BR112015021402B1

BR112015021402B1 - Método para isolar frações azuis de antocianina

Info

Publication number: BR112015021402B1
Application number: BR112015021402-9A
Authority: BR
Inventors: J. Christopher Johnson; Rebecca J. Robbins; Thomas M. Collins; Neda Ahmadiani; M. Monica Giusti
Original assignee: Mars, Incorporated; The Ohio State University
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2021-11-03
Also published as: US20160017150A1; CN105229084A; CN105229084B; BR112015021402A2; GB2527453B; CA2904650C; AU2014239875A1; AU2014239875B2; US20170204269A1; MX362026B; EP2986675B1; EP2986675A2; BR112015021402A8; CA2904650A1; JP5981675B2; JP2016519177A; WO2014152417A3; GB201517443D0; HK1215040A1; WO2014152417A2

Abstract

método para isolar frações azuis de antocianina a presente invenção é direcionada a um método para isolar frações de moléculas de antocianina de extratos e sucos de vegetais e frutas contendo antocianina, ou combinações dos mesmos, a um ph selecionado com base em diferenças em polaridade das moléculas de antocianina nos extratos e sucos de vegetais e frutas contendo antocianina.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um método para obter composições corantes azuis naturais contendo antocianina por isolamento seletivo de frações de moléculas de antocianina a partir de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[0002] Há um interesse crescente na indústria alimentícia por substituir materiais sintéticos para colorir alimentos por corantes naturais.

[0003] Um desafio na substituição de corantes sintéticos por corantes naturais tem sido identificar corantes naturais que fornecem características de cor similares àquelas fornecidas por corantes sintéticos.

[0004] Os corantes naturais que forneçam as mesmas características de cor que o corante azul sintético, Azul FD&C n° 1, não foram encontrados até o momento. A falta de corantes de tonalidade azul ciano naturais apropriados também tem tornado desafiador obter corantes de tonalidade verde naturais a partir da mescla de corantes azuis e amarelos naturais. A Spirulina Azul, um material derivado de alga azul esverdeado, é usada como um corante azul natural, mas não fornece as mesmas características de cor que o Azul FD&C n° 1.

[0005] As antocianinas são compostos solúveis em água encontrados nos vacúolos celulares de frutas, vegetais e pétalas de flores e, algumas vezes, raízes, folhas, caules e brácteas de plantas. Pelo menos em parte devido à sua ampla disponibilidade, extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina têm sido usados como corantes comestíveis naturais e para produzir composições de corante, em particular, composições de corante natural de tonalidade vermelha, roxa e azul.

[0006] Uma antocianina compreende uma antocianidina (a aglicona) esterificada a uma ou mais moléculas de açúcar (a(s) glicona(s)) para formar um glicosídeo. As moléculas de açúcar podem ser ligadas nas posições C-3, C-5, C-7, C-3’, C-4’ e/ou C-5’. Os exemplos de moléculas de açúcar encontradas em estruturas de antocianina são arabinose, galactose, glicose, ramnose, rutinose, sambubiose, soforose e xilose.

[0007] As antocianinas podem ser também aciladas, isto é, podem ter uma ou mais moléculas esterificadas às moléculas de açúcar, tipicamente na posição 6 de um monossacarídeo, mas também potencialmente nas posições 2, 3 ou 4. As unidades acila mais comuns incluem aquelas derivadas de ácidos coumárico, ferúlico, cafeico, sinápico, gálico, malônico, acético, málico, succínico, vanílico e oxálico.

[0008] A estrutura de uma antocianidina é mostrada abaixo na forma de cátion flavílio, que é a forma primária sob condições ácidas. A antocianidina pode ser substituída por grupos hidrogênio, hidroxila e/ou metoxila em várias posições:

em que R3 é H ou OH, R5é H, OH, ou OCH3, R6é H ou OH, R7é OH ou OCH3, R3’ é H, OH ou OCH3, R4’ é OH ou OCH3, e R5’ é H, OH ou OCH3.

[0009] As antocianidinas mais comuns na natureza são mostradas pelas estruturas a seguir:

[0010] Portanto, a classe de compostos conhecida como antocianinas abrange um número enorme de compostos estruturalmente diversos com base nas diferenças em padrões de estrutura primária, glicosilação e acilação.

[0011] As fontes vegetais conhecidas de antocianinas incluem: (1) vegetais tais como repolho vermelho, batata doce roxa, batata azul, batata vermelha, rabanete vermelho, cenoura preta, cenoura roxa, milho roxo, milho vermelho, cebola vermelha, brócolis roxo, brócolis vermelho, couve-flor roxa, ruibarbo, feijão preto, alface de folha vermelha, arroz preto e berinjela; e (2) frutas tais como morango, framboesa, amora, arando-vermelho, uva vermelha, maça, groselha-negra, groselha vermelha, cereja, mirtilo, fruto do sabugueiro, uva-do-monte, empetro negro, amora preta, arônia, groselha, açaí, nectarina, pêssego, ameixa, laranja-de-sangue e tomate azul. Cada fonte de antocianina contém diferentes quantidades de múltiplas espécies distintas de antocianina, com 15 a 30 moléculas de antocianina estruturalmente distintas sendo comuns para uma dada fonte vegetal.

[0012] As características de cor de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina mudam como um resultado de mudança de pH. Os sucos e extratos contendo antocianina, de modo geral, exibem tonalidades vermelhas em pH baixo e a tonalidade muda para roxo conforme o pH é aumentado. Apenas alguns extratos e sucos exibem uma tonalidade azul conforme o pH é mais aumentado.

[0013] A mudança em cor de sucos e extratos contendo antocianina resultante de mudanças em pH está relacionada às inúmeras estruturas secundárias de antocianinas que podem existir em equilíbrio com a estrutura primária de cátion flavílio em solução aquosa. Quando o pH é alterado, as quantidades relativas das diferentes estruturas de equilíbrio mudarão. Em um dado pH, uma ou mais formas estruturais podem predominar, enquanto outras estão presentes em quantidades baixas ou não estão presentes. Por exemplo, em pH muito baixo, a forma de cátion flavílio predomina. Conforme o pH é aumentado, as moléculas na forma de cátion flavílio podem ser desprotonadas e convertidas na forma de pseudobase carbinol, que pode ser, ainda, convertida através da perda de uma molécula de água e um próton nas formas de base quinonoidal neutra e ionizada, respectivamente e, ainda, na forma de calcona. Essas transformações efetuam a redução da quantidade de moléculas na forma de cátion flavílio e o aumento das quantidades nas outras formas de equilíbrio com intensidades diferentes. Portanto, as diferentes estruturas de equilíbrio existem em diferentes quantidades relativas a pH mais alto em comparação a pH baixo. Cada forma estrutural de antocianina pode absorver luz de modo diferente, resultando em uma cor percebida diferente, incluindo nenhuma cor. Portanto, conforme o pH da solução e alterado, as mudanças nas quantidades relativas das diferentes formas estruturais podem resultar em mudanças na cor da solução.

[0014] Cada molécula de antocianina distinta é caracterizada por seu próprio conjunto de estruturas moleculares de equilíbrio e constantes de equilíbrio para as reações que transformam uma estrutura em outra. Por exemplo, a reação que transforma uma estrutura de equilíbrio de antocianina em outra pode ter uma constante de dissociação de ácido particular, Ka, associada à mesma. A reação pode ser também discutida em termos da constante logarítmica, pKa, que é definida como - log10 Ka.

[0015] O cátion flavílio e as estruturas de base quinonoidal têm ligações conjugadas que conectam todos os três anéis das moléculas de antocianina. As ligações pi deslocalizadas extensivas permitem que o cátion flavílio e a base quinonoidal absorvam luz visível, resultando na tonalidade vermelha percebida do cátion flavílio em pH baixo e na tonalidade roxa ou azul da base quinonoidal ionizada a um pH mais alto. Em contraste, as estruturas de calcona e pseudobase carbinol não têm ligações pi deslocalizadas que conectam todos os três anéis e são incolores ou ligeiramente amarelas.

[0016] O padrão de substituição de antocianinas também afeta a cor. Por exemplo, observa-se de modo geral que a tonalidade muda de rosa para roxo quando os átomos de hidrogênio são substituídos por grupos hidroxila. Similarmente, observa-se que o número de unidades glicosila (açúcar) e o número e o tipo de unidades acila afeta a cor. No entanto, esses fenômenos não são bem entendidos ou previsíveis.

[0017] Adicionalmente, as interações intermoleculares e intramoleculares também afetam a cor da antocianina. A mesma antocianina pode produzir diferentes tonalidades dependendo das outras moléculas presentes. Por exemplo, acredita-se que grupos acila nos açúcares de antocianina podem ser adicionados e proteger a posição C-2 do cátion flavílio contra ataque nucleofílico. Portanto, essa interação intramolecular impede a formação da estrutura de pseudobase carbinol incolor. Similarmente, acredita- se que as moléculas de antocianina se autoassociam, o que é evidenciado pelo fato de que um aumento de duas vezes na concentração de antocianina pode causar um aumento de 300 vezes em saturação e pode mudar também a tonalidade e o valor. Supõe-se que essa autoassociação é similar ao empilhamento intramolecular e impede o ataque nucleofílico e a formação da estrutura de pseudobase carbinol.

[0018] Embora se saiba que todos os fatores dentre pH, estrutura química de antocianina, padrões de substituinte, interações inter e intramoleculares impactem na cor observada em extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina, não é bem entendido como esses fatores interagem para alterar a cor, isto é, a causa e o efeito específicos não são previsíveis.

[0019] Por exemplo, as moléculas individuais de antocianina foram separadas por HPLC, mas a separação ocorreu sempre em pH baixo, e as características de cor de antocianinas individuais foram analisadas em pH baixo. Similarmente, o efeito de pH nas características de cor de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina foi estudado, mas esses estudos analisaram as misturas complexas de antocianinas de ocorrência natural em sucos e extratos. De que maneira a mudança de pH afeta as características de cor de moléculas de antocianina individuais ou frações de antocianinas separadas a partir de fontes naturais, no entanto, não é bem entendido ou previsível. A técnica anterior revela que o número e os tipos de substituintes, por exemplo, os grupos açúcar e acila, impactam a cor; no entanto, não é revelado e não se sabe como esses substituintes afetam a cor conforme o pH muda. Finalmente, embora a técnica anterior sugira que várias interações inter e intramoleculares afetem a cor, não é revelado como a mudança de pH afeta essas interações inter e intramoleculares e, em último caso, a cor observada das antocianinas.

[0020] O documento WO 2009/100165 A2 revela um método para separar antocianinas de outras moléculas fenólicas no suco de frutas e vegetais contendo antocianina. O documento WO 2009/100165 A2 não revela a separação seletiva de frações de moléculas de antocianina com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas para produzir frações com uma cor desejada que é diferente do suco contendo antocianina.

[0021] A separação de antocianinas individuais em escala analítica é descrita em J. Chromatography A., 1.148 (2007), páginas 38 a 45. A separação é conduzida em pH baixo, isto é, pH inferior a 2, com o uso de HPLC a fim de auxiliar na identificação de antocianinas individuais. Esse método separa moléculas de antocianina para detecção em vez de produzir frações com misturas de antocianinas.

[0022] O documento WO 2004/012526 revela uma solução de corante azul de antocianinas de repolho vermelho a um pH de 7,9 que é usada em um xarope de açúcar para revestir núcleos de confeitaria. As antocianinas de repolho vermelho não foram separadas em frações.

[0023] Não há exemplo na técnica anterior de isolamento de frações de moléculas de antocianina de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina a um pH selecionado com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina. Adicionalmente, os métodos para obter frações de antocianina que fornecem características de cor diferentes daquelas fornecidas pelos sucos e extrato fonte não foram revelados. Em particular, a técnica anterior não descreveu um método para obter uma composição de corante contendo antocianina azul natural que fornece características de cor similares àquelas fornecidas pelo corante azul sintético, Azul FD&C n° 1.

[0024] É desejável ter uma paleta ampla de corantes naturais disponíveis para colorir alimentos. Há uma necessidade de longa data de corantes azuis naturais que forneçam características de cor similares àquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1 sintético. Portanto, um método para obter tais corantes azuis naturais a partir de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina é desejado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0025] A presente invenção é direcionada a um método para obter composições de corante azul natural contendo antocianina que fornecem características de cor similares àquelas fornecidas pelo corante azul sintético Azul FD&C n° 1. O corante azul natural contendo antocianina é obtido a partir de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina por isolamento de frações contendo uma mistura de moléculas de antocianina a um pH selecionado com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina.

[0026] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método para isolar uma fração de antocianinas a partir de um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, que compreende: a) carregar um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, em uma coluna de troca iônica; b) separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina com o uso de um solvente de pH selecionado, em que o valor de pH é pelo menos cerca de 2; e c) selecionar uma fração ou a combinação de frações contendo antocianinas separadas, de modo que as antocianinas separadas na uma fração ou na combinação de frações, quando em uma solução aquosa a pH 8,0, tenha uma absorbância máxima de 615 nm a 635 nm. A fração ou combinação de frações contendo antocianina selecionada contém antocianinas separadas que fornecem características de cor mais próximas àquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1, mas são diferentes, isto é, um subconjunto fracionado, daquele do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou a combinação dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1 mostra duas perspectivas de uma representação tridimensional das características de cor fornecidas por Azul FD&C n° 1 em espaço de cor CIE 1976 CIELAB L*a*b* como uma função de concentração em solução aquosa.

[0028] A Figura 2 mostra duas perspectivas de uma representação tridimensional das características de cor fornecidas por Azul FD&C n° 1 em espaço de cor CIE 1976 CIELCH L*C*h° como uma função de concentração em solução aquosa.

[0029] A Figura 3 representa duas perspectivas da área em espaço de cor CIE 1976 CIELAB L*a*b* de cores que diferem das cores fornecidas por Azul FD&C n° 1 por um ΔE de 3 ou menos e uma ilustração de um tubo segmentado definido pelos dados de espaço de cor.

[0030] A Figura 4 mostra uma comparação das cores fornecidas por diferentes extratos de fruta e vegetal em solução aquosa a diferentes valores de pH.

[0031] A Figura 5 mostra duas perspectivas de uma representação tridimensional das características de cor fornecidas por Azul FD&C n° 1 em espaço de cor 1976 CIELAB L*a*b* como uma função de concentração em solução aquosa assim como a área de cores que diferem das cores fornecidas pelo Azul n°. 1 por um ΔE de 3 ou menos e também mostra duas perspectivas de uma representação tridimensional das características de cor fornecidas por Spirulina Azul como uma função de concentração em solução aquosa (linha branca mais próxima ao eixo geométrico x).

[0032] A Figura 6 mostra cromatogramas de HPLC a 520 nm de detecção de solução de extrato de repolho vermelho e duas frações isoladas de solução de extrato de repolho vermelho com o uso de uma coluna de troca catiônica forte.

[0033] A Figura 7 mostra cromatogramas de HPLC a 520 nm de detecção de solução de extrato de repolho vermelho e quatro frações isoladas de solução de extrato de repolho vermelho com o uso de uma coluna de troca catiônica forte.

[0034] A Figura 8 mostra cromatogramas de HPLC a 520 nm de detecção de solução de extrato de repolho vermelho que identificam dois grupos de picos que foram alvejados para isolamento. Esses dois grupos de picos foram isolados como a “Fração de 520 nm” e a “Fração de 530 nm”.

[0035] A Figura 9 fornece uma comparação visual das cores fornecidas pelas Frações de 52 nm e 530 nm em diferentes valores de pH. A Figura 9 também permite uma comparação visual das cores fornecidas pelas Frações de 52 nm e 530 nm com a cor de um produto de confeitaria drageado com um xarope de açúcar colorido com Azul FD&C n° 1.

[0036] A Figura 10 mostra cromatogramas de HPLC a 520 nm de detecção de solução de extrato de repolho vermelho e duas frações isoladas de solução de extrato de repolho vermelho com o uso de HPLC semipreparativa. A Figura 10 mostra que as Frações de 520 nm e 530 nm contêm, cada uma, três compostos de antocianina distintos e identifica os grupos e açúcares funcionais nos compostos de antocianina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] Extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina são atualmente usados como corantes comestíveis naturais e para produzir composições de corante, em particular, composições de corante natural de tonalidade vermelha, roxa e azul. Os sucos e extratos contêm uma mistura de todas as moléculas de antocianina naturalmente presentes nas fontes de vegetais e frutas, juntamente com inúmeras outras classes de compostos. Portanto, os corantes de antocianina atualmente disponíveis são limitados àquelas cores associadas às misturas de antocianinas que existem naturalmente nas fontes de vegetais e frutas. A invenção envolve métodos para isolar misturas de moléculas de antocianina diferentes da mistura complexa de antocianinas naturalmente presente em extratos e sucos de vegetais e frutas. O método envolve isolar frações de moléculas de antocianina da mistura complexa nos sucos e extratos de vegetais e frutas a um pH selecionado com base em diferenças na carga e polaridade das moléculas de antocianina.

[0038] Um aspecto da invenção envolve isolar frações de moléculas de antocianina de extratos e sucos de fruta e vegetal contendo antocianina para obter composições de corante que fornecem características de cor almejadas específicas similares àquelas fornecidas pelo corante azul sintético, Azul FD&C n° 1. Conforme usado no presente documento, fornecer características de cor “similares” a Azul FD&C n° 1 significa que a cor está mais próxima em características de cor que qualquer outro corante natural, tal como, por exemplo, Spirulina Azul.

[0039] Os requerentes revelaram que separar antocianinas com o uso de um solvente a um pH selecionado e de diferenças em polaridade das moléculas de antocianina poderia render frações contendo misturas de antocianinas que fornecem características de cor similares àquelas fornecidas pelo corante azul sintético, Azul FD&C n° 1. Cada fonte de antocianina contém diferentes quantidades de múltiplas moléculas de antocianina distintas, e cada molécula pode existir em equilíbrio com uma ou mais estruturas secundárias. Pode haver diferenças em carga e/ou polaridade entre as diferentes moléculas de antocianina e suas estruturas moleculares de equilíbrio. Através de separação com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina a um pH selecionado, os requerentes foram capazes de isolar frações de antocianinas com características espectrais distintas de uma mistura complexa de antocianinas. As características espectrais das frações foram diferentes e não evidentes a partir das características espectrais da mistura complexa de antocianinas encontradas no suco ou extrato. Os requerentes identificaram frações de antocianina que fornecem características de cor mais próximas àquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1 sintético do que qualquer corante azul natural conhecido pode fornecer, incluindo Spirulina Azul.

[0040] Um “suco de fruta ou vegetal contendo antocianina” pode ser obtido espremendo-se líquido da fruta ou vegetal. Um “extrato de vegetal ou fruta contendo antocianina” pode ser obtido lavando-se uma fruta ou vegetal macerado com um solvente (por exemplo, água, álcool). Há sucos e extratos que contêm antocianinas, assim como muitos outros compostos de ocorrência natural, incluindo, por exemplo, carboidratos, ácidos, flavonoides, íons metálicos, ácidos fenólicos, ésteres de ácido fenólico e vitaminas. O termo “suco ou extrato de vegetal ou fruta” é equivalente à lista de termos “suco de vegetal, suco de fruta, extrato de vegetal ou extrato de fruta” e inclui sucos e extratos processados, incluindo, por exemplo, sucos e extratos reconstituídos, sucos e extratos desodorizados e sucos e extratos submetidos a outros processos para remover classes específicas ou amplas de compostos.

[0041] O “fracionamento” é o processo para selecionar e separar uma porção de antocianinas da mistura complexa de antocianinas em um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina. A fonte de antocianinas usada no método da invenção é um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina que fornece tonalidades azuis em valores altos de pH. Em algumas modalidades, a fonte de antocianinas usada no método da invenção é repolho vermelho, batata doce roxa, batata azul, cenoura roxa ou canoura preta, ou uma combinação dos mesmos.

[0042] Uma “fração” é o produto de fracionamento. Uma “fração de antocianina” contém uma mistura de antocianinas que é diferente da mistura de antocianinas no suco ou extrato contendo antocianina do qual a fração foi separada. As frações de antocianina são separadas do suco ou extrato a um pH selecionado com base nas diferenças em carga e polaridade das diferentes moléculas de antocianina presentes.

[0043] Um “pH selecionado” é um pH de 2 ou mais alto, por exemplo, um pH em uma faixa de cerca de 2 a cerca de 9, tanto no contexto de separação quanto no de realização de caracterização de cor de antocianinas. Em outas modalidades, o pH pode ser um pH de 3 ou mais alto, 4 ou mais alto, 5 ou mais alto, 6 ou mais alto, ou 7 ou mais alto, por exemplo, um pH em uma das respectivas faixas a seguir, isto é, cerca de 3 a cerca de 9, cerca de 4 a cerca de 9, cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 9 ou cerca de 7 a cerca de 9.

[0044] “Absorbância máxima”, “lambda max” ou “Àmax” é o comprimento de onda em nanômetros em que a fração máxima de luz é absorvida por uma substância. Em geral, a absorbância máxima pode ser usada como um valor característico para comparar substâncias quando medidas com um espectrofotômetro ou colorímetro de UV/Visível.

[0045] As referências a “Azul FD&C n° 1” incluem os diferentes nomes dados ao corante azul idêntico, Azul Brilhante FCF e E133 da Comissão Europeia. O lambda max de Azul FD&C n° 1 é 630 nm.

[0046] Um “corante” é qualquer substância que confere cor por absorção ou difusão de luz em diferentes comprimentos de onda. Um “corante natural” é um corante que existe em ou é produzido pela natureza ou é originado a partir da mesma. Um “corante azul” é um corante que reflete luz em comprimentos de onda na região de 450 a 495 nanômetros e tem uma absorbância de comprimento de onda UV/VIS máxima na faixa de 615 a 635 nanômetros. Um “corante natural contendo antocianina” é um corante natural que compreende antocianinas originadas de plantas.

[0047] O corante natural contendo antocianina é uma composição que pode compreender apenas antocianinas ou pode também incluir outros componentes de planta. A composição pode tomar a forma de um sólido, por exemplo, um pó, ou uma solução líquida, por exemplo, um líquido aquoso.

[0048] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método para isolar uma fração de antocianinas a partir de um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, que compreende: a) carregar um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, em uma coluna de troca iônica; b) separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina com o uso de um solvente de pH selecionado, em que o valor de pH é pelo menos cerca de 2; e c) selecionar uma fração ou a combinação de frações contendo antocianinas separadas, de modo que as antocianinas separadas na uma fração ou na combinação de frações, quando em uma solução aquosa a pH 8,0, tenha uma absorbância máxima de 615 nm a 635 nm. Em uma modalidade, a fração contendo antocianina é separada do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina com um solvente a um pH de uma faixa de cerca de 2 a cerca de 9, ou em uma das faixas a seguir, isto é, cerca de 3 a cerca de 9, cerca de 4 a cerca de 9, cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 9 ou cerca de 7 a cerca de 9.

[0049] “Tonalidade” refere-se à propriedade de cor que dá a uma cor seu nome, por exemplo, vermelho, laranja avermelhado, azul, violeta, etc.

[0050] “Saturação” é uma propriedade de cor que indica a pureza de uma cor, em que a saturação mais alta está associada à maior pureza de tonalidade e menos diluição por branco, cinza ou preto.

[0051] “Valor” é uma propriedade de cor que indica a luminosidade ou escurecimento de uma cor, em que o valor mais alto está associado a maior caráter claro.

[0052] Os termos “cor” e “características de cor” são usados de modo intercambiável e abrangem propriedades de cor, tais como tonalidade, saturação e valor, e parâmetros de sistema de modelo de cor usados para descrever essas propriedades, tais como valores L*a*b* de espaço de cor CIELAB e valores L*C*h° de espaço de cor CIELCH da Commission Internationale de l’Eclairage CIE 1976. Os modelos de cor CIELAB e CIELCH fornecem espaços de cor mais perpetuamente uniformes que modelos de cor anteriores. Os corantes são analisados com um espectrofotômetro, e os valores CIELAB L*a*b* e CIELCH L*C*h° são calculados a partir dos dados espectrais. Os valores L*a*b* e L*C*h° fornecem um meio para representar características de cor e avaliar a magnitude de diferença entre duas cores. Os valores CIELAB L*a*b* e CIELCH L*C*h° apresentados no presente documento, em todos os casos a não ser que determinado de outro modo, foram calculados a partir de dados espectrais obtidos a partir de um Espectrofotômetro CM-3500d Konica Minolta operado em modo de transmitância, com CIE Standard Illuminant D65 e ângulo de observador de 10 graus.

[0053] Os valores L*a*b* consistem em um conjunto de valores coordenados definidos em um sistema de coordenadas Cartesiano tridimensional. L* é a coordenada de valor ou luminosidade. L* fornece uma escapa de luminosidade de preto (0 unidades L*) até branco (100 unidades L*) em um eixo geométrico vertical. a* e b* são coordenadas relacionadas tanto à tonalidade quanto à saturação. a* fornece uma escala de esverdeado (- unidades a*) a avermelhado (+ unidades a*), com neutro no ponto central (0 unidades a*), em um eixo geométrico horizontal. b* fornece uma escala para azulado (- unidades b*) a amarelado (+ unidades b*), com neutro no ponto central (0 unidades b*), em um segundo eixo geométrico horizontal perpendicular ao primeiro eixo geométrico horizontal. Os três eixos geométricos cruzam-se onde L* tem um valor de 50 e a* e b* são ambos zero.

[0054] Os valores L*C*h° consistem em um conjunto de valores coordenados definidos em um sistema de coordenadas cilíndricas tridimensional. L* é a coordenada de valor ou luminosidade. L* fornece uma escala de luminosidade de preto (0 unidades L*) a branco (100 unidades L*) em um eixo geométrico longitudinal. h° é a coordenada de tonalidade. h° é especificado como um ângulo de 0° a 360° que se move no sentido anti- horário em torno do eixo geométrico L*. Vermelho puro tem um ângulo de tonalidade de 0°, amarelo puro tem um ângulo de tonalidade de 90°, verde puro tem um ângulo de tonalidade de 180°, e azul puro tem um ângulo de tonalidade de 270°. A coordenada C* representa saturação e é especificada como uma distância radial a partir do eixo geométrico L*. C* fornece uma escala de acromático, isto é, branco, cinza ou preto neutro, no eixo geométrico L* (0 unidades C*) a pureza maior de tonalidade conforme a coordenada se move para longe do eixo geométrico L* (até 100 ou mais unidades C*). C* e h° podem ser calculados a partir de a* e b* com o uso das Equações 1 e 2:

[0055] “Delta E,” “ΔEab*” ou “ΔE” é uma medida da magnitude de diferença de cor total entre duas cores representadas em espaço de cor CIELAB L*a*b*. Foi relatado que um observador de cor experiente não pode distinguir qualquer diferença entre duas cores quando o ΔE é cerca de 2,3 ou menos. O ΔE de duas cores diferentes com valores L*a*b*, L*1a*1b*1 e L*2a*2b*2, é calculado com o uso da Equação 3:

[0056] Os valores CIELAB L*a*b* e CIELCH L*C*h° de Azul FD&C n° 1 em sete concentrações diferentes em solução aquosa são apresentados na Tabela 1. Esses valores foram calculados a partir de dados espectrais obtidos com um Espectrofotômetro CM-3500d Konica Minolta com o uso das definições de transmitância. TABELA 1

[0057] Esses valores L*a*b* e L*C*h° para Azul FD&C n° 1 representam os valores alvo ideais para um corante azul natural alternativo a Azul FD&C n° 1. Poderia ser esperado que os corantes azuis naturais que têm valores L*a*b* que estão dentro de um ΔE de 2,3 ou menos a partir desses valores alvo forneçam características de cor suficientemente similares àquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1 de modo que um olho humano não poderia distinguir a diferença em cor fornecida pelo corante natural versus o sintético. Claramente, quanto mais perto os valores L*a*b* para corante azul natural chegarem dos valores alvo sintéticos (isto é, rendendo valores menores de ΔE), melhor será a substituição do corante azul natural para Azul FD&C n° 1 em uma aplicação comestível.

[0058] A Figura 1 mostra duas perspectivas de uma representação tridimensional dos valores L*a*b* para soluções aquosas de Azul FD&C n° 1 nas sete concentrações relatadas na Tabela 1, conectadas por segmentos de linha. A Figura 2 mostra duas perspectivas de uma representação tridimensional dos valores L*C*h° para soluções aquosas de Azul FD&C n° 1 nas sete concentrações relatadas na Tabela 1, conectadas por segmentos de linha.

[0059] Os modelos matemáticos podem ser gerados para representar as características de cor fornecidas por Azul FD&C n° 1 em qualquer concentração nos espaços de cor L*a*b* e L*C*h*. Por exemplo, as características de cor podem ser representadas por um modelo de linha segmentada que conecta os pontos de dados L*a*b* ou L*C*h° da Tabela 1. Uma linha (L) que conecta dois pontos (P1 e P2) que representam duas concentrações diferentes de Azul FD&C n° 1 em espaço L*a*b* podem ser calculada com a Equação 4 a seguir: L = {Pi + t * (P2 — Pi)} (4) em que P1 é (L*1, a*1, b*1); P2 é (L*2, a*2, b*2); e t é qualquer número real.

[0060] Consequentemente, um modelo de linha segmentada para Azul FD&C n° 1 em espaço de cor L*a*b* pode ser interpolado com base nos valores L*a*b* para os sete pontos de concentração diferentes com o uso da Equação 4 conforme segue:

[0061] Para concentrações entre 500 e i.000 ppm, 0 < t < i: L* = i0,49 + i3,58 * t a* = i5,82 + -6,02 * t b* = -44,99 + -i3,i9 * t

[0062] Para concentrações entre i00 e 500 ppm, 0 < t < i: L* = 24,07 + 28,36 * t a* = 9,80 + -39,37 * t b* = -58,i8 + 0,80 * t

[0063] Para concentrações entre 50 e i00 ppm, 0 < t < i: L* = 52,43 + ii,2i * t a* = -29,57 + -i4,i4 * t b* = -57,38 + 9,07 * t

[0064] Para concentrações entre i0 e 50 ppm, 0 < t < i: L* = 63,64 + 20,6i * t a* = -43,7i + 6,48 * t b* = -48,3i + 24,89 * t

[0065] Para concentrações entre 5 e i0 ppm, 0 < t < i: L* = 84,25 + 6,40 * t a* = -37,23 + i2,83 * t b* = -23,42 + 9,i4 * t

[0066] Para concentrações entre i e 5 ppm, 0 < t < i: L* = 90,65 + 7,04 * t a* = -24,40 + i7,97 * t b* = -i4,28 + i0,7i * t

[0067] O modelo de linha segmentada para Azul FD&C n° 1 em espaço L*a*b* está desenhado na Figura 1.

[0068] Adicionalmente, as cores que têm valores L*a*b* que estão dentro de uma faixa de ΔE específica do modelo de Azul FD&C n° 1 podem ser matematicamente modeladas em espaço de cor L*a*b*. Selecionar um valor ΔE específico, por exemplo, 3, em relação ao Azul FD&C n° 1 e plotar o ΔE em espaço de cor L*a*b* resulta em uma estrutura do tipo tubo em torno do modelo de Azul FD&C n° 1, conforme mostrado na Figura 3. Percebe-se que qualquer cor com um valor ΔE de cerca de 2,3 ou menos de qualquer ponto no modelo não será distinguível da cor fornecida por Azul FD&C n° 1.

[0069] Para determinar se um ponto (X0) em espaço de cor L*a*b* está dentro de um valor ΔE específico do modelo de Azul FD&C n° 1, a distância mínima, dmin, entre o ponto e o modelo (representada pelo segmento de linha X1 a X2) precisa ser calculada.

[0070] A Equação 5 pode ser usada para calcular dmin: |(x0-x1)x(x0-x2)|

[0071] em que x denota o produto cruzado de dois vetores e as barras verticais denotam a magnitude de uma expressão de vetor.

[0072] Se o valor de dmin for menor ou igual ao valor ΔE escolhido, então, o ponto em espaço de cor L*a*b* está dentro desse valor ΔE específico do modelo de Azul FD&C n° 1.

[0073] Por exemplo, pode ser determinado se Spirulina Azul fornece uma cor que tem um ΔE de 12 ou menos em comparação à cor fornecida por Azul FD&C n° 1. A Tabela 2 mostra as características de cor fornecidas por Spirulina Azul, um corante azul natural conhecido, em duas concentrações diferentes em solução aquosa: TABELA 2

[0074] O X0 para a solução de Spirulina Azul a 404,8 mg/l em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (69,97, -29,69, -43,56)

[0075] O X0 para a solução de Spirulina Azul a 206 mg/l em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (80,3, -23,97, -29,39)

[0076] X1 e X2 são dois pontos do modelo de Azul FD&C n° 1 a 10 ppm e 50 ppm de concentração em uma solução aquosa, respectivamente: X1 = (63,64, -43,71, -48,31) X2 = (84,25, -37,23, -23,24)

[0077] A dmin, calculada com o uso da Equação 5, é 12,4 para a solução de Spirulina Azul a 404,8 mg/l e 14,4 para a solução de Spirulina Azul a 206 mg/l. Portanto, as soluções de Spirulina Azul não fornecem uma cor que tem um ΔE de 12 ou menos em comparação à cor fornecida por Azul FD&C n° 1 em solução aquosa quando medida contra a linha segmentada definida pelos valores L*a*b* para 10 ppm e 50 ppm de Azul FD&C n° 1 em solução aquosa.

[0078] As características espectrais de diversas soluções diferentes de Spirulina Azul foram determinadas conforme mostrado na Tabela 3. TABELA 3 Dados de Soluções de Spirulina

Dados de Soluções de Spirulina

Os dados para Spirulina Azul foram plotados nos gráficos de cor mostrados na Figura 5 versus os dados de FD&C n° 1.

[0079] As diferenças entre as características de cor fornecidas por Spirulina Azul e Azul FD&C n° 1 são representadas na Figura 5. A Figura 5 mostra o modelo de linha segmentada das características de cor fornecidas por Azul FD&C n° 1 em espaço de cor L*a*b* em concentrações de 1 ppm a 1.000 ppm em solução aquosa, com o modelo cercado por um tubo que representa a área de cores que diferem das cores fornecidas por Azul n° 1 por um ΔE de 3 ou menos. Para comparação, a Figura 5 também mostra um modelo de linha segmentada das características de cor fornecidas por Spirulina Azul em espaço de cor L*a*b* a concentrações de 50 ppm a 400 ppm em solução aquosa. O modelo de Spirulina Azul não cruza o modelo de Azul n° 1 ou tubo associado em qualquer ponto em espaço de cor L*a*b*.

[0080] A invenção inclui selecionar uma fração ou combinação de frações que tem corantes naturais azuis contendo antocianina originadas de vegetal, fruta ou combinações dos mesmos. A fração ou a combinação de frações compreende uma mistura separada seletivamente de antocianinas, em que pelo menos uma concentração do corante em uma solução aquosa a pH de 8,0 fornece características de cor que têm um valor ΔE de 12 ou menos em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definida pelos valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C n° 1 em solução aquosa. Em outras modalidades, o valor ΔE pode ser menor do que 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3. A pelo menos uma concentração de corante pode também, se desejado, ser medida contra uma pluralidade de linhas segmentadas definidas por diferentes concentrações de Azul FD&C n° 1 em solução aquosa, por exemplo, 1 e 5 ppm, 10 ppm e 50 ppm, 50 ppm e 100 ppm, 100 ppm e 500 ppm, 500 ppm e 1.000 ppm, ou qualquer combinação selecionada das mesmas. Por exemplo, embora não exigido, a pelo menos uma concentração de um corante pode ser definida como tendo um valor ΔE de 12 ou menos para uma primeira linha segmentada a 5 ppm a 10 ppm, um valor ΔE de 8 ou menos para uma linha segmentada a 1 a 5 ppm e valor ΔE de 12 ou menos para uma linha segmentada a 10 ppm a 50 ppm. No entanto, se o valor ΔE for usado para descrever o corante da invenção, apenas uma linha segmentada é exigida para definir o corante.

[0081] Apesar de a Spirulina Azul ser o corante natural considerado como fornecedor da correlação de cor mais próxima ao Azul FD&C n° 1, o corante azul natural contendo antocianina de vegetal, fruta ou combinações dos mesmos que é uma mistura seletivamente separada de antocianinas em uma fração ou combinação de frações obtida em conformidade com o método desta invenção, é uma correlação de cor melhor. Em particular, quando pelo menos uma concentração do corante na fração selecionada ou combinação de frações está em uma solução aquosa a pH 8,0, essa solução aquosa de corante fornece características de cor correlacionadas a uma linha segmentada de Azul FD&C n° 1 com base em uma série de soluções aquosas que têm diferentes concentrações de Azul FD&C n° 1 definidas em um espaço de cor L*a*b*, em que correlação significa que a pelo menos uma concentração do corante em uma solução aquosa a pH de 8,0 tem um valor ΔE medido contra a linha segmentada de Azul FD&C n° 1 que é pelo menos uma unidade menor que um valor ΔE para uma linha segmentada de Spirulina Azul definida no mesmo espaço de cor L*a*b* com base em uma série de soluções aquosas que têm diferentes concentrações de Spirulina Azul medidas contra a linha segmentada de Azul FD&C n° 1. Em outras modalidades, o valor ΔE da pelo menos uma concentração do corante em uma solução aquosa a pH de 8,0 medido contra a linha segmentada de Azul FD&C n° 1 é pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 unidades menor que um valor ΔE para uma linha segmentada de Spirulina Azul medida contra a linha segmentada de Azul FD&C n° 1. Em ainda outras modalidades, o valor ΔE da pelo menos uma concentração do corante em uma solução aquosa a pH de 8,0 medido contra a linha segmentada de Azul FD&C n° 1 é pelo menos 7, 8, 9, 10 ou 11 unidades menor que um valor ΔE para uma linha segmentada de Spirulina Azul medida contra a linha segmentada de Azul FD&C n° 1.

[0082] Vários extratos de fruta e vegetais contendo antocianinas foram analisados para identificar uma fonte de antocianinas que poderia fornecer características de cor mais próximas àquelas fornecidas pelo corante azul sintético, Azul FD&C n° 1. A Figura 4 mostra uma comparação de seis extratos comercialmente disponíveis diferentes de repolho vermelho, batata doce roxa, cenoura preta, rabanete vermelho, milho roxo e uva em solução aquosa a cinco valores de pH diferentes. Visualmente, pode ser visto que as antocianinas de rabanete vermelho, milho roxo e uva não forneceram tonalidades azuis em solução aquosa a qualquer pH na faixa de pH 6 a pH 8. As antocianinas de repolho vermelho, batata doce roxa e cenoura preta forneceram tonalidades azuis em solução aquosa na extremidade mais alta da faixa de pH.

[0083] Qualquer suco ou extrato de fruta ou vegetal contendo antocianina que fornece tonalidades azuis a valores altos de pH pode ser usado como uma fonte de antocianinas para produzir a(s) fração(ões) de antocianina da invenção. Em algumas modalidades, a fração de antocianina é isolada de um extrato de repolho vermelho, batata doce roxa, batata azul, cenoura roxa ou canoura preta, ou uma combinação dos mesmos.

[0084] Em uma modalidade, o método envolve isolar seletivamente frações contendo antocianina de extrato de repolho vermelho para produzir um corante natural contendo antocianina que fornece características de cor similares àquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1 sintético.

[0085] As frações contendo antocianina selecionadas de sucos e extratos de fruta e vegetal contendo antocianina podem ser isoladas com o uso e uma coluna de troca iônica ou coluna de HPLC semipreparativa. Os meios de troca iônica adequados incluem meios de troca catiônica e aniônica. As colunas de HPLC semipreparativas adequadas incluem colunas C-18. Em uma modalidade, a coluna de troca iônica é ativada com um solvente apropriado para os meios de troca iônica antes do carregamento de um suco ou extrato de vegetal ou fruta.

[0086] A fração contendo antocianina é separada do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina com um solvente a um pH de pelo menos cerca de 2, de preferência, pelo menos cerca de 4. Em algumas modalidades, a fração de antocianina é separada com um solvente a um pH de cerca de 2 a cerca de 9. Em ainda outra modalidade, a fração de antocianina é separada com um solvente a um pH de cerca de 3 a cerca de 9. Em ainda outra modalidade, a fração de antocianina é separada com um solvente a um pH de cerca de 4 a cerca de 9. Em ainda outra modalidade, a fração de antocianina é separada com um solvente a um pH de cerca de 5 a cerca de 9. Em outras modalidades, a fração de antocianina é separada com um solvente a um pH de cerca de 6 a cerca de 9. Em ainda outras modalidades, a fração de antocianina é separada com um solvente a um pH de cerca de 7 a cerca de 9.

[0087] Os solventes adequados para eluir as frações contendo antocianina selecionadas incluem metanol, acetonitrila, água e misturas dos mesmos, dependendo da polaridade do meio de coluna e da solubilidade do suco ou extrato contendo antocianina. Em algumas modalidades, o solvente é uma solução aquosa de metanol.

[0088] Os agentes adequados que podem ser adicionados ao solvente para ajustar o pH incluem fosfato de potássio, hidróxido de sódio e similares.

[0089] Em ainda outra modalidade, a invenção é direcionada a um método para isolar uma segunda fração de antocianinas a partir do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, que compreende: a) separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base nas diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina com o uso de um segundo solvente de um pH selecionado, em que o valor de pH do segundo solvente é diferente do, de preferência mais alto que o, valor de pH do solvente usado para eluir a primeira fração; e b) selecionar uma segunda fração ou combinação de frações contendo antocianinas separadas, de modo que as antocianinas separadas na segunda fração ou combinação de frações, quando em uma solução aquosa a pH de 8,0, forneçam características de cor daquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1 conforme medido tendo-se uma absorbância máxima de 615 nm a 635 nm. Nessa modalidade, a primeira fração, que pode ser separada com um primeiro solvente de pH selecionado, tal como um solvente de pH de pelo menos cerca de 2, a partir da coluna de troca iônica não fornece uma mistura de antocianinas separadas que, quando em uma solução aquosa a pH de 8,0, fornece características de cor daquelas fornecidas por Azul FD&C n° 1 conforme medido tendo-se uma absorbância máxima de 615 nm a 635 nm. Em uma modalidade, a segunda fração contendo antocianina selecionada é separada do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina com um solvente a um pH de cerca de 2 a cerca de 9 ou em uma das faixas a seguir de preferência crescente, isto é, cerca de 3 a cerca de 9, cerca de 4 a cerca de 9, cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 9 ou, de preferência máxima, cerca de 7 a cerca de 9.

[0090] Frações contendo antocianinas adicionais podem ser isoladas por fracionamento adicional de uma fração contendo antocianina selecionada com o uso de uma coluna de troca iônica ou coluna de HPLC semipreparativa. Os meios de troca iônica adequados incluem meios de troca catiônica e aniônica. As colunas de HPLC semipreparativas adequadas incluem colunas C-18.

[0091] Por exemplo, em uma outra modalidade, o método de fracionamento pode compreender adicionalmente as etapas de: c) carregar a uma fração selecionada ou combinação de frações, que contêm antocianinas separadas, em uma coluna de troca iônica; d) separar seletivamente as antocianinas carregadas na coluna de troca iônica na etapa e) com base nas diferenças na carga e polaridade das moléculas de antocianina com o uso de um solvente de pH selecionado; e f) selecionar uma fração ou uma combinação de frações, que contêm antocianinas separadas, que foram separadas na etapa e) de modo que as antocianinas separadas selecionadas na etapa f), quando em uma solução aquosa em um pH 8,0, proporcionem uma absorbância máxima de 620 nm a 635 nm. Uma terceira, quarta ou ainda outra fração contendo antocianinas adicional pode ser produzida de um modo semelhante se for desejado. Em ainda outra modalidade, as antocianinas separadas selecionadas na etapa f), em pelo menos uma concentração em uma solução aquosa em pH 8,0, proporcionam características de cor que têm um valor de ΔE de 12 ou menor, em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definida pelos valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C no 1 em solução aquosa.

[0092] Em ainda outra modalidade, a etapa de separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base nas diferenças na carga e polaridade das moléculas de antocianina compreende as etapas de (i) primeiro, usar o solvente de pH selecionado para se obter uma primeira fração e (ii) usar um segundo solvente em um segundo pH selecionado, em que o valor de pH do segundo solvente é diferente do valor de pH do primeiro solvente, para se obter uma fração subsequente que é a uma fração ou obter uma combinação de uma pluralidade de frações subsequentes que é a combinação de frações, em que as antocianinas separadas na uma fração ou combinação de frações, quando em pelo menos uma concentração em uma solução aquosa em pH 8,0, proporcionam características de cor que têm um valor de ΔE de 12 ou menos em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definida pelos valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C no 1 em solução aquosa.

[0093] Em ainda outra modalidade, a etapa de separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica baseada nas diferenças na carga e polaridade das moléculas de antocianina compreende as etapas de (i) primeiro, usar o solvente de pH selecionado, que é um primeiro solvente de eluição, para se obter uma primeira fração e (ii) usar um ou mais solventes de eluição subsequentes de pH selecionado para se obter a uma fração ou combinação de frações, em que cada solvente de eluição é diferente, e a diferença pode ser independentemente selecionada a partir do grupo de pH, constituição de solvente e uma combinação dos mesmos. De preferência, o pH selecionado do primeiro solvente de eluição é mais baixo do que o pH selecionado de uma ou mais frações subsequentes. De preferência, o pH selecionado estará na faixa de cerca de 2 a cerca de 9, ou em uma das seguintes faixas crescentes em preferência, isto é, cerca de 3 a cerca de 9, cerca de 4 a cerca de 9, cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 9 ou, mais preferencialmente, cerca de 7 a cerca de 9. Em ainda outra modalidade, as antocianinas separadas na uma fração ou na combinação de frações, quando pelo menos uma concentração está em uma solução aquosa em pH 8,0, proporcionam características de cor que têm um valor de ΔE de 12 ou menos em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definidas pelos valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C no 1 em solução aquosa.

[0094] Frações de antocianina isoladas podem ser usadas como corantes, ou podem ser adicionalmente processadas, por exemplo, por purificação, concentração, desodorização ou estabilização de cor.

[0095] O método de separação seletiva pode ser executado em uma escala que produza quantidades comercialmente úteis de corantes de azul natural.

[0096] Os corantes de azul natural contendo antocianina preparados pelo método dessa invenção podem ser aplicados ou incorporados em todos os tipos de produtos comestíveis, que incluem alimentos para o consumo humano e animal, bebidas e produtos farmacêuticos. Exemplos de produtos comestíveis incluem alimentos e guloseimas para animais de estimação, alimentos secos (por exemplo, arroz, grãos e cereais), sopas e molhos, produtos de confeitaria (por exemplo, chocolates, balas com açúcar e sem açúcar de todos os tipos, goma de mascar, barras de doce e doces revestido com açúcar), produtos de sobremesa (por exemplo, pudim, recheios, glacês e coberturas), produtos de panificação (por exemplo, bolos, biscoitos do tipo cookies, bolachas e biscoitos), produtos do leite (por exemplo, iogurte, creme batido e queijo), bebidas (por exemplo, bebidas à base de leite, águas, sucos, chás e sodas), produtos de lanche (por exemplo, biscoitos do tipo cracker, barras para lanche, pretzels, e chips) e formas farmacêuticas (por exemplo, tabletes, suspensões, mastigáveis e xaropes). O corante de azul natural contendo antocianina também pode ser incorporado à composições, revestimentos e tintas de corantes de grau alimentício. Em uma modalidade, o corante azul contendo antocianina é incluído em um revestimento ou tinta aplicada a uma superfície de um produto de confeitaria. Em uma outra modalidade, o corante azul contendo antocianina é incluído em um revestimento ou tinta aplicada a uma superfície de um produto de confeitaria, em que o produto de confeitaria é um núcleo de confeitaria com um revestimento à base de açúcar com drageado macio ou drageado duro. Em ainda uma outra modalidade, o corante azul contendo antocianina é incluído em um revestimento ou tinta aplicada a uma superfície de um produto de confeitaria, em que o produto de confeitaria é um núcleo de confeitaria com um revestimento sem açúcar com drageado macio ou drageado duro.

[0097] Em uma modalidade, uma solução de extrato de repolho vermelho é fracionada com o uso de uma coluna de troca catiônica forte. Uma primeira fração é eludida com 75% em v/v de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M em pH 8 e 25% em v/v de metanol. Uma segunda fração é eludida com 30% em v/v de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M em pH 8 e 70% em v/v de metanol.

[0098] Em uma outra modalidade, uma solução de extrato de repolho vermelho é fracionada com o uso de uma coluna de troca catiônica forte. Uma primeira fração é eludida com 75% em v/v de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M em pH 6 e 25% em v/v de metanol. Uma segunda fração é eludida com 75% em v/v de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M em pH 7 e 25% em v/v de metanol. Uma terceira fração é eludida com 75% em v/v de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M em pH 8 e 25% em v/v de metanol. Uma quarta fração é eludida com 30% em v/v de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M em pH 8 e 70% em v/v de metanol.

[0099] Em uma outra modalidade, uma solução de extrato de repolho vermelho é separada com o uso de uma coluna de HPLC semipreparativa C-18.

[00100] O método de separar seletivamente frações de antocianina a partir de misturas complexas de antocianinas em sucos de vegetal e de fruta e extratos baseados nas diferenças na carga e polaridade das moléculas de antocianina produz corantes que proporcionam características de cor que são diferentes daquelas proporcionadas pelas misturas complexas.

[00101] Esse método de separar seletivamente frações de antocianina a partir de misturas complexas de antocianinas baseado nas diferenças em polaridade das moléculas de antocianina satisfaz a necessidade de longo termo para um meio de se obter corantes naturais que proporcionam características de cor semelhantes àquelas proporcionadas pelo corante sintético, Azul FD&C no 1.

[00102] Modalidades específicas da invenção serão agora demonstradas com referência aos exemplos a seguir. Deve-se compreender que exemplos são revelados somente a título de ilustração da invenção e variações dentro do espírito da invenção são antecipadas. EXEMPLO 1 FRACIONAMENTO DE EXTRATO DE REPOLHO VERMELHO COM O USO DE CARTUCHO DE TROCA CATIÔNICA FORTE

[00103] Um cartucho de extração de fase sólida de SCX (Strong Cation Exchange) da Phenomenex® (Torrance, CA) foi ativado com o uso de metanol puro. O cartucho foi lavado com o uso de 0,01% em v/v de água acidificada. Uma solução aquosa de extrato de repolho vermelho foi carregada no cartucho e lavada com 0,01% em v/v de água acidificada. Um tampão de fosfato de potássio (0,1 M) em pH 8 foi passado através do cartucho. A fração 1 foi eludida e coletada com o uso de 25% em v/v de solução de metanol em pH 8. A fração 2 foi eludida e coletada com o uso de 70% em v/v de solução de metanol em pH 8.

[00104] As frações 1 e 2 foram acidificadas com 2 a 5 ml de 88% em v/v de ácido fórmico. O metanol foi removido com o uso de um evaporador giratório.

[00105] A fim de remover quaisquer sais, a fração 1 foi carregada em um cartucho C-18 e eludida com 0,01% em v/v de água acidificada. O eluente foi coletado em 0,01% em v/v de água acidificada, e o metanol residual foi evaporado. A fração 2 também foi passada através de um cartucho C-18 com o uso do mesmo procedimento esquematizado para a fração 1.

[00106] A absorbância de comprimento de onda UV/VIS máxima e características de cor proporcionadas pela solução de extrato de repolho vermelho (RCE) e frações 1 e 2 foram analisadas em diferentes valores de pH, conforme mostrado na Tabela 4. TABELA 4

[00107] A fração 2, em pH 7,6 e pH 8,0, proporcionou valores de Àmax mais próximos àqueles do Azul FD&C no 1 sintético (Àmax = 630 nm), isto é, valores de Àmax de 616,40 e 619,40, respectivamente.

[00108] Os valores de ΔE também podem ser calculados para se compararem as características de cor proporcionadas pela fração 2, em pH 7,6 e pH 8,0, àquelas proporcionadas pelo Azul FD&C no 1 sintético. Os valores de ΔE são equivalentes às distâncias mínimas entre os pontos de cor da fração 2 em espaço de cor L*a*b* e o modelo de Azul FD&C no 1. Portanto, a equação 5 é usada para calcular os valores de dmin, ou ΔE, a partir dos seguintes dados:

[00109] O X0 para a fração 2 em pH 7,6 em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (91,62, -4,17, -5,68)

[00110] O X0 para a fração 2 em pH 8,0 em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (91,56, -5,80, -5,81)

[00111] XI e X2 são dois pontos do modelo de Azul FD&C no 1: X1 = (90,65, -24,40, -14,28) X2 = (97,69, -6,43, -3,57)

[00112] Os valores de dmin, ou ΔE, calculados são 6,7 para a fração 2, em pH 7,6, e 6,0 para a fração 2 em pH 8,0.

[00113] A Figura 6 fornece os cromatogramas de HPLC em 520 nm da solução de extrato de repolho vermelho (RCE) e frações 1 a 2. A Figura 6 mostra que a fração 2 tem uma concentração mais alta dos picos de eluição mais tardia da solução de extrato de repolho vermelho. EXEMPLO 2 FRACIONAMENTO DE EXTRATO DE REPOLHO VERMELHO COM O USO DE CARTUCHO DE TROCA CATIÔNICA FORTE E SOLVENTES DE DIFERENTES VALORES DE PH ALTO

[00114] Um cartucho de extração de fase sólida de SCX (Strong Cation Exchange) da Phenomenex® (Torrance, CA) foi usado. Um extrato de repolho vermelho diluído em 0,01% em v/v de água acidificada (10 a 15 ml) foi carregado no cartucho e lavado com 0,01% em v/v de água acidificada. Um tampão de fosfato de potássio (0,1 M) em pH 6 foi passado através do cartucho. A fração 1 foi eludida e coletada com o uso de 25% em v/v de solução de metanol em pH 6. Um tampão de fosfato de potássio (0,1 M) em pH 7 foi passado através do cartucho. A fração 2 foi eludida e coletada com o uso de 25% em v/v de solução de metanol em pH 7. Um tampão de fosfato de potássio (0,1 M) em pH 8 foi passado através do cartucho. A fração 3 foi eludida e coletada com o uso de 25% em v/v de solução de metanol em pH 8. A fração 4 foi eludida e coletada com o uso de 70% em v/v de solução de metanol em pH 8.

[00115] As frações 1 a 4 foram acidificadas com 20% em v/v de ácido fórmico. O metanol foi removido com o uso de um evaporador giratório.

[00116] A fim de lavar os sais, a fração 1 foi carregada em um cartucho C-18 cartucho e eludida com 0,01% em v/v de água acidificada. O eluente foi coletado em 0,01% em v/v de água acidificada, e o metanol residual foi evaporado. As frações 2 a 4 também foram passadas através de um cartucho C-18 cartucho com o uso do mesmo procedimento esquematizado para a fração 1.

[00117] A absorbância de comprimento de onda UV/VIS máxima e características de cor proporcionadas pela solução de extrato de repolho vermelho (RCE) e frações 1 a 4 foram analisadas em diferentes valores de pH, conforme mostrado na Tabela 5. TABELA 5

[00118] A fração 4 em pH 8,0 proporcionou um valor de Àmax mais próximo àqueles do Azul FD&C no 1 sintético (Àmax = 630 nm), isto é, um valor de Àmax de 622,2.

[00119] Um valor de ΔE também pode ser calculado para se compararem as características de cor proporcionadas pela fração 4, em pH 8,0, àquelas proporcionadas pelo Azul FD&C no 1 sintético. O valor de ΔE é equivalente à distância mínima entre os pontos de cor da fração 4 em espaço de cor L*a*b* e o modelo de Azul FD&C no 1. Portanto, a equação 5 é usada para calcular o valor de dmin, ou ΔE, a partir dos seguintes dados:

[00120] O X0 para a fração 4 em pH 8,0 em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (90,08, -7,87, -7,20)

[00121] X1 e X2 são dois pontos do modelo de Azul FD&C no 1: X1 = (90,65, -24,40, -14,28) X2 = (97,69, -6,43, -3,57)

[00122] O valor de dmin, ou ΔE, calculado é 6,7 para a fração 4 em pH 8,0.

[00123] A Figura 7 fornece os cromatogramas de HPLC em detecção de 520 nm da solução de extrato de repolho vermelho (RCE) e frações 1 a 4. A Figura 7 mostra que a fração 4 tem uma concentração mais alta dos picos de eluição mais tardia da solução de extrato de repolho vermelho. EXEMPLO 3 SEPARAÇÃO DE GRUPOS DE PICO DE EXTRATO DE REPOLHO VERMELHO COM O USO DE HPLC SEMIPREPARATIVO

[00124] As frações associadas a dois grupos específicos de picos, conforme mostrado no cromatograma da Figura 7, podem ser separadas e coletadas a partir da solução de extrato de repolho vermelho com o uso de HPLC semipreparativo. A solução de extrato de repolho vermelho foi carregada em um cartucho de HPLC semipreparativo C-18 e duas frações, a fração de 520 nm (Àmax = 524 nm) e a fração de 530 nm (Àmax = 532 nm), foram eludidas com o uso de um gradiente de acetonitrila ácida e água. A acetonitrila residual foi evaporada de cada fração com um evaporador giratório.

[00125] A caracterização de cor foi executada após o ajuste das concentrações das frações e a mistura de alíquotas de fração separadas com tampão para se produzir cinco alíquotas em pH 6, 6,6, 7, 7,6, e 8. A absorbância de comprimento de onda UV/VIS máxima e características de cor das alíquotas das frações 520 nm e 530 nm foram analisadas, e os resultados são fornecidos na Tabela 6. TABELA 6

ND indica que os espectros de absorbância da amostra não mostraram um pico máximo na faixa visível.

[00126] A fração de 530 nm tem uma absorbância máxima de cerca de 621 nm em pH 7,6 e pH 8,0 e proporciona uma Àmax mais próxima àquela do Azul FD&C no 1 sintético (Àmax = 630 nm).

[00127] Os valores de ΔE também podem ser calculados para se compararem as características de cor proporcionadas pela fração de 530 nm em pH 7,6 e pH 8,0 àquelas fornecidas pelo Azul FD&C no 1 sintético. Os valores de ΔE são equivalentes às distâncias mínimas entre os pontos de cor da fração de 530 nm em espaço de cor L*a*b* e o modelo Azul FD&C no 1. Portanto, a equação 5 é usada para calcular os valores de dmin, ou ΔE, a partir dos seguintes dados:

[00128] O X0 para a fração de 530 nm em pH 7,6 em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (87,67, -5,44, -9,90)

[00129] O X0 para a fração de 530 nm em pH 8,0 em espaço de cor L*a*b* é: X0 = (86,39, -11,79, -11,98)

[00130] Xi e X2 são dois pontos do modelo de Azul FD&C no 1: X1 = (84,25, -37,23, -23,42) X2 = (90,65, -24,40, -14,28)

[00131] Os valores de dmin, ou ΔE, calculas são 12,1 para a fração de 530 nm em pH 7,6, e 9,9 para a fração de 530 nm fração em pH 8,0.

[00132] A Figura 9 proporciona uma comparação visual entre as frações de 520 nm e 530 nm em diferentes valores de pH. A concentração da fração de 520 nm é 107,7 mg/l (Cyn-3-glu) e a concentração da fração de 530 nm é 55,6 mg/l (Cyn-3-glu). Em pH neutro e mais alto, pode ser visto que a fração de 530 nm proporciona duas a quatro vezes a saturação (conforme medido por C*) da fração de 520 nm com metade da concentração de corante.

[00133] A Figura 10 fornece os cromatograma de HPLC em detecção de 520 nm da solução de extrato de repolho vermelho e das frações de 520 nm e 530 nm. A Figura 10 indica que cada fração contém três compostos de antocianina distintos. EXEMPLO COMPARATIVO

[00134] Algumas concentrações diferentes da solução de antocianina de repolho vermelho, reveladas nos exemplos do documento WO 2004/012526, foram preparadas em pH 8,0. Nenhum fracionamento foi conduzido para separar e coletar os corantes contendo antocianina separados. A absorbância máxima das soluções resultantes foi de 610 nm. A cor não foi considerada uma equiparação adequada para a cor do Azul FD&C no 1.

Claims

1. Método para isolar uma fração de antocianinas de um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) carregar um extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, em uma coluna de troca iônica; b) separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina com o uso de um solvente de pH selecionado; e c) selecionar uma fração ou uma combinação de frações contendo antocianinas separadas, de modo que as antocianinas separadas na uma fração ou na combinação de frações, quando em uma solução aquosa a pH 8,0, tenham uma absorbância máxima na faixa de comprimento de onda de 615 nm a 635 nm.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as antocianinas separadas na uma fração ou na combinação de frações em pelo menos uma concentração em uma solução aquosa a pH de 8,0 fornecem características de cor que têm um valor ΔE de 12 ou menos em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definida por valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C n° 1 em solução aquosa.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina é selecionada a partir do grupo que consiste em repolho vermelho, batata doce roxa, batata azul, cenoura preta, cenoura roxa e combinações dos mesmos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina é repolho vermelho.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a fração contendo selecionada é separada do extrato ou suco de fruta ou vegetal contendo antocianina, ou uma combinação dos mesmos, com um solvente a um pH selecionado de 4 a 9.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que uma primeira fração contendo antocianina é eluída com uma solução de metanol a 25% em v/v a pH 8 e uma fração contendo antocianina subsequente que é a uma fração ou uma pluralidade de frações subsequentes que é a combinação de frações é eluída com uma solução de metanol a 70% em v/v a pH 8.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, ainda, uma etapa de purificar a uma fração ou a combinação de frações.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a coluna de troca iônica é uma coluna de troca catiônica.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina compreende as etapas de (i) primeiramente usar o solvente de pH selecionado para obter uma primeira fração e (ii) usar um segundo solvente de um segundo pH selecionado, em que o valor de pH do segundo solvente é diferente do valor de pH do primeiro solvente, para obter uma fração subsequente que é a uma fração ou para obter uma combinação de uma pluralidade de frações subsequentes que é a combinação de frações, em que as antocianinas separadas na uma fração ou combinação de frações, quando em pelo menos uma concentração em uma solução aquosa a pH de 8,0, fornecem características de cor que têm um valor ΔE de 12 ou menos em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definida pelos valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C n° 1 em solução aquosa.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, ainda, as etapas de: d) carregar a uma fração selecionada ou combinação de frações contendo antocianinas separadas em uma coluna de troca iônica; e) separar seletivamente as antocianinas carregadas na coluna de troca iônica na etapa d) com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina com o uso de um solvente de pH selecionado; e f) selecionar uma fração ou uma combinação de frações contendo antocianinas separadas que são separadas na etapa e) de modo que as antocianinas separadas selecionadas na etapa f), quando em uma solução aquosa a um pH de 8,0, forneçam absorbância máxima de 620 nm a 635 nm.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de separar seletivamente antocianinas na coluna de troca iônica com base em diferenças em carga e polaridade das moléculas de antocianina compreende as etapas de (i) primeiramente usar o solvente de pH selecionado que é um primeiro solvente de eluição para obter uma primeira fração e (ii) usar um ou mais solventes de eluição subsequentes de pH selecionado para obter a uma fração ou combinação de frações, em que cada solvente de eluição é diferente, e a diferença pode ser selecionada independentemente a partir do grupo de pH, constituição de solvente e uma combinação dos mesmos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que as antocianinas separadas na uma fração ou na combinação de frações, quando em pelo menos uma concentração em uma solução aquosa a pH de 8,0, fornecem características de cor que têm um valor ΔE de 12 ou menos em comparação às características de cor definidas pela linha segmentada definida pelos valores L*a*b* de 5 ppm e 10 ppm de Azul FD&C n° 1 em solução aquosa.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro solvente de eluição é uma mistura de um solvente orgânico e água a uma primeira concentração de solvente orgânico e é usado um solvente de eluição subsequente que é uma segunda mistura de um solvente orgânico e água que tem uma segunda concentração de solvente orgânico, em que a primeira concentração é diferente da segunda concentração.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro solvente de eluição tem um pH selecionado que é diferente de um pH selecionado do solvente de eluição subsequente.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH selecionado do primeiro solvente de eluição é mais baixo que o pH selecionado do solvente de eluição subsequente.