BR112019025453A2 - Terapias de combinação para o tratamento de cânceres - Google Patents

Abstract

São fornecidas as terapias combinadas e composições e métodos relacionados para o tratamento de cânceres, incluindo tumores epiteliais, que incluem uma combinação de pelo menos dois agentes como um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) 4/6.

Description

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCERES Referência cruzada para pedidos relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade ao PCT/CN2017/086911, depositado em dois de junho de 2017, que é incorporado por referência em sua totalidade.

Histórico Campo técnico

[002] As modalidades da presente divulgação se relacionam a terapias de combinação e composições e métodos relacionados para o tratamento de cânceres, incluindo tumores epiteliais, que incluem uma combinação de pelo menos dois agentes como um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) 4/6.

Breve resumo

[003] As modalidades da presente divulgação dizem respeito, na parte pertinente, a métodos para tratar um câncer em um indivíduo que precise dele, compreendendo a administração ao indivíduo de uma combinação de dois ou mais agentes selecionados de: (a) um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); (b) um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e (c) um inibidor da quinase dependente da ciclina (CDK) 4/6.

1/68

[004] Em certas modalidades, (a) uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao EGFR ou a um dos seus ligantes ou é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe, matuzumabe, erlotinibe, gefitinibe, afatinibe, lapatinibe, osimertinibe, brigatinibe e icotinibe.

[005] Em certas modalidades, (b) é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a um MEK 1/2 ou a um dos seus ligantes ou é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: trametinibe selumetinibe e cobimetinibe.

[006] Em certas modalidades, (c) é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento e ligação ao antígeno) que se liga especificamente a uma CDK 4/6 ou a um de seus ligantes ou é opcionalmente selecionada a partir de um ou mais dos seguintes compostos: palbociclibe, ribociclibe e abemaclibe.

[007] Algumas modalidades compreendem a administração da combinação de (a) e (b) ao indivíduo, opcionalmente como composições separadas ou juntos como parte da mesma composição. Algumas modalidades compreendem a administração da combinação de (a) e (c) ao indivíduo, opcionalmente como composições separadas ou juntos como parte da mesma composição. Algumas modalidades compreendem a administração da combinação de (a), (b) e (c) ao sujeito, opcionalmente como composições separadas ou juntos como parte da mesma composição.

[008] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor epitelial maligno ou carcinoma. Em algumas modalidades, o carcinoma é selecionado a partir de um ou mais de um 2/74 adenocarcinoma, um carcinoma de células escamosas, um carcinoma adenoescamoso, um carcinoma anaplásico, um carcinoma de grandes células e um carcinoma de pequenas células. Em algumas modalidades, o carcinoma é selecionado a partir de um ou mais de uma neoplasia epitelial, uma neoplasia de células escamosas (carcinoma de células escamosas), uma neoplasia de células basais (carcinoma de células basais), um carcinoma de células transicionais, um adenocarcinoma (opcionalmente uma linite plástica, um vipoma, um colangiocarcinoma, um carcinoma hepatocelular, um carcinoma adenoide cístico, um carcinoma de células renais ou um tumor de Grawitz), uma neoplasia de apêndice cutâneo, uma neoplasia mucoepidermoide, uma neoplasia cística, mucinosa ou serosa, uma neoplasia ductal, lobular ou medular, uma neoplasia de células acinares e uma neoplasia epitelial complexa. Em algumas modalidades, o câncer é um carcinoma selecionado a partir de um ou mais de um câncer de colo, câncer gástrico, câncer de pulmão (opcionalmente câncer de pulmão de pequenas células ou câncer de pulmão de células não pequenas), um câncer de mama, um câncer pancreático, um câncer oral, um câncer de próstata, um câncer de células germinativas, um câncer retal, um câncer de fígado (opcionalmente carcinoma hepatocelular), um câncer renal (opcionalmente carcinoma de células renais) e um câncer de ovário.

[009] Em algumas modalidades, a combinação de (a) e (b) reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais relativos a (a) e/ou (b) sozinhos. Em algumas modalidades, a combinação de (a) e (b) reduz sinergicamente o crescimento das células 3/74 cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas relativas a (a) e/ou (b) sozinhos. Em algumas modalidades, a combinação de (a) e (c) reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais relativos a (a) e/ou (c) sozinhos. Em algumas modalidades, a combinação de (a) e (c) reduz sinergicamente o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas relativas a (a) e/ou (c) sozinhos. Em algumas modalidades, a combinação de (a), (b) e (c) reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais relativos a (a), (b) e/ou (c) sozinhos. Em algumas modalidades, a combinação de (a), (b) e (c) reduz sinergicamente o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas relativas a (a), (b) e/ou (c) sozinhos.

[0010] Em algumas modalidades, a combinação de (a) e (b), (a) e (c) ou (a), (b) e (c) é selecionada a partir de uma combinação nas Tabelas E1-E6 e opcionalmente no qual o câncer corresponde a uma célula cancerosa nas Tabelas E1-E6.

[0011] Também estão incluídas a composição terapêutica, compreendendo uma combinação de dois ou mais agentes selecionados a partir de: (a) um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); 4/74

(b) um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e (c) um inibidor da quinase dependente da ciclina (CDK) 4/6.

[0012] Em algumas modalidades, (a) uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao EGFR ou a um dos seus ligantes e é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe, matuzumabe, erlotinibe, gefitinibe, afatinibe, lapatinibe, osimertinibe, brigatinibe e icotinibe. Em algumas modalidades, (b) é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a um MEK 1/2 ou a um dos seus ligantes e é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: trametinibe selumetinibe e cobimetinibe. Em algumas modalidades, (c) é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento e ligação ao antígeno) que se liga especificamente a uma CDK 4/6 ou a um de seus ligantes e é opcionalmente selecionada a partir de um ou mais dos seguintes compostos: palbociclibe, ribociclibe e abemaclibe.

[0013] Certas composições compreendem a combinação de (a) e (b). Certas composições compreendem a combinação de (a) e (c). Certas composições compreendem a combinação de (a), (b) e (c).

[0014] Em algumas modalidades, a combinação de (a) e (b), (a) e (c) ou (a), (b) e (c) é selecionada a partir de uma combinação nas Tabelas E1-E6 e opcionalmente no qual o câncer corresponde a uma célula cancerosa/tipo celular nas Tabelas E1-E6.

5/74

[0015] Certas composições terapêuticas são para uso no tratamento de um câncer em um indivíduo que precise dele. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor epitelial maligno ou carcinoma.

[0016] Também estão incluídos kits de cuidados ao paciente, compreendendo uma combinação de dois ou mais agentes selecionados a partir de: (a) um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); (b) um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e (c) um inibidor da quinase dependente da ciclina (CDK) 4/6.

[0017] Certos kits compreendem a combinação de (a) e (b), opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição. Alguns kits compreendem a combinação de (a) e (c), opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição. Certos kits compreendem a combinação de (a), (b) e (c), opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição.

Rápida descrição dos desenhos

[0018] A Figura 1 mostra imagens de células tumorais epiteliais derivadas de pacientes após exposição a agentes ou combinações de agentes.

Descrição detalhada

[0019] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que comumente compreendidos por aqueles 6/74 versados na técnica a qual pertence essa divulgação. Embora os métodos, materiais, composições, reagentes, células, similares ou similares equivalentes ou equivalentes aos aqui descritos, possam ser utilizados na prática ou testados da matéria da presente divulgação, os métodos e materiais preferidos estão descritos neste documento. Todas as publicações e referências, incluindo, mas não limitadas a patentes e pedidos de patente, citadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência em sua totalidade como se cada publicação ou referência individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência aqui como sendo totalmente estabelecida. Qualquer pedido de patente ao qual este pedido reivindica prioridade também é incorporado por referência a este documento em sua totalidade, na forma descrita acima para publicações e referências.

[0020] Podem ser usadas técnicas-padrão para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídios e a cultura e transformação de tecido (p. ex., eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação podem ser feitas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente feitas na técnica ou como descrito neste documento. Essas e outras técnicas e procedimentos relacionados podem ser geralmente executados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação. Exceto se forem fornecidas definições específicas, a nomenclatura usada junto com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, biologia molecular, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos aqui são aqueles bem 7/74 conhecidos e comumente usados na técnica. Podem ser usadas técnicas padrão para tecnologia recombinante, biologia molecular, microbiologia, sínteses químicas e análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, distribuição e tratamento dos pacientes.

[0021] Para efeitos da presente divulgação, são definidos os seguintes termos abaixo.

[0022] Os artigos “um/uma” são usados aqui para se referir a um ou mais de um (ou seja, pelo menos um) objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[0023] Por “cerca de” entende-se uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia tanto quanto 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% para uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.

[0024] O termo “antígeno” refere-se a uma molécula ou a uma parte de uma molécula capaz de ser ligada por um agente ligante seletivo, como um anticorpo e além disso, ser capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de se ligar a um epítopo desse antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos. Como usado neste documento, o termo “antígeno” inclui substâncias capazes, sob condições adequadas, a induzir uma resposta imune à substância e de reagir com os produtos da resposta imune. Por exemplo, um antígeno pode ser reconhecido por anticorpos (resposta imune humoral) ou linfócitos T sensibilizados (resposta imune mediada por células ou linfócitos T auxiliares) ou ambos. Os antígenos podem ser substâncias solúveis, como toxinas e proteínas estranhas ou 8/74 particuladas, como bactérias e células do tecido; no entanto, apenas uma parte da proteína ou molécula de polissacarídeo conhecida como determinante antigênico (epítopos) se combina com o anticorpo ou um receptor específico em um linfócito. De forma mais ampla, o termo “antígeno” inclui qualquer substância à qual um anticorpo se liga, ou para o qual os anticorpos são projetados, independentemente da substância ser imunogênica ou não. Para tais antígenos, os anticorpos podem ser identificados por métodos recombinantes, independentemente de qualquer resposta imune.

[0025] Um “antagonista” ou “inibidor” refere-se um agente biológico ou químico que interfere ou reduz de outra forma a ação fisiológica de outro agente ou molécula. Em alguns casos, o antagonista liga-se especificamente ao outro agente ou molécula. Estão incluídos os antagonistas e inibidores totais e parciais.

[0026] Um “agonista” refere-se a uma estrutura biológica ou agente químico que aumenta ou potencializa a ação fisiológica de outro agente ou molécula. Em alguns casos, o agonista liga-se especificamente ao outro agente ou molécula. Estão incluídos os agonistas totais e parciais.

[0027] Como usado neste documento, o termo “aminoácido” pretende significar ambos aminoácidos naturais e não naturais, assim como análogos e miméticos de aminoácidos. Os aminoácidos naturais incluem os 20 (L)-aminoácidos usados durante a biossíntese de proteínas, assim como outros como 4- hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina e ornitina, por exemplo. Os aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, (D)- aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, 9/74 etionina e similares, que são conhecidos por aqueles que são versados na técnica. Os análogos de aminoácidos incluem formas modificadas dos aminoácidos naturais e não naturais. Tais modificações podem incluir, por exemplo, substituição ou troca de grupos químicos e porções no aminoácido ou por derivatização do aminoácido. Os miméticos de aminoácidos incluem, por exemplo, estruturas orgânicas que apresentam propriedades similares funcionais, como a carga e o espaçamento de carga característicos do aminoácido de referência. Por exemplo, uma estrutura orgânica que mimetiza a arginina (Arg ou R) teria uma porção de carga positiva localizada num espaço molecular e tendo o mesmo grau de mobilidade que o grupo e-amino da cadeia lateral do aminoácido Arg natural. Os miméticos também incluem estruturas restritas de modo a manter o espaçamento ideal e as interações de carga do aminoácido ou dos grupos funcionais do aminoácido. Aqueles versados na técnica sabem ou podem determinar quais estruturas constituem os análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.

[0028] Como usado neste documento, um indivíduo “em risco” de desenvolver uma doença ou reação adversa pode ou não ter doença detectável ou sintomas da doença e pode ou não ter apresentado doença detectável ou sintomas da doença antes dos métodos de tratamento descritos neste documento. A expressão “em risco” significa que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento de uma doença, como descritos neste documento e conhecidos na técnica. Um indivíduo com um ou mais destes fatores de risco tem maior probabilidade de desenvolver 10/74 uma doença ou uma reação adversa do que um indivíduo sem um ou mais deste(s) fator(es) de risco.

[0029] O termo “biocompatível” refere-se a materiais ou compostos que geralmente não são prejudiciais para as funções biológicas de uma célula ou indivíduo e que não resultarão em qualquer grau de toxicidade inaceitável, incluindo quadros alergênicos e de doenças.

[0030] O termo “ligação” refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido a, por exemplo, interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iônicas e/ou pontes de hidrogênio, incluindo interações como pontes salinas e pontes de água.

[0031] Ao longo desta divulgação, exceto se o contexto exigir o contrário, as palavras “compreender”, “compreende” e “compreendendo” serão entendidas como implicando a inclusão de uma determinada etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos.

[0032] A expressão “consistindo em” significa incluir e limitando-se ao que se segue a expressão “consistindo em”. Assim, a expressão “consistindo em” indica que os elementos listados são exigidos ou obrigatórios e que não pode estar presente nenhum outro elemento. A expressão “consistindo essencialmente em” significa incluir quaisquer elementos listados após a expressão e limitado a outros elementos que não interfiram na ou contribuam para a atividade ou ação especificadas na divulgação dos elementos enumerados. Assim, a expressão “constituído essencialmente por” indica que os elementos enumerados são exigidos ou obrigatórios, mas que outros elementos são facultativos e podem ou não estar 11/74 presentes dependendo se eles afetam materialmente ou não atividade ou ação dos elementos enumerados.

[0033] O termo “isento de endotoxinas” ou “substancialmente isento de endotoxinas” refere-se a composições, solventes e/ou recipientes que contêm no máximo quantidades traço (p. ex., quantidades sem efeitos fisiológicos clinicamente adversos a um indivíduo) de endotoxinas e de preferência, quantidades indetectáveis de endotoxinas. As endotoxinas são toxinas associadas a certos microrganismos, como as bactérias, tipicamente as bactérias gram-negativas, embora as endotoxinas possam ser encontradas em bactérias gram-positivas, como a Listeria monocytogenes. As endotoxinas mais prevalentes são os lipopolissacarídeos (LPS) ou os lipo-oligossacarídeos (LOS) encontrados na membrana externa de várias bactérias gram-negativas e que representam uma característica patogênica central na capacidade dessas bactérias de provocar doenças. Pequenas quantidades de endotoxina em humanos podem produzir febre, redução na pressão arterial e ativação da inflamação e coagulação, entre outros efeitos fisiológicos adversos.

[0034] Portanto, muitas vezes é desejável remover a maioria ou todos os traços de endotoxina de medicamentos e/ou recipientes de medicamentos, na indústria farmacêutica, porque mesmo pequenas quantidades podem causar efeitos adversos nos humanos. Pode ser usada uma estufa de despirogenação para este fim, pois são necessárias temperaturas tipicamente superiores a 300 °C para decompor a maioria das endotoxinas. Por exemplo, com base em material de embalagem primário como seringas ou frascos, a combinação de uma temperatura do vidro de 250 °C e um tempo de retenção de 30 minutos é suficiente, na maioria dos casos, para 12/74 alcançar uma redução de 3 log nos níveis de endotoxinas. São contemplados outros métodos de remoção de endotoxinas, incluindo, por exemplo, cromatografia e métodos de filtração, como descritos nestes documentos e conhecidos na técnica.

[0035] As endotoxinas podem ser detectadas usando técnicas de rotina conhecidas na técnica. Por exemplo, o ensaio de lisado de Limulus Amoebocyte, que usa o sangue do caranguejo ferradura, é um ensaio muito sensível para detectar a presença de endotoxinas. Neste teste, níveis muito baixos de LPS podem causar uma coagulação detectável do lisado do Limulus devido a uma potente cascata enzimática que amplifica esta reação. As endotoxinas também podem ser quantificadas através do ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Para ser substancialmente isento de endotoxinas, os níveis de endotoxinas podem ser inferiores a cerca de 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 EU/mg do composto ativo. Tipicamente, 1 ng de lipopolissacarídeo (LPS) corresponde a cerca de 1-10 EU.

[0036] O termo “meia concentração máxima eficaz” ou “EC50” refere-se a concentração de um agente (por exemplo, pequena molécula, anticorpo), como descrito no presente documento, na qual ele induz uma resposta a meio caminho entre o valor inicial e o máximo após algum tempo de exposição especificado; o EC50 de uma curva de resposta à dose calibrada representa a concentração de um composto à qual se observa 50% de seu efeito máximo. EC50 também representa a concentração plasmática necessária para obter 50% de um efeito máximo in vivo. De forma similar, o “EC90” refere-se à concentração de um agente ou composição na qual é observado 90% do seu efeito 13/74 máximo. O “EC90” pode ser calculado a partir do “EC50” e do coeficiente de Hill ou pode ser determinado diretamente a partir dos dados, usando o conhecimento de rotina usado na técnica. Em algumas modalidades, o EC50 de um agente (p. ex., pequena molécula, anticorpo) é inferior a cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 ou 500 nM. Em algumas modalidades, um agente terá um valor EC50 de cerca de 1 nM ou menos.

[0037] A “meia-vida” de um agente pode se referir ao tempo necessário para que o agente perca metade de sua atividade farmacológica, fisiológica ou outra atividade, em relação a tal atividade no momento da administração no soro ou tecido de um organismo, ou em relação a qualquer outro tempo definido. A “meia-vida” pode também referir-se ao tempo necessário para que a quantidade ou concentração de um agente possa ser reduzida pela metade de uma quantidade inicial administrada no soro ou tecido de um organismo, em relação a tal quantidade ou concentração no momento da administração no soro ou tecido de um organismo ou em relação a qualquer tempo definido. A meia-vida pode ser medida no soro e/ou em um ou mais tecidos selecionados.

[0038] Os termos “modular” e “alterar” incluem “aumentar”, “potencializar”, ou “estimular” assim como “diminuir” ou “reduzir”, tipicamente em uma quantidade ou grau estatística ou fisiologicamente importante em relação a um controle. Uma quantidade “aumentada”, “estimulada” ou “potencializada” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente importante” e pode incluir um aumento de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 14/74

60, 70, 80, 90, 100 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e intervalos entre, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) a quantidade produzida pela ausência de composição (p. ex., na ausência de agente) ou de uma composição do controle. Uma quantidade “diminuída” ou “reduzida” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente importante” e pode incluir uma redução de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% (incluindo todos os números inteiros e intervalos entre eles) na quantidade produzida por nenhuma composição (p. ex., na ausência de um agente) ou de uma composição do controle. Os exemplos de comparações e valores “estatisticamente importantes” estão descritos neste documento.

[0039] Os termos “polipeptídio”, “proteína” e “peptídio” são utilizados indistintamente e significam um polímero de aminoácidos que não se limita a um comprimento específico. O termo “enzima” inclui catalisadores polipeptídios ou proteínas. Os termos incluem modificações como miristoilação, sulfatação, glicosilação, fosforilação e adição ou deleção de sequências sinalizadoras. Os termos “polipeptídio” ou “proteína” significam um ou mais cadeias de aminoácidos, nas quais cada cadeia compreende aminoácidos ligados, de forma covalente, por ligações peptídicas e onde o polipeptídio ou a proteína em questão pode compreende uma pluralidade de cadeias unidas, de forma covalente, ou não por ligações peptídicas, com a sequências de proteínas nativas, ou seja, proteínas produzidas pelo processo natural ou especificamente células não recombinantes ou células 15/74 geneticamente modificadas ou recombinantes e compreendem moléculas com a sequências de aminoácidos da proteína nativa ou moléculas com deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Em certas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio “recombinante”, produzido pela célula recombinante que compreende uma ou mais moléculas de DNA recombinante, que são tipicamente feitas de sequências heterólogas de polinucleotídios ou combinações de sequências de polinucleotídios que não seriam encontradas na célula.

[0040] O termo polipeptídio ou proteína “isolado/a” citado neste documento significa que uma proteína em questão (1) está livre de pelo menos outras proteínas com as quais ela seria tipicamente encontrada na natureza, (2) está essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, p. ex., da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos 50 por cento de polinucleotídios, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais está associada na natureza, (5) não está associada (por interação covalente ou não covalente) com partes de uma proteína com a qual a “proteína isolada” está associada na natureza, (6) está operacionalmente associada (por interação covalente ou não covalente) a uma polipeptídio com o qual não está associada na natureza ou (7) não ocorre na natureza. Tal proteína isolada pode ser codificada por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética ou qualquer combinação destes. Em certas modalidades, a proteína isolada está substancialmente livre de proteínas ou polipeptídios ou outros contaminantes encontrados na natureza que interfeririam com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou não).

16/74

[0041] Em certas modalidades, pode ser definida a “pureza” de um determinado agente (por exemplo, anticorpo, pequena molécula) em uma composição. Por exemplo, certas composições podem incluir um agente como um agente polipeptídico que tenha pureza de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% numa base proteica ou peso-peso, incluindo todas as casas decimais e intervalos intermediários, como medidos, por exemplo e em hipótese alguma, limitante, por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), uma forma bem conhecida de cromatografia em coluna usada frequentemente em bioquímica e química analítica para separar, identificar e quantificar os compostos.

[0042] O termo “solubilidade” refere-se à propriedade de um agente (por exemplo, anticorpo, pequena molécula) fornecido neste documento em se dissolver em um solvente líquido e formar uma solução homogênea. A solubilidade é normalmente expressa em concentração, tanto por massa de soluto por unidade de volume de solvente (g de soluto por kg de solvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridade, molalidade, fração molar ou outras descrições de concentração similares. A quantidade máxima de equilíbrio do soluto que pode se dissolver por quantidade de solvente é a solubilidade desse soluto naquele solvente sob condições específicas, incluindo temperatura, pressão, pH e a natureza do solvente. Em certas modalidades, a solubilidade é medida em pH fisiológico ou outro pH, por exemplo, pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0, pH 7,4, pH 7,6, pH 7,8 ou pH 8,0 (p. ex., em torno de pH 5 a 8). Em certas modalidades, a solubilidade é medida em água ou em um tampão fisiológico, como PBS ou o NaCl (com ou sem NaP). Em modalidades específicas, a solubilidade é medida com pH 17/74 relativamente menor (p. ex., pH 6,0) e concentração de sal relativamente maior (p. ex., 500 mM de NaCl e 10 mM de NaP). Em certas modalidades, a solubilidade é medida em um fluido biológico (solvente), como sangue ou soro. Em certas modalidades, a temperatura pode estar em torno da temperatura ambiente (p. ex., em torno de 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) ou temperatura corporal (37 °C). Em certas modalidades, um agente tem uma solubilidade de pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/ml à temperatura ambiente ou a 37 °C.

[0043] Um “indivíduo” ou “indivíduo em necessidade disso” ou um “paciente” ou um “paciente em necessidade disso” inclui um indivíduo mamífero como o indivíduo humano.

[0044] “Substancialmente” ou “essencialmente” significam quase total ou completamente, por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior de alguma quantidade fornecida.

[0045] “Estatisticamente significativo” significa que era improvável que o resultado tivesse ocorrido por acaso. A estatística pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. As medidas de significância comumente usadas incluem o valor-p, que é a frequência ou probabilidade com que o evento observado ocorreria, se a hipótese nula fosse verdadeira. Se o valor-p obtido for menor que o nível de significância, então a hipótese nula é rejeitada. Em casos simples, o nível de significância é definido com um valor-p de 0,05 ou menos.

[0046] A “resposta terapêutica” refere-se à melhoria dos sintomas (sustentados ou não) com base na administração de um ou mais agentes terapêuticos.

18/74

[0047] Como usado neste documento, os termos “quantidade terapeuticamente eficaz”, “dose terapêutica”, “quantidade profilaticamente eficaz” ou “quantidade diagnosticamente eficaz” é a quantidade de um agente (por exemplo, anticorpo, molécula pequena) necessária para obter a resposta biológica desejada após a administração.

[0048] Como usado neste documento, “tratamento” de um indivíduo (p. ex., mamífero, como um humano) ou uma célula é qualquer tipo de intervenção usada em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célula. O tratamento inclui, mas não está limitado a, administração de uma composição farmacêutica e pode ser feito profilaticamente ou após o início de um evento patológico ou contato com um agente etiológico. Também estão incluídos os tratamentos “profiláticos”, que podem ser direcionados para reduzir a taxa de progressão da doença ou condição a ser tratada, retardando o início dessa doença ou condição ou reduzindo a gravidade do seu início. O “tratamento” ou a “profilaxia” não indicam necessariamente a erradicação, cura ou prevenção completas da doença ou condição ou dos seus sintomas associados.

[0049] O termo “tipo selvagem” refere-se a um gene ou produto do gene (p. ex., um polipeptídio) que é observado com maior frequência em uma população e por isso é arbitrariamente projetado como a forma “normal” ou “tipo selvagem” do gene.

[0050] Cada modalidade nesta especificação deve ser aplicada a todas as outras modalidades, salvo indicação expressa em contrário.

19/74

Vias e agentes

[0051] Certas modalidades empregam uma combinação de dois ou mais agentes que inibem ou antagonizam a atividade do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), a atividade da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e/ou a atividade da quinase dependente de ciclina (CDK) 4/6. Os exemplos gerais de tais agentes incluem pequenas moléculas e anticorpos (ou fragmentos de ligação ao antígeno), que são descritos com mais detalhes neste documento.

[0052] EGFR. O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; ErbB-1; HER1 em humanos) é uma proteína transmembrana que atua como um receptor para membros da família do fator de crescimento epidérmico (família EGF) de ligantes de proteínas extracelulares. O EGF é um fator de crescimento que estimula o crescimento, a proliferação e diferenciação celular ao se ligar ao seu receptor EGFR. O EGF humano é uma proteína de 6-kDa com 53 resíduos de aminoácidos e três pontes dissulfeto intramoleculares. O EGF atua ao se ligar com alta afinidade ao EGFR na superfície celular. Isso estimula a dimerização induzida por ligante, que ativa a atividade intrínseca da proteína tirosina quinase do receptor. A atividade da tirosina quinase então inicia uma cascata de transdução sinalizadora que resulta em uma variedade de alterações bioquímicas dentro da célula, incluindo um aumento nos níveis de cálcio intracelular, aumento da glicólise e síntese proteica e aumento da expressão de certos genes, incluindo os envolvidos na síntese de DNA e na proliferação celular.

[0053] As mutações que levam à superexpressão ou atividade excessiva estão associadas a uma variedade de cânceres, incluindo carcinoma de células escamosas do pulmão, 20/74 cânceres anais, glioblastoma e tumores epiteliais da cabeça e pescoço, entre outros. Assim, em certas modalidades, o agente inibe uma atividade do EGFR ou uma via regulada pelo EGFR.

[0054] Por exemplo, em certas modalidades, o agente é um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao EGFR, que se liga especificamente ao domínio de ligação do ligante extracelular do EGFR e, opcionalmente, inibe ou reduz a ligação de ligantes estimulantes ou moléculas sinalizadoras como EGF. Os anticorpos anti-EGFR ilustrativos estão descritos, por exemplo, nas U.S Patentes Nos. 5.844.093; 7.132.511;

7.247.301; 7.595.378; 7.723.484; 7.939.072; e 7.960.516, que são incorporados por referência. Exemplos específicos não limitantes de anticorpos inibidores do EGFR incluem cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe e matuzumabe e fragmentos ou variantes destes. Em modalidades específicas, o anticorpo é o cetuximabe (Erbitux®) ou um fragmento ou variante deste. O cetuximabe é composto de regiões Fv (variável; ligação de antígenos) do anticorpo monoclonal EGFR murino 225 específico para a porção N-terminal do EGFR humano com as regiões constantes (arcabouço) de cadeia pesada IgG1 e cadeia leve kappa humano.

[0055] Também estão incluídos os inibidores de pequenas moléculas do EGFR, por exemplo, inibidores da tirosina quinase da atividade quinase do EGFR. Os exemplos não limitantes de pequenas moléculas inibidoras do EGFR incluem erlotinibe, gefitinibe, afatinibe, lapatinibe, osimertinibe, brigatinibe e icotinibe. Assim, em certas modalidades, o inibidor de EGFR é qualquer um ou mais dos anticorpos ou pequenas moléculas acima mencionadas.

21/74

[0056] MEK 1/2. As cascatas da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) são vias de sinalização críticas envolvidas na regulação da proliferação, sobrevida e diferenciação das células normais. A regulação aberrante das cascatas da MAPK contribui para o câncer e outras doenças em humanos. Em particular, a via MAPK da quinase regulada por sinal extracelular (ERK) está envolvida em muitos cânceres como um alvo terapêutico. A ERK é um componente a jusante de um módulo de sinalização evolutivamente conservado que é ativado pelas quinases Raf para serina/treonina. A Raf ativa as proteínas quinases de dupla especificidade MAPK/ERK quinase (MEK) 1/2, que então ativa a ERK 1/2. A ativação mutacional da Raf em cânceres em humanos reforça o importante papel desta via na oncogênese humana. Além disso, a via Raf-MEK-ERK é um importante efetor a jusante da Ras pequena GTPase, o oncogene mutado mais frequentemente em cânceres em humanos. Por fim, a Ras é um fator chave a jusante do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que é ativado e/ou superexpresso mutado em uma ampla variedade de cânceres em humanos. A ativação da ERK também promove a expressão superregulada de ligantes do EGFR, promovendo um ciclo de crescimento autócrino crítico para o crescimento do tumor.

[0057] Assim, certas modalidades são direcionadas para modular (p. ex., inibir) a via de sinalização EGFR-Ras-Raf- MEK-ERK, por exemplo, ao inibir as proteínas quinases de dupla especificidade MEK 1/2. Algumas modalidades, portanto, incluem pequenas moléculas que inibem MEK1 e/ou MEK2. Os exemplos não limitantes de inibidores de pequenas moléculas MEK 1/2 incluem trametinibe, selumetinibe, cobimetinibe e binimetinibe. Exemplos adicionais de inibidores MEK1 e MEK2 são descritos, 22/74 por exemplo, no Pedido US Nº. 2009/0124595; Pedido US Nº. 2009/0246198; e Pedido US Nº. 2010/0004234, que são incorporados por referência.

[0058] CDK 4/6. As quinases dependentes da ciclina (CDKs) são uma família de proteínas quinase que desempenham um papel na regulação do ciclo celular. CDK4 e CDK6 regulam a progressão de fase G1 do ciclo celular e a transição da fase G1/S do ciclo celular. Foi demonstrado que CDK4 e CDK6 fosforilam e assim regulam a atividade da proteína supressora do tumor retinoblastoma e são superexpressas ou de outra forma desequilibradas em uma variedade de tumores. Por exemplo, a superexpressão de CDK4 e CDK6 pode fornecer às células cancerosas certas características do câncer, incluindo a desregulação do ciclo celular e do metabolismo celular.

[0059] Assim, certas modalidades são direcionadas para modular (p. ex., inibir) as vias CDK 4/6-reguladas, por exemplo, ao inibir as quinases CDK4 e/ou CDK6. Estão incluídos agentes que inibem a capacidade ou atividade da CDK 4/6 em fosforilar um resíduo de serina ou treonina nas proteínas, ou inibem a interação da CDK 4/6 com outras proteínas/ligantes que estão envolvidas na via de sinalização. CDK4 e CDK6 formam um complexo com Ciclina D para regular a progressão do ciclo celular da fase G1 para a fase S. Foi demonstrado que CDK4 interage com o retinoblastoma (Rb), CDC37, CDKN1B, CDKN2B, CDKN2C, CEBPA, CCND1, CCND3, DBNL, MyoD, P16, PCNA e SERTAD1. Foi demonstrado que CDK6 interage com retinoblastoma (RB), CDKN2C, PPM1B, Ciclina D3, Ciclina D1 e PPP2CA. Assim, em certas modalidades, o inibidor de CDK 4/6 reduz a interação de CDK4 e/ou CDK6 com qualquer uma ou mais das proteínas ou ligantes anteriores.

23/74

[0060] Algumas modalidades, portanto, incluem pequenas moléculas que inibem CDK4 e/ou CDK6. Os exemplos não limitantes de inibidores de CDK 4/6 incluem ribociclibe, abemaciclibe e palbociclibe. Exemplos adicionais de inibidores de CDK 4/6 são descritos, por exemplo, em WO 2007/140222; WO 2010/020675 e Pedido US Nº. 2013/0035336, que são incorporados por referência.

[0061] Anticorpos. Em algumas modalidades, como mencionado acima, o agente é um anticorpo ou “fragmento de ligação a antígenos”. O anticorpo ou fragmento de ligação a antígenos pode ser praticamente de qualquer tipo. Como é bem conhecido na técnica, um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar especificamente a um alvo através de pelo um local de reconhecimento de epítopo, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Em certas modalidades, o alvo é EGFR (por exemplo, o domínio de ligação de ligantes do EGFR), EGR, MEK1, MEK2, CDK4, CDK6 ou qualquer combinação destes ou qualquer ligante destes. Em certas modalidades, um anticorpo se liga especificamente a um alvo descrito neste documento com uma afinidade de ligação (Kd) de cerca de pelo menos, ou mesmo do que 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 ou 50 nM. Em certas modalidades, um anticorpo (ou fragmento de ligação a antígenos deste) se liga especificamente e/ou inibe EGFR, MEK1, MEK2, CDK4, CDK6 ou qualquer combinação destes, incluindo qualquer ligante destes (p. ex., EGR), como descrito no presente documento e conhecido na técnica.

24/74

[0062] Tal como usado no presente documento, o termo “anticorpo” abrange não só anticorpos policlonais ou monoclonais, mas também fragmentos destes (como dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv), variantes sintéticas destes, variantes naturais, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo com um fragmento de ligação ao antígeno da especificidade exigida, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um local ou fragmento de ligação ao antígeno (local de reconhecimento de epítopos) com a especificidade exigida. Determinados recursos e características dos anticorpos (e respectivos fragmentos de ligação a antígenos) estão descritos neste documento com mais detalhes.

[0063] O termo “fragmento de ligação ao antígeno” como usado neste documento refere-se a um fragmento de polipeptídio que contém pelo menos um CDR de uma cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina que se liga ao antígeno de interesse. Neste caso, um fragmento de ligação a antígeno dos anticorpos descritos neste documento pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, ou todos os 6 CDRs de uma sequência VH e VL de anticorpos que se ligam a uma molécula alvo.

[0064] O termo “antígeno” refere-se a uma molécula ou a uma parte de uma molécula capaz de ser ligada por um agente ligante seletivo, como um anticorpo e além disso, ser capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de se ligar a um epítopo desse antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos.

[0065] O termo “epítopo” inclui qualquer determinante, de preferência um determinante do polipeptídio, capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou a um receptor de 25/74 células T. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Em certas modalidades, os determinantes do epítopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativos, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforil ou sulfonil e pode em certas modalidades ter características estruturais tridimensionais e/ou características de carga específicas. Os epítopos podem ser contíguos ou não contíguos em relação a estrutura primária do antígeno.

[0066] Diz-se que uma molécula como um anticorpo exibe “ligação específica” ou “ligação preferencial” se ela reage ou associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma determinada célula ou substância do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo “liga-se especificamente” ou “liga-se preferencialmente” a um alvo se ligar-se com maior afinidade, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias, por exemplo, por uma quantidade estatisticamente significativa. Por exemplo, um anticorpo que se liga especifica ou preferencialmente a um epítopo específico é um anticorpo que se liga a esse epítopo específico com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos. Entende-se também ao ler essa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou parte ou epítopo) que se liga de forma específica ou preferencial a um primeiro alvo pode ou não se ligar de forma específica ou preferencial a um segundo alvo. Como tal, “ligação específica” ou “ligação preferencial” não exige necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Em geral, mas não necessariamente, a referência a ligação significa ligação preferencial.

26/74

[0067] A ligação imunológica refere-se em geral a interações não covalentes do tipo que ocorrem entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica, por exemplo, a título de ilustração e não limitação, como um resultado de atrações eletrostáticas, iônicas, hidrofílicas e/ou hidrofóbicas ou repulsão, forças estéricas ou pontes de hidrogênio, forças de van der Waals e outras interações. A força ou afinidade das interações de ligação imunológica pode ser expressa em termos da constante de dissociação (Kd) da interação, onde um Kd menor representa uma maior afinidade. As propriedades de ligação imunológica dos polipeptídios podem ser quantificadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Um desses métodos consiste em medir as taxas de formação e dissociação de sítios de ligação a antigênos/formação e dissociação de complexos de antígenos, onde essas taxas dependem das concentrações dos parceiros, da afinidade de interação e dos parâmetros geométricos que influenciam igualmente a taxa em ambas as direções. Assim, a “constante de taxa ligada” (Kon) e a “constante de taxa desligada” (Koff) podem ser determinadas pelo cálculo das concentrações e as taxas reais de associação e dissociação. A razão Koff /Kon permite o cancelamento de todos parâmetros não relacionados à afinidade, sendo assim igual à constante de dissociação Kd.

[0068] Os anticorpos podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Ver, p. ex., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Foram preparados anticorpos monoclonais específicos para um polipeptídio de interesse, por exemplo, ao usar a técnica de 27/74

Kohler e Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976 e melhorias para isso. Também estão incluídos os métodos que usam animais transgênicos como camundongos para expressar anticorpos humanos. Ver, p. ex., Neuberger et al., Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg et al., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994 e Lonberg et al., Internal Review of Immunology 13:65-93, 1995. Os exemplos particulares incluem a plataforma VELOCIMMUNE® da REGENEREX® (ver, p. ex., Patente U.S. Nº. 6.596.541).

[0069] Os anticorpos também podem ser gerados ou identificados com o uso de bibliotecas de exibição de fagos ou de exibição de leveduras (ver, p. ex., Patente U.S. Nº.

7.244.592; Chao et al., Nature Protocols. 1:755-768, 2006). Os exemplos não limitantes das bibliotecas disponíveis incluem as bibliotecas clonadas ou sintéticas como a Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL), nas quais a diversidade estrutural do repertório de anticorpos humanos é representada por sete genes de cadeia leve com região variável. A combinação destes genes dá origem a 49 quadros na biblioteca principal. Ao sobrepor os cassetes genéticos altamente variáveis (CDRs = regiões determinantes da complementaridade) nestes quadros, pode ser reproduzido o vasto repertório de anticorpos humanos. Também estão incluídas as bibliotecas humanas projetadas com fragmentos oriundos de doadores humanos que codificam uma região variável de cadeia leve, um CDR-3 de cadeia pesada, o DNA sintético que codifica uma diversidade no CDR-1 de cadeia pesada e o DNA sintético que codifica diversidade no CDR-2 de cadeia pesada. Outras bibliotecas apropriadas para uso serão aparentes para aqueles versados na técnica.

28/74

[0070] Em certas modalidades, os anticorpos e os fragmentos ligantes a antígenos destes como descritos neste documento incluem um conjunto de CDR de cadeia pesada e um de cadeia leve, respectivamente interpostos entre uma cadeia de região do quadro (FR) de cadeia pesada e cadeia leve que fornecem suporte para os CDRs e definem a relação espacial dos CDR entre si. Como usado neste documento, o termo “conjunto CDR” refere-se a três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. A partir do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são designadas como “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, respectivamente. Um local de ligação para antígenos, portanto, inclui seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDRs de cada uma das regiões V de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Um polipeptídio compreendendo um único CDR (por exemplo, CDR1, CDR2 ou CDR3) é chamado aqui de “unidade de reconhecimento molecular”. A análise cristalográfica de vários complexos antígeno-anticorpo demonstrou que os resíduos de aminoácidos dos CDR formam extenso contato com o antígeno ligado, onde o contato com antígeno mais extenso é com o CDR3 de cadeia pesada. Assim, as unidades de reconhecimento molecular são as principais responsáveis pela especificidade de um local de ligação ao antígeno.

[0071] Como usado neste documento, o termo “conjunto FR” refere-se às quatro sequências de aminoácidos flanqueadoras que enquadram os CDR de um conjunto de CDR de uma região V de cadeia pesada ou leve. Alguns resíduos FR podem entrar em contato com o antígeno ligado; no entanto, os FRs são os principais responsáveis pela dobra da região V no local de ligação ao antígeno, em particular, os resíduos de FR diretamente adjacentes aos CDRs. Dentro dos FRs, alguns 29/74 resíduos aminados e certas características estruturais estão muito bem conservados. Neste caso, todas as sequências de regiões V contêm uma ponte dissulfeto interna de cerca de 90 resíduos de aminoácidos. Quando as regiões V se dobram em um local de ligação ao antígeno, os CDRs são exibidos como motifs de projeção da ponte que formam uma superfície de ligação ao antígeno. É geralmente reconhecido que existem regiões estruturais conservadas dos FRs que influenciam a forma dobrada dos laços de CDR em certas estruturas “canônicas”– independentemente da sequência precisa de aminoácidos do CDR. Além disso, alguns resíduos de FR são conhecidos por participarem de contatos interdomínios não covalentes que estabilizam a interação das cadeias pesada e leve do anticorpo.

[0072] As estruturas e localizações dos domínios variáveis das imunoglobulinas podem ser determinadas por referência a Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4ª edição. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, 1987 e suas atualizações.

[0073] Também estão incluídos os anticorpos “monoclonais”, que se referem à população homogênea de anticorpos onde o anticorpo monoclonal é constituído por aminoácidos (naturais e não naturais) que estão envolvidos na ligação seletiva de um epítopo. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único epítopo. O termo “anticorpo monoclonal” abrange não só anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento total, mas também os fragmentos destes [tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv], cadeia única (ScFv), variantes destes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação a antígeno, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos 30/74 monoclonais quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um fragmento de ligação a antígeno (local de reconhecimento de epítopos) com a especificidade necessária e a capacidade de se ligar a um epítopo. Não se pretende ser limitado no que diz respeita à origem do anticorpo ou à forma como ele é produzido (por exemplo, por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante, animais transgênicos). O termo inclui as imunoglobulinas totais assim como os fragmentos etc., descritos acima na definição de “anticorpo”.

[0074] A enzima proteolítica da papaína cliva preferencialmente moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) cada um compõe um heterodímero covalente que inclui um local de ligação ao antígeno. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab’)2 que compreende ambos os locais de ligação a antígeno. Um fragmento Fv para uso de acordo com certas modalidades da presente invenção pode ser produzido por clivagem proteolítica de um IgM e, em raras ocasiões, de uma molécula de imunoglobulina IgG ou IgA. Entretanto, é mais comum derivar os fragmentos Fv usando as técnicas recombinantes conhecidas na técnica. O fragmento Fv inclui um heterodímero VH::VL não covalente incluindo um local de ligação ao antígeno que retém grande parte do reconhecimento de antígenos e capacidades de ligação da molécula do anticorpo. Ver Inbar et al., PNAS USA. 69:2659-2662, 1972; Hochman et al., Biochem. 15:2706-2710, 1976; e Ehrlich et al., Biochem. 19:4091-4096, 1980.

31/74

[0075] Em certas modalidades, são contemplados os anticorpos Fv ou scFV de cadeia única. Por exemplo, corpos Kappa (Ill et al., Prot. Eng. 10:949-57, 1997); minicorpos (Martin et al., EMBO J 13:5305-9, 1994); diabodies (Holliger et al., PNAS 90: 6444-8, 1993); ou Janusinas (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-59, 1991; e Traunecker et al., Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52, 1992), podem ser preparados usando técnicas de biologia molecular seguindo os ensinamentos do presente pedido com relação à seleção de anticorpos com a especificidade desejada.

[0076] Um polipeptídio Fv (sFv) de cadeia única é um heterodímero VH::VL covalentemente ligado que é expresso a partir de uma fusão de genes incluindo genes que codificam os VH e VL ligados por um ligante de codificação de peptídios. Huston et al. (PNAS USA. 85(16):5879-5883, 1988). Foram descritos vários métodos para discernir as estruturas químicas para converter as cadeias de polipeptídios leve e pesada naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas, de uma região V do anticorpo em uma molécula sFv que se dobrará numa estrutura tridimensional muito similar à estrutura do sítio de ligação ao antígeno. Ver, p. ex., U.S. Pat. Nos. 5.091.513 e 5.132.405, a Huston et al. e U.S. Pat. No. 4.946.778, a Ladner et al.

[0077] Em certas modalidades, um anticorpo como descrito neste documento está na forma de um “diabody”. Os diabodies são multímeros de polipeptídios, cada polipeptídio compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um segundo domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, os dois domínios ligados (por exemplo, por um ligante de peptídio), mas incapazes de se associarem entre si para formar um sítio de 32/74 ligação ao antígeno: os sítios de ligação ao antígeno são formados pela associação do primeiro domínio de um polipeptídio dentro de um multímero com o segundo domínio de outro polipeptídio dentro do multímero (WO94/13804). Um fragmento dAb de um anticorpo consiste em um domínio VH (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989). Os diabodies e outros fragmentos multivalentes ou multiespecíficos podem ser construídos, por exemplo, por fusão gênica (ver WO94/13804; e Holliger et al., PNAS USA. 90:6444-6448, 1993)).

[0078] Os minicorpos compreendendo um scFv unido a um domínio CH3 também estão incluídos (ver Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996). Ver também Ward et al., Nature. 341:544- 546, 1989; Bird et al., Science. 242:423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA. 85:5879-5883, 1988); PCT/US92/09965; WO94/13804 e Reiter et al., Nature Biotech. 14:1239-1245, 1996.

[0079] Onde os anticorpos biespecíficos convencionais devem ser usados, eles podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados de várias formas (Holliger e Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 1993), p. ex., preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Os diabodies e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos da reação anti-idiotípica.

[0080] Os diabodies biespecíficos, ao contrário dos anticorpos totais biespecíficos, também podem ser particularmente úteis porque podem ser construídos com facilidade e ser expressos na E. coli. Os diabodies (e muitos outros polipeptídios, como os fragmentos de anticorpos) de 33/74 especificidades de ligação adequadas podem ser facilmente selecionados usando a exibição de fagos (WO94/13804) a partir das bibliotecas. Se um braço do diabody deve ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade dirigida contra o antígeno X, então a biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Os anticorpos completos biespecíficos podem ser produzidos através da engenharia de botões-em-furos (Ridgeway et al., Protein Eng., 9:616-621, 1996).

[0081] Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste documento podem ser fornecidos sob a forma de um UniBody®. Um UniBody® é um anticorpo IgG4 com a região da dobradiça removida (ver GenMab Utrecht, Países Baixos; ver também, p. ex., US20090226421). Esta tecnologia de anticorpos cria um formato de anticorpo estável, menor com uma janela terapêutica mais longa e antecipada do que os atuais formato de anticorpos pequenos. Os anticorpos IgG4 são considerados inertes e, portanto, não interagem com o sistema imunológico. Os anticorpos IgG4 totalmente humanos podem ser modificados ao eliminar a região de dobradiça do anticorpo para obter fragmentos de meia molécula com diferentes propriedades de estabilidade em relação ao IgG4 intacto correspondente (GenMab, Utrecht). A redução para metade da molécula IgG4 deixa apenas uma área no UniBody® que pode ligar-se a antígenos cognatos (p. ex., alvos de doenças) e o UniBody® liga-se assim de forma univalente a apenas um sítio nas células alvo. Para certos antígenos de superfície de células, esta ligação univalente pode não estimular o crescimento de células tumorais, como pode ser observado usando anticorpos bivalentes com a mesma especificidade antigênica e, assim, a tecnologia UniBody® pode 34/74 oferecer opções de tratamento para alguns tipos de câncer que podem ser refratários ao tratamento com anticorpos convencionais. O tamanho pequeno do UniBody® pode ser um grande benefício quando tratar algumas formas de câncer, permitindo uma melhor distribuição da molécula em tumores sólidos maiores e potencialmente aumentando a eficácia.

[0082] Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste documento podem ser fornecidos sob a forma de um nanocorpo. Os minicorpos são codificados por genes únicos e são produzidos de forma eficiente em quase todos os hospedeiros procarióticos e eucarióticos, por exemplo, E. coli (ver U.S. Pat. Nº. 6.765.087), bolores (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) e leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Kluyvermyces, Hansenula ou Pichia (ver U.S. Pat. Nº. 6.838.254). O processo de produção é escalonável e foram produzidas multiquilogramas de quantidades de nanocorpos. Os nanocorpos podem ser formulados como uma solução pronta para uso com um prazo de validade longo. O método Nanoclone (ver WO 06/079372) é um método patenteado para produzir Nanocorpos contra um alvo desejado, com base em uma seleção automatizada de alto rendimento de células B.

[0083] Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos ligados ao antígeno destes são humanizados. Essas modalidades referem-se a uma molécula quimérica, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, com um sítio de ligação ao antígeno derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e a estrutura restante da imunoglobulina da molécula com base na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. O sítio de ligação ao antígeno pode incluir domínios variáveis completos fundidos em domínios 35/74 constantes ou apenas os CDRs enxertados em regiões de estrutura apropriadas em domínios variáveis. Os sítios de ligação ao epítopo podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos. Isso elimina a região constante como imunógeno nos humanos, mas a possibilidade de resposta imune à região variável estranha permanece (LoBuglio et al., PNAS USA 86:4220-4224, 1989; Queen et al., PNAS USA. 86:10029-10033, 1988; Riechmann et al., Nature. 332:323-327, 1988). Os métodos ilustrativos para humanização de anticorpos incluem os métodos descritos na US Patente nº 7.462.697.

[0084] Outra abordagem se concentra não apenas em fornecer regiões constantes derivadas humanas, mas também em modificar as regiões variáveis, bem como em reformulá-las o mais próximo possível para a forma humana. É conhecido que as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm três regiões determinantes da complementaridade (CDRs), que variam em função dos epítopos em questão e determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de quadro (FRs) que estão relativamente conservadas numa determinada espécie e que supostamente fornecem uma armação para os CDRs. Quando os anticorpos não humanos são preparados em relação a um epítopo particular, as regiões variáveis podem ser “remodeladas” ou “humanizadas” ao enxertar os CDRs derivados de anticorpos não humanos presentes nos FRs presentes no anticorpo humano a ser modificado. A aplicação desta abordagem para vários anticorpos foi divulgada por Sato et al., Cancer Res. 53:851-856, 1993; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988; Kettleborough et al., Protein Engineering. 4:773-3783, 1991; Maeda et al., Human Antibodies 36/74

Hybridoma 2:124-134, 1991; Gorman et al., PNAS USA. 88:4181- 4185, 1991; Tempest et al., Bio/Technology 9:266-271, 1991; Co et al., PNAS USA. 88:2869-2873, 1991; Carter et al., PNAS USA. 89:4285-4289, 1992 e Co et al., J Immunol. 148:1149-1154,

1992. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências CDR (por exemplo, um anticorpo murino humanizado que contém todos os seis CDRs dos anticorpos murino). Em certas modalidades, os anticorpos humanizados têm um ou mais CDRs (um, dois, três, quatro, cinco, seis) que são alterados em relação ao anticorpo original, que também são denominados um ou mais CDRs “derivados de” um ou mais CDRs do anticorpo original.

[0085] Em certas modalidades, os anticorpos podem ser anticorpos quiméricos. A este respeito, um anticorpo quimérico é composto por um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo ligado operavelmente ou de outra forma fundido a uma porção Fc heteróloga de um anticorpo diferente. Em certas modalidades, o domínio heterólogo Fc é de origem humana. Em outras modalidades, o domínio heterólogo Fc pode ser de uma classe Ig diferente do anticorpo original, incluindo IgA (incluindo as subclasses IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (incluindo as subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. Em modalidades adicionais, o domínio heterólogo Fc pode ser composto por domínios CH2 e CH3 de uma ou mais das diferentes classes de Ig. Como observado acima com relação aos anticorpos humanizados, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo quimérico pode incluir apenas um ou mais dos CDRs dos anticorpos aqui descritos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs dos anticorpos aqui descritos) ou pode compreender um domínio inteiro variável (VL, VH ou ambos).

37/74

[0086] Pequenas moléculas Em modalidades particulares, o inibidor ou antagonista é uma “pequena molécula”. Uma pequena molécula refere-se a um composto orgânico de origem sintética ou biológica (biomolécula), mas que normalmente não é um polímero. Compostos orgânicos referem-se a uma grande classe de compostos químicos cujas moléculas contêm carbono, normalmente, excluindo aqueles que contêm apenas carbonatos, óxidos de carbono simples ou cianetos. Uma “biomolécula” refere-se geralmente a uma molécula orgânica que é produzida por um organismo vivo, incluindo grandes moléculas poliméricas (biopolímeros), como peptídios, polissacarídeos e ácidos nucleicos, também, e pequenas moléculas como metabolitos secundários, lipídios, fosfolipídios, glicolipídios, esteróis, glicerolipídios, vitaminas e hormônios. Um “polímero” refere- se geralmente a uma grande molécula ou macromolécula composta por unidades estruturais, que estão normalmente ligadas por uma ligação química covalente.

[0087] Em certas modalidades, uma pequena molécula tem um peso molecular inferior a cerca de 1000-2000 Daltons, geralmente entre cerca de 300 e 700 Daltons e incluindo cerca de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 650, 600, 750, 700, 850, 800, 950, 1000 ou 2000 Daltons.

[0088] Certas pequenas moléculas podem ter as características de “ligação específica” descritas para os anticorpos. Por exemplo, em algumas modalidades, uma pequena molécula se liga especificamente a um alvo descrito neste documento com uma afinidade de ligação (Kd) de cerca de pelo menos, ou mesmo do que 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38/74

29, 30, 40 ou 50 nM. Em certas modalidades, uma molécula pequena se liga e/ou inibe especificamente EGFR, MEK1, MEK2, CDK4, CDK6 ou qualquer combinação destes, incluindo qualquer ligante destes (p. ex., EGR), como descrito no presente documento e conhecido na técnica.

Métodos de uso e composições terapêuticas

[0089] Como observado acima, as modalidades da presente divulgação estão relacionadas à descoberta de que certas combinações de pelo menos dois agentes fornecem uma atividade significativa e muitas vezes sinergicamente aumentada de inibição da atividade de crescimento da célula tumoral em um modelo ex vivo de câncer primário celular, com relação aos agentes individuais. Algumas modalidades, portanto, estão relacionadas s métodos de tratamento, melhora dos sintomas ou inibição da progressão de um câncer em um indivíduo que necessite, compreendendo a administração ao indivíduo de uma combinação de dois ou mais agentes selecionados a partir de um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), inibidor da proteína quinase (MEK) 1/2 ativada por mitógeno e um inibidor da quinase dependente de ciclina (CDK) 4/6. Os exemplos particulares dos agentes acima mencionados estão descritos neste documento.

[0090] Certos métodos incluem a administração de uma combinação de um inibidor de EGFR e um inibidor de MEK 1/2. Alguns métodos incluem a administração de uma combinação de um inibidor de EGFR e um inibidor de CDK 4/6. Métodos particulares incluem a administração de uma combinação de um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6. Certos métodos incluem a administração de uma combinação de um inibidor de 39/74

MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6. Em alguns casos, os agentes são administrados separadamente, por exemplo, em composições terapêuticas separadas e em momentos iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, os agentes são administrados como parte da mesma composição terapêutica, ao mesmo tempo.

[0091] Em algumas modalidades, a combinação dos agentes reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais em relação a cada agente individual sozinho. Em algumas modalidades, a combinação dos agentes reduz sinergicamente o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas em relação a cada agente individual sozinho.

[0092] Em algumas modalidades, os métodos e composições terapêuticas descritos neste documento aumentam o tempo mediano de sobrevida de um indivíduo em pelo menos 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 40 semanas, 50 semanas, 60 semanas, 70 semanas, 80 semanas, 90 semanas, 100 semanas ou mais. Em certas modalidades, os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento aumentam o tempo médio de sobrevida de um indivíduo em pelo menos 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos ou mais. Em algumas modalidades, os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento aumentam a sobrevida livre de progressão em 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 40 40/74 semanas, 50 semanas, 60 semanas, 70 semanas, 80 semanas, 90 semanas, 100 semanas ou mais. Em certas modalidades, os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento aumentam a sobrevida livre de progressão em 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos ou mais.

[0093] Em certas modalidades, os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento são suficientes para resultar em regressão tumoral, como indicado por uma diminuição estatisticamente importante na quantidade de tumores viáveis, por exemplo, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou maior redução na massa tumoral, ou por dimensões alteradas de exames (p. ex., reduzido com importância estatística). Em certas modalidades, os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento são suficientes para resultar em doença estável. Em certas modalidades, os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento são suficientes para resultar em redução clinicamente relevante nos sintomas de uma indicação de doença particular conhecida pelo médico qualificado. Em algumas modalidades, a combinação de agentes é selecionada a partir de uma combinação fornecida nas Tabelas E1-E6.

[0094] Os métodos e as composições terapêuticas descritos neste documento podem ser usados no tratamento de qualquer variedade de cânceres. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor epitelial maligno ou carcinoma. Em algumas modalidades, o carcinoma é selecionado a partir de um ou mais de uma neoplasia epitelial, uma neoplasia de células escamosas (carcinoma de células escamosas), uma neoplasia de células basais (carcinoma de células basais), um carcinoma de células 41/74 transicionais, um adenocarcinoma (opcionalmente uma linite plástica, um vipoma, um colangiocarcinoma, um carcinoma hepatocelular, um carcinoma adenoide cístico, um carcinoma de células renais ou um tumor de Grawitz), uma neoplasia de apêndice cutâneo, uma neoplasia mucoepidermoide, uma neoplasia cística, mucinosa ou serosa, uma neoplasia ductal, lobular ou medular, uma neoplasia de células acinares e uma neoplasia epitelial complexa.

[0095] Em algumas modalidades, o câncer ou carcinoma é selecionado a partir de um ou mais de um câncer de cólon ou colorretal, um câncer gástrico, um câncer de pulmão (câncer de pulmão de células pequenas ou câncer de células não pequenas), um câncer de mama (por exemplo, receptor de estrogênio positivo (ER+), receptor de estrogênio negativo (ER-), Her2 positivo (Her2+), Her2 negativo (Her2-), ou uma combinação destes, por exemplo, ER+/Her2+, ER+/Her2-, ER-/Her2+ ou ER-/Her2-; ou câncer da mama “triplo negativo” que é receptor-negativo de estrogênios, receptor-negativo de progesterona e HER2-negativo), um câncer de pâncreas, um câncer oral, um câncer de próstata, um câncer de células germinativas, um câncer retal, um câncer do fígado (opcionalmente carcinoma hepatocelular), um câncer renal (opcionalmente carcinoma de células renais) e um câncer do ovário. Em algumas modalidades, o câncer ou carcinoma é câncer metastático de qualquer um dos anteriores.

[0096] Em algumas modalidades, o câncer ou carcinoma é selecionado de um ou mais melanomas (p. ex., melanoma metastático), câncer ósseo, mesotelioma, leucemia (por exemplo, leucemia linfocítica, leucemia mieloide crônica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidivada), linfoma, sarcoma, malignidade de células B, glioma (por exemplo, 42/74 astrocitoma, oligodendroglioma, ependimona ou um papiloma de plexo coroide), glioblastoma multiforme (por exemplo, gliobastoma de células gigantes ou um gliosarcoma), meningioma, adenoma pituitário, schwannoma vestibular, linfoma primário do SNC, tumor neuroectodérmico primitivo (medulloblastoma), câncer de bexiga, câncer uterino, câncer esofágico, câncer laríngeo, câncer do cérebro, cânceres do cérebro, cabeça e pescoço, câncer cervical, câncer do testículo, câncer do estômago, tumores induzidos por vírus como, por exemplo, carcinomas induzidos pelo vírus do papiloma (p. ex., carcinoma cervical, câncer cervical), adenocarcinomas, tumores induzidos pelo vírus do herpes (por exemplo, linfoma de Burkitt, linfoma de células B induzido por EBV), tumores induzidos por hepatite B (carcinomas hepatocelulares), linfomas induzidos por HTLV-1 e HTLV-2, neuroma acústico, cânceres do pulmão (por exemplo, carcinoma pulmonar, carcinoma branquial), câncer faríngeo, carcinoma anal, gliobastoma, carcinoma retal, astrocitoma, tumores cerebrais, retinoblastoma, basalioma, metástases cerebrais, medulloblastomas, câncer vaginal, síndrome de Hodgkin, meningiomas, doença de Schneeberger, tumor hipofisário, micose fungoide, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, câncer renal, timoma, carcinoma de corpo, câncer ósseo, linfomas não Hodgkin, câncer uretral, síndrome CUP, tumores de cabeça/ pescoço, oligodendroglioma, câncer vulvar, câncer intestinal, câncer orofaríngeo, envolvimento de vermes, tumores do intestino delgado, craniofaringiomas, tumores genitais, carcinoma endometrial, metástases hepáticas, câncer do pênis, câncer da língua, câncer da vesícula biliar, plasmocitoma e tumor da pálpebra. Em algumas modalidades, o câncer ou carcinoma é um câncer metastático de qualquer um dos anteriores.

43/74

[0097] Em algumas modalidades, o câncer ou carcinoma tem uma mutação ou alteração associada ao EGFR e pelo menos um dos agentes é um inibidor do EGFR. Os exemplos incluem um câncer ou carcinoma que superexpressa o EGFR. Em algumas modalidades, o câncer tem uma mutação do EGFR, por exemplo, uma deleção do éxon 19 do EGFR e/ou uma mutação de substituição do éxon 21 L858R.

[0098] Em algumas modalidades, o tipo de câncer ou carcinoma é selecionado a partir das Tabelas E1-E6, e é opcionalmente tratado pela combinação correspondente dos agentes fornecida nas Tabelas E1-E6.

[0099] Os métodos de tratamento dos cânceres podem ser combinados com outras modalidades terapêuticas. Por exemplo, uma terapia de combinação descrita neste documento pode ser administrada a um indivíduo antes, durante ou após outras intervenções terapêuticas, incluindo cuidados sintomáticos, radioterapia, cirurgia, transplante, terapia hormonal, terapia fotodinâmica, antibioticoterapia ou qualquer combinação destas. Os cuidados sintomáticos incluem a administração de corticosteroides para reduzir o edema cerebral, dores de cabeça, disfunção cognitiva e emese e administração de anticonvulsivantes para reduzir as convulsões. A radioterapia inclui a irradiação de todo o cérebro, radioterapia fracionada e a radiocirurgia, como a radiocirurgia estereotáxica, que ainda pode ser combinada com a cirurgia tradicional.

[00100] Os métodos para identificação de indivíduos com uma ou mais das doenças ou condições aqui descritas são conhecidos na técnica.

[00101] Para uso in vivo, como observado acima, para o tratamento de doenças humanas ou testes, os agentes descritos 44/74 neste documento são em geral incorporados em uma ou mais composições terapêuticas ou farmacêuticas antes da administração.

[00102] Assim, certas modalidades estão relacionadas a composições terapêuticas que compreendem uma combinação de dois ou mais (p. ex., 3, 4, 5, 6) agentes selecionados de um inibidor de EGFR, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6, como descritos neste documento. Algumas composições terapêuticas compreendem a combinação de um inibidor de EGFR e um inibidor de MEK 1/2. Certas composições terapêuticas compreendem a combinação de um inibidor de EGFR e um inibidor de CDK 4/6. Composições terapêuticas particulares compreendem a combinação de um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6. Algumas composições terapêuticas compreendem a combinação de um inibidor de EGFR, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6. Em modalidades particulares, a composição terapêutica compreende a combinação de agentes selecionados a partir de uma combinação fornecida nas Tabelas E1-E6.

[00103] Em alguns casos, a composição terapêutica ou farmacêutica compreende um ou mais dos agentes descritos neste documento em combinação com um carreador ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico. Certas composições terapêuticas compreendem ainda pelo menos um agente imunoterápico contra o câncer, como descrito neste documento.

[00104] Em modalidades particulares, a composição terapêutica compreendendo os agentes como anticorpos é substancialmente pura em termos de proteínas ou em termos de peso, por exemplo, a composição tem uma pureza de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% em termos de proteínas ou em termos de peso.

45/74

[00105] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento não formam agregados, têm uma solubilidade desejada e/ou têm um perfil de imunogenicidade adequado para uso em humanos, como descrito neste documento e conhecido na técnica. Assim, em algumas modalidades, a composição terapêutica compreendendo um agente anticorpo é substancialmente livre de agregados. Por exemplo, certas composições compreendem menos de cerca de 10% (numa base proteica) de proteínas agregadas de alto peso molecular ou menos de cerca de 5% de proteínas agregadas de alto peso molecular ou menos de cerca de 4% de proteínas agregadas de alto peso molecular ou menos de cerca de 3% de proteínas agregadas de alto peso molecular ou menos de cerca de 2% de proteínas agregadas de alto peso molecular ou menos de cerca de 1% de proteínas agregadas de alto peso molecular. Algumas composições compreendem um agente anticorpo que está pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 95% monodisperso em relação à sua aparente massa molecular.

[00106] Em algumas modalidades, os agentes anticorpos estão concentrados em torno de ou pelo menos em torno de 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/ml e estão formulados para usos bioterapêuticos.

[00107] Para preparar uma composição terapêutica ou farmacêutica, uma quantidade eficaz ou desejada de um ou mais agentes é misturada com qual(is)quer(s) carreador(es) ou excipiente(s) conhecido(s) por aqueles versados na técnica como adequado para o agente e/ou o modo de administração 46/74 específico. Um carreador farmacêutico pode ser líquido, semilíquido ou sólido. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea ou tópica podem incluir, por exemplo, um diluente estéril (tal como água), solução salina (por exemplo, salina de tampão fosfato, PBS), óleo fixo, poletilenoglicol, glicerina, propilenoglicol ou outro solvente sintético; agentes antimicrobianos (como álcool benzílico e metilparabenos); antioxidantes (como ácido ascórbico e bissulfito de sódio) e agentes quelantes (como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA)); tampões (como acetatos, citratos e fosfatos). Se administrados por via intravenosa (por exemplo, infusão IV), os carreadores adequados incluem soro fisiológico ou salina de tampão fosfato (PBS) e soluções que contenham agentes espessantes e solubilizantes, como glicose, polietilenoglicol, polipropilenoglicol e suas misturas.

[00108] A administração dos agentes descritos neste documento, na forma pura ou em composição terapêutica ou farmacêutica, pode ser feita via qualquer uma das vias de administração dos agentes aceitas para atender a utilidades similares. As composições terapêuticas ou farmacêuticas podem ser preparadas através da combinação de uma composição contendo o agente com um carreador, diluente ou excipiente aceitável do ponto de vista fisiológico e podem ser formuladas em preparações sob formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalatórios, géis, microesferas e aerossóis. Além disso, outros ingredientes ativos do ponto de vista farmacêutico (incluindo outras pequenas moléculas como descritas em outra parte deste 47/74 documento) e/ou excipientes adequados como sais, tampões e estabilizadores podem, embora não seja necessário, estar presentes na composição.

[00109] A administração pode ser feita por uma variedade de vias diferentes, incluindo oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutânea ou tópica. As vias de administração preferidas dependem da natureza da condição a ser tratada ou prevenida. As modalidades particulares incluem a administração por infusão IV.

[00110] Os carreadores podem incluir, por exemplo, carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis do ponto de vista farmacêutico ou fisiológico que não são tóxicos à célula ou ao mamífero a ser exposto a este nas doses e concentrações usadas. Frequentemente, o carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico é uma solução tampão de pH aquosa. Os exemplos de carreadores aceitáveis do ponto de vista fisiológico incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídios de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); polipeptídio, proteínas, como a albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA, alcoóis de açúcares como manitol ou sorbitol; substâncias contraíons formadoras de sal como sódio e/ou surfactantes não iônicos como polissorbato 20 (TWEEN™), polietilenoglicol (PEG) e poloxâmeros (PLURONICS™) e similares.

[00111] Em algumas modalidades, um ou mais agentes podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por 48/74 técnicas de coacervação ou por polimerização (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente) em sistemas coloidais de liberação de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edição, Oslo, A., Ed., (1980). A(s) partícula(s) ou lipossomas podem ainda incluir outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico.

[00112] A posologia e duração precisa do tratamento é uma função da doença a ser tratada e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de testes conhecidos ou testando as composições em sistemas modelo conhecidos na técnica e extrapolando a partir delas. Também podem ser feitos ensaios clínicos controlados. As posologias também podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Uma composição farmacêutica é geralmente formulada e administrada para exercer um efeito terapêutico útil enquanto minimiza os efeitos colaterais indesejáveis. A composição pode ser administrada uma vez ou pode ser dividida em várias doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. Para um indivíduo particular, os regimes de posologia específicos podem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual.

[00113] As vias típicas de administração dessas e de outras composições terapêuticas ou farmacêuticas relacionadas incluem, sem limitação, oral, tópica, transdérmica, inalatória, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal e intranasal. O termo parenteral como usado aqui inclui injeções 49/74 subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intraesternal ou técnicas de infusão. As composições terapêuticas ou farmacêuticas de acordo com certas modalidades da presente divulgação são formuladas de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos nestas sejam biodisponíveis sob administração da composição a um indivíduo ou paciente. As composições que serão administradas a um indivíduo ou paciente podem assumir a forma de uma ou mais unidades de dose, por exemplo, um comprimido pode ser uma forma farmacêutica única e um recipiente de um agente descrito neste documento em forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dose. Os métodos atuais para preparar tais formas farmacêuticas são conhecidos ou serão aparentes para aqueles versados nesta técnica, por exemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edição (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). A composição a ser administrada conterá normalmente uma quantidade terapêutica eficaz de um agente descrito neste documento para o tratamento de uma doença ou condição de interesse.

[00114] Uma composição terapêutica ou farmacêutica pode estar na forma de um sólido ou líquido. Em uma modalidade, o(s) carreador(es) é(são) particulados, de modo que as composições estejam, por exemplo, na forma de comprimido ou pó. O(s) carreador(es) podem(s) ser líquido(s), com as composições sendo, por exemplo, um óleo oral, líquido injetável ou um aerossol, que é útil, por exemplo, na administração inalatória. Quando destinada para administração oral, a composição farmacêutica deve ser, de preferência, na forma sólida ou líquida, onde as formas semissólidas, semilíquidas, suspensão e gel estão incluídas nas formas consideradas no presente 50/74 documento como sendo sólidas ou líquidas. Certas modalidades incluem soluções estéreis, injetáveis.

[00115] Como uma composição sólida para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em um pó, grânulo, comprimido preparado sob compressão, pílula, cápsula, goma de mascar, pastilha ou similares. Tal composição sólida contém normalmente um ou mais diluentes inertes ou carreadores comestíveis. Além disso, um ou mais dos seguintes elementos podem estar presentes: aglutinantes tais como carboximetilcelulose, etilcelulose, celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; excipientes tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e similares; lubrificantes como estearato de magnésio ou Sterotex; deslizantes como dióxido de silício coloidal; agentes edulcorantes como sacarose ou sacarina; um agente aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metila ou aroma de laranja e um corante. Quando a composição farmacêutica está na forma de uma cápsula gelatinosa, por exemplo, uma cápsula gelatinosa pode conter, além dos materiais do tipo acima, um carreador líquido como o polietilenoglicol ou óleo.

[00116] A composição terapêutica ou farmacêutica pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para liberação como injeção, como dois exemplos. Quando destinado para administração oral, a composição preferida contém, além dos compostos presentes, um ou mais de um edulcorante, conservante, pigmento/corante e intensificador de sabor. Em uma composição destinada a ser 51/74 administrada por injeção, podem ser incluídos um ou mais de um surfactante, conservante, agente molhante, agente dispersante, agente suspensor, tampão, estabilizador e agente isotônico.

[00117] As composições líquidas terapêuticas ou farmacêuticas, sejam elas soluções, suspensões ou outras formas similares, podem incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis, como água para injeção, solução salina, de preferência soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, como mono ou diglicerídeos sintéticos, que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos como o álcool benzílico ou metilparabeno; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como os acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser envasada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico. O soro fisiológico é o adjuvante preferido. Uma composição farmacêutica injetável é preferencialmente estéril.

[00118] Uma composição líquida terapêutica ou farmacêutica destinada à administração parenteral ou oral deve conter uma quantidade de um agente que permita obter uma posologia adequada. Normalmente, esta quantidade é pelo menos 0,01% do agente de interesse na composição. Quando destinada à administração oral, essa quantidade pode variar entre cerca de 0,1% a 70% do peso da composição. Certas composições orais terapêuticas ou farmacêuticas contêm entre cerca de 4% e cerca de 75% do agente de interesse. Em certas modalidades, as 52/74 composições e preparações terapêuticas ou farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que a forma farmacêutica parenteral tenha entre 0,01% a 10% em peso, do agente de interesse antes da diluição.

[00119] As composições terapêuticas ou farmacêuticas podem ser destinadas à administração tópica, caso em que o carreador pode incluir uma solução, emulsão, pomada ou base de gel. A base, por exemplo, pode incluir um ou mais dos seguintes componentes: petrolato, lanolina, polietilenoglicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes como a água e o álcool e emulsionantes e estabilizadores. Os agentes espessantes podem estar presentes numa composição terapêutica ou farmacêutica para administração tópica. Se for destinado para administração transdérmica, a composição pode incluir um adesivo transdérmico ou um dispositivo de iontoforese.

[00120] As composições terapêuticas ou farmacêuticas podem ser destinadas à administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório, que se derrete no reto e libera o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietilenoglicol.

[00121] A composição terapêutica ou farmacêutica pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma forma farmacêutica sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um envoltório de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o envoltório de revestimento são tipicamente inertes e podem ser selecionados, por exemplo, a partir de açúcar, goma-laca e outros agentes de revestimento entérico.

53/74

Como alternativa, os ingredientes ativos podem ser encapsulados em uma cápsula de gelatina. As composições terapêuticas ou farmacêuticas na forma sólida ou líquida podem incluir um componente que se liga ao agente e, assim, auxilia na liberação do composto. Os componentes adequados que podem atuar nesta capacidade incluem anticorpos monoclonais ou policlonais, uma ou mais proteínas ou um lipossoma.

[00122] A composição terapêutica ou farmacêutica pode consistir essencialmente de formas farmacêuticas que podem ser administradas como aerossol. O termo aerossol é usado para designar uma variedade de sistemas que vão desde os de natureza coloidal a sistemas que consistem em embalagens pressurizadas. A liberação pode ser feita por um gás liquefeito ou comprimido ou um sistema de bomba adequado que dispensa os ingredientes ativos. Os aerossóis podem ser fornecidos em sistemas monofásicos, bifásicos ou trifásicos para fornecer o(s) ingrediente(s) ativo(s). A liberação do aerossol inclui o recipiente, ativadores, válvulas, sub-recipientes necessários e similares que, juntos, podem formar um kit. Uma das habilidades comuns na técnica, sem a experimentação indevida pode determinar os aerossóis preferidos.

[00123] As composições descritas neste documento, podem ser preparadas com carreadores que protegem os agentes contra a rápida eliminação do corpo, tais como formulações de liberação controlada ou revestimentos. Tais carreadores incluem formulações de liberação controlada, tais como, mas não limitados a, implantes e sistemas de liberação microencapsulados e polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como acetato de etileno-vinila, polianidridos, ácido 54/74 poliglicólico, poliortoésteres, ácido poliláctico e outros conhecidos por aqueles de versados na técnica.

[00124] As composições terapêuticas ou farmacêuticas podem ser preparadas por metodologia bem conhecida na técnica farmacêutica. Por exemplo, uma composição terapêutica ou farmacêutica destinada a ser administrada por injeção pode incluir um ou mais sais, tampões e/ou estabilizantes, com água destilada estéril, de modo a formar uma solução. Um surfactante pode ser adicionado para facilitar a formação de uma solução ou suspensão homogênea. Os surfactantes são compostos que interagem de modo não covalente com o agente de modo a facilitar a dissolução ou suspensão homogênea do agente no sistema de liberação aquoso.

[00125] As terapias combinadas descritas neste documento podem incluir a administração de uma única formulação farmacêutica, com uma combinação de dois, três ou mais agentes (opcionalmente com um ou mais agentes ativos adicionais), assim como a administração de composições que incluam cada agente individual na sua própria formulação farmacêutica separada. Por exemplo, um inibidor de EGFR e um inibidor de MEK 1/2 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração oral, como um comprimido ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de administração oral separadas. De forma similar, um inibidor de EGFR e um inibidor de MEK 1/2 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração parenteral, como em uma solução salina ou outra solução aceitável do ponto de vista fisiológico ou cada agente administrado em formulações de administração parenteral separadas. Por exemplo, um inibidor de EGFR e um inibidor de 55/74

CDK 4/6 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração oral, como um comprimido ou cápsula ou cada agente administrado em formulações de administração oral separadas.

Também, um inibidor de EGFR e um inibidor de CDK 4/6 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração parenteral, como em uma solução salina ou outra solução aceitável do ponto de vista fisiológico ou cada agente administrado em formulações de administração parenteral separadas.

Como outro exemplo, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração oral, como um comprimido ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de administração oral separadas.

Também, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração parenteral, como em uma solução salina ou outra solução aceitável do ponto de vista fisiológico ou cada agente administrado em formulações de administração parenteral separadas.

Como mais um exemplo, um inibidor de EGFR, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração oral, como um comprimido ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de administração oral separadas.

Também, um inibidor de EGFR, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6 podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma única composição de administração parenteral, como em uma solução salina ou outra solução aceitável do ponto de vista fisiológico ou cada agente administrado em formulações de administração parenteral separadas.

Quando são usadas formulações de administração

56/74 separadas, as composições podem ser administradas praticamente ao mesmo tempo, ou seja, simultânea ou em períodos escalonados separadamente, ou seja, em sequência e em qualquer ordem; entende-se que a terapia combinada inclui todos estes regimes.

[00126] Também estão incluídos kits de cuidados ao paciente, compreendendo uma combinação de dois ou mais (p. ex., 3, 4, 5, 6) agentes selecionados de um inibidor de EGFR, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6. Alguns kits de cuidados ao paciente compreendem a combinação de um inibidor de EGFR e um inibidor de MEK 1/2, opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição. Certos kits de cuidados com o paciente compreendem a combinação de um inibidor de EGFR e um inibidor de CDK 4/6, opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição. Certos kits de cuidados com o paciente compreendem a combinação de um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6, opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição. Kits específicos de cuidados ao paciente compreendem a combinação de um inibidor de EGFR, um inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6, opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição. Em modalidades específicas, o kit de cuidados ao paciente compreende a combinação de agentes selecionados a partir de uma combinação fornecida nas Tabelas E1-E6, opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição.

[00127] Os kits descritos neste documento também incluem um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou outros componentes adequados ou desejados para a indicação a ser tratada ou para a aplicação de diagnóstico desejada. Os kits 57/74 descritos neste documento também podem também incluir uma ou mais seringas ou outros componentes necessários ou desejados para facilitar um modo de liberação pretendido (por exemplo, stents, depósitos implantáveis, etc.).

[00128] Em algumas modalidades, um kit de cuidados ao paciente contém recipientes divisores ou compartimentos separados para a(s) composição(ões) e material(is) informativo(s). Por exemplo, a(s) composição(ões) pode(m) ser contida(s) em uma garrafa, frasco ou seringa, e o(s) material(is) informativo(s) pode(m) ser contido(s) em associação com o recipiente. Em algumas modalidades, os elementos separados do kit estão contidos em um único recipiente indivisível. Por exemplo, a composição está contida em uma garrafa, frasco ou seringa que tem anexado o material informativo na forma de um rótulo. Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade (por exemplo, uma embalagem) de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas farmacêuticas (p. ex., uma forma farmacêutica descrita neste documento) de um agente ou agentes descritos neste documento. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, pacotes de folhas ou de blisters, cada um contendo uma dose unitária de cada agente. Os recipientes dos kits podem ser hermeticamente fechados, a prova d’água (p. ex., impermeáveis a alterações de umidade ou evaporação) e/ou protegido da luz.

[00129] O kit de cuidados ao paciente inclui opcionalmente um dispositivo adequado para a administração da composição, p. ex., uma seringa, inalante, conta-gotas (p. ex., conta-gotas oftálmico), cotonete (p. ex., um cotonete de algodão ou cotonete de madeira) ou qualquer outro dispositivo de liberação. Em algumas modalidades, o dispositivo é um dispositivo implantável 58/74 que distribui doses medidas do(s) agente(s). Também estão incluídos os métodos de fornecimento de um kit, p. ex., ao combinar os componentes descritos neste documento.

[00130] Todas as publicações, pedidos de patente e patentes concedidas citadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência como se cada publicação individual, pedido de patente ou patente concedida fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[00131] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em certos detalhes, a título de ilustração e exemplo, para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente aparente, para uma pessoa versada na técnica, à luz dos ensinamentos desta invenção, que podem ser feitas certas mudanças e modificações nela, sem afastar-se do espectro ou do escopo das reivindicações anexas. Os exemplos a seguir são fornecidos apenas a título de ilustração e não a título de limitação. Aqueles versados na técnica reconhecerão de imediato uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.

Exemplos Exemplo 1 Testes de fármacos ex vivo usando pools de células de reprogramação condicional

[00132] Amostras cirúrgicas de pacientes com câncer colorretal, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer gástrico e câncer de mama foram obtidas do Hospital do Câncer de Pequim e do Hospital do Câncer da Academia Chinesa de Ciências Médicas após receber o 59/74 consentimento dos pacientes. Foram obtidas amostras de tumores xenoenxertos derivadas de camundongos Nod/SCID inoculados com amostras tumorais cirúrgicas de pacientes.

[00133] Para os ensaios de sensibilidade a fármacos ex vivo, as células tumorais foram isoladas a partir da amostra de tecido do paciente ou do tecido do tumor xenoenxerto PDX. Resumidamente, os tecidos tumorais foram cortados em pequenos pedaços de menos de 1 mm de diâmetro com tesoura. Os fragmentos de tumores foram transferidos para um frasco de vidro triangular estéril de 100 ml carregado com uma barra de agitação magnética. Um meio de digestão de 10-15 ml contendo 0,25 U/ml de Liberase DH foi adicionado aos tecidos do tumor picado para iniciar a digestão enzimática. A mistura enzimática foi incubada a 37 °C durante 1 a 2 com agitação moderada. O tecido tumoral digerido foi filtrado através de um retentor de células de 100 µm. Os filtrados foram refiltrados através de um retentor de células de 40 µm. Os aglomerados de células tumorais retidos no retentor de células de 40 µm foram coletados, lavados duas vezes com HBSS e então ressuspendidos com meios de crescimento definidos suplementados com vários fatores de crescimento de células-tronco.

[00134] Os aglomerados de células tumorais retidos no retentor de células de 40 µm foram coletados, lavados duas vezes com HBSS, ressuspendidos em meios de crescimento definidos suplementados com fatores de crescimento celular e inibidores de pequenas moléculas. Os aglomerados de células tumorais foram recuperados em um meio de crescimento definido durante a noite. O meio de crescimento definido foi StemPro® hESC SFM (meio definido, sem soro e alimentador (SFM)) suplementado com: Nicotinamida, Wnt3A, Noggin (inibidor da 60/74 proteína óssea morfogenética (BMP)), R-spondin-1 (agonista da sinalização de Wnt/β-catenina), e Y27632 (inibidor da proteína quinase, em espiral e associada a Rho (ROCK-1)).

[00135] Para a reprogramação condicional, os CTOSs recuperados foram dissociados em células únicas e semeados em um sistema de cocultura de célula alimentadora/inibidor Rock (Y27632) em cerca de 3.000 células por poço em placa de cultura celular e cresceram a 37 °C durante 3 dias.

[00136] Para o teste de fármaco ex vivo, as células tumorais semeadas foram expostas a sete inibidores de EGFR, três inibidores de MEK 1/2 e três inibidores de CDK 4/6 isoladamente ou uma combinação de inibidor de EGFR e inibidor de MEK 1/2, uma combinação de inibidor de EGFR e inibidor de CDK 4/6, uma combinação de inibidor MEK 1/2 e inibidor de CDK 4/6 e uma combinação tripla de inibidor de EGFR, inibidor de MEK 1/2 e um inibidor de CDK 4/6 durante 72 horas. As células tumorais tratadas foram reexpostas ao mesmo fármaco ou combinação de fármacos com uma troca de meios frescos por mais 72 horas. Todos os fármacos foram preparados em DMSO e a concentração final de DMSO nos meios era 0,1%. A concentração testada do fármaco e das combinações de fármacos estavam na concentração ASC relevante (ver Tabela E1).

Tabela E1 contro contro Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Cobime Cobime le le nibe nibe ibe ibe tinibe tinibe tinibe tinibe DMSO DMSO 5 1 0,2 0,04 2 0,4 0,2 0,04 0,2% 0,5% Dabraf Dabraf Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Selume Selume enibe enibe nibe + nibe + ibe + ibe + tinibe tinibe tinibe tinibe 61/74

Dabraf Dabraf Dabraf Dabraf + + enibe enibe enibe enibe Dabraf Dabraf enibe enibe 2 0,4 5 + 2 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 2 0,4 + 2 0,4 0,4 2 0,4 0,4 Tramet Tramet Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Lapati Lapati inibe inibe nibe + nibe + ibe + ibe + tinibe tinibe nibe nibe Tramet Tramet Tramet Tramet + + inibe inibe inibe inibe Tramet Tramet inibe inibe 0,02 0,004 5 + 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 0,4 + 10 2 0,02 0,004 0,02 0,004 0,02 0,004 Palboc Palboc Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Vorino Vorino iclibe iclibe nibe + nibe + ibe + ibe + tinibe tinibe state state Palboc Palboc Palboc Palboc + + iclibe iclibe iclibe iclibe Palboc Palboc iclibe iclibe 0,5 0,1 5 + 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 0,4 + 1 0,2 0,5 0,1 0,5 0,1 0,5 0,1 Dabraf Dabraf Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Olapar Olapar enibe enibe nibe + nibe + ibe + ibe + tinibe tinibe ibe ibe + + Dabraf Dabraf Dabraf Dabraf + + Tramet Tramet enibe enibe enibe enibe Dabraf Dabraf inibe inibe + + + + enibe enibe Tramet Tramet Tramet Tramet + + inibe inibe inibe inibe Tramet Tramet inibe inibe

62/74

2 + 0,4 + 5 + 2 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 2 0,4 + 10 2 0,02 0,004 + 0,02 0,4 + 2 + 0,4 + + 0,02 0,4 + 0,004 0,02 0,004 0,004 Dabraf Dabraf Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Everol Everol enibe enibe nibe + nibe + ibe + ibe + tinibe tinibe imo imo + + Dabraf Dabraf Dabraf Dabraf + + Palboc Palboc enibe enibe enibe enibe Dabraf Dabraf iclibe iclibe + + + + enibe enibe Palboc Palboc Palboc Palboc + + iclibe iclibe iclibe iclibe Palboc Palboc iclibe iclibe 2 + 0,4 + 5 + 2 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 2 0,4 + 0,03 0,006 0,5 0,1 + 0,5 0,4 + 2 + 0,4 + + 0,5 0,4 + 0,1 0,5 0,1 0,1 Tramet Tramet Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Crizot Crizot inibe inibe nibe + nibe + ibe + ibe + tinibe tinibe inibe inibe + + Tramet Tramet Tramet Tramet + + Palboc Palboc inibe inibe inibe inibe Tramet Tramet iclibe iclibe + + + + inibe inibe Palboc Palboc Palboc Palboc + + iclibe iclibe iclibe iclibe Palboc Palboc iclibe iclibe 0,02 + 0,004 5 + 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 0,4 + 0,3 0,06 0,5 + 0,1 0,02 + 0,004 0,02 + 0,004 0,02 + 0,004 0,5 + 0,1 0,5 + 0,1 0,5 + 0,1 Dabraf Dabraf Erloti Erloti Afatin Afatin Osimer Osimer Osimer Osimer enibe enibe nibe + nibe + ibe+ ibe+ tinibe tinibe tinibe tinibe + + Dabraf Dabraf Dabraf Dabraf + + + + Tramet Tramet enibe enibe enibe enibe Dabraf Dabraf

63/74 inibe inibe + + + + enibe enibe Crizot Crizot + + Tramet Tramet Tramet Tramet + + inibe inibe Palboc Palboc inibe inibe inibe inibe Tramet Tramet iclibe iclibe + + + + inibe inibe Palboc Palboc Palboc Palboc + + iclibe iclibe iclibe iclibe Palboc Palboc iclibe iclibe 2 + 0,4 + 5 + 2 1 + 0,2 + 0,04 + 2 + 2 0,4 + 2 + 0,4 + 0,02 + 0,004 + 0,02 0,4 + 2 + 0,4 + + 0,02 0,4 + 0,3 0,06 0,5 + 0,1 + 0,5 0,004 0,02 + 0,004 + 0,5 0,004 + 0,1 0,5 + 0,1 + 0,1

[00137] Após a exposição ao fármaco, as células tumorais epiteliais foram marcadas com 5-etil-2'-desoxiuridina (Edu) para avaliar as taxas de proliferação celular do tumor. A marcação durou 24 horas na presença de exposição ao fármaco. No grupo controle, as células tumorais epiteliais não receberam exposição a fármacos com mudança de meio, mas foram marcadas de forma semelhante com Edu. A célula tumoral marcada foi fixada e corada com Hoechst 33342 em tampão de bloqueio contendo 0,5% de Triton X-100 e 3% de BSA durante a noite a 4 °C. As células tumorais foram incubadas com anticorpo EpCAM (1:4000) durante 2 horas à temperatura ambiente e enxaguadas com PBST. Posteriormente, as células tumorais foram incubadas com anticorpo secundário conjugado de cabra anti-camundongo Alexa Fluor® 647 durante 30 minutos à temperatura ambiente e enxaguadas com PBST.

[00138] O Edu incorporado foi detectado pela reação de Click-iT onde as células fixadas foram incubadas com uma mistura reacional contendo o tampão de reação 1X Click-iT Edu, CuSO4 e o pigmento Alexa Fluor conjugado com azida no escuro.

64/74

As células coradas foram lavadas com PBS duas vezes antes da aquisição e análise da imagem.

[00139] Para aquisição e análise da imagem, as células tumorais coradas foram captadas por uma plataforma de triagem de alto conteúdo (HCS) (leitor de HCS Thermo Scientific CellomicsArrayScanXTi). A objetiva 10X foi usada para coletar as imagens. Foram fotografados vinte e cinco campos para cada poço para a análise. A partir das imagens foram obtidos três sinais fluorescentes do leitor de HCS. Os sinais fluorescentes azuis detectaram sinais nucleares corados com Hoechst 33342, o sinal fluorescente verde detectou o Edu incorporado em DNA recém-sintetizado e o sinal fluorescente vermelho detectou a população de células epiteliais positivas EpCAM (ver Figura 1).

[00140] O MI (Índice máximo de inibição) foi calculado utilizando o EpCAM e a leitura positiva para Edu (ver Tabela E2 e Tabela E3 abaixo).

Tabela E2 ID do Tipo EdU+ E E+D E+T E+P E+D+ E+D+ E+T+P E+D+ E+C pacien de Contr T P T+P te cânce ole r NYL- cólon 5876 11,7 3,34 123, 30,1 58,8 19,9 309,7 172, 20,5 102 9 96 8 2 9 4 72 9 NYL- cólon 16127 0,76 1,68 15,5 6,83 2,75 2,44 238,9 39,2 0,72 081 5 2 4 NYL- fígad 15032 61,7 11,6 5693 983, 222, 223, 13918 9954 126, 088 o 9 3 ,89 12 30 29 ,39 ,87 96 65/74

CKY- cólon 3095 2,32 3,24 271, 10,2 20,7 8,99 87,49 49,6 1,74 016 22 7 3 3 NYL- cólon 3047 49,0 24,6 192, 447, 111, 219, 447,0 447, 50,0 HZ-002 7 7 60 43 37 84 0 00 3 ZKB- cólon 8605 13,5 5,22 39,2 123, 87,7 10,4 907,6 220, 39,0 171 0 1 10 9 1 7 07 8 NYL- cólon 3810 67,6 21,8 451, 1085 254, 449, 1085, 1085 101, 109 3 5 43 ,49 00 30 00 ,00 57 NYL- cólon 19624 1,82 2,15 2,69 10,2 4,46 7,07 214,4 279, 178 5 7 07 NYL- cólon 5065 7,79 4,57 115, 8,60 21,4 15,8 107,0 80,1 13,4 JN-025 97 9 3 9 5 0 NYL- cólon 1498 2,18 2,95 140, 6,18 10,7 5,20 561,0 50,5 3,82 149 79 7 3 9 NYL- cólon 27848 5,35 3,44 7,86 49,4 6,80 28,3 174,9 229, 6,47 161 5 7 8 54 NYL- cólon 25722 1,19 9,37 110, 2,69 956, 42,0 440,4 813, 132 04 90 0 4 97 NYL- cólon 15034 3,58 2,77 65,1 32,2 21,2 9,95 239,7 124, 113 5 3 3 8 20 NYL- cólon 4512 0,81 1,20 3,83 2,14 1,46 1,70 38,92 13,1 0,77 170 1 ZKB- cólon 4765 18,4 7,78 55,3 1430 34,5 172, 5015, 5015 25,5 070 9 4 ,91 9 96 73 ,73 8 NYP- gástr 1236 2,07 0,98 1,22 1,85 1,06 1,55 9,49 9,60 1,30 006 ico NYL- cólon 6000 10,0 8,74 64,8 194, 39,6 144, 2069, 586, 11,9 040 6 8 75 7 94 08 54 5

66/74

ZKB- cólon 6871 18,1 9,20 55,9 1861 38,9 302, 6871, 6871 33,2 007 8 3 ,97 4 41 00 ,00 9 ZKB- gástr 3984 0,65 0,85 6,48 32,5 3,40 24,1 257,3 320, 0,65 165 ico 7 7 8 02 ZKB- pâncr 12746 2,54 1,99 7,39 13,4 3,62 7,36 171,4 78,5 2,62 011 eas 3 1 9 NYL- cólon 13107 11,4 7,45 84,8 143, 16,9 36,6 1040, 255, 42,4 053 8 0 21 6 4 23 79 0 NYL- pulmã 3471 7,97 3,33 155, 158, 13,6 26,9 3337, 396, 11,7 171 o 25 08 5 5 84 73 7 E, inibidor de EGFR; D, inibidor de BRAF; T, inibidor de MEK1/2; P inibidor de CDK4/6; C, inibidor de c-MET

Tabela E3 ID do Tipo de EdU+ D T P D+T D+P T+P D+T+P paciente câncer Controle NYL-102 cólon 5876 1,81 2,58 4,44 2,83 NYL-081 cólon 16127 0,93 2,18 5,68 2,63 NYL-088 fígado 15032 1,39 2,69 2,81 1,39 CKY-016 cólon 3095 4,43 3,20 98,06 17,12 NYL-HZ- cólon 3047 0,83 2,06 2,10 2,02 2,08 4,11 3,40 002 CKY-041 cólon 12553 1,05 1,10 0,90 1,64 1,01 1,14 ZKB-171 cólon 8605 1,18 1,85 1,43 1,46 1,81 3,92 2,77 NYL-109 cólon 3810 1,52 7,57 1,68 5,45 1,41 6,46 3,42 NYL-178 cólon 19624 NYL-JN- cólon 5065 3,56 3,13 4,37 4,13 025 NYL-149 cólon 1498 4,01 4,13 2,35 0,59 5,23 4,28 1,59

67/74

NYL-161 cólon 27848 0,94 1,01 1,35 0,96 1,39 1,43 1,62 NYL-132 cólon 25722 1,42 1,42 1,94 2,45 2,88 2,40 3,97 NYL-113 cólon 15034 0,96 1,86 1,79 1,12 1,21 3,98 1,88 NYL-170 cólon 4512 2,11 0,61 3,09 0,51 5,68 0,89 0,93 ZKB-070 cólon 4765 1,18 0,74 4,35 0,73 3,29 1,72 1,23 NYP-006 gástrico 1236 0,47 0,55 2,89 0,35 1,16 0,86 0,79 NYL-040 cólon 6000 1,08 0,85 6,68 0,57 4,82 3,02 2,99 ZKB-007 cólon 6871 0,91 0,76 3,00 0,69 2,93 2,37 1,60 ZKB-165 gástrico 3984 1,83 0,60 7,38 0,63 9,15 8,00 13,40 ZKB-011 pâncreas 12746 1,00 1,08 6,85 0,73 5,44 20,42 17,06 NYL-053 cólon 13107 1,10 1,96 2,71 1,36 1,90 5,00 2,48 E, inibidor de EGFR; D, inibidor de BRAF; T, inibidor de MEK1/2; P inibidor de CDK4/6; C, inibidor de c-MET

[00141] MI (Índice máximo de inibição) = células Edu positivas no controle/células Edu positivas no tratamento.

[00142] A percentagem de inibição foi calculada usando o EpCAM e a leitura positiva para Edu (ver Tabela E4 e Tabela E5 abaixo). Tabela E4 ID do Tipo Cntr E E+D E+T E+P E+D+ E+D+ E+T+ E+D+ E+C pacie de l. T P P T+P nte cânce EdU+ r NYL- cólon 5876 102 NYL- cólon 1612 91,5 70,03 99,1 96,6 98,3 95,0 99,6 99,4 95,1 081 7 2% % 9% 9% 0% 0% 8% 2% 4% 68/74

NYL- fígad 1503 0,00 40,42 93,5 85,3 63,5 58,9 99,5 97,4 0,00 088 o 2 % % 7% 7% 9% 7% 8% 5% % CKY- cólon 3095 98,3 91,40 99,9 99,9 99,5 99,5 99,9 99,9 99,2 016 8% % 8% 0% 5% 5% 9% 9% 1% NYL- cólon 3047 56,8 69,12 99,6 90,2 95,1 88,8 98,8 97,9 42,6 HZ- 5% % 3% 7% 8% 7% 6% 9% 6% 002 CKY- cólon 1255 97,9 95,95 99,4 99,7 99,1 99,5 99,7 99,7 98,0 041 3 6% % 8% 8% 0% 5% 8% 8% 0% ZKB- cólon 8605 0,00 100,0 77,5 70,9 59,4 39,8 96,0 79,3 0,00 171 % 0% 8% 8% 5% 2% 7% 5% % NYL- cólon 3810 92,5 80,85 97,4 99,1 98,8 90,4 99,8 99,5 97,4 109 9% % 5% 9% 6% 0% 9% 5% 4% NYL- cólon 1962 98,5 95,42 99,7 99,9 99,6 99,7 99,9 99,9 99,0 178 4 2% % 8% 1% 1% 8% 1% 1% 2% NYL- cólon 5065 45,1 53,44 62,7 90,2 77,6 85,8 99,5 99,6 JN- 9% % 9% 4% 0% 6% 3% 4% 025 NYL- cólon 1498 87,1 78,10 99,1 88,3 95,3 93,6 99,0 98,7 92,5 149 7% % 4% 8% 5% 8% 7% 5% 4% NYL- cólon 2784 54,2 66,12 99,2 83,8 90,7 80,7 99,8 98,0 73,8 161 8 3% % 9% 2% 2% 8% 2% 2% 2% NYL- cólon 2572 81,3 70,90 87,2 97,9 85,3 96,4 99,4 99,5 84,5 132 2 0% % 7% 8% 0% 7% 3% 6% 5% NYL- cólon 1503 15,7 89,33 99,0 62,7 99,9 97,6 99,7 99,8 113 4 4% % 9% 7% 0% 2% 7% 8% NYL- cólon 4512 72,0 63,84 98,4 96,9 95,2 89,9 99,5 99,1 170 6% % 7% 0% 9% 5% 8% 9%

69/74

ZKB- cólon 4765 0,00 16,37 73,8 53,1 31,4 41,2 97,4 92,3 0,00 070 % % 7% 6% 3% 5% 3% 7% % NYP- gástr 1236 94,5 87,15 98,1 99,9 97,1 99,4 99,9 99,9 96,0 006 ico 9% % 9% 3% 1% 2% 8% 8% 9% NYL- cólon 6000 51,7 - 18,3 46,0 5,55 35,4 89,4 89,5 23,2 040 5% 2,54% 1% 1% % 2% 6% 8% 6% ZKB- cólon 6871 90,0 88,56 98,4 99,4 97,4 99,3 99,9 99,8 91,6 007 6% % 6% 9% 8% 1% 5% 3% 3% ZKB- gástr 3984 94,5 89,13 98,2 99,9 97,4 99,6 99,9 99,9 97,0 165 ico 0% % 1% 5% 3% 7% 9% 9% 0% ZKB- pâncr 1274 0,00 0,00% 84,5 96,9 70,6 95,8 99,6 99,6 0,00 011 eas 6 % 7% 3% 1% 6% 1% 9% % NYL- cólon 1310 60,6 49,87 86,4 92,5 72,3 86,4 99,4 98,7 61,7 053 7 1% % 6% 5% 9% 1% 2% 3% 9% E, inibidor de EGFR; D, inibidor de BRAF; T, inibidor de MEK1/2; P inibidor de CDK4/6; C, inibidor de c-MET

Tabela E5

ID do Tipo de EdU+ D T P D+T D+P T+P D+T+P pacient câncer Control e e NYL-102 cólon 5876 44,87 61,27 77,49 64,68 % % % % NYL-081 cólon 16127 0,00% 54,05 82,38 61,97 % % % NYL-088 fígado 15032 27,88 62,76 64,39 27,80 % % % % CKY-016 cólon 3095 77,43 68,76 98,98 94,16 % % % %

70/74

NYL-HZ- cólon 3047 0,00% 51,53 52,48 50,56 51,99 75,66 70,61 002 % % % % % % CKY-041 cólon 12553 5,05% 9,05% 0,00% 39,07 0,56% 12,42 % % ZKB-171 cólon 8605 15,07 46,02 30,13 31,67 44,81 74,51 63,87 % % % % % % % NYL-109 cólon 3810 34,25 86,79 40,42 81,65 28,85 84,52 70,73 % % % % % % % NYL-178 cólon 19624 NYL-JN- cólon 5065 71,95 68,06 77,12 75,78 025 % % % % NYL-149 cólon 1498 75,06 75,78 57,40 0,00% 80,86 76,61 37,06 % % % % % % NYL-161 cólon 27848 - 0,59% 26,16 0,00% 27,82 30,25 38,17 6,33% % % % % NYL-132 cólon 25722 29,59 29,60 48,53 59,20 65,24 58,39 74,82 % % % % % % % NYL-113 cólon 15034 - 46,31 44,25 10,74 17,53 74,90 46,70 3,84% % % % % % % NYL-170 cólon 4512 52,58 0,00% 67,64 0,00% 82,40 0,00% 0,00% % % % ZKB-070 cólon 4765 15,53 - 77,00 0,00% 69,60 41,91 18,51 % 34,50 % % % % % NYP-006 gástric 1236 0,00% 0,00% 65,36 0,00% 13,84 0,00% 0,00% o % % NYL-040 cólon 6000 7,18% 0,00% 85,02 0,00% 79,24 66,85 66,51 % % % %

71/74

ZKB-007 cólon 6871 0,00% 0,00% 66,72 0,00% 65,86 57,89 37,46 % % % % ZKB-165 gástric 3984 45,31 0,00% 86,45 0,00% 89,07 87,51 92,54 o % % % % % ZKB-011 pâncrea 12746 0,00% 7,36% 85,40 0,00% 81,61 95,10 94,14 s % % % % NYL-053 cólon 13107 9,11% 49,02 63,04 26,59 47,25 79,99 59,60 % % % % % % E, inibidor de EGFR; D, inibidor de BRAF; T, inibidor de MEK1/2; P inibidor de CDK4/6; C, inibidor de c-MET

[00143] Percentagem de inibição para o fármaco A (AI) = células 1-Edu positivas no tratamento A/células Edu positivas no controle.

[00144] Percentagem de inibição para o fármaco AB (ABI) = células 1-Edu positivas no tratamento AB/células Edu positivas no controle.

[00145] Percentagem de inibição para o fármaco ABC (ABCI) = células 1-Edu positivas no tratamento ABC/células Edu positivas no controle.

[00146] O índice de combinação na concentração em ASC para as combinações de fármacos foi calculado usando o modelo Bliss Independence sob a estratégia baseada no efeito (ver Tabela E6 abaixo). Tabela E6 ID do Tipo E+D E+T E+P E+D+ E+D+ E+T+ E+D+ E+C D+T D+P T+P D+T+ pacie de T P P T+P P nte cânce r 72/74

NYL- cólon 1,99 0,53 0,23 0,91 0,47 0,48 0,48 0,98 1,02 1,01 1,06 1,28 HZ- 002 CKY- cólon 0,24 0,32 0,05 1,00 1,15 041 ZKB- cólon 3,04 0,64 0,16 0,34 2,18 0,04 0,19 0,40 1,49 0,93 0,68 1,13 171 NYL- cólon 4,71 1,13 0,10 3,06 0,38 0,79 1,20 0,97 2,11 1,82 1,97 5,65 109 NYL- cólon 2,97 0,06 0,83 3,36 3,95 0,04 1,68 0,57 16,5 1,80 2,27 24,4 149 6 6 NYL- cólon 1,56 0,68 0,15 0,79 0,26 0,04 0,03 0,83 1,01 0,98 0,95 0,84 161 NYL- cólon 0,18 0,02 0,86 0,00 0,08 0,01 0,01 0,82 0,96 1,15 0,99 132 NYL- cólon 1,29 0,10 0,20 0,31 0,65 0,05 0,10 1,66 1,48 0,84 1,78 113 NYL- cólon 1,76 0,26 1,45 1,45 3,83 0,08 0,50 1,00 2,11 1,15 3,09 6,52 170 ZKB- cólon 2,81 0,33 0,06 0,63 0,55 0,02 0,02 0,72 1,18 1,56 2,53 4,19 070 NYP- gástr 2,07 1,69 3,23 1,96 3,86 0,63 0,62 1,59 1,00 2,49 2,89 2,89 006 ico NYL- cólon 1,24 0,16 0,34 0,27 0,50 0,03 0,12 0,84 1,08 1,49 2,21 2,41 040 ZKB- cólon 1,98 0,33 0,03 0,47 0,18 0,01 0,01 0,60 1,00 1,03 1,27 1,88 007 ZKB- gástr 1,83 0,15 0,23 0,54 0,56 0,03 0,04 1,31 1,83 1,47 0,92 1,01 165 ico

73/74

ZKB- pâncr 1,27 0,37 1,29 0,76 2,36 0,11 0,24 1,03 1,08 1,26 0,36 0,43 011 eas NYL- cólon 1,70 0,27 0,22 1,46 0,93 0,06 0,26 0,39 1,58 1,57 1,06 2,36 053 NYL- pulmã 3,71 0,05 0,15 0,95 1,33 0,01 0,10 0,74 1,63 1,55 1,02 2,13 171 o E, inibidor de EGFR; D, inibidor de BRAF; T, inibidor de MEK1/2; P inibidor de CDK4/6; C, inibidor de c-MET

[00147] CI(AB) = (AI + BI-AI*BI)/(ABI).

[00148] O índice de combinação na concentração na ASC para combinações triplas de fármacos foi calculado usando o modelo Bliss Independence sob estratégia baseada no efeito.

[00149] CI(ABC) = (AI + BI + CI-AI*BI-AI*CI-BI*CI + AI*BI*CI)/(ABCI)

[00150] Se CI < 1, a combinação de A e B é sinérgica.

[00151] Se CI = 1, a combinação de A e B é aditiva.

[00152] Se CI > 1, a combinação de A e B é antagonista.

[00153] Esses resultados ilustram que várias combinações de inibidores de EGFR, MEK 1/2, e/ou CDK 4/6 fornecem uma atividade significativamente aumentada (p. ex., sinergicamente aumentada) de morte de células tumorais em um modelo ex vivo de células tumorais primárias de uma variedade de tecidos, incluindo tecidos do cólon, gástrico, pancreático e pulmonares, entre outros.

74/74

Claims (32)

Reivindicações

1. Um método caracterizado pelo tratamento de um câncer em um indivíduo que precise dele, compreendendo a administração ao indivíduo de uma combinação de dois ou mais agentes selecionados de: (a) um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); (b) um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e (c) um inibidor da quinase dependente da ciclina (CDK) 4/6.

2. O método da Reivindicação 1, caracterizado por (a) que é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao EGFR ou a um dos seus ligantes ou é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe, matuzumabe, erlotinibe, gefitinibe, afatinibe, lapatinibe, osimertinibe, brigatinibe e icotinibe.

3. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 2, caracterizado por (b) que é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a um MEK 1/2 ou a um dos seus ligantes ou é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: trametinibe selumetinibe e cobimetinibe.

4. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, caracterizado por (c) que é uma pequena molécula ou anticorpo 1/8

(ou seu fragmento e ligação ao antígeno) que se liga especificamente a uma CDK 4/6 ou a um de seus ligantes ou é opcionalmente selecionada a partir de um ou mais dos seguintes compostos: palbociclibe, ribociclibe e abemaclibe.

5. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, caracterizado pela administração da combinação de (a) e (b) ao indivíduo, opcionalmente como composições separadas ou juntos como parte da mesma composição.

6. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, caracterizado pela administração da combinação de (a) e (c) ao indivíduo, opcionalmente como composições separadas ou juntos como parte da mesma composição.

7. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, caracterizado pela administração da combinação de (a), (b) e (c) ao indivíduo, opcionalmente como composições separadas ou juntos como parte da mesma composição.

8. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo câncer que é um tumor epitelial maligno ou carcinoma.

9. O método da Reivindicação 8, caracterizado pelo carcinoma que é selecionado a partir de um ou mais de um adenocarcinoma, um carcinoma de células escamosas, um carcinoma adenoescamoso, um carcinoma anaplásico, um carcinoma de grandes células e um carcinoma de pequenas células.

2/8

10. O método da Reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo carcinoma que é selecionado a partir de um ou mais de uma neoplasia epitelial, uma neoplasia de células escamosas (carcinoma de células escamosas), uma neoplasia de células basais (carcinoma de células basais), um carcinoma de células transicionais, um adenocarcinoma (opcionalmente uma linite plástica, um vipoma, um colangiocarcinoma, um carcinoma hepatocelular, um carcinoma adenoide cístico, um carcinoma de células renais ou um tumor de Grawitz), uma neoplasia de apêndice cutâneo, uma neoplasia mucoepidermoide, uma neoplasia cística, mucinosa ou serosa, uma neoplasia ductal, lobular ou medular, uma neoplasia de células acinares e uma neoplasia epitelial complexa.

11. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo câncer que é um carcinoma selecionado a partir de um ou mais de um câncer de colo, câncer gástrico, câncer de pulmão (opcionalmente câncer de pulmão de pequenas células ou câncer de pulmão de células não pequenas), um câncer de mama, um câncer pancreático, um câncer oral, um câncer de próstata, um câncer de células germinativas, um câncer retal, um câncer de fígado (opcionalmente carcinoma hepatocelular), um câncer renal (opcionalmente carcinoma de células renais) e um câncer de ovário.

12. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 11, caracterizado pela combinação de (a) e (b) que reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 3/8

400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais relativas a (a) e/ou (b) sozinhos.

13. O método da Reivindicação 12, caracterizado pela combinação de (a) e (b) que reduz sinergicamente o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas relativas a (a) e/ou (b) sozinhos.

14. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 11, caracterizado pela combinação de (a) e (c) que reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais relativas a (a) e/ou (b) sozinhos.

15. O método da Reivindicação 14, caracterizado pela combinação de (a) e (c) que reduz sinergicamente o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas relativas a (a) e/ou (c) sozinhos.

16. O método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 11, caracterizado pela combinação de (a), (b) e (c) que reduz o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta a morte de células cancerosas em cerca ou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000% ou mais relativas a (a), (b) e/ou (c) sozinhos.

4/8

17. O método da Reivindicação 16, caracterizado pela combinação de (a), (b) e (c) que reduz sinergicamente o crescimento das células cancerosas e/ou aumenta sinergicamente a morte das células cancerosas relativas a (a), (b) e/ou (c) sozinhos.

18. O método de qualquer uma das Reivindicação 1 a 17, caracterizado pela combinação de (a) e (b), (a) e (c) ou (a), (b) e (c) que é selecionada a partir de uma combinação nas Tabelas E1-E6 e opcionalmente no qual o câncer corresponde a uma célula cancerosa nas Tabelas E1-E6.

19. Uma composição terapêutica, caracterizada por compreender uma combinação de dois ou mais agentes selecionados a partir de: (a) um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); (b) um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e (c) um inibidor da quinase dependente da ciclina (CDK) 4/6.

20. A composição terapêutica da Reivindicação 19, caracterizada por (a) que é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente ao EGFR ou a um dos seus ligantes e é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: cetuximabe, panitumumabe, zalutumumabe, nimotuzumabe, matuzumabe, erlotinibe, 5/8 gefitinibe, afatinibe, lapatinibe, osimertinibe, brigatinibe e icotinibe.

21. A composição terapêutica das Reivindicações 19 ou 20, caracterizada por (b) que é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a um MEK 1/2 ou a um dos seus ligantes e é opcionalmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes compostos: trametinibe selumetinibe e cobimetinibe.

22. A composição terapêutica de qualquer uma das Reivindicações 19 a 21, caracterizado por (c) que é uma pequena molécula ou anticorpo (ou seu fragmento e ligação ao antígeno) que se liga especificamente a uma CDK 4/6 ou a um de seus ligantes ou é opcionalmente selecionada a partir de um ou mais dos seguintes compostos: palbociclibe, ribociclibe e abemaclibe.

23. A composição terapêutica de qualquer uma das reivindicações 19 a 22 caracterizada pela combinação de (a) e (b).

24. A composição terapêutica de qualquer uma das reivindicações 19 a 22 caracterizada pela combinação de (a) e (c).

25. A composição terapêutica de qualquer uma das reivindicações 19 a 22 caracterizada pela combinação de (a), (b) e (c).

6/8

26. A combinação terapêutica de qualquer uma das Reivindicação 19 a 25 caracterizada pela combinação de (a) e (b), (a) e (c) ou (a), (b) e (c) que é selecionada a partir de uma combinação nas Tabelas E1-E6 e opcionalmente no qual o câncer corresponde a um tipo de célula/tecido canceroso nas Tabelas E1-E6.

27. A combinação terapêutica de qualquer uma das Reivindicação 19 a 26, caracterizada pelo uso no tratamento de um câncer em um indivíduo que precise dele.

28. A combinação terapêutica para uso conforme a Reivindicação 27, caracterizado pelo câncer que é um tumor epitelial maligno ou carcinoma.

29. Um kit de cuidados ao paciente, caracterizado por compreender uma combinação de dois ou mais agentes selecionados a partir de: (a) um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR); (b) um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) 1/2 e (c) um inibidor da quinase dependente da ciclina (CDK) 4/6.

30. O kit de cuidados ao paciente da Reivindicação 29, caracterizado por compreender a combinação de (a) e (b), opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição.

7/8

31. O kit de cuidados ao paciente da Reivindicação 29, caracterizado por compreender a combinação de (a) e (c), opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição.

32. O kit de cuidados ao paciente da Reivindicação 29, caracterizado por compreender a combinação de (a), (b) e (c), opcionalmente como composições separadas ou como parte da mesma composição.

8/8