BR112019025224A2 - Terapêutica para doença de armazenamento de glicogênio tipo iii - Google Patents

Abstract

esta invenção fornece uma faixa de moléculas de polinucleotídeo e oligômero traduzíveis para expressar uma amilo-alfa-1, 6- glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (agl) humana ou um fragmento da mesma que tem atividade de agl. as moléculas de polinucleotídeo e oligômero são expressáveis para fornecer a agl humana ou um fragmento do mesmo com atividade de agl. as moléculas podem ser usadas como agentes ativos para expressar um polipeptídeo ou proteína ativos em células ou indivíduos. os agentes podem ser usados em métodos para melhorar, prevenir, retardar o início ou tratar uma doença ou afecção associada à atividade reduzida de amilo-alfa1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (agl) em um sujeito.

Description

“TERAPÊUTICA PARA DOENÇA DE ARMAZENAMENTO DE GLICOGÊNIO TIPO III” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório Número de Série U.S. 62/513.350, depositado em 31 de maio de 2017, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0002] Esta invenção refere-se aos campos de biologia molecular e genética, bem como aos biofarmacêuticos e terapêuticas gerados a partir de moléculas traduzíveis. Mais particularmente, esta invenção refere-se a métodos, estruturas e composições para moléculas que têm capacidade de serem traduzidas em polipeptídeos ou proteínas ativos, para uso in vivo e como terapêuticas.

DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO ENVIADO ELETRONICAMENTE

[0003] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente é incorporado aqui por referência em sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome do arquivo: ULPI 041 O01WO SeqList ST25.txt, data registrada: 30 de maio de 2018, tamanho do arquivo: 226 kilobytes).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A doença de armazenamento de glicogênio tipo Ill (também conhecida como GSD Ill ou doença de Cori) é um erro congênito raro (incidência 1:100.000) do metabolismo do glicogênio causado pela deficiência de uma enzima de desfibramento de glicogênio conhecida como amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL). Esse distúrbio metabólico autossômico recessivo é caracterizado por envolvimento variável do fígado, músculo cardíaco e músculo esquelético.

[0005] Existem quatro subtipos de GSD Ill, com base nas diferenças na expressão tecidual da enzima deficiente, AGL. A GSD Illa é responsável por aproximadamente 85% de toda a GSD Ill e apresenta envolvimento hepático e muscular, resultante da deficiência de enzimas no fígado e nos músculos. A GSDIllb é responsável por aproximadamente 15% e geralmente apresenta apenas envolvimento hepático, resultante da deficiência de enzimas apenas no fígado. Enquanto isso, GSDIllc e GSDIlld são ambas extremamente velozes, em que se acredita que GSDlllc resulta de uma deficiência na atividade de degradação de glicosidase e GSDIIld como resultado de uma deficiência na atividade de degradação de transferase.

[0006] Na infância e na primeira infância, o envolvimento hepático se apresenta como hipoglicemia cetótica, hepatomegalia, hiperlipidemia e transaminases hepáticas elevadas. Na adolescência e na idade adulta, a doença hepática se torna menos proeminente. A cardiomiopatia hipertrófica se desenvolve na maioria das pessoas com GSD llla, geralmente durante a infância. Seu significado clínico varia de assintomático na maioria a disfunção cardíaca grave, insuficiência cardíaca congestiva e, raramente, morte súbita. A miopatia esquelética que se manifesta como fraqueza geralmente não é evidente na infância, mas progride lentamente, tornando-se proeminente em adultos.

[0007] De acordo com os órgãos afetados, as atividades aumentadas de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), fosfatase alcalina (ALP) e/ou creatina fosfoquinase (CPK) estão frequentemente presentes no soro de pacientes com GSD Ill.

[0008] Como observado acima, a GSD Ill é causada por uma deficiência na AGL. Essa deficiência é geralmente atribuída a mutações herdadas do gene de AGL, que resultam na abolição parcial ou total da atividade da enzima de AGL em um sujeito afetado por GSD Ill. Análises moleculares da proteína AGL em pacientes com GSD Ill foram realizadas em várias populações étnicas e mais de 100 diferentes mutações de AGL foram descritas. Consulte Goldstein et a/., 2010, Genet. Med. 12: 424 a 430. Consulte também Sentner et al., 2013, JIMD Rep. 7: 19 a 26.

[0009] Não existe atualmente nenhum tratamento eficaz de GSD Ill. Têm sido feitas tentativas para controlar hipoglicemia com refeições frequentes ricas em carboidratos, muitas vezes através do uso de alimentações de gotejamento noturno gástrico ou suplementos de amido de milho. Enquanto isso, pacientes com miopatia foram tratados com dietas ricas em proteínas durante o dia, mais infusões entéricas durante a noite. A melhora transitória dos sintomas foi documentada em alguns pacientes, mas não há dados a longo prazo que demonstrem que a dieta rica em proteínas previne ou trata a miopatia progressiva. Consulte Chen YT, Burchell A, Glycogen storage disease. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, The metabolic and molecular basis of inherited disease. Nova lorque: McGraw Hill, 1995: 935 a 965. A miopatia progressiva e/ou cardiomiopatia é uma das principais causas de morbidade em adultos, e foram relatados pacientes com cirrose hepática progressiva e carcinoma hepático. Assim, há uma necessidade urgente de terapia que possa abordar a causa subjacente desta doença, ou seja, a deficiência da atividade da enzima AGL.

[0010] Até o momento, a reposição enzimática não foi explorada em doenças nas quais a enzima defeituosa está presente no citosol, como AGL na GSD Ill, provavelmente devido à falta de um mecanismo de captação celular eficiente e específico que entregue enzima exógena na membrana plasmática no citoplasma.

[0011] A presente invenção aborda as necessidades acima mencionadas, fornecendo moléculas, estruturas e composições que têm a capacidade de serem traduzidas no citoplasma para fornecer AGL ativa, que pode melhorar, prevenir ou tratar uma doença ou afecção associada à deficiência de AGL, como GSD Ill.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] Esta invenção fornece composições que compreendem novas moléculas que têm a capacidade de ser traduzidas, que podem ser usadas para proporcionar um ou mais polipeptídeos ativos e proteínas, ou fragmentos dos mesmos. A invenção fornece ainda métodos de uso dessas composições que compreendem novas moléculas para a prevenção ou tratamento de vários distúrbios. Mais especificamente, as modalidades desta invenção fornecem composições que compreendem moléculas traduzíveis para fornecer amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) e métodos de uso das composições para o tratamento de GSD Ill.

[0013] As moléculas traduzíveis desta invenção podem ter atividade citoplasmática funcional para a produção de polipeptídeos ou proteínas de AGL. Os peptídeos e proteínas podem ser ativos para modalidades terapêuticas.

[0014] As moléculas traduzíveis desta invenção podem ter meia-vida longa, particularmente no citoplasma de uma célula. As moléculas traduzíveis podem ser expressáveis para fornecer um produto que é ativo para melhorar, prevenir ou tratar uma doença ou afecção associada a uma deficiência de AGL.

[0015] Esta divulgação fornece uma faixa de estruturas para moléculas traduzíveis para a produção de polipeptídeos ou proteínas AGL. Em algumas modalidades, as moléculas traduzíveis podem ter uma capacidade aumentada de ser traduzidas e/ou uma meia-vida estendida ao longo de um mRNA nativo.

[0016] As moléculas traduzíveis desta invenção podem ser usadas em medicamentos, e para métodos e composições para produzir e entregar polipeptídeos ativos e proteínas. As moléculas traduzíveis desta invenção podem ser usadas para fornecer polipeptídeos ou proteínas, in vitro, ex vivo ou in vivo.

[0017] Modalidades —“da presente divulgação fornecem uma faixa de novos polinucleotídeos para expressar uma amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana, ou um fragmento da mesma que tem atividade de AGL. Os polinucleotídeos podem incluir nucleotídeos naturais e nucleotídeos quimicamente modificados. Os polinucleotídeos podem ser expressáveis para fornecer uma AGL humana ou um fragmento da mesma com atividade de AGL.

[0018] Em aspectos adicionais, esta invenção fornece uma variedade de novos oligômeros traduzíveis que compreendem um ou mais monômeros de ácido nucleico desbloqueado (UNA) para expressar uma amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana ou um fragmento da mesma com atividade de AGL. Um oligômero traduzível pode conter um ou mais monômeros de UNA, juntamente com nucleotídeos naturais e nucleotídeos quimicamente modificados. Um oligêômero traduzível que compreende um ou mais monômeros de UNA pode ser expressável para fornecer a amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana, ou um fragmento da mesma que tem atividade de AGL.

[0019] Em certos aspectos, as moléculas traduzíveis desta invenção podem fornecer expressão de alta eficiência de um polipeptídeo ou proteína, ou um fragmento do mesmo. A expressão pode ser in vitro, ex vivo ou in vivo.

[0020] Em algumas modalidades, uma molécula desta invenção pode ter meia-vida citoplasmática aumentada ao longo de um mMRNA maduro nativo que codifica o mesmo polipeptídeo ou proteína. As moléculas e composições da invenção podem fornecer atividade celular funcional aumentada em relação a um mRNA maduro nativo.

[0021] Em outros aspectos, uma molécula traduzível desta invenção pode proporcionar maior atividade como um agente fármaco que fornece um produto peptídeo ou proteína, em comparação com um mMRNA maduro nativo. Uma molécula traduzível desta invenção pode reduzir o nível de dose requerido para a terapia eficaz.

[0022] Modalidades desta invenção incluem o seguinte.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] A Figura 1 mostra os resultados da expressão de amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL, NM 000028) humana in vitro com o uso de moléculas traduzíveis desta invenção. A Figura 1 mostra a expressão relativa de AGL nas células AML12 e C2C12 normalizadas para a molécula de referência 534. O eixo geométrico vertical reflete o aumento de dobra em relação à referência, por exemplo, sendo que 10 é um aumento de vezes em relação à referência. As moléculas, incluindo a molécula de referência, compreendem um vírus do tabaco gravitacional (TEV) 5 UTR e XenopusXenopus beta-globina (XBG) 3' UTR. As moléculas foram capeadas durante a transcrição e sintetizadas com N'-metilpseudouridina, de modo que 100% de uridinas fossem substituídas por N'-metilpseudouridina. As moléculas traduzíveis que codificam AGL foram transfectadas em duas linhas celulares (AML12, C2C12). As células foram lisadas e colhidas 6 horas após a transfecção. Realizou-se Western Blot quantitativo para detectar AGL com o uso de um anticorpo específico para AGL (ab133720, coelho).

[0024] A Figura 2 mostra os resultados da expressão de amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL, NM 000028) humana in vitro com o uso de moléculas traduzíveis desta invenção. A Figura 2 mostra a expressão relativa de AGL em células AML12 e C2C12 normalizadas para a molécula de referência 534. O eixo geométrico vertical reflete o aumento de dobra em relação à referência, por exemplo, sendo que 10 é um aumento de 10 vezes em relação à referência. As moléculas, incluindo a molécula de referência, compreendem um vírus do tabaco gravitacional (TEV) 5 UTR e Xenopus beta-globina (XBG) 3' UTR. As moléculas foram capeadas durante a transcrição e sintetizadas com N'-metilpseudouridina, de modo que 100% de uridinas fossem substituídas por N'-metilpseudouridina. As moléculas traduzíveis que codificam AGL foram transfectadas em duas linhas celulares (AML12, C2C12). As células foram lisadas e colhidas 24 horas após a transfecção. Realizou-se Western Blot quantitativo para detectar AGL com o uso de um anticorpo específico para AGL (ab133720, coelho).

[0025] A Figura 3 mostra os resultados da expressão de amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL, NM 000028) humana in vivo com o uso de moléculas traduzíveis desta invenção. A Figura 3 mostra a expressão relativa de AGL em camundongos WT para as moléculas traduzíveis 528 e 534 (referência) nos pontos de tempo 24 h e 48 h. As moléculas compreendem um do vírus do tabaco gravitacional (TEV) 5' UTR e um Xenopus beta-globina (XBG) 3' UTR. As moléculas foram capeadas durante a transcrição e sintetizadas com N'-metilpseudouridina, de modo que 100% de uridinas fossem substituídas por N'-metilpseudouridina. As moléculas traduzíveis que codificam AGL foram preparadas em uma formulação de nanopartículas lipídicas e injetadas intravenosamente em camundongos WT a 10 mg/kg. Os fígados de camundongos foram colhidos em 24 h e 48 h, e Western Blot quantitativo foi realizado para detectar AGL com o uso de um anticorpo específico para AGL (ab133720, coelho).

[0026] A Figura 4 mostra os resultados da expressão de amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL, NM 000028) humana in vivo com o uso de moléculas traduzíveis desta invenção. A Figura 4 mostra a expressão relativa do fígado de AGL em camundongos WT após a dose das moléculas traduzíveis 525, 527, 528, 529 e 546, em comparação com a linha de referência PBS (100). As moléculas traduzíveis sintetizadas 525, 527, 528, 529 e 546 que codificam AGL foram preparadas em uma formulação de nanopartículas lipídicas e injetadas via IP em camundongos WT. A dose injetada foi de 10 mpk e os fígados foram coletados às 6 h para posterior análise. Realizou-se Western Blot quantitativo para detectar AGL com o uso de um anticorpo específico para AGL (ab133720, coelho).

[0027] A Figura 5 mostra o resultado da expressão de AGL humano a partir de três moléculas traduzíveis: 546, 1783 e 1784. Os hepatócitos primários humanos foram transfectados com mRNA otimizado para códon e a expressão da proteína de AGL foi medida por In-Cell Western'Y 6, 24, 48 e 72 horas após a transfecção. A expressão das sequências de mMRNA foi comparada com um controle não tratado ("unt").

[0028] A Figura 6 mostra a expressão de AGL humana a partir de várias moléculas de mMRNA formuladas com nanopartículas lipídicas em camundongos C57BL/6 do tipo selvagem. A concentração de proteína (ng/mg) de AGL humana exógena expressa a partir de moléculas de mMRNA em homogenatos de amostras de biópsia hepática foi determinada por um ensaio de monitoramento de reação múltipla. As moléculas traduzíveis mostradas no gráfico como 546.1, 736.1, 738.1, 737.1, 731.1 e 1783.1 são as mesmas que 546, 736, 738, 737, 731 e 1783, respectivamente, conforme descrito no Exemplo 2. Enquanto isso, a molécula traduzível 546.7 tem a mesma sequência de nucleobases de 546, que é descrita no Exemplo 2, mas foi sintetizada com 5-metoxiuridina no lugar de uridina em vez de Nº- metilpseudouridina, que foi utilizada para sintetizar molécula traduzível 546.

[0029] A Figura 7 mostra a expressão de AGL de camundongo endógeno em camundongos C57BL/6 do tipo selvagem tratados com várias moléculas de mRNA formuladas com nanopartículas lipídicas. À concentração de proteína (ng/mg) de AGL de camundongo endógeno expressa em homogenatos de amostras de biópsia hepática foi determinada por um ensaio de monitoramento de reação múltipla. As moléculas traduzíveis mostradas no gráfico como 546.1, 736.1, 738.1, 737.1, 731.1 e 1783.1 são as mesmas que 546, 736, 738, 737, 731 e 1783, respectivamente, conforme descrito no Exemplo

2. Enquanto isso, a molécula traduzível 546.7 tem a mesma sequência de nucleobases de 546, que é descrita no Exemplo 2, mas foi sintetizada com 5- metoxiuridina no lugar de uridina em vez de N'-metilpseudouridina, que foi utilizada para sintetizar molécula traduzível 546.

[0030] A Figura 8 mostra a histopatologia de um fígado de um camundongo knockout de AGL tratado com veículo (VEH").

Observou-se vacuolização acentuada de hepatócitos e aumento moderado a acentuado no acúmulo de glicogênio nos hepatócitos tratados com veículo.

[0031] A Figura 9 mostra a histopatologia de um fígado de um camundongo knockout AGL tratado com a molécula traduzível 546 formulada com nanopartículas ATX2 lipídicas. Apenas vacuolização leve a moderada de hepatócitos e apenas aumentos leves a moderados no acúmulo de glicogênio nos hepatócitos foram observados nos hepatócitos tratados com a molécula traduzível 546 formulada com nanopartículas ATX2 lipídicas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] Esta invenção fornece uma faixa de novos agentes e composições a serem usados para aplicações terapêuticas. As moléculas e composições desta invenção podem ser usadas para melhorar, prevenir ou tratar a GSD Ill e/ou uma presença ou função reduzida associada à doença da amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito.

[0033] Em algumas modalidades, esta invenção abrange moléculas polinucleotídicas sintéticas, purificadas e traduzíveis para expressar uma amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase humana. As moléculas podem conter nucleotídeos naturais e quimicamente modificados e codificar a amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana, ou um fragmento do mesmo com atividade de AGL.

[0034] Em certas modalidades, esta divulgação inclui moléculas de oligômeros sintéticas, purificadas e traduzíveis que compreendem um ou mais monômeros de UNA para expressar uma amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana ou um fragmento da mesma com atividade de AGL. Um oligômero traduzível pode conter um ou mais monômeros de UNA, bem como nucleotídeos naturais e quimicamente modificados. Um oligôêômero traduzível que compreende um ou mais monômeros de UNA pode ser expressável “para fornecer a amilo-alfa-1, G6G-glicosidase, 4-alfa-

glucanotransferase (AGL) humana, ou um fragmento da mesma com atividade de AGL.

[0035] Como usado aqui, o termo "traduzível" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "expressável" e refere-se à capacidade de o polinucleotídeo, ou uma porção dele, ser convertido em um polipeptídeo por uma célula hospedeira. Como é entendido na técnica, tradução é o processo no qual ribossomos no citoplasma de uma célula criam polipeptídeos. Na tradução, o RNA mensageiro (mMRNA) é decodificado por tRNAs em um complexo de ribossomo para produzir uma cadeia de aminoácidos específica ou polipeptídeo. Além disso, o termo "traduzível", quando usado neste relatório descritivo em referência a um oligômero, significa que pelo menos uma porção do oligômero, por exemplo, a região de codificação de uma sequência de oligômeros (também conhecida como sequência de codificação ou CDS), tem capacidade de ser convertida em uma proteína ou um fragmento da mesma.

[0036] Como usado aqui, o termo "monômero" refere- se a uma única unidade, por exemplo, um único ácido nucleico, que pode ser unido a outra molécula do mesmo tipo ou diferente para formar um oligômero. Em algumas modalidades, um monômero pode ser um ácido nucleico desbloqueado, isto é, um monômero de UNA.

[0037] Enquanto isso, o termo "oligômero" pode ser usado de forma intercambiável com "polinucleotídeo" e refere-se a uma molécula que compreende pelo menos dois monômeros e inclui oligonucleotídeos, como DNAs e RNAs. No caso de oligêmeros que contêm monômeros de RNA e/ou monômeros de ácido nucleico desbloqueado (UNA), os oligômeros da presente invenção podem conter sequências além da sequência de codificação (CDS). Essas sequências adicionais podem ser sequências não traduzidas, isto é, sequências que não são convertidas em proteína por uma célula hospedeira. Essas sequências não traduzidas podem incluir um cap 5', uma região não traduzida em 5' (5' UTR), uma região não traduzida em 3' (3' UTR) e uma região de cauda, por exemplo, uma região de cauda poliA. Conforme descrito em maiores detalhes neste documento, qualquer uma dessas sequências não traduzidas pode conter um ou mais monômeros de UNA - esses monômeros de UNA não têm capacidade de serem traduzidos pelo maquinário de uma célula hospedeira. No contexto da presente invenção, um "oligômero traduzível", uma "molécula traduzível", "polinucleotídeo traduzível" ou "composto traduzível" refere-se a uma sequência que compreende uma região, por exemplo, a região de codificação de um RNA (por exemplo, a sequência de codificação de AGL humana ou uma versão otimizada por códon da mesma), que tem capacidade de ser convertida em uma proteína ou um fragmento da mesma, por exemplo, a proteína AGL humana ou um fragmento da mesma.

[0038] Como usado aqui, o termo "otimizado por códon" significa uma sequência de codificação natural (ou propositalmente projetada de uma natural) que foi redesenhada escolhendo diferentes códons sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína codificada, aumentando os níveis de expressão da proteína (Gustafsson et al., Codon bias and heterologous protein expression. 2004, Trends Biotechno! 22: 346 a 353). Variáveis como alto índice de adaptação de códons (CAI), método LowU, estruturas secundárias de MRNA, sequências reguladoras cis, conteúdo de GC e muitas outras variáveis semelhantes mostraram correlacionar-se um pouco com os níveis de expressão de proteínas (Villalobos et al., Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. 2006, BMC Bioinformatics 7: 285). O método de alto CAI (índice de adaptação de códons) seleciona um códon sinônimo usado com mais frequência para toda uma sequência de codificação de proteínas. O códon mais frequentemente usado para cada aminoácido é deduzido a partir de 74.218 genes codificadores de proteínas de um genoma humano. O método LowU visa apenas códons que contêm U que podem ser substituídos por um códon sinônimo com menos porções U. Se houver algumas opções para a substituição, o códon usado com mais frequência será selecionado. Os códons restantes na sequência não são alterados pelo método LowU. Esse método pode ser usado em conjunto com os mRNAs divulgados para projetar sequências de codificação que devem ser sintetizadas com 5- metoxiuridina.

[0039] Como será observado pelo versado na técnica equipado com a presente divulgação, as moléculas traduzíveis da presente invenção podem ser usadas para melhorar, prevenir ou tratar qualquer doença ou distúrbio associado à atividade reduzida (por exemplo, resultante de concentração, presença e/ou função reduzidas) da amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4- alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito. Em algumas modalidades, as moléculas traduzíveis desta invenção podem ser usadas em métodos para melhorar, prevenir ou tratar um ou mais dentre as GSD Illa, GSD Illb, GSDIlle e GSDIlld (referidas coletiva ou individualmente aqui como "GSD Ill" ou "doença de armazenamento de glicogênio tipo III”). A doença ou distúrbio a ser tratado neste documento (por exemplo, GSD Illa, GSD Illb, GSDIllc ou GSDIlIld) pode estar associado a baixo nível de açúcar no sangue (hipoglicemia), aumento do fígado (hepatomegalia), quantidades excessivas de gordura no sangue (hiperlipidemia), níveis sanguíneos elevados de enzimas hepáticas, doença hepática crônica (cirrose), insuficiência hepática, crescimento lento, baixa estatura, tumores benignos (adenomas), cardiomiopatia hipertrófica, disfunção cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, miopatia esquelética e/ou baixo tônus muscular (hipotonia). Em algumas modalidades, as moléculas traduzíveis da presente invenção podem ser usadas para melhorar, prevenir, ou tratar qualquer um ou todos esses sintomas acima mencionados.

[0040] Como é entendido pelo versado, o GSD Ill pode ser referido por qualquer número de nomes alternativos na técnica, incluindo, entre outros, deficiência de AGL, doença Cori, doença de Cori, deficiência de debrancher, doença de Forbes, deficiência de debrancher de glicogênio, GSD3 ou dextrinose limite (devido às estruturas semelhantes a dextrina limitadas no citosol). Por conseguinte, a GSD Ill pode ser usada de forma intercambiável com qualquer um desses nomes alternativos no relatório, nos exemplos, nos desenhos e nas reivindicações.

[0041] Uma molécula traduzida desta invenção que codifica uma porção química de AGL funcional pode ser entregue para o fígado, em particular, aos hepatócitos, de um paciente em necessidade (por exemplo, um paciente com GSD Ill) e pode elevar os níveis de AGL ativas do paciente. À molécula traduzível pode ser usada para a prevenir, tratar, melhorar ou reverter quaisquer sintomas de GSD Ill no paciente.

[0042] Em outros aspectos, uma molécula traduzível desta invenção também pode ser usada para reduzir a dependência de um paciente com GSD Ill de uma dieta especial para controlar a doença. Por exemplo, uma molécula traduzível desta invenção pode ser usada para reduzir a dependência de um paciente com GSD Ill de frequentes refeições e/ou dietas ricas em carboidrato anormalmente ricas em proteína.

[0043] As modalidades desta invenção abrangem ainda processos para produzir uma molécula traduzível para expressar uma amilo-alfa-1, G6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana. Os processos incluem a transcrição in vitro de um modelo de DNA AGL na presença de trifosfatos de nucleosídeos naturais e modificados quimicamente para formar uma mistura de produtos e purificar a mistura de produtos para isolar a molécula traduzível. Uma molécula traduzível também pode ser produzida por métodos como são conhecidos na técnica.

[0044] As moléculas desta invenção podem ser moléculas traduzíveis que contêm RNA e/ou monômeros de UNA. Essas moléculas traduzíveis podem ter meia-vida longa, principalmente no citoplasma. As moléculas traduzíveis de longa duração podem ser usadas para melhorar, prevenir, ou tratar a doença ou distúrbio associado com atividade reduzida (por exemplo, resultante da concentração, presença e/ou função reduzida) da amilo- alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito.

[0045] As propriedades das moléculas traduzíveis desta invenção surgem de acordo com a sua estrutura molecular, e a estrutura da molécula na sua totalidade, como um todo, pode proporcionar benefícios significativos, com base nessas propriedades. Modalidades desta invenção podem fornecer moléculas traduzíveis que têm uma ou mais propriedades que proporcionam vantajosamente concentração de proteína melhorada ou aumento da atividade de proteína. As moléculas e composições desta invenção podem fornecer formulações que compreendem agentes terapêuticos para melhorar, prevenir ou tratar qualquer doença ou distúrbio associado com a atividade reduzida (por exemplo, resultante de concentração, presença e/ou função reduzida) de amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito.

[0046] Esta invenção fornece uma faixa de moléculas traduzíveis que são surpreendentemente traduzíveis para fornecer polipeptídeo ativo ou proteínas, in vitro, ex vivo e in vivo.

[0047] Uma molécula traduzível desta invenção pode ser expressa para proporcionar um ou mais ativos polipeptídeos ou proteínas ou fragmentos dos mesmos.

[0048] As estruturas e composições traduzíveis e podem ter aumentada a atividade de translação ou uma meia-vida citoplasmática. Nessas modalidades, as estruturas e composições traduzíveis podem fornecer meia-vida funcional aumentada no citoplasma de células de mamíferos, em comparação com um mRNA nativo.

[0049] Tal como aqui usado, o termo “meia-vida” é o tempo necessário para que uma quantidade, tal como concentração ou atividade de ácido nucleico ou proteína a caia para a metade do seu valor medido no começo de um período de tempo.

[0050] Uma faixa de estruturas para moléculas traduzíveis desta invenção é aqui fornecida, incluindo oligômeros que contêm um ou mais monômeros de UNA. Um oligômero que contém um ou mais monômeros de UNA pode incorporar grupos de ligação especializados. Os grupos de ligação podem estar ligados a uma cadeia na molécula traduzível. Cada grupo de ligação também pode ser conectado a uma nucleobase.

[0051] Em alguns aspectos, um grupo de ligação pode ser um monômero. Monômeros podem ser ligados para formar uma molécula em cadeia. Em uma molécula de cadeia desta invenção, um monômero de grupo de ligação pode ser ligado em qualquer ponto da cadeia.

[0052] Em certos aspectos, os monômeros do grupo de ligação podem ser ligados a uma molécula da cadeia desta invenção, de modo que os monômeros do grupo de ligação residam perto das extremidades da cadeia ou em qualquer posição na cadeia.

[0053] Em outros aspectos, os grupos de ligação de uma molécula de cadeia podem ser ligados a uma nucleobase. A presença de nucleobases na molécula da cadeia pode fornecer uma sequência de nucleobases na molécula de cadeia.

[0054] Em certas modalidades, esta invenção fornece moléculas de oligôêômero traduzíveis que têm estruturas de cadeia que incorporem novas combinações de monômeros do grupo de ligação, juntamente com certos nucleotídeos naturais ou nucleotídeos não naturais ou nucleotídeos modificados, ou nucleotídeos modificados quimicamente.

[0055] As moléculas de oligômeros desta invenção podem exibir uma sequência de nucleobases e podem ser projetadas para expressar um polipeptídeo ou proteína, in vitro, ex vivo ou in vivo. O polipeptídeo ou proteína expresso pode ter atividade em várias formas, incluindo atividade correspondente a uma proteína expressa a partir de um mRNA do tipo natural, nativo ou selvagem, ou atividade correspondente a uma proteína negativa dominante ou negativa.

[0056] Em alguns aspectos, esta invenção pode fornecer moléculas de oligômeros ativas traduzíveis que têm uma sequência de base que é idêntica a pelo menos um fragmento de uma molécula de ácido nucleico nativo de uma célula.

[0057] Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula eucariótica, uma célula de mamífero ou uma célula humana.

[0058] Esta invenção fornece estruturas, métodos e composições para agentes oligoméricos traduzíveis que incorporam os monômeros do grupo de ligação. As moléculas oligoméricas desta invenção podem ser usadas como agentes ativos em formulações para terapêutica.

[0059] Esta invenção fornece uma faixa de moléculas traduzíveis que são úteis para proporcionar efeitos terapêuticos devido a sua capacidade de serem expressas como polipeptídeo ou proteína em uma célula de um sujeito.

[0060] Em certas modalidades, uma molécula traduzível pode ser estruturada como um oligêômero composto por monômeros. As estruturas oligoméricas desta invenção podem conter um ou mais monômeros do grupo de ligação, juntamente com certos nucleotídeos.

[0061] Em certas modalidades, uma molécula traduzível pode conter uma sequência de nucleobases e pode ser projetada para expressar um peptídeo ou proteína de qualquer isoforma, em parte por ter homologia suficiente com uma sequência de polinucleotídeo nativo.

[0062] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode ter de cerca de 200 a cerca de 12.000 monômeros de comprimento ou mais. Em certas modalidades, uma molécula traduzível pode ser de 1.000 a 9.000 monômeros de comprimento, a partir de 3.000 a 7.000 monômeros de comprimento ou de 4.000 a 6.000 monômeros de comprimento. Em uma modalidade exemplar, a molécula traduzível tem de 4.500 a 5.500 monômeros de comprimento. Em uma modalidade exemplar adicional, a molécula traduzível tem cerca de 5.000 monômeros de comprimento.

[0063] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode conter de 1 a cerca de 800 monômeros de UNA. Em certas modalidades, uma molécula traduzível pode conter de 1 a 600 monômeros de UNA, ou 1 a 100 monômeros de UNA ou 1 a 12 monômeros de UNA.

[0064] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode conter de 1 a cerca de 800 monômeros de ácido nucleico bloqueado (LNA). Em certas modalidades, uma molécula traduzível pode conter de 1 a 600 monômeros de LNA, ou 1 a 100 monômeros de LNA ou 1 a 12 monômeros de LNA.

[0065] Uma molécula traduzível desta invenção pode compreender um cap 5', uma região não traduzida em 5' de monômeros, uma região codificadora de monômeros, uma região não traduzida em 3' de monômeros e uma região de cauda de monômeros.

[0066] Uma molécula traduzível desta invenção pode compreender uma região não traduzida em 3' de monômeros que contêm um ou mais monômeros de UNA.

[0067] Uma molécula traduzível desta invenção pode compreender uma região de cauda de monômeros que contêm um ou mais monômeros de UNA.

[0068] Uma molécula traduzível desta invenção pode compreender regiões de sequências ou estruturas que são operáveis para tradução em uma célula ou que têm a funcionalidade de regiões de um mMRNA incluindo, por exemplo, um cap 5', uma região não traduzida em 5', uma região de codificação, uma região não traduzida em 3' e uma cauda poliA.

[0069] A presente invenção contempla ainda métodos para entregar um ou mais vetores que compreendem uma ou mais moléculas traduzíveis para uma célula. De acordo com outras modalidades, a invenção também contempla entregar ou uma ou mais moléculas traduzíveis a uma célula.

[0070] Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas traduzíveis podem ser entregues a uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Os métodos de transferência viral e não viral, como são conhecidos na técnica, podem ser usados para introduzir moléculas traduzíveis em células de mamíferos. As moléculas traduzíveis podem ser entregues com um veículo farmaceuticamente aceitável, ou por exemplo, com nanopartículas ou lipossomas.

[0071] Em algumas modalidades, estruturas e composições traduzíveis desta invenção podem reduzir o número e frequência de transfecções necessárias para a manipulação de células-destino em cultura, em comparação com a utilização de composições nativas.

[0072] Em aspectos adicionais, esta invenção fornece atividade aumentada para moléculas traduzíveis como agente ativo, em comparação com a utilização de um mRNA nativo.

[0073] Em alguns aspectos, esta invenção pode fornecer moléculas traduzíveis que podem reduzir a resposta imune celular inata, em comparação com a induzida por um ácido nucleico, polipeptídeo ou proteína nativo.

[0074] Esta invenção pode fornecer moléculas traduzíveis sintéticas que são refratárias à deadenilação em comparação com moléculas nativas.

[0075] Em certas modalidades, esta invenção pode fornecer moléculas traduzíveis sintéticas com atividade específica aumentada e meia-vida funcional mais longa em comparação com moléculas nativas. As moléculas traduzíveis sintéticas desta invenção podem fornecer níveis aumentados de expressão de proteína ectópica. Quando se expressa uma molécula traduzível com o uso de um vetor, celular de entrega pode ser em níveis aumentados, e citotóxicos respostas imunitárias inatas podem ser fixadas, de modo que os níveis mais elevados de expressão de proteína ectópica podem ser alcançados. As moléculas traduzíveis desta invenção podem ter um aumento da atividade específica e uma meia-vida mais longa funcional do que os MRNAs nativos.

[0076] Em certos aspectos, uma molécula traduzível pode ter diversas mutações em relação a um mRNA nativo.

[0077] Em outras modalidades, esta invenção pode fornecer moléculas traduzíveis com porções químicas de entrega e direcionamento cliváveis ligadas na extremidade 3' e/ou na extremidade 5'.

[0078] Em geral, a atividade específica para uma molécula traduzível sintética entregue por transfecção pode ser vista como o número de moléculas de proteína expressas por transcrito entregue por unidade de tempo.

[0079] Como aqui usado, a eficiência de tradução refere-se a uma medida da produção de uma proteína ou polipeptídeo por tradução de uma molécula traduzível in vitro ou in vivo.

[0080] Esta invenção fornece uma faixa de moléculas de oligômeros traduzíveis, que podem conter um ou mais monômeros de UNA e vários monômeros de ácido nucleico, em que a molécula traduzível pode ser expressável para fornecer um polipeptídeo ou proteína.

[0081] Em algumas modalidades, esta invenção inclui uma faixa de moléculas de oligômeros traduzíveis, que podem conter um ou mais monômeros de UNA em uma ou mais regiões não traduzidas e um número de monômeros de ácido nucleico, em que a molécula traduzível pode ser expressável para fornecer um polipeptídeo ou proteína.

[0082] Em algumas modalidades, esta invenção inclui uma faixa de moléculas traduzíveis, que contêm um ou mais monômeros de UNA em uma região de cauda e um número de monômeros de ácido nucleico, em que a molécula traduzível pode ser expressável para fornecer um polipeptídeo ou proteína.

[0083] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode conter um cap 5' modificado.

[0084] Em outras modalidades, uma molécula traduzível pode conter uma região de monômeros não traduzida em 5' que melhora a tradução.

[0085] Em modalidades adicionais, uma molécula traduzível pode conter uma região de monômeros não traduzida 3' que melhora a tradução.

[0086] Em modalidades adicionais, uma molécula traduzível pode conter um ou mais monômeros de UNA em uma região de monômeros não traduzida 3'.

[0087] Em outras modalidades, uma molécula traduzível pode conter um ou mais monômeros de UNA em uma região de cauda dos monômeros.

[0088] Em outras modalidades, uma molécula traduzível pode conter um ou mais monômeros de UNA em uma cauda de poliA.

[0089] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode conter um ou mais monômeros de LNA em uma região de monômeros não traduzida 3' ou em uma região de cauda de monômeros, por exemplo, em uma cauda de poliA.

[0090] Em outro aspecto, uma molécula traduzível desta invenção pode exibir pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior eficiência de tradução in vivo em comparação com um mRNA nativo que codifica o mesmo produto de tradução.

[0091] Em um aspecto adicional, uma molécula traduzível pode produzir pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes mais um nível de polipeptídeo ou proteína aumentado in vivo, em comparação com um mRNA nativo que codifica o mesmo polipeptídeo ou proteína.

[0092] Em certas modalidades, uma molécula traduzível pode fornecer níveis aumentados de um polipeptídeo ou proteína in vivo em comparação com um mRNA nativo que codifica o mesmo polipeptídeo ou proteína. Por exemplo, o nível de um polipeptídeo ou proteína pode ser aumentado em 10%, ou 20%, ou 30%, ou 40% ou 50% ou mais.

[0093] Em modalidades adicionais, esta invenção fornece métodos para o tratamento de uma doença ou afecção em um sujeito, administrando ao sujeito uma composição que contém uma molécula traduzível da invenção.

[0094] Uma molécula traduzível desta invenção pode ser usada para melhorar, prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio, por exemplo, uma doença ou distúrbio associado a atividade reduzida (por exemplo, resultante de concentração, presença e/ou função reduzida) de amilo-alfa-1, 6- glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito. Nessas modalidades, uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção pode ser administrada para regular, modular ou aumentar a concentração ou eficácia da enzima AGL em um sujeito. Em alguns aspectos, a enzima pode ser uma enzima natural não modificada da qual o paciente tem uma quantidade anormal (por exemplo, um paciente com uma versão mutada do AGL que abole parcial ou totalmente a atividade do AGL). Em alguns aspectos, a enzima pode ser uma enzima AGL natural não modificada que pode ser usada para tratar um paciente portador de uma versão mutada do AGL. Em modalidades exemplares, uma molécula traduzível desta invenção pode ser usada para melhorar, prevenir ou tratar a GSD Ill.

[0095] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode ser entregue às células ou sujeitos e traduzida para aumentar os níveis de AGL na célula ou no sujeito.

[0096] Tal como aqui usado, o termo “sujeito” refere- se a um ser humano ou qualquer outro animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho, cão, gato, gado, suínos, ovelhas, cavalos ou primatas). Um ser humano inclui formas pré e pós-natal. Em muitas modalidades, um sujeito é um ser humano. Um sujeito pode ser um paciente, que se refere a um ser humano que se apresenta a um médico para diagnóstico ou tratamento de uma doença. O termo "sujeito" é aqui usado de forma intercambiável com "indivíduo" ou "paciente". Um sujeito pode ser atingido por ou é suscetível a uma doença ou distúrbio, mas pode ou não exibir sintomas da doença ou distúrbio.

[0097] Em uma modalidade exemplar, um sujeito da presente invenção é um sujeito com atividade reduzida (por exemplo, resultante de concentração, presença e/ou função reduzida) de amilo-alfa-1, 6-glicosidase,

4-alfa-glucanotransferase (AGL). Em uma modalidade exemplar adicional, o sujeito é um ser humano.

[0098] Em algumas modalidades, administrar uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção pode resultar em maiores níveis de proteína AGL no fígado em um sujeito tratado. Em algumas modalidades, administrar uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção resulta em cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de aumento nos níveis de proteína AGL no fígado em relação ao nível basal de proteína AGL no sujeito antes do tratamento. Em uma modalidade exemplar, administrar uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção resulta em um aumento nos níveis de AGL no fígado em relação aos níveis basais de AGL no fígado no sujeito antes do tratamento. Em algumas modalidades, o aumento nos níveis de AGL no fígado pode ser de pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200% ou mais.

[0099] Em algumas modalidades, a proteína AGL que é expressa a partir de uma molécula traduzível da invenção que é detectável no fígado, soro, plasma, rim, coração, músculo, cérebro, líquido cefalorraquidiano ou linfonodos. Em modalidades exemplares, a proteína AGL é expressa nas células do fígado, por exemplo, hepatócitos de um sujeito tratado.

[00100] Em algumas modalidades, administrar uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção resulta na expressão de um nível de proteína AGL humana natural não mutada (isto é, AGL normal ou do tipo selvagem, em oposição a AGL anormal ou mutada) em ou acima de cerca de 10 ng/mg, cerca de 20 ng/mg, cerca de 50 ng/mg, cerca de 100 ng/mg, cerca de 150 ng/mg, cerca de 200 ng/mg, cerca de 250 ng/mg, cerca de 300 ng/mg, cerca de 350 ng/mg, cerca de 400 ng/mg, cerca de 450 ng/mg, cerca de 500 ng/mg, cerca de 600 ng/mg, cerca de 700 ng/mg, cerca de 800 ng/mg, cerca de 800 ng/mg, cerca de 900 ng/mg, cerca de 1.000 ng/mg, cerca de 1.200 ng/mg ou cerca de 1.500 ng/mg da proteína total no fígado de um sujeito tratado.

[00101] Conforme usado neste documento, o termo “cerca de" ou "aproximadamente" conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor que é semelhante a um valor de referência indicado. Em certas modalidades, o termo "aproximadamente" ou “cerca de" refere-se a uma faixa de valores que caem dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior ou menor que) do valor de referência indicado, salvo indicação em contrário ou evidente do contexto (exceto quando esse número exceder 100% de um valor possível).

[00102] Em algumas modalidades, a expressão da proteína AGL humana natural e não mutada é detectável 6, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60 e/ou 72 horas após a administração de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção. Em algumas modalidades, a expressão da proteína AGL humana natural e não mutada é detectável 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias e/ou 7 dias após a administração de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção. Em algumas modalidades, a expressão da proteína AGL humana natural e não mutada é detectável 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e/ou 4 semanas após a administração. Em algumas modalidades, a expressão da proteína AGL humana natural e não mutada é detectável após a administração de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção. Em algumas modalidades, a expressão da proteína AGL humana natural e não mutada é detectável no fígado, por exemplo, hepatócitos, após administração de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção.

MODELOS DE VARIANTES PARA A PRODUZIR MOLÉCULAS TRADUZÍVEIS

[00103] Em várias modalidades descritas aqui, o oligômero traduzível pode compreender um mRNA que codifica AGL, em que o mMRNA que codifica AGL é otimizado por códon. Em algumas modalidades, a

AGL é AGL humana (isto é, hAGL). Em algumas modalidades, a AGL humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a AGL humana consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[00104] Em algumas modalidades, um modelo de DNA variante pode ser usado para produzir uma molécula traduzível com capacidade de codificar AGL. Um modelo de DNA variante desta divulgação pode exibir vantagens em processos para produzir uma molécula traduzível e a eficiência da molécula traduzível. A variação do modelo pode ser utilizada para melhorar a incorporação de nucleotídeos ou monômeros modificados em uma molécula traduzível desta invenção. Em certos aspectos, a variação do modelo pode ser utilizada para aprimorar as características estruturais da molécula traduzível. As características estruturais aprimoradas da molécula traduzível podem fornecer propriedades inesperadamente vantajosas, incluindo a eficiência da tradução para fornecer um produto polipeptídico ou proteico.

[00105] Em alguns aspectos desta invenção, a variação do modelo pode incluir a redução da ocorrência ou frequência de aparecimento de certos nucleotídeos na cadeia do modelo. Reduzir a ocorrência de um certo nucleotídeo pode alterar as estruturas e processos desta divulgação para fornecer formas não nativas, que alcançam propriedades surpreendentemente aprimoradas de um produto de RNA traduzível que codifica AGL.

[00106] Os aspectos desta invenção podem exigir um modelo de DNA variante nos processos para produzir uma molécula traduzível. Uma molécula de DNA pode ter um filamento de modelo não codificante de nucleotídeos que pode ser transcrita para fornecer uma molécula alvo traduzível que codifica AGL.

[00107] Uma molécula alvo traduzível pode ser qualquer RNA, seja nativo ou modificado, sintético ou derivado de uma fonte natural.

[00108] Em algumas modalidades, um modelo de DNA variante pode ser usado para o qual um quadro de leitura aberto do filamento de modelo é transformado para uma forma alternativa, preservando a atribuição de códons.

[00109] Em certas modalidades, um modelo de DNA pode ser usado para os quais nucleotídeos alternativos são usados com base na otimização alternativa de códons e/ou degenerescência de sequência.

[00110] Em modalidades adicionais, um modelo de DNA pode ter certos nucleotídeos substituídos por nucleotídeos alternativos, preservando a atribuição de códons.

[00111] Modalidades — desta invenção utilizam vantajosamente códons alternativos em um modelo de DNA desta invenção para serem usados em processos para produzir uma molécula traduzível que codifica AGL. As variações que podem ser alcançadas em um modelo de DNA desta invenção podem ter um escopo muito maior do que para células e organismos, que podem requerer códons preferidos em muitos processos. Nesta invenção, uma ampla faixa de códons e posições alternativos pode ser usada em um modelo de DNA para transcrever uma molécula traduzível.

[00112] Em aspectos adicionais desta invenção, a variação do modelo pode incluir a redução da ocorrência ou frequência de aparecimento de certos nucleotídeos na cadeia do modelo. Por exemplo, a ocorrência de um nucleotídeo em um modelo pode ser reduzida para um nível abaixo de 25% dos nucleotídeos no modelo. Em outros exemplos, a ocorrência de um nucleotídeo em um modelo pode ser reduzida para um nível abaixo de 20% de nucleotídeos no modelo. Em alguns exemplos, a ocorrência de um nucleotídeo em um modelo pode ser reduzida para um nível abaixo de 16% dos nucleotídeos no modelo. Em certos exemplos, a ocorrência de um nucleotídeo em um modelo pode ser reduzida para um nível abaixo de 12% dos nucleotídeos no modelo.

AGL HUMANA

[00113] O gene AGL humano codifica uma proteína de

1.532 aminoácidos com uma massa molecular de aproximadamente 174,8 kDa. A AGL é uma enzima multifuncional que atua como 1,4-alfa-D-glucana:1,4-alfa- D-glucan-4-alfa-D-glicosiltransferase = e uma —amilo-1,6-glicosidase na degradação do glicogênio. Como observado acima, a deficiência genética da atividade normal de AGL causa a doença de armazenamento de glicogênio Ill.

[00114] A sequência de codificação de AGL humana de consenso tem uma sequência de RNA de 4.599 nucleobases, mostrada na SEQ ID NO: 1.

[00115] A sequência de codificação de AGL humana de consenso - encontrada no NCBI No. de acesso NP 000019.2 - se traduz na SEQ ID NO: 2.

[00116] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode ser feita e usada para expressar a amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4- alfa-glucanotransferase (hAGL) com eficiência de tradução vantajosamente aumentada, em comparação com um mMRNA nativo de hAGL. A molécula traduzível que expressa hAGL pode exibir atividade adequada para uso em métodos para melhorar, prevenir ou tratar doenças. Em algumas modalidades, a molécula traduzível pode compreender um ou mais monômeros de UNA.

[00117] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode incluir um cap 5', uma UTR 5', uma sequência de iniciação da tradução, por exemplo, uma sequência Kozak, um AGL CDS humano, uma 3'UTR e/ou uma região de cauda. Em uma modalidade exemplar, uma molécula traduzível pode incluir um cap 5' (mn7GpppGm), uma UTR 5' do vírus do tabaco (TEV), uma sequência de Kozak, uma AGL CDS humana, uma UTR 3' da Xenopus beta-globina e uma região de cauda. Em outras modalidades exemplares, a AGL CDS humana pode compreender uma sequência otimizada por códon de SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45, descritas em mais detalhes abaixo. Em qualquer uma dessas e outras modalidades aqui descritas,

a molécula traduzível pode compreender um ou mais monômeros de UNA. Em qualquer uma dessas e outras modalidades aqui descritas, a molécula traduzível pode compreender um ou mais monômeros de LNA.

[00118] A eficiência de tradução da molécula pode ser aumentada em comparação com um MRNA nativo de AGL. Em particular, após 48 horas, a eficiência de tradução da molécula pode ser mais do que duplicada em comparação com o mMRNA nativo de AGL.

[00119] Em algumas modalidades, uma sequência de mMRNA adequada para a presente invenção compreende uma sequência de ARNm que codifica para a proteína AGL humana. A sequência da proteína AGL humana de ocorrência natural é mostrada na SEQ ID NO: 2.

[00120] Em algumas modalidades, uma sequência de MRNA adequada pode ser uma sequência de MRNA que codifica um homólogo ou variante de AGL humana. Como usado aqui, um homólogo ou uma variante da proteína AGL humana pode ser uma proteína AGL humana modificada que contém uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em comparação com uma proteína AGL humana de tipo selvagem ou de ocorrência natural, mantendo atividade proteica substancial de AGL. Em algumas modalidades, um mRNA adequado para a presente invenção codifica uma proteína substancialmente idêntica à proteína AGL humana. Em algumas modalidades, um mRNA adequado para a presente invenção codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um mRNA adequado para a presente invenção codifica um fragmento ou uma porção da proteína AGL humana.

[00121] Em algumas modalidades, um mMRNA adequado para a presente invenção codifica um fragmento ou uma porção da proteína AGL humana, em que o fragmento ou porção da proteína ainda mantém a atividade do AGL semelhante à da proteína do tipo selvagem.

[00122] Em algumas modalidades, um mMRNA adequado para a presente invenção compreende uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

[00123] Em algumas modalidades, uma molécula oligomérica traduzível da presente invenção compreende uma sequência de codificação que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45. Em algumas modalidades, uma molécula oligomérica traduzível que compreende uma sequência de codificação que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45 compreende ainda uma ou mais sequências selecionadas a partir de um cap 5', uma UTR 5', uma sequência de iniciação da tradução, uma UTR 3' e uma região de cauda.

[00124] Em algumas modalidades, uma molécula oligomérica traduzível da presente invenção compreende uma sequência de codificação que é inferior a 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência codificante de AGL humana do tipo selvagem ao longo da sequência codificante de AGL humana de comprimento total da SEQ ID NO: 1, e expressa uma proteína AGL humana funcional. Em uma modalidade exemplar, uma molécula oligomérica traduzível da presente invenção compreende uma sequência de codificação que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humano do tipo selvagem ao longo da sequência de codificação de AGL humano de comprimento total da SEQ ID NO: 1 e expressa uma proteína AGL humana funcional. Em outra modalidade exemplar, uma molécula oligomérica traduzível da presente invenção compreende uma sequência de codificação que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humana de SEQ ID NO: 1 e expressa uma proteína AGL humana funcional, em que a sequência de codificação é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45. Em ainda outra modalidade exemplar, uma molécula oligomérica traduzível da presente invenção compreende uma sequência de codificação que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humana de SEQ ID NO: 1 e expressa uma proteína AGL humana funcional, em que a sequência de codificação é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45. Em ainda outra modalidade exemplar, uma molécula oligomérica traduzível da presente invenção compreende uma sequência de codificação que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humana de SEQ ID NO: 1 e expressa uma proteína AGL humana funcional, em que a sequência de codificação é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 45. Por conseguinte, em algumas modalidades, o presente pedido fornece um polinucleotídeo que compreende ou que consiste em uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo da sequência de codificação de AGL humana de comprimento total da SEQ ID NO: 1,e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45. Em uma modalidade exemplar, o presente pedido fornece um polinucleotídeo que compreende ou consiste em uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humana de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 45. Em uma modalidade específica, o presente pedido fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humana de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade específica, o presente pedido fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humana de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação humana AGL é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade específica, o presente pedido fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana do tipo selvagem ao longo de toda a sequência de codificação de AGL humano de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação humana AGL é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 45.

[00125] Em algumas modalidades, uma molécula oligomérica traduzível da invenção codifica uma proteína de fusão que compreende um comprimento total, fragmento ou porção de uma proteína de AGL fundida com outra sequência (por exemplo, uma fusão terminal N ou C). Em algumas modalidades, a sequência de terminal N ou C é uma sequência de sinal ou uma sequência de direcionamento celular.

MONÔMEROS E OLIGÔMEROS DE UNA

[00126] Em algumas modalidades, os monômeros do grupo de ligação podem ser núcleo-monômeros desbloqueados (monômeros de

UNA), que são pequenas moléculas orgânicas baseadas em uma estrutura de propano-1,2,3-tri-il-trisoxi, como mostrado abaixo: R' R3 Ox 2 À kom Base o 3

MONÔMERO DE UNA

[00127] em que R' e R? são H, e R' e R2 podem ser ligações fosfodiéster, de base pode ser uma nucleobase e Rº é um grupo funcional descrito abaixo.

[00128] Em outra visão, os átomos principais do monômero de UNA podem ser desenhados na notação IUPAC da seguinte maneira: Unidade de monômero de UNA R3

JS

AM O--[|--P—rO—C!—C2—CI—O--j--P > direção da cadeia

[00129] em que a direção do progresso da cadeia oligomérica é da extremidade 1 à extremidade 3 do resíduo de propano.

[00130] Exemplos de uma nucleobase incluem uracila, timina, citosina, 5-metilcitosina, adenina, guanina, inosina e análogos de nucleobases naturais e não naturais.

[00131] Exemplos de uma nucleobase incluem pseudouracila, 1-metilpseudouracila (m1YW), isto é, N'i-metilpseudouracila e 5- metoxiuracila.

[00132] Em geral, um monômero de UNA, que não é um nucleotídeo, pode ser um monômero ligante interno em um oligômero. Um monômero de UNA interno em um oligômero é flanqueado por outros monômeros de ambos os lados.

[00133] Um monômero de UNA pode participar do pareamento de bases quando o oligômero forma um complexo ou duplex, por exemplo, e existem outros monômeros com nucleobases no complexo ou duplex.

[00134] Exemplos de monômero de UNA como monômeros internos flanqueados em ambas a posição propano-1-ila e a posição de propano-3-ila, em que R? é -OH, são mostrados abaixo.

2 1 o P “o on A e At ó ST Ho Son N N z < DT De N 2 n Cs " AN, - ” UNA-A UNA-U

? PS 22O—Pp 1 O-.. OP 1 O-.. “o ot “ao om A o or o or 2 Oo. 2 H

NÇZ TS N N N

Y H (x CA Y* gm N N H | ” HN-n. - o. UNA-C UNA-G

[00135] Um monômero de UNA pode ser um monômero terminal de um oligômero, em que o monômero de UNA está ligado a apenas um monômero na posição propano-í-ila ou na posição propano-3-ila. Como os monômeros de UNA são estruturas orgânicas flexíveis, diferentemente dos nucleotídeos, o monômero de UNA terminal pode ser um terminador flexível para o oligôêômero.

[00136] Exemplos de um monômero de UNA como um monômero terminal ligado na posição propano-3-ila são mostrados abaixo.

CS F HO Proa, es —P 1 O. Ho A RO con, — oH SL o Q/TOH NoN Er.)

Y N <ÃS x

N AN N NH H2N Oo UNA-A terminal UNA-U terminal

2? ? Hop 1 O. Hop 1 O. Ho or A no “o, - o OH E /oH ENro z

N A N N NH Y 2 C. < O ” N NH NH? o UNA-C terminal UNA-G terminal

[00137] Como um monômero de UNA pode ser uma molécula flexível, um monômero de UNA como monômero terminal pode assumir conformações amplamente diferentes. Um exemplo de uma conformação de monômero de UNA minimizada em energia como um monômero terminal conectado na posição propano-3-ila é mostrado abaixo. o 7 1 o Ho Po e, ” Ho o! Ho ” Po o /or qui To” Ns Ns NA o SÃO ' N AN H2N í à H2N N AN Ho Formas terminais UNA-A: a ligação tracejada mostra a ligação de propano-3-ila

[00138] Entre outras coisas, a estrutura do monômero de UNA permite que ele seja ligado a nucleotídeos que ocorrem naturalmente.

[00139] Um oligôêômero de UNA pode ser uma cadeia composta por monômeros de UNA, bem como vários nucleotídeos que podem ser baseados em nucleosídeos de ocorrência natural.

[00140] Em algumas modalidades, o grupo funcional de R?º de um monômero de UNA pode ser -OR$, -SRº, -NRº2, -NH(C=O)Rº, morfolino, morfolin-1-ila, piperazin-1-ila ou 4-alcanoil-piperazin-1-ila, em que Rº é o mesmo ou diferente em cada ocorrência, e pode ser H, alquila, um colesterol, uma molécula de lipídio, uma poliamina, um aminoácido ou um polipeptídeo.

[00141] Os monômeros de UNA são moléculas orgânicas. Os monômeros de UNA não são monômeros ou nucleotídeos de ácidos nucleicos, nem são nucleosídeos de ocorrência natural ou nucleosídeos de ocorrência natural modificados.

[00142] Um oligôêômero de UNA desta invenção é uma molécula de cadeia sintética.

[00143] Em algumas modalidades, como mostrado acima, um monômero de UNA pode ser UNA-A (designado À), UNA-U (designado Ú), UNA-C (designado É) e UNA-G (designado É).

[00144] As designações que podem ser usadas aqui incluem mA, mG, mC e mU, que se referem aos ribonucleotídeos modificados com 2'-O-metila.

[00145] As designações que podem ser usadas aqui incluem dT, que se refere a um nucleotídeo 2'-desoxi T.

[00146] Como aqui usado, no contexto de sequências de oligômeros, o símbolo N pode representar qualquer monômero de nucleotídeo natural ou qualquer monômero de nucleotídeo modificado.

[00147] Como aqui usado, no contexto de sequências de oligômeros, o símbolo Q representa um monômero de nucleotídeo não natural, modificado ou quimicamente modificado.

[00148] Como aqui usado, no contexto de sequências de oligômeros, o símbolo X pode ser usado para representar um monômero de UNA.

NUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS E QUIMICAMENTE MODIFICADOS

[00149] Nos exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados neste documento, um substituinte alquila, cicloalquila ou fenila pode ser não substituído ou ainda substituído por um ou mais substituintes alquila, halo, haloalquila, amino ou nitro.

[00150] Exemplos de monômeros de ácidos nucleicos incluem nucleotídeos não naturais, modificados e quimicamente modificados, incluindo quaisquer nucleotídeos conhecidos na técnica.

[00151] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados incluem B5-hidroxicitidinas, 5-alquilcitidinas, 5- hidroxialquilcitidinas, S-carboxicitidinas, 5-formilcitidinas, 5-alcoxicitidinas, 5- alquinilcitidinas, — 5-halocitidinas, — 2-tiocitidinas, Nº-alquilcididinas, Nº aminocitidinas, Ni-acetilcitidinas e Nº Ni-dialquilcitidinas.

[00152] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente — modificados incluem 5-hidroxicitidinay S5-metilcitidina,y 5- hidroximetilcitidina, = 5-carboxicitidina, 5-formilcitidina, 5-metoxicitidina, 5- propinilcitidina, 5-bromocitidina, 5-ioditidina, 2-tiocitidina; Nº-metilcitidina, Nº- aminocitidina, N *-acetilcitidina e Nº, Ni-dimetilcitidina.

[00153] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados incluem B5-hidroxiuridinas, 5-alquiluridinas, 5- hidroxialquiluridinas, B-carboxiuridinas, B-carboxialquilesteruridinas, 5- formiluridinas, 5-alcoxiuridinas, 5-alquiniluridinas, 5-halouridinas, 2-tiuridinas e 6- alquiluridinas.

[00154] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente — modificados incluem B5-hidroxiuridinay S5-metiluridinay 5- hidroximetiluridina, 5-carboxiuridina, 5-carboximetilesteruridina, 5-formiluridina, 5-metoxiuridina, 5-propiniluridina, 5-bromouridina, 5-fluorouridina, 5-iodouridina, 2-tiouridina e 6-metiluridina.

[00155] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente — modificados incluem 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5- metilaminometil-2-tiouridina, = 5-carbamoilmetiluridina, — 5-carbamoilmetil-2'-O- metiluridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropi)pseudouridina, 5- metilaminometil-2-selenouridina, 5-carboximetiluridina, 5-metildi-hidrouridina, 5-

taurinometiluridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, 5-(isopentenilaminometil)uridina, 2'-O-metilpseudouridina, 2-tio-2'O-metiluridina e 3,2'-O-dimetiluridina.

[00156] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados incluem Nº-metiladenosina, 2-aminoadenosina, 3- metiladenosina, 8-azaadenosina, 7-deazaadenosina, 8-oxoadenosina, 8- bromoadenosina, 2-metiltio-Nº-metiladenosina, N$-isopenteniladenosina, 2- metiltio-Nº-isopenteniladenosina, — Nº-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, — 2- metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, Nº-glicinilcarbamoiladenosina, Nº- treonilcarbamoil-adenosina, Nº-metil-Nº-treonilcarbamoil-adenosina, 2-metiltio- Nº-treonilcarbamoil-adenosina, Nº Nº-dimetiladenosina, Nº- hidroxinorvalilcarbamoiladenosine, 2-metiltio-Nº-hidroxinorvalilcarbamoil- adenosina, Nº-acetil-adenosina, 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi- adenina, alfa-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina, N6,2'-O-dimetil-adenosina, Nº ,Nº,2-O-trimetil-adenosina, 1,2'-O-dimetil-adenosina, 2'-O-ribosiladenosina, 2-amino-Nº-metil-purina, 1-tio-adenosina, 2'-F-ara-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'-OH-ara-adenosina e Nº-(19-amino-pentaoxanonadecil|)-adenosina.

[00157] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados incluem N'-alquilguanosinas, N?-alquilguanosinas, tienoguanosinas, 7-deazaguanosinas, 8-oxoguanosinas, 8-bromoguanosinas, O-alquilguanosinas, xantosinas, inosinas e N'-alquilinosinas.

[00158] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados incluem N'-metilguanosina, Nº-metilguanosina, tienoguanosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoguanosina, 8-bromoguanosina, Oº- metilguanosina, xantosina, inosina e N'-metilinosina.

[00159] Exemplos de nucleotídeos modificados ou quimicamente — modificados — incluem — pseudouridinas. Exemplos de pseudouridinas incluem N'-alquilpseudouridinas, N'-cicloalquilpseudouridinas, N'-hidroxipseudouridinas, N'-hidroxialquilpseudouridinas, Nº- fenilpseudouridinas, N-fenilalquilpseudouridinas, Nº- aminoalquilpseudouridinas, Nº-alquilpseudouridinas, Nº-alquilpseudouridinas,

Nº-alcoxipseudouridinas, Nº-hidroxipseudouridinas, Nº- hidroxialquilpseudouridinas, Nº-morfolinopseudouridinas, Nº-fenilpseudouridinas e Nº-halopseudouridinas. Exemplos de pseudouridinas incluem N'-alquil-Nº- alquilpseudouridinas, N-alquil-Nº-alcoxipseudouridinas, N-alquil-N6- hidroxipseudouridinas, = N'-alquil-Nº-hidroxialquilpseudouridinas, Ni-alquil-N6- morfolinopseudouridinas, — Ni-alquil-Nº-fenilpseudouridinas e —Ni-alquil-Nº- halopseudouridinas. Nesses exemplos, os substituintes alquila, cicloalquila e fenila podem ser não substituídos ou ainda substituídos por substituintes alquila, halo, haloalquila, amino ou nitro.

[00160] Exemplos de pseudouridinas incluem Nº'- metilpseudouridina, — Ni-etilpseudouridina, — N'-propilpseudouridina, — Nº- ciclopropilpseudouridina, N'-fenilpseudouridina, N'-aminometilpseudouridina, Nº-metilpseudouridina, N'-hidroxipseudouridina e N'-hidroximetilpseudouridina.

[00161] Exemplos de monômeros de ácidos nucleicos incluem nucleotídeos modificados e quimicamente modificados, incluindo quaisquer nucleotídeos conhecidos na técnica.

[00162] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem quaisquer desses nucleotídeos conhecidos na técnica, por exemplo, ribonucleotídeos 2'-O-metila, nucleotídeos 2'-O-metil-purina, ribonucleotídeos 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleotídeos 2'-desoxi-2'-fluoro pirimidina, ribonucleotídeos 2'-desoxi, nucleotídeos 2'-desoxi- purina, nucleotídeos de base universais, 5-C-metil-nucleotídeos e resíduos de monômeros desoxiabásicos invertidos.

[00163] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem nucleotídeos estabilizados na extremidade 3', nucleotídeos 3'-glicerila, nucleotídeos abásicos invertidos em 3' e timidina invertida em 3'.

[00164] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleotídeos 2'-0,4-C-metileno-(D-ribofuranosil),

nucleotídeos 2'-metoxietoxi (MOE), 2'-metil-tio-etila, nucleotídeos 2'-desoxi-2"- fluoro e os nucleotídeos 2'-O-metila. Em uma modalidade exemplar, o monômero modificado é um nucleotídeo de ácido nucleico bloqueado (LNA).

[00165] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem DNAs modificados com 2',4' com restrição de 2'-O-metoxietila (CMOE) e 2"-O-etila (cEt) modificados.

[00166] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem nucleotídeos 2'-amino, nucleotídeos 2'-O-amino, nucleotídeos 2'-C-alila e nucleotídeos 2'-O-alila.

[00167] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem nucleotídeos Nº- metiladenosina.

[00168] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem monômeros de nucleotídeos com bases modificadas 5-(3-amino)propiluridina, 5-(2-mercapto)etiluridina, 5- bromouridina; 8-bromoguanosina ou 7-desaza-adenosina.

[00169] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem nucleotídeos substituídos por 2'-O-aminopropila.

[00170] Exemplos de monômeros de nucleotídeos modificados e quimicamente modificados incluem a substituição do grupo 2':-OH de um nucleotídeo por um 2'-R, um 2:-OR, um 2'-OR, um 2'-halogênio, um 2:-SR ou um 2'-amino, em que R pode ser H, alquila, alquenila ou alquinila.

[00171] Alguns exemplos de nucleotídeos modificados são dados em Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag,

1984.

[00172] Exemplos de modificações de base descritas acima podem ser combinados com modificações adicionais da estrutura do nucleosídeo ou nucleotídeo, incluindo modificações de açúcar e modificações de ligação.

[00173] Certos monômeros de nucleotídeos modificados ou quimicamente modificados podem ser encontrados na natureza.

MOLÉCULAS TRADUZÍVEIS QUE CONTÊM UM OU MAIS MONÔMEROS DE UNA

[00174] Os aspectos desta invenção fornecem estruturas e composições para moléculas traduzíveis que são compostos oligoméricos contendo um ou mais monômeros de UNA. Os oligômeros traduzíveis podem ser agentes ativos para composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, os oligôêmeros traduzíveis codificam AGL humana ou uma variante da mesma.

[00175] Uma molécula oligomérica traduzível desta invenção pode conter um ou mais monômeros de UNA. As moléculas oligoméricas desta invenção podem ser usadas como agentes ativos em formulações para fornecer peptídeos e proteínas terapêuticas. Em algumas modalidades, os oligôêmeros traduzíveis codificam AGL humana ou uma variante da mesma.

[00176] Em algumas modalidades, esta invenção fornece compostos oligoméricos traduzíveis com uma estrutura que incorpora novas combinações de monômeros de UNA com certos nucleotídeos naturais, nucleotídeos não naturais, nucleotídeos modificados ou nucleotídeos quimicamente modificados.

[00177] Os compostos oligoméricos traduzíveis desta invenção podem ter um comprimento de cerca de 200 a cerca de 12.000 bases de comprimento. Os compostos oligoméricos traduzíveis desta invenção podem ter um comprimento de cerca de 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000,

8.000 ou cerca de 9.000 bases. Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos traduzíveis desta invenção podem ter um comprimento de cerca de

4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900, 5.000,

5.100, 5.200, 5.300, 5.400 ou cerca de 5.500 bases. Em uma modalidade exemplar, o composto oligomérico traduzível da invenção tem um comprimento de cerca de 5.000 bases.

[00178] Em aspectos adicionais, os compostos oligoméricos traduzíveis desta invenção que compreendem um ou mais monômeros de UNA podem ser moléculas farmacologicamente ativas. Uma molécula oligomérica traduzível pode ser usada como ingrediente farmacêutico ativo para gerar um peptídeo ou agente ativo de proteína in vitro, in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade exemplar, o composto oligomérico traduzível desta invenção codifica AGL humana ou uma sua variante.

[00179] Uma molécula oligomérica traduzível desta invenção pode ter a estrutura de Fórmula |:

R E) n Fórmula |

[00180] em que L' é uma ligação, n é de 200 a 12.000 e para cada ocorrência L? é um grupo de ligação de UNA com a fórmula -C!—- C2-C?-, em que R está ligado a C? e tem a fórmula -OCH(CH2Rº)R5, em que R? é -ORt, -SRº, -NR%2, —NH(C=O)Rº, morfolino, morfolin-1-ila, piperazin-1-ila ou 4-alcanoil-piperazin-1-ila, em que Rº é o mesmo ou diferente em cada ocorrência e é H, alguila, um colesterol, uma molécula de lipídio, uma poliamina, um aminoácido ou um polipeptídeo, e em que R5 é uma nucleobase, ou Lº(R) é um açúcar, tal como uma ribose e R é uma nucleobase, ou L? é um açúcar modificado tal como uma ribose modificada e R é uma nucleobase. Em certas modalidades, uma nucleobase pode ser uma nucleobase modificada. L' pode ser uma ligação fosfodiéster.

[00181] A sequência base de uma molécula oligomérica traduzível pode ser qualquer sequência de nucleobases.

[00182] Em alguns aspectos, uma molécula oligomérica traduzível desta invenção pode ter qualquer número de ligações intermonômeros de fosforotioato em qualquer local do intermonômero.

[00183] Em algumas modalidades, qualquer uma ou mais das ligações intermonômeras de uma molécula oligomérica traduzível pode ser um fosfodiéster, um fosforotioato incluindo ditioatos, um fosforotioato quiral e outras formas quimicamente modificadas.

[00184] Quando uma molécula oligomérica traduzível termina em um monômero de UNA, a posição terminal tem uma extremidade 1, ou a posição terminal tem uma extremidade 3, de acordo com a numeração posicional mostrada acima.

TRADUÇÃO MELHORADA

[00185] Uma molécula traduzível desta invenção pode incorporar uma região que melhora a eficiência de tradução da molécula.

[00186] Em geral, as regiões intensificadoras da tradução, como conhecidas na técnica, podem ser incorporadas na estrutura de uma molécula traduzível para aumentar o rendimento de peptídeos ou proteínas.

[00187] Uma molécula traduzível que contém uma região intensificadora da tradução pode proporcionar maior produção de peptídeo ou proteína.

[00188] Em algumas modalidades, uma região intensificadora da tradução pode compreender ou estar localizada em uma região não traduzida 5' ou 3' de uma molécula traduzível.

[00189] Exemplos de regiões melhoradoras da tradução incluem regiões melhoradoras que ocorrem naturalmente a partir de TEV 5S'UTR e Xenopus beta-globina 3'UTR.

ESTRUTURAS E SEQUÊNCIAS MOLECULARES

[00190] Uma molécula traduzível pode ser projetada para expressar um peptídeo ou proteína alvo. Em algumas modalidades, o peptídeo ou proteína alvo pode ser associado a uma afecção ou doença em um sujeito.

[00191] Em alguns aspectos, a sequência base de uma molécula traduzível pode incluir uma porção que é idêntica a pelo menos uma porção ou domínio eficaz de uma sequência base de um MRNA, em que uma porção eficaz é suficiente para transmitir uma atividade terapêutica a uma tradução produto do traduzível molécula.

[00192] Em alguns aspectos, esta invenção fornece moléculas traduzíveis ativas que têm uma sequência de bases idêntica a pelo menos um fragmento de uma molécula nativa de ácido nucleico de uma célula.

[00193] Em certas modalidades, a sequência de bases de uma molécula traduzível pode incluir uma porção que é idêntica a uma sequência de bases de um mRNA, exceto para uma ou mais mutações de base. O número de mutações para a molécula traduzível não deve exceder uma quantidade que iria produzir um produto de tradução da molécula traduzível que tem substancialmente menos atividade do que o MRNA.

[00194] As moléculas de UNA oligoméricas e traduzíveis desta invenção podem exibir uma sequência de nucleobases e podem ser projetadas para expressar um peptídeo ou proteína, in vitro, ex vivo ou in vivo. O peptídeo ou proteína expressa pode ter atividade em várias formas, incluindo atividade correspondente à proteína expressa a partir de um MRNA nativo ou natural.

[00195] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível desta invenção podem ter um comprimento de cadeia de cerca de 400 a 15.000 monômeros, em que qualquer monômero que é um monômero não de UNA pode ser um monômero N ou Q.

ESTRUTURA MOLECULAR CAP

[00196] Uma molécula traduzível desta invenção pode ter uma extremidade 5' tapada com vários grupos e seus análogos, como são conhecidos na técnica. Em uma modalidade exemplar, o cap 5' pode ser um cap m7GpppGm. De acordo com outras modalidades, o cap 5' pode ser selecionado a partir de mM7GpppA, m7GpppC; análogos de cap não metilado (por exemplo, GpppG); análogo de cap dimetilado (por exemplo, m2,7GpppG), um análogo de cap trimetilado (por exemplo, m2,2,7GpppG), análogos de cap simétrico dimetilado (por exemplo, m7Gpppm7G) ou análogos anti-cap reverso (por exemplo, ARCA; m7, 2'OmeGpppG, m72'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'GpppG e seus derivados de tetrafosfato) (consulte, por exemplo, Jemielity, J. et al., RNA 9: 1108 a 1122 (2003). Em outras modalidades, o cap 5º pode ser um cap ARCA (3-OMe-m7G (5') pppG). O cap 5' pode ser um mCAP (M7G(5')ppp(5')G, N7-Metil-Guanosina-5'-Trifosfato-5'-Guanosina). O cap 5' pode ser resistente à hidrólise.

[00197] Alguns exemplos de estruturas de caps 5' são apresentados nos documentos WO2015/051169A2, WO/2015/061491 e Patentes Nos. US 8.093.367 e 8.304.529.

REGIÃO DE CAUDA

[00198] Em algumas modalidades, o oligômero traduzível que codifica AGL compreende uma região de cauda, que pode servir para proteger o MRNA da degradação da exonuclease. Em algumas modalidades, a região de cauda pode ser uma cauda poliA.

[00199] As caudas de PoliA podem ser adicionadas usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando a polimerase A para adicionar caudas ao RNA transcrito sintético ou in vitro. Outros métodos incluem o uso de um vetor de transcrição para codificar caudas de poli A ou o uso de uma ligase (por exemplo, através da ligação de splint usando uma ligase de RNA T4 e/ou ligase de DNA T4), em que poliA pode ser ligado à extremidade 3' de um RNA de sentido. Em algumas modalidades, é utilizada uma combinação de qualquer um dos métodos acima.

[00200] Em algumas modalidades, um oligômero traduzível compreende uma estrutura de cauda polit 3. Em algumas modalidades, o comprimento da cauda de poliA pode ser pelo menos cerca de

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 ou 300 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma cauda de poliA 3' contém cerca de 5 a 300 nucleotídeos de adenosina (por exemplo, cerca de 30 a 250 nucleotídeos de adenosina, cerca de 60 a 220 nucleotídeos de adenosina, cerca de 80 a 200 nucleotídeos de adenosina, ou cerca de 90 a cerca de 150 nucleotídeos de adenosina, ou cerca de 100 a cerca de 120 nucleotídeos de adenosina). Em uma modalidade exemplar, a cauda poliA 3' tem cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade exemplar, a cauda poliA 3' tem cerca de 115 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade exemplar, a cauda poliA 3' tem cerca de 250 nucleotídeos de comprimento.

[00201] Em algumas modalidades, a cauda poliA 3' compreende um ou mais monômeros de UNA. Em algumas modalidades, a cauda poliA 3' contém 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais monômeros de UNA. Em uma modalidade exemplar, a cauda poliA 3' contém 2 monômeros de UNA. Em uma outra modalidade exemplar, a cauda poliA 3' contém 2 monômeros de UNA que são encontrados consecutivamente, isto é, contíguos um ao outro na cauda poliA 3'.

[00202] Em uma modalidade exemplar, a cauda poliA 3' compreende ou consiste em uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade exemplar, a cauda poliA 3' compreende ou consiste em uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 38. Em ainda outra modalidade exemplar, a cauda poliA 3' compreende ou consiste em uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 39.

[00203] Em algumas modalidades, o oligômero traduzível compreende uma estrutura de cauda poliC 3. Em algumas modalidades, o comprimento da cauda poliC pode ser pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 ou 300 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma cauda poliC 3' contém cerca de 5 a 300 nucleotídeos de citosina (por exemplo, cerca de 30 a 250 nucleotídeos de citosina, cerca de 60 a 220 nucleotídeos de citosina, cerca de 80 a cerca de 200 nucleotídeos de citosina, ou cerca de 90 a 150 nucleotídeos de citosina, ou cerca de 100 a cerca de 120 nucleotídeos de citosina). Em uma modalidade exemplar, a cauda poli 3' tem cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade exemplar, a cauda poliC 3' tem cerca de 115 nucleotídeos de comprimento. À cauda poliC pode ser adicionada à cauda poliA ou pode substituir a cauda poliA. A cauda poliC pode ser adicionada à extremidade 5' da cauda poliA ou à extremidade 3' da cauda poliA.

[00204] Em algumas modalidades, o comprimento da cauda de poli A e/ou poli C é ajustado para controlar a estabilidade de uma molécula oligomérica traduzível modificada da invenção e, portanto, a transcrição de proteína. Por exemplo, como o comprimento da cauda de poliA pode influenciar a meia-vida de uma molécula traduzível, o comprimento da cauda de poliA pode ser ajustado para modificar o nível de resistência do MRNA às nucleases e, assim, controlar o tempo de expressão da polinucleotídeo e/ou produção de polipeptídeo em uma célula alvo.

REGIÕES NÃO TRADUZIDAS 5' E 3' (UTRS)

[00205] Em algumas modalidades, o oligômero traduzível que codifica AGL pode compreender uma região não traduzida em 5' e/ou uma região não traduzida 3'. Como é entendido na técnica, a UTR 5' e/ou 3' pode afetar a estabilidade ou a eficiência da tradução de um mMRNA. Em uma modalidade exemplar, o oligômero traduzível compreende uma UTR 5º e uma UTR 3".

[00206] Em algumas modalidades, o oligômero pode compreender uma UTR 5' que é pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma UTR 5' contém cerca de 50 a 300 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 75 a 250 nucleotídeos, cerca de 100 a 200 nucleotídeos, cerca de 120 a 150 nucleotídeos ou cerca de 135 nucleotídeos). Em uma modalidade exemplar, a UTR 5' tem cerca de 135 nucleotídeos de comprimento.

[00207] Em algumas modalidades, a UTR 5º é derivada de uma molécula de mRNA conhecida na técnica como relativamente estável (por exemplo, enzimas do ciclo da histona, tubulina, globina, GAPDH, actina ou ácido cítrico) para aumentar a estabilidade do oligômero traduzível. Em outras modalidades, uma sequência UTR 5' pode incluir uma sequência parcial de um gene CMV imediato-precoce 1 (IE1). Exemplos de sequências UTR 5' podem ser encontrados na Patente US No. 9.149.506. Em algumas modalidades, a UTR 5' compreende uma sequência selecionada das UTRs 5' da IL-6 humana, alanina aminotransferase 1, apolipoproteína E humana, cadeia alfa de fibrinogênio humano, transtiretina humana, haptoglobina humana, alfa-1- anticrimotripsina humana, antitrombina humana, alfa-1-antitripsina humana, albumina humana, beta globina humana, complemento humano C3, complemento humano C5, SynK, AT1G58420, beta globina de camundongo, albumina de camundongo e um vírus etch do tabaco, ou fragmentos de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade exemplar, a UTR 5' é derivada de um vírus de etch do tabaco (TEV). Em uma modalidade exemplar adicional, a UTR 5' compreende ou consiste em uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3. Em ainda outra modalidade exemplar, a UTR 5' é um fragmento de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, como um fragmento de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 ou 125 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 3.

[00208] Em algumas modalidades, a molécula oligomérica traduzível compreende um local interno de entrada do ribossomo (IRES). Como é entendido na técnica, um IRES é um elemento de RNA que permite o início da tradução de maneira independente da extremidade. Em modalidades exemplares, o IRES está na UTR 5º. Em outras modalidades, o IRES pode estar fora da UTR 5.

[00209] Em algumas modalidades, o oligômero pode compreender uma UTR 3' que é pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma UTR 3' contém cerca de 50 a 300 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 75 a 250 nucleotídeos, cerca de 100 a 200 nucleotídeos, cerca de 140 a 175 nucleotídeos ou cerca de 160 nucleotídeos). Em uma modalidade exemplar, o UTR 3' tem cerca de 160 nucleotídeos de comprimento.

[00210] Em algumas modalidades, o UTR 3 compreende um ou mais monômeros de UNA. Em algumas modalidades, o UTR 3' contém 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais monômeros de UNA.

[00211] Exemplos de sequências UTR 3' podem ser encontrados na Patente US No. 9.149.506. Em algumas modalidades, a UTR 3' compreende uma sequência selecionada das UTRs 3' da alanina aminotransferase 1, apolipoproteína E humana, cadeia alfa de fibrinogênio humano, haptoglobina humana, antitrombina humana, alfa globina humana, beta globina humana, complemento humano C3, fator de crescimento humano, hepcidina humana, MALAT-1, beta globina de camundongo, albumina de rato e beta globina de Xenopus, ou fragmentos de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade exemplar, a UTR 3' é derivada de Xenopus beta globina. Em outra modalidade exemplar, a UTR 3' é derivada de Xenopus beta globina e contém um ou mais monômeros de UNA. Em uma modalidade exemplar adicional, a UTR 3' compreende ou consiste em uma sequência estabelecida nas SEQ ID NOs: 5 e 33-37. Em ainda outra modalidade exemplar, a UTR 3' é um fragmento de uma sequência estabelecida nas SEQ ID NOs: 5 e 33-37, como um fragmento de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 5 e 33-37.

[00212] Em certas modalidades exemplificativas, o oligômero traduzível que codifica AGL compreende uma sequência de UTR 5'

de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de UTR 3' selecionada a partir de SEQ ID NOs: 5 e 33-37. Em algumas modalidades, o oligôêômero traduzível que codifica AGL compreende ainda uma cauda poliA mostrada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a sequência de codificação de MRNA de AGL compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

CÓDON DE PARADA TRIPLA

[00213] Em algumas modalidades, o oligômero traduzível que codifica AGL pode compreender uma sequência imediatamente a jusante do CDS que cria um códon de parada tripla. O códon de tripla parada pode ser incorporado para aumentar a eficiência da tradução. Em algumas modalidades, o oligômero transacionável pode compreender a sequência AUAAGUGAA (SEQ ID NO: 40) imediatamente a jusante de um PAH CDS aqui descrito, como exemplificado nas SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41445.

LOCAIS DE INICIAÇÃO DA TRADUÇÃO

[00214] Em algumas modalidades, o oligômero traduzível que codifica AGL pode compreender um local de iniciação da tradução. Tais sequências são conhecidas na técnica e incluem a sequência de Kozak. Consulte, por exemplo, Kozak, Marilyn (1988) Mol. e Cell Biol., 8: 2737 a 2744; Kozak, Marilyn (1991) J. Biol. Chem., 266: 19867 a 19870; Kozak, Marilyn (1990) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8301 a 8305; e Kozak, Marilyn (1989) J. Cell Biol, 108: 229-241; e as referências aí citadas. Tal como é entendido na técnica, uma sequência de Kozak é uma sequência de consenso curta centrada em torno do local de iniciação da tradução de mRNAs eucarióticos que permite a iniciação eficiente da tradução do MRNA. A maquinaria de tradução ribossômica reconhece o códon de iniciação do AUG no contexto da sequência de Kozak.

[00215] Em algumas modalidades, o local de iniciação da tradução, por exemplo, uma sequência de Kozak, é inserido a montante da sequência de codificação para AGL. Em algumas modalidades, o local de iniciação da tradução é inserido a jusante de uma UTR 5'. Em certas modalidades exemplares, o local de iniciação da tradução é inserido a montante da sequência de codificação para AGL e a jusante de uma UTR 5'.

[00216] Como é entendido na técnica, o comprimento da sequência de Kozak pode variar. Geralmente, aumentar o comprimento da sequência líder aprimora a tradução.

[00217] Em algumas modalidades, o oligômero traduzível que codifica AGL compreende uma sequência de Kozak com a sequência de SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades exemplares, o oligômero traduzível que codifica AGL compreende uma sequência Kozak com a sequência da SEQ ID NO: 4, em que a sequência Kozak está imediatamente a jusante de uma UTR 5' e imediatamente a montante da sequência de codificação para AGL.

MÉTODOS DE SÍNTESE

[00218] Em vários aspectos, esta invenção fornece métodos para síntese de moléculas mensageiras traduzíveis.

[00219] As moléculas traduzíveis desta invenção podem ser sintetizadas e isoladas usando métodos aqui divulgados, bem como quaisquer técnicas pertinentes conhecidas na técnica.

[00220] Alguns métodos para a preparação de ácidos nucleicos são apresentados em, por exemplo, Merino, Chemical Synthesis of Nucleoside Analogues, (2013); Gait, Oligonucleotide synthesis: a practical approach (1984); Herdewijn, Oligonucleotide Synthesis, Methods in Molecular Biology, Vol. 288 (2005).

[00221] Em algumas modalidades, uma molécula traduzível pode ser feita por reação de transcrição in vitro (IVT). Uma mistura de nucleosídeo trifosfatos (NTP) pode ser polimerizada usando reagentes T7, por exemplo, para produzir RNA a partir de um modelo de DNA. O modelo de DNA pode ser degradado com a DNase livre de RNase e o RNA separado por coluna.

[00222] Em algumas modalidades, uma ligase pode ser usada para ligar um oligômero sintético à extremidade 3' de uma molécula de RNA ou um transcrito de RNA para formar uma molécula traduzível. O oligômero sintético que está ligado à extremidade 3' pode fornecer a funcionalidade de uma cauda poliA e, vantajosamente, fornecer resistência à sua remoção por 3'-exoribonucleases. O produto ligado de molécula traduzível pode ter aumentado a atividade específica e proporciona níveis elevados de expressão da proteína ectópica aumentada.

[00223] Em certas modalidades, o produto ligado das moléculas traduzíveis da presente invenção pode ser feito com um transcrito de RNA que tem especificidade nativa. O produto ligado pode ser uma molécula sintética que retém a estrutura do transcrito de RNA na extremidade 5' para garantir a compatibilidade com a especificidade nativa.

[00224] De acordo com outras modalidades, o produto ligado das moléculas traduzíveis da presente invenção pode ser feito com um transcrito de RNA exógeno ou RNA não natural. O produto ligado pode ser uma molécula sintética que retém a estrutura do RNA.

[00225] Sem desejar ser limitado pela teoria, a via de degradação do mRNA canônico nas células inclui as etapas: (i) a cauda poliA é gradualmente cortada em um stub por exonucleases 3', interrompendo a interação de loop necessária para uma tradução eficiente e deixando o cap aberto ao ataque; (ii) complexos de decapagem removem o cap 5'; (ili) o resíduo desprotegido e translacionalmente incompetente do transcrito é degradado pela atividade da exonuclease 5' e 3'.

[00226] Modalidades desta invenção envolvem novas estruturas traduzíveis que podem ter aumentada a atividade de tradução ao longo de uma transcrição nativa. Entre outras coisas, as moléculas traduzíveis aqui podem impedir as exonucleases de cortar a cauda de poliA no processo de desadenilação.

[00227] Modalidades “desta invenção fornecem estruturas, composições e métodos para moléculas traduzíveis. Modalidades desta invenção podem fornecer moléculas traduzíveis contendo um ou mais monômeros de UNA e tendo meia-vida funcional aumentada.

[00228] Verificou-se que a ligação de um oligômero sintético à extremidade 3' de um transcrito de MRNA pode surpreendentemente ser realizada com conversão elevada do transcrito de MRNA para o produto de ligação.

[00229] Como usado aqui, os termos oligômero de cauda poliA e poliA se referem a um oligômero de monômeros, em que os monômeros podem incluir nucleotídeos baseados em adenina, monômeros de UNA, nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos modificados ou análogos de nucleotídeos.

[00230] Os oligômeros para ligação à extremidade 3' de um RNA podem ter de 2 a 120 monômeros de comprimento, ou de 3 a 120 monômeros de comprimento, ou de 4 a 120 monômeros de comprimento, ou de a 120 monômeros de comprimento ou mais. Em uma modalidade exemplar, o oligômero para ligação tem cerca de 30 monômeros de comprimento.

FORMULAÇÕES À BASE DE LIPÍDIOS

[00231] As formulações à base de lipídios têm sido cada vez mais reconhecidas como um dos sistemas de entrega de RNA mais promissores devido à sua biocompatibilidade e facilidade de produção em larga escala. Os lipídios catiônicos têm sido amplamente estudados como materiais sintéticos para a entrega de RNA. Após a mistura, os ácidos nucléicos são condensados por lipídios catiônicos para formar complexos lipídicos/ácidos nucleicos, conhecidos como lipoplexos. Esses complexos lipídicos são capazes de proteger o material genético da ação das nucleases e entregá-lo às células, interagindo com a membrana celular carregada negativamente. Os lipoplexos podem ser preparados misturando diretamente lipídios com carga positiva a pH fisiológico com ácidos nucleicos com carga negativa.

[00232] Os lipossomas convencionais consistem em uma bicamada lipídica que pode ser composta de (fosfo)lipídios e colesterol catiônicos, aniônicos ou neutros, que encerra um núcleo aquoso. Tanto a bicamada lipídica quanto o espaço aquoso podem incorporar compostos hidrofóbicos ou hidrofílicos, respectivamente. As características e o comportamento dos lipossomas in vivo podem ser modificados pela adição de um revestimento de polímero hidrofílico, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), à superfície do lipossoma para conferir estabilização estérica. Além disso, os lipossomas podem ser usados para direcionamento específico anexando ligantes (por exemplo, anticorpos, peptídeos e carboidratos) à sua superfície ou à extremidade terminal das cadeias PEG anexadas (Front Pharmacol. 2015 Dec 1;6:286).

[00233] Os lipossomas são sistemas de administração baseados em lipídios e tensoativos, coloidais, compostos por uma bicamada fosfolipídica que circunda um compartimento aquoso. Eles podem se apresentar como vesículas esféricas e podem variar em tamanho de 20 nm a alguns mícrons. Os lipossomas baseados em lipídios catiônicos são capazes de complexar com ácidos nucleicos carregados negativamente por meio de interações —* eletrostáticas, resultando em complexos que oferecem biocompatibilidade, baixa toxicidade e a possibilidade de produção em larga escala necessária para aplicações clínicas in vivo. Os lipossomas podem fundir- se com a membrana plasmática para captação; uma vez dentro da célula, os lipossomas são processados pela via endocítica e o material genético é então liberado do endossoma/carreador para o citoplasma. Os lipossomas são há muito vistos como veículos de administração de medicamentos devido à sua superior biocompatibilidade, uma vez que os lipossomos são basicamente análogos das membranas biológicas e podem ser preparados a partir de fosfolipídios naturais e sintéticos (Int J] Nanomedicine. 2014; 9: 1833 a 1843).

[00234] Os lipossomas catiônicos têm sido tradicionalmente os sistemas de distribuição não viral mais comumente usados para oligonucleotídeos, incluindo DNA plasmídico, oligos antissentido e SIRNA/SIRNA/gancho de cabelo pequeno RA-sShRNA. Lipídios catiônicos, como

DOTAP, (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano) e DOTMA (N-[l-(2,3- dioleoiloxi)propil]-N,N N-trimetil-amônio sulfato de metila) podem formar complexos ou lipoplexos com ácidos nucleicos carregados negativamente para formar nanopartículas por interação eletrostática, proporcionando alta eficiência de transfecção in vitro. Além disso, foram desenvolvidos nanolipossomos neutros à base de lipídios para a entrega de RNA como, por exemplo, nanolipossomos neutros à base de |,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC). (Adv Drug Deliv Rev. Fev de 2014; 66: 110 a 116.)

[00235] De acordo com algumas modalidades, os polinucleotídeos expressáveis e as construções de mRNA heterólogos aqui descritos são formulados em lipídios. A formulação lipídica é preferencialmente selecionada dentre, mas não se limitando a, lipossomas, lipoplexos, copolímeros, como PLGA, e nanopartículas lipídicas. Em uma modalidade preferida, uma nanopartícula lipídica (LNP) compreende:

[00236] (a) um ácido nucleico,

[00237] (b) um lipídio catiônico,

[00238] (c) um agente redutor de agregação (como lipídio de polietileno glicol (PEG) ou lipídio modificado por PEG),

[00239] (d) opcionalmente, um lipídio não catiônico (como um lipídio neutro), e

[00240] (e) opcionalmente, um esterol.

[00241] Em uma modalidade, a formulação de nanopartículas lipídicas consiste em (i) pelo menos um lipídio catiônico; (ii) um lipídio neutro; (iii) um esterol, por exemplo colesterol; e (iv) um lipídio de PEG, em uma razão molar de cerca de 20 a 60% de lipídio catiônico: 5 a 25% de lipídio neutro: 25 a 55% de esterol; 0,5 a 15% de lipídio PEG.

FORMULAÇÕES LIPÍDICAS QUE CONTÊM TIOCARBAMATO E CARBAMATO

[00242] Alguns exemplos de lipídios e composições lipídicas para entrega de uma molécula ativa desta invenção são dados em

WO/2015/074085 e USSN 15/387.067, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o lipídio é um composto da seguinte fórmula: R,-O o Ra Va AXN. o N G R3 R5 L> Fo o R2

[00243] em que

[00244] R: e R2 ambos consistem em uma alquila linear que consiste em 1 a 14 átomos de carbono ou alquenila ou alquinila que consiste em 2 a 14 átomos de carbono;

[00245] L1 e L2 ambos consistem em um alquileno ou alquenileno linear que consiste em 5 a 18 átomos de carbono ou formando um heterociclo com N;

[00246] Xés,;

[00247] L3 consiste em uma ligação ou um alquileno linear que consiste em 1 a 6 átomos de carbono, ou formando um heterociclo com N;

[00248] R3 consiste em um alquileno linear ou ramiíficado que consiste em 1 a 6 átomos de carbono; e

[00249] Ra e R5 são o mesmo ou diferente, cada um, consistindo em um átomo de hidrogênio ou uma alquila linear ou ramificada que consiste em 1 a 6 átomos de carbono;

[00250] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00251] A formação lipídica pode conter um ou mais lipídios catiônicos ionizáveis selecionados dentre os seguintes:

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LIPÍDIOS CATIÔNICOS

[00252] A nanopartícula lipídica inclui preferencialmente um lipídio catiônico adequado para formar uma nanopartícula lipídica. De preferência, o lipídio catiônico carrega uma carga positiva líquida aproximadamente a pH fisiológico.

[00253] O lipídio catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N-dioleil-N N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N N-distearil- N,N-dimetilamônio (DDAB), cloreto de 1,2-dioleoil-dimetilamôniopropano (DOTAP) (também conhecido como cloreto de N-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio e sal de cloreto de 1,2-dioleiloxi-3-trimetilaminopropano), cloreto de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propi!)-N,N N-trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-(2,3- dioleiloxi)propilamina = (DODMA), — 1,2-DiLinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-Dilinoleniloxi-N N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-di-i- linoleniloxi-N N-dimetilaminopropano (y-DLenDMA), 1,2-Dilinoleilcarbamoiloxi-3-

dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleioxi-3- (dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleyoxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoliltio-3- dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de 1,2-dilinoliloxi-3- trimetilaminopropano (DLiIn-TMA.CI), sal de cloreto de 1,2-dilinoleoil-3- trimetilaminopropano (DLin-TAP.CI), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), ou 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2- N,N-dimetilamino )etoxipropano (DLin-EG-DM A), 2,2-Dilinolil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano — (DLIn-K-DMA) ou seus análogos, (3aR,5s,6aS)-N N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetra-hidro-3aH- ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina, (62,97,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-il4-(dimetilamino)butanoato (MC3), 1,1" -(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodi-

il)didodecan-2-0l (C12-200), 2,2-dilinolil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA), — 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano — (DLin-K- DMA), 4-(dimetilamino)butanoato de (62,97Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila (DLin-M-C3-DMA), 3-((62,92,282,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-iloxi)-N N-dimetilpropan-1-amina (éter MC3), 4-((62,92,282,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-iloxi)-N N-dimetilbutan-1-amina (éter MC4) ou qualquer combinação de qualquer um dos anteriores.

Outros lipídios catiônicos incluem, mas não estão limitados a, brometo de N N-distearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), 3P-(N-(N' N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Choi), trifluoracetato de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N-2- (esperminocarboxamido)etil)-N N-dimetilamônio (DOSPA), dioctadecilamidoglicil carboxispermina (DOGS), 1,2-dileoil-sn-3- fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP), brometo de N-(1,2-dimiriloxiprop-3-il)-N, N-dimetil-N-hidroxietil amônio (DMRIE) e 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC). Além disso, podem ser utilizadas preparações comerciais de lipídios catiônicos, como, por exemplo, LIPOFECTINA (incluindo DOTMA e DOPE, disponível junto à GIBCO/BRL) e Lipofectamina (que compreende DOSPA e DOPE, disponível junto à GIBCO/BRL).

[00254] Outros lipídios catiônicos adequados são divulgados nas Publicações Internacionais Nos. WO 09/086558, WO 09/127060, WO 10/048536, WO 10/054406, WO 10/088537, WO 10/129709 e WO 2011/153493; Publicações de Patentes dos EUA Nos. 2011/0256175, 2012/0128760 e 2012/0027803; Patentes US Nos. 8.158.601; e Love et al., PNAS, 107 (5), 1864 a 1869, 2010. Outros aminoácidos lipídicos adequados incluem aqueles que possuem grupos de ácidos graxos alternativos e outros grupos dialquilamino, incluindo aqueles nos quais os substituintes alquil são diferentes (por exemplo, N-etil-N-metilamino- e N-propil-N-etilamino-). Em geral, aminoácidos lipídicos com cadeias acila menos saturadas são mais facilmente dimensionados, particularmente quando os complexos devem ser dimensionados abaixo de cerca de 0,3 mícron, para fins de esterilização por filtro. Podem ser usados aminoácidos lipídicos que contêm ácidos graxos insaturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C14 a C22. Outros andaimes também podem ser usados para separar o grupo amino e a porção de ácidos graxos ou alquil graxos do amino lipídico.

[00255] Em uma outra modalidade preferida, o LNP compreende o lipídio catiônico com a fórmula (Ill) de acordo com o pedido de patente — PCT/EP2017/064066. Neste contexto, a divulgação de PCT/EP2017/064066 também é incorporada aqui por referência.

[00256] Em certas modalidades, os lipídios amino ou catiônicos da invenção têm pelo menos um grupo protonável ou desprotonável, de modo que o lipídio é carregado positivamente a um pH igual ou inferior ao pH fisiológico (por exemplo, pH 7,4) e neutro a um segundo pH, preferencialmente a ou acima do pH fisiológico. Obviamente, será entendido que a adição ou remoção de prótons em função do pH é um processo de equilíbrio e que a referência a um lipídio carregado ou neutro se refere à natureza das espécies predominantes e não exige que todos do lipídio estar presente na forma carregada ou neutra. Os lipídios que possuem mais de um grupo protonável ou desprotonável, ou que são zwitteriônicos, não são excluídos do uso na invenção. Em certas modalidades, os lipídios protonáveis têm um pKa do grupo protonável na faixa de cerca de 4 a cerca de 11, por exemplo, um pKa de cerca de 5 a cerca de 7.

[00257] O lipídio catiônico pode compreender de cerca de 20% em mol a cerca de 70 ou 75% em mol ou de cerca de 45 a cerca de 65% em mol ou cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou aproximadamente 70% em mol do lipídio total presente na partícula. Em outra modalidade, as nanopartículas lipídicas incluem de cerca de 25% a cerca de 75% em uma base molar de lipídio catiônico, por exemplo, de cerca de 20 a cerca de 70%, de cerca de 35 a cerca de 65%, de cerca de 45 a cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 57,5%, cerca de 57,1%, cerca de 50% ou cerca de 40% em uma base molar (com base em 100% de mols totais de lipídio na nanopartícula lipídica). Em uma modalidade, a razão de lipídio catiônico para ácido nucleico é de cerca de 3 a cerca de 15, tal como de cerca de 5 a cerca de 13 ou de cerca de 7 a cerca de

11.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00258] Em alguns aspectos, esta invenção fornece composições farmacêuticas que contêm um composto traduzível e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00259] Uma composição farmacêutica pode ser capaz de administração local ou sistêmica. Em alguns aspectos, uma composição farmacêutica pode ser capaz de qualquer modalidade de administração. Em certos aspectos, a administração pode ser por qualquer via, incluindo administração intravenosa, subcutânea, pulmonar, intramuscular, intraperitoneal, dérmica, oral, por inalação ou nasal.

[00260] Modalidades — desta invenção incluem composições farmacêuticas que contêm um composto traduzível em uma formulação lipídica.

[00261] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais lipídios selecionados dentre lipídios catiônicos, lipídios aniônicos, esteróis, lipídios peguilados e qualquer combinação dos anteriores. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que contém um composto traduzível compreende um lipídio catiônico, um fosfolipídio, colesterol! e um lipídio peguilado.

[00262] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode estar substancialmente livre de lipossomas.

[00263] Em outras modalidades, uma composição farmacêutica pode incluir nanopartículas.

[00264] Alguns exemplos de lipídios e composições lipídicas para entrega de uma molécula ativa desta invenção são dados no documento WO/2015/074085, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o lipídio é um lipídio catiônico. Em alguma modalidade, o lipídio catiônico compreende um composto de fórmula |l: R—O o Ry > PR X ú

Ó YW E CR SR É X XI

Y Fórmula ||,

[00265] em que R: e R2 são o mesmo ou diferentes, cada um dentre cadeia linear ou ramificada, alquila, alquenila ou alquinila, L1 e L2 são o mesmo ou diferentes, sendo que cada alquila linear tem pelo menos cinco átomos de carbono, ou forma um heterociclo com o N, X1 é uma ligação simples, ou é --CO--O-- em que L2-CO--O--R2 é formada X2 é S ou O, L3 é uma ligação ou uma alquila inferior, Ra é um alquila inferior, Ra e Rs são o mesmo ou diferentes, cada um, uma alquila inferior.

O que também é aqui descrito é o composto de fórmula Il, em que L3 está ausente, R: e R2 cada um consiste em pelo menos sete átomos de carbono, R3 é etileno ou n-propileno, Ra e R5 é metila ou etila e L1 e L2 cada um consiste em uma alquila linear que tem pelo menos cinco átomos de carbono.

O que também é aqui descrito é o composto de fórmula Il, em que L3 está ausente, R: e R2 cada um consiste em pelo menos sete átomos de carbono, R3 é etileno ou n-propileno, Ra e R5 são metila ou etila, e L1 e L2 cada um consistem em uma alquila linear que tem pelo menos cinco átomos de carbono.

O que também é aqui descrito é o composto de fórmula |l, em que L3 está ausente, R: e R2 cada um consiste em um alquenilo de pelo menos nove átomos de carbono, R3 é etileno ou n-propileno, Ra e Rs são metila ou etila, e L1 e L2 cada um consiste em uma alquila linear que tem pelo menos cinco átomos de carbono.

O que também é aqui descrito é o composto de fórmula Il, em que L3 é metileno, R: e R2 cada um consiste em pelo menos sete átomos de carbono, R3 é etileno ou n-propileno, Ra e R5 são metila ou etila, e L1 e L2 cada um consiste em uma alquila linear que tem pelo menos cinco átomos de carbono.

O que também é aqui descrito é o composto de fórmula Il, em que L3 é metileno, R1 e R2 cada um consiste em pelo menos nove átomos de carbono, R3 é etileno ou n-propileno, Ra e R5 são cada um metila, L1 e L2 cada um consiste em uma alquila linear que tem pelo menos sete átomos de carbono.

O que também é aqui descrito é o composto de fórmula Il, em que L3 é metileno, Ri consiste em uma alquenila que tem pelo menos nove átomos de carbono e R2 consiste em uma alquenila que tem pelo menos sete átomos de carbono, R3 é n- propileno, Ra e R5 são cada um metila, L1 e L2 cada um consiste em uma alquila linear que tem pelo menos sete átomos de carbono. O que também é aqui descrito é o composto de fórmula Il, em que L3 é metileno, R:1 e R2 cada um consiste em uma alquenila que tem pelo menos nove átomos de carbono, R3 é etileno, Ra e R5 são cada um metila, L1 e L2 cada um consiste em uma alquila linear que tem pelo menos sete átomos de carbono.

[00266] Em modalidades exemplares, o lipídio catiônico compreende um composto selecionado do grupo que consiste em ATX- 001, ATX-002, ATX-003, ATX-004, ATX-0O05, ATX-O0O6, ATX-O007, ATX-OO8, ATX-009, ATX-010, ATX-011, ATX-012, ATX-013, ATX-014, ATX-015, ATX-016, ATX-017, ATX-018, ATX-019, ATX-020, ATX-021, ATX-022, ATX-023, ATX-024, ATX-025, ATX-026, ATX-027, ATX-028, ATX-029, ATX-030, ATX-031, ATX-032, ATX-081, ATX-095 e ATX-126, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00267] Em certas modalidades exemplares, o lipídio catiônico compreende ATX-002, ATX-081, ATX-095 ou ATX-126.

[00268] Em algumas modalidades, o lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser apresentado em uma composição lipídica, que compreende uma nanopartícula ou uma bicamada de moléculas lipídicas. A bicamada lipídica preferencialmente compreende ainda um lipídio neutro ou um polímero. A composição lipídica compreende preferencialmente um meio líquido. A composição preferencialmente encapsula ainda um composto traduzível da presente invenção. A composição lipídica preferencialmente compreende ainda um composto traduzível da presente invenção e um lipídio neutro ou um polímero. A composição lipídica preferencialmente encapsula o composto traduzível.

[00269] Em outras modalidades, o lipídio catiônico compreende um composto de fórmula Ill: ( Ra X3—L) A x N 2 sd N = CR OR t

Y X|

É Fórmula Ill,

[00270] em que R: e R2 são o mesmo ou diferentes, cada um uma alquila linear ou ramificada que consiste em 1 a 9 átomos de carbono, uma alquenila ou alquinila que consiste em 2 a 11 átomos de carbono ou colesterilo, L1 e L2 são os mesmos ou diferente, cada um alquileno ou alquenileno linear ou que consiste em 5 a 18 átomos de carbono, X1 é --CO--O- - em que L2-CO-O-R>2 é formada, X2 é S ou O, X;3 é --CO--O-- em que -L1-CO-- O--R1 é formado, L3 é uma ligação, R3 é um alquileno linear ou ramificado que consiste em 1 a 6 átomos de carbono, e Ra e Rs são o mesmo ou diferentes, cada um hidrogênio ou uma alquila linear ou ramificada que consiste em 1 a 6 átomos de carbono; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade, X2 é S. Em uma outra modalidade, R3 é selecionado a partir de etileno, n-propileno ou isobutileno. Em ainda outra modalidade, Ra e Rs são separadamente metila, etila ou isopropila. Em ainda outra modalidade, L1: e L2 são o mesmo. Em ainda outra modalidade, L1: e L2 diferem. Em ainda outra modalidade, L1 ou L2 consiste em um alquileno linear que tem sete carbonos. Em ainda outra modalidade, L1 ou L2 consiste em um alquileno linear que tem nove átomos de carbono. Em ainda outra modalidade, R: e R2 são o mesmo. Em ainda outra modalidade, R: e R2 são diferentes. Em ainda outra modalidade, R: e R2 cada um consiste em uma alquenila. Em ainda outra modalidade, R: e R2 cada um consiste em uma alquila. Em ainda outra modalidade, a alquenila consiste em uma única ligação dupla. Em ainda outra modalidade, R1 ou R2 consiste em nove carbonos. Em ainda outra modalidade, Ri ou R2 consiste em onze carbonos. Em ainda outra modalidade, R: ou R2 consiste em sete átomos de carbono. Em ainda outra modalidade, L3 é uma ligação, R3 é etileno, XC é S, e R1 e R5 são cada um metila. Em ainda outra modalidade, L3 é uma ligação, R3 é n-propileno, X2 é S, Ra e R5 são cada um metila. Em ainda outra modalidade, L3 é uma ligação, R3 é etileno, X2 é S, e Ra e R5 são cada um etila.

[00271] Como seria apreciado pelos versados na técnica, os compostos de fórmulas Il e Ill formam sais que também estão dentro do escopo desta divulgação. A referência a um composto de fórmulas Il e Ill aqui é entendida como incluindo referência aos seus sais, a menos que indicado de outra forma. O termo "sal (ou sais)", como aqui usado, denota sais ácidos formados com ácidos inorgânicos e/ou orgânicos, bem como sais básicos formados com bases inorgânicas e/ou orgânicas. Além disso, quando um composto de fórmula Il ou Ill contém uma porção química básica, como, mas não se limitando a, uma piridina ou imidazol e uma porção química ácida, como, mas não se limitando a, um ácido carboxílico, zwitterions ("sais internos") podem ser formados e estão incluídos no termo "sal (ou sais)", conforme aqui usado. Os sais podem ser sais farmaceuticamente aceitáveis (isto é, não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis), embora outros sais também sejam úteis. Os sais dos compostos de fórmula Il ou Ill podem ser formados, por exemplo, fazendo reagir um composto de fórmula Il ou Ill com uma quantidade de ácido ou base,

como uma quantidade equivalente, em um meio como aquele em que o sal precipitados ou em meio aquoso seguido de liofilização.

[00272] Exemplos de sais de adição de ácido incluem acetatos, adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, benzenossulfonatos, bissulfatos, boratos, butiratos, citratos, cânforos, canforsulfonatos, — ciclopentanopropionatos, —digluconatos, dodecilsulfatos, etanossulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, —hexanoatos, cloridratos, bromidratos, hidroiodetos, 2- hidroxietanossulfonatos, — lactatos, — maleatos, — metanossulfonatos, — 2- naftalenossulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3- fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, sulfonatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos, sulfonatos (como os aqui mencionados), tartaratos, tiocianatos, toluenossulfonatos — (também conhecidos como tosilatos) undecanoatos e similares. Adicionalmente, ácidos que são geralmente considerados adequados para a formação de sais farmaceuticamente úteis a partir de compostos farmacêuticos básicos são discutidos, por exemplo, por S. Berge et al., J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66 (1) 1 a 19; P. Gould, International J. Pharmaceutics (1986) 33 201 a 217; Anderson et al., The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, Nova lorque; e no The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, DC em seu site). Essas divulgações são incorporadas por referência aqui.

[00273] Exemplos de sais básicos incluem sais de amônio, sais de metais alcalinos, como sais de sódio, lítio e potássio, sais de metais alcalinoterrosos, como sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas (por exemplo, aminas orgânicas), como benzatinas, diciclo- hexilaminas, hidrabaminas (formado com N N-bis(desidroabietil)etilenodiamina), N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butilaminas e sais com aminoácidos como arginina, lisina e semelhantes. Grupos que contêm nitrogênio básico podem ser quarternizados com agentes como halogenetos de alquila inferior (por exemplo, cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila), sulfatos de dialquila (por exemplo, sulfatos de dimetila, dietila, dibutila e diamila), halogenetos de cadeia longa (por exemplo, cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila), halogenetos de arilalquila (por exemplo, brometos de benzila e fenetila) e outros.

[00274] Todos esses sais ácidos e básicos devem ser sais farmaceuticamente aceitáveis dentro do escopo da divulgação e todos os sais ácidos e básicos são considerados equivalentes às formas livres dos compostos correspondentes para fins da divulgação. Os compostos de fórmula 1l ou Ill podem existir em formas não solvatadas e solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, as formas solvatadas, com solventes farmaceuticamente aceitáveis, como água, etanol e similares, são equivalentes às formas não solvatadas para os fins desta divulgação. Os compostos de fórmula Il ou Ill e sais, seus solvatos, podem existir em sua forma tautomérica (por exemplo, como amida ou imino éter). Todas essas formas tautoméricas são aqui contempladas como parte da presente divulgação.

[00275] Os compostos lipídicos catiônicos aqui descritos podem ser combinados com um composto traduzível da invenção para formar micropartículas, nanopartículas, lipossomas ou micelas. O composto traduzível da invenção a ser entregue pelas partículas, lipossomas ou micelas pode estar na forma de um gás, líquido ou sólido. O composto lipídico catiônico e o composto traduzível podem ser combinados com outros compostos lipídicos catiônicos, polímeros (sintéticos ou naturais), tensoativos, colesterol, carboidratos, proteínas, lipídios, etc. para formar as partículas. Essas partículas podem então ser opcionalmente combinadas com um excipiente farmacêutico para formar uma composição farmacêutica.

[00276] Em certas modalidades, os compostos lipídicos catiônicos são relativamente não citotóxicos. Os compostos lipídicos catiônicos podem ser biocompatíveis e biodegradáveis. O lipídio catiônico pode ter um pKa na faixa de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, mais preferencialmente entre aproximadamente 6,0 e aproximadamente 7,0. Pode ser projetado para ter um pKa desejado entre aproximadamente 3,0 e aproximadamente 9,0 ou entre aproximadamente 5,0 e aproximadamente 8,0.

[00277] Uma composição que contém um composto lipídico catiônico pode ser 30 a 70% de composto lipídico catiônico, O a 60% de colesterol, O a 30% de fosfolipídio e 1 a 10% de polietilenoglicol (PEG). Preferencialmente, a composição é 30 a 40% de composto lipídico catiônico, 40 a 50% de colesterol e 10 a 20% de PEG. Em outras modalidades preferidas, a composição é 50 a 75% de composto lipídico catiônico, 20 a 40% de colesterol e 5 a 10% de fosfolipídio e 1 a 10% de PEG. A composição pode conter 60 a 70% de composto lipídico catiônico, 25 a 35% de colesterol e 5 a 10% de PEG. A composição pode conter até 90% de composto lipídico catiônico e 2 a 15% de lipídio auxiliar. A formulação pode ser uma formulação de partículas lipídicas, por exemplo, que contém 8 a 30% de composto, 5 a 30% de lipídio auxiliar e O a 20% de colesterol; 4 a 25% de lipídio catiônico, 4 a 25% de lipídio auxiliar, 2 a 25% de colesterol, 10 a 35% de colestero|l-PEG e 5% de colesterol-amina; ou 2 a 30% de lipídio catiônico, 2 a 30% de lipídio auxiliar, 1 a 15% de colesterol, 2 a 35% de colesterol-PEG e 1 a 20% de colesterol-amina; ou até 90% de lipídios catiônicos e 2 a 10% de lipídios auxiliares ou mesmo 100% de lipídios catiônicos.

[00278] Em algumas modalidades, os um ou mais lipídios à base de colesterol são selecionados a partir de colesterol, colestero! PEGuilado e DC-Chol (N ,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol) e 1,4-bis(3-N- oleilamino-propil)piperazina. Em uma modalidade exemplar, o lipídio à base de colesterol é colesterol.

[00279] Em algumas modalidades, o um ou mais lipídios peguilados, isto é, lipídios modificados por PEG. Em algumas modalidades, os um ou mais lipídios modificados por PEG compreendem uma cadeia de poli(etileno) glicol de até 5 kDa de comprimento covalentemente ligada a um lipídio com cadeia (ou cadeias) alquila de comprimento C6-C20. Em algumas modalidades, um lipídio modificado por PEG é uma ceramida derivatizada como N-octanoil-esfingosina-1-[Succinil(metoxi polietileno glicol)-2000]. Em algumas modalidades, um lipídio PEG-modificado ou PEGuilado é colesterol PEGuilado ou Dimiristoilglicerol (DMG)-PEG-2K. Em uma modalidade exemplar, o lipídio modificado por PEG é colesterol PEGuilado.

[00280] Em modalidades adicionais, uma composição farmacêutica pode conter um composto oligomérico dentro de um vetor viral ou bacteriano.

[00281] Uma composição farmacêutica desta divulgação pode incluir carreadores, diluentes ou excipientes, como são conhecidos na técnica. Exemplos de composições e métodos farmacêuticos são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. 1985) e Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21º Edição (2005).

[00282] Exemplos de excipientes para uma composição farmacêutica incluem antioxidantes, agentes de suspensão, agentes de dispersão, conservantes, agentes de tamponamento, agentes de tonicidade e tensoativos.

[00283] Uma dose eficaz de um agente ou formulação farmacêutica desta invenção pode ser uma quantidade que seja suficiente para causar a tradução de uma molécula traduzível em uma célula.

[00284] Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser uma quantidade de um agente ou formulação que é suficiente para causar um efeito terapêutico. Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações separadas e por diferentes vias. Como irá ser apreciado na técnica, uma dose terapeuticamente eficaz ou uma quantidade terapeuticamente eficaz é largamente determinada com base na quantidade total do agente terapêutico contido nas composições farmacêuticas da presente invenção. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para alcançar um benefício significativo para o sujeito (por exemplo, tratamento, modulação, cura, prevenção e/ou melhoria da GSD Ill). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma quantidade suficiente para alcançar um efeito terapêutico e/ou profilático desejado. Geralmente, a quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, um oligômero traduzível que codifica AGL) administrado a um sujeito em necessidade do mesmo dependerá das características do sujeito. Tais características incluem a afecção, gravidade da doença, estado geral de saúde, idade, sexo e peso corporal do sujeito. Um versado na técnica será capaz de determinar prontamente as dosagens apropriadas, dependendo desses e de outros fatores relacionados. Além disso, ambos os ensaios objetivos e subjetivos podem, opcionalmente, ser empregados para identificar faixas ideais de dosagem.

[00285] Os métodos aqui fornecidos contemplam administrações únicas e múltiplas de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto traduzível (por exemplo, um oligômero traduzível que codifica AGL) aqui descrito. As composições farmacêuticas que compreendem um composto traduzível que codifica AGL podem ser administradas em intervalos regulares, dependendo da natureza, gravidade e extensão da afecção do indivíduo (por exemplo, a gravidade do estado de doença de GSD Ill de um indivíduo e os sintomas associados de GSD Ill e/ou os níveis de atividade de AGL do sujeito). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto traduzível (por exemplo, um traduzível oligômero que codifica AGL) da presente invenção podem ser administrados periodicamente a intervalos regulares (por exemplo, uma vez por ano, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada dois meses, uma vez por mês), quinzenalmente, semanalmente, diariamente, duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia, cinco vezes por dia, seis vezes por dia ou continuamente.

[00286] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção são formuladas de modo que sejam adequadas para liberação prolongada do composto traduzível que codifica AGL nela contido. Tais composições de liberação prolongada podem ser convenientemente administradas a um sujeito em intervalos de dosagem prolongados. Por exemplo, em uma modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção são administradas a um indivíduo duas vezes por dia, diariamente ou em dias alternados. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção são administradas a um indivíduo duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada 10 dias, a cada duas semanas, a cada 28 dias, a cada mês, a cada seis semanas, a cada oito semanas, a cada dois meses, a cada três meses, a cada quatro meses, a cada seis meses, a cada nove meses ou uma vez por ano. Também são contempladas aqui composições farmacêuticas que são formuladas para administração de depósito (por exemplo, subcutaneamente, intramuscularmente) para entregar ou liberar um composto traduzível que codifica AGL por longos períodos de tempo. De preferência, os meios de libertação prolongada usados são combinados com modificações feitas no composto traduzível que codifica AGL para melhorar a estabilidade.

[00287] Em algumas modalidades, uma dose terapeuticamente eficaz, após a administração, pode resultar em níveis séricos ou plasmáticos de AGL de 1 a 1.000 pg/ml, ou 1 a 1.000 ng/ml, ou 1 a 1.000 pg/ml ou mais.

[00288] Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção pode resultar em níveis aumentados de proteína AGL no fígado em um sujeito tratado. Em algumas modalidades, administrar uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção resulta em 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% aumento dos níveis de proteína AGL no fígado em relação ao nível basal de proteína AGL no indivíduo antes do tratamento. Em certas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção resultará em um aumento nos níveis de AGL do fígado em relação aos níveis basais de AGL do fígado no sujeito antes do tratamento. Em algumas modalidades, o aumento dos níveis de AGL no fígado em relação aos níveis basais de AGL no fígado será de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200% ou mais.

[00289] Em algumas modalidades, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em aumento da expressão de AGL no fígado em comparação com os níveis basais antes do tratamento. Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível da invenção resulta na expressão de um nível de proteína AGL igual ou superior a cerca de 10 ng/mg, cerca de 20 ng/mg, cerca de 50 ng/mg, cerca de 100 ng/mg, cerca de 150 ng/mg, cerca de 200 ng/mg, cerca de 250 ng/mg, cerca de 300 ng/mg, cerca de 350 ng/mg, cerca de 400 ng/mg, cerca de 450 ng/mg, cerca de 500 ng/mg, cerca de 600 ng/mg, cerca de 700 ng/mg, cerca de 800 ng/mg, cerca de 900 ng/mg, cerca de 1.000 ng/mg, cerca de 1.200 ng/mg ou cerca de 1.500 ng/mg da proteína total no fígado de um sujeito tratado.

[00290] Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um oligômero traduzível que codifica AGL resultará em níveis reduzidos de um ou mais marcadores selecionados de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), fosfatase alcalina (ALP), creatina fosfoquinase (CPK), glicogênio e limitam a dextrina (ou seja, um carboidrato de baixa molécula produzido pela hidrólise do glicogênio).

[00291] Em alguns modalidades uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em uma redução dos níveis de ALT, AST, ALP e/ou CPK em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução dos níveis de ALT, AST, ALP e/ou CPK em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de plasma ou soro) em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em comparação com os níveis basais ALT, AST, ALP e/ou CPK antes do tratamento. Em algumas modalidades, a amostra biológica é selecionada a partir de plasma, soro, sangue total, urina ou líquido cefalorraquidiano.

[00292] Em certas modalidades exemplificativas, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em uma redução dos níveis de ALT, por exemplo, como medido em unidades de ALT atividade/litro (UI), em uma amostra de soro ou plasma. Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução dos níveis de ALT em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de plasma ou soro) em pelo menos cerca de 5%, em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% em comparação com os níveis basais de ALT antes do tratamento. Em uma modalidade exemplar, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução dos níveis de ALT em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de plasma ou soro) em pelo menos cerca de 50% em comparação com os níveis basais de ALT antes do tratamento. Em uma modalidade exemplar adicional, os níveis de ALT são medidos após o jejum, por exemplo, após 6, 8, 10, 12, 18 ou 24 horas de jejum.

[00293] Em outras modalidades exemplificativas, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em uma redução de níveis de AST, por exemplo, como medido em unidades de AST atividade/litro (U/l), em uma amostra de soro ou plasma. Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução dos níveis de AST em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de plasma ou soro) em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% em relação à linha de base AST níveis antes do tratamento. Em uma modalidade exemplar, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução dos níveis de AST em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de plasma ou soro) em pelo menos cerca de 50% em comparação com os níveis basais de AST antes do tratamento. Em uma modalidade exemplar adicional, os níveis de AST são medidos após o jejum, por exemplo, após 6, 8, 10, 12, 18 ou 24 horas de jejum.

[00294] As medições dos níveis de ALT, AST, ALP e/ou CPK podem ser feitas usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, usando um Analisador de Química Clínica Fuji Dri-Chem FDC 3500, como descrito em Liu et al., 2014, Mol Genet e Metabolism 111: 467 a 476.

[00295] Em outras modalidades exemplificativas, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em uma redução de níveis de glicogênio em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução da acumulação de glicogênio em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de fígado) em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em comparação com os níveis basais de glicogênio antes do tratamento. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma porção de um órgão selecionado a partir de fígado, coração, diafragma, quadríceps e gastrocnêmio. Em uma modalidade exemplar, a amostra biológica é uma seção do fígado, por exemplo, uma seção de hepatócitos.

[00296] Em outras modalidades exemplificativas, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em uma redução dos níveis limite de dextrina em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma molécula traduzível desta invenção resulta em uma redução do acúmulo de limite de dextrina em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra de fígado) em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% em comparação com os níveis basais limite de dextrina antes do tratamento. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma porção de um órgão selecionado a partir de fígado, coração, diafragma, quadríceps e gastrocnêmio.

Em uma modalidade exemplar, a amostra biológica é uma seção do fígado, por exemplo, uma seção de hepatócitos. Em uma outra modalidade exemplar, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em pelo menos um 50%, 60%, 70%, ou 80% de redução de níveis limite de dextrina numa amostra de fígado em comparação com o níveis basais limite de dextrina antes do tratamento.

[00297] Em outras modalidades uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, atrasa o aparecimento de fibrose hepática em um sujeito tratado. Em algumas modalidades, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrado regularmente, retarda o desenvolvimento da fibrose do fígado ou diminui a quantidade de fibrose do fígado em um sujeito afligido com GSD III.

[00298] Uma dose terapeuticamente eficaz de um agente ativo (por exemplo, um oligôêômero traduzível que codifica AGL) in vivo pode ser uma dose de cerca de 0,001 a cerca de 500 mg/kg de peso corporal. Por exemplo, a dose terapeuticamente eficaz pode ser de cerca de 0,001 a 0,01 mg/kg de peso corporal, ou 0,01 a 0,1 mg/kg, ou 0,1 a 1 mg/kg, ou 1 a 10 mg/kg, ou 1 a 10 mg/kg, ou 10 a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, um oligômero traduzível que codifica AGL é fornecido em uma dose que varia de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, de cerca de 0,5 a cerca de mg/kg, de cerca de 1 a 4,5 mg/kg, ou de cerca de 2 a cerca de 4 mg/kg.

[00299] Uma dose terapeuticamente eficaz de um agente ativo (por exemplo, um oligômero traduzível que codifica AGL) in vivo pode ser uma dose de pelo menos cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal, ou pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, ou pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, ou pelo menos cerca de 1 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2 mg/Kg, ou pelo menos cerca de 3 mg/kg, ou pelo menos cerca de 4 mg/Kg, ou pelo menos cerca de 5 mg/kg, pelo menos cerca de 10 mg/kg, pelo menos cerca de 20 mg/kg, pelo menos cerca de 50 mg/kg ou mais. Em algumas modalidades, um oligômero traduzível que codifica AGL é fornecido a uma dose de cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg,

cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/Kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg ou cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75 ou 100 mg/kg.

[00300] As sequências de nucleobases aqui mostradas são da esquerda para a direita, de 5' a 3', a menos que indicado de outra forma.

TRANSFECÇÕES

[00301] Em algumas experiências, as moléculas mensageiras traduzíveis foram transfectadas em células Hepa1-6 ou AML12 em placas de 96 cavidades. O reagente de transfecção MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific) foi usado por instruções de fabricação para todas as transfecções. Outras linhas celulares adequadas incluem células HEK293 e Hep3B.

[00302] Um exemplo de protocolo de transfecção in vitro foi o seguinte:

[00303] Plaquear células Hepa1-6 de hepatócitos 5000 células por poço em placas de 96 cavidades pelo menos 8 horas antes da transfecção.

[00304] Substituir 90 ul de meio DMEM contendo 10% de FBS e aminoácido não essencial) adicionando 90 ul em cada poço da placa de 96 cavidades imediatamente antes de iniciar o experimento de transfecção.

[00305] Preparar o complexo da molécula traduzível do reagente de transfecção MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.

[00306] Transferir 10 ul do complexo para uma cavidade que contém as células na placa de 96 cavidades.

[00307] Coletar o meio após o tempo desejado e adicionar 100 ul de meio fresco em cada cavidade. O meio será mantido a -80 ºC até que um ensaio ELISA para AGL seja realizado usando o protocolo padrão do fabricante.

[00308] Um exemplo de um protocolo de transfecção in vivo foi o seguinte:

[00309] A molécula traduzível é formulada com nanopartículas.

[00310] Injetar a molécula traduzível formulada por nanopartículas (1 mg/kg) em camundongos BL57BL/c (4 a 6 semanas de idade) por injeção i.v. padrão na veia lateral da cauda.

[00311] Coletar aproximadamente 50 ul de sangue em um tubo de microcentrífuga revestido com heparina em um momento adequado após a injeção.

[00312] Centrifugar a 3.000 X g por 10 minutos a 4 ºC.

[00313] Transferir o sobrenadante (plasma) para um tubo de microcentrífuga novo. O plasma será mantido a -80 ºC até que um ensaio ELISA para AGL seja realizado usando o protocolo padrão do fabricante.

FORMULAÇÕES DE NANOPARTÍCULAS

[00314] Nanopartículas lipídicas podem ser preparadas contendo um mRNA, usando volumes apropriados de lipídios em um etanol/tampão aquoso que contém o mMRNA. Um dispositivo microfluídico Nanossemblr pode ser usado para esse fim, seguido pelo processamento a jusante. Por exemplo, para preparar nanopartículas, uma quantidade desejada de mRNA alvo pode ser dissolvida em tampão de ácido cítrico 5 mM (pH 3,5). Os lipídios podem ser dissolvidos na razão molar adequada, em etanol. A razão percentual molar para os lipídios constituintes pode ser, por exemplo, 50% de lipídios ionizáveis, 7% de DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocololina; lipídios polares avanti), 40% de colesterol (lipídios polares avanti) e DMG-PEG a 3% (1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenoglicol, peso molecular da cadeia PEG: 2000; NOF America Corporation). Em seguida, as soluções lipídicas e mMRNA podem ser combinadas no dispositivo microfluídico (Precision NanoSystems) a uma razão de fluxo de 1:3 (etanol:fase aquosa). A vazão combinada total pode ser de 12 mIl/min. Nanopartículas lipídicas podem ser formadas e subsequentemente purificadas por diálise durante a noite usando um tampão de fosfato em um dispositivo de diálise (Float-a-lyzer, Spectrum Labs), seguido de concentração usando filtros centríffugos Amicon Ultra-15 (Merck Millipore). O tamanho das partículas pode ser determinado por espalhamento dinâmico de luz (ZEN3S600, Malvern Instruments). Uma eficiência de "encapsulamento" pode ser calculada determinando o conteúdo de mMRNA não encapsulado medido pela fluorescência após a adição de RiboGreen (Molecular Probes) à pasta de LNP (Fi); então, o valor foi comparado ao conteúdo total de MRNA obtido na lise dos LNPs em 1% de Triton X-100 (Ft), onde a porcentagem de "encapsulamento" = (Ft - Fi//Ft x 100. Encapsulamento pode se referir à inclusão do RNAm na nanopartícula, independentemente da forma.

WESTERN NA CÉLULA

[00315] Placas de colágeno de 96 cavidades foram usadas para semear as células na densidade apropriada no meio de cultura DMEM/FBS. Na confluência ideal, as células foram transfectadas com os MRNAs alvo diluídos na mistura de reagentes para transfecção (MessengerMax e Opti-MEM). As células foram colocadas na incubadora de CO? e as deixaram crescer. No momento desejado, o meio foi removido e as células foram fixadas em PFA fresco a 4% por 20 minutos. Depois disso, o fixador foi removido e as células foram permeabilizadas em TBST por 5 minutos várias vezes. Quando as lavagens de permeabilização estão completas, as células foram incubadas com o tampão de bloqueio por 45 min. O anticorpo primário foi então adicionado e incubado por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas várias vezes em TBST e incubadas por 1 hora com o anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio e contendo a mancha CellTag 700. Para finalizar, as células foram lavadas várias vezes em TBST, seguidas por uma última lavagem em TBS. Em seguida, a placa foi fotografada usando o sistema de detecção Licor e os dados foram normalizados para o número total de células rotuladas pelo CellTag 700.

GERAR PRODUTOS DE CAUDA PCR

[00316] O DNA do plasmídeo (10 ng) que contém cada construção de expressão de mRNA pode ser usado para gerar os produtos de PCR de cauda poli A 120 em uma reação de PCR de 50 ul com 2X KAPA HiFi PCR mix (KR0370) conforme as instruções do fabricante. O produto pode ser verificado em um gel de 2% da Thermo Fisher Scientific e quantificado aproximadamente com base na intensidade da escada de baixo peso molecular (Thermo Fisher Scientific, 10068-013), e limpo com o kit de purificação Qiagen PCR e ressuspenso em 50 ul de água.

TRANSCRIÇÃO IN VITRO (IVT) PARA SÍNTESE

[00317] O protocolo a seguir é para uma reação de IVT de 200 ul usando reagentes de RNA polimerase NEB HiScribe T7, que devem render cerca de 1 mg de RNA. A mistura de 2,5X NTP foi preparada conforme exigido pelo descongelamento de estoques individuais de 100mM de NTP (nucleotídeos ATP, GTP, CTP e UTP, ou contrapartes quimicamente modificadas) e reunindo-os. Para a reação de IVT, foram usados cerca de 2 a 4 vg do gabarito para uma reação de 200 ul. O tampão de reação 10X IVT, a mistura de 2,5X dNTP, o DNA modelo e a RNA polimerase T7 são bem misturados por pipetagem e incubados a 37 “ºC por 4 horas. Para degradar o modelo de DNA, a reação de IVT é diluída com 700 ul de água livre de nuclease e, em seguida, 10X de DNase | e 20 ul de DNase | sem RNase são adicionados à mistura de IVT e incubados a 37 ºC por 15 minutos. A reação diluída (a 1 ml) e tratada com DNase é então purificada por colunas Qiagen RNeasy Maxi conforme as instruções do fabricante com uma eluição final em água livre de RNase. O RNA purificado é então quantificado por absorbância UV, onde o A260/A280 deve estar em torno de 1,8 a 2,2, dependendo do tampão de ressuspensão usado.

CAPEAMENTO ENZIMÁTICO DE RNA DE IVT

[00318] Para capeamento enzimático, pode ser usada uma versão em escala 50X da captação de uma etapa do NEB e reação de metilação com 2'O, adequada para o tratamento de até 1 mg de transcritos de IVT. Recomenda-se 10 ug de RNA em uma reação de 20 ul, com base na suposição de que o comprimento do transcrito seria tão curto quanto 100 nt. No entanto, um volume mais alto de substrato para reação é aceitável para transcrições, que geralmente podem ser mais longas (cerca de 300 a 600 nt) de comprimento. Antes de iniciar a reação de capeamento, o RNA é desnaturado a 65 “C por 5 minutos e depois resfriado com pressão para aliviar quaisquer conformações secundárias. Para a reação de tamponamento total de 1 ml, é usado 1 mg de RNA desnaturado em 700 ul de água livre de nuclease, juntamente com 100 ul (10X) de tampão de tamponamento, 50 ul (10 mM) de GTP, 50 ul (10 mM) de GTP, 50 ul (4 mM) de SAM, 50 ul de (10 U/ul) de enzima de cobertura de Vaccinia e 50 ul de MRNA cap 2'-O-metiltransferase a (50 U/ul) são combinados e incubados a 37 ºC por 1 hora. O MRNA com cap resultante é eluído usando água livre de RNase, purificado novamente em uma coluna RNeasy, quantificada por nanodrop. O mRNA também é visualizado no gel executando 500 ng do produto purificado por pista em um gel desnaturante após a desnaturação e um resfriamento rápido para remover estruturas secundárias.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: MOLÉCULA TRADUZÍVEL DE REFERÊNCIA 534.

[00319] Neste exemplo, uma molécula traduzível de referência 534 foi preparada e usada para expressar amilo-alfa-1 WT humano, 6-glicosidase, —4-alfa-glucanotransferase (AGL) A molécula traduzível compreendeu um cap 5' (7MGpppG), uma UTR 5' de TEV, uma sequência Kozak, um WT AGL CDS (SEQ ID NO: 1), uma 3º UTR de beta globina Xenopus e uma poli (A) região de cauda que consiste em 114 As (ou seja, "região de cauda Poli(A) 114"). A molécula traduzível de referência compreendeu ainda a sequência da SEQ ID NO: 40 imediatamente a jusante do AGL CDS. Esta molécula traduzível referência foi sintetizado com N'-metilpseudouridina em lugar de uridina.

[00320] Os detalhes da estrutura desta molécula traduzível de referência são os seguintes: Vírus do Etch do Tabaco (TEV) 5 UTR da SEQ ID NO: 3, uma Sequência Kozak da SEQ ID NO: 4, uma Xenopus beta globina (XBG) 3' UTR da SEQ ID NO: 5 e uma cauda Poli(A) 114 da SEQ ID NO:

6.

[00321] As moléculas traduzíveis nos exemplos abaixo podem ser sintetizadas com o cap 5º que é um cap m7/GpppGm. As moléculas traduzíveis nos exemplos abaixo podem conter uma 5'-UTR (por exemplo, uma 5' UTR de TEV (SEQ ID NO: 3)), uma sequência de iniciação da tradução (por exemplo, uma sequência Kozak da SEQ ID NO: 4), uma sequência de SEQ ID NO: 40, uma 3' UTR (por exemplo, uma 3' UTR de Xenopus beta globina (SEQ ID NO: 5)) e uma cauda poli(A) (por exemplo, uma cauda poliA de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 39).

EXEMPLO 2: MOLÉCULAS TRADUZÍVEIS QUE CODIFICAM AGL.

[00322] Neste exemplo, as moléculas traduzíveis 522- 533, 546, 730-740 e 1783-1784 foram produzidas e usadas para expressar amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) com aumento vantajoso eficiência de tradução. Essas moléculas traduzíveis que expressam a amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana exibiram atividade adequada para uso em métodos para melhorar ou tratar GSD Ill. Essas moléculas traduzíveis compreendiam um cap 5º (7MGpppG), uma 5' UTR de TEV, uma sequência Kozak, um AGL CDS e uma 3' UTR de Xenopus beta globina. As moléculas traduzíveis 522-533, 546 e 1783-1784 compreendem ainda uma região de cauda Poli(A) 114. A molécula traduzível 730 compreende ainda uma região de cauda Poli(A) 100, enquanto as moléculas traduzíveis 731- 740 compreendem ainda uma região de cauda Poli(A) 110. As moléculas traduzíveis 522-533, 546, 730-740 e 1783-1784 compreendem ainda a sequência da SEQ ID NO: 40 imediatamente a jusante do AGL CDS. Duas moléculas traduzíveis adicionais - 2.258 e 2.259 - foram desenvolvidas que são idênticas a 546 e 1.783, respectivamente, exceto que elas contêm uma região de cauda Poli(A) 100 em oposição a uma região de cauda Poli(A) 114. À sequência de codificação de 1783 e 2259 pode opcionalmente ser modificada para conter 12 diferenças de nucleotídeos, como refletido na SEQ ID NO: 45. As moléculas traduzíveis descritas neste exemplo foram sintetizadas com uma N'- metilpseudouridina em lugar de uridina.

[00323] O AGL CDS em cada uma das moléculas traduzíveis é composto pelas seguintes sequências: Molécula AGL CDS SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 524 SEQ ID NO: 9 525 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 546 & 2.258 SEQ ID NO: 19 730 SEQ ID NO: 20 731 SEQ |D NO: 21 732 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 | 734 | SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 736 SEQ ID NO: 26 737 SEQ ID NO: 27 738 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30

1.783 e 2.259 | SEQID NO: 31

1.784 SEQ ID NO: 32

[00324] As moléculas traduzíveis deste exemplo foram traduzidas nas células AML12 e C2C12 para produzir AGL humana.

EXEMPLO 3: MELHORADOR DE TRADUÇÃO BASEADO EM XENOPUS BETA GLOBINA 3'UTR.

[00325] Neste exemplo, são mostradas as estruturas das sequências de 3' UTR para uso no aprimoramento da eficiência de tradução de uma molécula traduzível.

[00326] As sequências de bases mostradas nas SEQ ID NOs: 33-37 são a porção da molécula traduzível que pode corresponder em funcionalidade ao 3-UTR de Xenopus beta globina. A molécula traduzível completa compreende um cap 5' (17 GpppGm), 5-UTR e região de codificação (CDS) a montante da sequência abaixo, e uma cauda de poliA a jusante da sequência abaixo, cada uma das quais corresponde à estrutura de um nativo mMRNA humano. Como mostrado acima, uma sequência de Kozak pode opcionalmente ser usada. Assim, uma molécula traduzível que incorpora o fragmento abaixo pode ter maior eficiência de tradução. A sequência do gene da Xenopus beta globina é mostrada no número de acesso. NM 001096347.1 EXEMPLO 4: EXPRESSÃO DE AGL EM HEPATÓCITOS

PRIMÁRIOS HUMANOS

[00327] Neste exemplo, os hepatócitos primários humanos foram transfectados com as moléculas de mRNA 546, 1783 e 1784 otimizadas para códons. A expressão da proteína AGL foi medida por In-Cell Western'M 6, 24, 48 e 72 horas após a transfecção. A expressão das sequências de mRNA em comparação com um controle não tratado ("unt") é mostrada na Figura 5.

EXEMPLO 5: ANÁLISE IN VIVO DA EXPRESSÃO DA

PROTEÍNA AGL EM CAMUNDONGOS DO TIPO SELVAGEM

[00328] Neste exemplo, os ratos C57BL/6 de tipo selvagem foram injetados com mMRNA de AGL humana formulado com nanopartículas lipídicas. Os camundongos foram sacrificados 6 horas após a injeção. Amostras de biópsia hepática foram coletadas de camundongos e analisada a expressão da proteína AGL humana e de camundongo em homogenatos hepáticos. A Figura 6 mostra a expressão ectópica da proteína AGL humana a partir de várias moléculas de MRNA. A Figura 7 mostra os níveis de proteína AGL de camundongo, indicando níveis semelhantes de expressão endógena da proteina AGL de camundongo nos camundongos tratados. Molécula traduzível 546.7 - como mostrado nas Figuras 6 e 7 - tem uma sequência de nucleobases idêntica à molécula traduzível 546, mas foi sintetizado com 5-metoxiuridina em lugar de uridina em vez de N'-metilpseudouridina.

EXEMPLO 6: TRATAMENTO DE MRNA REDUZ A ACUMULAÇÃO DE GLICOGÊNIO EM CAMUNDONGOS GSD3

[00329] Neste exemplo, camundongos Knockout para AGL foram tratados com veículo ou molécula traduzível 546 formulada com nanopartículas lipídicas ATX2. Fígados de camundongos knockout tratados com veículo ("VEH") mostraram vacuolização marcada a grave de hepatócitos e aumentos moderados a marcados no acúmulo de glicogênio nos hepatócitos (Figura 8). Em contraste, os fígados de camundongos knockout tratados com a molécula traduzível 546 formulada com nanopartículas lipídicas ATX2 tiveram apenas vacuolização de hepatócitos leve a moderada e apenas aumentos leves a moderados no acúmulo de glicogênio nos hepatócitos (Figura 9). Com base nos resultados histopatológicos mostrados neste exemplo, parece haver uma redução na gravidade da vacuolização hepatocelular e acúmulo de glicogênio nos fígados de camundongos knockout tratados com mRNA em comparação com camundongos KO tratados com veículo.

EXEMPLO 7: MOLÉCULAS TRADUZÍVEIS ADICIONAIS

QUE EXPRESSAM AGL

[00330] Quatro moléculas traduzíveis adicionais - 1970, 1987, SD1 e SD2 - foram projetadas com sequências de codificação AGL humanas otimizadas por códon adicionalmente modificadas mostradas nas SEQ ID NOs: 41, 42, 43 e 44, respectivamente. As moléculas traduzíveis 1970, 1987,

SD1 e SD2 compreendem ainda um cap 5' (7MGpppG), uma 5' UTR de TEV, uma sequência Kozak, uma sequência de SEQ ID NO: 40 imediatamente a jusante da sequência de codificação, uma 3' UTR de Xenopus beta globina e uma região de cauda Poli(A) (por exemplo, uma região de cauda poli(A) 100, 110 ou 114). Estas moléculas traduzíveis pode opcionalmente ser sintetizado com a Ni-metilpseudouridina ou 5-metoxiuridina em lugar de uridina.

[00331] Todas as publicações, patentes e literatura mencionadas aqui são incorporadas por referência para todos os fins.

[00332] Entende-se que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, materiais e reagentes específicos descritos, pois estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será abrangido pelas reivindicações anexas.

[00333] Deve-se notar que, conforme usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um", “uma”, “o” e “a” incluem referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, os termos “um" (ou “uma”"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados de forma intercambiável neste documento. É também de notar que os termos "compreende", “que compreende", “que contém", "que inclui" e "que tem" podem ser usados de forma intercambiável.

[00334] Sem mais elaboração, acredita-se que um versado na técnica possa, com base na descrição acima, utilizar a presente invenção em toda a sua extensão. As modalidades específicas a seguir devem, portanto, ser interpretadas como meramente ilustrativas e não limitativas do restante da divulgação de qualquer maneira.

[00335] Todos os recursos divulgados neste relatório descritivo podem ser combinados em qualquer combinação. Cada característica divulgada neste relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que serve ao mesmo objetivo, equivalente ou similar.

Claims (65)

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo para expressar uma amilo-alfa-1, 6- glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana, ou um fragmento da mesma, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos naturais e quimicamente modificados e é expressável para fornecer a AGL humana ou um fragmento da mesma que tem atividade de AGL.

2. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que é otimizado por códon em comparação com o mMRNA do tipo selvagem de AGL humana.

3. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são selecionados a partir de B-hidroxicitidina, 5-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 5- carboxicitidina, 5-formilcitidina, 5-metoxicitidina, 5-propinilcitidina, 2-tiocitidina; 5-hidroxiuridina, 5-metiluridina, 5,6-di-hidro-S-metiluridina, 2'-O-metiluridina, 2'- O-metil-5-metiluridina, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina, 2'-amino-2'-desoxiuridina, 2'- azido-2'-desoxiuridina, 4-tiouridina, 5-hidroximetiluridina, 5-carboxiuridina, 5- carboximetilesteruridina, 5-formiluridina, 5-metoxiuridina, 5-propiniluridina, 5- bromidrina 5-iodouridina, 5-fluorouridina; pseudouridina, 2'-O-metil-pseudouridina, Nº- hidroxipseudouridina, N'-metilpseudouridina, 2-O-metil-N'-metilpseudouridina, N'-etilpseudouridina, N'-hidroximetilpseudouridina e Arauridina; Nº-metiladenosina, 2-aminoadenosina, 3-metiladenosina, 7-deazaadenosina, 8-0x0adenosine, inosina; tienoguanosina, 7-desazaguanosina, 8-0xoguanosina e 6- O-metilguanina.

4, Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são N'-metilpseudouridinas.

B. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos quimicamente modificados são 5-metoxiuridinas.

6. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são uma combinação de pseudouridinas e N'-metilpseudouridinas.

7. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são uma combinação de 5-metilcitidinas e N'-metilpseudouridinas.

8. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são uma combinação de 5-metoxiuridinas e N'-metilpseudouridinas.

9. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são uma combinação de 5-metoxiuridinas, 5-metilcitidinas e N'-metilpseudouridinas.

10. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a eficiência de tradução do polinucleotídeo é aumentada em pelo menos 50% em comparação com o MRNA do tipo selvagem de AGL humana.

11. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a eficiência de tradução do polinucleotídeo é aumentada pelo menos três vezes em comparação com o MRNA do tipo selvagem de AGL humana.

12. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende de 200 a 12.000 nucleotídeos.

13. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos quimicamente modificados compreendem 1 a 99% dos nucleotídeos.

14. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos quimicamente modificados compreendem 50 a 99% dos nucleotídeos.

15. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende um cap 5', uma região não traduzida 5', uma região de codificação, uma região não traduzida 3' e uma região de cauda.

16. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende um melhorador de tradução.

17. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que é traduzível em uma célula de mamífero para expressar a AGL humana ou um fragmento da mesma com atividade de AGL.

18. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que é traduzível em um sujeito in vivo para expressar a AGL humana ou um fragmento da mesma com atividade de AGL.

19. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um produto de tradução do polinucleotídeo é uma AGL humana ativa ou um fragmento da mesma que tem atividade de AGL.

20. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que tem imunogenicidade reduzida em comparação com um mRNA do tipo selvagem de AGL humana.

21. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

22. Oligômero traduzível para expressar uma amilo-alfa- 1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL), ou um fragmento da mesma, sendo que o oligômero é caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos naturais e quimicamente modificados, um ou mais monômeros de UNA e é expressável para fornecer a amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa- glucanotransferase (AGL) humana ou um fragmento da mesma com atividade de AGL.

23. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, sendo que o oligôêômero é caracterizado pelo fato de que é otimizado por códon em comparação com o mRNA do tipo selvagem de AGL humana.

24. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a eficiência de tradução do oligômero é aumentada em pelo menos 50% em comparação com o MRNA do tipo selvagem de AGL humana.

25. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a eficiência de tradução do oligômero é aumentada pelo menos três vezes em comparação com o mMRNA do tipo selvagem de AGL humana.

26. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são selecionados a partir de B-hidroxicitidina, 5-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 5- carboxicitidina, 5-formilcitidina, 5-metoxicitidina, 5-propinilcitidina, 2-tiocitidina; B-hidroxiuridina, 5-metiluridina, 5-hidroximetiluridina, 5- carboxiuridina, 5-carboximetilesteruridina, 5-formiluridina, S-metoxiuridina, 5- propiniluridina, 5-bromouridina, 5-fluorouridina, 5-iodouridina, 5,6-di-hidro-5- metiluridina, 2':-O-metiluridina, 2:-O-metil-5-metiluridina, 2'-fluor-2"-desoxiuridina, 2'-amino-2'-desoxiuridina, 2'-azido-2'-deoxiuridina;

pseudouridina, 2'-O-metil-pseudouridina, Nº- hidroxipseudouridina, N'-metilpseudouridina, N'-hidroximetilpseudouridina, 2'- O-metil-N'-metilpseudouridina, N'-etilpseudouridina, Arauridine; Nº-metiladenosina, 2-aminoadenosina, 3-metiladenosina, 7-deazaadenosina, 8-o0xoadenosine, inosina; tienoguanosina, 7-desazaguanosina, 8-0xoguanosina e 6- O-metilguanina.

27. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos quimicamente modificados compreendem 1 a 99% dos nucleotídeos.

28. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, sendo que o oligômero é caracterizado pelo fato de que compreende um cap 5', uma região não traduzida 5', uma região de codificação, uma região não traduzida 3' e uma região de cauda.

29. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, sendo que o oligômero é caracterizado pelo fato de que compreende um melhorador de tradução.

30. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, sendo que o oligômero é caracterizado pelo fato de que é traduzível em uma célula de mamífero para expressar a amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) humana ou um fragmento da mesma que tem atividade de AGL.

31. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que um produto de tradução do oligômero é uma amilo-alfa-1, 6-glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase humana ativa ou um fragmento da mesma que tem atividade de AGL.

32. Oligômero, de acordo com a reivindicação 22, sendo que o oligômero é caracterizado pelo fato de que tem imunogenicidade reduzida em comparação com um mRNA do tipo selvagem de AGL humana.

33. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 32, sendo que o oligômero é caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

34. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de nucleobases selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

35. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleobases selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41445.

36. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de nucleobases selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

37. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, sendo que o polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende uma nucleobase selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

38. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 34 a 37, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

39. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais oligômeros, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

40. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 34 a 37, e um ou mais oligômeros, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

41. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizada pelo fato de que o carreador compreende um reagente de transfecção, uma nanopartícula ou um lipossomo.

42. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia médica.

43. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento do corpo humano ou animal.

44, Uso de uma composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizado pelo fato de que é para preparar ou fabricar um medicamento para melhorar, prevenir, retardar o início ou tratar uma doença ou distúrbio associado à atividade reduzida de amilo-alfa-1, 6- glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito que necessita do mesmo.

45. Uso, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a doença é doença de armazenamento de glicogênio tipo III.

46. Uso, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a doença de armazenamento de glicogênio tipo Ill é selecionada a partir da doença de armazenamento de glicogênio tipo lIlla, doença de armazenamento de glicogênio tipo Illb, doença de armazenamento de glicogênio tipo Illc e doença de armazenamento de glicogênio tipo Illd.

47. Método para melhorar, prevenir, retardar o início ou tratar uma doença ou distúrbio associado à atividade reduzida de amil-alfa-1, 6- glicosidase, 4-alfa-glucanotransferase (AGL) em um sujeito que necessita do mesmo, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a doença é doença de armazenamento de glicogênio tipo Ill.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a doença de armazenamento de glicogênio tipo Ill é selecionada a partir da doença de armazenamento de glicogênio tipo llla, doença de armazenamento de glicogênio tipo Illb, doença de armazenamento de glicogênio tipo Illc e doença de armazenamento de glicogênio tipo llld.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo fato de que a administração é intravenosa, subcutânea, pulmonar, intramuscular, intraperitoneal, dérmica, oral, nasal ou por inalação.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizado pelo fato de que a administração é uma vez diariamente, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 51, caracterizado pelo fato de que a administração compreende uma dose eficaz de 0,01 a 10 mg/kg.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 52, caracterizado pelo fato de que a administração aumenta a expressão de AGL no fígado, soro, plasma, rim, coração, músculo, cérebro, líquido cefalorraquidiano ou linfonodos do sujeito.

54. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que, após a administração, o nível de AGL no fígado do sujeito é de 10 a 1.500 ng/mg de proteína total do fígado.

55. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que, após a administração, o nível de AGL no fígado do sujeito é de 20 a 150 ng/mg de proteína total do fígado.

56. Kit para expressar uma AGL humana in vivo, sendo que o kit é caracterizado pelo fato de que compreende uma dose de 0,1 a 500 mg de um ou mais polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 34 a 37, ou um ou mais oligômeros, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, e um dispositivo para administrar a dose.

57. Kit, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é uma agulha de injeção, uma agulha intravenosa ou um dispositivo de inalação.

58. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana de tipo selvagem ao longo da sequência codificante de AGL humana de comprimento total de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

59. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleobases que é menos que 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana de tipo selvagem ao longo da sequência codificante de AGL humana de comprimento total de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 7-32 ou SEQ ID NOs: 41-45.

60. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana de tipo selvagem ao longo da sequência codificante de AGL humana de comprimento total de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 19.

61. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana de tipo selvagem ao longo da sequência codificante de AGL humana de comprimento total de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 31.

62. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases que é menos de 80% idêntica à sequência de codificação de AGL humana de tipo selvagem ao longo da sequência codificante de AGL humana de comprimento total de SEQ ID NO: 1, e em que a sequência de codificação de AGL humana é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 45.

63. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases de SEQ ID NO: 19.

64. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases de SEQ ID NO: 31.

65. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleobases de SEQ ID NO: 45.