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BR112019017001A2 - composição, proteína de fusão, ácido nucleico, célula hospedeira, e, métodos para produção de um domínio de aglutinação de albumina, para preparação de uma variante de il-15, para produção de uma proteína de fusão e para inibição ou redução de um tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo. - Google Patents

composição, proteína de fusão, ácido nucleico, célula hospedeira, e, métodos para produção de um domínio de aglutinação de albumina, para preparação de uma variante de il-15, para produção de uma proteína de fusão e para inibição ou redução de um tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo. Download PDF

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BR112019017001A2
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BR
Brazil
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abd
fusion protein
sequence
protein according
scfv
Prior art date
Application number
BR112019017001A
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Huang Haomin
K Cini John
Original Assignee
Sonnet Bio Therapeutics
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Abstract

composições que incluem um domínio de aglutinação de albumina e um parceiro de fusão (por exemplo, uma citocina ou uma fração de aglutinação) são providas. tais terapêuticos têm meia-vida de soro aumentada e encontram uso em aplicações onde um ou mais desses terapêuticos são necessários, por exemplo, em aplicações de oncologia.

Description

COMPOSIÇÃO, PROTEÍNA DE FUSÃO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UM DOMÍNIO DE AGLUTINAÇÃO DE ALBUMINA, PARA PREPARAÇÃO DE UMA VARIANTE DE IL-15, PARA PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO E PARA INIBIÇÃO OU REDUÇÃO DE UM TUMOR EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE DO MESMO
FUNDAMENTOS [001] Enquanto os produtos biológicos têm sido úteis no tratamento de muitas doenças, incluindo cânceres, a meia-vida circulatória curta de tais moléculas representam um obstáculo maior.
[002] Os produtos biológicos são úteis para o tratamento de cânceres de várias maneiras. As terapias com base em citocinas podem atuar diretamente nas células cancerígenas, interferindo na maneira como tais células crescem e se multiplicam. As citocinas também podem estimular o sistema imunológico, encorajando o crescimento de células T assassinas e outras células que atacam as células cancerígenas. Adicionalmente, as citocinas podem fazer com que células cancerígenas emitam produtos químicos que atraem as células do sistema imunológico. Ver, por exemplo, Dranoff, Nature Reviews Cancer 4: 11-22 (2004); e Zhang et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (18): 7513-7518 (2009). Os anticorpos são desejáveis como terapêutica devido à sua capacidade de reconhecer alvos com ambas especificidade e alta afinidade. Terapias com base em anticorpos monoclonais, incluindo aquelas que têm como alvo antígenos de superfície tumoral e sinais inibidores que limitam a ativação de células T, têm sido um componente padrão da terapêutica do câncer há mais de 20 anos. Ver, por exemplo, Weiner, Nat Rev Cancer 15 (6): 361-370 (2015).
[003] A meia-vida circulatória curta representa um obstáculo maior para muitos produtos biológicos. Ver, por exemplo, Perdreau et al., European Cytokine Network 21: 297-307 (2010). Tais terapêuticas de ação curta exigem
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2/85 perfis de dosagem frequentes que podem reduzir a aplicabilidade à clínica, particularmente para condições crônicas. A meia-vida longa do sérum é desejável, pois diminuiría a necessidade de injeções repetitivas da molécula para alcançar uma concentração sérica terapeuticamente relevante. Os métodos para prolongar a meia-vida de proteínas terapêuticas incluem PEGuilação, fusão a albumina de sérum humano (HSA), fusão ao fragmento constante (Fe) de uma imunoglobulina IgG humana e fusão a polipeptídeos não estruturados, tais como XTEN. Ver, por exemplo, Stohl, BioDrugs 29 (4): 215-239 (2015). As tecnologias de extensão de meia-vida permitem terapias biológicas novas e melhoradas, que reduzem o custo e a carga da dosagem frequente. Assim, permanece uma necessidade continuada por novos reagentes e métodos úteis para prolongar as meias-vidas de terapêuticas com base em proteínas e peptídeos.
SUMÁRIO [004] As composições que incluem o domínio de aglutinação de albumina (ABD) são aqui providas. Como aqui descrito, os produtos biológicos que incluem a matéria de domínio de aglutinação de albumina (isto é, proteínas de fusão de domínio de aglutinação de albumina) exibem vantajosamente meias-vidas prolongadas e de melhor farmacocinética in vivo em comparação aos produtos biológicos sem o ABD.
[005] Em um aspecto, é aqui provida uma composição que inclui um domínio de aglutinação de albumina (ABD). O ABD inclui: a) uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2; e b) uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2.
[006] Em algumas modalidades o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3
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3/85 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em uma modalidade, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2 e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em uma modalidade, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2. Em uma modalidade exemplar, o domínio de aglutinação de albumina compreende a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D).
[007] Em outro aspecto, é aqui provida uma composição que inclui uma variante de IL-15. A variante de IL-15 inclui uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em K86A, K86R, N112A, N112S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/N112A/N79A,
K86R/N112A/N79A, K86A/N112A/N79D, K86R/N112A/N79D, K86A/ N112A/N79Q, K86R/N112A/N79Q, K86A/N112A/N71D, K86R/
N112A/N71D, K86A/N112A/N71Q, K86R/N112A/N71Q, K86A/
N112A/N71D/N79A, K86A/N112A/N71D/N79D, K86A/N112A /N71Q/ N79A, K86A/N112A/N71Q/N79D, K86R/N112A/N71D/N79A, K86R/ N112A/N71D/N79D, K86R/N112A/N71D/N79Q, K86R/N112A/ N71Q/ N79A, K86R/N112A/N71Q/N79D e K86R/N112A/N71Q/N79Q, em comparação à IL-15 parental.
[008] Em algumas modalidades, a variante de IL-15 inclui uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das variantes de IL-15 representadas na Figura 3. Em certas modalidades, a variante de IL-15 inclui adicionalmente um receptor alfa de IL-15 (IL-15Ra) anexado à dita IL-15.
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4/85 [009] Em um aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) que inclui um ABD anexado a um parceiro de fusão. O ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2.
[0010] Em algumas modalidades, o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 inclui uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
[0011] Em certas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2, e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável representadas graficamente na Figura 2.
[0012] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável incluem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
[0013] Em algumas modalidades, o parceiro de fusão é uma citocina. Em certas modalidades, a citocina é selecionada a partir de: IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF e IFN-a.
[0014] Em certas modalidades, o parceiro de fusão é uma fração de aglutinação. Em algumas modalidades, a fração de aglutinação é uma scFv que inclui uma cadeia pesada variável scFv e uma cadeia leve variável scFv. Em algumas modalidades, a scFv é selecionada a partir de: uma scFv de anti
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ΤϋΕβ, uma scFv de anti-PD-Ll e uma scFv de anti-TNF. Em algumas modalidades, a scFv é uma scFv de anti-interleucina. Em modalidades exemplares, a scFv é uma scFv de anti-IL-1, IL-6, IL-8, IL-17 (AF) ou IL-23. [0015] Em algumas modalidades, o ABD é anexado ao dito parceiro de fusão por um ligador. Em uma modalidade exemplar, o ligador é (GGGGS) x, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
[0016] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) IL-15 de acordo com a fórmula (IL-15)-L-(ABD). O ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2, e L é um ligador.
[0017] Em algumas modalidades, o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 inclui uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
[0018] Em certas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2 e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável representadas graficamente na Figura 2.
[0019] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável incluem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
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6/85 [0020] 28. Uma proteína de fusão de IL 15-ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, em que a dita IL-15 é uma variante de IL-15 que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em K86A, K86R, NI 12A, NI 12S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/N112A/N79A, K86R/N112A/N79A, K86A/N112A/N79D, K86R/N112A/N79D, K86A/N112A/N79Q, K86R/ N112A/N79Q, K86A/N112A/N71D, K86R/N112A/N71D, K86A/
N112A/N71Q, K86R/N112A/N71Q, K86A/N112A/N71D/N79A, K86A/ N112A/N71D/N79D, K86A/N112A/N71Q/N79A, K86A/ N112A/N71Q /N79D, K86R/N112A/N71D/N79A, K86R/ N112A/ N71D/ N79D, K86R/N112A/N71D/N79Q, K86R/N112A/N71Q/N79A, K86R/N112A/
N71Q/N79D e K86R/N112A/N71Q/N79Q, em comparação a uma IL-15 parental. Em algumas modalidades, a variante de IL-15 inclui uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das variantes de IL-15 descritas na Figura 3. Em uma modalidade exemplar, a variante de IL-15 inclui a sequência de aminoácidos de IL15 K86R/N112A.
[0021] Em certas modalidades, a IL-15 i é uma IL-15 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a IL-15 compreende uma IL-15 de tipo selvagem anexada a um receptor alfa IL-15 (IL-15Ra).
[0022] Em certas modalidades, o ligador é selecionado a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48. Em algumas modalidades, o ligador é (GGGGS)X, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
[0023] Em uma modalidade, a proteína de fusão de IL-15-ABD tem uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas na Figura 4.
[0024] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) IL-12 de acordo com a fórmula
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7/85 (IL-2)-L-(ABD). 0 ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2, e L é um ligador.
[0025] Em algumas modalidades, o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 inclui uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
[0026] Em certas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2, e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável representadas graficamente na Figura 2.
[0027] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável incluem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
[0028] Em uma modalidade, a IL-12 é uma cadeia única de IL-12 que inclui uma subunidade p35, uma subunidade p40 e um ligador de IL-12, e o ligador de IL-12 anexa covalentemente a subunidade p35 à subunidade p40. Em certas modalidades, o ligador é selecionado a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48. Em uma modalidade exemplar, o ligador é (GGGGS)X, onde x é um número inteiro de 1 a 10.
[0029] Em uma modalidade exemplar, a proteína de fusão de IL-12ABD inclui uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das
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8/85 sequências de aminoácidos da Figura 20.
[0030] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) com uma fórmula, a partir de Nterminal para C-terminal, selecionadas a partir de: a) (IL-12)-L1-(ABD)-L2(IL-15); e b) (IL-15)-L1-(ABD)-L2-(IL-12). O ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2, e LI e L2 são um primeiro e segundo ligadores, respectivamente.
[0031] Em algumas modalidades, o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 inclui uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
[0032] Em certas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2, e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável representadas graficamente na Figura 2.
[0033] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável incluem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
[0034] Em algumas modalidade, a IL-15 inclui um polipeptídeo de tipo selvagem IL-15. Em certas modalidades, a IL-15 de tipo selvagem é anexada a um receptor alfa IL-15 (IL-15Ra).
[0035] Em uma modalidade, a IL-15 é uma variante de IL-15 que
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9/85 inclui uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: K86A, K86R, N112A, N112S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/
N112A/N79A, K86R/N112A/N79A, K86A/N112A/N79D, K86R/
N112A/N79D, K86A/N112A/N79Q, K86R/N112A/N79Q, K86A/
N112A/N71D, K86R/N112A/N71D, K86A/N112A/N71Q, K86R/
N112A/N71Q, K86A/N112A/N71D/N79A, K86A/N112A/N71D/N79D,
K86A/N112A/N71Q/N79A, K86A/N112A/N71Q/N79D, K86R/N112A/
N71D/N79A, K86R/N112A/N71D/N79D, K86R/N112A/N71D/N79Q, K86R /N112A/N71Q/N79A, K86R/N112A/N71Q/N79D e K86R/N112A/N71Q/
N79Q, em comparação a uma IL-15 parental. Em uma modalidade, a IL-15 inclui uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das sequências de aminoácidos representadas na Figura 3.
[0036] Em certas modalidades, a IL-12 é uma cadeia única de IL-12 que inclui uma subunidade p35, uma subunidade p40 e um ligador de IL-12, e onde o ligador de IL-12 anexa a subunidade p35 à subunidade p40.
[0037] Em algumas modalidades, cada um do primeiro ligador e do segundo ligador são independentemente selecionados a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48. Em uma modalidade exemplar, o ligador é (GGGGS)X, onde x é um número inteiro de 1 a 10.
[0038] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de ABD que inclui um domínio de aglutinação de albumina (ABD), uma citocina e um ligador (L), de acordo com a fórmula (citocina)-L-(ABD). O ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2, e L é um ligador. A citocina é selecionada a partir de: IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF e
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IFN-α.
[0039] Em algumas modalidades, o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 inclui uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
[0040] Em certas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2 e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável representadas graficamente na Figura 2.
[0041] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável incluem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
[0042] Em algumas modalidades, o ligador é selecionado a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48. Em uma modalidade exemplar, o ligador é (GGGGS)X, onde x é um número inteiro de 1 a 10.
[0043] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de ABD de acordo com a fórmula: (FP1)-L1-(ABD)-L2-(FP2), onde ABD é um domínio de aglutinação de albumina que inclui uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável; onde FP1 e FP2 são uma primeira proteína de fusão e uma segunda proteína de fusão, respectivamente; e onde LI e L2 são um primeiro e um segundo ligador, respectivamente. O ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui um vlCDRl, um vlCDR2 e um
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11/85 vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2.
[0044] Em algumas modalidades, o vhCDRl inclui uma sequência vhCDRl, o vhCDR2 inclui uma sequência vhCDR2, e o vhCDR3 inclui uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
[0045] Em certas modalidades, o vlCDRl inclui uma sequência vlCDRl, o vlCDR2 inclui uma sequência vlCDR2, e o vlCDR3 inclui uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável inclui a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variável representadas graficamente na Figura 2.
[0046] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável incluem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
[0047] Em algumas modalidades, FP1 e FP2 são uma primeira citocina e uma segunda citocina, respectivamente. Em uma modalidade exemplar, a primeira citocina e a dita segunda citocina são selecionadas a partir de IL-2 e de IL-12; IL-7 e IL-15; IL-15 e IL-12; IL-18 e GM-CSF; IL21 e IL-15; GM-CSF e IL-12; GM-CSF e IL-21; e IFN-α e IL-15.
[0048] Em algumas modalidades, o primeiro e segundo parceiro de fusão são selecionados a partir de: uma scFv de anti-PD-Ll e uma IL-12; uma scFv de anti-PD-Ll e uma IL-15; uma scFv de anti-PD-Ll e uma scFv de anti-TGFP; uma primeira scFv de anti-PD-Ll e uma segunda scFv de PD-L1; uma scFv de anti-TGFp e uma IL-12; uma scFv de anti-TGFp e uma IL-15; uma scFv de anti-TGFp e uma scFv de PD-L1; e uma primeira scFv de antiTGFP e uma segunda scFv de anti-TGFp.
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12/85 [0049] Uma proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 68, em que FP1 e FP2 são uma primeira fração de aglutinação e uma segunda fração de aglutinação, respectivamente. Em certas modalidades, cada uma da primeira fração de aglutinação e da segunda fração de aglutinação são uma scFv. Em uma modalidade exemplar, a primeira fração de aglutinação e a segunda fração de aglutinação são selecionadas a partir de: uma scFv de TNF e uma scFv de IL-1; uma scFv de TNF e uma scFv de IL-6; uma scFv de TNF e uma scFv de IL-8; uma scFv de TNF e uma scFv de IL-17 (isoformas A-F); scFv de TNF e uma scFv de IL-23; e uma primeira scFv de TNF e uma segunda scFv de TNF.
[0050] Em algumas modalidades, cada um do primeiro ligador e do segundo ligador são independentemente selecionados a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48. Em uma modalidade, cada um do primeiro ligador e do segundo ligador são independentemente (GGGGS) x, onde x é um número inteiro de 1 a 10.
[0051] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) que inclui um domínio de aglutinação à ΤΘΕβ e um domínio de aglutinação de albumina. O domínio de aglutinação de albumina inclui uma cadeia pesada variável de ABD e uma cadeia leve variável de ABD com as sequências de aminoácidos de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis na Figura 2.
[0052] Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável de ABD e a dita cadeia leve variável de ABD compreendem a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e da cadeia leve variável de A10m3.
[0053] Em uma modalidade, o domínio de aglutinação à ΤΘΕβ é uma scFv que inclui uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de 4D9 (Figura 40B). Em algumas modalidades, a ABD adicionalmente inclui uma IL-12, uma IL-15, um domínio de aglutinação à PD-L1 ou um segundo domínio de aglutinação à ΤΘΕβ.
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13/85 [0054] Em outro aspecto, é aqui provida uma proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) que inclui um domínio de aglutinação à PD-L1 e um domínio de aglutinação de albumina. O domínio de aglutinação de albumina inclui uma cadeia pesada variável de ABD e uma cadeia leve variável de ABD com as sequências de aminoácidos de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis na Figura 2.
[0055] Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável de ABD e a cadeia leve variável de ABD compreendem a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e da cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D). Em certas modalidades, o domínio de aglutinação à PD-L1 é uma scFv que compreende uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de 10D12 (Figura 50).
[0056] Em algumas modalidades, o ABD inclui adicionalmente uma IL-12, uma IL-15, um domínio de aglutinação à ΤΘΕβ ou um segundo domínio de aglutinação à PD-L1.
[0057] Em outro aspecto, é aqui provido um ácido nucleico que codifica qualquer um dos domínios de aglutinação de albumina, variantes de IL-15 ou proteínas de fusão de ABD aqui descritas, células hospedeiras que incluem qualquer um de tais ácidos nucleicos, e métodos de preparação de tais ABDs, variantes de IL-15 ou proteínas de fusão de ABD.
[0058] Em ainda outro aspecto, é aqui provido um método de inibição ou redução de um tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método inclui a administração ao indivíduo de uma proteína de fusão de ABD.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0059] As figuras 1A-C ilustram diversas proteínas de fusão de domínio de aglutinação de albumina exemplificativas aqui descritas, incluindo as proteínas de fusão em que um domínio de aglutinação de albumina é anexado a uma citocina (por exemplo, IL-12 ou IL-15) e proteínas
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14/85 de fusão onde um domínio de aglutinação de albumina é anexado a 1) duas citocinas; 2) duas frações de aglutinação (por exemplo, scFvs); 3) uma fração de aglutinação e uma citocina.
[0060] As Figuras 2A-2Z mostram as sequências de domínios de aglutinação de albumina exemplificativos incluídos em certas modalidades das proteínas de fusão de domínio de aglutinação de albumina sujeitas aqui descritas. Estão incluídas nestas figuras as sequências de domínio pesado variável e de domínio leve variável, bem como sequências particulares de vhCDRl-3 e vlCDRl-3.
[0061] A Figura 3 mostra as sequências de variantes de IL-15 exemplificativas aqui descritas.
[0062] A Figura 4 mostra modalidades exemplares das proteínas de fusão de IL-15-ABD aqui descritas. As proteínas de fusão de IL-15-ABD representadas na Figura 4 incluem A10m3 de ABD.
[0063] A Figura 5 representa os resultados de estudos que mostram que a transcrição não é responsável pela baixa expressão de IL-15-A10m3 em células HEK293T. A verificação de IL15-A10m3 mRNA em células Transfectadas. A) A expressão de IL15-A10m3 em HEK293 não pode ser detectada por Western blotting usando ou anticorpo anti-His tag (esquerdo), ou por aglutinação funcional ELISA a MSA (direito). M: Marcador, CK: meio de cultura não transfectado como controle, 1-3: meio de 3 culturas celulares transfectadas independentemente (100, 200 e 250 = 100, 200, 250 ug/ml de Zeocina respeitosamente). 10ug/ml de E. coli produziu IL15-A10m3 que serviu como o controle positivo. B) mRNA foi preparado a partir de 4 células Transfectadas independentemente de IL15-A10m3 e RT-PCR foi realizada para quantificar o nível de IL15-A10m3 mRNA mRNA em comparação com o de um gene de manutenção, GAPDH. Pista 1) controle celular não transfectado; 2-5) A transcrição de IL15-A10m3 mRNA parece ser normal em todas as células transfectadas; 6) controle positivo de GAPDH
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15/85 mRNA.
[0064] A Figura 6 representa a identificação dos potenciais locais de ubiquitinação de IL-15 que são putativamente protegidos pela aglutinação do receptor alfa IL-15 (IL-15Ra) à IL-15. (A) K86 em vermelho é um local de ubiquitinação putativo que está próximo dos locais de aglutinação à IL-15Ra (marcados por estrelas); (B) K86 é um acerto para a ubiquitinação a partir do UbPred, um banco de dados online de locais de ubiquitinação (www.ubpred.org).
[0065] A Figura 7 provê ilustrações esquemáticas de várias proteínas de fusão de IL-15-ABD com estabilidade melhorada aqui descritas, incluindo uma IL-15-ABD com um parceiro de fusão de “domínio de sushi” IL15Ra/IL15 (A) e proteínas de fusão de IL-15-ABD que incluem parceiros de fusão variantes de IL-15 com substituições de aminoácidos em local de ubiquitinação putativa K86 (B).
[0066] A Figura 8 representa estudos que avaliam o nível de expressão (Figura 8A) e a capacidade de variantes de IL-15-ABD K86R e K86A produzidas por células HEK293 e IL-15Ra/IL-15-ABD para ligar à albumina de sérum de camundongo (Figura 8A) e IL-15Ra (Figura 8B). A) Leitura de ELISA para aglutinação de IL15-ABD à albumina de sérum de camundongo (MSA) de 12 clones de WT IL15-A10m3 (WT), 12 clones de IL-15Ra/IL-15-A10m3 (IL15Ra), 6 clones mutantes de IL-15 K86A-A10m3 (K86A) e 6 clones mutantes de IL-15 K86R-A10m3 (K86R). O meio de cultura de cada cavidade de amostra de placas de 24Cavidades foi adicionado às placas de ELISA revestidas com MSA. B) ELISA para a aglutinação da IL15 ao receptor alfa IL-15 (IL-15Ra) que foi revestido na placa foi usado para confirmar que as mutações K86A (clone A3, estrela amarela) e K86R (clone R6, estrela verde) não tiveram impacto na atividade de aglutinação da IL-15 a IL-15Ra. A IL-15Ra interna em IL-15Ra -IL-15-A10m3 (clone alfal, estrela vermelha) pode ligar-se à IL15 interna e, assim, bloquear sua aglutinação à
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IL-15Ra revestida na placa. Foram usados 10ug/ml de E. coli produzidos por WT IL-15-A10m3 como controle positivo.
[0067] A Figura 9 representa a produção em escala do clone IL15K86R-A10m3 #6. A) Cromatógrafo de IL15K86R-A10m3 por uma coluna de exclusão de tamanho; B) análise por SDS-PAGE das frações SEC de 14 a 42; C) Produtos finais (1: IL15K86R-A10m3, 2: IL15Ra-IL15A10m3) foram confirmados finalmente por SDS-PAGE (esquerda) e Western blotting com anticorpo anti-His tag (direita).
[0068] A Figura 10 representa os resultados de ensaios de aglutinação in vitro , confirmando a capacidade de IL-15 K86R-A10m3 para ligar à albumina de sérum de camundongo (MSA).
[0069] A Figura 11 representa os resultados de ensaios de proliferação de CTLL2, que mostra que os polipeptídeos de IL-15 K86R-A10m3 produzidos a partir de células HEK293T têm bioatividade reduzida em comparação à IL-15 de tipo selvagem e IL-15-A10m3 produzidas a partir de
E. coli.
[0070] A Figura 12 representa os resultados de estudos que mostram que a bioatividade reduzida de células HEK produzidas por IL-15 K86RA10m3 é pelo menos parcialmente devida à sua glicosilação.
[0071] A Figura 13 provê os resultados de estudos que mostram que a mutação N112A introduzida na IL15 K86R-A10m3 pode restaurar a bioatividade da IL-15 comparável àquela da IL-15R-A10m3 desglicosilada em ensaios de proliferação CTLL2 (A). (B) mostra adicionalmente que as proteínas de fusão de IL-15R-A10m3 com substituições de aminoácidos de IL-15 N112A, N112Q e N112S exibiram bioatividade aumentada inversamente proporcional ao tamanho da cadeia lateral substituída.
[0072] A Figura 14 representa a montagem experimental de um estudo para avaliar os efeitos in vivo de IL-15 e IL-15-ABD no crescimento tumoral em um modelo de melanoma de camundongo B16-F10.
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17/85 [0073] A Figura 15 é um gráfico, que mostra a quantidade de inibição do crescimento tumoral B16-F10 em camundongos C57BL/6 tratados com a proteína de fusão de IL-15-ABD, 11 dias após o tratamento.
[0074] A Figura 16 provê análises FACS, descrevendo o efeito do tratamento com IL-15-ABD nas populações de linfócitos com infiltração tumoral.
[0075] As Figuras 17 e 18 proveem um resumo dos efeitos do tratamento com IL-15-ABD em populações de linfócitos em baços e tumores.
[0076] As figuras 19A e B proveem resultados de estudos que mostram a estabilidade do indivíduo a IL-15-ABD em um modelo de camundongo (A) e no sérum humano (B), em comparação ao controle de IL15 WT.
[0077] A Figura 20 representa as sequências de IL-12-ABD exemplificativas aqui descritas: mIL-12sc-A10m3 e IL-12sc-A10m3 humana.
[0078] As Figuras 21 e 22 são estudos que mostram que o indivíduo à IL-12-ABD produzido a partir de células HEK293T é biologicamente ativo em ensaios in vitro e ensaios com base em células.
[0079] A Figura 23 representa a montagem experimental de um estudo para avaliar os efeitos in vivo de IL-12 e IL-12-ABD no crescimento tumoral em um modelo de melanoma de camundongo B16-F10. As concentrações molares similares de IL-12 e IL-12 foram usadas em três concentrações diferentes. Por exemplo, 3 pg de IL-12 é a mesma concentração molar que 4,5 pg de IL-12-ABD, 10 pg de IL-12 é a mesma concentração molar que 15 pg de IL-12-ABD e 20 pg de IL -12 é a mesma concentração molar que 30 pg de IL-12-ABD. O peso molecular da IL-12 é de 70 kD e o peso molecular da IL-12-ABD é de 107 kD.
[0080] A Figura 24 são gráficos que representam a cinética de crescimento tumoral de vários grupos nos estudos in vivo de IL-12-ABD/IL-
12. A Figura 24A mostra os resultados das avaliações de tamanho do tumor
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18/85 nos grupos IL-12 e IL-12-ABD, a Figura 24B mostra os grupos de tratamento IL-12 separadamente e a Figura 24C mostra os grupos de tratamento IL-12ABD separadamente.
[0081] A Figura 25 são gráficos que representam a cinética de crescimento tumoral de animais individuais em cada um dos vários grupos dos estudos in vivo de IL-12-ABD/IL-12.
[0082] A Figura 26 são gráficos que mostram os volumes tumorais de vários grupos nos estudos in vivo de IL-12-ABD/IL-12, 10 dias após o tratamento.
[0083] A Figura 27 representa as medidas de peso corporal longitudinal (esquerda) e % de peso corporal (direita) em camundongos portadores de tumor B16-F10 em vários momentos após o tratamento com ΙΕ- 12 ou IL-12-ABD.
[0084] A Figura 28 provê Curvas de Sobrevida de Kalpan-Meier para vários grupos nos estudos in vivo de IL-12-ABD/IL-12.
[0085] A Figura 29 representa um resumo de estudos que comparam os efeitos farmacodinâmicos de uma dose única de IL-12-ABD versus IL-12 em camundongos portadores de tumor B16-F10 em cinco dias. São mostradas comparações do peso do tumor, peso do baço, IFN-γ do sérum e peso corporal.
[0086] A Figura 30 mostra o resultado de um estudo que compara o volume tumoral de camundongos portadores de tumor B16-F10 em 10 dias, injetados ou com IL-12-ABD (1,3 pg), IL-12 (30 pg) ou placebo. A IL-12ABD é administrada a uma dose molar mais baixa ~ 30 vezes superior à da IL-12 neste estudo.
[0087] A Figura 31 adicionalmente representa os efeitos hematopoiéticos de IL-12-ABD e IL-12 em camundongos a partir do estudo representado graficamente na Figura 32 aos 3 e 7 dias.
[0088] A Figura 32 representa um estudo, que mostra o efeito de
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19/85 terapias de combinação de dose única usando IL-12-ABD ou IL-12 com anticorpos anti-PD-1 no crescimento tumoral em camundongos portadores de tumor Bl6-F10.
[0089] A Figura 33 representa os resultados de uma análise de sérum, que mostra um aumento na PK para IL12-ABD sobre IL-12 WT.
[0090] A Figura 34 representa as sequências do indivíduo exemplificativo às IL-15-ABD-IL-12 aqui descritas: 1) hIL-15 (K86R/N112A)-A10m3-mIL-12sc; 2) mIL-12sc-A10m3-hIL-15 (K86R); e 3) mIL-12sc-A10m3-hIL-15 (K86R/N112A).
[0091] A Figura 35 mostra atividades de aglutinação de ambas hIL-15 (K86R)-A10m3-mIL-12sc e mIL-12sc -A10m3-hIL-15 (K86R) a MSA (A), receptor alfa IL-15 e receptor beta2 IL- 12 (B), como confirmado por ELISA.
[0092] A Figura 36 representa as sequências do indivíduo exemplificativo adicional IL-15-ABD-IL-12 aqui descrito: 1) hIL-15 (K86R)A10m3-hIL-12sc; 2) hIL-12sc-A10m3-hIL-15 (K86R); e 3) hIL-12scA10m3-hIL-15 (K86R/N112A).
[0093] As Figuras 37 e 38 representam os resultados de experimentos que mostram que a IL-15-ABD-IL-12 aqui descrita exibe ambas a atividade da IL-12 (Figura 39) como da IL-15 (Figura 40).
[0094] A Figura 39 representa os resultados de um estudo, que mostra que a IL-15-ABD-IL-12 aqui descrita exibiu uma atividade superior em comparação à IL-12-ABD sozinha.
[0095] As Figuras 40A e B representam as sequências de dois domínios de aglutinação à ΤΘΕβ exemplificativos aqui descritos: 4H7 e 4D9, incluindo cadeia pesada variável, cadeia leve variável e sequências de formato scFv.
[0096] A Figura 41 representa os resultados de um estudo, que mostra que scFvs de ΤΘΕβ aqui descritas são capazes de bloquear a expansão Treg (CD4+Foxp3+) induzida por ΤΘΕβΙ.
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20/85 [0097] As figuras 42 e 43 mostram que o bloqueio de TGF-β inverte induzida por transição TGF-β 1 epitelial-mesenquimal (Figura 44) e migração (Figura 45). (Figura 42A) Representação esquemática da perda de E-caderina e expressão induzida de vimentina durante EMT. (Figura 44 B) Células de camundongo 4T1 foram cultivadas em meio de crescimento suplementado apenas com TGF-β 1 ou com 1D11 (painel 3) ou scFv anti-TGF-βΙ (painel 4), depois fixadas e coradas com anticorpo E-caderina (verde) e anticorpo de vimentina (púrpura). Núcleos foram contrastados com DAPI (azul). O tratamento com TGF-β 1 induziu perda de E-caderina das junções célulacélula e aumento da expressão de vimentina. Este efeito é revertido pela adição de 1D11 ou indivíduo à scFv de anti-TGF-βΙ aqui descrito. A Figura 43 mostra adicionalmente que indivíduos à scFv anti-TGF-βΙ são aqui descritos bloquear a migração de células de carcinoma de TGF-β 1-mediada.
[0098] A Figura 44 apresenta um resumo de estudos que mostram que as scFvs anti-TGF-31 descritos aqui são capazes de inibir a fosforilação de Smad2 mediada por TGF-β em células humanas (A) e de camundongo (B). Em A, os indivíduos à scFv de anti-TGF-31 foram capazes de inibir a fosforilação de Smad2 mediada por TGF-31 humano em células humanas de um modo dependente da dose. Em B, os indivíduos à scFv de anti-TGF-βΙ foram capazes de inibir o TGF-β 1, -β2 e β3 de camundongo medeiam a fosforilação de Smad2 em células de camundongo.
[0099] A Figura 45A representa as sequências de construtos exemplares de TGF-β 1 scFv-ABD (4D9M-A6m e 4H7-A6m).
[00100] A Figura 45B proporciona um resumo de um estudo, que mostra que o anti- ΤΟΕβ-1 -ABD estende-se a scFv anti-TGF-βΙ.
[00101] A Figura 46 provê um resumo de um estudo, que mostra que vários Fv-ABDs anti- TGF-β 1 se (bivalente para TGF-β 1) produzidos em E. coli ou células de mamíferos (HEK) são capazes de se ligar à albumina de sérum de camundongo.
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21/85 [00102] A Figura 47 provê a síntese de um estudo, que mostra que a inibição mediada por ΤΘΡβ-1 de proliferação de células T foi revertida (isto é, aumentar a proliferação de células T), por construtos TGF-βΙ scFv-ABD (4D9M-A6m e 4H7-A6m) exemplares.
[00103] A Figura 48 descreve ligadores exemplificativos que podem ser usados com a proteína de fusão em questão. Tais ligadores podem ser utilizados como ligadores scFv para a cadeia pesada variável de ABD e cadeias leves variáveis. Tais ligadores também podem ser usados para ligar os domínios de aglutinação de albumina aqui descritos a parceiros de fusão de IL-12 e IL-15 ou para ligar componentes de parceiros de fusão de IL-12 (p35 e p40) ou parceiros de fusão de IL-15 (IL-15 e IL-15Ra) entre si.
[00104] A Figura 49A-G provê a sequência de aminoácidos de citocinas exemplares que podem ser incluídos nas proteínas de fusão de ABD descritas no presente documento. Também representado nas Figuras 49A-G são proteínas de fusão citocina-ABD exemplificativas onde o ABD é A10m3. Embora essas proteínas de fusão citocina-ABD sejam representadas com A10m3 de ABD, qualquer ABD, incluindo a ABD aqui descrita, pode ser incluída nas proteínas de fusão citocina-ABD.
[00105] A Figura 50 provê a sequência de aminoácidos de um domínio de aglutinação anti-PD-Ll exemplar, 10D12 que pode ser utilizado com as proteínas de fusão de ABD aqui descritas. O 10D12 aglutina-se a hPD-Ll a pH baixo e tem reatividade cruzada com mPD-LL 10D12 não se aglutina a hPD-L2 ou mPD-L2. Além disso, o 10D12 bloqueia a interação PD-1/PD-L1, bem como a interação B71/PD-L1.
[00106] As Figuras 51A e B representam várias combinações úteis de citocina-ABD-citocina (A) e de fração de aglutinação citocina-ABD/fração de aglutinação (B). “A” e “B” em cada combinação podem ser alternados para a orientação oposta. Também representada nestas figuras está uma estrutura de aglutinação-ligador A10m3 que pode ser incluída na combinação citocina
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ABD-citocina e fração de aglutinação -ABD-citocina/fração de aglutinação. Embora A10m3 de ABD seja representado, qualquer ABD, incluindo qualquer um dos aqui descritos (por exemplo, Figura 2) pode ser usado em tais construtos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A. Visão Geral [00107] Os produtos biológicos, incluindo citocinas e terapias com base em anticorpos, são úteis para o tratamento de cânceres.
[00108] Os agentes terapêuticos à base de citocinas, atuais e potenciais, incluem os que utilizam IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL- 21MG-CSF e IFN-a.
[00109] A IL - 12 é capaz de mediar funções efetoras imunes de uma maneira compatível com o aumento da resposta imune antitumoral próinflamatória e endógena. (Ver, p. Ex., Boggio et al., J Exp Med 188: 589-96 (1998); Cavallo et al., Cancer Res 59: 414-21 (1999); Yu et al. Int Immunol 8: 855-65 (1996), Nastala et al., J Immunol 153: 1697: 706 (1994), Brunda et al., J Exp Med 178: 1223-30 (1993), IL-12 é conhecida por induzir uma resposta CD4 + de células T inflamatórias Thl. bem como aumentar a citotoxicidade CD8+ das células T Estudos também mostraram que a secreção de células T de IFNy mediada por IL-12 pode reverter a anergia de células T e conferir resistência a células T efetoras a células T reguladoras supres soras da imunidade, apenas ativar o sistema imunológico adaptativo e inato, mas também modular o microambiente tumoral imune-hostil toma a IL-12 um candidato ideal para a imunoterapia tumoral.
[00110] A IL-15 é capaz de estimular a proliferação de células T no interior de tumores (ver, por exemplo, Miecnik et al., Sei Transi Med 6 (228): 228ra37 (2014) bem como aumentar a capacidade de sobrevivência de memória efetiva CD8+ de células T, e é crítica para o desenvolvimento de células NK. Assim, acredita-se que a IL-15 pode aumentar a potência dos
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23/85 inibidores de checkpoint e outras imunoterapias que aproveitam as células T para atacar as células cancerígenas. Monômero IL-15, no entanto, tem uma meia-vida curta de menos de 40 minutos in vivo As modificações no monômero de IL-15 podem melhorar sua farmacocinética in vivo no tratamento de cânceres. Estas modificações geralmente se centraram em melhorar a trans-apresentação de IL-15 com a subunidade alfa do receptor de IL-15Ra.Tais modificações incluem: 1) pré-associação de IL-15 e sua fusão de subunidade-subunidade-Fc de receptor solúvel para formar o complexo IL15: IL-15Ra-Fc (ver, por exemplo, Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sei USA 1 03: 9166-71 (2006)); 2) expressão da proteína IL-15-sIL-15Ra-sushi hiperagonista (ver, por exemplo, Bessard et al., Molecular cancer therapeutics 8: 2736-45 (2009)); e 3) pré-associação de IL-15N72D mutante de IL-15 humana com o complexo de fusão de IL-15Ra-Fc sushi-Fc (ver, por exemplo, Zhu et al., Journal of Immunology 183: 3598-6007 (2009)).
[00111] Terapias à base de anticorpos monoclonais, incluindo aqueles que alvejar os antígenos de superfície de tumor e inibidoras sinais que limitam a ativação de células T, têm sido um componente padrão de terapêutica do câncer há mais de 20 anos. Ver, por exemplo, Weiner, Nat Rev Cancer 15 (6): 361-370 (2015).
[00112] A meia-vida em circulação curta representa um obstáculo maior para muitos produtos biológicos, incluindo citocinas e anticorpos com base terapêutica. Ver, por exemplo, Herrington-Symes et al., Advances in Bioscience and Biotechnology 4: 689-698 (2013) e Perdreau et al., European Cytokine Network 21: 297-307 (2010). Tais terapias de ação curta requerem perfis de dosagem frequentes que podem reduzir a aplicabilidade à clínica, particularmente para condições crônicas. A meia-vida longa no sérum é desejável, pois diminuiría a necessidade de injeções repetitivas da molécula para alcançar uma concentração sérica terapeuticamente relevante. Os métodos para prolongar a meia-vida de proteínas terapêuticas incluem
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PEGuilação, fusão a albumina do sérum humano (HSA), fusão ao fragmento constante (Fc) de uma imunoglobulina humana IgG e fusão a proteína de fusão não estruturada s tal como XTEN. Ver, por exemplo, Stohl, BioDrugs 29 (4): 215-239 (2015). Tecnologias de extensão de meia-vida permitem terapias biológicas melhoradas ou novas que reduzem o custo e a carga da dosagem frequente. Assim, permanece uma necessidade continuada de novos reagentes e métodos que podem prolongar as meias-vidas de terapêuticas com base em proteínas e peptídeos.
[00113] São aqui providas novas proteínas de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD), úteis para o alargamento das meias-vidas de agentes biológicos (por exemplo, interleucinas e anticorpos). A albumina sérica possui uma meia-vida longa na faixa de 2 a 4 semanas devido à reciclagem através do receptor Fc neonatal (FcRn). A albumina é absorvida pelas células endoteliais através de macropinocitose e aglutina-se ao FcRn de uma maneira dependente do pH no ambiente ácido do endossoma inicial. A albumina-FcRn vinculativo mergulhador t moléculas de albumina s de degradação no compartimento lisossômico e redireciona as moléculas de albumina para a membrana de plasma, onde eles são libertados de volta para o plasma sanguíneo, devido ao pH neutro.
[00114] Domínios de aglutinação de albumina (ABDS) aqui descritos não competem com FcRn para aglutinação de albumina e ligam-se a albumina em uma gama de pH que permite a ABD para também submeter-se a reciclagem endossomal albumina dirigida por FcRn quando ligada à albumina. Como tal, os produtos biológicos que incluem o indivíduo ao domínio de aglutinação de albumina (ABD) são capazes de escapar à degradação lisossomal usando o caminho da albumina-FcRn e, consequentemente, apresentam meia-vidas mais longas no sérum do que homólogos faltantes ABDs.
[00115] Além disso, tais agentes terapêuticos contendo ABD
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25/85 localizam-se vantajosamente a tumores, que são conhecidos por conterem níveis elevados de albumina sérica. Assim, tais terapêuticas contendo ABD são particularmente úteis para o tratamento de cânceres.
B. Domínios de Aglutinação de albumina [00116] Em um aspecto, são providas aqui composições que incluem um domínio de aglutinação de albumina. Como aqui usado, “albumina sérica” refere-se a um membro de uma família de proteínas globulares produzidas pelo fígado que funciona principalmente como uma proteína transportadora de esteroides, ácidos graxos e hormônios tireoidianos no sangue. A albumina sérica também desempenha um papel maior na estabilização do volume do fluido extracelular, contribuindo para a pressão oncótica do plasma e inclui, mas não se limita, a albumina do sérum humano (HSA, Números de Acesso Genbank: NM_000477 e NP_000468) e albumina de sérum de camundongo (MSA, Números de acesso Genbank: NM_009654 e NP_0033784). A estrutura da albumina é distinguida por várias hélices α longas e contém onze domínios de aglutinação distintos para compostos hidrofóbicos. Em humanos, a albumina sérica é codificada pelo gene ALB.
[00117] A proteína de fusão s que incluem o indivíduo um domínio de aglutinação de albumina (ABD) podem ligar-se a albumina do sérum (AS), que permite que a proteína de fusão a ser tomadas por células por macropinocitose. Em certos corpos, os ABDs aqui descritos ligam-se a uma faixa de pH de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 7,2. No endossoma inicial, tais proteínas de fusão de ABD ligadas a SA ligam-se a FcRn via SA a um pH ácido (por exemplo, pH 5,5), que por sua vez desvia a proteína de fusão de ABD ligada a SA do compartimento de lisossomo da célula e de volta ao plasma membrana. Na membrana plasmática, o SA dissocia-se do FcRn devido ao pH neutro (por exemplo, pH 7 a 1-7,5) e as proteínas de fusão SA e ABD são liberadas de volta à corrente sanguínea. Como terapêuticas que incluem o indivíduo ABD são capazes de se ligar à albumina em uma gama
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26/85 de pH de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 7,2, tal terapêutica vantajosamente também sofre reciclagem de albumina endossômica dirigida por FcRn e, assim, evita a degradação lisossomal. Por conseguinte, os agentes terapêuticos que incluem tais ABD exibem, de um modo vantajoso, meias-vidas no sérum mais longas do que as correspondentes sem ABDs. Tais terapêuticas são particularmente úteis para o tratamento de cânceres, que são conhecidos por conterem níveis elevados de albumina do sérum.
[00118] Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina se aglutina a albumina em um site que não interfere com SA aglutinação a um receptor Fe neonatal (FcRn). Por “FcRn” ou “Receptor Fe neonatal”, como aqui utilizado, entende-se uma proteína que se aglutina regi Fe do anticorpo IgG e codificada, pelo menos em parte, por um gene FcRn. O FcRn pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas não limitado a humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Como é conhecido na arte, a proteína FcRn funcional compreende duas proteínas de fusão são frequentemente ditas coma cadeia pesada e cadeia leve. A cadeia leve é a beta-2-microglobulina e a cadeia pesada é codificada pelo gene FcRn. Salvo indicação em contrário aqui, FcRn ou uma proteína FcRn refere-se ao complexo da cadeia pesada de FcRn com beta-2-microglobulina.
[00119] Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina descritos ou exemplificados aqui preferencialmente se aglutina especificamente à albumina do sérum (por exemplo, HSA) a um epítopo na molécula de albumina do sérum que não participa na interação da molécula de albumina de sérum com o FcRn. A aglutinação da fração de aglutinação a SA à molécula de albumina do sérum preferivelmente não interfere substancialmente com, inibe, previne ou reduz de outro modo a aglutinação da molécula de albumina do sérum (por exemplo, HSA) com o FcRn. Preferencialmente, o domínio de aglutinação de albumina não compete com o FcRn para aglutinação molécula de albumina sódica. De preferência, o
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27/85 domínio de aglutinação de albumina não inibe esteticamente a aglutinação da albumina do sérum ao FcRn. Preferencialmente, a fração de aglutinação a SA não altera a conformação da molécula de albumina sérica de tal modo que a albumina não pode interagir com o FcRn.
[00120] Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina se aglutina SA (por exemplo, HSA) a um pH de 5,0 ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0. 2.1, 2.2,.2.3,.2.4,.2.5,.2.6, 2.7, 2.8, 2.9 ou 3.0. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina se aglutina SA a uma gama de pH de cerca de pH 5.5- cerca de pH 7. 2. Em algumas modalidades, a fração de aglutinação a SA aglutina-se a SA a um pH de 5,5.
[00121] Em certas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina é um domínio de aglutinação de albumina de sérum humano (HSA). Os domínios de aglutinação à HSA incluem, mas não estão limitados, aos domínios de aglutinação de albumina que podem se ligar a uma molécula de HSA, tais como uma molécula completa de HSA ou um fragmento de uma HSA. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação à HSA também se aglutina à albumina de sérum de camundongo. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação à HSA também se aglutina à albumina de macacocinomolgo. Em certas modalidades, o domínio de aglutinação à HSA não se aglutina à albumina sérica bovina (BSA).
[00122] Os domínios de aglutinação de albumina aqui providos podem incluir uma cadeia pesada variável sozinha ou uma cadeia pesada variável em associação com uma cadeia leve variável. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina inclui uma cadeia pesada variável. Em certas modalidades, a cadeia pesada variável inclui um vHCDRl, vHCDR2, e vHCDR3 (Regiões Determinantes Complementares 1-3 de cadeia pesada variável). Em certas modalidades, o domínio de aglutinação ao antígeno também inclui uma cadeia leve variável. Em certas modalidades, a cadeia leve
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28/85 variável inclui um vLCDRl, vLCDR2 e vlCDR3 (Regiões Determinantes Complementares 1-3 de cadeia leve variável).
[00123] Em algumas modalidades o domínio de aglutinação de albumina inclui uma cadeia pesada variável que inclui o vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina inclui o vhCDRl, vhCDR2, e vhCDR3 de uma cadeia pesada variável de A10m3, como mostrado na Figura 2D. Em certas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina inclui o vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 de A10m3, como mostrado na Figura 2D.
[00124] Em certas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina também inclui uma cadeia leve variável. Em uma modalidade exemplar, o domínio de aglutinação de albumina inclui uma cadeia leve variável que inclui o vlCDRl, vlCDR2, e vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina inclui o vlCDRl, vlCDR2, e vlCDR3 de uma cadeia leve variável de A10m3, tal como mostrado na Figura 2D. Em certas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina inclui o vlCDRl, vlCDR2 e vlCDR3 de A10m3, como mostrado na Figura 2D.
[00125] Em certas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina (por exemplo, domínio de aglutinação à HSA) é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina (por exemplo, domínio de aglutinação à HSA) é uma scFv.
[00126] Em algumas modalidades onde o ABD inclui ambas uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável, a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável são anexadas uma a outra por um ligador (por exemplo, um ligador de scFv). Em certas modalidades, o ligador é anexado à cadeia pesada variável em seu C-terminal e a cadeia leve variável em seu N-terminal. Ligadores adequados são aqui descritos e na Figura 48. Em algumas
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29/85 modalidades, o ligador é um ligador (Gly4Ser)x, onde x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou
8. Em certas modalidades, o ligador é um ligador (Gly4Ser)5.
[00127] Em certas modalidades, o domínio de aglutinação de albumina também inclui uma cadeia pesada variável que inclui o vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 de A10m3 e uma cadeia leve variável que inclui o vlCDRl, vlCDR2 e vlCDR3 de A10m3 (Figura 2D). Em uma modalidade, o domínio de aglutinação de albumina inclui a sequência pesada variável e sequência leve variável do A10m3 ABD representado graficamente na Figura 2D.
C. Variantes de Interleucina-15 [00128] Em outro aspecto, são aqui providas composições que incluem variantes de IL-15 com estabilidade melhorada in vivo e/ou atividade biológica, em comparação à IL-15 de tipo selvagem.
[00129] Como aqui usado, “interleucina 15”, “IL-15” e “IL15” referem-se todas a uma interleucina que se aglutina e sinaliza através de um complexo composto por uma cadeia alfa do receptor específico da IL-15, uma cadeia de receptor beta IL-2/ IL-15 (CD 122) e a cadeia gama comum (gamaC, CD 132) (Números de Acesso Genbank: NM_00000585 e NP_000576 (humano); e NM_001254747 e NP_001241676 (camundongo)).
[00130] A IL-15 mostrou que estimula a proliferação de células T dentro de tumores (ver, por exemplo, Miecnik et al., Sei Transi Med 6 (228):228ra37 (2014). A IL-15 também é capaz de prolongar a sobrevivência de memória efetiva CD8+ de células T e é fundamental para o desenvolvimento de células NK. Acredita-se que a IL-15 pode aumentar a potência de pontos de controle inibidores e outras imunoterapias que aproveitam as células T para atacar as células cancerígenas. Portanto, sem estar ligada por qualquer teoria particular de operação, acredita-se que as IL15s aqui descritas são úteis para o tratamento de cânceres.
[00131] O monômero de IL-15, no entanto, tem uma meia-vida curta de menos de 40 minutos in vivo. Modificações ao monômero de IL-15 podem
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30/85 melhorar sua farmacocinética in vivo no tratamento de cânceres. Estas modificações centraram-se geralmente na melhoria da trans-apresentação da IL-15 com a subunidade alfa do receptor IL-15, IL-15Ra. Tais modificações incluem: 1) pré-associação de IL-15 e sua fusão solúvel a-subunidade-Fc de receptor para formar IL-15: complexo IL-15Ra-Fc (ver, por exemplo, Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103:9166-71 (2006)); 2) expressão da proteína IL-15-sIL-15Ra-sushi hiperagonista (ver, por exemplo, Bessard et al., Molecular cancer therapeutics 8: 2736-45 (2009)); e 3) préassociação de IL-15N72D mutante de IL-15 humana com o complexo de fusão de IL-15Ra-Fc sushi-Fc (ver, por exemplo, Zhu et al., Journal of Immunology 183: 3598-6007 (2009)).
[00132] Em algumas modalidades, a IL-15 é uma variante de uma IL15 parental com estabilidade aumentada em comparação à IL-15 de tipo selvagem. Em modalidades particulares, a variante de IL-15 é uma variante de uma IL-15 humana de tipo selvagem. Em uma modalidade exemplar, a variante de IL-15 inclui uma substituição de aminoácidos na posição K86 da IL-15 parental mostrada na Figura 3. Como aqui descrito, ο K86 é um local putativo para a degradação dependente da ubiquitina (ver Exemplo 2) quando preparada usando tipos de células particulares (por exemplo, células T HEK293). Portanto, sem estar ligada a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a remoção do local de ubiquitinação K86 pela substituição de aminoácidos melhora a estabilidade da IL-15 (ver exemplos 2 e 3).
[00133] Em certas modalidades, a IL-15 é uma variante de IL-15 com uma substituição de aminoácidos na posição NI 12. A posição do aminoácido NI 12 é um local-chave para a bioatividade da IL-15, uma vez que é crítico para uma interação gama adequada de receptor IL-15/IL-15, particularmente quando a IL-15 é anexada a um ABD. Portanto, sem ser ligada a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que mutações na posição NI 12 podem melhorar uma ou mais funções de IL-15, incluindo, mas não limitadas
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31/85 a, promover a proliferação de células T em ambientes tumorais, aumentando a sobrevivência de CD8+ de células T e promovendo o desenvolvimento de células NK.
[00134] Substituições de aminoácidos particulares que podem melhorar a estabilidade da IL-15 in vivo e/ou a atividade biológica incluem, mas não estão limitadas a: K86A, K86R, N112A, N112S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/N112A/N79A, K86R/N112A/N79A, K86A/N112A/N79D, K86R/ N112A/N79D, K86A/N112A/N79Q, K86R/N112A/N79Q, K86A/N112A/ N71D, K86R/N112A/N71D, K86A/N112A/N71Q, K86R/N112A/N71Q, K86A/N112A/N71D/N79A, K86A/N112A/N71D/N79D, K86A/N112A/ N71Q/N79A, K86A/N112A/N71Q/N79D, K86R/N112A/N71D/N79A,
K86R/N112A/N71D/N79D, K86R/N112A/N71D/N79Q, K86R/N112A/ N71Q/N79A, K86R/N112A/N71Q/N79D e K86R/N112A/N71Q/N79Q. As variantes exemplificativas IL-15 que incluem uma ou mais dessas substituições de aminoácidos estão representadas na Figura 3. Em uma modalidade exemplar, a variante de IL-15 inclui as substituições de aminoácidos K86A e NI 12A.
[00135] Em uma modalidade, a IL-15 aqui descrita (de tipo selvagem e variantes de IL-15) é anexada à IL-15R alfa. Tal IL-15, apresentada em trans com o seu receptor, mostrou ter uma meia-vida prolongada e potência mais alta em comparação à IL-15 nativa sozinha. Ver, por exemplo, Wu, J Mol Genet Medi, 85 (2013).
D. IL-12 [00136] Em outro aspecto, são aqui providas composições que incluem IL-12. Como aqui usado, “interleucina 12”, “IL-12” e “IL12” referem-se todas a uma interleucina que é uma citocina heterodimérica codificada pelos genes IL-12A e IL-12B (números de acesso Genbank: NM_000882 (IL-12A) e NM_002187 (IL-12B)). A IL-12 é composta por um feixe de quatro hélices
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32/85 alfa e está envolvida na diferenciação de células T nativas em células TH1. A IL-12 aglutina-se ao receptor de IL-12, que é um receptor heterodimérico formado por IL-12R-pi e IL-12R-32. A IL-12 é conhecida como um fator estimulante de células T que pode estimular o crescimento e a função das células T. Em particular, a IL-12 pode estimular a produção de interferon gama (IFN-γ) e fator alfa de necrose tumoral (TNF-α) a partir de células T e de células assassinas naturais (NK) e reduzir a supressão mediada por IL-4 de IFN-γ. A IL-12 pode adicionalmente mediar a intensificação da atividade citotóxica de células NK e de linfócitos T citotóxicos CD8+. Além do mais, a IL-12 também pode ter atividade antiangiogênica ao aumentar a produção de interferon gama, que, por sua vez, aumenta a produção da proteína 10 induzível por quimiocina (IP-10 ou CXCL10). A IP-10 então medeia este efeito antiangiogênico. Sem estar ligada a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a IL-12 através de sua capacidade de induzir respostas imunes e sua atividade antiangiogênica possa ser usada para tratar cânceres.
[00137] Em algumas modalidades, a IL-12 é uma IL-12 de camundongo. Em outras modalidades, a IL-12 é uma IL-12 humana.
[00138] Em certas modalidades, a IL-12 é um polipeptídeo de cadeia única de IL-12 que compreende uma subunidade p35 de IL-12 anexada a uma subunidade p40 de IL-12. Tais polipeptídeos de cadeia única de IL-12 retêm vantajosamente uma ou mais das atividades biológicas da IL-12 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia única de IL-12 aqui descrito está de acordo com a fórmula, de N-terminal a C-terminal, (p40)-(L)-(p35), em que “p40” é uma subunidade p40 de IL-12, “p35” é subunidade p35 de IL-12 e L é um ligador. Em outras modalidades, a cadeia única de IL-12 está de acordo com a fórmula de N-terminal a C-terminal, (p35)-(L)-(p40). Qualquer ligador adequado pode ser usado no polipeptídeo de cadeia única de IL-12, incluindo aqueles aqui descritos e representados
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33/85 graficamente na Figura 49C. Os ligadores adequados podem incluir, por exemplo, ligadores com a sequência de aminoácidos (GGGGS)X em que x é um número inteiro de 1 a 10. Outros ligadores adequados incluem, por exemplo, a sequência de aminoácidos GGGGGGS. Ligadores de cadeia única de IL-12 exemplificativos que podem ser usados com os polipeptídeos de cadeia única de IL-12 indivíduos também são descritos em Lieschke et al., Nature Biotechnology 15: 35-40 (1997), que é aqui incorporado em sua totalidade por referência e particularmente para seu ensinamento de ligadores polipeptídicos de IL-12.
[00139] Em uma modalidade exemplar, o polipeptídeo de IL-12 de cadeia única é um polipeptídeo de IL-12 humana cadeia única (isto é, que inclui um p35 e p40 de IL-12 subunidade humana). Em certas modalidades, o polipeptídeo de IL-12 de cadeia única é um polipeptídeo de IL-12 de cadeia única de camundongo. As IL-12 exemplificativas de cadeia única humana e de camundongo estão representadas graficamente na Figura 20 (mostrado como peptídeo de fusão com ABD) e 49C.
E. Proteínas de fusão de ABD [00140] Em um aspecto, são providas aqui composições de ABD que incluem um domínio de aglutinação de albumina anexado a um ou mais parceiros de fusão (por exemplo, um primeiro parceiro de fusão, um segundo parceiro de fusão, etc.) através de um ligador. Como aqui discutido, as proteínas de fusão de ABD de indivíduos são capazes de reduzir a reciclagem endossomal mediada de FcRn e, assim, exibem vantajosamente uma meiavida prolongada em comparação com correspondentes que não incluem tais ABDs.
[00141] Os ABDs úteis para essas proteínas de fusão de ABD incluem, mas não estão limitados a, aqueles aqui descritos. As sequências de aminoácidos de tais ABDs, incluindo vhCDRl-3, vlCDRl-3, sequências de cadeia pesada variável e de cadeia leve variáveis, são descritas, por exemplo,
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34/85 na Figura 2. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui o vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis ABD na Figura 2, e uma cadeia leve variável que inclui o vlCDRl, vlCDR2 e vCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis ABD na Figura 2. Em certas modalidades, o ABD inclui uma cadeia pesada variável tendo uma vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de um ABD descrito na Figura 2 e uma cadeia leve variável tendo uma vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de um ABD descrito na Figura 2. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de um ABD descrito na Figura 2.
[00142] Em uma modalidade exemplar, a proteína de fusão de ABD inclui uma cadeia pesada variável que inclui o vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 da cadeia pesada variável de A10m3, e uma cadeia leve variável que inclui o vlCDRl, vlCDR2 e vCDR3 da cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D). Em certas modalidades, o ABD inclui uma cadeia pesada variável tendo um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de A10m3 e uma cadeia leve variável tendo um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de A10m3 (Figura 2D). Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D).
[00143] As proteínas de fusão de ABD aqui descritas incluem um parceiro de fusão. Em algumas modalidades, o parceiro de fusão inclui dois parceiros de fusão (um primeiro parceiro de fusão (FP1) e um segundo parceiro de fusão (FP2). Em modalidades que incluem dois parceiros de fusão, os parceiros de fusão podem ser anexados ao ABD em diversas orientações. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD de acordo com a fórmula, do terminal N até o terminal C: FP1-ABD-FP2, FP1-PF2ABD ou ABD-FP1-FP2, em que FP1 um primeiro parceiro de fusão e FP2 um segundo parceiro de fusão.
[00144] Qualquer parceiro de fusão adequado em que a extensão de
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35/85 meia-vida do parceiro de fusão é desejada, pode ser incluído nas proteínas de fusão ABD de indivíduos. Os parceiros de fusão podem incluir, por exemplo, citocinas (por exemplo, interferons e interleucinas), fatores de crescimento, polipeptídeos, proteínas e hormônios (por exemplo, hormônios do crescimento, hormônios da paratireoide).
[00145] Em certas modalidades, o parceiro de fusão é uma fração de aglutinação com base em anticorpos que inclui uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável. Tais frações de aglutinação podem aglutinar-se a qualquer alvo de interesse incluindo, por exemplo, alvos específicos de tumor ou citocinas. Em uma modalidade exemplar, o parceiro de fusão é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Os parceiros de fusão com base em anticorpos também incluem, mas não estão limitados a, ds-scFv, anticorpos de domínio único (sdAb), diacorpos, dsFvs, ds-scFvs, Fabs e anticorpos de comprimento total. Os parceiros de fusão com base em anticorpos também incluem anticorpos e fragmentos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos).
[00146] As proteínas de fusão de ABD aqui descritas utilizam ligadores entre os componentes (ABD e parceiros de fusão) e dentro de componentes. Por exemplo, os parceiros de fusão de scFv utilizam ligadores de peptídeo padrão, geralmente com base em glicina e serina, para fixar as cadeias pesada e leve variantes para formar o scFv. Além disso, os ligadores de peptídeo padrão são utilizados para ABDs anexados a parceiros de fusão (por exemplo, parceiros de fusão de citocina). Além disso, os ligadores são utilizados para fixar componentes de frações particulares, por exemplo, a subunidade p35 e p40 de IL-12 e IL-15 com IL-15Ra. Em algumas modalidades, o ligador é um ligador (Gly4Ser)x, onde x é 1, 2, 3, 4, 6, 7 ou 8. Em modalidades particulares, o ABD está conectado a parceiros de fusão por ligadores (Gly4Ser)5.
[00147] Como mostrado aqui, há um número de ligadores adequados
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36/85 que podem ser utilizados, incluindo aglutinações de peptídeo tradicionais, geradas por técnicas recombinantes. O peptídeo ligador pode incluir predominantemente os seguintes resíduos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala ou Thr. O peptídeo ligador deve ter um comprimento que seja adequado para ligar duas moléculas de tal forma que elas assumam a conformação correta em relação uma à outra, de modo que mantenham a atividade desejada. Em uma modalidade, o ligador tem cerca de 1 a 50 aminoácidos de comprimento, de um modo preferido, cerca de 1 a 30 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, podem ser utilizados ligadores de 1 a 20 aminoácidos de comprimento, com cerca de 5 a cerca de 10 aminoácidos encontrando uso em algumas modalidades. Ligadores úteis incluem polímeros de glicina-serina, incluindo por exemplo (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n e (GGGS)n, onde n é um inteiro de pelo menos um (e geralmente de 3 a 4), polímeros de glicinaalanina, polímeros de alanina-serina e outros ligadores flexíveis. Altemativamente, uma variedade de polímeros não proteicos, incluindo mas não limitados a polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol, podem encontrar uso como ligadores, isto é, pode encontrar usar como ligadores.
[00148] Outras sequências ligadores podem incluir qualquer sequência de qualquer comprimento de domínio CL/CH1, mas nem todos os resíduos de domínio CL/CH1; por exemplo, os primeiros 5-12 resíduos de aminoácidos dos domínios CL/CH1. Os ligadores podem ser derivados de cadeia leve de imunoglobulina, por exemplo, Ck ou CX. Os ligadores podem ser derivados a partir de cadeias pesadas de imunoglobulina de qualquer isotipo, incluindo, por exemplo Cyl, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, Cô, Ce, e Cp. As sequências de ligadores também podem ser derivadas de outras proteínas, tais como proteínas semelhantes a Ig (por exemplo, TCR, FcR, KIR), sequências derivadas da região de articulação e outras sequências naturais de outras proteínas.
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37/85 [00149] Frequentemente, o ligador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como aqui utilizado, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular”, no contexto de um ligador, significa que não mais do que cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, ou não mais do que cerca de 1% dos ligadores, em uma amostra de composto conjugado anticorpo-droga, são clivados quando o composto conjugado anticorpo-droga se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma).
[00150] Se um ligador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, por meio de incubação com plasma do composto conjugado anticorpo-droga por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16, ou 24 horas) e depois quantificar a quantidade de droga livre presente no plasma.
[00151] Em outras, modalidades não mutuamente excludentes, o ligador promove a intemalização celular. Em certas modalidades, o ligador promove a intemalização celular quando conjugado com o agente terapêutico (isto é, em meio à fração do agente de ligador-terapêutico do composto conjugado anticorpo-droga como aqui descrito). Ainda em outras modalidades, o ligador promove a intemalização celular quando conjugado com o composto de auristatina e com as proteínas de fusão de ABD da invenção.
[00152] Uma variedade de ligadores exemplificativos que podem ser usados com as presentes composições e métodos são descritos em WO 2004010957, Publicação U.S. n° 2006/0074008, Publicação U.S. n° 20050238649, e Publicação U.S. n° 2006/0024317 (cada qual é incorporada por referência aqui na sua totalidade e para todos os efeitos).
[00153] Os ligadores exemplificativos que podem ser utilizados com os ABDs de indivíduos como ligadores de domínio, ligadores de scFv, bem como anexar componentes de parceiros de fusão particulares são ainda representados graficamente na Figura 48.
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38/85 [00154] Em algumas modalidades, o ligador é um “ligador de domínio”, usado para ligar quaisquer dois domínios como delineado aqui em conjunto (por exemplo, um parceiro de fusão de citocina (por exemplo, uma interleucina) e um ABD). Embora qualquer ligador adequado possa ser utilizado, muitas modalidades utilizam um polímero de glicina-serina, incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n e (GGGS)n, em que n um número inteiro de pelo menos um (e geralmente de 3 a 4 a 5) bem como qualquer sequência de peptídeo que permita a anexação recombinante dos dois domínios com comprimento e flexibilidade suficientes para permitir que cada domínio retenha a sua função biológica.
[00155] Em algumas modalidades, o parceiro de fusão é um scFv que inclui uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável. Em tais modalidades, a cadeia pesada variável de ABD é anexada à cadeia leve variável com um ligador de scFv.
[00156] Proteínas de fusão de ABD exemplificativas são discutidas abaixo.
1. Proteínas de fusão de citocina-ABD [00157] Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui um parceiro de fusão de citocina, ou seja, proteínas de fusão de domínio de aglutinação de citocina-albumina (citocina-ABD) (Figura 1). Em algumas modalidades, a proteína de fusão de citocina-ABD inclui uma IL-2, IL-7, IL12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, GM-CSF ou IFN-α. As proteínas de fusão de citocina-ABD de indivíduos para efeitos imunomoduladores em um indivíduo onde tais efeitos imunomoduladores são necessários (por exemplo, tratamento de um câncer ou uma doença autoimune). Além disso, a citocina-ABDs de indivíduos exibem uma meia-vida mais longa e melhoradas propriedades farmacocinéticas em comparação com interleucina terapêutica sozinha.
[00158] Qualquer ABD pode ser utilizado com as proteínas de fusão de citocina-ABD de indivíduos aqui descritas. Em algumas modalidades, o ABD
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39/85 inclui uma cadeia pesada variável de ABD. Em certas modalidades, o ABD inclui uma cadeia leve variável ABD. Em modalidades exemplares, o ABD é um scFv que inclui uma cadeia pesada variável anexada a um cadeia leve variável por meio de um ligador (por exemplo, qualquer um dos ligadores aqui descritos e na Figura 48).
[00159] Em certas modalidades, a cadeia pesada variável inclui o vhCDRl-3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis de ABD aqui descritas, incluindo aquelas cadeias pesadas variáveis de ABD representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia pesada variável de ABD incluindo o vhCDRl-3 da cadeia pesada variável A10m3 (Figura 2D). Em algumas modalidades, a cadeia pesada variável de ABD inclui o vhCDRl-3 de A10m3 como representado graficamente na Figura 2D. Nas modalidades exemplares, a cadeia pesada variável de ABD tem a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável de A10m3.
[00160] Em certas modalidades, o ABD inclui uma cadeia leve variável ABD. Em algumas modalidades, a cadeia leve variável de ABD inclui o vlCDRl-3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis de ABD aqui descritas, incluindo as cadeias leves variáveis de ABD representadas graficamente na Figura 2. Em certas modalidades, a cadeia leve variável ABD inclui o vlCDRl-3 da cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D). Em algumas modalidades, a cadeia leve variável de ABD inclui o vlCDRl-3 de A10m3 como representado graficamente na Figura 2D. Em modalidades exemplares, a cadeia leve variável de ABD tem a sequência da cadeia leve variável de A10m3.
[00161] As sequências de aminoácidos das citocinas exemplificativas que podem ser utilizadas nas fusões de citocina-ABD de indivíduos, bem como proteínas de fusões de citocina-ABD exemplificativas, onde o ABD é A10m3 estão representadas na Figura 49A-G.
[00162] Em algumas modalidades, a IL-ABD está de acordo com a
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40/85 fórmula, de terminal N até terminal C, citocina-L-ABD ou ABD-L- citocina, onde L é um ligador que anexa a citocina ao ABD (por exemplo, um ligador de peptídeo). Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma cadeia pesada variável e a citocina é anexada ao terminal N da cadeia pesada variável de ABD. Em algumas modalidades, a citocina é anexada ao terminal C da cadeia pesada variável de ABD. Em uma modalidade exemplar, a interleucina-ABD inclui um ABD que também inclui uma cadeia leve variável (por exemplo, um scFV de ABD). Em algumas modalidades, a citocina é anexada ao terminal C da cadeia leve variável. Em certas modalidades, o terminal N da citocina é anexado ao ABD. Em outras modalidades, o terminal C da citocina é anexado ao ABD.
[00163] Em certas modalidades, a citocina é citocina selecionada a partir de IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-27, GM-CSF e IFN-α. As moléculas de citocina incluem, por exemplo, citocinas de comprimento total e fragmentos de citocinas, por exemplo, uma parte que é importante para a função específica da citocina (por exemplo, uma parte de interleucina que se aglutina ao seu receptor).
[00164] Em algumas modalidades, a citocina-ABD inclui uma molécula de IL-2 ou um fragmento da mesma. Como aqui utilizado, “interleucina 2”, “IL-2” e “IL2” se referem a um membro da citocina com quatro feixes de hélice alfa e sinais através do receptor de IL-2 (números de acesso ao GenBank: NM_000586 e NP_000577 (humano) e NM_008366 e NP_032392 (camundongo)). A IL-2 desempenha um papel importante no funcionamento, tolerância e imunidade do sistema imunológico, principalmente através de seus efeitos diretos sobre as células T. No timo, a IL-2 previne doenças autoimunes promovendo a diferenciação de certas células T imaturas em células T reguladoras, que exterminam outras células T que são preparadas para atacar células saudáveis normais no corpo. A IL-2 tem sido utilizada para o tratamento de cânceres (melanoma maligno, câncer
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41/85 das células renais) em grandes doses intermitentes e tem sido amplamente utilizada em doses contínuas. IL-2-ABDs exemplificativas são mostradas na Figura 49 A.
[00165] Em algumas modalidades, a proteína de fusão de citocinaABD inclui uma molécula de IL-7 ou de um fragmento da mesma. Como usado aqui, “interleucina 7”, “IL-7”, e “IL7” (números de acesso ao GenBank: NM_000880 e NP_000871 (humano); e NM_008371 e NP.032397 (camundongo)) se referem a um membro de uma citocina que é um fator de crescimento hematopoiético secretado pelas células do estroma na medula óssea e no timo e se aglutina ao receptor de IL-7. A interleucina-7 (IL-7) é uma citocina derivada de células não hematopoiéticas com um papel central no sistema imune adaptativo. Isso promove o desenvolvimento de linfócitos no timo, mantendo a sobrevivência da homeostase de células T virgens e de memória na periferia. Além disso, é importante para a organogênese dos linfonodos (LN) e para a manutenção de células T ativadas recrutadas nos órgãos linfoides secundários (SLOs). A IL-7 é uma solução ideal para a reconstituição imune de indivíduos com câncer imunossuprimidos, promovendo a expansão das células T periféricas. Em modelos animais, a IL7 provou prolongar a sobrevivência de hospedeiros portadores de tumor. IL-7ABDs exemplificativas são mostradas na Figura 49 B.
[00166] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma molécula de IL-12 ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, a IL-12 é uma cadeia única de IL-12, como aqui descrito e como representado graficamente na Figuras 20 (mostrado como um peptídeo de fusão com ABD) e49C.
[00167] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma molécula de IL-15 ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, a IL-15ABD inclui uma variante de IL-15 como aqui descrito e nas Figuras 3 e 4. Em algumas modalidades, a IL-15 é uma IL-15 do tipo selvagem, como mostrado
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42/85 na Figura 3 (por exemplo, “IL-15 parental”). Em certas modalidades, a IL-15 de tipo selvagem é anexada a um receptor alfa de IL-15 (IL-15Ra).
[00168] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma molécula de IL-21 ou um fragmento da mesma. Como utilizado aqui, “interleucina 21” “IL-21” e “IL21” (números de acesso ao GenBank: NM_001207006 e NP_001193935 (humano); e NM_0001291041 e NP_001277970 (camundongo)) todas se referem a um membro de uma citocina que se aglutina ao receptor de IL-21 e tem efeitos reguladores potentes sobre as células do sistema imunológico, incluindo células exterminadoras naturais (NK) e células citotóxicas e se aglutina ao receptor de IL-21 que pode destruir células infectadas com vírus ou cancerosas. Portanto, sem estar vinculado a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a citocina-ABD de indivíduo tendo uma IL-21 é útil para o tratamento de vários cânceres. IL-21 ABDs exemplificativas são mostradas na Figura 49 E.
[00169] Outras citocinas úteis que podem ser incluídas em citocinaABDs de indivíduo incluem, não estando limitadas a IL-27, IFN-α e GMCSF. Em certas modalidades, o polipeptídeo de interleucina-ABD também inclui uma molécula de interferon-alfa, interferon-beta ou GM-CSF. Tais moléculas são úteis para entrega em tumores e redução de toxicidade.
[00170] Em algumas modalidades, a citocina-ABD inclui duas citocinas anexadas a um ABD selecionado a partir de: IL-2 e IL-12; IL-7 e IL15, IL-15 e IL-12; IL-18 e GMC SF; IL-21 e IL-15; GMC - SF e IL-12; GMC - SF e IL-21; e IFN-α e IL-15. A Figura 1 representa várias orientações exemplificativas em que duas citocinas podem ser anexadas ao ABD. Qualquer ABD pode ser utilizado em tal proteína de fusão, incluindo aqueles que incluem qualquer um dos domínios pesados variáveis de ABD e domínios leves variáveis mostrados na Figura 2. Em algumas modalidades, o ABD é A10m3.
[00171] Qualquer ligador pode ser usado para anexar cada citocina ao
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ABD, incluindo qualquer ligador representado graficamente na Figura 48. Uma sequência de Iigador-A10m3-ligador da cadeia principal exemplificativa para utilização nessas proteínas de fusão é descrita na Figura 50. Ligadores exemplificativos que podem ser usados incluem ligadores (GGGGS)X em que X é 1-10. Em certas modalidades, é utilizado um (GGGGS)s para anexar a citocina ao ABD.
[00172] Em algumas modalidades, a citocina-ABD está de acordo com uma fórmula selecionada a partir do seguinte: (do terminal N até o terminal C): Citocina 1 -Ll-ABD-L 2- Citocina 2; Citocina 1- Ll-Citocina 2- L2ABD; e ABD-L1-Citocina 1 -L2-Citocina 2, onde LI e L2 são ligadores que conectam as citocinas e componentes de ABD e a Citocina 1 e a Citocina 2 são selecionadas dos seguintes pares de citocinas: IL-2 e IL-2 12; IL-7 e IL15, IL-15 e IL-12; IL-18 e GM-CSF; IL-21 e IL-15; GM-CSF e IL-12; GMCSF e IL-21; e IFN-α e IL-15. Em algumas modalidades, o ABD é A10m3 (Figura 2D).
[00173] Em tais citocina-ABDs, ambas citocinas podem ser “Citocina 1” e a outra citocina pode ser “Citocina 2”. Por exemplo, em uma modalidade do par de citocina IL-2 e IL-12, IL-2 é “Citocina 1” e a IL-12 é “Citocina 2”. Em outra modalidade do par de citocinas IL-2 e IL-12, a IL-12 é “Citocina 1” e IL-2 é “Citocina 2”.
[00174] Em algumas modalidades, a citocina-ABD inclui duas das mesmas interleucinas. Em outras modalidades, o polipeptídeo de interleucinaABD inclui duas interleucinas diferentes (por exemplo, uma IL-12 e uma IL15), como descrito acima. As proteínas de fusão de ABD que incluem combinações particulares de citocinas são descritas na Figura 51. Exemplos de proteínas de fusão de citocina-ABD que, em conjunto com uma combinação de diferentes citocinas, são discutidas em detalhe adiante.
a. IL-12 e IL-15 [00175] Em certas modalidades, a proteína de fusão de citocina-ABD
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44/85 inclui uma IL-12 e uma IL-15. Sequências de IL-12 e IL-15 exemplificativas que podem ser incluídas em tais modalidades são representadas nas Figuras 3 e 49C. Acredita-se que as citocinas-ABDs que incluem um parceiro de fusão IL-12 e IL-15 exibem os efeitos antitumorais de ambas as interleucinas. Mostrou-se que a combinação de IL-12 e IL-15 induzia uma atividade antitumoral intensificada em comparação com qualquer das citocinas sozinhas. Esta atividade antitumoral intensificada foi relacionada com a suprarregulação recíproca dos receptores de cada citocina através da indução sinérgica de IFN-γ. Mostrou-se ainda que IL-12 em combinação com IL-15 promove atividade antitumoral em macrófagos peritoneais através da síntese de óxido nítrico. Sem estar vinculado a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que os polipeptídeos tendo tanto um parceiro de fusão de IL-12 como de IL-15 são capazes de ativar rapidamente a resposta inata (IL-12) bem como estimular potencialmente a proliferação de células T e manter as células T CD8+ de memória (IL-15). Estudos em animais mostram que a administração sequencial de células que expressam IL-12 e IL-15 também curou camundongos em um cenário terapêutico de tumor estabelecido. A depleção de células CD8+ eliminou a proteção dessa terapia, sugerindo expansão clonal do CTL do tumor. Consultar, por exemplo, Croce et al., Clin Cancer Res 11 (2 Pt 1): 735-742 (2005).
[00176] Em algumas modalidades, a citocina-ABD está de acordo com a fórmula, do terminal N até o terminal C:
a) (IL-12)-L1-(ABD)-L2-(IL-15); ou
b) (IL-15)-L1-(ABD)-L2-(IL-12).
[00177] Qualquer ABD adequado pode ser utilizado, incluindo, por exemplo, um ABD tendo uma cadeia pesada variável que inclui o ABD vhCDRl-3 de qualquer das cadeias pesadas variáveis de ABD listados na Figura 2. Em uma modalidade exemplar, a cadeia pesada variável inclui o vhCDRl-3 de uma cadeia pesada variável de A10m3 (Figura 2D). Em certas
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45/85 modalidades, o ABD inclui uma cadeia leve variável de ABD que inclui o vlCDRl-3 de uma cadeia leve variável de A10m3. Em uma modalidade exemplar, o ABD é um scFv de A10m3.
[00178] Qualquer IL-12 e IL-15 adequada pode ser usada. Em algumas modalidades, a IL-15 é uma variante de IL-15, como aqui descrito (consultar, por exemplo, Figura 3). A IL-15 pode também ser uma IL-15 do tipo selvagem ou uma IL-15 do tipo selvagem que está ligada a um IL-15Ra. Em uma modalidade, a IL-15 é uma IL-15 variante selecionada a partir daqueles representados graficamente na Figura 3. Em uma modalidade exemplar, a IL15 é uma IL-15 variante tendo substituições de aminoácidos K86R e NI 12A.
[00179] As IL-12 que podem ser usadas incluem aquelas IL-12s que têm um domínio p35 e p40. Em algumas modalidades, a IL-12 é uma única cadeia de IL-12 tal como aqui descrito (consultar, por exemplo, a Figura 20, como mostrado como parte de um polipeptídeo de fusão de IL-12-ABD e a Figura 49C).
[00180] Em tais modalidades, LI e L2 são um primeiro e segundo ligador, respectivamente, LI e L2 podem ser qualquer ligador adequado para anexar os domínios IL-15 e IL-12 ao domínio de ABD (por exemplo, os ligadores listados na Figura 48). Ligadores exemplificativos que podem ser usados incluem ligadores (GGGGS)X em que X é 1-10. Em certas modalidades, LI e L2 são cada um (GGGGS)s.
[00181] As sequências de polipeptídeos de ABD exemplificativos que incluem uma IL-12 e uma IL-15 são mostradas nas Figuras 34 e 36.
b. IL-2 e IL-12 [00182] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma IL-2 e uma IL-12.
[00183] As IL-2 e a IL-12 se regulam reciprocamente e utilizam vias de sinalização separadas para induzir efeitos biológicos diferentes mas complementares. Tanto a IL-2 como a IL-12 podem estimular células T
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46/85 mitogênicas ou ativadas por CD3 a proliferar e produzir IFN-γ. Além disso, os estudos mostram que a entrega de ambos os genes IL-2 e IL-12 em camundongos portadores de melanoma B16 provocou uma redução significativa da carga de tumor e melhoria na sobrevivência global (consultar, por exemplo, Dietrich et al., Arch Surg 387 (34): 177-182 (2002)). Assim, acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD tendo uma IL-2 e uma IL- são úteis para a redução de tumores e tratamento de cânceres.
c. IL-2 e IL-15 [00184] Em certas modalidades, a proteína de fusão de citocina-ABD inclui uma IL-2 e uma IL-15. Tanto a IL-2 como a IL-15 são capazes de estimular a proliferação de células NK e células T ativadas, bem como suportar a expansão de células T efetoras. Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD que incluem tanto IL-2 como IL-15 são úteis para a redução de doenças e tratamento de cânceres.
d. IL-7 e IL-12 [00185] Em certas modalidades, a proteína de fusão de citocina-ABD inclui um parceiro de fusão IL-7 e IL-12.
[00186] A interleucina-7 (IL-7) é uma citocina derivada de células não hematopoiéticas com um papel central no sistema imunológico adaptativo. Promove o desenvolvimento de linfócitos no timo, mantendo a sobrevivência da homeostase de células T virgens e de memória na periferia. Além disso, é importante para a organogênese dos linfonodos (LN) e para a manutenção de células T ativadas recrutadas nos órgãos linfoides secundários (SLOs). A capacidade imunológica de indivíduos com câncer é suprimida e distinguida por menor contagem de células T, menor infiltração de células imunes efetoras, maiores níveis de células efetoras exauridas e níveis mais altos de citocinas imunossupressoras, tal como o fator de crescimento β transformante (TGF-β). A IL-7 é uma solução ideal para a reconstituição imune de indivíduos com câncer imunossuprimidos, promovendo a expansão das
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47/85 células T periféricas. Em modelos animais, a IL-7 demonstrou prolongar a sobrevivência de hospedeiros portadores de tumor. Consultar Gao et al., Int. J. Mol. Sei. 16: 10267-10280 (2015).
[00187] A IL-12 atua diretamente nas células T CD8+ para intensificar sua proliferação mediada por IL-7. Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD que, em conjunto com um domínio de aglutinação de IL-7 e IL12, promovem vantajosamente a proliferação de células T CD8+ e intensificam a atividade citolítica contra tumores.
e. IL-7 e IL-15 [00188] Em certas modalidades, a proteína de fusão de citocina-ABD inclui uma IL-7 e uma IL-15. Como mencionado acima, as interleucinas 7 e 15 são consideradas poderosas citocinas pró-inflamatórias que têm a capacidade de reduzir a gênese do tumor. Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina ABD que incluem tanto IL-7 como IL-15 são úteis para a redução de tumores e tratamento de cânceres.
f. IL-12 eIL-21 [00189] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma IL-12 e uma IL-21.
[00190] Como mencionado acima, a IL-12 é capaz de estimular a proliferação de células NK e células T ativadas e suportar a expansão de células T efetoras. A IL-21 é uma reguladora da função das células T e NK que junta o sistema imune inato e adaptativo. A IL-21 promove a maturação de células NK a partir de progenitores da medula óssea, ativa células NK periféricas humanas, promove a expansão e maturação de NK e melhora as funções efetoras mediadas por células T CD8+.
[00191] Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD que incluem tanto uma IL-12 e IL-21 são úteis para a redução de tumores e tratamento de cânceres.
g. IL-12 eIL-18
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48/85 [00192] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui uma IL-12 e uma IL-18.
[00193] A IL-18 é conhecida por induzir a produção de IFN-γ, promover o desenvolvimento de células Thl e a ativação de NK. A IL-12 é conhecida por induzir a suprarregulação do receptor de IL-18 em um modo de IFN-y-dependente. A administração de células de carcinoma mamário de murino de SCK coexpressando IL-18 e IL-12 a camundongos reduziu a carga tumoral e inibiu a angiogênese (consultar, por exemplo, Coughlin et al., J Clin Invest 101 (6): 1441-1452 (1998)). A IL-18 em combinação com a IL-12 a camundongos portadores de tumor sinergicamente induziu um nível de soro prolongado de IFN-γ, enquanto os camundongos portadores de tumor tratados com a IL-18 ou IL-12 apenas induziu soro mínimo IFN-γ que foi rapidamente atenuado(Consultar, por exemplo, Subleski et al., Cancer Res 66 (22): 11 005-11012 (2006)). IL-18-ABDs exemplificativas são mostradas na Figura 37.
[00194] Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD que incluem tanto um parceiro de fusão IL-12 quanto IL-18 são úteis para a redução de tumores e tratamento de cânceres.
h. GM-CSFe IL-12 [00195] Em certas modalidades, a citocina-ABD inclui um GM-CSF e uma IL-18. O GM-CSF regula a diferenciação e proliferação de células progenitoras hematopoiéticas. O GM-CSF também intensifica a capacidade da APC de processar e apresentar antígeno, o que, por sua vez, leva à ativação de células T citotóxicas, ao aumento da produção de IFN-γ e, por fim, à regressão tumoral. Tanto o GM-CSF como o IL-12 são capazes de elicitar respostas antitumorais significativas em vários modelos pré-clínicos de tumores, incluindo um modelo de tumor do fígado e um modelo de tumor do pulmão. (Consulta, por exemplo, Kilinc et al., J Immunol 177 (10): 6962-6973 (2006)).
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49/85 [00196] Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD que incluem tanto um parceiro de fusão IL-12 quanto GM-CSF são úteis para a redução de tumores e o tratamento de cânceres.
1. IFN alfa e IL-12 [00197] A natureza cooperativa dessas duas citocinas se estende além de meros efeitos biológicos similares. Por exemplo, a IL-12, que é bem conhecida por induzir a produção de IFN-γ, pode levar à produção de fatores solúveis adicionais que intensificam a sinalização de IFN-α. Sabe-se que os interferons, incluindo o interferon alfa, induzem a apoptose em células malignas. Consultar, por exemplo, Thyrell, L. et al., Oncogene 21, 1251-1262 (2002).
[00198] Acredita-se que as proteínas de fusão de citocina-ABD que incluem tanto um IFN alfa e IL-12 são úteis para a redução de tumores e tratamento de cânceres.
[00199] Combinações de citocina-citocina adicionais que podem ser incluídas nas proteínas de fusão de citocina-ABD de indivíduo estão representadas na Figura 51 A.
2. Fração de aglutinação de Proteínas de Fusão de ABD [00200] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão de ABD incluem um parceiro de fusão de fração de aglutinação (por exemplo, um scFv), ou seja, uma proteína de fusão BM-ABD. Em algumas modalidades, o BM-ABD inclui uma fração de aglutinação. Em certas modalidades, o BMABD inclui duas frações de aglutinação (por exemplo, scFvs). Em outras modalidades, o BM-ABD inclui uma citocina e uma fração de aglutinação (Figura IB). A Figura 1 representa várias orientações exemplificativas em que a fração de aglutinação ou a fração de aglutinação de citocina/combinações de fração de aglutinação-fração de aglutinação podem ser anexadas ao ABD.
[00201] A frações de aglutinação que são úteis para a prática com as frações de aglutinação de BM-ABDs de indivíduo que são com base em
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50/85 anticorpo de domínio pesado variável e domínio leve variável. Em algumas modalidades, a fração de aglutinação inclui um domínio pesado variável e um domínio leve variável. Em algumas modalidades, a fração de aglutinação é um fragmento variável de cadeia única (scFv).
[00202] Qualquer ABD pode ser utilizado em tal proteína de fusão, incluindo aqueles que incluem qualquer um dos domínios pesados variáveis de ABD e domínios leves variáveis mostrados na Figura 2. Em certas modalidades, o ABD inclui os domínios pesados e leves variáveis de A10m3. Em algumas modalidades, o ABD é scFv de A10m3.
[00203] Qualquer ligador pode ser usado para anexar a citocina e/ou de fração de aglutinação de ABD, incluindo qualquer ligador representado graficamente na Figura 48. Em uma modalidade exemplar, o ligador é (GGGGS)5. Uma sequência de Iigador-A10m3-ligador exemplificativa da cadeia principal para utilização nessas proteínas de fusão é representada na Figura 4 8.
[00204] Combinações exemplificativas de duas frações de aglutinação (por exemplo, scFvs) ou uma citocina e uma fração de aglutinação que podem ser tais proteínas de fusão de ABD estão representados graficamente na Figura 51B.
[00205] Em algumas modalidades, o BM-ABD inclui um domínio de aglutinação anti-TGFp (por exemplo, um anticorpo ScFv de anti-TGFP). Sequências de scFv de anti-TGFp exemplificativas estão representadas na Figura 45. Em algumas modalidades, o scFv de anti-TGFp inclui o domínio leve variável e pesado variável de scFv de 4D9 anti-TGFp. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui um scFV de anti-TGFp e uma citocina ou uma fração de aglutinação adicional, em que a citocina ou fração de aglutinação adicional é um segundo scFv de anti-TGFp, IL-15, IL12 ou um domínio de aglutinação de anti-PD-Ll (10D12). Consultar a Figura 51B.
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51/85 [00206] Em algumas modalidades, o BM-ABD inclui um domínio de aglutinação anti-PD-Ll (por exemplo, um scFV de anti-T PD-L1). Em algumas modalidades, o scFV de anti-PD-Ll inclui o domínio pesado variável e leve variável de scFV de 4D9 anti-PD-Ll 10D12. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui um scFv anti-PD-Ll e uma citocina ou fração de aglutinação adicional, em que a citocina ou fração de aglutinação adicional é um segundo scFv de anti-PD-Ll, IL-15, IL-12, ou um domínio de aglutinação anti- ΤΘΕβ (4D9). Consultar a Figura 51B.
a. Frações de aglutinação de TGF-β [00207] Em certas modalidades, o BM-ABD aqui provido inclui uma fração de aglutinação de TGF-β. Como usado aqui, “TGF-β”, “ΤΟΕβ”, “TGFb” e “fator de crescimento transformador beta” se referem a um membro de uma família de citocinas envolvidas na proliferação, diferenciação celular e outras funções na maioria das células e existem em pelo menos três isoformas: ΤΟΕβΐ (Números de acesso ao GenBank: NM_000660 e NP.000651 (humano); e NM_011577 e NP_035707 (camundongo)), ΤΟΕβ2 (Números de Acesso ao GenBank: NM_001135599 e NP_001129071 (humano)) e NM_009367 e NP_33393 (camundongo)) e ΤΟΕ-β3 (número de acesso ao GenBank: NM_003239). Os membros da família ΤΟΕβ têm um peptídeo de sinal terminal N de 20 a 30 aminoácidos que são necessários para secreção de células, uma pró-região e uma região terminal C de 112-113 aminoácidos que se toma a molécula ΤΟΕβ madura seguindo a sua forma de liberação da pró-região por clivagem proteolítica. Em certas modalidades, a proteína ΤΟΕβ madura pode dimerizar para produzir uma molécula ativa de 25kDa com muitos motivos estruturais conservados, incluem nove resíduos de cisteína, oito dos quais formam aglutinações de dissulfeto dentro da molécula de ΤΟΕβ para criar uma estrutura de nó de cisteína. A nona cisteína conservada forma uma aglutinação com a nona cisteína de outro ΤΟΕβ para produzir o dímero.
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52/85 [00208] Sem estar vinculado por qualquer teoria em particular de operação, acredita-se que o BM-ABD de indivíduo que aglutina TGFp pode ser usado para tratar indivíduos com cânceres (por exemplo, um câncer em estágio terminal). Em certas modalidades, o BM-ABD inclui uma fração de aglutinação de ΤΘΕβΙ. Em certas modalidades, o BM-ABD inclui uma fração de aglutinação de ΤΘΕβ2. Em certas modalidades, o BM-ABD inclui uma fração de aglutinação de ΤΘΕβ3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aglutinação multivalente inclui uma fração de aglutinação que pode aglutinar ΤΘΕβΙ, ΤΘΕβ2 e/ou ΤΘΕβ3 ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, aglutinar ΤΘΕβΙ e ΤΘΕβ2; aglutinar ΤΘΕβ2 e ΤΘΕβ3; aglutinar ΤΘΕβΙ e ΤΘΕβ3; ou aglutinar ΤΘΕβΙ, ΤΘΕβ2 e ΤΘΕ-β3). Em algumas modalidades, a fração de aglutinação de ΤΘΕβ aglutina ΤΘΕβΙ, ΤΘΕβ2 e ΤΘΕβ3. Em algumas modalidades, a fração de aglutinação a ΤΘΕβ que inclui o domínio pesado variável e o domínio leve variável de uma fração de aglutinação a ΤΘΕβ na Figura 40. Em uma modalidade, a fração de aglutinação de ΤΘΕβ inclui o domínio pesado variável e o domínio leve variável da fração de aglutinação de ΤΘΕβ de 4D9 (Figura 40B). Em uma modalidade particular, a fração de aglutinação de ΤΘΕβ é o scFv de 4D9. Foi demonstrado que o 4D9 previne a expansão da célula T reguladora de CD4+ FoxP3+, previne a ativação da Smad (por exemplo, a fosforilação de Smad2), bem como previne a transição celular epitelial para mesenquimal e/ou a migração de células cancerígenas.
[00209] Em algumas modalidades, a fração de aglutinação de TGF-β da proteína de fusão de ABD é ainda anexada a uma outra fração de aglutinação ou de citocinas. Em certas modalidades, a outra fração de aglutinação é uma fração de aglutinação a PD-L1 ou outra fração de aglutinação de ΤΘΕβ. Em algumas modalidades, a citocina é IL-15 ou IL-12 (consultar Figura 51B).
b. Frações de aglutinação de PD-L1
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53/85 [00210] Em certas modalidades, o BM-ABD provido aqui inclui uma fração de aglutinação de Extermínio de Célula Programado 1 do Ligante 1 (PD-L1). Como aqui utilizado, “Extermínio de Célula Programado 1 do Ligante 1”, “Extermínio Programado do Ligante 1”, “PDL1” e “PD-L1” (números de acesso ao GenBank: NM_001267706 e NP_001254635 (humano) e NM_021893 e NP_068693 (camundongo)) todos se referem a um membro de uma proteína transmembranar de tipo 1 de 40kDa que se aglutina ao receptor PD1, encontrado em células T ativadas, células B e células mieloides, para modular a ativação ou inibição. A suprarregulação de PD-L1 permite que os cânceres evadam do sistema imunológico. Consultar, por exemplo, Hamanishi et al., Proc Natl Acad Sei USA 104 (9): 3360-5 (2007). Como tal, acredita-se que BM-ABDs de indivíduos, que incluem uma fração de aglutinação de PD-L1 pode ser útil no tratamento de cânceres.
[00211] Em algumas modalidades, o PD-L1 Em uma modalidade, a fração de aglutinação de PD-L1 inclui o domínio pesado variável e domínio leve variável da fração de aglutinação de PD-L1 de 10D12 (Figura 50). Em uma modalidade particular, a fração de aglutinação de PD-L1 é o scFv de 10D12 (Figura 50). O 10D12 se aglutina a hPD-Ll a um pH baixo e tem reatividade cruzada com mPD-Ll. 10D12 não se aglutina a hPD-L2 ou mPDL2. Além disso, o 10D12 bloqueia a interação PD-1/PD-L1, bem como a interação de B71/PD-L1.
[00212] Em algumas modalidades, a fração de aglutinação de PD-L1 da proteína de fusão de ABD é ainda anexada a outra fração de aglutinação ou de citocinas. Em certas modalidades, a outra fração de aglutinação é uma fração de aglutinação de TGFP ou outra fração de aglutinação a PD-L1. Em algumas modalidades, a citocina é IL-15 ou IL-12 (consultar a Figura 51B).
c. TNF e outras frações de aglutinação [00213] Em uma modalidade, a proteína de fusão de ABD aqui providos inclui uma fração de aglutinação do fator de necrose tumoral (TNF).
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Sem estar vinculado a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que tais proteínas de fusão de ABD são úteis como agentes anti-inflamatórios e/ou terapêuticos para o câncer. Em algumas modalidades, a fração de aglutinação de TNF é um scFv. Em modalidades particulares, a fração de aglutinação de TNF da proteína de fusão de ABD é ainda anexada a outro parceiro de fusão que é uma fração de aglutinação ou um peptideo inibidor. Em certas modalidades, a segunda fração de aglutinação é uma segunda fração de aglutinação de TNF, uma fração de aglutinação de IL-1, uma fração de aglutinação de IL-6, uma fração de aglutinação de IL-8, uma fração de aglutinação de IL-17 (isoformas A-F) ou uma fração de aglutinação IL-23.
[00214] Em uma outra modalidade, a proteína de fusão de ABD inclui uma fração de aglutinação selecionada a partir de uma fração de aglutinação de IL-1, IL-6, IL-8, IL-17 (A-F) e IL-23.
[00215] Em algumas modalidades, tal TNF e frações de aglutinação de interleucina de ABDs são úteis para o tratamento de doenças como artrite reumatoide, doença de Crohn, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, psoríase em placas crônicas e doenças com base em TNF.
F. Usos Diagnósticos [00216] Em outro aspecto, são providos aqui métodos para formação de imagem e/ou detecção de tumores. Em alguns aspectos, os métodos compreendem o contato de uma célula tumoral, cultura de células Tumorais, células de vasculatura tumoral, cultura de célula de vasculatura tumoral, tecido tumoral e outros tecidos e células com uma proteína de fusão de ABD de indivíduo da invenção que é rotulada.
[00217] A proteína de fusão de ABD também encontra utilização na formação de imagem in vitro ou in vivo de tumores ou estados de doença autoimunes associadas com os parceiros de aglutinação do antigeno da proteína de fusão de ABD proteína de fusão. Em algumas modalidades, a proteína de fusão aqui descrita é utilizada para diagnóstico e tratamento, ou
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55/85 apenas para diagnóstico. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de ABD de indivíduo é rotulada.
[00218] O diagnóstico pode ser feito in vivo, por administração de uma proteína diagnostica que permite a formação de imagem de todo o corpo como descrito abaixo, ou in vitro, em amostras removidas de um paciente. “Amostra” neste contexto inclui qualquer número de coisas, incluindo, mas não limitado a, fluidos corporais (incluindo, mas não limitados a, sangue, urina, soro, linfa, saliva, secreções anal e vaginal, transpiração e sêmen), como bem como amostras de tecidos, como resultado de biópsias de tecidos relevantes.
[00219] O termo “rotulado” aqui significa que a proteína de fusão de ABD aqui descrita tem um ou mais elementos, isótopos, ou compostos químicos anexados para possibilitar a detecção de uma tela ou de um procedimento de diagnóstico. Em geral, os rótulos se enquadram em várias classes: a) rótulos imunológicos, que podem ser um epítopo incorporado como um parceiro de fusão reconhecido por um anticorpo, b) rótulos isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados, c) rótulos de moléculas pequenas, que podem incluir corantes fluorescentes e colorimétricos, ou moléculas como biotina, que permitem outros métodos de rotulagem, e d) rótulos, como partículas (incluindo bolhas para rotulagem de ultrassom) ou rótulos paramagnéticos que permitem a formação de imagem do corpo. Os rótulos podem ser incorporados nas proteínas em qualquer posição (por exemplo, através de um ou mais dos ligadores aqui descritos) e podem ser incorporados in vitro ou in vivo durante a expressão da proteína, como é conhecido na técnica. Os rótulos específicos incluem corantes ópticos, incluindo, mas não limitados a, cromóforos, fósforos e fluoróforos, sendo estes últimos específicos em muitos casos. Os fluoróforos podem ser fluorescentes de “pequenas moléculas” ou fluorescentes proteicos.
[00220] O termo “rótulo fluorescente” significa que qualquer molécula
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56/85 pode ser detectada através das suas propriedades fluorescentes inerentes. Rótulos fluorescentes adequados incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarelo Lúcifer, azul cascata, vermelho Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5,5, LC Red 705, verde Oregon, os corantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), azul cascata, amarelo cascata e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, Oreg.), FITC, Rodamina e vermelho Texas (Pierce, Rockford, Illinois), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, Pa.). Corantes ópticos adequados, incluindo fluoróforos, são descritos em Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland, inteiramente incorporado por referência. [00221] Rótulos fluorescentes proteicos adequados também incluem, mas não estão limitados a, proteína fluorescente verde, incluindo uma espécie Renilla, Ptilosarcus ou Aequorea de GFP (Chalfie et al., Science 263: 802-805 (1994)), EGFP (1994). Clontech Labocamundongories, Inc., Número de Acesso ao GenBank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462- 471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP, Clontech Labocamundongories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., J. Immunol. 150: 5408-5417. (1993)), beta galactosidase (Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2603-2607 (1998)) e Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes U.S. n° 5.292.658, 5.418.155, 5.683.888, 5.741.668, 5.777.079, 5.804.387, 5874304, 5876995, 5925558). Todas as referências acima citadas neste parágrafo são expressamente incorporadas aqui por referência.
G. Produção de Proteínas de Fusão e Domínios de Aglutinação de Albumina
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57/85 [00222] Como será observado por aqueles versados na técnica, os protocolos padrão são usados para fazer os ABDs de indivíduo. Métodos gerais para biologia molecular de anticorpo, expressão, purificação e rastreio são descritos em Antibody Engineering, editado por Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001; e Hayhurst e Georgiou, Curr Opin Chem Biol 5: 683-689 (2001); Maynard e Georgiou, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76 (2000).
[00223] Em uma modalidade aqui descrita, são criados ácidos nucleicos que codificam a proteína de fusão de ABD, e que podem em seguida ser clonados em células hospedeiras, expressados e ensaiados, se desejado. Assim, os ácidos nucleicos, e particularmente o DNA, podem ser preparados para codificar cada sequência de proteína. Essas práticas são realizadas usando procedimentos bem conhecidos. Por exemplo, uma variedade de métodos que podem encontrar utilização na geração de proteínas de fusão de ABD, semelhantes à produção de anticorpos, aqui descritos são descritos em Molecular Cloning - A Labocamundongory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press, Nova Iorque, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), ambos incorporados inteiramente por referência. Existe uma variedade de técnicas que podem ser utilizadas para gerar DNA de modo eficiente codificando os ABDs aqui descritos. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de montagem de genes, método com base em PCR e métodos que usam variações de PCR, métodos com base em reação em cadeia da ligase, métodos oligo combinados tais como aqueles usados em embaralhamento sintético, métodos de amplificação propensos a erros e métodos que utilizam oligos com mutações aleatórias, métodos clássicos de mutagênese dirigida ao local, mutagênese por cassete e outros métodos de amplificação e síntese gênica. Como é conhecido na técnica, há uma variedade de kits disponíveis comercialmente e métodos para montagem de
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58/85 genes, mutagênese, subclonagem de vetores e semelhantes, e tais produtos comerciais encontram uso para gerar ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão de ABD.
[00224] Os ABDs aqui descritos podem ser produzidos por cultura de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, por exemplo, um vetor de expressão, contendo ácido nucleico que codifica as proteínas de fusão de ABD, sob as condições apropriadas para induzir ou causar expressão da proteína. As condições apropriadas para a expressão variarão com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira e serão facilmente verificadas por um especialista na técnica através de experimentação de rotina. Pode ser utilizada uma grande variedade de células hospedeiras apropriadas, incluindo mas não se limitando a células de mamífero, bactérias, células de inseto, levedura e células vegetais. Por exemplo, uma variedade de linhas celulares que podem encontrar utilização na geração de proteínas de fusão de ABD aqui descritas são descritas no catálogo de linhas celulares ATCC®, disponível na American Type Culture Collection.
[00225] Em uma modalidade, os ABDs são expressos em sistemas de expressão de mamíferos, incluindo sistemas em que as construções de expressão são introduzidos nas células de mamíferos usando vírus, como retrovirus ou adenovirus. Podem ser utilizadas quaisquer células de mamífero, por exemplo, células humanas, de camundongo, de rato, de hamster e de primatas. As células adequadas incluem também células de pesquisa conhecidas, incluindo mas não se limitando a células T Jurkat, NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, células NSO e variantes da mesma. Em uma modalidade alternativa, as proteínas da biblioteca são expressas em células bacterianas. Os sistemas de expressão bacteriana são bem conhecidos na técnica e incluem Escherichia coli (E. coll), Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris e Streptococcus lividans. Em modalidades alternativas, as proteínas de fusão de ABD são produzidas em células de
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59/85 inseto (por exemplo, Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5bl-4) ou células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, Pichia, etc.). Em uma modalidade alternativa, os polipeptídeos de ABD são expressos in vitro utilizando sistemas de translação livre de células. Estão disponíveis sistemas de translação in vitro derivados de células Tanto procarióticas (por exemplo, E. coli) como eucarióticas (por exemplo, gérmen de trigo, reticulócitos de coelho) e podem ser escolhidas com base nos níveis de expressão e propriedades funcionais da proteína de interesse. Por exemplo, conforme observado pelos versados na técnica, é necessária translação in vitro para algumas tecnologias de visor, por exemplo, visor de ribossomos. Além disso, as proteínas de fusão de ABD podem ser produzidas por métodos de síntese química. Também sistemas de expressão transgênica animal (por exemplo, leite de vaca, ovelha ou cabra, ovos de galinha embrionados, larvas inteiras de insetos, etc.) e plantas (por exemplo, milho, tabaco, lentilha, etc.).
[00226] Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão de ABD aqui descritas podem ser incorporados em um vetor de expressão de modo a expressar a proteína. Uma variedade de vetores de expressão pode ser utilizada para expressão de proteína. Os vetores de expressão podem compreender vetores extra-cromossômicos auto-replicantes ou vetores que se integram em um genoma do hospedeiro. Os vetores de expressão são construídos para serem compatíveis com o tipo de célula hospedeira. Assim, os vetores de expressão que encontram utilização na geração de anticorpos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a aqueles que permitem a expressão de proteínas em células de mamífero, bactérias, células de inseto, levedura e em sistemas in vitro. Como é conhecido na técnica, uma variedade de vetores de expressão está disponível, comercialmente ou de outro modo, que pode ser utilizada para expressar os anticorpos aqui descritos.
[00227] As proteína de fusão de ABD descritas podem ser codificadas por múltiplas moléculas de ácido nucleico. Por exemplo, as cadeias pesadas e
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60/85 leves variáveis podem ser introduzidas em uma célula hospedeira de forma independente. Embora presentes em ácidos nucleicos separados, a sua expressão produz um único polipeptídeo.
[00228] Os vetores de expressão compreendem tipicamente uma proteína ligada operativamente com sequências de controle ou reguladoras, marcadores selecionáveis, quaisquer parceiros de fusão e/ou elementos adicionais. Por “operativamente ligado” entende-se aqui que o ácido nucleico é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Geralmente, estes vetores de expressão incluem ácido nucleico regulador da transcrição e translação operativamente ligada ao ácido nucleico que codifica as proteínas de fusão de ABD multivalentes, e são tipicamente apropriados célula hospedeira utilizada para expressar a proteína. Em geral, as sequências reguladoras da transcrição e da translação podem incluir sequências promotoras, locais de aglutinação ao ribossomial, sequências de início e paragem da transcrição, sequências de início e paragem da translação e sequências intensificadoras ou ativadoras. Como é também conhecido na técnica, os vetores de expressão contêm tipicamente um gene ou marcador de seleção para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas contendo o vetor de expressão. Os genes de seleção são bem conhecidos na técnica e variarão com a célula hospedeira utilizada.
[00229] Em uma modalidade, ABDs são purificados ou isolados após a expressão. As proteínas de fusão de ABD e ABDs podem ser isoladas ou purificadas de várias maneiras conhecidas dos versados na técnica. A purificação pode ser particularmente útil para separar espécies de cadeia pesada heterodiméricas de espécies de cadeia pesada homodimérica, como aqui descrito. Os modos de purificação padrão incluem técnicas cromatográficas, incluindo troca iônica, interação hidrofóbica, afinidade, dimensionamento ou filtração em gel, e fase inversa, realizadas em pressão atmosférica ou a alta pressão utilizando sistemas tais como FPLC e HPLC. Os
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61/85 métodos de purificação incluem também técnicas eletroforéticas, de focagem isoelétrica, de precipitação imunológicas, de diálise e de cromatofocagem. Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com a concentração de proteína, também são úteis. A fusão é empregada, cromatografia de afinidade de Ni+2 se uma etiqueta-His é empregada, ou anticorpo anti-indicação imobilizado se uma etiqueta de indicação é usada. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, consultar, por exemplo, incorporado inteiramente por referência Protein Purification: Principies and Practices, 3a Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, incorporado inteiramente por referência. O grau de purificação necessário irá variar dependendo da tela ou do uso dos anticorpos. Em alguns casos, nenhuma purificação é necessária.
H. Usos Terapêuticos de Proteínas de Fusão de ABD de Domínio de Aglutinação de Albumina [00230] As proteínas de fusão de ABD e de ABDs de indivíduo encontram utilização em uma variedade de utilizações terapêuticas como aqui descrito.
[00231] Em um aspecto, é provido aqui um método de inibir o crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo por administração da proteína de fusão (ABD) do domínio de aglutinação de albumina descritas aqui. Proteínas de fusão de ABD úteis incluem, mas não estão limitadas a, àquelas descritas nas Figuras 4, 20, 34, 36, 40, 45, 50-51.
[00232] Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma IL-12 ou IL-15 (por exemplo, uma proteína de fusão de IL-12-ABD ou IL-15-ABD). Como aqui descrito, as proteínas de fusão de IL-15 ABD são capazes de inibir o crescimento tumoral de um modo dependente da dose. Tal inibição do crescimento do tumor mediada por IL-15 é acompanhada por um aumento nos linfócitos infiltrantes do tumor, incluindo linfócitos T citotóxicos (CTLs) e células exterminadoras naturais ativadas (NK). Em certas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma molécula de IL-12. Em
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62/85 algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma IL-15. Em ainda outras modalidades, a citocina-ABD inclui uma IL-12 e uma IL-15. Em algumas modalidades, a IL-15-ABD inclui uma variante de IL-15 como aqui descrito (consultar, por exemplo, Figura 3).
[00233] Também é provido aqui um método de tratamento de um indivíduo com câncer por meio da administração da proteína de fusão (ABD) do domínio de aglutinação de albumina do indivíduo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma IL-12 ou IL-15 (por exemplo, uma proteína de fusão de IL-12-ABD ou IL-15-ABD). A IL-12 e IL-15 são citocinas para imunomodulação do microambiente tumoral devido à sua capacidade de proliferar e ampliar a capacidade de sobrevivência das células T CD8 +. Outras proteínas de fusão de ABD úteis incluem, mas não estão limitadas, às descritas nas Figuras 4, 20, 34, 36, 40, 45, 50-51.
[00234] Os exemplos de câncer a serem aqui tratados incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, blastoma, sarcoma, certas leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer epitelial de células escamosas), câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, gástrico ou estomacal incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, glândula salivar carcinoma, câncer do rim ou renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, câncer da pele/melanoma, bem como câncer de cabeça de câncer de pescoço e metástases associada com qualquer dos tumores primários.
[00235] Em outro aspecto provido aqui, é um método de aumentar a
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63/85 proliferação e/ou capacidade de sobrevivência de uma célula T CD8+. Em certas modalidades, o método compreende o contato da célula com uma proteína de fusão do domínio de aglutinação de albumina que inclui IL-12 e/ou IL-15 (por exemplo, uma proteína de fusão de IL-12-ABD ou IL-15ABD). Em certas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma molécula de IL-12. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de ABD inclui uma molécula de IL-15. Em ainda outras modalidades, a proteína de fusão de ABD da proteína de fusão inclui uma proteína de IL-12 e uma de IL-
15.
I. Formulações Farmacêuticas, Administração e Dosagem [00236] Em outro aspecto, é aqui provida uma composição terapêutica que compreende qualquer polipeptídeo (ABD) de domínio de aglutinação de albumina de indivíduo e um carreador. As composições terapêuticas do indivíduo utilizadas na prática dos métodos anteriores podem ser formuladas em composições farmacêuticas compreendendo um carreador adequado para o método de entrega desejado. Carreadores adequados incluem qualquer material que quando combinado com a composição terapêutica retém a função antitumoral da composição terapêutica e é geralmente não reativo com o sistema imunológico do indivíduo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a qualquer um de um número de carreadores farmacêuticos padrão tais como soluções salinas estéreis tamponadas com fosfato, água bacteriostática e semelhantes (consultar, em geral, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Edição, A. Osal., Ed, 1980).
1. Composições para Administração In Vivo [00237] As formulações da proteína de fusão (ABD) do domínio de aglutinação de albumina usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento por mistura de uma proteína de fusão de ABD tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's
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Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. [1980]), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citcamundongo e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butrlico ou benzílico; alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); proteínas de fusão de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidcamundongos incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA ou DPTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íon formadores de sal, tais como sódio; complexos de metais (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG) de vários pesos moleculares.
[00238] A formulação aqui também pode conter mais de um composto ativo, conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável prover proteínas de fusão de ABD com outras especificidades. Altemativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente citotóxico, citocina, agente inibidor do crescimento e/ou antagonista de molécula pequena. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
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65/85 [00239] Os ingredientes ativos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[00240] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis, ou próximas disso. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[00241] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, matrizes essas que são na forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinil álcool)), polilactidas (U.S. Pat. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradável tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido lático-ácido glicólico possibilitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos.
[00242] Quando proteínas de fusão de domínio de aglutinação a albumina encapsuladas permanecem no corpo por muito tempo, elas podem desnaturar ou agregar como resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na
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66/85 imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se foi verificado que o mecanismo de agregação é intermolecular formação de aglutinação S—S através de troca de tiodissulfeto, pode ser alcançada estabilização por modificação de resíduos de sulfidrilas, liofilização de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específica.
2. Modalidades administrativas [00243] As proteínas de fusão de domínio de aglutinação a albumina e agentes terapêuticos da matéria são administrados a um indivíduo, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua por um período de tempo, por vias intramusculares, intraperitoneais, intracerobrospinais, subcutâneas, intra-articulares, intrassinoviais, intratecáis, orais, topicais, ou de inalação. Administração intravenosa ou administração subcutânea do anticorpo é preferida.
3. Modalidades de tratamento [00244] Nos métodos providos aqui, terapia é usada para prover uma resposta terapêutica positiva em relação a uma doença ou condição. Por “resposta terapêutica positiva” entende-se uma melhoria na doença ou condição, e/ou uma melhoria nos sintomas associados com a doença ou condição. Por exemplo, uma resposta terapêutica positiva referiria a uma ou mais das seguintes melhorias na doença: (1) uma redução no número de células Tumorais; (2) um aumento na morte de células Tumorais; (3) inibição de sobrevivência de célula tumoral; (5) inibição (isto é, retardamento em certa medida, preferencialmente parada) do crescimento do tumor; (6) uma taxa de sobrevivência de paciente aumentada; e (7) algum alívio de um ou mais sintomas associados com a doença ou condição.
[00245] Respostas terapêuticas positivas em alguma dada doença ou condição podem ser determinadas por critérios de resposta padronizados
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67/85 específicos àquela doença ou condição. Resposta tumoral pode ser avaliada para mudanças na morfologia do tumor (isto é, carga tumoral global, tamanho do tumor, e semelhantes) usando técnicas de triagem tais como varredura de imageamento por ressonância magnética (IRM), imageamento por radiografia com raio X, tomografia computadorizada (CT), imageamento por cintilografia óssea, endoscopia, e amostragem de biopsia tumoral incluindo aspiração da medula óssea (BMA) e contagem de células Tumorais na circulação.
[00246] Além dessas respostas terapêuticas positivas, o indivíduo submetido à terapia pode experimentar o efeito benéfico de uma melhoria nos sintomas associados com a doença [00247] Assim, para tumores de célula B, por exemplo, o indivíduo pode experimentar uma diminuição nos sintomas assim chamados B, isto é, suores noturnos, febre, perda de peso, e/ou urticária. Para condições prémalignas, a terapia com um agente terapêutico multivalente pode bloquear e/ou prolongar o tempo antes do desenvolvimento de uma condição maligna relacionada, por exemplo, desenvolvimento de mieloma múltiplo em indivíduos sofrendo de gamopatia monoclonal de significância indeterminada (MGUS).
[00248] Uma melhoria na doença pode ser distinguida como uma resposta completa. Por “resposta completa” entende-se uma ausência de doença clinicamente detectável com normalização de quaisquer estudos radiográficos previamente anormais, medula óssea, e líquido cefalorraquidiano (CSF) ou proteína monoclonal anormal no caso de mieloma.
[00249] Tal resposta pode persistir por pelo menos 4 a 8 semanas, ou algumas vezes 6 a 8 semanas, seguindo tratamento de acordo com os métodos da matéria. Altemativamente, uma melhoria na doença pode ser categorizada como sendo uma resposta parcial. Por “resposta parcial” entende-se pelo menos um aumento de cerca de 50% em toda carga tumoral mensurável (isto
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68/85 é, o número de células malignas presentes no indivíduo, ou o volume medido de massas tumorais ou a quantidade de proteína monoclonal anormal) na ausência de novas lesões, as quais podem persistir por 4 a 8 semanas, ou 6 a 8 semanas.
[00250] Tratamento inclui uma “quantidade terapeuticamente eficaz” dos medicamentos usados. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” referese a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado.
[00251] Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, a capacidade dos medicamentos de elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[00252] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” para terapia tumoral pode também ser medida por sua capacidade de estabilizar a progressão de doença. A capacidade de um composto inibir câncer pode ser avaliada em um sistema de modelo animal que preveja a eficácia em tumores humanos.
[00253] Altemativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto de inibir o crescimento de células ou induzir apoptose por ensaios in vitro conhecidos pelo técnico versado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outro modo melhorar sintomas em um indivíduo. Um versado na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particular ou via de administração selecionada.
EXEMPLOS
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Exemplo 1: Triagem e identificação de domínios de aglutinação a albumina de soro humano [00254] Métodos de panning em fase sólida e de panning em solução foram executados para domínios de aglutinação a albumina (ABD) de scFv em fagos. Domínios de aglutinação a albumina que foram selecionados a partir de uma triagem primária por domínios de aglutinação a albumina de soro humano foram subsequentemente triados por reatividade cruzada a albumina de soro de rato usando técnicas de ELISA padrão. Candidatos a domínio de aglutinação a albumina primários obtidos usando os métodos de triagem foram sequenciados e subsequentemente testados para aglutinação dependente da concentração alvo, estabilidade de pH, interferência de aglutinação de FcRn e aglutinação cinética. Em particular, ABDs candidatos foram escolhidos por sua capacidade de se ligar a albumina de soro humano (kD -20-60 nM), albumina de soro de rato (kD -10-30 nM) e albumina de soro cino (kD -20-60 nM) em baixo pH (pH5,5) e pH neutro (pH 7,7). ABDs candidatos foram testados para garantir que eles não competiam com aglutinação FcRn a albumina de soro. Como explicado aqui, ABDs que se ligam em tal pH e não competiam com aglutinação FcRn são capazes de serem submetidos a reciclagem endossomai mediada por FcRn. Assim, agentes biológicos (por exemplo, citosinas e agentes biológicos com base em anticorpo) que incluem tais ABDs são também capazes de serem submetidos a tal reciclagem mediada por FcRne, assim, exibem uma maior meia-vida em comparação a contrapartes que não incluem tais ABDs.
[00255] Cinco clones de aglutinação a albumina foram selecionados com base nesses critérios: A9, A10, A6, 2B4, 2H10. Desses cinco clones, A10 foi selecionado com base em alto nível de expressão e melhor perfil de atividade. A10 foi então mutado para eliminar regiões que poderíam putativamente causar imunogenicidade. Dessas variantes A10, A10m3 foi selecionado como a principal com base em sua alta afinidade para albumina
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70/85 de soro.
[00256] As sequências de domínios de aglutinação a albumina de soro humano exemplares são mostradas na Figura 2 incluindo A10m3 (Figura 2D). Exemplo 2: Variantes IL-15 e IL-15-ABDs
Expressão da proteína IL15-A10m3 é extremamente pobre em células HEK293T, as quais não podem ser consideradas pela transcrição [00257] Construtos IL-15-ABD (IL-15-A10m3) foram produzidos em células HEK293 em três culturas de células independentemente transfectadas e avaliadas por Western blotting usando anticorpo anti-His tag (Figura 5A, esquerda) ou por ELISA funcional ligando a albumina de soro de rato (Figura 5A, direita). Como mostrado na Figura 5A, expressão de IL-15-A10m3 não pôde ser avaliada por nenhum desses métodos. Para avaliar se a falta de expressão IL-15-A10m3 em células HEK293 foi devido a baixos níveis de transcrição, mRNA foi preparado a partir de quatro células IL-15-A10m3 independentemente transfectadas e RT-PCR foi realizado para quantificar o nível de mRNA de mRNA IL15-A10m3 (Figura 5B, faixas 2-5) em comparação com aquele de um gene de manutenção, GAPDH (Figura 5B, faixa 6). Como mostrado na Figura 5B, mRNA IL15-A10m3 foi detectado em quantidades significantes das células Transfectadas em relação àquele GAPDH controle, sugerindo que os baixos níveis de expressão de IL-15A10m3 produzidos em células HEK293 não é devido à transcrição, mas mais provavelmente por ser associado com processo translacional ou póstranslacional.
Identificação de um sítio de ubiquitinação putativo em IL15 que é adjacente ao sítio de aglutinação de receptor IL15 alpha [00258] Estudos mostram que proteína IL15 foram expressadas nas células, mas são muito instáveis com uma meia-vida curta. Coexpressão de IL15Ra com IL15 na mesma célula aumentou profundamente a quantidade de superfície celular IL15Ra bem como IL15. Estudos adicionais confirmaram
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71/85 que IL15Ra atua como uma chaperona de IL15 e aglutina IL15 intracelularmente para proteger e estabilizar IL15 antes da secreção. Essas verificações sugerem que tradução pode não contar para a baixa produtividade de IL15. Em vez disso, modificação pós-translacional (PTM) pode desempenhar um papel na instabilidade intracelular de IL15, e que a instabilidade intracelular de IL15 pode ser superada por IL15Ra bloqueando a modificação pós-translacional específica ainda não conhecida. Ubiquitinação é um mecanismo bem documentado que permite que células marquem proteínas intracelulares para degradação.
[00259] Dado que IL15 é uma citosina pró-inflamatória muito potente, cuja expressão é rigidamente controlada por células, é possível que células utilizem ubiquitinação para controlar ativamente níveis de proteína IL15. Sítios de ubiquitinação potenciais em IL-15 que são putativamente protegidos mediante aglutinação a IL-15Ra foram identificados (Figura 6). Em particular, aminoácido K86 é um sítio de ubiquitinação putativo que é próximo ao sítio de aglutinação IL-15/ IL-15Ra (Figura 6A), sugerindo a possibilidade de que a aglutinação de IL15Ra a IL15 bloqueia a acessibilidade de ubiquitina ligase (por exemplo, E3) a K86 na proteína IL15. K86 foi adicionalmente confirmado como um sítio de ubiquitinação usando UbPred, uma base de dados de sítio de ubiquitinação online (www.ubpred.org) Figura 6B.
Mutação de K86 em IL15 restaura a expressão da proteína IL15-A10m3 por células HEK293T [00260] Para avaliar se ubiquitinação em K86 afeta a estabilidade intracelular de variantes IL-15, IL-15 contendo aminoácido substituições em K86, incluindo K86A e K86R, foram feitas. As sequências de diversas dessas variantes IL-15 são mostradas na Figura 3. Sem ser vinculado a qualquer teoria de operação em particular, acredita-se que substituições de aminoácido nesses sítios de ubiquitinação em particular levam a IL-15 resistente à
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72/85 ubiquitinação que exibe estabilidade aumentada sobre o tipo selvagem IL-15. Tais variantes IL-15 foram afixadas a um ABD (A10m3) para extensão de meia-vida adicional (Figura 4). A Figura 7 provê ilustrações esquemáticas de tais proteínas de fusão IL-15-ABD incluindo um IL-15-ABD com um “domínio sushi” IL-15Ra/IL15 (A) e proteínas de fusão IL-15-ABD que incluem variantes IL-15 tendo substituições de aminoácido em sítio de ubiquitinação K86 (B).
[00261] Variantes IL-15-ABD K86R e K86A e IL-15Ra/IL15-ABD produzidas em célula HEK293 foram avaliadas em sua capacidade de se ligar a albumina de soro de rato (MSA) e IL-15Ra. Como mostrado na Figura 8A, variantes IL-15-ABD K86R e K86A produzidas em HEK293 (12 clones) e IL-15Ra/IL15-ABD (12 clones) exibiram maior expressão em comparação a IL-15-ABD tipo selvagem produzida em HEK-293 (12 clones). Tais construtos também foram capazes de aglutinação a MSA. Além do mais, como mostrado na Figura 8B, as substituições de K86R (clone R6, estrela verde) e K86A (clone A3, estrela amarela) não interferiram na capacidade das variantes de se ligar à IL-15Ra. Interessantemente, IL15-A10m3 fundida com IL15Ra falhou em mostrar qualquer aglutinação a IL15Ra, sugerindo que o domínio sushi IL15Ra interno se ligou a IL15 de maneira intramolecular e bloqueou assim a aglutinação a IL15Ra externo revestida na placa. Isso é consistente com essas e outras verificações de que a aglutinação de IL15 ao domínio sushi IL15Ra aumenta a expressão de IL15 (Figura 7B).
[00262] Uma produção aumentada de uma variante particular de IL-15ABD produzida por célula HEK293 contendo substituição de aminoácido K86R (IL-15 K86R-A10m3) foi executada e o construto IL-15 K86R-A10m3 foi avaliado para aglutinação a albumina de soro in vitro. Como mostrado na Figura 9, IL-15-ABD tendo uma mutação K86 (IL-15 K86R-A10m3) e IL15Ra/IL15-ABD (IL-15Ra/IL15-A10m3) foram capazes de ser produzidos em células HEK 293 em quantidades aumentadas, como confirmado por SDS
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PAGE (Figura 9C, esquerda) e Western blotting com um anticorpo anti-His tag (direita). Além disso, como mostrado na Figura 10, K86R-A10m3 exibiu aglutinação a albumina de soro de rato (MSA).
Bioatividade de K86R -A10m3 IL15 produzida a partir de células HEK293T é prejudicada, o que pode ser resgatado por desglicosilação.
[00263] Bioatividade de vários IL-15-ABDs foram testadas usando ensaios de proliferação CTLL2. IL-15-ABDs testadas incluem tipo selvagem IL-15-A10m3 e três K86R-A10m3s de IL-15 diferentes produzidos em células HEK293T. IL-15 comercialmente disponível e IL-15-ABD produzido in-house, ambos feitos usando E. coli, foram usados como controles. Como mostrado na Figura 11, K86R-A10m3 de IL-15 produzido a partir de HEK293T mostrou uma capacidade significantemente produzida de promover proliferação de CTLL2 em comparação a controles produzidos em E. coli, incluindo tipo selvagem comercial IL-15 (R&D) e IL-15-A10m3 produzido in-house. Dada a diferença em ensaios de proliferação CTLL2 entre IL15 de HEK293T e IL15-A10m3 de E. coli, foi hipotetizado que visto que IL15A10m3 produzido a partir de E. coli não é submetido à N-glicosilação clássica como é feito em células de mamíferos, é possível que a glicosilação de K86R -A10m3 IL15 em HEK293 células T podem interferir na interação de K86R -A10m3 IL15 com seus receptores.
[00264] Para avaliar se a bioatividade reduzida de IL-15 K86R-A10m3 produzida por célula HEK é devido a glicosilação, IL-15 K86R-A10m3 foi desglicosilada usando PNGase e ensaios de proliferação CTLL2 foram executados para avaliar bioatividade da IL15 K86R-A10m3 desglicosilada. Após tratamento de mistura de PNGase de IL-15 K86R-A10m3 sob condições nativas, glicano foi completamente removido e visualizado por SDS-PAGE seguido por manchamento glicano (Figura 12A, esquerda) e coloração com azul de comassie (Figura 12A, direita). 1) mistura IL-15R-A10m3+ 5ul PNGase; 2) proteína+ mistura de PNGase de lOul; 3) nenhum controle de
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74/85 enzima. Como mostrado na Figura 12B, desglicosilação de IL-15 K86RA10m3 (azul) atividade quase completamente resgatada em ensaios de proliferação CTLL2, em comparação com amostras não tratadas (roxo, amarelo). WT IL-15 de sistemas R&D (vermelho) e IL-15-A10m3 produzido in-house com E.coli (preto) foram usados como controles positivos.
NI 12 de IL-15 K86R-A10m3 é crítico para sua bioatividade em promover proliferação de CTLL2 [00265] Posição de aminoácido NI 12 de IL-15 K86R-A10m3 é um sítio chave para a bioatividade de IL-15, particularmente no contexto de IL15-ABD, como é crítico para um estabelecimento adequado da interação entre IL-15 e receptor IL15 gama. IL-15 variante K86R foi adicionalmente mutada em N112A para determinar se mutações nesse sítio poderíam recuperar bioatividade de IL-15, similar a IL-15 desglicosilada. Em particular, IL15 K86R-A10m3 foram mutados para incluir adicionalmente uma substituição de aminoácido N112Q, N112A ou N112S IL-15 e ensaios de proliferação CTTLL2 foram executados para testar bioatividade. Como mostrado na Figura 13A, introduzir substituição de aminoácido N112A em IL-15 K86RA10m3 (azul) recuperou sua bioatividade comparável àquela de IL-15 desglicosilada K86R-A10m3 (verde) em ensaios de proliferação CTLL2, enquanto mutação N112Q (vermelho) não tem nenhum efeito na bioatividade em relação à IL-15R-A10m3 parental sem desglicosilação (amarelo). WT IL15 (preto) de sistemas R&D serviu como controle positivo.
[00266] Mutações com diferentes cadeias laterais em NI 12 foram testadas para demonstrar adicionalmente o efeito de tamanho na bioatividade. Como mostrado na Figura 13B, N112Q (grande, vermelho), N112S (médio, verde) e N112A (pequeno, azul) apresentaram uma bioatividade aumentada inversamente proporcional ao tamanho das cadeias laterais. Além do mais, a aglutinação de hidrogen sugerida estabelecida por NI 12 de IL-15 e Y103 do receptor IL15 gama não parecem serem importantes para essa atividade, como
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N112A não pode formar tal aglutinação. WT IL-15 de sistemas R&D (preto) e IL-15-A10m3 produzido in-house com E.coli (roxo) foram usados como o controle positivo; IL15 K86R-A10m3 parental sem desglicosilação (amarelo) foi usado como o controle negativo.
Exemplo 3: Atividade in vivo da IL-15 variante e IL-15-ABDs [00267] A capacidade de IL-15 e IL-15-ABD inibir crescimento do tumor foi avaliada usando um modelo de melanoma de camundongo BI 6F10. Como resumido na Figura 14, camundongos foram tratados com IL-15, placebo PBS ou várias doses de IL-15-ABD por injeção IV em quatro pontos diferentes no tempo, espaçados em 48 horas entre si. Como mostrado na Figura 16, IL-15-ABD inibe crescimento do tumor de uma maneira dependente da dose.
[00268] Análises FACS foram realizadas para avaliar adicionalmente o perfil de populações de linfócitos de infiltração de tumor em camundongos tratados com IL-15-ABD desses estudos. Como mostrado na Figura 16, tumores em camundongos tratados com IL-15-ABD exibiram um aumento em populações de célula NK. Esses dados combinados com observações de acumulação e retenção de tumor aumentado em camundongos tratados com IL-15-ABD, como descrito acima, sugerem que o ABD intensifica o efeito pró-inflamatório de IL-15 dentro do tumor. Os efeitos do tratamento com IL15-ABD em populações de linfócitos em baços e tumores são resumidos nas Figuras 17 e 18. Como mostrado nas Figuras 17 e 18, Análise FACS de populações de linfócitos mostram um aumento de 3 - 6 vezes de CTL infiltrando o tumor e populações de célula NK em tumores de camundongos tratados com IL-15 ABD. Nenhuma diferença significante foi observada no baço. Tomados em conjunto, os resultados desses estudos mostram a capacidade imunomodulatória do tumor de IL-15-ABDs in vivo.
[00269] Para avaliar a capacidade de proteínas de fusão ABD de aumentar a meia-vida de IL-15, camundongos C57B foram injetados
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76/85 intravenosamente com 5 pg de IL-15-ABD ou IL-15 somente e concentrações de soro de IL-15-ABD e IL-15 foram subsequentemente avaliadas. Como mostrado na Figura 20A, IL-15-ABD exibiu um maior PK em comparação a IL-15 WT. IL-15 T Άβ = 0,6 h, similar àquele reportado no domínio público (~0,5 h). Resultados de estudo mostram ABD estende IL-15 T Υιβ a ~7,0 horas, que é um aumento de ~10X vezes. IL-15-ABD foi também testado para estabilidade em soro humano usando um ensaio com base em células. Como mostrado na Figura 19B, IL-15-ABD foi mais estável em soro humano em comparação a controle IL-15 comercial, sem ABD.
Exemplo 4: IL-12-ABD [00270] Construtos ABD de cadeia simples de IL-12 de camundongo foram feitos em células HEK293T e purificados por cromatografia por exclusão de tamanho. IL-12-A10m3 produzido a partir de células HEK293T são completamente ativos em ambos o ensaio in vitro e ensaios com base em células. Como mostrado na Figura 21 A, IL12-A10m3 é capaz de se ligar a albumina de soro de rato, com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 2,lnM. IL12-A10m3 produzidos a partir de HEK293T foram também capazes de estimular proliferação de PBMC humano, comparável àquela do IL12 de camundongo produzido in-house e IL-12 de camundongo comercialmente disponível (R&D)(Figura 21B). Além do mais, IL12-A10m3 produzido a partir de HEK293T estimulou secreção de interferon gama de PBMC humano, comparável àquele do IL-12 de camundongo produzido inhouse e IL-12 de camundongo comercialmente disponível (R&D) (Figura 22). Tratamento com IL-12-ABD reduz volume de tumor in vivo.
[00271] A capacidade de IL-12 e IL-12-ABD inibir crescimento do tumor foi avaliada usando um modelo de melanoma de camundongo BI 6F10. Como resumido na Figura 23, camundongos foram tratados com IL-12ABD ou IL-12 em três doses similares por injeção IV no dia 7 após inoculação do tumor (dia 0), quando o volume de tumor alcançou 100 mm3. O
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77/85 crescimento do tumor foi monitorado a cada 2 dias após tratamento por 10 dias. Placebo PBS serviu como um controle. Como mostrado na Figuras 2426 e 28, ambos IL-12 e IL-12-ABD foram capazes de reduzir crescimento do tumor de uma maneira dependente da dose. Além do mais, IL-12-ABD foi capaz de reduzir volume de tumor mais efetivamente em comparação a IL-12 somente em concentrações similares (Veja, por exemplo, a Figura 26 em 10 dias e Figura 28, dias médios para 50% de tumores alcançar 2000 mm3). Medições de massa corporal longitudinais de camundongos desses estudos mostram mudanças mínimas em peso em todos os grupos de tratamento com IL-12-ABD (Figura 27). Falta de mudanças significantes observadas em massa, sugere a falta de toxidade de IL-12-ABD em grupos de tratamento no curso de pós tratamento de 12 dias.
[00272] Caracterização adicional dos efeitos farmacodinâmicos de uma única dose de IL-12-ABD (4,5 pg IL-12-ABD, mesma dose molar como controle IL-12 de 3 pg) em camundongos com tumor B16-F10 após 5 dias demonstrou que IL-12-ABD exibiu uma maior supressão similar do crescimento do tumor em comparação a uma dose molar similar de controle de IL-12. Camundongos tratados com IL-12-ABD também exibiram um aumento correspondente em ativação imune como mostrado por um aumento em peso de baço e IFN-γ, sem um efeito no peso corporal do camundongo, em comparação ao controle (Figura 29).
[00273] A Figura 30 mostra além disso o resultado de um estudo comparando o volume de tumor de camundongos com tumor B16-F10 em 10 dias, injetados com IL-12-ABD (1,3 pg), IL-12 (30 pg), ou placebo. Embora IL-12 (1 pg) e IL-12-ABD (1,3 pg) sejam equivalentes molares e tenham a mesma bioatividade in vitro, IL-12-ABD é ~ 30+ vezes mais potente do que IL-12 in vivo (compare resultados no dia 10 na Figura 30, 1,3 pg IL-12-ABD > 30 pg IL-12). A Figura 31 além disso representa os efeitos hematopoiéticos de IL-12-ABD e IL-12 em camundongos do estudo representado graficamente
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78/85 na Figura 30 em 3 e 7 dias. Como mostrado na Figura 31, camundongos tratados com IL-12-ABD exibiram uma diminuição transiente de WBC, neutrófilos e linfócitos no dia 3 em comparação a camundongos tratados com IL-12 e controle de placebo. Tais populações de células, no entanto, retornadas ao normal no dia 7. Além disso, níveis de IFN-γ em camundongos tratados com IL-12-ABD foram maiores nos dias 3 e 7, como em comparação a camundongos tratados com IL-12 e controle.
Avaliação de efeitos antitumorais de IL-12-ABD ou IL-12 em combinação com anticorpo anti-PD-1 in vivo.
[00274] O efeito de terapias de combinação de única dose usando IL12-ABD ou IL-12 com anticorpos anti-PD-1 foi avaliado em camundongos com tumor B16-F10 em 8 dias (Figura 32).
[00275] Animais (7 - 10 semanas de idade) foram distribuídos em 8 grupos (8 animais por grupo) 10 dias após inoculação de célula tumoral B16F10 (2 x 104 célula/camundongo). Animais foram distribuídos com base no volume de tumor. Na hora da distribuição, o volume médio de tumor por grupo foi 100 mm3). No dia 0 (quando tumores alcançaram 100 mm3) a cada grupo foi dada uma dose única I.V. do PBS (Placebo), IL12-ABD (1,5 ug, 5 ug, 15 ug) ou IL15-ABD-IL12 (1,7 ug, 6 ug, 17 ug).
[00276] Grupos foram examinados para peso corporal, volume de tumor e capacidade de pseudossobrevivência. Pesos corporais foram medidos antes da inoculação do tumor e em tempo de medições de tumor. O tamanho do tumor foi medido a cada 2 dias em duas dimensões usando um paquímetro, e o volume expresso em mm3 usando a fórmula: V = 0,5 x a x b2 onde a e b são os diâmetros longo e curto do tumor. O estudo foi conduzido como pseudossobrevivência; cada camundongo foi eutanizado quando seu tumor alcançou 2000 mm3 ou quando determinado como moribundo.
[00277] Como mostrado na Figura 33, IL-12-ABD foi mais eficaz do que tratamento com anti-PD-1 ou a dose de equivalente molar de IL-12
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79/85 recombinante. Além do mais, IL-12-ABD foi tão eficaz quanto a combinação de tratamento com IL-12 recombinante e anti-PD-1. Interessantemente, a adição de anti-PD-1 Ab a IL-12 recombinante melhorou a eficácia de qualquer tratamento sozinha, enquanto que, tratamento com anti-PD-1 proveu benefício adicional a IL-12-ABD [00278] Para avaliar a capacidade de proteínas de fusão ABD de aumentar a meia-vida de IL-12, camundongos C57B foram injetados intravenosamente com 5 pg de IL-12-ABD ou IL-12 somente e concentrações de soro de IL-12-ABD e IL-12 foram avaliados. Como mostrado na Ligura 33, IL-12-ABD exibiu um maior PK do que IL-12 WT. IL-12 T Υιβ = 2,5 h, similar àquele reportado no domínio público (—3,5 h). Resultados de estudo mostram ABD estende IL-12 T Άβ a 9,5 horas, um aumento de ~4X vezes. Exemplo 5: IL-15-ABD-IL-12 biespecífico [00279] Construtos IL-15-ABD-IL-12, hIL15 (K86R/N112A)-A10m3mIL-12sc e mIL-12sc -A10m3- hIL15 (K86R/N112A) foram feitos em células HEK293T e purificados por cromatografia por exclusão de tamanho. As sequências desses construtos são representadas na Figura 34. A capacidade de construtos hIL15 (K86R/N112A)-A10m3-mIL-12sc e mIL-12sc -A10m3hIL15 (K86R/N112A) de se ligar a MS A, receptor beta 2 de IL12 e receptor alpha de IL-15 foram avaliados por ELISA. Como mostrado na Figura 35, ambos os construtos IL-15-ABD-IL-12 foram capazes de se ligar a MS A de uma maneira dependente da dose em meios de cultura de célula. Além disso, ambos os construtos biespecíficos foram capazes de se ligar ao receptor beta2 de IL12 e receptor alpha de IL15 de uma maneira dependente da dose em meios de cultura de célula. Como mostrado na Figura 35, IL-12/IL-15-ABDs tendo a orientação, para N-término a C-término, IL-15-ABD-IL-12, exibiu melhor aglutinação a antígeno como em comparação a IL-12-ABD-IL-15. Biespecíficos adicionais que incluem IL-15 e IL-12 são reveladas na Figura 36.
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Avaliação de IL-15-ABD-IL-12 para atividade de IL-12 e IL-15 [00280] IL-15-ABD-IL-12 foi além disso avaliado para atividade de
IL-12 e IL-15 (Figures 37 e 38).
[00281] Para avaliar atividade de IL-12, linfócitos de PBMCs que foram desencadeados são submetidos a formação de blastos por tratamento com PHA-P por quatro dias e rhIL-2 no terceiro dia. Linfoblastos foram então tratados com controle de IL-15-ABD-IL-12 ou de IL-12 por dois dias e atividade de IL-12 foi avaliada, com base em proliferação de linfoblastos e secreção de IFN-γ (Figura 37A). Atividade de IL-15 foi avaliada usando um ensaio de proliferação de linfócito T citotóxico CTLL-2 (Figura 38A).
[00282] Como mostrado na Figura 37, IL-15-ABD-IL-12 exibiu atividade de IL-12 como avaliado por proliferação de linfoblastos (Figura 37B) e IFN-γ secreção (Figura 37C). Além do mais, IL-15-ABD-IL-12 exibiu IL-15 no ensaio de proliferação de CTLL-2 (Figura 38B). Como tal, IL-15ABD-IL-12 do indivíduo exibiu ambos IL-12 e bioatividade de IL-15.
Efeitos antitumorais de IL-15-ABD-IL-12 em um modelo de melanoma de camundongo B16-F10 [00283] Sem ser vinculado a qualquer teoria de operação em particular acredita-se que IL-15/IL-12 ABDs provê atividade biológica sinérgica. Em particular, IL-12 aumenta receptor alfa IL-15, IFN-γ. Células NK/T, e imunidade a TH1, enquanto regula negativamente células Treg. IL-15 aumenta receptor beta 1 de IL-12, e células NK, enquanto reduzCD8 perda de memória celular.
[00284] Os efeitos antitumorais e capacidade de pseudossobrevivência de IL-12-ABD a IL15-ABD-IL12 foi avaliada usando em modelo de melanoma de camundongo B16-F10 (Figura 39).
[00285] Animais (7-10 semanas de idade) foram distribuídos em 8 grupos (8 animais por grupo) 10 dias após inoculação de célula tumoral B16F10 (2 x 104 célula/camundongo). Animais foram distribuídos com base no
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81/85 volume de tumor. No tempo de distribuição, o volume médio de tumor por grupo foi 100 mm3). No dia 0 (quando tumores alcançaram 100 mm3) a cada grupo foi dada uma dose única I.V. de PBS (Placebo) ou doses molares equivalentes de IL 12-ABD (1,5 ug, 5 ug, 15 ug) ou IL15-ABD-IL12 (1,7 ug, 6 ug, 17 ug).
[00286] Como mostrado na Figura 39, IL-15-ABD-IL-12 foi superior em atividade antitumoral como em comparação a IL-12-ABD no Modelo de camundongo B16-F10 em concentração molar igual. Outros estudos similares in vivo estudos mostram que IL-12 livre (5ug) em combinação com 1-15 (lug) é menos do que 50% tão potente quanto IL-15-ABD-IL-12 (6ug) (dados não mostrados).
Exemplo 6: Anti-TGFP-ABD [00287] Após biopanning e triagem conduzida usando tecnologia de ressonância de plasmas de superfície, domínios de aglutinação anti-hTGFpi foram identificados: 1A10, 1F11, 2H6, 4B9, 4C10, 4D9, 4G3, 4G6, 4H4, 4H7, e 6H11. Esses clones exibiram reatividade cruzada a hTGF32, 3 e mTGFpi e com inibição potencial da aglutinação do hTGFpi a seu receptor
II. Os clones foram subsequentemente selecionados para purificação como scFvs e caracterização adicional [00288] Os scFvs foram triados para reatividade cruzada a ΤΘΕβ-Ι de camundongo e humano usando técnicas de ELISA padrão. Aglutinação de ELISAs mostra que 2H6, 4G3, 4H7, 4B9, 4D9 & 6H11 têm boa reatividade cruzada contra ambos πϊΓΟΕβ-Ι e ΙιΤΟΕβ-1.
[00289] Aglutinação & bloqueio de ELISA foi realizado para determinar se os scFvs anti-TGFβ-l foram capazes de se ligar a ΤΘΕβ-Ι e bloquear sua interação com ΤΘΕβΚ-Π. 2H6, 4G3, 4H7, 4B9 & 4D9 todas mostram boa eficácia de bloqueio e inibição de πϊΓΟΕβ & πιΤΟΕβΚ-ΙΙ interação.
[00290] Diversos desses anti-TGFβ-l scFvs foram testados para a
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82/85 capacidade de interferir na bioatividade de ΤΘΡβ-Ι. As sequências de scFvs anti-TGFβ-l 4H7 e 4D9 são mostradas na Figuras 40A e B.
Bloqueio de Expansão induzida por TGFftl de células T regulatórias CD4+Foxp3+ [00291] Células T regulatórias (Tregs) são capazes de influenciar a homeostase do sistema imune. Tais Treg são essenciais para manter autotolerância visto que defeitos podem levar a doenças autoimunes graves. Em câncer, células Tumorais são capazes de secretar citosinas que afetam homeostase de sistema imune. Em particular, células Tumorais podem secretar ΤΟΕβ, o que pode então afetar o número de Tregs circulantes. Foi previamente demonstrado que exposição a ΤΟΕβΙ leva a uma expansão de subconjuntos Treg CD4+Foxp3+ de células T CD4+Foxp3-. Essas Tregs induzidas são então capazes de contribuir para a indução de uma resposta anérgica de célula inibindo a ativação de células T CD8+citotóxicas específicas de antígeno de tumor.
[00292] Como mostrado na Figura 41, ΤΟΕβΙ recombinante é capaz de estimular a expansão de CD4+Foxp3+ Tregs de uma população de célula T mista isolada de 4D9 doador humano saudável PBMCs. ΤΟΕβ bloqueio com anti- ΤΟΕβ 1D11 anticorpo ou o TGF-βΙ scFv 2H6, 4H7, e, no entanto, todas inibem significantemente a expansão induzida por ΤΟΕβ de CD4+Foxp3+ Tregs também de uma maneira dependente da dose. Assim, tais scFvs ΤΟΕβΙ são úteis para reduzir expansão TReg em cânceres.
Bloqueio de transição de epitelial para mesenquimal induzida por TGFftl (EMT) [00293] Exposição a ΤΟΕβ é conhecida por induzir transição de epitelial para mesenquimal. Durante esse processo, células epiteliais se diferenciam de uma folha epitelial organizada, polarizada e conectada rigidamente de células com morfologia de paralelepípedo em células desorganizadas e móveis que aparecem mesenquimal em morfologia. Durante
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EMT, a capacidade invasiva das células é ativada e assim intensifica a capacidade tumorigênica das células. E-caderina é um marcador comumente usado de células epiteliais, e é localizado nas junções de adaquinas entre células epiteliais. Perda de E-caderina é um forte marcador de EMT que é indicativo de do processo de transdiferenciação. (Figura 42A). Adicionalmente, vimentina é associada com células altamente móveis. Assim, a indução de expressão de vimentina em células é também indicativa de motilidade aumentada e invasão localizada aumentada in vivo.
[00294] Como mostrado na Figuras 42 e 43, bloqueio de TGF-β pelo anticorpo anti- ΤΟΕβ ID 11 ou o scFv TGF-β 1 reverte transição de epitelial para mesenquimal induzida por TGF-β 1 (Figura 42) e migração (Figura 43). Células 4T1 de camundongo foram cultivadas em meios crescidos suplementados com TGF-β 1 (painel 2); TGF-β 1 e 1D11 (painel 3); ou TGFβΐ e scFv anti-TGF-βΙ (painel 4), então fixadas e tingidas com anticorpo Ecaderina (verde) e anticorpo vimentina (roxo). Núcleos foram tingidos com corante de contraste com DAPI (azul). Tratamento com TGF-β 1 induziu perda de E-caderina junções de célula com célula e aumentou a expressão de vimentina. Esse efeito é revertido pela adição de 1D11 ou scFv anti-TGF-βΙ indivíduo descritos aqui (Figura 42 painéis 3 e 4). Além do mais, o scFv antiTGF-βΙ descrito aqui é capaz de bloquear Migração de célula de carcinoma mediada por TGF-β 1 (Figura 43).
[00295] Neutralização de ativação Smad induzida por TGFftl [00296] A superfamília ΤΟΕβ consiste em citosinas pleitrópicas que regulam vários processos biológicos incluindo proliferação celular, diferenciação, migração, sobrevivência celular, angiogênes, cicatrização de feridas vigilância imunogênica. Em humanos, a isoforma predominante é ΤΟΕβΙ, que é expressada em vários tipos de tecidos. ΤΟΕβ inibe a proliferação da maioria de células epiteliais normais. Adicionalmente, durante os estágios iniciais de cânceres de origem epitelial, ΤΟΕβ funciona como um
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84/85 inibidor de crescimento celular. Assim, durante iniciação do câncer, TGFp atua como um supressor de tumor. No entanto, durante estágios finais progressão de câncer, células Tumorais se tomam resistentes aos efeitos inibitórios de crescimento de ΤΘΕβ, e ΤΘΕβ assume um papel de promotor de tumor. De fato, TGFpi mostrou-se ser superexpressado em vários tumores. Ativação da via ΤΘΕβ ocorre através da aglutinação do ligante ΤΘΕβ ao receptor ΤΘΕβ tipo II (ΤβΚΙΙ), o que induz então uma associação e oligomerização entre ΤβΚΙΙ e ΤβΚΙ. Quando esse oligômero forma, Smad2 e Smad3 são recrutados e fosforilados por ΤβΚΙ. Smad2 ou Smad3 fosforilados se ligam então a Smad4 no citoplasma, e esse complexo se transloca ao núcleo onde ele interage com a região de promotor e ativa transcrição de genes alvo. Assim, a ativação da via ΤΟΡβ é mensurável pela rápida fosforilação de Smad2 após adição de ΤΟΡβ a células carenciadas por soro. No entanto, bloqueio eficaz de ΤΟΡβ inibirá fosforilação de Smad2. Aqui, a ausência de fosforilação de Smad2 pode ser usada como uma medida de bloqueio eficaz de ΤΟΡβ pelos construtos anti-TGFβ scFv do indivíduo.
[00297] Usando células humanas carenciadas por soro (Figura 44A) ou de camundongo (Figura 44B), foi determinado que adição de ΤΟΡβΙ recombinante humano (Figura 44A) ou TGF-βΙ, -β2 e -β3 de camundongo (Figura 44B) induziu fosforilação de Smad2. Tal fosforilação é reduzida de uma maneira dependente da dose quando ο ΤΟΡβ é pré-incubado com anticorpo ηηίΐ-ΤΟΡβ 1D11 de controle ou os construtos de scFv TGF-βΙ 2H6, 4H7 e 4D9. Esses dados sugerem que os construtos scFv 2H6, 4H7 e 4D9 são capazes de sequestrar ΤΘΕβ 1 e inibir sua interação com ΤβΚΙΙ/ΤβΚΙ, inibindo dessa forma a cascata de ativação de ΤΘΕβ durante câncer em estágio avançado.
anti-TGFft-l-ABD 4D9 [00298] As sequências dos construtos scFv-ABD TGF-βΙ exemplares (4D9M-A6m e 4H7-A6m), são mostradas na Figura 45A. Como mostrado na
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Figura 45B, anti-TGFP-l-ABD estendeu o scFv T Άβ de anti-TGFP-l de 106 minutos a 10,6 horas.
[00299] ScFv-ABDs anti-TGF-βΙ (bivalente para TGF-βΙ) produzido em células E. coli e HEK foram avaliados para aglutinação a albumina de soro de rato (Figura 47). Três orientações diferentes dos construtos foram avaliadas: dois scFvs anti-TGF-βΙ afixados ao terminal N do ABD (“Bi N Term”); dois scFvs anti-TGF-βΙ afixados ao terminal C do ABD (“Bi C Term); ou um scFv anti-TGF-βΙ afixado a cada um do terminal N e do terminal C do ABD (“Bi Mid”). Como mostrado na Figura 46, todos os construtos exibiram aglutinação a albumina de soro de rato. Em relação a construtos produzidos em E. coli, Bi Mid exibiu melhor aglutinação a MSA do que a orientação de N Term. Em relação a construtos produzidos em células HEK, a orientação de Bi N Term exibiu melhor aglutinação a MSA do que a orientação de Bi Mid ou Bi C term.
[00300] Como mostrado na Figura 47, inibição mediada por ΤΟΕβ-1 de proliferação de células T foi revertida (isto é, aumento da proliferação de células T) por tais construtos (Figura 46B). Além disso, mostrou-se que 4D9M-ABD bloqueia aglutinação de ΤϋΕβ-Ι humano e ΤϋΕβ-3 humano com receptores cognatos (dados não mostrados).
[00301] Todas as referências citadas são aqui expressamente incorporadas a título de referência em sua totalidade.
[00302] Enquanto que formas de modalidades particulares da invenção foram descritas acima para fins de ilustração, será apreciado por aqueles versados na técnica que numerosas variações dos detalhes podem ser feitas sem se afastar da invenção como descrito nas reivindicações anexas.

Claims (99)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de aglutinação de albumina (ABD), dito ABD compreendendo:
    a) uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2; e
    b) uma cadeia leve variável compreendendo um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  2. 2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de aglutinação de albumina como definido na reivindicação 2, em que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  4. 4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, o dito vlCDR2 compreende uma sequência vlCDR2 e o dito vlCDR3 compreende uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a sequência de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2.
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  6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito domínio de aglutinação de albumina compreende a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D).
  7. 7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de IL-15 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em K86A, K86R, N112A, N112S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/N112A/N79A, K86R/ N112A/N79A, K86A/N112A/N79D, K86R/N112A/N79D, K86A/N112A/ N79Q, K86R/N112A/N79Q, K86A/N112A/N71D, K86R/N112A/N71D, K86A/N112A/N71Q, K86R/N112A/N71Q, K86A/N112A/N71D/N79A,
    K86A/N112A/N71D/N79D, K86A/N112A/N71Q/N79A, K86A/N112A /N71Q/N79D, K86R/N112A/N71D/N79A, K86R/N112A/N71D/N79D,
    K86R/N112A/N71D/N79Q, K86R/N112A/N71Q/N79A, K86R/N112A /N71Q/N79D e K86R/N112A/N71Q/N79Q, em comparação à IL-15 parental.
  8. 8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de IL-15 como definida na reivindicação 7, em que a dita variante de IL-15 compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das variantes de IL-15 representadas graficamente na Figura 3.
  9. 9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de IL-15 como definida na reivindicação 7 ou 8, compreendendo adicionalmente um alfa do receptor de IL-15 (IL-15Ra) anexado ao dita IL15.
  10. 10. Proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD), caracterizada pelo fato de que compreende um ABD anexado a um parceiro de fusão, em que o dito ABD compreende uma cadeia pesada variável que compreende um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável compreendendo um vlCDRl, um
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    3/17 vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves varieis representadas graficamente na Figura 2.
  11. 11. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    10, caracterizada pelo fato de que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  12. 12. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    11, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências da cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
  13. 13. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, o dito vlCDR2 compreende uma sequência vlCDR2 e o dito vlCDR3 compreende uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  14. 14. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  15. 15. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável e a dita cadeia leve variável compreendem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
  16. 16. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    10, caracterizada pelo fato de que o dito parceiro de fusão é uma citocina.
  17. 17. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
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    16, caracterizada pelo fato de que a citocina é selecionada do grupo que consiste em: IL-2, IL-7, IL-1 2, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF e IFN-a.
  18. 18. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o dito parceiro de fusão é uma fração de aglutinação.
  19. 19. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    18, caracterizada pelo fato de que a dita fração de aglutinação é um scFv compreendendo uma cadeia pesada variável de scFv e uma cadeia leve variável de scFv.
  20. 20. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    19, caracterizada pelo fato de que o dito scFv é selecionado do grupo que consiste em um anti-TGFp scFv, um anti-PD-Ll scFv, um anti-TNF scFv, um anti-IL-1 scFv, um anti-IL-6 scFv, um anti-IL-8 scFv, um anti-IL-17 (A-F) scFv e um anti-IL-23 scFv.
  21. 21. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 20, caracterizada pelo fato de que o dito ABD é anexado ao dito parceiro de fusão por um ligador.
  22. 22. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é (GGGGS)X, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
  23. 23. Proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) IL-15, caracterizada pelo fato de ser de acordo com a fórmula (IL-15)L-(ABD), em que o dito ABD compreende uma cadeia pesada variável que compreende um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que compreende uma vlCDRl, um vlCDR2 e um VLCDR3 de qualquer uma da variável cadeias leves representadas graficamente na Figura 2, e
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    5/17 em que o dito L é um ligador.
  24. 24. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  25. 25. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
  26. 26. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, dito vlCDR2 compreende uma sequência vlCDR2, e o dito VLCDR3 compreende uma sequência VLCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2, e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  27. 27. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  28. 28. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável e a dita cadeia leve variável compreendem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
  29. 29. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizada pelo fato de que o dita IL-15 é uma variante de IL-15 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em K86A, K86R,
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    N112A, N112S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/N112A/N79A,
    K86R/N112A/N79A, K86A/N112A/N79D, K86R/N112A/N79D, K86A/ N112A/N79Q, K86R/N112A/N79Q, K86A/N112A/N71D, K86R/N112A /N71D, K86A/N112A/N71Q, K86R/N112A/N71Q, K86A/N112A/
    N71D/N79A, K86A/N112A/N71D/N79D, K86A/N112A/N71Q/N79A, K86A/N112A/N71Q/N79D, K86R/N112A/N71D/N79A, K86R/N112A/
    N71D/N79D, K86R/N112A/N71D/N79Q, K86R/N112A/N71Q/N79A, K86R/N112A/N71Q/N79D e K86R/N112A/N71Q/N79Q, em comparação à IL-15 parental.
  30. 30. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a dita variante de IL-15 compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das variantes de IL-15 representadas graficamente na Figura 3.
  31. 31. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a dita variante de IL-15 compreende a sequência de aminoácidos de IL-15 K86R/N112A.
  32. 32. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizada pelo fato de que a dita IL-15 é uma IL-15 de tipo selvagem.
  33. 33. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizada pelo fato de que a dita IL-15 compreende uma IL-15 de tipo selvagem ligada a um alfa do receptor de IL15 (IL-15Ra).
  34. 34. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 33, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é selecionado a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48.
  35. 35. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a
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    7/17 reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é (GGGGS)X, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
  36. 36. Proteína de fusão de ABD IL-15 de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a dita proteína de fusão de ABD IL-15 tem uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das sequências de aminoácidos representadas graficamente na Figura 4.
  37. 37. Proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD) IL-12, caracterizada pelo fato de ser de acordo com a fórmula (IL-12)L-(ABD), em que o dito ABD contém uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável compreendendo um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2, e em que o dito L é um ligador.
  38. 38. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  39. 39. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências da cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
  40. 40. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, o dito vlCDR2 compreende uma
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    8/17 sequência vlCDR2 e o dito vlCDR3 compreende uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  41. 41. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  42. 42. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável e a dita cadeia leve variável compreendem a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
  43. 43. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 42, caracterizada pelo fato de que a dita IL-12 é uma IL-12 de cadeia única compreendendo uma subunidade p35, uma subunidade p40 e um ligador de IL-12 e em que o dito ligador IL-12 aglutina covalentemente a dita subunidade p35 à dita subunidade p40.
  44. 44. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 41, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é selecionado a partir de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48.
  45. 45. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é (GGGGS)X, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
  46. 46. Proteína de fusão de ABD IL-12 de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a dita proteína de fusão de ABD IL-12 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das sequências de aminoácidos da Figura 20.
  47. 47. Proteína de fusão do domínio de aglutinação de albumina (ABD), caracterizada pelo fato de ter uma fórmula do N-terminal ao terminal
    Petição 870190079258, de 15/08/2019, pág. 102/202
    9/17
    C, selecionado do grupo que consiste em:
    a) (IL-12)-L1-(ABD)-L2-(IL-15); e
    b) (IL-15)-L1-(ABD)-L2-(IL-12), em que ABD é um domínio de aglutinação de albumina compreendendo uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2 e uma cadeia leve variável compreendendo um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves variáveis representadas graficamente na Figura 2, e em que LI e L2 são um primeiro e segundo ligadores, respectivamente.
  48. 48. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    47, caracterizada pelo fato de que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  49. 49. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    48, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
  50. 50. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, o dito vlCDR2 compreende uma sequência vlCDR2 e o dito vlCDR3 compreende uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  51. 51. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a
    Petição 870190079258, de 15/08/2019, pág. 103/202
    10/17 sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  52. 52. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    47, caracterizada pelo fato de que a dita proteína de fusão de ABD está de acordo com a dita fórmula, a partir do N-terminal até o C-terminal (IL-12)L1-(ABD)-L2-(IL-15).
  53. 53. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    47, caracterizada pelo fato de que a dita proteína de fusão de ABD está de acordo com a dita fórmula, a partir do N-terminal até o C-terminal (IL-15)L1-(ABD)-L2-(IL-12).
  54. 54. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    47, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável e cadeia leve variável compreende a cadeia pesada variável e cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D), respectivamente.
  55. 55. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 54, caracterizada pelo fato de que a dita IL-15 compreende um polipeptídeo IL-15 do tipo selvagem.
  56. 56. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 54, caracterizada pelo fato de que a dita IL-15 compreende uma IL-15 de tipo selvagem anexada a um receptor alfa de IL-15 (IL-15Ra).
  57. 57. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 54, caracterizada pelo fato de que a dita IL-15 é uma IL-15 variante compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de K86A, K86R, N112A, N112S, N112Q, K86A/N112A, K86R/N112A, K86A/N112S, K86R/N112S, K86A/N112Q, K86R/N112Q, K86A/N112A/N79A, K86R/N112A/N79A, K86A/N112A /N79D, K86R/N112A/N79D, K86A/N112A/N79Q, K86R/N112A/N79Q, K86A/N112A/N71D, K86R/N112A/N71D, K86A/N112A/N71Q, K86R
    Petição 870190079258, de 15/08/2019, pág. 104/202
    11 / 17 /N112A/N71Q, K86A/N112A/N71D/N79A, K86A/N112A/N71D/N79D, K86A/N112A/N71Q/N79A, K86A/N112A/N71Q/N79D, K86R/N112A /N71D/N79A, K86R/N112A/N71D/N79D, K86R/N112A/N71D/N79Q,
    K86R/N112A/N71Q/N79A, K86R/N112A/N71Q/N79D, e K86R/N112A /N71Q/N79Q, em comparação com uma IL-15 parental.
  58. 58. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 54, caracterizada pelo fato de que a dita IL-15 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das sequências de aminoácidos representadas graficamente na Figura 3.
  59. 59. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 58, caracterizada pelo fato de que a dita IL-12 é uma IL-12 de cadeia única compreendendo uma subunidade p35, uma subunidade p40 e um ligador de IL-12 e em que o dito ligador IL-12 aglutina covalentemente a dita subunidade p35 à dita subunidade p40.
  60. 60. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 59, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro ligador e segundo ligador são, cada um, independentemente selecionados de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48.
  61. 61. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é (GGGGS)X, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
  62. 62. Proteína de fusão de ABD, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de aglutinação de albumina (ABD), uma citocina e um ligador (L) de acordo com a fórmula (citocina)-L-(ABD), em que o dito ABD compreende uma cadeia pesada variável que compreende um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2, e uma cadeia leve variável que compreende um vlCDRl, um vlCDR2 e um VÍCDR3 de qualquer um das cadeias leves variáveis representadas graficamente na
    Petição 870190079258, de 15/08/2019, pág. 105/202
    12/17
    Figura 2, e em que a dita citocina é selecionada do grupo que consiste em IL-2, IL-7, IL-1 2, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF e IFN-a.
  63. 63. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    62, caracterizada pelo fato de que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  64. 64. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    63, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências da cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
  65. 65. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, o dito vlCDR2 compreende uma sequência vlCDR2 e o dito vlCDR3 compreende uma sequência vlCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  66. 66. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  67. 67. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 66, caracterizada pelo fato de que o dito ligador é selecionado de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48.
  68. 68. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    67, caracterizada pelo fato de que o dito ligador XXXX (GGGGS)X, em que x
    Petição 870190079258, de 15/08/2019, pág. 106/202
    13/17 é um número inteiro de 1 a 10.
  69. 69. Proteína de fusão de ABD, caracterizada pelo fato de ser de acordo com a fórmula: (FP1)-L1-(ABD)-L2-(FP2), em que ABD é um domínio de aglutinação de albumina compreendendo uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável;
    em que FP1 e FP2 são uma primeira proteína de fusão e uma segunda proteína de fusão, respectivamente;
    em que LI e L2 são um primeiro e segundo ligadores, respectivamente;
    em que a dita cadeia pesada variável do dito ABD compreende um vhCDRl, um vhCDR2 e um vhCDR3 de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis representadas graficamente na Figura 2; e onde a dita cadeia leve variável do dito ABD compreende um vlCDRl, um vlCDR2 e um vlCDR3 de qualquer uma das cadeias leves varieis representadas graficamente na Figura 2.
  70. 70. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    69, caracterizada pelo fato de que o dito vhCDRl compreende uma sequência vhCDRl, o dito vhCDR2 compreende uma sequência vhCDR2 e o dito vhCDR3 compreende uma sequência vhCDR3 de acordo com qualquer uma das sequências vhCDRl, vhCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  71. 71. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    70, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências da cadeia pesada variável representadas graficamente na Figura 2.
  72. 72. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 71, caracterizada pelo fato de que o dito vlCDRl compreende uma sequência vlCDRl, o dito vlCDR2 compreende uma sequência vlCDR2 e o dito vlCDR3 compreende uma sequência vlCDR3 de
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    14/17 acordo com qualquer uma das sequências vlCDRl, vlCDR2 e vhCDR3 representadas graficamente na Figura 2.
  73. 73. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia leve variável compreende a sequência de qualquer uma das sequências de cadeia leve variáveis representadas graficamente na Figura 2.
  74. 74. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável e a dita cadeia leve variável compreendem a cadeia pesada variável e cadeia leve variável A10m3 (Figura 2D), respectivamente.
  75. 75. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que FP1 e FP2 são uma primeira citocina e uma segunda citocina, respectivamente.
  76. 76. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que a dita primeira citocina e a dita citocina são selecionadas do grupo que consiste em:
    IL-2 e IL-12; IL-7 e IL-15, IL-15 e IL-12; IL-18 e GM-CSF; IL-21 e IL-15; GM-CSF e IL-12; GM-CSF e IL-21; e IFN-α e IL-15.
  77. 77. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que FP1 e FP2 são uma primeira fração de aglutinação e uma segunda fração de aglutinação, respectivamente.
  78. 78. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que a dita primeira fração de aglutinação e a dita segunda fração de aglutinação são cada uma scFv.
  79. 79. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação
    77, caracterizada pelo fato de que a dita primeira fração de aglutinação e a dita segunda fração de aglutinação são selecionadas do grupo que consiste em um TNF scFv e uma IL-1 scFv; um scFv de TNF e um scFv de IL-6; um scFv de TNF e um scFv de IL-8; um scFv de TNF e um scFv de IL-17 (AF de
    Petição 870190079258, de 15/08/2019, pág. 108/202
    15/17 isoformas); um scFv de TNF e um scFv de IL-23; um primeiro TNF scFv e um segundo TNF scFv; um scFv anti-PD-Ll e uma IL-12; um scFv anti-PDL1 e uma IL-15; um scFv anti-PD-Ll e um scFv anti-TGFP; um primeiro scFv anti-PD-Ll e um segundo scFv PD-L1; um scFv anti-TGFp e uma IL12; um scFv anti-TGFp e uma IL-15; um scFv anti-TGFp e um scFv PD-L1; e um primeiro anti-TGFp scFv e um segundo anti-TGFp scFv.
  80. 80. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 79, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro ligador e segundo ligador são, cada um, independentemente selecionados de qualquer um dos ligadores representados graficamente na Figura 48.
  81. 81. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro e segundo ligador são, cada um, independentemente (GGGGS)X, em que x é um número inteiro de 1 a 10.
  82. 82. Proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD), caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de aglutinação ao TGF-β e um domínio de aglutinação de albumina, em que o dito domínio de aglutinação de albumina compreende uma cadeia pesada variável de ABD e uma cadeia leve variável de ABD tendo as sequências de aminoácidos de qualquer uma das cadeias pesadas varieis e cadeias leves variáveis na Figura 2.
  83. 83. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que a dita cadeia pesada variável de ABD e a dita cadeia leve variável de ABD compreendem a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e de cadeia leve variável de A10m3 (Figura 2D), respectivamente.
  84. 84. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que o dito domínio de aglutinação a TGF é um scFv compreendendo uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de 4D9 (Figura 40B).
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    16/17
  85. 85. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, caracterizada pelo fato de que o dito ABD compreende uma IL-12, uma IL-15, um domínio de aglutinação PD-L1 ou um segundo domínio de aglutinação a TGFp.
  86. 86. Proteína de fusão de domínio de aglutinação de albumina (ABD), caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de aglutinação de PD-L1 e um domínio de aglutinação de albumina, em que o dito domínio de aglutinação de albumina envolve uma cadeia pesada variável de ABD e uma cadeia leve variável de ABD tendo as sequências de aminoácidos de qualquer uma das cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis na Figura 2.
  87. 87. Proteína de fusão de ABD de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que o dito ABD cadeia pesada variável e a dita cadeia leve variável ABD compreendem a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável e de cadeia leve variável de A10m3, respectivamente (Figura 2D).
  88. 88. Proteína de fusão de ABD de fusão de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que o dito domínio de aglutinação ao PD-L1 é um scFv que compreende uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de 10D12 (Figura 50).
  89. 89. Proteína de fusão de ABD de acordo com qualquer uma das reivindicações de 86 a 88, caracterizada pelo fato de que o dito ABD compreende adicionalmente uma IL-12, uma IL-15, um domínio de aglutinação ao TGF-β, ou um segundo domínio de aglutinação ao PD-LL
  90. 90. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica um domínio de aglutinação de albumina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
  91. 91. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica uma variante de IL-15 como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a
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    17/17
    9.
  92. 92. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de fusão de ABD como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 89.
  93. 93. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o dito ácido nucleico como definido na reivindicação 90.
  94. 94. Método para produção de um domínio de aglutinação de albumina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende realizar a cultura da dita célula hospedeira como definida na reivindicação 93 sob condições em que o dito domínio de aglutinação é produzido e recupera o dito domínio de aglutinação de albumina.
  95. 95. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o dito ácido nucleico como definido na reivindicação 91.
  96. 96. Método para preparação de uma variante de IL-15 como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende realizar a cultura da dita célula hospedeira como definida na reivindicação 95 sob condições em que a dita variante de IL-15 é produzida e recupera a variante de IL-15.
  97. 97. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o dito ácido nucleico como definido na reivindicação 92.
  98. 98. Método para produção de uma proteína de fusão de ABD como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 89, caracterizado pelo fato de que compreende realizar a cultura da dita célula hospedeira como definida na reivindicação 97 sob condições em que a dita proteína de fusão de ABD é produzida e recupera a dita proteína de fusão de ABD.
  99. 99. Método para inibição ou redução de um tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a administração ao dito indivíduo uma proteína de fusão de ABD como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 88.
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