BR112019027377A2

BR112019027377A2 - purificação de subespécies do fator viii

Info

Publication number: BR112019027377A2
Application number: BR112019027377-8A
Authority: BR
Inventors: Meinhard Hasslacher; Martin Feichtinger; Philipp Michael Bärnthaler; Christa Mayer; Birgit Reipert; Mantas Malisauskas; Julia ANZENGRUBER
Original assignee: Baxalta Incorporated; Baxalta GmbH
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2018-06-22
Publication date: 2020-07-14
Also published as: SG11201912962RA; US12071468B2; US20190062403A1; WO2018234543A1; JP2022123035A; CN111183151A; JP7253505B2; RU2020102459A; CN111183151B; US11299533B2; JP2020524688A; EP3642225A1; US20220275058A1; CA3068121A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para a purificação de uma subespécie do Fator VIII (FVIII) de uma composição que compreende o FVIII, dito método compreendendo uma etapa de cromatografia de troca aniônica, uma etapa de cromatografia de exclusão por tamanho e uma etapa de concentração. A invenção também se refere a uma composição que compreende uma subespécie do FVIII purificada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO E AUMENTO DA ATIVIDADE DE SUBESPÉCIES DO FATOR VIII, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA SUBESPÉCIE DO FATOR VIll E SEUS USOS NA

PREPARAÇÃO DE MEDICAMENTOS PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIO HEMORRÁGICO E HEMOFILIA A". CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um método para purificar uma subespécie do Fator VIII (FVIIl) de uma composição compreendendo o FVIII, dito método compreendendo uma etapa de cromatografia de troca aniônica, uma etapa de cromatografia de exclusão por tamanho e uma etapa de concentração. A invenção também se refere a uma composição que compreende uma subespécie purificada do FVIII.

ANTECEDENTES

[0002] A hemostasia é um processo que engloba todas as reações para interromper a perda de sangue após uma lesão ou dano tecidual ter ocorrido. Envolve três etapas principais:

1. Vasoconstrição, que significa o estreitamento do vaso sanguíneo afetado pela contração das fibras musculares circundantes, para reduzir o fluxo sanguíneo e, assim, diminuir a perda aguda de sangue.

2. Formação de um tampão plaquetário para a vedação temporária da parede danificada do vaso, que ocorre dentro do primeiro minuto após a lesão, e é principalmente devida ao contato com o colágeno subjacente do tecido conjuntivo mediado pelo fator de von Willebrand (Clemetson, 2012).

3. Coagulação, que é a ativação dos fatores de coagulação sanguínea e, finalmente, a ativação da trombina, a formação de fibrina e, assim, a estabilização do trombo. A ativação ocorre em uma maneira de amplificação semelhante à cascata, e desse modo intensifica a atividade de cada fator a jusante após a coagulação.

[0003] Os fatores de coagulação sanguínea são principalmente serina proteases com poucas exceções. Estes são FVIIl e FV, que atuam como cofatores e não apresentam nenhuma função enzimática. Os fatores de coagulação sanguínea são geralmente denominados com um F maiúsculo seguido de algarismos romanos, por exemplo, FVII. Quando os fatores de coagulação do sangue são ativados, eles são frequentemente indicados adicionalmente com um "a" minúsculo para indicar sua conversão de um zimogênio inativo em uma serina protease ativa, por exemplo, FVlla. A cascata de coagulação em si pode ser dividida em duas vias diferentes que se encontram na etapa fundamental da ativação de trombina.

[0004] A via do fator tecidual também é conhecida como via extrínseca e começa com a exposição do fator tecidual, uma proteína da transmembrana de 47 kDa localizada na superfície das células subendoteliais do tecido. Após a lesão tecidual, o fator FVII forma um complexo com o fator tecidual e é dessa forma ativado. Esse complexo também referido como complexo extrínseco de tenase, por sua vez, ativa os fatores FIX para FlIXa e FX a FXa, respectivamente. A segunda via é chamada via de ativação por contato ou via intrínseca e desempenha apenas um papel menor na formação de trombos. A via de ativação por contato envolve inicialmente os fatores FXII, FXI e FIX. O fator FlXa ativo forma o assim chamado complexo de tenase intrínseco com seu cofator FVIlla ativo, íons cálcio e fosfolipídios. O complexo de tenase é capaz de ativar o fator FX a FXa (para uma visão geral ver a Figura 1).

[0005] O fator FXa, ativado pela via do fator tecidual ou pela via de ativação por contato, ativa FV a FVa. Ambos os fatores, FXa e FVa, juntamente com os íons cálcio como cofatores, atuam na protrombina para formar trombina. Tanto a via do fator tecidual quanto a via de ativação por contato se encontram neste momento. Apenas pequenas quantidades de trombina são formadas nesta fase inicial, em grande parte incapazes de converter fibrinogênio suficiente em fibrina para formar um coágulo de fibrina estável. Mas a trombina faz parte de um laço direto de alimentação, que catalisa a sua própria formação. A trombina ativa o FV, o FXI e libera o FVIII do vWF que circula como um complexo inativo na corrente sanguínea. O FVII! é assim ativado para o FViIlla. Como mencionado anteriormente, o FXla ativa o FIX que forma o complexo intrínseco da tenase juntamente com o FVIlla e os íons cálcio. O complexo de tenase ativa grande quantidade de FX, o que leva à produção de ainda mais trombina. A trombina é necessária para o principal objetivo da coagulação, a conversão de fibrinogênio em fibrina no coágulo sanguíneo prematuro, a fim de estabilizá-lo e fortalecê-lo. Além disso, a trombina ativa o FXI!l para o FXllla, cuja responsabilidade é a reticulação da fibrina dentro do coágulo.

[0006] O fator VIII de coagulação sanguínea é um dos maiores fatores de coagulação sanguínea. O FVIII de cadeia única nativa normalmente contém 2332 aminoácidos e seu peso molecular é de aproximadamente 300 kDa (ExPASy, 2016). Como mostrado na Figura 2A, o FVII! é composto de seis domínios, os quais são designados como A1-A2-B-A3-C1-C2.

[0007] O FVIII de coagulação sanguínea nativa é sintetizado como uma única cadeia de polipeptídeo em hepatócitos, células renais, células endoteliais e tecido linfático. Sob a influência da furina protease intracelular, o FVIII é clivado em duas cadeias, uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Existem diferentes posições disponíveis em todo o FVIII de cadeia única, em que a furina protease pode se ligar e dividir. Isso resulta em um certo número de subespécies ativas heterogêneas de FVIII, cada uma compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve. O comprimento da cadeia pesada e leve varia de acordo com a extensão do truncamento do domínio B. A cadeia leve livre do domínio B consiste dos domínios A3-C1-C2, enquanto que a cadeia leve estendida ainda contém uma fração do domínio B. Os pesos moleculares das variantes de cadeia leve são 80 kDa para a cadeia leve padrão e 120 kDa para a cadeia leve estendida, respectivamente. À cadeia pesada do FVIII pode aparecer como variante de comprimento total (180 kDa), onde uma fração principal do domínio B ainda está conectada, assim como variantes truncadas (150 kDa e 110 kDa) com quantidades decrescentes de domínio B e da cadeia pesada exaurida de domínio B (90 kDa), completamente livre do domínio B. Os domínios A1 e A2 fazem parte de cada uma das variantes de cadeia pesada descritas.

[0008] Após a secreção, o FVIII circula na corrente sanguínea como uma forma inativa não covalentemente ligada ao vuWF, uma grande glicoproteína multimérica. O sítio de ligação do uWF é uma área altamente acídica (mostrada como espaço não colorido entre as designações de domínio na Figura 2A) localizada próxima ao N-terminal da cadeia leve de 80 kDa (OBrien and Tuddenham, 1997). O FVIIIl é liberado do vWF após a remoção dessa área acídica pela trombina. As duas áreas acídicas adicionais estão localizadas entre os domínios A1 e A? e entre A? e B, respectivamente. A trombina também provoca clivagem dessas áreas acídicas, separando assim os domínios A1, A2 e B. A forma ativa do FVIII é então formada como uma molécula heterotrimérica que compreende os domínios A1, A2 e a cadeia leve A3- C1-C2 - o domínio B não faz parte da molécula ativa do FVIIL. A molécula ativa do FVIII é inativada através da clivagem do domínio A2 pela proteína C ativa. O FVIII inativado é rapidamente eliminado da corrente sanguínea.

[0009] Cada domínio A contém aproximadamente 330 aminoácidos e forma dois barris B altamente conservados. A cadeia pesada e a cadeia leve são conectadas através de um íon metálico divalente ligado aos domínios A1 e A3. O domínio A2 contém um sítio de ligação específico ao FlXa. O sítio de ligação para FX inativo está localizado no domínio A1. O FVIlla ativo pode assim atuar como um mediador entre o FlXa e o FX. O próprio FVlIlla não possui atividade enzimática. O domínio B é o maior de todos os domínios do FVIII. Ele é altamente glicosilado e pelo menos parcialmente removido durante o processamento intracelular através da furina protease. Parece desempenhar um papel no transporte intracelular, que direciona e secreção de FVIIl. Enquanto os domínios A e C formam estruturas globulares, o domínio B permanece principalmente desdobrado como uma estrutura linear. Também parece desempenhar um papel importante na prevenção da formação de agregados intracelulares devido à sua glicosilação e interação altamente polares com chaperonas (Pipe et al., 1998). Existem dois domínios C no FVIII, cada um compreendendo aproximadamente de 150 a 160 aminoácidos. Ambos estão localizados no C-terminal da cadeia única do FVIII. Partes do domínio C2 formam uma área hidrofóbica que atua como sítio de ligação aos fosfolipídios e é importante para a formação do complexo de tenase durante a coagulação sanguínea (Mazurkiewicz-Pisarek et al., 2016). O domínio C1 parece influenciar a força de ligação ao vWF (Liu et al., 2000).

[0010] No geral, o fator VIII humano (FVII!) é uma glicoproteína plasmática que desempenha um papel essencial na cascata de coagulação sanguínea através da ação de servir como um cofator para o fator IXa na conversão do fator X em fator Xa (Toole et al., 1984, Vehar et al. 1984). O FVIII é produzido principalmente por células sinusoidais do fígado (Do et al., 1999) como uma grande proteína de cadeia única (2332 aminoácidos) compreendendo a estrutura de domínio NH2-A1-

a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2-COOH. O processamento intra- e extracelular variável do domínio B resulta em uma mistura de espécies moleculares heterodiméricas que circulam no plasma. Assim, o FVIIl contém uma cadeia leve de tamanho constante (LC) (a3-A3-C1-C2) e uma cadeia pesada (HC), minimamente composta dos domínios A1-a1-A2-a2, mas de tamanho variável devido à presença de uma parte ou todo o domínio B adjacente (Jankowski et al, 2007) (Figura 2B). As HC e LC são associadas através de um sistema articulado não covalente que requer um íon metálico divalente (Kaufman et al., 1988, Fay et al., 2006). O FVIII está circulando no complexo com o fator de von Willebrand (vWF) (Krishhaswamy et al., 2015, Pipe et al., 2016). A trombina converte o FVIIl em sua forma ativa (FVIlla) por clivagens específicas tanto na HC quanto na LC (Lenting et al., 1998). Durante esse processo proteolítico, o domínio B é completamente removido (Myles et al., 2002).

[0011] O domínio FVI!I B não possui homologia de aminoácido com outras proteínas conhecidas, é fortemente glicosilado e é dispensável para atividade procoagulante (Fay et al., 2006, Toole et al., 1986). No entanto, demonstrou-se ter influências funcionais ao longo do ciclo de vida do FVIII conforme revisado com detalhes por S.W. Pipe (Pipe et al., 2009). O domínio B pode desempenhar um papel importante no processamento intracelular e no trânsito de FVIIl mediante a interação com chaperonas para auxiliar no dobramento correto de proteínas (Pipe et al, 1998) e com receptores de classificação específicos de carregamento, principalmente por meio de componentes de carboidrato, para aumentar a eficiência da secreção (Pipe et al., 2005, Zhang et al., 2005). Além disso, possivelmente evita a proteólise prematura (Khrenov et al., 2006) e diminui a afinidade do FVIII inativo por plaquetas ativadas (Li et al., 1997), preservando assim o FVIII circulante. O domínio B possui pouco efeito na estrutura secundária geral do FVI!l em solução (Grushin et al., 2014). Estruturas tridimensionais disponíveis apenas de

BDD-rFVIII (Shen et al., 2008, Ngo et al., 2008) indicam dificuldade na cristalização do domínio B. Recentemente uma função estabilizadora do domínio B sob condições não ativadoras foi proposta, pois demonstrou estar firmemente associada com o núcleo da molécula de FVIII sob baixas concentrações de Ca?* (Bonazza et al., 2015).

[0012] Um distúrbio hemorrágico é definido como qualquer mau funcionamento no processo de formação de coágulos após a lesão, trauma ou cirurgia. Qualquer componente da cascata de coagulação sanguínea, isto é, fatores de coagulação sanguínea ou processos associados tais como a formação temporária de tampão de plaquetas, pode ser afetado. Todos os distúrbios hemorrágicos têm em comum que a formação de coágulio não existe ou é apenas parcialmente executada, o que leva a eventos hemorrágicos espontâneos e/ou prolongados. Estas doenças podem ser herdadas ou adquiridas, por exemplo, através do uso de medicamentos ou por outras doenças. Alguns exemplos de distúrbios hemorrágicos são dados abaixo.

1. A doença de von Willebrand é provocada por uma deficiência do fator de von Willebrand. Como um resultado, a aderência plaquetária, que é mediada pelo vWF, não funciona adequadamente.

2. A hemofilia A ocorre devido à deficiência do fator VIII de coagulação do sangue. A aderência plaquetária temporária e a fase inicial da coagulação são funcionais, mas a formação de trombina em grande escala na fase de propagação da coagulação não pode prosseguir.

3. A hemofilia B é uma deficiência do fator IX, que resulta em sintomas semelhantes como na hemofilia A. O complexo intrínseco de tenase não se forma e, portanto, o fator FX permanece principalmente inativo, o que resulta na ativação ineficiente da trombina e na geração insuficiente de fibrina.

[0013] A hemofilia A é um distúrbio hemorrágico hereditário provocado pela deficiência do FVII! de coagulação. O gene F8A afetado está localizado no cromossomo X. Portanto, é uma doença recessiva ligada ao sexo que afeta principalmente a linha germinativa masculina. A causa mais comum é uma grande inversão com translocação dos éxons de 1 a 22 como uma consequência da recombinação homóloga (Mazurkiewicz-Pisarek et al., 2016). Outras razões para a eclosão de hemofilia A são mutações pontuais e pequenas eliminações, inserções e inversões geralmente observadas. Como uma consequência, a proteína de FVIII não é expressa de modo algum ou a expressão da proteína leva a proteínas não funcionais. No caso de uma lesão, a hemostasia primária, que significa a aderência das plaquetas ao tecido conjuntivo subjacente mediado pelo vWF, funciona apropriadamente. À ausência de FVII! funcional em primeiro lugar causa problemas durante a fase de propagação da cascata de coagulação sanguínea. O complexo intrínseco de tenase, compreendendo FlXa, FVIlla, íons de cálcio e fosfolipídios, não pode se formar e, portanto, não é capaz de ativar o fator FX para FXa, que é sua principal responsabilidade. À consequência é uma carência de trombina ativa, necessária para a clivagem do fibrinogênio. A molécula de fibrina insolúvel em água, que fortaleceria o coágulo sanguíneo, não é formada e, de fato, o coágulo sanguíneo é muito instável e propenso a rompimento. No geral, um defeito ou deficiência no FVII! resulta na hemofilia A, o mais comum dos distúrbios hemorrágicos graves (Mannucci et al., 2004).

[0014] A hemofilia A é dividida em três formas de gravidade, classificadas pela quantidade de fator funcional FVIIl presente no sangue. A quantidade de FVIII funcional é definida por sua atividade, que pode ser determinada por um ensaio de coagulação em dois estágios ou mais preferivelmente por um ensaio cromogênico. O princípio básico do ensaio cromogênico é descrito abaixo. Pacientes com atividade de 5 a 40 IU/dL de fator VIII, que corresponde a 5 a 40%

da atividade do FVIIl em pacientes sem hemofilia A, são geralmente considerados como pacientes com hemofíilia A do tipo leve. Quase não há eventos de sangramento espontâneo, mas a hemorragia após a cirurgia é muito comum. O tipo moderado de hemofilia A é definido por uma atividade do FVIII de 1 a 5 IU/dL (1 a 5% do normal). Sangramentos espontâneos ocorrem com pouca frequência, às vezes ocorrem sangramentos nas articulações, mas nem todos os pacientes do tipo moderado são afetados. Os pacientes com hemofilia A do tipo grave apresentam menos de 1 IU/dL de FVIII funcional (< 1% do normal). Esses pacientes sofrem de hemorragia muscular espontânea durante a atividade física e sangramentos intra-articulares. O sangramento articular recorrente pode levar à inflamação e, consequentemente, à artropatia e comprometimento funcional (Valentino, 2010).

[0015] Para impedir que os pacientes com hemofilia A progridam da doença e as consequências associadas, o que ameaçaria sua saúde e reduziria sua qualidade de vida, é necessário fornecer acesso a terapia eficaz. Alguns exemplos de medicamentos comumente utilizados assim como novos e no estágio de desenvolvimento são apresentados a seguir.

[0016] A administração do fator de coagulação do sangue deficiente, por exemplo, FVIII, é chamada de terapia de reposição ou substituição. É utilizado para profilaxia e como terapia sob demanda no caso de sangramento agudo. A profilaxia deve começar o mais cedo possível, a fim de evitar a destruição articular relacionada com a doença. Existem dois grupos diferentes de fármacos de reposição. O FVIII derivado do plasma é separado de grandes pools de plasma, subsequentemente liofilizado e assim concentrado. No entanto, existe pelo menos um risco teórico de agentes infecciosos tais como vírus ou príons decorrentes desses medicamentos. O FVIIIl recombinante é considerado ser muito seguro, pois é derivado e produzido em linhagens celulares de mamíferos e não está em contato com o plasma humano. Independentemente da fonte do fator anti-hemofílico FVIII, as principais desvantagens, que são meias-vidas bastante curtas e o desenvolvimento de anticorpos direcionados contra esses fármacos, permanecem. A meia-vida típica do FVIll no sangue é de aproximadamente 8 a 12 horas, o que torna necessárias administrações muito frequentes de 2 a 3 vezes por semana. Outra desvantagem é o desenvolvimento de anticorpos que rapidamente iniciam a resposta imune e, assim, a degradação desses substitutos.

[0017] Novas abordagens visam o aumento da meia-vida. A adição de polímeros de polietileno glicol ao FVIII ou a fusão do FVIII com proteínas com meias-vidas mais longas, tais como a albumina humana ou a região Fc da IgG, levou a uma meia-vida aumentada, mas a melhora é, em média, apenas 1,5 vezes maior em comparação com a fator nativo FVIII (Peyvandi et al., 2016).

[0018] Como mencionado acima, a tecnologia de proteínas recombinantes levou ao desenvolvimento e produção de produtos recombinantes de FVIII (rFVIII) para o tratamento da hemofilia A através da terapia de reposição de proteínas. Esses produtos se distinguem principalmente entre si pela presença ou ausência do domínio B, referido como (FL-)rFVIII de tamanho total e (BDD-)rFVIII excluído do domínio B, respectivamente (Jankowski et al., 2007, D'Amici et al., 2010, Thim et al., 2010, Peters et al., 2013, Kannicht et al., 2013).

[0019] Sendo o FVIII um terapêutico protéico, está exposto aos mesmos riscos que outros produtos terapêuticos à base de proteínas, em particular a propensão de agregar durante a fabricação, armazenamento em prateleira e manipulação na clínica (Joubert et al,, 2011, Roberts et al., 2014). Foi demonstrado com relação aos produtos terapêuticos protéicos no cenário clínico que a presença de agregados pode induzir respostas imunes indesejadas em pacientes que podem afetar a eficácia das terapias (Moussa et al., 2016, Hermeling et al., 2003, van Beers et al., 2010, Barnard et al., 2013, Robbins et al., 1987a, Robbins et al., 1987b, Maislos et al., 1986, Ahmadi et al., 2015, Joubert et al., 2012).

[0020] A terapia de não substituição segue estratégias diferentes. As duas abordagens a seguir tentam melhorar a hemostase em vez de substituir os fatores de coagulação ausentes. Os anticorpos monoclonais direcionados contra o inibidor da via do fator tecidual (TFPI) reduzem o efeito inibidor do TFPI e, assim, mantêm a via do fator tecidual em um estado ativo. A segunda estratégia contorna a ausência de FVIII através da aplicação de anticorpos biespecíficos capazes de se ligar tanto ao FIXa quanto ao FX e assim imitando o papel de cofator de FVilla. Um complexo de tenase artificial composto por FIXa - anticorpo biespecífico - FX pode formar e ativar o fator FXK em FXa. Uma abordagem completamente diferente é a terapia genética. Uma vez que visa a redução persistente da gravidade, é mais curativo do que profilático. Os vetores virais são utilizados para a liberação e integração de genes F8 funcionais aos hepatócitos - o sítio de produção de FVIII - a fim de substituir o gene F8 não funcional e permitir a expressão do FVII! de coagulação sanguínea funcional.

[0021] O produto de FVIIl recombinante ADVATE é um dos fármacos de reposição mais amplamente estudados e mais frequentemente utilizados para terapia de hemofilia A, com uma baixa incidência de efeitos colaterais e eventos adversos (de acordo com a FDA Approval 2003). Assim, é considerado um medicamento seguro e eficiente.

[0022] Para investigar ainda mais a similaridade do FVIII anti- hemofílico recombinante, o qual é produzido na cultura de células de mamíferos, com o FVIII humano derivado de plasma em termos de composição, e para caracterizar as propriedades assim como o comportamento de todas as principais subespécies, é necessário produzir uma quantidade adequada de cada subespécie de FVIII com pureza suficiente. Uma ou mais dessas subespécies purificadas de FVIIl, ou uma mistura destas, também podem ser utilizadas em terapia.

[0023] Assim, a presente invenção fornece uma estratégia de purificação baseada em etapas cromatográficas. De preferência, a estratégia de purificação é capaz do seguinte:

1. Produzir uma quantidade suficiente de cada subespécie de FVIII.

2. Render uma concentração suficiente de proteína de subespécie de FVIII na formulação final.

3. Produzir uma formulação final em que a quantidade de outras subespécies de FVIIl, que são consideradas impurezas, é suficientemente baixa, por exemplo, para ser capaz de produzir resultados confiáveis em pesquisas imunológicas subsequentes. O produto final deve ser estéril e livre de contaminantes biológicos.

4. As frações finais da subespécie do FVIIl são fornecidas em uma matriz definida, por exemplo, uma matriz em pH definido contendo componentes de tampão, incluindo sais, assim como um surfactante.

5. Além disso, as etapas do processo avaliadas como úteis na presente invenção são facilmente atualizáveis para uma escala preparativa, a fim de garantir a produção de uma quantidade suficiente de produto.

[0024] Esta invenção refere-se às fases iniciais de desenvolvimento na forma de experimentos de viabilidade em colunas de cromatografia em pequena escala, assim como ao processo sofisticado em escala preparativa e o esquema de produção final para cada subespécie de FVII.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0025] A presente invenção atende às necessidades acima descritas e resolve os problemas acima mencionados na técnica, através do fornecimento das modalidades descritas abaixo.

[0026] Em particular, em um esforço para desenvolver um método para purificar uma subespécie do Fator VIll de uma composição compreendendo o Fator VIlli os inventores descobriram que empregando duas etapas de cromatografia, a saber, uma etapa de cromatografia de troca aniônica e uma etapa de cromatografia de exclusão por tamanho, seguido de uma etapa de concentração, que pode ser outra etapa da cromatografia de troca aniônica, produziram uma composição compreendendo as referidas subespécies do fator VIII em alta pureza e concentração elevada. Surpreendentemente, os inventores descobriram adicionalmente que o tratamento com furina protease do Fator VIll compreendendo a composição, assim como a execução da primeira etapa de cromatografia de troca aniônica através da eluição linear do gradiente com um comprimento estendido do gradiente, melhorou ainda mais a separação das subespécies do Fator VIII durante a cromatografia e, portanto, produziu uma composição compreendendo ditas subespécies do fator VIll com pureza e concentração ainda mais elevadas.

[0027] Em outras experiências, os inventores caracterizaram subespécies purificadas do Factor VIll obtidas de acordo com a presente invenção. Surpreendentemente, os inventores descobriram que todas as espécies de rFVII| purificadas e uma mistura das mesmas mostraram atividade aumentada em comparação com o material de partida não purificado. Adicionalmente, os inventores descobriram que uma subespécie do Fator VIII contendo 70% do domínio B apresentou uma propensão significativamente menor de agregar e uma propensão maior de formar oligômeros do que uma subespécie do Fator VIII que carece do domínio B inteiro. Assim, a subespécie purificada do Fator VIII obtida de acordo com o método da presente invenção pode potencialmente ser formulada em uma composição farmaceuticamente ativa (isto é, um medicamento) com propriedades melhoradas. A composição farmaceuticamente ativa pode conter uma única subespécie purificada do FVIII. Alternativamente, duas ou mais das subespécies purificadas do FVIIIl podem ser misturadas, por exemplo, na mesma relação de subespécies de FVII! encontradas no pdFVIII ou em produtos de rFVIII atualmente utilizados para tratar pacientes. Essa composição farmaceuticamente ativa pode ser utilizada para tratar pacientes com distúrbios hemorrágicos tais como a hemofilia A.

[0028] Em experiências adicionais, os inventores surpreendentemente observaram que o tratamento com furina do FVIII recombinante aumenta a atividade do FVIIl, mesmo na ausência de purificação de subespécies.

[0029] No geral, a presente invenção fornece meios melhorados para a purificação de uma subespécie de Fator VII! de uma composição compreendendo o Fator VIII, através do fornecimento das modalidades preferidas listadas como itens 1 a 86 abaixo:

[0030] 1. Um método para a purificação de uma subespécie de Fator VIII (FVIII) de uma composição que compreende o FVIII, dito método compreendendo as etapas de: (1) — submeter a composição que compreende o FVII| à cromatografia de troca aniônica, e coletar o eluato compreendendo ditas subespécies de FVIII; (2) submeter o eluato da etapa (1) compreendendo ditas subespécies de FVIII á cromatografia de exclusão por tamanho, e coletar o eluato compreendendo ditas subespécies de FVIIl; e (3) concentrar o eluato da etapa (2) compreendendo ditas subespécies de FVIII.

2. O método de acordo com o item 1, em que a etapa de concentração (3) é uma etapa de submeter o eluato da etapa (2) compreendendo ditas subespécies de FVIII à cromatografia de troca aniônica e coleta do eluato compreendendo ditas subespécies de FVIII.

3. O método de acordo com o item 1 ou 2, em que o FVIII é FVIII recombinante (rFVIII) e a subespécie de FVIIl é uma subespécie de FVIIIl recombinante (rF VII).

4. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 3, em que a subespécie de FVII! é uma cadeia pesada do FVIII que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

5. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 4, em que a subespécie FVII| é a cadeia pesada do FVII! de 180 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

6. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 4, em que a subespécie de FVIIl é a cadeia pesada do FVIII de 150 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

7. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 4, em que a subespécie de FVIIl é a cadeia pesada do FVIII de 110 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

8. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 4, em que a subespécie de FVIIl é a cadeia pesada do FVIIIl de 90 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

9. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 8, em que na etapa (1) uma resina Q de alta resolução com um tamanho de glóbulo de menos do que 20 um é utilizada para cromatografia de troca aniônica.

10. O método de acordo com o item 9, em que a resina Q de alta resolução com um tamanho de glóbulo de menos do que 20 um é uma resina MonoQ.

11. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 10, em que na etapa (2) uma resina de cromatografia de exclusão por tamanho com uma faixa de resolução de 10000 Da a 60000 Da é utilizada para cromatografia de exclusão por tamanho.

12. O método de acordo com o item 11, em que a resina de cromatografia de exclusão por tamanho com uma faixa de resolução de 10000 Da a 60000 Da é uma resina Superdex 200 pg.

13. O método de acordo com qualquer um dos itens de 2 a 12, em que na etapa (3) uma resina SourceQ é utilizada para cromatografia de troca aniônica.

14. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 13, em que o método compreende adicionalmente a seguinte etapa (0) antes da etapa (1): (0) submeter o FVIIl compreendido na composição ao tratamento com furina protease.

15. O método de acordo com o item 14, em que o tratamento com furina protease é executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 100 IU/ml.

16. O método de acordo com o item 14 ou 15, em que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (0') após a etapa (0): (0') filtrar a composição compreendendo o FVIII através de um filtro com um tamanho de poro ao redor de 0,2 um.

17. O método de acordo com qualquer um dos itens de 14 a 16, em que a cadeia leve do FVIII é a cadeia leve do FVIII de 80 kDa.

18. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 17, em que a eluição na etapa (1) é executada através de eluição linear do gradiente.

19. O método de acordo com o item 18, em que na etapa (1) o gradiente da eluição linear do gradiente possui um comprimento de pelo menos cerca de 16 volumes de coluna.

20. O método de acordo com o item 18, em que na etapa (1) o gradiente da eluição linear do gradiente possui um comprimento de pelo menos cerca de 24 volumes de coluna.

21. O método de acordo com o item 18, em que na etapa (1) o gradiente da eluição linear do gradiente possui um comprimento de pelo menos cerca de 32 volumes de coluna.

22. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 21, em que na etapa (1) a eluição é executada utilizando um tampão que compreende etileno glicol.

23. O método de acordo com o item 22, em que na etapa (1) a eluição é executada utilizando um tampão que compreende etileno glicol em uma concentração de cerca de 10% (v/v).

24. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 23, em que a etapa (2) é substituída pela etapa de: (2) submeter o eluato da etapa (1) compreendendo ditas subespécies de FVIII à cromatografia de interação hidrofóbica.

25. O método de acordo com o item 24, em que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (1') antes da etapa (2): (1') submeter as subespécies de FVII compreendidas no eluato da etapa (1) ao tratamento com furina protease.

26. O método de acordo com o item 25, em que o tratamento com furina protease é executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 100 IU/ml.

27. O método de acordo com o item 25 ou 26, em que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (1") após a etapa (1): (1") filtraro eluato compreendendo ditas subespécies de FVIII através de um filtro com um tamanho de poro ao redor de 0,2 um.

28. O método de acordo com qualquer um dos itens de 25 a 27, em que a cadeia leve do FVIII é a cadeia leve do FVII! de 80 kDa.

29. O método de acordo com qualquer um dos itens de 24 a 28, em que a cromatografia de interação hidrofóbica é a cromatografia de modo negativo.

30. O método de acordo com qualquer um dos itens de 24 a 29, em que a subespécie de FVIIl é a cadeia pesada do FVIII de 150 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

31. O método de acordo com qualquer um dos itens de 24 a 29, em que a subespécie de FVIII é a cadeia pesada do FVIII de 180 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

32. O método de acordo com qualquer um dos itens de 2 a 31, em que a eluição na etapa (3) é executada pela eluição em gradiente da etapa.

33. O método de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 4, 9, 10, 13 a 23 ou 32, em que a subespécie de FVII! é a cadeia pesada do FVII! de 90 kDa, em que a etapa (2) do método é omitida, e em que na etapa (3) o eluato da etapa (1) compreendendo ditas subespécies de FVIII substitui o eluato da etapa (2) que compreende ditas subespécies de FVIII.

34. Uma composição que compreende uma subespécie purificada de FVIII, obtida de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 33.

35. A composição compreendendo uma subespécie purificada de FVII! de acordo com o item 34, em que a relação de peso da subespécie purificada de FVII! na composição para todas as outras subespécies de FVIII! na composição é de pelo menos 9.

36. A composição compreendendo uma subespécie purificada de FVII! de acordo com o item 34, em que a relação de peso da subespécie purificada de FVII! na composição para todas as outras subespécies de FVIIIl na composição é de pelo menos 8.

37. A composição compreendendo uma subespécie purificada de FVII! de acordo com qualquer um dos itens de 34 a 36, em que a concentração da subespécie purificada de FVII! é de pelo menos 0,1 mg/ml.

38. A composição compreendendo uma subespécie purificada de FVII! de acordo com qualquer um dos itens de 34 a 36, em que a concentração da subespécie purificada de FVII! é de pelo menos 0,3 mg/ml.

39. Uma composição que compreende uma subespécie purificada de Fator VII (FVIII).

40. A composição de acordo com o item 39, em que o FVIII é FVIIl recombinante (rFVIII) e a subespécie de FVII! é uma subespécie de FVIII recombinante (rFVII!).

41. A composição de acordo com o item 39 ou 40, em que a subespécie de FVII! é a cadeia pesada do FVIII de 180 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII, a cadeia pesada do FVIII de 150 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII, a cadeia pesada do FVIII de 110 kDa que está associada com uma cadeia leve de FVIIl ou a cadeia pesada do FVIII de 90 kDa que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

42. A composição de acordo com qualquer um dos itens de 39 a 41, em que a relação de peso da subespécie purificada de FVII! na composição para todas as outras subespécies de FVIIl na composição é de pelo menos 9 ou pelo menos 8.

43. A composição de acordo com qualquer um dos itens de 39 a 42, em que a concentração da subespécie purificada de FVII é de pelo menos 0,1 mg/ml ou pelo menos 0,3 mg/ml.

44. A composição de acordo com qualquer um dos itens de 34 a 43 para uso como medicamento.

45. A composição de acordo com qualquer um dos itens de 34 a 44 para uso no tratamento de um distúrbio hemorrágico.

46. A composição de acordo com qualquer um dos itens de 34 a 45 para uso no tratamento da hemofilia A.

47. Um método para a purificação de uma proteína ou uma subunidade de uma proteína a partir de uma composição compreendendo várias proteínas ou várias subunidades de uma proteína, dito método compreendendo as etapas de: (1) submeter a composição que compreende a proteína ou subunidade de uma proteína à cromatografia de troca aniônica e coletar o eluato compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína; (2) submeter o eluato da etapa (1) compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína à cromatografia de exclusão por tamanho e coletar o eluato que compreende dita proteína ou subunidade de uma proteína; e (3) concentrar o eluato da etapa (2) compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína.

48. "O método de acordo com o item 47, em que a etapa de concentração (3) é uma etapa de submeter o eluato da etapa (2) compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína à cromatografia de troca aniônica e coletar o eluato que compreende dita proteína ou subunidade de uma proteína.

49. "O método de acordo com o item 47 ou 48, em que a proteína ou subunidade de uma proteína é uma proteína recombinante ou uma subunidade recombinante de uma proteína.

50. “O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 49, em que na etapa (1) uma resina Q de alta resolução com um tamanho de glóbulo de menos do que 20 um é utilizada para cromatografia de troca aniônica.

51. O método de acordo com o item 50, em que a resina

Q de alta resolução com um tamanho de glóbulo de menos do que 20 um é uma resina MonoQ.

52. "O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 51, em que na etapa (2) uma resina de cromatografia de exclusão por tamanho com uma faixa de resolução de 10000 Da a 60000 Da é utilizada para cromatografia de exclusão por tamanho.

53. O método de acordo com o item 52, em que a resina de cromatografia de exclusão por tamanho com uma faixa de resolução de 10000 Da a 60000 Da é uma resina Superdex 200 pg.

54. "O método de acordo com qualquer um dos itens de 48 a 53, em que na etapa (3) uma resina SourceQ é utilizada para cromatografia de troca aniônica.

55. —O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 54, em que o método compreende adicionalmente a seguinte etapa (0) antes da etapa (1): (0) — submeter a proteína ou a subunidade de uma proteína compreendida na composição ao tratamento com furina protease.

56. O método de acordo com o item 55, em que o tratamento com furina protease é executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 100 IU/ml.

57. O método de acordo com o item 55 ou 56, em que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (0') após a etapa (0): (0') filttar a composição compreendendo a proteína ou subunidade de uma proteína através de um filtro com um tamanho de poro ao redor de 0,2 um.

58. “O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 57, em que a eluição na etapa (1) é executada através de eluição linear do gradiente.

59. “O método de acordo com o item 58, em que na etapa

(1) o gradiente da eluição linear do gradiente possui um comprimento de pelo menos cerca de 16 volumes de coluna.

60. O método de acordo com o item 58, em que na etapa (1) o gradiente da eluição linear do gradiente possui um comprimento de pelo menos cerca de 24 volumes de coluna.

61. O método de acordo com o item 58, em que na etapa (1) o gradiente da eluição linear do gradiente possui um comprimento de pelo menos cerca de 32 volumes de coluna.

62. "O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 61, em que na etapa (1) a eluição é executada utilizando um tampão que compreende etileno glicol.

63. O método de acordo com o item 62, em que na etapa (1) a eluição é executada utilizando um tampão que compreende etileno glicol em uma concentração de cerca de 10% (v/v).

64. O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 63, em que a etapa (2) é substituída pela etapa de: (2) submeter o eluato da etapa (1) compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína à cromatografia de interação hidrofóbica.

65. O método de acordo com o item 64, em que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (1') antes da etapa (2): (1') submeter a proteína ou subunidade de uma proteína compreendida no eluato da etapa (1) ao tratamento com furina protease.

66. O método de acordo com o item 65, em que o tratamento com furina protease é executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 100 IU/ml.

67. O método de acordo com o item 65 ou 66, em que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (1") após a etapa (1): (1") filttar o eluato compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína através de um filtro com um tamanho de poro ao redor de 0,2 um.

68. “O método de acordo com qualquer um dos itens de 64 a 67, em que a cromatografia de interação hidrofóbica é a cromatografia de modo negativo.

69. O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 68, em que a eluição na etapa (3) é executada pela eluição em gradiente da etapa.

70. O método de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 51, 54 a 63 ou 69, em que a etapa (2) do método é omitida, e em que na etapa (3) o eluato da etapa (1) compreendendo dita proteína ou subunidade de uma proteína substitui o eluato da etapa (2) que compreende dita proteína ou subunidade de uma proteína.

71. Uma composição que compreende uma proteína purificada ou subunidade de uma proteína obtida de acordo com qualquer um dos itens de 47 a 71.

72. A composição compreendendo uma proteína purificada ou subunidade de uma proteína de acordo com o item 71, em que a relação de peso da proteína purificada ou subunidade de uma proteína na composição para todas as outras proteínas ou subunidades de uma proteína na composição é de pelo menos 9.

73. A composição compreendendo uma proteína purificada ou subunidade de uma proteína de acordo com o item 71, em que a relação de peso da proteína purificada ou subunidade de uma proteína na composição para todas as outras proteínas ou subunidades de uma proteína na composição é de pelo menos 8.

74. A composição compreendendo uma proteína purificada ou subunidade de uma proteína de acordo com qualquer um dos itens de 71 a 73, em que a concentração da proteína purificada ou subunidade de uma proteína é de pelo menos 0,1 mg/ml.

75. A composição compreendendo uma proteína purificada ou subunidade de uma proteína de acordo com qualquer um dos itens de 71 a 73, em que a concentração da proteína purificada ou subunidade de uma proteína é de pelo menos 0,3 mg/ml.

76. A composição de acordo com qualquer um dos itens de 71 a 75 para uso como medicamento.

77. Um método de submeter o fator VIII (FVIII) ao tratamento com furina protease.

78. O método de acordo com o item 77, em que o FVIII é FVII! recombinante (rF VIII).

79. O método de acordo com o item 77 ou 78, em que o FVII! compreende FVII! de cadeia única.

80. “O método de acordo com qualquer um dos itens de 77 a 79, em que o tratamento com furina protease é executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 100 IU/ml.

81. O método de acordo com qualquer um dos itens de 77 a 80, em que o método adicionalmente compreende uma etapa de separação da furina protease do FVIII.

82. "O método de acordo com qualquer um dos itens de 77 a 81, em que o método é para aumentar a atividade do FVIII.

83. “Composição que compreende FVIII, em que o FVIIl é obtido de acordo com qualquer um dos itens de 77 a 82.

84. A composição compreendendo FVIII de acordo com o item 83 para uso como um medicamento.

85. A composição compreendendo FVIII de acordo com o item 83 ou 84 para uso no tratamento de um distúrbio hemorrágico.

86. A composição compreendendo FVIII de acordo com qualquer um dos itens de 83 a 85 para uso no tratamento de hemofilia A.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0031] Figura 1: Cascata de coagulação sanguínea incluindo a via dependente do fator tecidual ou extrínseca no lado direito e a ativação por contato ou via intrínseca no lado esquerdo com setas pretas indicando a ativação do respectivo fator de coagulação sanguínea e linhas tracejadas marcadas como "feed forw." e "inact." mostrando o efeito de inativação orientada, respectivamente. Ilustração baseada em Schaller et al. (2008).

[0032] Figura 2: (A) Apresentação esquemática da molécula de cadeia única do fator VII! na parte superior e seus fragmentos de cadeia pesada derivados no lado esquerdo e fragmentos de cadeia leve no lado direito. Ilustração baseada em (Schaller et al., 2008). Os domínios protéicos particulares A1, A2, B, A3 e C1 acrescido de C2 são mostrados em diferentes tons de cinza. O domínio B é distribuído em diferentes extensões aos fragmentos de cadeia pesada e leve. Os espaços em branco entre as áreas de domínio coloridas representam sequências —altamente ácidas com funções diferentes. (B) Heterogeneidade do FVIII e espécies moleculares. Estrutura de domínio do FVIII. Os colchetes indicam as principais espécies de domínio HC/B com aminoácidos terminais presentes no FL-FVIII.

[0033] Figura 3: Apresentação esquemática dos três tipos mais comuns de modos de eluição, que são (1) eluição isocrática mostrada como linha tracejada, (2) eluição em etapa mostrada como linha tracejada e (3) eluição em gradiente mostrada como linha sólida.

[0034] Figura 4: Cromatograma da fase de eluição da subespécie molecular do FVII! na resina AIEX Mono 10Q, separada com os tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em oito volumes de coluna. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura do leito, 0,98 ml de volume da coluna.

[0035] Figura 5: Eletroforese em gel SDS-PAGE da separação de subespécies moleculares do FVIII na resina Mono 10Q separada com tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. Gradiente: cloreto de sódio

135,0 a 750,0 MM em oito volumes de coluna. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa de FVIII comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, SB) Tampão de amostra, Frações B7-C8, NE) Pós-eluato. De cima para baixo: Cadeia única de comprimento total (300 kDa), cadeia pesada de 180 kDa, cadeia pesada truncada de 150 kDa, cadeia leve estendida de 120 kDa, cadeia pesada truncada de 110 kDa, cadeia pesada de 90 kDa sem domínio B, cadeia leve de 80 kDa.

[0036] Figura 6: Camada de separação de subespécies moleculares de FVIII na resina AIEX Mono 10Q separada com os tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. (1) Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 MM em oito volumes de coluna, Linha quebrada: Condutividade, Linha sólida: Absorvência a 280 nm. (2) Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em 16 volumes de coluna, Linha tracejada: condutividade, Linha pontilhada: absorvência a 280 nm. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml! de volume de coluna.

[0037] Figura 7: camada de separação de subespécies moleculares de FVIIIl na resina AIEX Mono 10Q no pH 6,7. Linha sólida) Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em 16 volumes de coluna com tampões padrão QA1 e QB1, Linha quebrada) Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em 32 volumes de coluna com etileno glicol a 10% contendo tampões QA1 e QB1. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml de volume de coluna.

[0038] Figura 8: Camada de separação de subespécies moleculares de FVIII tratadas com furina e não tratadas com furina na resina AIEX Mono 10Q separada com tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em 16 volumes de coluna. (1) Amostra sem tratamento com furina: Linha tracejada)

Condutividade, Linha quebrada) Absorvência em 280 nm, (2) Amostra tratada com furina: Linha pontilhada) Condutividade, Linha sólida) Absorvência em 280 nm. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml de volume de coluna.

[0039] Figura 9: Cromatograma da fase de eluição da subespécie molecular de FVIII tratada com furina na resina AIEX Mono 10Q separada com tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 MM em 16 volumes de coluna. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml! de volume de coluna.

[0040] Figura 10: Eletroforese em gel SDS-PAGE da separação das subespécies moleculares de FVIII tratadas com furina na resina AIEX Mono 10Q separada com tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em 16 volumes de coluna. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIIl comercialmente, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, L) Carga, FT) Fluxo direto, W1) Fase de lavagem 1, W2) Fase de lavagem 2, W3) Fase de lavagem 3, VE) Pré-eluato, Frações B5-C7.

[0041] Figura 11: Eletroforese em gel SDS-PAGE da separação das subespécies moleculares de FVIII tratadas com furina na resina AIEX Mono 10Q separada com tampões padrão QA1 e QB1 no pH 6,7. Gradiente: cloreto de sódio 135,0 a 750,0 mM em 16 volumes de coluna. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, frações C8-D12, NE) pós-eluato.

[0042] Figura 12: Polimento por cromatografia de exclusão por tamanho do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa em Superdex 200. Aumento separado com tampão de cloreto de sódio de aproximadamente 300 mM no pH 6,7. Dimensões da coluna: 1,0 cm de diâmetro interno x 30,0 cm de altura de leito, 23,56 ml de volume de coluna.

[0043] Figura 13: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa SEC para purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kKDa e o respectivo material de partida (frações G4, G5 e G6) derivado da cromatografia de troca aniônica MonoQ. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, Frações C4-E2.

[0044] Figura 14: Polimento por cromatografia de exclusão por tamanho da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa no Superdex 200 Aumento separado com tampão de cloreto de sódio de aproximadamente 300 mM no pH 6,7. Dimensões da coluna: 1,0 cm de diâmetro interno x 30,0 cm de altura de leito, 23,56 ml de volume de coluna.

[0045] Figura 15: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa SEC para purificação do fragmento de cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa e o respectivo material de partida (frações F4, F5 e F6) derivado da cromatografia de troca aniônica MonoQ. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIII comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, Frações C4-D9.

[0046] Figura 16: Cromatograma da fase de eluição bidimensional de subespécies moleculares de FVIIl separadas em alto desempenho com fenila Sepharose. 1. Gradiente: cloreto de sódio 680,0 a 0,0 mM em 20 volumes de coluna, 2. Gradiente: etileno glicol O a 50% em 16 volumes de coluna. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml de volume de coluna.

[0047] Figura 17: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa bidimensional HIC para purificação de subespécies moleculares de FVIII do material de partida tratado com furina B14390000-30. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, FT) Fluxo Direto, Frações A5-B12. A Figura continua na Figura 18.

[0048] Figura 18: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa bidimensional HIC para purificação de subespécies moleculares de FVIII do material de partida tratado com furina B14390000-10. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, frações C2-G6.

[0049] Figura 19: Cromatograma da fase de eluição unidimensional de subespécies moleculares de FVIIl separadas em alto desempenho com fenila Sepharose. Gradiente: cloreto de sódio 680,0 a 0,0 mM em 40 volumes de coluna. Dimensões de coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml de volume de coluna.

[0050] Figura 20: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa unidimensional HIC para purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa do material de partida tratado com furina B14390000-10. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, FT) Fluxo Direto, Frações B2-G11.

[0051] Figura 21: Cromatograma da fase de lavagem e eluição de modo negativo das subespécies moleculares de FVII! separadas em alto desempenho com fenila Sepharose. Fase de lavagem: cloreto de sódio 860 mM para 30 volumes de coluna, Eluição por etapa: cloreto de sódio O mM para 10 volumes de coluna. Dimensões da coluna: 0,5 cm de diâmetro interno x 5,0 cm de altura de leito, 0,98 ml! de volume de coluna.

[0052] Figura 22: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa HIC de modo negativo para purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, Frações A10-C12.

[0053] Figura 23: Diagrama de fluxo do processo de purificação preparativa das subespécies moleculares de FVIII. A estratégia de purificação para as subespécies com peso molecular de 180 kDa, 150 kDa e 110 kDa inclui duas etapas de purificação por AIEX (MonoQ) e SEC (Superdex 200) e finalmente uma etapa de concentração por AIEX (SourceQ). O fragmento de cadeia pesada esgotado de domínio B não requer purificação adicional por cromatografia de exclusão por tamanho e, portanto, é aplicado ao MonoQ AIEX e posteriormente concentrado no SourceQ AIEX.

[0054] Figura 24: Cromatograma da fase de eluição de cromatografia de troca aniônica em escala preparativa das subespécies moleculares de FVIIl separadas na resina MonoQ. Eluição em gradiente: cloreto de sódio 135 a 750 mM em 32 volumes de coluna. Dimensões da coluna: 1,6 cm de diâmetro interno x 10,0 cm de altura de leito, 20,160 ml de volume de coluna. Tamanho da fração: E1: 22,6 ml, E2: 31,5 ml, E3: 34,6 ml, E4: 43,7 ml, ES: 28,9 ml, E6: 22,9 ml, E7: 26,1 ml, E8: 53,1 ml.

[0055] Figura 25: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa preparativa de cromatografia de troca aniônica para purificação das subespécies moleculares de FVII!Il. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, L1) Carga antes da filtração, L2) Carga após filtração, FT) Fluxo Direto, W1) Etapa de lavagem 1, W2) Etapa de lavagem 2, W3) Etapa de lavagem 3, VB) Pré-eluato, E1 a E8) Pool de eluato 1 a 8, NE) Pós- eluato 1, PE) Pós-eluato 2.

[0056] Figura 26: Cromatograma da fase de eluição de cromatografia de troca aniônica em escala preparativa das subespécies moleculares de FVIIl separadas na resina MonoQ. Eluição em gradiente: cloreto de sódio 135 a 750 mM em 32 volumes de coluna. Dimensões de coluna: 1,6 cm de diâmetro interno x 10,0 cm de altura de leito, 20,160 ml! de volume de coluna. Tamanho da fração: E1: 114,9 ml, E2: 24,0 ml, E3: 22,8 ml, E4: 83,6 ml.

[0057] Figura 27: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa de cromatografia de troca aniônica em escala preparativa para purificação de subespécies moleculares de FVIII. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, L1) Carga antes da filtração, L2) Carga após filtração, FT) Fluxo Direto, W1) Etapa de lavagem 1, W2) Etapa de lavagem 2, frações 1.E6 a 3.B5, PE) Pós-eluato.

[0058] Figura 28: Cromatograma da cromatografia de exclusão por tamanho de escala preparativa para a purificação da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa. Dimensões da coluna: 5,0 cm de diâmetro interno x 94,4 cm de altura de leito, 1853,54 ml de volume de coluna. Tamanho da fração E1: 70,0 ml.

[0059] Figura 29: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa de cromatografia de exclusão por tamanho de escala preparativa para a purificação da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa derivada da cromatografia de troca aniônica MonoQ preparativa. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVII| comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, frações B5 - D1.

[0060] Figura 30: Cromatograma da fase de eluição da cromatografia de troca aniônica em escala preparativa da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa concentrada na resina SourceQ. Eluição da etapa: cloreto de sódio 300 mM. Dimensões de coluna: 1,0 cm de diâmetro interno x 3,9 cm de altura de leito, 3,06 ml de volume de coluna. Tamanho da fração E1: 6,98 ml.

[0061] Figura 31: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa SourceQ AIEX para concentração da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa derivada da cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa, corada com prata (esquerda) e western blot do FVIII (direita). M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVII! comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, L) Carga, SB) Tampão de amostra, FT) Fluxo direto, W) Fase de lavagem, VE) Pré-eluato, E1) Pool de eluato em diluição de 1:198 (coloração prata) e 1:264 (western blot do FVIII), E2) Pool de eluato em diluição de 1:66 (coloração prata) e diluição 1:88 (western blot do FVII!), NE) Pós-eluato.

[0062] Figura 32: Comparação de desempenho de (1) coluna SEC de pequena escala Superdex 200 Aumento (linha sólida) e a coluna SEC de escala preparatória Superdex 200 Prep Grade (linha quebrada). Ambas as curvas mostram as respectivas fases de eluição da cadeia pesada de comprimento total com um peso molecular de 180 kDa. Dimensões de coluna: (1) 1,0 cm de diâmetro interno x 30,0 cm de altura de leito, 23,56 ml de volume de coluna, (2) 5,0 cm de diâmetro interno x 94,4 cm de altura de leito, 1853,54 ml de volume de coluna.

[0063] Figura 33: Cromatograma da cromatografia de exclusão de tamanho em escala preparativa para a purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa. Dimensões da coluna: 5,0 cm de diâmetro interno x 94,4 cm de altura de leito, 1853,54 ml de volume de coluna. Tamanho da fração: C1: 15,80 ml, C2: 15,75 ml, C3: 15,74 ml, E2: 45,69 ml.

[0064] Figura 34: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa para a purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa derivado da cromatografia de troca aniônica MonoQ preparativa. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIII comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, SB) Tampão de amostra, Frações B7 - D1.

[0065] Figura 35: Cromatograma da fase de eluição da cromatografia de troca aniônica em escala preparativa da cadeia pesada de comprimento total de 150 kDa concentrada na resina SourceQ. Eluição da etapa: cloreto de sódio 300 mM. Dimensões da coluna: 1,0 cm de diâmetro interno x 3,9 cm de altura de leito, 3,06 ml! de volume de coluna. Tamanho da fração E1: - 7,5 ml.

[0066] Figura 36: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa de SourceQ AIEX para concentração do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa derivado de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa, corado com prata (esquerda) e western blot do FVIII (direita). M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, L) Carga, SB) Tampão de amostra, FT) Fluxo direto, W) Fase de lavagem, VE) Pré-eluato, E1) pool de eluato em diluição 1:120 (mancha de prata) e diluição 1:160 (western blot do FVIII), E2) Pool de eluato 1:40 (coloração prata) e 1:53 (western blot do FVIII), NE) Pós-eluato.

[0067] Figura 37: Cromatograma da cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa para a purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa. Dimensões de coluna: 5,0 cm de diâmetro interno x 94,4 cm de altura de leito, 1853,54 ml de volume de coluna. Tamanho da fração: B10-C1: 140 ml, C2-C3: 70 ml, C4: 35 ml, C5: 35 ml, C6: 35 ml, C7-C8: 70 ml.

[0068] Figura 38: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa para a purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa derivado da cromatografia de troca aniônica MonoQ preparativa. M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, Frações B9 - C10.

[0069] Figura 39: Cromatograma da fase de eluição de cromatografia de troca aniônica em escala preparativa da cadeia pesada de comprimento total de 110 kDa concentrada na resina SourceQ. Eluição da etapa: cloreto de sódio 300 mM. Dimensões de coluna: 1,0 cm de diâmetro interno x 3,9 cm de altura de leito, 3,06 ml de volume de coluna. Tamanho da fração E1: 7,20 ml.

[0070] Figura 40: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa SourceQ AIEX para concentração do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa derivado da cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa, corado com prata (esquerda) e western blot do FVIII (direita). M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, L) Carga, FT) Fluxo direto, W) Fase de lavagem, VE) Pré-eluato, E1) Pool de eluato em diluição 1:147 (coloração prata) e diluição 1:196 (western blot do FVIII), E2) Pool de eluato em diluição 1:49 (coloração prata) e diluição 1:65 (western blot do FVIII), NE) Pós-eluato.

[0071] Figura 41: Cromatograma da fase de eluição de cromatografia de troca aniônica em escala preparativa da cadeia pesada de comprimento total de 90 kDa concentrada na resina SourceQ. Eluição da etapa: cloreto de sódio 300 mM. Dimensões da coluna: 1,0 cm de diâmetro interno x 8,9 cm de altura de leito, 7,0 ml de volume de coluna. Tamanho da fração E1: 18,37 ml.

[0072] Figura 42: Eletroforese em gel SDS-PAGE da etapa SourceQ AIEX para concentração do fragmento de cadeia pesada esgotado no domínio B de 90 kDa derivado da cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa, corada de prata (esquerda) e western blot de FVIII (direita) M) Marcador de peso molecular, AS) Padrão da substância medicamentosa do FVIIl comercialmente disponível, que mostra todas as espécies relevantes de cadeia pesada e leve, SB) Tampão de amostra L) Carga, FT) Fluxo direto, W) Fase de lavagem, E1) Pool de eluato em diluição 1:99 (coloração prata) e diluição 1:132 (western blot do FVIII), E2) Pool de eluato em diluição 1:33 (coloração prata) e 1:44 (western blot do FVIII), NE) Pós-eluato.

[0073] Figura 43: Resumo do processo de purificação preparativa das subespécies moleculares de FVIIl. Da esquerda para a direita: fragmento de cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa, fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa, fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa, fragmento de cadeia pesada esgotado de domínio B de 90 kDa.

[0074] Figura 44: Heterogeneidade do FVIIll e espécies moleculares. (Esquerda) gel SDS-PAGE corado com prata de FL-rFVIII (1), paFVIII (2), espécies de rFVIII purificadas B7O-rF VII (3), B20-rF VII (4), BDD-rFVIII (5) e de lotes históricos (direita) de FL-rFVII! produzidos em 2005 (1), 2007 (2), 2008 (3), 2012 (4), 2013 (5), 2014 (6) e 2015 (7); HC, cadeia pesada; LC, cadeia leve; Mm, precisão mais padrão de proteína não corada (Bio-Rad).

[0075] Figura 45: Agregação de rFVIIl em temperatura elevada. Agregados termicamente induzidos de FL-rFVII! (linha pontilhada), B70- rFVIII (linha pontilhada e tracejada), B20-rFVIII (linha tracejada) e BDD- rFVII (linha sólida) foram analisados por DLS. A inserção apresenta as amostras correspondentes analisadas por HPLC-SEC.

[0076] Figura 46: Vias do oligômero de rFVIIl e formação de agregados. FL-rFVIII (linha pontilhada, C), B7O-rFVII (linha pontilhada e tracejada), B20-rFVIII (linha tracejada), BDD-rFVIII (linha sólida, D) e pdFVIII (linha pontilhada e tracejada dupla, E) foram incubados a 45ºC durante 24 horas. A quantidade de oligômeros (A), agregados (B) e monômeros (F) foi analisada continuamente por HPLC-SEC e traçada em gráfico contra o tempo de incubação.

[0077] Figura 47: Ligação do corante fluorescente ThT a oligômeros e agregados de FVIII. A capacidade de ligação do ThT aos oligômeros e agregados de proteínas é expressa como a relação dos sinais fluorescentes nas excitações de 440 e 280 nm após 24 h de incubação a 45ºC. n=2 a 4, as barras de erro indicam valores SD.

[0078] Figura 48: Semeadura homóloga da agregação de rFVIII. As sementes foram preparadas através da incubação de BDD-rFVIII, B70- rFVII e FL-rFVII! durante 2, 5, 8 ou 18 horas a 45ºC. As amostras de BDD-rFVII (A), B7O-rFVII (B) e FL-rFVII! (C) foram misturadas 1:1 com as respectivas sementes pré-formadas e incubadas a 45ºC durante 24 horas. A quantidade de oligômeros (painéis da esquerda) e agregados (painéis da direita) foi analisada continuamente por HPLC-SEC e traçada em gráfico contra o tempo de incubação.

[0079] Figura 49: Formação de partículas subvisíveis contendo proteína. As amostras de FVIII (0,244 UM) foram expostas à agitação e esforço de cisalhamento e submetidas à análise de partículas á base de citometria de fluxo. A diferença estatística foi demonstrada mediante o uso do teste t não pareado. As concentrações de partículas de proteína mostraram-se significativamente diferentes entre BDD-rFVIII vs. FL- rFVII! (P = 0,0002) e pdFVII! (P = 0,0010), assim como entre B20-rFVIII vs. FL-rFVII! (P < 0,0001) e pdFVII! (P < 0,0001); n= 4 a 6, as barras de erro indicam valores SD.

[0080] Figura 50: Modelo esquemático da formação de oligômeros e agregados após exposição de rFVIII ao estresse térmico. O FL-rFVIII é descrito como uma mistura heterogênea de espécies de rFVIIl, mas não reflete a relação real de espécies. O comprimento das setas é indicativo das diferenças nas taxas de oligomerização e agregação de FL-rFVIN e BDD-rFVIILL

[0081] Figura 51: Perfis cromatográficos de exclusão por tamanho das espécies moleculares pdFVIII, FL-rFVIII altamente purificadas e rFVII! purificada em concentrações equimolares (0,122 uM).

[0082] Figura 52: Mapa de calor HDX-MS de B70-rFVIII. A cinética HDX-MS de 120 peptídeos foi medida após 3 s, 10 s, 30 s, 2 min, 10 min, 60 min e 3 h de tempo de incubação. Níveis de cinza indicam a % de incorporação de deutério.

[0083] Figura 53: Composição dos agregados de FL-rFVIII. Gel SDS-PAGE corado com prata de FL-rFVIII nativo (1) e agregados purificados de FL-rFVIII (2); Mm, precisão acrescida de padrão de proteína não corada (Bio-Rad).

[0084] Figura 54: (A) Atividade de coagulação de um estágio do FVIIl. A linha cinza indica o nível de atividade de SOS-E, que foi o material inicial da purificação de espécies de FVIII. As amostras foram medidas em duplicado. A barra de seta indica valores SD. (B) Atividade cromogênica do FVIII. A linha cinza indica o nível de atividade de SOS- E, que foi o material inicial da purificação de espécies de FVIIl. As amostras foram medidas em duplicado. A barra de seta indica valores SD.

[0085] Figura 55: Pico de trombina e tempo de atraso das espécies de FVIII. A linha cinza indica o nível de atividade de SOS-E, que foi o material inicial da purificação de espécies de FVIII.

[0086] Figura 56: SDS-PAGE corado com prata dos produtos de FVIIL.

[0087] Figura 57: SDS-PAGE corado com prata de FL-rFVII! após tratamento com furina. NUPAGE 3 a 8% de TrisAcetate Midi Gel (1,0 mm; 20 reservatórios, Invitrogen Cat.Nr WG1602BOX). As amostras foram incubadas 1:2 com redução de LDS-SB durante uma hora a 37ºC. uL/100 uL de solução de iodacetamida 750 mM foram adicionados. O gel foi manipulado durante 70 min em 150V (constante) e corado com prata.

[0088] Figura 58: SDS-PAGE e anti-FVIIl-Western Blot de FL-rF VII após tratamento com furina. NUPAGE 3 a 8% de TrisAcetate Midi Gel (1,0 mm; 20 reservatórios, Invitrogen Cat.Nr WG1602BOX). As amostras foram incubadas 1:2 com redução de LDS-SB durante uma hora a 37ºC. 20 yL/100 uL de solução de iodacetamida 750 mM foram adicionados. O gel foi manipulado durante 70 min em 150V (constante). Western Blot: 1º Anticorpo: Ovelha anti FVIII:C 2º Anticorpo antiovelha de burro IgG ALP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0089] A menos que definido de outra forma abaixo, os termos utilizados na presente invenção devem ser entendidos de acordo com seu significado comum conhecido pela pessoa versada na técnica.

[0090] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui mencionados são por meio desta incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

[0091] De acordo com a presente invenção, cada ocorrência do termo "compreendendo" pode opcionalmente ser substituída pelo termo "consistindo em”.

[0092] As seguintes abreviações são usadas na presente divulgação: Abreviação Contexto Completo/Descrição AIEX Cromatografia de troca aniônica ALP Fosfatase Alcalina AS Padrão de FVIII

B14390000-30 Material de partida derivado de SourceS

B20/B70/B100-rFVIII Fator VIll recombinante humano contendo 20%/70%/100% de domínio B

BDD-rFVIIlI fator VIll recombinante excluído do Domínio B humano

BDS Substância medicamentosa em volume c18 Fase estacionária de HPLC de fase reversa com alcanos de cadeia reta contendo 18 átomos de carbono (n-Octadecano)

C4 Fase estacionária de HPLC de fase reversa com alcanos de cadeia reta contendo quatro átomos de carbono (n-Butano)

cHO Ovário de Hamster Chinês

CIEX Cromatografia de troca catiônica

CL4B Matriz de base de agarose reticulada

Crillet 4 HP Nome comercial para Polysorbat 80

Cv Volume da coluna

Cys2 Cistina

DLS Dispersão dinâmica da luz

DTT Ditiotreito|

E Pool de eluato 1

E2 Pool de eluato 2

EG Etileno glicol

ELISA Ensaio imunoabsorvente ligado a enzima

EtoH Etanol

EXxPASy Swiss Institute of Bioinformatics Bioinformatics Resource Portal

F8 AD2 90kDa Material de partida enriquecido com subespécie de 90 kDa derivado de manipulações de SourceQ e MonoQ

8A Posição do gene que codifica o Fragmento do Fator VIII de Coagulação Sanguínea

Fe Fragmento cristalizável

FIX Fator IX de Coagulação Sanguínea

FlXa Fator IX de Coagulação do Sangue Ativado

FL-rF VII Fator VIll recombinante de comprimento total (preferivelmente humano)

FPLC Cromatografia Líquida de Proteína Rápida

Frac Coletor de frações

FT Fluxo direto

FV Fator V de Coagulação Sanguínea

FVa Fator V de Coagulação Sanguínea Ativado

FVII Fator VII de Coagulação Sanguínea

FVila Fator VII de Coagulação Sanguínea Ativado

FVII Fator VII! de Coagulação Sanguínea

FVilla Fator Villa de Coagulação Sanguínea Ativado

FX Fator X de Coagulação Sanguínea

FXa Fator X de Coagulação Sanguínea Ativado

FXI Fator X| de Coagulação Sanguínea

FXla Fator X| de Coagulação Sanguínea Ativado

EXII Fator XIl de Coagulação Sanguínea

EXI Fator XII! de Coagulação Sanguínea

FXllla Fator XII! de Coagulação Sanguínea Ativado

HAc Ácido acético

HDX-MS Espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1- Piperazinoetanossulfônico

HIC Cromatografia de Interação Hidrofóbica

HPLC Cromatografia em Fase Líquida de Alta Eficiência

HPLC-SEC Cromatografia de Exclusão por Tamanho de Alta Eficiência

HRP Peroxidase de Raiz Forte

IgG Imunoglobulina G

IPA Álcool! isopropílico

IU unidade internacional kDa Kilodálton

L Carga

LDS dodecil sulfato de lítio

M Marcador de peso molecular

M Molar mAB Anticorpo monoclonal

MÊS Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico

NMÍNiQ Água ultrapura tipo 1

Nac! Cloreto de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

NE Pós-eluato

OC1 Tampão de equilíbrio alcalino

Out 1-7 Válvula de saída 1-7

P1 Pool de produtos 1

P2 Pool de produtos 2 pdFVII! Fator VIII derivado do plasma (preferivelmente humano)

PE Pós-eluato

PETG Tereftalato de polietileno

Polysorbate 80 Surfactante não iônico

ProtParam Ferramenta para o cálculo de vários Parâmetros físicos e químicos de proteínas

PVDF Polivinildissulfona

QA1 Tampão de equilíbrio AIEX

QB1 Tampão de eluição AIEX 1 QB2 Tampão de eluição AIEX 2 Rel. Abs. Absorvência relativa rE VII Fator — VIII de coagulação sanguínea recombinante RP Fase invertida S/D Solvente/Detergente SA3 Tampão de equilíbrio CIEX SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio SEC Cromatografia de Exclusão por Tamanho SOP Procedimento Operacional Padrão SOS-E Eluato SourceS TFA Ácido trifluoroacético TFPI Inibidor da via do fator tecidual ThT Tioflavina T TNBP Fosfato de tributila Tris Tris(hidroximetil)-aminometano Triton X100 4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietileno Glicol Trp Triptofano TWA Solução de cloreto de sódio 1 M Tween 80 Nome comercial para Polysorbat 80 Tyr Tirosina UV Ultravioleta vv volume/volume VE Pré-eluato vWwF Fator de von Willebrand W1-3 Fase de lavagem 1-3

[0093] Como representado na Figura 2A, o Fator VIll de cadeia única de comprimento total (FVIIl) compreende seis domínios principais, designados A1, A2, B, A3, C1 e C2. Durante a biossíntese, o FVIII de cadeia única é clivado em duas cadeias, uma cadeia pesada e uma cadeia leve. A presença de diferentes posições de clivagem através do FVIIIl de cadeia única leva à geração de quatro variantes de cadeia pesada e duas variantes de cadeia leve: a variante de cadeia pesada de comprimento total (180 kDa), as variantes de cadeia pesada truncada (150 kDa e 110 kDa) e a variante da cadeia pesada exaurida de domínio B (90 kDa), a cadeia leve padrão (80 kDa) e a cadeia leve estendida (120 kDa). Aqui, as variantes de cadeia pesada serão principalmente referidas como cadeia pesada do FVIII! de 180 kDa ou cadeia pesada do B100-FVIII, FVII de 150 kDa ou cadeia pesada de B7O-FVIII, FVIII de 110 kDa ou cadeia pesada de B20-FVII! e FVIII de 90 kxDa ou BDD- FVIIl. A associação de uma dessas variantes de cadeia pesada com uma das cadeias leves resulta em várias subespécies heterogêneas de FVIII, cada uma compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[0094] O termo "uma composição compreendendo FVIII" como aqui utilizado, refere-se a uma composição em que todo o FVIII é definido como se segue. Salvo indicação em contrário, o termo "Fator VIII" ou "FVIII" conforme aqui utilizado, refere-se ao FVIIl naturalmente processado, compreendendo várias subespécies heterogêneas de FVIII. No entanto, mesmo após o processamento natural, o FVIII pode compreender FVIII de cadeia única residual (isto é, não clivado) (ver abaixo). Se o processamento natural for ineficiente, o FVIII pode até compreender principalmente o FVIII de cadeia única. Assim, o termo "Fator VIII" ou "FVIII" conforme aqui utilizado, também se refere ao FVII! naturalmente processado compreendendo FVIII de cadeia única residual ou ainda principalmente o FVIII de cadeia única.

[0095] Como será conhecido por uma pessoa versada na técnica, o termo "rFVII! de comprimento total" conforme aqui utilizado, refere-se ao rFVII! expresso a partir do CDNA do FVII! de comprimento total. Como descrito acima, o rFVII de comprimento total é compreendido de uma mistura heterogênea de subespécies de rF VIII.

[0096] Como será conhecido de uma pessoa versada na técnica, os pesos moleculares das várias cadeias pesadas de FVIII, isto é, 180 kDa, 150 kDa, 110 kDa e 90 kDa, assim como os pesos moleculares das cadeias leves de FVIII, isto é, 80 kDa e 120 kDa, são "pesos moleculares aparentes" como visto em SDS-PAGE. Se necessário, a pessoa versada estará ciente de como os "pesos moleculares verdadeiros" podem ser calculados com base nas sequências de aminoácido conhecidas das cadeias pesadas e leves individuais do FVIII.

[0097] Como será compreendido por uma pessoa versada na técnica, "FVIII de cadeia única" conforme aqui utilizado, geralmente refere-se ao FVIII não clivado. A cadeia única pode compreender todos os domínios do Fator VIII, como representado na Figura 2A. No entanto, também é possível produzir FVI!l sem alguns domínios, um domínio ou parte de um domínio que está presente no FVIII de comprimento total. Nesse caso, o "FVIII de cadeia única" ainda se refere ao produto de FVIII não clivado que carece de alguns domínios, um domínio ou parte de um domínio, respectivamente.

[0098] Como será entendida por uma pessoa versada na técnica, no método de purificação de uma subespécie de FVIII de acordo com a presente invenção, a composição compreendendo FVIIlI é preferivelmente uma solução, embora a composição também possa ser um sólido que é dissolvido antes de executar o método de presente invenção. Como descrito acima, a geração intracelular do FVII| geralmente resulta na geração de várias subespécies heterogêneas ativas de FVIII. Portanto, como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, a composição compreendendo o FVIII contém mais de uma subespécie de FVIII.

[0099] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "relação de peso" refere-se a uma relação de pesos. Por exemplo, a relação de peso de uma subespécie de FVIII purificada em uma composição para todas as outras subespécies de FVIIIl na composição é calculada através da divisão do peso das subespécies de FVII| purificadas em uma composição pelo peso de todas as outras subespécies de FVIIl na composição.

[00100] “Como será entendido por uma pessoa versada na técnica, o método de purificação de uma subespécie de FVIII de acordo com a presente invenção refere-se ao aumento da relação de peso de uma subespécie de FVIIl para todas as outras subespécies de FVIII compreendidas na composição. A composição compreendendo o FVIII que é utilizado como um material de partida para o método da presente invenção pode conter um tampão diferente e ter um volume diferente do que a composição que compreende as subespécies de FVIII purificadas após a execução do método da presente invenção. No entanto, para avaliar o aumento na relação de peso (isto é, para avaliar a purificação) mediante a execução do método da presente invenção, o peso da subespécie de FVII! é determinado na composição que compreende o FVII! que é utilizado como material de partida para o método da presente invenção e na composição após a execução do método da presente invenção. Adicionalmente, o peso de todas as outras subespécies é determinado na composição compreendendo o FVIII que é utilizado como um material de partida para o método da presente invenção e na composição após a execução do método da presente invenção. Então, a relação de peso de uma subespécie de FVIII para todas as outras subespécies de FVIIlI pode ser calculada na composição que compreende o FVIII que é utilizado como um material de partida para o método da presente invenção e na composição após a execução do método da presente invenção, e um aumento na relação de peso pode ser determinado.

[00101] Para determinar a relação de peso de uma subespécie de FVIII para todas as outras subespécies de FVIIl em uma composição, o peso da subespécie de FVIII é determinado por HPLC de fase reversa C4, como descrito abaixo. Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, utilizando HPLC de fase reversa C4, as áreas sob a curva e desse modo as concentrações de subespécies de FVIIl em uma composição são determinadas (ver abaixo). Em uma solução com um determinado volume, a relação da concentração de uma subespécie de FVIIl e a concentração de todas as outras subespécies de FVIII é igual à relação de peso de uma subespécie de FVIII e todas as outras subespécies de FVIII. Assim, na presente invenção, a relação das áreas sob a curva e assim a relação das concentrações é utilizada para avaliar um aumento na relação de peso de uma subespécie de FVI!II para todas as outras subespécies de FVII!l compreendidas em uma composição.

[00102] Como mencionado acima, uma subespécie de FVIIl geralmente compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que estão associadas entre si. Assim, no método para purificar uma subespécie de FVIII de acordo com a presente invenção, a composição compreendendo o FVIII que é utilizado como material de partida e a composição compreendendo as subespécies de FVII! purificadas após a execução do método da presente invenção preferivelmente compreende as subespécies de FVIIIl que são compostas de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Contudo, também é possível que a cadeia pesada de FVIIl e a cadeia leve de FVIII sejam dissociadas, antes ou durante a execução do método da presente invenção. Assim, em uma modalidade alternativa do método da presente invenção, após a execução do método da presente invenção, a subespécie de FVIII purificada compreende uma cadeia pesada, mas nenhuma cadeia leve. Em tal modalidade, a composição que compreende o FVIII que é utilizado como um material de partida para o método da presente invenção pode compreender uma ou mais subespécies de FVII! que são compostas de uma cadeia pesada, mas nenhuma cadeia leve, ou de uma cadeia pesada que é associada com uma cadeia leve. Obviamente, se a composição compreendendo o FVIII que é utilizado como um material de partida para o método da presente invenção compreende subespécies de FVIIl que são compostas por uma cadeia pesada, mas nenhuma cadeia leve, as cadeias leves dissociadas podem ainda estar presentes na composição.

[00103] Aqui, o termo "espécies de FVIII" é geralmente utilizado como um equivalente a "subespécies de FVIII". No entanto, ficará claro para uma pessoa versada na técnica que, ocasionalmente, o termo "espécies de FVIII", conforme aqui utilizado, também pode se referir a uma única cadeia pesada ou leve de FVIII.

[00104] Como será claro para uma pessoa versada na técnica, as etapas individuais do método da presente invenção podem ser repetidas antes de prosseguir para a próxima etapa. Em tal modalidade, as soluções (por exemplo, os eluatos de cromatografia) resultantes de cada repetição da mesma etapa podem ser reunidas e depois utilizadas como o material de partida para a próxima etapa.

[00105] De preferência, o FVIIl da presente invenção é o FVIII humano, e a subespécie de FVIIl a ser purificada é uma subespécie de FVII! humano.

[00106] Preferiveimente, o FVIII da presente invenção é FVII| recombinante, e a subespécie de FVIIl a ser purificada é uma subespécie de FVIIIl recombinante. Contudo, também é possível que o FVIII da presente invenção seja FVIII derivado de plasma (pd) e que a subespécie de FVIIIl a ser purificada seja uma subespécie de FVIII derivada de plasma (pd).

[00107] Em princípio, qualquer composição compreendendo o Fator VIII pode ser utilizada como um material de partida para executar o método de purificação de uma subespécie de Fator VIII de acordo com a presente invenção.

[00108] Por exemplo, o Fator VIII anti-hemofílico recombinante humano ADVATE (um produto de Baxalta) ou a ADVATE Bulk Drug Substance (BDS) pode ser utilizado no método da presente invenção. O ADVATE é alternativamente referido como Octocog alfa, e mais informações sobre o ADVATE podem ser encontradas, por exemplo, em Keating et al. (Keating et al., 2012; incorporado aqui na sua totalidade). Durante a produção de ADVATE, o FVIII recombinante é secretado através do transporte vesicular e, portanto, enriquecido no sobrenadante da fermentação. Após a purificação, o pool de produtos de rFVII! é congelado a -80ºC e será aqui referido como ADVATE Bulk Drug Substance (BDS). Notavelmente, ADVATE/ADVATE BDS compreende várias subespécies heterogêneas de FVIII.

[00109] Alternativamente, eluatos tais como SOS-E podem ser utilizados como um material de partida no método da presente invenção. O SOS-E é produzido como o ADVATE BDS descrito acima, mas faltando uma etapa final de purificação.

[00110] Alternativamente, outras composições compreendendo o FVIIl humano de comprimento total (FL-FVIII) podem ser utilizadas como um material de partida no método da presente invenção. Notavelmente, como descrito acima, durante a biossíntese, o FVII! de cadeia única é processado em diferentes cadeias pesadas e leves. Assim, o FL-FVIII que pode ser utilizado como material de partida para o método da presente invenção geralmente compreende várias subespécies heterogêneas de FVIIl, cada uma compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[00111] No método da presente invenção, o tratamento com furina protease do Fator VIll compreendendo a composição melhora a separação de uma subespécie de Fator VIII durante a cromatografia,

produzindo uma composição que compreende ditas subespécies do Fator VIll com pureza e concentração ainda mais elevadas. O tratamento com furina é executado como será conhecido por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, o tratamento com furina pode ser executado através da mistura da composição compreendendo o FVIll com furina, ou através da aplicação da composição compreendendo o FVIIl a uma coluna que compreende furina. Por exemplo, a furina pode ser imobilizada na coluna e a composição compreendendo o FVIIl pode então ser aplicada à coluna. Alternativamente, o FVIII pode ser ligado na coluna e a furina pode então ser aplicada à coluna. Na presente invenção, quando se submete o FVIIll compreendido na composição ao tratamento com furina protease, a concentração final de furina é preferivelmente maior do que a 100 IU/ml. A concentração final como aqui utilizada refere-se à concentração de furina durante a incubação da composição compreendendo o FVIIl com furina, isto é, após a mistura da composição que compreende o FVIII com furina.

[00112] Durante o tratamento com furina protease, a maior parte da cadeia leve do FVIII estendida (120 kDa) que pode estar compreendida em uma composição compreendendo o FVIII é clivada para produzir a cadeia leve padrão (80 kDa). Assim, quando o método da presente invenção envolve tratamento com furina protease, a subespécie purificada de FVIII contém de preferência a cadeia leve do FVII! de 80 kDa e quase nenhuma cadeia leve do FVIIl de 120 kDa. Quase nenhuma cadeia leve do FVIII de 120 kDa refere-se a uma cadeia leve do FVIII de 120 kDa em peso de menos do que 5%, preferivelmente menos de 1% do peso total de toda a cadeia leve do FVIII nas subespécies purificadas de FVIII.

[00113] No método da presente invenção, várias etapas de cromatografia são executadas para purificar as subespécies de FVIII.

Cada uma dessas etapas de cromatografia compreende a "coleta do eluato que compreende ditas subespécies de FVIII". Como aqui utilizado, "coleta do eluato que compreende ditas subespécies de FVIII" geralmente significa que apenas uma fração do eluato é coletada, isto é, a fração compreendendo as subespécies de FVIIll a serem purificadas. A referida fração compreendendo a subespécie de FVIIIl a ser purificada não precisa compreender todas as subespécies de FVIII a serem purificadas que estão presentes no eluato. Em vez disso, a fração que compreende as subespécies de FVIII a serem purificadas é selecionada para compreender uma quantidade máxima de subespécies de FVIIl a ser purificada, enquanto compreende uma quantidade mínima de outras subespécies de FVIII. A pessoa versada na técnica estará ciente de vários métodos para selecionar a fração que compreende uma quantidade máxima de subespécies de FVIII a ser purificada, enquanto compreende uma quantidade mínima de outras subespécies de FVIIl. Por exemplo, o eluato pode ser coletado em várias alíquotas separadas de igual volume. Depois, a concentração das subespécies de FVII| a serem purificadas e a concentração de todas as outras subespécies de FVII! em cada alíquota podem ser determinadas por métodos conhecidos tais como determinação espectrofotométrica da concentração de proteínas, eletroforese em gel de poliacrilamida acrescida de coloração com prata e/ou western blotting ou cromatografia. Finalmente, as alíquotas que contêm as quantidades mais elevadas das subespécies de FVII!I a serem purificadas enquanto compreendem as quantidades mais baixas de outras subespécies de FVIIl podem ser selecionadas como a fração que compreende as subespécies de FVIII a serem purificadas. Estas alíquotas podem ser reunidas e utilizadas como o eluato compreendendo as subespécies de FVIII de acordo com a presente invenção.

[00114] Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, o processo de seleção das alíquotas que contêm as maiores quantidades das subespécies de FVIIl a serem purificadas, enquanto contém as quantidades mais baixas de outras subespécies de FVIII influenciará a pureza e a concentração das subespécies de FVIII purificadas obtidas através da execução do método da presente invenção. Por exemplo, qualquer omissão de alíquotas contendo subespécies de FVIIl a serem purificadas a partir do eluato compreendendo as subespécies de FVII| de acordo com a presente invenção reduzirá a concentração das subespécies de FVIII purificadas obtidas através da execução do método da presente invenção. Da mesma forma, a inclusão de alíquotas contendo quantidades significativas de outras subespécies de FVIII reduzirá a pureza das subespécies de FVIII purificadas obtidas pela execução do método da presente invenção. Assim, dependendo da concentração e pureza desejadas das subespécies de FVIII purificadas obtidas através da execução do método da presente invenção, a pessoa versada será capaz de determinar quais alíquotas selecionar como a fração que compreende as subespécies de FVIIIl a serem purificadas.

[00115] Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, assim que o eluato compreendendo a subespécie FVII| a ser purificada tenha sido determinado uma vez ou um número limitado de vezes no método da presente invenção, o método pode ser repetido sem determinar o eluato que compreende a subespécie do FVIIl a ser purificada. Em tal modalidade, o eluato compreendendo a subespécie de FVIII a ser purificada é selecionado com base na determinação anterior do eluato compreendendo a subespécie de FVIIl a ser purificada e o mesmo eluato é coletado. Naturalmente, mesmo quando o método da presente invenção for executado sem determinar o eluato que compreende a subespécie de FVIII a ser purificada, a seleção da fração compreendendo uma quantidade máxima da subespécie de FVII| a ser purificada enquanto compreende uma quantidade mínima de outras subespécies de FVIIl pode ser monitorada, por exemplo, utilizando cromatogramas.

[00116] O método para a purificação de uma subespécie de FVIIl da presente invenção compreende várias etapas de cromatografia. Como será conhecido de uma pessoa versada na técnica, existem diferentes modos de executar a cromatografia nos métodos de acordo com a presente invenção. Por exemplo, a purificação de amostras contendo apenas um ou dois produtos com poucas impurezas e comportamento muito diferente na resina correspondente pode ser executada utilizando um modo de eluição isocrática ou uma eluição de gradiente em etapas e os resultados podem parecer ser suficientes. Enquanto a eluição isocrática é executada com uma mistura de eluente inalterada ao longo de toda a fase de eluição, a eluição gradual aumenta a fração de um eluente gradualmente.

[00117] Como mencionado acima, a composição do FVIIl recombinante de comprimento total típico é altamente heterogênea, visto que contém todos os possíveis fragmentos de cadeia pesada e cadeia leve. Além do mais, todas as subespécies apresentam comportamento mais ou menos semelhante, pois são derivadas da mesma molécula de cadeia única. Assim, a eluição geralmente isocrática pode não levar a resultados satisfatórios. De preferência, o método para a purificação de subespécies de FVIII de acordo com os métodos da presente invenção é a eluição gradiente linear. Embora não se limite a isso, uma breve descrição é dada no que se segue, incluindo o princípio geral de eluição gradiente linear, assim como vantagens e desvantagens sobre outros tipos de eluição (ver também a Figura 3).

[00118] Em contraste com o modo de eluição isocrática, as quantidades relativas de dois eluentes em uma eluição gradiente linear variam ao longo do tempo. A eluição gradiente linear é geralmente iniciada com uma baixa porcentagem de eluente forte. Sua quantidade é então constantemente elevada, consequentemente diminuindo a fração de eluente fraco. A propriedade causadora da eluição da fase de eluente, por exemplo, polaridade na cromatografia de troca iônica, é dessa maneira intensificada ao longo do tempo. O comprimento e a inclinação do gradiente se comportam inversamente proporcional entre si. Quanto mais íngreme a inclinação, tanto mais curto o comprimento do gradiente e, assim, a fase de eluição. O comprimento do gradiente é mais frequentemente expresso como um múltiplo do volume da coluna. A inclinação do gradiente possui grande influência no comportamento da eluição. Substâncias com afinidades fracas irão eluir no início de um gradiente, enquanto substâncias com afinidades fortes exigem quantidades mais elevadas de eluente forte para romper sua ligação com a fase estacionária.

[00119] A eluição gradiente linear é preferivelmente adequada para misturas de moléculas semelhantes. Ao contrário de outros tipos de eluição, toda a faixa de condições é abordada no modo de eluição linear. Isso garante que a condição adequada para a eluição de uma determinada molécula seja dada em algum momento. Mesmo que duas moléculas apresentem alta similaridade, suas diferenças provocam pelo menos um comportamento de eluição ligeiramente diferente. O nivelamento das inclinações do gradiente pode ajudar a resolver essas duas substâncias, pelo menos em parte, através da eluição da substância de ligação mais fraca, enquanto que aquela com alta afinidade permanece ligada. Em geral, isso faz da eluição gradiente linear um processo muito robusto com muitos campos de aplicação. Mas o nivelamento das inclinações de gradiente possui suas desvantagens. Quanto mais nivelado o gradiente, tanto mais a fase móvel é transportada pela coluna, afetando assim volumes totais mais elevados. Leva mais tempo para eluir uma certa substância e requer mais eluato tornando-a assim mais diluída na fração final de eluato. A assim chamada ampliação máxima é observada no cromatograma. Por outro lado, gradientes lineares também podem minimizar a ampliação máxima em comparação com a eluição isocrática. A eluição isocrática pode fazer com que as moléculas eluam por longos intervalos na forma de amplos picos. Se o comportamento da eluição for conhecido, um gradiente linear mais inclinado pode ser aplicado para acelerar a eluição de substâncias distintas. Os picos resultantes são mais nítidos e as frações de eluato são mais concentradas.

[00120] As várias etapas de cromatografia dos métodos da presente invenção são executadas como serão conhecidas por uma pessoa versada na técnica. O que se segue descreve as modalidades preferíveis das diferentes etapas de cromatografia executadas nos métodos de acordo com a presente invenção. No entanto, a invenção não está limitada a essas modalidades.

[00121] Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, os métodos da presente invenção podem ser executados em pequena escala ou em grande escala (isto é, preparativa). Em pequena escala, os métodos podem ser executados sob várias condições diferentes para encontrar as condições ideais, que podem então ser utilizadas em grande escala. As condições que os inventores observaram ser particularmente adequadas são dadas abaixo. No entanto, a invenção não está limitada a elas.

[00122] Precedendo todas as operações cromatográficas da presente invenção, o sistema de cromatografia pode ser tratado com hidróxido de sódio 1 M, ácido acético 1 M e, finalmente, MilliQ para higienização. Adicionalmente, as bombas do sistema e a bomba de amostra podem ser expurgadas para remover o ar preso do corpo da bomba. Finalmente, todas as entradas podem ser lavadas com os tampões correspondentes.

Primeira etapa de cromatografia dos métodos da presente invenção

[00123] No método para purificar uma subespécie de Fator VIII de acordo com a presente invenção, a primeira etapa de cromatografia é uma etapa de cromatografia de troca aniônica. Os inventores descobriram surpreendentemente que sua alta resolução oferece alta capacidade de separação.

[00124] Em pequena escala, várias operações podem ser executadas utilizando resinas MonoQ sob diferentes condições para avaliar a combinação mais adequada de parâmetros. Tais operações podem, por exemplo, ser executadas nos sistemas ÁKTA Avant 25 ou ÁAKTA Pure 25 a 4ºC utilizando a coluna MonoQ Small Scale com um volume de coluna de 0,982 ml. Uma separação aproximada das subespécies de FVIII é alcançada.

[00125] Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, o sistema tampão MonoQ padrão e as condições padrão podem ser utilizados para a (primeira) etapa de cromatografia de troca aniônica dos métodos da presente invenção. Tampões MonoQ exemplares que podem ser utilizados nos métodos da presente invenção são listados na Tabela 9. O material de partida pode ser uma composição que compreende o FL-rFVIIl, por exemplo, uma composição chamada eluato SourceS (SOS-E). O SOS-E foi eluído sob condições de alta força iônica e é armazenado a < -60ºC. Para evitar uma perda de atividade, o material de partida é preferivelmente descongelado lentamente na temperatura ambiente. A amostra nativa pode subsequentemente ser diluída por um fator de diluição de quatro com um tampão de baixa força iônica, por exemplo, tampão QA1. Isso reduz a condutividade em uma extensão suficiente e, portanto, permite a ligação do produto à resina MonoQ. A solução de amostra pode finalmente ser filtrada estéril com um filtro de membrana de 0,2 um para evitar a contaminação potencial ou bloqueio do leito da coluna. A seguinte tabela mostra um esquema de cromatografia geral exemplar, incluindo informações sobre tampões, gradiente, taxa de fluxo linear e tempo de permanência, assim como volume da coluna e direção do fluxo para cada etapa cromatográfica.

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[00126] Oque segue descreve uma modalidade exemplar ("padrão") de como a cromatografia em pequena escala é executada na primeira etapa do método de acordo com a presente invenção.

Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, todas as condições representam meramente parâmetros e condições preferíveis, sem limitar a invenção.

Além do mais, todos os parâmetros e condições listados podem ser combinados com quaisquer outros parâmetros e condições listados para executar a primeira etapa de cromatografia de acordo com os métodos da presente invenção.

No início a coluna passa de preferência por uma fase de equilíbrio intensiva composta de quatro etapas distintas.

A coluna é lavada por seis volumes de coluna com tampão OC1, que é uma solução alcalina de alta força iônica, seguida por uma etapa de lavagem com água ultrapura, a fim de remover o tampão OC1 da coluna.

O tratamento com tampão OC1 garante que todos os grupos de amônio quaternário da resina MonoQ sejam acoplados ao seu contraíon correspondente, que é neste caso o íon de cloreto monovalente.

A troca de íons como hidróxido que surge do armazenamento anterior ou qualquer outra molécula remanescente por cloreto ocorre preferivelmente sob condições alcalinas.

A fim de preparar a coluna para a composição tampão final, a resina pode ser equilibrada para cinco volumes de coluna com uma mistura de 65% QA1 e 35% QB1. Ambos são tampões Tris 50 mM, diferindo apenas em sua concentração de cloreto de sódio.

Adicionalmente, ambos os tampões contêm cloreto de cálcio 5 mM e 0,1% Polissorbato 80, que são necessários para estabilização da estrutura de proteína e prevenção da adsorção em superfícies com carga negativa, respectivamente.

A relação já mencionada de tampão QA1 e QB1 fornece uma molaridade de cloreto de sódio de aproximadamente 260 mM.

A quarta e efetiva etapa de equilíbrio é preferivelmente executado exclusivamente com tampão QA1. Visto que esta é a última etapa antes da aplicação de amostra, um volume total de dez volumes da coluna é passado através da coluna para garantir condições de baixa condutividade e pH quase neutro, ambas necessárias para a ligação das moléculas de FVIII à resina.

A amostra pode ser preparada conforme descrita acima e depois aplicada à coluna utilizando a bomba de amostra e o sensor de ar.

À carga de coluna é de aproximadamente 18.500 IU/ml de resina MonoQ.

O fluxo direto resultante pode ser coletado através da válvula de saída e utilizado para outras análises do produto remanescente não ligado.

À solução de amostra não ligada pode ser removida da coluna por uma etapa de lavagem utilizando quatro volumes da coluna do tampão QA1. Impurezas menores podem ser removidas por baixas concentrações de sal.

Portanto, duas etapas de lavagem ambas de dez volumes de coluna com 13% e 18% de tampão QB1 são preferivelmente implementadas.

Todas essas etapas descritas até agora podem ser executadas com uma taxa de fluxo linear de 35,71 cm/h, que corresponde a um tempo de permanência de 8,40 minutos.

A taxa de fluxo durante a eluição gradiente linear é preferivelmente reduzida para 20,0 cm/h e a concentração de tampão QB1 aumenta de 18% para 100% em oito volumes de coluna.

Isso fornece um gradiente de condutividade começando em 20 mS/cm e finalmente terminando em aproximadamente 80 mS/cm.

Esse nível pode ser mantido por outros cinco volumes de coluna com taxa de fluxo quase semelhante para remover as subespécies eventualmente remanescentes do FVIII.

Todas as três etapas de lavagem, assim como a eluição da etapa de gradiente e linear, podem ser reunidas no coletor de frações em tamanhos razoáveis de fração para posterior amostragem.

Uma vez concluída a eluição, a coluna deve ser regenerada para remover todos os tipos de substâncias remanescentes da resina, principalmente proteínas e peptídeos.

Uma sequência de MIlliQ, ácido acético a 75%, MÍIlliQ e hidróxido de sódio 1 M, cada etapa de cinco volumes de coluna, é preferivelmente repetida duas vezes e finalmente concluída com outra etapa de enxágue de MIlliQ. O fluxo é direcionado ascendente, porque é assumido que a ligação ocorre nas áreas superiores da coluna devido à enorme capacidade de ligação da resina MonoQ. O limite de capacidade quase nunca é atingido. Um modo de fluxo descendente na fase de regeneração, no entanto, apenas transportaria impurezas de um sítio de ligação para o próximo, até finalmente removê-las na saída da coluna. O modo de fluxo ascendente, por outro lado, remove as impurezas com muito mais eficiência. Além disso, a higienização da coluna evita a contaminação biológica por bactérias ou algas. A taxa de fluxo linear durante o ciclo de regeneração depende da respectiva solução. A taxa de fluxo linear máxima de 60,48 cm/h é utilizada apenas para MIilliQ devido à sua baixa viscosidade. O ácido acético a 75% é muito mais viscoso e seria capaz de provocar problemas de pressão na coluna. Para evitar isso, seu fluxo pode ser reduzido para 19,05 cm/h, aproximadamente um terço da taxa de fluxo máxima. As etapas utilizando solução de hidróxido de sódio 1 M são preferivelmente operadas em taxas de fluxo intermediárias. A etapa final pode ser o armazenamento da coluna. As resinas MonoQ são armazenadas em solução de hidróxido de sódio 10 mM para mantê-las estéreis ou, pelo menos, evitar incrustações microbiológicas. A coluna pode ser lavada com cinco volumes de coluna de solução de hidróxido de sódio 10 mM no modo de fluxo descendente em uma taxa de fluxo intermediária de 38,10 cm/h.

[00127] Na primeira etapa de cromatografia de acordo com os métodos da presente invenção, é preferível estender o comprimento do gradiente na fase de eluição Os inventores descobriram surpreendentemente que isso intensifica a separação das subespécies de FVIII. O comprimento do gradiente linear padrão é definido como oito volumes de coluna, conforme descrito acima. O gradiente resultante é relativamente íngreme e de curta duração, visto que já a condutividade atinge seu valor alvo em apenas oito volumes de coluna. Uma duplicação do comprimento do gradiente para 16 volumes de coluna leva a um aumento de condutividade duas vezes mais uniforme. O próprio sistema de tampão e as outras fases não precisam ser mais modificados.

[00128] Em uma modalidade preferida, a maturação da furina protease pode ser executada antes da primeira etapa de cromatografia no método de acordo com a presente invenção. A furina protease é geralmente responsável pela clivagem de pró-peptídeos e proteínas imaturas para suas respectivas formas ativas. Os inventores descobriram surpreendentemente que a incubação da amostra com uma certa quantidade de furina ativa leva à redução da heterogeneidade e, portanto, a um comportamento diferente durante a eluição. Portanto, é preferível que um procedimento de maturação seja incluído na preparação padrão da amostra. Em tal modalidade, a amostra nativa pode ser diluída por um fator de diluição de dois, por exemplo, com tampão QA1 temperado no ambiente, de modo a diminuir sua força iônica e aumentar a temperatura da solução. Ambos são necessários para a enzima apresentar sua função e atividade apropriadas. Uma certa quantidade de solução enzimática pode ser adicionada de modo que a concentração neste momento seja de pelo menos 100 IUÚ/ml de solução de amostra diluída. Após a incubação, por exemplo, durante um período mínimo de quatro horas na temperatura ambiente, outra etapa de diluição (1:2) com tampão QA1 frio pode ser executada para interromper a reação enzimática e diminuir ainda mais a condutividade da amostra. Ambas as etapas de diluição podem corresponder a um fator de diluição total de quatro. A solução da amostra pode finalmente ser filtrada através de uma cápsula de filtro estéril de 0,2 um para remover as partículas sólidas que eventualmente ocorrem e evitar danos à coluna. Além do tratamento com furina protease, é preferível aplicar a abordagem de prolongamento do comprimento de gradiente como descrito acima. O comprimento do gradiente de 16 volumes de coluna para a fase de eluição pode ser retido.

[00129] Uma outra modalidade da primeira etapa de cromatografia de acordo com os métodos da presente invenção alcança a separação de subespécies de FVIIIl através de um comprimento de gradiente estendido adicional e etileno glicol como um aditivo na fase de eluição. O esquema de cromatografia pode ser quase idêntico àquele descrito na tabela 1, exceto pelo comprimento do gradiente e composição do tampão. A amostra tratada e diluída com furina protease pode ser aplicada à coluna e posteriormente lavada com quatro volumes de coluna do tampão QA1 original. As próximas duas etapas de lavagem podem ser executadas com etileno glicol contendo tampões QA1 e QB1. A eluição pode então ser realizada através da elevação da porcentagem de tampão QB1 contendo etileno glicol de 18% para 100% ao longo de um comprimento de gradiente aumentado de 32 volumes de coluna. O comprimento do gradiente estendido deve espalhar ainda mais a distribuição dos picos de subespécies de FVIII. O etileno glicol diminui a condutividade dos tampões durante a eluição. Pode ser adicionado para aumentar a resolução através da abordagem das propriedades hidrofóbicas das proteínas alvo.

[00130] O que se segue descreve uma modalidade exemplar de como a cromatografia em grande escala (preparativa) pode ser executada na primeira etapa do método de acordo com a presente invenção. Como ficará claro para uma pessoa versada na matéria, todas as condições representam meramente parâmetros e condições preferíveis, sem limitar a invenção. Além disso, todos os parâmetros e condições listados podem ser combinados com quaisquer outros parâmetros e condições listados para executar a primeira etapa de cromatografia de acordo com os métodos da presente invenção.

À cromatografia de troca aniônica preparativa como a primeira etapa de purificação em grande escala de subespécies de FVIIl pode ser executada utilizando a coluna MonoQ Prep Scale com aproximadamente 20 ml de volume de coluna.

Informações adicionais com respeito à resina MonoQ e o hardware de coluna correspondente são fornecidas abaixo.

As operações preparatórias podem ser executadas sob condições semelhantes como as descritas acima.

Assim, as modalidades preferidas descritas para as operações em pequena escala também são modalidades preferidas das operações preparativas.

No entanto, alguns parâmetros avaliados como úteis são preferivelmente implementados no esquema de cromatografia exemplar para operações de MonoQ preparativas, que é mostrado na seguinte tabela.

VvVTIIVE no o ox 2 ê o Ss o o 3 = no Sm; = FC 9 o oo o e o o o 0 0 0 0 0 06 É E 8 88 $SE- no *3n 388666 óóóós8oêB Ss SSS o Ss S SSSSS8S8SSÇE 8 | 33SS SS SST osooigoEkE ST ooo 2 STE TOA A A A A 8 DD DE y O w O O O o mu ww o CE ww o ooo o ooo Lc odds o çx>y o XXÉãdo ouoovosoXda da Kd Ka Ka Kd Ka Xe ss TT oº2 o 2 ZW Tv 2 o [3 2 2222 2222 2 215 8 sc E E E É E E E E c 2 2 2 2 2 2 2 2 2 08 o 2 S&S SS SS SS SS TT T TOTO SETE 8 c à xXx [6 6 6 SS 3 Soo o ooo ooo oo oco? 5 go 2 [E É 888 2 EEE 91ó$ó3$3333333ce E 3? < $$ S SFT E ES $& cs sc es ec ee cc os Sa 8 | 888 338 338 SS SS E Ego SC & O E SS OOo o O a À À à À À à à Og 3 O g [6 SST 333 SST TWT TWT TT SS O o o 9 o o o olê o 8 & | E 3 2 232 2 RATE &£ | 33535353 33535353 3333535353 533334 o Ao JE EELL EELL EEE LELErars3seEe 2 > g a . o o Ss Ss Ô Soo Ss É FNE v õ o o o 2 18% eo 2 o " ") ") ") o ço SS - ooo + + + + E E O $3 22 2 0 QCocqÊd cocoooooooos 5? > odNG?P> PPS seosscosorsrougêãs a 2 oç E eo Sox s 28 E 2 o o eo 2º go TE o o Ss ZE S o o o 2 |6 x GS às eo o S s S & 18 x EE o oooo cgo9go o CC Ss o Ss E 8 o 66 TTTTT TT TG 6266 2 6 aa do FO o o o o o CC Tas TNNTEeNNNgE O 8 of E 33 FA o E Oo = 3 o o o o o CN E = - - = ES ge | ae ara ecoeeo clonoeonanaoaoaNOoH ES El ec EeZ rrro & wo Tí)oí)s Io Ir os5 XÁ 2 IRFRFRRRF RRFFSY Sos Rrososoraorosoes o o o Ss ER 8 & Rr & RW 28º

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[00131] Semelhante às operações em pequena escala, o SOS-E pode ser utilizado como material de partida para operações preparatórias. O carregamento da coluna pode ser definido como

20.000 IU/ml de resina MonoQ. De preferência, a quantidade requerida que corresponde à carga da coluna é descongelada lentamente e subsequentemente diluída, por exemplo, com tampão QA1 temperado no ambiente, por um fator de diluição de dois. A maturação da furina protease pode ser executada em um nível de atividade de > 100 IU/ml de solução de amostra diluída, por exemplo, durante pelo menos quatro horas em temperatura ambiente. A solução de amostra maturada de furina pode ser novamente diluída com tampão QA1 por um fator de diluição de dois, de modo que a diluição total seja igual a 1:4. Desta vez, o tampão QA1 utilizado é de preferência esfriado para 4ºC, a fim de diminuir a atividade da furina através da diminuição da temperatura de solução. A solução da amostra pode finalmente ser filtrada através de um módulo de filtro estéril de 0,2 um em uma taxa de fluxo de 50 ml/min, utilizando uma bomba peristáltica e tubulação de silicone estéril. Pode haver uma diferença na composição de tampão dos materiais de partida, por exemplo, devido a diferentes etapas cromatográficas das quais são derivadas. Por exemplo, na presente invenção, a purificação do pool de subespécies de 90 kDa denominado F8 AD2 90kDa torna necessário o desenvolvimento de um procedimento modificado de preparação de amostras. Quando não há valor cromogênico disponível para o material de partida sem muita proteína diferente do FVIIl, a atividade pode ser aproximadamente derivada da concentração de proteína, utilizando a atividade específica aproximada de 5000 IU/mg de proteína. Um exemplo é mostrado abaixo:

[00132] carga da coluna = atividade específica x quantidade de amostra volume da coluna carga da coluna = 5000 IU/mg x 15,7 mg = 4000 IU/ml 20,11 ml

[00133] — Aqui, 4000 IU/ml é muito menor que o limite de carregamento da coluna superior de 20.000 IU/ml, para que todo o pool de amostras possa ser aplicado à coluna em uma única operação.

A amostra pode, portanto, ser descongelada e depois diluída, por exemplo, com tampão QA1 e tampão SA3 temperados no ambiente, até que uma condutividade de 11 mS/cm e um valor de pH de 6,5 sejam alcançados.

A relação do volume da amostra nativa para o tampão QA1 e para o tampão SA3 é de aproximadamente 1:4:2,9. Este procedimento garante condições semelhantes em relação à composição do tampão, condutividade e valor de pH, como se estivesse iniciando com o eluato SourceS.

A maturação da furina e a filtração estéril não são preferivelmente executadas se o material já tiver passado através de um ciclo de purificação e, portanto, deve ser muito puro.

As etapas gerais de cromatografia e tampões podem ser mantidas inalteradas.

O equilíbrio da coluna pode começar com seis volumes de coluna do tampão alcalino OC1 em uma taxa de fluxo linear de 71,0 cm/h.

A taxa de fluxo linear pode ser mantida até a fase de eluição do gradiente.

Dois volumes de coluna de água ultrapura podem ser subsequentemente aplicados à coluna para remover o tampão alcalino OC1. O equilíbrio efetivo da coluna pode ser executado de forma semelhante ao procedimento padrão.

Em primeiro lugar, cinco volumes de coluna de uma mistura contendo 65% de tampão QA1 e 35% de tampão QB1 podem ser aplicados à coluna e seguidos por dez volumes de coluna de tampão QA1, a fim de obter condições apropriadas para o carregamento da amostra.

A aplicação de amostra pode ser realizada através da aplicação direta na coluna utilizando a bomba de amostra e o sensor de ar.

A passagem através do líquido pode ser coletada para análise posterior dos componentes da amostra eventualmente não ligados.

Mais tarde, a amostra não ligada pode ser lavada com quatro volumes de coluna de tampão QA1. Os componentes da amostra de ligação fraca podem ser eluídos por duas etapas de lavagem com gradientes de etapa de 13% e 18% de QB1 em tampão QA1, respectivamente. Ambos possuem comprimentos de fase de dez volumes de coluna e podem ser executados com taxas de fluxo lineares de 71,0 cm/h. A própria eluição gradiente linear aumenta a quantidade de tampão de eluição QB1 de 18% para 100% em 32 volumes de coluna. O comprimento do gradiente estendido é preferivelmente utilizado, por causa da avaliação de operações em pequena escala. A taxa de fluxo durante a fase de eluição é preferivelmente reduzida para 40,0 cm/h. Outros cinco volumes da coluna de tampão QB1 em uma taxa de fluxo linear de 39,0 cm/h são supostos de remover a proteína que ainda está ligada à coluna. À regeneração da coluna pode ser quase idêntica às fases de regeneração padrão descritas acima. De modo a evitar condições de alta pressão quando se utiliza uma solução de baixa viscosidade como água ultrapura após uma solução de alta viscosidade como ácido acético a 75%, a fase consequente pode ser operada para um volume de coluna com a menor taxa de fluxo linear da fase anterior antes de aumentar o fluxo. A regeneração da coluna pode ser acionada no modo de fluxo ascendente. A coluna pode finalmente ser armazenada em solução de hidróxido de sódio 10 MM. As operações MonoQ preparativas podem ser executadas nos sistemas ÁKTA Pure 150. Todas as fases, partindo com a aplicação da amostra e terminando com a fase de eluição linear, podem ser coletadas através de diferentes saídas e do coletor de frações. A primeira parte e o fim da fase de eluição de gradiente linear podem ser coletados nas posições de saída, enquanto que a faixa na qual o produto é finalmente eluído é de preferência coletada em pequenas frações com o coletor de frações para posterior agrupamento.

Segunda etapa de cromatografia dos métodos da presente invenção

[00134] O que segue descreve uma modalidade exemplar de como a cromatografia em pequena escala pode ser executada na segunda etapa do método de acordo com a presente invenção.

Além do mais, todos os parâmetros e condições listados podem ser combinados com quaisquer outros parâmetros e condições listados para executar a segunda etapa de cromatografia de acordo com os métodos da presente invenção.

A cromatografia de exclusão por tamanho como uma segunda etapa de cromatografia dos métodos da presente invenção serve como etapa do processo para purificação adicional de eluatos produzidos pela cromatografia de troca aniônica em colunas MonoQ.

Também pode ser referido como etapa final de polimento para a remoção de impurezas menores.

O desenvolvimento de um procedimento geral para cromatografia de exclusão por tamanho pode ser realizado em uma coluna Superdex Increaese 200 pré- acondicionada, com 30 cm de altura do leito e um volume de coluna aproximado de 23,5 ml.

A cromatografia de exclusão por tamanho se baseia em diferentes volumes de gel que são acessíveis para uma molécula dependente de seu tamanho.

Portanto, as resinas SEC não possuem grupos funcionais que se ligam ou retêm a proteína alvo.

Consequentemente, não é necessário ter um tampão específico de equilíbrio ou eluição, mas sim um tampão que sirva como tampão de operação durante o equilíbrio, a aplicação da amostra e a fase de eluição.

O tampão de operação SEC é de preferência composto de 20% de tampão QA1 e 80% de tampão QB2, a fim de obter aproximadamente cloreto de sódio 300 mM.

Isto está na mesma faixa de concentração de sal em que o produto é preferivelmente eluído das resinas MonoQ.

O esquema geral de cromatografia pode ser encontrado na tabela 3. À primeira fase de equilíbrio é utilizada para remover 20% de etanol no qual a coluna é geralmente armazenada.

Portanto, 1,5 volume de coluna de MIilliQ podem ser lavados em 20,0 cm/h, o que corresponde a um tempo de permanência de 90 minutos.

A coluna pode então ser equilibrada no tampão de operação SEC para dois volumes de coluna em uma taxa de fluxo linear de 45,0 cm/h.

Esta também pode ser a taxa de fluxo padrão para todas as etapas, exceto o armazenamento da coluna.

Taxas de fluxo mais elevadas foram testadas, mas se mostraram inadequadas, devido às condições de alta pressão que às vezes elas provocam.

Os volumes de amostra recomendados variam de uL a 500 yuL para obter resultados satisfatórios de separação.

Esses pequenos volumes de amostra podem ser aplicados utilizando uma alça capilar.

A amostra pode ser lavada com 1,5 volume de coluna de tampão de operação durante a fase de eluição, na qual a separação ocorre de fato.

Esse volume é coletado em pequenas frações utilizando o coletor de frações.

Posteriormente, a coluna pode passar por uma fase de regeneração curta, compreendendo dois volumes de coluna de solução de hidróxido de sódio 0,5 M e dois volumes da coluna de água ultrapura na taxa de fluxo padrão.

A coluna pode finalmente ser lavada com dois volumes de 20% de etanol em uma taxa de fluxo linear reduzida de 20,0 cm/h para armazenamento.

Etapa Tampão/amostra Entrada Taxade Tempo de Volume Direçãodofluxo Saída fluxo linear — permanência — da

[em/h) Im) coluna Equilíbrio 1 MilliQ A2 20,0 90,0 15 Fluxo descendente Resíduos Equilíbrio 2 Tampão SEC A 45,0 40,0 2,0 Fluxo descendente Resíduos Aplicação de Eluato MonoQ Laço 45,0 40,0 —600uL Fluxo descendente Resíduos amostra Eluição Tampão SEC A 45,0 40,0 1,5 — Fluxodescendente Frac.

Regeneração 1 0,5 M NaOH B1 45,0 40,0 2,0 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 2º MiliQ A2 45,0 40,0 2,0 Fluxo descendente Resíduos Armazenagem 20% EtoH B2 20,0 90,0 2,0 Fluxo descendente Resíduos Tabela 3: Esquema de cromatografia exemplar da cromatografia de exclusão por tamanho em pequena escala com resina de aumento Superdex 200, fornecendo informações sobre os tampões e soluções utilizados, configurações de entrada, taxa de fluxo linear, tempo de permanência, volume da coluna aplicado, direção do fluxo na coluna e configuração de saída para cada etapa.

[00135] O que segue descreve uma modalidade exemplar de como a cromatografia em grande escala (preparativa) é executada na segunda etapa do método de acordo com a presente invenção.

O procedimento para cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa é baseado no procedimento em pequena escala descrito acima e, portanto, a maioria dos parâmetros é mantida constante.

Visto que a altura do leito das colunas SEC em escala preparativa é de quase 100 cm, é muito mais sensível à compressão do leito de gel.

Assim, a taxa de fluxo deve ser reduzida drasticamente para evitar condições de sobrepressão e possíveis danos à coluna.

A primeira etapa do equilíbrio é utilizada para remover a solução de armazenamento, que geralmente é hidróxido de sódio 0,1 M, mas em alguns casos também a solução de etanol a 20% é utilizada.

Um volume da coluna de água ultrapura pode ser esguichado através da coluna em taxas de fluxo reduzidas antes da fase de equilíbrio efetiva para esse propósito.

Essa fase pode ser executada com dois volumes de coluna de tampão de equilíbrio/eluição de SEC em uma taxa de fluxo de 9,5 cm/h, o que corresponde a um tempo de permanência de 596,21 minutos.

Todas as etapas que se seguem são preferivelmente executadas com uma taxa de fluxo padrão de 10,7 cm/h, o que equivale a 529,85 minutos de tempo de permanência.

Uma amostra de eluato MonoQ de aproximadamente 30 a 35 ml, contendo as subespécies de FVIIl desejadas, pode ser descongelada lentamente na temperatura ambiente e aplicada diretamente à coluna através de um superlaço de 50 ml.

A fase de eluição original preferivelmente utilizada em experiências de pequena escala é de 1,5 volume de coluna e foi fracionada inteiramente.

O tamanho de coluna em escala preparativa torna necessário dividir a fase de eluição original em três fases distintas de eluição, de modo a ser capaz de coletar a interessante faixa de eluição em frações apropriadas.

Semelhante às outras fases de eluição, a primeira é preferivelmente executada com tampão de equilíbrio/eluição SEC na taxa de fluxo padrão para 0,24 volume da coluna, que é coletada através de uma válvula de saída.

A eluição efetiva do produto deve ocorrer na segunda fase de eluição.

O volume total de 0,49 volumes da coluna pode ser coletado em 55 frações de -16,5 ml cada.

A terceira fase de eluição pode ter 0,77 volumes de coluna e semelhante à primeira fase de eluição completamente coletada através de uma válvula de saída.

Todas as três fases de eluição juntas podem ter 1,5 volume de coluna no total, o que equivale ao procedimento de eluição preferido original das experiências em pequena escala.

Depois disso, pode ocorrer uma regeneração de coluna curta pode ocorrer que contém tratamento com hidróxido de sódio 0,5 M e água ultrapura.

Cada uma das duas fases pode ter dois volumes de coluna no comprimento e realizada na taxa de fluxo padrão de 10,7 cm/h.

A coluna pode finalmente ser lavada com 1,5 volume de coluna de solução de hidróxido de sódio 0,1 M para armazenamento.

A regeneração da coluna e o armazenamento da coluna podem eventualmente ser omitidos se duas ou mais bateladas da mesma subespécie de FVIII forem purificadas em sequência.

Nesses casos, o reequilíbrio com o tampão de equilíbrio/eluição SEC pode ser colocado diretamente após a terceira fase de eluição.

Etapa Tampão/ Entra- Taxa de Tempo de Volume Direção do fluxo Saída amostra da fluxo linear perma- da [em/h] nência [m] coluna Equilíbrio 1 MiNiQ A2 1,5 3,777 1,0 Fluxo descendente = Resíduos Equilíbrio 2 Tampão SEC —A1 9,5 596,21 2,0 — Fluxo descendente Resíduos Aplicação de Eluato Laço 10,7 529,35 —-32 Fluxodescendente Resíduos amostra MonoQ mL Eluição 1 Tampão SEC Al 10,7 529,35 0,24 —Fluxodescendente Saída 1 Eluição 2 Tampão SEC Al 10,7 529,35 0,49 Fluxodescendente Frac. Eluição 3 Tampão SEC A 10,7 529,35 0,77 Fluxo descendente Saída 2 Regeneração 1 0,5 M NaOH B1 10,7 529,35 2,0 Fluxo descendente = Resíduos Regeneração 2 MilliQ A2 10,7 529,35 2,0 Fluxo descendente = Resíduos Armazenagem 0,1M NaOH B2 10,7 529,35 1,5 Fluxo descendente = Resíduos Tabela 4: Esquema de cromatografia exemplar da cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa com resina Superdex 200 Prep Grade, fornecendo informações sobre os tampões e soluções utilizados, configurações de entrada, taxa de fluxo linear, tempo de permanência, volume da coluna aplicado, direção do fluxo na coluna e configuração de saída para cada etapa.

[00136] Em outra modalidade da segunda etapa de cromatografia nos métodos de acordo com a presente invenção, a cromatografia de interação hidrofóbica é executada como um meio alternativo de separar as subespécies de 150 kDa e 180 kDa. As operações podem ser executadas em uma coluna de alto desempenho com 1,0 ml de fenil sepharose em um sistema ÁKTA Avant 25 na temperatura ambiente. Diferentes parâmetros e condições podem ser variados e testados. Um esquema de cromatografia exemplar para uma operação sob condições padrão pode ser visto na tabela 5. Visto que o mecanismo da cromatografia de interação hidrofóbica é oposto à cromatografia de troca iônica, a ligação da amostra ocorre sob condições de alto teor de sal, enquanto que a eluição é provocada por baixas condutividades. À configuração padrão é uma cromatografia bidimensional utilizando dois gradientes lineares consecutivos com tampões de eluição de resistência diferente.

O que se segue descreve uma modalidade exemplar de como a cromatografia de interação hidrofóbica pode ser executada na segunda etapa do método de acordo com a presente invenção.

O limite de carga da coluna superior pode ser especificado com 10.000 IU/ml de resina e a carga de coluna efetiva pode ser selecionada para estar mais abaixo desse limite.

Uma certa quantidade de, por exemplo, eluato SourceS é de preferência descongelado lentamente na temperatura ambiente.

Mais tarde, a furina protease pode ser adicionada em uma tal medida em que a atividade de furina esteja acima de 100 IU/ml de solução da amostra.

Após a maturação da furina na temperatura ambiente durante quatro horas, a amostra pode ser diluída com tampão HIC A através de um fator de diluição de dois.

Isso é necessário para aumentar a concentração de sal e permitir a ligação de amostra.

A filtragem estéril através de um disco de filtro de 0,2 um pode ser a etapa final da preparação de amostra.

Uma solução de etanol a 20% é comumente utilizada para armazenamento de coluna.

A coluna pode inicialmente ser lavada com dois volumes de coluna do tampão de equilíbrio EIC E1 para remover o etanol da coluna.

Isso pode ser realizado com uma taxa de fluxo linear de 10 cm/h.

A coluna pode posteriormente ser equilibrada com cinco volumes de coluna do tampão D contendo etileno glicol e cinco volumes de coluna do tampão E1 de equilíbrio com elevado teor de sal.

Uma taxa de fluxo linear de 20 cm/h pode ser utilizada como taxa de fluxo padrão para essas duas etapas, assim como para todas as etapas seguintes. Após a coluna ter sido equilibrada em condições de alto teor de sal, a amostra pode ser aplicada. As áreas hidrofóbicas sobre a superfície da proteína tendem a ligar os grupos de fenila hidrofóbicos na resina, a fim de evitar o contato com a fase aquosa circundante altamente polar. A aplicação da amostra pode ser realizada com bomba de amostra e sensor de ar até que todo o volume de amostra passe pela coluna. A fração de fluxo direto pode ser coletada através de uma posição de saída. Depois de lavar a coluna com cinco volumes de coluna de tampão de equilíbrio E1, a fase de eluição pode começar. A princípio a fração percentual do tampão de eluição C pode ser aumentada de O a 100% em 20 volumes de coluna. Este nível é preferivelmente mantido para mais cinco volumes de coluna até que a segunda parte da eluição comece. O nível de tampão D contendo etileno glicol pode ser aumentado para 100% em 16 volumes de coluna e mantido por mais cinco volumes de coluna. Toda a fase de eluição compreendendo ambos os gradientes pode ser coletada em pequenas frações utilizando o coletor de frações. A coluna pode ser regenerada por uma sequência de água ultrapura, álcool isopropílico, água ultrapura, solução de hidróxido de sódio 1 M e, finalmente, novamente água ultrapura. A coluna pode, depois disso, ser lavada com cinco volumes de coluna de solução de etanol a 20% para armazenamento.

[00137] Em outramodalidade da etapa de cromatografia de interação hidrofóbica nos métodos de acordo com a presente invenção, os tampões são ajustados e o comprimento do gradiente é estendido. Embora o procedimento geral seja semelhante à modalidade descrita acima, alguns parâmetros são de preferência variados nesta modalidade. Um novo tampão de equilíbrio com uma molaridade de cloreto de sódio de 750 mM é preferivelmente implementado e denominado tampão HIC E2 - sua condutividade é de aproximadamente 71 mS/cm. O material de partida pode ser substituído por um pool de eluato MonoQ enriquecido de 150 kDa. Se essa amostra já tiver sido tratada com furina protease antes de carregá-la na coluna MonoQ, uma segunda maturação de furina não será necessária. A condutividade das soluções de amostra é de preferência aumentada para aproximadamente 71 mS/cm com solução tampão HIC A e solução de cloreto de sódio 2 M, a fim de ajustá-la no mesmo nível que o tampão de equilíbrio. O equilíbrio da coluna, a aplicação da amostra e a regeneração da coluna podem ser iguais ao procedimento padrão. À fase de lavagem após a aplicação da amostra é preferivelmente dobrada para dez volumes de coluna utilizando o novo tampão de equilíbrio E2. A própria fase de eluição consiste preferivelmente de apenas um gradiente utilizando o tampão de eluição C, que não contém nenhum cloreto de sódio sob qualquer condição. A quantidade de tampão C é de preferência aumentada de forma muito mais plana para 100% em um comprimento de gradiente estendido de 40 volumes de coluna. O nível de 100% de tampão C pode ser mantido por mais cinco volumes de coluna. Imediatamente depois, a coluna pode ser submetida ao procedimento de regeneração habitual. De preferência, o segundo gradiente que utiliza o tampão D contendo etileno glicol não é mais utilizado.

[00138] Em uma modalidade preferida da segunda etapa de cromatografia nos métodos de acordo com a presente invenção, a cromatografia de interação hidrofóbica é uma cromatografia de modo negativo. A cromatografia de modo negativo visa à ligação de impurezas ao invés do produto. Na presente invenção, as subespécies remanescentes diferentes das subespécies de 150 kDa são supostas de se ligar à coluna, enquanto que as subespécies de 150 kDa são supostas de mais ou menos passar através da coluna e eluir na fração de fluxo direto. O procedimento para cromatografia em modo negativo é bastante diferente das outras abordagens de HIC e um procedimento exemplar é apresentado na tabela 5. O que segue descreve uma modalidade exemplar de como a cromatografia em modo negativo pode ser executada na segunda etapa do método de acordo com a presente invenção.

Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, todas as condições meramente representam parâmetros e condições preferíveis, sem limitar a invenção.

A amostra pode ser um pool de eluato MonoQ enriquecido com subespécie de 150 kDa, derivado de uma etapa de purificação preparativa.

A solução da amostra é de preferência descongelada e diluída com a mesma quantidade de tampão A temperado no ambiente (diluição 1:2). A condutividade pode então ser aumentada ainda mais para 70,0 mS/cm utilizando o tampão G de alto teor de sal.

O tampão de equilíbrio E2 pode ser similarmente ajustado para um nível de condutividade de 75,0 mS/cm pela adição do tampão G.

A coluna pode ser equilibrada de acordo com o procedimento padrão.

O eluato MonoQ diluído e ajustado pode ser aplicado diretamente na coluna utilizando a bomba de amostra.

A carga máxima da coluna pode ser muito excedida, em cujo caso, em algum momento, é provável que seja observada uma ruptura.

A fase de lavagem é de preferência estendida para 30 volumes de coluna, uma vez que é nessa etapa que se espera que o produto seja lavado para fora da coluna.

A fase de lavagem pode ser coletada em pequenas frações para permitir uma análise detalhada de frações únicas.

Para eluir a coluna, ela pode ser lavada com dez volumes de coluna do tampão de eluição C para remoção de toda a proteína ligada.

A regeneração da coluna pode ser executada de acordo com o procedimento padrão.

linear (om/h] permanência [m] coluna Equilíbrio 1 Tampão E1 Al 10,0 30,0 2,0 Fluxo descendente Resíduos Equilíbrio 2 Tampão D A2 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Resíduos Equilíbrio 3 Tampão E1 Al 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Resíduos Aplicação de amostra — Eluato SourceS Ss1 20,0 15,0 Volume de Fluxo descendente Saída 1 amostra Lavagem Tampão E1 Al 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Frac, Eluição gradiente 1 0-100% Tampão — A1/B1 20,0 15,0 20,0 Fluxo descendente Frac, c Eluição linear 1 Tampão C B1 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Frac, Eluição gradiente 2 0-100% Tampão B1/A2 20,0 15,0 16,0 Fluxo descendente Frac,

D Eluição linear 2 Tampão D A2 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Frac, Regeneração 1 MiliQ A3 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 2 IPA B2 20,0 15,0 100 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 3 MilliQ A3 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 4 1 M NaOH A4 20,0 15,0 100 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 5 MiliQ A3 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Resíduos Armazenagem 20% EtoH AS5 20,0 15,0 5,0 Fluxo descendente Resíduos Tabela 5: Esquema de cromatografia exemplar da cromatografia de interação hidrofóbica em pequena escala em resina de alto desempenho de resina sepharose, fornecendo informações sobre os tampões e soluções utilizados, configurações de entrada, taxa de fluxo linear, tempo de permanência, volume da coluna aplicado, direção do fluxo na coluna e configuração de saída para cada etapa. O respectivo volume de amostra depende do procedimento de preparação da amostra. Etapa de concentração dos métodos da presente invenção (por exemplo, uma terceira etapa de cromatografia)

[00139] Na etapa de concentração de acordo com os métodos da presente invenção, a cromatografia de troca aniônica pode ser executada para concentração. A resina SourceQ de troca aniônica é semelhante à resina MonoQ. Os grupos funcionais são idênticos, mas as partículas de SourceQ são três vezes maiores do que as partículas de MonoQ - a resolução na resina SourceQ é, portanto, menor.

O trocador de ânions SourceQ pode - na presente invenção - ser utilizado como etapa final da purificação preparativa das subespécies de FVIII.

Mas, em vez de outros eluantos de purificação que surgem da cromatografia de exclusão por tamanho, esta etapa pode ser utilizada para concentração.

Os eluatos MonoQ são muito diluídos durante a cromatografia de exclusão por tamanho preparativa, o que torna necessária uma etapa de concentração.

O procedimento geral inclui o equilíbrio da coluna, a aplicação de amostra, uma fase de eluição de etapa aguda que visa a rápida eluição de todo o teor de proteína em um pequeno volume e, finalmente, a regeneração e armazenamento da coluna.

Existem duas colunas SourceQ disponíveis para a concentração de eluatos SEC.

Visto que a capacidade de ligação das resinas SourceQ é comparável com as resinas MonoQ, as quais possuem capacidades de ligação muito elevadas, é na maioria dos casos suficiente utilizar a pequena coluna SourceQ com aproximadamente 3 ml de volume de coluna.

O esquema de cromatografia preferível mostrado na tabela 6 refere-se à pequena coluna SourceQ.

Mas alguns pools de produto podem tornar necessário o uso da coluna de SourceQ maior com 7 ml de volume de coluna, devido às suas concentrações mais elevadas de proteína.

O esquema de cromatografia para a coluna maior é, em princípio, semelhante àquele mostrado na tabela 6. As taxas de fluxo linear são ampliadas de acordo com as respectivas propriedades da coluna de uma tal forma que os tempos de permanência sejam mantidos constantes.

Etapa Tampão/amostra “Entrada — Taxa de Tempo de Volumeda Direçãodofluxo Saída fluxo linear permanência [m] coluna lem/h) Equilíbrio 1 oc1 AB 29,80 7,85 68 Fluxo descendente Resíduos Equilíbrio 2 Milia A2 78,80 297 20 Fluxo descendente Resíduos Equilíbrio 3 30% QA1/70% A1/B2 78,80 297 50 Fluxo descendente Resíduos QB2 Equilíbrio 4 QA1 Al 78,80 297 100 — Fluxo descendente Resíduos Aplicação de amostra Eluato SEC si 78,80 297 Vol. da Fluxo descendente Saída 1 amostra Lavagem QA1 Al 78,80 297 40 Fluxo descendente Saída 2 Eluição de etapa 1 20% QA1/80% — A1/B2 78,80 297 40 Fluxo descendente Frac. QB2 Eluição de etapa 2º 100% QB2 B1 78,80 297 20 Fluxo descendente Frac. Regeneração 1 MÍiliQ A2 48,90 4,79 55 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 2 50% HAc As 14,90 15,70 55 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 3 MiliQ A2 48,90 4,79 55 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 4 1 MNaPH A5 31,90 7,34 55 Fluxo descendente Resíduos Regeneração 5 Mila A2 48,90 479 55 Fluxo descendente Resíduos Armazenagem 10 MM NaOH A6 38,30 611 5,0 Fluxo descendente Resíduos Tabela 6: Esquema de cromatografia exemplar da cromatografia de troca aniônica SourceQ em escala preparativa, fornecendo informações sobre os tampões e soluções utilizados, configurações de entrada, taxa de fluxo linear, tempo de permanência, volume da coluna aplicado, direção do fluxo na coluna e configuração de saída para cada etapa. O respectivo volume de amostra depende do procedimento de preparação da amostra.

[00140] O que segue descreve uma modalidade exemplar de como a cromatografia pode ser executada na terceira etapa do método de acordo com a presente invenção. Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, todas as condições representam meramente parâmetros e condições preferíveis, sem limitar a invenção. Além do mais, todos os parâmetros e condições listados podem ser combinados com quaisquer outros parâmetros e condições listados para executar a cromatografia na terceira etapa de cromatografia de acordo com os métodos da presente invenção.

O equilíbrio pode ser iniciado primeiro com 6,8 volumes de coluna do tampão alcalino OC1 em uma taxa de fluxo linear reduzida de 29,8 cm/h, a fim de associar os grupos funcionais ao cloreto como contraíon.

O tampão OC1 pode ser subsequentemente removido através do enxágue da coluna com dois volumes de coluna do MIilliQ em uma taxa de fluxo de 78,8 cm/h, o que corresponde a um tempo de permanência de 2,97 minutos.

A coluna pode depois disso ser tratada com uma mistura de tampão QA1 30% e QB2 70% para cinco volumes de coluna.

Esta mistura contém aproximadamente 260 mM de cloreto de sódio e evita a lavagem dos contraíons de cloreto dos grupos funcionais, quando se altera o sistema tampão.

A quarta fase de equilíbrio pode ser executada exclusivamente com o tampão QA1. Dez volumes de coluna podem ser aplicados à coluna em uma taxa de fluxo de 2,97 cm/h, a fim de levar a coluna às condições adequadas para a aplicação da amostra.

A aplicação de amostra ocorre apenas em condições de baixa condutividade.

A cromatografia de exclusão por tamanho preparativa é preferivelmente operada em concentrações intermediárias de cloreto de sódio, provocando níveis de condutividade de cerca de 30 mS/cm, o que impediria a ligação da amostra da coluna de SourceQ.

Portanto, é necessário diminuir o nível de condutividade através da adição de tampão QA1 até 11 mS/cm ou menos.

Isso pode provocar um aumento de aproximadamente cinco vezes no volume da amostra.

A amostra pode ser aplicada à coluna utilizando a bomba de amostra e o sensor de ar com uma taxa de fluxo linear de 78,8 cm/h.

Depois disso, a coluna pode ser lavada com quatro volumes de coluna de tampão QA1 antes do início da fase de eluição.

A eluição é de preferência realizada com um gradiente de etapa de tampão QB2 a 80% e tampão QA1 a 20% para quatro volumes de coluna.

Isso se correlaciona com uma concentração de cloreto de sódio de 300 mM ou uma condutividade de

30 mS/cm. A proteína-alvo é assim rapidamente eluída em um pequeno volume. As frações podem ser coletadas no coletor de frações. As respectivas frações podem ser agrupadas de tal maneira que uma concentração de proteína adequada seja alcançada. O segundo nível de eluição é preferivelmente executado com 100% de tampão QB2, o que corresponde à concentração de cloreto de sódio 375 mM. A coluna pode então ser regenerada por uma sequência de água ultrapura, ácido acético 50%, água ultrapura, hidróxido de sódio 1 M e finalmente água ultrapura mais uma vez, cada 5,5 volumes de coluna de comprimento em várias taxas de fluxo de acordo com suas viscosidades. As condições de armazenamento antimicrobiano podem ser obtidas através da lavagem da coluna com cinco volumes de coluna de hidróxido de sódio 10 mM.

[00141] Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, qualquer sistema de cromatografia adequado pode ser utilizado para executar os métodos da presente invenção. Por exemplo, purificações em pequena e larga escala podem ser executadas nos sistemas ÁKTA FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). Os sistemas ÁKTA Pure e ÁKTA Avant 25 são adequados para colunas em pequena escala e baixas taxas de fluxo, enquanto que os sistemas AÁKTA Pure 150 são utilizados para a purificação de quantidades mais elevadas de proteínas e diâmetros de coluna maiores concomitantes, assim como taxas de fluxo mais elevadas. Todos os cromatógrafos ÁKTA podem ser operados pelo pacote de software UNICORN.

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[00142] “Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, a etapa final de concentração dos métodos da presente invenção não é necessariamente uma etapa de cromatografia. A pessoa versada na técnica estará ciente de numerosas alternativas adequadas para concentrar o eluato que compreende as subespécies de FVIII da etapa de cromatografia precedente (segunda) da presente invenção. Por exemplo, a ultrafiltração pode ser utilizada para concentração.

[00143] Como será óbvio para uma pessoa versada na técnica, o método para purificar uma subespécie de FVIIl de acordo com a presente invenção também pode ser utilizado para purificar outras proteínas ou subunidades de proteína de composições compreendendo várias proteínas ou subunidades de proteína com alta pureza. Obviamente, as composições compreendendo proteínas Ou subunidades de proteína purificadas podem então ser utilizadas, por exemplo, como um medicamento.

[00144] —Surpreendentemente, os inventores também descobriram que o tratamento com furina do FVII! recombinante aumenta a atividade do FVIIl, mesmo sem a purificação de subespécies. Esse tratamento com furina do FVIII pode ser executado como descrito acima para o tratamento com furina como parte do método para purificação de uma subespécie de FVIIl. De preferência, o FVIIl recombinante que compreende o FVIII de cadeia única (isto é, não clivado) é submetido ao tratamento com furina sem purificação de subespécies da presente invenção. Tal tratamento com furina pode ser executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 50 IU/ml, mais do que 100 IU/ml, mais do que 200 IU/ml ou mais do que 300 IU/ml, mas é preferivelmente executado utilizando furina em uma concentração final de mais do que 100 IU/ml. O tratamento com furina pode ser executado durante 1 h na temperatura ambiente, isto é, ao redor de 21ºC. Após o tratamento com furina, a furina pode ser separada do FVIII. O FVIII tratado com furina pode ser utilizado como um medicamento, por exemplo, para tratar pacientes com distúrbios hemorrágicos tais como a hemofilia A.

[00145] “Como será conhecido de uma pessoa versada na técnica, existem diferentes métodos disponíveis para a determinação da concentração de proteina em soluções aquosas. A medição espectrofotométrica na faixa de ultravioleta em 280 nm é adequada para soluções de proteína altamente purifcadas e é, portanto, preferivelmente utilizada na presente invenção. De acordo com a Lambert Beers Law A=e*l*c é a absorvência medida A, uma função linear da concentração de proteína c (M), do comprimento da via celular 1 (cm) e do coeficiente de extinção e (Mem). O princípio subjacente para a absorvência de soluções de proteína em 280 nm é o teor dos aminoácidos aromáticos triptofano e tirosina, assim como a cistina, isto é, as ligações de dissulfeto, que contribuem para a absorvência total em menor extensão. A fenilalanina contribui para a absorvência apenas em comprimentos de onda mais baixos e, portanto, não é relevante para medições de UV em 280 nm. Para ser capaz de observar concentrações de proteína a partir de soluções aquosas, o coeficiente de extinção para uma proteína particular, que depende principalmente da composição de aminoácidos e da abundância de aminoácidos aromáticos e cistina, deve ser determinado. Devido à composição heterogênea do FVIII recombinante (ver acima), coeficientes de extinção específicos para cada subespécie de FVIIll são necessários para calcular as concentrações de proteína para as frações de subespécies purificadas. O cálculo desses coeficientes de extinção específicos de subespécies em uma concentração de proteína de 1 mg/ml pode ser observado abaixo. Os fatores de conversão baseados nesses coeficientes de extinção específicos de subespécies foram calculados para simplificar ainda mais o cálculo da concentração de proteína. A medição em si é executada contra uma solução em branco, a qual contém uma composição tampão idêntica como a amostra. O grau de absorção pode ser convertido na respectiva concentração de proteína, utilizando a equação acima. A concentração de proteína como valor alvo deste método é, por exemplo, utilizada como uma medida de quão eficaz uma etapa de concentração cromatográfica funciona.

[00146] Como será conhecido de uma pessoa versada na técnica, a eletroforese em gel de poliacrilamida é uma técnica utilizada para separar biomoléculas macromoleculares, por exemplo, proteínas de acordo com seu tamanho, conformação e carga. O uso de dodecil- sulfato de sódio (SDS) ou dodecil-sulfato de lítio (LDS) provoca a ruptura de estruturas secundárias e terciárias através da complexação e, assim, linearização de proteínas. Agentes redutores tais como ditiotreitol (DTT) e iodoacetamida, são utilizados para separar as ligações de dissulfeto e impedir a reforma. Além disso, a ligação de SDS produz uma carga líquida negativa de cadeias de polipeptídeo, o que torna a separação apenas dependente do peso molecular das proteínas. O próprio gel é composto de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida reticulada, por meio dos quais a densidade e o tamanho dos poros do gel são definidos pela concentração de bis-acrilamida. Quando um campo elétrico é aplicado ao gel, as proteínas migram em direção ao polo positivo (isto é, anodo) em velocidades diferentes, dependendo do seu peso real. À coloração subsequente torna as frações de proteína separadas visíveis e acessíveis para outro processamento ou interpretação. A eletroforese em gel de poliacrilamida faz uma afirmação qualitativa quanto à pureza e concentração das amostras aplicadas. A pessoa versada na técnica conhecerá várias maneiras de executar a eletroforese em gel de poliacrilamida, assim como os procedimentos de coloração correspondentes. Por exemplo, a eletroforese em gel de poliacrilamida, assim como os procedimentos de coloração correspondentes, podem ser executados com equipamento tamponado com Tris-acetato sob condições redutoras. Equipamento exemplar e condições gerais estão resumidos na seguinte tabela. Gel Gel de trisacetato Invitrogen Midi NUPAGE 3 a 86º WG1602BOX Tampão de operação Tampão de operação Invitrogen LAOO41 Acetato SDS 2 x Tampão de amostra — Tampão de amostra Invitrogen NPOOO7

LDS Agente redutor Invitrogen NPOO0O9

NUPAGE Tabela 10: Equipamento e tampões exemplares para eletroforese em gel de poliacrilamida. Todos os tampões, assim como o próprio gel de poliacrilamida, são equipamentos prontos para uso fabricados pela Thermo Fisher Scientific, nome comercial Invitrogen. Os respectivos números de catálogo são listados.

[00147] Como será conhecido de uma pessoa versada na técnica, a coloração prata após eletroforese em gel é um método rápido e muito sensível para detectar bandas de proteína. Seu princípio fundamental é a ligação de íons de prata à superfície da proteína e subsequente redução em prata metálica fina, que produz bandas de proteína de cor escura. Íons de prata em excesso precisam ser removidos após o desenvolvimento para evitar a ocorrência de sinais inespecíficos. Protocolos básicos de coloração também podem envolver etapas adicionais de preparação tais como remoção de íons interferentes,

aumento da sensibilidade e contraste e várias etapas de lavagem. À coloração com prata é um método inespecífico que mancha qualquer proteína presente na amostra. Portanto, pode ser utilizado para avaliação da pureza na presente invenção.

[00148] Como será conhecido de uma pessoa versada na técnica, western blotting é um método ainda mais sensível para detectar bandas de proteína. Além disso, também é específico para um tipo específico de proteína, o que permite a distinção entre a proteína alvo e as impurezas. Após a separação das proteínas na eletroforese em gel, as proteínas são transferidas para uma membrana. |sso pode ser alcançado por diferentes mecanismos. O mais proeminente é a eletrotransferência, onde um campo elétrico é utilizado para forçar a migração de proteínas em direção à membrana. O desenvolvimento envolve dois anticorpos diferentes. Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos à superfície da membrana, é essencial bloquear a membrana com albumina de soro bovino ou leite em pó desnatado. O anticorpo primário é altamente específico para a proteína alvo (por exemplo, FVIII de coagulação sanguínea). O anticorpo secundário é acoplado à fosfatase alcalina (ALP) e direcionado contra o anticorpo primário. Após a ligação de ambos os anticorpos, um substrato específico de ALP é adicionado e subsequentemente convertido em uma forma colorida insolúvel, que precipita próximo ao FVII! imobilizado.

[00149] “Como será conhecido por uma pessoa versada na técnica, o ensaio cromogênico do FVIIl conta com a geração de um produto cromogênico cuja aparência pode ser seguida através da medição espectrofotométrica em 405 nm. Nesse ensaio, a amostra de FVIII é misturada com uma solução de trombina, fosfolipídios, FIXa e Ca?**. O FVIII inativo é ativado em sua forma ativa do FVIlla pela trombina e forma um complexo contendo FVIlla, FlIXa, fosfolipídios e cálcio. Este complexo é capaz de ativar FX para ativar o FXa, que por sua vez degrada um substrato cromogênico. Essa reação libera para- nitroanilina, cuja formação pode ser seguida através da medição fotométrica em 405 nm. O aumento da extinção é diretamente proporcional à quantidade de FXa, que por sua vez é diretamente proporcional à quantidade de FVI!l na amostra. Na presente invenção, OS ensaios de atividade cromogênica podem ser executados como conhecido na técnica. Por exemplo, o ensaio de atividade do FVIII pode ser executado com reagentes comercialmente disponíveis (Siemens, Germany) em um analisador de coagulação automatizado (BCS XP, Siemens). Na primeira etapa do ensaio cromogênico, uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de FVIII funcional, pode ser adicionada a uma mistura de reação que consiste em trombina, FIX ativado (FIXa), fosfolipídeo, FX e um tampão contendo cálcio. O FVII é ativado pela trombina. O FVIII ativado (FVIlla) forma um complexo com fosfolipídios, FIXa e cálcio, o que resulta na ativação do Fator X (FXa). Na segunda etapa do ensaio cromogênico, o FXa pode ser medido através da clivagem de um substrato de nitroanilida de peptídeo específico do FXa. P-nitroanilina é produzida, dando uma cor que pode ser medida fotometricamente pela absorvência em 405 nm. A cor produzida é diretamente proporcional à quantidade de FVIII funcional presente na amostra. O padrão de referência pode ser o FVIII de comprimento total, calibrado de acordo com o padrão internacional da WHO.

[00150] Os ensaios de coagulação de um estágio podem ser executados como conhecido na técnica. Por exemplo, a atividade de FVIII por ensaio de coagulação de um estágio pode ser executada com um reagente aPTT comercialmente disponível, Actin FSL (Siemens, Germany), em um analisador de coagulação automatizado (BCS XP, Siemens, Germany) Uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de FVIII funcional pode ser misturada com plasma humano com deficiência de FVIIl e o ativador. Após a incubação a +37ºC, a coagulação pode ser iniciada pela adição de cloreto de cálcio e o tempo para formação de coágulos é registrado. O tempo de coagulação é indiretamente proporcional à concentração de FVIII na amostra. Os resultados podem ser fornecidos em IU FVIII/ml, lidos a partir de uma curva de referência. O padrão de referência pode ser rFVIII de comprimento total, determinável de acordo com o padrão internacional da WHO.

[00151] Osensaios de geração de trombina desencadeada pelo fator tecidual podem ser executados como conhecido na técnica. Por exemplo, a trombografia automatizada calibrada (CAT), um tipo de ensaio de geração de trombina (TGA), é um ensaio hemostático global que é cada vez mais utilizado em estudos clínicos como parâmetro de eficácia ex vivo e como ferramenta de pesquisa. O trombograma descreve a concentração de trombina no plasma de coagulação e, portanto, é um teste de função do sistema hemostático sob condições próximas da fisiológica. O ensaio baseia-se na medição da fluorescência que é gerada pela clivagem do substrato fluorogênico Z- G-G-R-AMC através da trombina ao longo do tempo após o início da coagulação pelo Fator Tecidual. O ensaio é executado em um Thrombograph'"Y, um fluorômetro de placa de 96 reservatórios, e utiliza um calibrador de trombina necessário para corrigir o efeito de filtro interno, variabilidade de doador para doador na cor do plasma, depleção de substrato e diferenças instrumentais.

[00152] Os seguintes parâmetros de CAT caracterizam o estado hemostático de uma amostra de plasma: . Tempo de atraso [min]: representa o tempo de coagulação, o início da geração de trombina . Tempo para atingir o pico [min]: tempo até que a quantidade máxima de trombina seja gerada

. Pico da trombina [NM]: concentração máxima de trombina formada . Potencial endógeno de trombina (ETP) [nM min]: Área sob a curva de geração de trombina que representa a quantidade total de trombina que é gerada.

[00153] “Como será conhecido por uma pessoa versada na técnica, o ensaio imunossorvente ligado a enzima é uma abordagem imunológica que utiliza anticorpos e uma reação colorida - geralmente mediada por enzimas para detectar e quantificar um antígeno. Os antígenos podem ser imobilizados diretamente na superfície de uma placa de 96 reservatórios profundos ou estão ligados por um anticorpo que foi imobilizado na superfície antes da aplicação da amostra. Em cada caso, o antígeno é imobilizado de modo que um anticorpo secundário específico para o antígeno possa se conectar ao antígeno. Em muitos casos, o anticorpo secundário é conjugado com uma enzima capaz de converter um substrato incolor em uma substância colorida, que pode ser detectada pela medição fotométrica. Portanto, é um método quantitativo que fornece informações sobre a atividade da proteína do FVII! na respectiva amostra. Uma curva-padrão gerada sob condições idênticas é necessária para a interpretação dos resultados.

[00154] Sea proteínarecombinante (por exemplo, rFVII!) produzida em células de CHO for utilizada nos métodos da presente invenção, a determinação do teor de proteína da célula hospedeira de CHO pode ser utilizada para interpretar a qualidade dos materiais de partida. Para este fim, uma placa de 96 reservatórios profundos pode ser coberta com anticorpo de IgG de cabra policlonal específico de CHO. A adição de diferentes diluições da solução de amostra leva à formação de um complexo imune, compreendendo anticorpo anti-CHO primário e antígeno. As proteínas excedentes da amostra podem ser removidas por lavagem. O anticorpo policlonal anti-CHO de cabra conjugado com

HRP secundário reconhece o complexo imune. Após a ligação e outra etapa de lavagem adicional, a solução de substrato pode ser adicionada. Ela contém orto-fenilenodiamina que é convertida em 2,3- diaminofenazina de cor amarela alaranjada sob catálise de peroxidase de raiz forte. O grau de coloração é diretamente proporcional à quantidade de proteínas de células hospedeiras de CHO na amostra e pode ser detectado em 490 nm através da medição fotométrica.

[00155] “Como será conhecido por uma pessoa versada na técnica, o princípio básico do vWF Antigen ELISA é semelhante ao descrito acima. Um anticorpo do vWF anti-humano de coelho é utilizado para imobilizar o VWF presente na amostra. O anticorpo do vWF anti-humano de coelho conjugado com HRP secundário liga-se ao complexo imune. Após uma etapa de lavagem, a solução de orto-fenilenodiamina é adicionada e convertida em 2,3-diaminofenazina sob catálise de peroxidase de raiz forte. A detecção é semelhante ao CHO Antigen ELISA descrito acima.

[00156] “Como será conhecida por uma pessoa versada na técnica, a cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser utilizada para separar, identificar e quantificar analiticamente todos os componentes dentro de uma amostra. Embora a cromatografia em fase líquida tradicional opere em baixa pressão, a HPLC é executada sob condições de alta pressão. O termo fase reversa refere-se às propriedades hidrofóbicas da fase estacionária, o que é oposto à historicamente chamada fase normal utilizando resinas estacionárias polares tais como géis de sílica. As resinas de fase reversa são geradas pela alquilação de matrizes de sílica gel com cadeias de carboidrato de comprimentos variados, geralmente variando de quatro a dezoito átomos de carbono (C4 a C18). Eluentes típicos são soluções aquosas polares de sais ou ácidos, por um lado, e solventes orgânicos não polares tais como acetonitrila ou metanol, por outro lado. A separação das subespécies de FVIII de coagulação sanguínea é preferivelmente realizada em uma coluna de fase reversa C4 (Jupiterº 5 m C4 300 À, LC column 150 x 2 mm, Phenomenex) com ácido trifluoroacético (TFA) em água como eluente A e 0,085% TFA em acetonitrila como eluente B com porcentagem crescente de eluente B durante a eluição conforme ilustrado na seguinte tabela. Etapa Tempo(m) Taxadefluxo[mL/m] PorcentagemA PorcentagemB.

1 0,0 0,2 68,0 32,0 2 12,0 0,2 56,0 44,0 3 24,0 0,2 48,0 52,0 4 30,0 0,2 0,0 100,0 35,0 0,2 0,0 100,0 6 36,0 0,2 68,0 32,0 Tabela 11: Condições e parâmetros preferidos para a análise por cromatografia em fase líquida de alta eficiência de fase reversa C4 de subespécies moleculares de FVIII. A porcentagem A e a porcentagem B são referentes às frações percentuais das duas fases móveis utilizadas para a separação. (A) ácido trifluoracético a 0,1% em água ultrapura; (B) ácido trifluoroacético a 0,085% em acetonitrila.

[00157] A quantidade de amostra injetada corresponde de preferência a 15 ug ou 75 IU de proteína, respectivamente. Visto que as interações hidrofóbicas são dependentes da temperatura, a coluna é preferivelmente aquecida para 60ºC para aumentar a resolução. As proteínas de eluição são preferivelmente detectadas com um detector de matriz de fotodíodo em 214 nm, o que corresponde ao comprimento de onda de excitação da ligação peptídica. A HPLC de fase reversa, por si só, é responsável pela separação de proteínas devido à sua capacidade hidrofóbica diferente. O modo de detecção é de natureza espectrofotométrica. Tanto a separação quanto a detecção juntas permitem a medição das intensidades de absorvência das proteínas de eluição diferentes e, após a integração da área sob a curva, o cálculo da respectiva concentração de proteína. Isto é de grande importância,

porque pode ser utilizado como uma medida para a qualidade do sucesso da separação na presente invenção e é utilizado para determinar a relação de peso das subespécies de FVIIl como descrito acima.

[00158] “Como será conhecido por uma pessoa versada na técnica, o cálculo dos coeficientes de extinção molar para cada subespécie de FVIII, assim como a molécula de cadeia única de comprimento total, é uma aproximação, com base nas propriedades reais da respectiva molécula. As informações gerais, conforme fornecidas na tabela 12, podem ser derivadas da ferramenta ProtParam (número de entrada POO451), fornecida pelo portal de recursos de bioinformática EXPASy. Isso inclui o número de aminoácidos, o ponto isoelétrico teórico, o peso molecular da cadeia principal de aminoácido e os coeficientes de extinção aproximados para uma solução de 1 g/L de subespécies de FVIIl em um comprimento de onda de 280 nm. As glicosilações e outras modificações pós-translacionais não estão incluídas nos dados de peso molecular da cadeia principal de aminoácido. O coeficiente de absorção molar teórico para uma molécula pode ser derivado da seguinte equação.

E€ = N(Tyr) + e(Tyr) + N(Trp) - e(Trp) + N(Cys2) - e(Cys2)

[00159] O número dos três aminoácidos que contribuem para a absorção de luz em 280 nm — estes são tirosina, tripofano e cisteína - é multiplicado com seus respectivos coeficientes de extinção molar. À soma de todos os três produtos é igual ao coeficiente de extinção total da molécula para uma concentração de 1 g/L. O cálculo não inclui modificações pós-translacionais, tais como glicosilação e sulfatação de tirosina. Além disso, assume-se que todos os resíduos de cisteína formam cistina, pois a cistina contribui para a absorção de luz, enquanto a cisteína não. A localização real dos resíduos de tirosina, triptofano e cistina na proteína dobrada e, portanto, eventualmente ocorrendo influência pelo ambiente circundante, não é levada em consideração para essa estimativa.

Cada cadeia pesada do FVIII está associada com a cadeia leve de 80 kDa ou a cadeia leve estendida de 120 kDa.

Supõe- se que uma solução contendo uma espécie de cadeia pesada e uma espécie de cadeia é preparada de 50% de cada.

As espécies tanto de cadeia pesada quanto de cadeia leve apresentam seus coeficientes de absorção de luz distintos, o que contribui para a absorção total da solução como uma função de sua fração de massa.

A fração de massa é calculada como quociente do respectivo peso molecular da cadeia principal de aminoácido de uma subespécie e do peso molecular total de ambas as subespécies.

Mecadeia pesada UWradeia pesada = Mecadeia pesada + Mcadeia teve

Designação Número de | Ical pl | Peso molecular da | % de | Coeficiente de aminoácidos teórico cadeia principal de | cadeia extinção e em aminoácido kDa) única (%) | 280 nm para 1 gl Subespécie 1313 6,30 148,45 56 1.066 de 180 kDa Subespécie 976 5,68 110,41 42 1.293 de 150 kDa Subespécie 817 5,84 93,47 35 1.452 de 110 kDa Subespécie 740 5,74 84,67 32 1.520 de 90 kDa Cadeia leve 8,58 116,29 44 1.414 estendida Tabela 12: Informações gerais sobre subespécies moleculares de FVIII: número de aminoácidos, ponto isoelétrico teórico, peso molecular da cadeia principal de aminoácido (glicosilação não incluída), porcentagem com referência à cadeia única de comprimento total e coeficientes de absorção em 280 nm.

[00160] Uma combinação de cadeia pesada de 180 kDa e cadeia leve de 80 kDa, por exemplo, fornece frações de massa de 0,65 e 0,35, respectivamente.

148,45 kKDa UWroadeia pesada = = 0,65 148,45 kDa + 78,99 kDa 78,99 kDa UWoeadeia leve = = 0,35 78,99 kDa + 148,45 kDa

[00161] Isso significa que a cadeia pesada de 180 kDa com seu coeficiente de extinção específico de 1,066 Mem”, contribui com 65% para a absorvência total da solução. A cadeia leve de 80 kDa, em contraste, contribui para uma extensão menor de apenas 35%, com um coeficiente de extinção de 1,617 Mem". A soma dos produtos da fração de massa e do coeficiente de extinção específico da subespécie £, tanto para a cadeia pesada quanto para a cadeia leve, fornece o coeficiente de extinção total etotar para uma solução de proteína de 1 g/L. Etotal = Wrcadeia pesada * Ecadeia pesada + UWocadeia leve * Ecadeia leve

[00162] —Consequentemente, uma solução de proteína contendo a cadeia pesada de 180 kDa associada com a cadeia leve de 80 kDa possui um coeficiente de extinção aproximado dado pela seguinte equação.

Etotar = 0,65 - 1,066 Mem"! + 0,35 - 1,617 Mem =1,26 Mem"

[00163] O coeficiente de extinção total etotaa para soluções contendo cada uma das quatro variantes de cadeia pesada (180 kDa, 150 kDa, 110 kDa e 90 kDa) em combinação com a cadeia leve de 80 kDa pode ser calculado de maneira igual. Os resultados são mostrados na tabela

13.

Designação Fração Molar Fração de €/M'cm'] Rel Abs[Mºcm'] Massa Cadeia pesada de 180 kDa + cadeia leve de 80 kDa Cadeia pesada de 180 kDa 50% 0,65 1,066 0,70 Cadeia leve de 80 kDa 50% 0,35 1,617 0,56 Soma 100% 1,00 - 1,26 Cadeia pesada de 150 kDa + cadeia leve de 80 kDa Cadeia pesada de 150 kDa 50% 0,58 1,293 0,75 Cadeia leve de 80 kDa 50% 0,42 1,617 0,67 Soma 100% 1,00 - 1,43 Cadeia pesada de 110 kDa + cadeia leve de 80 kDa Cadeia pesada de 110 kxDa 50% 0,54 1,452 0,79 Cadeia leve de 80 kDa 50% 0,46 1,617 0,74 Soma 100% 1,00 - 1,53 Cadeia pesada de 90 kDa + cadeia leve de 80 kDa Cadeia pesada de 90 kDa 50% 0,52 1,520 0,79 Cadeia leve de 80 kDa 50% 0,48 1,617 0,78 Soma 100% 1,00 - 1,57 Tabela 13: Cálculo dos valores de absorvência relativa específicos da subespécie de FVIII derivados da fração de massa de uma mistura de cadeia pesada 50% e cadeia leve 50% e os respectivos coeficientes de extinção.

[00164] Como ficará claro para uma pessoa versada na técnica, qualquer equipamento de laboratório adequado pode ser utilizado para executar os métodos da presente invenção. No entanto, a seguinte tabela mostra equipamentos de laboratório pequenos exemplares que podem ser utilizados para os métodos da presente invenção. A lista exemplar inclui equipamentos para a preparação de tampão, preparação de amostra, experiências de cromatografia propriamente ditas, assim como análise e armazenamento. Algumas informações correspondentes sobre o fabricante, código do produto, faixa de medição etc. são fornecidas.

de vidro de borossilicato Schott Duran mL, 11,2L,5L) mL) LM, 100-1000 uL) | Pontas de pipeta mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 11, 2L) 50 mL, 100 mL, 250 mL, 400 mL, 600 mL.

Cores 250 mL, 500 mL, 11,21) unidade de filtro estéril de 0,22 um Millipak 20 Gamma Gold Round Bottom Tabela 14: Lista exemplar de equipamento laboratorial geral que pode ser utilizado no método da presente invenção. Algumas informações sobre fabricante, código do produto, faixa de medição etc. são fornecidas

[00165] A seguir, a presente invenção será ilustrada por exemplos, sem se limitar a eles.

EXEMPLOS

[00166] A menos que indicado de outra forma, todas as etapas do método nos seguintes Exemplos de 1 a 16 executadas de acordo com as respectivas modalidades (preferidas) que são descritas em detalhes na seção acima "Descrição Detalhada da Invenção". Exemplo 1: Material de partida para a purificação de subespécies de

EVII

[00167] Quase todas as seguintes experiências de purificação são executadas com um eluato SourceS (SOS-E) contendo FL-rFVIII, designado B14390000-30. O SOS-E é produzido como ADVATE BDS, mas falta uma etapa final de purificação.

[00168] O segundo material de partida somente utilizado em uma purificação em larga escala é um pool de vários pós-eluatos de MonoQ e SourceQ, contendo subespécies de FVII! de 90 kDa enriquecidas em baixa concentração. Os pós-eluatos isolados foram agrupados para receber um grande pool de produtos. Esse pool é denominado F8 AD2 90KkDa. Exemplo 2: Purificação em pequena escala de subespécies de FVIII — primeira etapa de cromatografia

[00169] “Independentemente do tipo geral de cromatografia - cromatografia de troca aniônica utilizando resinas MonoQ ou cromatografia de exclusão por tamanho em resinas Superdex 200 - os resultados produzidos durante as seguintes experiências em pequena escala são usados para o processo em grande escala das etapas preparatórias de purificação. Os resultados são importantes para a configuração do respectivo procedimento de cromatografia.

[00170] Visto que a cromatografia de troca aniônica é a primeira etapa de purificação das subespécies de FVIII, ela é de grande interesse para o refinamento das condições operacionais. O MonoQ como uma resina AIEX analítica com partículas monodispersas de 10 um de tamanho e formato quase uniforme apresenta de longe a melhor resolução e as propriedades de separação mais promissoras. Portanto, esta etapa passou por muitos testes e variações de parâmetros, incluindo a preparação de amostras.

[00171] A Figura4 mostra um cromatograma do eluato SourceS não tratado com furina B14390000-30, separado sob condições padrão. À fase de eluição possui oito volumes de coluna e é operada com os tampões padrão QA1 e QB1. A eluição começa relativamente cedo com o primeiro aumento de condutividade. Existem alguns picos difusos, assim como um pico muito proeminente reconhecível assim que o sinal UV aumenta em sua intensidade. São conhecidos de serem variantes diferentemente carregadas da cadeia pesada de comprimento total (180 kDa), mais provavelmente provocadas pela glicosilação diferente na área do domínio B, assim como combinações da cadeia leve estendida com as outras subespécies de cadeia pesada. O mecanismo subjacente ainda não está totalmente esclarecido, mas as interações hidrofóbicas também podem ser uma razão para esse comportamento específico de eluição. O pico mais proeminente eluído nos números de fração Bê e B9 pode ser visto na imagem correspondente de SDS-PAGE (figura 5). É composto principalmente por fragmentos de cadeia pesada de 180 kDa de comprimento total. Mas há também uma certa quantidade de cadeia única de comprimento total, que pode ser vista acima da posição do marcador de 250 kDa na parte superior do gel. Nas partes inferiores do gel existe um sinal intenso ligeiramente acima de 100 kDa provocado pela cadeia leve estendida de 120 kDa. Diretamente abaixo estão os traços da subespécie de cadeia pesada truncada de 110 kDa. Outra faixa forte pode ser vista em torno de 75 kDa. Representa o fragmento de cadeia leve de 80 kDa.

[00172] Existe outro pico intenso coletado na fração B10. Sua composição no gel SDS-PAGE é bastante semelhante àquela descrita acima. Parece surgir principalmente de uma mistura de cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa, assim como de cadeia leve estendida de 120 kDa e de cadeia leve de 80 kDa com quantidades menores de fragmento de cadeia pesada de 110 kDa e cadeia única de comprimento total. Mas, além disso, as frações B11 e B12 também contêm um sinal fraco na área de 150 kDa. É a subespécie de cadeia pesada truncada de 150 kDa, que é identificável como pequeno rebaixo no lado descendente do pico no cromatograma.

[00173] O próximo ponto interessante no cromatograma é um pequeno pico com uma intensidade aproximada de 100 mAU, que não é uma linha de base separada do seu pico próximo esquerdo. As frações C1 e C2 mostram que existe uma quantidade máxima de subespécies de cadeia pesada de 110 kDa, em comparação com outras frações. Há também uma certa quantidade de subespécies de 180 kDa nessas frações, que é porque a resolução das resinas não é suficiente para separar os dois picos. No entanto, existe esse pequeno pico provocado pelo fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa. Finalmente, existe um pequeno pico duplo com uma intensidade de aproximadamente 40 mAU nas frações C4 a C6. Este pico representa a cadeia pesada de 90 kDa exaurida de domínio B, conforme indicado pela SDS-PAGE. A sequência geral de eluição com condutividade em elevação é, portanto:

1. Variantes carregadas de forma diferente de subespécies de cadeia pesada, principalmente fragmento de comprimento total de 180 kDa, FVIII de cadeia única e diferentes combinações de cadeia leve estendida juntamente com outras subespécies

2. Cadeia pesada de comprimento total (180 kDa)

3. Cadeia pesada com truncamento parcial de domínio B (150 kDa)

4. Cadeia pesada com truncamento parcial de domínio B (110 kDa)

5. Cadeia pesada exaurida de domínio B (90 kDa) Exemplo 3: Purificação em pequena escala de subespécies de FVIII — otimização do comprimento do gradiente na primeira etapa da cromatografia

[00174] Um gradiente mais plano é equivalente a uma melhor separação devido a um aumento percentual mais lento de eluente forte. A Figura 6 mostra uma sobreposição de dois experimentos de viabilidade diferentes, o primeiro é operado com um gradiente de oito volumes de coluna indicado como linha sólida para o sinal UV e como linha quebrada para a condutividade, enquanto que o outro é executado com uma eluição de gradiente de 16 volumes de coluna, mostrado como linha pontilhada para o sinal UV e como linha tracejada para o sinal de condutividade — correspondente. É claramente visível que a condutividade aumenta muito mais lentamente durante a eluição de 16 volumes de coluna em comparação com a eluição de oito volumes de coluna. Os respectivos sinais UV compartilham alta similaridade em termos de seu padrão geral, mas o comportamento de eluição é obviamente diferente. A curva pontilhada, representando o sinal UV de eluição de 16 volumes de coluna, é ampliada e o pequeno rebaixo representando a subespécie de 150 kDa é melhor visível em comparação com a curva UV de oito volume de coluna. Visto que o volume no qual a fase de eluição é coletada é duas vezes maior para a eluição de 16 volumes de coluna do que para a eluição de oito volumes coluna, também é provável que algumas dessas estruturas possam ser coletadas em frações separadas. A diferença mais proeminente pode ser vista na área em que geralmente a subespécie truncada de domínio B de 150 kDa tende a eluir da coluna. Essa área é bastante curta na fase de eluição de oito volumes de coluna. Parece que o sinal completo da cadeia pesada de 180 kDa diminui rapidamente sua intensidade e depois se eleva novamente porque a eluição da subespécie de 110 kDa ocorre. A fase de eluição de 16 volumes de coluna, ao contrário, resolve a eluição das subespécies de 150 kDa. O sucesso da separação pode não ser satisfatório, mas no lado descendente do pico de cadeia pesada de 180 kDa de comprimento total, um pequeno rebaixo é reconhecível. Isso ocorre porque sob condições de condutividade constantemente crescentes, algum ponto sob o qual a cadeia pesada completa de 180 kDa elui enquanto a cadeia truncada de domínio B de 150 kDa que ainda se liga é retida por um longo período de tempo.

[00175] A Figura7 mostra uma sobreposição de duas curvas de UV derivadas de uma fase de eluição de 16 volumes de coluna mostrada como linha sólida e uma fase de eluição de 32 volumes de coluna com etileno glicol a 10% como aditivo mostrado como linha quebrada. Ambas as amostras foram tratadas com furina protease antes da aplicação da amostra. O efeito de ampliação máxima de uma fase de eluição dupla contanto que o original seja claramente visível. O rebaixo que surge da eluição da cadeia pesada truncada de domínio B de 150 kDa durante a fase de eluição de 32 volumes de coluna, é mais proeminente como na fase de eluição de 16 volumes de coluna. Além disso, seu volume é o dobro tanto quanto para a eluição de 16 volumes de coluna e, portanto, dado que o fracionamento ocorre em tamanhos de fração adequados, deve ser possível gerar um pool de produtos enriquecido de 150 kDa adequado para purificação adicional. Exemplo 4: Purificação em pequena escala de subespécies de FVII! - tratamento com furina protease antes da primeira etapa da cromatografia

[00176] Afurinaprotease é uma enzima proteolítica responsável pelo processamento intracelular do FVIII. Existem várias posições ao longo de toda a sequência do FVII!l em que a furina pode fixar e clivar seu substrato. Visto que o FVIIl, mesmo que seja derivado de fonte recombinante, não seja completamente processado, existe um alto grau de heterogeneidade. Não é apenas o domínio B que contribui para a heterogeneidade. Também pode ser que diferentes tipos de glicosilação influenciem a maneira em que uma determinada molécula de FVII! se comporta durante a eluição. Isso é especialmente válido para a cadeia pesada de 180 kDa de comprimento total. Essa subespécie ainda contém todo o domínio B, que é altamente glicosilado (Pipe et al. (1998)). Diferentes tipos de glicosilação e, portanto, áreas diferentemente carregadas na superfície da proteína, parecem ser a razão pela qual a cadeia pesada de comprimento total não apenas elui como um único pico, mas como dois picos distintos.

[00177] A Figura8 mostra uma sobreposição das curvas de UV de uma amostra tratada com furina (linha sólida) e uma amostra que não foi tratada com furina protease antes da aplicação da amostra (linha quebrada). Ambas as operações são executadas com fases de eluição de 16 volumes de coluna, conforme indicado pela alta similaridade das curvas de condutividade. A única diferença é o tipo de preparação da amostra, incluindo a maturação da furina ou não. A primeira coisa que é óbvia é que existe uma diminuição significativa da intensidade máxima da amostra tratada com furina na primeira metade da fase de eluição. Esta área principalmente representa variantes de cadeia pesada diferentemente carregadas em combinação com a cadeia leve estendida. Além disso, o pico mais proeminente da amostra tratada sem furina desapareceu quase completamente na curva sólida. Por sua vez, oO pico de cadeia pesada de comprimento total típico é significativamente intensificado. A maturação de furina parece aumentar a intensidade de outras subespécies igualmente. Mesmo a intensidade das subespécies de 90 kDa e subespécies de 110 kDa exauridas de domínio B é maior em comparação com a amostra não tratada com furina.

[00178] A eluição da amostra tratada com furina é mostrada na Figura 9. Quase toda fração é aplicada na análise de SDS-PAGE (figuras 10 e 11), a fim de elucidar suas respectivas composições. Os números das frações B5 a C7 parecem virtualmente uniformes em termos de composição. Embora esta área contenha picos individuais no cromatograma, todos eles obviamente consistem de variantes de cadeia pesada de comprimento total com glicosilação diferente, que não fazem diferença na SDS-PAGE. Tendo uma visão sobre o lado ascendente do que segue, o pico mais intenso, já existem algumas frações (C8 - C10) do fragmento de cadeia pesada de comprimento total (180 kDa), que parecem suficientemente puras para outra purificação. A parte descendente do pico é como de costume misturada com o fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa, mas ambas as espécies se mostram mais separadas umas das outras em comparação com o padrão, a separação amadurecida sem furina. Em relação à subespécie truncada de 110 kDa, especialmente as frações D4 e D5 são bem separadas contendo apenas pequenas quantidades de outras subespécies. A cadeia pesada de 90 kDa sem domínio B é totalmente separada e pode ainda estar pronta para concentração. Uma das diferenças mais notáveis diz respeito à distribuição de variantes da cadeia leve. Como pode ser observado em todo o gel, não existe nenhum vestígio deixado da cadeia leve estendida de 120 kDa. Obviamente, foi processado pela furina protease resultando em quase exclusivamente fragmentos de cadeia leve de 80 kDa, o que reduz significativamente a heterogeneidade dos materiais de partida.

[00179] Algumas modificações são implementadas para a seguinte purificação em grande escala (preparativa):

1. A fim de reduzir a heterogeneidade e melhorar o sucesso geral da separação das subespécies de FVIII, a amostra é tratada com > 100 IU/ml de furina protease antes da aplicação da amostra.

2. O comprimento da eluição gradiente linear é aumentado quatro vezes para 32 volumes de coluna. A dispersão aumentada de picos específicos de subespécies na segunda metade da eluição parece superar os efeitos da diluição de fração. Exemplo 5: Purificação em pequena escala de subespécies de FVII! - segundo passo de cromatografia

[00180] A cromatografia de exclusão por tamanho é utilizada como uma etapa de polimento para remover pequenas impurezas de um pool que já contém o produto desejado em alta pureza. Também é adequado como segunda etapa de purificação para subespécies moleculares de FVIII, seguinte a etapa de cromatografia de troca aniônica MonoQ. Portanto, cada amostra que será purificada por meio da exclusão por tamanho é originalmente derivada da cromatografia de troca aniônica e obtida por subsequente agrupamento de frações que contêm as subespécies desejadas. Supondo que a cadeia leve estendida de 120 kDa tenha sido completamente removida durante o curso de maturação de furina, cada variante de cadeia pesada presente na respectiva amostra deve ser ligada exclusivamente à cadeia leve de 80 kDa. Portanto, a diferença média no peso molecular entre todas as subespécies é de aproximadamente 50 kDa, o que deve ser suficiente para obter resultados satisfatórios. Exemplo 6: Purificação em pequena escala de subespécies de FVII! - burificação do fragmento de cadeia pesada truncada na segunda etapa de cromatografia

[00181] O lado direito da Figura 13 mostra uma seção de uma eletroforese em gel SDS-PAGE de uma operação anterior de cromatografia de troca aniônica MonoQ. Uma vez que as frações G4, G5 e G6 mostram a cadeia pesada de 110 kDa com pureza suficiente, elas foram reunidas e utilizadas para purificação adicional por cromatograffa de exclusão por tamanho. O cromatograma correspondente, assim como a eletroforese em gel corada com prata da maior parte das frações, pode ser vista na Figura 12 e no lado esquerdo da Figura 13, respectivamente. Todas as quatro subespécies de cadeia pesada estão obviamente presentes na amostra, mas elas eluem da coluna em momentos distintos devido ao seu peso e tamanho molecular diferentes. A cadeia pesada de comprimento total (180 kDa) é a maior de todas as variantes do FVIII. Assim, ela pode acessar o menor número de volume de todas as subespécies e eluir antes de tudo, o que pode ser visto nas frações C4 a C7 no gel. Um segundo pico é visível nas frações C9 a C11, que é provocado pelas espécies de cadeia pesada truncada de 150 kDa. O pico mais proeminente é, como esperado, o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa, que começa a eluir na fração D1 e prossegue até a fração D9. Os fragmentos com 150 kDa e 110 kDa são claramente separados um do outro, mas também é visível que os traços da cadeia pesada de 90 kDa exaurida de domínio B contaminam as frações D5 e as seguintes. Ambas as subespécies de 110 kDa e 90 kDa parecem ser capazes de penetrar volumes de poros semelhantes, o que não é surpreendente, uma vez que a sua diferença de peso molecular é de apenas 20 kDa. No entanto, a intensidade da subespécie de 90 kDa exaurida de domínio B é muito baixa em comparação com a proteína alvo de 110 kDa e as frações D2, D3 e D4 parecem absolutamente puras.

Exemplo 7: Purificação em pequena escala de subespécies de FVII! - burificação da cadeia pesada de comprimento total na segunda etapa de cromatografia

[00182] Um eluato de cromatografia de troca aniônica serve como material de partida para purificação e polimento adicionais do fragmento de cadeia pesada de comprimento total. As frações F4, F5 e F6, mostradas na Figura 15, são compostas principalmente das subespécies de 180 kDa. As impurezas menores surgem de espécies de cadeia pesada truncada (110 kDa) e fragmento de cadeia pesada exaurida de domínio B (90 kDa), mas também em menor extensão da variante de cadeia pesada truncada de 150 kDa.

Essas facções foram reunidas e aplicadas à cromatografia de exclusão por tamanho.

O respectivo cromatograma pode ser visto na Figura 14, assim como a eletroforese em gel SDS-PAGE correspondente no lado esquerdo da Figura 15. A concentração de proteína nesta experiência é geralmente mais alta em comparação com os resultados de purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa.

Portanto, a absorvência é maior e os sinais na eletroforese em gel SDS-PAGE são mais intensos.

Como já mencionado acima, o fragmento de comprimento total de 180 kDa é a primeira subespécie que elui da coluna.

Ele aparece como um grande pico de aproximadamente 70 mAU de absorvência no cromatograma nas frações C4 a D1. A SDS-PAGE colorida com prata apropriada mostra claramente que esse pico se origina exclusivamente da cadeia pesada de 180 kDa de comprimento total, mas também existe contaminação pela cadeia pesada truncada de 150 kDa nas frações C10 a D1. No entanto, a primeira metade do pico (frações C4 a C9) parece definitivamente pura.

A cadeia pesada truncada de 150 kDa é visível apenas no gel de eletroforese, mas não no cromatograma, o que pode ser devido à sua baixa quantidade que é eluída em um ponto no qual o fragmento de 180 kDa de comprimento total ainda está eluindo.

O fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa, assim como o fragmento de cadeia pesada exaurida de domínio B, podem ser representados como picos particulares de intensidade bastante baixa.

Ambos também são aparentes na SDS-PAGE em frações D3 a D8 e D6 a D9, respectivamente.

Como já visto no Exemplo 6, existe uma separação suficiente entre as espécies de 150 kKDa e as espécies de 110 kDa.

A cadeia pesada de comprimento total e a cadeia pesada de 150 kDa não são tão bem separadas, o que torna o agrupamento cuidadosamente considerado de frações necessário para obter conjuntos de produtos puros. O mesmo se aplica às espécies de 110 kDa e à cadeia pesada livre de domínio B de 90 kDa. De longe, elas não são completamente separadas e o agrupamento cuidadosamente considerado também será necessário nesta invenção. Exemplo 8: Purificação em pequena escala da subespécie de FVII! - cromatografia de interação hidrofóbica na segunda etapa de cromatografia

[00183] A abordagem da cromatografia de interação hidrofóbica foi testada na fase de pequena escala como um método alternativo possível para a divisão do fragmento de cadeia pesada de comprimento total (180 kDa) e de cadeia pesada truncada (150 kDa), cujo comportamento na cromatografia de troca aniônica é semelhante, o que torna a separação bastante difícil.

[00184] O cromatograma da fase de eluição bidimensional de um eluato SourceS tratado com furina pode ser visto na Figura 16. O procedimento geral da cromatografia de interação hidrofóbica bidimensional está de acordo com as respectivas modalidades (preferidas) que são descritas com detalhes na seção acima "Descrição Detalhada da Invenção". Após a aplicação da amostra estar concluída, uma curta fase de lavagem com tampão de equilíbrio ocorre. A diferença na condutividade é de aproximadamente apenas 2 mS/cm, mas já parece suficiente para provocar um aumento do sinal UV. Este primeiro rebaixo, que é apenas ao redor de 4 mAU de absorvência UV, pode ser visto na SDS-PAGE correspondente (figuras 17 e 18) como números de fração A5 a B4. Ele surge principalmente da subespécie de cadeia pesada truncada de 150 kDa, indicando que se liga mais fracamente e elui já em baixa redução de condutividade.

[00185] A própria fase de eluição contém dois gradientes lineares diretamente adjacentes entre si. O primeiro tampão de eluição não contém cloreto de sódio, o que leva a uma rápida e inicial diminuição da condutividade.

Após atingir um certo nível de condutividade ao redor de 3 mS/cm, o segundo tampão de eluição é aplicado à coluna.

Ele contém etileno glicol e, portanto, reduz a condutividade ainda mais para baixo para menos de 1 mS/cm.

Os picos de eluição não são tão definidos como na resina MonoQ.

É de preferência uma transição de proteínas de eluição ampla, não nitidamente separadas uma da outra.

A composição real das frações ao longo da eluição é visível apenas na eletroforese em gel SDS-PAGE.

O sinal UV aumenta acentuadamente com o início do primeiro gradiente que resulta em um pico muito mais amplo com um rebaixo no seu lado descendente, que dura até o início do segundo gradiente.

A SDS-PAGE mostra que essa área de eluição se origina principalmente pelo fragmento de cadeia pesada de comprimento total (180 kDa), assim como pelo fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa e fragmento de 90 kDa exaurido de domínio B, que todos começam a se desatar mais ou menos no mesmo momento.

O rebaixo coletado nas frações C12 a D6 pode vir do fragmento truncado de 110 kDa, que parece eluir uma segunda vez naquele momento.

O segundo gradiente com tampão de eluição contendo etileno glicol gera um padrão não estruturado de sinais UV com tendência decrescente.

Como conhecido a partir de experimentos anteriores, essa área é provocada pela eluição de pequenas quantidades de subespécies com 180 kDa, 110 kDa e 90 kDa.

A cadeia leve correspondente de 80 kDa é distribuída totalmente durante a fase de eluição inteira.

Sua intensidade varia em relação à intensidade geral do sinal UV.

Por fim, é evidente que o fragmento de cadeia pesada de 150 kDa truncada é deslocado adiante quando é eluído mais cedo do que os outros - já durante a fase de lavagem.

A eluição em si realmente não separa as outras subespécies, pois elas eluem mais ou menos da mesma maneira quando elas foram aplicadas à coluna.

[00186] Contanto com os resultados do experimento HIC bidimensional, o objetivo principal a seguir é a separação das espécies de cadeias pesadas truncadas de 150 kDa das outras, especialmente o fragmento de comprimento total. O seguinte procedimento de eluição unidimensional é, portanto, derivado da cromatografia de interação hidrofóbica bidimensional descrita acima. A segunda fase de gradiente linear utilizando o tampão de etileno glicol é omitida, uma vez que não contribui realmente para a separação das subespécies de FVIIl. Em vez disso, a fase de lavagem após a aplicação da amostra é dobrada para dez volumes de coluna e a fase de eluição efetiva é estendida para 40 volumes de coluna, a fim de intensificar a separação. Além disso, o carregamento da coluna é reduzido significativamente. Como consequência disso, as intensidades gerais dos sinais UV são diminuídas (Figura 19). Como pode ser visto na Figura 20, a separação do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa do fragmento de cadeia pesada completa de 180 kDa adjacente não foi significativamente melhorada. Além do mais, as frações coletadas são altamente diluídas e o rendimento parece ser tão baixo que um processo preparativo seria muito ineficiente.

Exemplo 9: Purificação em pequena escala da subespécie de FVII! - cromatografia de interação hidrofóbica de modo negativo na segunda etapa de cromatografia

[00187] A abordagem de cromatografia em modo negativo visa a lavagem do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa durante a fase de ruptura e lavagem, enquanto que outras subespécies são cogitadas de permanecer ligadas à coluna. Supõe-se que essa subespécie se ligue tão fracamente que é capaz de se soltar espontaneamente apenas pelo movimento da passagem através da fase móvel. Um pool de eluato MonoQ enriquecido por subespécies de 150 kDa serve como carga, cuja condutividade é aumentada para ligação à coluna. A fase de lavagem original é muito prolongada por esse motivo. A Figura 21 mostra que a capacidade das colunas é excedida em algum lugar em torno da fração A9. A ruptura ocorre neste momento e leva a um aumento do sinal UV.

[00188] A eletroforese SDS-PAGE (figura 22) mostra que mesmo a ruptura (frações A10 a A12) contém fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa altamente purificado. O sinal UV diminui com o início da fase de lavagem na fração B1 e prossegue até o final da fase. As frações correspondentes na SDS-PAGE (B1 a C2) mostram principalmente fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa, embora também existam traços das subespécies de 110 kDa e 90 kDa e até mesmo da cadeia leve estendida de 120 kDa, que pode surgir de uma maturação de furina incompleta antes da etapa de purificação de MonoQ. A eluição em si é executada como uma etapa nítida de 100% de tampão de eluição. Isso leva à rápida eluição de todas as proteínas remanescentes do FVIII da coluna. É notável que quase toda a quantidade de fragmentos de cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa seja eluída neste momento, mas não antes. Parece ligar muito mais forte que os outros, pois não existe nenhuma subespécie de 180 kDa encontrada durante a fase de ruptura e lavagem. Ambas as subespécies podem ser separadas em modo negativo facilmente e em um grau satisfatório.

Exemplo 10: Purificação em grande escala (preparativa) de subespécies de F VIII

[00189] A purificação em escala preparativa de subespécies de FVII| envolve a etapa inicial de cromatografia de troca aniônica MonoQ para enriquecimento do fragmento de cadeia pesada desejado, seguida pela etapa de polimento na coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em grande escala, cuja capacidade de separação é suficiente para separar outras subespécies que são consideradas como impurezas. O fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B (90 kDa) é uma exceção, visto que a etapa de exclusão por tamanho é omitida para essa subespécie. Já é purificado em grau satisfatório pela etapa MonoQ AIEX e não requer polimento adicional. A etapa final para todas as quatro subespécies diferentes é a concentração devido à alta diluição durante a cromatografia de exclusão por tamanho. Isso é executado por outra etapa AIEX em uma resina de troca aniônica SourceQ.

[00190] A Figura 23 fornece uma visão geral de todo o processo para as respectivas subespécies de FVIII. Exemplo 11: Purificação em grande escala (preparativa) de subespécies de FVIII - primeira etapa de cromatografia

[00191] A cromatografia de troca aniônica é a etapa principal de purificação das subespécies moleculares de FVIIl e alcança a separação aproximada de todos os quatro fragmentos desejados da cadeia pesada de tal maneira que as frações adequadas podem ser reunidas para purificação adicional. A Figura 24 mostra o primeiro cromatograma de uma fase de eluição da etapa AIEX na coluna MonoQ em grande escala. O material de partida B14390000-30 é separado de acordo com o procedimento padrão modificado descrito acima e fornece um padrão de eluição característico, que já é conhecido das experiências em pequena escala. A fase de eluição é reunida em oito conjuntos de produto, cada um deles contendo um certo fragmento de cadeia pesada na forma purificada e enriquecida. A primeira metade da eluição é conhecida de ser dominada por variantes de cadeia pesada de comprimento total diferentemente glicosiladas, as quais eluem como picos mais ou menos separados. Os picos que podem ser claramente distinguidos das proximidades são utilizados para conjuntos de produto individuais, mas não serão mais avaliados.

[00192] A Tabela 15 dá uma impressão de como o pool de frações ocorre e mostra que os quatro primeiros conjuntos de produto E1 a E4 são dedicados àquelas variantes de cadeia pesada de comprimento total diferentemente glicosiladas. A cadeia pesada de comprimento total mais abundante é coletada no produto de laço E5, que contém as frações 2.C2 a 2.D3 e fornece uma concentração aproximada de proteína de 0,669 mg/ml. A eletroforese em gel SDS-PAGE mostrada na Figura 25 também confirma a pureza do produto de laço E5 e mostra adicionalmente que essa variante de cadeia pesada de comprimento total é a mais proeminente, visto que sua concentração é a mais elevada. Além disso, todas as outras variantes de cadeia pesada de comprimento total (E1 a E4) mostram quase o mesmo padrão na SDS- PAGE - há apenas pouca diferença na posição das respectivas bandas que sustentam a suposição de glicosilação diferente do domínio B. Os números de fração 2.D7 a 2.E6 contêm o fragmento de cadeia pesada truncada com um peso molecular de 150 kDa, mas é bem conhecido de experiências anteriores que essa fração é geralmente contaminada com a cadeia pesada de comprimento total, que também pode ser efetuada na imagem da SDS-PAGE. O produto de laço E6 mostra duas bandas em —180 kDa e —150 kDa de intensidade relativamente semelhante, indicando quantidades comparáveis de ambas. As frações 2.D4, 2.D5 e

2.D6 não são utilizadas para nenhum dos dois conjuntos de produto adjacentes, pois essas frações contêm uma mistura das subespécies de 180 kDa e 150 kDa, que contaminariam qualquer uma delas. O produto de laço E7 é composto das frações 2.E7 a 3.A7 e contém o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa. O respectivo pico no cromatograma é muito melhor separado dos anteriores e também a SDS-PAGE mostra principalmente o fragmento de cadeia pesada truncada em aproximadamente 110 kDa, embora existam traços de cadeia pesada de comprimento total aqui também. O oitavo produto de laço contém o fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B com peso molecular de 90 kDa, coletado nas frações 3.B8 a 3.E1.

[00193] Jáé visívelnocromatograma que os picos de subespécie de 90 kDa são bastante baixos e, portanto, não é de surpreender que a concentração de proteína desse produto de laço seja de 0,025 mg/ml de longe muito baixa. Por outro lado, esses picos são linhas de base separadas de tudo o que já foi eluído e, portanto, a pureza dessa fração é satisfatória. Isso de fato permite pular a etapa de polimento por meio de cromatografia de exclusão por tamanho e prosseguir diretamente com a concentração. No mesmo momento, isso torna óbvio que quantidades muito diferentes das quatro subespécies estão presentes no material de partida e a simples separação dessas não é o único desafio. Assim como há bastante cadeia pesada de comprimento total contida no material de partida, parece bastante difícil coletar quantidades suficientes das subespécies menos existentes. O produto de laço E6 desta operação, contendo uma quantidade suficiente de fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa, é selecionado para purificação subsequente na coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa. Em contraste, o produto de laço E8 que contém o fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B de 90 kDa será concentrado diretamente pela etapa AIEX no SourceQ, omitindo qualquer outro tipo de purificação ou polimento. Os resultados apropriados serão debatidos a seguir.

1.C3 cadeia pesada de comprimento total E2 1.C4- Variante de | 180 0,249 0,198

1.D6 cadeia pesada de comprimento total E3 1.D7- Variante de 180 0,350 0,278

1.A2 cadeia pesada de comprimento total E4 2.A3- Variante de 180 0,310 0,246

2.01 cadeia pesada de comprimento total E5 2.02- Variante de 180 0,868 0,689

2.D3 cadeia pesada de comprimento total E6 2.D7- Fragmento de 150 0,442 0,309

2.E6 cadeia pesada truncad E7 2.E7-3- Fragmento de 110 0,250 0,163 A7 cadeia — pesada truncada E8 3.B8- Fragmento de 0,040 0,025

3.E1 cadeia pesada exaurido de domínio B Tabela 15. Esquema de agrupamento para a etapa de purificação AIEX de eluato SourceS B14390000-30 na coluna MonoQ em escala preparativa mostrada na Figura 24.

Designação de | Fração Subespécie de cadeia | Peso Absorvência em | Concentração de laço pesada molecular | 280 nm (laço) proteína [Mg/mL) [kDa] E1 1.A1- Variante de cadeia 180 não não especificada

1.E7 pesada de especificada comprimento total E2 1.E8- Variante de cadeia 180 0,633 0,502

2.A8 pesada de comprimento total E3 2.04- Fragmento de cadeia 110 0,182 0,119

2.D3 pesada truncada E4 2.D4- Fragmento de cadeia não não especificada

3.85 pesada exaurido de especificada domínio B Tabela 16. Esquema de agrupamento para a etapa de purificação AIEX de eluato SourceS B14390000-30 na coluna MonoQ em escala preparativa mostrada na Figura 26.

[00194] Um segundo exemplo de uma fase de eluição da escala preparativa AIEX é mostrado na Figura 26 e na Figura 27 para a imagem de gel SDS-PAGE correspondente. O procedimento geral de agrupamento não é muito diferente daquele examinado anteriormente. Um resumo das frações reunidas e das concentrações de proteína associadas pode ser encontrado na tabela 16.

[00195] Os conjuntos de produto designados como E2 e E3 contêm a cadeia pesada de comprimento total e o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa e são frações interessantes para purificação e polimento adicionais na etapa de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa. Nem todas as frações podem ser vistas na eletroforese SDS-PAGE e as frações que são utilizadas para agrupamento são, portanto, parcialmente determinadas por meios ópticos. Em vez disso, existem dados disponíveis na análise de HPLC de fase reversa C4 (tabela 17), que fornecem evidencias de como os conjuntos de produto E2 e E3 são compostos. Estes dados revelam que o produto de laço de cadeia pesada de comprimento total E2 já contém aproximadamente 91% de proteína alvo, que inclui todas as variantes de cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa, assim como as duas variantes de cadeia leve.

O produto de laços E3 não mostra uma pureza igual após a primeira etapa AIEX, mas 82,5% da proteína alvo em uma concentração de proteína de 0,119 mg/ml parece ser uma boa base para outro processamento.

Varávl”————————— — Produtodelaço Produtodelaço E2 [%] E3 [%] Cadeia leve 34,16 42,10 Cadeia única pesada e leve 1 2,11 1,97 Cadeia única pesada e leve 2 17,69 2,03 Cadeia pesada de 180 kDa 35,80 4,39 Cadeia pesada de 150 kDa 4,05 2,59 Cadeia pesada de 110 kDa 3,77 38,69 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 0,76 2,90 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 0,44 3,61 Tabela 17: Composição dos conjuntos de produto E2 (cadeia pesada de comprimento total) e E3 (fragmento de cadeia pesada truncada com um peso molecular de 110 kDa) determinados pela análise de HPLC de fase reversa C4. O produto de laço E2 contém aproximadamente 91% de proteína alvo, incluindo todos os fragmentos de cadeia pesada de comprimento total, assim como as duas variantes de cadeia leve.

O produto de laço E3 contém aproximadamente 82,5% de proteína alvo em relação ao fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa e a ambas as variantes de cadeia leve.

Exemplo 12: Purificação em grande escala (preparativa) de subespécies de FVII! - purificação e concentração da cadeia pesada de comprimento total (180 kDa) na segunda e terceira etapas da cromatografia

[00196] Conforme indicado no diagrama de fluxo do processo na Figura 23, está a purificação da cadeia pesada de comprimento total composta das três etapas AIEX e SEC como etapas de purificação verdadeiras e outra etapa AIEX para concentração. Com base na avaliação da eletroforese em gel SDS-PAGE da primeira purificação AIEX, as frações mais promissoras, que apresentam alto teor de proteínas assim como baixas frações de impurezas, são selecionadas, reunidas e aplicadas na coluna SEC preparativa. A saída coletada da cromatografia de exclusão por tamanho é ainda aplicada a uma coluna SourceQ e finalmente concentrada através da eluição por etapas. Os resultados concordantes serão debatidos a seguir.

[00197] A Figura 28 mostra a purificação subsequente do produto de laço AIEX E2 contendo a cadeia pesada de 180 kDa de comprimento total enriquecida na coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em grande escala. O procedimento geral da escala preparativa SEC pode ser encontrado na respectiva modalidade da seção "Descrição Detalhada da Invenção" acima. Considera-se que pequenas impurezas provêm do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa que não pode ser totalmente separado por meio de AIEX. O pico mais proeminente do cromatograma mostra aproximadamente 50 mAU de intensidade de absorvência e começa a eluir na fração 1.B5. A imagem da eletroforese em gel SDS-PAGE corada com prata (Figura 29) mostra que as frações 1.B5 a 1.B11 são compostas principalmente da cadeia pesada de comprimento total desejada (180 kDa) em associação com a cadeia leve de 80 kDa. O fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa elui nas frações 1.C1 a 1.C4, que não podem ser detectadas no cromatograma. Parece mais como o rejeito do pico da subespécie de 180 kDa, mas na verdade é da subespécie de 150 kDa. Também é visível na imagem de SDS-PAGE que as subespécies com peso molecular de 180 kDa e 150 kDa tendem a se sobrepor nas frações posteriores do pico alvo, o que as torna inadequadas para agrupamento. Dois picos de intensidades bastante baixas aparecem nas frações 1.C6 a 1.C9 e 1.C10 a 1.D3, respectivamente. Esses picos surgem do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa e do fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B e ambos são claramente separados do pico desejado de cadeia pesada de comprimento total.

[00198] Visto que a cromatografia de exclusão por tamanho é a verdadeira etapa final de purificação, devem ser consideradas cuidadosamente quais frações encontrariam seu caminho dentro do produto de laço final. Por um lado, omitir as frações no início e no final do pico alvo pode diminuir a chance de trazer outras subespécies para dentro do produto de laço, mas, por outro lado, isso diminui drasticamente o rendimento, pois cada fração que não é utilizada para agrupar se iguala a uma perda de proteína de aproximadamente 1 mg de proteína total ou até mais. Um produto de laço que abrange as frações 1.B7 a 1.B10 deve provavelmente ser o melhor compromisso entre a geração de purezas razoáveis e ainda manter um processo eficiente. Esse pico de produto é referido como E1 e seus parâmetros mais significativos estão listados nas tabelas 18 e 19.

[00199] O volume de amostra final é de aproximadamente 70 ml! com uma concentração de proteína de 0,134 mg/ml, representando quase mg de proteína do FVIII de cadeia pesada de comprimento total. À pureza é apenas ligeiramente aumentada para 92% da proteína alvo, onde as espécies de cadeia pesada truncada de 150 kDa ainda são a maior fonte de contaminação (5,71%).

Fração Absorvência | Concentração de | Volume de | Proteína o neem denainania faoina oa | Tabela 18: Esquema de agrupamento para a etapa de purificação SEC do pool de eluato AIEX E2 (cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa) na coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa. Varável— ProdutodelaçoE1[%] Cadeia leveestendidta = 129 0 Cadeia leve 33,97 Cadeia única pesada e leve 1 2,82 Cadeia única pesada e leve 2 16,67 Cadeia pesada de 180 kDa 36,89 Cadeia pesada de 150 kDa 5,71 Cadeia pesada de 110 kDa 1,96 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 0,31 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 0,37 Somadaproteína-alvo 9164 Somadasimpurezas 22885 Tabela 19: Composição do produto de laço E1 (cadeia pesada de comprimento total) derivada da cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa determinada pela análise de HPLC de fase reversa CA4.

[00200] Devido à diluição na coluna SEC, é necessário implementar uma etapa para a concentração daqueles eluatos diluídos, a fim de atingir a concentração final desejada > 0,3 mg/ml. As frações diluídas são aplicadas a outra etapa de cromatografia de troca aniônica executada na resina Source30Q. Um gradiente da etapa, em sua composição equivalente à composição tampão final desejada, leva à eluição imediata de todo o produto ligado à coluna. O produto de laço E1 contendo as frações SEC 1.B7 a 1.B10 é aplicado à segunda etapa AIEX para concentração e eluído em um gradiente da etapa como mostrado na Figura 30. Não existe nenhum efeito de separação, como alternativa todo o teor de proteína é eluído começando na fração 1.A6 e mostrando uma aparência de rejeito de pico chegando até a fração

1.B7. Em conformidade, todas as frações entre 1.A6 e 1.B8 são agrupadas no produto de laço final, resultando em aproximadamente 7 ml de volume de produto. A medição UV subsequente para determinação da concentração de proteína fornece um valor de cerca de 0,982 mg/ml, o que corresponde a 6,85 mg de proteína total. A Figura 31 mostra duas imagens de uma eletroforese em gel SDS com desenvolvimento de coloração prata no lado esquerdo e um western blot do FVIII no lado direito. Ambas mostram fragmento de cadeia pesada exclusivamente de comprimento total em combinação com a variante de cadeia leve de 80 kDa, mas nenhum outro sinal envolvido. Os dados de HPLC de fase reversa C4 também fornecem resultados satisfatórios, como mostrados na tabela 20. A solução de produto final da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa contém 94,52% de proteína- alvo, incluindo todas as variantes de cadeia pesada de comprimento total e ambas as variantes de cadeia leve. Em comparação, apenas menos de 6% de toda a quantidade de proteína são impurezas que principalmente surgem das espécies de cadeia pesada truncada com 3,28% e 1,76% das espécies de 150 kDa e 110 kDa, respectivamente.

Varável— ProdutodelaçoE1[%] “Cadeia leveestendida 1160 Cadeia leve 33,61 Cadeia única pesada e leve 1 2,32 Cadeia única pesada e leve 2 18,51 Cadeia pesada de 180 kDa 38,92 Cadeia pesada de 150 kDa 3,28 Cadeia pesada de 110 kDa 1,76 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 0,18 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 0,26 “Somadaproteína-alvo 94,52 Somadasimpurezas 548 “Soma (respectivos picos) 10000 Tabela 20: Composição do produto de laço E1 (cadeia pesada de comprimento total) derivada da escala preparativa AIEX no SourceQ determinada pela análise de HPLC em fase reversa C4.

[00201] Este procedimento de purificação da cadeia pesada de comprimento total foi repetido várias vezes para produzir a quantidade desejada de proteína. Os dados concordantes não são mais mostrados.

[00202] Visto que as resinas de cromatografia utilizadas durante as experiências em pequena escala e o processo de purificação preparativa são ligeiramente diferentes, é interessante avaliar a diferença em relação ao desempenho e à resolução. A Figura 32 mostra uma sobreposição de uma operação de viabilidade e uma purificação preparativa da cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa, que foram conduzidas sob condições comparáveis. Os tampões de operação, a amostra aplicada, os tempos de permanência e Oo comprimento da fase de eluição são semelhantes para ambas as operações.

[00203] Os métodos possuem 1,5 fases de eluição de volume da coluna, o que facilita a sua comparação - dado que o eixo x é convertido em volumes de coluna. As curvas foram deslocadas de modo que ambas tenham o mesmo ponto de partida, que neste caso é o fim da etapa de injeção. A eluição da operação de viabilidade - mostrada como linha sólida - começa em torno de 0,36 CV, enquanto que a operação preparativa - mostrada como linha tracejada - é levemente atrasada em 0,02 CV. A diferença é marginal e, considerando os tamanhos de coluna muito diferentes e os volumes de tampão passados através dela, não parece significativo fazer declarações com base em valores. No entanto, ambas as curvas parecem idênticas em relação à forma geral e ao número de volumes de coluna necessários para eluir o primeiro fragmento - a cadeia pesada de comprimento total de 180 kDa. Nesse caso, o aumento de Superdex 200 é de aproximadamente apenas um terço do comprimento da coluna Superdex 200 Prep Grade, o que significa que a eficiência de separação do aumento de Superdex 200 é aproximadamente três vezes melhor em comparação com o Superdex 200 Prep Grade. No entanto, o processo sofisticado não foi executado de acordo com qualquer quantidade constante, mas, em vez disso, estava sujeito à disponibilidade de colunas desse tamanho e dimensão. Portanto, é ainda mais benéfico que ambas as resinas com suas respectivas geometrias tenham desempenho mais ou menos semelhante, pois torna as experiências de viabilidade SEC comparáveis com as purificações preparativas de exclusão por tamanho.

Exemplo 13: Purificação em grande escala (preparativa) de subespécies de FVIIl - purificação e concentração de fragmento de cadeia pesada truncada (150 kDa) na segunda e terceira etapas da cromatografia

[00204] O procedimento para a purificação do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa é, em princípio, semelhante àquele utilizado para a purificação da cadeia pesada de comprimento total,

descrito nas seções anteriores. Visto que o rebaixo típico que a subespécie de 150 kDa geralmente aparece fornece muito menos frações com pureza suficiente, é bastante difícil purificar quantidades totais adequadas desse tipo de subespécie de FVIII. Conforme indicado pelo número de operações necessárias e a quantidade total de cada subespécie no final, a Figura 43 mostra que o mesmo número de operações produz apenas cerca de um décimo do fragmento de cadeia pesada truncada (6,74 mg) em comparação com a cadeia pesada de comprimento total (62,97 mg).

[00205] A purificação da subespécie de cadeia pesada truncada com um peso molecular de 150 kDa (produto de laço MonoQ AIEX E6) por cromatografia de exclusão por tamanho é mostrada na Figura 33. O padrão geral de eluição é diferente da purificação do fragmento de cadeia pesada de comprimento total. Visto que seu peso molecular é 30 kDa abaixo daquele da cadeia pesada de comprimento total, pode-se acessar mais poros e, portanto, um volume maior da resina. Sua eluição é considerada de estar em algum lugar entre a subespécie de 180 kDa e o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa, mas visto que não houve qualquer experimento de viabilidade para esse fragmento, o comportamento exato da eluição é desconhecido. Existem diferentes picos de intensidades variáveis que aparecem ao longo da fase de eluição. O sinal UV começa a subir na fração 1.B4 e fornece um pico duplo como estrutura com intensidades máximas observadas nas frações 1.B6 e 1.B9. Como a eletroforese em gel da SDS-PAGE elucida, ambos os picos provêm da cadeia pesada de comprimento total (180 kDa) que permanece (ver a Figura 34). Embora o fato de que existam diferentes tipos de fragmentos de cadeia pesada de comprimento total devido à glicosilação variável do domínio B, não se sabe por que eles eluem como picos mais ou menos particulares na cromatografia de exclusão por tamanho. Além disso, a eluição das subespécies enriquecidas de 180 kDa não mostrou nenhum pico distinto de cadeia pesada de comprimento total. As frações 1.B10 a 1.C5 contêm o pico de intensidade mais elevado que provém claramente do fragmento desejado da cadeia pesada truncada de 150 kDa. Mas o número de frações que contêm exclusivamente o fragmento desejado e possuem concentrações de proteína satisfatórias ao mesmo tempo é altamente limitado. A fração 1.B11 ainda está contaminada com a cadeia pesada de 180 kDa de comprimento total, mas as seguintes frações parecem quase puras, embora a fração 1.C5 seja apenas baixa em concentração de proteína e haja uma certa quantidade de cadeia leve estendida de 120 kDa detectável. A eluição de fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa começa na fração 1.C6 e é então misturada com a cadeia pesada exaurida de domínio B que não aparece como um pico separado. Devido às suas altas concentrações de proteína e igualmente baixas contaminações com outras subespécies, as frações 1.C1, 1.C2 e 1.C3 são selecionadas para serem utilizadas pelo produto de laço denominado E2. Dependendo das medições de concentração de proteína para as frações isoladas, todo o conjunto é calculado para ter uma quantidade total de proteína de 2,67 mg em uma concentração de proteína bastante baixa. Fração Absorvência em Concentração de Volume de Proteína 280 nm proteína [mg/ml] —fração[mlL] total[mog]

1.01 0,068 0,051 16,90 0,86

1.c2 0,085 0,064 16,85 1,08

1.C3 0,058 0,044 16,84 0,73 Soma (E2) não especificada — não especificada 50,59 2,67 Tabela 21: Esquema de agrupamento para a etapa de purificação SEC do pool de eluato AIEX E6 na coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa. Os valores para o volume e a proteína total não são determinados por meio de medições separadas, mas representam a soma dos valores das frações particulares que são utilizadas para o agrupamento.

[00206] Afim de concentrar a fração SEC preparativa previamente polida E2 e outro pool de eluato SEC semelhante do fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa, ambos são reunidos e aplicados na etapa SourceQ AIEX. Além disso, todos os parâmetros são mantidos constantes, de modo que a eluição começa como de costume na fração

1.A6 e dura até a fração 1.B7 em um modo de rejeito máximo, como mostrado no cromatograma na Figura 35. A altura dos picos é de aproximadamente 1200 mAU, que vem da maior quantidade de proteína carregada como resultado da concentração de dois pools de eluato SEC em uma etapa AIEX em vez de apenas um. Visto que a principal prioridade é perder tão poucos produtos quanto possível, todas as frações com absorbência UV (1.A6 a 1.B8) são utilizadas para o produto de laço.

[00207] A eletroforese em gel de SDS associada é mostrada na Figura 36 com um desenvolvimento de coloração rata no lado esquerdo e o western blot do FVIII no lado direito, onde as designações E1 e E2 correspondem a duas diluições (1:40 e 1:120 para o desenvolvimento da coloração prata e 1:53 e 1:160 para o western blot do FVIII) do produto de laço final. O desenvolvimento de coloração prata não mostra faixas adicionais, indicando uma composição de espécies de cadeia pesada exclusivamente truncada de 150 kDa em combinação com a variante de cadeia leve de 80 kDa. O western blot do FVIIl em contraste é muito mais sensível e apresenta baixa coloração na área de 180 kDa, sugerindo que pelo menos pequenas impurezas da cadeia pesada de comprimento total ainda permaneçam. Como já mencionado durante o debate da etapa de exclusão por tamanho das espécies de cadeia pesada truncada de 150 kDa, o rendimento de uma sequência de purificação para esta subespécie é bastante baixo. Uma quantidade de apenas 2,5 mg pode ser purificada no estágio SEC após uma passagem. Portanto, é necessário repetir a respectiva sequência de purificação várias vezes, a fim de purificar a quantidade necessária de 10 mg de cadeia pesada truncada de 150 kDa do FVII! puro. Essas operações são executadas de acordo com o mesmo procedimento e não serão mais examinadas, pois os resultados são iguais. Um número total de quatro pools de eluato SEC é concentrado em duas etapas subsequentes de Source30Q AIEX e posteriormente agrupado em um único pool de produtos final, que é analisado por HPLC em fase reversa C4.

[00208] Os dados apropriados são representados na tabela 22, na qual cadeias leves estendidas, cadeias leves e cadeias pesadas de 150 kDa são consideradas como espécies de proteína alvo, enquanto todas as outras subespécies são consideradas como impurezas. A porcentagem da proteína alvo é de quase 92%, o que significa que a meta de menos de 10% de outras subespécies pode ser satisfeita para o produto de laço final do fragmento de cadeia pesada truncada com um peso molecular de 150 kDa. “Variável SS . CFProduto delaço EN] “Cadeia leve estendida | ó UU 98 Cadeia leve 40,27 Cadeia única pesada e leve 1 1,58 Cadeia única pesada e leve 2 0,99 Cadeia pesada de 180 kDa 1,80 Cadeia pesada de 150 kDa 50,43 Cadeia pesada de 110 kDa 3,05 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 0,29 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 0,33 “Soma da proteína-alvo UU BIF ga gg “Somadasimpurezas 80 “Soma (respectivos picos) 10002 Tabela 22: Composição do produto de laço final E1 para o fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa derivado de duas operações AIEX em escala preparativa no SourceQ determinada por análise por HPLC em fase reversa CA4.

Exemplo 14: Purificação em grande escala (preparativa) de subespécies de FVIII - purificação e concentração de fragmento de cadeia pesada truncada (110 kDa) na segunda e terceira etapas de cromatografia

[00209] A subespécie de cadeia pesada truncada com um peso molecular de 110 kDa é purificada de acordo com o procedimento padrão já utilizado para as subespécies de FVIIl com 180 kDa e 150 kDa. Uma vez que o pico com o fragmento desejado é muito melhor separado dos picos próximos, tanto na primeira etapa AIEX quanto na cromatografia de exclusão por tamanho, parece ser muito mais fácil selecionar e agrupar frações convenientes. Os resultados são apresentados nas seguintes duas seções.

[00210] O polimento adicional do produto de laço MonoQ AIEX E3 contendo as subespécies de cadeia pesada truncada de 110 kDa é considerado não problemático. A cadeia pesada de 90 kDa exaurida de domínio B já foi suficientemente separada na etapa de purificação do MonoQ AIEX e ainda são esperados apenas valores baixos. O cromatograma na Figura 37 mostra três picos de baixa intensidade no início. Os dois deles nas frações 1.B10 a 1.C1 são decorrentes de variantes de cadeia pesada de comprimento total como indicado na eletroforese em gel (figura 38). O seguinte pico nas frações 1.02 e 1.C3 provem de pequenas quantidades de fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa. O pico mais intenso com valores de absorvência de aproximadamente 10 a 11 mAU é provocado pelo fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa. A eletroforese em gel SDS mostra três frações contendo as subespécies desejadas, a saber, 1.C4, 1.C5 e

1.C6. A fração 1.C4 representa a parte ascendente do pico, que já parece relativamente pura. O pico máximo cai na fração 1.C5, que mostra alta concentração de proteína e pureza satisfatória ao mesmo tempo. A parte descendente do pico é coletada na fração 1.C6, que já contém quantidades vestigiais do fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B (90 kDa).

[00211] Também pode ser visto no cromatograma que essa subespécie aparece como um rebaixo do pico principal e, portanto, parece contaminar a parte descendente do pico do produto. A Tabela 23 mostra as concentrações de proteína e a quantidade total de proteína dos números de fração 1.C4, 1.C5 e 1.C6 que englobam o pico de produto. Uma vez que as frações 1.C4 e 1.C6 contêm quantidades desprezíveis de proteína, parece não valer a pena utilizar essas frações para agrupamento por causa do risco potencial de contaminação. Como consequência, apenas a fração 1.C5 será utilizada para a etapa de concentração AIEX na coluna SourceQ. Os dados da análise por HPLC de fase reversa C4 são apresentados na tabela 24 e claramente confirma a decisão de descartar as frações 1.C4 e 1.C6, já que a fração

1.05 por si mesma contém 8,82% de impurezas. 280 nm proteína [Mg/mL] fração [mL] total [mg]

1.C4 0,013 0,010 35,0 0,34

1.c5 0,054 0,041 35,0 1,42

1.c6 0,020 0,015 35,0 0,53 Tabela 23: Esquema de agrupamento para a etapa de purificação SEC do pool de eluato AIEX E3 na coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa. Somente a fração 1.C5 é utilizada para a etapa de concentração subsequente na etapa SourceQ AIEX, enquanto que as frações 1.C4 e 1.C6 são descartadas.

“Cadeia leveestendida 1/79 Cadeia leve 44,14 Cadeia única pesada e leve 1 1,97 Cadeia única pesada e leve 2 1,00 Cadeia pesada de 180 kDa 0,91 Cadeia pesada de 150 kDa 0,23 Cadeia pesada de 110 kDa 45,25 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 2,18 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 2,53 “Somadaproteína-alvo 9118 Somadasimpurezas 882 “Soma (respectivos picos) 10000 Tabela 24: Composição da fração 1.C5 derivada de cromatografia de exclusão por tamanho em escala preparativa determinada pela análise por HPLC em fase reversa C4.

[00212] O cromatograma da etapa de concentração AIEX para o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa pode ser visto na Figura 39. Os pools de eluato de três operações particulares de cromatografia de exclusão por tamanho são reunidos e concentrados simultaneamente. A condutividade é a primeira em um nível estável de cerca de 5 mS/cm até ser aumentada abruptamente para -30 mS/cm, a fim de eluir toda a amostra ligada de maneira rápida. Conforme indicado pela curva UV, a amostra começa eluir na fração 1.A7 e atinge sua absorvência máxima de aproximadamente 1100 mAU na fração 1.A9. A absorvência cai rapidamente nas frações 1.A10 a 1.A12 e depois passa para uma fase de rejeito longa que finalmente atinge o nível de referência na fração 1.B6. As frações 1.A7 a 1.B8 são utilizadas para o produto de laço final.

[00213] Visto que a amostra já passou através de duas etapas diferentes de purificação, ela deve conter apenas o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa. Isso também é confirmado pela Figura 40, que mostra uma imagem corada de prata da eletroforese em gel SDS- PAGE no lado esquerdo e um desenvolvimento de western blot do FVII| no lado direito

[00214] Ambos mostram exclusivamente o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa em combinação com a variante de cadeia leve de 80 kDa na carga, que foi sondada antes do carregamento da coluna. As outras frações, isto é, fluxo direto, fase de lavagem e as primeiras frações da fase de eluição que não são utilizadas para o produto de laço (designado como VE), não mostram quantidades relevantes de produto. Isso significa que a capacidade das colunas era alta o suficiente para vincular toda a quantidade de amostra. Uma segunda etapa de concentração é executada da mesma maneira e os dois eluatos são reunidos em um produto de laço final, composto exclusivamente do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa. Duas diluições diferentes - 1:147 (P1) e 1:49 (P2) para coloração prata e 1:196 (P1) e 1:65 (P2) para western blot do FVIII - desse produto de laço podem ser vistas como fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa quase puro. A imagem corada de prata não mostra nenhuma outra subespécie, enquanto existe um sinal baixo para a cadeia pesada de comprimento total visível para a diluição de P2 na imagem de western blot do FVIIl. A Tabela 25 fornece os dados analíticos correspondentes em relação à composição do produto de laço final, incluindo todos os pools de eluato SEC concentrados. A fração de proteína alvo no pool final é de 93,7%, que inclui tanto a cadeia leve estendida de 120 kDa quanto a variante da cadeia leve de 80 kDa, assim como a variante da cadeia pesada truncada de 110 kDa. A fração de impurezas é de 6,3%, que é menor do que 10%.

Variável Produto de laço E1 [%] Cadeia leve estendida 1,46 Cadeia leve 42,39 Cadeia única pesada e leve 1 1,53 Cadeia única pesada e leve 2 0,47 Cadeia pesada de 180 kDa 1,07 Cadeia pesada de 150 kDa 0,52 Cadeia pesada de 110 kDa 49,85 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 1,44 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 1,28 Soma da proteína-alvo 93,70 Soma das impurezas 6,31 Soma (respectivos picos) 100,01 Tabela 25: Composição do produto de laço E1 contendo fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa derivado da AIEX em escala preparativa na SourceQ determinado pela análise por HPLC em fase reversa C4. O produto de laço final é composto de eluatos de duas operações de SourceQ AIEX, que foram utilizados para a concentração de cinco pools de eluato de cromatografia de exclusão por tamanho. Exemplo 15: Purificação em grande escala (preparativa) de subespécies de FVII! - concentração do fragmento de cadeia pesada (90 kDa) exaurido de domínio B na terceira etapa da cromatografia

[00215] O fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio Bé a subespécie de FVIIIl menos presente no material de partida B1439000-

30. Para obter uma quantidade satisfatória dessa subespécie, seria necessário executar um número enorme de purificações AIEX, o que exigiria um grande volume desse material de partida cuja disponibilidade é bastante limitada. Como uma consequência disso, um segundo material de partida denominado F8 AD2 90kDa com um conteúdo aproximado de -38% das subespécies de 90 kDa é utilizado para esse propósito. Independente de sua fonte, a etapa de polimento através da cromatografia de exclusão por tamanho é omitida e as soluções serão concentradas diretamente em uma coluna SourcedQ. Existem duas disponíveis em dois tamanhos diferentes — visto que o volume e o teor total de proteína de ambos os materiais iniciais excedem a capacidade da coluna SourceQ em pequena escala, uma maior com volume de coluna de 7,0 ml será usada no seu lugar. O que se segue será limitado aos resultados da purificação de espécies de cadeia pesada exauridas de domínio B derivadas de B14390000-30.

[00216] Como já mencionado anteriormente, o fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B de 90 kDa é quase completamente separado de outras subespécies na etapa MonoQ AIEX e, portanto, não requer qualquer outra purificação ou polimento por meio da cromatografia de exclusão por tamanho. Como já está altamente diluído, isso também levaria a resultados insuficientes na cromatografia de exclusão por tamanho e, além disso, causaria grandes perdas desse fragmento em particular. Um produto de laço MonoQ AIEX típico das espécies exauridas de domínio B de 90 kDa, tal como o produto de laço E8 descrito no Exemplo 11, contém apenas 0,025 mg/ml de proteína e se torna assim necessário concentrar um número maior de tais conjuntos de produto para obter a quantidade desejada de 10 mg de proteína alvo. A Figura 41 mostra a fase de eluição de uma operação AIEX SourceQ para a concentração de seis pools de eluato MonoQ simultaneamente. A pequena coluna SourceQ com —3 ml de volume de coluna não é mais adequada porque os volumes significativamente aumentados do produto causariam tempos de espera da amostra muito longos na temperatura ambiente.

Portanto, era inevitável aproximadamente dobrar o volume da coluna para -7 ml para manter os tempos de retenção em um faixa aceitável.

A eluição por si mesma é semelhante àquelas debatidas anteriormente, embora o pico pareça ter sido ampliado.

Como já visto nas fases de eluição da cromatografia de troca aniônica MonoQ, o fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B elui por último, pois requer a mais alta condutividade de todas as subespécies para liberação.

O gradiente de etapa da etapa SourceQ AIEX pode não fornecer condutividades altas o suficiente para eluir o fragmento exaurido de domínio B em uma ordem rápida e nítida.

Em vez disso, se adota volumes mais elevados de tampão de eluição para remover toda a proteína da resina e, assim, provocar o pico de alargamento.

No entanto, as frações 1.A11 a 1.D12 são utilizadas para o produto de laço final, que mostra uma concentração de proteína de 0,493 mg/ml e uma quantidade total de proteína de 9,06 mg.

A respectiva eletroforese em gel SDS pode ser vista na Figura 42, como de costume, fornecendo uma imagem de gel corada de prata no lado esquerdo e um desenvolvimento de western blot do FVIII no lado direito.

Embora a imagem corada de prata pareça bastante pura, pode ser visto na imagem de western blot do FVIII muito mais sensível que ainda existe uma quantidade significativa de cadeia pesada de comprimento total visível na carga e nas diluições do pool de eluato.

A análise por HPLC de fase reversa C4 confirma uma quantidade de 3,84% de cadeia pesada de comprimento total ainda presente no produto de laço final, mas 94,49% da proteína alvo está em conformidade com a meta de pureza de <10% de outras subespécies.

Este procedimento de purificação da cadeia pesada de comprimento total foi repetido várias vezes para produzir a quantidade desejada de proteína.

Varável— ProdutodelaçoE1[%] = “Cadeia leve estendida BT Cadeia leve 46,75 Cadeia única pesada e leve 1 2,40 Cadeia única pesada e leve 2 0,45 Cadeia pesada de 180 kDa 0,99 Cadeia pesada de 150 kDa 0,48 Cadeia pesada de 110 kDa 1,19 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 1 18,36 Variante de cadeia pesada de 90 kDa 2 27,87 “Somadaproteína-alvo 9449 “Somadasimpurezas 551 0 “Soma (respectivos picos) 10000 Tabela 26: Composição do produto de laço E1 (fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B de 90 kDa) derivado da etapa de concentração AIEX em escala preparativa de seis operações AIEX determinadas pela análise por HPLC de fase reversa C4.

Exemplo 16: Resumo da purificação em grande escala (preparativa)

[00217] O processo de purificação preparativa da subespécie de FVII! abrange a etapa AIEX no MonoQ para separação inicial, a etapa SEC em uma resina Superdex 200 para polimento e, finalmente, uma etapa de concentração na resina de troca aniônica Source30Q. A cadeia de comprimento total, assim como os dois fragmentos truncados, devem passar por essas três etapas para obter o sucesso adequado da purificação. O fragmento exaurido de domínio B é uma exceção fácil de purificar, que omite a etapa de polimento e é simplesmente aplicada às etapas de troca aniônica. A Figura 43 fornece uma visão geral do programa completo de purificação conduzido durante a presente invenção. A cadeia pesada de comprimento total com um peso molecular de 180 kDa, incluindo todas as variantes diferentemente glicosiladas, exigiu um número total de quatro operações de purificação AIEX, três operações SEC e três operações AIEX para concentração.

Isto produziu 62,97 mg de proteína alvo, incluindo todas as variantes de cadeia pesada de comprimento total, assim como as duas variantes de cadeia leve.

A porcentagem de impureza é de 6,84% ou, em outras palavras, o produto de laço final mostra 93,16% de pureza, o que cumpre a meta de quantidade e pureza de proteínas.

As impurezas surgem principalmente das duas espécies de cadeia pesada truncada.

O fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa é um dos mais desafiadores para purificar.

Um número total de quatro operações AIEX no MonoQ, quatro operações de polimento SEC e duas operações AIEX para concentração foi necessário para produzir a quantidade bastante baixa de 6,74 mg de proteína alvo, incluindo as espécies de cadeia pesada truncada (150 kDa) e as duas variantes de cadeia leve.

O percentual de impurezas pode ser mantido abaixo de 10% (8,04%), quase que exclusivamente da cadeia pesada de comprimento total, que cumpre a meta.

As espécies de cadeia pesada truncada de 110 kDa foram purificadas por cinco operações de purificação AIEX, seguidas de cinco operações de polimento SEC e, finalmente, duas operações de concentração AIEX.

Os 8,57 mg finais do fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa apresentam 6,31% de impurezas, que são provocadas por todas as outras subespécies.

O fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B exigiu sete operações AIEX e duas operações de concentração AIEX na coluna Source30Q em grande escala.

Este processo de purificação forneceu uma quantidade total de proteína de 15,31 mg, incluindo as duas variantes de subespécie de 90 kDa em combinação com as duas variantes de cadeia leve.

À porcentagem de impurezas é exatamente 5,00%, que é o menor número percentual de impurezas de todas as subespécies, embora a etapa intermediária de polimento não tenha sido executada. Ambos os objetivos são, portanto, cumpridos com relação ao fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B. Em conclusão, a meta referente ao limite de <10% de impurezas pode ser alcançada para todas as subespécies. A quantidade total de proteína é muito satisfatória para o fragmento de cadeia pesada de comprimento total devido à sua alta abundância no material de partida, mas também os resultados para o fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B estão na faixa correta.

[00218] A concentração de proteína para todos os quatro conjuntos de produto finais é de 0,974 mg/ml para a cadeia pesada de comprimento total, 0,568 mg/ml para o fragmento de cadeia pesada truncada de 150 kDa, 0,640 mg/ml para o fragmento de cadeia pesada truncada de 110 kDa e 0,537 mg/ml para o fragmento de cadeia pesada exaurido de domínio B. O objetivo de todos os conjuntos de produto estarem acima do limite de 0,3 mg/ml é, portanto, claramente alcançado. Além disso, todas as espécies de produto são fornecidas na matriz tampão desejada.

[00219] Em conclusão, os experimentos em pequena escala onde diferentes condições e parâmetros foram testados em quatro resinas diferentes foram muito importantes para o processo de purificação sofisticado e final. Essa estratégia final levou a resultados satisfatórios. Especialmente o fragmento de cadeia pesada truncado com peso molecular de 150 kDa é bastante difícil de purificar. Além disso, ele também está consumindo muito material de partida devido ao seu conteúdo bastante baixo. No entanto, quase 7,0 mg podem ser produzidos, o que é um bom resultado. A estratégia final de purificação oferece um procedimento direto para a purificação de todas as quatro subespécies. A Tabela 27 resume os resultados da presente invenção e fornece uma avaliação em relação aos pré-requisitos.

Variante do FVII| Quantidade de Pureza Concentração Avaliação proteína [mg] [%] [mg/mL] Cadeia pesada de 180 kDa 62,97 93,16 0,974 Alcançada Cadeia pesada de 150 kDa 6,74 91,96 0,568 Parcialment e alcançada Cadeia pesada de 110 kDa 8,57 93,69 0,640 Parcialment e alcançada Cadeia pesada de 90 kDa 15,31 95,00 0,537 Alcançada Tabela 27: Resumo dos resultados experimentais finais e avaliação em relação aos objetivos. A quantidade total de proteínas, pureza e concentração são mostradas para todas as frações alvo, assim como a avaliação correspondente que indica se os objetivos do projeto podem ser alcançados ou parcialmente alcançados.

[00220] Inicialmente, a cromatografia de interação hidrofóbica foi considerada de ser uma alternativa à etapa MonoQ AIEX, pois poderia eluir as espécies de cadeia pesada truncada de 150 kDa mais separadas da cadeia pesada de comprimento total. As primeiras experiências mostraram que ela realmente faz, mas o conteúdo das subespécies de 150 kDa parecia relativamente baixo para purificação. Uma possível solução para isso foi incorporar um HIC de modo negativo como uma alternativa à cromatografia de exclusão por tamanho. Uma experiência foi executada, e foi bem-sucedida e mostrou que um pool enriquecido de subespécies de 150 kDa poderia ser purificado em um grau satisfatório. Outras experiências podem revelar as condições apropriadas em relação ao nível de condutividade, que se presume ter a maior influência sobre o comportamento de ligação.

[00221] Finalmente, os objetivos foram alcançados e forneceram um procedimento novo e eficientemente funcional para a purificação das subespécies de FVIIl, assim como uma nova abordagem para a substituição da etapa de cromatografia de exclusão por tamanho. Além disso, o fornecimento de soluções proteicas puras para todas as quatro subespécies é uma pedra angular que permite investigações adicionais da natureza das subespécies moleculares do FVIII. Além disso, as subespécies purificadas de FVII! ou uma mistura destas podem ser úteis no tratamento de distúrbios hemorrágicos. Exemplo 17: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVII! - Materiais e métodos

[00222] A seguir, detalhes experimentais são fornecidos para todos os Exemplos relacionados à "Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVIII". Amostras e produtos químicos do FVIII

[00223] O FL-rFVIII (um material intermediário de processo de um produto de FL-rFVIII comercialmente disponível, 0,23 mg/ml) produzido em Ovário de Hamster Chinês (CHO), lotes históricos de FL-rFVII e produto de FVIII plasmático liofilizado comercialmente disponível foram fornecidos pela Shire, Viena Austria. Os produtos químicos foram adquiridos da Sigma Aldrich, MO, USA. Salvo indicação em contrário, o FL-rFVIII refere-se ao FL-rFVII! humano e pdFVIII refere-se ao pdF VIII humano. Purificação das espécies moleculares de pdF VI e rFE VI!

[00224] O pdFVIIl isento de vWF foi purificado a partir de um produto do FVIIl plasmático liofilizado comercialmente disponível. A reconstituição de vários frascos foi executada em uma solução tampão seguida de agrupamento para obter um material inicial homogêneo. À separação de vWF e FVIII foi induzida por meios químicos. A captura de FVIII foi executada em uma coluna de afinidade anti-FVIIl. À depleção adicional de vuWF foi alcançada por uma cromatografia de troca catiônica forte. Finalmente, uma etapa de polimento adicional em uma resina de troca aniônica forte foi executada para troca e concentração de tampão.

[00225] As espécies moleculares de rFVIIl com uma extensão diferente de truncamento de domínio B foram isoladas do FL-rFVIII. Uma etapa de cromatografia de troca aniônica de alta resolução com um gradiente plano foi utilizada para pré-separar as entidades. Grupos com subespécies enriquecidas foram então gerados e posteriormente purificados através da cromatografia de exclusão por tamanho preparativa seguida de concentração e troca de tampão em uma resina de troca aniônica forte. SDS-PAGE

[00226] A SDS-PAGE foi realizada utilizando o sistema Novex NuPAGE SDS-PAGE (ThermoFisher Scientific, MA, USA). As amostras (cada uma de 50 ul) foram misturadas com 20 ul de iodoacetamida 0,5 M e incubadas durante 30 min a 37ºC. Mais tarde, 15 ul de água deionizada, 25 ul de tampão de amostra NUPAGE LDS e 10 ul de agente redutor NUPAGE foram adicionados à mistura de reação e a incubação continuou durante 30 min a 37ºC. Dez ul (30 ng) de cada amostra e 2 ul de precisão mais padrão de proteína não corada (Bio-Rad, CA, USA) foram carregados em um mini gel de Tris-acetato NUPAGE 7%. À eletroforese foi operada durante 90 min em 150 V. Bandas de proteína foram visualizadas com o Kit de coloração prata SilverQuest (ThermoFisher Scientific). Análise de proteína in silico

[00227] Para o cálculo da hidropaticidade média do domínio B, a ferramenta BioAnnotator do Vector NTI Advance 11 foi utilizada. Espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério

[00228] A fim de caracterizar os motivos estruturais do rFVIIl, a espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS) foi executada. A cinética da amida HDX local da construção da proteína foi seguida após 3 s, 10 s, 30 s, 2 min 10 min, 60 min, 3 he 3 dias de tempo de incubação. Todas as reações de HDX foram executadas na temperatura ambiente (22ºC), exceto para a reação de incubação de 3 s que foi realizada a 6ºC. A reação de marcação de HDX foi iniciada através da mistura das espécies moleculares de rFVIII B7O-rFVII com tampão deuterado (tampão Tris 50 mM, pH 6,7, contendo CaCl2 5 mM e NaCl 260 mM). A reação foi interrompida pela adição de tampão fosfato 100 mM gelado, pH 2,3, contendo Tris(2-carboxietil)fosfina 100 mM e uréia 3,3 M, e subsequente congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. As amostras deuteradas foram digeridas utilizando uma coluna de HPLC (21 x 30 mm) (ACE, Aberdeen, UK) acondicionada com pepsina-agarose da mucosa gástrica suína (Sigma- Aldrich) e dessalinizadas em uma pré-coluna C18 de 2 x 10 mm (ACE). Os peptídeos pépticos foram submetidos à cromatografia líquida acoplada a MS (LC-MS) utilizando uma coluna HALO C18/1,8 um 2 x 50 mm (AMT, DE, USA). Os peptídeos foram eluídos através de um gradiente de acetonitrila e analisados em um espectrômetro de massa Orbitrap XL (resolução de 60.000 em m/z 400) (ThermoFisher Scientific). A identificação do peptídeo péptico foi executada por 3 análises independentes de LC-MS/MS de uma amostra de proteína não deuterada, utilizando o mesmo procedimento que para as amostras deuteradas.

Atividade Cromogênica do FVIII

[00229] Amedição da atividade do FVIII foi executada de acordo com um kit de ensaio de atividade cromogênica do FVIIl comercialmente disponível (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany) em um analisador de coagulação automatizado (BCS XP) (Siemens Healthcare). Resumidamente, as amostras contendo quantidade desconhecida de FVII funcional foram adicionadas à mistura de reação que consiste em trombina, fator IX de coagulação ativado (FIXa), fosfolipídio, fator de coagulação X (FX) e um tampão contendo cálcio. Após a clivagem da trombina, o FVIlla formou um complexo com fosfolipídios, FIXa e cálcio, resultando na ativação do FX. O FX ativado (FXa) foi medido fotometricamente através da clivagem do substrato de p-nitroanilina cromogênico específico do FXa e foi diretamente proporcional à quantidade de FVIII funcional presente na amostra. O padrão de referência era o FL-rFVIIl comercialmente disponível (Shire), calibrado de acordo com o padrão internacional da WHO. Preparação de Agregados do FVII|

[00230] Todas as amostras de FVIII foram submetidas à diálise contra PBS contendo CaCl2 0,9 mM e MgCl2 0,5 mM (PBS++) e diluídas para uma concentração de proteína de 0,122 uM, 0,244 UM ou 0,61 uM. Para garantir a reprodutibilidade, todas as experiências foram executadas pelo menos duas vezes. Agregação Dependente da Temperatura

[00231] Todas as amostras de FVIIl com concentrações de proteína de 0,122 uM para análise de cromatografia de exclusão por tamanho de alto desempenho (HPLC-SEC) ou 0,61 uM para análise de dispersão da luz dinâmico (DLS), foram incubadas a 25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC ou 50ºC durante 20 h em microplacas de 96 reservatórios de poliestireno (Corning, NY, USA) cobertas com seladores de placa em Synergy H4 Hybrid Reader (BioTek, VT, USA) com 20 segundos de agitação do meio a cada 10 min. As amostras foram subsequentemente congeladas a -80ºC até a análise de DLS e HPLC-SEC. Agregação dependente do tempo a 45ºC

[00232] Todas as amostras de FVIII (0,122 uM) foram incubadas a 45ºC durante 24 h em microplacas de 96 reservatórios de poliestireno (Corning) cobertas com seladoras de placa em PST-60HL acrescidas de agitador térmico (Biosan, MI, USA). As amostras foram retiradas após vários períodos de tempo e imediatamente congeladas a -80ºC até exame por HPLC-SEC. Semeadura homóloga da agregação do FVII!

[00233] Paraa preparação das sementes, amostras de FVIII (0,122

UM) foram incubadas durante 2, 5, 8 ou 18 h a 45ºC em microplacas de 96 reservatórios de poliestireno (Corning) cobertas com seladoras de placa em PST-60HL acrescida de agitador térmico (Biosan). Amostras de FVIII nativas (0,122 uM) foram misturadas 1:1 com suas sementes correspondentes e a agregação dependente do tempo a 45ºC foi executada. As amostras foram armazenadas a -80ºC até análise por HPLC-SEC. Agregação induzida por agitação e esforço de cisalhamento

[00234] As soluções de FVIIl com concentração de proteína 0,244 UM foram agitadas manualmente durante 10 min em uma seringa Omnifix descartável (Braun, Melsungen, Germany). O esforço de cisalhamento foi induzido pela injeção da solução através de "conjuntos de infusão Winged com proteção ed agulha" (23G x 34"; L= 35 cm, V = 0,25 ml) da Terumo Europe, Belgium. Essas condições de esforço bem controladas pretendem representar um possível manuseio inadequado dos produtos de rFVIII durante a reconstituição e aplicação. Todas as amostras, após exposição às condições de esforço, foram armazenadas a -80ºC até a análise de partículas baseada em citometria de fluxo. Dispersão da luz dinâmica

[00235] A DLS foi executada utilizando um Malvern NanoZetasizer ZSP (Malvern Instruments, Malvern, UK). Todas as amostras (0,244 uM) foram centrifugadas (Centrífuga 5415C) (Eppendorf, Viena, Austria) em

10.000 rpm durante 5 min e 60 uL de amostra foram carregados em uma microcubeta descartável ZENOO40. A temperatura de operação foi ajustada para 25ºC com um tempo de equilíbrio de 2 min. O ângulo foi definido para retrodispersão de 173º para determinar o diâmetro hidrodinâmico de uma proteína. Este parâmetro foi utilizado para analisar o tamanho efetivo das proteínas por DLS. Um mínimo de três operações por amostra foi medido para obter um resultado médio. Cromatografia de exclusão por tamanho de alto desempenho

[00236] A HPLC-SEC foi executada na temperatura ambiente utilizando uma coluna TSKgel G4000SWxI (7,8 x 300 mm) (Tosoh Bioscience, Tokio, Japan) e uma coluna de proteção TSK (6 x 40 mm) (Tosoh Bioscience) acoplada a um sistema infinitivo HPLC 1260 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). A SEC foi realizada sob condições isocráticas em uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min utilizando um tampão aquoso que consiste em Tris-HCI 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 400 MM e NaN; 0,05%, pH 7,0. Um volume de amostra de 100 ul (concentração de proteína 0,122 uM) foi misturado com 3 ul de tioflavina T1mM(ThT) e subsequentemente carregado na coluna. Para monitorar a eluição da proteína com detecção de fluorescência, os comprimentos de onda de excitação e emissão foram ajustados para 280 nm e ordem zero, respectivamente. A fluorescência de ThT foi monitorada com excitação de 440 nm e emissão de ordem zero. Os picos que eluíram com o volume vazio (tempos de retenção de 18,0 a 21,2 min), com tempos de retenção de 21,2 a 27,0 min e 27,0 a 43,0 min foram designados como agregados proteicos solúveis, oligômeros e monômeros, respectivamente. A quantidade de agregados, oligômeros e monômeros foi calculada como uma porcentagem da área total de todos os picos no cromatograma. A ligação do ThT foi calculada como a relação entre o ThT e os sinais de fluorescência de proteína intrínseca. O padrão de filtração em gel à base de proteínas (Bio-Rad) foi analisado entre as amostras para monitorar o desempenho ideal da coluna. Todas as amostras foram analisadas em ordem aleatória.

Ajuste de curva e análise estatística

[00237] O ajuste de curva foi calculado pelo GraphPad Prism 6. As constantes de taxa cinética para formação de oligômeros (Koiigo [h-1]) foram derivadas dos dados de ajuste no modelo de associação monofásica, seguindo a equação: y = yo+(platô-yo)*[1-exp(-Koiigo*X)]; y = quantidade de oligêmero [%]; x = tempo [h]; yo = valor y quando x for zero; platô = valor de y em tempos infinitos. As taxas de formação de agregados (kagg [h]) foram derivadas do ajuste de dados para modelo sigmóide de Boltemann, seguindo a equação: y = ymint(yYnax YminY/(1+exp[(x12-x)/(1/Kaga)l; y = quantidade agregada [%]; ymin = y durante a fase de atraso; ymax = y após o término da agregação; x = tempo [h]; x12 = tempo na metade do máximo y (Uversky et al., 2001).

[00238] As diferenças estatísticas foram calculadas pelo GraphPad Prism 6 utilizando teste t não pareado. Análise de partículas baseada em citometria de fluxo

[00239] “Um método de análise de partículas baseado em citometria de fluxo para a detecção e caracterização de partículas invisíveis foi utilizado. O método baseado em citometria de fluxo está utilizando uma combinação de glóbulos de calibração de tamanho (glóbulos Fluoresbriteº YG Carboxylate Size Range) (Polyscience Inc., PA, USA), glóbulos de contagem (CountBright'"" Absolute Counting Beads) (Invitrogen Corp., CA, USA) e sondas fluorescentes para caracterização das partículas invisíveis. Para distinguir proteínas e partículas contendo proteínas de partículas invisíveis não protéicas, as amostras foram coradas com o corante fluorescente sal dipotássico de ácido 4,4" dianilino-1,1"-binafil-5,5'-dissulfônico (Bis-ANS). O método é descrito com detalhes na publicação (Lubich et al., 2015). Exemplo 18: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVII! - Heterogeneidade semelhante de pdFVIIl e FL-rF VII

[00240] Nas seguintes experiências o objetivo foi investigar a influência do domínio B e da heterogeneidade natural originada da presença do domínio B no FL-rFVIII e no (pd)FVII! derivado de plasma na estabilidade e agregação de proteínas. As características estruturais do domínio B foram estudadas e comparadas a capacidade das espécies moleculares de FL-rFVII, pdFVIII e rFVII purificadas com conteúdo variável de domínio B para suportar o estresse físico, e seu comportamento de agregação foi explorado. Com base nas observações, um modelo esquemático de agregação de FL-rFVIIl e BDD-rFVIII foi construído e um novo papel do domínio B e da heterogeneidade molecular para garantir a estabilidade da molécula de FVIII foi sugerido.

[00241] Uma visão geral esquemática da estrutura de múltiplos domínios do FVIIIl é mostrada na Figura 2B. Os parênteses indicam espécies moleculares resultantes do processamento pós-translacional complexo dentro do domínio B do FL-FVIII. As espécies moleculares de rFVII! contendo o domínio 100% (B100-), 70% (B70-), 20% (B20-) ou 0% (BDD-rFVIIll) B apresentam as principais espécies de FVIII encontradas no FL-rFVIII (Jankowski et al., 2007, dados analíticos internos não mostrados). As porcentagens do conteúdo de domínio B foram calculadas com base nas massas moleculares aparentes do respectivo rFVIII HC. A parte do domínio B que alcança os aminoácidos Arg1313 a Arg1648 é, muito provavelmente, completamente removida após o processo de clivagem, uma vez que não foi encontrada em nenhuma espécie secretada de FVII!Il HC (Jankowski et al., 2007).

[00242] O pdFVIII foi isolado do plasma humano reunido na maior pureza mediante uma combinação de cromatografia por afinidade e cromatografia de troca iônica. A quantidade de vWF foi reduzida para 7,5 ug de vWF/mg de FVIII. Perfis de proteínas heterogênicos quase idênticos foram identificados para pdFVIII e FL-rFVII! derivado de CHO no gel SDS-PAGE corado com prata (imagem à esquerda na Figura 44, pistas 1-2). Ambos apresentaram a banda mais intensa em aproximadamente 200 kDa, indicando espécies B100-HC glicosiladas, e várias espécies de domínio HC/B truncadas com menor peso molecular migrando em níveis comparáveis em FL-rFVII! e pdFVIIl no gel. A presença das principais espécies moleculares de FVI!l em ambos, FL-rFVII e pdFVIII, foi ainda observada nos perfis SEC (Figura 51).

Além disso, a heterogeneidade no FL-rFVII! mostrou consistência em relação aos lotes históricos produzidos de 2005 a 2015 (imagem à direita na Figura 44). Exemplo 19: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVII! - Purificação e caracterização de espécies moleculares de rF VII!

[00243] Espécies moleculares isoladas de FVIII foram purificadas a partir do FL-rFVIII derivado de CHO através da aplicação de métodos cromatográficos de exclusão por tamanho e de troca iônica. BDD-rFVII, B20-rFVIIl e B7O-rFVIII foram isolados com 95%, 94% e 92% de pureza com base na análise de HPLC CA4, respectivamente (dados não mostrados). Enquanto uma faixa de peso molecular aparente constante de 75 kDa foi observada para a LC de cada espécie, a HC de B70-rFVIII, B20- rFVII e BDD-rFVIII mostrou, devido a quantidades variáveis de domínio B, pesos moleculares evidentes de 150, 110 e 90 kDa no gel SDS-PAGE, respectivamente (imagem esquerda na Figura 44, pistas 3 a 5) A integridade das espécies de rFVIII purificadas foi ainda demonstrada por HPLC-SEC (Figura 51). O B100-FVII! não é utilizado no que se segue. Exemplo 20: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVII! - características estruturais do domínio B

[00244] O domínio B possui uma sequência de aminoácido com baixa hidrofobicidade geral. A média de hidropaticidade de acordo com Kyte and Doolittle (Kyte et al., 1982) foi calculada como 0,751 para a sequência total de aminoácido de domínio B. Aglomerados de baixa hidrofobicidade são distribuídos igualmente entre as sequências de domínio B. As sequências de domínio B em B100-, B70- e B20-rFVIII apresentam valores de hidropaticidade médios semelhantes de -0,779, -0,741 e -0,896, respectivamente. A baixa hidrofobicidade tipicamente caracteriza proteínas desdobradas de forma nativa como revisado em detalhes por Uversky (Uversky et al., 2002).

[00245] A espécie molecular de FVIII B7O-rFVIII foi submetida à espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS). Essa abordagem explora o fato de que a exposição da proteína ao D2O induz a rápida amida HDX em regiões desordenadas, enquanto elementos firmemente dobrados são muito mais protegidos da incorporação do deutério, resultando em troca lenta de isótopos (Konermann et al., 2011). A cinética HDX-MS de 120 peptídeos de B70- rFVII foi medida cobrindo 63% da sequência de proteína total e 37% da sequência de domínio B70-rFVII! B (Figura 52). Todos os peptídeos obtidos a partir das sequências pertencentes ao domínio B demonstraram cinética muito rápida de incorporação de deutério. Mesmo no menor tempo de incubação de 3 segundos, todos os peptídeos incorporaram a mesma quantidade de deutério que sua amostra totalmente deuterada correspondente após 3 dias de marcação.

[00246] Os dados HDX-MS, juntamente com as características da sequência de aminoácido, indicam que o domínio B do B7O-rFVIII carece de estrutura secundária, mas parece bastante intrinsecamente desordenado e flexível. Com base na análise in silico descrita acima, pode-se esperar uma exposição e flexibilidade semelhantes ao solvente para o domínio B total e vários truncamentos do domínio B presentes nas espécies moleculares de FVIII.

[00247] Os resultados de cinética HDX da sequência HC excluída de qualquer domínio B (Figura 52) estão de acordo com a estrutura cristalina publicada do FVIIl, que mostra elementos estruturais ordenados interrompidos por um loop de superfície desordenado no domínio A1 e uma região conectora flexível entre os domínios A1 e A2 (Shen et al., 2008).

Exemplo 21: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVIIl - Comportamento de agregação de espécies moleculares de FL- rFE VII e rEVII em temperaturas elevadas

[00248] O comportamento de agregação dependente da temperatura de FL-rFVIII, B7O-rFVII, B20-rFVII e BDD-rFVIII foi investigado. As amostras foram expostas a temperaturas elevadas (25 a 50ºC) e analisadas por DLS e HPLC-SEC (Figura 45). A média Z, que descreve o diâmetro hidrodinâmico médio ponderado pela intensidade dos agregados de proteína, não foi alterada de 25 a 35ºC para as espécies FL-rFVII e rFVIIl. A partir de 40ºC, um aumento na média Z foi observado para todos os itens testados, no entanto, com claras diferenças entre as amostras de rFVIIl. Considerando que o aumento dobrado do tamanho médio agregado observado de 25 a 50ºC foi de 9,2 para BDD-rFVIII e 6,4 para B20-rFVIII, atingiu apenas 3,4 para B70- rFVIIl e 2,5 para FL-rFVIIl. Os agregados de BDD-rFVIII detectados após a incubação durante 20 horas a 45ºC e 50ºC foram 2,5 e 3,1 vezes maiores em tamanho, respectivamente, em comparação com os agregados FL-rF VIII.

[00249] A mesma tendência no comportamento de agregação detectada por DLS foi mostrada após a análise agregada do rFVIII por HPLC-SEC (inserção da Figura 45).

[00250] Os agregados de FL-rFVIII, separados dos monômeros do FL-rFVIII por HPLC-SEC, mostraram conter cada espécie molecular de rFVIll em uma relação semelhante à FL-rFVIIl nativa, conforme analisado por SDS-PAGE (Figura 53).

[00251] Em resumo, após exposição a temperaturas elevadas, o tamanho médio do agregado aumentou à medida que o teor de domínio B diminuiu (ordem de propensão à agregação BDD-rFVIII>B20- rFVIII>B70-rFVIII>FL-rFVIN). O FLFVIIl, sendo uma mistura heterogênea de espécies moleculares de rFVIIl, apresentou menor propensão à formação de agregados de todas as amostras testadas de rFVII.

Exemplo 22: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVIIl - as vias de agregação de FVIIIl dependem da heterogeneidade molecular e do teor de domínio B

[00252] A análise detalhada da agregação dependente do tempo foi executada a 45ºC, a temperatura na qual o início das alterações conformacionais na molécula de FVIII foi relatado (Grillo et al., 2001, Ramani et al., 2005a). A cinética de agregação a 45ºC seguida por HPLC-SEC revelou diferenças claras nas vias de formação de agregados e oligômeros entre espécies moleculares de rFVIII! e FL- rFVII! (Figura 46). Com base no limite de exclusão da coluna utilizada, os agregados foram definidos como agregados de proteína solúveis na faixa de tamanho de 50 a 100 nm, que foram eluídos com o volume vazio. Os oligômeros (tempos de retenção: 21,2 a 27,0 min) foram definidos como estruturas proteicas na faixa de tamanho de 10 a 50 nm que foram retardadas pela coluna de exclusão por tamanho, mas que elui antes dos monômeros de proteína (tempos de retenção: 27,0 a 43,0). A formação de oligômeros de todas as amostras de FVII! seguiu uma curva de associação monofásica, no entanto, quanto menos domínio B a molécula analisada continha, tanto mais rapidamente os oligôêômeros foram formados (Figura 46A). As constantes da taxa para a formação de oligômeros (Kotigo) de FL-rFVII, B7O-rFVII, B20-rFVII e BDD-rFVIII foram calculadas como 0,13 + 0,02, 0,12 + 0,05, 0,35 + 0,24 e 0,70 + 0,24 h1, respectivamente. As curvas de agregação mostraram formas sigmóides com taxas variáveis de formação de agregados (Kagg), novamente, de forma clara dependendo do teor de domínio B (Figura 46B). Na ausência do domínio B, os agregados se formaram mais rápida e excessivamente; Kagg(FL-rFVIII) = 0,11 + 0,00 h-1, kagg (B7O-rFVIN) = 0,18 + 0,02 h-1, kagg (B20-rFVIII) = 0,21 + 0,07 h"1, kagg (BDD-rFVII) =

0,21 + 0,08 h-1. Embora a quantidade de oligômeros de BDD-rFVIII tenha aumentado para um máximo de 22% após 8 h e diminuiu continuamente mais tarde, a quantidade de agregados de BDD-rFVIII aumentou em uma fase de atraso de 1 h excessivamente até 48% após 24 h de incubação (Figura 46D). O valor mais elevado do teor de oligômeros de B20-rFVIIl (31%) foi observado após 17 h, a concentração de agregados de B20-rFVIII (31%) foi a mesma após 24 horas. Enquanto os oligômeros de B70-rFVIII 33% e FL-rFVIIl 44% foram formados em níveis de platô após 22 a 24 h, apenas baixos teores de agregado de 17% e 11% para B7OFVIN e FL-rFVII, respectivamente, foram observados no final do tempo de incubação. As vias de agregação de FL-rFVIIl e BDD-rFVIII foram mais contrárias conforme representado nas Figuras 46C e D, respectivamente. À agregação de pdFVIII (Figura 46E) seguiu um caminho muito semelhante ao FL-rFVIIl com as constantes da taxa Korgo(pdF VIII) = 0,24 + 0,04 e Kaga(PdFVIII) = 0,15 + 0,03 h!. Consistente com as taxas de formação de oligômeros e agregados, a perda de monômeros de BDD- rFVII foi mais rápida em comparação com FL-rFVII! e pdFVII! (Figura 46F). A atividade de FVIII de cada amostra testada foi reduzida de acordo com a diminuição na concentração de monômeros (dados não mostrados).

[00253] Em resumo, a propensão para a formação de oligômeros aumentou com o aumento do teor de domínio B, enquanto que a propensão para a formação de agregados era vice-versa e tanto FL- rFVIII quanto pdFVIII heterogêneos mostraram uma tendência muito semelhante, porém muito menor, para a formação de agregados do que qualquer espécie molecular monogênica purificada de rF VIII.

Exemplo 23: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVIIll - Vias de agregação divergentes acionadas pela diferença estrutural dos agregados

[00254] Para investigar a causa das diferenças detectadas no comportamento de agregação, a fluorescência de ThT após a ligação a oligômeros e agregados de espécies moleculares de rF VIII, FL-rFVII e pdFVIII após incubação a 45ºC durante 24 h foi analisada por HPLC- SEC. A ThT é um corante fluorescente comumente utilizado que apresenta fluorescência acentuada após a ligação a estruturas ricas em folha B cruzada (Biancalana et al., 2010). A capacidade de ligação da ThT às estruturas protéicas agregadas de FVIII foi expressa como relação da ThT e fluorescência intrínseca da proteína (Figura 47). Uma ligação de ThT aumentada aos oligômeros de BDD-rFVIIlI em comparação com oligômeros de espécies contendo domínio B (B20- rFVII e B7OrFVIII), assim como o FL-rFVII e pdFVIII, foi observada. Os agregados de BDD-rFVII! mostraram uma capacidade de ligação de ThT aumentada em mais de 3 vezes como aqueles de FL-rFVII! e pdFVIII. Além disso, a fluorescência de ThT dos agregados de B20-rFVIII foi maior do que àquela observada nos agregados de B70O-rFVIIl. À fluorescência medida após a ligação de ThT aos oligômeros e agregados de FL-rFVII! e pdFVIII foi muito semelhante (Figura 47). As relações de fluorescência de ThT e os sinais de absorção de proteína em 280 nm mostraram as mesmas diferenças de ligação de ThT entre as amostras de FVIII testadas em comparação com as relações de fluorescência de ThT/proteína intrínseca. A ligação de ThT aos monômeros de qualquer amostra analisada de FVIII não foi detectada. Exemplo 24: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVIIl - Semeadura homóloga da agregação de FVII!

[00255] Os agregados contendo folha B cruzada são conhecidos de servir como sementes que transformam-se em núcleo no interior da célula além da agregação de proteínas sob condições de estresse (Gsponer et al., 2006, Jarrett et al, 1993). A capacidade dos BDD-rFVII, B7O-rFVIIl e FL-rFVIIl agregado (45ºC durante 2, 5, 8 ou 18 h) de semear o processo de agregação da respectiva amostra foi explorada. A Figura 48 mostra a formação dependente do tempo de oligôêômeros e agregados de amostras de FVIIl contendo 50% de sementes pré- formadas em comparação com amostras de FVIIIl não semeadas. À semeadura homóloga de B70-rFVII! e FL-rFVII! heterogêneo (Figura 48B e C, respectivamente) não alterou o comportamento de oligomerização e agregação. As espécies moleculares de rFVIIIl sem domínio B mostram um mecanismo diferente. Após a rápida formação inicial de oligômeros de BDD-rFVIII, as curvas foram niveladas com a adição de sementes homólogas e, finalmente, uma concentração de 10% de saturação de oligômeros foi alcançada. A fase de atraso da formação de agregado de BDD-rFVIII diminuiu dependendo do tipo de semente adicionada. Após a adição de sementes que foram geradas por incubação durante 8 ou 18 horas a 45ºC, a fase de atraso das curvas de agregação de BDD-rFVII| desapareceu completamente (Figura 48A). A redução da fase de atraso é uma característica típica da polimerização dependente de nucleação descrita anteriormente para várias proteínas, incluindo a insulina bioterapêutica (Arosio et al., 2015, Surmacz- Chwedoruk et al., 2014).

[00256] Agregados ricos em folha B cruzada de BDD-rFVII! foram eficazes na semeadura homóloga de agregação adicional de proteína. Um fenômeno não observado para o B7O-rFVIIl nem para o FL-rFVII, os quais não formam agregados positivos de folha B cruzada. Curiosamente, o FL-rFVIIl, embora devido à sua heterogeneidade natural contendo também uma pequena parte do BDD-rFVIII, é menos propenso à agregação e semeadura quando comparado com espécies moleculares de rFVIIl monocomponenciais.

Exemplo 25: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVII! - Formação de partículas invisíveis do FVIIl sob agitação e esforço de cisalhamento

[00257] As condições de estresse clinicamente relevantes foram simuladas mediante a aplicação de agitação e esforço de cisalhamento às espécies moleculares de FL-rFVIIl, pdFVIII e rFVIIl. Proteínas invisíveis induzidas contendo partículas no tamanho de 0,75 a 70 um estão além da faixa analítica de HPLC-SEC e foram detectadas por um método baseado em citometria de fluxo (Lubich et al., 2015, Nishi et al., 2014). As concentrações detectadas de proteínas invisíveis contendo partículas atingiram níveis semelhantes em FL-rFVII! e pdFVIII na faixa de 2,4 a 4,2 x 10º contagens/ml (valores médios 3,1 x 10º contagens/ml! e 3,2 x 10º contagens/ml, respectivamente) após exposição à agitação e esforço de cisalhamento. Uma concentração significativamente mais elevada foi detectada no BDD-rFVIII (valor médio de 6,0 x 10º contagens/ml; faixa de 4,9 a 6,9 x 10º contagens/ml). A proteína invisível que contém a concentração de partícula de espécies moleculares truncadas de domínio B foi dependente do teor de domínio B das respectivas espécies e foi maior para B20-rFVIII (valor médio de 5,5 x 10º contagens/ml) do que para B70-rFVIII (valor médio de 3,9 x 10º contagens/ml) (Figura 49). Amostras não esforçadas apresentaram concentrações de partícula de proteína invisíveis na faixa de 0,4 a 4,6 x 10º contagens/ml. Exemplo 26: Caracterização funcional de subespécies purificadas de FVII! — Exame dos resultados

[00258] Nos Exemplos anteriores, a heterogeneidade, estabilidade e comportamento de agregação de FL-rFVIII humano expresso em células de CHO foram investigados e comparados com pdFVII! humano altamente purificado, com espécies moleculares de rFVII! purificadas contendo quantidade variável de domínio B. As características estruturais do domínio B são exploradas e seu papel potencial na estabilização da molécula de FVIII é abordado.

[00259] Os dados indicam que o FL-rFVIIl produzido na linhagem celular de CHO apresenta heterogeneidade natural semelhante ao pdFVII! e que possui todas as espécies moleculares de domínio B também presentes no pdFVIIl. Embora ainda não completamente compreendido, o processamento do domínio B durante a secreção de FL-rFVIIlI é consistente como indicado por perfis de proteína heterogênicos idênticos da linhagem celular de CHO que historicamente produzem lotes de FL-rFVIIl apresentados nessas experiências e idêntico ao pdFVIII. Curiosamente, o FL-rFVII! produzido na linhagem celular de rim de hamster bebê apresenta um perfil de proteína ligeiramente distinto para a linhagem celular de CHO derivada de FL- rFVIll e para o pdFVIll (Jankowski et al., 2007). Em geral, a heterogeneidade do FVIIl, embora com pequenas diferenças no comprimento exato dos truncamentos do domínio de HC/B, é uma característica independente da espécie. Foi observado para o pdFVIIl e FL-rFVIIl humanos nesses experimentos e trabalhos anteriores (Jankowski et al., 2007) e também para o pdFVII! suíno (Lollar et al., 1988). Por outro lado, o BDD-rFVIII analisado nessas experiências, assim como os produtos de BDD-rFVIIl comercializados, apresentam um padrão monogênico de proteína quase artificialmente aparente e, portanto, mostram grandes diferenças quando comparados ao pdFVIII heterogênico (D'Amici et al., 2010; Thim et al., 2010; Peters et al., 2013).

[00260] O papel da heterogeneidade e o impacto do domínio B na agregação de FVIII foram explorados. O FL-rFVIII demonstrou anteriormente ser suscetível à agregação devido a pequenas alterações estruturais nas estruturas terciárias partindo de 45ºC (Grillo et al., 2001) e iniciar a agregação como um resultado de alterações conformacionais na região de ligação lipídica no domínio C2 (Ramani et al., 2005a). Na presente invenção, foi mostrado que em temperaturas crescentes, o FL- rFVIII heterogêneo demonstrava a menor propensão à agregação, enquanto que o BDD-rFVIIl monogênico agregava-se extensivamente e também formava agregados muito maiores. Uma tendência de agregação elevada foi observada à medida que o teor de domínio B das espécies moleculares de rFVIIl diminuía. A análise detalhada dependente do tempo da formação de oligômeros e agregados sob estresse térmico (45ºC) revelou caminhos divergentes de diferentes amostras de FVIIIl. A lenta formação de oligêmeros de FL-rFVIII e pdFVIII estressados termicamente quase inibiu a agregação. Uma formação muito mais rápida de oligômeros e também uma agregação mais rápida foi observada para o BDD-rFVIII. As espécies moleculares de rFVIII eram propensas à oligomerização ou agregação dependentes da quantidade de domínio B remanescente. As estruturas ricas em folhas B cruzadas positivas á ThT foram detectadas em oligômeros e agregados de BDD-rFVIII induzidos termicamente, mas estavam em menor extensão ou mesmo não presentes no domínio B contendo F VIII. Muito provavelmente, folhas B cruzadas em oligôêômeros do BDD-rFVIII acionam a agregação rápida e extensa e explicam o comportamento de agregação divergente entre BDD-rFVIII e FL-rFVIIl. Além disso, a semeadura homóloga eficiente da agregação de BDD-rFVIIl, não observada em nenhuma outra amostra de FVIIl analisada, provavelmente ocorreu devido a essa diferença estrutural.

[00261] Com base nos resultados observados da agregação termicamente induzida na presente invenção, um modelo esquemático que descreve as vias divergentes dos oligômeros e formação de agregados de BDD-rFVIII e FL-rFVIII foi construído (Figura 50). Embora o material de partida inicial em FL-rFVIIl representa uma mistura heterogênea de todas as espécies de rFVIII, o BDD-rFVIII existe apenas de uma única espécie. Os comprimentos das setas no modelo indicam taxas de formação de oligômeros e agregados, que são muito mais rápidos para o BDD-rFVII! em comparação com o FL-rFVIII. Enquanto as formas de BDD-rFVII| ordenaram grandes agregados ricos em folhas B cruzadas, os agregados de FL-rFVIIl carecem de natureza repetitiva, sendo compostos por várias espécies e menores em tamanho. A montagem de proteínas solúveis em estruturas contendo B cruzada ordenadas é um evento essencia de muitas doenças neurodegenerativas humanas, tais como doenças de Alzheimer, doenças de Parkinson ou encefalopatias espongiformes (Chiti et al., 2006). O rápido desenvolvimento de tais distúrbios, assim que os sintomas clínicos são detectados, foi associado à capacidade de semeadura dos respectivos agregados protéicos acumulados (Jarrett et al., 1993).

[00262] Na presente invenção, foi elucidado que o domínio B é exposto ao solvente, desordenado e flexível, além disso, apresenta baixa hidrofobicidade. Essas observações permitem propor uma função protetora de agregação do domínio B para o FVIIl semelhante à observada em outras proteínas com segmentos desordenados significativos, tais como a-sinucleína. A região C-terminal altamente carregada nativamente desdobrada de a-sinucleína, demonstrou ser essencial na estabilização e prevenção da agregação da proteína. Os fragmentos truncados de forma C-terminal da a-sinucleina se agregaram mais rapidamente do que a proteína de comprimento total. A agregação de fragmentos truncados foi claramente dependente do comprimento da região C-terminal e foi menor quanto maior o conteúdo da região desordenada (Murray et al., 2003; Serpell et al., 2000; Hoyer et al., 2004).

[00263] Curiosamente, a propensão mais baixa de agregação de todas as amostras de FVIII testadas na presente invenção foi observada para o FL-rFVII! heterogênico, que consiste em uma mistura de domínio

B contendo espécies de rFVII! truncadas e excluídas de domínio B. À heterogeneidade provoca uma similaridade reduzida de sequência entre as espécies individuais de rFVIIl. De fato, essa diversidade de sequência nas proteínas já foi demonstrada essencial na redução da suscetibilidade de agregação e processos de semeadura em estudos anteriores. As descobertas de Wright e colaboradores sobre o comportamento de agregação da proteína titina de múltiplos domínios demonstraram que a eficiência da coagregação entre diferentes domínios diminui acentuadamente com a diminuição da identidade de sequência e, além disso, eles reivindicaram que manter uma baixa identidade de sequência entre as proteínas é uma importante característica evolutiva que inibe fortemente agregação no ambiente lotado de um sistema vivo (Wright et al., 2005). Similarmente, a eficiência da formação de fibrilas de semeadura de lisozimas mostrou- se fortemente dependente da similaridade de suas sequências, quanto menor a identidade da sequência tanto menor a eficiência de propagação (Krebs et al., 2004). Estas observações correlacionam-se bem com os resultados da presente invenção, mostrando claramente uma menor propensão à agregação e eficiência de semeadura do FL- rFVIII heterogênico em comparação com espécies monogênicas de rFVII.

[00264] Também a influência da agitação e esforço de cisalhamento na agregação de FVIII foi explorada nesta invenção. Essas condições de esforço clinicamente relevantes imitam a possível manipulação inadequada dos produtos terapêuticos de FVII| pelos pacientes e podem facilitar a interação de proteínas com o óleo de silicone, que frequentemente está presente nas superfícies internas das seringas para permitir um movimento suave do êmbolo (Lubich et al., 2015, Thirumangalathu et al., 2009, Gerhardt et al., 2014). Isso leva à formação de partículas contendo proteínas invisíveis que estão tipicamente na faixa de tamanho de 0,1 a 50 um (den Engelsman et al., 2011). Na presente invenção, a proteína invisível que contém a formação de partículas após agitação e esforço de cisalhamento foi semelhante à observada para agregação induzida termicamente, claramente dependente do teor de domínio B. As concentrações de partícula em FL-rFVII e pdFVIII atingiram níveis semelhantes, enquanto que significativamente mais partículas foram detectadas em BDD-rFVIII.

[00265] A presente invenção demonstra que a agregação de FVII| depende de dois parâmetros principais que, por sua vez, podem influenciar um ao outro, tais como (i) o teor do domínio B que possui um efeito estabilizador na molécula de FVIIl mediante a prevenção da formação de agregados ricos de folha B cruzada e propensos a semeadura e (ii) heterogeneidade que suprime a agregação devido à diversidade de sequências emergente. Publicado anteriormente, a glicosilação estava influenciando significativamente a estabilidade do FL-rFVIII, demonstrada pela resistência reduzida à agregação do FL- rFVII desglicosilado (Kosloski et al., 2009). Dado que -80% dos sítios de N-glicosilação estão distribuídos do domínio B (Fay et al., 2006), parece provável que a exclusão desse domínio torne a proteína mais suscetível à agregação. Fabricação e formulação são outros fatores críticos que influenciam a agregação de FVII| e a terapêutica de proteína em geral (Eon-Duval et al, 2012). Os profissionais da saúde devem estar cientes dessas diferenças de qualidade e das possíveis preocupações de segurança resultantes para os pacientes.

[00266] Os agregados de proteína não afetam apenas a estabilidade e o prazo de validade dos medicamentos protéicos, mas também aumentam a sua imunogenicidade (Eon-Duval et al, 2012). A natureza repetitiva dos agregados de proteína pode ser reconhecida por receptores de reconhecimento padrão ou reticular os receptores de antígeno na célula imune. Os anticorpos antifármacos formados podem ter um efeito neutralizante sobre a proteína, que por sua vez afeta sua potência ou farmacocinética e, especialmente no caso de terapêutica relacionada a uma proteína endógena, arriscam a segurança do paciente (Moussa et al., 2016). Anticorpos inibidores são formados em aproximadamente um quinto dos pacientes com hemofilia A tratados com FVIII (Gouw et al., 2013; Hay et al., 1998). A influência dos agregados de FVIII na indução de anticorpos inibidores em um modelo de camundongo com hemofilia A foi anteriormente investigada. Foi demonstrado que os agregados de proteina modulam a imunogenicidade do FVIIl em modelos in vivo de maneira diferente, dependendo da natureza dos agregados e de como eles foram formados (Ramani et al., 2005b; Pisal et al., 2012). No entanto, até o momento, não existem dados sobre como os agregados de proteína nos produtos de FVIIl modulam a imunogenicidade da bioterapêutica em seres humanos e quais propriedades imunogênicas podem ter oligômeros e agregados de FVIII caracterizados neste estudo.

[00267] Em resumo, a presente invenção demonstra heterogeneidade de proteína semelhante de FL-rFVIIl e pdFVIIl, e sugere um efeito benéfico da heterogeneidade mediante a redução da suscetibilidade de agregação de proteínas após exposição ao estresse físico. Adicionalmente, um novo papel do domínio B em garantir a estabilidade da molécula de FVIII através da modulação da via de agregação de proteína e proteção do FVIII! da agregação excessiva foi identificado.

[00268] As descobertas acima podem ser utilizadas em projetos futuros de novas terapêuticas de FVII! para melhorar sua estabilidade, prazo de validade e, mais importante, sua segurança. Exemplo 27: Determinação das concentrações de proteína de espécies de FVIII

[00269] Oque segue fornece um exemplo de como as concentrações de proteína das espécies de FVI!Il podem ser determinadas.

[00270] Cálculo dos coeficientes de absorção do FVII!Il em 280 nm: Com base nas sequências de aminoácido, os coeficientes de absorção em 280 nm foram calculados assumindo que todas as cisteínas estão em ligações de dissulfeto. A sulfatação da tirosina não foi incluída no cálculo.

[00271] Os coeficientes de absorção são a absorção teórica de uma solução a 1 mg/ml da proteína indicada.

[00272] O coeficiente de absorção de SOS-E foi calculado com base na relação de espécies presentes no Advate, como é conhecido dos dados analíticos de cromatografia em C4. Os coeficientes de absorção de pdFVII! e uma mistura de subespécies de FVIII foram assumidos da mesma como para SOS-E. Espécies de Composição Assumida Coeficiente de FVII absorção em 280 nm 180 kDa Cadeia pesada de comprimento total 50% 180 kDa 1,26 cadeia leve 50% 150 kDa Cadeia pesada truncada 50% 150 kDa 1,43 cadeia leve 50% 110 kDa Cadeia pesada truncada 50% 110 kDa 1,53 cadeia leve 50% 90 kDa Cadeia pesada exaurida de domínio B 50% 1,57 cadeia leve 50% paFvII SOS-E, — % de cadeia pesada de 180, 150, 110 e 1,33 mistura (ver 90 kDa com base nos dados analíticos de o Exemplo cromatografia 28) cadeia leve 50% Tabela 28: Coeficientes de absorção em 280 nm de amostras de FVIII

[00273] Determinação das concentrações de proteína de FVIIIl: À absorção de amostras do FVIIll em 280 nm foi determinada espectrofotometricamente. A concentração foi calculada de acordo com:

Concentração (mg/ml) = absorção medida/coeficiente de absorção em 280 nm Exemplo 28: Atividade de espécies recombinantes de FVII| purificadas e suas misturas

[00274] As atividades das espécies recombinantes purificadas de FVIII (rFVII) e suas misturas foram medidas e comparadas com as atividades de FL-rFVIII (SOS-E) e (pd)FVIII derivado de plasma.

[00275] A atividade das amostras de FVIII foi medida por: . ensaio de atividade cromogênica . ensaio de coagulação em um estágio . ensaio de geração de trombina desencadeada pelo fator tecidual através da trombografia automatizada calibrada

[00276] Amostras de FVIII: . espécies de rFVIII purificadas (90 kDa, 110 kDa, 150 kDa, 180 kDa) . mistura: mistura das espécies 90 kDa, 110 kDa, 150 kDa e 180 kDa em relações molares quando presentes no Advate (com base nos dados analíticos de cromatografia C4) . SOS-E: FL-rFVIII, material de partida para purificação de espécies . pdFVII!

[00277] Todas as amostras foram diluídas para 0,244 uM em um tampão em pH definido contendo componentes de tampão, incluindo sais, assim como um surfactante. Devido às diferenças de tamanho e peso molecular das concentrações de espécies de FVII! (ug/ml) de espécies na molaridade de 0,244 UM, foram as seguintes:

[00278] —AmostradeFVIll Concentração (pg/ml) 90 kDa 40 110 kDa 42 150 kDa 46

180 kDa 55 Mistura 52 SOS-E 52 pdFVII! 52

[00279] Descrição dos métodos: Ensaio de coagulação de um estágio

[00280] A atividade de FVIII por ensaio de coagulação de um estágio foi executada com um reagente aPTT comercialmente disponível, Actin FSL (Siemens, Germany), em um analisador de coagulação automatizado (BCS XP, Siemens, Germany). Uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de FVIII funcional é misturada com plasma humano deficiente de FVIIl e o ativador. Após a incubação a +37 C, a coagulação é iniciada pela adição de cloreto de cálcio e o tempo para a formação de coágulos é registrado. O tempo de coagulação é indiretamente proporcional à concentração de FVIIl na amostra. Os resultados são apresentados em IU FVIII/ml, lidos a partir de uma curva de referência. O padrão de referência era o rFVIIl de comprimento total, determinável pelo padrão internacional da WHO. Ensaio de Atividade Cromogênica

[00281] O ensaio de atividade de FVIII foi executado com reagentes comercialmente disponíveis (Siemens, Germany) em um analisador de coagulação automatizado (BCS XP, Siemens). Na primeira etapa do ensaio cromogênico, uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de FVII! funcional é adicionada a uma mistura de reação que consiste em trombina, FIX ativado (FIXa), fosfolipídeo, FX e um tampão contendo cálcio. O FVIII é ativado pela trombina. O FVII! ativado (FVIlla) forma um complexo com fosfolipídios, FIXa e cálcio resultando na ativação do Fator X (FXa) Na segunda etapa do ensaio cromogênico, o FXa é medido através da clivagem de um substrato de nitroanilida do peptídeo específico do FXa. P-nitroanilina é produzida,

dando uma cor que pode ser medida fotometricamente através da absorvência em 405 nm. A cor produzida é diretamente proporcional à quantidade de FVIII funcional presente na amostra. O padrão de referência foi o FVIIl de comprimento total, calibrado contra o padrão internacional da WHO. Ensaio de geração de trombina ativada pelo fator tecidual

[00282] A trombografia automatizada calibrada (CAT), um tipo de ensaio de geração de trombina (TGA), é um ensaio hemostático global que é cada vez mais utilizado em estudos clínicos como parâmetro de eficácia ex vivo e como ferramenta de pesquisa. O trombograma descreve a concentração de trombina no plasma de coagulação e, portanto, é um teste de função do sistema hemostático sob condições próximas á fisiológica. O ensaio baseia-se na medição da fluorescência que é gerada pela clivagem do substrato fluorogênico Z-G-G-R-AMC pela trombina ao longo do tempo após o início da coagulação pelo fator tecidual. O ensaio é executado em um Thrombograph'Y, um fluorômetro de placa de 96 reservatórios e utiliza um calibrador de trombina que é necessário para corrigir o efeito do filtro interno, a variabilidade de doador para doador na cor do plasma, a depleção de substrato e as diferenças instrumentais.

[00283] Os seguintes parâmetros de CAT caracterizam o estado hemostático de uma amostra de plasma: . Tempo de atraso [min]: representa o tempo de coagulação, o início da geração de trombina . Tempo para atingir o pico [min]: tempo até que a quantidade máxima de trombina seja gerada . Pico de trombina [NM]: concentração máxima de trombina formada . Potencial endógeno de trombina (ETP) [NM min]: Área sob a curva de geração de trombina que representa a quantidade total de trombina que é gerada.

[00284] A geração de trombina de diferentes espécies de rFVIIl e suas misturas foi medida no plasma de pacientes com hemofilia À através da trombografia automatizada calibrada (CAT). As diluições de amostra das espécies de rFVIll e as misturas foram preparadas em tampão de amostra (HEPES 25 mM, NaCl 175 mM, pH 7,4, 5 mg/ml de BSA). As amostras foram diluídas para resultar em concentrações plasmáticas de 0,0625 a 1 nM de rFVIII no ensaio.

Em uma placa de microtitulação de 96 reservatórios (Immulon 2HB, Thermo Labsystems, Waltham, MA USA), os seguintes componentes foram combinados: 10 ul das diluições da amostra de rFVIII, 10 ul de uma mistura de fator tecidual (TF) e fosfolipídios (PL) com concentrações finais de 1 pM de TF e 4 uM de PL (PPP-Reagent Low Thrombinoscope, Maastricht, Netherlands), e 80 ul de plasma pobre em plaquetas (PPP) de pacientes com hemofilia A (FVIIl < 1% George King Biomedical). O PPP foi previamente tratado com inibidor de tripsina de milho (Haematologic Technologies Inc) em 62 pg/ml para evitar a pré-ativação do plasma.

A reação foi iniciada pela adição de 20 ul de substrato fluorogênico Z-G- G-R-AMC e cloreto de cálcio (FluCa Kit, Trombinoscópio). A fluorescência foi detectada usando um Fluoroskan Ascent (Thermo Lab Systems). A geração de trombina foi calculada utilizando o software Thrombinoscope (Thrombinoscope). A análise pelo software Thrombinoscope resulta em curvas de geração de trombina com tempo (min) no eixo x e trombina (nM) no eixo y.

O software determina os seguintes parâmetros: tempo de atraso (min; tempo até o começo da geração inicial de trombina); potencial endógeno de trombina (ETP; NM; área sob a curva de geração de trombina — que reflete a quantidade total de trombina gerada ao longo do ensaio); pico de trombina (nM; maior quantidade de trombina gerada em qualquer ponto do ensaio), tempo até o pico (min; tempo até a maior quantidade de trombina gerada em qualquer ponto do teste). O pico de trombina foi selecionado como parâmetro principal para comparar a atividade de geração de trombina das diferentes amostras de rFVIII nas diferentes concentrações.

[00285] Resultados:

[00286] A atividade de coagulação de um estágio das amostras de FVIIl na concentração de 0,244 mM é apresentada e comparada na Figura 54A. A atividade cromogênica das amostras de FVIII na concentração de 0,244 mM é apresentada e comparada na Figura 54B. Os picos de trombina e o tempo de atraso das amostras de FVII! nas concentrações de 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM são apresentados e comparados na Figura 55. Esses resultados mostram que todas as espécies de rFVIII purificadas e suas misturas apresentaram atividade aumentada em comparação com SOS-E em ensaios de atividade do FVIIl de coagulação cromogênicos e de um estágio. O padFVIIl apresentou atividade semelhante ao SOS-E no ensaio de atividade cromogênica, mas aumentou a atividade no ensaio de coagulação de um estágio. Todas as espécies de rFVIII purificadas, suas misturas e o pdFVIII apresentaram picos de trombina aumentados em comparação com SOS-E no ensaio de geração de trombina desencadeada por TF. Todas as amostras testadas apresentaram tempos de atraso reduzidos em comparação com o SOS-E. Exemplo 29: Maturação de furina de ADVATE BDS e intermediários

[00287] —Surpreendentemente, a Figura 56 mostra que o FVIII de cadeia única está presente em vários produtos de FVII! comercialmente disponíveis. Por isso, foi testado se a maturação de furina levaria ao aumento da atividade do FL-rFVIII. O que segue descrieve as amostras e sua preparação: Amostras: SOS-E: * Intermediário do processo Advate sem etapa final de polimento

ADVATE BDS Tampão: controle negativo Preparação de amostra: A: Amostra nativa B: Amostra nativa + 100 ul de estoque de furina + 22,4 ul de Milli-Q C: Amostra nativa + 100 ul de tampão de furina + 22,4 ul de Milli-Q D: Amostra nativa + 100 ul de estoque de furina + 22,4 ul de estoque de inibidor E: Amostra nativa + 100 ul de tampão de furina + 22,4 ul de estoque de inibidor

[00288] O volume total para B-E foi igual, portanto, comparações diretas são possíveis. rFurin BDS foi utilizado. O tampão de furina era igual ao Estoque de Furina apenas sem Furina. Estoque de inibidor: Cloridreto de benzamidina 100 mM.

[00289] A seguinte tabela mostra os resultados dos ensaios de atividade cromogênica que foram executados utilizando as amostras descritas acima.

Código da amostra — | Amostratampão | Furina Tampão de | Solução Incubação | Conc.

[00290] A Figura 57 mostra um gel SDS-PAGE corado com prata das amostras preparadas como descrito acima. A Figura 58 mostra uma análise de Western Blot de um gel SDS-PAGE das amostras preparadas como descrito acima.

[00291] Os resultados acima mostram que o FVIII de comprimento total, assim como a cadeia leve estendida, podem ser amadurecidos pela adição de furina em uma atividade de 200 a 300 IU/ml. A atividade cromogênica é assim aumentada em cerca de 17 a 19%. O SDS-PAGE mostra claramente a maturação com relação ao FVIII de comprimento total, assim como da cadeia leve estendida.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00292] Os métodos da presente invenção são úteis, por exemplo, para processos de fabricação industrial. Os produtos da presente invenção são úteis, por exemplo, para a fabricação de medicamentos. Assim, a invenção é industrialmente aplicável.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a purificação de uma subespécie do Fator VIII (FVIII) de uma composição que compreende o FVIIl, em que a subespécie do FVIIIl é uma cadeia pesada de FVIII que está associada com uma cadeia leve de FVIIIl, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) submeter a composição que compreende o FVIII à cromatografia de troca aniônica e coletar o eluato compreendendo ditas subespécies do FVIII; (2) submeter o eluato da etapa (1) que compreende ditas subespécies do FVIII à cromatografia de exclusão por tamanho e coletar o eluato compreendendo ditas subespécies do FVIII; e (3) concentrar o eluato da etapa (2) compreendendo ditas subespécies do FVIII.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método adicionalmente compreende a seguinte etapa (0) antes da etapa (1): (0) — submeter o FVIIl compreendido na composição ao tratamento com furina protease.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de FVIII é a cadeia leve de 80 kDa do FVIIL.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentração (3) é uma etapa de submeter o eluato da etapa (2) compreendendo ditas subespécies do FVIII à cromatografia de troca aniônica e coletar o eluato que compreende ditas subespécies do FVIII.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que na etapa (3) uma resina SourceQ é utilizada para a cromatografia de troca aniônica.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a5, caracterizado pelo fato de que o FVII é FVII! recombinante (rF VIII) e a subespécie de FVIIl é uma subespécie de FVIIl recombinante (rFVII).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a subespécie de FVIIIl é a cadeia pesada de 180 kDa do FVIII que está associada com uma cadeia leve do FVIIl, ou a cadeia pesada de 150 kDa do FVIII que está associada com uma cadeia leve do FVIII, ou a cadeia pesada de 110 kDa do FVIII que está associada com uma cadeia leve do FVIII, ou a cadeia pesada de 90 kDa do FVIII que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que na etapa (1) uma resina Q de alta resolução com um tamanho de glóbulo menor do que 20 um é utilizada para a cromatografia de troca aniônica.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que na etapa (2) uma resina de cromatografia de exclusão por tamanho com uma faixa de resolução de 10000 Da a 60000 Da é utilizada para a cromatografia de exclusão por tamanho.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a9, caracterizado pelo fato de que a eluição na etapa (1) é executada através da eluição em gradiente linear e em que o gradiente da eluição em gradiente linear possui um comprimento de pelo menos cerca de 16 volumes de coluna, pelo menos cerca de 24 volumes de coluna ou pelo menos cerca de 32 volumes de coluna.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma subespécie do Fator VIII (FVII!) purificada, em que a subespécie é uma cadeia pesada do FVIII que está associada com uma cadeia leve do FVIII.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a relação de peso da subespécie do FVIII purificada na composição para todas as outras subespécies na composição é de pelo menos 9 ou pelo menos 8.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a concentração da subespécie do FVIII| purificada é de pelo menos 0,1 mg/ml ou pelo menos 0,3 mg/ml.

14. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de um distúrbio hemorrágico.

15. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de hemofilia A.

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