aminoácido modificado não é um aminoácido naturalmente codificado. Esses aminoácidos modificados podem compreender um grupo reativo útil para formação de uma ligação covalente com um precursor de ligador ou com um precursor da carga útil. O técnico no assunto pode utilizar o grupo reativo para ligar o polipeptídeo a qualquer entidade molecular capaz de formar uma ligação covalente com o aminoácido modificado. Assim, são aqui providos conjugados que compreendem um anticorpo compreendendo um resíduo de aminoácido modificado ligado a uma carga útil diretamente ou indiretamente por meio de um ligador. Aminoácidos modificados exemplares são descritos nas seções abaixo. Em geral, os aminoácidos modificados têm grupos reativos capazes de formar ligações a ligadores ou cargas úteis com grupos reativos complementares.
[00106] Os aminoácidos não naturais estão posicionados em localizações selecionadas em uma cadeia polipeptídica do anticorpo. Essas localizações foram identificadas como aquelas que proporcionam sítios ótimos para substituição pelos aminoácidos não naturais. Cada sítio é capaz de carregar um aminoácido não natural com estrutura, função e/ou métodos ótimos para produção do anticorpo.
[00107] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo que é estável. A estabilidade pode ser medida por qualquer técnica evidente para os versados na técnica.
[00108] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo com propriedades funcionais ótimas. Por exemplo, o anticorpo pode mostrar pouca ou nenhuma perda da afinidade de ligação por seu antígeno alvo em comparação a um anticorpo sem o aminoácido não natural sítio-específico. Em certas modalidades, o anticorpo
30 / 202 pode mostrar ligação aperfeiçoada em comparação com o sem o aminoácido não natural sítio-específico.
[00109] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo que pode ser produzido com vantagens. Por exemplo, em certas modalidades, o anticorpo mostra propriedades vantajosas em seus métodos de síntese, discutidos abaixo. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar pouca ou nenhuma perda de rendimento na produção em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar rendimento aperfeiçoado na produção em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio- específico. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar pouca ou nenhuma perda da supressão de tRNA em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar supressão intensificada de tRNA na produção em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico.
[00110] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo com vantagem em termos de solubilidade. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar pouca ou nenhuma perda na solubilidade em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio- específico. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar solubilidade aperfeiçoada em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico.
[00111] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo com vantagem em termos de expressão. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar pouca ou nenhuma perda na expressão em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio- específico. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar expressão aperfeiçoada em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico.
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[00112] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo com vantagem em termos de dobramento. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar pouca ou nenhuma perda no dobramento correto em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar dobramento aperfeiçoado em comparação a um anticorpo sem o anticorpo não natural sítio-específico.
[00113] Em certas modalidades, uma posição para substituição sítio- específica fornece um anticorpo que é capaz de conjugação vantajosa. Como descrito abaixo, diversos aminoácidos não naturais possuem cadeias laterais e grupos funcionais que facilitam a conjugação do anticorpo com um segundo agente, quer diretamente ou por meio de um ligador. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar eficiência de conjugação aperfeiçoada em comparação a um anticorpo sem os mesmos ou outros aminoácidos não naturais em outras posições. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar rendimento de conjugação aperfeiçoado em comparação a um anticorpo sem os mesmos ou outros aminoácidos não naturais em outras posições. Em certas modalidades, o anticorpo pode mostrar especificidade de conjugação aperfeiçoada em comparação a um anticorpo sem os mesmos ou com outros aminoácidos não naturais em outras posições.
[00114] Um ou mais aminoácidos não naturais estão localizados em posições sítio-específicas selecionadas em pelo menos uma cadeia polipeptídica do anticorpo. A cadeia polipeptídica pode ser qualquer cadeia polipeptídica do anticorpo sem limitação, incluindo qualquer cadeia leve ou cadeia pesada. A posição sítio-específica pode ser em qualquer domínio do anticorpo, incluindo qualquer domínio variável e qualquer domínio constante.
[00115] Em certas modalidades, os anticorpos aqui providos compreendem um aminoácido não natural em uma posição sítio-específica. Em certas modalidades, os anticorpos aqui providos compreendem dois
32 / 202 aminoácidos não naturais em posições sítio-específicas. Em certas modalidades, os anticorpos aqui providos compreendem três aminoácidos não naturais em posições sítio-específicas. Em certas modalidades, os anticorpos aqui providos compreendem mais de três aminoácidos não naturais em posições sítio-específicas.
[00116] Em certas modalidades, os anticorpos aqui providos compreendem um ou mais aminoácidos não naturais cada um em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em resíduos da cadeia pesada ou da cadeia leve HC-F404, HC-K121, HC-Y180, HC-F241, HC-221, LC-T22, LC- S7, LC-N152, LC-K42, LC-E161, LC-D170, HC-S136, HC-S25, HC-A40, HC-S119, HC-S190, HC-K222, HC-R19, HC-Y52 ou HC-S70 de acordo com o esquema de numeração de Kabat ou Chothia ou EU, ou uma variante dos mesmos após modificação pós-traducional. Nessas designações, HC indica um resíduo da cadeia pesada e LC indica um resíduo da cadeia leve.
[00117] Em certas modalidades, são providos conjugados de acordo com a Fórmula (C1) ou (C2): (C1) (C2) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, estereoisômero, regioisômero ou tautômero do mesmo, em que: COMP é um resíduo de um anticorpo anti-FOLR1; PAY é uma porção de carga útil; W1, W2, W3, W4 e W5 são, cada um independentemente, uma ligação dupla, está ausente ou é um grupo de junção bivalente; EG está ausente ou é um grupo eliminador; cada RT é um grupo a grupo acionador da liberação, na cadeia principal de Fórmula (C1) ou (C2) ou ligado a EG, em que cada RT é
33 / 202 opcional; HP é uma ligação dupla, está ausente ou é um grupo hidrofílico bivalente; SG é uma ligação dupla, está ausente ou é um grupo espaçador bivalente; e R é hidrogênio, um grupo conjugador terminal ou um resíduo bivalente um grupo conjugador terminal.
[00118] Em algumas modalidades, um conjugado de acordo com a Fórmula (C1) ou (C2) compreende n número de porções PAY, em que n é um número inteiro de 1 a 8. Em algumas modalidades, n é 2. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é 4. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é 6. Em algumas modalidades, n é 7. Em algumas modalidades, n é 8. Grupos de junção
[00119] Os grupos de junção facilitam a incorporação de grupos eliminadores, grupos acionadores da liberação, grupos hidrofóbicos, grupos espaçadores, e/ou grupos conjugadores em um composto. Grupos de junção úteis são conhecidos e evidentes para os versados na técnica. Exemplos de grupos de junção úteis são fornecidos abaixo. Em certas modalidades, os grupos de junção recebem a designação W1, W2, W3, W4 ou W5. Em certas modalidades, um grupo de junção pode compreender uma cetona bivalente, éster bivalente, éter bivalente, amida bivalente, amina bivalente, alquileno, arileno, sulfeto, dissulfeto, carbonileno ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um grupo de junção pode compreender -C(O)-, -O-, - C(O)NH-, -C(O)NH-alquil-, -OC(O)NH-, -SC(O)NH-, -NH-, -NH-alquil-, - N(CH3)CH2CH2N(CH3)-, -S-, -S-S-, -OCH2CH2O-, ou o inverso (por exemplo, -NHC(O)-) ou uma combinação dos mesmos. Grupos eliminadores
[00120] Os grupos eliminadores facilitam a separação de uma parte
34 / 202 biologicamente ativa de um composto ou conjugado aqui descrito do restante do composto ou conjugado in vivo e/ou in vitro. Os grupos eliminadores podem também facilitar a separação de uma parte biologicamente ativa de um composto ou conjugado aqui descrito em conjunto com um grupo acionador da liberação. Por exemplo, o grupo eliminador e o grupo acionador da liberação podem reagir em uma Reação de Liberação para liberar uma parte biologicamente ativa de um composto ou conjugado aqui descrito do composto ou conjugado in vivo e/ou in vitro. Quando do início da Reação de Liberação pelo acionador da liberação, o grupo eliminador cliva a porção biologicamente ativa, ou uma forma de pró-fármaco da porção biologicamente ativa, e forma uma entidade estável, não tóxica que não tem qualquer efeito sobre a atividade da porção biologicamente ativa.
[00121] Em certas modalidades, o grupo eliminador é designado EG no presente. Os grupos eliminadores úteis incluem aqueles descritos abaixo. Em certas modalidades, o grupo eliminador é: , ou ; em que REG é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, bifenila, -CF3, -NO2, -CN, flúor, bromo, cloro, alcoxila, alquilamino, dialquilamino, alquil-C(O)O-, alquilamino-C(O)- e dialquilaminoC(O)-. Em cada estrutura, o anel fenila pode ser ligado a um,
35 / 202 dois, três, ou em alguns casos, quatro grupos REG. Na segunda e na terceira estrutura, os versados na técnica reconhecerão que EG está ligado a um RT que não está dentro da cadeia principal de Fórmula (C1), como indicado na descrição acima da Fórmula (C1). Em algumas modalidades, REG é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, bifenila, - CF3, alcoxila, alquilamino, dialquilamino, alquil-C(O)O-, alquilamino-C(O)- e dialquilaminoC(O)-. Em modalidades adicionais, REG é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, -NO2, -CN, flúor, bromo e cloro. Em certas modalidades, o grupo eliminador é . Em certas modalidades, o grupo eliminador é . Em certas modalidades, o grupo eliminador é .
[00122] Em algumas modalidades, o grupo eliminador é: , ou
36 / 202 .
[00123] em que Z pode ser CH ou N, REG é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, bifenila, -CF3, -NO2, -CN, flúor, bromo, cloro, alcoxila, alquilamino, dialquilamino, alquil-C(O)O-, alquilamino-C(O)- e dialquilaminoC(O)-. Em cada estrutura, o anel fenila pode ser ligado a um, dois, três, ou em alguns casos, quatro grupos REG. Na primeira e na segunda estrutura, os versados na técnica reconhecerão que EG está ligado a um RT que não está dentro da cadeia principal de Fórmula (C1), como indicado na descrição acima da Fórmula (C1). Em algumas modalidades, REG é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, bifenila, -CF3, alcoxila, alquilamino, dialquilamino, alquil-C(O)O-, alquilamino-C(O)- e dialquilaminoC(O)-. Em modalidades adicionais, REG é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, -NO2, -CN, flúor, bromo e cloro. Em algumas modalidades, cada REG no EG é hidrogênio. Em certas modalidades, o grupo eliminador é . Em certas modalidades, o grupo eliminador é
37 / 202 . Em certas modalidades, o grupo eliminador é . Grupos acionadores da liberação
[00124] Os grupos acionadores da liberação facilitam a separação de uma parte biologicamente ativa de um composto ou conjugado aqui descrito do restante do composto ou conjugado in vivo e/ou in vitro. Os grupos acionadores da liberação podem também facilitar a separação de uma parte biologicamente ativa de um composto ou conjugado aqui descrito em conjunção com um grupo eliminador. Por exemplo, o grupo eliminador e o grupo acionador da liberação podem reagir em uma Reação de Liberação para liberar uma parte biologicamente ativa de um composto ou conjugado aqui descrito do composto ou conjugado in vivo e/ou in vitro. Em certa modalidade, o acionador da liberação pode atuar através de uma reação dirigida biologicamente com alta especificidade tumor:não tumor, tal como a ação proteolítica de uma enzima superexpressada em um ambiente tumoral.
[00125] Em certas modalidades, o grupo acionador da liberação é designado RT no presente. Em certas modalidades, RT é bivalente e ligado dentro da cadeia principal de Fórmula (C1). Em outra modalidades, RT é
38 / 202 monovalente e ligado a EG como representado acima. Os grupos acionadores da liberação úteis incluem aqueles descritos abaixo. Em certas modalidades, o grupo acionador da liberação compreende um resíduo de um aminoácido natural ou não natural ou resíduo de um anel de açúcar. Em certas modalidades, o grupo acionador da liberação é: ou .
[00126] Os versados na técnica reconhecerão que a primeira estrutura é bivalente e pode estar ligada dentro da cadeia principal de Fórmula (C1) ou como representado na Fórmula (C2), e que a segunda estrutura é monovalente e pode estar ligada a EG como representado na Fórmula (C1) acima.
[00127] Em certas modalidades, o grupo acionador da liberação é . Em certas modalidades, o grupo acionador da liberação é .
[00128] Em algumas modalidades, o grupo acionador da liberação é um peptídeo R1-Val-X que pode ser clivado por protease, tendo a estrutura de:
39 / 202 em que R1 é H ou e R2 é CH3, CH2CH2CO2H ou (CH2)3NHCONH2; um peptídeo Ala-Ala-Asn ou Ala- Ala-Asp que pode ser clivado por legumaína, tendo a estrutura de: onde Z é OH ou NH2; ou um glicuronídeo que pode ser clivado por β-glicuronidase, tendo a estrutura de: .
[00129] Os versados na técnica reconhecerão que e são estruturas bivalentes e podem estar ligados dentro da cadeia principal de Fórmula (C1) ou como representados na Fórmula (C2). A estrutura é monovalente e pode estar ligada a EG como representado na Fórmula (C1) acima. Grupos hidrofílicos
[00130] Os grupos hidrofílicos facilitam aumentando a hidrofilicidade dos compostos aqui descritos. Acredita-se que a hidrofilicidade aumentada permite maior solubilidade em soluções aquosas, tais como as soluções aquosas encontradas em sistemas biológicos. Os grupos hidrofílicos podem também atuar como grupos espaçadores, os quais são descritos mais
40 / 202 detalhadamente abaixo.
[00131] Em certas modalidades, o grupo hidrofílico é designado HP no presente. Os grupos hidrofílicos úteis incluem aqueles descritos abaixo. Em certas modalidades, o grupo hidrofílico é um poli(etilenoglicol) bivalente. Em certas modalidades, o grupo hidrofílico é um poli(etilenoglicol) bivalente de acordo com a fórmula: ; em que m é um número inteiro de 1 a 13, opcionalmente 1 a 4, opcionalmente 2 a 4 ou opcionalmente 4 a 8.
[00132] Em algumas modalidades, o grupo hidrofílico é um poli(etilenoglicol) bivalente tendo a fórmula seguinte: .
[00133] Em algumas outras modalidades, o grupo hidrofílico é um poli(etilenoglicol) bivalente tendo a fórmula seguinte: .
[00134] Em outra modalidades, o grupo hidrofílico é um poli(etilenoglicol) bivalente tendo a fórmula seguinte: .
[00135] Em outra modalidades, o grupo hidrofílico é um poli(etilenoglicol) bivalente tendo a fórmula seguinte: .
[00136] Em algumas modalidades, o grupo hidrofílico pode carregar um ácido sulfônico presente na cadeia tendo a fórmula: . Grupos espaçadores
41 / 202
[00137] Os grupos espaçadores facilitam o espaçamento entre o grupo conjugador e os outros grupos dos compostos aqui descritos. Esse espaçamento pode levar à conjugação mais eficiente dos compostos aqui descritos com um segundo composto, bem como à clivagem mais eficiente do catabólito ativo. O grupo espaçador pode também estabilizar o grupo conjugador e melhorar as propriedades globais do conjugado fármaco- anticorpo.
[00138] Em certas modalidades, o grupo espaçador é designado SP no presente. Os grupos espaçadores úteis incluem aqueles descritos abaixo. Em certas modalidades, o grupo espaçador é: , ou .
[00139] Em certas modalidades, o grupo espaçador, W4 e o grupo hidrofílico combinam para formar um poli(etilenoglicol) bivalente de acordo com a fórmula: ; em que m é um número inteiro de 1 a 13, opcionalmente 1 a 4, opcionalmente 2 a 4 ou opcionalmente 4 a 8.
[00140] Em algumas modalidades, o SP é .
[00141] Em algumas modalidades, o poli(etilenoglicol) bivalente tem a fórmula seguinte: .
[00142] Em algumas outras modalidades, o poli(etilenoglicol) bivalente tem a fórmula seguinte: .
[00143] Em outra modalidades, o poli(etilenoglicol) bivalente tem a
42 / 202 fórmula seguinte: .
[00144] Em outra modalidades, o poli(etilenoglicol) bivalente tem a fórmula seguinte: .
[00145] Em algumas modalidades, o grupo hidrofílico pode carregar um ácido sulfônico presente na cadeia tendo a fórmula: . Grupos conjugadores e resíduos dos mesmos
[00146] Os grupos conjugadores facilitam a conjugação das cargas úteis aqui descrita com um segundo composto, tal como um anticorpo aqui descrito. Em certas modalidades, o grupo conjugador é designado R no presente. Os grupos conjugadores podem reagir por intermédio de qualquer mecanismo de reação adequado conhecido pelos versados na técnica. Em certas modalidades, um grupo conjugador reage através de uma reação de cicloadição [3+2] entre alcino e azida, reação de ligação de Diels-Alder com demanda inversa de elétrons, reação com eletrófilos-tio. ou reação com carbonil-oxiamina, como descrito detalhadamente abaixo. Em certas modalidades, o grupo conjugador compreende um alcino, alcino tensionado, tetrazina, tiol, resíduo para-acetil-fenilalanina, oxiamina, maleimida ou azida. Em certas modalidades, o grupo conjugador é: , , , , ,
43 / 202 , , , , , -N3 ou -SH; em que R201 é alquila inferior. Em uma modalidade, R201 é metila, etila ou propila. Em uma modalidade, R201 é metila. Grupos conjugadores adicionais são descritos em, por exemplo, Publicação da Patente U.S. No 2014/0356385, Publicação da Patente U.S. No 2013/0189287, Publicação da Patente U.S. No 2013/0251783, Patente U.S. No 8 703 936, Patente U.S. No 9 145 361, Patente U.S. No 9 222 940, e Patente U.S. No 8 431 558.
[00147] Após a conjugação, um resíduo bivalente do grupo conjugador é formado e ligado ao resíduo de um segundo composto. A estrutura do resíduo bivalente é determinada pelo tipo de reação de conjugação empregada para formar o conjugado.
[00148] Em certas modalidades, quando um conjugado é formado através de uma reação de cicloadição [3+2] entre alcino e azida, o resíduo bivalente do grupo conjugador compreende um anel triazol ou um grupo cíclico fundido compreendendo um anel triazol. Em certa modalidade quando um conjugado é formado através de uma reação de ciclo adição [3+2] alcino- azida promovida por tensão (SPAAC), o resíduo bivalente do grupo conjugador é: e/ou .
[00149] Em uma modalidade, é provido um conjugado de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, onde COMP indica um resíduo do anticorpo anti-FOLR1 e PAY indica uma porção de carga útil:
44 / 202 (101a) (101b) (102a)
O O O O COMP O O N N N O O N PAY N H
N (102b) (103a) (103b)
45 / 202 (104a) (104b).
[00150] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o conjugado compreende n número de porções PAY, em que n é um número inteiro de 1 a
8. Em algumas modalidades, n é 2. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é 4. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é 6. Em algumas modalidades, n é 7. Em algumas modalidades, n é 8.
[00151] Em modalidades específicas, são providos conjugados anti- FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (30), abaixo. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (30), abaixo, na posição 404 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (30), abaixo, na posição 180 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo
46 / 202 com a Fórmula (30), abaixo, na posição 241 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (30), abaixo, na posição 222 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (30), abaixo, na posição 7 da cadeia leve de acordo com o sistema de numeração de Kabat ou Chothia. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (30), abaixo, na posição 42 da cadeia leve de acordo com o sistema de numeração de Kabat ou Chothia. Em certas modalidades, PAY é selecionada a partir do grupo que consiste em maitansina, hemiasterlina, amanitina, monometil auristatina F (MMAF) e monometil auristatina E (MMAE). Em certas modalidades, a PAY é maitansina. Em certas modalidades, PAY é hemiasterlina. Em certas modalidades, PAY é amanitina. Em certas modalidades, PAY é MMAF. Em certas modalidades, PAY é MMAE.
(30)
[00152] Em modalidades específicas, são providos conjugados anti- FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo. Em modalidades específicas, são providos conjugados
47 / 202 anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo, na posição 404 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU.
Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo, na posição 180 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU.
Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo, na posição 241 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU.
Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo, na posição 222 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU.
Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a- 104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo, na posição 7 da cadeia leve de acordo com o sistema de numeração de Kabat ou Chothia.
Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo do aminoácido não natural de acordo com a Fórmula (56), abaixo, na posição 42 da cadeia leve de acordo com o sistema de numeração de Kabat ou Chothia.
Em certas modalidades, PAY é selecionada a partir do grupo que consiste em maitansina, hemiasterlina, amanitina, MMAF e MMAE.
Em certas modalidades, a PAY é maitansina.
Em certas modalidades, PAY é hemiasterlina.
Em certas modalidades, PAY é amanitina.
Em certas modalidades, PAY é MMAF.
Em certas modalidades, PAY é MMAE.
48 / 202 (56)
[00153] Em modalidades específicas, são providos conjugados anti- FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo de aminoácido não natural de para-azido-L- fenilalanina. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti- FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica o resíduo de aminoácido não natural para-azido-fenilalanina na posição 404 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo de aminoácido não natural de para-azido-L-fenilalanina na posição 180 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo de aminoácido não natural de para-azido-L-fenilalanina na posição 241 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo de aminoácido não natural de para-azido-L-fenilalanina na posição 222 da cadeia pesada de acordo com o sistema de numeração EU. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo de aminoácido não natural de para-azido-L-fenilalanina na posição 7 da cadeia leve de acordo com o sistema de numeração de Kabat ou Chothia. Em modalidades específicas, são providos conjugados anti-FOLR1 de acordo com qualquer uma das Fórmulas 101a-104b, em que COMP indica um resíduo de aminoácido não natural de para-azido-L-fenilalanina na posição 42 da cadeia
49 / 202 leve de acordo com o sistema de numeração de Kabat ou Chothia. Em certas modalidades, PAY é selecionada a partir do grupo que consiste em maitansina, hemiasterlina, amanitina, MMAF e MMAE. Em certas modalidades, a PAY é maitansina. Em certas modalidades, PAY é hemiasterlina. Em certas modalidades, PAY é amanitina. Em certas modalidades, PAY é MMAF. Em certas modalidades, PAY é MMAE.
[00154] Em algumas modalidades, são providos conjugados anti- FOLR1 compreendendo uma hemiasterlina modificada e ligador como descrito, por exemplo, na Publicação PCT No WO 2016/123582. Por exemplo, o conjugado pode ter uma estrutura compreendendo qualquer uma das Fórmulas 1000-1000b, 1001-1001b, 1002-1002b e I-XIXb-2, 101-111b, ou 1-8b, como descrito na Publicação PCT No WO 2016/2016/123582. Exemplos de conjugados que compreendem uma hemiasterlina modificada e ligador são fornecidos abaixo.
[00155] Em algumas modalidades, são providos conjugados anti- FOLR1 tendo a estrutura do Conjugado M: onde n é um número inteiro de 1 a 6. Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 4. Em algumas modalidades, n é
2. Por exemplo, em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 tem a estrutura: .
50 / 202
[00156] Em algumas modalidades, n é 4. Por exemplo, em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 tem a estrutura: .
[00157] Em algumas modalidades, são providos conjugados anti- FOLR1 tendo a estrutura do Conjugado P: H2N O
HN O O H H N N HN N N H
N O O H O N O N CO2H
N N O H
NH O n onde n é um número inteiro de 1 a 6. Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 4. Em algumas modalidades, n é
2. Por exemplo, em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 tem a estrutura: .
[00158] Em algumas modalidades, n é 4. Por exemplo, em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 tem a estrutura:
51 / 202 .
[00159] Em algumas modalidades, são providos conjugados anti- FOLR1 tendo a estrutura do Conjugado Q: onde n é um número inteiro de 1 a 6. Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 4. Em algumas modalidades, n é
2. Por exemplo, em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 tem a estrutura: .
[00160] Em algumas modalidades, n é 4. Por exemplo, em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 tem a estrutura:
O O H H N N HN N N N H O
O H O N O N CO2H
N N O H NH O
4.
[00161] Em qualquer uma das modalidades anteriores em que o conjugado anti-FOLR1 tem uma estrutura de acordo com o Conjugado M, Conjugado P ou Conjugado Q, a estrutura entre colchetes pode ser ligada covalentemente a um ou mais aminoácidos não naturais do anticorpo, em que um ou mais dos aminoácidos não naturais estão localizados em sítios
52 / 202 selecionados a partir do grupo que consiste em: HC-F404, HC-Y180 e LC- K42 de acordo com o esquema de numeração de Kabat ou EU. Em algumas modalidades, a estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um ou mais aminoácidos não naturais no sítio HC-F404 do anticorpo. Em algumas modalidades, a estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um ou mais aminoácidos não naturais no sítio HC-Y180 do anticorpo. Em algumas modalidades, a estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um ou mais aminoácidos não naturais no sítio LC-K42 do anticorpo. Em algumas modalidades, a estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um ou mais aminoácidos não naturais nos sítios HC-F404 e HC-Y180 do anticorpo. Em algumas modalidades, pelo menos uma estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um aminoácido não natural no sítio HC-F404 do anticorpo, e pelo menos uma estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um aminoácido não natural no sítio HC-Y180 do anticorpo. Em algumas modalidades, a estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um ou mais aminoácidos não naturais nos sítios HC-Y180 e LC-K42 do anticorpo. Em algumas modalidades, pelo menos uma estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um aminoácido não natural no sítio HC-Y180 do anticorpo, e pelo menos uma estrutura entre colchetes é ligada covalentemente a um aminoácido não natural no sítio LC-K32 do anticorpo.
3. Cargas úteis
[00162] Além das cargas úteis descritas acima, a carga útil molecular pode ser qualquer entidade molecular que o técnico no assunto possa desejar conjugar ao polipeptídeo. Em certas modalidades, a carga útil é uma porção terapêutica. Em tal modalidade, o conjugado de anticorpo pode ser utilizado para direcionar a porção terapêutica a seu alvo molecular. Em certas modalidades, a carga útil é uma porção de marcação. Em tais modalidades, o conjugado de anticorpo pode ser utilizado para detectar a ligação do polipeptídeo ao seu alvo. Em certas modalidades, a carga útil é uma porção
53 / 202 citotóxica. Em tais modalidades, o conjugado de anticorpo pode ser utilizado para direcionar a porção citotóxica até uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerígena, para iniciar a destruição ou eliminação da célula. Conjugados compreendendo outras cargas úteis moleculares evidentes para os versados na técnica são abrangidos pelo âmbito dos conjugados aqui descritos.
[00163] Em certas modalidades, um conjugado de anticorpo pode ter uma carga útil selecionada a partir do grupo que consiste em um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, polietilenoglicol, um derivado de polietilenoglicol, um agente de fotorreticulação, um composto citotóxico, um radionuclídeo, um fármaco, um marcador de afinidade, um marcador de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo do polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antisense, um peptídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, uma porção contendo metal, uma porção radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalente e não covalentemente com outras moléculas, uma porção photocaged (fotorregulada), uma porção fotoisomérizável, biotina, um derivado da biotina, um análogo da biotina, uma porção incorporando um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um aminotioácido, uma porção tóxica, uma porção marcada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo eletronicamente denso, um grupo magnético, um grupo intercalador, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um marcador detectável, uma molécula pequena ou
54 / 202 qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a carga útil é um marcador, um corante, um polímero, um composto citotóxico, um radionuclídeo, um fármaco, um marcador de afinidade, uma resina, uma proteína, um polipeptídeo, um análogo do polipeptídeo, um anticorpo, fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um peptídeo, um fluoróforo ou um açúcar ligado a carbono. Em outra modalidade, a carga útil é um marcador, um corante, um polímero, um fármaco, um anticorpo, fragmento de anticorpo, um DNA, um RNA ou um peptídeo.
4. Ligadores
[00164] Em certas modalidades, os anticorpos podem ser ligados às cargas úteis com um ou mais ligadores capazes de reagir com um aminoácido do anticorpo e com um grupo da carga útil. Um ou mais ligadores podem ser quaisquer ligadores evidentes para os versados na técnica.
[00165] O termo “ligador”, neste relatório descritivo, refere-se a grupos ou ligações que normalmente são formados como resultado de uma reação típica e tipicamente são ligações covalentes.
[00166] Os ligadores úteis incluem aqueles aqui descritos. Em certas modalidades, o ligador é qualquer ligador bivalente ou multivalente conhecido pelos versados na técnica. Os ligadores bivalentes úteis incluem alquileno, alquileno substituído, heteroalquileno, heteroalquileno substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno e heteroarileno substituído. Em certas modalidades, o ligador é alquileno C1-10 ou heteroalquileno C1-10. Em algumas modalidades, o heteroalquilenoC1-10 é PEG.
[00167] Em certas modalidades, o ligador é hidroliticamente estável. Ligações hidroliticamente estáveis significam ligações substancialmente estáveis em água e que não reagem com água em valores úteis de pH, incluindo, mas não limitadas a, sob condições fisiológica por um período prolongado de tempo, talvez mesmo indefinidamente. Em certas modalidades,
55 / 202 o ligador é hidroliticamente instável. Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam ligações degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam ligações que podem ser degradadas por uma ou mais enzimas.
[00168] Tal como entendido na técnica, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal do polímero ou no grupo ligador entre a cadeia principal do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula polimérica. Por exemplo, ligações éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos do PEG ou ácido carboxílicos ativados do PEG com grupos alcoólicos em um agente biologicamente ativo em geral hidrolisam sob condições fisiológicas e liberam o agente.
[00169] Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, sem limitação, ligações carbonato; ligações imina resultantes da reação de uma amina e um aldeído; ligações ésteres de fosfato formadas reagindo um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são o produto de reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto de reação de um formato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amino, incluindo, mas não limitados a, na extremidade de um polímero, tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não limitados a, na extremidade de um polímero, e um grupo hidroxila 5’ de um oligonucleotídeo.
[00170] Alguns ligadores cliváveis diferentes são conhecidos pelos versados na técnica. Ver Patentes U.S. Nos 4 618 492; 4 542 225 e 4 625 014. Os mecanismos para liberação de um agente desses grupos ligador incluem, por exemplo, irradiação de uma ligação fotossensível e hidrólise catalisada por ácido. A Patente U.S. No 4 671 958, por exemplo, inclui uma descrição de
56 / 202 imunoconjugados compreendendo ligadores que são clivados no sítio alvo pelas enzimas proteolíticas do sistema complemento do paciente. O comprimento do ligador pode ser predeterminado ou selecionado dependendo da relação espacial desejada entre o polipeptídeo e a molécula ligada ao mesmo. Em vista do grande número de métodos que foram relatados para anexar uma variedade de compostos radiodiagnósticos, compostos, radioterápicos, fármacos, toxinas e outros agentes a polipeptídeos, o técnico no assunto será capaz de determinar um método adequado para anexar um dado agente a um polipeptídeo.
[00171] O ligador pode ter uma grande variedade de pesos moleculares ou comprimentos moleculares. É possível utilizar ligadores de peso molecular menor ou maior para obter uma relação espacial desejada ou conformação entre o polipeptídeo e a entidade ligada. Ligadores com comprimento molecular mais longo ou mais curto podem também ser utilizados para obter um espaço ou flexibilidade desejada entre o polipeptídeo e a entidade ligada. Do mesmo modo, um ligador com uma forma ou conformação em particular pode ser utilizado para transmitir uma determinada forma ou conformação ao polipeptídeo ou à entidade ligada, quer antes ou depois que o polipeptídeo atingir seu alvo. Os grupos funcionais presentes em cada extremidade do ligador podem ser selecionados para modular a liberação de um polipeptídeo ou uma carga útil sob condições desejadas. Essa otimização da relação especial entre o polipeptídeo e a entidade ligada pode fornecer ovas propriedades moduladas ou desejadas à molécula.
[00172] Em algumas modalidades, são providos ligadores bifuncionais solúveis em água com uma estrutura do tipo haltere que incluem: a) uma porção contendo azida, alcino, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina ou carbonila em pelo menos uma primeira extremidade de uma cadeia principal polimérica; e b) pelo menos um segundo grupo funcional em uma segunda extremidade da cadeia principal polimérica. O segundo grupo funcional pode
57 / 202 ser igual ou diferente do primeiro grupo funcional. O segundo grupo funcional, em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. Em algumas modalidades, são providos compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser uma estrutura dendrítica.
[00173] Em algumas modalidades, o ligador é derivado de um precursor de ligador selecionado a partir do grupo que consiste em: N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil 4-(2- piridilditio)pentanoato de (SPP), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo-butanoato (sulfo-SPDB), N- succinimidil-iodoacetato (SIA), N-succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB), maleimida PEG NHS, N-succinimidil 4- (maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-sulfosuccinimidil 4- (maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (sulfo-SMCC) ou 17-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-il)-5,8,11,14-tetraoxo-4,7,10,13-tetraazaheptadecan-1- oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (CX1-1). Em uma modalidade específica, o ligador é derivado do precursor de ligador N-succinimidil 4- (maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC).
[00174] Em algumas modalidades, o ligador é derivado de um precursor de ligador selecionado a partir do grupo que consiste em dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos e pentapeptídeos. Em tais modalidades, o ligador pode ser clivado por uma protease. Os dipeptídeos exemplares incluem, entre outros, valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina- fenilalanina (af ou ala-phe); fenilalanina-lisina (fk ou phe-lys); fenilalanina- homolisina (phe-homolys); e N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Os tripeptídeos exemplares incluem, entre outros, glicina-valina-citrulina (gly- val-cit), glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly), e glicina-metoxietoxietil)serina- valina (gly-val-citalanina OMESerValAla).
58 / 202
[00175] Em algumas modalidades, um ligador compreende um espaçador auto-imolativo. Em certas modalidades, o espaçador auto-imolativo compreende p-aminobenzila. Em algumas modalidades, um álcool p- aminobenzílico é anexado a uma unidade de aminoácido através de uma ligação amida, sendo produzido um carbamato, metilcarbamato ou carbonato entre o álcool benzílico e a carga útil (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). Em algumas modalidades, o ligador compreende p-aminobenziloxicarbonyla (PAB). Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem, compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes ao grupo PAB, tal como os derivados 2- aminoimidazol-5-metanol (Patente U.S. No 7 375 078; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto- ou para-aminobenzilacetais. Em algumas modalidades, podem ser utilizados espaçadores que sofrem ciclização quando da hidrólise da ligação amida, tal como amidas substituídas e não substituídas do ácido 4-aminobutírico (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] adequadamente substituídos (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). A ligação de um fármaco ao carbono α de um resíduo de glicina é outro exemplo de um espaçador auto-imolativo que pode ser útil em conjugados (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
[00176] Em certas modalidades, os precursores de ligador podem ser combinados para formar ligadores maiores. Por exemplo, em certas modalidades, os ligadores compreendem o dipeptídeo valina-citrulina e p-aminobenziloxicarbonila. Eles são também referidos como ligadores citValCit--PAB.
[00177] Em certas modalidades, as cargas úteis podem ser ligadas aos ligadores, aqui referidos como um ligador-carga útil, com um ou mais grupos de ligador capazes de reagir com grupo de aminoácido do anticorpo
59 / 202 aminoácido grupo. Um ou mais ligadores podem ser quaisquer ligadores evidentes para os versados na técnica ou aqueles apresentados no presente.
[00178] Ligadores adicionais são aqui descritos, tais como, por exemplo, os precursores de ligador (A)-(L) descritos abaixo.
5. Especificidade do anticorpo
[00179] Os conjugados compreendem anticorpos que se ligam seletivamente ao receptor alfa de folato humano. Em alguns aspectos, o anticorpo liga-se seletivamente ao domínio extracelular do receptor alfa de folato humano (FOLR1 humano).
[00180] Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se a um homólogo do FOLR1 humano. Em alguns aspectos, o anticorpo liga-se a um homólogo do FOLR1 humano proveniente uma espécie selecionada dentre macacos, camundongos, cães, gatos, ratos, vacas, cavalos, cabras e ovelhas. Em alguns aspectos, o homólogo é um homólogo do macaco cinomolgo. Em alguns aspectos, o homólogo é um análogo de camundongo ou murino.
[00181] Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem pelo menos uma sequência de CDR definida por uma sequência consenso fornecida neste relatório descritivo. Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma sequência ilustrativa de CDR, VH, ou VL fornecida neste relatório descritivo, ou uma variante da mesma. Em alguns aspectos, a variante é uma variante com uma substituição conservadora de aminoácido.
[00182] Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma ou mais CDRs tendo comprimentos específicos, em termos do número de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a CDR-H1 Chothia do anticorpo tem formada por 6, 7 ou 8 resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, a CDR-H1 Kabat do anticorpo tem 4, 5, ou 6 resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, a CDR-H2 Chothia do anticorpo tem 5, 6 ou 7 resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, a CDR-H2 Kabat do anticorpo tem 16, 17 ou 18 resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, a
60 / 202 CDR-H3 Kabat/Chothia do anticorpo tem 13, 14, 15, 16 ou 17 resíduos de comprimento.
[00183] Em alguns aspectos, a CDR-L1 Kabat/Chothia do anticorpo tem 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 resíduos de comprimento. Em alguns aspectos, a CDR-L2 Kabat/Chothia do anticorpo tem 6, 7 ou 8 resíduos de comprimento. Em alguns aspectos, a CDR-L3 Kabat/Chothia do anticorpo tem 8, 9 ou 10 resíduos de comprimento.
[00184] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve. Em alguns aspectos, a cadeia leve é uma cadeia leve kappa. Em alguns aspectos, a cadeia leve é uma cadeia leve lambda.
[00185] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgA. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgD. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgE. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgM. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG1. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG2. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG3. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgG4. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgA1. Em alguns aspectos, a cadeia pesada é uma IgA2.
[00186] Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, o fragmento do anticorpo é um fragmento Fv. Em alguns aspectos, o fragmento do anticorpo é um fragmento Fab. Em alguns aspectos, o fragmento do anticorpo é um fragmento F(ab’)2. Em alguns aspectos, o fragmento do anticorpo é um fragmento Fab’. Em alguns aspectos, o fragmento do anticorpo é um fragmento scFv (sFv). Em alguns aspectos, o fragmento do anticorpo é um fragmento scFv-Fc.
[00187] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo policlonal.
[00188] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo
61 / 202 quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano.
[00189] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo com afinidade maturada. Em alguns aspectos, o anticorpo é um derivado de anticorpo com afinidade maturada de uma sequência ilustrativa fornecida neste relatório descritivo.
[00190] Os anticorpos aqui providos podem ser úteis para o tratamento de uma variedade de doenças e condições incluindo cânceres. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui providos podem ser úteis para o tratamento de cânceres de tumores sólidos. Por exemplo, os anticorpos aqui providos podem ser úteis para o tratamento de câncer colorretal.
5.1. Sequências de CDR-H3
[00191] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H3 de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs.: 308-366.
[00192] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs.: 240-298. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 255. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 294.
5.2. Sequências de VH compreendendo CDRs ilustrativas
[00193] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma ou mais sequências de CDR-H que compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma ou mais
62 / 202 sequências de CDR-H ilustrativas fornecidas neste relatório descritivo, e variantes das mesmas. Em algumas modalidades, as sequências de CDR-H compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma ou mais sequências de CDR-H fornecidas em uma sequência de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.1. Sequências de VH compreendendo CDRs ilustrativas de Kabat
[00194] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma ou mais sequências de CDR-H Kabat que compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma ou mais sequências de CDR-H Kabat ilustrativas fornecidas neste relatório descritivo, e variantes das mesmas.
5.2.1.1. CDR-H3 Kabat
[00195] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3, em que a sequência de CDR-H3 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H3 Kabat de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 Kabat é uma sequência de CDR-H3 Kabat de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00196] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs.: 240-298. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR- H3 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 255. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 294.
5.2.1.2. CDR-H2 Kabat
63 / 202
[00197] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H2, em que a sequência de CDR-H2 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H2 Kabat de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H2 Kabat é uma sequência de CDR-H2 Kabat de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00198] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 181-239. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR- H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 196. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 235.
5.2.1.3. CDR-H1 Kabat
[00199] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1, em que a sequência de CDR-H1 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H1 Kabat de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 Kabat é uma sequência de CDR-H1 Kabat de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00200] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 63-121. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-
64 / 202 H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 78. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 117.
5.2.1.4. CDR-H3 Kabat + CDR-H2 Kabat
[00201] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298, e uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 181-239. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 Kabat e a sequência de CDR-H2 Kabat são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H3 Kabat e a CDR-H2 Kabat são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.1.5. CDR-H3 Kabat + CDR-H1 Kabat
[00202] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298, e uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 63-121. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 Kabat e a sequência de CDR-H1 Kabat são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H3 Kabat e a CDR-H1 Kabat são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.1.6. CDR-H1 Kabat + CDR-H2 Kabat
65 / 202
[00203] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 63-121 e uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 181-239. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 Kabat e a sequência de CDR-H2 Kabat são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H1 Kabat e a CDR-H2 Kabat são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.1.7. CDR-H1 Kabat + CDR-H2 Kabat + CDR-H3 Kabat
[00204] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 63-121, uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 181-239 e uma sequência de CDR-H3 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 Kabat, a sequência de CDR-H2 e a sequência de CDR-H3 Kabat são todas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H1 Kabat, a CDR-H2 Kabat e a CDR-H3 Kabat são todas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.2. Sequências de VH compreendendo CDRs ilustrativas de Chothia
[00205] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma ou mais sequências de CDR-H Chothia que compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma ou mais sequências ilustrativas de CDR-H Chothia fornecidas neste relatório
66 / 202 descritivo, e variantes das mesmas.
5.2.2.1. CDR-H3 Chothia
[00206] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3, em que a sequência de CDR-H3 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H3 Chothia de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 Chothia é uma sequência de CDR-H3 Chothia de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00207] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR- H3 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 255. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 294.
5.2.2.2. CDR-H2 Chothia
[00208] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H2, em que a sequência de CDR-H2 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H2 Chothia de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H2 Chothia é uma sequência de CDR-H2 Chothia de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00209] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência
67 / 202 selecionada dentre SEQ ID NOs: 122-180. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR- H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 137. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 176.
5.2.2.3. CDR-H1 Chothia
[00210] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1, em que a sequência de CDR-H1 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-H1 Chothia de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VH aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 Chothia é uma sequência de CDR-H1 Chothia de uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00211] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 4-62. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR- H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 19. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 58.
5.2.2.4. CDR-H3 Chothia + CDR-H2 Chothia
[00212] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298, e uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma
68 / 202 sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 122-180. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 Chothia e a sequência de CDR-H2 Chothia são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H3 Chothia e a CDR-H2 Chothia são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.2.5. CDR-H3 Chothia + CDR-H1 Chothia
[00213] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H3 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298, e uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 4-62. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 Chothia e a sequência de CDR-H1 Chothia são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H3 Chothia e a CDR-H1 Chothia são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.2.2.6. CDR-H1 Chothia + CDR-H2 Chothia
[00214] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 4-62 e uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 122-180. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 Chothia e a sequência de CDR-H2 Chothia são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H1 Chothia e a CDR-H2 Chothia são ambas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID
69 / 202 NOs: 308-366.
5.2.2.7. CDR-H1 Chothia + CDR-H2 Chothia + CDR-H3 Chothia
[00215] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH compreendendo uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 4-62, uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 122-180 e uma sequência de CDR-H3 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 240-298. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 Chothia, a sequência de CDR-H2 Chothia e a sequência de CDR-H3 Chothia são todas de uma única sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-H1 Chothia, a CDR-H2 Chothia e a CDR-H3 Chothia são todas de uma única sequência ilustrativa de VH selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366.
5.3. Sequências de VH
[00216] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de VH fornecida em SEQ ID NOs: 308-366.
[00217] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 308-366. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 323. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VH que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 362.
5.3.1. Variantes de sequências de VH
[00218] Em algumas modalidades, as sequências de VH aqui providas compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma variante
70 / 202 de uma sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo.
[00219] Em alguns aspectos, a sequência de VH compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma variante de uma sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Em alguns aspectos, a sequência de VH compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.5% identidade com qualquer uma das sequências ilustrativas de VH fornecidas neste relatório descritivo.
[00220] Em algumas modalidades, a sequência de VH compreende, consiste em ou consiste essencialmente em qualquer uma das sequências ilustrativas de VH fornecidas neste relatório descritivo tendo 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos ou 1 ou menos substituições de aminoácidos. Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos.
5.4. Sequências de CDR-L3
[00221] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-L3 de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VL aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 de uma sequência de VL fornecida em SEQ ID NOs.: 367-369.
[00222] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 305-307. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 305.
71 / 202 Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 306. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 307.
5.5. Sequências de VL compreendendo CDRs ilustrativas
[00223] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma ou mais sequências de CDR-L que compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma ou mais sequências ilustrativas de CDR-L fornecidas neste relatório descritivo, e variantes das mesmas.
5.5.1. CDR-L3
[00224] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3, em que a sequência de CDR-L3 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-L3 de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VL aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 de uma sequência de VL fornecida em SEQ ID NOs.: 367-369.
[00225] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 305-307. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 305. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 306. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO:
72 / 202
307.
5.5.2. CDR-L2
[00226] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L2, em que a sequência de CDR-L2 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-L2 de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VL aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 de uma sequência de VL fornecida em SEQ ID NOs.: 367-369.
[00227] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 302-304. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 302. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 303. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO:
304.
5.5.3. CDR-L1
[00228] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1, em que a sequência de CDR-L1 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de CDR-L1 de um anticorpo ilustrativo ou uma sequência de VL aqui providas. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 de uma sequência de VL fornecida em SEQ ID NOs.: 367-369.
73 / 202
[00229] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 299-301. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 299. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 300. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO:
301.
5.5.4. CDR-L3 + CDR-L2
[00230] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 305-307 e uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 302-304. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L3 e a sequência de CDR-L2 são ambas de uma única sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-L3 e a CDR-L2 são ambas de uma única sequência ilustrativa de VL selecionada dentre SEQ ID NOs.: 367-369.
5.5.5. CDR-L3 + CDR-L1
[00231] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 305-307 e uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre
74 / 202 SEQ ID NOs: 299-301. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L3 e a sequência de CDR-L1 são ambas de uma única sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-L3 e a CDR-L1 são ambas de uma única sequência ilustrativa de VL selecionada dentre SEQ ID NOs.: 367-369.
5.5.6. CDR-L1 + CDR-L2
[00232] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 299-301 e uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 302-304. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L1 e a sequência de CDR-L2 são ambas de uma única sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-L1 e a CDR-L2 são ambas de uma única sequência ilustrativa de VL selecionada dentre SEQ ID NOs.: 367-369.
5.5.7. CDR-L1 + CDR-L2 + CDR-L3
[00233] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL compreendendo uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 299-301, uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 302-304 e uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 305-307. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-L1, a sequência de CDR- L2 e a sequência de CDR-L3 são todas de uma única sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo. Por exemplo, em alguns aspectos, a CDR-L1, a CDR-L2 e a CDR-L3 são todas de uma única sequência ilustrativa de VL selecionada dentre SEQ ID NOs.: 367-369.
75 / 202
5.6. Sequências de VL
[00234] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de VL fornecida em SEQ ID NOs.: 367-369.
[00235] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VL que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs.: 367-369. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 367. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 368. Em alguns aspectos, o anticorpo compreende uma sequência de VL que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 369.
5.6.1. Variantes de sequências de VL
[00236] Em algumas modalidades, as sequências de VL aqui providas compreendem, consistem em ou consistem essencialmente em uma variante de uma sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo.
[00237] Em alguns aspectos, a sequência de VL compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma variante de uma sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo. Em alguns aspectos, a sequência de VL compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.5% identidade com qualquer uma das sequências ilustrativas de VL fornecidas neste relatório descritivo.
[00238] Em algumas modalidades, a sequência de VL compreende, consiste em ou consiste essencialmente em qualquer uma das sequências ilustrativas de VL fornecidas neste relatório descritivo tendo 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8
76 / 202 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos ou 1 ou menos substituições de aminoácidos. Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos.
5.7. Pares
5.7.1. Pares de CDR-H3 - CDR-L3
[00239] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H3 e uma sequência de CDR-L3. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 faz parte de uma VH e a sequência de CDR-L3 faz parte de uma VL.
[00240] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 240-298, e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR- L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
[00241] Em alguns aspectos, os pares de CDR-H3 - CDR-L3 são selecionados dentre SEQ ID NO: 305 e SEQ ID NO: 255; e SEQ ID NO: 305 e SEQ ID NO: 294.
[00242] Em alguns aspectos, os pares de CDR-H3 - CDR-L3 são selecionados dentre SEQ ID NO: 306 e SEQ ID NO: 255; e SEQ ID NO: 306 e SEQ ID NO: 294.
[00243] Em alguns aspectos, os pares de CDR-H3 - CDR-L3 são selecionados dentre SEQ ID NO: 307 e SEQ ID NO: 255; e SEQ ID NO: 307 e SEQ ID NO: 294.
5.7.2. Pares de CDR-H1 – CDR-L1
[00244] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H1 e uma sequência de CDR-L1. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 faz parte de uma VH e a sequência de CDR-L1 faz parte de uma VL.
77 / 202
[00245] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 4-62, e a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR- L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301.
[00246] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 63-121, e a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs:299-301.
5.7.3. Pares de CDR-H2 – CDR-L2
[00247] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H2 e uma sequência de CDR-L2. Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H2 faz parte de uma VH e a sequência de CDR-L2 faz parte de uma VL.
[00248] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 122-180, e a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304.
[00249] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 181-239, e a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304.
5.7.4. Pares VH-VL
[00250] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de VH e uma sequência de VL a.
[00251] Em alguns aspectos, a sequência de VH é uma sequência de VH
78 / 202 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 308-366, e a sequência de VL é uma sequência de VL que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 367-369.
[00252] Em alguns aspectos, os pares VH-VL são selecionados dentre SEQ ID NO: 367 e SEQ ID NO: 323; e SEQ ID NO: 367 e SEQ ID NO: 362.
[00253] Em alguns aspectos, os pares VH-VL são selecionados dentre SEQ ID NO: 368 e SEQ ID NO: 323; e SEQ ID NO: 368 e SEQ ID NO: 362.
[00254] Em alguns aspectos, os pares VH-VL são selecionados dentre SEQ ID NO: 369 e SEQ ID NO: 323; e SEQ ID NO: 369 e SEQ ID NO: 362.
5.7.4.1. Variantes de pares VH-VL
[00255] Em algumas modalidades, os pares VH-VL aqui providos compreendem uma variante de uma sequência ilustrativa de VH e/ou VL fornecida neste relatório descritivo.
[00256] Em alguns aspectos, a sequência de VH compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma variante de uma sequência ilustrativa de VH fornecida neste relatório descritivo. Em alguns aspectos, a sequência de VH compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,1% identidade com qualquer uma das sequências ilustrativas de VH fornecidas neste relatório descritivo.
[00257] Em algumas modalidades, a sequência de VH compreende, consiste em ou consiste essencialmente em qualquer uma das sequências ilustrativas de VH fornecidas neste relatório descritivo tendo 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos ou 1 ou menos substituições de aminoácidos. Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos.
79 / 202
[00258] Em alguns aspectos, a sequência de VL compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma variante de uma sequência ilustrativa de VL fornecida neste relatório descritivo. Em alguns aspectos, a sequência de VL compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% identidade com qualquer uma das sequências ilustrativas de VL fornecidas neste relatório descritivo.
[00259] Em algumas modalidades, a sequência de VL compreende, consiste em ou consiste essencialmente em qualquer uma das sequências ilustrativas de VL fornecidas neste relatório descritivo tendo 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos ou 1 ou menos substituições de aminoácidos. Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos.
5.8. Anticorpos compreendendo todas as seis CDRs
[00260] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de CDR-H1, uma sequência de CDR-H2, uma sequência de CDR- H3, uma sequência de CDR-L1 e uma sequência de CDR-L3. Em alguns aspectos, as sequências de CDR fazem parte de uma VH (para CDR-H) ou VL (para CDR-L).
[00261] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 4-62; a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 122-180; a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 240- 298; a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende,
80 / 202 consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301; a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304; e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
[00262] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 19; a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 137; a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 255; a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301; a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304; e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
[00263] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 58; a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR-H2 Chothia que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 176; a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 294; a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301; a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304; e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
81 / 202
[00264] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 63-121; a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR- H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 181-239; a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 240- 298; a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301; a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304; e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
[00265] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 78; a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 196; a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 255; a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301; a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304; e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
[00266] Em alguns aspectos, a sequência de CDR-H1 é uma sequência de CDR-H1 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 117; a sequência de CDR-H2 é uma sequência de CDR-H2 Kabat que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 235; a sequência de CDR-H3 é uma sequência de CDR-H3 que
82 / 202 compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 294; a sequência de CDR-L1 é uma sequência de CDR-L1 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 299-301; a sequência de CDR-L2 é uma sequência de CDR-L2 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 302-304; e a sequência de CDR-L3 é uma sequência de CDR-L3 que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em SEQ ID NOs: 305-307.
6. Linhagem germinativa
[00267] Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especificamente ao receptor alfa de folato é um anticorpo compreendendo uma região variável que é codificada por um gene da linhagem germinativa em particular, ou uma variante do mesmo. Os anticorpos ilustrativos aqui providos compreendem regiões variáveis que são codificadas pelos genes VH1-18, VH3-33, VH2-5, VH2-70 e VH4-30-4 das regiões variáveis da cadeia pesada da linhagem germinativa, ou variantes dos mesmos; e os genes Vκ1-5, Vκ3-11, Vκ2-20, Vκ1-33, e Vκ1-16 das regiões variáveis da cadeia leve da linhagem germinativa, ou variantes dos mesmos.
[00268] O técnico no assunto reconheceria que as sequências de CDR aqui fornecidas podem também ser úteis quando combinadas com regiões variáveis de outros genes de regiões variáveis da linhagem germinativa, ou variantes dos mesmos. Em particular, as sequências de CDR aqui providas podem ser úteis quando combinadas com regiões variáveis codificadas por genes de regiões variáveis da linhagem germinativa, ou variantes dos mesmos, que sejam estruturalmente semelhantes aos genes de regiões variáveis da linhagem germinativa recitados acima. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência de CDR-H aqui provida pode ser combinada com uma região variável codificada por um gene de regiões variáveis da linhagem germinativa , selecionadas dentre as famílias VH 1, VH 2, VH 3 ou VH 4, ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, uma sequência
83 / 202 de CDR-L aqui provida pode ser combinada com pode ser combinada com uma região variável codificada por um gene de regiões variáveis da linhagem germinativa , selecionadas dentre a Vκ1, Vκ2 ou Vκ3, ou uma variante da mesma.
7. Afinidade
[00269] Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato, como indicada por KD, é inferior a aproximadamente 10-5 M, inferior a aproximadamente 10-6 M, inferior a aproximadamente 10-7 M, inferior a aproximadamente 10-8 M, inferior a aproximadamente 10-9 M, inferior a aproximadamente 10-10 M, inferior a aproximadamente 10-11 M ou inferior a aproximadamente 10-12 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-7 M e 10-11 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-7 M e 10-10 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-7 M e 10-9 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-7 M e 10-8 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-8 M e 10-11 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-8 M e 10-10 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-9 M e 10-11 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo é entre aproximadamente 10-9 M e 10-10 M.
[00270] Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato humano, conforme determinada ressonância plasmônica de superfície a 25°C, e como indicada por KD, é entre aproximadamente 0,36×10-9 M e 2,21×10-9 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato humano, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, e como indicada por KD, é entre aproximadamente 8,55×10-10 M e 1,70×10-8 M. Em
84 / 202 algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato humano, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, e como indicada por KD, é entre aproximadamente 5,71×10-10 M e 2,58×10-8 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato humano é aproximadamente qualquer um dos valores de KD relatados para receptor alfa de folato humano nos exemplos abaixo.
[00271] Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka pelo menos próxima de 104 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka pelo menos próxima de 105 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka pelo menos próxima de 106 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka pelo menos próxima de 107 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka pelo menos próxima de 108 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka pelo menos próxima de 109 M- 1 ×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka entre aproximadamente 104 M-1×s-1 e 1010 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka entre aproximadamente 105 M-1×s-1 e 1010 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka entre aproximadamente 106 M- 1 ×s-1 e 1010 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka entre aproximadamente 107 M-1×s-1 e 1010 M-1×s-1.
[00272] Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka ao associar- se com receptor alfa de folato humano, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, entre aproximadamente 4,44×105 M-1×s-1 e 1,61×105 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka ao associar-se com o receptor alfa de folato humano, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, entre aproximadamente 2,90×105 M-1×s-1 e 9,64×109 M-1×s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma ka ao associar-se com o receptor alfa de folato humano de aproximadamente qualquer um dos valores de ka relatados para receptor alfa de folato humano nos exemplos abaixo.
85 / 202
[00273] Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma kd próxima ou inferior a 10-5 s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma kd próxima ou inferior a 10-4 s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma kd próxima ou inferior a 10-3 s-1. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma kd entre aproximadamente 10-2 s-1 e 10-5 s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma kd entre aproximadamente 10-2 s-1 e 10-4 s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma kd entre aproximadamente 10-3 s-1 e 10-5 s-1.
[00274] Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma kd ao dissociar-se do receptor alfa de folato humano, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, entre aproximadamente 8,66×10-4 s-1 e 1,08×10-2 s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma kd ao dissociar-se do receptor alfa de folato humano, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, entre aproximadamente 2,28×10-4 s-1 e 4,82×101 s-1. Em algumas modalidades o anticorpo tem uma kd ao dissociar-se do receptor alfa de folato humano de aproximadamente qualquer um dos valores de kd relatados para receptor alfa de folato humano nos exemplos abaixo.
[00275] Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato de macaco cinomolgo, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, e como indicada por KD, é entre aproximadamente 0,19×10-9 M e 2,84×10-9 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato de macaco cinomolgo é aproximadamente qualquer um dos valores de KD relatados para receptor alfa de folato de macaco cinomolgo nos exemplos abaixo.
[00276] Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato de camundongo, conforme determinada por ressonância plasmônica de superfície a 25°C, e como indicada por KD, é entre aproximadamente 0,5×10-9 M e 9,07×10-8 M. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo receptor alfa de folato de camundongo é
86 / 202 aproximadamente qualquer um dos valores de KD relatados para receptor alfa de folato de camundongo nos exemplos abaixo.
[00277] Em alguns aspectos, a KD, a ka e a kd são determinadas a 25°C. Em algumas modalidades, a KD, a ka e a kd são determinadas por ressonância plasmônica de superfície. Em algumas modalidades, a KD, a ka e a kd são determinadas de acordo com os métodos descritos nos exemplos aqui providos.
8. Bins sobre epítopos
[00278] Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo abrangendo qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 308-366. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo qualquer uma dos pares VH-VL, acima. Em algumas modalidades, o anticorpo compete pela ligação ao epítopo com um anticorpo abrangendo qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 308-366. Em algumas modalidades, o anticorpo compete pela ligação ao epítopo com um anticorpo compreendendo qualquer um dos pares VH-VL, acima.
9. Variantes de glicosilação
[00279] Em certas modalidades, um anticorpo pode ser alterado para aumentar, diminuir ou eliminar até que medida é glicosilado. A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente “N-ligada” ou “O-ligada”.
[00280] Glicosilação “N-ligada” refere-se à ligação de uma porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio potencial para glicosilação.
[00281] Glicosilação “O-ligada” refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais
87 / 202 comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser utilizadas.
[00282] A adição ou deleção de sítios de glicosilação N-ligada ao anticorpo pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima sejam criadas ou removidas. A adição ou deleção de sítios de glicosilação O-ligada pode ser realizada pela adição, deleção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina em ou a (como o caso venha ser) a sequência de um anticorpo.
10. Variantes de Fc
[00283] Em certas modalidades, as modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo aqui provido para gerar uma variante da região Fc. Em certas modalidades, a variante da região Fc possui algumas, mas não todas as funções efetoras. Tais anticorpos podem ser úteis, por exemplo, em aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, contudo certas funções efetoras são desnecessárias ou prejudiciais. Os exemplos de funções efetoras incluem citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e citotoxicidade mediada pelo complemento direcionada por anticorpos (ADCC). Inúmeras substituições ou substituições ou deleções com função efetora alterada são conhecidas na técnica.
[00284] Em algumas modalidades, o Fc compreende uma ou mais modificações em pelo menos uma das sequências de CH3. Em algumas modalidades, o Fc compreende uma ou mais modificações em pelo menos uma das sequências de CH2. Por exemplo, o Fc pode incluir uma ou modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em: V262E, V262D, V262K, V262R, V262S, V264S, V303R e V305R. Em algumas modalidades, Fc é um polipeptídeo isolado. Em algumas modalidades, Fc é peptídeos múltiplos, por exemplo, dois polipeptídeos. Modificações exemplares na
88 / 202 região Fc são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional No PCT/US2017/037545, depositado em 14 de junho de 2017.
[00285] Uma alteração na atividade CDC e/ou ADCC pode ser confirmada utilizando ensaios in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para medir a ligação a FcγR. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FcγRIII somente, enquanto monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida em Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 1991, 9:457-492, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00286] Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são fornecidos nas Patentes U.S. Nos 5 500 362 e 5 821 337; Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83:7059-7063; Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82:1499-1502; e Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1987, 166:1351- 1361; cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente ou além de, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, utilizando um modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:652-656, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00287] Ensaios de ligação a C1q podem também ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar-se a C1q e, consequentemente, desprovido da atividade CDC. Os exemplos de ensaios de ligação a C1q incluem aqueles descritos em WO 2006/029879 e WO 2005/100402, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00288] Os ensaios de ativação do complemento incluem aqueles descritos, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods,
89 / 202 1996, 202:163-171; Cragg et al., Blood, 2003, 101:1045-1052; e Cragg and Glennie, Blood, 2004, 103:2738-2743; cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00289] A ligação a FcRn e depuração in vivo (determinação da meia- vida) podem também ser medidas, por exemplo, utilizando os métodos descritos em Petkova et al., Intl. Immunol., 2006, 18:1759-1769, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
11. Aminoácidos modificados
[00290] Quando o conjugado de anticorpo compreende um aminoácido modificado, o aminoácido modificado pode ser qualquer aminoácido modificado considerado adequado pelo praticante. Em modalidades específicas, o aminoácido modificado compreende um grupo reativo útil para formar uma ligação covalente com um precursor do ligador ou com um precursor da carga útil. Em certas modalidades, o aminoácido modificado é um aminoácido não natural. Em certas modalidades, o grupo reativo é selecionado a partir do grupo que consiste em amino, carboxi, acetil, hidrazino, hidrazido, semicarbazido, sulfanila, azido e alquinila. Aminoácidos modificados são também descritos em, por exemplo, WO 2013/185115 e WO 2015/006555, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00291] Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido é de acordo com qualquer uma das fórmulas seguintes: , ou .
[00292] Os versados na técnica reconhecerão que os anticorpos são em geral compostos por L-aminoácidos No entanto, com aminoácidos não naturais, os presentes métodos e composições oferecem ao praticante a capacidade para utilizar L-, D- ou aminoácidos não naturais racêmicos nas posições sítio-específicas. Em certas modalidades, os aminoácidos não
90 / 202 naturais aqui descritos incluem versões D- das versões de aminoácidos naturais e racêmicos dos aminoácidos naturais.
[00293] Nas fórmulas acima, as linhas onduladas indicam ligações que conectam ao restante das cadeias polipeptídicas dos anticorpos. Esses aminoácidos não naturais podem ser incorporados em cadeias polipeptídicas exatamente como aminoácidos naturais são incorporados nas mesmas cadeias polipeptídicas. Em certas modalidades, os aminoácidos não naturais são incorporados na cadeia polipeptídica através de ligações amida como indicado nas fórmulas.
[00294] Nas fórmulas acima, R designa qualquer grupo funcional sem restrição, desde que o resíduo de aminoácido não seja idêntico a um resíduo de aminoácido natural. Em certas modalidades, R pode ser um grupo hidrofóbico, um grupo hidrofílico, um grupo polar, um grupo ácido, um grupo básico, um grupo quelante, um grupo reativo, uma porção terapêutica ou uma porção de marcação. Em certas modalidades, R é selecionado a partir do grupo que consiste em R1NR2R3, R1C(=O)R2, R1C(=O)OR2, R1N3, R1C(≡CH). Nessas modalidades, R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação, alquileno, heteroalquileno, arileno, heteroarileno. R2 e R3 são, cada um independentemente, selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila e heteroalquila.
[00295] Em algumas modalidades, os aminoácidos não codificados naturalmente incluem grupos funcionais de cadeias laterais que reagem de modo eficiente e seletivo com grupos funcionais não encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não limitados a, grupos azido, cetona, aldeído e amino-oxi) para formar conjugados estáveis. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação antígeno que inclui um aminoácido não codificado naturalmente contendo um grupo funcional azido pode ser reagido com um polímero (incluindo, mas não limitados a, poli(etilenoglicol) ou, alternativamente, um segundo polipeptídeo contendo uma porção alcino para
91 / 202 formar um conjugado estável, resultante da reação seletiva dos grupos funcionais azida e alcino para formar um produto da cicloadição [3+2] de Huisgen.
[00296] Os aminoácidos não codificados naturalmente exemplares que podem ser adequados para o uso na presente invenção e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água incluem, entre outros, aqueles com grupos reativos carbonila, amino-oxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e alcino. Em algumas modalidades, os aminoácidos não codificados naturalmente compreendem uma porção de sacarídeo. Os exemplos de tais aminoácidos incluem N-acetil-L-glicosaminil-L-serina, N-acetil-L- galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glicosaminil-L-treonina, N-acetil-L- glicosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Os exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos onde a N- ou O-ligação natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não comumente encontrada na natureza - incluindo, mas não limitados a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e similares. Os exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas naturais tais como 2-desoxi-glicose, 2-desoxigalactose e similares.
[00297] Muitos dos aminoácidos não codificados naturalmente aqui providos são fornecidos comercialmente, por exemplo, pela Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., EUA), Novabiochem (uma divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha) ou Peptech (Burlington, Mass., EUA). Aqueles que não estão disponíveis comercialmente são opcionalmente sintetizados como aqui provido ou utilizando métodos padrão conhecidos pelos versados na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova York); e Advanced Organic Chemistry
92 / 202 por Carey e Sundberg (Terceira edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova York). Ver, também, as Publicações de Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 e 2003/0108885, que são aqui incorporadas por referência.
[00298] Muitos aminoácidos não naturais têm por base aminoácidos naturais, tais como tirosina, glutamina, fenilalanina e similares, e são adequados para uso na presente invenção. Os análogos da tirosina incluem, entre outros, tirosinas para-substituídas, tirosinas orto-substituídas e tirosinas meta-substituídas, em que a tirosina substituída compreende, incluindo, mas não limitados a, um grupo ceto (incluindo, mas não limitados a, um grupo acetila), um grupo benzoíla, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carboxi, um grupo isopropila, um grupo metila, um grupo hidrocarboneto C6-C20 de cadeia reta ou ramificada, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metila, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alquinila ou similares. Além disso, múltiplos anéis arila substituídos são também contemplados. Os análogos de glutamina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, entre outros, derivado α-hidroxi, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos e derivados de glutamina amida substituídos. Os exemplo de análogos da fenilalanina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, entre outros, fenilalaninas para-substituídas, fenilalaninas orto-substituídas e fenilalaninas meta-substituídas, em que o substituinte compreende, incluindo, mas não limitados a, um grupo hidroxi, um grupo metoxi, um grupo metila, um grupo alila, um aldeído, um azido, um grupo de iodo, bromo, ceto (incluindo, mas não limitados a, um grupo acetila), um grupo benzoíla, alquinila ou similares. Exemplos específicos de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, entre outros, p- acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil- fenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GlcNAcβ- serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-
93 / 202 fenilalanina, p-azido-metil-L-fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L- fenilalanina, L-fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-iodo- fenilalanina, p-bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina e p-propargiloxi-fenilalanina, e similares. Exemplos de estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para uso na presente invenção são fornecidos em, por exemplo, WO 2002/085923, intitulado “In vivo incorporation of unnatural amino acids”. Ver também Kiick et al., (2002) A incorporação de azidas em proteínas recombinantes para modificação quimiosseletiva pela ligação de Staudinger, PNAS 99:19- 24, para análogos de metionina adicionais.
[00299] Muitos dos aminoácidos não naturais adequados para uso na presente invenção estão disponíveis comercialmente, por exemplo, fornecidos pela Sigma (EUA) ou Aldrich (Milwaukee, Wis., EUA). Aqueles que não estão disponíveis comercialmente são opcionalmente sintetizados como aqui provido ou como provido em várias publicações ou utilizando métodos padrão conhecidos pelos versados na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira edição, 1985, Wiley and Sons, New York); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova York). Publicações adicionais descrevendo a síntese de aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, WO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”; Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4
94 / 202 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Cloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201- 5; Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308; e Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta- heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Ver também os pedidos de Patente intitulada “Protein Arrays”, depositada em 22 de dezembro de 2003, No de Série 10/744 899 e No de Série 60/435 821 depositado em 22 de dezembro de 2002.
[00300] Exemplos específicos de aminoácidos não naturais úteis incluem, entre outros, p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, L-3-(2- naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GlcNAc b-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L- fenilalanina, p-azido-metil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L- fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-iodo-fenilalanina, p-bromofenilalanina, p-amino-L- fenilalanina, isopropil-L-fenilalanina, e p-propargiloxi-fenilalanina. Outros exemplos úteis incluem N-acetil-L-glicosaminil-L-serina, N-acetil-L- galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glicosaminil-L-treonina, N-acetil-L- glicosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina.
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[00301] Em modalidades específicas, os aminoácidos não naturais são selecionados dentre p-acetil-fenilalanina, p-etinil-fenilalanina, p- propargiloxifenilalanina, p-azido-metil-fenilalanina e p-azido-fenilalanina. Um aminoácido não natural particularmente útil é p-azido fenilalanina. Esse resíduo de aminoácido é conhecido pelos versados na técnica para facilitar reações de cicloadição [3+2] de Huisgen (as reações químicas “click”) com, por exemplo, compostos carregando grupos alquinila. Essa reação permite ao técnico no assunto conjugar fácil e rapidamente o anticorpo na localização sítio-específica do aminoácido não natural.
[00302] Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo é uma porção alquinila (incluindo, mas não limitados a, no aminoácido não natural, p- propargiloxifenilalanina, onde o grupo propargila é também, às vezes, referido como porção acetileno) e o segundo grupo reativo é uma porção azido, e a química da cicloadição [3+2] pode ser utilizada. Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo é a porção azido (incluindo, mas não limitados a, no aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção alquinila.
[00303] Nas fórmulas acima,, cada L representa um ligador bivalente. o ligador bivalente pode ser qualquer ligador bivalente conhecido pelos versados na técnica. Em geral, o ligador bivalente é capaz de formar ligações covalentes com a porção funcional R e o grupo reativo cognato (por exemplo, carbono alfa) do aminoácido não natural. Os ligadores bivalentes úteis incluem uma ligação, alquileno, alquileno substituído, heteroalquileno, heteroalquileno substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno e heteroarileno substituído. Em certas modalidades, L é alquileno C1-10 ou heteroalquileno C1-10.
[00304] Os aminoácidos não naturais usados nos métodos e composições aqui descritos possuem pelo menos uma das quatro propriedades seguintes: (1) pelo menos um grupo funcional na cadeia lateral do aminoácido
96 / 202 não natural possui pelo menos uma características e/ou atividade e/ou reatividade ortogonal em relação à reatividade química dos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados (ou seja, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina), ou pelo menos ortogonal em elação à reatividade química dos aminoácidos naturais presentes no polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural; (2) os aminoácidos não naturais introduzidos são substancialmente inertes quimicamente frente aos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados; (3) o aminoácido não natural pode ser estavelmente incorporado em um polipeptídeo, de preferência com a estabilidade comensurada com os aminoácidos naturais ou em condições fisiológicas típicas e, ainda preferencialmente, tal incorporação pode ocorrer viva um sistema in vivo; e (4) o aminoácido não natural inclui um grupo funcional oxima ou um grupo funcional que pode ser transformado em um grupo oxima reagindo com um reagente, de preferência, sob condições que não destruam as propriedades biológicas do polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural (a menos que, evidentemente, tal destruição de propriedades biológicas seja o objetivo da modificação/transformação), ou em que a transformação pode ocorrer sob condições aquosas em pH entre aproximadamente 4 e 8 ou quando o sítio reativo no aminoácido não natural é um sítio eletrofílico.
Qualquer número de aminoácidos não naturais pode ser introduzido no polipeptídeo.
Os aminoácidos não naturais podem também incluir oximas protegidas ou mascaradas ou grupos protegidos ou mascarados que podem ser transformados em um grupo oxima depois da desproteção do grupo protegido ou desmascaramento do grupo mascarado.
Os aminoácidos não naturais podem também incluir grupos carbonila ou dicarbonila protegidos ou mascarados, os quais podem ser transformados em grupo carbonila ou dicarbonila depois da desproteção do grupo protegido, ou
97 / 202 desmascaramento do grupo mascarado e, assim, estão disponíveis para reagir com hidroxilaminas ou oximas para formar grupos oxima.
[00305] Em modalidades adicionais, os aminoácidos não naturais que podem ser utilizados nos métodos e composições aqui descritos incluem, entre outros, aminoácidos compreendendo um agente reticulante fotoativável, aminoácidos marcados com spin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos ligados a metais, aminoácidos contendo metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos photocaged e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos compreendendo biotina ou um análogo da biotina, aminoácidos glicosilados tais como uma serina com açúcar substituído, outros aminoácidos modificados com carboidrato, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos contendo aldeído, aminoácidos compreendendo polietilenoglicol ou outros poliéteres, aminoácidos substituídos com átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas quando comparados a aminoácidos naturais, incluindo, mas não limitados a, poliéteres ou carboidratos de cadeia longa, incluindo, mas não limitados a, com mais de aproximadamente 5 ou mais de aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar carbono-ligado, aminoácidos redox-ativos, aminoácidos contendo aminotioácido e aminoácidos compreendendo uma ou mais porções tóxicas.
[00306] Em algumas modalidades, os aminoácidos não naturais compreendem uma porção de sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N-acetil-L-glicosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glicosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glicosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos onde a N- ou O-ligação natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não encontrada comumente na natureza
98 / 202 - incluindo, mas não limitados a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e similares. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas naturais tais como 2- desoxi-glicose, 2-desoxigalactose e similares.
[00307] Em modalidades específicas, o aminoácido não natural é selecionado a partir do grupo que consiste em: (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)
99 / 202
O O N3
HO N N
H H NH2 (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30); e (40); ou um sal dos mesmos. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo com aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e opcionalmente modificados após a tradução.
[00308] Em certas modalidades, o aminoácido modificado é de acordo com qualquer uma das Fórmulas 51-62: (51) (52) (53)
100 / 202 (54) (55) (56) (57) (58) (59) (61) (60) (62) ou um sal dos mesmos.
[00309] Em certas modalidades, o aminoácido não natural é selecionado a partir do grupo que consiste nos compostos 30, 53, 56, 59, 60, 61 e 62 acima. Em certas modalidades, o aminoácido não natural é o composto 30. Em certas modalidades, o aminoácido não natural é o composto
56. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é o composto 61. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é o composto 62.
12. Preparação de conjugados de anticorpos
12.1. Preparação do antígeno
[00310] A proteína FOLR1 a ser utilizada para o isolamento dos anticorpos pode ser FOLR1 intacta ou um fragmento de FOLR1. A proteína FOLR1 intacta, ou fragmento de FOLR1, pode estar na forma de uma proteína isolada ou proteína expressa por uma célula. Outras formas de
101 / 202 FOLR1 úteis para gerar anticorpos serão evidentes para os versados na técnica.
12.2. Anticorpos monoclonais
[00311] Anticorpos monoclonais podem ser obtidos, por exemplo, pelo método do hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 1975, 256:495-497 (aqui incorporado, em sua totalidade, por referência) e/ou por métodos do DNA recombinante (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4 816 567, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência). Os anticorpos monoclonais podem também ser obtidos, por exemplo, utilizando bibliotecas de fatos ou baseadas em leveduras. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 8 258 082 e 8 691 730, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
[00312] No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro adequado é imunizado para provocar linfócitos e fazer com que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma. Ver Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3a ed. (1986) Academic Press, San Diego, CA, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00313] As células do hibridoma são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado contendo uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células parentais de mieloma não fundidas. Por exemplo, se as células parentais de mieloma não contiverem a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirão tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), que são substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
102 / 202
[00314] Células de mieloma úteis são aquelas que se fundem eficientemente, sustentam produção estável de alto nível do anticorpo pelas células produtoras do anticorpo selecionado e são sensíveis às condições do meio, tal como a presença ou ausência de meio HAT. Entre essas, as linhagens preferidas de mieloma são as linhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas dos tumores MOP-21 e MC-11 de camundongo (disponibilizados pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA), e células SP-2 ou X63-Ag8-653 (disponibilizadas pela American Type Culture Collection, Rockville, MD). Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano foram também descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos. Ver, por exemplo, Kozbor, J. Immunol., 1984, 133:3001, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00315] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, clones selecionados podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos padrão. Ver Goding, supra. Os meios de cultura adequados para essa finalidade incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores ascíticos em um animal.
[00316] O DNA codificador dos anticorpos monoclonais pode ser rapidamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais). Assim, as células de hibridoma podem servir como uma fonte útil de DNA que codifica anticorpos com as propriedades desejadas. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, os quais são então transfectados em células hospedeiras tais como bactérias (por exemplo, E. coli), leveduras (por exemplo, Saccharomyces ou
103 / 202 Pichia sp.), células COS, células do ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que do contrário não produzem o anticorpo, para produzir os anticorpos monoclonais.
12.3. Anticorpos humanizados
[00317] Os anticorpos humanizados podem ser gerados substituindo a maioria ou todas as porções estruturais de um anticorpo monoclonal não humano pelas sequências correspondentes do anticorpo humano. Consequentemente, é gerada uma molécula híbrida na qual somente a região variável, específica para o antígeno, ou CDR, é composta por sequência não humana. Os métodos para obter anticorpos humanizados incluem aqueles descritos em, por exemplo, Winter e Milstein, Nature, 1991, 349:293-299; Rader et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:36073-36078; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86:10029-10033; e Patentes U.S. Nos 5 585 089, 5 693 761, 5 693 762 e 6 180 370; cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.
12.4. Anticorpos humanos
[00318] Anticorpos humanos podem ser gerados por uma variedade de técnicas conhecidas na área, por exemplo, utilizando animais transgênicos (por exemplo, camundongos humanizados). Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90:2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362:255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7:33; e Patentes U.S. Nos 5 591 669, 5 589 369 e 5 545 807; cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. Anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas de expressão em fagos (phage-display) (ver, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227:381-388; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; e Patentes U.S. Nos 5 565 332 e 5 573 905; cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência). Anticorpos humanos também podem ser gerados por células B
104 / 202 ativadas in vitro (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos 5 567 610 e 5 229 275, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência Anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas baseadas em leveduras (ver, por exemplo, Patente U.S. No 8 691 730, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência).
12.5. Conjugação
[00319] Os conjugados de anticorpos podem ser preparados por técnicas padrão. Em certas modalidades, um anticorpo é colocado em contato com um precursor de carga útil sob condições adequadas para formar uma ligação desde o anticorpo até a carga útil para formar um conjugado anticorpo-carga útil. Em certas modalidades, um anticorpo é colocado em contato com um precursor de ligador sob condições adequadas para formar uma ligação desde o anticorpo até o ligador. O anticorpo-ligador resultante é colocado em contato com um precursor de carga útil sob condições adequadas para formar uma ligação desde o anticorpo-ligador até a carga útil para formar um conjugado anticorpo-ligador-carga útil. Em certas modalidades, um precursor de carga útil é colocado em contato com um precursor de ligador sob condições adequadas para formar uma ligação desde a carga útil até o ligador. A carga útil-ligador resultante é colocada em contato com um anticorpo sob condições adequadas para formar uma ligação desde a carga útil-ligador até o anticorpo para formar um conjugado anticorpo-ligador-carga útil. Ligadores adequados para preparar os conjugados de anticorpos são aqui descritos, e condições exemplares para conjugação são descritas nos exemplos abaixo.
[00320] Em algumas modalidades, um conjugado anti-FOLR1 é preparado colocando um anticorpo anti-FOLR1, conforme aqui descrito, em contato com um precursor do ligador tendo uma estrutura de qualquer um dentre (A) - (L):
105 / 202
(A) (B) (C) (D) (E)
106 / 202
(F) (G) (H) (I) (J)
107 / 202 (K) (L)
[00321] Em algumas modalidades, a estereoquímica dos precursores de ligador identificados como (A)-(L) é identificada com uma anotação R e S para cada centro quiral, da esquerda para a direita, como representado nas fórmulas (A1) - (L1) e (A2) - (L2) ilustradas abaixo: (a1) (B1)
108 / 202
(C1)
(D1)
(E1)
(F1)
(G1)
109 / 202
(h1)
(i1)
(j1)
(k1)
(L1)
110 / 202
(A2)
(B2)
(C2)
(D2)
111 / 202
(E2)
(F2)
(G2)
(H2)
112 / 202 (I2) (J2) (K2) (L2)
13. Vetores, células hospedeiras e métodos recombinantes
[00322] Há também modalidades direcionadas para o fornecimento de ácidos nucleicos isolados que codificam anticorpos anti-FOLR1, vetores e células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos e técnicas recombinantes para a produção dos anticorpos.
[00323] Para produção recombinante do anticorpo, o(s) ácido(s) nucleico(s) que o codifica(m) pode(m) ser isolado(s) e inserido(s) em um vetor replicável para clonagem futura (ou seja, amplificação do DNA) ou
113 / 202 expressão. Em alguns aspectos, o ácido nucleico pode ser produzido por recombinação homóloga, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No 5 204 244, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência.
[00324] Muitos vetores diferentes são conhecidos na técnica. Os componentes do vetor em geral incluem, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes de marcadores, um elemento reforçador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No 5 534 615, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência.
[00325] Abaixo, são fornecidos exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas. Essas células hospedeiras não pretendem ser limitantes.
[00326] As células hospedeiras adequadas incluem qualquer célula procariótica (por exemplo, bacteriana), eucariótica inferior (por exemplo, levedura) ou eucariótica superior (por exemplo, mamífero). Os procariotos adequados incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia (E. coli), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (S. typhimurium), Serratia (S. marcescans), Shigella, Bacilli (B. subtilis e B. licheniformis), Pseudomonas (P. aeruginosa) e Streptomyces. Um E. coli útil como hospedeiro para clonagem é E. coli 294, embora outras cepas tais como E. coli B, E. coli X1776 e E. coli W3110 são adequadas.
[00327] Além de procariotos, micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são também hospedeiros adequados de clonagem ou expressão para vetores que codificam o anticorpo anti-FOLR1. Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura comum do padeiro, é um microrganismos hospedeiro eucariótico inferior comumente utilizado. No entanto, várias outros gêneros, espécies e cepas estão disponíveis e úteis, tais como Spodoptera frugiperda (por exemplo, SF9), Schizosaccharomyces
114 / 202 pombe, Kluyveromyces (K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thermotolerans e K. marxianus), Yarrowia, Pichia pastoris, Candida (C. albicans), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces (S. occidentalis), e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus (A. nidulans e A. niger).
[00328] As células hospedeiras úteis de mamíferos incluem células COS-7, células HEK293; células de rim de hamster neonato (BHK); células de ovário de hamster chinês (CHO); células de Sertoli de camundongo; células renais do macaco verde africano (VERO-76) e similares.
[00329] As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo anti- FOLR1 desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios disponíveis comercialmente tais como, por exemplo, F10 de Ham, Meio Essencial Mínimo (MEM), RPMI-1640 e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz., 1979, 58:44; Barnes et al., Anal. Biochem., 1980, 102:255; e Patentes U.S. Nos 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 e 5 122 469 ou WO 90/03430 e WO 87/00195 pode ser usado. Cada uma das referências anteriores é aqui incorporada, em sua totalidade, por referência.
[00330] Qualquer um desses meios pode ser suplementado, se necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos, elementos traço (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que seriam conhecidas pelos versados
115 / 202 na técnica.
[00331] As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas anteriormente usadas com a células hospedeira selecionada para expressão, e serão óbvias para qualquer técnico no assunto.
[00332] Quando se usam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido no meio intracelular, no espaço periplasmático ou ser diretamente secretadas no meio. Se o anticorpo for produzido no meio intracelular, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, quer células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Por exemplo, Carter et al. (Bio/Technology, 1992, 10:163-167) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados no espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) ao longo de aproximadamente 30 minutos. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação.
[00333] Em algumas modalidades, o anticorpo é produzido em um sistema livre de células. Em alguns aspectos, o sistema livre de células é um sistema para transcrição e tradução in vitro como descrito em Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Em alguns aspectos, o sistema livre de células utiliza um extrato sem células de uma célula eucariótica ou de uma célula procariótica. Em alguns aspectos, a célula procariótica é E. coli. A expressão livre de células do anticorpo pode ser útil, por exemplo, quando o anticorpo se acumula em uma célula como um agregado insolúvel, ou quando os rendimentos da expressão periplasmática são baixos. Os anticorpos produzidos em um sistema sem células pode ser aglicosilado dependendo da fonte das células.
[00334] Quando o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são em geral concentrados em primeiro lugar usando um filtro disponível comercial para concentração de proteínas, por
116 / 202 exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon® ou Milipore® Pellcon®. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise, e antibióticos podem ser incluídos para impedir o crescimento de contaminantes adventícios.
[00335] A composição do anticorpo preparado em células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, sendo cromatografia por afinidade uma técnica especialmente útil de purificação. A adequação da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas γ1, γ2 ou γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 1983, 62:1-13, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência). A proteína G é útil para todos os isotipos de camundongos e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J., 1986, 5:1567-1575, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência).
[00336] A matriz à qual o ligante de afinidade é anexado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como de vidro poroso controlado ou de poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de vazão mais rápidas e tempos menores de processamento dos que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina BakerBond ABX® é útil para purificação.
[00337] Outras técnicas para purificação de proteínas, tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina Sepharose®, cromatofocalização, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amônio são também disponíveis e podem ser aplicadas pelo técnico no assunto.
117 / 202
[00338] Após qualquer/quaisquer etapa(s) preliminar(es) de purificação, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida à cromatografia por interação hidrofóbica em pH baixo utilizando um tampão de eluição em um pH entre aproximadamente 2,5 e 4,5, geralmente realizada em concentrações salinas baixas (por exemplo, entre aproximadamente 0 e 0,25 M de sal).
14. Composições farmacêuticas e métodos de administração
[00339] Os conjugados de anticorpos aqui providos podem ser formulados em composições farmacêuticas utilizando métodos disponíveis na técnica e aqueles aqui descritos. Qualquer um dos conjugados de anticorpos aqui providos pode ser fornecido na composição farmacêutica adequada e ser administrado por uma via de administração adequada.
[00340] Os métodos aqui providos abrangem administrar composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um conjugado de anticorpo aqui provido e um ou mais veículos compatíveis e farmaceuticamente aceitáveis. Nesse contexto o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou de um estado, listado na Farmacopeia U.S. ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em humanos. O termo “veículo” inclui um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto)), excipiente, ou veículo com o qual o agente terapêutico é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Água pode ser utilizada como veículo quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também ser empregadas como veículos líquidos, especialmente para soluções injetáveis. Exemplos de veículos farmacêuticos exemplares são descritos em Martin, E.W.,
118 / 202 Remington’s Pharmaceutical Sciences.
[00341] Na prática clínica, as composições farmacêuticas ou conjugados de anticorpos aqui providos podem ser administrados por qualquer via conhecida na técnica. As vias de administração exemplares incluem, entre outros, as vias de inalação, intra-arterial, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, nasal, parenteral, pulmonar e subcutânea. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica ou conjugado de anticorpo aqui providos é administrada por via parenteral.
[00342] As composições para administração parenteral podem ser emulsões ou soluções estéreis. As composições parenterais podem incluir, por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis (por exemplo, oleato de etila). Essas composições podem também conter agentes hidratantes, isotonizantes, emulsificantes, dispersantes e estabilizantes. A esterilização pode ser realizada de diversas maneiras, por exemplo, usando um filtro bacteriológico, por radiação ou por aquecimento. As composições parenterais podem também ser preparadas na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas no momento de uso em água estéril ou qualquer outro meio estéril injetável.
[00343] Em algumas modalidades, uma composição aqui provida é uma composição farmacêutica ou uma forma de dose unitária única. As composições farmacêuticas e formas de dose unitária única aqui providas compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um ou mais conjugados de anticorpos profiláticos ou terapêuticos.
[00344] A composição farmacêutica pode compreender um ou mais excipientes farmacêuticos. Qualquer excipiente farmacêutico adequado pode ser utilizado, e qualquer técnico no assunto é capaz de selecionar excipientes farmacêuticos adequados. Exemplos não limitantes de excipientes adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, calcário, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco,
119 / 202 cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e similares. Se um determinado excipiente é adequado para incorporação em uma composição farmacêutica ou forma farmacêutica depende de uma variedade de fatores bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, a maneira na qual a forma farmacêutica será administrada a um indivíduo e o anticorpo específico na forma farmacêutica. A composição ou forma de dose unitária única, se desejado, pode também conter quantidades mínimas de agentes hidratantes ou emulsificantes, ou de agentes de tamponamento do pH. Deste modo, os excipientes farmacêuticos fornecidos abaixo se destinam a ser ilustrativos, e não limitantes. Excipientes farmacêuticos adicionais incluem por exemplo, aqueles descritos no Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.) 6a Ed. (2009), aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00345] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um agente antiespumante. Qualquer agente antiespumante adequado pode ser utilizado. Em alguns aspectos, o agente antiespumante é selecionado dentre um álcool, um éter, um óleo, uma cera, um silicone, um tensoativo e combinações do mesmo. Em alguns aspectos, o agente antiespumante é selecionado dentre um óleo mineral, um óleo vegetal, etileno bis estearamida, uma cera parafínica, uma cera esterificada uma cera de álcool graxo, um álcool graxo de cadeia longa, um sabão de ácido graxo, um éster de ácido graxo, um glicol de silício, um silicone fluorado, um copolímero de polietilenoglicol-polipropilenoglicol, polidimetilsiloxano-dióxido de silício, éter, álcool octílico, álcool caprílico, trioleato de sorbitano, álcool etílico, 2- etil-hexanol, dimeticona, álcool oleílico, simeticona e combinações dos mesmos.
[00346] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um co-solvente. Exemplos ilustrativos de co-solventes incluem etanol, poli(etileno)glicol, butilenoglicol, dimetilacetamida, glicerina e
120 / 202 propilenoglicol.
[00347] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um tampão. Exemplos ilustrativos de tampões incluem acetato, borato, carbonato, lactato, malato, fosfato, citrato, hidróxido, dietanolamina, monoetanolamina, glicina, metionina, goma guar e glutamato monossódico.
[00348] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um veículo ou um material de preenchimento (filler). Exemplos ilustrativos de veículos ou materiais de preenchimento include lactose, maltodextrina, manitol, sorbitol, quitosano, ácido esteárico, goma xantana e goma guar.
[00349] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um tensoativo. Exemplos ilustrativos de tensoativos incluem d- alfa tocoferol, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, cetrimida, cloreto de cetilpiridínio, docusato sódico, behenato de glicerila, monooleato de glicerila, ácido láurico, hidroxiestearato de macrogol 15, álcool miristílico, fosfolipídios, alquil éteres de polioxietileno, ésteres de polioxietileno sorbitano de ácidos graxos, estearatos de polioxietileno, polioxiglicerídeos, lauril sulfato de sódio, ésteres de sorbitano, vitamina E e succinato de polietileno(glicol).
[00350] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um agente anti-aglomerante. Exemplos ilustrativos de agentes anti-aglomerantes incluem fosfato de cálcio (tribásico), hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose e óxido de magnésio.
[00351] Outro excipientes que podem ser utilizados com as composições farmacêuticas incluem, por exemplo, albumina, antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, polímeros bioabsorvíveis, agentes quelantes, agentes de liberação controlada, diluentes, agentes dispersantes, promotores de dissolução, agentes emulsificantes, agentes gelificantes, bases de pomada, promotores de penetração, conservantes,
121 / 202 agentes solubilizantes, solventes, agentes estabilizantes e açúcares. Exemplos específicos de cada um desses agentes são descritos, por exemplo, no Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.) 6a Ed. (2009), The Pharmaceutical Press, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00352] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um solvente. Em alguns aspectos, o solvente é solução salina, tal como solução salina isotônica estéril ou solução de dextrose. Em alguns aspectos, o solvente é água para injeção.
[00353] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas estão em forma particulada, tal como uma micropartícula ou uma nanopartícula. Micropartículas e nanopartículas podem ser formadas a partir de qualquer material adequado, tal como um polímero ou um lipídio. Em alguns aspectos, as micropartículas ou nanopartículas são micelas, lipossomas ou polimersomas.
[00354] Além disso, são providas composições farmacêuticas e formas farmacêuticas anidras que compreendem um conjugado de anticorpo, já que, em algumas modalidades, a água pode facilitar a degradação de alguns anticorpos.
[00355] As composições farmacêuticas e formas farmacêuticas anidras aqui providas podem ser preparadas utilizando ingredientes anidros ou contendo baixa umidade ou em condições de baixa umidade. Composições farmacêuticas e formas farmacêuticas, compreendendo lactose e pelo menos um ingrediente ativo que compreende uma amina primária ou secundária, podem ser anidras, se for previsto contato substancial com hidratação e/ou umidade durante a fabricação, embalagem e/ou armazenamento.
[00356] Uma composição farmacêutica anidra pode ser preparada e armazenada de tal modo que sua natureza anidra seja mantida. Assim, as composições anidras podem ser embaladas com materiais conhecidos por
122 / 202 impedir exposição à água de tal modo que possam ser incluídas em kit adequados de formulário. Exemplos de embalagem adequada incluem, entre outros, laminados hermeticamente fechadas, plástico, recipientes de dose unitária (por exemplo, frascos-ampolas), embalagens de blister e embalagens em tiras.
[00357] As composições sem lactose aqui providas podem compreender excipientes que são bem conhecidos na técnica e estão listados, por exemplo, na Farmacopeia U.S. (USP) SP (XXI)/NF (XVI). Em geral, as composições sem lactose compreendem um ingrediente ativo, um aglutinante/material de preenchimento e um lubrificante em quantidades farmaceuticamente compatíveis e farmaceuticamente aceitáveis. As formas farmacêuticas exemplares sem lactose compreendem um ingrediente ativo, celulose microcristalina, amido pré-gelatinizado e estearato de magnésio.
[00358] Além disso, são providas composições farmacêuticas e formas farmacêuticas que compreendem um ou mais excipientes que reduzem a taxa na qual um anticorpo ou conjugado de anticorpo se decomporá. Tais excipientes, que são aqui referidos como “estabilizadores”, incluem, entre outros, antioxidantes, como ácido ascórbico, tampões do pH ou tampões com sais.
14.1. Formas farmacêuticas parenterais
[00359] Em certas modalidades, são providas formas farmacêuticas parenterais. As formas farmacêuticas parenterais podem ser administradas aos indivíduos por várias vias incluindo, entre outras, subcutânea, intravenosa (incluindo injeção de bolus), intramuscular e intra-arterial. Pelo fato de sua administração tipicamente contornar as defesas naturais dos indivíduos contra contaminantes, as formas farmacêuticas parenterais são tipicamente estéreis ou capazes de ser esterilizadas antes da administração a um indivíduo. Os exemplos de formas farmacêuticas parenterais incluem, entre outras, soluções prontas para injeção, produtos secos prontos para ser dissolvidos ou suspensos
123 / 202 em um veículo farmaceuticamente aceitável para injeção, suspensões prontas para injeção e emulsões.
[00360] Os veículos adequados que podem ser utilizados para fornecer formas farmacêuticas parenterais são bem conhecidos pelos versados na técnica. Os exemplos incluem, entre outros: Água para Injeção USP; veículos aquosos tais como, entre outros, Cloreto de Sódio Injetável, Solução de Ringer Injetável, Dextrose Injetável, Dextrose e Cloreto de Sódio Injetáveis e Solução de Ringer com Lactato Injetável; veículos miscíveis em água, tais como, entre outros, álcool etílico, polietilenoglicol e polipropilenoglicol; e veículos não aquosos tais como, entre outros, óleo de milho, óleo de sementes de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila e benzoato de benzila.
[00361] Excipientes que aumentam a solubilidade e um ou mais dos anticorpos aqui descritos podem também ser incorporados nas formas farmacêuticas parenterais.
14.2. Dose e formas farmacêuticas unitárias
[00362] Em agentes terapêuticos para uso humano, o médico determinará a posologia que considera mais adequada de acordo com um tratamento preventivo ou curativo e de acordo com a idade, o peso, a condição e outros fatores específicos do indivíduo a ser tratado.
[00363] Em certas modalidades, uma composição aqui provida é uma composição farmacêutica ou uma forma de dose unitária única. As composições farmacêuticas e formas farmacêuticas de dose unitária única providas compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos profiláticos ou terapêuticos.
[00364] A quantidade do conjugado de anticorpo ou composição que será eficaz na prevenção ou no tratamento de um transtorno ou um ou mais de seus sintomas variará com a natureza e gravidade da doença ou condição, e a via pela qual o anticorpo é administrado. A frequência e dose também
124 / 202 variarão de acordo com fatores específicos de cada indivíduo dependendo da terapia específica (por exemplo, agentes terapêuticos ou profiláticos) administrada, da gravidade do transtorno, doença ou condição, da via de administração, bem como idade, peso corporal, resposta e a história médica passada do indivíduo. Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou modelo animal.
[00365] Em certas modalidades, as doses exemplares de uma composição incluem quantidades em miligramas ou microgramas do anticorpo por quilograma de peso do indivíduo ou da amostra (por exemplo, entre cerca de 10 microgramas por quilograma e 50 miligramas por quilograma, entre cerca de 100 microgramas por quilograma e 25 miligramas por quilograma ou entre cerca de 100 micrograma por quilograma e 10 miligramas por quilograma). Em certa modalidade, a dose do conjugado de anticorpo aqui provido, com base no peso do anticorpo, administrado para prevenir, tratar, controlar ou melhorar um transtorno, ou um ou mais de seus sintomas, em um indivíduo é 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg ou 15 mg/kg ou mais do peso corporal de um indivíduo. Em outra modalidade, a dose da composição ou de uma composição aqui provida administrada para prevenir, tratar, controlar ou melhorar um transtorno, ou um ou mais de seus sintomas, em um indivíduo é 0,1 mg a 200 mg, 0,1 mg a 100 mg, 0,1 mg a 50 mg, 0,1 mg a 25 mg, 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 7,5 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 mg a 7,5 mg, 0,25 mg a 5 mg, 0,25 mg a 2,5 mg, 0,5 mg a 20 mg, 0,5 a 15 mg, 0,5 a 12 mg, 0,5 a 10 mg, 0,5 mg a 7,5 mg, 0,5 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 7,5 mg, 1 mg a 5 mg ou 1 mg a 2,5 mg.
[00366] A dose pode ser administrada de acordo com um esquema
125 / 202 adequado, por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes ou quatro vezes semanalmente. Pode ser necessário usar doses do conjugado de anticorpo fora das faixas aqui descritas em alguns casos, como será evidente para quaisquer versados na técnica. Além disso, cabe ressaltar que o clínico ou médico atendente saberá como e quando interromper, ajustar ou encerrar a terapia em conjugação com a resposta do indivíduo.
[00367] Quantidades terapeuticamente eficazes diferentes pode ser aplicáveis para doenças e condições distintas, como será prontamente conhecido pelos versados na técnica. Do mesmo modo, quantidades suficientes para prevenir, controlar, tratar ou melhorar tais transtornos, mas insuficientes para provocar ou suficientes para reduzir efeitos adversos associados com os anticorpos aqui providos são também abrangidas pelas quantidades de dose e esquemas para frequência de doses descritos acima. Além disso, quando múltiplas doses de uma composição aqui provida são administradas a um indivíduo, nem todas as doses precisam ser iguais. Por exemplo, a dose administrada ao indivíduo pode ser aumentada para melhorar o efeito profilático ou terapêutico da composição ou pode ser diminuída para reduzir um ou mais efeitos colaterais que um determinado indivíduo pode estar apresentando.
[00368] Em certas modalidades, o tratamento ou a prevenção pode ser iniciado com uma ou mais doses de ataque de um conjugado de anticorpo ou composição aqui providos seguidas por uma ou mais doses de manutenção.
[00369] Em certas modalidades, uma dose de um conjugado de anticorpo ou composição aqui providos pode ser administrada para alcançar uma concentração no estado de equilíbrio do anticorpo no sangue ou soro do indivíduo. A concentração no estado de equilíbrio pode ser determinada por medição de acordo com técnicas disponíveis aos versados na técnica ou pode ter como base as características físicas do indivíduo como altura, peso e idade.
[00370] Em certas modalidades, a administração da mesma
126 / 202 composição pode ser repetida e as administrações podem ser separadas por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses ou 6 meses. Em outra modalidades, a administração do mesmo agente profilático ou terapêutico pode ser repetida e a administração pode ser separada por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses ou 6 meses.
14.3. Terapias e formulações combinadas
[00371] Em certas modalidades, são providas composições e formulações terapêuticas compreendendo qualquer um dos conjugados de anticorpos aqui providos em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos aqui descritos, e métodos de tratamento compreendendo a administração de tais combinações a indivíduos que precisam do mesmo. Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem, entre outros, Erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), Bortezomibe (VELCADE®, Millennium Pharm.), Fulvestranto (FASLODEX®, AstraZeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), Letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de Imatinibe (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatina (Eloxatin®, Sanofi), 5-FU (5-fluorouracila), Leucovorina, Rapamicina (Sirolimo, RAPAMUNE®, Wyeth), Lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), Lonafarnibe (SCH 66336), Sorafenibe (BAY43-9006, Bayer Labs) e Gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes como tiotepa e CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina,
127 / 202 carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas nitrogenadas tais como clorambucil, clomafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato do óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enediínicos (por exemplo, caliqueamicina, especialmente uncialamicina, caliqueamicina gama ll e caliqueamicina ômega ll (Angew Chem.
Intl.
Ed.
Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como o cromóforo neocarzinostatina e cromóforos de cromoproteínas relacionadas de antibióticos enediínicos), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA® (doxorrubicina), morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2- pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pladienolida B, pteropterina, trimetrexato; análogos da purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênicos tais como calusterona, propionato de dromostanolona,
128 / 202 epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK® complexo polissacarídeo (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2’’-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, TAXOL® (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® (Cremophor-free), formulações de paclitaxel em nanopartículas ligadas à albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.) e TAXOTERE® (doxetaxel; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; GEMZAR® (gemcitabina); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® (vinorelbina); novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®); ibandronato; CPT- 11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um dos acima.
[00372] Em certas modalidades, são providas composições e formulações terapêuticas compreendendo qualquer um dos conjugados de
129 / 202 anticorpos aqui providos em combinação com um ou mais inibidores de PD-1 ou PD-L1, e métodos de tratamento compreendendo administrar tais combinações a indivíduos que precisam do mesmo.
Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-L1 compreendem uma pequena molécula bloqueadora da via de PD-1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-L1 compreendem um anticorpo que inibe a atividade de PD-1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-L1 são selecionados a partir do grupo que consiste em: CA-170, BMS-8, BMS-202, BMS-936558, CK-301 e AUNP12. Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-L1 são selecionados a partir do grupo que consiste em: avelumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, atezolizumabe, durvalumabe, AMP-224 (GlaxoSmithKline), MEDI0680/AMP-514 (AstraZeneca), PDR001 (Novartis), cemiplimabe, TSR-042 (Tesaro), Tizlelizumabe/BGB-A317 (Beigene), CK-301 (Checkpoint Therapeutics), BMS-936559 (Bristol-Meyers Squibb), canrelizumabe, sintilimabe, toripalimabe, genolinzumabe e A167 (Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical). Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-são selecionados a partir do grupo que consiste em: MGA012 (Incyte/MacroGenics), PF-06801591 (Pfizer/Merck KGaA), LY3300054 (Eli Lilly), FAZ053 (Novartis), PD-11 (Novartis), CX- 072 (CytomX), BGB-A333 (Beigene), BI 754091 (Boehringer Ingelheim), JNJ-63723283 (Johnson e Johnson/Jannsen), AGEN2034 (Agenus), CA-327 (Curis), CX-188 (CytomX), STI –A1110 (Servier), JTX-4014 (Jounce), (LLY) AM0001 (Armo Biosciences), CBT-502 (CBT Pharmaceuticals), FS118 (F-Star/Merck KGaA), XmAb20717 (Xencor), XmAb23104 (Xencor), AB122 (Arcus Biosciences), KY1003 (Kymab), RXI-762 (RXi). Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-L1 são selecionados a partir do grupo que consiste em: PRS-332 (Pieris Pharmaceuticals), ALPN- 202 (Alpine Immune Science), TSR-075 (Tesaro/Anaptys Bio), MCLA-145
130 / 202 (Merus), MGD013 (Macrogenics), MGD019 (Macrogenics). Em algumas modalidades, um ou mais dos inibidores de PD-1 ou PD-L1 são selecionados dentre um anticorpo monoespecífico ou biespecífico anti-PD1 descrito em, por exemplo, WO 2016/077397, WO 2018/156777 e o Pedido de Patente Internacional No PCT/US2013/034213, depositado em 23 de maio de 2018.
[00373] Os agentes administrados em combinação com os conjugados de anticorpos aqui descritos podem ser administrados um pouco antes, concomitantemente com ou logo depois da administração dos conjugados de anticorpos. Para fins da presente invenção, tais esquemas de administração são considerados a administração de um conjugado de anticorpo “em combinação com” um componente terapeuticamente ativo adicional. As modalidades incluem composições farmacêuticas nas quais um conjugado de anticorpo aqui descrito é formulado junto com um ou mais dos agentes quimioterápicos, inibidores de PD-1 ou inibidores de PD-L1 aqui descritos.
15. Aplicações terapêuticas
[00374] Para aplicações terapêuticas, os conjugados de anticorpos aqui providos podem ser administrados a um mamífero, geralmente um humano, em uma forma farmaceuticamente aceitável tal como aquelas conhecidas na técnica e aquelas discutidas acima. Por exemplo, os conjugados de anticorpos podem ser administrados a um humano por via intravenosa em bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal ou intratumoral. Os conjugados de anticorpos também são adequadamente administrados pelas vias peritumoral, intralesional ou perilesional, para exercer efeitos locais bem como sistêmicos. A via intraperitoneal pode ser particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores ovarianos.
[00375] Os conjugados de anticorpos aqui providos podem ser úteis para o tratamento de qualquer doença ou condição que envolva o receptor alfa
131 / 202 de folato (FOLR1). Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição que pode ser diagnostica pela superexpressão do receptor alfa de folato. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição que pode se beneficiar do tratamento com um anticorpo anti- receptor alfa de folato. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um câncer.
[00376] Qualquer câncer adequado pode ser tratado com os conjugados de anticorpos aqui providos. Cânceres ilustrativos adequados incluem, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), carcinoma adrenocortical, câncer de ânus, câncer de apêndice, astrocitoma, carcinoma basocelular, tumor cerebral, câncer de ductos biliares, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer de mama (incluindo câncer de mama triplo-negativo ou CMTN), tumor brônquico, carcinoma de origem primária desconhecida, tumor cardíaco, câncer cervical, cordoma, câncer de cólon, câncer colorretal, craniofaringioma, carcinoma ductal, tumor embrionário, câncer de endométrio, ependimoma, câncer de esôfago, estesioneuroblastoma, carcinoma de trompa de Falópio, histiocitoma fibroso, sarcoma de Ewing, câncer de olho, tumor de células germinativas, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal, doença trofoblástica gestacional, glioma, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular, histiocitose, linfoma de Hodgkin, câncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumor de células das ilhotas, sarcoma de Kaposi, câncer de rim, histiocitose de células de Langerhans, câncer de laringe, câncer de lábio e da cavidade oral, câncer de fígado, carcinoma lobular in situ, câncer de pulmão, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer escamoso metastático do pescoço com primário oculto, carcinoma do trato da linha média envolvendo o gene NUT, câncer de boca, síndrome das neoplasias endócrinas múltiplas, mieloma múltiplo, micose fungoide, síndrome
132 / 202 mielodisplásica, neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa, câncer do seio paranasal e cavidade nasal, câncer de nasofaringe, neuroblastoma, câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), câncer de orofaringe, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, papilomatose, paraganglioma, câncer de paratireoide, câncer de pênis, câncer de faringe, feocromocitomas, tumor de hipófise, blastoma pleuropulmonar, linfoma primário do sistema nervoso central, carcinoma peritoneal primário, câncer de próstata, câncer de reto, câncer de células renais, câncer da pelve renal e ureter, retinoblastoma, tumor rabdoide, câncer de glândula salivar, síndrome de Sezary, câncer de pele, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, tumor da medula espinhal, câncer de estômago, linfoma de células T, tumor teratoide, câncer de testículo, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer de uretra, câncer de útero, câncer de vagina, câncer de vulva e tumor de Wilms.
[00377] Em algumas modalidades, a doença a ser tratada com os conjugados de anticorpos aqui providos é câncer gástrico, câncer colorretal, carcinoma de células renais, câncer cervical, carcinoma pulmonar de não pequenas células, câncer de ovário, câncer de útero, carcinoma de trompa de Falópio, carcinoma peritoneal primário, carcinoma do corpo uterino, carcinoma do endométrio, câncer de próstata, câncer de mama, câncer da cabeça e pescoço, carcinoma cerebral, câncer de fígado, câncer de pâncreas, mesotelioma e/ou um câncer de origem epitelial. Em modalidades específicas, a doença é câncer colorretal. Em algumas modalidades, a doença é câncer de ovário. Em algumas modalidades, a doença é câncer de mama. Em algumas modalidades, a doença é câncer de mama triplo-negativo (CMTN). Em algumas modalidades, a doença é câncer de pulmão. Em algumas modalidades, a doença é câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC). Em algumas modalidades, a doença é câncer da cabeça e pescoço. Em
133 / 202 algumas modalidades, a doença é carcinoma de células renais. Em algumas modalidades, a doença é carcinoma cerebral. Em algumas modalidades, a doença é câncer de endométrio.
16. Aplicações diagnósticas
[00378] Em algumas modalidades, os conjugados de anticorpos aqui providos são utilizados em aplicações diagnósticas. Por exemplo, um conjugado de anticorpo anti-FOLR1 pode ser útil em ensaios para proteína FOLR1. Em alguns aspectos, o conjugado de anticorpo pode ser utilizado para detectar a expressão de FOLR1 em várias células e tecidos. Esses ensaios podem ser úteis, por exemplo, para fazer a um diagnóstico e/ou prognóstico de uma doença, tal como um câncer.
[00379] Em algumas aplicações diagnósticas e prognósticas, o conjugado de anticorpo pode ser marcado com uma porção detectável. As porções detectáveis adequadas incluem, entre outros, radioisótopos, marcadores fluorescentes e marcadores substratos de enzimas. Em outra modalidade, o conjugado anti-FOLR1 de anticorpo não precisa ser marcado, e a presença do conjugado de anticorpo pode ser detectada utilizando um anticorpo marcado que se liga especificamente ao conjugado anti-FOLR1 de anticorpo.
17. Reagentes para purificação por afinidade
[00380] Os conjugados de anticorpos aqui providos podem ser utilizados como agentes para purificação por afinidade. Nesse processo, os conjugados de anticorpos podem ser imobilizados em uma fase sólida, tal como uma reina ou papel filtro, por meio de métodos bem conhecidos na técnica. O conjugado de anticorpo imobilizado é colocado em contato com uma amostra contendo a proteína receptor alfa de folato (ou fragmento do mesmo) a ser purificada e, depois, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto a proteína receptor alfa de folato, que está ligada ao anticorpo imobilizado.
134 / 202 Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão glicina, pH 5,0, que liberará a proteína receptor alfa de folato do anticorpo.
18. Kits
[00381] Em algumas modalidades, um conjugado de anticorpo anti- FOLR1 aqui provido é fornecido na forma de um kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar um procedimento. Em algumas modalidades, o procedimento é um ensaio diagnóstico. Em outra modalidades, o procedimento é um procedimento terapêutico.
[00382] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um solvente para a reconstituição do conjugado anti-FOLR1 de anticorpo. Em algumas modalidades, o conjugado anti-FOLR1 de anticorpo é fornecido na forma de uma composição farmacêutica. Exemplos Exemplo 1. Geração e rastreamento primário de anticorpos anti-FOLR1
[00383] Bibliotecas de anticorpos Fab foram construídas utilizando um protocolo padrão de PCR por extensão-sobreposição com primers (iniciadores) mutagênicos direcionados para regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Ver Heckman e Pease, Nat. Protoc., 2007, 2:924-932; Stafford et al., 2014, Protein Eng. Des. Sel. 27:97-109, ambos incorporados, em sua totalidade por referência. As seleções de novos anticorpos foram realizadas utilizando protocolos padrão de apresentação por ribossomos. Ver Dreier e Plückthun, 2011, Methods Mol Biol 687:283-306, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00384] Os anticorpos iniciais líderes da apresentação por ribossomos foram derivados de uma biblioteca humana virgem que foi construída por sobreposição de PCR utilizando HC de trastuzumabe como o molde base. CDRs H1 e H2 foram randomizadas, empregando o mesmo desenho como
135 / 202 descrito por Lee et al., J. Mol. Biol. 2004, 340:1073-1093, utilizando oligonucleotídeos adquiridos da Integrated DNA Technologies. Nesse desenho, CDRs H1 e H2 correspondem melhor às distribuições de aminoácidos de anticorpos humanos naturais. CDR H3 foi diversificada utilizando oligonucleotídeos incorporando misturas de trímeros de fosforamidita (TRIMs) para randomização dos aminoácidos. Os oligos TRIM oligos foram sintetizados como descrito por Yagodkin A et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2007, 26:473-97. Especificamente, usaram-se seis oligonucleotídeos separados contendo TRIMs para produzir 6 comprimentos da alça de H3 (13-18; conforme definido por Zemlin et al.) para corresponder aos comprimentos mais comuns de alça observados no repertório humano. Em conjunto, esses comprimentos de alça compreendem aproximadamente 54,5% da variação do comprimento de alça natural em IgGs humanas, conforme relatado por Zemlin et al., J. Mol. Biol. 2003, 334:733-749. A distribuição da frequência de cada aminoácido foi projetada para corresponder melhor à distribuição observada de aminoácidos em CDR H3 de IgGs humanas, conforme relatado por Zemlin et al. Em conjunto, a biblioteca corresponde melhor à variação natural de anticorpos humanos, que é conhecida no campo para melhorar a estabilidade e o dobramento dos anticorpos como descrito por Zhai et al., J Mol Biol. 2011, 412:55-71. A biblioteca da cadeia pesada (HC) foi pareada com uma cadeia leve constante (LC), não modificada de trastuzumabe por todo o processo de seleção como descrito por Stafford et al., Protein Eng Des Sel 2014, 27:97-109.
[00385] Os líderes dos anticorpos maturados por afinidade (por exemplo, anticorpos SRP 1848, abaixo) foram derivados de uma biblioteca focada, tendenciosa em favor de dois líderes, a qual foi construída com PCR por sobreposição utilizando oligonucleotídeos “soft-randomized” (randomizados de modo tendencioso) da Eurofins MWG Operon. A soft- randomization (randomização parcial) é um processo no qual uma
136 / 202 distribuição tendenciosa de nucleotídeos é usada para cada códon soft- randomized de tal modo que a sequência de aminoácidos parental é codificada mais frequentemente do que outros aminoácidos ~30% do tempo. Outros aminoácidos são codificados em cada posição, mas em uma porcentagem menor. Em cada posição soft-randomized, 70% do nucleotídeo parental são misturados com 10% dos outros três nucleotídeos. Para a biblioteca, CDRs H1, H2 e H3 foram soft-randomized simultaneamente e selecionados por protocolos padrão de apresentação por ribossomos. Tal como com a seleção dos líderes iniciais, os anticorpos maturados por afinidade foram pareados com uma LC constante, não modificada de trastuzumabe por todo o processo de seleção como descrito por Stafford et al., Protein Eng Des Sel 2014, 27:97-
109.
[00386] As seleções de novos anticorpos foram realizadas utilizando protocolos padrão de apresentação por ribossomos. Ver Dreier e Plückthun, Methods Mol. Biol., 2003, 687:283-306, Clifton, NJ, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Seleções de Fab, com apresentação por ribossomos, foram realizadas de acordo com protocolos publicados. Ver Stafford et al., 2014, Protein Eng. Des. Sel. 27:97-109; Hanes e Plückthun, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:4937-4942; ambos incorporados, em sua totalidade, por referência. Após múltiplos ciclos de seleção, o DNA obtido por RT-PCR foi clonado em um vetor otimizado para expressão livre de células, utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Ver Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Todas as construções receberam etiquetas HIS e FLAG para agilizar a purificação e testes durante o rastreamento.
[00387] Bibliotecas de variantes de anticorpos, geradas por fluxo de trabalho de seleção, foram transformadas em E. coli e cultivadas em placas de ágar com antibiótico (canamicina). Colônias individuais foram cultivadas em caldo líquido (TB + canamicina), e usadas como molde para amplificação de
137 / 202 DNA via amplificação por círculo rolante (RCA). As variantes foram então expressas em reações de síntese proteica livre de células como descrito in Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225.
[00388] Resumidamente, extratos sem células foram tratados com iodoacetamida 50 µM durante 30 minutos à temperatura ambiente (20°C) e adicionados a uma pré-mistura contendo componentes livres de células (ver Cai et al., Biotechnol Prg, 2015, 3:823-831, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência) e molde RCA DNA 10% (v/v) (DNA aproximadamente 10 μg/mL) para variantes HC, além de LC de Transtuzumabe 2,5 µg/mL, que está presente para montagem do anticorpo, mas não é variada na biblioteca. Sessenta microlitros de reações livre de células foram incubados a 30°C durante 12 horas em um agitador a 650 rpm em placas de 96 cavidades. Quatrocentos a mil e quinhentas (400 a 1500) colônias foram rastreadas, dependendo da diversidade prevista de diferentes campanhas de seleção.
[00389] Após a síntese, cada reação foi diluída 1:50 em PBS (pH 7,4) com soro fetal bovino 3% (FBS), e as variantes expressas foram testadas quanto à atividade funcional por meio de ELISA celular da ligação a células CHO-hFOLR1 (FOLR1 humano expresso por recombinação em células do ovário de hamster chinês). Resumidamente, placas de 384 cavidades foram semeadas com células CHO-controle ou CHO-hFOLR1 no dia antes do ensaio. No dia do ensaio, as células foram fixadas com 20 µL de paraformaldeído 4% em PBS durante 15 minutos no escuro, lavadas com PBS e, a seguir, bloqueadas com FBS 30% em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Variantes de anticorpos de interesse (diluídas 1:50 na reação livre de células) foram deixadas ligarem-se às células CHO-hFOLR1 fixadas, detectadas com anticorpos secundários (por exemplo, anti-Fc humano conjugado com HRP ou anti-FLAG) e então detectadas com substrato quimioluminescente (Pierce ELISA SuperSignalTM Substrate). A
138 / 202 quimioluminescência foi quantificada em um leitor de placas Molecular Devices SpectraMax® M5. Os principais acertos foram selecionados com base na razão sinal/ruído no ELISA celular, e os seus nucleotídeos foram sequenciados. Tendo por base a atividade de ligação e a análise da sequência, um subconjunto de variantes foi selecionado para ampliação da escala e caracterização adicional.
[00390] Os líderes melhores da avaliação com base em ELISA foram cultivados, e extrações plasmidiais em pequena escala (minipreps) foram realizadas com um kit QIAprep® 96 Turbo miniprep (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. DNA obtido por miniprep, 10 μg/mL, foi adicionado a 4 mL de reações livres de células e incubado durante a noite por 12 horas a 30°C e 650 rpm. No caso de variantes de IgG com uma LC comum de Trastuzumabe, 7,5 µg/mL do DNA da variante HC e 2,5 µg/mL da LC comum de Trastuzumabe foram adicionados à reação.
[00391] As variantes expressas das reações livres de células clarificadas foram purificadas via purificação por cromatografia de afinidade por íon metálico imobilizado (IMAC) utilizando um método semiautomático de purificação de alto rendimento em batelada. Resumidamente, as purificações foram realizadas em um formato de placa com 96 cavidades onde uma resina IMAC, 50 μL/cavidade (Ni Sepharose High Performance, GE Healthcare), foi equilibrada em tampão de ligação IMAC (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM), incubada com 1 mL de reação livre de células por 15 minutos seguido por duas lavagens em tampão de ligação IMAC. Variantes de anticorpos com etiqueta His foram então eluídas usando 200 μL do tampão de eluição IMAC (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM), e o tampão trocado para PBS usando uma placa Zeba com 96 cavidades (7 kD MWCO, Thermo Fisher). Os anticorpos purificados foram quantificados via eletroforese capilar de alto rendimento usando o LabChip GXII (Perkin Elmer) contra uma curva padrão de Herceptina, de acordo com
139 / 202 as instruções do fabricante.
[00392] Anticorpos exemplares maturados por afinidade são relatados na Tabela 5, abaixo. Tabela 5. Anticorpos maturados por afinidade (SRP1848) Anticorpo VH SEQ ID NO. VL SEQ ID NO. 1 SRP1848-A01 308 Trastuzumabe 367 2 SRP1848-A02 309 Trastuzumabe 367 3 SRP1848-A04 310 Trastuzumabe 367 4 SRP1848-A06 311 Trastuzumabe 367 5 SRP1848-A07 312 Trastuzumabe 367 6 SRP1848-A08 313 Trastuzumabe 367 7 SRP1848-A09 314 Trastuzumabe 367 8 SRP1848-A10 315 Trastuzumabe 367 9 SRP1848-B01 316 Trastuzumabe 367 10 SRP1848-B03 317 Trastuzumabe 367 11 SRP1848-B04 318 Trastuzumabe 367 12 SRP1848-B05 319 Trastuzumabe 367 13 SRP1848-B06 320 Trastuzumabe 367 14 SRP1848-B07 321 Trastuzumabe 367 15 SRP1848-B09 322 Trastuzumabe 367 16 SRP1848-B10 323 Trastuzumabe 367 17 SRP1848-B11 324 Trastuzumabe 367 18 SRP1848-C01 325 Trastuzumabe 367 19 SRP1848-C03 326 Trastuzumabe 367 20 SRP1848-C04 327 Trastuzumabe 367 21 SRP1848-C05 328 Trastuzumabe 367 22 SRP1848-C07 329 Trastuzumabe 367 23 SRP1848-C10 330 Trastuzumabe 367 24 SRP1848-D02 331 Trastuzumabe 367 25 SRP1848-D03 332 Trastuzumabe 367 26 SRP1848-D04 333 Trastuzumabe 367 27 SRP1848-D05 334 Trastuzumabe 367 28 SRP1848-D07 335 Trastuzumabe 367 29 SRP1848-D09 336 Trastuzumabe 367 30 SRP1848-D10 337 Trastuzumabe 367 31 SRP1848-E01 338 Trastuzumabe 367 32 SRP1848-E02 339 Trastuzumabe 367 33 SRP1848-E03 340 Trastuzumabe 367 34 SRP1848-E05 341 Trastuzumabe 367 35 SRP1848-E06 342 Trastuzumabe 367 36 SRP1848-E07 343 Trastuzumabe 367 37 SRP1848-F01 344 Trastuzumabe 367 38 SRP1848-F02 345 Trastuzumabe 367 39 SRP1848-F04 346 Trastuzumabe 367 40 SRP1848-F05 347 Trastuzumabe 367 41 SRP1848-F06 348 Trastuzumabe 367 42 SRP1848-F07 349 Trastuzumabe 367 43 SRP1848-F08 350 Trastuzumabe 367 44 SRP1848-F09 351 Trastuzumabe 367 45 SRP1848-F10 352 Trastuzumabe 367 46 SRP1848-F11 353 Trastuzumabe 367 47 SRP1848-G01 354 Trastuzumabe 367 48 SRP1848-G03 355 Trastuzumabe 367 49 SRP1848-G04 356 Trastuzumabe 367 50 SRP1848-G06 357 Trastuzumabe 367
140 / 202 Anticorpo VH SEQ ID NO. VL SEQ ID NO. 51 SRP1848-G07 358 Trastuzumabe 367 52 SRP1848-G09 359 Trastuzumabe 367 53 SRP1848-G10 360 Trastuzumabe 367 54 SRP1848-G11 361 Trastuzumabe 367 55 SRP1848-H01 362 Trastuzumabe 367 Exemplo 2. Preparação de scFvs
[00393] Um anticorpo de cadeia única é produzido na orientação VHVL ou VLVH com uma sequência de ligador entre os domínios VH e VL. Tipicamente, ligadores de scFv são compostos por (GGGGS)n repetições, onde n = 3, 4, 5 ou 6 para ligadores de 15, 20, 25 ou 30 resíduos respectivamente. Para expressão livre de células, um Met N-terminal é adicionado, mas, para expressão em mamíferos, uma peptídeo líder é adicionado. Na extremidade C-terminal do scFv, uma sequência de Fc pode ser adicionada para prolongar a meio-vida in vivo ou o scFv pode ser utilizado diretamente. Uma sequência de ligador opcional pode ser incorporada entre o scFv e o Fc. Uma sequência de ligador exemplar para scFv-Fc é AAGSDQEPKSS (SEQ ID NO: 378). Etiquetas de afinidade no C-terminal podem ser opcionalmente adicionadas para facilitar o desenvolvimento na purificação e ensaio. Uma etiqueta de afinidade exemplar é uma etiqueta FlagHis no C-terminal GSGDYKDDDDKGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 376). Um códon de parada é tipicamente inserido no final da sequência. Um scFv exemplar pode incluir um resíduo Met N-terminal, um domínio VH, um ligador GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 377), um domínio VL, um ligador AAGSDQEPKSS (SEQ ID NO: 378), um domínio Fc, uma etiqueta FlagHis e um códon de parada. Exemplo 3. Análises da afinidade e cinética da ligação
[00394] Anticorpos policlonais anti-Fc foram imobilizados em um chip CM5 (GE Life Sciences) usando a química de acoplamento com amina (da Amine Coupling Kit, GE Life Sciences). As etapas de imobilização foram realizadas com uma vazão de 25 µL/min em 1x tampão HBS-EP+ (GE Life Sciences; 10x Estoque diluído antes do uso). As superfícies do sensor foram
141 / 202 ativadas por 7 minutos com uma mistura de N-hidroxissuccinimida (NHS, 0,05 M) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC, 0,2 M). Os anticorpos policlonais anti-Fc foram injetados sobre todas as 4 células do fluxo a uma concentração de 25 µg/mL em acetato de sódio 10 mM, pH 4,5, por 7 minutos. Etanolamina (1 M, pH 8,5) foi injetada durante 7 minutos para bloquear quaisquer grupos ativados restantes. Uma média de 12.000 unidades de resposta (RU) do anticorpo de captura foi imobilizada em cada célula do fluxo.
[00395] Experimentos de off-rate (taxa de dissociação) e cinética de ligação foram realizados a 25°C com 1x tampão HBS-EP+. Anticorpos teste e controle foram injetados sobre a superfície anti-Fc em concentrações de 5-10 µg/mL por 12 segundos com uma vazão de 10 µL/minuto nas células do fluxo 2, 3 e 4, seguido por um tampão de lavagem por 30 segundos na mesma vazão. A caracterização da cinética de amostras do anticorpo foi realizada com uma única concentração de antígeno (para ordenação da taxa de dissociação) ou uma série de diluições 1:2 do antígeno (para caracterização da cinética) e 1 injeção de antígeno 0 nM. Após a captura do ligante (anticorpo) na superfície anti-Fc, o analito (FOLR1 humano-HIS) foi ligado a 50; 25; 12,5; 6,25 e 0 nM por 180 segundos, seguido por uma fase de dissociação de 600 segundos com vazão de 50 µL/min. Entre cada ciclo de captura do ligante e ligação do analito, a regeneração foi realizada utilizando 2 injeções de glicina 10 mM, pH 2,0, por 30 segundos a 30 µL/min, seguido por uma etapa de lavagem com tampão de 30 segundos.
[00396] Os dados foram ajustados com o software Biacore T200 Evaluation, usando um modelo de ligação 1:1 de Langmuir. KD (afinidade, nM) foi determinada como uma razão entre as constantes da taxa cinética calculadas a partir dos ajustes das fases de associação e dissociação. Exemplo 4. Ensaio ligação celular com base em citometria de fluxo
[00397] Variantes com níveis de expressão >250 nM foram testadas em
142 / 202 um ensaio de ligação celular de separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Células CHO foram transfectadas para expressar estavelmente (CHO-hFOLR1) humano, (CHO-cFOLR1) de macaco cinomolgo ou (CHO-mFOLR1) de camundongo da molécula alvo FOLR1 na superfície celular. Células CHO parentais foram usadas como controle negativo controle para determinar níveis de ligação de fundo. Células CHO parentais e CHO-hFOLR1, CHO-cFOLR1 e CHO-mFOLR1 estavelmente transfectadas foram cultivadas em meio de Ham F-12:DMEM com alto teor de glicose (50:50) (Corning, Cellgro-Mediatech), suplementado com soro fetal bovino 10% inativado pelo calor (Corning, Cellgro-Mediatech), penicilina/estreptomicina 1% (Corning, Cellgro-Mediatech) e glutamax 2 mmol/L (Life Technology).
[00398] Uma mistura de células CHO parentais marcadas por fluorescência e células CHO-hFOLR1 não marcadas foram preparadas como segue. Células CHO parentais foram lavadas duas vezes em PBS e incubadas em PBS contendo CellTraceTM Oregon Green488® 1 nM (Life Technologies) a 37°C por 30 minutos. As células CHO parentais marcadas foram então lavadas com 2x meio de Ham F-12 e 2x com tampão FACS (PBS com albumina sérica bovina 1%). As células CHO-hFOLR1 não marcadas foram igualmente lavadas e preparadas. As células CHO parentais marcadas e CHO- hFOLR1 não marcadas foram combinadas em proporção 1:1 e semeadas a 50 µL por cavidade (200.000 células por cavidade) em placas de polipropileno com 96 cavidades. As células foram misturadas com 50 µL de anticorpos teste (ou seja, variantes anti-FOLR1) diluídos serialmente em tampão FACS e incubados em gelo por 60 minutos. As células foram lavadas com tampão FACS e incubadas em gelo por 60 minutos com 100 µL de tampão FACS contendo R-ficoeritrina-conjugado de cabra-anti-IgG humano 2,5 µg/mL (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS, fixadas em paraformaldeído 2% em
143 / 202 PBS (Santa Cruz Biotechnology; Dallas, TX) por 10 minutos em gelo no escuro e analisadas com o Citômetro de Fluxo BD LSR II (BD Biosciences; San Jose, CA). Os dados foram analisados utilizando o software FlowJo® (FlowJo, LLC; Ashland, OR) para determinar intensidades médias de fluorescência. As constantes de ligação foram calculadas com o software de estatística, GraphPad Prism (GraphPad Software; La Jolla, CA) usando a equação de regressão não linear, um sítio – ligação específica com inclinação Hill. O anticorpo secundário sozinho foi usado como controle, além de medir a ligação não específica do anticorpo às células CHO parentais.
[00399] Esse procedimento foi repetido para avaliar a ligação celular em células CHO-cFOLR1 e CHO-mFOLR1. Exemplo 5. Análise de morte celular
[00400] A internalização dos anticorpos foi avaliada por um ensaio de morte celular com anticorpo secundário em células positivas alvo. Células KB FOLR1-positivas foram obtidas da ATCC, e células Igrov1 FOLR1-positivas foram obtidas do NIH. As células foram mantidas em meio de Ham F- 12:DMEM com alto teor de glicose (50:50) (Corning, Cellgro-Mediatech), suplementado com soro fetal bovino 10% inativado pelo calor (Corning, Cellgro-Mediatech, Manassas, Virginia), penicilina/estreptomicina 1% (Corning, Cellgro-Mediatech, Manassas, Virginia) e glutamax 2 mmol/L- (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). Células aderentes foram lavadas duas vezes com Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS) sem cálcio e magnésio, colhidas com HYQ®TASE™ (Hyclone; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) e contadas pelos Analisadores de Viabilidade Celular Vi-CELL (Beckman Coulter, Indianapolis, Indiana). No total, 625 células foram semeadas em cada cavidade de uma placa branca de poliestireno com fundo plano de 384 cavidades. Os anticorpos líderes foram formulados a uma concentração 4 vezes a inicial no meio de cultura e filtrados através de placas MultiScreenHTS 96-Well Filter Plates (Milipore;
144 / 202 Billerica, Massachusetts). Diluições seriadas do anticorpo teste (diluição seriada 1:3 iniciando a partir de 200 nM) foram adicionadas a cavidades de tratamento, e um nanobody anti-Fc humano conjugado à hemiasterlina através de um ligador clivável foi então adicionado a cada cavidade com uma concentração final fixa de 20 nM. As placas de ensaio foram cultivadas a 37°C em uma incubadora com CO2 durante 120 horas antes do ensaio. Para medição da viabilidade celular, 30 μL do reagente Cell Titer-Glo® (Promega Corp. Madison, WI) foram adicionados a cada cavidade, e as placas foram processadas de acordo com as instruções do produto. A luminescência relativa foi medida em um leitor de placa ENVISION® (Perkin-Elmer; Waltham, MA). As leituras de luminescência relativa foram convertidas em porcentual de viabilidade usando células não tratadas como controle. Os dados foram ajustados com análise de regressão não linear, usando uma inclinação de log(inibidor) vs. resposta-variável, ajuste de 4 parâmetros com GraphPad Prism (GraphPad v 5.0, Software; San Diego, California). Os dados foram expressos como % de viabilidade celular relativa (teor de ATP) vs. dose de anticorpo. Exemplo 6. Geração de hibridoma
[00401] Camundongos imunocompetentes (C57BL/6) foram imunizados com células MC38 de camundongo que superexpressam FOLR1 humano. Anticorpos específicos contra FOLR1 foram detectados no soro, e o baço foi recolhido e fundido com células P3X para gerar os hibridomas (Aragen Biosciences, Morgan Hill, CA), de modo semelhante ao que anteriormente descrito. Ver Chronopoulou, et al., 2014, Methods Mol Biol 1131:47-70, e Kim, et al., 2014, Methods Mol Biol 1131:31-45, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência. RNA total foi extraído de células de hibridoma usando o QIAGEN RNeasy Mini Kit (Cat. No 74104) e convertido em cDNA utilizando o kit Clontech SMARTer RACE cDNA Amplification (Cat. No 634923) (Lake Pharma, Belmont, CA).
145 / 202 Clones positivos foram identificados por eletroforese em gel, clonados usando um kit Invitrogen TOPO e sequenciados por métodos de Sanger padrão. As CDRs para m6D1 foram enxertadas nas regiões de arcabouços VH1-18, VH3- 33, VH2-5, VH2-70, VH4-30-4, Vk1-5, Vk3-11, Vk2-30, Vk1-33 e Vk1-16 do anticorpo humano pela metodologia padrão para produzir anticorpos humanizados. Ver Kuramochi, et al., 2014, Methods Mol Biol 1060:123-137, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência. Desses enxertos, as IgGs h6D1-HC3/LC4 (enxertos VH3-33/Vk3-11) e h6D1- HC3/LC5 (enxertos VH3-33/Vk1-5) forneceram o melhor rendimento quando expressas em sistema sem célula e mantiveram a afinidade mais alta. As duas variantes HC3/LC4 e HC3/LC5 humanizadas progrediram para maturação por afinidade por apresentação em ribossomos com base em Fab (como descrito acima), direcionado para as CDRs da cadeia pesada CDRs por soft- randomization deixando a região constante da cadeia leve, como descrito in Stafford, et al., 2014, Protein Eng Des Sel 4:97-109, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
[00402] Certos anticorpos foram gerados com maturação por afinidade de anticorpos humanizados de camundongo. Anticorpos candidatos exemplares são relatados na Tabela 6, abaixo. Tabela 6. Anticorpos humanizados maturados por afinidade (SRP2060). Anticorpo VH SEQ ID NO. VL SEQ ID NO. 56 SRP2060-E10 363 H6D1-LC4 368 57 SRP2060-E05 364 H6D1-LC4 368 58 SRP2060-B01 365 H6D1-LC5 369 59 SRP2060-A06 366 H6D1-LC5 369 Exemplo 7. Características de anticorpos anti-FOLR1 ilustrativos
[00403] As Tabelas 7 a 9 mostram resultados obtidos utilizando os anticorpos ilustrativos aqui descrito.
[00404] A Tabela 7 mostra resultados obtidos com anticorpos isolados da maturação por afinidade de anticorpos iniciais líderes obtidos a partir d uma biblioteca de Fab virgem TRiM de apresentação por ribossomos, construída em uma região de arcabouço da cadeia pesada (HC) de
146 / 202 Trastuzumabe.
[00405] A Tabela 8 mostra os resultados da cinética de ligação obtidos para os mesmos anticorpos listados na Tabela 7.
[00406] A Tabela 9 mostra resultados obtidos de anticorpos isolados a partir de clones candidatos humanizados de camundongo.
Tabela 7. Anticorpos maturados por afinidade desde líderes iniciais (Framework HC de Trastuzumabe). Igrov, 2° Anticorpo de CHO-FolR1 humano KB, 2° Anticorpo de CHO-FolR1 morte celular, Nb- CHO-FolR1 cino morte celular, Nb-239 camundongo ID da variante Fab-HC SC239 Intervalo Intervalo Bmax Bmax EC50 (nM) EC50 (nM) Bmax (MFI) KD (nM) KD (nM) KD (nM) (%) (%) (MFI) (MFI) SRP1848-A01 0,064 94 0,015 71 25899 0,39 22552 0,44 16475 0,8 SRP1848-A02 0,028 94 0,039 71 24710 0,64 18500 0,50 18569 2,4 SRP1848-A07 0,062 95 0,029 68 29182 0,61 23643 0,43 9646 0,9 SRP1848-C03 0,074 93 0,035 72 29143 0,51 25148 0,50 3310 3,0 SRP1848-F04 0,096 93 0,015 73 26867 0,73 26353 0,55 2741 11,0 SRP1848-B04 0,035 94 0,018 70 27818 0,72 27796 0,65 2187 17,9 SRP1848-B11 0,058 93 0,026 74 28394 0,56 22885 0,34 1632 3,9 SRP1848-F07 0,057 92 0,018 71 27371 0,58 18662 0,56 1387 8,8 SRP1848-E06 0,060 93 0,025 74 25611 0,48 15755 0,26 2349 1,2 SRP1848-A09 0,060 93 0,026 71 28910 0,61 2028 0,31 7990 1,0
147 / 202 SRP1848-E07 0,059 94 0,013 73 27284 0,54 20381 0,23 11837 1,2 SRP1848-G03 0,064 91 0,021 76 26424 0,82 19238 0,44 2220 2,4 SRP1848-A04 0,052 92 0,015 64 26810 0,43 23055 0,30 3888 2,0 SRP1848-H01 0,49 96 0,016 67 26985 0,59 17227 0,28 3950 33,8 SRP1848-B10 0,040 97 0,020 71 28186 0,83 21268 0,44 2455 7,3 SRP1848-C07 0,065 93 0,013 67 28757 0,62 18136 0,23 3170 1,4 SRP1848-F05 0,061 94 0,015 74 27155 0,72 24731 0,61 5100 18,0 SRP1848-D02 0,034 93 0,027 71 28804 0,60 27973 0,61 916 87,0 SRP1848-A08 0,039 93 0,013 65 28554 0,62 26197 0,45 3202 2,5 SRP1848-E03 0,057 94 0,027 73 26694 0,76 17427 0,43 5939 0,5 SRP1848-A10 0,033 96 0,027 75 27097 0,66 14816 0,47 10167 1,2 SRP1848-F10 0,038 94 0,009 68 25554 0,36 20700 0,40 1742 6,9 SRP1848-D05 0,055 92 0,030 73 26748 0,57 22202 0,45 1360 14,0 SRP1848-C01 0,060 90 0,023 68 28527 0,66 25941 0,60 1369 26,0 SRP1848-F01 0,047 91 0,018 69 25240 0,56 21491 0,43 3750 1,8 SRP1848-D04 0,380 97 0,068 77 29297 2,21 25737 2,84 NB NB SRP1848-E05 0,071 95 0,027 78 27306 0,46 28170 0,55 NB NB SRP1848-A06 0,046 93 0,020 72 24521 0,47 20170 0,30 2767 2,4 SRP1848-B01 0,064 95 0,031 82 26634 1,06 23881 0,83 3404 16,4 SRP1848-C04 0,006 94 0,016 68 26269 0,44 22014 0,86 2506 62,0 SRP1848-C10 0,057 96 0,036 75 27465 0,91 15966 0,27 2326 5,6 SRP1848-B09 0,073 97 0,027 74 25152 0,46 25213 0,99 1424 78,0
Igrov, 2° Anticorpo de CHO-FolR1 humano KB, 2° Anticorpo de CHO-FolR1 morte celular, Nb- CHO-FolR1 cino morte celular, Nb-239 camundongo ID da variante Fab-HC SC239 Intervalo Intervalo Bmax Bmax EC50 (nM) EC50 (nM) Bmax (MFI) KD (nM) KD (nM) KD (nM) (%) (%) (MFI) (MFI) SRP1848-C05 0,073 92 0,021 62 26836 0,52 15199 0,35 4134 4,8 SRP1848-F02 0,054 92 0,009 54 25714 0,62 14911 0,19 2741 2,6 SRP1848-F08 0,061 94 0,024 77 26483 0,91 21024 1,07 NB NB SRP1848-D07 0,075 94 0,032 71 25738 0,77 24272 0,92 NB NB SRP1848-F11 0,054 91 0,017 70 26774 0,75 21790 0,47 1762 4,6 SRP1848-F09 0,056 93 0,050 79 23816 0,36 24178 0,75 1671 90,7 SRP1848-D10 0,016 90 1,012 54 16468 0,48 20578 0,52 1859 13,0 SRP1848-G01 0,070 91 0,022 66 27406 0,98 20913 0,56 1993 4,6 SRP1848-B06 0,058 95 0,022 72 25070 0,67 26767 1,21 NB NB SRP1848-D03 0,160 98 0,038 76 25977 1,90 14130 0,58 3170 9,5 SRP1848-B07 0,079 96 0,038 73 25612 0,66 25491 1,05 NB NB SRP1848-E02 0,046 93 0,025 71 23847 0,53 18717 0,59 1473 21,0
148 / 202 SRP1848-B03 0,050 94 0,028 66 26338 0,82 17228 0,41 2722 6,4 SRP1848-E01 0,088 92 0,029 72 26430 1,01 22420 0,96 NB NB SRP1848-B05 0,065 94 0,040 72 24536 0,65 21871 0,64 NB NB SRP1848-D09 0,042 91 0,023 70 24966 0,46 21306 0,65 NB NB SRP1848-F06 0,066 94 0,032 77 25598 0,87 2658 0,86 NB NB SRP1848-G10 0,046 97 0,019 79 25269 0,49 14163 0,24 2891 4,3 SRP1848-G04 0,051 92 0,016 75 25156 0,76 12538 0,25 1999 2,5 SRP1848-G06 0,057 96 0,026 81 25838 0,63 12830 0,31 1857 11,1 SRP1848-G07 0,058 94 0,038 78 24939 0,78 13668 0,35 1978 2,9 SRP1848-G09 0,073 97 0,036 83 25066 0,59 17685 0,35 2184 6,4 SRP1848-G11 0,040 97 0,023 84 27191 0,68 11837 0,26 2744 7,6
Tabela 8. Anticorpos maturados por afinidade desde líderes iniciais (Framework HC de Trastuzumabe): Resultados da cinética de ligação Cinética Biacore ID da Variante ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) SRP1848-A01 8,29E+05 1,55E-03 1,87E-09 SRP1848-A02 5,25E+05 8,82E-03 1,68E-08 SRP1848-A07 1,01E+06 8,66E-04 8,55E-10 SRP1848-C03 1,36E+06 1,52E-03 1,11E-09 SRP1848-F04 8,15E+05 1,08E-03 1,32E-09 SRP1848-B04 7,80E+05 1,17E-03 1,50E-09 SRP1848-B11 1,22E+06 1,86E-03 1,52E-09 SRP1848-F07 1,60E+06 2,49E-03 1,56E-09 SRP1848-E06 9,44E+05 1,54E-03 1,63E-09 SRP1848-A09 7,30E+05 1,33E-03 1,82E-09 SRP1848-E07 1,25E+06 2,40E-03 1,91E-09
149 / 202 SRP1848-G03 9,90E+05 1,97E-03 1,99E-09 SRP1848-A04 1,61E+06 3,26E-03 2,03E-09 SRP1848-H01 6,59E+05 1,39E-03 2,11E-09 SRP1848-B10 6,81E+05 1,48E-03 2,18E-09 SRP1848-C07 8,56E+05 1,89E-03 2,21E-09 SRP1848-F05 6,56E+05 1,57E-03 2,40E-09 SRP1848-D02 8,51E+05 2,05E-03 2,41E-09 SRP1848-A08 4,93E+05 1,19E-03 2,42E-09 SRP1848-E03 6,88E+05 1,83E-03 2,67E-09 SRP1848-A10 1,20E+06 3,30E-03 2,74E-09 SRP1848-F10 8,72E+05 2,47E-03 2,83E-09 SRP1848-D05 6,75E+05 1,98E-03 2,93E-09 SRP1848-C01 7,30E+05 2,23E-03 3,05E-09 SRP1848-F01 1,14E+06 3,62E-03 3,18E-09 SRP1848-D04 4,97E+05 1,73E-03 3,48E-09 SRP1848-E05 7,16E+05 2,51E-03 3,51E-09 SRP1848-A06 1,37E+06 4,83E-03 3,51E-09 SRP1848-B01 1,13E+06 4,16E-03 3,67E-09 SRP1848-C04 1,29E+06 4,99E-03 3,86E-09 SRP1848-C10 8,99E+05 3,63E-03 4,03E-09 SRP1848-B09 1,55E+06 6,61E-03 4,26E-09
Cinética Biacore ID da Variante ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) SRP1848-C05 1,06E+06 4,54E-03 4,29E-09 SRP1848-F02 1,42E+06 6,37E-03 4,49E-09 SRP1848-F08 5,94E+05 2,72E-03 4,58E-09 SRP1848-D07 1,09E+06 5,11E-03 4,70E-09 SRP1848-F11 8,28E+05 3,90E-03 4,71E-09 SRP1848-F09 1,40E+06 6,79E-03 4,85E-09 SRP1848-D10 1,13E+06 5,58E-03 4,95E-09 SRP1848-G01 4,44E+05 2,26E-03 5,09E-09 SRP1848-B06 6,20E+05 3,17E-03 5,10E-09 SRP1848-D03 1,03E+06 5,35E-03 5,19E-09 SRP1848-B07 7,06E+05 3,78E-03 5,35E-09 SRP1848-E02 1,14E+06 7,07E-03 6,21E-09 SRP1848-B03 1,13E+06 8,59E-03 7,63E-09 SRP1848-E01 6,64E+05 5,22E-03 7,87E-09 SRP1848-B05 9,76E+05 8,85E-03 9,07E-09
150 / 202 SRP1848-D09 1,07E+06 1,08E-02 1,01E-08 SRP1848-F06 4,56E+05 7,75E-03 1,70E-08 SRP1848-G10 7,58E+05 3,45E-03 4,55E-09 SRP1848-G04 5,91E+05 3,79E-03 6,40E-09 SRP1848-G06 5,69E+05 3,81E-03 6,70E-09 SRP1848-G07 6,05E+05 4,51E-03 7,45E-09 SRP1848-G09 8,56E+05 6,46E-03 7,56E-09 SRP1848-G11 6,96E+05 6,37E-03 9,14E-09
Tabela 9. Resultados obtidos com anticorpos humanizados 6D1 (2060) Cinética Biacore Igrov 2° Anticorpo de morte celular, Nb-SC239 SRP ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) EC50 (nM) Intervalo (%) SRP2060-E10 5,82E+05 1,20E-03 2,06E-09 0,061 68 SRP2060-E05 5,41E+05 1,58E-03 2,92E-09 0,22 71 SRP2060-B01 5,61E+05 1,47E-03 2,62E-09 0,045 76 SRP2060-A06 5,47E+05 7,29E-03 1,33E-08 0,013 66
151 / 202
152 / 202 Exemplo 8. Expressão de FOLR1 em linhagens celulares de câncer de ovário, endométrio, CPNPC e CMTN
[00407] Nos cânceres de ovário e endométrio, câncer de mama triplo- negativo (CMTN) e carcinoma pulmonar de não pequenas células (CPNPC) foram encontrados níveis elevados de FolRα. Com base nos níveis de expressão relatados do mRNA de FolRα, um painel de linhagens celulares de câncer de ovário, câncer de endométrio, CMTN e CPNPC foi selecionado para testar in vitro ADC moléculas candidatas. Para medir o número de receptores FolRα expressos na superfície celular, usou-se o anticorpo 1848- H01 (Y180/F404) conjugado com Alexa647 em um ensaio de ligação celular por FACS, e o número de cópias de FolRα foi determinado com base na Capacidade de Ligação do Anticorpo (ABC) do anticorpo conjugado medida por esferas de quantificação (Esferas Simply Cellular anti-human IgG do Bangs Laboratories). Como mostrado na Tabela 10, o número de cópias de FolRα em células de câncer de ovário, câncer de endométrio, CMTN e CPNPC variou de 35.000 a 4.000.000 receptores por célula. Tabela 10. Número de cópias de FolRα em várias linhagens celulares Indicação da doença Linhagem celular No de cópia de FolRα por célula OVKATE 3.590.356 Igrov1 1.375.828 OVMANA 1.224.753 OVSAHO 842.703 Câncer de ovário OVISE 678.472 CAOV3 336.900 OVCAR3 196.426 OV90 97.717 MFE-280 434.941 HEC-1-A 220.690 EFE-184 128.166 Câncer de endométrio HEC-1-B 176.400 Ishikawa 194.128 SNG-M 61.961 NUGC-4 35.395 H2342 1.419.355 H1651 918.800 H2110 347.447 H441 251.390 Câncer de pulmão H226 85.164 H2405 68.182 H358 40.058 H2052 37.677 A549 35.078
153 / 202 Indicação da doença Linhagem celular No de cópia de FolRα por célula H1770 33.781 HCC1143 255.813 HEC-251 113.270 HCC1599 65.624 MDA-MB-468 61.588
CMTN MDA-MB-231 50.005 HCC38 40.712 HCC1187 34.936 HCC1937 23.097 Exemplo 9. Expressão de FOLR1 em tecidos de câncer de ovário e endométrio, CMTN e CPNPC
[00408] Para determinar a prevalência da expressão de FolRα em amostras de pacientes, representativas de cânceres de ovário e endométrio, CMTN e CPNPC, realizou a coloração para imuno-histoquímica (IHC) em microarranjos de tecido, disponíveis comercialmente (TMAs) contendo amostras de pacientes das quatro indicações. Os TMAs (Biomax; Biomax; Cat. no BC11115b, EMC1021, BR1001 e BC041115c) foram corados para expressão de FolRα usando um kit comercial de ensaio IHC de FolRα (Biocare; Cat. no IPI4006K G10) com o protocolo recomendado pelo fabricante. As lâminas foram visualizadas e os núcleos corados do tumor foram classificados quanto à coloração. Coloração positiva para FolRα foi observada em ~80% das amostras de câncer de ovário, ~60% das amostras de câncer de endométrio, ~ 30% das amostras de CMTN e ~ 50% das amostras de CPNPC; sugerindo que essas podem ser indicações adequadas para um agente terapêutico direcionado contra FolRα. Os níveis de expressão relativos de FolRα em amostras do ovário e endométrio estão resumidos na Tabela 11. Tabela 11. Resumo dos níveis de expressão de FolRα em amostras de cânceres de ovário e endométrio No total de núcleos Intensidade de coloração Indicação/Cat. no da lâmina (Biomax US) de doença 0 1+ 2+ 3+ Microarranjo de tecido de câncer de ovário com tecido normal adjacente, 100 97 21 19 29 25 casos/ 100 núcleos (BC11115b) Microarranjo de tecido de câncer de endométrio, 102 casos/102 núcleos 90 26 37 15 12 (EMC1021) Exemplo 10. Avaliação do conjugado fármaco-anticorpo (ADC)
154 / 202
[00409] Tendo por base a afinidade no Biacore pelo domínio extracelular de FOLR1 (ou “FolRα-ECD”), nove anticorpos foram selecionados para ampliação da escala com para-azidometil-L-fenilalanina (pAMF) incorporada no sítio HC F404. Os nove anticorpos selecionados para os testes foram: 1848-A01, 1848-H01, 1848-A08, 1848-B04, 1848-D02, 1848-A07, 1848-B10, 1848-G10, e 1848-G04). O anticorpo 1848-D02 não expressou bem e, consequentemente, não foi usado para investigação futura. Os demais oito anticorpos foram conjugados a uma maitansina não clivável para formar conjugados fármaco-anticorpo (ADCs) tendo a estrutura de Conjugado M, abaixo: Conjugado M
[00410] Os conjugados fármaco-anticorpo candidatos foram testados para morte celular em células expressando FolRα, incluindo KB, Igrov1, HeLa e JEG3. A Tabela 12 fornece um resumo da atividade citotóxica in vitro dos conjugados candidatos em células KB e JEG3. Tabela 12. Atividade citotóxica in vitro de conjugados fármaco-anticorpo anti-FOLR1 Morte em células KB Morte em células JEG3 Anticorpo [IgG], μg/mL EC50 (nM) Intervalor (%) EC50 (nM) Intervalo (%) 1848-A01 1100 0,16 96 83* 94* 1848-A07 1021 0,17 96 80* 96* 1848-A08 1358 0,17 95 74* 95* 1848-B04 1257 0,3 98 113* 85* 1848-B10 802 0,23 98 43* 82* 1848-D02 1208 Não testado Não testado Não testado Não testado 1848-G04 1415 0,31 94 38* 93* 1848-G10 1746 0,26 92 NC NC 1848-H01 1723 0,24 93 NC NC *Estimado NC = Não calculável
[00411] Não houve diferença significativa entre os ADCs para
155 / 202 atividade de morte celular em células KB e JEG3, Tabela 12). Desse modo, selecionaram-se quatro líderes (1848-A01, 1848-A07, 1848-B04, 1848-G10) conjugados à maitansina não clivável para formar estruturas do Conjugado M, na relação fármaco-anticorpo de dois (DAR2), para um estudo in vivo tendo por base a afinidade Biacore (Tabela 8) e maximizando a diversidade de sequência. Além disso, a atividade citotóxica em células JEG3 foi fraca com os ADCs tendo DAR2.
[00412] Para estudar o efeito da relação fármaco-anticorpo (DAR) na atividade de morte celular de líderes anti-FolRα, os ADCs com DAR2 foram também combinados com um nanobody secundário anti-IgG humana DAR2, conjugado à maitansina não clivável, para aproximar-se a um ADC DAR 4 nos ensaios de morte celular. Nesse ensaio, 1848-B10 ADC revelou a melhor atividade de morte celular quando combinado com o nanobody secundário em células JEG3 e Igrov1 (dados não mostrados). Com base nesse resultado, 1848-B10 ADC com DAR2 foi adicionado a um estudo in vivo para avaliar candidatos a ADC além dos outros quatro líderes (1848-A01, 1848-A07, 1848-B04, 1848-G10). Os resultados dos testes do estudo de eficácia in vivo revelaram que somente 1848-B10 ADC como DAR2 mostrou fraca inibição do tumor no modelo KB (dados não mostrados).
[00413] Como resultado, 1848-B10 foi selecionado como um dos anticorpos líderes para estudos futuros dos ADC. Exemplo 11. Avaliação da eficácia dos melhores anticorpos líderes contra FOLR1
[00414] Os ADCs contendo o Conjugado M com DAR2 apresentaram atividade potente in vitro contra células KB, que expressam níveis elevados de FolRα. No entanto, os ADCs tiveram pouca atividade in vitro em células JEG3 e Igrov1, que expressam níveis mais moderados de FolRα, e baixa atividade in vivo no modelo KB. O padrão e níveis de expressão de FolRα em células JEG3 e Igrov1 é mais representativo da expressão em tumores de
156 / 202 pacientes, enquanto a avaliação de ADC líderes em células KB não parece diferenciar as propriedades dos diferentes líderes. FolRα sofre rápida internalização e reciclagem sem atingir o lisossomo; portanto, para melhorar a atividade de um ADC direcionado contra FolRα, seria útil ter um ligador que pudesse liberar o fármaco no compartimento endossomal. Além disso, a expressão de FolRα em tumores ovarianos primários e xenoenxertos de Igrov1 é heterogênea (Ab et al. 2015. Molecular Cancer Therapeutics 14(7):1605-1613), sugerindo que um ADC com atividade bystander poderia potencialmente ter maior atividade nesses tumores. A fim de ajustar o desenho à biologia do alvo de um ADC direcionado contra FolRα bem como o nível e padrão de expressão no câncer de ovário, diversas alterações foram implementadas na estratégia de avaliação. O modelo KB foi empregado para avaliação primária, e a atividade de líderes foi testada em células Igrov1 in vitro e in vivo para avaliar e comparar os diferentes líderes.
[00415] A avaliação inicial de variantes de ADC contra FolRα foi conduzida em tumores KB que expressam níveis elevados de FolRα. Esse estudo buscou avaliar os efeitos antitumorais de quatro anticorpos anti-FolRα diferentes conjugados com o mesmo ligador-warhead (Conjugado P, abaixo) e sítios de conjugação (Y180/F404). Células KB de carcinoma cervical foram implantadas por via subcutânea em camundongos nude atímicos e tratados com uma dose única das variantes de ADC contra FolRα 2,5 mg/kg listadas na Tabela 13. As variantes de ADC foram administradas quando os tumores atingiram ~150 mm3.
Conjugado P
157 / 202 Tabela 13. Variantes de ADC testadas Forma do ADC Molécula Anticorpo Sítios de conjugação DAR conjugado Veículo (PBS -- -- -- NA somente) 1 1848-B10 HC-Y180, F404 P 3,8 2 1848-A07 HC-Y180, F404 P 3,9 3 1848-B04 HC-Y180, F404 P 3,8 4 1848-H01 HC-Y180, F404 P 3,8
[00416] Não foi observada toxicidade com qualquer artigo em teste, conforme evidenciado pela ausência de qualquer perda de peso significativa, definida como diminuição >20% no peso do animal (Figura 6). As Figuras 7 (A, B) ilustram os efeitos do tratamento no crescimento de tumor KB e o tamanho tumoral no Dia 25 quando o grupo de veículo controle atingiu o desfecho do estudo (>1000 mm3). Os resultados mostram que ADC Molécula 1 (anticorpo 1848-B10 contra FolRα, Y180/F404, Conjugado P) e ADC Molécula 4 (anticorpo 1848-H01contra FolRα, Y180/F404, Conjugado P) inibiu significativamente o crescimento do tumor KB quando comparado ao controle, enquanto as outras duas variantes de ADC não exibiram qualquer atividade antitumoral. Até o final do estudo no Dia 31, não houve diferença significativa entre as ADC Moléculas 1 e 4 (Figura 8). Portanto, ADCs contendo os anticorpos 1848-B10 e 1848-H01 anti-FolRα foram investigados para caracterização e testes futuros. Exemplo 12. Relação fármaco-anticorpo de conjugados fármaco-anticorpo
[00417] ADCs com DAR crescente (2-6) e com um ligador clivável foram avaliados para determinar se variar essas características melhoraria a atividade da molécula. Para aumentar a potência in vivo dos ADCs direcionados contra FolRα, anticorpos 1848-B10 foram expressos com 2, 4, ou 6 resíduos de para-azidometil-fenilalanina (pAMF) incorporados em cada anticorpo e conjugados a maitansina não clivável (Conjugado M, Exemplo 10) e hemiasterlina clivável (Conjugado P, Exemplo 11) para gerar ADCs com DAR = 2, 4 ou 6.
[00418] A morte celular in vitro em células FolRα-positivas (KB,
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Igrov1 e JEG3) mostrou que os conjugados do anticorpo 1848-B10 do Conjugado P eram mais potentes do que conjugados 1848-B10 do Conjugado M em células Igrov1, que têm níveis moderados de expressão de FolRα (Tabela 14). Além disso, o aumento da DAR para 4 resultou em ADCs com potência bastante aumentada quando comparados às versões DAR2, enquanto ADCs DAR6 melhoraram mais a atividade de morte celular apenas marginalmente em relação a DAR4. Com base nesses dados, determinou-se que os conjugados com hemiasterlina clivável (Conjugado P) e DAR4 eram o formato ótimo do conjugado para o ADC contra FolRα.
Tabela 14. Comparação da atividade citotóxica in vitro de ADCs 1848-B10 Conjugado / KB (+++) Igrov (++) A549 (-)
ADC Sítios de conjugação Ligador DAR prevista DAR medida EC50 Interval EC50 Interval EC50 Interval Molécula fármaco (nM) o (%) (nM) o (%) (nM) o (%) 5 F404 Conjugado M 2 1,94 0,74 87 NC NC NK NK 6 K42/F404 Conjugado M 4 3,86 0,42 94 NC NC NK NK 7 K42/Y180/F404 Conjugado M 6 5,54 0,2 96 NC NC NK NK 8 F404 Conjugado P 2 1,89 0,81 80 0,55 56 NK NK 9 K42/F404 Conjugado P 4 3,69 0,35 94 0,17 62 NK NK 10 K42/Y180/F404 Conjugado P 6 5,28 0,21 97 0,14 69 NK NK NC = Não calculável NK = Nenhuma morte 159 / 202
160 / 202 Exemplo 13. Estudo para comparar a atividade de pares de sítios diferentes em ADCs
[00419] Esse estudo buscou comparar os efeitos antitumorais dos três pares de sítios diferentes de conjugação (Y180/F404, Y180/K42 e F404/K42) usando o mesmo anticorpo contra FolRα (1848-B10) e ligador-warhead (Conjugado P). A atividade de morte celular in vitro dos três ADCs foi muito semelhante em células KB e Igrov1 (Tabela 15). Tabela 15. Atividade de morte celular in vitro de ADCs testados (Conjugado P) EC50 em EC50 em ADC Forma do Anticorpo Sítios de conjugação DAR células KB células Molécula conjugado (nM) Igrov1 (nM) 11 α-GFP HC-Y180, F404 P 3,58 NK NK 12 1848-B10 HC-Y180, LC-K42 P 3,93 0,21 0,085 1 1848-B10 HC-Y180, F404 P 3,82 0,21 0,083 9 1848-B10 HC-F404, LC-K42 P 3,90 0,19 0,061
[00420] Para os testes de eficácia in vivo, células KB de carcinoma cervical células foram implantadas por via subcutânea em camundongos nude atímicos e tratadas com uma dose única das variantes de ADC contra FolRα 2,5 mg/kg listadas na Tabela 15. ADCs foram administrados quando os tumores atingiram ~150 mm3. Não foi observada toxicidade com qualquer artigo em teste, conforme evidenciado pela ausência de qualquer perda de peso significativa, definida como diminuição >20% no peso do animal (Figura 9). As Figuras 10 (A, B) ilustram o efeito do tratamento sobre o crescimento de tumor KB e tamanho tumoral no Dia 21 quando os tumores tratados com veículo atingiram o desfecho do estudo (>1000 mm3), depois do que o estudo foi encerrado. Os resultados mostram que todas as três variantes de ADC contra FolRα (ADC Moléculas 1, 12 e 9) com diferentes sítios de conjugação inicialmente induziram regressão do tumor e retardaram significativamente o crescimento tumoral quando comparados ao veículo controle, enquanto o ADC anti-GFP controle (ADC Molécula 11) comportou- se de modo semelhante ao veículo (Figuras 10A e 10B). Até o final do estudo no Dia 36, ADC Molécula 12 exibiu a melhor duração de resposta com a
161 / 202 maioria dos tumores nesse grupo permanecendo com crescimento inibido, enquanto a volta do crescimento tumoral foi observada para ADC Moléculas 1 e 9 (Figura 10A). A análise estatística revelou que ADC Molécula 12 foi significativamente mais eficaz em comparação à ADC Molécula 9 (p=0,0297) e ADC Molécula 1 (p=0,0470) (Figura 11). Em conclusão, o sítio de conjugação Y180/K42 resultou na melhor potência e duração de resposta em tumores KB. Exemplo 14. Estudo para seleção de anticorpos anti-FOLR1 líderes para desenho de ADC
[00421] Para avaliar anticorpos líderes potenciais para ADCs anti- FolRα, uma seleção dos melhores líderes contra FolRα que foram conjugados para formar o Conjugado P com DAR4 foram avaliados in vitro. A atividade de morte celular in vitro dos melhores anticorpos líderes é muito semelhante em células KB e Igrov1 e o resultado está resumido na Tabela 16. Tabela 16. Atividade de morte celular in vitro de ADCs líderes (Conjugado P) KB Igrov1 A549 ADC Sítios de Amostra DAR EC50 Interval EC50 Interval EC50 Interval Molécula conjugação (nM) o (%) (nM) o (%) (nM) o (%) 1 1848-B10 Y180/F404 3,82 0,21 98 0,083 76 NK NK 2 1848-A07 Y180/F404 3,76 0,18 97 0,084 61 NK NK 3 1848-B04 Y180/F404 3,84 0,16 97 0,081 68 NK NK 4 1848-H01 Y180/F404 3,84 0,12 96 0,028 76 NK NK
[00422] O mesmo Conjugado P com DAR4 para os quatro melhores anticorpos líderes foi avaliado em um estudo de eficácia in vivo no modelo KB (Figuras 7, 8). Com base nos resultados desses estudos, 1848-B10 e 1848-H01 foram escolhidos como os melhores anticorpos líderes para caracterização mais detalhada. As sequências de 1848-B10 e 1848-H01, bem como as CDRs correspondentes, são mostradas na Tabela 32. Propriedades adicionais dos melhores anticorpos líderes são resumidas na Tabela 17. Tabela 17. Propriedades de anticorpos líderes Propriedade 1848-B10, Y180/F404 1848-H01, Y180/F404 KD (Biacore) 1,4 nM 1 nM KD (ligação celular por FACS, (CHO-h-FOLRα) 4,5 nM 3,7 nM Reatividade cruzada, (CHO-c-FOLRα) Cino 3,3 nM 3,8 nM
162 / 202 Propriedade 1848-B10, Y180/F404 1848-H01, Y180/F404 Termoestabilidade (DSC) 66,6°C, 85,9°C 66,8°C, 83,4°C PK de camundongo (ADC, sem análise de 11,2 dias; 14,3 dias; 5,46 mL/kg/dia DAR)* 6,94 mL/kg/dia PK de macaco cinomolgo (anticorpo naked)* comparável à maioria dos comparável à maioria dos anticorpos; T1/2 = 13,6 dias anticorpos; T1/2 = 8,5 dias ADA em macaco cinomolgo (anticorpo naked)* Resposta ADA observada em todos os animais, T1/2 Resposta ADA muito baixa afetada; sem AUC após a segunda dose em um animal Morte celular do ADC (Igrov1), Conjugado = P EC50 < 0,09 nM, intervalo > 70% 0,26 nM, intervalo 63% (média entre 10 experimentos diferentes) Morte celular do ADC (OVCAR3), Conjugado = EC50 = 0,03 nM, P Intervalo = 71% Eficácia de múltiplos líderes no modelo KB e Inibição fraca do tumor em Inibição significativa do modelo clínico Igrov1 comparação ao grupo tumor em comparação ao veículo (E4) grupo veículo (E4) DSC: Calorimetria diferencial de varredura * ADCs substitutos: (1) 1848-B10, Y180/K42, (2) 1848-H01, Y180/K42 Exemplo 15. seleção de ligador ótimo para hemiasterlina clivável
[00423] Hemiasterlina com múltiplos ligadores com diferentes propriedades de clivagem foram gerados. O anticorpo 1848-B10 foi conjugado a diversas variantes candidatas para ligador, e os ADCs resultantes foram testados em ensaios de citotoxicidade in vitro (Tabela 18). Entre as variantes candidatas para ligador, uma alternativa do Conjugado P, com uma sequência proteolítica de ValAla no lugar de ValCit, revelou boa atividade de morte celular (Conjugado Q, abaixo) e forneceu uma vantagem potencial em termos de ampliação da escala e eficiência sintética.
Conjugado Q Tabela 18. Comparação da citotoxicidade in vitro de variantes do ligador hemiasterlina clivável-fármaco Igrov1 A549 ADC Forma do Anticorpo DAR EC50 Intervalo EC50 Intervalo Molécula conjugado (nM) (%) (nM) (%) 1848-B10, 12 P 3,74 0,12 78 NK NK Y180/K42 1848-B10, 16 Q 3,6 0,32 66 NK NK Y180/K42
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[00424] A atividade citotóxica in vitro de múltiplos lotes de variantes candidatas para ADC está resumida na Tabela 19. ADC Molécula 4 mostrou morte celular consistente com EC50 variando de 0,03-0,66 nM e um intervalo variando de 69-96% entre experimentos diferentes. Tabela 19. Resumo de estudos de citotoxicidade in vitro nas linhagens celulares KB e Igrov1 1848-H01, 1848-H01, 1848-B10, 1848-B10, Y180/F404, Y180/F404, Y180/F404, Y180/F404, Linhagem Conjugado P (ADC Conjugado Q (ADC Conjugado P (ADC Conjugado Q (ADC celular Molécula 4) Molécula 20) Molécula 1) Molécula 17) EC50 Intervalo EC50 Intervalo EC50 Intervalo EC50 Intervalo (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) 0,66 78 0,45 83
KB 0,12 96 0,21 98 0,11 69 0,26 63 0,03 76 0,08 76 0,31 72 0,21 71 0,16 62 0,24 42 Igrov1 0,12 68 0,21 53 0,06 70 0,13 54 0,08 80 0,13 70 0,09 81 0,23 70 0,02 74 0,11 73
[00425] Além disso, em um estudo separado, um conjugado fármaco- anticorpo foi sintetizado usando o anticorpo 1848-B10 Y180/F404 e o Conjugado R (abaixo): Conjugado R
[00426] O Conjugado R inclui DBCO adipoil ValGlu ligado a um warhead de hemiasterlina. O ADC compreendendo 1848-H01 HC- Y180/F404 com o Conjugado R (ADC Molécula 22) mostrou atividade de morte celular in vitro comparável à ADC Molécula 4 (dados não mostrados) bem como atividade in vivo comparável no modelo Igrov1 (Figuras 14A, 14B). Deste modo, esses resultados indicam que o anticorpo 1848-B10 HC- Y180/F404 pode ser utilizado com warheads alternativas de ligador em ADCs
164 / 202 direcionados contra FolRα. Exemplo 16. Seleção de um ADC líder ótimo
[00427] Esse estudo buscou avaliar aspectos diferentes da ADC molécula contra FolRα incluindo o anticorpo, sítios de conjugação e warhead de ligador. Células Igrov1 de câncer de ovário foram implantadas por via subcutânea em camundongos Beige SCID e tratadas com uma dose única das variantes de ADC contra FolRα 2,5 mg/kg listadas na Tabela 20. ADCs foram administrados quando os tumores atingiram ~150 mm3. Tabela 20. ADCs testados na avaliação de eficácia Morte de células Sítios de Forma de Igrov1 ADC Molécula Anticorpo DAR conjugação conjugado EC50 (nM) Intervalo (%) 1 1848-B10 Y180/F404 P 3,82 0,09 76 17 1848-B10 Y180/F404 Q 3,74 0,21 71 12 1848-B10 K42/Y180 P 3,72 0,12 78 16 1848-B10 K42/Y180 Q 3,6 0,32 66 4 1848-H01 Y180/F404 P 3,84 0,03 76 18 1848-H01 K42/Y180 P 3,87 0,14 70 19 1848-H01 K42/Y180 Q 3,61 0,23 52
[00428] Não foi observada toxicidade com qualquer artigo em teste, conforme evidenciado pela ausência de qualquer perda de peso significativa, definida como diminuição >20% no peso do animal (Figura 12). A Figura 13 (A, B) ilustra os efeitos do tratamento no crescimento de tumor Igrov1 e no tamanho tumoral final no Dia 24 após o tratamento, quando os tumores tratados com o controle-veículo atingiram o desfecho do estudo (~1000 mm3). Das sete variantes testadas de ADC contra FolRα, ADC Molécula 4 inibiu significativamente o crescimento tumoral em comparação ao veículo controle (Figuras 13A,13B). Esse resultado identifica 1848-H01, Y180/F404 e SC239 como uma combinação ótima de anticorpo anti-FolRα, sítios de conjugação e warhead de ligador, respectivamente, em tumores Igrov-1. Exemplo 17. Reatividade cruzada de ADC variantes contra isoformas de FolR
[00429] O receptor de folato possui três isoformas nos humanos, denominadas hFolRα, hFolRβ e hFolRγ (também FOLR1, FOLR2 e FOLR3, respectivamente). hFolRα e hFolRβ são expressos na membrana plasmática
165 / 202 via ancoragem com GPI, enquanto FolRγ é secretado. Em tecidos normais, FolRα é geralmente expresso na superfície apical de células epiteliais polarizadas, enquanto hFolRβ é expresso em estágios mais tardios da mielopoiese normal e na placenta, baço e timo. No desenvolvimento normal da linhagem mielomonocítica, hFolRβ é visto como um marcador da diferenciação coexpresso com CD14 em níveis relativamente baixos em monócitos, mas não em progenitores hematopoiéticos normais CD34+. hFolRγ é secretado em níveis baixos por células linfoides no baço, timo e na medula óssea. As três isoformas de FR possuem alto grau de homologia com FolRα, compartilhando 72% e 71% de identidade de sequência com FolRβ e FolRγ, respectivamente. Portanto, é útil determinar a especificidade dos anticorpos líderes 1848-B10 e 1848-H01 por FolRα, e a extensão da reatividade cruzada com células expressando FolRβ e FolRγ.
[00430] Células 293T expressando estavelmente as três isoformas do receptor de folato (hFolRα, hFolRβ, e hFolRγ) foram geradas e testadas quanto à ligação com os anticorpos 1848-B10 e 1848-H01 em um ensaio FACS. Nesse ensaio, 1848-H01, mas não 1848-B10 revelou ligação muito fraca ao FolRβ (Figura 15), mas não ao FolRγ (não mostrado). A ligação de 1848-H01 a células expressando FolRβ apresentou 156 nM de afinidade, com uma Bmax que era somente 20% quando comparada à Bmax para FolRα. A avaliação da atividade citotóxica das ADC Moléculas 4 e 1 correspondentes em células 293T expressando as isoformas FolRα e FolRβ mostrou que ADC Molécula 4 tinha um efeito citotóxico fraco, mas específico em células expressando FolRβ em concentrações acima de 10 nM, com EC50 ~100 nM, em comparação a uma EC50 < 10 nM para células expressando FolRα (Figura 16). Exemplo 18. Ligação e atividade citotóxica de variantes de ADC em células hematopoiéticas
[00431] Para determinar se ADC Moléculas 1 e 4 tinham um efeito um
166 / 202 efeito sobre a viabilidade de células hematopoiéticas, a expressão de FolR foi determinada em células T, células B e monócitos em PBMCs isoladas (n=4 doadores), e avaliou-se a extensão da ligação do anticorpo 1848-H01 e 1848- B10 ao FolRβ em células imunes. Foi detectada expressão heterogênea de FolRα (variável com doador) em monócitos, mas essa expressão foi transitória e desapareceu depois de 1 dia em cultura (dados não mostrados), enquanto FolRβ foi consistentemente expresso em uma subpopulação de monócitos (dados não mostrados). Não foi observada ligação do anticorpo 1848-B10 ou 1848-H01 a monócitos, embora a expressão de FolRβ fosse detectável nessas células (dados não mostrados). Além disso, monócitos CD14 foram avaliados quanto à viabilidade após o tratamento com ADC Moléculas 1 e 4 e para abordar a citotoxicidade potencial. Em correlação com ligação celular negativa, as ADC variantes não afetaram a viabilidade de monócitos/macrófagos, sugerindo a ausência de impacto clínico em monócitos PB em humanos (dados não mostrados).
[00432] FolRβ é fracamente expresso em macrófagos M1, e altamente expressos em macrófagos M2 e seus subconjuntos. Os anticorpos 1848-H01 e 1848-B10 foram, portanto, avaliados quanto à sua capacidade para ligar macrófagos isolados. No entanto, nenhum dos anticorpos mostrou qualquer ligação a macrófagos M1 ou M2 embora a expressão de FolRβ fosse confirmada nessas células. Para confirmar essa falta de interação, as ADC moléculas correspondentes (1, 4) foram avaliadas quanto às atividades de morte celular em macrófagos polarizados (10.000 células, período de incubação = 3 dias). Coerentemente com a falta de ligação, nenhuma variante de ADC mostrou qualquer atividade citotóxica nos macrófagos de múltiplos doadores (dados não mostrados).
[00433] Desse modo, as variantes de ADC demonstraram ter ligação e impacto citotóxico mínimos sobre monócitos e macrófagos isolados de doadores humanos.
167 / 202 Exemplo 19. Caracterização adicional de conjugados fármaco-anticorpo
[00434] Conjugados fármaco-anticorpo líderes (ADCs) compreendendo um anticorpo anti-FolRα foram avaliados e caracterizados. As características que foram medidas e analisadas incluíram perfis de expressão e purificação dos ADCs líderes, eficiência de conjugação efe atividade in vitro e in vivo do ADC em modelos clinicamente relevantes. As propriedades dos ADCs anti-FolRα líderes estão resumidas na Tabela 21. Tabela 21. Propriedades de ADCs anti-FolRα líderes Propriedade ADC Molécula 4 ADC Molécula 20 DAR por MALDI 3,73 3,81 Eficiência de conjugação 93% 95% Igrov1: EC50 = 0.08nM, Igrov1: EC50 = 0.13 nM, intervalo Morte celular do ADC intervalo = 80% = 70% Inibição completa do crescimento Inibição completa do tumor em 10 Eficácia pré-clínica in vivo tumoral a uma dose de 5 mpk e e 15 mpk, inibição fraca do tumor a acima 5 mpk Exemplo 20. Estudo para determinação de eficácia da dose
[00435] A relação dose-resposta de ADC Moléculas 4 e 20 foi avaliada em tumores Igrov-1. Esse estudo buscou: (1) avaliar qual variante de ADC contra FolRα conjugada a warheads de ligador à base de hemiasterlina (Conjugados P, Q) era superior; (2) comparar a atividade antitumoral dessas variantes de ADC contra FolRα a uma molécula comparadora (ADC Molécula 21), e (3) determinar a dose eficaz mínima e máxima da variante mais eficaz identificada de ACD contra FolRα. Todos os artigos em teste são descritos na Tabela 22. Tabela 22. ADCs testados no estudo de variação de dose Forma de ADC Molécula Anticorpo Sítios de conjugação DAR conjugado Veículo
NA NA NA NA (PBS somente) 4 1848-H01 Y180/F404 P 3,73 20 1848-H01 Y180/F404 Q 3,76 21 Mov19-sulfo-SPDB-DM4 3,3
[00436] Camundongos Beige SCID com tumores ovarianos Igrov1 estabelecidos foram tratados uma vez com 4 doses de ADC Molécula 4 ou 20, com variação da dose de 2,5 mg/kg a 15 mg/kg. Para comparação, o grupo de referência (benchmark) foi tratado uma vez com 5 mg/kg de uma ADC
168 / 202 molécula comparadora (ADC Molécula 21). Não foi observada toxicidade com qualquer artigo em teste, conforme evidenciado pela ausência de perda de peso significativa (definida como diminuição >20% no peso do animal) (Figura 17). A Figura 18 (A, B, C) ilustra os efeitos do tratamento sobre o crescimento do tumor Igrov1 e os tamanhos de tumores individuais até o Dia 21 após o tratamento quando tumores tratados com o veículo controle atingiram o desfecho do estudo (> 1000 mm3). A comparação do tamanho tumoral no Dia 21 (versus veículo controle) indica que as doses de 5 mg/kg e 10 mg/kg de ADC Molécula 4 são mais eficazes do que doses equivalentes de ADC Molécula 20 ou do comparador, ADC Molécula 21, com base nos valores p menores (Figura 18C). Na dose mais alta (15 mg/kg), ambas as ADC Moléculas 4 e 20 demonstraram atividade antitumoral potente com valores p semelhantes, em comparação ao veículo controle (Figura 18C). A comparação direta de curvas de crescimento tumoral, separadas por dose, revelou que ADC Molécula 4 era mais potente que ADC Molécula 20 tendo por base a atividade superior de ADC Molécula 4 em doses menores (Figura 19, A-D). Estase tumoral foi observada até o Dia 26 após o tratamento com ADC Molécula 4 a 5 mg/kg versus ADC Molécula 20 a 10 mg/kg (Figuras 19B, 19C). A regressão do tumor foi induzida a partir de ADC Molécula 4 10 mg/kg versus ADC Molécula 20 15 mg/kg (Figuras 19C, 19D). Além disso, ADC Molécula 4 retardou significativamente o crescimento do tumor até que atingisse 300 mm3 em comparação a ADC Molécula 20, a 5, 10 e 15 mg/kg, e o comparador ADC Molécula 21 a 5 mg/kg (Figura 20).
[00437] Cumulativamente, esses resultados demonstram que ADC Molécula 4 é significativamente mais eficaz do que ADC Molécula 20 e ADC Molécula 21 em tumores Igrov1. A dose eficaz mínima de ADC Molécula 4 foi observada a 5 mg/kg, enquanto 15 mg/kg foi a dose eficaz máxima com a duração de resposta mais longa. Exemplo 21. Eficácia de variantes de ADC em tratamento combinado com
169 / 202 carboplatina
[00438] A eficácia de ADC Molécula 4 em combinação com um agente quimioterápico padrão para o câncer de ovário, carboplatina, foi avaliada em tumores Igrov1. Animais portadores de tumores Igrov1 estabelecidos (tamanho tumoral médio: 150 mm3) foram tratados com uma dose única de ADC Molécula 4, 2,5 mg/kg, com ou sem carboplatina 60 mg/kg a cada 7 dias, para dois tratamentos (7/7 dias x2). A Figura 21A ilustra os efeitos do tratamento sobre o crescimento de tumor Igrov1 até o dia 29 após o tratamento quando a média de tumores tratados com veículo controle atingiu o desfecho do estudo (~1200 mm3). A análise do tamanho tumoral final e da inibição do crescimento tumoral (TGI) no Dia 29 mostrou que ADC Molécula 4 e carboplatina como agentes isolados exibiram atividade moderada em comparação ao veículo controle com TGI variando de 50% e 70%, respectivamente (Figuras 21B e 21C). A combinação de ADC Molécula 4 com carboplatina melhorou significativamente a eficácia em comparação à carboplatina isoladamente, mas a combinação não foi significativamente diferente em comparação a ADC Molécula 4 como agente único (Figura 21A). O tamanho tumoral final médio em animais tratados com a combinação foi significativamente menor quando comparados a animais tratados com carboplatina como agente único (414 mm3 versus 842 mm3, p = 0,0011) (Figura 21B). Além disso, TGI no grupo tratado com a combinação foi maior com 79% versus 47% para o grupo de carboplatina como agente único (p =
0.0008) (Figura 21C).
[00439] Em conclusão, foi observado benefício adicionado significativo quando ADC Molécula 4 foi combinada com carboplatina em comparação à carboplatina como agente único. Essa observação consistentemente reproduzida em dois estudos independentes adicionais usando o mesmo modelo com administração de doses semelhantes de ADC Molécula 4 e carboplatina (dados não mostrados).
170 / 202 Exemplo 22. Eficácia de variantes de ADC em modelos de tumores ovarianos
[00440] A eficácia de ADC Molécula 4 foi avaliada em modelos de tumor ovariano humano da linhagem celular OVCAR3. Animais portadores de tumores OVCAR3 estabelecidos variando de 100 – 200 mm3 foram tratados com uma dose única ADC Molécula 4 de 2,5 ou 5 mg/kg. A Figura 22 (A, B) ilustra os efeitos do tratamento sobre o crescimento do tumor OVCAR3 e o tamanho tumoral final no Dia 31 após o tratamento quando a média de tumores tratados com veículo controle atingiu >1500 mm3. O tratamento com , 2,5 mg/kg de ADC Molécula 4 resultou em estase tumoral até por volta de 12 dias após o tratamento, enquanto 5 mg/kg de ADC Molécula 4 induziu regressão do tumor com a volta do crescimento observada em torno do Dia 20 após o tratamento (Figura 22A). A análise do tamanho tumoral final no Dia 31 revelou que o tratamento com 2,5 e com 5 mg/kg de ADC Molécula 4 eram ambos significativamente eficazes quando comparados ao veículo controle, exibindo 60% e 89% de inibição do crescimento tumoral (TGI), respectivamente (Figura 22B). Exemplo 23. Eficácia de variantes de ADC em modelos de xenoenxerto derivado do endométrio de pacientes
[00441] Modelos de xenoenxerto derivados de pacientes com câncer do endométrio (PDX) foram avaliados quanto aos níveis de expressão de FolRα pela análise imuno-histoquímica de tecido do xenoenxerto usando um anticorpo monoclonal bionitilado de camundongo contra FolRα. A da of ADC Molécula 4 foi avaliada em um subconjunto desses modelos PDX e incluiu modelos com expressão negativa, baixa (+), média (++) e alta (+++) de FolRα. Animais portadores de tumores PDX estabelecidos (~ 100-200 mm3) PDX receberam 10 mg/kg de ADC Molécula 4, semanalmente por injeção intravenosa (IV) (n=3) ou nenhum tratamento (controle, n=2-3) até que a média do grupo fosse >1.000 mm3 ou até o Dia 45 após o tratamento. Se os tumores atingissem 1.000 mm3 antes do Dia 14 após o tratamento, o desfecho
171 / 202 era ampliado para 2.000 mm3.
[00442] Eficácia estatisticamente significante foi observada em cerca de 50% dos modelos FolRα positivos testados, com a inibição do crescimento tumoral (TGI) variando de aproximadamente 50% a mais de 100% (indicando regressão abaixo do tamanho tumoral no início do tratamento). Enquanto isso, não foi observada atividade significativa em todos os modelos PDX com expressão negativa para FolRα. O grau de atividade antitumoral de ADC Molécula 4 pareceu correlacionar-se positivamente com os níveis de expressão de FolRα (por exemplo, tumores PDX com níveis mais altos de FolRα exibiram TGI maior em resposta ao tratamento com ADC Molécula 4). Os dados mostrados (Figura 23) são uma representação de alguns dos modelos que exibiram eficácia: (A) Modelo PDX com expressão negativa para FolRα; (B) Modelo PDX com expressão FolRα+; (C, D) modelos PDX com expressão FolRα++; (E, F) modelos PDX com expressão FolRα+++. TGI percentual (determinado no último dia de tumores controle) e valores p correspondentes são indicados nos gráficos. A análise estatística de TGI foi realizada usando um teste t não pareado. Uma probabilidade inferior a 5% (p < 0,05) foi considerada significativa. Todos os gráficos são apresentados como média ± SEM. Exemplo 24. Eficácia de variantes de ADC em tratamento combinado com avelumabe
[00443] A eficácia de ADC Molécula 4 em combinação com o inibidor de PD-L1, Avelumabe (grau clínico) foi avaliada em animais portadores de tumores MC38-FolRα estabelecidos. Os resultados são ilustrados nas Figuras 24 e 25. As Figuras 24A e 25A ilustram curvas de crescimento do tumor MC38-hFolRα em resposta às doses indicadas de ADC Molécula 4, Avelumabe ou de uma combinação de ambos. As curvas de crescimento são mostradas até que > 50% dos animais nos grupos de tratamento com agente único foram sacrificados por terem atingido o limite para tamanho tumoral
172 / 202 baseado no protocolo da IACUC. A Figura 24B é um gráfico de dispersão do tamanho de tumores individuais no Dia 12 quando a média de tumores controle era > 1.200 mm3. A análise estatística para comparação com o veículo controle foi realizada usando ANOVA one-way (de um fator) com teses de comparações múltiplas de Dunnett. Uma probabilidade inferior a 5% (p < 0,05) foi considerada significativa. A Figura 25B é uma curva de Kaplan- Meier que mostra a fração de animais que sobrevivem em resposta ao tratamento com as doses indicadas de ADC Molécula 4, Avelumabe ou da combinação de ambos. Todos os gráficos são apresentados como média ou valores individuais ± SEM.
[00444] Como ilustrado na Figura 24, ADC Molécula 4 como agente único em qualquer dose (10 mg/kg ou 15 mg/kg, uma vez por injeção IV) ou Avelumabe (administrado 3x/dia de 3/3 dias, via intraperotineal) resultou inicialmente na estase tumoral até aproximadamente o Dia 7, enquanto o tratamento combinado induziu regressão tumoral (Figura 24A). A análise do tamanho tumoral no Dia 12 mostrou inibição significativa do crescimento tumoral em todos os grupos de tratamento em comparação ao veículo controle (Figura 24B). O monitoramento continuado revelou que ADC Molécula 4 em combinação com Avelumabe reforçou acentuadamente a atividade antitumoral em comparação a qualquer um dos agentes únicos isoladamente, conforme evidenciado pela regressão completa (por exemplo, ausência de tumores palpáveis) em 14 de 15 animais (Figura 24B).
[00445] Como ilustrado na Figura 25, a volta do crescimento tumoral foi observada em um animal no grupo ADC Molécula 10 mg/kg + Avelumabe que foi sacrificado no Dia 59 por ter atingido o tamanho tumoral máximo (Figura 25A). Além disso, o tratamento combinado demonstrou efeitos curativos ou remissão completa com base na sobrevida significativamente prolongada de animais sadios com ganho do peso corporal normal e sem volta do crescimento tumoral até 112 dias após o tratamento, a qual é 3-4 vezes
173 / 202 mais longa do que a sobrevida mediana com os agentes isolados (Figura 25B). Exemplo 25. Propriedades farmacocinéticas de variantes de ADC em camundongos Beige SCID
[00446] Os parâmetros farmacocinéticos não compartimentais de variantes candidatas a ADC contra FolRα ADC que demonstraram boa eficácia nos modelos de tumor KB e Igrov1 foram avaliados em camundongos Beige SCID não portadores do tumor. Um bolus IV de 5 mg/kg foi administrado, amostrado e agrupado de camundongos diferentes a fim de obter momentos para os parâmetros farmacocinéticos (PK). Variantes de ADC contra FolRα não se ligam a FolRα murino, portanto, efeitos PK mediados por antígeno não são esperados. Uma lista de artigos testados e o resumo dos resultados são apresentados na Tabela 23. Tabela 23. Parâmetros farmacocinéticos de variantes de ADC contra FolRα em camundongos Beige SCID Parâmetros Unidades ADC Molécula 4 ADC Molécula 20 ADC Molécula 21 Dose mg/kg 5 5 5 Duração do estudo Dias 21 21 21 T1/2 Dias 6,36 5,48 7,59 C0 μg/mL 122 125 115 Cmax ± SE μg/mL 118 ± 5 123 ± 10 113 ± 4 AUC(0-todos) ± SEM dia* μg/mL 476 ± 22 543 ± 22 447 ± 8 AUC(0-∞) dia* μg/mL 523 580 510 CL mL/dia/kg 9,57 8,63 9,8 VSS mL/kg 79,7 62,2 95,2
[00447] A meia-vida de eliminação (T1/2) foi determinada a partir de uma análise de regressão da gráfico log-linear das curvas de concentração- tempo. Especificamente, T1/2, CL e Vss de ADC Molécula 4 foram 6,36; 9,57 e 79,7, respectivamente. Além disso, a Cmax determinada para ADC Molécula 4 foi 118 ± 5 μg/mL.
[00448] Em geral, as propriedades farmacocinéticas de todas as variantes testadas de ADC contra FolRα foram comparáveis e exibiram valores semelhantes nos perfis PK (Figura 26). Além disso, o perfil farmacocinético murino de todos os artigos em teste exibiu perfis PK que são semelhantes aqueles de outros anticorpos monoclonais IgG aprovados pela
174 / 202 FDA. Exemplo 26. Propriedades farmacocinéticas de anticorpos ADC líderes em macacos cinomolgos
[00449] Os parâmetros farmacocinéticos não compartimentais dos anticorpos 1848-B10 e 1848-H01 com os sítios de conjugação K42/Y180 foram avaliados em macacos cinomolgos (n=3 para cada dose do anticorpo) em um estudo de dose repetida. Duas doses IV de 10 mg/kg IV foram administradas no Dia 1 e dia 15, e as amostras analisadas para determinar parâmetros PK e resposta de anticorpo anti-fármaco (ADA). Os dois anticorpos ligam-se ao FolRα cino com afinidade comparável ao alvo humano, portanto, efeitos PK mediados por antígeno seriam esperados. Como resumido na Tabela 24, os perfis PK de ambos os anticorpos são semelhantes. Tabela 24. Parâmetros farmacocinéticos de anticorpos anti-FolRα líderes em macacos cinomolgos AUC(0- Tratamento Terminal t1/2 C0 AUC(0-∞) Depuração VSS último) (dia* (dia* (dia) (μg/mL) (mL/dia/kg) (mL/kg) μg/mL) μg/mL) 1848-B10, Média 9,73 263 1100 1700 6,02 78,8 K42/Y180 SE 1,01 8 95 171 0,59 8,4 (dose 1) 1848-B10, Média 13,1 241 1670 2110 4,74 83,2 K42/Y180 SE 2,3 14 120 40 0,09 15,5 (dose 2) 1848-H01, Média 6,54 267 1010 1310 7,83 67,3 K42/Y180 SE 0,51 8 60 130 0,83 2,0 (dose 1) 1848-H01, Média 8,08 220 1370 1530 6,60 71,3 K42/Y180 SE 2,51 25 30 110 0,47 12,1 (dose 2)
[00450] Os parâmetros farmacocinéticos médios para o anticorpo 1848-H01 (K42/Y180) foram semelhantes após as Doses 1 e 2. A depuração (clearance) plasmática média após as Doses 1 e 2 foi 7,83 e 6,60 mL/dia/kg, respectivamente, e o volume de distribuição foi 67 e 71 mL/kg, respectivamente. A meia-vida terminal média para as Doses 1 e 2 foi 6,5 e 8,0 dias, respectivamente. Os parâmetros farmacocinéticos médios para 1848-B10 (K42/Y180) foram comparáveis após a Dose 1 e Dose 2. As depurações
175 / 202 plasmáticas das Doses 1 e 2 foram 6,02 e 4,74 mL/dia/kg, respectivamente. Os valores médios da meia-vida terminal para as Doses 1 e 2 foram 9,7 e 13 dias, respectivamente. O volume de distribuição foi aproximadamente 80 mL/kg.
[00451] Amostras do soro dos animais tratados foram também analisadas quanto ao desenvolvimento de anticorpos anti-fármaco (dados não mostrados). A análise de ADA mostrou não haver resposta significativa no Dia 15 (após a 1a dose) para os dois anticorpos, no entanto, ADA foi detectado em diversos animais no Dia 28 e 43 (após a 2a dose no Dia 15). Exemplo 27. Avaliação toxicocinética de um candidato a ADC em macacos cinomolgos
[00452] Macacos cinomolgos fêmeas receberam doses em bolus IV lento de veículo controle ou ADC Molécula 4 nas doses de 1, 3, 10 e 30 mg/kg nos Dias 1 e 22 (n=3/grupo) e foram observados até o Dia 43. Soro e plasma foram coletados em diversos momentos de todos os grupos para avaliação do perfil toxicocinético (anticorpo total, ADC e catabólito de e fármaco livre (I)). A análise toxicocinética confirmou exposições de ADC Molécula 4 em todas as doses, verificada pela avaliação dos níveis circulantes do ADC, anticorpo total e fármaco livre (I). Os valores médios de Cmax e AUC de ADC, anticorpo total e fármaco livre (I) aumentou com níveis crescentes da dose de ADC Molécula 4 de maneira aproximadamente proporcional à dose e foram em geral semelhantes nos Dias 1 e 22. A meia-vida (T1/2) do ADC variou de 1,7 até mais de 2 dias, e Cmax variou de 29-560 µg/mL dependendo da dose administrada. Exemplo 28. Identificação de catabólitos liberados dos candidatos a ADC
[00453] Prevê-se que os ADCs anti-FolRα aqui descritos sejam processados dentro do endossomo ou lisossomo, resultando na liberação do metabólito, fármaco livre (I), e possam permear para células em volta e causar atividade bystander. Prevê-se que o fármaco livre liberado dos conjugados P e
176 / 202 Q seja um composto da estrutura (I), que é ilustrada abaixo: (I)
[00454] A geração de fármaco livre (I) foi confirmada em células cultivadas (não mostradas) e tumores Igrov1 tratados com ADC Molécula 1 e ADC Molécula 17, com os tumores colhidos em momentos diferentes após a administração. Os tumores foram homogeneizados e extraídos em acetonitrila e a fração extraída do solvente foi analisada por LC/MS. Nos animais tratados com ADC Molécula 1 e ADC molécula 17, encontrou-se o catabólito C1 nas amostras do tumor, mas não no plasma dos camundongos tratados (Figura 27). O perfil de C1 por LC/MS correspondeu àquele do catabólito previsto do fármaco livre (I) e a estrutura foi confirmada por análise espectrofotométrica de massa (não mostrada). O fármaco livre (I) demonstrou ter atividade citotóxica in vitro, com EC50 variando de 0,5-20 nM dependendo da linhagem celular testada (Tabela 26, dados não mostrados para todas as linhagens celulares). Exemplo 29. Estabilidade in vivo de candidatos a ADC
[00455] A estabilidade in vivo de ADC Molécula 4 foi medida em uma linhagem de camundongos nude após uma dose única de ADC a 5 mg/kg. Plasma foi coletado em vários momentos e analisados para IgG total por ELISA. A análise de DAR do ADC circulante foi medida por captura de afinidade seguida por LC-MS. Os dados mostram que o valor de DAR não altera no decorrer do estudo, Figura 28. O pico observado de degradação também não se altera durante a corrida e está presente em uma quantidade semelhante à vista no estoque original. Exemplo 30. Estabilidade de candidatos a ADC no plasma
[00456] A estabilidade de ADC Moléculas 4 e 20 foi testada no plasma
177 / 202 de macaco cinomolgo e no humano para comparar a estabilidade dos dois ligador-fármacos, Conjugados P e Q. Os ADCs foram incubados em duplicata em PBS, plasma humano e de macaco cinomolgo a 50 μg/mL. As amostras foram incubadas para os momentos de 60 minutos, 1 dia, 3 dias, 7 dias, 14 dias e 21 dias. A análise de IgG total por ELISA e DAR do ADC com captura por afinidade, e empregou-se LC-MS para avaliar a estabilidade da molécula. Os dados apresentados na Figura 29 mostram que a estabilidade in vitro de ADC Moléculas 4 e 20 foi comparável no plasma humano e de cinomolgo, com DAR4 retida até o Dia 21. As duas moléculas também mostraram a ocorrência de recorte, provavelmente na extremidade C-terminal do anticorpo, que foi observado a partir do Dia 1 após a incubação. Esse recorte é provavelmente a clivagem dos dois resíduos de lisina na extremidade C- terminal da cadeia pesada, sendo improvável que tenha impacto sobre a estabilidade ou atividade da molécula. Recorte semelhante é comumente observado durante a produção de moléculas IgG em células CHO. Exemplo 31. Comparação do candidato a ADC e um ADC comparador
[00457] Um comparador dos candidatos a ADC aqui descritos é IMGN853. IMGN853 (mirvetuximabe soravetansina) é um conjugado fármaco-anticorpo contendo um anticorpo que se liga ao FolRα ligado ao maitansinoide causador de rompimento da tubulina, DM4, via um ligador clivável (sulfo-SPDB). O desenho de IMGN853, incluindo a seleção de seus componentes anticorpo e ligador, baseou-se na otimização de sua atividade antitumoral em modelos pré-clínicos com níveis de expressão de FolRα representativos daqueles em amostras tumorais de pacientes com câncer ovariano e pulmonar de não pequenas células. Embora pareça ser promissor na clínica, tendo por base a sua química, IMGN853 pode ter algumas desvantagens potenciais que afetam a estabilidade, segurança e atividade da molécula. Assim, ensaios para avaliar as propriedades e efeitos pré-clínicos de um IMGN853 substituto (ADC Molécula 21) e de ADC Molécula 4 são
178 / 202 descritos abaixo.
[00458] Para avaliar a especificidade de ADC Molécula 4 em comparação àquela de IMGN853, as atividades citotóxicas de ADC Molécula 4 foram comparadas a um substituído estreitamente próximo de IMGN853. O substituto foi expresso transitoriamente em células CHO e conjugado ao sulfo-SPDB-DM4 para produzir ADC Molécula 21. As atividades citotóxicas das duas ADC moléculas foram comparadas na presença de um anticorpo “naked” não conjugado em excesso, como competidor, em células que eram positivas para expressão de FolRα (Igrov1 e OVCAR3) e em células que eram negativas para expressão de FolRα (A549). Para ADC Molécula 4, a atividade de morte celular em células Igrov1 foi reduzida cerca de 800 vezes na presença de um anticorpo não conjugado (de uma EC50 de 0.053 nM para uma EC50 acima de 33 nM), indicando que a atividade de morte celular de ADC Molécula 4 é específica para a presença do antígeno de FolRα na superfície celular, uma vez que o anticorpo naked compete com o ADC pela ligação ao antígeno de FolRα. A atividade de morte celular de ADC Molécula 21 não é completamente dependente da presença do antígeno de FolRα na superfície celular, pois a adição do anticorpo naked somente deslocou a EC50 aproximadamente 3 vezes em células Igrov1. Resultados semelhantes foram também observados em células OVCAR3 (Figuras 30A, 30B). Em células A549 negativas para FolRα, foi observada morte celular potente não específica para ADC Molécula 21, mas morte celular não específica não foi observada para ADC Molécula 4 (Figura 30C). Com base nesses dados pode- se concluir que ADC Molécula 4 mostra morte celular potente e específica somente em células positivas para FolRα, enquanto ADC Molécula 21 mostra morte celular não específica que não está relacionada à ligação do ADC ao antígeno de FolRα. Os resultados são resumidos na Tabela 25. Tabela 25. Atividades citotóxicas específicas de ADC Molécula 4 e ADC Molécula 21 em células positivas e negativas para FolRα
179 / 202 Igrov1 OVCAR3 A549 Amostra testada EC50 Intervalo EC50 Intervalo EC50 Interval (nM) (%) (nM) (%) (nM) o (%) ADC Molécula 4 0.053 66 0,58 53 NK NK ADC Molécula 4 + 1848-H01 0,5 µM >33 NC >33 NC NK NK ADC Molécula 21 3,9 87 7,9 100 7,4 79 ADC Molécula 21 + Mov19 0,5 µM ~ 11 80 10 99 7 81 NC = Não calculável NK = Ausência de morte
[00459] ADC Molécula 4 apresentou atividade de morte celular específica em células Igrov1 positivas para FolRα, mas não teve qualquer atividade em células A549 negativas para FolRα. Por outro lado, ADC Molécula 21 apresentou atividade citotóxica em linhagens celulares positiva e negativa para FolRα, sugerindo uma falta de especificidade que pode ser atribuída à instabilidade potencial do ligador sulfo-SPDB sob condições redutoras em cultura e in vivo ou devido à pinocitose do ADC para as células. Os fármacos livres liberados da ADC Molécula 4 e ADC Molécula 21 são compostos de estrutura (I) e (II), respectivamente, que são ilustrados abaixo: (I) (II)
[00460] Em estudos de citotoxicidade in vitro, os fármacos livres (I) e (II) liberados apresentaram atividade citotóxica comparável (Tabela 26). Uma observação fundamental nesse estudo é que ADC Molécula 4 é 10 vezes mais potente do que as quatro porções teóricas de fármaco livre (I) com o qual é conjugada, indicando que o conjugado confere níveis maiores de morte específica a células alvo do que o fármaco livre (I).
180 / 202 Tabela 26. Atividades citotóxicas em células Igrov1 e A549 Igrov1 A549 Molécula EC50 (nM) Intervalo (%) EC50 (nM) Intervalo (%) ADC Molécula 4 0.06 70 NK NK ADC Molécula 21 4,4* 85 9* 71 Fármaco livre (I) 2,4 92 11 81 Fármaco livre (II) 4,9 90 7,7 81 * EC50 estimada com base em titulação incompleta NC = Não calculável NK = Ausência de morte
[00461] Para avaliar o perfil farmacocinético do fármaco livre (I), ratos Sprague-Dawley fêmeas (peso corporal médio: 250 g) receberam uma dose de 0,4 mg/kg ou 1 mg/kg por administração de bolus IV (N= três animais por nível de dose) via um cateter permanente na veia jugular. Amostras de sangue foram coletadas em 0; 0,83; ; 2; 8; 24; 32; 48 e 72 horas após a dose. Os níveis de fármaco livre (I) e (II) foram medidos por LC-MS/MS e a análise farmacocinética não compartimental foi conduzida utilizando Phoenix WinNonlin, versão 6.4 (Pharsight Corporation). A Tabela 27 fornece os dados PK coletados nesse estudo. A PK do fármaco livre (I) não pôde ser estimada devido ao fato de que as concentrações de (I) aumentaram de 2 para 8 horas e foram indetectáveis depois. Os resultados desse estudo sugerem que a depuração do fármaco livre (I) é mais rápida do que aquela do fármaco livre (II), uma vez que (I) é indetectável 24 horas após a dose (dados não mostrados). Além disso, a administração das duas doses de fármaco livre (I) não teve efeito sobre o peso corporal dos animais, enquanto a perda progressiva do peso corporal foi observada quando do tratamento com 0,4 mg/kg do fármaco livre (II) (Figura 31). Tabela 27. Dados farmacocinéticos dos fármacos livres (I) e (II) t1/2 AUC0-último ± ID do Nível de Cmax ± SE C0 AUC0-inf Clearance VSS terminal SE composto dose (ng/mL) (ng/mL) (h*ng/mL) (L/h/kg) (L/kg) (h) (h*ng/mL) Fármaco 0,1 Dados 5,82 ± Dados Dados 6,81 11,0 ± 2,1 Dados insuf. livre (I) mg/kg insuf. 0,69 insuf. insuf. Fármaco 0,4 Dados Dados Dados 12,8 ± 2,1 15,5 23,9 ± 2,6 Dados insuf. livre (I) mg/kg insuf. insuf. insuf. Fármaco 0,1 9,31 ± 22,4 10,7 96,9 ± 11,0 129 0,775 15,8 livre (II) mg/kg 2,19 Fármaco 0,4 44,3 53,3 ± 19 62,5 211 ± 70 242 1,66 44,1 livre (II) mg/kg
181 / 202
[00462] A Tabela 28 é um resumo das propriedades de ADC Molécula 4 e de seu metabólito, o fármaco livre (I). Tabela 28. Propriedades de ADC Molécula 4 e do fármaco livre (I) Propriedade/Característica Resultados para ADC Molécula 4 T1/2: 6,38 dias; PK de ADC Molécula 4 em camundongos com Taxa de depuração ~ 9,5 mL/kg/dia; análise de DAR DAR4 retido até o Dia 21 Estabilidade de ADC Molécula 4 no plasma DAR4 retido até o Dia 21 humano e cino com análise de DAR PK de fármaco livre (I) em rato versus fármaco Fármaco livre (I) com depuração mais rápida do livre (II) que (II) ADC Molécula 4 não é ativa em linhagens Especificidade da atividade celulares que não expressam FolRα Exemplo 32. Comparação da estabilidade da ligação do fármaco em candidato a ADC versus um ADC comparador
[00463] A estabilidade de ADC Molécula 4 e do comparador ADC Molécula 21 foi avaliada no plasma de macaco cinomolgo e no humano e em PBS, seguido pela quantificação dos catabólitos liberados, os fármaco livres (I) e (II), respectivamente (ver Exemplo 29). Com base nos dados resumidos na Figura 32, a ligação do fármaco para ADC Molécula 4 parece ser mais more estável do que aquela de ADC Molécula 21. ADC Molécula 21 parece ser clivada mais rapidamente no plasma humano e cino, de tal modo que o fármaco livre (II) é detectado dentro de 15-30 minutos da adição ao plasma. O fármaco livre (II) parece então sofrer metabolismo adicional ao longo do tempo. Por outro lado, o fármaco livre (I) não é detectado dentro de 15-30 minutos da adição de ADC Molécula 4 ao plasma. Os níveis do fármaco livre (I) aumentam muito ligeiramente ao longo de 4 dias de incubação no plasma, mas não em PBS; sugerindo uma ligação do fármaco mais estável no plasma. Exemplo 33. Comparação de catabólitos ADC para bombas de efluxo
[00464] A glicoproteína 1 de permeabilidade (PgP; também conhecida como proteína 1 de resistência a múltiplos fármacos (MDR1)) é uma proteína da membrana celular que bombeia substâncias estranhas para fora das células e reduz concentrações intracelulares de uma variedade de fármacos citotóxicos. A atividade de PgP resulta em menor citotoxicidade induzida por
182 / 202 quimioterapia in vitro e in vivo. Células cancerígenas frequentemente tornam- se resistentes a fármacos devido à regulação positiva de PgP, sendo, em alguns casos, essa regulação positiva mediada pelo próprio fármaco. O ensaio comparando a sensibilidade a PgP dos fármaco livres (I) e (II) (Exemplo 29) foi conduzido em um modelo de linhagem celular resistente à cisplatina.
[00465] Para avaliar se o fármaco livre (I) é especificamente um substrato da glicoproteína P (PgP), que é responsável pela resistência à cisplatina em algumas linhagens celulares do câncer de ovário (Stordal et al.
2012. PLoS One 7(7)), as atividades de morte celular do fármaco livre foram investigadas na linhagem celular MES-SA/MX2 que superexpressam PgP e as células MES-SA parentais. A atividade de morte celular do fármaco livre (I), fármaco livre (II) e de um fármaco livre controle (MMAE, designado “III”) nas células MES-SA/MX2 com superexpressão de PgP foram reduzidas em níveis diferentes em comparação às suas atividades nas células MES-SA parentais. As células MES-SA/MX2 foram também tratadas com um inibidor de PgP, GF120918 (5 μM), para investigar mais se a redução observada na morte celular é contribuída pela presença PgP na superfície celular. Na presença do inibidor de PgP, a atividade de morte celular dos fármacos livres foi invertida para o mesmo nível que a linhagem de células MES-SA parentais, indicando que a superexpressão de PgP nas células MES-SA/MX2 foi o principal motivo para a resistência ao fármaco livre.
[00466] A EC50 de morte celular do fármaco livre de controle positivo (III) em células MEA-SA/MX2 mostrou uma variação de 111 vezes na presença e ausência do inibidor de PgP GF120918, o que indicou que o fármaco livre (III) é um substrato muito bom para PgP. O fármaco livre (I) é um substrato fraco para PgP tendo por base o fato de que somente foi observada uma variação de 8 vezes na EC50 de morte celular na presença e ausência do inibidor de PgP em células MEA-SA/MX2. Como substrato para PgP, o fármaco livre (II) é também relativamente ruim, mas é mais suscetível
183 / 202 ao transporte por bombas de efluxo quando comparado ao fármaco livre (I), pois observou-se uma variação de 17 vezes na EC50 de morte celular (Tabela 29, Figura 33). Tabela 29. Atividades citotóxicas em células Igrov1 e A549 MEA-SA MEA-SA/MX2 Mudança Fármaco No GF120918 No GF120918 GF120918 em EC50 testado Intervalo EC50 (nM) EC50 (nM) Intervalo EC50 (nM) Intervalo (%) Fármaco 6 100 50 100 6,4 99 8 livre (I) Fármaco 1,9 100 28 100 1,7 98 17 livre (II) Fármaco 0,75 100 111 100 1 99 111 livre (III)
[00467] Os dados sugerem que o fármaco livre (I) é um substrato mais fraco para transporte ativo através da membrana por bombas de efluxo, quando comparado ao fármaco livre (II). Como resultado, o fármaco livre (I) é menos propenso a ser bombeado para fora de células cancerígenas, o que poderia levar a melhor retenção celular da toxina e, portanto, citotoxicidade melhorada de ADC Molécula 4 quando comparada ao comparador ADC Molécula 21. O efluxo de fármacos mediado por PgP é um mecanismo comum de resistência a ADCs e, na clínica, é um dos mecanismos principais de resistência a agentes à base de platina e inibidores de PARP. A capacidade baixa como substrato do fármaco livre (I) para PgP, torna-o, assim, um warhead promissor para atingir cânceres resistentes à platina e resistentes potenciais a PARP. Exemplo 34. Acúmulo de catabólitos em tumores e plasma
[00468] A ligação ao fármaco de ADC Molécula 4 parece ser mais estável do que aquela do comparador ADC Molécula 21, no entanto a liberação do fármaco livre (I) da ADC Molécula 4 dentro da célula tumoral é crítica para sua citotoxicidade. A fim de avaliar a liberação do warhead das ADC Moléculas 4 e 21, os níveis no tumor e plasmáticos dos fármacos livres (I) e (II) foram medidos em camundongos portadores de tumores Igrov1 tratados com as duas ADC moléculas. Como mostrado na Figura 34, a
184 / 202 liberação e o acúmulo no tumor do fármaco livre (I) da ADC Molécula 4 foi comparável ou ligeiramente melhor do que aquela do fármaco livre (II) da ADC Molécula 21. Esses dados, considerados junto com a citotoxicidade comparável dos dois warheads sugerem que a atividade citotóxica da ADC Molécula 4 seria pelo menos comparável àquela do comparador ADC Molécula 21.
[00469] Em suma, os dados descritos nos Exemplos 29-32 sugerem que um índice terapêutico (TI) mais largo pode resultar de ambos os atributos: o warhead liberado (fármaco livre (I) versus fármaco livre (II)) e a arquitetura da ADC Molécula 4 como um todo. Os fármacos livres (I) e (II) são comparáveis em termos de atividade citotóxica in vitro quando administrados como fármaco livres bem como comparáveis em termos de seu acúmulo em tumores quando administrados como um ADC. A capacidade muito mais fraca de substrato para PgP do fármaco livre (I) versus o fármaco livre (II) prediz que à medida que tumores desenvolverem resistência com base no efluxo, a ADC Molécula 4 reterá a maior parte de sua atividade original. O mecanismo de liberação de clivagem por protease da ADC Molécula 4 tem maior estabilidade e especificidade pelo tumor, do que o mecanismo de liberação pelo dissulfeto do comparador ADC Molécula 21. Isso transmite concomitantemente maior especificidade por células que expressam FolRα. A maior estabilidade da ADC Molécula 4 junto com a depuração mais rápida e maior tolerabilidade do catabólito (I) também confere um perfil de segurança melhorado para a ADC Molécula 4. Tudo isso indica que a ADC Molécula 4 poderia ter um TI maior do que o comparador ADC IMGN853, conforme medido pela substituto ADC Molécula 21. Exemplo 35. Introdução de mutações em anticorpos candidatos
[00470] Uma mutação V262E foi introduzido na variante de anticorpo 1848-H01 (Y180/F404) para investigar se essa mutação aumentaria os rendimentos da variante. A introdução da mutação V262E resultou em um
185 / 202 aumento de 70% no rendimento após a purificação com ProA (350 mg/L em comparação ao título da parental de 170 mg/L) sem qualquer alteração em qualidade da proteína purificada (dados não mostrados). As propriedades da proteína com a mutação V262E conjugada ao Conjugado P (Exemplo 11) e ao Conjugado Q (Exemplo 15) foram comparadas com ao conjugado ADC Molécula 4 parental quanto à eficiência da conjugação e atividade in vitro do ADC. Como visto na Tabela 30, a introdução da mutação V262E reduziu a atividade citotóxica in vitro em células Igrov1 do conjugado P, em menor medida, e do conjugado Q em maior medida, embora a eficiência da conjugação e DAR fossem comparáveis. Tabela 30. Comparação de ADC moléculas com ou sem mutações V262E Morte celular (Igrov1) ADC Sítio(s) de % Anticorpo Conjugado DAR EC50 (nM) Intervalo Molécula conjugação Conjugado (%) 4 1848-H01 P Y180/F404 3,73 93% 0,083 80 20 1848-H01 Q Y180/F404 3,81 95% 0,13 70 23 1848-H01 P Y180/F404 3,57 89% 0,088 72 V262E 24 1848-H01 Q Y180/F404 3,76 94% 0,19 56 V262E
[00471] A comparação das propriedades farmacocinéticas e estabilidade in vivo e eficácia in vivo do conjugado P com a ADC Molécula 4 mostrou que, embora a PK dos ADCs fossem comparáveis entre as duas versões (Tabela 31, Figura 36), a atividade in vivo do conjugado P com mutação (ADC Molécula 23) foi marginalmente menor do que aquela da ADC Molécula 4 (Figura 35A). A análise estatística do tamanho tumoral no Dia 21 mostrou que o tratamento somente com ADC Molécula 4 resultou em tumores significativamente menores em comparação ao veículo, no entanto os tamanhos tumorais nos grupos ADC Molécula 4 e ADC Molécula 23 não foram estatisticamente diferentes um do outro (Figura 35B). Com base nisso, a ADC Molécula 23 é adequada como ADC alternativo para o desenvolvimento e investigação futura do direcionamento para FolRα.
Tabela 31. Propriedades farmacocinéticas de Moléculas ADC com ou sem V262E ADC t1/2 Conjuga Sítio(s) de C0 Cmax ± SE AUC0-último ± SE AUC0-inf ± SE Clearance Vss Molécu SP Anticorpo terminal do conjugação (μg/mL) (μg/mL) (dia * μg/mL) (dia * μg/mL) (mL/dias/kg) (mL/kg) la (h) 4 8193 1848-H01 P Y180/F404 6,36 122 118 ± 5 476 ± 22 523 9,57 79,7 1848-H01 23 8675 P Y180/F404 5,70 115 113 ± 11 599 ± 34 636 7,87 60,5 V262E
186 / 202
187 / 202 Exemplo 36. Sequências
[00472] A Tabela 32 fornece as sequências aqui referidas. Tabela 32. Sequências SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: Receptor alfa de MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEA folato humano QTRIAWARTELLNVCMNAKHHKE (hFOLR1) KPGPEDKLHEQCRPWRKNACCST
NTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGE MAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGP WIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGW NWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPT PTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGR CIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAA AMSGAGPWAAWPFLLSLALMLL
WLLS Receptor alfa de MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEA folato de macaco QTRTARARTELLNVCMNAKHHKE cinomolgo KPGPEDKLHEQCRPWKKNACCST
NTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGE MAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGP WIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED CERWWEDCRTSYTCKSNWHKGW NWTSGFNKCPVGAACQPFHFYFPT PTVLCNEIWTYSYKVSNYSRGSGR CIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAA AMSGAGPWAAWPLLLSLALTLLW
LLS Receptor alfa de MAHLMTVQLLLLVMWMAECAQS folato murino RATRARTELLNVCMDAKHHKEKP
GPEDNLHDQCSPWKTNSCCSTNTS QEAHKDISYLYRFNWNHCGTMTS ECKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQ VDQSWRKERILDVPLCKEDCQQW WEDCQSSFTCKSNWHKGWNWSS GHNECPVGASCHPFTFYFPTSAAL CEEIWSHSYKLSNYSRGSGRCIQM WFDPAQGNPNEEVARFYAEAMSG
AGFHGTWPLLCSLSLVLLWVIS SRP1848-A01 CDR-H1 Chothia GFNITRY SRP1848-A02 CDR-H1 Chothia GFNISGF SRP1848-A04 CDR-H1 Chothia GFNIDQS SRP1848-A06 CDR-H1 Chothia GFNIGNS SRP1848-A07 CDR-H1 Chothia GFNIGYH SRP1848-A08 CDR-H1 Chothia GSNIRKH SRP1848-A09 CDR-H1 Chothia GFNIRKQ SRP1848-A10 CDR-H1 Chothia GFNIRKY SRP1848-B01 CDR-H1 Chothia GFNIRNY SRP1848-B03 CDR-H1 Chothia GFNISMK SRP1848-B04 CDR-H1 Chothia SFNISNH SRP1848-B05 CDR-H1 Chothia GFNISNY SRP1848-B06 CDR-H1 Chothia GFNISNY SRP1848-B07 CDR-H1 Chothia GFNISRF SRP1848-B09 CDR-H1 Chothia GFNITNY SRP1848-B10 CDR-H1 Chothia GFNTTTK SRP1848-B11 CDR-H1 Chothia GFNIGNN
188 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-C01 CDR-H1 Chothia GFNIGNS SRP1848-C03 CDR-H1 Chothia GFNIGVY SRP1848-C04 CDR-H1 Chothia GFNIRHY SRP1848-C05 CDR-H1 Chothia GFNIRKY SRP1848-C07 CDR-H1 Chothia GFNIRKY SRP1848-C10 CDR-H1 Chothia GFNIRTY SRP1848-D02 CDR-H1 Chothia GFNISHN SRP1848-D03 CDR-H1 Chothia GFNIRYF SRP1848-D04 CDR-H1 Chothia GFNISHY SRP1848-D05 CDR-H1 Chothia GFNISIS SRP1848-D07 CDR-H1 Chothia GFNISKY SRP1848-D09 CDR-H1 Chothia GFNISNY SRP1848-D10 CDR-H1 Chothia GFNISRN SRP1848-E01 CDR-H1 Chothia GFNITNK SRP1848-E02 CDR-H1 Chothia GFNIGKY SRP1848-E03 CDR-H1 Chothia GFNIGNY SRP1848-E05 CDR-H1 Chothia GFNIGVY SRP1848-E06 CDR-H1 Chothia GFNINRY SRP1848-E07 CDR-H1 Chothia GFNIRKS SRP1848-F01 CDR-H1 Chothia GFNIRTY SRP1848-F02 CDR-H1 Chothia GFNIRTY SRP1848-F04 CDR-H1 Chothia GFNISNY SRP1848-F05 CDR-H1 Chothia GFNISKS SRP1848-F06 CDR-H1 Chothia GFNISLS SRP1848-F07 CDR-H1 Chothia GFNISNH SRP1848-F08 CDR-H1 Chothia GFNISNH SRP1848-F09 CDR-H1 Chothia GFNISNH SRP1848-F10 CDR-H1 Chothia GFNISNN SRP1848-F11 CDR-H1 Chothia GFNISNN SRP1848-G01 CDR-H1 Chothia GFNISRH SRP1848-G03 CDR-H1 Chothia GFNISTY SRP1848-G04 CDR-H1 Chothia GFNIHST SRP1848-G06 CDR-H1 Chothia GFNIRST SRP1848-G07 CDR-H1 Chothia GFNIHST SRP1848-G09 CDR-H1 Chothia GFNIRGT SRP1848-G10 CDR-H1 Chothia GFNIRST SRP1848-G11 CDR-H1 Chothia GFNISST SRP1848-H01 CDR-H1 Chothia GFNIRTQ SRP2060-E10 CDR-H1 Chothia GFSLSTFGM SRP2060-E05 CDR-H1 Chothia GFSLSTFGM SRP2060-B01 CDR-H1 Chothia GFSLSTFGM SRP2060-A06 CDR-H1 Chothia GFSLSTFGM SRP1848-A01 CDR-H1 Kabat RYSIH SRP1848-A02 CDR-H1 Kabat GFRIH SRP1848-A04 CDR-H1 Kabat QSSIH SRP1848-A06 CDR-H1 Kabat NSYIH SRP1848-A07 CDR-H1 Kabat YHSIH SRP1848-A08 CDR-H1 Kabat KHSIH SRP1848-A09 CDR-H1 Kabat KQSIH SRP1848-A10 CDR-H1 Kabat KYSIH SRP1848-B01 CDR-H1 Kabat NYSIH SRP1848-B03 CDR-H1 Kabat MKYIH SRP1848-B04 CDR-H1 Kabat NHSIH SRP1848-B05 CDR-H1 Kabat NYYIH SRP1848-B06 CDR-H1 Kabat NYYIH SRP1848-B07 CDR-H1 Kabat RFYIH SRP1848-B09 CDR-H1 Kabat NYYIH
189 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-B10 CDR-H1 Kabat TKSIH SRP1848-B11 CDR-H1 Kabat NNSIH SRP1848-C01 CDR-H1 Kabat NSYIH SRP1848-C03 CDR-H1 Kabat VYSIH SRP1848-C04 CDR-H1 Kabat HYSIH SRP1848-C05 CDR-H1 Kabat KYSIH SRP1848-C07 CDR-H1 Kabat KYSIH SRP1848-C10 CDR-H1 Kabat TYYIH SRP1848-D02 CDR-H1 Kabat HNYIH SRP1848-D03 CDR-H1 Kabat YFSIH SRP1848-D04 CDR-H1 Kabat HYSIH SRP1848-D05 CDR-H1 Kabat ISYIH SRP1848-D07 CDR-H1 Kabat KYYIH SRP1848-D09 CDR-H1 Kabat NYYIH SRP1848-D10 CDR-H1 Kabat RNSIH SRP1848-E01 CDR-H1 Kabat NKYIH SRP1848-E02 CDR-H1 Kabat KYSIH SRP1848-E03 CDR-H1 Kabat NYYIH SRP1848-E05 CDR-H1 Kabat VYYIH SRP1848-E06 CDR-H1 Kabat RYYIH SRP1848-E07 CDR-H1 Kabat KSSIH SRP1848-F01 CDR-H1 Kabat TYSIH SRP1848-F02 CDR-H1 Kabat TYSIH SRP1848-F04 CDR-H1 Kabat NYSIH SRP1848-F05 CDR-H1 Kabat KSSIH SRP1848-F06 CDR-H1 Kabat LSYIH SRP1848-F07 CDR-H1 Kabat NHSIH SRP1848-F08 CDR-H1 Kabat NHSIH SRP1848-F09 CDR-H1 Kabat NHYIH SRP1848-F10 CDR-H1 Kabat NNSIH SRP1848-F11 CDR-H1 Kabat NNYIH SRP1848-G01 CDR-H1 Kabat RHSIH SRP1848-G03 CDR-H1 Kabat TYYIH SRP1848-G04 CDR-H1 Kabat STDIH SRP1848-G06 CDR-H1 Kabat STDIH SRP1848-G07 CDR-H1 Kabat STDIH SRP1848-G09 CDR-H1 Kabat GTDIH SRP1848-G10 CDR-H1 Kabat STDIH SRP1848-G11 CDR-H1 Kabat STDIH SRP1848-H01 CDR-H1 Kabat TQSIH SRP2060-E10 CDR-H1 Kabat TFGMGVG SRP2060-E05 CDR-H1 Kabat TFGMGVG SRP2060-B01 CDR-H1 Kabat TFGMGVG SRP2060-A06 CDR-H1 Kabat TFGMGVG SRP1848-A01 CDR-H2 Chothia LPESGG SRP1848-A02 CDR-H2 Chothia YPESGA SRP1848-A04 CDR-H2 Chothia YPVDGT SRP1848-A06 CDR-H2 Chothia TPIDGN SRP1848-A07 CDR-H2 Chothia FPVDGT SRP1848-A08 CDR-H2 Chothia YPNDGT SRP1848-A09 CDR-H2 Chothia FPNDGT SRP1848-A10 CDR-H2 Chothia FPIDDI SRP1848-B01 CDR-H2 Chothia YPVDGI SRP1848-B03 CDR-H2 Chothia TPIDGM SRP1848-B04 CDR-H2 Chothia YPVDGI SRP1848-B05 CDR-H2 Chothia SPIDGY SRP1848-B06 CDR-H2 Chothia TPIDGY
190 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-B07 CDR-H2 Chothia SPYDGF SRP1848-B09 CDR-H2 Chothia TPVDGY SRP1848-B10 CDR-H2 Chothia YPRDGI SRP1848-B11 CDR-H2 Chothia SPIDGF SRP1848-C01 CDR-H2 Chothia TPNDGY SRP1848-C03 CDR-H2 Chothia YPIDGN SRP1848-C04 CDR-H2 Chothia YPGPGN SRP1848-C05 CDR-H2 Chothia FPIDGI SRP1848-C07 CDR-H2 Chothia FPIDGI SRP1848-C10 CDR-H2 Chothia SPIDGY SRP1848-D02 CDR-H2 Chothia TPQDGY SRP1848-D03 CDR-H2 Chothia FPNDGS SRP1848-D04 CDR-H2 Chothia YPRDGI SRP1848-D05 CDR-H2 Chothia SPIDGY SRP1848-D07 CDR-H2 Chothia SPNDGY SRP1848-D09 CDR-H2 Chothia SPNDGY SRP1848-D10 CDR-H2 Chothia SPNDGT SRP1848-E01 CDR-H2 Chothia TPFDGF SRP1848-E02 CDR-H2 Chothia YPNDGN SRP1848-E03 CDR-H2 Chothia TPRDGF SRP1848-E05 CDR-H2 Chothia TPNDGY SRP1848-E06 CDR-H2 Chothia TPNDGY SRP1848-E07 CDR-H2 Chothia FPYDGS SRP1848-F01 CDR-H2 Chothia FPNDGT SRP1848-F02 CDR-H2 Chothia FPNDGT SRP1848-F04 CDR-H2 Chothia YPIDGI SRP1848-F05 CDR-H2 Chothia YPNDGS SRP1848-F06 CDR-H2 Chothia SPIDGN SRP1848-F07 CDR-H2 Chothia YPNDGI SRP1848-F08 CDR-H2 Chothia YPVDGI SRP1848-F09 CDR-H2 Chothia SPLDGY SRP1848-F10 CDR-H2 Chothia FPNDGY M SRP1848-F11 CDR-H2 Chothia TPIDGN SRP1848-G01 CDR-H2 Chothia APNDGS SRP1848-G03 CDR-H2 Chothia TPSDGF SRP1848-G04 CDR-H2 Chothia TPAGGA SRP1848-G06 CDR-H2 Chothia TPAGGA SRP1848-G07 CDR-H2 Chothia TPAGGA SRP1848-G09 CDR-H2 Chothia TPAGGA SRP1848-G10 CDR-H2 Chothia TPAGGA SRP1848-G11 CDR-H2 Chothia TPAGGA SRP1848-H01 CDR-H2 Chothia FPIDGI SRP2060-E10 CDR-H2 Chothia WWDDD SRP2060-E05 CDR-H2 Chothia WWDDD SRP2060-B01 CDR-H2 Chothia WWDDD SRP2060-A06 CDR-H2 Chothia WWDDD SRP1848-A01 CDR-H2 Kabat GILPESGGTSYADSVKG SRP1848-A02 CDR-H2 Kabat GIYPESGATYYADSVKG SRP1848-A04 CDR-H2 Kabat VIYPVDGTTDYADSVKG SRP1848-A06 CDR-H2 Kabat GITPIDGNTDYADSVKG SRP1848-A07 CDR-H2 Kabat EIFPVDGTTDYADSVKG SRP1848-A08 CDR-H2 Kabat SIYPNDGTTDYADSVKG SRP1848-A09 CDR-H2 Kabat SIFPNDGTTDYADSVKG SRP1848-A10 CDR-H2 Kabat DIFPIDDITDYADSVKG SRP1848-B01 CDR-H2 Kabat EIYPVDGITDYADSVKG SRP1848-B03 CDR-H2 Kabat GITPIDGMTDYADSVKG SRP1848-B04 CDR-H2 Kabat EIYPVDGITDYADSVKG
191 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-B05 CDR-H2 Kabat GISPIDGYTDYADSMKG SRP1848-B06 CDR-H2 Kabat GITPIDGYTDYADSVKG SRP1848-B07 CDR-H2 Kabat GISPYDGFTDYADSVKG SRP1848-B09 CDR-H2 Kabat GITPVDGYTDYADRVKG SRP1848-B10 CDR-H2 Kabat EIYPRDGITDYADSVKG SRP1848-B11 CDR-H2 Kabat DISPIDGFTDYADSVKG SRP1848-C01 CDR-H2 Kabat GVTPNDGYTDYADSVKG SRP1848-C03 CDR-H2 Kabat EIYPIDGNTDYADSVKG SRP1848-C04 CDR-H2 Kabat EIYPGPGNTDYADSVKG SRP1848-C05 CDR-H2 Kabat DIFPIDGINDYADSVKG SRP1848-C07 CDR-H2 Kabat DIFPIDGITDYADSVKG SRP1848-C10 CDR-H2 Kabat GISPIDGYTDYADSMKG SRP1848-D02 CDR-H2 Kabat GITPQDGYTDYADSVKG SRP1848-D03 CDR-H2 Kabat DIFPNDGSTDYADSVKG SRP1848-D04 CDR-H2 Kabat EIYPRDGITDYADSVKG SRP1848-D05 CDR-H2 Kabat GISPIDGYTDYADSVKG SRP1848-D07 CDR-H2 Kabat GISPNDGYTDYADSVKG SRP1848-D09 CDR-H2 Kabat GISPNDGYTDYADSVKG SRP1848-D10 CDR-H2 Kabat WISPNDGTTDYADSVKG SRP1848-E01 CDR-H2 Kabat GITPFDGFTDYADSVKG SRP1848-E02 CDR-H2 Kabat EIYPNDGNTDYADSVKG SRP1848-E03 CDR-H2 Kabat GITPRDGFTDYADSVKG SRP1848-E05 CDR-H2 Kabat GITPNDGYTDYADSVKG SRP1848-E06 CDR-H2 Kabat GITPNDGYTDYADSVEG SRP1848-E07 CDR-H2 Kabat EIFPYDGSTDYADNVKG SRP1848-F01 CDR-H2 Kabat SIFPNDGTTDYADSVKG SRP1848-F02 CDR-H2 Kabat SIFPNDGTTDYADSVKG SRP1848-F04 CDR-H2 Kabat EIYPIDGITDYADSVKG SRP1848-F05 CDR-H2 Kabat EIYPNDGSTDYADSVKG SRP1848-F06 CDR-H2 Kabat GISPIDGNTDYADSVKG SRP1848-F07 CDR-H2 Kabat EIYPNDGITDYADSVKG SRP1848-F08 CDR-H2 Kabat EIYPVDGITDYADSVKG SRP1848-F09 CDR-H2 Kabat GISPLDGYTDYADSVKG SRP1848-F10 CDR-H2 Kabat SIFPNDGYTDYADSVKG SRP1848-F11 CDR-H2 Kabat GITPIDGNTDYADSVKG SRP1848-G01 CDR-H2 Kabat WIAPNDGSTDYADSVKG SRP1848-G03 CDR-H2 Kabat GITPSDGFTDYADSVKG SRP1848-G04 CDR-H2 Kabat YITPAGGATFYADSVKG SRP1848-G06 CDR-H2 Kabat YITPAGGATYYADNVKG SRP1848-G07 CDR-H2 Kabat YITPAGGATWYADSVKG SRP1848-G09 CDR-H2 Kabat YITPAGGATFYADSVKG SRP1848-G10 CDR-H2 Kabat YITPAGGATYYADSVKG SRP1848-G11 CDR-H2 Kabat YITPAGGATWYADSVKG SRP1848-H01 CDR-H2 Kabat DIFPIDGITDYADSVKG SRP2060-E10 CDR-H2 Kabat HIWWDDDKYYHPALKG SRP2060-E05 CDR-H2 Kabat HIWWDDDKYYHPALKG SRP2060-B01 CDR-H2 Kabat HIWWDDDKYYHPALKG SRP2060-A06 CDR-H2 Kabat HIWWDDDKYYYPALKG SRP1848-A01 CDR-H3 HIYPWDWFSNYVLDY SRP1848-A02 CDR-H3 HLYVWDWVLDHVLDY SRP1848-A04 CDR-H3 GAWSWRSGYGYYIDY SRP1848-A06 CDR-H3 GAWSWRSGYGYYIDY SRP1848-A07 CDR-H3 GFWAWRSGYGYYLDY SRP1848-A08 CDR-H3 GSWFWRAGYGYYLDY SRP1848-A09 CDR-H3 GSWFWRSGYGYFLEY SRP1848-A10 CDR-H3 GSWSWPSGHSYYLDY SRP1848-B01 CDR-H3 GFWSWPSGYSYFLDY
192 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-B03 CDR-H3 GSWSWPSGYSYYLDY SRP1848-B04 CDR-H3 GRYSWRAGYSYYLDY SRP1848-B05 CDR-H3 GSWFWQSGYGYYLDY SRP1848-B06 CDR-H3 GFWSWPSGYGYYQDY SRP1848-B07 CDR-H3 GSWSWPAGYGYYQDY SRP1848-B09 CDR-H3 GAWSWRSGYGYYMDY SRP1848-B10 CDR-H3 GGWHWRSGYSYYLDY SRP1848-B11 CDR-H3 GSWSWRAGYGYYLDY SRP1848-C01 CDR-H3 GSWFWRAGYGYYLDY SRP1848-C03 CDR-H3 GSWAWRSGYSYYLDY SRP1848-C04 CDR-H3 GSLSWRAGYGYYLDY SRP1848-C05 CDR-H3 GSWSWKAGYGYYLDY SRP1848-C07 CDR-H3 GSWSWPAGYGYYQDY SRP1848-C10 CDR-H3 GSWSWPAGYGYYLDY SRP1848-D02 CDR-H3 GAWSWRAGYGYYLDY SRP1848-D03 CDR-H3 GHWSWPSGYWYYLDY SRP1848-D04 CDR-H3 GYWFWRSGYGYYLDY SRP1848-D05 CDR-H3 GSWSWRAGYGYYLDY SRP1848-D07 CDR-H3 GFWAWRSGYGYYLDY SRP1848-D09 CDR-H3 GSWSWRHGYGYYLDY SRP1848-D10 CDR-H3 GAWSWRSGYGYYIDY SRP1848-E01 CDR-H3 GSWSWPAGYGYYQDY SRP1848-E02 CDR-H3 GSWSWRSGYGYYLDY SRP1848-E03 CDR-H3 GSWSWPAGHSYYLDY SRP1848-E05 CDR-H3 GFWAWRSGYGYYLDY SRP1848-E06 CDR-H3 GTWSWPSGHSYYLDY SRP1848-E07 CDR-H3 GAWSWRSGYGYYIDY SRP1848-F01 CDR-H3 GSWAWRAGYSYYLDY SRP1848-F02 CDR-H3 GSWSWQAGYGYYLDY SRP1848-F04 CDR-H3 GSWFWRSGYGYYLDY SRP1848-F05 CDR-H3 GSWAWRSGYSYFLDY SRP1848-F06 CDR-H3 GFWAWRSGYGYYLDY SRP1848-F07 CDR-H3 GSWDWRSGYSYYLDY SRP1848-F08 CDR-H3 GSWYWQSGYSYYLDY SRP1848-F09 CDR-H3 GAWSWRSGYGYYIDY SRP1848-F10 CDR-H3 GSWFWRSGYGYYLDY SRP1848-F11 CDR-H3 GSWYWRAGYGYYLDY SRP1848-G01 CDR-H3 GSWAWRSGYSYFLDY SRP1848-G03 CDR-H3 GSWSWPSGHGYFLDY SRP1848-G04 CDR-H3 YPYWFAGYMDY SRP1848-G06 CDR-H3 QPYWFAGYMDY SRP1848-G07 CDR-H3 YPFWFAGYMDY SRP1848-G09 CDR-H3 HEYWFSGYMDY SRP1848-G10 CDR-H3 YPYWFAGYIDY SRP1848-G11 CDR-H3 YPYWFSGYMDY SRP1848-H01 CDR-H3 GSWSWPSGMDYYLDY SRP2060-E10 CDR-H3 NHFPHYYGSSHWYFNV SRP2060-E05 CDR-H3 NHFPHYYGSSHWYFNV SRP2060-B01 CDR-H3 NHFPHYYGSSHWYFNV SRP2060-A06 CDR-H3 NHFPHYYGSSHWYFDV trastuzumabe CDR-L1 RASQDVNTAVA H6D1-LC4 CDR-L1 KASQDINSYLS H H6D1-LC5 CDR-L1 KASQDINSYLS trastuzumabe CDR-L2 SASFLYS H6D1-LC4 CDR-L3 RANRLVD H6D1-LC5 CDR-L2 RANRLVD trastuzumabe CDR-L3 QQHYTTPPT
193 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: H6D1-LC4 CDR-L3 LQYDEFPYT H6D1-LC5 CDR-L3 LQYDEFPYT SRP1848-A01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNITRYSIHWVRQAPGKGLEWV AGILPESGGTSYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARHIYPWDWFSNYVLDYWGQGTL
VTVSS SRP1848-A02 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISGFRIHWVRQAPGKGLEWV AGIYPESGATYYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARHLYVWDWVLDHVLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-A04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIDQSSIHWVRQAPGKGLEWV GVIYPVDGTTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGAWSWRSGYGYYIDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-A06 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIGNSYIHWVRQAPGKGLEWV GGITPIDGNTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGAWSWRSGYGYYIDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-A07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIGYHSIHWVRQAPGKGLEWV GEIFPVDGTTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLHMNSLRAEDTAVYYC ARGFWAWRSGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-A08 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGSNIRKHSIHWVRQAPGKGLEWV GSIYPNDGTTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWFWRAGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-A09 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRKQSIHWVRQAPGKGLEWV GSIFPNDGTTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQVNSLRAEDTAVYYC ARGSWFWRSGYGYFLEYWGQGTL
VTVSS SRP1848-A10 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRKYSIHWARQAPGKGLEWV GDIFPIDDITDYADSVKGRFTISADT SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGSWSWPSGHSYYLDYWGQGTLV
TVSS SRP1848-B01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRNYSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPVDGITDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGFWSWPSGYSYFLDYWGQGTL VTVSS
194 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-B03 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISMKYIHWVRQAPGKGLEW VGGITPIDGMTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGSWSWPSGYSYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-B04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SSFNISNHSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPVDGITDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGRYSWRAGYSYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-B05 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNYYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPIDGYTDYADSMKGRFTISAD TSKNTAYLQMSSLRAEDTAVYYC ARGSWFWQSGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-B06 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNYYIHWVRQAPGKGLEWV GGITPIDGYTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGFWSWPSGYGYYQDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-B07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISRFYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPYDGFTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWPAGYGYYQDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-B09 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
GGFNITNYYIHWVRQAPGKGLEW VGGITPVDGYTDYADRVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGAWSWRSGYGYYMDYWG
QGTLVTVSS SRP1848-B10 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLEW VGEIYPRDGITDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGGWHWRSGYSYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-B11 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIGNNSIHWVRQAPGKGLEWV GDISPIDGFTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWRAGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-C01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIGNSYIHWVRQAPGKGLEWV GGVTPNDGYTDYADSVKGRFTISA DTSKNTTYLQMNSLRAEDTAVYY CARGSWFWRAGYGYYLDYWGQG ALVTVSS
195 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-C03 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIGVYSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPIDGNTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWAWRSGYSYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-C04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRHYSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPGPGNTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSLSWRAGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-C05 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRKYSIHWVRQAPGKGLEWV GDIFPIDGINDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWKAGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-C07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRKYSIHWVRQAPGKGLEWV GDIFPIDGITDYADSMKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWPAGYGYYQDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-C10 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRTYYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPIDGYTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWPAGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-D02 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISHNYIHWVRQAPGKGLEWV GGITPQDGYTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNRLRAEDTAVYY CARGAWSWRAGYGYYLDYWGQ
GTLVTVSS SRP1848-D03 VH EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRYFSIHWVRQAPGKGLEWV GDIFPNDGSTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEETAVYYC ARGHWSWPSGYWYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-D04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISHYSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPRDGITDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLSAEDTAVYYC ARGYWFWRSGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-D05 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISISYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPIDGYTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWRAGYGYYLDYWGQGT LVTVSS
196 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-D07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISKYYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPNDGYTDYADSVKGRFAISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGFWAWRSGYGYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-D09 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNYYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPNDGYTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGSWSWRHGYGYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-D10 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISRNSIHWVRQAPGKGLEWV GWISPNDGTTDYADSVKGRFTISA DGSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGAWSWRSGYGYYIDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-E01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNITNKYIHWVRQAPGKGLEW VGGITPFDGFTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGSWSWPAGYGYYQDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-E02 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIGKYSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPNDGNTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGSWSWRSGYGYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-E03 VH EVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAA
SGFNIGNYYIHWVRQAPGKGLEW VGGITPRDGFTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQVNSLRAEDTAVYY CARGSWSWPAGHSYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-E05 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRVSCAA
SGFNIGVYYIHWVRQAPGKGLEW VGGITPNDGYTDYADSVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGFWAWRSGYGYYLDYWGQ
GTLVTVSS SRP1848-E06 VH EVQLVESGGGLVQPSGSLRLSCAA
SGFNINRYYIHWVRQAPGKGLEW VGGITPNDGYTDYADSVEGRFTTS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGTWSWPSGHSYYLDYWGQ
GTLVTVSS SRP1848-E07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRKSSIHWVRQAPGKGLEWV GEIFPYDGSTDYADNVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGAWSWRSGYGYYIDYWGQGT LVTVSS
197 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-F01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRTYSIHWVRQAPGKGLEWV GSIFPNDGTTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWAWRAGYSYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-F02 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRTYSIHWVRQAPGKGLEWV GSIFPNDGTTDYADSVKGRLTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWQAGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-F04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNYSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPIDGITDYADSVKGRFTISADT SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGSWFWRSGYGYYLDYWGQGTL
VTVSS SRP1848-F05 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISKSSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPNDGSTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWAWRSGYSYFLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-F06 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISLSYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPIDGNTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGFWAWRSGYGYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-F07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNHSIHWVRQAPGKGLEWV GEIYPNDGITDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLSAEDTAVYYC ARGSWDWRSGYSYYLDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-F08 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
GGFNISNHSIHWVRQAPGKGVEW VGEIYPVDGITDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLRMNSLRAEDTAVYY CARGSWYWQSGYSYYLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-F09 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNHYIHWVRQAPGKGLEWV GGISPLDGYTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGAWSWRSGYGYYIDYWGQGT
LVTVSS SRP1848-F10 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNNSIHWVRQAPGKGLEWV GSIFPNDGYTDYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWFWRSGYGYYLDYWGQGT LVTVSS
198 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-F11 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISNNYIHWVRQAPGKGLEWV GGITPIDGNTDYADSVKGRFTISAD TSMNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWYWRAGYGYYLDYWGQG
ALVTVSS SRP1848-G01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISRHSIHWVRQAPGKGLEWV GWIAPNDGSTDYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARGSWAWRSGYSYFLDYWGQG
TLVTVSS SRP1848-G03 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISTYYIHWVRQAPGKGLEWV GGITPSDGFTDYADSVKGRSTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSWSWPSGHGYFLDYWGQGTL
VTVSS SRP1848-G04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIHSTDIHWVRQAPGKGLEWV AYITPAGGATFYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARYPYWFAGYMDYWGQGTLVTV
SS SRP1848-G06 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRSTDIHWVRQAPGKGLEWV AYITPAGGATYYADNVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARQPYWFAGYMDYWGQGTLVT
VSS SRP1848-G07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIHSTDIHWVRQAPGKGLEWV AYITPAGGATWYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARYPFWFAGYMDYWGQGTLVT
VSS SRP1848-G09 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRGTDIHWVRQAPGKGLEWV AYITPAGGATFYADSVKGRFTISAD TSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARHEYWFSGYMDYWGQGTLVTV
SS SRP1848-G10 VH EVQLVESGGGLVQPGSSLRLSCAA
SGFNIRSTDIHWVRQAPGKGLEWV AYITPAGGATYYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARYPYWFAGYIDYWGQGTLVTV
SS SRP1848-G11 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNISSTDIHWVRQAPGKGLEWV AYITPAGGATWYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CARYPYWFSGYMDYWGQGTLVT VSS
199 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: SRP1848-H01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA
SGFNIRTQSIHWVRQAPGKGLEWI GDIFPIDGITDYADSVKGRFTISADT SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGSWSWPSGMDYYLDYWGQGTL
VTVSS SRP2060-E10 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAF
SGFSLSTFGMGVGWVRQAPGKGL EWVSHIWWDDDKYYHPALKGRFT ISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCGRNHFPHYYGSSHWYFNVW
GQGTTVTVSS SRP2060-E05 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAF
SGFSLSTFGMGVGWVRQAPGKGL EWVSHIWWDDDKYYHPALKGRFT VSKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTA VYYCGRNHFPHYYGSSHWYFNV
WGQGTTVTVSS SRP2060-B01 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAL
SGFSLSTFGMGVGWVRQATGKGL EWVSHIWWDDDKYYHPALKGRFT ISKDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAV YYCGRNHFPHYYGSSHWYFNVW
GQGTTVTVSS SRP2060-A06 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAF
SGFSLSTFGMGVGWVRQAPGKGL EWVGHIWWDDDKYYYPALKGRF TISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTA VYYCGRNHFPHYYGSSHWYFDV
WGQGTTVTVSS Trastuzumabe VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA
SQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF
GQGTKVEIK H6D1-LC4 VL EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKA
SQDINSYLSWYQQKPGQAPRLLIY RANRLVDGIPARFSGSGSGTDYTL TISSLEPEDFAVYYCLQYDEFPYTF
GGGTKVEIK H6D1-LC5 VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKA
SQDINSYLSWYQQKPGKAPKLLIY RANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLT ISSLQPDDFATYYCLQYDEFPYTFG
GGTKVEIK HC Constante de ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL IgG1 humana GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
200 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: LC Constante RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV Ckappa de IgG VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ humana SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC HC Constante de AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT IgG1 de camundongo LGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSS
GVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSS TWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKI VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPK PKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDP EVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREE QFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKE FKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTC MITDFFPEDITVEWQWNGQPAENY KNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKS NWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTE
KSLSHSPG LC Constante RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASV Ckappa de IgG de VCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ camundongo NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLT
LTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI
VKSFNRNEC LC Kappa HMTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS
VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC LD Lambda GQPKAAPSVTLFPPSVERLQANKA
TLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSP VKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYL SLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV
EKTVAPTECS Etiqueta FlagHis GSGDYKDDDDKGSGHHHHHH Ligador GGGGSGGGGSGGGGS Ligador AAGSDQEPKSS 1848-B10-VH- scFv MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA (G4S)3-VL ASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLE
WVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA SQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF
GQGTKVEIK 1848-B10-VL- scFv MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR (G4S)3-VH ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL
IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGG SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLE WVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQ GTLVTVSS
201 / 202 SEQ ID Molécula Região Esquema Sequência NO: 1848-B10-VH- scFv-Fc MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA (G4S)3-VL ASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLE
WVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQ GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA SQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKAAGSDQEPKSSDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK 1848-B10-VL- scFv-Fc MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR (G4S)3-VH ASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL
IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTF GQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGG SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLE WVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTIS ADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQ GTLVTVSSAAGSDQEPKSSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK Equivalentes
[00473] A descrição apresentada acima pode abranger múltiplas invenções com utilidade independente. Embora cada uma destas invenções tenha sido descrita em sua(s) forma(s) preferida(s), as modalidades específicas das mesmas, conforme reveladas e ilustradas no presente, não deverão ser consideradas em sentido limitante, pois inúmeras variações são possíveis. A matéria das invenções inclui todas as novas e não óbvias combinações e subcombinações dos vários elementos, características, funções
202 / 202 e/ou propriedades aqui descritos. As reivindicações seguintes salientam particularmente certas combinações e subcombinações consideradas novas e não óbvias. Invenções incorporadas em outras combinações e subcombinações de características, funções, elementos e/ou propriedades podem ser reivindicadas neste pedido de patente, em pedidos de patente que reivindicam a prioridade do mesmo a este pedido de patente ou em pedidos de patente correlatos. Tais reivindicações, quer direcionadas a uma invenção diferente ou à mesma invenção, e quer de âmbito mais amplo, mais estreito, igual ou diferente em comparação às reivindicações originais, são igualmente consideradas abrangidas pelo âmbito da matéria inventiva da presente invenção.
[00474] Uma ou mais características de quaisquer modalidades aqui descritas ou nas figuras podem ser combinadas com uma ou mais características de quaisquer outras modalidades aqui descritas ou nas figuras figures sem se afastar do âmbito da invenção.
[00475] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência conforme seria se cada publicação ou pedido de patente individual tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplos para fins de clareza de entendimento, será rapidamente evidente para qualquer técnico no assunto, à luz dos ensinamentos desta invenção, que certas alterações e modificações podem ser efetuadas à mesma sem se afastar do espírito ou âmbito das reivindicações anexadas.

Claims (54)

1 / 20 REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao receptor alfa de folato (FOLR1) ligado sítio-especificamente a pelo menos uma porção de carga útil (payload), em que o anticorpo compreende um ou mais aminoácidos não naturais em sítios selecionados a partir do grupo que consiste em: HC-F404, HC-K121, HC-Y180, HC-F241, HC-221, LC-T22, LC-S7, LC-N152, LC-K42, LC-E161, LC-D170, HC-S136, HC-S25, HC- A40, HC-S119, HC-S190, HC-K222, HC-R19, HC-Y52 ou HC-S70, de acordo com o esquema de numeração de Kabat, Chothia ou EU.
2. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos aminoácidos não naturais é selecionado a partir do grupo que consiste em p-acetil-L-fenilalanina, O- metil-L-tirosina, -3-(2-naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, uma tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-azido-metil-L- fenilalanina, composto 56, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L- fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-iodo-fenilalanina, p- bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L-fenilalanina e p- propargiloxi-fenilalanina.
3. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um resíduo de um ou mais dos aminoácidos não naturais é ligado à porção de carga útil por meio de um ligador que é hidroliticamente estável.
4. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um resíduo de um ou mais dos aminoácidos não naturais é ligado à porção de carga útil por meio de um ligador que é clivável.
2 / 20
5. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido não natural é um resíduo do composto (30) ou composto (56).
6. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de carga útil é selecionada a partir do grupo que consiste em maitansinas, hemiasterlinas, amanitinas e auristatinas.
7. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de carga útil é selecionada a partir do grupo que consiste em DM1, hemiasterlina, amanitina, MMAF e MMAE.
8. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (i) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 58 e 117; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 176 e 235; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 294; (ii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 19 e 78; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 137 e 196; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 255; (iii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 4 e 63; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 122 e 181; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 240; (iv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 5 e 64; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 123 e 182; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 241;
3 / 20
(v) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 6 e 65; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 124 e 183; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 242; (vi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 7 e 66; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 125 e 184; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 243; (vii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 8 e 67; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 126 e 185; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 244; (viii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 9 e 68; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 127 e 186; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 245; (ix) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 10 e 69; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 128 e 187; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 246; (x) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 11 e 70; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 129 e 188; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 247; (xi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 12 e 71; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 130 e 189; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 248; (xii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 13 e 72; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 131 e 190; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 249; (xiii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 14 e 73; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 132 e 191; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 250;
4 / 20
(xiv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 15 e 74; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 133 e 192; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 251; (xv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 16 e 75; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 134 e 193; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 252; (xvi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 17 e 76; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 135 e 194; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 253; (xvii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 18 e 77; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 136 e 195; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 254; (xviii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 20 e 79; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 138 e 197; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 256; (xix) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 21 e 80; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 139 e 198; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 257; (xx) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 22 e 81; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 140 e 199; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 258; (xxi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 23 e 82; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 141 e 200; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 259; (xxii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 24 e 83; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 142 e 201; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 260;
5 / 20
(xxiii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 25 e 84; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 143 e 202; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 261; (xxiv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 26 e 85; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 144 e 203; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 262; (xxv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 27 e 86; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 145 e 204; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 263; (xxvi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 28 e 87; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 146 e 205; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 264; (xxvii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 29 e 88; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 147 e 206; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 265; (xxviii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 30 e 89; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 148 e 207; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 266; (xxix) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 31 e 90; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 149 e 208; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 267;
6 / 20
(xxx) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 32 e 91; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 150 e 209; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 268; (xxxi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 33 e 92; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 151 e 210; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 269; (xxxii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 34 e 93; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 152 e 211; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 270; (xxxiii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 35 e 94; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 153 e 212; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 271; (xxxiv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 36 e 95; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 154 e 213; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 272; (xxxv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 37 e 96; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 155 e 214; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 273; (xxxvi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 38 e 97; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 156 e 215; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 274; (xxxvii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 39 e 98; uma CDR-H2
7 / 20 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 157 e 216; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 275; (xxxviii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 40 e 99; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 158 e 217; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 276; (xxxix) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 41 e 100; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 159 e 218; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 277; (xl) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 42 e 101; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 160 e 219; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 278; (xli) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 43 e 102; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 161 e 220; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 279; (xlii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 44 e 103; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 162 e 221; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 280; (xliii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 45 e 104; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 163 e 222; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 281; (xliv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 46 e 105; uma CDR-H2 compreendendo uma
8 / 20 dentre SEQ ID NOs: 164 e 223; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 282; (xlv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 47 e 106; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 165 e 224; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 283; (xlvi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 48 e 107; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 166 e 225; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 284; (xlvii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 49 e 108; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 167 e 226; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 285; (xlviii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 50 e 109; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 168 e 227; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 286; (xlix) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 51 e 110; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 169 e 228; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 287; (l) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 52 e 111; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 170 e 229; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 288; (li) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 53 e 112; uma CDR-H2 compreendendo uma
9 / 20 dentre SEQ ID NOs: 171 e 230; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 289; (lii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 54 e 113; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 172 e 231; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 290; (liii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 55 e 114; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 173 e 232; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 291; (liv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 56 e 115; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 174 e 233; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 292; (lv) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 57 e 116; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 175 e 234; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 293; (lvi) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 59 e 118; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 177 e 236; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 295; (lvii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 60 e 119; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 178 e 237; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 296; (lviii) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 61 e 120; uma CDR-H2 compreendendo uma
10 / 20 dentre SEQ ID NOs: 179 e 238; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 297; ou (lix) uma VH que compreende: uma CDR-H1 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 62 e 121; uma CDR-H2 compreendendo uma dentre SEQ ID NOs: 180 e 239; e uma CDR-H3 compreendendo SEQ ID NO:
298.
9. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma VL que compreende: uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 300; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 303; e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 306; ou (b) uma VL que compreende: uma CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 301; uma CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 304; e uma CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 307.
10. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (i) a região VH é SEQ ID NO: 362, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (ii) a região VH é SEQ ID NO: 323, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (iii) a região VH é SEQ ID NO: 308, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (iv) a região VH é SEQ ID NO: 309, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (v) a região VH é SEQ ID NO: 310, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma;
11 / 20
(vi) a região VH é SEQ ID NO: 311, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (vii) a região VH é SEQ ID NO: 312, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (viii) a região VH é SEQ ID NO: 313, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (ix) a região VH é SEQ ID NO: 314, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (x) a região VH é SEQ ID NO: 315, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xi) a região VH é SEQ ID NO: 316, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xii) a região VH é SEQ ID NO: 317, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xiii) a região VH é SEQ ID NO: 318, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xiv) a região VH é SEQ ID NO: 319, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xv) a região VH é SEQ ID NO: 320, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xvi) a região VH é SEQ ID NO: 321, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xvii) a região VH é SEQ ID NO: 322, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xviii) a região VH é SEQ ID NO: 324, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xix) a região VH é SEQ ID NO: 325, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma;
12 / 20
(xx) a região VH é SEQ ID NO: 326, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; ou (xxi) a região VH é SEQ ID NO: 327, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxii) a região VH é SEQ ID NO: 328, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxiii) a região VH é SEQ ID NO: 329, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxiv) a região VH é SEQ ID NO: 330, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxv) a região VH é SEQ ID NO: 331, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxvi) a região VH é SEQ ID NO: 332, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxvii) a região VH é SEQ ID NO: 333, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxviii) a região VH é SEQ ID NO: 334, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxix) a região VH é SEQ ID NO: 335, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxx) a região VH é SEQ ID NO: 336, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxi) a região VH é SEQ ID NO: 337, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxii) a região VH é SEQ ID NO: 338, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxiii) a região VH é SEQ ID NO: 339, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma;
13 / 20
(xxxiv) a região VH é SEQ ID NO: 340, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxv) a região VH é SEQ ID NO: 341, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxvi) a região VH é SEQ ID NO: 342, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxvii) a região VH é SEQ ID NO: 343, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxviii) a região VH é SEQ ID NO: 344, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xxxix) a região VH é SEQ ID NO: 345, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xl) a região VH é SEQ ID NO: 346, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xli) a região VH é SEQ ID NO: 347, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xlii) a região VH é SEQ ID NO: 348, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xliii) a região VH é SEQ ID NO: 349, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xliv) a região VH é SEQ ID NO: 350, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xlv) a região VH é SEQ ID NO: 351, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xlvi) a região VH é SEQ ID NO: 352, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xlvii) a região VH é SEQ ID NO: 353, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma;
14 / 20 (xlviii) a região VH é SEQ ID NO: 354, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (xlix) a região VH é SEQ ID NO: 355, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (l) a região VH é SEQ ID NO: 356, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (li) a região VH é SEQ ID NO: 357, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (lii) a região VH é SEQ ID NO: 358, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (liii) a região VH é SEQ ID NO: 359, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (liv) a região VH é SEQ ID NO: 360, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (lv) a região VH é SEQ ID NO: 361, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma; (lvi) a região VH é SEQ ID NO: 363, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 368, ou uma variante da mesma; (lvii) a região VH é SEQ ID NO: 364, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 368, ou uma variante da mesma; (lviii) a região VH é SEQ ID NO: 365, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 369, ou uma variante da mesma; ou (lix) a região VH é SEQ ID NO: 366, ou uma variante da mesma, e a região VL é SEQ ID NO: 369, ou uma variante da mesma.
11. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um ou mais aminoácidos não naturais em sítios selecionados a partir do grupo de: HC- F404, HC-Y180 e LC-K42, de acordo com o esquema de numeração de Kabat ou EU.
15 / 20
12. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um aminoácido não natural no sítio HC-F404.
13. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende aminoácidos não naturais nos sítios HC-F404 e HC-Y180.
14. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende aminoácidos não naturais nos sítios HC-F404 e LC-K42.
15. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende aminoácidos não naturais nos sítios HC-Y180 e LC-K42.
16. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que um ou ambos os aminoácidos não naturais são selecionados a partir do grupo que consiste em para-azido-metil-fenilalanina e p-azido-metil-L-fenilalanina.
17. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticorpo tem a estrutura do Conjugado P: H2N O
HN
O O H
H
N N
HN N N
N H O H
O O O N N CO2H
N
N
O H
NH O n em que n é um número inteiro de 1 a 6.
18. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticorpo tem a estrutura do Conjugado M:
16 / 20 em que n é um número inteiro de 1 a 6.
19. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticorpo tem a estrutura do Conjugado Q: em que n é um número inteiro de 1 a 6.
20. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região VH de SEQ ID NO: 362, ou uma variante da mesma com 7 ou menos substituições de aminoácidos, e uma região VL de SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma com 7 ou menos substituições de aminoácidos.
21. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região VH de SEQ ID NO: 323, ou uma variante da mesma com 7 ou menos substituições de aminoácidos, e uma região VL de SEQ ID NO: 367, ou uma variante da mesma com 7 ou menos substituições de aminoácidos.
22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos.
17 / 20
23. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um domínio da região constante.
24. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a região constante compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 370, 371 e 372.
25. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
26. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é uma IgA, uma IgD, uma IgE, uma IgG ou uma IgM.
27. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado ou humano.
28. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é aglicosilado.
29. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
30. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é selecionado dentre um fragmento Fv, um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fab’, um fragmento scFv (sFv) e um fragmento scFv-Fc.
31. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento scFv.
18 / 20
32. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o fragmento scFv compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 379-380.
33. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento scFv-Fc.
34. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o fragmento scFv-Fc compreende SEQ ID NO: 381 ou SEQ ID NO: 382.
35. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo apresenta ka entre aproximadamente 2,90×105 M-1×s-1 e 9,64×109 M-1×s-1 ao associar-se com o receptor de folato humano a uma temperatura de 25°C.
36. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo apresenta kd entre aproximadamente 2,28×10-4 s-1 e 4,82×101 s-1 ao dissociar-se do receptor de folato humano a uma temperatura de 25°C.
37. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo apresenta KD entre aproximadamente 2,26×10-11 M e 7,20×10-9 M quando ligado ao receptor de folato humano a uma temperatura de 25°C.
38. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente ao receptor de folato de cinomolgo.
39. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo apresenta KD entre aproximadamente 0,19×10-9 M e 2,84×10-9 M quando ligado ao receptor de folato de cinomolgo a uma temperatura de 25°C.
19 / 20
40. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente ao receptor de folato de camundongo.
41. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo apresenta KD entre aproximadamente 0,5×10-9 M e 9,07×10-8 M quando ligado ao receptor de folato de camundongo a uma temperatura de 25°C.
42. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um conjugado de anticorpo, definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, e instruções para uso do conjugado de anticorpo.
43. Kit de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticorpo é liofilizado.
44. Kit de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um líquido para reconstituição do anticorpo liofilizado.
45. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 0 a 41 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
46. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 0 a 41, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 45.
47. Método de diagnóstico de uma doença ou condição em um indivíduo com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 0 a 41, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 45.
20 / 20
48. Método de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é um câncer.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer de mama.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer de mama triplo-negativo (CMTN).
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer de ovário.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer de pulmão.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC).
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é câncer de endométrio.
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