BR112012008907A2

BR112012008907A2 - fatores de crescimento de fibroblastos quiméricos com especificidade receptora alterada

Info

Publication number: BR112012008907A2
Application number: BR112012008907-2A
Authority: BR
Inventors: Junichiro SONODA
Original assignee: Genentech, Inc
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2020-11-24
Also published as: RU2573896C2; US20110104152A1; JP6016636B2; MX2012004303A; CA2777717C; EP2488643A4; HK1175198A1; MX368790B; WO2011047267A1; CN102656266B; KR20120095392A; CA2777717A1; US20180079806A1; US20140148388A1; KR101952453B1; JP2013507930A; EP2488643A1; US8535912B2; CN102656266A; RU2012119800A

Abstract

FATORES DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS QUIMÉRICOS COM ESPECIFICIDADE RECEPTORA ALTERADA. A presente invenção se refere a novos polipeptídeos com fator de crescimento de fibroblasto quimérico (FGF), novos codificadores de DNA de polipeptídeos quiméricos FGF, e à produção re combinante de polipeptídeos quiméricos FGF para o tratamento terapêutico de distúrbios metabólicos relacionados e outras condições, e à preparação de composições farmaceuticamente ativas incluindo polipeptídeos quiméricos FGF, sendo que as composições contendo propriedades terapêuticas e farmacológicas incluem aquelas associadas ao tratamento de distúrbios metabólicos relacionados e outras condições.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOS QUIMÉRICOS DO FATOR DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTO 19, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEU USO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, SISTEMA DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, ANTICORPO, VETOR E ARTIGO DE FABRICAÇÃO",

REFERÊNCIA CRUZADA APEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade ao pedido de patente U.S. provisório número de série 61/252.074, arquivado em 15 de outubro de 2009, em que a todo é anexado aqui como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se geralmente a novos polipeptídeos designados aqui como polipeptídeos quiméricos com fator de crescimento de fibroblasto (FGF), a novos DNAs que codificam polipeptídeos FGF quiméricos, e à produção recombinante de polipeptídeos FGF quiméricos, e a métodos, composições, e ensaios que utilizam polipeptídeos FGF quiméricos para o tratamento terapêutico de distúrbios metabólicos relacionados e outras condições, e para a produção de composições farmaceuticamente ativas, incluindo polipeptídeos FGF quiméricos, sendo que as composições contendo propriedades terapêuticas e farmacológicas incluem aquelas associadas ao tratamento de distúrbios metabólicos relacionados e outras condições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A família dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGF) inclui a subfamília FGF19, que consiste em FGF21, FGF23 e FGF19 humanos e de FGF15 de camundongo. Diferentemente de outros membros da família FGF, que agem tipicamente em seu tecido de origem de uma maneira parácrina, membros da subfamília FGF19 agem em tecidos distais específicos de uma maneira endócrina. Os efeitos dos membros da família FGF são o resultado de sua ligação, dependente de heparina, a um ou mais membros da família do receptor FGF de tirosina quinase (FGFR). Esta família de receptores inclui quatro membros, cada qual contendo um domínio de tirosina quinase, FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFRA4, bem como duas variantes do encaixe (splice variants) cada qual de FGFR1, FGFR2 e FGFR3. Essas variantes de encaixe (splice variants), que ocorrem no exon 3 de FGFR1, FGFR2 e FGFR3, são designadas variantes "b" e "Cc" (i.e., FGFR1b, FGFR2b, FGFR3c, FGFR1Ic, FGFR2c e FGFR3c, que também são conhecidas como FGFR1(III)b, FGFR2(II)b, FGFR3(Ill)c, FGFR1(Ill)c, FGFR2(Ill)c e FGFR3(Ill)c, respectivamente).

[0004] Membros da subfamília FGF19 têm interferido na regulação de inúmeros processos metabólicos específicos de tecidos em mamíferos. É de particular interesse o FGF19 que foi mostrado para atingir o alvo e que apresenta efeitos em ambos os adipócitos e os hepatócitos. Por exemplo, camundongos tratados com recombinante humano FGF19 (rhFGF19), apesar de se encontrarem sob uma dieta altamente calóricay apresentam taxas metabólicas aumentadas, oxidação de lipídio aumentada, um quociente respiratório menor e perda de peso. Além disso, tais camundongos apresentaram baixos níveis de soro de leptina, insulina, colesterol e triglicerídeos, e níveis normais de glicose no sangue apesar da dieta com nível elevado de gordura, e sem redução do apetite. Camundongos obesos com deficiência de leptina, mas que possuiam incluído um transgen FGF19, mostraram uma perda de peso e uma redução no colesterol e nos triglicerídeos, e não desenvolveram diabetes. Camundongos obesos, diabéticos com falta de leptina, quando injetados com rhFGF19, mostraram uma reversão de suas características metabólicas na forma de perda de peso e redução da glicose do sangue. (Fu, L. et al., Endocrinology 145(6), 2594-2603 (2004); Tomlinson, E. et al,

Endocrinology 143(5), 1741-1747 (2002)).

[0005] Outro membro da subfamília FGF19, FGF21, é expresso primariamente pelo fígado e possui efeitos metabólicos similares àqueles de FGF19, tal como um aumento do metabolismo via seus efeitos em tecido adiposo, perda de peso, baixos níveis de glicose no sangue, e resistência à obesidade e diabetes. (Kharitonenkov, A. et al., J Clin Invest 115(6), 1627-1635 (2005)). Camundongos transgênicos FGF21 também eram resistentes a obesidade induzida por dieta. Além disso, em modelos de roedores diabéticos, a administração de FGF21 reduziu o nível de glicose no sangue e os níveis de triglicerídeos.

[0006] Também foi demonstrado que FGF21 possui um papel na regulação da via do hormônio do crescimento (GH). Os efeitos anabólicos do GH são mediados pelo fator de crescimento 1 semelhante a insulina (IGF-1) o qual é principalmente produzido pelo fígado. O GH induz a transcrição de IGF-1, aumentando assim seus níveis de circulação, através da ativação da Janus quinase 2 (JAK2) pelo receptor GH. Membros fosforilados JAK2 ativados da família dos transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STAT), quando fosforilados, se submetem à translocação nuclear e se ligam aos elementos reguladores de gens alvo, incluindo aqueles do IGF-1. Em particular, STAT5, na sua forma fosforilada, mostrou ter um papel proeminente nesta resposta.

[0007] Os efeitos do GH nos níveis de IGF-1 parecem ser contrabalançados por condições de fome ou de jejum que resultam em baixos níveis de transcrição de IGF-1 e circulação de IGF-1. (Esta sen, J.P. et al., Endocr. Rev. 15, 80—101 (1994)). Esses efeitos em IGF-1 podem ser devidos aos níveis reduzidos de STATS fosforilado. Em particular, ratos em jejum injetados com GH apresentam níveis mais baixos de STATS hepático fosforilado do que ratos em não jejum. (Beauloye, V. et al., Endocrinology 143, 792-800 (2002)). FGF21, que é induzido no fígado sob condições de fome ou de jejum, pode mediar este efeito. Mostrou-se que camundongos transgênicos FGF21 tinham níveis mais baixos de IGF-1 e de STATS fosforilado. (Inagaki, T. et al., Cell Metabolism 8, 77-83 (2008)).

[0008] Os efeitos metabólicos de FGF19 e FGF21 são afetados via sua ligação aos receptores FGFR1c, FGFR2c e FGFR3c, dentre as quais as ligações de FGFR1c e FGFR2c são as mais significativas. Além disso, a ligação de FGF19 e FGF21 a esses receptores requer o co-receptor Klotho-beta. Apesar do predomínio desses receptores FGFR, os efeitos metabólicos de FGF19 e FGF21 são produzidos especificamente para os adipócitos, devido a esta requisição para o co-receptor klotho-beta, que apresenta uma localização específica no tecido.

[0009] Tem-se mostrado também que FGF19 apresenta efeitos que são distintos daqueles do FGF21. Por exemplo, tem-se mostrado que FGF19 regula a produção da bile pelo fígado via seus efeitos específicos no fígado. Em resposta à produção pós prandial da bile, FGF19 regula negativamente a produção da bile através da repressão da transcrição do gen do colesterol 7-alfa-hidroxilase (CYP7A1), a uma taxa de enzima limite na síntese dos ácidos biliáres, e através do estímulo ao enchimento da vesícula bilial. Além disso, FGF19 parece ter efeitos mitogenéticos do fígado que não são observados no que se refere a FGF21. Por exemplo, camundongos transgênicos FGF19 desenvolvem —adenocarcinoma hepático devido à proliferação aumentada e displasia de hepatócitos, e camundongos tratados com rhFGF19 exibem proliferação hepatocítica de hepatócitos. (Nicholes, K. et al., Am J Pathol 160, 2295-2307 (2000).)

[0010] Essas atividades adicionais do FGF19 parecem ser mediadas via sua ligação a FGFR4. FGF19 pode ligar FGFR4 de uma maneira tanto dependente de Klotho-beta quanto independente de

Klotho-beta. Apesar de ter sido mostrado que FGF21 também se liga a FGFRA4 de uma maneira Klotho-beta-dependente, nenhum sinal eficaz resulta da ligação de FGF21 a FGFRA.

[0011] Há uma necessidade de desenvolver novas terapias para o tratamento de distúrbios metabólicos relacionados, tais como diabetes, obesidade, elevado açúcar no sangue, e outros distúrbios relacionados. Também há uma necessidade de se desenvolver novas terapias para tais distúrbios metabólicos relacionados nos quais o crescimento indesejado ou proliferação potencial (p.ex., potencial tumorigênico) de uma tal terapia é eliminado ou reduzido. Há também a necessidade de desenvolver novas terapias para tais distúrbios metabólicos relacionados nos quais o potencial de resistência do hormônio do crescimento a uma tal terapia é eliminado ou reduzido.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um fator de crescimento de polipeptídeo 19 (hFGF19) de fibroblasto humano quimérico. Em alguns modos de execução da presente invenção, a sequência dos polipeptídeos quiméricos inclui uma porção C terminal que inclui uma porção C terminal da sequência de polipeptídeos hFGF19 e, uma porção N terminal que inclui uma porção N terminal da sequência de polipeptídeos hFGF21. Em certos modos de execução, a porção C terminal da sequência de polipeptídeo hFGF19 possui cerca de 45 até cerca de 185 resíduos no comprimento e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos hFGF21 possui cerca de 7 até cerca de 140 resíduos no comprimento.

[0013] Em um outro modo de execução da presente invenção, é fornecido um polipetídeo hFGF19 quimérico, no qual a sequência dos polipeptídeos inclui uma porção C terminal que inclui uma porção C terminal da sequência de polipeptídeos hFGF21 e, uma porção N terminal que inclui uma porção N terminal da sequência de polipeptídeos hFGF19. Em alguns modos de execução, a porção C terminali da sequência de polipeptíidecos hNhFGF21 é de aproximadamente de 8 até aproximadamente 145 resíduos de comprimento, e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos hFGF19 é de aproximadamente 45 até aproximadamente 175 resíduos de comprimento.

[0014] Em um outro modo de execução da presente invenção, um polipeptídeo hFGF19 quimérico é fornecido no qual a sequência do polipeptídeo quimérico inclui uma primeira sequência de polipeptídeos contendo pelo menos uma certa identidade de sequência com a sequência do polipeptídeo hFGF19, e em que uma porção da primeira sequência de polipeptídeos é substituída por uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeos, a segunda sequência de polipeptídeos contendo pelo menos uma certa identidade de sequência em relação à sequência do polipeptídeo hFGF21, tal que a porção substituída da primeira sequência de polipeptídeos é de aproximadamente 3 até aproximadamente 185 resíduos de comprimento.

[0015] Em alguns modos de execução da presente invenção, é fornecido um polipeptídeo hFGF19 quimérico no qual a sequência dos polipeptídeos quiméricos inclui a primeira sequência de polipeptídeo contendo pelo menos uma certa identidade de sequência com a sequência do polipeptídeo hFGF19, e em que uma porção da primeira sequência de polipeptídeos é substituída por mais do que uma porção de uma segunda sequência de polipepitídeos, a segunda sequência de polipeptídeos contendo pelo menos uma certa identidade de sequência com a sequência de polipeptídeos hFGF21. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico hFGF19 compreende uma substituição da alça (loop) B1-B2 do primeiro polipeptídeo, uma substituição do segmento B10-B12 do primeiro polipeptídeo, e/ou uma substituição dos cinco resíduos WGDPI do primeiro polipeptídeo com a alça B1-B2 do segundo polipeptídeo, o segmento B10-B12 do segundo polipeptídeo, e/ou a sequência correspondente GQV do segundo polipeptídeo.

[0016] Em certos modos de execução da presente invenção, o polipeptídeo — quimérico — hFGF19 “compreende a sequência:

HPIPDSSPLLOFGGQAVRARYLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARG QSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDC AFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLP

MLPMVPEEPELRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSF EK (SEQ ID NO:5).

[0017] Em certos modos de execução, o polipeptídeo quimérico hFGF19 da presente invenção é fundido com um segundo polipeptídeo, o segundo polipeptídeo é a porção Fc de uma imunoglobulina, um análogo da porção Fc de uma imunoglobulina e um ou mais fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina. Em certos modos de execução, a imunoglobulina é selecionada do grupo que consiste em: IgG-1, IgG-2, IgG-3, I9gG-4, IgA-1, I9gA-2, IgE, 1gD and IgM. Em alguns modos de execução, a porção Fc é humana ou humanizada. Em alguns modos de execução, a terminação C do polipeptídeo hFGF19 quimérico é fundida à terminação N do segundo polipeptídeo. Em alguns modos de execução, a terminação C do polipeptídeo hFGF19 quimérico é fundida à terminação N do segundo polipeptídeo via um ligador (linker), o ligador é selecionado do grupo que consiste em: um ligador [Gly]n, um ligador [Gly3Ser]m e um ligador [Gly4Ser]m, em que n é um inteiro de 1-30 e m é um inteiro de 1-6.

[0018] A presente invenção inclui polipeptídeos quiméricos hFGF19 que possuem uma vida útil fisiológica que é pelo menos ou aproximadamente a mesma que a da hFGF19 nativa. A presente invenção inclui polipeptídeos quiméricos hFGF19 que possuem uma vida útil fisiológica que é pelo menos ou aproximadamente a mesma que a nativa hFGF21.

[0019] Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico não ativa substancialmente FGFRA4, seja de uma maneira Klotho-beta independente ou Klotho-beta dependente. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico ativa FGFR1IC de uma maneira Klotho-beta dependente

[0020] Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz a massa magra do indivíduo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz substancialmente a massa magra do indivíduo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz a densidade óssea do indivíduo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz substancialmente a densidade óssea do indivíduo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz a capacidade cardíaca do indivíduo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico quando administrado a um indivíduo não reduz substancialmente a capacidade cardíaca do indivíduo.

[0021] Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de polipeptídeo STATB5 fosforilado in vivo. Em certos modos de execução, o polipeptíideo hFGF1I9 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de polipeptídeo STAT5 fosforilado no indivíduo. Em certos modos de execução, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a quantidade de polipeptídeo STAT5 fosforilado é reduzida no indivíduo, mas esta quantidade de polipeptídeo STAT5 fosforilado é maior do que a quantidade de polipeptídeo STATS fosforilado com a administração de hFGF21 nativo ao indivíduo. Em certos modos de execução, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a quantidade de polipetíideo STATS fosforilada é qualquer: de 100% até 5%, de 100% até 10%, de 100% até 20%, de 100% até 30%, de 100% até 40%, de 100% até 50%, de 100% até 60%, de 100% até 70%, de 100% até 80%, de 100% até 90% ou de 100% até 95%, de uma quantidade de polipetídeo STATS fosforilado no indivíduo sem uma tal administração. Em certos modos de execução, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a redução na quantidade de polipetíideo STAT5 fosforilado é menor do que a redução em uma quantidade de polipetídeo STAT5 fosforilado com administração de hFGF21 nativo. Por exemplo, a redução do polipetídeo STATS fosforilado, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, é qualquer uma: de 0% até 5%, de 0% até 10%, de 0% até 20%, de 0% até 30%, de 0% até 40%, de 0% até 50%, de 0% até 60%, de 0% até 70%, de 0% até 80%, de 0% até 90% ou de 0% até 95%, de uma redução na quantidade de polipetíideo STATS fosforilado com a administração de hFGF21 nativo.

[0022] Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade circulante do fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1) in vivo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico, quando administrado a um indivíduo, não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de IGF-1 circulante no indivíduo. Em certos modos de execução, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a quantidade de IGF-1 circulante é reduzida, mas esta quantidade de IGF-1 circulante é maior do que a quantidade de IGF-1 circulante com administração de hFGF21 nativo ao indivíduo. Em certos modos de execução, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a quantidade de IGF-1 circulante é qualquer uma: de 100% até 5%, de 100% até 10%, de 100% até 20%, de 100% até 30%, de 100% até 40%, de 100% até 50%, de 100% até 60%, de 100% até 70%, de 100% até 80%, de 100% até 90% ou de 100% até 95%, da quantidade de IGF-1 circulante no indivíduo sem tal administração. Em certos modos de execução, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a redução na quantidade de IGF-1 circulante é menor do que redução na quantidade de IGF-1 circulante sob administração de hFGF21 nativo. Por exemplo, a redução de IGF- 1 circulante, quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, é qualquer uma de: de 0% até 5%, de 0% até 10%, de 0% até 20%, de 0% até 30%, de 0% até 40%, de 0% até 50%, de 0% até 60%, de 0% até 70%, de 0% até 80%, de 0% até 90% ou de 0% até 95%, de uma redução na quantidade de IGF-1 circulante com administração de hFGF21 nativo.

[0023] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo hFGF19 quimérico da presente invenção; e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0024] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um indivíduo que exibe um ou mais dos fatores: obesidade, diabete do tipo 1, diabete do tipo 2, alto nível de glicose no sangue, síndrome metabólicay ateroesclerose, hipercolesterolemia, derrame, osteoporose, osteoartrite, doença articular degenerativa, atrofia muscular, sarcopenia, massa corporal magra reduzida, calvície, rugas, fadiga elevada, estamina reduzida, função cardíaca reduzida, disfunção do sistema imunológico, câncer,

doença de Parkinson, demência senil, doença de Alzheimer e função cognitiva reduzida, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da presente invenção.

[0025] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de redução da glicose sanguínea de um indivíduo com necessidade de um tal tratamento, sendo que o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da presente invenção .

[0026] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo DNA e contendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo contendo resíduos de aminoácidos de aproximadamente 1 até aproximadamente 190 da SEQ ID NO:5, ou do seu complemento.

[0027] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende a sequência:

CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTEGGGGGCCAA GTCCGGCAGCGGTACCTCTACACO TCECGGCCoCccACGGGCTCOTCE

CAGCTGCTTCCTGCGCATCCGTGCCGACGGCGTCGTGGACTGCGÇ CGCGGGGCCAGAGCGCGCACAGTTTGCTGGAGATCAAGGCAGTC GCTCTGCGGACCGTGGCCATCAAGGGCGTGCACAGCGTGCGGTA CCTCTGCATGGGCGCCEGACGGCAAGATGCAGGGGCTGCTTCAGT ACTCGGAGGAAGACTGTGCTTTCGAGGAGGAGATCCGCCCAGAT GGCTACAATGTGTACCGATCCGAGAAGCACCGCCTCCCGGTCTCE CCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGCTGTACAAGAACAGAGGCT TTCTTCCACTCTCTCATTTCOTGCCCATGCOTGCCCATGGTCCCAGA

GGAGCCTGAGGACCTCAGGGGCCACTTGGAATCTGACATGTTCT CTTCGCCCeTteaGAGACCGACAGCATGGACCCATTTGGGCTTGTCA

CCGGACTGGAGGCCGTGAGGAGTCCCAGCTTTGAGAAG (SEQ |D NO:7), ou uma porção dela.

[0028] Em certos modos de execução, um ácido nucleico isolado da presente invenção compreende ainda uma sequência que codifica os resíduos de aminoácidos que correspondem a uma porção Fc de uma imunoglobulina.

[0029] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um sistema de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende um sistema de expressão ou ácido nucleico da presente invenção.

[0030] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado codificado por uma molécula de ácido nucleico da presente invenção.

[0031] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a preparação de um polipeptídeo isolado que compreende a cultura de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições apropriadas para a expressão do polipeptídeo codificado e recuperação do polipeptídeo codificado da cultura celular. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado preparado por um processo da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] A FIG. 1 mostra a sequência de aminoácidos de polipeptídeos FGF19 humanos (SEQ ID NO:1) e polipeptídeos pre- FGF19 humanos (SEQ ID NO:3);

[0033] A FIG. 2 mostra a sequência de aminoácidos polipeptídeos FGF21 humanos (SEQ ID NO:2) e polipeptídeos pre-FGF21 humanos (SEQ ID NO:4);

[0034] A FIG. 3 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de ligação de um receptor usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção;

[0035] A FIG. 4 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de ligação de um receptor usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção;

[0036] A FIG. 5 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de expressão genética específica de fígado usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção;

[0037] A FIG. 6 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de expressão genérica específica de adipócitos usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção;

[0038] A FIG. 7 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de redução da glicose do sangue usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção;

[0039] A FIG. 8 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de teste de tolerância a glicose usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção;

[0040] A FIG. 9 mostra resultados dos exemplos de um ensaio de atividade usando fusões de imunoglobulina Fc de polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção; e

[0041] A FIG. 10-14 mostra resultados dos exemplos de um ensaio específico de receptor usando polipeptídeos FGF19 quiméricos da presente invenção .

[0042] A FIG. 15 mostra resultados dos exemplos do uso de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção nos níveis da proteína fosforilada Stat5.

[0043] A FIG. 16 mostra resultados dos exemplos do uso de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção na atividade metabólica total das células.

[0044] A Figura 17 mostra que FGFRA4 foi requisitado para regulação do ácido biliático ("BA") mas não para o aperfeiçoamento da tolerância a glicose por FGF19. A Figura 17A mostra o nível de glicose de camundongos do tipo selvagem ("WT") tratados com FGF19 ou PBS e a morte de camundongos (Knockout) ("KO") com FGFR4 em teste de tolerância a glicose. *p<0,05. **p<0,01. O valor p da área sob a curva (AUC) foi de p<0,02 (WT) e p<0,005 (KO). N=6-8. A Figura 17B mostra vários parâmetros metabólicos (peso corporal (g), proporção de fígado/BW (peso corporal) (%), insulina do soro (ng/mL), soro beta-hidroxibutirato ("BHB") (mg/L), lactato do soro (mg/dl), e triglicerídeo do soro (mg/dl)) de camundongos tratados com FGF19 ou PBS WT e FGFR4 KO com eutanásia no dia 7. Os camundongos foram mortos por eutanásia e o soro foi separado depois de 3 horas jejum. N=6-8. A Figura 17C mostra a análise da composição do soro BA em camundongos WT tratados com FGF1I19 ou PBS e camundongos FGFR4 KO. Somente as espécies maiores BA são mostradas. CA: ácido cólico, DCA: ácido desoxicólico, MCA: ácido muricólico, T-: taurino conjugado. A Figura 17D mostra expressão relativa de vários gens hepáticos (Egr-1, c-Fos, AFP, Cyp7a1, Cyp8b, Cyp27a1, Cyp7b, e GK) em camundongos WT e FGFR4 KO tratados por FGF19 ou PBS determinados por tempo real qPCR. N=6-8. Os valores de p para as figuras 17B-17D são: <0,05, **<0,005 (PBS vs FGF19), t<0,05, tHt<0,005 (WT vs FGFR4KO).

[0045] A Figura 18 mostra a identificação de variantes FGF19 com atividade FGFR4 reduzida. A Figura 18A mostra a atividade de luciferase de vaga-lumes relativa normalizada pela atividade de luciferase de renilla (mostrada como unidade de luciferase relativa ("RLU")) de um ensaio de luciferase GAL-EIk1 usando células de rato L6 transfectadas com KLB e FGFR1c ou FGFRA4 e incubadas com meio contendo concentrações crescentes de FGF19 (O) ou FGF21(A). A Figura 18B mostra desenhos (em escala) do FGF19 (topo), FGF21 (fundo), e várias proteínas quiméricas com composição de aminoácido na esquerda. Baseado nos resultados dos ensaios GAL-EIlk1 mostrados na Fig. 18C, cada quimera foi classificada em classe (1), (II) ou (Ill) conforme indicado na direita. Quimeras que não exibiram uma atividade FGFR1c equivalente a FGF21 ou FGF19 quando o meio condicionado foi usado não são mostradas aqui. À Figura 18C mostra a ativação de FGFR1c ou FGFR4 em um ensaio GAL-EIlk-1 usando células L6 cotransfectadas com KLB e/ou FGFR (FGFR1c ou FGFR4) e incubadas com meio condicionado de 293 células transientemente transfectadas com vários construtos de FGF (ver Figura 18B para composições aminoácidas usadas em construtos FGF). Os resultados são mostrados como uma indução fold única (one fold induction) sobre o meio de controle condicionado com células de simulação transfectadas. A Figura 18D mostra a indução fold (fold induction) para ativação FGFR em um ensaio de luciferase GAL-Elk1 usando células de rato L6 transfectadas com FGFR1c, FGFR4 + KLB, ou FGFR4 e incubadas com um meio contendo concentrações crescentes de FGF19 (O) purificado ou FGF19v (V) (o construto ft4 nas figs. 18B e 18C). A figura 18E mostra resultados de ensaios de ligação de fase sólida para FGF19 e FGF19v a FGFRA4 fundido ao fragmento Fc. O diagrama esquemático dos experimentos é mostrado à direita. A Figura 18F mostra que o anticorpo anti-FGF19 usado na Fig. 18E reconheceu FGF19 e FGF19v com afinidade indistinguível (experimento de controle ELISA). O diagrama esquemático para os experimentos é mostrado à direita.

[0046] A Figura 19 mostra a unidade RLU em um ensaio de luciferase GAL-EIk1 em células de rato L6 transfectadas com KLB e FGFR2c ou FGFR3c e incubadas com meio contendo concentrações crescentes de FGF19 (O) ou FGF21(A). Células L6 foram cotransfectadas com vetores de expressão para KLB e o FGFR indicado junto com GAL-EIk1, SV40-Renilla Luciferase, e reporter luciferase com resposta a Gal. Células transfectadas foram incubadas com meio contendo concentrações crescentes de FGF19 ou FGF21 por 6 horas antes dos ensaios de luciferase. Ativação transcripcional foi realizada pela atividade de luciferase relativa normalizada pela atividade de luciferase renilla e expressa como unidade de luciferase relativa (RLU). Esta figura mostra que FGF21 e FGF19 ativaram FGFR2c e FGFR3c na presença de KLB.

[0047] A Figura 20 mostra a ativação de FGFR1c ou FGFR4 em um ensaio GAL-Elk-1 usando células L6 cotransfectadas com KLB e/ou FGFR (FGFR1c ou FGFR4) e incubadas com meio condicionado de 293 células transientemente transfectadas com vários construtos FGF mostrados no eixo X (ver Figura 18B para composições de aminoácidos de construtos FGF usados). Os resultados são mostrados como indução fold (fold induction) por meios de controle condicionados com células transfectadas simuladas. A numeração indicada no eixo X corresponde à numeração do construto mostrado na Fig. 18B.

[0048] A Figura 21 mostra os efeitos de FGF19v em ratos alimentados com ração padrão (chow-fed mice). A Figura 21A mostra a expressão relativa de vários genes (c-Fos, Egr-1, GK, SHP, e Cyp7a1) em ratos FVB injetados (via veia da cauda) com 1mg/kg de FGF21, FGF19, ou FGF19v ou PBS de controle. Os valores p: *<0,05, **<0,01, ***<0,001 (vs PBS). 4 horas após a injeção, MRNA hepático foi preparado de cada camundongo e submetido a análise qQPCR em tempo real para os genes indicados. A Figura 21B mostra a expressão relativa de vários genes (c-Fos, Egr-1, GK, SHP, e Cyp7a1i) em camundongos WT ou FGFR4 KO (KO) (N=5-7) injetados via i.p. com 1Img/kg de FGF21 ou FGF19 ou PBS de controle. Camundongos que jejuaram durante a noite foram injetados via i.p.com proteína FGF ou PBS de controle. 4 horas após-injeção, MRNA hepático foi preparado de cada camundongo e submetido a análise em tempo real de qPCR para os genes indicados. Valores p: *<0,05, **<0,01, ***<0,001. A Figura 21C mostra a proliferação das células HepG2 tratadas com FGF21, FGF19, ou FGF19v em várias concentrações (10 ng/mL, 60 ng/mL, e 200 ng/mL) medido pela intensidade fluorescente (x 10º) em um ensaio do crescimento celular independente de ancoragem. À proliferação das células HepG2 em agar macio foi estimada com base na conversão de resazurina (Alamer Blue), um corante indicador não- fluorescente, em resorufina. A Figura 21D mostra o número de variações (fold change) de hepatócitos Brdu+ em camundongos FVB infundidos com FGF19 ou FGF19v. N=6, *p<0,01, ***p<5E- 5 (vs PBS), ttHp<0,0002 (vs FGF19). Implantou-se em camundongos FVB uma bomba osmótica para infundir continuamente a proteína FGF indicada em 1ng/hora (-0,8mg/kg/dia) (dia O). O camundongo também recebeu diariamente uma injeção de 1Img/kg/dia de proteína FGF (q.d.) e 30mg/kg/dia de BrdU (b.i.d.) iniciando no dia 1. No sétimo dia, foram dissecados fígados e submetidos a um tingimento com anti-BrdU. Os resultados são mostrados como uma indução fold (fold induction) em animais tratados por simulação do número de hepatócitos positivos BrdU por área analisada. A Figura 21E mostra imagens representativas para o estudo mostrado na figura 21C. A Figura 21F mostra a expressão relativa de vários genes (c-Fos, Egr-1, AFP, GK, Cyp7ai and Cyp8b) em camundongos usados nas Figuras 21D e 21E. N=6. *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,001 (vs PBS), ttp<0,05, tHttp<0,005 (vs FGF19).

[0049] A Figura 22 mostra que FGF19v e FGF21 tiveram efeitos metabólicos similares e hiperglicemia melhorada em camundongos ob/ob. Camundongos ob/ob com 11-semanas foram submetidos a implante subcutâneo com uma bomba osmótica para infundir 1ng/hora de proteína FGF (0,4mg/Kkg/dia) ou PBS de controle (N=7). A Figura 22A mostra o peso corporal (g) e a glicose do sangue (mg/dl) em camundongos ob/ob submetidos a infusão por bomba osmótica de 1ng/hora de FGF21 ou FGF19v (0,Amg/kg/dia) ou PBS de controle (N=7). A bomba osmótica foi implantada no dia 0. A Figura 22B mostra níveis de glicose no sangue (mg/dl) em camundongos ob/ob submetidos a infusão com FGF21, FGF19v ou PBS de controle em condição de alimentação aleatória e após jejum durante a noite. À Figura 22C mostra níveis de soro não esterificado de ácidos graxos ("NEFA") em camundongos ob/ob submetidos a infusão com FGF21, FGF19v ou PBS de controle no dia 8. A Figura 22D mostra resultados de teste de tolerância a glicose conduzidos em camundongos ob/ob submetidos a infusão com FGF21, FGF19v ou PBS de controle no dia

6. Camundongos após jejum durante a noite foram injetados i.p. com 1g9/kg de glicose no t=0. A Figura 22E mostra proporções de órgão/peso corporal (%) em camundongos ob/ob submetidos a infusão com FGF21, FGF19v ou PBS de controle no dia 8. A Figura 22F mostra a expressão relativa de vários genes (AFP, IGFBP2, SCD-1, Cyp7A, Cyp8B, UCP-1, MCAD, e SREBP-1c) de vários tecidos (fígado, tecido adiposo marrom ("BAT"), e tecido adiposo branco ("WAT")) em camundongos ob/ob submetidos a infusão com FGF21, FGF19v ou PBS de controle determinados por qPCR. Valores p: *<0,05, **<0,005, ***<0,0005 (vs controle PBS).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0050] A presente invenção fornece novos polipeptídeos FGF19 quiméricos. Em alguns modos de execução da presente invenção, uma sequência de polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção de uma sequência de polipeptideo FGF1I9 e uma porção de uma sequência de polipeptídeo FGF21. Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo FGF19 é um polipeptideo FGF19 (hFGF19) humano processado em que a sequência é definida na SEQ ID NO:1. Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo FGF21 é polipeptídeo FGF21 (hFGF21) humano processado em que a sequência é definida na SEQ ID NO:2. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece novos polipeptídeos FGF19 quiméricos que são ainda fundidos em um domínio imunoglobulina, tal como o domínio Fc.

[0051] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece novos polipeptídeos FGF19 quiméricos que possuem especificidade do receptor alterada. Em certos modos de execução preferidos, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente ou Klotho-beta-independente. Em certos modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção ativa pelo menos um dos FGFR1c, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta- dependente.

[0052] Em alguns modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção pode ter uma ou mais das seguintes características vantajosas: o polipeptídeo não induz substancialmente à proliferação do hepatócito em um indivíduo com sua administração, o polipeptídeo não induz substancialmente à resistência ao hormônio do crescimento em um indivíduo com sua administração, o polipeptídeo não inclui um resíduo que é polimórfico na população, o polipeptídeo possui uma vida útil fisiológica in vivo que é pelo menos ou cerca da mesma que o polipeptídeo FGF19 nativo (tal como polipeptídeo nativo hFGF19), o polipeptídeo possui uma vida útil fisiológica in vivo que é pelo menos ou aproximadamente a mesma que a do polipeptídeo FGF21 nativo (tal como polipeptídeo hrFGF21 nativo), o polipeptídeo não reduz substancialmente a massa magra em um indivíduo com sua administração, o polipeptídeo não reduz substancialmente a densidade óssea em um indivíduo com sua administração, e o polipeptídeo não reduz substancialmente a capacidade cardíaca em um indivíduo com sua administração.

[0053] Outras características vantajosas de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção podem incluir uma ou mais das seguintes: o polipeptídeo reduz a glicose do sangue em um indivíduo, em um indivíduo com necessidade de um tal tratamento; o polipeptídeo ativa pelo menos um dos FGFR1c, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta-dependente; o polipeptídeo não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente; o polipeptídeo não ativa substancialmente FGFR4 em uma maneira Klotho-beta-independente; o polipeptídeo não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de polipetídeo STATS fosforilada em um indivíduo com sua administração; o polipeptídeo quando administrado a um indivíduo, a quantidade de polipetíideo STATS fosforilada no indivíduo é reduzida mas esta quantidade de polipeptídeo STATS fosforilado é maior do que a quantidade de polipetídeo STATS fosforilado com administração do hFGF21 nativo ao indivíduo; o polipeptídeo quando administrado a um indivíduo a redução na quantidade de polipetídeo STATS fosforilado no indivíduo é menor do que a redução na quantidade de polipetídeo STATS fosforilado com administração de hFGF21 nativo no indivíduo; o polipeptídeo não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de polipeptídeos IGF-1 circulante em um indivíduo com sua administração; o polipeptídeo quando administrado a um indivíduo a quantidade de IGF-1 circulante no indivíduo é reduzida mas esta quantidade de circulação IGF-1 é maior do que a quantidade de IGF-1 circulante com a administração do hFGF21 nativo ao indivíduo; o polipeptídeo quando administrado a um indivíduo a redução na quantidade de IGF-1 circulante no indivíduo é menor do que redução na quantidade de IGF-1 circulante sob a administração de hFGF21 nativo no indivíduo; e o polipeptídeo não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de polipeptídeo IGF-1 circulante em um indivíduo contendo uma quantidade normal ou supranormal do GH.

[0054] Em certos modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção possui características vantajosas de ativação de pelo menos um FGFR1c, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta-dependente, e não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente ou Klotho-beta “independente. Em certos modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção tem as características vantajosas de ativação de pelo menos um dos FGFR1c, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta-dependente, não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente ou Klotho-beta -independente, e reduz a quantidade de polipetídeo STATS fosforilado em um indivíduo mas esta quantidade de polipeptídeo STATS fosforilado é maior do que a quantidade de polipetídeo STATS fosforilado com administração de hFGF21 nativo para o indivíduo. Em certos modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção tem as características vantajosas de ativação de pelo menos um FGFR1c, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta-dependente, e não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente ou Klotho-beta -independente, e não inclui um resíduo que é polimórfico na população. Em certos modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção tem as características vantajosas que ativa pelo um dos FGFR1c, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta-dependente, não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente ou Klotho-beta “independente, reduz a quantidade de polipetídeos STATS fosforilados em um indivíduo mas esta quantidade de polipeptídeos STATS fosforilados é maior do que a quantidade de polipetídeos STATS fosforilados com administração de hFGF21 nativo ao indivíduo e não inclui um resíduo que é polimórfico na população.

[0055] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece novos polipeptídeos FGF19 quiméricos que têm especificidade receptora alterada. Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção não ativa substancialmente FGFR4 de uma maneira Klotho-beta-dependente ou Klotho-beta- independente. Em certos modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção ativa pelo menos um dos FGFR1Ic, FGFR2c ou FGFR3c de uma maneira Klotho-beta- dependente.

[0056] Em um outro aspecto, o polipeptídeo quimérico FGF19 não efetua uma atividade de resistência ao hormônio do crescimento em um indivíduo se comparado com a resistência ao hormônio de crescimento efetuada pelo FGF21 nativo. Em um outro aspecto, o polipeptídeo quimérico FGF19 não efetua uma atividade de resistência substancial ao hormônio do crescimento em um indivíduo quando comparado à resistência ao hormônio de crescimento efetuada pelo FGF21 nativo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de polipetídeo STAT5 fosforilada em um indivíduo. Em certos modos de execução quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a quantidade de polipetídeo STATS fosforilada é reduzida no indivíduo mas esta quantidade de polipeptídeo STAT5 fosforilada é maior do que a quantidade de polipetídeo STATS5 fosforilada com administração de hFGF21 nativo ao indivíduo. Em certos modos de execução quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a redução na quantidade de polipetíideo STATS fosforilada é menor do que a redução na quantidade de polipetideo STAT5 fosforilada sob administração de hFGF21 nativo. Em certos modos de execução, o polipeptídeo — quimérico FGFI9 não reduz ou não reduz substancialmente a quantidade de fator de crescimento 1 semelhante a insulina circulante (IGF-1). Em certos modos de execução quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a quantidade de IGF-1 circulante é reduzida mas esta quantidade de IGF-1 circulante é maior do que a quantidade de IGF-1 circulante com a administração do hFGF21 nativo para o indivíduo. Em certos modos de execução quando o polipeptídeo hFGF19 quimérico é administrado a um indivíduo, a redução na quantidade de IGF-1 circulante é menor do que redução na quantidade de IGF-1 circulante sob administração de hFGF21 nativo.

[0057] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece novas moléculas de ácido nucleico isoladas contendo uma sequência que codifica um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção, novos sistemas de expressão que incluem uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, e células hospedeiras que incluem uma molécula de ácido nucleico da invenção ou um sistema de expressão da invenção.

[0058] Em um outro aspecto, a presente invenção inclui anticorpos que podem se ligar especificamente a um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção .

[0059] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece composições farmacêuticas que incluem um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0060] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um indivíduo contra um distúrbio metabólico relacionado através da administração de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção, ou uma formulação farmacêutica dele apropriada. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para efetuar pelo menos um ou mais dos seguintes efeitos em um indivíduo: diminuição da glicose do sangue, redução da obesidade, aumento da taxa metabólica, aumento da oxidação de lipídeos, redução do peso, redução dos níveis de glicose do soro, leptina, insulina, colesterol! e/ou triglicerídios, tratamento do diabetes, e outros efeitos metabólicos, sendo que tais efeitos são devidos à administração ao indivíduo de uma quantidade terapêutica de um polipeptídeo quimérico FGF19 da invenção ou de uma formulação farmacêutica sua.

|. Polipeptídeos Quiméricos FGF19 com Sequências de polipeptídeo N-terminais FGF21

[0061] Em um aspecto da presente invenção, uma sequência de polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção C terminal e uma porção N terminal. A porção N terminal da sequência do polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção N terminal de uma sequência de polipeptídeo FGF21 e uma porção C terminal da sequência do polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção C terminal de uma sequência de polipeptídeo FGF19. Em alguns modos de execução precedentes, a porção C terminal da sequência de polipeptídeo FGF19 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeo FGF21 quimérico são ligados contiguamente. Em alguns dos modos de execução precedentes, uma porção C terminal da sequência de polipeptídeo FGF19 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeo quimérico FGF21 são contiguamente ligados por sobreposição de 1, 2, 3 ou mais resíduos em comum entre as duas porções. Em alguns modos de execução alternativos, a porção C terminal da sequência de polipeptídeos FGF19 e a porção N terminal da sequência polipeptídeo quimérica FGF21 tem um espaçador interveniente de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos aminoácidos.

[0062] Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo FGF19 é um polipeptídeo humano FGF19 (hFGF19) em que a sequência é definida na SEQ ID NO:1 (Fig. 1). Em alguns modos de execução, a porção C terminal da sequência de polipeptídeo hFGF19 é de aproximadamente 45 até aproximadamente 185 resíduos de comprimento, incluindo expressamente os comprimentos de sequência das porções C terminais de hFGF19 mostradas na Tabela 1. Em alguns modos de execução, a porção C terminal da sequência do polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção C terminal da sequência de polipeptídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos na sequência de polipeptídeos hFGF19. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo FGF19 é um polipeptídeo pré-processado humano FGF19 (hFGF19), que inclui a sua sequência de sinal e em que a sequência é definida na SEQ ID NO:3 (Fig. 1).

[0063] Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo FGF21 é polipeptídeo humano FGF21 (hFGF21) em que a sequência é definida na SEQ ID NO:2 (Fig. 2). Em alguns modos de execução, a porção N terminal da sequência de polipeptídeos hFGF21 é de aproximadamente 7 até aproximadamente 140 resíduos em comprimento, expressamente incluindo os comprimentos de sequência da porção N terminal hFGF19 mostrada na tabela 2. Em alguns modos de execução, a porção N terminal da sequência de polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% da identidade de sequência de aminoácidos da sequência de polipeptídeos hFGF21. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo FGF21 é um polipeptídeo FGF21 (hFGF21) humano pré-processado,

que inclui sua sequência de sinal e em que a sequência é definida na SEQ ID NO:4 (Fig. 2).

[0064] Conforme usado aqui, uma porção C terminal, uma porção N terminal, uma porção substituída ou uma porção que substitui uma sequência de polipeptídeos, tais como aquelas sequências de polipeptídeos hFGF19 ou hFGF21, apresenta uma primeira posição e uma posição final. Essas posições correspondem a posições na sequência de polipeptídeos a partir das quais a porção é referenciada. Portanto, a sequência de uma porção definida é a sequência contígua de aminoácidos que iniciam em ou em torno da posição na sequência de polipeptídeos que corresponde à primeira posição, e termina em ou em torno da posição na sequência de polipeptídeos que corresponde à posição final. Em alguns modos de execução, a posição final de uma porção C terminal de um polipeptídeo corresponde a ou aproximadamente ao resíduo final do polipeptídeo. Em alguns modos de execução, a primeira posição de uma porção N terminal de um polipeptídeo corresponde a ou aproximadamente ao primeiro resíduo do polipeptídeo.

[0065] Exemplos de porções C terminais da sequência de polipeptídeos hFGF19 referidos na presente invenção incluem, sem limitação, aqueles que apresentam uma primeira posição que corresponde a ou aproximadamente a qualquer uma das posições 10, 11, 25, 26, 27, 28, 30, 33, 35, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 72, 73, 74, 79, 80, 81, 143, 144, 145 ou 146 da SEQ ID NO:1. Cada porção C terminal dos exemplos também apresenta uma posição final que corresponde a ou aproximadamente à posição 194 da SEQ ID NO:1. A tabela 1 mostra as sequências de porções hFGF19 C terminais de polipeptídeos dos exemplos. Outras porções análogas de hFGF19 também são consideradas aqui.

Tabela 1: Porções C terminais da sequência de pbolipeptídeos hEGF19 dos exemplos ore — regônia de Aminaáddas O EEsaDNO] hFGF19- |[PHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARG Cc10 QSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQOYS

EEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGF LPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGL

VTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |HVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQ cu SAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLOYSE

EDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFL PLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPL

ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |LYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTV [10 C25 AIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYN

VYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEE

PEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- [|YTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA |11 C26 IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNV

YRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPL

ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- ITSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI |12 C27 KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVY

RSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPL

ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK rar sms AR SIDO hFGF19- [SGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIK [13 C28 GVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYR

SEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPL

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KHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |LSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSV [15 c33 RYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHR

LPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHL

ESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |[SCFLRIRADGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRY |16 Cc35 LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLP

VSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLES

DMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |FLRIRADGVVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLC [17 c37 MGADGKMQGLLOYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVS

LSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDM

FSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- [IRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGA |18 C40 DGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSA

KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSS

PLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- — |RADGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGA |19 C41 DGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSA

KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSS

PLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK rar sms SATA SIDO hFGF19- |ADGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGAD |20 C42 GKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK

QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPL

ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |[DGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADG |21 C43 KMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ

RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLE

TDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |GVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGK |22 Cu MQGLLOQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKOR

QLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLET

DSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- — |WDCARGOQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM |23 C45 QGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ

LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETD

SMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- — [QSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMOGLLQOYS |24 Cc52 EEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKORQLYKNRGF

LPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGL

VTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |[SAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMOQGLLQYSE |25 Cc53 EDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFL

PLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLV

TGLEAVRSPSFEK hFGF19- IAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMOQGLLOYSEE |26 C54 DCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLP

LSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVT

GLEAVRSPSFEK rar sms AARS O GDI hFGF19- |[SLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDC |27 C56 AFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLS

HFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGL

EAVRSPSFEK hFGF19- [LLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCA |28 c57 FEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSH

FLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK hFGF19- |LEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAF |29 C58 EEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHF

LPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA

VRSPSFEK hFGF19- [EIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFE |30 C59 EEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFL

PMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA

VRSPSFEK hFGF19- — |GVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYR [31 C72 SEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPED

LRGHLESDMFSSPL ETDOSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF1I9- |VHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRS |32 c73 EKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDL

RGHLESDMFSSPL ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |HSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSE |33 CT4 KHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPL ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- |LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLP |34 C79 VSLSSAKQRQ

LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPL

ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK rare eguênaa de ARES sein hFGF19- |CMGADGKMOGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV |35 C80 SLSSAKQRQ

LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETD

SMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK hFGF19- IMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVS |36 C81 LSSAKQRQ

LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETD

[0066] Exemplos de porções N terminais da sequência de polipeptídeo hFGF21 referida na presente invenção incluem, sem limitação, aquelas que apresentam uma posição final que corresponde a ou aproximadamente a quaisquer das posições 7, 8, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 66, 67, 68, 73, 74, 75, 135, 136, 137 e 138 da SEQ ID NO:2. Cada porção N terminal dos exemplos também possui uma primeira posição que corresponde a ou aproximadamente à posição 1 SEQ ID NO:2. À tabela 2 mostra uma lista de porções N terminais hFGF21 dos exemplos. Outras porções análogas de hFGF21 também são contémpladas aqui.

CC AA hFGF21-N74 — |HPIPDSSPLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT [iiÇ ESEEEAATE hFGF21-N75— |HPIPDSSPLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT ia ESO0EAATAETE hFGF21-N135 |HPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT |70

VGGAADOSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQORPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPG

NKSPHRDPAPRGPAR hFGF21-N136 |HPIPDSSPLLAFGGAVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT |71

VGGAADOSPESLLOLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQORPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPG

NKSPHRDPAPRGPARF hFGF21-N137/ |HPIPDSSPLLOFGGAVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT |72

VGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPG

NKSPHRDPAPRGPARFL rar segunda ATTAiRias IE sean hFGF21-N138 |HPIPDSSPLLAFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT |73

VGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQORPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPG NKSPHRDPAPRGPARFLP

[0067] É pretendido que uma porção C terminal, N terminal ou qualquer outra porção de uma sequência de polipeptídeos aqui definida possa incluir, independentemente e opcionalmente, de um até cinco ou mais resíduos adicionais ou menos na posição inicial ou final definidas. Por exemplo, uma porção C terminal de um polipeptídeo contendo uma primeira posição no resíduo ou próximo ao resíduo 100 pode, independentemente, (i) opcionalmente incluir 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos adicionais N terminais ao resíduo na posição 100, (ii) opcionalmente incluir 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos adicionais C terminais ao resíduo final, (li) opcionalmente iniciar em uma posição 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos C terminais ao resíduo na posição 100 ou (iv) opcionalmente terminar em uma posição 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos N terminais ao resíduo final. Se presente(s), um ou mais dos resíduos adicionais pode(m) ser ou não o(s) mesmo(s) que os resíduos na posição correspondente no polipeptídeo.

[0068] Em alguns modos de execução de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção, a porção N terminal desta sequência inclui uma sequência que é selecionada da porção N terminal da sequência de polipeptídeo hFGF21 listada na tabela 2,e a porção C terminal de sua sequência inclui a sequência que é selecionada dentre as porções C-terminais da sequência de polipeptídeo hFGF19 listada na tabela 1. Em alguns modos de execução, a porção N terminal selecionada hFGF21 e a porção C terminal selecionada hFGF19 são selecionadas independentemente uma em relação à outra. Em alguns modos de execução, a porção da sequência N-terminal hPFGF21 e a porção da sequência C-terminal hFGF19 são selecionadas tal que a terminação C da porção da sequência N terminal e a extremidade N terminal da porção da sequência C terminal possuem pelo menos 1, pelo menos 2 ou pelo menos 3 ou mais resíduos em comum. Em alguns modos de execução, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende a sequência na qual a porção C terminal da sequência de polipeptídeos FGF19 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF21 são contíguas sem aminoácidos intervenientes entre os mesmos. Em alguns modos de execução precedentes, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende uma sequência na qual a porção C terminal da sequência de polipeptídeos FGF19 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF21 são contiguamente unidas por sobreposição de 1, 2, 3 ou mais resíduos em comum entre as duas porções. Em alguns modos de realização alternativos, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende uma sequência a qual inclui a porção C terminal da sequência de polipeptídeos FGF1I9 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF21, e ainda inclui um espaçador interveniente entre os mesmos de 1,2,3,4, ou mais resíduos amino.

[0069] Sequências de polipeptídeos quiméricos FGF19 dos exemplos da presente invenção são mostrados na tabela 3, em que sua porção N terminal inclui uma porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos hFGF21 e sua porção C terminal inclui uma porção C terminal de uma sequência de polipeptídeos hFGF19.

Tabela 3: Sequências de polipeptídeos quiméricos FGF19 dos exemplos pare eqeniadeAmineásos NO O seanio cFGF21/19-1 HPIPDSS 74

PHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCAR GQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQ YSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKN RGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMD

PFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-2 HPIPDSSPLLAFGGQVRARY 5

LYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDG YNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMV PEEPEDLRGHLESDMFSSPL

ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-3 HPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDD 75

PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKG VHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYR SEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPE

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-4 |HPIPDSSPLLQFGGQVRARYLYTDDAQ 76

LSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHS VRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEK HRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-5 | HPIPDSSPLLQFGGQVRARYLYTDDAQAT TT

SCFLRIRADGVVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVR YLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHR LPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGH

LESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK fare Treme ano cFGF21/19-6 | HPIPDSSPLLQFGGQVRARYLYTDDAQQTEA 78

FLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYL CMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLP VSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLE

SDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-7 HPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLE 79

IRADGVVDCARGOQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMG ADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDM

FSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-8 | HPIPDSSPLLQFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIRE

DGVVDCARGOQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGAD GKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSA KQORQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFS

SPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19-9 |HPIPDSSPLLAFGGQVRAQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV |81

GGAAD QSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNR GFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDP

FGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV |82

GGAADQSPE SLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEED CAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLP LSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLV

TGLEAVRSPSFEK rar seguiria de ATiTaádas EE segiDNO cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAFGGQVRAQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV |83 kd GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQIL

GVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVY RSEKHRLPVSLSSAKQROLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEP

EDLRGHLESDMFSSPL ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV |84 12 GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRF

LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHL

ESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAFGGQAVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV |85 13 GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGAL

YGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKS PHRDPAPRGPAR FLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGL

EAVRSPSFEK Il. Polipeptídeos quiméricos FGF19 com sequências de pbolipeptídeos FGF21 C terminal

[0070] Em um segundo aspecto da presente invenção, uma sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 inclui uma porção C terminal e uma porção N terminal. A porção N terminal da sequência do polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos FGF19 e uma porção C terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 inclui uma porção C terminal de uma sequência de polipeptídeo FGF21. Em alguns modos de execução precedentes, a porção C terminal da sequência de polipeptídeos FGF21 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 estão ligadas contiguamente. Em alguns modos de execução precedentes, a porção C terminal de uma sequência de polipeptídeos FGF21 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 estão contiguamente ligadas por sobreposição de 1, 2, 3 ou mais resíduos em comum entre as duas porções. Em alguns modos de execução alternativos, uma porção C terminal de uma sequência de polipeptídeos FGF21 e a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 possuem um espaçador interveniente de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos amino.

[0071] Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo FGF19 é polipeptídeo FGF19 humano (hFGF19) em que a sequência é definida na SEQ ID NO:1. Em alguns modos de execução, a porção N terminal da sequência de polipeptidecos hFGF1I9 é de aproximadamente 45 até aproximadamente 175 resíduos de comprimento, expressamente incluindo os comprimentos da sequência da porção N terminal hFGF19 mostrada na tabela 4. Em alguns modos de execução, a porção N terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 inclui uma porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos que possue pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de polipeptídeos hFGF19.

[0072] Em certos modos de execução preferidos, o polipeptídeo FGF21 é polipeptídeo FGF21 humano (hFGF21) em que a sequência é definida na SEQ ID NO:2. Em alguns modos de execução, a porção C terminal da sequência de polipeptideo hFGF21 é de aproximadamente 8 até aproximadamente 145 resíduos de comprimento, expressamente incluindo os comprimentos da sequência das porções C terminais do hDFGF19 mostrados na tabela 5. Em alguns modos de execução, a porção C terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF21 inclui uma porção C terminal de uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de polipeptídeos hFGF21.

[0073] Exemplos de porções N terminais da sequência de polipeptídeos hFGF19 referida na presente invenção incluem, sem limitação, aqueles que têm uma posição final que corresponde a ou aproximadamente a qualquer uma das posições 9, 10, 24, 25, 26, 27, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 71, 72, 73, 78, 79, 80, 142, 143, 144 e 145 da SEQ ID NO:1. Cada porção N terminal do exemplo também possui uma posição final que corresponde a ou aproximadamente a posição 1 da SEQ ID NO:1. A Tabela 4 mostra a sequência de polipeptídeos de porções N terminais de hFGF19 dos exemplos. Outras porções análogas também são contémpladas aqui.

Tabela 4: Porções N terminais das Sequências de Polipeptídeos hFGF19 dos exemplos e por faro FS REATOR ar

FE EEE [ora prusorcnoGoAR A TsonISSaRAR o

FTA ECT

O hFGF19-N51 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG a hFGF19-N52 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG do hFGF19-N53|RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG |100

A hFGF19-N55| RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG |101

A hFGF19-N56 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG |102

A hFGF19-N57 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG |103

A hFGF19- — RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG [111 N142 VVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQ

GLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLY

KNRGFLPLSH hFGF19- — RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG [112 N143 VVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQ

GLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLY

KNRGFLPLSHF hFGF19- — |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG [113 N144 VVDCARGOQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQ

GLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLY

KNRGFLPLSHFL hFGF19- — [RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG [114 N145 VVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQ

GLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLY KNRGFLPLSHFLP

[0074] Exemplos de porções C terminais da sequência de polipeptídeos hFGF21 referida na presente invenção incluem, sem limitação, aquelas que possuem uma posição final que corresponde a ou aproximadamente a quaisquer das posições 8, 9, 21, 22, 23, 24, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 67, 68, 69, 146, 147, 148 e 149 da SEQ ID NO:2. Cada porção C terminal do exemplo também tem uma posição final que corresponde a ou aproximadamente à posição 181 da SEQ ID NO:2. A tabela 5 mostra uma lista de porções C terminais de hFGF21 dos exemplos. Outras porções análogas de hFGF21 também são consideradas aqui.

Tabela 5: Porções C terminais da sequência de polipeptídeos hFGF21 dos exemplos rare RAE IIS hFGF21-C8 —PLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADO |115

SPESLLOLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFD PEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS hFGF21-C9 — LLOAFGGAQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOS |116

PESLLOLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDP EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS hFGF21-C21 |LYTDDAQQOTEAHLEIREDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPG |117

VIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDG YNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLP

PALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C22 YTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOQSPESLLQLKALKPGV |118

IQILGVKTSRFLCARPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGY NVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPP

ALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C23 TDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVI [119

QILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGY NVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPP

ALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C24 /DDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQ! [120

LGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNV YQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALP

EPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS pars sina Aa SGD hFGF21-C35 |IREDGTVGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ |121

RPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLH LPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPP

DVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C36 |REDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ [122

DVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C37 EDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCAORP |123

DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLP GNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDV

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C38 |DGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORP [124

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C39 |GTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPD [125

GALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPG NKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVG

SSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C40 |TVGGAADOQSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGA | 126

LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSS

DPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C47 /QSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHF [127

DPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDP APRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMV

GPSQGRSPSYAS pre reinar Aa EaD hFGF21-C48 |SPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFD [128

PEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS hFGF21-C49 |PESLLOLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQORPDGALYGSLHFDP |129

EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS hFGF21-C51 |SLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCARPDGALYGSLHFDPEA |130

CSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRG PARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQ

GRSPSYAS hFGF21-C52 |LLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEAC |131

SFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGP ARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQG

RSPSYAS hFGF21-C53 |LQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACS [132

FRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPA RFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGR

SPSYAS hFGF21-C54 |QLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSF [133

RELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPAR FLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRS

PSYAS hFGF21-C67 |GVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY [134

QSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPE

PPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS rare seguiria de ARSSR E sEgD1O hFGF21-C68 VKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQ [135

SEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEP

PGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C69 KTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYOS |136

EAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPP

GILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C74 |LCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHG |137

LPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAP

QPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C75 (CORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGL |138

PLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAP

QPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C76 QRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPL [139

HLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQP

PDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS hFGF21-C146 FLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRS |140 us sv vs hFGF21-C147 |LPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSP |141

AA hFGF21-C148 PLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPS | 142 ns in ve hFGF21-C149 |LPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSY | 143 uu ss css

[0075] Em alguns modos de execução de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção, a porção N terminal de sua sequência inclui uma sequência que é selecionada das porções de sequência de polipeptídeos hFGF19 listados na tabela 4, e uma porção C terminal de sua sequência inclui a sequência que é selecionada dentre as porções de sequências de polipeptídeos hFGF21 listadas na tabela 5. Em alguns modos de execução, a porção N terminal hFGF19 selecionada e a porção C terminal hFGF21 selecionada são selecionadas independentemente uma da outra. Em alguns modos de execução, a porção da sequência N terminal de hFGF19 e a porção da sequência C terminal de hFGF21 são selecionadas tal que a terminação C da porção da sequência N terminal e o final da terminação N da porção da sequência C terminal possuem pelo menos 1, pelo menos 2 ou pelo menos 3 ou mais resíduos em comum. Em alguns modos de execução, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende a sequência na qual a porção N terminal de uma sequência de polipeptídeo FGF19 e uma porção C terminal da sequência de polipeptídeos quiméricos FGF21 são contíguas sem a interveniência de aminoácidos entre as mesmas. Em alguns modos de execução, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende a sequência na qual a porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos FGF19 e uma porção C terminal da sequência de polipeptídeos quimérica FGF21 são contiguamente unidas por sobreposição de 1, 2, 3 ou mais resíduos em comum entre as duas porções. Em alguns modos de execução alternativos, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende uma sequência que inclui a porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos FGF1I9 e a porção C terminal da sequência de polipeptídeos FGF21 quimérica, e ainda inclui um espaçador interveniente entre os mesmos de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos amino.

[0076] Sequências dos exemplos de polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção são mostradas na tabela 6, em que sua porção N terminal inclui uma porção N terminal de uma sequência de polipeptídeos hFGF19 e sua porção C terminal inclui uma porção C terminal de uma sequência de polipeptídeo hFGF21.

Tabela 6: Sequências de polipeptídeos quiméricos FGF19 dos exemplos cFGF19/21-1 RPLAFSDAG 144

PLLAFGGQVRAQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADO SPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFD PEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS cFGF19/21-2 RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRH 145

LYTDDAQQOTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPG VIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDG YNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLP

PALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21-3 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLR — [146

IREDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ RPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLH LPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPP

DVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21-4 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR 147

A DGTVGGAADOSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORP DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLP GNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDV

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21-5 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR | 148

ADGVVDCARG QSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHF DPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDP APRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMV

GPSQGRSPSYAS cFGF19/21-6 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR | 149

ADGVVDCARGOSAH SLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEA CSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRG PARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQ

GRSPSYAS cFGF19/21-7 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR [150

ADGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIK GVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY QSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPE

PPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21-8 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR [151

ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRY LCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHG LPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAP

QPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21-9 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |152

ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMG ADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSH FLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRS

PSYAS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |271

ADGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMG (Construto 8, ADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSL mostrado na, SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLP figura 188) |LPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSY

AS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR 272 id ADGVVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGV (Construto 9, KTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQS mostrado najE figura 188) |AHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPG

ILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR /273 12 ADGVVDCARGQSAHSLL (Construto 10, QLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDPEACSF mostrado na RELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPAR figura 188) |FLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRS

PSYAS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |274 13 ADGVVDCARGQOS (Construto 11) PESLLOLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALYGSLHFDP mostrado na EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP figura 188) IRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |275 14 ADG (Construto 12) TVGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQORPDGA mostrado na LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK figura 188) |SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSS

DPL

SMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |276

EDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORP (Construto 13) DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLP mostrado na GNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDV figura 188) — |ESSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21- |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYT 277 16 DDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQ! (Construto 14 LGVKTSRFLCARPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNV mostrado na/Y figura 188) |OSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPE

PPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF19/21- [RPLAFSDAGP 278 7 LLAFGGQAVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOS (Construto 15) PESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDP mostrado na EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP figura 188) IRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP

SQGRSPSYAS Ill. Polipeptídeos FGF19 quiméricos com sequências de polipeptídeo FGF21 substitutas

[0077] Em um terceiro aspecto da presente invenção, uma sequência de polipeptídeos quiméricos FGF19 inclui uma primeira sequência de polipeptídeos na qual uma porção de uma primeira sequência de polipeptídeos é substituída por uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeos. Em modos de execução preferidos, o primeiro polipeptídeo é polipeptídeo humano FGF19 (hFGF19) em que a sequência é definida na SEQ ID NO:1. Em alguns modos de execução, a primeira sequência de polipeptídeos é uma sequência de polipeptídeos que possui pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de polipeptídeos hFGF19.

[0078] Em certos modos de execução preferidos, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo humano FGF21 (hFGF21) em que a sequência é definida na SEQ ID NO:2. Em alguns modos de execução, a sequência de polipeptídeo FGF21 é uma sequência de polipeptídeo que possui pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de polipeptídeos hFGF21.

[0079] Em alguns modos de execução, a sequência dos polipeptídeos — quiméricos = FGF19 inclui uma sequência de polipeptídeos hFGF19 na qual a porção a ser substituída é de um grupo que inclui, sem limitação, porções que apresentam (i) uma primeira posição que corresponde a ou a aproximadamente quaisquer uma das posições 1, 10, 11, 17, 18, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 63, 72, 73, 74, 79, 80, 81, 143, 144, 145 e 146 na SEQ ID NO:1, e (ii) uma posição final que corresponde a ou a aproximadamente quaisquer uma das posições 9, 10, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 36, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 66, 71, 72, 73, 78, 79, 80, 142, 143, 144, 145 e 194 na SEQ ID NO:1, tal que a posição final é C terminal para a primeira posição e as posições são selecionadas independentemente. A tabela

7 mostra uma lista de porções da sequência de polipeptídeos hFGF19 dos exemplos que devem ser substituídas por uma porção da sequência de polipeptídeo hFGF21.

Tabela 7: Porções substituídas da sequência de polipeptídeos hFGF19 dos exemplos pare seguem de Amiesidos NO) ssaito hFGF19-810-52 [PHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCA |161

NM A hFGF19-810-58 PHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCA | 162 CC iss ui hFGF19-810-73 PHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCA | 163 CC Asa o)

par senindeAmiaásios ve) O ssapto hFGF19-S25-73 |LYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL [180

MMA

[0080] A porção substituída da sequência de polipeptídeos hFGF19 é substituída por uma porção da sequência de polipeptídeos hFGF21. Porções substitutas da sequência de polipeptídeos hFGF21 dos exemplos incluem, sem limitação, porções que possuem (i) uma primeira posição que corresponde a ou aproximadamente a quaisquer uma das posições 1, 8, 9, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 58, 67, 68, 69, 74, 75, 76, 136, 137, 138 e 139 na SEQ ID NO:2, e (ii) uma posição final que corresponde a ou a aproximadamente a quaisquer uma das posições 7, 8, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 61, 66, 67, 68, 73, 74, 75, 135, 136, 137, 138 e 181 na SEQ ID NO:?2, tal que a posição final é C terminal para a primeira posição e as posições são selecionadas independentemente. A tabela 8 mostra uma lista de porções da sequência de polipeptídeos hFGF21 dos exemplos que deverão substituir uma porção da sequência de polipeptídeos hFGF19.

Tabela 8: Porções substitutas da sequência de polipeptídeos hFGF21 dos exemplos pm Ss oo hFGF21-S8-53 |PLLOFGGQAVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOS 190 Cu | hFGF21-S8-68 |PLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADOS |191 sv sato |

A a

[0081] Em alguns modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 inclui a sequência de polipeptídeo de hFGF19 com uma porção de sua sequência, tal como uma sequência selecionada das porções da sequência de polipeptídeos hFGF19 listada na tabela 7, substituída por uma porção da sequência de polipeptídeos hFGF21, tal como as porções de sequência listadas na tabela 8. Em alguns modos de execução, a porção N terminal hFGF19 selecionada e a porção C terminal hFGF21 selecionada, são selecionadas independentemente uma da outra. Em alguns modos de execução, a porção hFGF19 a ser substituída inclui o resíduo N terminal do polipeptídeo hFGF19. Em alguns modos de execução, a porção hFGF19 a ser substituída inclui o resíduo C terminal do polipeptídeo hFGF19. Em alguns modos de execução, a porção hFGF21 substituta incluio resíduo N terminal do polipeptídeo hFGF21. Em alguns modos de execução, a porção hFGF21 substituta inclui o resíduo C terminal do polipeptídeo hFGF21. Em alguns modos de execução, a porção hFGF19 a ser substituída inclui o resíduo N terminal do polipeptídeo hFGF19, e a porção hFGF21 substituta também inclui o resíduo N terminal do polipeptídeo hFGF21. Em alguns modos de execução, a porção hFGF19 a ser substituída inclui o resíduo C terminal do polipeptídeo hFGF19, e a porção hFGF21 substituta também inclui o resíduo C terminal do polipeptídeo hFGF21.

[0082] Em alguns modos de execução, a porção da sequência hFGF19 e a porção da sequência hPFGF21 são selecionadas tal que pelo menos uma das suas respectivas extremidades (p.ex, a extremidade N terminal da porção hFGF19 e a extremidade N terminal da porção hFGF21, a extremidade C terminal da porção hFGF1I9 e a extremidade C terminal da porção hFGF21, ou ambas) possuem pelo menos 1, pelo menos 2 ou pelo menos 3 ou mais resíduos em comum nas respectivas extremidades correspondentes. Em alguns modos de execução, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende a sequência na qual a porção substituinte da sequência de polipeptídeos hFGF21 é contígua à sequência de polipeptídeos hFGF19 remanescente por sobreposição de 1, 2, 3 ou mais resíduos em comum entre as duas porções.

[0083] Em alguns modos de execução, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende à sequência na qual a porção da sequência de polipeptídeos hFGF21 é substituída na sequência de polipeptídeos hFGF19 tal que a sequência de polipeptídeos hFGF1I9 e hFGF21 estejam contíguas e sem interposição aminoácidos adicionais, intervenientes entre eles. Em alguns modos de execução alternativos, a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende a sequência na qual a porção da sequência de polipeptídeo hFGF21 é substituída na sequência de polipeptídeos hFGF19 tal que a sequência de polipeptídeos — quiméricos FGF1I9 ainda inclui um espaçador interveniente entre eles de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos amino entre as sequências hFGF19 e hFGF21.

[0084] Sequências de polipeptídeos quiméricos FGF19 dos exemplos da presente invenção são mostrados na tabela 9, na qual a porção de hFGF19 é substituída por uma porção de hFGF21.

Tabela 9: Sequências de polipeptídeos quiméricos FGF19 dos exemplos pane sgina de Amreásas E sean cFGF19/21/19-1º |RPLAFSDAGPLLOFGGQAVRARYLYTSGPHGLSSCFLRIR 208

ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLC MGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHR LPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDL

RGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-2º |RPLAFSDAGPLLOFGGQAVRARYLYTDDPHGLSSCFLRIR 209

RGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-3 |RPLAFSDAGPLLQOFGGQVRORYLYTDDAQGLSSCFLRIR /210

RGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-4 |RPLAFSDAGPLLQOFGGQVROARYLYTDDAQLSSCFLRIRA /211

DGVVDCARGOQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCM GADGKMQGLLOYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-5 |RPLAFSDAGPLLQFGGQVRARYLYTDDAQQTSCFLRIRA [212

DGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCM GADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK por same sab cFGF19/21/19-6. |RPLAFSDAGPLLOFGGQVROQRYLYTDDAQQTEAFLRIRA [213

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-7/ |RPLAFSDAGPLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIRA [214

DGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCM GADGKMQGLLOYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-8 |RPLAFSDAGPLLOFGGQVROARYLYTDDAQQTEAHLEIRE [215

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-9º [|RPLAFSDAGPLLQOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIRE [216

DGTVGGAADOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCM GADGKMQGLLOYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-10 |[RPLAFSDAGPLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIRE [217

DGTVGGAADQOSPESLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCM GADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK po same sab cFGF19/21/19-11 [|RPLAFSDAGPLLOFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIRE [218

DGTVGGAADOSPESLLOQLKALKPGVIQILGVHSVRYLCM GADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRL PVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR

GHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-12 |RPLAFSDAGPHVHYGWGGQVRQRYLYTSGPHGLSSCF 219

LRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVR YLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSE KHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEP EDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE

K cFGF19/21/19-13 |RPLAFSDAGPHVHYGWGGQVRQRYLYTDDPHGLSSCF 220

LRIRADGVVDCARGOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVR YLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSE KHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEP EDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE

K cFGF19/21/19-14 [|RPLAFSDAGPHVHYGWGGQVRQRYLYTDDAQGLSSCF 221

K cFGF19/21/19-15 |[RPLAFSDAGPHVHYGWGGQVRQARYLYTDDAQLSSCFL /222

RIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRY LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEK HRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPE

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK po sí sab cFGF19/21/19-16 |RPLAFSDAGPHVHYGWGGQVRQRYLYTDDAQQTSCFL 223

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-17 |RPLAFSDAGPHVHYGWGGQVRQRYLYTDDAQQTEAFL 224

RIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRY LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEK HRLPVSLSSAKQORQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPE

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-18 |[RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRYLYTSGPHGLSSCFL 225

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-19 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRYLYTDDPHGLSSCFL 226

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-20 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRYLYTDDAQGLSSCFL [227

DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK pa sam sab cFGF19/21/19-21 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRYLYTDDAQLSSCFLRI [228

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LRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK cFGF19/21/19-22 |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRYLYTDDAQQTSCFLRI 229

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RIRADGVVDCARGOSAHSLLEIKALKPGTVAIKGVHSVRY LCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEK HRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPE DLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK

[0085] Em alguns modos de execução de qualquer dos hFGF19 quiméricos, o polipeptídeo hFGF19 quimérico inclui uma primeira sequência de polipeptídeos contendo pelo menos uma certa identidade de sequência com a sequência do polipeptídeo hFGF19, e em que uma porção da primeira sequência de polipeptídeos é substituída por mais do que uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeos, a segunda sequência de polipeptídeos contendo pelo menos uma certa identidade de sequência com a sequência do polipeptídeo hFGF21. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico ainda compreende uma substituição da alça B1-B2 do primeiro polipeptídeo, uma substituição do segmento B10-B12 do primeiro polipeptídeo, e/ou uma substituição dos cinco resíduos WGDPI (SEQ ID NO:287) do primeiro polipeptídeo com a alça (loop) B1-B2 do segundo polipeptídeo, o segmento B10-B12 do segundo polipeptídeo, e/ou a sequência correspondente GQV do segundo polipeptídeo. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico ainda compreende uma substituição da alça B1-B2 (50-57 resíduos de aminoácidos de FGF19 (SGPHGLSS (SEQ ID NO:288)) de FGF19 com a alça B1-B2 (resíduos de aminoácidos 51-57 de FGF21 (DDAQQTE (SEQ ID NO:289)) de FGF21. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo hFGF19 quimérico ainda compreende uma substituição do segmento B10-B12 (resíduos aminoácidos 146- 162 de FGF19 (SSAKORQLYKNRGFLPL (SEQ ID NO:290)) de FGF19 com o segmento B10-B12 (resíduos aminoácidos 147-161 de FGF21 (PGNKSPHRDPAPRGP (SEQ ID NO:291)) de FGF21. Em alguns modos de execução, os polipeptídeos hFGF19 quiméricos ainda compreendem uma substituição dos resíduos aminoácidos 38- 42 (WGDPI (SEQ ID NO:287)) de FGF19 por resíduos aminoácidos 41-43 (GQV) de FGF21.

[0086] Polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção, e particularmente suas composições farmaceuticamente ativas e métodos que usam os referidos polipeptídeos quiméricos FGF19 no tratamento terapêutico de uma ou mais doenças, condições, etc. listadas ou descritas aqui ou conhecidas na arte possuem certas vantagens sobre o uso tanto de FGF19 (p.ex., hDFGF19) nativo ou de FGF21 (p.ex., hnFGF21) nativo.

[0087] Em alguns modos de execução, polipeptídeos FGF19 quiméricos podem ser menos imunogênicos do que um ou ambos os seus FGFs parentais nativos. Um FGF19 nativo e/ou FGF21 (tal como hFGF19 ou hFGF21) podem estar presentes na população em mais de uma variação alélica, em que há pelo menos um resíduo aminoácido que é diferente entre as formas alélicas. Por exemplo, hFGF21 é conhecido por ter um polimorfismo na posição 146 na forma madura, em que este resíduo pode ser leucina (como na Fig. 2 e SEQ ID NO:2) ou prolina em diferentes alelos. Tal polimorfismo pode limitar a utilidade do hFGF21 nativo como uma composição terapêutica. Por exemplo, quando se administrta um polipeptíideo FGF1I9 a um indivíduo, no qual o FGF19 endógeno do indivíduo possui uma sequência diferente do que a FGF19 administrada, pode resultar uma resposta imune do indivíduo ao hFGF21a ser administrado. Portanto, em alguns modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção pode incluir uma porção da sequência de polipeptídeos hFGF21 e uma porção da sequência de polipeptídeos hFGF19, sendo que ambas as porções incluem somente porções das respectivas sequências de polipeptídeos que são não polimórficos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por substituição de uma porção da sequência polimórfica de um FGF com a porção análoga, não polimórfica do outro polipeptídeo FGF. Por exemplo, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção, tal como cFGF21/19-2 (cf. tabela 3) que inclui uma porção de hFGF21 mas não inclui a posição 146, não tem polimorfismo nesta posição. Desta maneira, polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção podem ser vantajosamente menos imunogênicos, e portanto podem ser vantajosamente mais apropriados para a administração a uma ampla gama de indivíduos.

[0088] Em alguns modos de execução, polipeptídeos FGF19 quiméricos podem ser menos tumorigênicos do que um ou ambos os seus FGFs nativos correspondentes. Em particular, polipeptídeos quiméricos FGF19 podem ser menos tumorigênicos do que os hFGF19 nativos. hFGF19 nativo, conforme discutido anteriormente, demonstra atividade tumorigênica potencial via sua ligação a FGFRA4. Esta atividade tumorigênica aparece separável dos efeitos metabólicos de hFGF19, que, como hFGF21, são efetuados via ligação dependente de Klotho-beta a FGFR1c, FGFR2c e/ou FGFR3c. Em alguns modos de execução, os polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção incluem uma porção da sequência de polipeptídeos hFGF19 que não inclui o motivo do efetor FGFRA, e ao invés disso são substituídos por uma sequência correspondente de hFGF21. Em alguns modos de execução, os polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção não se ligam mais substancialmente a FGFR4 e/ou não ativam substancialmente FGFR4. Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos da presente invenção FGF19 não se ligam mais substancialmente a e/ou não ativam substancialmente um receptor, tal como FGFRA4, de uma maneira Klotho-beta-independente. Desta maneira, os polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção podem ser vantajosamente menos tumorigênicos, e portanto podem ser vantajosamente mais apropriados para administração a uma ampla gama de indivíduos.

[0089] Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF19 podem não efetuar resistência de hormônios do crescimento (GH), ou demonstrar substancialmente menos atividade de resistência do GH, do que um ou ambos dos seus FGFs nativos correspondentes. Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF19 podem ter menos atividade de resistência GH do que FGF21 nativo, tal como hFGF21 nativo. O GH normalmente possui efeitos de crescimento e metabólicos que são mediados pelo fator de crescimento 1 semelhante a insulina (IGF-1). A ligação do GH ao seu receptor resulta na ativação de Janus kinase 2 (JAK2), que então fosforila a proteína STAT5. A STAT5 fosforilada é translocada para o núcleo e se liga a elementos de resposta reguladora dos genes que promovem a expressão IGF-1.

[0090] Os efeitos do GH em indivíduos podem ser atenuados com a elevação dos níveis de FGF21 ou por jejum ou fome prolongados, o que eleva também os níveis de FGF21. Os efeitos da resistência do GH em indivíduos incluem a conservação da energia, aumento do torpor, diminuição da temperatura corporal, redução da atividade física, inibição do crescimento, perda de massa magra, e indução de cetona na síntese corporal. O hFGF21 nativo afeta a resistência do GH, por exemplo, por redução do nível de IGF-1 que é normalmente induzido pelo GH. Sem estarmos limitados à teoria, esta resistência, esta atividade de resistência do GH do hFGF21 pode ser mediada por sua capacidade de reduzir a quantidade de polipetídeos STAT5 fosforilados e, como um resultado, reduzir a translocação do STATS fosforilado para o núcleo e, deste modo, reduzir a expressão de IGF-1, resistindo assim aos efeitos do GH.

[0091] Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção não reduzem ou não reduzem substancialmente a quantidade de polipeptídeos STATS fosforilados. Desta maneira, polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção podem demonstrar menos ou substancialmente nenhuma atividade de resistência contra GH, e portanto ser vantajosamente mais apropriados para administração a uma gama de indivíduos.

[0092] Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF19 não substancialmente promovem ancoragem do crescimento independente de células. Em alguns modos de execução, polipeptídeos — quiméricos FGF19 podem não promover substancialmente o aumento da atividade metabólica e/ou a proliferação de células em um meio ambiente que requer oO crescimento independente de ancoragem. Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF1I9 podem promover o crescimento de células independentes da ancoragem até um certo ponto que é menor do que o crescimento correspondente de células independentes da ancoragem de FGF19 nativo. Em alguns modos de execução, quiméricos polipeptídeos FGF19 podem promover uma atividade metabólica aumentada e/ou a proliferação de células em um meio ambiente que requer um crescimento independente de ancoragem até um limite que é menor do que o efeito correspondente do FGF19 nativo. Como o fator de ancoragem independente é uma das características definidoras das células transformadas, tais polipepetídeos quiméricos FGF19 da presente invenção, que não promovem o crescimento de células independentes da ancoragem, ou não promovem substancialmente uma atividade metabólica aumentada, e/ou a proliferação de células em um ambiente que requer o crescimento independente da ancoragem, podem ser menos capazes de promover ou de aumentar diferencialmente o crescimento e/ou a atividade metabólica das células transformadas, e portanto podem ser vantajosamente mais apropriados para administração a uma vasta gama de indivíduos. WV. Definições

[0093] Os termos "polipeptídeo FGF19", "proteina FGF19" e "FGF19" quando empregados aqui abrangem um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que é a mesma de uma sequência nativa de um membro da família do fator de crescimento de fibroblastos 19. Membros de uma tal família incluem a sequência de aminoácidos 194 humanos FGF19 (hFGF19) conforme fornecido pela SEQ ID NO:1 e na FIG. 1. Um polipeptídeo FGF19 pode ser isolado da natureza ou pode ser preparado por meios recombinantes e/ou sintéticos. Um polipeptídeo FGF19 abrange especificamente formas truncadas ou secretadas que ocorrem naturalmente, formas variantes que ocorrem naturalmente (por exemplo formas alternativamente entrançadas (spliced)) e variantes alélicas de FGF19 que ocorrem naturalmente. Um — polipeptideo FGF1I9 também abrange especificamente ambas as formas processadas e não processadas, tais como, por exemplo, a sequência de aminoácidos 216 do polipeptídeo pré-humano FGF19, conforme fornecido pela SEQ ID NO:3 e na FIG.1.

[0094] Os termos "polipeptídeo FGF21", "proteina FGF21" e "FGF21" quando empregados aqui abrangem um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que é a mesma que a sequência nativa de um membro da família do fator de crescimento 21 fibroblástico. Membros de tais famílias incluem a sequência de aminoácidos 181 de FGF21 (hFGF21) humano como fornecido pela SEQ ID NO:2 e na FIG. 2. Um polipeptídeo FGF21 pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. Um polipeptídeo FGF21 abrange especificamente formas truncadas ou secretadas que ocorrem naturalmente, formas variantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas alternativamente unidas, entrançadas (spliced) e variantes alélicas de FGF21 que ocorrem naturalmente. Um polipeptídeo FGF21 também abrange especificamente ambas as formas processadas, e não processadas de FGF21, tais como por exemplo a sequência de aminoácidos 209 do polipeptídeo pré-humano FGF21 como fornecido pela SEQ ID NO:4 e na FIG.2.

[0095] Os termos "polipeptídeo FGF" e "proteína FGF" quando usados aqui abrangem um polipeptídeo contendo a sequência nativa de um membro da família FGF, tal como FGF1, FGF2, FGF3, FGFA, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, humanos e seus homólogos mamíferos. Uma sequência nativa de um dado polipeptídeo FGF pode ser isolada da natureza ou pode ser produzidoa por meios recombinantes e/ou sintéticos. À sequência nativa de um dado FGF especificamente abrange formas truncadas ou secretadas que ocorrem naturalmente, formas variantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas alternativamente entrelaçadas, suas variantes alélicas que ocorrem naturalmente, e ambas as formas processadas e não processadas de FGF.

[0096] Os termos "polipeptídeos quiméricos" e "proteina quimérica" quando usados aqui abrangem um polipeptídeo contendo uma sequência que inclui pelo menos uma porção de uma sequência de comprimento total da primeira sequência de polipeptídeos e pelo menos uma porção de uma sequência de comprimento total de uma segunda sequência de polipeptídeos, em que o primeiro e segundo polipeptídeos são polipeptídeos diferentes. Um polipeptídeo quimérico também abrange polipeptídeos que incluem duas ou mais porções não contíguas derivadas do mesmo polipeptídeo. Um polipeptídeo quimérico também abrange polipeptídeos contendo pelo menos uma substituição, sendo que o polipeptídeo quimérico inclui uma primeira sequência de polipeptídeos na qual uma porção da primeira sequência de polipeptídeo foi substituída por uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeo.

[0097] O termo "porção," quando empregado aqui com respeito a uma nova sequência de polipeptídeos, refere-se a um comprimemto contíguo da sequência de polipeptídeos dada que é menor do que a sequência de comprimento total do polipeptídeo dado. Uma porção de um dado polipeptídeo pode ser definida por sua primeira posição e sua posição final, na qual a primeira posição e a posição final cada qual corresponde a uma posição em uma sequência dos polipeptídeos dados, sendo que a posição da sequência correspondendo à primeira posição está situada N-terminalmente à posição da sequência que corresponde à posição final, e em que a sequência das porções é a sequência contígua de aminoácidos no polipeptídeo dado que inicia na posição de sequência que corresponde à primeira posição, e termina na posição da sequência que corresponde à posição final. Uma porção também pode ser definida por referência à posição na sequência dada de polipeptídeos e um comprimento de resíduos relativos à posição referenciada, sendo que a sequência da porção é uma sequência contígua dos aminoácidos no polipeptíidio dado que tem o comprimento definido e que está localizado no polipeptídeo dado no que se refere à posição definida

[0098] O termo "porção N terminal" de uma dada sequência de polipeptídeos é um comprimento contíguo da sequência de polipeptídeos dada que inicia em ou próximo ao resíduo N-terminal da sequência de polipeptideo dada. Uma porção N terminal do polipeptideo dado pode ser definida por um comprimento. Similarmente, o termo "porção C-terminal" de uma dada sequência de polipeptídeos é um comprimento contíguo da sequência de polipeptídeos dada que termina em ou próximo ao resíduo C-terminal da sequência de polipeptídeos dada. Uma porção C-terminal do polipeptídeo dado pode ser definida por um comprimento.

[0099] Os termos "polipeptídeos quiméricos FGF " e "proteínas quiméricas FGF" quando empregados aqui abrangem um polipeptídeo contendo uma sequência que inclui pelo menos uma porção de uma primeira sequência de polipeptídeo FGF e uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeo FGF, na qual o primeiro e segundos polipeptídeos também abrangem polipeptídeos que incluem duas ou mais porções não contíguas derivadas do mesmo polipeptídeo FGF. Um polipeptídeo FGF quimérico também abrange polipeptídeos contendo pelo menos uma substituição, em que o polipeptídeo FGF quimérico inclui uma primeira sequência de polipeptídeo FGF, na qual uma porção da primeira sequência de polipeptídeo FGF foi substituída por uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeo FGF.

[00100] Os termos "polipeptídeos quiméricos FGF19" e "proteínas quiméricas FGF19" quando empregados aqui abrangem polipeptídeos quiméricos FGF contendo uma sequência que inclui pelo menos uma porção de uma sequência de polipeptídeos FGF19 e uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeos. Por exemplo, um polipeptídeo quimérico FGF19 abrange polipeptídeos nos quais a segunda sequência de polipeptídecos é uma sequência de polipeptídeos FGF21.

[00101] Um polipeptídeo quimérico FGF1I9 também abrange polipeptídeos que incluem duas ou mais porções não contíguas derivadas de uma sequência de polipeptidecos FGF19. Um polipeptídeo — quimérico FGF1I9 também abrange polipeptídeos contendo pelo menos uma substituição, na qual a sequência do polipeptídeo quimérico FGF19 inclui uma sequência de polipeptídeo FGF19 na qual uma porção da sequência de polipeptídeo FGF19 foi substituída por uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeo. Em tais casos, um polipeptídeo quimérico FGF19 abrange expressamente polipeptídeos nos quais a porção substituta é uma porção de uma sequência de polipeptídeos FGF21.

[00102] Um polipeptídeo quimérico FGF19 também abrange um polipeptídeo em que a sequência consiste somente de porções derivadas ou de uma sequência de polipeptídeos FGF19 ou uma segunda sequência de polipeptídeos, tais como uma sequência de polipeptídeos FGF21. A menos que indicado de outra forma, um polipeptídeo quimérico FGF19 não está limitado a, nem implica em, a menos que indicado de outra forma, na respectiva ordem ou locais da sequência de polipeptídeos FGF19 no que se refere a quaisquer outras porções de sequências dentro da sequência de polipeptídeo quimérico FGF19.

[00103] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" no que diz respeito a uma dada sequência de polipeptídeos identificada aqui é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos aminoácidos da sequência de referência, depois de alinhar as sequências e introduzir espaços, se necessário, para conseguir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. O alinhamento para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras que estão dentro da perícia da técnica, por exemplo, usando um software de computador publicamente disponível tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Aqueles especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medição, alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se conseguir o máximo alinhamento pelo comprimento total das sequências comparadas.

[00104] Paraos propósitos aqui mencionados, a % da identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos, para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa % de identidade de uma sequência de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue: 100 vezes a fração XY, em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como idênticos, coincide com um dado programa de alinhamento de sequência, no qual o programa de alinhamento de A e

B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será observado que em que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % da identidade da sequência de aminoácidos de A para B não será igual à % da identidade da sequência de aminoácidos de B para A.

[00105] O "percentual (%) de identidade da sequência de ácido nucleico" no que se refere a uma sequência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeos é definido aqui como a porcentagem de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos na sequência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeos, depois do alinhamento das sequências e introdução de espaços, se necessário, para conseguir o percentual máximo de identidade de sequência. O alinhamento para os propósitos da determinação do percentual de identidade de sequência de ácido nucleico pode ser conseguido de várias maneiras que estão dentro do escopo da técnica, como por exemplo, o uso de software de computador publicamente disponível tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Aqueles especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se conseguir o alinhamento máximo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas.

[00106] Para os propósitos aqui expostos, a % da identidade da sequência de ácido nucleico de uma dada sequência de ácido nucleico C para, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D (que alternativamente pode ser formulada como uma dada sequência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de ácido nucleico para, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D (que pode ser alternativamente formulada como uma dada sequência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa identidade % de sequência de ácido nucleico para, com, ou contra uma dada ácido sequência de ácido nucleico D) é calculada como se segue: 100 vezes a fração W/Z em que Wé o número de nucleotídeos pontuados com resultados idênticos para um dado programa de alinhamento de sequência naquele alinhamento de CebD,Seem que Zé o número total de nucleotídeos em D. Será apreciado que em que o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento da sequência D de ácido nucleico, o % da identidade de sequência de ácido nucleico de C para D não será igual à % da identidade de sequência de ácido nucleico de D para C.

[00107] "Isolado," quando empregado para descrever os vários polipeptídeos “divulgados aqui, significa polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu meio ambiente natural. De preferência, o polipeptídeo isolado está livre da associação com todos os componentes com os quais ele está naturalmente associado. Componentes contaminantes de seu meio ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam no diagnóstico ou usos terapêuticos do polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não- proteináceos. Em modos de execução preferidos, o polipeptídeo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N terminais ou internos através do uso de um aparelho sequenciador (spinning cup sequenator), ou (2) para a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando Coomassie blue ou, de preferência, manchas de prata. Polipeptídeos isolados incluem polipeptídeos in situ dentro de células recombinantes, já que pelo menos um componente do meio ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normalmente, entretanto, polipeptídeos isolados serão preparados pelo menos por uma etapa de purificação.

[00108] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" que codifica um polipeptídeo é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula contaminante de ácido nucleico com a qual ela está normalmente associada na fonte natural de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. De preferência, o ácido nucleico isolado está livre de associação com todos os componentes com o qual ele está naturalmente associado. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica o polipeptídeo é diferente na forma ou ajuste em que ela é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas portanto são distintas da molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo conforme elas existem em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo inclui moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos — contidas nas células daqueles polipeptídeos normalmente expressos em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossomal diferente daquela das células naturais.

[00109] O termo "sequências de controle" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificadora operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são apropriadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente um operador de sequência, e um local de ligação de ribossoma. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.

[00110] Ácido nucleico está "operativamente ligado a" quando ele é colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré sequência ou um líder secretor está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma préproteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se ele afeta a transcrição da sequência; ou um local de ligação do ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se ele está posicionado de modo a facilitar a translação. Geralmente, "operacionalmente ligado a" significa que as sequências de DNA que estão ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguo e na fase de leitura. Entretanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são usados de acordo com a prática convencional.

[00111] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre, por exemplo, anticorpos monoclilonais simples (incluindo agonistas, antagonistas, e anticorpos de neutralização), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia única, e fragmentos de anticorpos (ver abaixo). O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, p.ex., os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em menores quantidades.

[00112] No que se refere à ligação de um polipeptídeo, anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica a uma molécula alvo ou receptor cognato, o termo "ligação específica" ou "se liga especificamente a" ou é "específico para" um polipeptídeo em particular, ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular ou receptor cognato, significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. Ligação específica pode ser medida,

por exemplo, determinando a ligação de uma molécula comparada à ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não possui atividade de ligação. Por exemplo, ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não-marcado. Neste caso, ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma amostra é competitivamente inibido pelo excesso de alvo não marcado. O termo "ligação específica" ou "se liga especificamente a" ou é "específico para" um polipeptídeo em particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular ou receptor cognato conforme usado aqui pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula contendo um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10 º* M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 107 M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10! M, alternativamente pelo menos cerca de 10? M, ou maior. Em um modo de execução, o termo "ligação específica" refere-se à ligação em que uma molécula se liga a um polipeptídeo particular ou epítopo em um polipeptídeo particular ou receptor cognato sem ligação substancial a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo ou receptor.

[00113] A "estringência" de reações de hibridização é prontamente determinável por um indivíduo com conhecimentos normais na técnica, e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da amostra, da temperatura de lavagem e da concentração de sal. Em geral, amostras mais longas requerem temperaturas mais elevadas para uma associação apropriada, enquanto amostras mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridização geralmente depende da capacidade de reassociação do DNA desnaturado quando filamentos complementares estão presentes em um ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre as amostras e sequência hibridizável, tanto maior é a temperatura relativa que pode ser usada. Como um resultado, segue- se que temperaturas relativas mais elevadas tenderiam a tornar as condições de reação mais estringentes, enquando temperaturas mais baixas menos estringentes. Para detalhes adicionais e explicação da estringência das reações de hibridização, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

[00114] "Condições de estringência" ou "condições de alta estringência", conforme definido aqui, podem ser identificadas como aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo cloreto de sódio 0,015 M / citrato de sódio 0,0015 M / dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50º C; (2) empregam durante a hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino / Ficoll 0,1% / 0,1% de polivinilpirrolidona / fosfato de sódio 50 mM tampão no pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42º C; ou (3) emprego de formamida 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5x, DNA de esperma de salmão sonicado (50 ug/ml), SDS 0,1%, e sulfato de dextrano 10% a 42º C, com lavagens a 42º C em 0,2xSSC (de cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% formamida a 55º C, seguido por uma lavagem de alta estringência consistindo de EDTA contendo 0,1xSSC a 55º C.

[00115] "Condições moderadamente estringentes" podem ser identificadas como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução de lavagem e condições de hibridização

(p.ex., temperatura, resistência iônica e %o SDS) menos estringente do que aquelas descritass acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é a incub ação durante a noite a 37º C em uma solução compreendendo: 20% de formamida, 5xSSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de trissódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, 10% sulfato de dextrano, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão de natureza cisalhada (natured sheared), seguido por lavagens dos filtros em 1xX8SSC em cerca de 37- 50º C. O artesão especializado reconhecerá como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc, como necessário para acomodar fatores tais como comprimento da amostra e semelhantes.

[00116] O termo "epítopo etiqueta" quando usado aqui refere-se a um polipeptídeo fundido a um "polipeptídeo etiqueta". O polipeptídeo etiqueta possui resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual pode ser feito um anticorpo, porém ele é curto o suficiente para não interferir com a atividade do polipeptídeo ao qual ele está fundido. O polipeptídeo etiqueta de preferência também é bastante singular, de modo que o anticorpo não apresenta reações cruzadas com outros epítopos. Polipeptídeos etiqueta apropriados geralmente possuem pelo menos seis resíduos aminoácidos e usualmente entre aproximadamente 8 e 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos)

[00117] Conforme usado aqui, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras dos domínios constantes da imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é outro que não o antígeno de reconhecimento e o local de ligação de um anticorpo (p.ex., é "heterólogo"), e uma sequência de domínio de imunoglobulina constante. A parte adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência contígua de aminoácidos compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou um ligante. À sequência de domínio de imunoglobulina constante na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos I9G-1, I9G-2, I9G-3, ou I9G-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[00118] “Ativo” ou "atividade" para os propósitos aqui descritos refere-se aos polipeptídeos quiméricos FGF19, que retêm pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica dos polipeptídeos FGF19 e/ou dos polipeptídeos FGF21 nativos ou que ocorrem naturalmente, particularmente os polipeptídeos hFGF1I9 e/ou os polipeptídeos hFGF21 nativos ou que ocorrem naturalmente. "Atividade "biológica" refere-se a uma função biológica (tanto inibidora, estimuladora ou cooperativa) causada por um polipeptideo FGF1I9 e/ou um polipeptídeo FGF21 nativos ou que ocorrem naturalmente, além da capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico possuído por um polipeptídeo FGF19 e/ou um polipeptídeo FGF21 nativos ou que ocorrem naturalmente. Atividade "biológica" também pode se referir a uma função celular ou bioquímica de polipeptídeos FGF19 e/ou polipeptídeos FGF21 nativos ou que ocorrem naturalmente, tal como a capacidade de se ligar a um ou mais dos seus respectivos receptores cognatos. Atividade "Imunológica" refere-se à capacidade de um polipeptideco FGF1I9 e/ou um polipeptídeo FGF21 nativos ou que ocorrem naturalmente de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico. Uma atividade biológica preferida inclui quaisquer das seguintes atividades dos exemplos: aumento do metabolismo (ou taxa metabólica) em um indivíduo, diminuição do peso corporal de um indivíduo, diminuição da adiposidade em um indivíduo, diminuição da absorção (uptake) da glicose em adipócitos, aumenta o desprendimento de leptina de adipócitos, diminui os triglicerídios em um indivíduo, diminui os ácidos graxos livres em um indivíduo, através da ligação Klotho-beta- dependente a um receptor FGF cognato, e ligação Klotho-beta- independente a um receptor FGF cognato. Compreende-se que algumas das atividades dos polipeptídeos FGF19 e/ou FGF21 são induzidas — diretamente pelos polipeptídecos e algumas são indiretamente induzidas, entretanto, cada uma delas é o resultado da presença dos polipeptídeos FGF19 e/ou FGF21 e de outro modo não teriam o resultado, na ausência dos polipeptídeos.

[00119] O termo "antagonista" é usado no mais amplo sentido e inclui qualquer molécula que, parcialmente ou totalmente, bloqueia, inibe ou neutraliza a atividade biológica de um polipeptídeo nativo ou quimérico divulgado aqui. De uma maneira similar, o termo "agonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que imite uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo ou quimérico divulgado aqui. Anticorpos antagonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipeptídeos nativos, peptídeos, moléculas orgânicas pequenas, etc. Métodos para identificar agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo podem compreender a contactação de um polipeptídeo com uma molécula agonista ou antagonista canditada, e medição de uma mudança detectável em uma ou mais atividades biológicas associadas com o polipeptídeo.

[00120] Conforme usado aqui, "tratamento" ("treatment" ou "treating") é uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo os resultados clínicos. Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: diminuição de um ou mais sintomas resultantes da doença, redução da extensão da doença, estabilização da doença (por exemplo, prevenção ou retardo da piora da doença), retardo ou atraso da progressão da doença, melhoria do estado da doença, diminuição da dose ou de mais outros medicamentos requisitados para tratar a doença, e/ou aumento na qualidade de vida.

[00121] Conforme empregado aqui, "retardo" na progressão significa adiar, impedir, diminuir, retardar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença. Este retardo pode ser de vários intervalos de tempo, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo sendo tratado.

[00122] Em alguns modos de execução, os métodos de tratamento descritos aqui melhoram (p.ex., reduzem a incidência de, a duração de, reduzem ou diminuem a gravidade de) um ou mais sintomas da doença.

[00123] “Um"sintoma" é qualquer fenômeno mórbido ou afastado do normal em estrutura função, ou sensação, experimentado pelo indivíduo.

[00124] Uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo, anticorpo, seu agonista ou antagonista conforme divulgado aqui é uma quantidade suficiente para executar um propósito especificamente mencionado. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente de uma maneira rotineira, em relação ao propósito mencionado.

[00125] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo, polipeptídeo, ou outro medicamento eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um indivíduo ou mamífero. Ver aqui a definição de "tratar".

[00126] Administração "crônica" refere-se à administração do(s) agente(s) em um modo contínuo como oposto a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um extenso período de tempo. Administração "intermitente" é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas ao invés disso é cíclico na natureza.

[00127] "“Mamiífero" para o propósito de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e animais de fazenda, de zoológico e de esportes, ou animais de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. De preferência o mamífero é humano.

[00128] "Indivíduo" é qualquer mamífero, de preferência um humano.

[00129] "Obesidade" refere-se a uma condição em que um mamífero tem um índice de massa corporal (BMI), que é calculado como peso (kg) por altura? (metros), de pelo menos 25,9. Convencionalmente, aquelas pessoas com peso normal possuem um BMI de 19,9 até menos do que 25,9. A obesidade aqui pode ser devida a qualquer causa, tanto genética quanto ambiental. Exemplos de distúrbios que podem resultar em obesidade ou ser a causa de obesidade incluem superalimentação e bulimia, doença de ovários policíclicos, craniofaringioma, a síndrome de Prader-Willi, síndrome de Frohlich, diabetes do tipo Il, indivíduos deficientes de GH, variante normal de baixa estatura, síndrome de Turner e outras condições patológicas que mostram atividade metabólica reduzida ou uma diminuição no gasto de energia de repouso como uma porcentagem da massa livre de gordura total, por exemplo crianças com leucemia linfoblástica aguda.

[00130] "Condições relacionadas à obesidade" referem-se a condições que são o resultado de ou que são exasperadas pela obesidade, tal como, mas não limitado a, distúrbios dermatológicos tais como infecções, veias varicosas, Acanthosis nigricans, e eczema, intolerância a exercícios, diabetes mellitus, resistência a insulina,

hipertensão, hipercolesterolemia, colelitiase, osteoartrite, danos ortopédicos, doenças tromboembólicas, câncer, e doenças cardíacas coronarianas (ou cardiovasculares), particularmente aquelas condições cardiovasculares associadas com triglicerídeos elevados e ácidos graxos livres em um indivíduo.

[00131] A administração "em combinação com" ou "em conjunção com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui a administração simultânea, concorrente, consecutiva e sequencial, em qualquer ordem.

[00132] "Transportadores" conforme empregado aqui incluem transportadores — farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizantes que são não tóxicos para a célula ou mamífero que está sendo exposto a ele nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o transportador fisiológicamente aceitável é uma solução aquosa pH tamponada. Exemplos de transportadores fisiológicamente aceitáveis incluem tamponadores, tais como fosfatos, citratos e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como soro albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidonas; aminoácidos tais como glicinas, glutaminas, asparaginas, argininas ou lisinas; monosacarídeos, dissacarídeos, e outros carbohidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como sódio; e/ou agentes tenso ativos não iônicos tais como TWEEN'Y, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS'Y,

[00133] A digestão de anticorpos pela papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação de antígenos, os denominados fragmentos "Fab", e um fragmento residual "Fc", uma designação que reflete a capacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (Vs), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Cm). Cada fragmento Fab é monovalente no que se refere à ligação com o antígeno, i.e., ele tem um local de ligação com o antígeno único. O tratamento de um anticorpo com pepsina produz um fragmento único grande F(ab'), que corresponde aproximadamente a dois dissulfitos ligados a fragmentos Fab contendo atividade de ligação com antígeno divalente e é ainda capaz de ligação cruzada com um antígeno. Fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem alguns resíduos adicionais na terminação carbóxi do domínio CH incluindo uma ou mais cisteínas da região da dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' na qual o(s) resíduo(s) da cisteína dos domínios constantes comportam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de framentos Fab' que possuem dobradiças de cisteínas entre eles. Outras ligações químicas de fragmentos de anticorpo também são conhecidas.

[00134] "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento de antígeno e local de ligação de antígenos completo. Esta região consiste em um dimero de um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve em associação apertada e não covalente. É nesta configuração que os três CDRs de cada domínio da variável interagem para definir um local de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, os seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e de ligar antígenos, apesar de a uma menor afinidade do que a de todo o local de ligação.

[00135] O fragmento "Fc" compreende as porções terminais carbóxi de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efectoras de anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, região esta que também é a parte reconhecida pelos receptoes Fc (FCcR) encontrados em certo tipo de células.

[00136] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (Cx1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos na terminação carbóxi do domínio da cadeia pesada Cn incluindo uma ou mais cisteínas da região da dobradiça do anticorpo.

[00137] As "cadeias leves" dos anticorpos (imunoglobulinas) de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um ou dois tipos claramente distintos, denominados Kappa e lambda, baseado nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[00138] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco maiores classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversas dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isótipos), p.ex., IgG1, IgG2, 1g9G3, IgG4, IgA, e IgA2.

[00139] Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "fragmentos de anticorpos sFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo única. De preferência, o polipeptídeco Fv ainda compreende um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que permite aos sFv formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., editora Springer, Nova lorque, págs. 269-315 (1994).

[00140] O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Usando um ligador que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, EP Patent Publication 0404097; PCT International Patent Publication WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993).

[00141] Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado, e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interferiiam com o diagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteínáceos. Em modos de execução preferidos, o anticorpo será purificado (1) a mais do que 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais preferentemente mais do que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N terminal ou interna pelo uso de um aparelho sequenciador (spinning cup sequenator), ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou de não redução usando "Coomassie blue" ou, de preferência, "silver stain". O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro das células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. É comum, entretanto, que os anticorpos isolados sejam preparados por pelo menos uma etapa de purificação.

[00142] A palavra "marcador" ("label") quando empregada aqui refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugada diretamente ou indiretamente com o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado". A marca pode ser detectável por si própria (p.ex. radioisótopos marcadores ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalizar uma alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.

[00143] Por"fase sólida" quer-se referir a uma matriz não aquosa à qual o anticorpo da presente invenção pode aderir. Exemplos de fases sólidas abrangidas aqui incluem aquelas formadas parcialmente ou inteiramente de vidro (p. ex, vidro com poro controlado), polisacarídeos (p. ex., agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certos modos de execução, dependo do contexto, a fase sólida pode compreender a cavidade de uma placa de teste; em outras palavras, a coluna de purificação (p.ex., uma coluna cromatográfica de afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tais como aquelas descritas na U.S. Pat. No. 4.275.149.

[00144] Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou agentes tenso ativos, que é empregável para o fornecimento de um medicamento (tal como um polímero quimérico FGF19 ou seu anticorpo) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são normalmente arranjados em uma formação em duas camadas, similar ao arranjo dos lipídios das membranas biológicas.

[00145] Referência a "aproximadamente" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) variações que são próximas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a "aproximadamente X" inclui a descrição de "X"'

[00146] Como empregado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "a," "ou," e "os/as" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente explicite de um outro modo. Compreende-se que aspectos e variações da invenção descrita aqui incluem aspectos e variações de "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente de". V. Variantes Quiméricas FGF19

[00147] Além dos polipeptídeos quiméricos FGF19 descritos aqui, verifica-se que polipeptídeos quiméricos FGF19 variantes (ou "variantes FGF19 quiméricos"”) podem ser preparados. Variantes FGF19 quiméricos podem ser preparados por introdução de mudanças apropriadas nos nucleotídeos em um DNA codificador de polipeptídeos FGF19 ou FGF21 quiméricos ou nativos, e/ou por síntese da variante FGF19 quimérica desejada. Aqueles com conhecimento na técnica verificarão que mudanças nos aminoácidos podem alterar processos pós-translacionais da variante FG19 quimérica, tais como mudança no número ou posição de locais de glicosilação ou alteração das características de ancoragem da membrana.

[00148] Variações nos polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção ou nos seus vários domínios podem ser feitas, por exemplo, usando quaisquer das técnicas e orientações para mutações conservadoras e não conservadoras estabelecidas, por exemplo, na U.S. Pat. No. 5.364.934. Variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam o polipeptídeo quimérico FGF19 que resulta em uma mudança na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos quiméricos FGF19. As variações, no que se refere a um ou mais códons, podem ser codificadoras do polipeptídeo quimérico FGF19 que é derivado do polipeptídeo nativo FGF19 ou do polipeptídeo FGF21. Opcionalmente a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Uma orientação para determinação de qual resíduo aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a atividade desejada pode ser encontrada comparando-se a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 com aquela dos homólogos conhecidos das moléculas de proteína e minimizando o número de mudanças na sequência de aminoácidos feita nas regiões de alta homologia. Substituições de aminoácidos podem ser o resultado da substituição de um aminoácido contendo propriedades estruturais similares e/ou químicas, tais como a substituição de uma leucina por uma serina, isto é, substituições de aminoácidos — conservadores. Inserções ou deleções podem opcionalmente estar na faixa de cerca de 1 até 5 aminoácidos. À variação permitida pode ser determinada por inserções, deleções, ou substituições de aminoácidos, feitas sistematicamente, na sequência e testando as variantes resultantes quanto à atividade exibida pelo comprimento total ou sequência nativa madura.

[00149] Fragmentos de polipeptídeos quiméricos FGF19 ("ou fragmentos FGF19 quiméricos") são fornecidos aqui. Tais fragmentos podem ser truncados na terminação N ou na terminação C, ou podem ter falta de resíduos internos, por exemplo, quando comparados com o comprimento total de uma proteína nativa. Certos fragmentos têm falta de resíduos de aminoácidos que não são essenciais para uma atividade biológica desejada dos polipeptídeos FGF19 quiméricos.

[00150] Fragmentos FGF19 quiméricos podem ser preparados por quaisquer de uma série de técnicas convencionais. Fragmentos de peptídeo desejados podem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos FGF19 quiméricos por digestão enzimática, por exemplo, através do tratamento da proteína com uma enzima conhecida por clivar proteínas em locais definidos por resíduos de aminoácidos particulares, ou por digestão de DNA com enzimas de restrição apropriadas e isolando o fragmento desejado. Ainda outra técnica apropriada envolve o isolamento e amplificação de um fragmento de DNA codificador de um fragmento de polipeptídeo desejado, por reação de cadeia de polimerase (PCR). Oligonucleotídeos que definem os termos desejados do fragmento de DNA são empregados nos primers 5' e 3 no PCR. De preferência, fragmentos de polipeptídeos quiméricos FGF19 compartilham pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com um polipeptídeo nativo FGF19, tal como os polipeptídeos hFGF19 mostram na FIG. 1 (SEQ ID NO:1) ou no polipeptídeo nativo FGF21, tal como hFGF21 mostrada na FIG. 2 (SEQ ID NO:2).

[00151] Em modos de execução particulares, substituições conservadoras de interesse são mostradas na tabela 10 sob o título substituições preferidas. Se tais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas substituições dos exemplos na tabela 10, ou como descritas mais abaixo com referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos são analisados.

Tabela 10: Substituições preferidas de Resíduos de Aminoácido era e e fe e O e gg

[00152] Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipeptídeo quimérico FGF19 são conseguidas selecionando as substituições que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substitução, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o bojo da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos baseados nas propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrofóbicas: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicas neutras: cys, ser, thr; (3) ácidas: asp, glu; (4) básicas: asn, gln, his, Ilys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e (6) aromáticas: trp, tyr, phe.

[00153] —Substituições não conservadoras implicarão na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais de substituição conservadores ou, mais preferentemente, nos locais remanescentes (não conservados).

[00154] As variações podem ser feitas empregando métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese (sítio dirigida) mediada por oligonucleotídeos, de varredura com alanina, e mutagênese por PCR. Mutagênese (sítio dirigida) [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagênese de cassette [Wells et al, Gene, 34:315 (1985), mutagênese de seleção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir os DNA codificadores dos polipeptídeos variantes FGF 19 quiméricos.

[00155] A análise de varredura dos aminoácidos também ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos de varredura são preferidos aminoácidos relativamente pequenos, neutros. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferido entre este grupo porque ele elimina a cadeia lateral além do beta-carbono e é menos propenso a alterar a conformação da cadeia principal da variante [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. Alanina é também tipicamente preferida porque ela é o aminoácido mais comum. Além disso, ela é frequentemente encontrada em ambas as posições enterradas e expostas [Creighton, "As proteínas" (The Proteins), (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição com alanina não produz quantidades adequadas de variante, pode ser empregado um aminoácido isotérico.

Vl. Modificações de Quiméricos FGF19

[00156] Modificações covalentes de polipeptídeos quiméricos FGF19 estão incluídas no âmbito desta invenção. Um tipo de modificação covalente inclui a reação de resíduos de aminoácido alvo de um polipeptídeo quimérico FGF19 com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N-terminais ou C-terminais dos polipeptídeos quiméricos FGF19. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para polipeptídeos quiméricos FGF19 reticulando-os com uma matriz de suporte insolúvel em água ou superfície para uso no processo de purificação de anticorpos, e vice-versa. Agentes de reticulação normalmente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2- feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres disuccinimidílicos tais como 3,3"- ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais, tais como bis- N-maleimido-1,8-octano / e agentes tais como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato.

[00157] Outras modificações incluem a desamidação de resíduos de glutaminila e asparaginila nos resíduos glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos a-amino de lisina, arginina, e cadeias laterais de histidina [T. E. Creighton, Proteínas: Estrutura e Propriedades Moleculares, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)], acetilação da amina N terminal e, amidação de qualquer grupo carboxila C terminal.

[00158] Outro tipo de modificação covalente do polipeptídeo quimérico FGF19 incluído no âmbito desta invenção compreende a alteração do padrão de glicosilação do polipeptídeo. Pretende-se por "alteração do padrão de glicosilação nativo" para fins de uso aqui o significado de deletar uma ou mais parcelas de carbohidratos verificadas nos polipeptídeos FGF19 nativos correspondentes e/ou na sequência de polipeptídeos FGF21 (tanto por remoção do sítio de glicosilação subjacente ou por deleção da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no polipetídeo FGF19 nativo e/ou na sequência de polipeptídeos FGF21. Além disso, a frase inclui mudanças qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolvendo uma mudança na natureza e proporções das várias parcelas de carbohidrato presentes.

[00159] A adição de sítios de glicosilação ao polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser conseguida pela alteração da sequência de aminoácido. A alteração pode ser feita, por exemplo, pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina ao polipeptídeo quimérico FGF19 (para sítios de glicosilação ligados por O). A sequência de aminoácidos dos polipeptídeos quiméricos FGF19 pode, opcionalmente, ser alterada por mudanças no nível do DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o polipeptídeo quimérico FGF19 em bases pré selecionadas, de modo que sejam gerados códons que serão transladados nos aminoácidos desejados.

[00160] Um outro meio de aumentar o número de parcelas de carbohidrato no polipeptídeo quimérico FGF19 é por ligação química ou enzimática de glicosídeos ao polipeptídeo. Tais métodos são descritos na técnica, por exemplo, na WO 87/05330 publicada em 11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).

[00161] A remoção de parcelas de carbohidrato presentes no polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser conseguida quimicamente ou enzimaticamente ou por substituição mutacional de códons que codificam resíduos de aminoácidos que servem como alvo para glicosilação. Técnicas de deglicosilação química são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch.

Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118131 (1981). A clivagem enzimática de parcelas de carbohidrato em polipeptídeos pode ser conseguida pelo uso de uma variedade de endoglicosidases e exoglicosidases, conforme descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

[00162] Outro tipo de modificação covalente de polipeptídeos quiméricos FGF19 compreende a ligação do polipeptídeo quimérico FGF19 a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo polietileno glicol (PEG), polipropileno glicoli ou polioxialquilenos, na maneira indicada na U.S. Pat. No. 4.640.835;

4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337.

[00163] O polipeptídeo quimérico FGF1I9 da presente invenção também pode ser modificado por fusão do polipeptídeo quimérico FGF19 fundido a outro polipeptídeo heterólogo ou sequência de aminoácido.

[00164] Em um modo de execução, uma tal molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo quimérico FGF19 com um polipeptídeo etiqueta (tag) que fornece um epítopo ao qual um anticorpo anti-etiqueta pode seletivamente se ligar. O epítopo etiqueta é geralmente colocado na terminação amino ou carboxila dos polipeptídeos quiméricos FGF19. A presença de tais formas de epítopos etiqueta dos polipeptídeos quiméricos FGF19 pode ser detectada usando um anticorpo contra o polipeptídeo de etiqueta. Também, o fornecimento de epítopos etiqueta permite que o polipeptídeo quimérico FGF19 seja prontamente purificado através de purificação por afinidade usando um anticorpo anti-etiqueta ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao epítopo etiqueta. Vários polipeptídeos etiqueta e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem poli-histidina (poly-his) ou as etiquetas poli-histidina-glicina (poly-his-gly); o polipeptídeo etiqueta flu

HA e seu anticorpo 12CASB5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; a etiqueta c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 da mesma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610- 3616 (1985)]; e a etiqueta da glicoproteína D (gD) do vírus do herpes simplex e seus anticorpos [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos etiqueta incluem o peptídeo etiqueta [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; o peptídeo de epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992); um peptídeo de epítopo a-tubulina [Skinner et al.,, J. Biol. Chem,, 266:15163-15166 (1991)]; e a etiqueta peptídica da proteína do gen 10 do fago T7 [Lutz-Freyermuth et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 87:6393-6397 (1990)].

[00165] Em um modo de execução alternativo, um polipeptídeo da presente invenção pode compreender uma fusão de um polipeptídeo quimérico FGF19 com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como uma "imunoadesina"), uma tal fusão poderia ser a porção Fc de uma imunoglobulina, um análogo da porção Fc de uma imunoglobulina e um ou mais fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina. Em alguns modos de execução, a imunoglobulina é selecionada do grupo que consiste em: IgG-1, IgG-2, I19G-3, 19G-4, IgA-1, I9gA-2, IgE, 1gD e IgM. Em alguns modos de execução, a porção Fc é humana ou humanizada.

[00166] Em alguns modos de execução, a terminação C do polipeptídeo quimérico FGF19 e a terminação N da porção Fc são fundidas. Em alguns modos de execução, a terminação N do polipeptídeo quimérico FGF19 e a terminação C da porção Fc são fundidas. Em alguns modos de execução, a fusão da imunoglobulina inclui as regiões da dobradiça, CH2 e CH3, ou da dobradiça CH1, CH2 e CH3 de uma molécula IgG1. Para a produção de fusões de imunoglobulina ver também a U.S. Pat. No. 5.428.130 divulgada em 27 de junho de 1995. Em alguns modos de execução, a terminação C do polipeptídeo quimérico FGF19 é fundida à terminação N da porção Fc via um ligador, e o ligador é selecionado do grupo que consiste em: um ligador [Gly]n, um ligador [GIly3Ser]m e um ligador [Gly4Ser]m, em que n é um inteiro de 1-30 e m é um inteiro de 1-6.

VII. Usos e Métodos de Uso de Polipeptídeos quiméricos FGF19

[00167] Os polipeptídeos quiméricos FGF19 e seus moduladores descritos aqui também podem ser empregados como agentes terapêuticos. Os polipeptídeos quiméricos FGF19 e seus moduladores da presente invenção podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para o preparo de composições farmaceuticamente úteis, pelo que o polipeptídeo quimérico FGF19 em questão é combinado em mistura com um veículo carreador farmaceuticamente aceitável. Formulações terapêuticas são preparadas para armazenamento misturando-se o ingrediente ativo com o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiológicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tamponadores, tais como fosfatos, citratos e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos) polipeptídeos; proteínas, tais como soro albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tais como glicinas, glutaminas, asparaginas, arginina ou lisina; monosacarídeos, dissacarídeos e outros carbohidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação, tais como EDTA;

álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; e/ou agentes tenso ativos não iônicos tais como TWEEN'Y, PLURONICS'"Y ou PEG.

[00168] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes ou após a liofilização e reconstituição.

[00169] As composições terapêuticas aqui descritas geralmente são colocadas em um recipiente contendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco para solução intravenosa contendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00170] A via de administração está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo injeção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial ou intralesional, administração tópica, ou por sistemas de liberação sustentável.

[00171] As concentrações de dosagens e de medicamento desejadas das composições farmacêuticas da presente invenção podem variar dependendo do uso particular imaginado. A determinação da dosagem apropriada ou via de administração está bem dentro da perícia de um médico comum. Experimentos em animais forneceram um guia confiável para a determinação das doses eficazes para a terapia humana. O escalonamento entre espécies das doses eficazes pode ser realizado seguindo os princípios previstos por Mordenti, J. e Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" Em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nova lorque 1989, págs. 42-96.

[00172] Quando é empregada uma administração in vivo de um polipeptídeo quimérico FGF19 ou um seu agonista ou antagonista, as quantidades de dosagem normal podem variar de aproximadamente ng/kg até 100 mg/kg do peso corporal do mamífero ou mais por dia, de preferência aproximadamente 1 ug/kg/dia até 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Um guia de dosagens específicas e métodos de administração é fornecido na literatura; ver, por exemplo, a U.S. Pat. No. 4.657.760; 5.206.344; ou 5.225.212. É antecipado que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes distúrbios, e que a administração com alvo em um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de uma administração de maneira diferente daquela para outro órgão ou tecido.

[00173] A microencapsulação é contémplada em que a administração com liberação sustentada de um polipeptídeo quimérico FGF19 ou modulador for desejada em uma formulação com características de desprendimento apropriadas para o tratamento de qualquer doença ou distúrbio que requeira a administração do polipeptídeo quimérico FGF19 ou modulador. A microencapsulação de proteínas recombinantes para desprendimento sustentado foi realizada com êxito com hormônio de crescimento humano (rhGH), interferon- (rhIFN-), interleukin-2, e MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795- 799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al. Bio/Technology 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: Nova lorque, 1995), págs. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; e U.S. Pat. No. 5.654.010.

[00174] As formulações com desprendimento sustentado dessas proteínas foram desenvolvidas usando polímero de ácido poli-latico- coglicólico (PLGA) devido a sua biocompatibilidade e ampla gama de propriedades biodegradáveis. Os produtos de degradação de PLGA,

ácidos lático e glicólico, podem ser limpados mais rapidamente dentro do corpo humano. Além disso, a degradabilidade deste polímero pode ser ajustada por meses até anos dependendo de seu peso molecular e composição. Lewis. "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," em: M. Chasin e R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nova lorque, 1990), págs. 1-41.

[00175] Os agentes terapêuticos e composições compreendendo polipeptídeos quiméricos FGF19 fornecidos aqui podem ser usados em um número de aplicações. As aplicações incluem o tratamento de um indivíduo com obseidade ou uma condição associada a obesidade. Em um aspecto, polipeptídeo quimérico FGF19 é administrado a um indivíduo com necessidade dele em uma quantidade eficaz para tratar a condição. De preferência, a condição é uma que requer para ser tratada pelo menos um dos seguintes: redução na glicose sanguínea, uma elevação no metabolismo, uma redução do peso corporal, uma redução da gordura corporal, uma redução dos triglicerídeos, uma redução dos ácidos graxos livres, um aumento da liberação da glicose dos adipósitos e/ou um aumento no desprendmento de leptina dos adipócitos. Cada um desses parâmetros pode ser medido por métodos padrão, por exemplo, por medição do consumo de oxigênio para determinar a taxa metabólica, usando balanças para determinar o peso, e medindo o tamanho para determinar a gordura. Além disso a presença e quantidade de triglicerídeos, ácidos graxos livres, glicose e leptina pode ser determinado por métodos padrão. Os reivindicantes incluem o tratamento de um indivíduo com um ou mais diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, glicemia elevada, síndrome metabólica, ateroesclerose, hipercolesterolemia, derrame, osteoporose, osteoartrite, doença degenerativa das articulações, atrofia muscular, sarcopenia, massa corporal magra reduzida, careca, rugas, aumento da fadiga, estamina reduzida, dimuição da função cardíaca, disfunção do sistema imunológico, câncer, doença de Parkinson, demência senil, doença de Alzheimer e função cognitiva reduzida.

[00176] Polipeptideos quiméricos FGFI9 e composições compreendendo polipeptídeos quiméricos FGF19 são de preferência usadas in vivo. Entretanto, conforme discutido abaixo, a administração pode ser in vitro tal como nos métodos descritos abaixo para varredura de moduladores de polipeptídeos quiméricos FGF19. Embora seja entendido que moduladores de polipeptídeos quiméricos FGF19 também podem ser identificados pelo uso de modelos animais e amostras de indivíduos.

[00177] A presente invenção também inclui aspectos nos quais um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção ou uma composição farmacêutica dele é administrado a um indivíduo em combinação com um segundo agente, em que o segundo agente é de preferência um agente farmacológico. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção ou uma composição farmacêutica dele é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz do segundo agente. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica é administrado em conjunção com o segundo agente, p.ex., os respectivos períodos de administração são parte de um regime administrativo único. Em alguns modos de execução, O polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica e o segundo agente são administrados simultaneamente, p.ex., os respectivos períodos de administração sobrepõem-se um ao outro. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica e o segundo agente são administrados não- concomitantemente, p.ex., os respectivos períodos de adminsitração não se sobrepõem um ao outro. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica e o segundo agente são administrados sequencialmente, p.ex, O polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica é administrado antes e/ou depois da administração do segundo agente. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica e o segundo agente são administrados simultaneamente como composições separadas. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou sua composição farmacêutica e o segundo agente são administrados simultaneamente como parte da mesma composição.

[00178] Em alguns modos de execução, o segundo agente é um polipeptídeo quimérico FGF19 diferente da presente invenção. Em alguns modos de execução, o segundo agente é um agente anti- inflamatório, um agente anti-diabético, e /ou um medicamento redutor do colesterol da classe da "estatina". Em alguns modos de execução, o segundo agente ativo é insulina. Em alguns modos de execução, a insulina é de ação rápida, ação lenta, ação regular, ação intermediária, ou insulina de longa ação. Em alguns modos de execução, a insulina é e/ou compreende Humalog, Lispro, Novolog, Apidra, Humulin, Aspart, insulina regular, NPH, Lente, Ultralente, Lantus, Glargine, Levemir, ou Detemir. Em alguns modos de execução, o segundo agente ativo é estatina. Em alguns modos de execução, a estatina é e/ou compreende Atorvastatin (p.ex., Lipitor ou Torvast), Cerivastatin (p.ex., Lipobay ou Baycol), Fluvastatin (p.ex., Lescol ou Lescol), Lovastatin (p.ex., Mevacor, Altocor, ou Altoprev) Mevastatin, Pitavastatin (p.ex., Livalo ou Pitava), Pravastatin (p.ex., Pravachol, Selektine, ou Lipostat) Rosuvastatin (p.ex., Crestor), Simvastatin (p.ex., Zocor ou Lipex ), Vytorin, Advicor, Besylate Caduet ou Simcor.

[00179] Em um outro aspecto da presente invenção, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção ou uma composição farmacêutica dela é administrado a um indivíduo em combinação com uma segunda terapia realizada no indivíduo, em que a segunda terapia compreende uma cirurgia. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção ou uma composição farmacêutica dela é administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz em combinação com a segunda terapia. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou composição farmacêutica dele é administrado juntamente com a segunda terapia, p.ex., a administração e a terapia são parte de um regime administrativo único. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou composição farmacêutica dele é administrado simultaneamente com a segunda terapia, p.ex., os respectivos períodos de administração e terapia sobrepõem-se um ao outro. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou composição farmacêutica dele e o segundo agente é administrado não-simultaneamente com uma segunda terapia, p.ex., os respectivos períodos de administração e terapia não sobrepõem-se um ao outro. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou composição farmacêutica dele e o segundo agente é administrado sequencialmente com uma segunda terapia, p.ex., O polipeptídeo quimérico FGF19 ou composição farmacêutica dele é administrado antes e/ou após uma segunda terapia. Em alguns modos de execução, o polipeptídeo quimérico FGF19 ou composição farmacêutica dele e o segundo agente é administrado simultaneamente com a segunda terapia.

[00180] Os polipeptídeos quiméricos FGF19 descritos aqui também podem ser empregados como marcadores do peso molecular para propósito de eletroforese de proteína.

[00181] Os polipeptídeos quiméricos FGF19 e moléculas de ácido nucleico da presente invenção também podem ser usados para tipos de tecido, nos quais os polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção podem ser diferentemente expressos em um tecido se comparado a outro. Os polipeptídeos quiméricos FGF19 das moléculas do ácido nucleico encontrarão uso para gerar amostras para PCR, Northern analysis, Southern analysis e Western analysis.

[00182] —Polipeptídeos quiméricos FGF19 da presente invenção que se ligam a uma outra proteína (exemplo, um dos FGFRs), o polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser usado em ensaios para identificar as outras proteínas ou moléculas envolvidas na interação da ligação. Por tais métodos, inibidores da interação de ligação do receptor/ligador podem ser identificados. As proteínas envolvidas em tais interações de ligação também podem ser empregadas para monitorar peptídeos ou inibidores de pequenas moléculas ou agonistas da interação de ligação. Também, o polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser usado para isolar ligante(s) correlato(s). Ensaios de monitoramento podem ser desenhados para encontrar componentes líderes que imitam a atividade biológica de um FGF19 nativo, FGF21 nativo, polipeptídeos quiméricos FGF19, ou um receptor de FGF19 e/ou FGF21. Tais ensaios de monitoramento incluirão ensaios de monitoramento das bibliotecas químicas passíveis de altos rendimento, — tornando-os — particularmente — apropriados para identificação de pequenas moléculas de medicamento candidatas. Pequenas moléculas contémpladas incluem compostos sintéticos orgânicos ou inorgânicos. Os ensaios podem ser executados em uma série de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de monitoramento bioquímico, imunoensaios e ensaios com base em células, que são bem caracterizados na técnica.

[00183] Como uma abordagem alternativa para identificação do receptor, o polipeptídeo quimérico FGF19 marcado pode estar ligado por fotoafinidade a uma membrana celular ou extratos de preparados que expressam a molécula receptora. O material reticulado é resolvido por PAGE e exposto a um filme de raio X. O complexo marcado contendo o receptor pode ser excisado, resolvido em fragmentos de peptídeos, e submetido à microsequenciamento de proteína. A sequência de aminoácidos obtidos do micro-sequenciamento seria usada para desenhar um conjunto de amostras de oligonucleoítdeo degeneradas para monitorar uma biblioteca de cDNA para identificar o gen codificador do receptor putativo.

[00184] Em um modo de execução aqui em que ensaios de ligação competitivos são realizados, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c e/ou FGFR4 ou um anticorpo para o polipeptídeo quimérico FGF19 é usado como um competidor.

VIII. Anticorpos para Polipeptídeos quiméricos FGF19

1. Anticorpos policlonais

[00185] Os anticorpos dos anti-polipeptídeos quiméricos FGF19 podem compreender anticorpos policlonais. Métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos pelos especialistas na técnica. Anticorpos policlonais podem ser cultivados em um mamífero, por exemplo, por uma ou mais injeções de um agente imunizador e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizador e/ou o adjuvante será injetado no mamífero por meio de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente de imunização pode incluir o polipeptídeo quimérico FGF19 ou uma proteína de fusão dele. Pode ser útil conjugar o agente de imunização a uma proteína conhecida como sendo imunogênica no mamífero a ser imunizado. Exemplos de tais proteínas imunogênicas incluem mas não estão limitados à hemocianina de lapa californiana, albumina de soro, tiroglobulina bovina, e inibidor de tripsina de sódio. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem o adjuvante completo de Freund e o adjuvante MPL-TDM (monofosforil lipídeo A, dicorinomicolato de trehalose sintética). O protocolo de imunização pode ser selecionado por um perito na técnica sem desfazer a experimentação.

2. Anticorpos Monoclonais

[00186] Os anticorpos de anti-polipeptídeos quiméricos FGF19 podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos de hibridomas, tais como aqueles descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975). Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente de imunização para obter linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que especificamente se ligarão ao agente de imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Em modos de execução preferidos, o anticorpo do anti-polipeptídeo — quimérico FGF19 se liga especificamente ao polipeptídeo da presente invenção. Em modos de execução mais preferidos, o anticorpo que se liga especificamente não se liga ao polipeptídeo FGF19 nativo ou ao polipeptídeo FGF21 nativo.

[00187] O agente de imunização tipicamente incluirá o polipeptídeo quimérico FGF19 ou uma proteína de fusão do mesmo. Geralmente, ou são usados linfócitos do sangue periférico ("PBLs") se são desejadas células de origem humana, ou células do baço ou células dos linfonodos se são desejadas fontes mamíferas não humanas. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada usando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) págs. 59-103]. Linhas celulares — imortalizadas são usualmente células mamíferas transformadas, particularmente células de mieloma de roedores, bovinos e de origem humana. Usualmente são empregadas linhas celulares de mieloma de rato ou camundongo. As células do hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células não fundidas, imortalizadas. Por exemplo, se células parental carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT or HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), cujas substâncias evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.

[00188] Linhas celulares preferidas imortalizadas são aquelas que fundem eficazmente, suportam o alto nível estável de expressão do anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Linhas celulares imortalizadas mais preferidas são as linhas do mieloma murino, que podem ser obtidas por exemplo no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. e na American Type Culture Collection, Manassas, Va. Linhas celulares do mieloma humano e do heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) págs. 51-63].

[00189] O meio de cultura no qual as células do hibridoma são cultivadas pode então ser testado quanto à presença de anticorpos monocionais dirigidos contra polipeptídeos quiméricos FGF19. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células do hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal, por exemplo, pode ser determinada pela Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[00190] Após as células de hibridoma desejadas terem sido identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e cultivados por processos padrão [Goding, supra]. Um meio de cultura apropriado para este propósito inclui, por exemplo, o Dulbecco's Modified Eagles Medium e o meio RPMI-1640. Alternativamente, as células do hibridoma podem ser cultivadas in vivo como ascites em um mamífero.

[00191] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura ou fluido da ascites por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia com hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografia de afinidade.

[00192] Os anticorpos monoclonais também podem ser preparados por métodos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na U.S. Pat. No. 4.816.567. DNAs que codificam os anticorpos monoclonais da invenção podem ser prontamente isolados e sequenciados empregando-se procedimentos convencionais (p.ex., com o uso de amostras de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a gens codificadores das cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). As células do hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células COS de símios, células do ovário de hamsters chineses (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, por substituição da sequência codificadora dos domínios constantes de cadeia humana pesada e leve no lugar das sequências murinas homólogas. [U.S. Pat. No. 4.816.567; Morrison et al., supra] ou juntando covalentemente à sequência codificadora de imunoglobulina toda ou parte da sequência codificadora de um polipeptídeo — não-imunoglobulina. Um tal polipeptideo não- imunoglobulina pode ser substituído por um domínio constante de um anticorpo da invenção, ou ele pode ser substituído pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de um antígeno com um anticorpo da invenção para criar um anticorpo quimérico bivalente.

[00193] Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Métodos de preparação de anticorpos monovalentes são bastante conhecidos na técnica. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve da imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto na região Fc de modo a impedir a reticulação de cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo aminoácido ou são deletados para impedir a reticulação.

[00194] Métodos in vitro também são apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir seus fragmentos, particularmente fragmentos Fab, pode ser conseguida usando técnicas rotineiras conhecidas na técnica.

3. Anticorpos Humanos e Humanizados

[00195] Os anticorpos dos anti-polipeptídeos quiméricos FGF19 da invenção ainda podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab,

Fab, F(ab')), ou outras subsequências de anticorpos ligados a antígenos) que contêm uma sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nos quais resíduos de uma região determinadora complementar (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como um camundongo, rato ou coelho contendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos arcabouço Fv (Fv framework) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado ou sequências de arcabouços. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiõôês CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regioes FR são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobuilna humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593- 596 (1992)].

[00196] Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bastante conhecidos na técnica. Geralmente um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos aminoácidos nele introduzidos de uma fonte que é não humana. Esses resíduos aminoácidos não humanos são comumente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser realizada essencialmente seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo sequências de CDRs ou CDR de roedores pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Concordantemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos — quiméricos (U.S. Pat No. 4.816.567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[00197] Anticorpos humanos também podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na arte, incluindo bibliotecas de representação de fagos [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, anticorpos humanos podem ser produzidos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou totalmente desativados. Em caso de desafio, é observada a produção de um anticorpo humano que se assemelha intimamente àquela vista em humanos em todos os aspectos, incluinto o re-arranjo dos genes, e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, na U.S. Pat. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425;

5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et al.

Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856- 859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996) Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

4. Anticorpos biespecíficos

[00198] Anticorpos biespecíficos são anticorpos monocionais, de preferência anticorpos humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação a pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para o FGF19, a outra é para qualquer outro antígeno, e de preferência para uma proteína da superfície celular ou receptor ou subunidade receptora.

[00199] Métodos para preparar anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades [Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Devido à variedade aleatória de cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez diferentes moléculas de anticorpo, das quais somente uma possui a estrutura biespeciífica correta. A purificação da molécula correta é normalmente conseguida por etapas de cromatografia por afinidade. Procedimentos similares são divulgados na WO 93/08829, publicada em 13 de maio de 1993, e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[00200] Domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios combinados de anticorpo-antígeno) podem ser fundidos a sequências de imunoglobulina de domínio constante. A fusão de preferência é com uma imunoglobulina de cadeia pesada de domínio constante, compreendendo pelo menos parte das regiões da dobradiça, CH2, e CH3. É preferido ter a primeira região constante da cadeia pesada (CH1) com o sítio necessário para ligação das cadeias leves presentes a pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada da imunoglobulina, e se desejado a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Para maiores detalhes sobre a geração biespecífica de anticorpos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

[00201] De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engenheirada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados de uma cultura celular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante de um anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula do anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (p.ex. tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula do anticorpo por substituição de cadeias laterais de aminoácido por outras menores (por exemplo alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para o aumento da produção de heterodímeros sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

[00202] Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo anticorpos biespecíficos F(ab').). Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos de fragmentos de anticorpos foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados com o uso de ligação química. Brennan et al., Science

229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença de um agente de complexação ditiol arsenita de sódio para estabilizar ditióis vicinais e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então reconvertido em Fab”- tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser empregados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[00203] Fragmentos Fab' podem ser diretamente recuperados de E. coli e ligados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula do anticorpo F(ab'), biespecífico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente de E. coli e submetido à ligação química por acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor ErbB2 e as células T humanas normais, bem como de acionar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

[00204] Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos — biespecíficos — diretamente da cultira de células recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando fechos (zipper) de leucina. Kostelhy et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos dos fechos de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região da dobradiça para formar monômeros e depois foram re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligador que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Concordantemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a formar pares com os domínios VL e VH complementares de um outro fragmento, formando assim dois sítios de ligação de antígeno. Também foi relatada uma outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos por meio do emprego de dímeros de cadeia única Fv (sFv). Ver, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Anticorpos com mais de duas valências são considerados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

[00205] — Anticorpos biespecíficos dos exemplos podem ligar-se a dois epítopos diferentes em um dado polipeptideco FGF19. Alternativamente, um anti-polipeptídeo do braço do polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeante em um leucócito, tal como uma molécula receptora célula T (p.ex. CD2, CD3, CD28, ou B7), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FceyRII (CD32) e FcyRIIl (CD16) de modo a focar mecanismos de defesa celular para a célula expressar o polipeptíideo FGF19 particular. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam um polipeptídeo FGF19 particular. Esses anticorpos possuem um braço de ligação a FGF1I9 e um braço que se liga a um agente citotóxico ou a um agente quelante para radionuclídeos, tais como EOTUBE, DPTA, DOTA, ou TETA. Outro anticorpo biespeciífico de interesse liga o polipeptídeo FGF19 e ainda se liga ao fator de tecido (TF).

5. Anticorpos heteroconjugados

[00206] Anticorpos heteroconjugados também estão dentro do âmbito da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para ter como alvo células do sistema imune como células indesejadas [U.S. Pat. No.

4.676.980], e para o tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Considera-se que os anticorpos possam ser preparados in vitro usando métodos conhecidos na química da proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou por formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolatos e metil-4-mercaptobutirimidatos e aqueles divulgados, por exemplo, na U.S. Pat. No. 4.676.980.

6. Engenharia da Função Efetora

[00207] Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção no que se refere à função efetora, de modo a aumentar, por exemplo, a efetividade do anticorpo. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, permitindo assim uma formação de ligação de dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização aperfeiçoada e/ou abate celular aumentado mediado por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148:

2918-2922 (1992). Em um exemplo, anticorpos homodiméricos com elevada atividade anti-tumoral também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais conforme descritos em Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo que possue duas regiões Fc pode ser engenheirado e pode assim ter lise mediada por complemento avançado e capacidades ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

7. Imunoconjugados

[00208] A invenção também se refere a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como um agente quimioterático, toxina (pex, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fungal, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (p. ex, um radioconjugado).

[00209] Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser empregados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos ativos não vinculantes da toxina difteria, exotoxina da cadeia A (do Pseudomonas aeruginosa), rícino da cadeia A, abrin da cadeia A, modeccin da cadeia A, alfa-sarcina, proteínas aleurites fordii, proteínas diantina, da cadeia A Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, crotina, sapaonaria, inibidor officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 1311, 131In, 90Y, e 186Re.

[00210] Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são preparados usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato

(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais imidoésteres (tais como, dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (tais como, suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como, glutaraldeídos), compostos bis- azido (tais como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis- diazônio (tais como, bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como, tolieno 2,6-diisocianato), e compostos bis- ativos de flúor (tais como, 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triamina penta acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um exemplo de agente de quelação para conjugação de radionucleotídeos ao anticorpo. Ver WO94/11026.

[00211] Em um outro modo de execução, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em um tumor préalvo em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao indivíduo, seguido por remoção de conjugado não ligado da circulação empregando um agente de remoção (clearing) e depois administração de um "ligador" (p.ex., avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (p.ex., um radionucleotídeo).

8. Imunolipossomas

[00212] Os anticorpos divulgados aqui também podem ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 77: 4030 (1980); e U.S. Pat. Nos.

4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempos de circulação mais elevados são divulgados na U.S. Pat. No 5.013.556.

[00213] Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídio compreendendo fosfatidilcolina, colesterol, e fosfatidiletanolaminas derivados de PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poros definidos para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) via uma reação de intercâmbio de dissulfeto.

9. Composições farmacêuticas de anticorpos

[00214] Anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo FGF19 identificado aqui, bem como outras moléculas identificadas pelos ensaios de monitoramento divulgados anteriormente, podem ser administrados para o tratamento de vários distúrbios na forma de composições farmacêuticas.

[00215] Seo polipeptídeo FGF19 é intracelular e anticorpos inteiros são usados como inibidores, são preferidos anticorpos internalizados. Entretanto, lipofecções ou lipossomas também podem ser usados para fornecer o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, para células. Em que os fragmentos de anticorpo são usados, o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo é preferido. Por exemplo, baseado nas sequências de região variáveis de um anticorpo, moléculas de peptídeo podem ser desenhadas que retêm a capacidade de se ligar à sequência de proteína alvo. Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia recombinante de DNA. Ver, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90: 7889-7893 (1993). A formulação aqui também pode conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência aquelas com atividades complementares que não afetam adversamente umas às outras. Alternativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente que aumenta sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citoquina, agente quimioterápico, ou agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[00216] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, — nano-partículas, = e nanocápsulas)) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

[00217] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Estas são prontamente obtidas por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[00218] Preparados de desprendimento sustentado podem ser preparados. Exemplos apropriados de preparados de desprendimento sustentado incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de desprendimento sustentado incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou álcool poli(vinílico)), polilactídeos (U.S. Pat. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e L-glutamato de y etila, etileno- acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOTY (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático- ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros, tais como etileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitem o desprendimento de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis desprendem proteínas por períodos de tempos mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um lonto tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37º C, resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é intermolecular, a formação da ligação S--S intercambia através do tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida por modificação dos resíduos de sulfohidrila, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matriz polimérica específica. G. Usos de Anticorpos

[00219] Os anticorpos do anti- polipeptídeo quimérico FGF19 da invenção têm várias utilidades. Por exemplo, anticorpos anti-FGF19 podem ser usados em ensaios diagnósticos para polipeptídeos quiméricos FGF19, p.ex., detectando sua expressão em células específicas, tecidos ou soro. Várias técnicas de ensaio diagnóstico conhecidas na técnica podem ser empregadas, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sandwich diretos ou indiretos e ensaios de imunoprecipitação conduzida tanto nas fases heterogêneas ou nas homogêneas [Zola, Monoclonal Anticorpos: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) págs. 147-158]. Os anticorpos usados nos ensaios diagnósticos podem ser marcados com uma parcela detectável. A parcela detectável deveria ser capaz de produzir, tanto diretamente quanto indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a parcela detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 358, ou 1251], um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre. Qualquer método conhecido na técnica para a conjugação do anticorpo com a parcela detectável pode ser empregado, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Imnmunol. Meth., 40:219 (1981); e Nygren, J. Histochem. e Cytochem., 30:407 (1982).

[00220] — Anticorpos de anti-polipeptídeos quiméricos FGF19 também são úteis para a purificação de afinidade do polipeptídeo quimérico FGF19 da cultura de células recombinantes ou fontes naturais. Neste processo, os anticorpos contra polipeptídeos quiméricos FGF19 são mobilizados em um suporte apropriado, tal como uma resina Sephadex ou filtro de papel, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é então contactado com uma amostra contendo o polipeptídeo quimérico FGF1I9 a ser purificado, e posteriormente o suporte é lavado com um solvente apropriado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto os polipeptídeos quiméricos FGF19, que estão ligados ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente apropriado que desprenderá o polipeptídeo quimérico FGF19 do anticorpo.

IX. Preparação de Polipeptídeos Quiméricos FGF19

[00221] A descrição abaixo relata primariamente a produção de um polipeptídeo quimérico FGF1I9 por meio de células de cultura transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico que codificam polipeptídeos quiméricos FGF19. É considerado, é claro, que métodos alternativos que são bem conhecidos na técnica podem ser empregados para preparar polipeptídeos quiméricos FGF19. Por exemplo, os polipeptídeos quiméricos FGF19, ou suas porções, podem ser produzidos por síntese de peptídeos direta usando técnicas de fase sólida [ver, p.ex., Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrífield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A síntese de proteína In vitro pode ser realizada usando técnicas manuais ou por automação; A síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando um sintetizador Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, Calif.) com instruções do fabricante. Várias porções dos polipeptídeos quiméricos FGF19 podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir polipeptídeos quiméricos FGF19 de comprimento total.

1. Isolamento dos DNAs que codificam polipeptídeos quiméricos FGF19

[00222] “Fragmentos de cDNA codificadores dos polipeptídeos quiméricos FGF da presente invenção podem ser gerados usando metodologia PCR usando cDNA codificando pelo menos uma porção dos polipeptídeos FGF19 nativos e pelo menos uma porção de polipetídeos FGF21 nativos como modelo. Por exemplo, em um exemplo, um fragmento de cDNA que codifica uma porção N terminal do polipeptídeo FGF21 e um fragmento de cDNA que codifica uma porção C terminal do polipeptideco FGF19 são separadamente amplificados e purificados por um procedimento padrão, tal como usando PCR seguido por eletroforese em gel de agarose. Sequências primárias são projetadas de tal modo que haja uma sobreposição de 18 nucleotídeos na extremidade 3' do fragmento do cDNA de FGF21 e na extremidade 5' do fragmento do cDNA de FGF19. Uma segunda amplificação usando PCR é conduzida usando uma mistura dos dois fragmentos de cDNA como modelo, resultando em um cDNA que codifica polipeptídeo quimérico do fragmento FGF21 e do fragmento FGF19. O fragmento do cDNA resultante é digerido com uma restrição apropriada de enzimas, purificado por eletroforese em gel de agarose, e clonado em um vetor de plasmídeo pRK5.sm (um vetor de plasmídeo à base de pUC contendo um promotor CMV para expressão de mamíferos) usando procedimentos padrão. A sequência dos plasmídeos — resultantes foi confirmada pelo método de sequenciamento de DNA de Sanger.

[00223] O DNA que codifica o polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser obtido a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que acredita-se possuir o nRNA de FGF19 e/ou FGF21 e expressá-lo a um nível detectável. Concordantemente, DNA humano FGF19 e/ou FGF21 pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos exemplos. O gene que codifica FGF19 e/ou FGF21 também pode ser obtido a partir de uma biblioteca genômica ou por procedimentos sintéticos conhecidos (p.ex., síntese de ácido nucleico automatizada).

[00224] Bibliotecas podem ser monitoradas com amostras (tais como anticorpos de FGF19 e/ou FGF21 ou oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20-80 bases) projetados para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. O monitoramento do CDNA ou biblioteca genômica com a amostra selecionada pode ser conduzido uando procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene que codifica FGF19 é o de usar a metodologia PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., POR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

[00225] Os exemplos abaixo descrevem técnicas para monitoramento de uma biblioteca de cDNA. As sequências de oligonucleotídeos — selecionadas como amostras deveriam ser suficientemente compridas e suficientemente não ambíguas para que falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é de preferência marcado (labeled) tal que ele possa ser detectado com hibridização ao DNA na biblioteca monitorada. Métodos de marcação são bem conhecidos na técnica, e incluem o uso de radiomarcadores como ATP marcada ?ºP, biotinilação ou enzima marcadora. Condições de hibridização, incluindo estringência moderada e alta estringência, são fornecidos em Sambrook et al., supra.

[00226] As sequências identificadas em tais métodos de varredura de biblioteca podem ser comparados e alinhados a outras sequências depositadas e disponíveis em bases públicas de dados, tais como o GenBank ou outras sequências de bases de dados privadas. Identidade de sequência (tanto ao nível do aminoácido ou nucleotídeo) dentro de regiões definidas da molécula ou através da sequência de comprimento total pode ser determinada usando métodos conhecidos na técnica e conforme descrito aqui.

[00227] Ácido nucleico contendo sequência codificadora de proteína pode ser obtido por varredura de cDNA ou bibliotecas genômicas usando a sequência de aminoácidos deduzida discutida aqui pela primeira vez, e, se necessário, usando procedimentos de extensão de primário convencional conforme descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e processar intermediários de mMRNA que podem não ter sido reversamente transcritos em cDNA.

2. Seleção e Transformação de Células hospedeiras

[00228] Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas pela expressão ou vetores de clonagem descritos aqui para a produção de polipeptídeos quiméricos FGF19 e cultivados em meio nutriente convencional modificado se apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação dos genes codificadores das sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meio, temperatura, pH e semelhantes, podem ser selecionadas pelo especialista na técnica sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximização da produtividade de culturas celulares podem ser encontradas em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.

[00229] Métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas são conhecidas para o especialista comum, por exemplo, CaCl2, CaPO4, mediado por lipossoma e electroporação. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é realizada usando técnicas padrão apropriadas a tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação é geralmente usada para procariotas. A infeção com agrobacterium tumefaciens é usada para a transformação de certas células de plantas, conforme descrito por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e na WO 89/05859 publicada em 29 de junho de 1989. Para células mamíferas sem tais paredes celulares, pode ser empregado o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspectos gerais das transfecções do sistema hospedeiro de células mamíferas foram descritos na U.S. Pat. No. 4.399.216. Transformações em levedura são tipicamente executadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA), 76:3829 (1979). Entretanto, também podem ser usados outros métodos para introdução de DNA em células, tais como por microinjeção nuclear, electroporação, fusão do protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, por exemplo, polibreno, poliornitina. Para várias técnicas de transformação de células mamíferas, ver Keown et al, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature,

336:348-352 (1988).

[00230] Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui descritos incluem células procariotas, leveduras, ou células eucariotas maiores. Procariotas apropriadas incluem mas não estão limitadas a eubactéria, tais como organismos — gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, enterobacteriáceas tais como E. coli. Várias cepas de E. coli estão disponíveis publicamente, tais como a E. coli K12 cepa MM294 (ATCC

31.446); E. coli X11776 (ATCC 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC

27.325) e K5772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluem as enterobacteriáceas, tais como, Escherichia, p.ex., E. coli, enterobacter, erwinia, Klebsiella, proteus, salmonella, p.ex., salmonella typhimurium, serratia, p.ex., serratia marcescans, e shigella, bem como bacilos tais como B. subtilis e B. licheniformis (p.ex., B. licheniformis 41P divulgado em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), pseudomonas tais como P. aeruginosa, e streptomyces. Esses exemplos são ilustrativos ao invés de limitantes. A cepa W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parente particularmente preferido porque ele é uma cepa hospedeira comum para fermentações de produto com DNA recombinante. De preferência, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 pode ser modificada para efetuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, sendo que os exemplos de tais hospedeiros incluem a E. coli W3110 cepa 1A2, que possui o genótipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que possui o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55,244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF- lac)169 degP ompT kanr; E. coli W3110 cepa 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 cepa 40B4, que é cepa 3/7/D6 com uma mutação deleção degP não resistente a kanamycin; e uma cepa de E. coli contendo protease periplásmica mutante divulgada na U.S. Pat. No. 4.946.783 editada em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, são apropriados métodos de clonagem in vitro, p.ex, PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucleico.

[00231] Em adição às procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros apropriados para clonagem ou expressão para vetores codificadores de FGF19. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico — baixo “normalmente — empregado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 ; EP 139,383 publicado em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (U.S. Pat. No. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tais como, p.ex., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 ), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC

24.178), K. waltil (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol., 28:265-278 ); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 76:5259-5263 ); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicado em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, p.ex., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 ; Tilburn et al. Gene, 26:205-221 ; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81: 1470- 1474 ) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 ). Leveduras metilotrópicas são apropriadas aqui e incluem, mas não estão limitadas a, leveduras capazes de crescimento em metanol selecionadas dos gêneros que consistem de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplo desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Metilotrophs, 269 (1982).

[00232] Células hospedeiras apropriadas para a expressão de polipeptídeos quiméricos FGF19 glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de insetos tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais. Exemplos de linhas celulares hospedeiras mamiíferas úteis incluem as células do ovário do hamster chinês (CHO) e COS. Exemplos mais específicos incluem linha celular CV1 dos rins de macacos transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha celular dos rins embriônicos humanos (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Células do ovário de hamsters chineses/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 77:4216 (1980)); células de camundongo sertoli (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); e tumor de mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51). A seleção de células hospedeiras apropriadas é considerada como estando dentro da perícia da técnica.

3. Seleção e uso de um vetor replicável

[00233] O ácido nucleico (p.ex, cDNA ou DNA genômico) que codifica polipeptídeos quiméricos FGF19 pode ser inserido em um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores estão publicamente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA está inserido em um sítio(s) apropriado(s) de restrição de endonuclease usando técnicas conhecidas na técnica. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, uma ou mais sequências de signal, uma origem de replicação, um ou mais marcadores de genes, um elemento aumentador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. A construção de vetores apropriados contendo um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas pelos especialistas.

[00234] O polipeptídeo quimérico FGF19 pode ser produzido recombinantemente não somente diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo contendo um sítio específico de clivagem na terminação N da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou ela pode ser uma parte dos DNA codificadores dos polipeptídeos quiméricos FGF19 que é inserida no vetor. A sequência de sinal pode ser a sequência de sinal original de FGF19 ou FGF21, tal como hFGF19 ou hFGF21. Portanto, em tais modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção pode incluir pelo menos uma porção N terminal de pre-hFGF19, tal como pelo menos os resíduos 1-22 da SEQ ID NO:3. Em tais modos de execução, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção pode incluir pelo menos uma porção N terminal de pré-hFGF1, tal como pelo menos os resíduos 1-28 da SEQ ID NO:4.

[00235] A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo das fosfatases alcalinas, penicillinase, !pp, ou líderes de enterotoxina |l estáveis a calor. Para a secreção da levedura a sequência de sinal pode ser, p.ex., o líder invertase da levedura, líder fator alfa (incluindo os líderes fator a. dos saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na U.S. Pat. No. 5.010.182), ou líder fosfatase ácida, o líder glucoamilase de C. albicans (EP 362,179 publicado em 4 de abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de novembro de 1990. Em expressão celular de mamíferos, sequências de sinal de mamíferos podem ser usadas para secreção direta da proteína, tais como sequências de sinal dos polipeptídeos secretados das mesmas espécies ou espécies relacionadas, bem como líderes secretórios virais.

[00236] Ambos os vetores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras, e vírus. À origem da replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias gram-negativas, a origem do plasmídeo 21 é apropriada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) são úteis para vetores de clonagem em células mamíferas.

[00237] Vetores de expressão e de clonagem tipicamente conterão um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexatos, ou tetraciclinas, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis dos meios complexos, p.ex., o gen que codifica D-alanina racemase para bacilos.

[00238] Um exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células mamíferas são aqueles que permitem a identificação de células que são competentes para absorver o ácido nucleico codificador do FGF19, tal como DHFR ou timidina quinase. Uma célula hospedeira apropriada, quando o DHFR do tipo selvagem é empregado, é a linha celular CHO deficiente em atividade DHFR, preparada e propagada conforme descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Um gene de seleção apropriada para uso em leveduras é o gene trp1 presente no plasmídeo da levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al, Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. O gen trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante da levedura sem capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

[00239] Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico codificadora de FGF19 para dirigir a síntese de mMRNA. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Promotores apropriados para uso com hospedeiros —procarióticos incluem os sistemas promotores B- lactamase e lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goedde!l et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP

36.776], e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotores para uso nos sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine- Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA codificador de FGF19.

[00240] “Exemplos de sequências promotoras apropriadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores de 3- fosfoglicerato quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme

Reg., 7:149 (1968); Holanda, Bioquímica, 17:4900 (1978)], tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofructoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3- fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, e glucoquinase.

[00241] Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis contendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras de álcool desidrogenase 2, isocitocrome C, fosfatase ácida, enzimas degradáveis associadas ao metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores apropriados para uso na expressão de levedura são ainda descritos na EP 73.657.

[00242] A transcrição de vetores em células hospedeiras mamíferas é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus, tais como, o polioma vírus, fowlpox vírus (UK 2.211.504 publicado em 5 de julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e vírus de símios 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, p.ex., o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros.

[00243] A transcrição de um DNA que codifica o polipeptídeo quimérico FGF19 por eucariotas mais elevados pode ser aumentada pela inserção de uma sequência potenciadora no vetor. Potenciadores (enhancers) são elementos do DNA com ação cis, usualmente cerca de 10 até 300 bp, que agem em um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas sequências promotoras de genes de mamíferos são conhecidas agora (globina, elastase, albumina, a-fetoproteina, e insulina). Tipicamente, entretanto, se usará um promotor de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o potencializador SV40 do lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o potencializador do promotor precoce (early side) do citomegalovírus, o potencializador do polioma do lado tardio (late side) da origem de replicação e potencializadores do adenovírus. O potencializador pode ser dividido no vetor na posição 5' ou 3' na sequência codificadora do polipeptídeo quimérico FGF19, mas ele está localizado de preferência em um sítio 5' do promotor.

[00244] Vetores de expressão usados nas células eucarióticas hospedeiras (levedura, fungos, insetos, plantas, animais, humanos, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do MRNA. Tais sequências são normalmente disponíveis das regiões 5' e, ocasionalmente 3', não transladadas dos DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não transladada do mMRNA codificador dos polipeptídeos quiméricos FGF19.

[00245] Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras apropriados para adaptação à síntese dos polipeptídeos quiméricos FGF19 em cultura celular recombinante de vertebrados são descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; e EP 117.058.

4. Detecção da Amplificação/Expressão dos Genes

[00246] A amplificação e/ou expressão dos genes pode ser medida em uma amostra direamente, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mMRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma amostra apropriadamente marcada, baseado nas sequências fornecidas aqui. Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de DNA, duplexes de RNA, e duplexes de DNA-RNA híbridos ou duplexes de DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado em que o duplex está ligado a uma superfície, de modo que com a formação de duplex na superfície, pode ser detectada a presença do anticorpo ligado ao duplex.

[00247] A expressão dos genes, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como tingimento imunohistoquímico de células ou seções de tecidos e ensaio da cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto de gene. Anticorpos úteis para tingimento imunohistoquímico e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser tanto monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptídeo quimérico FGF19 ou contra um peptídeo sintético baseado nas sequências de DNA fornecidas aqui ou contra sequência exógena fundida com DNA codificador de polipeptídeo quimérico FGF19 e codificador de um epítopo de anticorpo específico.

5. Purificação de Polipeptídeo

[00248] Formas de polipeptídeos quiméricos FGF19 podem ser recuperadas do meio de cultura ou de lisatos de célula hospedeira. Se ligadas a membrana, elas podem ser desprendidas da membrana usando uma solução detergente apropriada (p.ex. Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. Células empregadas na expressão de um polipeptídeo quimérico FGF19 podem ser interrompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclo de congelamento/descongelamento, sonicação, interrupção mecânica, ou agentes de lise celular.

[00249] Pode ser desejado purificar os polipeptídeos quiméricos FGF1I9 a partir de proteinas de células recombinantes ou polipeptídeos. Os seguintes procedimentos são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: por fracionamento em uma coluna trocadora de íon; precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina trocadora de cátion tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como I|gG; e colunas de quelato metálico para ligar formas com epítopos etiquetas dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, editora Springer, Nova lorque (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção usado e do polipeptídeo quimérico FGF19 particular produzido.

X. Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos quiméricos FGF19 e seus usos

[00250] A presente invenção inclui em um outro aspecto sequências de nucleotídeos (ou seu complemento) que codificam os polipeptídeos quiméricos FGF19 (ou "ácidos nucleicos quiméricos FGF19") da presente invenção. Ácidos nucleicos quiméricos FGF19 da presente invenção possuem várias aplicações na técnica da biologia molecular, incluindo usos como amostras de hibridização, no mapeamento de cromossomas e genes e na geração de RNA e DNA anti-sentido. Ácidos nucleicos quiméricos FGF19 também serão úteis para a preparação de polipeptídeos quiméricos FGF19 pelas técnicas recombinantes descritas aqui.

[00251] Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF19 podem incluir um ou mais epítopos etiquetas (epitope tag). Em alguns modos de execução, um epítopo etiqueta está posicionado na terminação N dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Em alguns modos de execução, um epítopo etiqueta está posicionado na terminação C dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Em alguns modos de execução, um epítopo etiqueta está posicionado na terminação N dos polipeptídeos quiméricos FGF19.

[00252] Em alguns modos de execução, polipeptídeos quiméricos FGF19 pode incluir um ou mais epítopos etiquetas. Em alguns modos de execução, um epítopo etiqueta está posicionado na terminação N dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Em alguns modos de execução, um epítopo etiqueta está posicionado na terminação C dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Em alguns modos de execução, um epítopo etiqueta está posicionado na terminação N dos polipeptídeos quiméricos FGF19. Em alguns modos de execução, epítopo etiqueta compreende a sequência de aminoácidos DYKDDDDK (SEQ ID NO:279).

[00253] Em um modo de execução exemplar, um ácido nucleico FGF 19 quimérico da presente invenção inclui a sequência:

CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGG GGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACCOTCOGGCCCccACG

GGCTCTCCAGCTGCTTCCTGCGCATCCGTGCCGACGGCGTCGTGE GACTGCGCGCGGGGCCAGAGCGCGCACAGTTTGCTGGAGATCAA GGCAGTCGCTCTGCGGACCGTGGCCATCAAGGGCGTGCACAGC GTGCGGTACCTCTGCATGGGCGCCGACGGCAAGATGCAGGGGCT GCTTCAGTACTCGGAGGAAGACTGTGCTTTCGAGGAGGAGATCC GCCCAGATGGCTACAATGTGTACCGATCCGAGAAGCACCGCCTC CCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGCTGTACAAGAA CAGAGGCTTTCTTCCACTCTCTCATTTCCOTGCCCATGCTGCCCATG GTCCCAGAGGAGCCTGAGGACCTCAGGGGCCACTTGGAATCTGA CATGTTCTCTTCEGCCCCTGGAGACCGACAGCATGGACCCATTTGG

GCTTGTCACCGGACTGGAGGCCGTGAGGAGTCCCAGCTTTGAGA AG (SEQ ID NO:7). Esta sequência de ácido nucleico exemplar codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que corresponde ao polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-2, conforme mostrado na tabela 3.

[00254] Em outro modo de realização exemplar, um ácido nucleico quimérico FGF 19 da presente invenção inclui a sequência: ATGGACTCGGACGAGACCGGGTTCGAGCACTCAGGgC

TGTGGGTTTCTGTGCTGGCTGGTCTTCTGCTGGGAGCCTGCCAG

GCACACCCCATCCCTGACTCCAGTCCOTCTCCTGCAATTCEGGGGGC CAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACCTCCGGCCcocACGGGCT

CTCCAGCTGCTTCCTGCGCATCCGTGCCGACGGCGTCGTGGACT GCGCGCEGGGEGCCAGAGCGCGCACAGTTTGCTGGAGATCAAGGC AGTCGCTCTGCGGACCGTGGCCATCAAGGGCGTGCACAGCGTGC GGTACCTCTGCATGGGCGCCGACGGCAAGATGCAGGGGCTGCTT CAGTACTCGGAGGAAGACTGTGCTTTCGAGGAGGAGATCCGCCC AGATGGCTACAATGTGTACCGATCCGAGAAGCACCGCCTCCCGG

TCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGCTGTACAAGAACAGA GGCTTTCTTCCACTCTCTCATTTCOTGCCcATGCTGCCCATGGTCC

CAGAGGAGCCTGAGGACCTCAGGGGCCACTTGGAATCTGACATG TTCTCTTCGCCCOTGGAGACCGACAGCATGGACCCATTTGGGCTT

GTCACCGGACTGGAGGCCGTGAGGAGTCCCAGCTTTGAGAAGGA CTACAAAGACGATGACGACAAGTGA (SEQ ID NO:281). Esta sequência de ácido nucleico exemplar codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que inclui a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-2, conforme mostrado na tabela 3. O polipeptídeo também inclui um epítopo etiqueta C terminal DYKDDDK (SEQ ID NO:280) e a sequência de sinal ativa na terminação N-N de hFGF21 polipeptídeo (MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACOQA; SEQ ID NO:282).

[00255] Em um outro modo de execução exemplar um ácido nucleico quiméricos FGF19 da presente invenção inclui a sequência:

ATGCGGAGCGGGTGTGTGGTGGTCCACGTATGGATCC TGGCCGGCCTCTGGCTGGCCSGTGGCCGGGCGCCcceTteGceTT

CTCGGACGCGGGGCCCCACGTGCACTACGGCTGGGGCGACCCC ATCCGCCTGCGGCACCTGTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGA AGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCT GCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAA GCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCT GTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTG ACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGA TACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTG

CCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACC AGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCccoGcACTCOCOGG AGCCACCCGGAATCCTGGCCcecccAGCCCccocGATGTGGGCTCC TCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCcCAGGGCCGAAGCOCC CAGCTACGCTTCCGACTACAAGGACGACGATGACAAGTGA (SEQ ID NO:283). Esta sequência de ácido nucleico exemplar codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que inclui a sequência dos polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-2, conforme mostrado na tabela 6. Os polipeptídeos também incluem um epítopo etiqueta C terminal DYKDDDK (SEQ ID NO:280) e a sequência de sinal ativo N terminal e do polipeptídeo hFGF19 (MRSGCVVVHVWILAGLWLAVAG; SEQ ID NO:284).

[00256] Em um outro modo de execução exemplar, um ácido nucleico quimérico FGF19 da presente invenção inclui a sequência:

ATGGACTCGGACGAGACCGGGTTCGAGCACTCAGGGC TGTGGGTTTCTGTGCTGGCTGGTCTTCTGCTGGGAGCCTGCCAG GCACACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCEGGGGGC CAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGAC AGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGCGGC GCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTT GAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTT CCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACT TTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGAC GGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCAC CTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGG ACCAGCTCGCTTCCTTCCACTCTCTCATTTCOTGCCCATGCOTGCC CATGGTCCCAGAGGAGCCTGAGGACCTCAGGGGCCACTTGGAAT CTGACATGTTCTCTTCGCCCCTGGAGACCGACAGCATGGACCCAT

TTGGGCTTGTCACCGGACTGGAGGCCGTGAGGAGTCCCAGCTTT GAGAAGGACTACAAAGACGATGACGACAAGTGA (SEQ |D NO:285). Esta sequência de ácido nucleico do exemplo codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que inclui a sequência dos polipeptídeos FGF19 quiméricos cFGF21/19-13, conforme mostrado na tabela 5. O polipeptídeo também inclui um epítopo etiqueta C terminal DYKDDDK (SEQ ID NO:280) e a sequência de sinal N terminal do polipeptídeo hFGF21 (MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACOQA; SEQ ID NO:282).

[00257] A sequência de ácido nucleico nativa de comprimento total do gene hFGF19 (SEQ ID NO:5), a sequência de ácido nucleico nativa de comprimento total do gene FGF21 (SEQ ID NO:6), a sequência de ácido nucleico nativa de comprimento total de um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção, ou de quaisquer de suas porções anteriores, pode ser usada como amostra de hibridização para detecção ou varredura de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos — quiméricos — FGFI19 da presente invenção. Opcionalmente, o comprimento das amostras será de cerca de 20 até aproximadamente 50 bases. Como exemplo, um método de varredura compreenderá o isolamento da região codificadora do gene FGF19 usando a sequência de DNA conhecida para sintetizar uma amostra selecionada de cerca de 40 bases. As amostras de hibridização podem ser marcadas por uma variedade de marcadores, incluindo radionucleotídeos tais como 32P ou 358, ou marcadores enzimáticos tais como fosfatase alcalina ligada à amostra via sistemas de ligação avidina/biotina. Amostras marcadas contendo uma sequência complementar àquela do gene FGF19 da presente invenção podem ser usadas para varredura de bibliotecas de cDNA humano, DNA ou mMRNA genômico para determinar que membros de tais bibliotecas são hibridizados com a amostra. Técnicas de hibridização são descritas em maior detalhe nos exemplos abaixo.

[00258] “Quaisquer sequências EST divulgadas no presente pedido de patente podem ser empregadas similarmente como amostras, usando os métodos divulgados aqui.

[00259] Outros fragmentos úteis de ácidos nucleicos FGF19 quiméricos incluem oligonucleotídeos antisentido ou no sentido compreendendo uma sequência de ácido nucleico de filamento único (tanto RNA ou DNA) capaz de se ligar a sequências alvo quiméricas FGF19 mRNA (sentido) ou (antisentido) quiméricas FGF19 DNA. Oligonucleotídeos antisentido ou no sentido, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento da região codificadora dos DNA quiméricos FGF19. Um tal fragmento geralmente compreende pelo menos cerca de 14 nucleotídeos, de preferência aproximadamente 14 a 30 nucleotídeos. A capacidade de derivar um oligonucleotídeo antisentido ou no sentido, baseado em uma sequência de cDNA codificadora de uma dada proteína é descrito, por exemplo em Stein e Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

[00260] A ligação de oligoncleotídeos antisentido ou no sentido a sequências de ácido nucleico alvo resulta na formação de duplexes que bloqueiam a transcrição ou translação da sequência alvo por um dos vários meios, incluindo a degradação aumentada dos duplexes, terminação prematura da transcrição ou translação, ou por outros meios. Os oligonucleotídeos antisentido portanto podem ser usados para bloquear a expressão dos polipetídeos FGF19 quiméricos. Oligonucleotídeos antisentido ou no sentido ainda compreendem oligonucleotídeos contendo cadeias principais modificadas de açúcar- fosfodiester (ou outras ligações de açúcar, tais como aquelas descritas na WO 91/06629) e em que tais ligações de açúcar são resistentes a nucleases endógenas. Tais oligonucleotídeos com ligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (i.e., capazes de resistir à degradação enzimática) mas retêm especificidade de sequência para serem capazes de se ligar às sequências de nucleotídeos alvo.

[00261] Outros exemplos de oligonucleotídeos no sentido ou antisentido — incluem aqueles —oligonucleotíidecos que estão covalentemente ligados a parcelas orgânicas, tais como aquelas descritas na WO 90/10048, e outras parcelas que aumentam a afinidade dos oligonucleotídeos a uma sequência alvo de ácido nucleico, tal como poli-(L-lisina). Ainda mais, agentes de intercalação, tais como elipticina, e agentes de alquilação ou complexos metálicos podem estar ligados a oligonucleotídeos no sentido ou antisentido para modificar as especificidades dos oligonucleotídeos antisentido ou no sentido para a sequência alvo de nucleotídeo.

[00262] —Oligonucleotídeos antisentido ou no sentido podem ser introduzidos em uma célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por qualquer método de transferência de gene, incluindo, por exemplo, a transfecção de DNA mediada por CaPO;; eletroporação, ou pelo uso de vetores de transferência de genes tais como vírus

Epstein-Barr. Em um procedimento preferido, um oligonucleotídeo antisentido ou no sentido é inserido em um vetor retroviral apropriado. Uma célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo é contactada com o vetor recombinante retroviral, tanto in vivo ou ex vivo. Vetores retrovirais apropriados incluem, mas não estão limitados àqueles derivados do retrovírus murino M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M-MuLV), ou os vetores de cópia duplos designados DCT5A, DCT5B e DCTS5C (ver WO 90/13641).

[00263] —Oligonucleotídeos no sentido ou antisentido também podem ser introduzidos em uma célula contendo uma sequência de nucleotídeos alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação ligadora, conforme descrito em WO 91/04753. Moléculas de ligação ligadoras apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, receptores de superfície, fatores de crescimento, outras citoquinas ou outros ligadores que se ligam aos receptores da superfície celular. De preferência a conjugação da molécula de ligação do ligador não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação se ligar à sua molécula ou receptor correspondente, ou bloquear a entrada do oligonucleotídeo no sentido ou no antisentido ou sua versão conjugada na célula.

[00264] &Alternativamente, um oligonucleotídeo no sentido ou antisentido pode ser introduzido em uma célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por formação de um complexo de oligonucleotídeo-lipídio, como descrito na WO 90/10448. O complexo de oligonucleotídeo-lipídio no sentido ou antisentido está, de preferência, dissociado dentro da célula por uma lipase endógena.

[00265] As amostras também podem ser empregadas nas técnicas PCR para gerar um conjunto de sequências para identificação de sequências codificadoras quiméricas FGF19 intimamente relacionadas.

[00266] Ácido nucleico que codifica o polipeptídeo quimérico FGF19 também pode ser empregado na terapia genética. Em aplicações na terapia genética, os genes são introduzidos em células para conseguir a síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente eficaz, por exemplo, para substituição de um gene com defeito. A "Terapia genética" inclui ambos os genes convencionais da terapia em que um efeito duradouro é obtido por um tratamento único, e a administração de agentes terapêuticos de genes, que envolve a administração única ou repetida de um DNA ou mRNA terapeuticamente eficaz. RNAs e DNAs antisentido podem ser usados como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de certos genes in vivo. Já foi mostrado que oligonucleotídeos antisentido podem ser importados em células em que eles agem como inibidores, apesar das suas baixas concentrações intracelulares causadas por suas restritas absorções pela membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 ). Os oligonucleotídeos podem ser modificados para aumentar suas absorções, por exemplo substituindo seus grupos fosfodiésteres negativamente carregados por grupos não carregados.

[00267] Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas apropriadas para a transferência do ácido nucleico em células mamiíferas in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. As técnicas de transferência de gens in vivo atualmente preferidas incluem a transfecção com vetores virais (tipicamente retrovírus) e transfeção mediada por lipossomas de proteína viral revestida (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205- 210 ). Em algumas situações é desejável fornecer a fonte de ácido nucleico com um agente que tem como alvo as células alvo, tais como um anticorpo específico para uma proteína de membrana celular ou para a célula alvo, um ligador para um receptor na célula alvo, etc.. Em que lipossomas são empregados, as proteínas que se ligam a uma proteína da membrana da superfície celular associada à endocitose pode ser empregada para a alvejar e/ou para facilitar a absorção, p.ex. as proteínas dos capsídeos ou seus fragmentos trópicos para um tipo celular em particular, anticorpos para proteínas que se submetem a uma internalização em ciclização, proteínas que têm como alvo a localização intracelular do alvo e aumentam a meia-vida intracelular. A técnica da endocitose mediada pelo receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para uma revisão de marcação de genes e protocolo de terapia de genes ver Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992). X. Artigos de Fabricação

[00268] Em outro modo de execução da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios relativos ao metabolismo, condições ou sintomas conforme descritos acima. De preferência, o artigo de fabricação compreende:(a) um recipiente que compreende uma composição com um polipeptídeo quimérico FGF19 descrito aqui e um carreador farmaceuticamente aceitável ou diluente dentro do recipiente; e (b) um folheto informativo com instruções para administração da composição a um individuo que sofre ou exibe distúrbios, condições ou sintomas relativos a metabolismo.

[00269] Em alguns modos de execução, o indivíduo apresenta distúrbios, condições ou sintomas relativos a metabolismo. Em alguns modos de execução, o indivíduo está em risco de desenvolver distúrbios, condições ou sintomas relativos a metabolismo. Em alguns modos de execução, o indivíduo apresenta uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) circunferência da cintura de aproximadamente 102 cm ou mais em homens e aproximadamente 88 cm ou mais em mulheres, (b) triglicerídeos em jejum de aproximadamente 150 mg/dL ou mais, (c) uma glicose em jejum de aproximadamente 95 mg/dL ou maior, e (d) altos níveis de LDL oxidado. Em alguns modos de execução, O indivíduo ainda tem inflamação associada a diabetes. Em alguns modos de execução, o indivíduo tem um elevado nível glicêmico de cerca de 95 mg/dL ou maior após jejum durante a noite. Em alguns modos de execução, o indivíduo tem um alto nível de glicose no sangue de aproximadamente 126 mg/dL ou mais após jejum durante a noite. Em alguns modos de execução, o indivíduo tem um nível de glicose no sangue de aproximadamente 140 mg/dL após um teste oral de tolerância de glicose de duas horas. Em alguns modos de execução, o indivíduo tem um nível de glicose no sangue de aproximadamente 200 mg/dL após um teste oral de tolerância a glicose de duas horas. Em alguns modos de execução, o indivíduo tem pré-diabetes. Em alguns modos de execução, o indivíduo tem diabetes. Em alguns modos de execução, o diabetes é selecionado do grupo consistindo de diabetes do tipo |, diabetes do tipo-ll, e diabetes gestacional. Em alguns modos de execução, o diabetes é diabetes do tipo-ll.

[00270] O artigo fabrcado compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo em ou associado com o recipiente. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados por uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente possui ou contém uma composição que é eficaz para tratamento da esclerose múltipla e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa ou um frasco para solução intravenosa contendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o polipeptídeo quimérico FGF19. O rótulo ou folheto indica que a composição é usada para tratamento de distúrbios, condições ou sintomas relativos a metabolismo em um indivíduo que sofre deles com um guia específico no que se refere às quantidades de dosagem e intervalos de anticorpo e qualquer outro medicamento fornecido. O artigo fabricado pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão diluente farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada de fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. O artigo de fabricação pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outras soluções tampão, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[00271] —Opcionalmente, o artigo de fabricação aqui descrito, compreende ainda um recipiente compreendendo um segundo agente diferente do polipeptídeo para tratamento e compreendendo ainda instruções do tratamento do mamífero com um tal agente. Em alguns modos de execução, o segundo agente é um agente anti-inflamatório, um agente anti-diabético, e/ou um medicamento redutor do colesterol da classe da "estatina". Em alguns modos de execução, o segundo agente ativo é insulina. Em alguns modos de execução, a insulina é uma insulina de ação rápida, ação curta, ação regular, ação intermediária, ou de longa ação. Em alguns modos de execução, a insulina é e/ou compreende humalog, lispro, novolog, apidra, humulin, aspart, insulina regular, NPH, lente, ultralente, lantus, glargine, levemir, ou detemir. Em alguns modos de execução, o segundo agente ativo é uma estatina. Em alguns modos de execução, a estatina é e/ou compreende atorvastatina (p.ex., lipitor ou torvast), cerivastatina (p.ex.,

lipobay ou baycol), fluvastatina (p.ex., lescol ou lescol), lovastatina (p.ex., mevacor, altocor, ou altoprev) mevastatina, pitavastatina (p.ex., livalo ou pitava), pravastatina (p.ex., pravachol, selectina, ou lipostat) rosuvastatina (p.ex., crestor), simvastatina (p.ex., zocor ou lipex ), vytorin, advicor, besylate caduet ou simcor.

[00272] Um "folheto" é usado para se referir a instruções normalmente incluídas em pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação acerca das indicações, usos, dosagens, administração, contraindicações ou outros produtos terapêuticos a serem combinados com o produto do pacote e/ou avisos concernentes ao uso de tais produtos terapêuticos, etc.

[00273] Os seguintes exemplos são oferecidos com propósitos ilustrativos somente, e não pretendem de modo algum limitar o âmbito da presente invenção.

[00274] Todas as referência da literatura citadas no presente pedido de patente são incorporadas aqui como referência na sua totalidade.

EXEMPLOS

[00275] Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indicado de outro modo. A fonte das células identificadas nos seguintes exemplos e através do pedido de patente pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA. Células foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ºC sob 5% de CO2, a menos que indicado de outra forma.

Exemplo 1: Atividade de ligação de polipeptídeos FGF quiméricos e nativos FGFR KLB-independentes

[00276] A atividade de ligação in vitro ao receptor FGF de um polipeptídeo quimérico FGF da presente invenção foi medida empregando um ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA). No que se refere à Fig. 3A (topo), estão representados um diagrama esquemático de ELISA para medição da atividade de ligação in vitro do receptor FGF (FGFR) e seu controle correspondente.

[00277] Anticorpos monoclonais específicos para o fragmento humano IgG-Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) foram imobilizados nas cavidades das 96 cavidades das placas de fundo chato MaxisorpTM (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Rochester, Nova lorque) durante a noite por incubação com 100 ul por cavidade de 2 ug/ml de solução de anticorpo. Cada cavidade foi então incubada ou com 1 upgiml de FGFR4-Fc (um polipeptídeo recombinante compreendendo um domínio extracelular humano FGFRA4 fundido a um fragmento humano IgG1 Fc; nº do catálogo. 685-FR-050, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) ou 1 ug/ml de FGFR1c-Fc (um recombinante de polipeptideco “compreendendo um domínio extracelular humano FGFR1c fundido a um fragmento humano IgG1 Fc; nº do catálogo. 658-FR-050, R&D Systems).

[00278] Os polipeptídeos FGFR4-Fc ou FGFR1c-Fce imobilizados na superfície foram incubados por 1 hora com polipeptídeos humanos nativos FGF19-Flag com um epítopo etiqueta C terminal (ver FGF19- Flag na tabela 10, SEQ ID NO:237) em concentrações de 1 ug/mL, 0,4 ug/mL, 0,16 ug/mL, 0,064 ug/mL, 0,0256 pg/mL, 0,004096 pg/ml ou 0,0016384 upg/mL, cada qual com 2 ug/mL de heparina, para permitir a ligação do polipeptídeo FGF19 ao domínio do receptor. Similarmente, os polipeptídeos com superfície imobilizada FGFR4-Fc ou FGFR1c-Fe foram incubados por 1 hora com um polipeptídeo quimérico FGF19 com um epítopo etiqueta C terminal (ver cFEGF21/19-2/Flag na tabela 10; SEQ ID NO:242) a concentrações de 1 ug/mL, 0,4 po/mL, 0,16 ug/mL, 0,064 upg/mL, 0,0256 pg/mL, 0,004096 pg/ml ou 0,0016384 ug/mL, cada qual com 2 ug/mL de heparina, para permitir a ligação do polipeptídeo quimérico FGF19 ao domínio receptor. Após a incubação,

a quantidade de polipeptídeo quimérico FGF19 nativo ligada ao domínio receptor a uma dada concentração de polipeptídeo FGF19 foi determinada usando um anticorpo policlonal FGF19 anti-humano biotinilado (nº do catálogo. BAF969, R&D Systems), estreptavidina- peroxidase de rábano silvestre (HRP) (nº do catálogo. RPN1231V, Amersham Biosciences, Pittsburgh, Pensilvania) e substrato de 3, 3', 5, 5-tetrametilbenzidina (nº do catálogo TMBE-1000, Moss, Inc., Pasadena, Maryland), e medindo a concentração do produto dependente de HRP por sua absorção em 450 nm. Experimentos de controle ELISA foram realizados para demonstrar que os polipeptídeos FGF19 nativos e quiméricos são reconhecidos pelo anticorpo policlonal do FGF19 anti-humano com uma eficácia equivalente (dados não mostrados).

[00279] Com referência à Fig. 3A, os resultados do ensaio de ligação in vitro FGFR para os polipeptídeos FGFR4-Fc ou FGFR1IcC-Fe com superfície imobilizada mostraram que os polipeptídeos FGF19 nativos humanos se ligaram a FGFR4-Fc de uma maneira concentração-dependente, Klotho-beta-independente, mas não se ligaram sensivelmente a FGFR1Ic-Fc. A ligação Klotho-beta- independente dos polipeptídeos FGFR19 quiméricos (cFGF21/19- 2/Flag; SEQ ID NO:242) tanto a FGFR4-Fc quanto a FGFR1c-Fc não foi detectada.

[00280] Com referência à Fig. 3B, é apresentado um diagrama esquemático de um ensaio para ativação de FGFR. Neste ensaio, células L6 transientemente transfectadas expressam um receptor FGF, tal como FGFR1c humano ou FGFR4 humano, em suas superfícies celulares. Uma ligação eficaz de um ligante ao receptor FGF pode resultar na ativação de uma via MAP quinase endógena, que pode resultar na fosforilação de um ativador transcricional quimérico contendo um domínio de ativação Elk-1 e um domínio de ligação ao

DNA GALA4. O ativador transcricional fosforilado pode ativar a expressão de um gene reporter sob o controle de uma sequência de ativação fluxo acima (upstream) apropriada, tal como a levedura GAL4 UAS. O gene reporter pode codificar uma enzima tal como a enzima luciferase, particularmente uma enzima luciferase de vagalume. As células L6 ainda podem ser transfectadas com uma luciferase Renilla constitutivamente expressa, que pode servir como um controle de normalização para a luciferase de vagalume induzível.

[00281] Neste ensaio, mioblastos L6 de rato em uma placa com 96 cavidades foram transientemente transfectados com um vetor de expressão codificando um polipeptídeo FGFR4 humano, um vetor de expressão codificando um ativador transcricional GAL4-Elk-1 (no do catálogo 219005, pFA2-Elk1, Stratagene, La Jolla, California), um vetor de expressão codificando um gene reporter luciferase de vagalume sob o controle do ativador upstream de levedura GALA4 (nº de catálogo 219050, pFR-luc, Stratagene). Um vetor para a expressão constitutiva de Renilla luciferase (nº de catálogo E2231, pRL-SVA40, Promega, Madison, Wisconsin) também foi transfectado para as células. As transfecções foram realizadas empregando-se um reagente de transfecção FUGENE HD (nº de catálogo 04 709 705 001, Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana) de acordo com as instruções do fabricante.

[00282] As células transfectadas L6 foram cultivadas durante a noite em DMEM (preparadas de Cellgro 50-013-PC, Mediatech, Inc., Manassas, Virginia) contendo 10% de FBS (no do catálogo F2442, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri). As células foram então lavadas e cultivadas por 6 horas adicionais em um meio livre de soro enriquecido derivado da mistura F12/DME 50:50 contendo 25 mg/L de heparina porcina e uma dada concentração do polipeptídeo FGF19. Os polipeptídeos FGF19 que foram testados foram polipeptídeos FGF19-

Flag nativos (ver FGF19-Flag na tabela 10; SEQ |D NO:237), polipeptídeo FGF21-His nativo (ver FGF21-His na tabela 10; SEQ ID NO:238) e um polipeptídeo quimérico FGF19-Flag (ver cFGF21/19- 2/Flag na tabela 10; SEQ ID NO:242). As células foram incubadas com o polipeptídeo a concentrações de 10 pug/mL, 1666,7 no/mL, 277,8 ng/mL, 46,3 ng/mL, 7,7 ng/mL, 1,3 ng/mL, 0,21 ng/mL, 0,036 ng/mL, 0,0060 ng/mL, 0,00099 ng/mL, 0,00017 ng/mL ou 0,000028 ng/mL. As células foram então lisadas com reagente PLB (nº do catálogo E1941, Promega) e a atividade de luciferase em cada cavidade foi determinada usando o sistema de ensaio Dual-Glo Luciferase Assay System (nº do catálogo E2940, Promega) e EnVision Multilabel Reader (nº do catálogo 2103, PerkinElmer, Waltham, Massachusetts) de acordo com as respectivas instruções do fabricante. Cada luciferase de vagalume foi normalizada para a atividade de luciferase de Renilla co-expressa e cada amostra foi realizada em triplicato. Atividade de luciferase de Renilla, e cada condição de amostra foi realizada em triplicato. Tabela 10: Sequências de Polipeptídeo fare regência de AmReáe NE sein FGF19-Flag |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR [237

ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGA DGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDM

FSSPLETDSMDPFGL VTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK FGF21-His — |HHHHHHPIPDSSPLLAFGGAVRARYLYTDDAQQTEAHLEIR 238

EDGTVGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORP DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLP GNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDV

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS pr sina ART sao FGF21-Flagc |HPIPDSSPLLAFGGQAVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV [239

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SMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK FGF21-FlagN |KDYKDDDDKLEHPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDDAQQTE |240

AHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRF LCARPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGL PLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQ

PPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS cFGF21/19- |HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADG [241 1/Flag VWVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGK

MOQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSS

PLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAFGGQAVRARYLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWV |242 2/Flag DCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM

QGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ ROLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSP

LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |[HPIPDSSPLLAFGGQAVRARYLYTDDPHGLSSCFLRIRADGVV [243 3/Flag DCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM

QGLLOYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ ROLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSP

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ETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- - |HPIPDSSPLLOFGGQVRORYLYTDDAQQTSCFLRIRADGWV |245 5/Flag DCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM

LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAFGGQAVRARYLYTDDAQQTEAFLRIRADGVWV |246 6/Flag DCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM

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LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |[HPIPDSSPLLAFGGQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGW |248 8/Flag DCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM

LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK pars sina AT sao cFGF21/19- |HPIPDSSPLLOFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV. |249 9/Flag GGAAD

QSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKN RGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSM

DPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAOFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV. |250 10/Flag GGAADQSPESLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKM

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LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAOFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV. |251 11/Flag GGAADQSPESLLOLKALKPGVIQILGVHSVRYLCMGADGKM

LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAOFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV. |252 12/Flag GGAADQSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCMGADGKM

LETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK cFGF21/19- |HPIPDSSPLLAOFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV |253 13/Flag GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPDGALY

GSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLET

DSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK pars sina Ama saDIO cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPLLQOFGGQVRORYLYTDDAQQTEAHLEIREDG |254 1/Flag TVGGAADOQSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQORPDGA

LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSD

PLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTDDAQQTEAHLEIRE |255 2/Flag DGTVGGAADOSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORPD

GALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPG NKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGS

SDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |256 3/Flag EDGTVGGAADOSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCORP

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |257 4/Flag ADGTVGGAADOSPESLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRP

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |[|RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |258 5/Flag ADGVVDCARGQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCARP

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK pars sina Aa SIDO cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |259 6/Flag ADGVVDCARGQSAHSLLOQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRP

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR 260 7IFlag ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVKTSRFLCQRP

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR [261 8/Flag ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCQRP

GSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21- - |RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |262 9/Flag ADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGA

DGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPD

VGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASDYKDDDDK cFGF19/21/19 |RPLAFSDAGPLLOFGGQAVRARYLYTSGPHGLSSCFLRIRAD |263 -1/Flag GVVDCARGQOSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGAD

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SSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK pars sina Am sEaDIO cFGF19/21/19 |RPLAFSDAGPLLQOFGGQAVRARYLYTDDPHGLSSCFLRIRAD |264 -2/Flag GVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGAD

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PLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK far Begin de ARES E sEgiDNO cFGF19/21/19 [RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIR |269 -29/Flag ADGVVDCARGQSAHSLLEIKALKPGTVAIKGVHSVRYLCMG

ADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESD MFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEKDYKDDDDK

[00283] No que se refere novamente à Fig. 3B, cada atividade de luciferase normalizada é mostrada como uma média e erro padrão da média das três réplicas. Os resultados mostram que as células L6 que expressam FGFR4 mas não Klotho-beta, quando tratadas com polipeptídeos FGF19 nativos, mostram uma ativação da atividade de luciferase dependente da dose, enquanto que nem o polipetídeo FGF21 nativo nem o polipeptídeo quimérico FGF19 mostraram tal atividade.

Exemplo 2: Atividade de ligação de FGFR4 dependente de KLB de polipeptídeos FGF quiméricos e nativos

[00284] Neste ensaio, mioblastos L6 de ratos em uma placa com 96 cavidades foram trasientemente transfectados com um vetor de expressão codificando tanto o polipeptídeo FGFR4 humano (baseado na sequência de referência NCBI: NM 002011.3) ou o polipetídeo FGFR1Ic humano (baseado na sequência de referência NCBI: NM 015850.3), um vetor de expressão codificando o polipeptídeo Klotho-beta (KLB) (baseado na sequência de referência NCBI: NM 175737.3 fundido a uma sequência de epítopo C terminal LEDYKDDDDK), um vetor de expressão codificando um ativador transcricional GAL4-EIlk-1 (pFA2-EIlk1, Stratagene), e um vetor de expressão codificando um gene reporter de luciferase de vagalume sob controle do ativador fluxo acima (upstream) de levedura GAL4 (pFR-luc, Stratagene). Um vetor para a expressão constitutiva da luciferase de Renilla (pRL-SV40, Promega) também foi transfectado para as células. As transfecções foram realizadas usando um reagente de transfecção FUGENE HD (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante.

[00285] As células L6 transfectadas foram cultivadas durante a noite em DMEM contendo 10% de FBS, como acima. As células foram então lavadas e cultivadas por 6 horas adicionais em um meio livre de soro contendo 25 mg/L de heparina porcina e uma dada concentração de um polipeptídeo FGF. Os polipeptídeos FGF que foram testados eram polipeptídeo FGF19-Flag nativo humano (ver FGF19-Flag na tabela 10, SEQ ID NO:237), polipeptídeo FGF21-His nativo humano (ver FGF21-His na tabela 10,SEQ ID NO:238) e um polipeptídeo FGF19-Flag quimérico (ver cFEGF21/19-2/Flag na tabela 10; SEQ ID NO:242). As células foram incubadas com o polipeptídeo FGF19 a concentrações de 500 ng/mL, 83,3 ng/mL, 13,9 ng/mL, 2,3 ng/mL, 0,39 ng/mL, 0,064 ng/mL ou 0,011 ng/mL. As células foram incubadas com o polipeptídeo quimérico FGF19 a concentrações de 2667 ng/mL, 444,4 ng/ml, 74,1 no/ml,12,3 ng/ml, 2,06 ng/mL, 0,34 ng/ml ou 0,057 ng/mL. As células foram então lisadas com o reagente PLB (Promega) e a atividade de luciferase foi determinada em cada cavidade empregando-se Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) e EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer) de acordo com as respectivas instruções do fabricante. Cada atividade de luciferase do vagalume foi normalizada para a atividade de luciferase de renilla co-expressa, e cada condição de amostra foi realizada em triplicato.

[00286] Com referência à Fig. 4, cada atividade de luciferase normalizada é mostrada como uma média e erro padrão da média das três réplicas. Os resultados mostram que polipeptídeo FGF19 nativo e polipeptídeo FGF19 quimérico mostram ativação de luciferase dependente da dose similar na presença de KLB e FGFR1c, com um

EC50 de 34,3 ng/ml e 22,7 ng/mL, respectivamente. Em células transformadas com FGFR4 e KLB, a ativação dependente da dose da atividade de luciferase pelo polipeptídeo quimérico FGF19 foi significativamente menor do que com o FGF19 nativo, com um EC50 de 269 ng/ml e 2,6 ng/mL, respectivamente. A seletividade de cada polipeptídeo FGF19 para FGFR1c e FGFRA4 foi estimada com base nos valores do EC50 calculados usando o software Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, California)))àúÔN Neste exemplo, o polipeptídeo quimérico FGF19 mostrou uma maior seletividade relativa para FGFR1c sobre FGFR4 (baseado nos respectivos valores do EC50 calculados) do que a seletividade relativa correspondente dos polipeptídeos FGF19 nativos.

Exemplo 3: Indução de genes específicos do fígado por bolipeptídeos FGF quiméricos e nativos

[00287] Neste exemplo, camundongos FVB jejuaram durante a noite. Um grupo de amostra (n = 5 ou 6) de camundongos em jejum foi injetado via veia da cauda com um polipeptídeo FGF19-Flag humano nativo (FGF19-Flag na tabela 10, polipeptídeo FGF21-His humano nativo (FGF21-His na tabela 10), polipeptídeo quimérico FGF19-Flag (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10; SEQ ID NO:242) ou veículo de controle de solução tampão de fosfato (PBS). Os polipeptídeos foram fornecidos em PBS a uma dose de 1 mg/kg. Em 4 horas de pós injeção, o tecido do fígado de cada camundongo foi colhido e snap- frozen (submetido a congelamento rápido) em nitrogênio líquido. O tecido total do RNA foi isolado do tecido do fígado colhido usando Qiazol (nº do catálogo 79306, Qiagen, Germantown, Maryland) e usado como um modelo para a síntese de cDNA (Quantitect Reverse Transcription Kit, nº do catálogo 205311, Qiagen). Seguindo protocolos padrão para o PCR em tempo-real quantitativo, o cDNA foi quantificado empregando o corante SYBR Green (nº do catálogo

11760500, Invitrogen, Carlsbad, California) e 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied BioSystems, Inc., Foster City, California), com o gene 36B4 como um padrão. Com referência à Fig. 5, os resultados mostram que os níveis de Egr-1 e cFos mRNA foram os maiores na amostra injetada com polipeptídeos FGF19 nativos, enquanto que os níveis de Egr-1 e cFos mRNA ou estiveram ausentes ou foram significativamente = menores nas amostras injetadas com os polipeptídeos FGF21 nativos ou polipeptídeos FGF19 quiméricos. Os níveis relativos de SHP mRNA ou Cyp7A1 mRNA foram comparáveis entre as amostras que foram injetadas com os polipeptídeos. Os níveis com valores de p < 0,05, < 0,01 e < 0,0005 são indicados por "*", "**"e n***", respectivamente.

Exemplo 4: Indução dos Genes específicos de adipócitos bor polipeptídeos FGF quiméricos e nativos

[00288] O exemplo foi realizado conforme descrito no exemplo 3, com tecido adiposo marrom (BAT) e tecido adiposo branco (WAT) colhido 4 horas após a injeção e congelado rapidamente (snap-frozen) em nitrogênio líquido. Com referência à Fig. 6, os resultados mostram que tais níveis de Egr-1 mMRNA em WAT e UCP-3 mMRNA em BAT, nenhum dos quais expressa um FGFR4 detectável, foram similarmente regulados pelos polipeptídeos FGF empregados. Níveis com os valores de p < 0,05, < 0,01 e < 0,001 são indicados por "*", "**" e "***", respectivamente.

Exemplo 5: Redução da glicemia (glicose no sangue) em camundongos obesos diabéticos por polipeptídeos FGF19 quiméricos e FGF21 nativos

[00289] Neste exemplo, implantou-se subcutaneamente em camundongos de 11 semanas de idade ob/ob (stockt&000632, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) uma bomba osmótica (nº do catálogo 2001, Alzet, Cupertino, California) contendo 200 ul de polipeptídeo FGF21 nativo humano (FGF21-FlagN na tabela 10; Img/mlL em PBS), polipeptídeo quimérico FGF19 (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10; SEQ ID NO:242) (Img/ml em PBS) ou veículo de controle (PBS). Cada grupo de amostra consistiu de nove (9) camundongos. A bomba osmótica foi configurada para fornecer polipeptídeos a uma taxa de — 0,4 mg/kg/dia.

[00290] Com referência à Fig. 7A, o peso corporal e nível de glicemia (glicose no sangue) alimentado aleatoriamente de cada camundongo foi medido iniciando três (3) dias antes da implantação da bomba até cinco (5) dias pós-implantação nos pontos do tempo indicados. A glicemia foi medida usando o sistema de monitoração One Touch 2 Ultra Blood glucose monitoring system (LifeScan, Milpitas, California). A Fig. 7A mostra o peso corporal médio e o nível de glicemia de cada amostra do grupo (níveis com valores de p < 0,05, <0,001 e < 5 x 107 são indicados com "*", "tm E Ne, respectivamente). No dia 5, os camundongos jejuaram durante a noite e mediu-se a glicemia na manhã seguinte. Com referência à Fig. 7B, os níveis de glicemia para cada camundongo nos dias 5 e 6 (que jejuaram durante a noite) são mostrados (níveis com valores de p < 0,002, < 0.0005 e < 5 x 10-10 são indicados por "*", "tm" E me, respectivamente). Os resultados mostram que ambos os polipeptídeos FGF21 humanos nativos e os polipeptíideos FGF19 quiméricos reduziram a glicemia a níveis similares nesses camundongos.

Exemplo 6: Tolerância intraperitoneal à glicose em camundongos diabéticos obesos por polipeptíidecos FGF19 por quiméricos e polipeptídeos FGF21 nativos

[00291] Os camundongos do exemplo 5 foram injetados intraperitonealmente com bolus de glicose em PBS (1 9g/kg) seguindo o jejum noturno no dia 6 para testar a tolerância a glicose. A injeção do bolus ocorreu no ponto correspondendo ao tempo time = O na Fig. 8A.

Subsequentemente à injeção de bolus, mediu-se os níveis de glicose no sangue para cada camundongo nos pontos do tempo indicados, com o nível médio de glicemia para cada amostra do grupo mostrado na Fig. 8A. Com referência à Fig. 8B, a área sob a curva (AUC) entre t = 0 e 120 min durante o teste de tolerância à glicose (GTT) para cada animal foi plotada. Os valores de p para a amostra injetada com polipeptídeos FGF21 humanos nativos ou com o polipeptídeo quimérico FGF19 comparados com o PBS de controle foram ambos < 0,001 de acordo com o teste t de Student. Os resultados mostram que ambos os polipeptídeos FGF21 nativos humanos e o polipeptídeo FGF19 quimérico não mostraram tolerância similar a glicose nesses camundongos em jejum.

Exemplo 7: Atividade dos polipeptídeos de fusão FGF-Fc nativos e quiméricos

[00292] Neste exemplo, meios condicionados contendo um polipeptídeo de fusão FGF-Fc é colhido de células transfectadas com o vetor de expressão correspondente. Células HEK293S foram trasfectadas transientemente com um vetor de expressão que codifica polipeptídeos FGF 19 nativos humanos fundidos à terminação N de um fragmento humano IgG1-Fc via um ligador com 21 aminoácidos GGGGSGGGGSDYKDDDDKGRAQVT (SEQ ID NO:286), polipeptídeos nativos humanos FGF21 fundidos à terminação N de um fragmento humano IgG1-Fc via um ligador com 4 aminoácidos GGGG, ou um polipeptídeo humano quimérico FGF19 (cFGF21/19-2) fundido à terminação N do fragmento humano IgG1-Fc via um ligador com 4 aminoácidos GGGS. Células transfectadas simuladas foram usadas como controle. As células foram cultivadas durante a noite em DMEM contendo 10% de FBS, como acima. As células foram então lavadas e cultivadas em um meio livre de soro enriquecido derivado da mistura F12/DME 50:50 por dois (2) dias. De cada amostra, foi colhido um meio condicionado. Volumes iguais (6,5 ul) de cada meio condicionado de cada amostra foram empregados para análise immunoblot usando anticorpos específicos para o fragmento humano IgG-Fc. Os resultados immunoblot são mostrados na Fig. 9B, que mostra a presença de um polipeptídeo contendo um fragmento Fc com o peso molecular esperado nos meios condicionados que foram colhidos das células transformadas com fusão de FGF19-Fc, FGF21- Fc e cFGF21/19-2-Fc.

[00293] Neste exemplo, os meios condicionados foram usados para demonstrar a atividade dos polipeptídeos de fusão FGF-Fc. As células HEK293S em uma placa com 96 cavidades foram transientemente transfectadas com um vetor de expressão que codifica o ativador transcricional GAL4-Elk-1 (pFA2-Elk1, Stratagene), e uma expressão vetorial que codifica um gene reporter codificador de luciferase de vagalume sob controle do ativador fluxo acima (upstream) da levedura GAL4 (pFR-luc, Stratagene). Em alguns experimentos, células também foram transfectadas com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo Klotho-beta (KLB). Um vetor para a expressão constitutiva de luciferase de Renilla (pRL-SV40, Promega) também foi transfectado nas células. As transfecções foram realizadas usando um FuGENE HD Transfection Reagent (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante .

[00294] As células transfectadas foram cultivadas durante a noite em DMEM contendo 10% de FBS, como acima. As células foram então lavadas e cultivadas por 6 horas adicionais em um meio preparado a partir de 1 parte do meio condicionado diluído com 3 partes de soro de um meio livre de soro enriquecido derivado da mistura F12/DME 50:50, o meio final contendo 25 mg/L de heparina porcina. As células foram então lisadas com um reagente PLB (nº do catálogo E1941, Promega) e a atividade da luciferase em cada cavidade foi determinada usando Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) e EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer) de acordo com as respectivas instruções do fabricante. Cada atividade da luciferase de vagalume foi normalizada para a atividade da luciferase de renilla co-expressa, e cada condição da amostra foi realizada em triplicado.

[00295] Com referência à Fig. 9A, cada atividade da luciferase normalizada é mostrada como uma média e o erro padrão da média das três réplicas. Os resultados mostram que a atividade da luciferase das células HEK293S transformadas, com a presença de KLB, pode ser ativada por um polipeptídeo FGF19-Fc nativo humano ou pelos polipeptídeos quiméricos FGF19-Fc de uma maneira similar aos seus respectivos análogos de não fusão Fc. Entretanto, em contraste com os análogos de não fusão FC correspondentes aos polipeptídeos FGF21 nativos, os polipeptídeos de fusão FGF21-Fc mostraram uma ativação substancialmente menor da luciferase de vagalumes mesmo na presença de KLB.

Exemplo 8: Especificidade do receptor de polipeptídeos nativos e quiméricos FGF

[00296] Neste exemplo, mioblastos L6 de ratos em uma placa com 48 cavidades foram transientemente transfectados com um vetor de expressão codificando tanto polipeptidecos FGFR4 humanos, polipeptídeos FGFR1c humanos ou um vetor de controle. Também foram transfectados em cada amostra celular um vetor de expressão que codifica o polipeptídeo Klotho-beta (KLB), um vetor de expressão que codifica um ativador GAL4-Elk-1 transcricional (pFA2-EIk1, Stratagene), um vetor de expressão que codifica um gene reporter da luciferase de vagalume sob o controle do ativador fluxo acima (upstream) da levedura GALA4 (pFR-luc, Stratagene), e o vetor para a expressão constitutiva da luciferase da renilla (pRL-SV40, Promega). Transfecções foram realizadas usando o reagente de transfecção

FuGENE HD (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante .

[00297] As células L6 transfectadas foram cultivadas durante a noite em DMEM contendo 10% de FBS, como acima. As células foram então lavadas e cultivadas por 6 horas adicionais em meio condicionado livre de soro (cada meio condicionado foi produzido e colhido de acordo com o Exemplo 7, diluído para uso com um igual volume de meio livre de soro) contendo 25 mg/L de heparina porcina. O meio condicionado continha tanto um vetor de controle (grupo A na Fig. 10) (vetor derivado de pUC contendo um promotor CMV:); polipeptídeos FGF21-FlagC nativos humanos (FGF21-FlagC na tabela 10; grupo B na Fig. 10); polipeptídeos nativos humanos FGF19-Flag (FGF19-Flag na tabela 10; grupo C na Fig. 10); um primeiro polipeptídeo quimérico FGF19 contendo uma sequência N terminal derivada de FGF21 nativo humano (grupo D na Fig. 10) (cFGF21/19- 13/Flag na tabela 10,

HPIPDSSPLLQOFGGQAQVRARYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT VGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCARPDGALYGSLH FDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGP

ARFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEKDYKDDDDK; SEQ ID NO:253); um segundo polipeptídeo quimérico FGF19 contendo uma sequência N-terminal derivada de FGF21 nativo humano (grupo E na Fig. 10) (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10;

HPIPDSSPLLAOFGGQAQVRARYLYTSGPHGLSSCFLRIRADG VVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLL QYVERDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGF

LPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGL EAVRSPSFEKDYKDDDDK; SEQ ID NO:242) ou um polipeptídeo quimérico FGF19 contendo uma sequência N-terminal derivada de

FGF19 nativo humano (grupo F na Fig. 10) (cFGF19/21-2/Flag na tabela 10; RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTDDAQQTEAHLEI|

REDGTVGGAADOQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCAQRPDGAL YGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDP

APRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGR SPSYASDYKDDDDK; SEQ ID NO:255). As células foram então lisadas com um reagente PLB (Promega) e a atividade da luciferase em cada cavidade foi determinada usando Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) e EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer) de acordo com as instruções do respectivo fabricante. Cada atividade da luciferase de vagalume foi normalizada paa a atividade da luciferase co-expressa, e cada condição de amostra foi executada em triplicado.

[00298] Com referência à Fig. 10, cada atividade da luciferase normalizada é mostrada como uma indução de fold sobre as células transfectadas correspondentes em amostras do grupo A, que foram incubadas no meio condicionado de controle derivado de células transfectadas com o vetor de controle. Cada indução de fold (dobra) é mostrada como uma média e um erro padrão da média das três réplicas. Os resultados mostram que a indução de fold da atividade de luciferase normalizada nas células L6 expressando FGFR1c foi comparável entre as amostras do não controle. Entretanto, a indução de fold em células L6 que expressam FGFR4 foram significativamente maiores nas células incubadas com FGF19 nativo do que naquelas células incubadas tanto com polipeptídeos FGF21 nativos ou polipeptídeos quiméricos FGF 19.

Exemplo 9: Atividade de Polipeptídeos quiméricos FGF19 — Parte 1

[00299] Neste exemplo, polipeptídeos quiméricos FGF19 contendo domínios N-terminais derivados do polipeptídeo FGF19 nativo humano foram testados quanto à atividade. Todos os polipeptídeos testados também continham um epítopo etiqueta C terminal Flag. Células HEK293S foram transfectadas transientemente com um vetor de expressão que codifica o polipeptídeo Klotho-beta (KLB), um vetor de expressão que codifica um ativador GAL4-Elk-1 transcricional (pFA2- EIlk1, Stratagene), um vetor de expressão que codifica um gene reporter de luciferase de vagalume sob controle do ativador da levedura GALA fluxo acima (pFR-luc, Stratagene), e o vetor para a expressão constitutiva de luciferase de renilla (pRL-SV40, Promega). Mioblastos L6 de rato foram transfectados transientemente com um vetor de expressão que codifica tanto o polipeptídeo humano FGFR4 quanto o polipeptídeo FGFR1c humano, um vetor de expressão que codifica o polipeptídeo Klotho-beta (KLB), um vetor de expressão que codifca um ativador transcricionall GAL4-Elk-1/ — (pFA2-EIk1, Stratagene), um vetor de expressão que codifica um gene reporter da luciferase sob o controle do ativador upstream da levedura GAL4 (pFR-luc, Stratagene), e o vetor para a expressão constitutiva da luciferase de Renilla (pRL-SV40, Promega). Transfecções foram executadas usando o reagente de transfecção FUGENE HD (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante.

[00300] As células HEK293S e L6 transfectadas foram cultivadas durante a noite em DMEM contendo 10% de FBS, como acima. As células foram então lavadas e cultivadas por 6 horas adicionais em meio condicionado livre de soro (cada meio condicionado foi produzido e colhido de acordo com o Exemplo 7, diluído para uso com um volume igual de meio livre de soro) contendo 25 mg/L de heparina porcina. Os meios condicionados foram colhidos de células transfectadas com polipeptídeos FGF21-FlagC nativos humanos (A na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF1I9 cFGF19/21-1/Flag (cFGF19/21-1/Flag na tabela 10; B na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-2/Flag (cFGF19/21-2/Flag na tabela 10; C na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-3/Flag (cFGF19/21-3/Flag na tabela 10; D na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-4/Flag (cFGF19/21-4/Flag na tabela 10; E na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-5/Flag (cFGF19/21-5/Flag na tabela 10; F na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-6/Flag (cFGF19/21-6/Flag na tabela 10; G na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-7/Flag (cFGF19/21-7/Flag na tabela 10; H na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-8/Flag (cFGF19/21-8/Flag na tabela 10; | na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-9/Flag (cFGF19/21-9/Flag na tabela 10; J na Fig. 11), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21/19-29/Flag (cFGF19/21/19-29/Flag na tabela 10; K na Fig. 11), ou polipeptídeos nativos FGF19-Flag (L na Fig. 11).

[00301] Com referência à Fig. 11, a atividade da luciferase do vagalume para cada amostra foi normalizada para a atividade da luciferase de renilla co-expressa, e cada condição de amostra foi realizada em triplicata. A atividade da luciferase normalizada foi comparada à atividade dos polipeptídecos FGF19-Flag nativos humanos, em que "+" indica atividade substancialmente equivalente àquela do polipetídeo de fusão FGF19-Fc nativo humano, "+/-" indica atividade intermediária e, "—" indica nenhuma atividade detectável. Meios condicionados que não mostraram nenhuma atividade detectável ou intermediária nas células HEK293S não foram testados nas células L6.

Exemplo 10: Atividade dos polipeptídeos quiméricos FGF19 — Parte 2

[00302] Neste exemplo, polipeptídeos quiméricos FGF19 contendo domínios N terminais derivados do polipeptídeo FGF21 nativo humano foram testados quanto à atividade. Todos os polipeptídeos testados também continham um epítopo etiqueta (tag) C terminal Flag. O ensaio foi realizado conforme descrito no exemplo 9. Os meios condicionados foram colhidos de células transfectadas com polipeptídeo FGF19-Flag nativo humano (FGF19-Flag na tabela 10; A na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-1/Flag (cFGF21/19-1/Flag na tabela 10; B na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-2/Flag (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10; C na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-7/Flag (cFGF21/19-7/Flag na tabela 10; D na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-8/Flag (cFGF21/19- 8/Flag na tabela 10; E na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-9/Flag (cFGF21/19-9/Flag na tabela 10; F na Fig. 12), polipeptídeo — quimérico FGF19 cFGF21/19-10/Flag (cFGF21/19- 10/Flag na tabela 10; G na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-11/Flag (cFGF21/19-11/Flag na tabela 10; H na Fig. 12), polipeptídeo — quimérico FGF19 cFGF21/19-12/Flag (cFGF21/19- 12/Flag na tabela 10; | na Fig. 12), polipeptídeo quimérico FGF19 cFGF21/19-13/Flag (cFGF21/19-13/Flag na tabela 10; J na Fig. 12), ou polipeptídeo FGF21-FlagC nativo (FGF21-FlagC na tabela 10; K na Fig. 12).

[00303] Com referência à Fig. 12, a atividade da luciferase do vagalume para cada amostra foi normalizada para a atividade da luciferase de Renilla co-expressa, e cada condição da amostra foi realizada em triplicata. A atividade da luciferase normalizada foi comparada à atividade do polipeptídeo de fusão FGF19-Fc nativo humano, em que "+" indica atividade substancialmente equivalente àquela do polipeptídeo de fusão FGF19-Fc nativo humano, "+/-" indica atividade intermediária, e "—" indica nenhuma atividade detectável. Meios condicionados que não mostraram nenhuma atividade detectável ou intermediária em células HEK293S não foram testados em células L6.

Exemplo 11: Atividade de polipeptídeos quiméricos FGF19 — Parte 3

[00304] Neste exemplo, polipeptídeos quiméricos FGF19 contendo domínios N terminais derivados dos polipeptídeos FGF21 nativos humanos foram testados quanto à atividade. Todos os polipeptídeos testados também continham um epítopo etiqueta C terminal Flag. O ensaio foi realizado conforme descrito no exemplo 9, exceto pelo fato de que somente as células HEK293S transfectadas e as células L6 transfectadas FGFRA4 foram usadas no teste. Os meios condicionados foram colhidos de células transfectadas com polipeptídeos FGF21- FlagC nativos humanos (FGF21-FlagC na tabela 10; A na Fig. 13), polipeptídeos FGF19-Flag nativos humanos (FGF19-Flag na tabela 10; B na Fig. 13), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-1/Flag (cFGF21/19-1/Flag na tabela 10; C na Fig. 13), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-2/Flag (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10; D na Fig. 13), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-3/Flag (cFGF21/19-3/Flag na tabela 10; E na Fig. 13), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-4/Flag (cFGF21/19-4/Flag na tabela 10; F na Fig. 13), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-5/Flag (cFGF21/19-5/Flag na tabela 10; G na Fig. 13), ou polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-6/Flag (cFGF21/19-6/Flag na tabela 10; G na Fig. 13).

[00305] Com referência à Fig. 13, a atividade da luciferase do vagalume para cada amostra foi normalizada para a atividade da luciferase da renilla co-expressa, e cada condição da amostra foi realizada em triplicata. A atividade da luciferase normalizada foi comparada à atividade dos polipeptidecos FGF19-Flag nativos humanos, em que "+" indica atividade substancialmente equivalente àquela de polipeptídeos FGF19-Flagn nativos humanos, "+/-" indica atividade intermediária, e "—" indica nenhuma atividade detectável. Meios condicionados que não mostraram atividade detectável ou mostraram atividade intermediária em células HEK293S não foram testados em células L6.

[00306] A Fig. 13 ainda mostra um alinhamento proposto das respectivas sequências de aminoácido da porção N terminal dos polipeptídeos testados. Resíduos aminoácidos selecionados que correspondem aos motivos LYT e LxxIxxG conservados em cada polipeptídeo são indicados no alinhamento por caixas delineadas.

Exemplo 12: Atividade de Polipeptídeos quiméricos FGF19 — Parte 4

[00307] Neste exemplo, polipeptídeos quiméricos FGF19 contendo domínios N-terminais e internos derivados de polipeptídeos nativos humanos FGF21 foram testados quanto à atividade. Todos os polipeptídeos testados também continham um epítopo etiqueta C terminal Flag. O ensaio foi realizado conforme descrito no exemplo 9. Os meios condicionados foram colhidos de células transfectadas com polipeptídeos FGF21-FlagC nativos humanos (conforme indicado na Fig. 14), polipeptídeos FGF19-Flag nativos humanos (conforme indicado na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19- 2/Flag (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10; A na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-3/Flag (cFGF21/19-3/Flag na tabela 10; B na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-4/Flag (cFGF21/19-4/Flag na tabela 10; C na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-5/Flag (cFGF21/19-5/Flag na tabela 10; D na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF21/19-6/Flag (cFGF21/19-6/Flag na tabela 10; E na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21/19-1/Flag (cFGF19/21/19-1/Flag na tabela 10; F na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21/19-2/Flag (cFGF19/21/19-2/Flag na tabela 10; G na Fig.

14), —polipeptídeos — quiméricos — FGF19 — cFGF19/21/19-3/Flag (cFGF19/21/19-3/Flag na tabela 10; H na Fig. 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21/19-4/Flag (cFGF19/21/19-4/Flag na tabela 10; | na Fig 14), polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21/19-5/Flag (cFGF19/21/19-5/Flag na tabela 10; J na Fig. 14), —polipeptídeos — quiméricos — FGF1I19 — cFGF19/21/19-6/Flag (cFGF19/21/19-6/Flag na tabela 10; K na Fig. 14), ou polipeptídeos quiméricos FGF19 cFGF19/21-1/Flag (cFGF19/21-1/Flag na tabela 10; L na Fig. 14).

[00308] Com referência à Fig. 14, a atividade da luciferase do vagalume para cada amostra foi normalizada para a atividade da luciferase de renilla co-expressa, e cada condição de amostra foi realizada em triplicata. A atividade da luciferase normalizada foi comparada à atividade para polipetíideos FGF19-Flag nativos humanos, em que "+" indica atividade substancialmente equivalente àquela de polipeptídeos FGF19-Flag nativos humanos, "+/—" indica atividade intermediária, e "—" indica nenhuma atividade detectável. Meios condicionados que não mostraram nenhuma atividade detectável ou intermediária em células HEK293S não foram testados em células L6.

[00309] A Fig. 14 ainda mostra um alinhamento proposto das respectivas sequências de aminoácido das porções terminais N dos polipeptídeos testados. Resíduos aminoácidos selecionados que correspondem aos motivos conservados LYT e LxxIXxG em cada polipeptídeo são indicados no alinhamento por caixas delineadas.

Exemplo 13: Desfosforilação STATS reduzida em polipeptídeos FGF19 quiméricos

[00310] Neste exemplo, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção foi testado quanto ao seu efeito na desfosforilação em STAT5. Camundongos macho de cinco semanas de idade

C57BL/6J (cerca de 18 até 19 gramas cada) foram injetados subcutaneamente em duplicata com polipeptídeos FGF21-His nativos humanos (nº. do catálogo 2539-FG-025/CF, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), polipeptídeos FGF19-Flag quiméricos (cFGF21/19-2/Flag na tabela 10; SEQ ID NO:242) ou transportador de controle, solução salina tamponada de fosfato (PBS). Os polipeptídeos foram solubilizados em PBS e fornecidos em uma dose de 1 mg/kg (cerca de 20 ug de polipeptídeos por injeção) duas vezes por dia por dois dias. Na manhã seguinte do terceiro dia, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com uma quinta dose e final de 1 mg/kg do respectivo polipeptídeo ou controle, e sacrificados 2 horas mais tarde. O fígado de cada camundongo foi recuperado e um extrato nuclear do fígado foi preparado usando um kit de extração nuclear (nº do catálogo 10009277, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). Para cada amostra de extrato nuclear, 225 pg de proteína foram redissolvidos por SDS poliacrilamida gel eletroforese e analisados por immunoblotting usando um anticorpo específico para a proteína Stat5 que é fosforilada em Tyr694 (nº do catálogo 9314, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts). Uma faixa não específica ("NS"), que foi usada em um controle de carregamento, é mostrada como detectável aproximadamente nas mesmas quantidades em cada pista. Resultados similares foram observados (dados não mostrados) no que se refere aos níveis de Try694-fosforilada-Stato com outro anticorpo monoclional específico para o Tyr694-fosforilada-Stat5 (nº de catálogo 9359, Cell Signaling Technology).

[00311] Com referência à Fig. 15, os resultados mostram que a proteína Stat5 Tyr694-fosforilada não foi detectável no camundongo que foram injetados com polipeptídeos FGF21 nativos humanos. Entretanto, camundongos que foram injetados com o polipeptídeo quimérico FGF19 mostraram níveis significativos da proteína Stat5 fosforilada.

Exemplo 14: Promoção reduzida do crescimento indepentende de ancoragem de polipeptídeos FGF19 quiméricos

[00312] Neste exemplo, um polipeptídeo quimérico FGF19 da presente invenção foi testado quanto a seu efeito no crescimento dependente de ancoragem de células de hepatoma humano HepG2, que expressam KLB e FGFR4. Uma placa com 96 cavidades foi preenchida com 50 uL por cavidade de base agar fundida (DMEM, 0,5% de agarose e 10% de FBS). Depois que a base agar solidificou, cerca de 670 células HepG2 suspensas em 50 yuL de solução agar de topo derretida (DMEM, 0,35% de agarose e 10% de FBS) foram adicionadas à base agar em cada cavidade e permitiu-se que solidificassem.

[00313] Em seguida à solidificação da suspensão celular, 20 ul do meio de cultura (DMEM e 10% de FBS) foram adicionados a cada cavidade num dia designado de dia zero (0). Para uma dada amostra experimental, o meio de cultivo ainda incluiu tanto polipeptídeos FGF19-Flag nativos humanos, polipeptídeos FGF21-His nativos humanos (nº. de catálogo 2539-FG-025/CF, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), polipeptídeo quiméricos rotulados FGF19 flag (cFGF21/19-2/Flag; SEQ ID NO:242), ou nenhum polipeptídeo FGF como um controle. A concentração de polipeptídeo no meio de cultivo adicionada no dia zero foi ou de 120 ng/mL ou de 1200 ng/mL, de modo que a concentração final em cada cavidade se torna de 20 ng/mL ou 200 ng/mL, respectivamente. Em cada dia subsequente 2, 4, 6 e 8, outros 20 ul do meio de cultura foram adicionados a cada cavidade, em que outro meio de cultura adicionado a uma dada cavidade continha o mesmo polipeptídeo FGF que nas aplicações anteriores àquela cavidade, mas com um sexto da concentração do polipeptídeo FGF (i.e. 20 ng/mL ou 200 ng/mL) do que aquela do dia zero. Um subconjunto das cavidades das amostras foi também tratado com o inibidor da síntese de proteínas G418 para fornecer um sinal de fluorescência de fundo.

[00314] No dia 59,10 ul de reagente AlamarBlue (nº do catálogo DAL1100, Invitrogen) foi adicionado a cada cavidade da amostra e a placa ainda foi incubada por 5 horas para testar o total da atividade metabólica em cada cavidade. A intensidade fluorescente resultante foi medida usando um EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Cinco (5) réplicas de cada amostra foram testadas.

[00315] Com referência à Fig. 16, os resultados são mostrados como intensidade fluorescente acima do fundo e representam a média e desvio padrão das cinco (5) réplicas. Os resultados mostram que a atividade metabólica total, como um indicador proposto de crescimento das células independente de ancoragem, foi promovido pela adição de polipeptídeos FGF19 nativos humanos, mas tal atividade foi reduzida com a adição de polipetídeos FGF21 nativos humanos ou os polipeptídeos FGF19 quiméricos (valores p < 0,05 comparados às amostras tratadas simuladas de acordo com o teste t de student).

Exemplo 15: FGF19 regula a proliferação celular, o metabolismo da glicose e do ácido biliático via caminhos dependentes de FGFR4 e independentes

[00316] Para investigar as exigências para FGFR4 na mediação da atividade FGF19 através do uso de camundongos deficientes em Fgfr4 bem como uma variante de proteína de FGF19, que é especificamente aperfeiçoada na sua capacidade de ativar FGFRA4.

Materiais e Métodos

[00317] Expressão de proteína recombinante FGF. Sequências de aminoácido de FGF19, FGF21, e quimeras foram construídos, os desenhos dos construtos das quimeras feitos são mostrados na figura 18B). Os construtos com a numeração de 1-17 mostrados na figura

18B correspondem aos construtos compreendendo as sequências de aminoácidos SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:270 (RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVV

DCARGQSAHSLLEIKALKPGTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQ YVERDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLP

LSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK), SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:273, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:275, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:85, e SEQ ID NO?Z, respectivamente. Todos os contrutos mostrados na figura 18B também incluíram sequências de sinais na extremidade N terminal (clivada mediante secreção) e a etiqueta flag (DYKDDDDK (SEQ ID NO:279)) na extremidade C terminal.

[00318] A menos que explicitado de outro modo, recombinante humano FGF21, FGF19 e variantes produzidas em célula CHO transientemente transfectadas e purificadas até a homogeneidade em PBS foram usados para experimentos. Para alguns experimentos, foram usados FGF21 (2539-FG/CF, R&D systems) derivados de E. coli. Todas as proteínas purificadas foram testadas por ensaios GAL- EIlk1i com base em células quanto à sua atividade antes da aplicação em outro ensaio. Para experimentos nas Fig 18B, 18C, e 20, proteínas FGF foram expressas em células HEK293 transientemente transfectadas e meio livre de soro recentemente condicionado (fresco) foi usado para ensaios sem purificação.

[00319] Ensaio com luciferase. Todas as células foram cultivadas em um meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37ºC sob 5% de CO?2. Mioblastos L6 de rato em uma placa com 96 cavidades foram transientemente transfectados com vetores de expressão codificando luciferase de renilla (pRL-SV40, Promega), KLB humano, FGFR humano apropriado, ativador transcricional GAL4-Elk-1 (pFA2-EIk1, Stratagene), e sítios de ligação GAL4 levados por luciferase de vagalume reporter (pFR-luc, Stratagene), usando reagente de transfecção FUGENE HD (Roche Applied Science). No dia seguinte, as células transfectadas foram cultivadas por 6-8 horas adicionais em um meio livre de soro contendo 25 mg/L de heparina porcina (Sigma) e proteína FGF a várias concentrações. As células foram então lisadas com um reagente PLB (Promega) e a atividade de luciferase em cada cavidade foi determinada usando um sistema de ensaio Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) e EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). A atividade de luciferase de vagalumes foi normalizada para a atividade de luciferase de renilla co-expressa, e foi mostrada como uma média e erro padrão da média das três réplicas.

[00320] Ensaio de proliferação celular independente de ancoragem. Uma placa com 96-cavidades foi preenchida com 50 ul/cavidade de 0,5% de agarose derretida em meio de cultura. Após a base de agarose ter solidificado, cerca de 670 células de HepG2 suspensas em 50 uL de solução de topo de agarose derretida (0,35% de agarose em meio de cultura) foram adicionados à base agar em cada cavidade, e permitiu-se solidificar. Em seguida à solidificação, 20 ul de um meio de cultura contendo uma quantidade apropriada de proteína FGF foi adicionada a cada cavidade no dia designado dia O. Em cada um dos dias subsequentes 2, 4, 6 e 8, um outro meio de cultura de 20 ul com uma quantidade apropriada de proteína FGF foi adicionada a cada cavidade. Um subconjunto das cavidades de amostra também foi tratado com um inibidor de síntese de proteína Geneticin (invitrogen) para fornecer um sinal de fluorescência de fundo. No dia 9, foram adicionados 10 ul de reagente AlamarBlue (Invitrogen) a cada cavidade de amostra e a placa foi incubada ainda por 5 horas. A intensidade fluorescente resultante foi medida usando EnvVision Multilabel Reader (PerkinElmer) e usada como uma indicação da atividade metabólica total em cada cavidade. Cinco réplicas de cada amostra foram testadas.

[00321] Ensaio de ligação FGFR/ligador. Atividade de ligação FGFR de FGF19 e FGF19v foi medida conforme descrito em Desnoyers et al, Oncogene 27(1):85-97 (2008) empregando o anticorpo anti-FGF19 biotinilado (BAF969, R&D systems) na presença de 2 ugml de heparina. Experimentos de controle ELSA foram realizados usando o anticorpo anti-FGF19 (AF969, R&D systems) e o anticorpo anti-FGF19 biotinilado (BAF969, R&D systems) para confirmar que o anticorpo reage a FGF19 e a FGF19v de uma maneira indistinguível.

[00322] Estudos de Camundongo. Camundongos foram mantidos em uma instalação animal livre (canil librê) de patógenos a 21 ºC sob um padrão de ciclo de 12 h luz/12 h escuridão com acesso a ração (uma ração para roedores padrão (Labdiet 5010, 12,7% de calorias de gordura) ou uma dieta de alta gordura, rica em carbohidratos (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% de calorias da gordura) e água ad libitum. Camundongos macho foram usados pra todos os experimentos. Camundongos FGFR4 KO em fundo C57BL/6 foram previamente descritos por Weinstein et al., Development 1998 125(18):3615-23 (1998). Camundongos C57BL/6, camundongos ob/ob em fundo C57BL/6 e camundongos FVB/NJ foram comprados do Jackson Laboratory. Para infusão contínua da proteina FGF, uma bomba osmótica (Alzet 2001) foi implantada subcutaneamente. Para o teste de tolerância a glicose, níveis de glicose foram medidos usando um glucômetro One Touch Ultra glucometer. Foram feitas estatísticas com o teste t de Student. Valores estiveram presentes como média +/- desvio padrão. O tingimento BrdU foi realizado conforme descrito como fNicholes, 2002 tH79) e hepatócitos BrdU positivos foram contados com o uso do sistema de análise de imagem automatizado Ariol. Todos os estudos de animais foram realizados sob protocolos aprovados do Genentech's Institutional Animal Care and Use Committee.

[00323] Análise do soro. Colesterol total, triglicerídeos, B- hidroxibutilatos (BHB), lactatos Thermo DMA) e ácido graxo não esterificado (Roche) foram determinados pelo uso de reações enzimáticas. Níveis de insulina do soro foram determinados por ELISA (crystal chem). A composição BA foi determinada por análise de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa conforme previamente descrito por Stedman et al., J Biol Chem. 279(12):11336- 43 (2004).

[00324] Análise da expressão genética. RNAs de tecido foram isolados usando o reagente QIAzol (Qiagen). cDNA foi sintetizado com O kit de transcrição Quantitect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Para qPCR em tempo real, amostras foram feitas em triplicata no ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems) usando uma mistura universal ver SYBR (Invitrogen) ou a mistura universal Tagman (Roche) e normalizada por níveis de 36B4. Primers pré-desenhados Quantitect primers para GK, SHP, Cyp8b1, IGFBP2, e AFP foram obtidos da Qiagen e todos os outros primers foram desenhados usando um software primer express (Applied Biosystems).

A. FGFR4 regula soro de ácidos biliáticosó, mas não o aperfeiçoamento da tolerância a glicose por FGF19 recombinante

[00325] Para determinar quais dos efeitos metabólicos provocados por FGF19 são mediados por FGFR4, camundongos WT alimentados com HFD ou Fgfr4 KO foram tratados com FGF19 recombinante ou veículo de controle, e fenótipos metabólicos e expressão de genes foram estudados. Para obter exposição sustentada a FGF19,

camundongos FGFR4 WT e KO com 12 até 15 semanas de idade em uma dieta rica em gorduras por 6 semanas foram implantados com uma bomba osmótica para bombear continuamente uma infusão de FGF19 a 1ng/h. Esta adquiriu uma concentração média de soro FGF19 de 26 ng/ml, conforme determinado por ELISA, que é de aproximadamente 50 até 250 vezes maior do que as concentrações de FGF19 circulando em humanos. No dia 6, camundongos em jejum durante a noite foram submetidos a um teste de tolerância a glicose com injeção i.p. de glicose a 19/kg. A infusão FGF19 aperfeiçoou a tolerância a glicose em uma extensão similar a ambos os camundongos WT e Fgafr4 KO (Fig. 17A), indicando que FGFR4 é dispensável para o aperfeiçoamento na tolerância a glicose em camundongos alimentados - HFD. A infusão contínua de FGF19 não induziu uma significante perda de peso, assim o aperfeiçoamento da tolerância a glicose foi independente do peso corporal. No dia 7, FGF19 reduziu o peso do fígado e soro insulina, bem como aumentou a formação do corpo cetona (BHB) em ambos os camundongos WT e Fgfr4 KO (Fig. 17B). FGF19 também reduziu o lactato e triglicerídeos do soro em camundongos WT mas não em Fgfr4 KO (Fig. 17B), apesar deste último ter exibido níveis de lactato e triglicerídeos reduzidos antes do tratamento.

[00326] Para avaliar as mudanças no metabolismo do BA (ácido biliático), a composição do soro BA foi determinada por espectrometria de massa — cromatografia líquida (Fig. 17C). Infusão de FGF19 reduziu ácido cólico livre (CA) e taurina conjugada e o ácido deoxicólico biliático secundário derivado de CA em camundongos WT, enquanto apresentava um efeito mínimo nos metabólitos CDCA (CDCA). Esta descoberta é consistente com uma mudança na síntese de BA para a via alternativa (ácida), contornando o FGF19-suprimido Cypral e procedendo assim a Cyprbl (Fig 17D).

Correspondentemente, a perda de Fgfr4 aumentou os níveis basais de CA e seus metabólitos enquanto reduziu os ácidos muricólicos (metabólitos hidroxilados de CDCA), indicando que FGFR4 não somente é importante como um regulador da síntese do ácido biliático, mas é também um determinante da proporção de CA para a produção de CDCA. Para determinar o papel do FGFR4 na regulação da expressão dos genes hepáticos, uma faixa de mMRNAs hepáticos foi examinada por QPCR (Fig. 17D). A infusão FGF19 induziu a expressão de marcadores da proliferação celular tais como Egr-1, c- Fos, e AFP, e suprimiu a expressão de Cyp7a1l em camundongos WT mas não em Fgfr4 KO. Em contraste, FGF19 suprimiu Cyp8b1 e glicoquinase (GK) em ambos os camundongos WT e Fgafr4 KO, enquanto a expressão dos níveis basais de Cyp8b1 e Cyp27a1 foram muito mais elevadas em camundongos Fgfr4 KO se comparado a WT. O Cyp8b1 é obrigatório para a síntese de (ácido) cólico, mas não de CDCA, portanto as mudanças observadas na expressão de Cyp8b1 contribuem para alterar o equilíbio entre os metabólitos de CA e CDCA (ácidos muricólicos) em camundongos Fgafr4á KO (Fig. 17C e D). Consideradas juntas, nossas descobertas revelam que FGFR4 é um regulador da síntese de BA e impacta na proliferação de hepatócitos, mas não é requisitado para a regulação da utilização de glicose, sensibilidade a insulina, e produção de cetonas pelo corpo por FGF19.

B. Identificação de variantes de FGF19 com uma redução específica na ativação de FGFRA.

[00327] Para avaliar quantitativamente a ativação específica dos FGFRs por FGF19, um ensaio de resposta de FGF a GAL-EIk1 luciferase reporter foi introduzido em células L6 de ratos. Neste ensaios, a ligação eficaz de um ligante a FGFR resulta na ativação de um caminho MAP quinase endógeno, levando à ativação de um ativador transcricional quimérico compreendendo um domínio de ativação Elk-1 e um domínio de ligação GAL4 DNA.

Células L6 não apresentam FGFR ou KLB funcionais e respondem apenas ao FGF19 ou FGF21 quando cotransfectadas com receptores cognatos.

Células L6 foram cotransfectadas com vetores de expressão para KLB e FGFR (FGFG1c ou FGFRA4) junto com GAL-EIlk1, SV40- Luciferase renilla, e resposta Gal à luciferase reporter de vagalume.

Células transfectadas foram incubadas com um meio contendo concentrações crescentes de FGF19 ou FGF21 por 6 horas antes dos ensaios com luciferase.

Os resultados para o ensaio com luciferase mostram que FGF19 e FGF21 ativam FGFR1c, 2c e 3c na presença de KLB, com potência e eficácia similar (Fig. 18A e 19). Em contraste, FGF19, mas não FGF21, ativam eficazmente FGFR4, mesmo na presença de KLB (Fig. 18A). Para mapear os sinais requisitados para a ativação de FGFR4, um número de construtos quiméricos entre FGF19 e FGF21 foram gerados usando resíduos conservados para formar junções (Fig. 18B). Acima são discutidas sequências na seção Materiais e Métodos entitulada Expressão da proteína FGF recombinante.

Cada construto de FGF foi expresso em células HEK293 transientemente transfectadas e os sobrenadantes da cultura contendo proteínas quiméricas FGF secretadas foram testados quanto à ativação de FGFR1c e/ou FGFR4 em células L6 que expressam KLB usando o ensaio GAL-EIk1 reporter.

Baseado na atividade dos FGFR1c e FGFRA4, os construtos quiméricos foram classificados em 4 classes: alta atividade de FGFR1c e FGFRA4 (Classe |, FGF19-ike); alta atividade FGFR1c e baixa atividade, mas detectável de FGFR4 (Classe Il); alta atividade de FGFR1c sem atividade detectável de FGFRA4 (Classe Ill, FGF21-like) e muito baixa atividade ou atividade indetectável de FGFR1c e FGFR4 devido à expressão pobre (Classe IV) (I-Ill, Fig. 18C e 20; IV não mostrada). Este mapeamento indicou que os 39 aminoácidos N- terminais de FGF19 são suficientes para conferir alguma atividade

FGFRA4 quando transferidos a FGF21. Além disso, os 24 aminoácidos N-terminais e os 49 aminoácidos C-terminais de FGF19 são necessários para a atividade total de FGFRA4, mas não são suficientes para conferir atividade FGFR4 quando transferidos a FGF21. Portanto múltiplos sinais em ambos a terminação N e a terminação C de FGF19 contribuem para a ativação de FGFRA.

[00328] Um construto quimérico classificado como uma molécula de classe Il, consistindo dos aminoácidos 1-20 de FGF21 e 25-194 de FGF19 (> 90% idênticos a FGF19), foi selecionado para síntese em grande escala em células CHO e esta variante é referida como "FGF19v". Quando comparado com FGF19 usando o ensaio luciferase reporter, a proteína FGF19v exibiu uma atividade dependente de dose similar a FGF19 em células L6 cotransfectadas com KLB e FGFR1c (Fig 18D). Entretanto, a atividade FGF19v foi significativamente reduzida em células L6 cotransfectadas com ou com FGFRA4 sozinho ou uma combinação de FGFRA4 e KLB (Fig. 18D), FGF19 tenso sido previamente mostrado que se liga diretamente a FGFR4 mesmo na ausência de KLB. FGF19, mas não FGF19v, exibiu atividade de ligação a FGFR4 dependente de dose (Fig. 18E e F).

C. FGFR4 media a Proliferação de hepatócitos in vitro e in vivo

[00329] A atividade de FGF19v foi ainda testada in vivo em comparação com FGF19 e FGF21 por injeção intravenosa em camundongos FVB em jejum durante a noite. Fígados foram colhidos 4 horas após a injeção e a expressão de mMRNA hepático foi determinada por QPCR. Genes que foram intensamente induzidos por FGF19 mas não por FGF21, tal como Egr-1 e c-Fos, não foram eficazmente induzidos por FGF19v, o que é consistente com a atividade FGFR4 reduzida de FGF19v (Fig. 21A). FGF19v teve uma atividade similar a FGF19 ou FGF21 em genes que foram co-

regulados por FGF19 e FGF21, tal como GK. Usando camundongos Fgfr4 KO, FGFR4 contribui para a regulação de Egr-1 e c-Fos, mas não de GK, pelo FGF19 (Fig. 21B). Inesperadamente, FGF21 (bem como FGF19 e FGF19v) alterou a expressão de SHP e Cyp7a1 (Fig. 21A), que foram propostas como os maiores alvos para a regulação por FGF19 dependente de FGFRA4. Alterações em SHP e Cyp7a1 por FGF19 e FGF21 foram observadas até mesmo em camundongos Fgfr4 KO, indicando que com este tratamento agudo, ambos os FGFs endócrinos podem modular a expressão desses genes através de um caminho independente de FGFR4 (Fig. 21B).

[00330] O FGF1I9 aumentou a proliferação independente de ancoragem de células HepG2 em agar macio, e este efeito foi muito menos aparente para proteínas FGF19v ou FGF21 (Fig. 21C). Para ver se FGF19v também exibiu capacidade reduzida de induzir a proliferação de hepatócitos in vivo, administrou-se a camundongos infusão com FGF19, FGF19v (1 ng/h) ou veículo de controle por meio de uma minibomba osmóticaa Além disso, injetou-se intraperitonealmente 1 mg/kg/dia da proteína FGF diariamente por 7 dias aos mesmos camundongos para obter exposições de alto pico. Para capturar eventos proliferativos intermitentes, foi injetada uma solução de BrdU (30 mg/kg) duas vezes ao dia num total de 13 vezes. A proliferação de hepatócitos foi determinada medindo hepatócitos positivos BrdU em fígado colhido no dia 7. Conforme reportado anteriormente, o tratamento com FGF19 resultou em um aumento dramático na incorporação de BrdU; entretanto, esta resposta foi significativamente mascarada para FGF19v (Fig. 21D and E). MRNA hepático para Egr-1, c-Fos, e o marcador da proliferação de hepatócitos AFP foram todos dramaticamente induzidos por FGF19 e essas induções foram largamente ausentes para FGF19v, enquanto a regulação de GK, Cyp7a1 and Cyp8b1 não diferiu entre FGF19 e

FGF19v (Fig. 21F).

D. FGFR4 não é requisitado para melhoramento da hiperglicemia em camundongos ob/ob no FGF19.

[00331] Os resultados in vitro e in vivo descritos acima levantaram a questão de se FGF19v, uma variante de FGF19 com atividade FGFR4 reduzida e potencial proliferativo, poderia melhorar a hiperglicemia em animais diabéticos como o faz FGF21. FGF21, FGF19v (1ng/h) ou veículo de controle foram continuamente administrados por infusão subcutaneamente em camundongos ob/ob empregando minibombas osmóticas. Enquanto a infusão não afetou significativamente o peso corporal (Fig. 22A), ambos FGF21 e FGF19v reduziram dramaticamente os níveis de glicose do sangue (glicemia) em ambos os camundongos alimentados aleatoriamente e em jejum. (Fig. 22A e B), reduziram os níveis de ácido graxo livre circulante (Fig. 22C), e melhoraram a tolerância a glicose (Fig. 22D).

[00332] Para visualizar a proliferação de hepatócitos, injetou-se em animais BrdU 4 horas antes do sacrifício no dia 7. Nem FGF21 nem FGF19v aumentaram a incorporação de BrdU hepático (não mostrado), porém o peso bruto do fígado foi significativamente reduzido (Fig. 22E) e nenhuma mudança significativa na expressão hepática de AFP mRNA foi observada (Fig. 22F). Considerados juntos, FGF19v pode aperfeiçoar o status metabólido de camundongos obesos sem a indução da proliferação de hepatócitos.

[00333] Um número de genes foi identificado e exibiu uma expressão normalmente alterada em camundongos ob/ob tratados com FGF21 e FGF19v. No fígado, ambas as proteínas induziram IGFBP2 (uma proteína anti-diabética recentemente demonstrada), e suprimiram a estearoil-Coenzima A desaturase 1 (SCD-1; um gene lipogênico) e Cyp8b1 (o determinante do equilíbrio entre CA e a produção de CDCA). Além disso, ambos induziram a uma UCP-1

(termogenese adaptiva), SCD-1 e Acyl-CoA deshidrogenase (MCAD; oxidação de ácido graxo mitocondrial) de cadeia média em tecido adiposo marrom, e SREBP-1c (fator de transcrição lipogênico) em tecido branco adipose (Fig. 22F). Portanto, ações em múltiplos tecidos poderiam mediar os efeitos anti-diabéticos de FGF21 e FGF19v que agem através de um mecanismo FGFRA4 independente.

[00334] Examinando o soro BA individual, foi demonstrado que FGF19 recombinante, agindo através de Fgfr4, suprimiu Cyp7a1 fazendo com que a síntese do ácido biliático prosseguisse até o caminho Cyp7a1-independente alternativo (ácido) que leva à produção de CDCA às custas de CA. A expressão de Cyp8b1 aumentou diversas vezes a a morte (knockout) em camundongos Fgfr4 e aquele tratamento com FGF19 suprime Cyp8b1i, uma etapa enzimática obrigatória para a síntese de CA. FGFRA4 foi um determinante da proporção de CDCA para a produção de CA, através de uma regulagem negativa de ambos Cyp7a1l e Cyp8b1. A ativação de FGFR4 desloca a produção de BA para CDCA, enquanto sua abrogação leva à formação de CA. Além disso, FGF19 aumentou a expressão hepática de AFP de uma maneira dependente de Fgafrd4. FGF19 aperfeiçoou a tolerância a glicose em camundongos FGFR4 KO alimentados HFD (Fig 17) e FGF19v, uma proteína especificamente aperfeiçoada para ligação e ativação de FGFRA4, e melhorou a hiperglicemia em camundongos ob/ob (Fig. 18 e 21-22). Além disso dos efeitos da resistência à insulina e metabolismo da glicose, FGF19 aumentou os níveis do soro BHB mesmo em camundongos KO FGFRA4 (Fig. 17), como FGF21. Ambos FGF19 e FGF21 podem ligar e ativar FGFR1c, FGFR2c, e FGFR3c na presença deKLB. Portanto FGFR1c, FGFR2c, ou FGFR3c, em cooperação com KLB, pode mediar os efeitos metabólicos comuns de FGF19 e FGF21.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo quimérico do fator de crescimento de fibroblasto 19 (FGF19), caracterizado pelo fato de que a sequência do polipeptídeo compreende: uma porção terminal C que compreende uma porção terminal C da sequência de polipeptídeo hFGF19; e uma porção terminal N que compreende uma porção terminal N da sequência hFGF21, em que a porção terminal C da sequência de polipeptídeo hFGF19 contém cerca de 45 até cerca de 185 resíduos de comprimento, a porção terminal C da sequência de polipeptídeo hFGF19 contém uma primeira posição e uma posição final, a porção terminal N da sequência de polipeptídeo hFGF21 contém cerca de 7 até cerca de 140 resíduos de comprimento, a porção terminal C da sequência de polipeptídeo hFGF21 contém uma primeira posição e uma posição final.

2. Polipeptídeo quimérico FGF19 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira posição da porção terminal C da sequência de polipetídeo hFGF corresponde a uma posição da SEQ ID NO:1, selecionada do grupo que consiste em: 10, 11, 25, 26, 27, 28, 30, 33, 35, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 72, 73, 74, 79, 80, 81, 143, 144, 145 e 146; e a posição final da porção terminal C da sequência de polipetídeo hFGF corresponde aproximadamente à posição 194 da SEQ ID NO:1, e/ou a primeira posição da porção terminal N da sequência de polipeptídeo hFGF21 corresponde aproximadamente à posição | da SEQ ID NO:2, e a posição final da porção terminal N da sequência de polipeptídeo hFGF21 corresponde a uma posição da SEQ ID NO:2, selecionada do grupo que consiste em: 7, 8, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 66, 67, 68, 73, 74,

75, 135, 136, 137 e 138.

3. Polipeptídeo quimérico FGF1I19 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a primeira posição da porção terminal C da sequência de polipetídeo hFGF19 corresponde à posição 25 da SEQ ID NO:1, ea posição final da porção terminal C da sequência de polipetídeo hFGF corresponde aproximadamente à posição 194 da SEQ ID NO:1 e/ou a primeira posição da porção terminal N da sequência de polipeptídeo hFGF21corresponde, aproximadamente, à posição 1 da SEQ ID NO:2; em que a posição final da porção terminal N da sequência de polipeptídeo hFGF21 corresponde à posição 20 da SEQ ID NO:2.

4. Polipeptídeo quimérico FGF19, caracterizado pelo fato de que a sequência do polipeptídeo compreende: uma primeira sequência de polipeptídeos que contém pelo menos 85% da identidade de sequência SEQ ID NO:1, sendo que uma porção da primeira sequência de polipeptídeo é substituída por uma porção de uma segunda sequência de polipeptídeo, e a segunda sequência de polipeptídeo contém pelo menos 85% da identidade de sequência SEQ ID NO:2, e a porção substituída da primeira sequência de polipeptídeo possui uma primeira e uma última posição, sendo que a primeira posição da porção substituída corresponde à posição na SEQ ID NO:1, selecionada do grupo que consiste em: 1, 10, 11, 17, 18, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 63, 72, 73, 74, 79, 80, 81, 143, 144, 145 e 146, e a última posição da porção substituída corresponde à posição na SEQ ID NO:1, selecionada do grupo que consiste em: 9, 10, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 36, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 66, 71, 72, 73, 78, 79, 80, 142, 143, 144, 145 e 194, e a primeira posição da porção substituída e a última posição da porção substituída são selecionadas de tal modo que a porção substituída da primeira sequência de polipeptídeo é de cerca de 3 até cerca de 185 resíduos de comprimento.

5. Polipeptídeo quimérico FGF19 de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo hFGF19 quimérico compreende ainda uma substituição da alça B1-B2 do primeiro polipeptídeo, uma substituição do segmento B10-B12 do primeiro polipeptídeo, e/ou uma substituição dos resíduos de aminoácidos 38 a 42 do primeiro polipeptídeo com a alça B1-B2 do segundo polipeptídeo, o segmento B10-B12 do segundo polipeptídeo, e/ou a sequência correspondente dos resíduos de aminoácidos do segundo polipeptídeo.

6. Polipeptídeo quimérico FGF19, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência SEQ ID NO:5.

7. Polipeptídeo quimérico FGF19 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo hFGF19 quimérico é fusionado a um segundo polipeptídeo, o segundo polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste: da porção Fc de uma imunoglobulina, de um análogo da porção Fc de uma imunoglobulina e de um ou mais fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina.

8. Polipeptídeo quimérico FGF19 de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: (i) a imunoglobulina é selecionada do grupo que consiste em: IgG-1, IgG-2, IgG-3, I9G-4, IgA-1, IgA-2, IgE, IgD e IgM; e/ou (ii) a porção Fc é humana ou humanizada; e/ou (ili) a terminação C do polipeptídeo hFGF19 quimérico é fundida à terminação N do segundo polipeptídeo, em que, opcionalmente, a terminação C do polipeptídeo hFGF19 quimérico é fundida à terminação N do segundo polipeptídeo via um ligador, o ligador é selecionado do grupo que consiste em: um ligador [Gly]n, um ligador [Gly3Ser]m e um ligador [GIly4Ser]m, em que n é um inteiro de 1a30emé um inteiro de 1 a 6.

9. Polipeptídeo quimérico FGF19 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo hFGF19 quimérico: (i) não ativa substancialmente FGFRA4, tanto de uma maneira Klotho-beta independente como Klotho-beta dependente; (ii) ativa FGFR1c de uma maneira dependente de Klotho- beta; (iii) quando administrado a um indivíduo, não reduz o nível de polipeptideo STAT5 fosforilado do indivíduo, em que, opcionalmente, o individuo é um humano; (iv) quando administtado a um indivíduo, reduz a quantidade de polipeptídeos STATS no indivíduo, mas esta quantidade de polipeptídeos STATS fosforilados é maior do que a quantidade dos polipeptídeos STAT5 fosforilados sob administração do hFGF21 natural em um indivíduo, em que, opcionalmente, o individuo é um humano; (v) quando administrado a um indivíduo, reduz a quantidade de polipeptídeos STATS5 fosforilados a uma quantidade entre: 100% até 5%, de 100% até 10%, de 100% até 20%, de 100% até 30%, de 100% até 40%, de 100% até 50%, de 100% até 60%, de 100% até 70%, de 100% até 80%, de 100% até 90% ou de 100% até 95%, da quantidade de polipeptídeos STAT5 fosforilados no indivíduo sem a administração, em que, opcionalmente, o individuo é um humano; (vi) quando administrado a um indivíduo, a redução na quantidade de polipeptídeo STAT5 fosforilado é menos do que a redução na quantidade de polipeptideco STATS fosforilado sob administração de hFGF21 nativo, em que, opcionalmente, a dita redução é uma porcentagem: de 0% até 5%, de 0% até 10%, de 0% até 20%, de 0% até 30%, de 0% até 40%, de 0% até 50%, de 0% até 60%, de 0% até 70%, de 0% até 80%, de 0% até 90% ou de 0% até 95%, da redução na quantidade do polipeptídeo STATS5 fosforilado sob a administração de hFGF21 nativo, em que, opcionalmente, o individuo é humano; (vii) quando administrado a um indivíduo, não induz a resistência ao hormônio do crescimento, em que, opcionalmente, o individuo é humano; (vili) apresenta uma meia vida fisiológica in vivo que é pelo menos ou aproximadamente igual a do FGF19; ou (ix) apresenta uma meia vida fisiológica in vivo que é pelo menos ou aproximadamente igual a do FGF21.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo quimérico FGF19, como definido em qualquer uma das reivindicações 1age (b) um carreador farmacêutico aceitável.

11. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um medicamento para o tratamento de um indivíduo que exibe uma ou mais: obesidade, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2, alto nível de glicose no sangue, síndrome metabólica, aterosclerose, hipercolesterolemia, derrame, osteoporose, osteoartrite, doenças articulares degenerativas, atrofia muscular, sarcopenia, diminuição da massa magra corporal, calvície, rugas, fadiga aumentada, estamina reduzida, função cardíaca reduzida, disfunção do sistema imunológico, câncer, doença de Parkinson, demência senil, doença de Alzheimer's e função cognitiva diminuída, em que, opcionalmente, o indivíduo é um humano.

12. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para o preparo de um medicamento para reduzir os níveis de glicose no sangue em um indivíduo com necessidade deste tratamento, em que, opcionalmente, o indivíduo é um humano.

13. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende o DNA contendo um de: pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de uma identidade da sequência à: (a) uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo contendo a sequência de aminoácido com SEQ ID NO:5; ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a).

14. Molécula isolada de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende: (1) a sequência de ácido nucleico com SEQ ID NO:7; (ii) uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de resíduos de aminoácidos de 1 até 190 da SEQ ID NO:5, ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a); (iii) uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que contém pelo menos 85% da sequência de aminoácido a resíduos de 1 até 190 da SEQ ID NO:5, ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a); ou (iv) a molécula de ácido nucleico compreendendo o DNA tendo um de: pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% da identidade de sequência com a sequência SEQ ID NO:7, em que o polipeptídeo codificado compreende ainda os resíduos de aminoácido que correspondem à porção Fc de uma imunoglobulina.

15. Sistema de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 13 ou 14.

16. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 13 ou 14, ou o sistema de expressão, como definido na reivindicação 15.

17. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é codificado pela molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 13 ou 14.

18. Processo para a preparação de um polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) a cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 16, sob condições apropriadas para a expressão dos polipeptídeos codificados; e (ii) a recuperação do polipeptídeo codificado a partir da cultura celular.

19. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é preparado pelo processo, como definido na reivindicação 18.

20. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que liga especificamente a qualquer um dos polipeptídeos quiméricos FGF19, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que: (i) o anticorpo é monocional; e/ou (ii) o anticorpo não se liga a polipeptídeos nativos FGF19 ou polipeptídeos nativos FGF21.

22. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequencia de ácido nucleico, como definida na reivindicação 13, além de compreender pelo menos um componente, dentre: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um marcador de gene, um elemento aumentador, um promotor e/ou uma sequência de terminação de transcrição.

23. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um recipiente que compreende uma composição com um polipeptídeo quimérico FGF19, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um carreador farmaceuticamente aceitável ou diluente dentro do recipiente; e (b) um folheto informativo com instruções para administração da composição a um indivíduo.

24. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.