BR112015026823B1

BR112015026823B1 - Anticorpo da proteína de morte-1 programada (pd-1) isolada, composição compreendendo o mesmo e uso da composição

Info

Publication number: BR112015026823B1
Application number: BR112015026823-4A
Authority: BR
Inventors: David J. King; Marilyn Kehry
Original assignee: Anaptysbio, Inc
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2024-09-24

Abstract

POLIPEPTÍDEO DE CADEIA PESADA DE IMUNOGLOBULINA ISOLADA, POLIPEPTÍDEO DE CADEIA LEVE DE IMUNOGLOBULINA ISOLADA, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA OU PURIFICADA, VETOR AGENTE DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA DE MORTE-1 PROGRAMADA (PD-1) ISOLADA, CÉLULA ISOLADA, COMPOSIÇÃO, E USO DO AGENTE DE LIGAÇÃO DE PD-1 ISOLADA. A invenção refere-se a um polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada e um polipeptídeo de cadeia leve isolada de imunoglobulina que ligam a uma proteína de morte-1 programada (PD-1). A invenção fornece um agente de ligação PD-1 que compreende o polipeptídeo de cadeia pesada imunoglobulina, acima referidos. A invenção também proporciona vetores relacionados, composições e métodos de utilização o agente de ligação PD-1 para tratar um câncer ou uma doença infecciosa.

Description

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO ELETRONICAMENTE

[001] Incorporado por referência na sua totalidade aqui é uma sequência de nucleotídeo/aminoácido legível por computador, submetido concorrentemente com este e identificados como se segue: One 45,084 Byte ASCII (Texto) arquivo chamado de "716746_ST25.TXT", criado em 1 de Maio, 2014.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A morte 1 programada (PD-1) (também conhecida como morte celular 1 programada) é uma proteína da transmembrana do tipo I de 268 aminoácidos originalmente identificados por hibridação subtrativa de uma linha de células T de camundongo sofrendo apoptose (Ishida et al., Embo J., 11: 3887-95 (1992)). PD-1 é um membro da família CD28/CTLA-4 de reguladores de células T, e é expressa em células T, células B e células de linhagem do mielóide ativadas (Greenwald et al., Annu. Rev. Immunol., 23: 515548 (2005); and Sharpe et al., Nat. Immunol., 8: 239-245 (2007)).

[003] Dois ligantes para PD-1 foram identificados, PD ligante 1 (PD-L1) e PD ligante 2 (PD-L2), ambos dos quais pertencentes à superfamília de proteínas B7 (Greenwald et al., supra). PD-L1 é expressa numa variedade de tipos de células, incluindo células do pulmão, coração, timo, baço e rim (ver, por exemplo, Freeman et al., J. Exp. Med., 192(7): 1027-1034 (2000); and Yamazaki et al., J. Immunol., 169(10): 5538-5545 (2002)). A expressão PD-L1 é regulada ascendenetemente nos macrófagos e células dendríticas (DCs) em resposta ao tratamento com lipopolissacarídeo (LPS) e GM-CSF, e em células T e células B sobre a sinalização através de receptores de células T e de células B. PD-L1 é também expressa numa variedade de linhas de células tumorais de murino (ver, por exemplo, Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(19): 1229312297 (2002); and Blank et al., Cancer Res., 64(3): 11401145 (2004)). Em contraste, PD-L2 exibe um padrão de expressão muito mais restrito e é expresso primariamente pelas células apresentando antígeno (por exemplo, células dendríticas e macrófagos), e algumas linhas de células de tumor (ver, por exemplo, Latchman et al., Nat. Immunol., 2(3): 261-238 (2001)). Alta expressão de PD-L1 em tumores, quer na célula tumoral, estroma, ou outras células dentro do microambiente do tumor, correlaciona-se com o prognóstico clínico insatisfatório, provavelmente, por inibição das células T efetoras e células T reguladoras de regulação ascendente (Treg) no tumor.

[004] PD-1 regula negativamente a ativação de células T, e esta função inibidora está ligada a um motivo de troca baseado em imunorreceptor de tirosina (ITSM) no domínio citoplasmático (ver, por exemplo, Greenwald et al., supra; and Parry et al., Mol. Cell. Biol., 25: 9543-9553 (2005)). A deficiência de PD-1 pode levar à autoimunidade. Por exemplo, camundongos do tipo knockout (geneticamente modificado) C57BL/6 PD-1 foram mostrados desenvolver uma síndrome semelhante ao lúpus (ver, por exemplo, Nishimura et al., Immunity, 11: 141-1151 (1999)). Em seres humanos, um polimorfismo de um único nucleotídeo no gene PD-1 está associado com uma maior incidência de lúpus eritematoso sistémico, diabetes do tipo 1, artrite reumatóide, e a progressão de esclerose múltipla (ver, por exemplo, Nielsen et al., Tissue Antigens, 62(6): 492-497 (2003); Bertsias et al., Arthritis Rheum., 60(1): 207-218 (2009); Ni et al., Hum. Genet., 121(2): 223-232 (2007); Tahoori et al., Clin. Exp. Rheumatol., 29(5): 763-767 (2011); and Kroner et al., Ann. Neurol., 58(1): 50-57 (2005)). A expressão de PD-1 anormal também tem sido implicada em disfunções das células T em várias patologias, tais como a evasão imune do tumor e infecções virais crônicas (ver, por exemplo, Barber et al., Nature, 439: 682-687 (2006); and Sharpe et al., supra).

[005] Estudos recentes demonstram que a supressão de células T induzida por PD-1 também desempenha um papel na supressão da imunidade antitumoral. Por exemplo, PD-L1 é expressa numa variedade de tumores humanos e camundongos, e ligação de PD-1 para PD-L1 em tumores resulta na supressão de células T e evasão e proteção imune do tumor (Dong et al., Nat. Med., 8: 793-800 (2002)). Expressão de PD-L1 por células tumorais tem sido diretamente associada com sua resistência à lise pelas células T anti-tumorais in vitro (Dong et al., supra; and Blank et al., Cancer Res., 64: 1140-1145 (2004)). Camundongos do tipo knockout PD-1 (geneticamente modificado) são resistentes ao desafio do tumor (Iwai et al., supra; and Hirano et al., Cancer Res., 65: 1089-1096 (2005)), e as células T a partir de PD-1 knockout mice são altamente eficazes na rejeição de tumor quando transferidos adoptivamente a ratinhos portadores de tumor (em branco et al., supra). PD-1 bloqueando sinais inibitórios usando um anticorpo monoclonal pode potenciar hospedeiro imunidade anti-tumoral em camundongos (Iwai et al., supra; and Hirano et al., Cancer Res., 65: 1089-1096 (2005)), e os níveis elevados de expressão de PD-L1 em tumores estão associados com o prognóstico insatisfatório para muitos tipos de câncer humano (Hamanishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 3360-335 (2007), Brown et al., J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003); and Flies et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 84(4): 409-421 (2011)).

[006] Levando em conta o acima mencionado, as estratégias para a inibição da atividade PD-1 para tratar vários tipos de câncer e para imunopotenciação (por exemplo, para o tratamento de doenças infecciosas) foram desenvolvidas (ver, por exemplo, Ascierto et al., Clin. Cancer. Res., 19(5): 1009-1020 (2013)). A este respeito, os anticorpos monoclonais almejando PD-1 têm sido desenvolvidos para o tratamento de câncer (ver, por exemplo, Semin. Oncol., 37(5): 430-4309 (2010); and Tang et al., Current Oncology Reports, 15(2): 98-104 (2013)). Por exemplo, nivolumabe (também conhecido como BMS-936558) produziu respostas completas ou parciais em câncer de de pulmão nas células não pequenas, melanoma e câncer das células renais, em uma Fase I de ensaios clínicos (ver, por exemplo, Topalian, New England J. Med., 366: 2443-2454 (2012)), e está atualmente na Fase III de ensaios clínicos. MK-3575 é um anticorpo monoclonal humanizado direcionado contra o PD-1 que tem mostrado evidência de atividade antitumoral na Fase I de ensaios clínicos (ver, por exemplo, Patnaik et al., 2012 American Society of Clinical Oncology (ASCO) Annual Meeting, Abstract # 2512). Além disso, as evidências recentes sugerem que as terapias que PD-1 alvo podem aumentar as respostas imunológicas contra os agentes patogênicos, tais como o HIV (ver, por exemplo, Porichis et al., Curr. HIV/AIDS Rep., 9(1): 81-90 (2012)). Apesar destes avanços, no entanto, a eficácia destas terapias potenciais em seres humanos pode ser limitada.

[007] Por conseguinte, existe uma necessidade de um agente de ligação PD-1 (por exemplo, um anticorpo) que liga PD-1 com elevada afinidade e neutraliza eficazmente atividade PD-1. A invenção proporciona esses agentes de ligação PD-1.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, em que, opcionalmente, (a) resíduo 9 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, (b) um ou mais dos resíduos 7, 8 e 9 da SEQ ID NO: 2 são substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, (c) um ou mais dos resíduos 1, 2, e 5 de SEQ ID NO: 3 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, ou (d) qualquer combinação de (a) - (c).

[009] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada que compreende uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 14, em que, opcionalmente, (a) resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, (b) resíduo 8 e/ou resíduo 9 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um diferente resíduo de aminoácido, (c) resíduo 5 de SEQ ID NO: 14 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, ou (d) qualquer combinação de (a) - (c).

[0010] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada que compreende uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 20, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 21.

[0011] A invenção também proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-11, SEQ ID NOs: 15-18, e SEQ ID NOs: 22-25.

[0012] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 26 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 27.

[0013] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 31, em que, opcionalmente, o resíduo 12 de SEQ ID NO: 30 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente.

[0014] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 37, em que, opcionalmente, (a) resíduo 5 de SEQ ID NO: 36 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, e/ou (b) resíduo 4 de SEQ ID NO: 37 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente.

[0015] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, ou SEQ ID NO: 41.

[0016] Além disso, a invenção proporciona sequências de ácidos nucleicos isoladas ou purificadas que codificam polipeptídeos de imunoglobulina anterior, os vetores compreendendo tais sequências de ácidos nucleicos, agentes de ligação PD-1 isolados compreendendo os polipeptídeos da imunoglobulina anterior, sequências de ácidos nucleicos codificando tais agentes de ligação PD-1, os vetores compreendendo tais sequências de ácidos nucleicos, células isoladas compreendendo tais vetores, as composições compreendendo, tais agentes de ligação PD-1 ou esses vetores com um veículo farmaceuticamente aceitável, e métodos de tratamento de doenças cancerígenas ou infecciosas em mamíferos através da administração de quantidades eficazes de tais composições para mamíferos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 é um diagrama que ilustra esquematicamente diferentes construções de antígeno PD-1 utilizadas para gerar anticorpos monoclonais de anti-PD-1, conforme descrito no Exemplo 1.

[0018] A Figura 2 é um gráfico que ilustra os resultados experimentais demonstrando atividade aumentada de um anticorpo antagonista anti-TIM-3 em um ensaio de MLR das células T CD4+ humana, na presença de níveis baixos de anticorpo anti-PD-1 APE2058.

[0019] A Figura 3 é um gráfico que ilustra os resultados experimentais demonstrando o aumento da atividade de um anticorpo antagonista anti-LAG-3 num ensaio de MLR das células T CD4+ humana, na presença de níveis baixos de anti-PD-1 APE2058.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0020] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada e/ou um polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada, ou um fragmento (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) dos mesmos. O termo "imunoglobulina" ou "anticorpo", como aqui utilizado, refere-se a uma proteína que está presente no sangue ou outros fluidos corporais de vertebrados, que é usada pelo sistema imunológico para identificar e neutralizar objetos estranhos, tais como bactérias e vírus. O polipeptídeo é "isolado" na medida em que é removido a partir do seu ambiente natural. Numa modalidade preferida, uma imunoglobulina ou anticorpo é uma proteína que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR). As CDRs formam a "região hipervariável" de um anticorpo, que é responsável pela ligação ao antígeno (discutido mais adiante). A imunoglobulina total tipicamente consiste em quatro polipeptídeos: duas cópias idênticas de um polipeptídeo de cadeia pesada (H) e duas cópias idênticas de um polipeptídeo de cadeia leve (L). Cada cadeia pesada contém uma região variável do terminal N (VH) e três regiões constantes C-terminal (CH1, CH2, e CH3), e cada cadeia leve contém a região de uma variável N-terminal (VL) e uma região constante C-terminal (CL). As cadeias leves dos anticorpos podem ser atribuídas a um de dois tipos distintos, quer kapa (K) ou lambda (X), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Em uma imunoglobulina típica, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por pontes de dissulfureto, e as duas cadeias pesadas estão ligadas uma à outra por ligações de dissulfeto. A região variável da cadeia leve está alinhada com a região variável da cadeia pesada e a região constante da cadeia leve está alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada. As regiões constantes restantes das cadeias pesadas estão alinhadas umas com as outras.

[0021] As regiões variáveis de cada par de cadeias leve e pesada formam o local de ligação ao antígeno de um anticorpo. As regiões VH e VL têm a mesma estrutura geral, com cada região compreendendo quatro regiões de estruturas (FW ou FR). O termo "região estrutural", como aqui utilizado, refere-se às sequências de aminoácidos relativamente conservadas dentro da região variável, que estão localizadas entre as regiões hipervariáveis determinantes ou complementares (CDRs). Existem quatro regiões de estrutura de cada domínio variável, que são designadas FR1, FR2, FR3 e FR4. As regiões de formam as folhas β que fornecem a estrutura estrutural da região variável (ver, por exemplo, C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)).

[0022] As regiões de estrutura estão ligadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Como discutido acima, as três CDRs, conhecidas como CDR1, CDR2 e CDR3, formam a "região hipervariável" de um anticorpo, que é responsável pela ligação ao antígeno. As CDRs formam alças ligando, e em alguns casos compreendendo parte de, a estrutura em folha beta formada pelas regiões estruturais. Enquanto as regiões constantes das cadeias leves e pesadas não estão diretamente envolvidas na ligação do anticorpo a um antígeno, as regiões constantes podem influenciar a orientação das regiões variáveis. As regiões constantes também exibem várias funções efetoras, tais como participação na lise mediada pelo complemento ou dependente de anticorpos ou toxicidade celular dependente de anticorpo através de interações com moléculas efetoras e células.

[0023] O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada e o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada da invenção ligam-se desejavelmente a PD-1. Como discutido acima, a morte 1 programada (PD-1) (também conhecida como morte celular 1 programada) é uma proteína transmembranar do tipo com 268 aminoácidos (Ishida et al., supra). PD-1 é um membro da família CD28/CTLA-4 de reguladores de células T e é expresso em células T ativadas, células B, e células da linhagem mielóide (Greenwald et al., supra; and Sharpe et al., supra). PD-1 inclui um domínio IgV extracelular, seguido por haste curta extracelular, uma região transmembranar e uma extremidade intracelular. A extremidade intracelular contém dois locais de fosforilação localizados em um motivo inibidor baseado em imunorreceptor de tirosina e um motivo interruptor baseado em imunorreceptor de tirosina, que desempenham um papel na capacidade de PD-1 para regular negativamente a sinalização do receptor de células T (ver, por exemplo, Ishida et al., supra; and Blank et al., supra). O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada inventiva e o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada podem formar um agente que se liga a PD-1 e um outro antígeno, resultando em um agente de ligação de "duplo reativo" (por exemplo, um anticorpo duplo reativo). Por exemplo, o agente pode ligar-se a PD-1 e a outro regulador negativo do sistema imune, como, por exemplo, o gene de ativação de linfócitos 3 (LAG-3) e/ou o domínio de imunoglobulina da célula T e proteína 3 de domínio de mucina (TIM-3).

[0024] Os anticorpos que se ligam a PD-1, e os seus componentes, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente US 8,168,757;. Topalian et al., supra; and Patnaik et al., supra). Os anticorpos anti-PD-1 também estão comercialmente disponíveis a partir de fontes, tais como, por exemplo, Abcam (Cambridge, MA).

[0025] Uma "troca" ou "substituição" de aminoácido refere-se à substituição de um aminoácido numa dada posição ou resíduo por outro aminoácido na mesma posição ou resíduo dentro de uma sequência de polipeptídeo.

[0026] Os aminoácidos são amplamente agrupados como "aromático" ou "alifático". Um aminoácido aromático inclui um anel aromático. Exemplos de aminoácidos "aromáticos" incluem histidina (H ou His), fenilalanina (Phe ou F), tirosina (Y ou Tyr) e triptofano (W ou Trp). Os aminoácidos não aromáticos são agrupados como "alifático". Exemplos de aminoácidos "alifáticos" incluem glicina (G ou Gli), alanina (A ou Ala), valina (V ou Val), leucina (L ou Leu), isoleucina (I ou Ile), metionina (M ou Met), serina (S ou Ser), treonina (T ou Thr), cisteína (C ou Cys), prolina (P ou Pro), ácido glutâmico (E ou Glu), ácido aspártico (A ou Asp), asparagina (N ou Asn), glutamina (Q ou Gln), lisina (K ou Lys), e arginina (R ou Arg).

[0027] Os aminoácidos alifáticos podem ser subdivididos em quatro subgrupos. O "sub-grupo não polar alifático grande" consiste em valina, leucina, e isoleucina. O "subgrupo alifático ligeiramente polar" consiste em metionina, serina, treonina e cisteína. O "subgrupo alifático polar/carregada" consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina, glutamina, lisina, e arginina. O "pequeno subgrupo de resíduos" consiste em glicina e alanina. O grupo de aminoácidos de carga/polares pode ser subdividido em três subgrupos: o "subgrupo carregado positivamente" consistindo em lisina e arginina, o "subgrupo carregado negativamente" consistindo em ácido glutâmico e ácido aspártico e o "subgrupo polar" consistindo em asparagina e glutamina.

[0028] Os aminoácidos aromáticos podem ser subdivididos em dois subgrupos: o "subgrupo do anel de nitrogênio" consistindo em histidina e triptofano e o "subgrupo fenil" que consiste em fenilalanina e tirosina.

[0029] A substituição ou troca de aminoácidos pode ser conservativa, semi-conservativa, ou não conservativa. A frase "substituição conservativa de aminoácido" ou "mutação conservativa" refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido com uma propriedade comum. Uma forma funcional para definir as propriedades comuns entre os aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácidos entre proteínas de organismos homólogos correspondentes ((Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). De acordo com estas análises, os grupos de aminoácidos podem ser definidos em que aminoácidos dentro de um grupo trocam, de preferência, um com o outro e, portanto, assemelham-se mais no seu impacto sobre a estrutura da proteína total (Schulz e Schirmer, supra).

[0030] Os exemplos de substituições conservativas de aminoácidos incluem as substituições de aminoácidos dentro dos subgrupos acima descritos, por exemplo, lisina por arginina e vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida, ácido glutâmico por ácido aspártico e vice-versa, de modo que uma carga negativa pode ser mantida, serina para treonina, tal que um -OH livre pode ser mantido, e glutamina por asparagina, tal que uma -NH2 livre pode ser mantida.

[0031] As "mutações semi-conservativas" incluem substituições de aminoácidos dos aminoácidos dentro dos mesmos grupos listados acima, mas não dentro do mesmo subgrupo. Por exemplo, a substituição de ácido glutâmico por asparagina, ou asparagina por lisina, envolve aminoácidos dentro do mesmo grupo, mas subgrupos diferentes. "Mutações não conservativas" envolvem substituições de aminoácidos entre diferentes grupos de, por exemplo, lisina para triptofano, ou fenilalanina para serina, etc.

[0032] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3. Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácido CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, em que, opcionalmente, (a) resíduo 9 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, (b) um ou mais dos resíduos 7, 8 e 9 da SEQ ID NO: 2 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, (c) um ou mais dos resíduos 1, 2, e 5 de SEQ ID NO: 3 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente ou (d) qualquer combinação de (a) - (c). Quando o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3 e substituições opcionais de aminoácidos, componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetam significativamente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteínas, tais como biotina que facilitam a purificação ou isolamento). Quando o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina da invenção consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3 e as substituições opcionais de aminoácidos, o polipeptídeo não contém quaisquer componentes adicionais (ou seja, os componentes que não são endógenos ao polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada da invenção).

[0033] Numa modalidade da invenção, a polipeptídeo de imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que (a) o resíduo 9 da SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, (b) um ou mais dos resíduos 7, 8 e 9 da SEQ ID NO: 2 é substituído com um resíduo diferente de aminoácido, (c) um ou mais dos resíduos 1, 2, e 5 de SEQ ID NO: 3 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, ou (d) qualquer combinação de (a) - (c). Por exemplo, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que o resíduo 9 da SEQ ID NO: 1 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente e um ou mais dos resíduos 7, 8, e 9 da SEQ ID NO: 2 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Alternativamente, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 em SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que resíduo 9 da SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, um ou mais dos resíduos 7, 8 e 9 da SEQ ID NO: 2 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, e um ou mais dos resíduos 1, 2, 5 da SEQ ID NO: 3 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 em SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que um ou mais dos resíduos 1, 2, e 5 de SEQ ID NO: 3 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. Cada um resíduo 9 da SEQ ID NO: 1, resíduos 7, 8 e 9 da SEQ ID NO: 2, e os resíduos 1, 2, e 5 de SEQ ID NO: 3 pode ser substituído com qualquer resíduo de aminoácido adequado que pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. Por exemplo, o resíduo de aminoácido de uma primeira posição pode ser substituído com um primeiro resíduo de aminoácido diferente, e o resíduo de aminoácido de uma segunda posição pode ser substituído com um segundo resíduo de aminoácido diferente, em que o primeiro e o segundo resíduos de aminoácido diferente são o mesmo ou diferentes.

[0034] Numa modalidade, polipeptídeo de cadeia pesada imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 em SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que o resíduo 9 da SEQ ID NO: 1 é substituído com um resíduo de metionina (M). Noutra modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que (a) resíduo 7 de SEQ ID NO: 2 é substituído com um resíduo de asparagina (N), (b) resíduo 8 de SEQ ID NO: 2 é substituído por um resíduo serina (S), (c) resíduo 9 da SEQ ID NO: 2 é substituído com um resíduo de treonina (T), ou (d) qualquer combinação de (a) - (c). Noutra modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos CDR2 em SEQ ID NO: 2, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 3, exceto que (a) resíduo 1 da SEQ ID NO: 3 é substituído com um resíduo de ácido glutâmico (E), (b) resíduo 2 de SEQ ID NO: 3 é substituído com um resíduo de tirosina (Y), (c) resíduo 5 de SEQ ID NO: 3 é substituído com um resíduo de serina (S) ou (d) qualquer combinação de (a) - (c).

[0035] Exemplos de polipeptídeos de cadeia pesada da imunoglobulina como descrito acima pode compreender qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 11.

[0036] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 13 , e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 14, em que opcionalmente (a) resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, (b) resíduo 8 e/ou o resíduo 9 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, (c) o resíduo 5 de SEQ ID NO: 14 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, ou (d) qualquer combinação de (a) - (c). Quando o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 14 e de substituições opcionais de minoácidos, componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetam significativamente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteínas, como biotina que facilita a purificação ou isolamento). Quando o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 14 e as substituições opcionais de aminoácidos, o polipeptídeo não contém quaisquer componentes adicionais (ou seja, os componentes que não são endógenos ao polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada da invenção).

[0037] Numa modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 14, exceto que (a) resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, (b) resíduo 8 e/ou resíduo 9 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, (c) resíduo 5 de SEQ ID NO: 14 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, ou (d) qualquer combinação de (a) - (c). Por exemplo, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 em SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 14, exceto que o resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído por um resíduo de aminoácido diferente, resíduo 8 de SEQ ID NO: 13, e o resíduo 9 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Alternativamente, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 14, exceto que resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente e resíduo 5 de SEQ ID NO: 14 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 14, exceto que o resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, o resíduo 8 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, o resíduo 9 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um aminoácido diferente resíduo, e o resíduo 5 de SEQ ID NO: 14 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Cada resíduo 9 da SEQ ID NO: 12, resíduos 8 e 9 da SEQ ID NO: 13, e o resíduo 5 de SEQ ID NO: 14 podem ser substituídos por qualquer resíduo de aminoácido adequado que pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. Por exemplo, o resíduo de aminoácido de uma primeira posição pode ser substituído com um primeiro resíduo de aminoácido diferente, e o resíduo de aminoácido de uma segunda posição pode ser substituído com um segundo resíduo de aminoácido diferente, em que o primeiro e o segundo resíduos de aminoácido diferentes são o mesmo ou diferentes. Numa modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 14, exceto que o resíduo 9 da SEQ ID NO: 12 é substituído por um resíduo de leucina (L). Noutra modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 14, exceto que (a) resíduo 8 de SEQ ID NO: 13 é substituído com um resíduo de tirosina (Y), e/ou (b) resíduo 9 da SEQ ID NO: 13 é substituído com um resíduo de alanina (a). Noutra modalidade, o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos CDR2 em SEQ ID NO: 13, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 14, exceto que resíduo 5 da SEQ ID NO: 14 é substituído com um resíduo de treonina (T).

[0038] Exemplos de polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia pesada, como descritos acima podem compreender qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, ou SEQ ID NO: 18.

[0039] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 20, e uma sequência de aminoácidos CDR3 de SEQ ID NO: 21. Quando a cadeia pesada de imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 20, e uma sequência de aminoácidos CDR3 dae SEQ ID NO: 21, os componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetam significativamente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteínas, tais como biotina, que facilitam a purificação ou isolamento). Quando o polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 19, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 20, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 21, o polipeptídeo não compreende quaisquer componentes adicionais (ou seja, os componentes que não são endógenos ao polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina da invenção). Exemplos de polipeptídeos de cadeia pesada de imunoglobulina, como descritos acima podem compreender qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, ou SEQ ID NO: 25.

[0040] Além disso, um ou mais aminoácidos podem ser inseridos nos polipeptídeos acima referidos de cadeia pesada da imunoglobulina. Qualquer número de quaisquer aminoácidos apropriados podem ser inseridos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina. A este respeito, pelo menos um aminoácido (por exemplo, 2 ou mais, 5 ou mais, ou 10 ou mais aminoácidos), mas não mais do que 20 aminoácidos (por exemplo, 18 ou menos, 15 ou menos, ou 12 ou menos aminoácidos), podem ser inseridos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina. De um modo preferido, 1-10 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos) são inseridos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina. A este respeito, o(s) aminoácido(s) pode(m) ser inserido(s) em qualquer um dos polipeptídeos de cadeia pesada acima mencionados de imunoglobulina em qualquer local adequado. De preferência, o(s) aminoácido(s) é/são inserido(s) em uma CDR (por exemplo, CDR1, CDR2, ou CDR3) do polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina.

[0041] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica) a qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-11, SEQ ID NOs: 15-18, e SEQ ID NOs: 22-25. A "identidade" do ácido nucleico ou sequência de aminoácidos, tal como aqui descrita, pode ser determinada por comparação de um ácido nucleico ou sequência de aminoácido de interesse a um ácido nucleico ou sequência de aminoácidos de referência. A identidade por porcentagem é o número de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos (isto é, que são idênticos), como entre a sequência de interesse e a sequência de referência, dividida pelo comprimento da sequência mais longa (isto é, o comprimento de qualquer um da sequência de interesse ou sequência de referência, o que for maior). Certo número de algoritmos matemáticos para obter um alinhamento ótimo e o calcular a identidade entre duas ou mais sequências são conhecidas e incorporadas num certo número de programas de software disponíveis. Exemplos de tais programas incluem CLUSTAL-W, T-Coffee, e ALIGN (para o alinhamento de ácido nucleico e as sequências de aminoácidos), os programas BLAST (por exemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ, e versões posteriores dos mesmos) e os programas FASTA (por exemplo, FASTA3x, FASTM, e SSEARCH) (para alinhamento de sequências e buscas de similaridade de sequência). Algoritmos de alinhamento de sequências são também descritos em, por exemplo, Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), and Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)).

[0042] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 26 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 27. Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 26 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 27. Quando o polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 26 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 27, os componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetam significativamente o polipeptídeo (por exemplo, frações de proteínas, como biotina, que facilitam a purificação ou isolamento). Quando o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 26 e uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 27, o polipeptídeo não contém quaisquer componentes adicionais (ou seja, os componentes que não são endógenos ao polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina inventiva). Polipeptídeos exemplificativos de cadeia leve de imunoglobulina como descritos acima pode compreender SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.

[0043] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina isolada compreende uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) de SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 31. Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 de SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 31, em que, opcionalmente, o resíduo 12 de SEQ ID NO: 30 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Quando o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 31 e substituições opcionais de aminoácidos, os componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetam substancialmente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteínas, tais como biotina que facilitam a purificação ou isolamento). Quando o polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina da invenção consiste em uma sequência de aminoácidos de CDR1 de SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 31 e substituições opcionais de aminoácidos, o polipeptídeo não contém quaisquer componentes adicionais (isto é, componentes que não são endógenos ao polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção).

[0044] A este respeito, por exemplo, o polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 31, exceto que o resíduo 12 da SEQ ID NO: 30 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Resíduo 12 da SEQ ID NO: 30 pode ser substituído com qualquer resíduo de aminoácido apropriado. Numa modalidade, o polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 30 e uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 31, exceto que o resíduo 12 da SEQ ID NO: 30 é substituído com um resíduo de treonina (T). Exemplos de polipeptídeos de cadeia leve de imunoglobulina, como descritos acima podem compreender qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34.

[0045] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina isolada que compreende uma sequência de aminoácidos da região 1 determinante de complementaridade (CDR) da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37. Numa modalidade, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 de SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37, em que, opcionalmente, (a) resíduo 5 de SEQ ID NO: 36 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, e/ou (b) resíduo 4 de SEQ ID NO: 37 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Quando o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37 e substituições de aminoácidos opcionais, componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetam significativamente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteínas, como biotina, que facilitam a purificação ou isolamento). Quando o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção consiste em uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37 e as substituições de aminoácidos opcionais, o polipeptídeo não contém quaisquer componentes adicionais (ou seja, os componentes que não são endógenos ao polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção). A este respeito, por exemplo, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolado pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37. Em alternativa, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada pode compreender uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37, exceto que (a) o resíduo 5 da SEQ ID NO: 36 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente, e/ou (b) resíduo 4 da SEQ ID NO: 37 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente. Cada resíduo 5 da SEQ ID NO: 36 e resíduo 4 da SEQ ID NO: 37 podem ser substituídos por qualquer resíduo de aminoácido adequados que podem ser o mesmo ou diferente em cada posição. Por exemplo, o resíduo de aminoácido de uma primeira posição, pode ser substituído com um primeiro resíduo de aminoácido diferente, e o resíduo de aminoácido de uma segunda posição, pode ser substituído com um segundo resíduo de aminoácido diferente, em que o primeiro e segundo resíduos de aminoácido diferente são os mesmos ou diferentes.

[0046] Numa modalidade, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolado compreende uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ ID NO: 36, e uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ ID NO: 37, exceto que (a) o resíduo 5 da SEQ ID NO: 36 é substituído por um resíduo de leucina (L), e/ou (b) resíduo 4 da SEQ ID NO: 37 é substituído por um resíduo de asparagina (N). Exemplos de polipeptídeos de cadeia leve de imunoglobulina, como descrito acima pode compreender qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, ou SEQ ID NO: 41.

[0047] Além disso, um ou mais aminoácidos podem ser inseridos nos polipeptídeos de cadeia leve de imunoglobulina acima mencionados. Qualquer número de quaisquer aminoácidos apropriados pode ser inserido na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina. A este respeito, pelo menos um aminoácido (por exemplo, 2 ou mais, 5 ou mais, ou 10 ou mais aminoácidos), mas não mais de 20 aminoácidos (por exemplo, 18 ou menos, 15 ou menos, ou 12 ou menos aminoácidos), podem ser inseridos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina. De um modo preferido, 1-10 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos) são inseridos para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina. A este respeito, o(s) aminoácido(s) pode(m) ser inserido(s) em qualquer um dos polipeptídeos de cadeia leve de imunoglobulina, acima mencionados, em qualquer local adequado. De preferência, o(s) aminoácido(s) é/são inseridos em uma CDR (por exemplo, CDR1, CDR2, ou CDR3) do polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina.

[0048] A invenção proporciona um polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica) a qualquer uma das SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, e SEQ ID NO: 41. A "identidade" do ácido nucleico ou da sequência de aminoácidos, como aqui descrita, pode ser determinada utilizando os métodos aqui descritos.

[0049] A invenção proporciona um agente de ligação de morte 1 programada (PD-1) isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas sequências de aminoácidos isoladas da invenção aqui descritas. Por agente de ligação de "morte 1 programada (PD-1)" entende-se uma molécula, de preferência, uma molécula proteinácea, que se liga especificamente a proteína de morte 1 programada (PD-1). De preferência, o agente de ligação de PD-1 é um anticorpo ou um fragmento deste (por exemplo, fragmento imunogênico). O agente de ligação de PD-1 isolado da invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consiste no polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina isolada da invenção e/ou o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina isolada da invenção. Numa modalidade, o agente de ligação de PD-1 isolado compreende, consiste essencialmente em, ou consiste no polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção ou polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção. Numa outra modalidade, o agente de ligação da PD-1 isolada compreende, consiste essencialmente em, ou consiste no polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina da invenção e no polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção.

[0050] A invenção não se limita a um agente de ligação de PD-1 isolado que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina e/ou polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina possuindo substituições, inserções e/ou deleções dos resíduos de aminoácidos específicos aqui divulgados. Com efeito, qualquer resíduo de aminoácido do polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina da invenção e/ou o polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina da invenção podem ser substituídos, em qualquer combinação, com um resíduo de aminoácido diferente, ou pode ser suprimido ou inserido, desde que a atividade biológica do agente de ligação PD-1 seja aumentada ou melhorada como resultado das substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos. A "atividade biológica" de um agente de ligação de PD-1 refere-se a, por exemplo, afinidade de ligação para PD-1 ou um particular, epítopo PD-1, neutralização ou inibição da ligação da proteína PD-1 aos seus ligantes PD-L1 e PD-L1, neutralização ou inibição da atividade da proteína de PD-1 in vivo (por exemplo, IC50), da farmacocinética e da reatividade cruzada (por exemplo, com os homólogos não humanos ou ortólogos da proteína PD-1, ou com outras proteínas ou tecidos). Outras propriedades biológicas ou características de um agente de ligação ao antígeno reconhecidas na técnica incluem, por exemplo, avidez, seletividade, solubilidade, dobramento, imunotoxicidade, expressão, e formulação. As propriedades mencionadas ou características podem ser observadas, medidas e/ou avaliadas utilizando técnicas padrões incluindo, mas não se limitando a, ELISA, ELISA competitiva, análise de ressonância de plasma de superfície (BIACORE™), ou KINEXA™, ensaios de neutralização in vitro ou in vivo, ensaios de ligação de ligante do receptor, uma citoquina ou produção de fator de crescimento e/ou ensaios de secreção, e ensaios de transdução de sinal e imunoistoquímicos.

[0051] Os termos "inibir" ou "neutralizar" como aqui usados no que diz respeito à atividade de um agente de ligação de PD-1, referem-se à capacidade de antagonizar substancialmente, proibir, prevenir, restringir, diminuir, interromper, alterar, eliminar, parar ou reverter a progressão, ou a severidade, por exemplo, da atividade biológica com uma proteína PD-1, ou uma doença ou condição associada com uma proteína de PD-1. O agente de ligação de PD-1 isolado da invenção, de preferência, inibe ou neutraliza à atividade de uma proteína PD-1 em, pelo menos, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 100%, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores precedentes.

[0052] O agente de ligação de PD-1 isolado da invenção pode ser um anticorpo completo, como aqui descrito, ou um fragmento de anticorpo. Os termos "fragmento de um anticorpo", "fragmento de anticorpo" e "fragmento funcional de um anticorpo" são aqui utilizados indiscriminadamente para significar um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (ver, geralmente, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). O agente de ligação de PD-1 isolado pode conter qualquer fragmento de anticorpo de ligação PD-1. O fragmento de anticorpo compreende desejavelmente, por exemplo, uma ou mais CDRs, a região variável (ou porções das mesmas), a região constante (ou porções das mesmas), ou suas combinações. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente que consiste em VL, VH, CL, e os domínios CH1, (ii) um fragmento F(ab')2, que é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobra, (iii) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (iv) um fragmento Fab', o que resulta de quebrar a ponte de dissulfeto de um fragmento F(ab')2 utilizando condições redutoras suaves, (v) um fragmento Fv estabilizado por dissulfeto Fv (dsFv), e (vi) um anticorpo de domínio (dAb), que é um polipeptídeo do domínio de região variável de anticorpo único (VH ou VL) que se liga especificamente ao antígeno.

[0053] Em modalidades onde o agente de ligação de PD-1 isolado compreende um fragmento de polipeptídeo da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina, o fragmento pode ser de qualquer tamanho, desde que o fragmento se ligue, e preferencialmente iniba a atividade de uma proteína de PD-1. A este respeito, um fragmento do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina compreende desejavelmente entre cerca de 5 e 18 (por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , ou uma faixa definida por dois valores quaisquer dos anteriores) aminoácidos. Do mesmo modo, um fragmento do polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina compreende desejavelmente entre cerca de 5 e 18 (por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou uma faixa definida por dois quaisquer dos valores anteriores) aminoácidos.

[0054] Quando o agente de ligação de PD-1 é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende desejavelmente uma região constante da cadeia pesada (Fc) de qualquer classe adequada. De um modo preferido, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que é baseada em anticorpos IgG1, IgG2, ou IgG4 do tipo selvagem, ou suas variantes.

[0055] O agente de ligação de PD-1 também pode ser um fragmento de anticorpo de cadeia única. Exemplos de fragmentos de anticorpo de cadeia simples incluem, mas não estão limitados a, (i) um Fv de cadeia simples (scFv), que é uma molécula monovalente consistindo nos dois domínios do fragmento Fv (isto é, VL e VH) ligado por um ligante sintético que permite que os dois domínios para ser sintetizado como uma cadeia de polipeptídeo simples (ver, por exemplo, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) e (ii) um diacorpo, que é um dímero de cadeias polipeptídicas, em que cada cadeia polipeptídica compreende uma VH ligado a uma VL por um ligante peptídico que é demasiadamente curto para permitir o emparelhamento entre os domínios VH e VL na mesma cadeia de polipeptídeo, assim, dirigindo o emparelhamento entre os domínios complementares de cadeias polipeptídicas diferentes VH-VL para gerar uma molécula dimérica possuindo dois locais de ligação ao antígeno funcional. Os fragmentos de anticorpos são conhecidos na técnica e são descritos em maiores detalhes em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2009/0093024 A1.

[0056] O agente de ligação PD-1 isolado também pode ser um intracorpo ou um fragmento deste. Um intracorpo é um anticorpo que é expresso e que funciona intracelularmente. Os intracorpos, tipicamente, não têm ligações de dissulfeto e são capazes de modular a expressão ou atividade de genes alvo através da sua atividade de ligação específica. Os intracorpos incluem fragmentos de domínio simples, tais como domínios isolados VH e VL e scFvs. Um intracorpo pode incluir sinais de sobrecarga subcelulares ligados ao terminal N ou C do intracorpo para permitir a expressão em concentrações elevadas nos compartimentos subcelulares onde uma proteína alvo está localizada. Após a interação com um gene alvo, um intracorpo modula a função da proteína alvo e/ou atinge geneticamente (knockout) modificado na forma fenotípica/funcional através de mecanismos, tais como a acelerar a degradação da proteína alvo e sequestrar a proteína alvo num compartimento subcelular não fisiológico. Outros mecanismos de inativação de genes mediada por intracorpo podem depender do epítopo ao qual o intracorpo é dirigido, como a ligação para o sítio catalítico em uma proteína alvo ou a epítopos que estão envolvidos nas interações proteína-proteína, proteína-DNA, ou proteína- RNA.

[0057] O agente de ligação PD-1 isolado também pode ser um conjugado de anticorpo. A este respeito, o agente de ligação PD-1 isolado pode ser um conjugado de (1) um anticorpo, uma plataforma alternativa, ou fragmentos dos mesmos, e (2) uma proteína ou uma porção de não proteína compreendendo o agente de ligação PD-1. Por exemplo, o agente de ligação PD-1 pode ser a totalidade ou parte de um anticorpo conjugado com um peptídeo, uma molécula fluorescente, ou um agente quimioterapêutico.

[0058] O agente de ligação PD-1 pode ser isolado, ou pode ser obtido a partir de um anticorpo humano, um anticorpo não humano, ou um anticorpo quimérico. Por "quimérico" significa um anticorpo ou fragmento do mesmo que compreende ambas as regiões humanas e não humanas. De preferência, o agente de ligação de PD-1 isolado é um anticorpo humanizado. Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo monoclonal compreendendo uma plataforma do anticorpo humano e pelo menos uma CDR obtida ou derivada de um anticorpo não humano. Os anticorpos não humanos incluem anticorpos isolados a partir de qualquer animal não humano, tal como, por exemplo, um roedor (por exemplo, um camundongo ou rato). Um anticorpo humanizado pode compreender, uma, duas, ou três CDR obtidas ou derivadas de um anticorpo não humano. Numa modalidade preferida da invenção, CDRH3 do agente de ligação de PD-1 da invenção é obtida ou derivada de um anticorpo monoclonal de camundongo, enquanto que as regiões variáveis restantes e a região constante do agente de ligação de PD-1 da invenção são obtidas ou derivadas de um anticorpo monoclonal humano.

[0059] Um anticorpo humano, um anticorpo não humano, um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado pode ser obtido por qualquer meio, incluindo via fontes in vitro (por exemplo, um hibridoma ou uma linha celular que produz um anticorpo de forma recombinante) e fontes in vivo (por exemplo, roedores). Os métodos para a geração de anticorpos são conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); and Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Em certas modalidades, um anticorpo humano ou um anticorpo quimérico pode ser gerado usando um animal transgênico (por exemplo, um camundongo), em que um ou mais genes de imunoglobulina endógenos são substituídos com um ou mais genes de imunoglobulina humana. Exemplos de camundongos transgênicos, em que os genes de anticorpos endógenos são eficazmente substituídos por genes de anticorpos humanos incluem, mas não estão limitados a, o Medarex HUMAB-MOUSE™, o Kirin TC MOUSE™, e o Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (ver, por exemplo, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), and Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)). Um anticorpo humanizado pode ser gerado utilizando qualquer método adequado conhecido na técnica (ver, por exemplo, An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009)), incluindo, por exemplo, enxerto de CDRs não humanas num suporte de anticorpo humano (ver, por exemplo, Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34 (2005); and Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). Numa modalidade, um anticorpo humanizado pode ser produzido utilizando os métodos descritos em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2011/0287485 A1.

[0060] Numa modalidade preferida, o agente de ligação PD-1 se liga a um epítopo de uma proteína PD-1, que bloqueia a ligação de PD-1 e PD-L1. A invenção também proporciona um epítopo isolado ou purificado de uma proteína PD-1, que bloqueia a ligação de PD-1 e PD-L1 de um modo indireto ou alostérico.

[0061] A invenção também proporciona um ou mais sequências de ácidos nucleicos isoladas ou purificadas que codificam o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção, e o agente de ligação de PD-1 da invenção.

[0062] O termo "sequência de ácido nucleico" pretende abranger um polímero de DNA ou RNA, ou seja, um polinucleotídeo, que pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla e que pode conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo", como aqui utilizado, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA). Estes termos referem-se à estrutura primária da molécula e, portanto, incluem DNA de cadeia dupla e simples, e RNA de cadeia dupla e simples. Os termos incluem, como equivalentes, análogos ou de RNA ou de DNA fabricados a partir de análogos de nucleotídeos e polinucleotídeos modificados, tal como, embora não se limitando a, polinucleotídeos metilados e/ou cobertos. Os ácidos nucleicos estão, geralmente, ligados através das ligações de fosfato para formar sequências de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, embora muitas outras ligações sejam conhecidas na técnica (por exemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, e semelhantes). Sequências de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos da cadeia pesada da imunoglobulina da invenção incluem, por exemplo, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, e SEQ ID NO: 55. As sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos da cadeia leve de imunoglobulina da invenção incluem, por exemplo, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, e SEQ ID NO: 64.

[0063] A invenção proporciona ainda um vetor compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo da cadeia leve da imunoglobulina da invenção, e/ou o agente de ligação PD- 1 da invenção. O vetor pode ser, por exemplo, um plasmídeo, epissoma, cosmídeo, vetor viral (por exemplo, retroviral ou adenoviral) ou um fago. Vetores e métodos adequados de preparação de vetor são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).

[0064] Em adição à sequência de ácido nucleico codificando para o polipeptídeo da cadeia pesada da imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina da invenção, e/ou o agente de ligação de PD-1 da invenção, o vetor compreende, preferivelmente, sequências de controle de expressão, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, locais internos de entrada de ribossoma (IRES), e semelhantes, que proporcionam para a expressão da sequência de codificação numa célula hospedeira. Exemplos de sequências de controle de expressão são conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0065] Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, indutíveis e reprimíveis a partir de uma variedade de diferentes fontes são bem conhecidos na técnica. Fontes representativas de promotores incluem, por exemplo, vírus, mamíferos, insetos, plantas, leveduras e bactérias, e promotores adequados a partir destas fontes são prontamente disponíveis, ou podem ser produzidos sinteticamente, com base nas sequências disponíveis publicamente, por exemplo, a partir de depósitos, tais como no ATCC, bem como de outras fontes comerciais ou individuais. Os promotores podem ser unidirecionais (ou seja, iniciar a transcrição numa direção) ou bidirecionais (ou seja, iniciar a transcrição ou em 3' ou 5'). Exemplos de promotores não limitativos incluem, por exemplo, o sistema de expressão bacteriano T7, sistema de expressão bacteriano pBAD (araA), promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor de SV40, o promotor de RSV. Os promotores indutíveis incluem, por exemplo, o sistema Tet (Patentes US 5,464,758 e 5,814,618), o sistema indutível Ecdysone (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), o sistema T-REX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), o sistema de LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA), e o sistema recombinase indutível tamoxifeno Cre-ERT (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); U.S. Patent 7,112,715; and Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).

[0066] O termo "intensificador", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de DNA que aumenta a transcrição de, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico à qual está ligada operacionalmente. Os intensificadores podem ser localizados muitas quilobases de distância da região de codificação da sequência de ácido nucleico e podem mediar à ligação de fatores de regulação, os padrões de metilação do DNA, ou alterações na estrutura de DNA. Um grande número de intensificadores a partir de uma variedade de fontes diferentes é bem conhecido na técnica e estão disponíveis como ou dentro dos polinucleotídeos clonados (a partir de, por exemplo, depósitos como o ATCC, bem como de outras fontes comerciais ou individuais). Um número de polinucleotídeos compreendendo innsificadores (tais como o promotor de CMV frequentemente utilizado) também compreendem sequências intensificadoras. Os intensificadores podem ser localizados a montante, dentro ou a jusante das sequências codificadoras.

[0067] O vetor pode também compreender um "gene marcador selecionável." O termo "gene marcador selecionável", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de ácido nucleico que permitem células expressando a sequência de ácido nucleico a ser especificamente selecionada para ou contra, na presença de um agente seletivo correspondente. Genes marcadores selecionáveis adequados são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Publicações dos Pedidos de Patente Internacional WO 1992/008796 e WO 1994/028143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817-823 (1980); e Patentes US 5,122,464 e 5,770,359.

[0068] Em algumas modalidades, o vetor é um "vetor de expressão epissomal" ou "epissoma", que é capaz de se replicar numa célula hospedeira, e persiste como um segmento extracromossômico de DNA dentro da célula hospedeira, na presença da pressão seletiva adequada (ver, por exemplo, Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)). Os vetores de expressão epissomais representativos comercialmente disponíveis incluem, mas não estão limitados aos plasmídeos epissomais que utilizam a origem do antígeno nuclear Epstein Barr 1 (EBNA 1) e o vírus Epstein Barr (EBV) de replicação (oriP). Os vetores pREP4, pCEP4, pREP7, e pcDNA3.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) e pBK-CMV de Stratagene (La Jolla, CA) representam exemplos não limitativos de um vetor epissômico que utiliza o antígeno T e origem de SV40 da replicação em vez de EBNA1 e oriP.

[0069] Outros vetores adequados incluem vetores de expressão de integração, o que pode integrar aleatoriamente no DNA da célula hospedeira, ou pode incluir um local de recombinação para permitir a recombinação específica entre o vetor de expressão e o cromossoma da célula hospedeira. Tais vetores de expressão de integração podem utilizar as sequências de controle de expressão endógena dos cromossomas da célula hospedeira para efetuar a expressão da proteína desejada. Exemplos de vetores que integram de uma forma específica do local incluem, por exemplo, componentes do sistema flp-in da Invitrogen (Carlsbad, CA) (por exemplo, pcDNA™ 5/FRT), ou o sistema cre-lox, tal como pode ser encontrado nos Vetores de Núcleo pExchange-6 de Stratagene (La Jolla, CA). Exemplos de vetores que se integram aleatoriamente nos cromossomas da célula hospedeira incluem, por exemplo, pcDNA3.1 (quando introduzidos na ausência do antígeno-T) a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA), UCOE da Millipore (Billerica, MA), e pCI ou pFN10A (ACT) FLEXI™ da Promega (Madison, WI).

[0070] Os vetores virais também podem ser usados. Os vetores de expressão virais disponíveis comercialmente representativos incluem, mas não estão limitados a, o sistema de Per.C6 à base adenovírus disponível de Crucell, Inc. (Leiden, Holanda), o pLP1 à base de lentivírus de Invitrogen (Carlsbad, CA), e os vetores retrovirais pFB-ERV mais PCFB-EGSH de Stratagene (La Jolla, CA).

[0071] As sequências de ácidos nucleicos codificando as sequências de aminoácidos da invenção podem ser fornecidas a uma célula no mesmo vetor (isto é, em cis). Um promotor unidirecional pode ser utilizado para controlar a expressão de uma determinada sequência de ácido nucleico. Em outra modalidade, uma combinação de promotores bidirecionais e unidirecionais pode ser utilizada para controlar a expressão de múltiplas sequências de ácido nucleico. Sequências de ácido nucleico codificando as sequências de aminoácidos da invenção podem, alternativamente, ser fornecidas para a população de células sobre vetores separados (isto é, em trans). Cada uma das sequências de ácidos nucleicos de cada um dos vetores separados pode compreender as mesmas ou diferentes sequências de controle de expressão. Os vetores separados podem ser fornecidos para células simultaneamente ou sequencialmente.

[0072] O(s) vetor(es) compreendendo o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando as sequências de aminoácidos da invenção podem ser introduzidos numa célula hospedeira, que é capaz de expressar os polipeptídeos por elas codificadas, incluindo qualquer célula procariota ou eucariota adequada. Como tal, a invenção proporciona uma célula isolada que compreende o vetor da invenção. As células hospedeiras preferidas são aquelas que podem ser facilmente cultivadas e confiavelmente crescidas, têm taxas de crescimento razoavelmente rápidas, têm sistemas de expressão bem caracterizados, e podem ser transformadas ou transfectadas de forma fácil e eficientemente.

[0073] Exemplos de células procariotas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células do gênero Bacillus (tais como Bacillus subtilis e Bacillus brevis), Escherichia (tal como E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella, e Erwinia. As células procarióticas particularmente úteis incluem as várias cepas de Escherichia coli (por exemplo, K12, HB101 (ATCC No. 33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC No. 53338), e CC102).

[0074] De preferência, o vetor é introduzido numa célula eucariótica. Células eucarióticas adequadas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, células de levedura, células de inseto, e células de mamíferos. Exemplos de células de levedura adequadas incluem as dos gêneros Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces, e Schizosaccharomyces. Células de levedura preferidas incluem, por exemplo, Saccharomyces cerivisae e Pichia pastoris.

[0075] As células de insetos adequados são descritos em, por exemplo, Kitts et al, Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564572 (1993); and Lucklow et al., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Células preferidas de inseto incluem Sf-9 e HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0076] De preferência, as células de mamíferos são utilizadas na invenção. Uma série de células hospedeiras de mamífero adequadas é conhecida na técnica, e muitas estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Exemplos de células de mamífero adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células de ovário de hamster chinês (CHO) (ATCC No. CCL61), células CHO DHFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), células 293 ou 293T do rim embrionário humano (HEK) (ATCC No. CRL 1573) e células 3T3 (ATCC No. CCL92). Outras linhas celulares de mamífero adequadas são do macaco COS-1 (ATCC No. CRL1650) e linhas de células COS- 7 (ATCC No. CRL1651), bem como a linha celular CV-1 (ATCC No. CCL70). Outras células hospedeiras de mamíferos exemplificativas incluem linhas celulares de primatas e linhas celulares de roedores, incluindo linhas celulares transformadas. Células diplóides normais, cepas celulares derivadas da cultura in vitro de tecido primário, bem como explantes primários, são também adequados. Outras linhas celulares de mamíferos adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células de neuroblastoma de camundongo N2A, HeLa, células de camundongo L-929, linhas de células de hamster BHK ou HaK, todas as quais estão disponíveis a partir do ATCC. Os métodos para a seleção de células hospedeiras de mamífero adequadas e métodos para transformação, cultura, amplificação, rastreio, e a purificação das células são conhecidos na técnica.

[0077] Mais preferencialmente, a célula de mamífero é uma célula humana. Por exemplo, a célula de mamífero pode ser um linfóide humano ou linha celular derivada do linfóide, como uma linha celular de origem de pré-B linfócitos. Exemplos de linhas de células de linfóides humanos incluem, sem limitação, RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)), células Raji (CCL-86), e seus derivados.

[0078] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da invenção pode ser introduzida numa célula por "transfecção", "transformação" ou "transdução". "Transfecção", “transformação” ou "transdução", como aqui utilizado, refere-se à introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos numa célula hospedeira através de métodos físicos ou químicos. Muitas técnicas de transfecção são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, co-precipitação do DNA do fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Murray EJ (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextrano; eletroporação; transfecção mediada por lipossomas catiônicos; bombardeamento de micropartículas facilitada de partícula tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); and strontium phosphate DNA co-precipitation (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Os fagos ou vetores virais podem ser introduzidos em células hospedeiras, após o crescimento de partículas infecciosas em células de empacotamento adequadas, muitas das quais estão disponíveis comercialmente.

[0079] A invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção, o agente de ligação de PD-1 da invenção, a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica qualquer um dos anteriores, ou o vetor da invenção compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção. De preferência, a composição é uma composição farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamente aceitável), que compreende um veículo, preferencialmente um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamente aceitável), e as sequências de aminoácidos da invenção, o agente de ligação ao antígeno, ou o vetor. Qualquer veículo adequado pode ser utilizado dentro do contexto da invenção, e tais veículos são bem conhecidos na técnica. A escolha do veículo será determinada, em parte, pelo local particular ao qual a composição pode ser administrada bem como o método particular utilizado para administrar a composição. A composição pode opcionalmente ser estéril. A composição pode ser congelada ou liofilizada para armazenamento e reconstituída num veículo estéril adequado antes de usar. As composições podem ser geradas de acordo com s técnicas convencionais descritas em, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

[0080] A invenção proporciona ainda um método de tratamento de qualquer doença ou distúrbio em que a expressão inadequada (por exemplo, a sobre-expressão) ou o aumento da atividade de uma proteína de PD-1 induz ou contribui para os efeitos patológicos da doença, ou uma diminuição nos níveis ou atividade da proteína de PD-1 tem um benefício terapêutico em mamíferos, de preferência, seres humanos. A invenção também proporciona um método de tratamento de um câncer ou de uma doença infecciosa num mamífero. O método compreende a administração da composição acima mencionada para um mamífero tendo um câncer ou uma doença infecciosa, após o que o câncer ou doença infecciosa é tratado no mamífero. Tal como aqui discutido, PD-1 é expressa de forma anormal em uma variedade de cânceres (ver, por exemplo, Brown et al., J. Immunol., 170: 1257- 1266 (2003); and Flies et. al., Yale Journal of Biology and Medicine, 84: 409-421 (2011)), e expressão PD-L1 em alguns pacientes de carcinoma de células renais correlaciona-se com a agressividade do tumor. O método da invenção pode ser utilizado para tratar qualquer tipo de câncer conhecido na técnica, tal como, por exemplo, melanoma, carcinoma de células renais, câncer do pulmão, câncer da bexiga, câncer da mama, câncer cervical, câncer do cólon, câncer da vesícula biliar, câncer da laringe, câncer de fígado, câncer da tireóide, câncer de estômago, câncer da glândula salivar, câncer de próstata, câncer de pâncreas, ou carcinoma de células de Merkel (ver, por exemplo, Bhatia et al., Curr. Oncol. Rep., 13(6): 488-497 (2011)). O método da invenção pode ser utilizado para tratar qualquer tipo de doença infecciosa (isto é, uma doença ou distúrbio causado por uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita). Os exemplos de doenças infecciosas que podem ser tratadas pelo método da invenção incluem, mas não estão limitados às doenças causadas por um vírus da imunodeficiência humana (HIV), um vírus sincicial respiratório (RSV), um vírus da gripe, um vírus da dengue, um vírus da hepatite B (HBV, ou um vírus da hepatite C (HCV)). A administração de uma composição compreendendo um polipeptídeo da cadeia pesada da imunoglobulina da invenção, um polipeptídeo da cadeia leve da imunoglobulina da invenção, o agente de ligação de PD-1 da invenção, a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica qualquer um dos anteriores, ou o vetor da invenção compreendendo a sequência de ácido nucleico inventiva induz uma resposta imune contra um câncer ou uma doença infecciosa num mamífero. Uma "resposta imune" pode implicar, por exemplo, a produção de anticorpos e/ou a ativação de células efetoras imunológicas (por exemplo, células T).

[0081] Como aqui utilizados, os termos "tratamento", "tratar", e os semelhantes referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. De preferência, o efeito terapêutico é, ou seja, o efeito de cura parcial ou completa uma doença e/ou sintoma adverso atribuível à doença. Para este fim, o método da invenção compreende administração de uma "quantidade terapeuticamente eficaz" do agente de ligação de PD-1. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com os fatores, tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do agente de ligação de PD-1 para desencadear uma resposta desejada no indivíduo. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de PD-1 de ligação da presente invenção é uma quantidade que diminui bioatividade da proteína PD-1 num ser humano e/ou intensifica a resposta imunológica contra um câncer ou doenças infecciosas.

[0082] Em alternativa, o efeito farmacológico e/ou fisiológico pode ser profilático, isto é, o efeito completamente ou parcialmente impede uma doença ou sintoma deste. A este respeito, o método da invenção compreende administração de uma "quantidade profilacticamente eficaz" do agente de ligação de PD-1. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado profilático desejado (por exemplo, a prevenção do aparecimento da doença).

[0083] Uma dose típica pode ser, por exemplo, na faixa de 1 pg/kg a 20 mg/kg de peso do corpo animal ou humano; contudo, doses abaixo ou acima desta faixa exemplar estão dentro do escopo da invenção. A dose parentérica diária pode ser de cerca de 0, 00001 μg/kg a cerca de 20 mg/kg de peso total do corpo (por exemplo, cerca de 0,001 μg/kg, cerca de 0,1 μg/kg, cerca de 1 μg/kg, cerca de 5 μg/kg, cerca de 10 μg/kg, cerca de 100 μg/kg, cerca de 500 μg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores), de preferência, de cerca de 0,1 μg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso total do corpo (por exemplo, cerca de 0,5 μg/kg, cerca de 1 μg/kg, cerca de 50 μg/kg, cerca de 150 μg/kg, cerca de 300 μg/kg, cerca de 750 μg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores), mais preferencialmente a partir de cerca de 1 μg/kg a 5 mg/kg de peso total do corpo (por exemplo, cerca de 3 μg/kg, cerca de 15 μg/kg, cerca de 75 μg/kg, cerca de 300 μg/kg, cerca de 900 μg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores precedentes), e ainda mais preferencialmente de cerca de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal por dia (por exemplo, cerca de 1 mg/kg, sobre 2,5 mg kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 11 mg/kg, cerca de 13 mg/kg, ou uma faixa definida por duas qualquer um dos valores anteriores). A eficácia terapêutica ou profilática pode ser monitorada através da avaliação periódica dos doentes tratados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser repetido até que uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorra. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis e estão dentro do âmbito da invenção. A dosagem desejada pode ser administrada por uma única administração de bolus da composição, por várias administrações de bolus da composição, ou por administração a infusão contínua da composição.

[0084] A composição compreende uma quantidade eficaz do polipeptídeo da cadeia pesada da imunoglobulina da invenção, do polipeptídeo da cadeia leve da imunoglobulina da invenção, o agente de ligação de PD-1 da invenção, a sequência de ácido nucleico da invenção que codifica qualquer um dos anteriores, ou o vetor da invenção compreendendo a sequência de ácido nucleico da invenção pode ser administrado a um mamífero utilizando técnicas de administração convencionais, incluindo pela administração via oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou por supositórios. A composição é preferencialmente adequada para administração parentérica. O termo "parentérica", como aqui utilizado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, e intraperitoneal. Mais preferencialmente, a composição é administrada a um mamífero utilizando administração sistémica periférica, por administração intravenosa, intraperitoneal, ou subcutânea.

[0085] Uma vez administrada a um mamífero (por exemplo, um humano), a atividade biológica do agente de ligação PD-1 da invenção pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a atividade biológica pode ser avaliada através da determinação da estabilidade de um agente de ligação de PD- 1 específica. Numa modalidade da invenção, o agente de ligação de PD-1-(por exemplo, um anticorpo) tem uma semivida in vivo entre cerca de 30 minutos e 45 dias (por exemplo, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, cerca de 1 dia, cerca de 5 dias, cerca de 10 dias, cerca de 15 dias, cerca de 25 dias, cerca de 35 dias, cerca de 40 dias, cerca de 45 dias, ou de uma faixa definida por quaisquer dois dos valores precedentes). Numa outra modalidade, o agente de ligação de PD-1 tem uma semivida in vivo entre cerca de 2 horas e 20 dias (por exemplo, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 15 horas, cerca de 20 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 7 dias, cerca de 12 dias, cerca de 14 dias, cerca de 17 dias, cerca de 19 dias, ou uma faixa definida por duas qualquer um dos valores anteriores). Numa outra modalidade, o agente de ligação de PD-1 tem uma semivida in vivo entre cerca de 10 dias e cerca de 40 dias (por exemplo, cerca de 10 dias, cerca de 13 dias, cerca de 16 dias, cerca de 18 dias, cerca de 20 dias, cerca de 23 dias, cerca de 26 dias, cerca de 29 dias, cerca de 30 dias, cerca de 33 dias, cerca de 37 dias, cerca de 38 dias, cerca de 39 dias, cerca de 40 dias, ou uma faixa definida por duas qualquer um dos valores anteriores).

[0086] A atividade biológica de um agente de ligação de PD-1 particular também pode ser avaliada por determinação da sua afinidade de ligação para uma proteína de PD-1 ou um epítopo deste. O termo "afinidade" refere-se à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes e é expresso como a constante de dissociação (KD). A afinidade de um agente de ligação a um ligante, como a afinidade de um anticorpo para um epítopo, pode ser, por exemplo, a partir de cerca de 1 picomolar (pM) a cerca de 100 micromolar (μM) (por exemplo, a partir de cerca de 1 picomolar (pM) a cerca de 1 nanomolar (nM), a partir de cerca de 1 nM a cerca de 1 micromolar (μM), ou a partir de cerca de 1 μM até cerca de 100 μM). Numa modalidade, o agente de ligação de PD-1 pode ligar-se a um PD-1 de proteína com uma KD igual ou inferior a 1 nanomolar (por exemplo, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,025 nM, 0,01 nM, 0,001 nM, ou uma faixa definida por duas quaisquer um dos valores anteriores). Numa outra modalidade, o agente de ligação de PD-1 pode ligar-se a PD-1 com uma KD inferior ou igual a 200 pM (por exemplo, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores precedentes). A afinidade de imunoglobulina para um antígeno ou epítopo de interesse pode ser medida utilizando qualquer ensaio reconhecido na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, fluorescência de células (FACS), grânulos separáveis (por exemplo, pérolas magnéticas), ressonância de plasma de superfície (SPR), concorrência em fase de solução (KINEXA™), balanço do antígeno, e/ou ELISA (ver, por exemplo, Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001).

[0087] O agente de ligação de PD-1 da invenção pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros fármacos (por exemplo, como um adjuvante). Por exemplo, o agente de ligação de PD-1 pode ser administrado em combinação com outros agentes para o tratamento ou prevenção das doenças aqui descritas. A este respeito, o agente de PD-1 de ligação pode ser utilizado em combinação com pelo menos outro agente anti-câncer incluindo, por exemplo, qualquer agente quimioterapêutico conhecido na técnica, a radiação de ionização, agentes pequenos de molécula anticancerígenos, vacinas para o câncer, as terapias biológicas (por exemplo, outros anticorpos monoclonais, vírus eliminar o câncer, a terapia gênica e transferência adotiva de células T), e/ou cirurgia. Quando o método da invenção trata uma doença infecciosa, o agente de ligação de PD-1 pode ser administrado em combinação com pelo menos um agente antibacteriano ou pelo menos um agente antiviral. A este respeito, o agente antibacteriano pode ser qualquer antibiótico adequado conhecido na técnica. O agente antiviral pode ser qualquer vacina de qualquer tipo adequado, que tem como alvo especificamente um vírus em particular (por exemplo, vacinas vivas atenuadas, as vacinas de subunidade, vacinas de vetor recombinantes, e terapias antivirais de moléculas pequenas (por exemplo, inibidores de replicação virais e de análogos de nucleosídeos)).

[0088] Numa outra modalidade, o agente de ligação de PD-1 da invenção pode ser administrado em combinação com outros agentes que inibem as vias de pontos de verificação do sistema imunológico. Por exemplo, o agente de ligação PD-1 da invenção pode ser administrado em combinação com agentes que inibem ou antagonizam as vias CTLA-4, TIM-3 ou LAG-3. Tratamentos de combinação que, simultaneamente, têm como alvo duas ou mais destas vias de ponto de verificação imunes têm demonstrado atividade antitumoral melhorada e potencialmente sinérgica (ver, por exemplo, Sakuishi et al., J. Exp. Med., 207: 2187-2194 (2010); Ngiow et al., Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011); and Woo et al., Cancer Res., 72: 917-927 (2012)). Numa modalidade, o agente de ligação de PD-1 da invenção é administrado em combinação com um anticorpo que se liga a TIM-3 e/ou um anticorpo que se liga a LAG-3. A este respeito, o método da invenção para tratamento de um câncer ou de uma doença infecciosa num mamífero pode compreender adicionalmente administrar ao mamífero uma composição que compreende (i) um anticorpo que se liga a uma proteína TIM-3 e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável ou uma composição compreendendo (i) um anticorpo que se liga a uma proteína LAG-3 e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0089] Além disso, os usos terapêuticos, o agente de ligação de PD-1 aqui descrito pode ser utilizado em aplicações de diagnóstico ou de pesquisa. A este respeito, o agente de ligação de PD-1 pode ser utilizado num método para o diagnóstico do câncer ou de uma doença infecciosa. De um modo semelhante, o agente de ligação de PD-1 pode ser utilizado num ensaio para monitorar os níveis de proteína de PD-1 num indivíduo a ser testado para uma doença ou distúrbio que está associada com PD-1 anormal. Aplicações de pesquisa incluem, por exemplo, os métodos que utilizam o agente de ligação de PD-1 e um marcador para detectar uma proteína PD-1 numa amostra, por exemplo, num fluido corporal humano ou num extrato de células ou tecido. O agente de ligação de PD-1 pode ser usado com ou sem modificação, como a rotulagem covalente ou não covalente com uma porção detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo (por exemplo, 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I), um composto fluorescente ou quimioluminescente (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou peroxidase de rábano), ou grupos prostéticos. Qualquer método conhecido na técnica para conjugar separadamente um agente de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo) a uma porção detectável pode ser empregada no contexto da invenção (ver, por exemplo, Hunter et al., Nature, 194: 495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)).

[0090] Os níveis de proteína de PD-1 podem ser medidos utilizando o agente de ligação de PD-1 da invenção por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, radioimunoensaio (RIA), e FACS. Os valores de expressão normal ou padrão de proteína de PD-1 podem ser estabelecidos utilizando qualquer técnica adequada, por exemplo, através da combinação de uma amostra que compreende, ou se suspeita que compreenda, um polipeptídeo de PD-1 com um anticorpo específico para PD-1- sob condições adequadas para formar um complexo antígeno- anticorpo. O anticorpo é marcado diretamente ou indiretamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos (ver, por exemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). A quantidade de polipeptídeo PD-1 expressa numa amostra é então comparada com um valor padrão.

[0091] O agente de ligação PD-1 pode ser fornecido num kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para a realização de um ensaio de diagnóstico. Se o agente de ligação PD-1 é marcado com uma enzima, o kit inclui, desejavelmente, substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que proporciona um cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos no kit, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise), e similares. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser proporcionados como pós secos (tipicamente liofilizada), incluindo excipientes que em dissolução proporcionarão uma solução de reagente possuindo a concentração apropriada.

[0092] Os exemplos seguintes ilustram ainda mais a invenção, mas, naturalmente, não devem ser interpretados como limitador do âmbito, de forma alguma.

EXEMPLO 1

[0093] Este exemplo demonstra um método para gerar anticorpos monoclonais direcionados contra o PD-1 humano.

[0094] Diversas formas de genes codificando PD-1 humana e os seus ligantes PD-L1 e PD-L2 foram gerados como antígenos para utilização em imunização do camundongo, o rastreio de hibridomas, e maturação da afinidade de anticorpos enxertados com CDR, e está representado esquematicamente na Figura 1. Os genes PD-1 de comprimento total do macaco cinomolgo e humano foram expressos com a sua sequência líder nativa e nenhum marcador adicionado usando um vetor único de expressão do elemento de abertura de cromatina ubíqua (UCOE) com seleção higromicina (Millipore, Billerica, MA). As células CHO-K1 foram transfectadas estavelmente com Lipofectamine LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Após a seleção com higromicina, células que expressam PD-1 na superfície celular foram identificadas por citometria de fluxo utilizando um anticorpo de camundongo conjugado com PE para PD-1 humana (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) e subclonados. Os subclones foram, então, selecionados para expressão de PD-1 uniforme e alto nível.

[0095] As sequências de ácidos nucleicos que codificam formas monoméricas solúveis do domínio extracelular (ECD) de PD-1 humano e de macaco cinomolgo foram construídos com marcações His anexas ao C-terminal do ECD ou proteínas solúveis de fusão dimérica como com IgG2a Fc de camundongo como indicado na Figura 1. As sequências de ácidos nucleicos codificando as formas diméricas solúveis de ECD de PD-L1 e PD-L2 humano foram construídas como proteínas de fusão com IgG1 Fc de camundongo, como indicado na Figura 1. As proteínas solúveis foram expressas transitoriamente em células HEK 293 ou em linhas estáveis de células CHO, utilizando técnicas padrões. Proteínas marcadas com His foram purificadas a partir de sobrenadante de cultura celular por meio de cromatografia em coluna de afinidade de Ni seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas de fusão IgG-Fc foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade de proteína A/G. As proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho para assegurar a homogeneidade. Além disso, o tamanho e a identidade foram confirmados por espectrometria de massa.

[0096] Para as experiências de triagem/separação por FACS, as proteínas purificadas foram marcadas com biotina, utilizando um agente de reticulação de éster NHS (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ou o corante fluorescente DyLight 650 (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) utilizando técnicas padrões.

[0097] Os camundongos foram imunizados com células CHO que expressam comprimento completo PD-1 na superfície das células ou a proteína PD-1 ECD His. Especificamente, os camundongos fêmeas BALB/c (7 semanas de idade) foram comprados de Harlan Laboratories, Inc. (Indianapolis, IN) e divididos em dois grupos. Depois de seis dias de aclimatização, um grupo de animais foi imunizado com quatro doses semanais de PD-1 ECD-His purificada humana a 50 μg/camundongo, como uma mistura 1:1 de emulsão com TITERMAX GOLD™ (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). A imunização foi realizada por via subcutânea em torno das regiões das axilas e inguinais. O segundo grupo de animais foi injetado com quatro doses semanais de células CHO-K1 que expressam estavelmente PD-1 humana de comprimento total (5 x 106 células/camundongo) por via subcutânea em torno das regiões inguinais. Após dez dias, os animais foram sangrados para a medição do título de soro para PD-1, e um animal de cada grupo foi impulsionado com PD-1 humana solúvel, após 3 semanas de repouso. Depois de três dias, baços, linfonodos axilar/braquial, e linfonodos inguinais foram coletados de cada animal. As suspensões de células únicas de células de todos os tecidos coletados a partir de ambos os animais foram reunidos e utilizados para a geração de hibridomas por fusão de células utilizando técnicas padrões. Duas linhas de células de mieloma diferentes foram utilizadas para a fusão, F0 (como descrito em de St. Groth and Scheidegger, J. Immunol. Methods, 35: 1-21 (1980)) and P3X63Ag8.653 (as described in Kearney et al., J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979)).

[0098] Os sobrenadantes dos hibridomas a partir de dez placas de 96 cavidades foram pesquisados para a ligação a um clone de células CHO-K1 transfectadas de forma estável com uma sequência de ácido nucleico que codifica comprimento total de PD-1 humana e comparada com a ligação de células CHO-K1 transfectadas. Especificamente, os sobrenadantes de hibridoma foram diluídos 1:1 com PBS/2% de FBS e incubados com um volume igual de células PD-1 CHO-K1 (2,5x105 células em PBS, 2% de FBS) durante 30 minutos a 4°C. As células foram centrifugadas, lavadas uma vez com PBS/1% de FBS, e incubadas com anti-camundongo IgG (H + L) de cabra conjugada com APC (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) durante 30 minutos a 4°C. As células foram lavadas duas vezes em PBS/2% de FBS, ressuspensas em PBS, 2% de FBS, 1% de paraformaldeído e analisadas em um Bioanalizados de fluorescência BD FACSArray™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Os níveis de IgG de camundongo foram quantificados por ELISA.

[0099] Com base na forte ligação às células CHO PD- 1, 46 cavidades parentais foram expandidas, e os sobrenadantes foram testados quanto à capacidade para bloquear a ligação de proteína de fusão DyL650 marcado com PD-L1-mIgG1 Fc para células PD-1 de CHO. Especificamente, os anticorpos monoclonais de camundongos purificados foram incubados em uma resposta à dose com a concentração EC30 da PD-L1-DyL650 (10 nM), e a inibição foi quantificada por citometria de fluxo. As células a partir das cavidades mostrando a melhor atividade de bloqueio de PD-L1 e níveis mais altos de IgG de camundongo foram subclonados para análise adicional, incluindo a purificação e sequenciação da cadeia pesada e leve (VL e VH). Onze dos bloqueadores mais fortes da interação de PD-1/PD-L1 foram selecionados para subclonagem. Na sequência de reconfirmação da ligação PD-1 e bloqueio PD-L1, subclones selecionados foram ampliados, e o sobrenadante foi submetido à purificação de anticorpos. Os anticorpos purificados foram verificados se ligar a ambos PD-1 dos macacos cinomolgos e dos humanos e para a atividade de bloqueio de PD-L1. Valores de KD foram determinados por ressonância de plasma de superfície num instrumento BIACORE ™ T200 (GE Healthcare, Waukesha, WI), e as constantes cinéticas foram determinadas utilizando o software de avaliação de BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Waukesha, WI). A este respeito, os anticorpos foram capturados num chip BIACORE™ CM5 ao qual GE anti-camundongo IgG foi acoplado. O monômero PD-1-His foi vertido sobre o anticorpo capturado utilizando duas ou três séries de diluições começando com 500 nM na concentração mais elevada. Os sensorgramas resultantes foram ajustados globalmente usando um modelo de ligação 1:1 para calcular as taxas de entrada e saída e as afinidades subsequentes (KD).

[00100] Os resultados deste exemplo demonstram um método de produção de anticorpos monoclonais que se ligam a PD-1 do macaco cinomolgo e de humanos e bloqueiam a ligação do ligante do PD-1.

EXEMPLO 2

[00101] Este exemplo descreve a criação e geração de anticorpos monoclonais anti-PD-1 enxertados com CDR e quiméricos.

[00102] Os subclones dos hibridomas que produziram anticorpos de ligação de PD-1 com atividade bloqueadora de PD-L1 como descrito no Exemplo 1 foram isotipados, submetidos a RT-PCR para clonar a região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH) e a região variável da cadeia leve de anticorpo (VL), e sequenciados. Especificamente, o RNA foi isolado a partir de sedimentos celulares de clones de hibridoma (5 x 105 células/sedimentos), utilizando o kit RNEASY™ (Qiagen, Venlo, Holanda), e o cDNA foi preparado utilizando Sitema de Síntese oligo-dT-primed SUPERSCRIPT™ III First-Strand (Life Technologies, Carlsbad, CA). A amplificação por PCR da VL utilizou um conjunto de 9 ou 11 camundongos degenerados VL seguidos por iniciadores (ver Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer-Verlag, Berlin (2001)) e um iniciador reverso da região constante K. A amplificação por PCR da VH utilizou um conjunto de 12 camundongos degenerados VH seguido de iniciadores (Kontermann e Dubel, supra) e um iniciador reverso da região constante do camundongo y1 ou y2a (com base na isotipagem do anticorpo purificado a partir de cada clone) com o protocolo recomendado no Sistema de Síntese SUPERSCRIPT™ III First-Stand (Life Technologies, Carlsbad, CA). Os produtos de PCR foram purificados e clonados em pcDNA3.3-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, CA). As colônias individuais de cada sedimento celular (24 cadeias pesadas e 48 cadeias leves) foram selecionadas e sequenciadas utilizando metodologia de Sanger de sequenciação padrão (Genewiz, Inc., South Plainfield, NJ). Sequências de região variável foram examinadas e alinhadas com a cadeia pesada humana mais próxima ou sequência de linha germinal da região V de cadeia leve. Três anticorpos foram selecionados para enxerto de CDR: (1) 9A2, compreendendo uma VH de SEQ ID NO: 4 e uma VL de SEQ ID NO: 28, (2) 10B11, compreendendo uma VH de SEQ ID NO: 15 e uma VL de SEQ ID NO: 32, e (3) 6E9, compreendendo uma VH de SEQ ID NO: 22 e uma VL de SEQ ID NO: 38.

[00103] As sequências de anticorpos enxertados com CDR foram concebidas por enxerto de resíduos de CDR de cada um dos anticorpos dos camundongos acima descritos no homólogo da linha germinal mais próximo da humana. Regiões variáveis de anticorpo enxertado com CDR, foram sintetizados e expressos com regiões constantes de IgG1 humana/K para análise. Além disso, camundongo: anticorpos quiméricos humanos foram construídos utilizando as regiões variáveis dos anticorpos acima descritos dos camundongos ligados às regiões IgG1 humana/constantes K. Os anticorpos quiméricos e enxertados com CDR foram caracterizados quanto à ligação aos antígenos PD-1 humanos e macaco cinomolgo e de atividade no ensaio de bloqueamento PD-1/PD-L1, como descrito acima.

[00104] A atividade de antagonista funcional de anticorpos quiméricos e enxertados com CDR foi também testada em um ensaio de reação de linfócito misto de células T CD4+ de humano (MLR), em que a ativação das células T CD4+, na presença de anticorpos de anti-PD-1 é avaliada através da medição da secreção de IL-2. Porque PD- 1 é um regulador negativo da função das células T, o antagonismo da PD-1 foi prevista para resultar num aumento da ativação das células T, conforme medido pelo aumento da produção de IL-2. Os anticorpos 9A2, 10B11, e 6E9 enxertados com CDR demonstraram atividade antagonista e foram selecionados para maturação de afinidade.

[00105] Os resultados deste exemplo demonstram um método de gerar anticorpos monoclonais quiméricos e enxertados com CDR que se ligam especificamente e inibem a PD-1.

EXEMPLO 3

[00106] Este exemplo demonstra a maturação da afinidade dos anticorpos monoclonais direcionados contra a PD-1.

[00107] Os anticorpos enxertados com CDR derivados a partir dos anticorpos monoclonais de murino original (9A2, 10B11, e 6E9) foram submetidos à maturação de afinidade via in vitro de hipermutação somática. Cada anticorpo foi apresentado sobre a superfície de células HEK 293c18 utilizando o sistema de decíduo SHM-XEL (ver Bowers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 20455-20460 (2011); e Publicação de Pedido de Patente US No. 2013/0035472). Após o estabelecimento das linhas estáveis epissomais, um vetor para a expressão de desaminase de citosina induzida por activação (AID) foi transfectado nas células para iniciar a hipermutação somática como descrito em Bowers et al., supra. Após múltiplos ciclos de seleção por FACS, em condições de restringência de ligação de antígeno crescente, um número de mutações na região variável de cada um dos anticorpos foi identificado e recombinado para produzir anticorpos humanizados maduro com propriedades melhoradas.

[00108] Um painel de seis sequências da região variável da cadeia pesada e leve humanizada maturada por afinidade foi emparelhado (denotado APE1922, APE1923, APE1924, APE1950, APE1963 e APE2058) e selecionado para a caracterização, e estão apresentados na Tabela 1. As propriedades de ligação PD- 1 de cada uma destas sequências de anticorpo foram ensaiadas utilizando ressonância de plasma de superfície (SPR) e análise de afinidade à base de solução. Os anticorpos foram expressos a partir de células HEK 293 como anticorpos IgG1 humanos e em comparação com o anticorpo de referência, uma versão de lgG1 humana de BMS- 936558, BMS designado.

[00109] As análises SPR foram efetuadas utilizando um instrumento BIACORE™ T200, e as constantes cinéticas foram determinadas utilizando o software de avaliação de BIACORE™ T200. Parâmetros experimentais foram escolhidos para garantir que a saturação seria alcançada nas concentrações mais elevadas de antígeno e valores Rmax que seriam mantidos abaixo de 30 RU. GE IgG anti -humano (Fc- específica, aproximadamente 7.000 RU) foi imobilizado num chip BIACORE™ CM5 utilizando química de acoplamento de amina ativado por EDC. Os anticorpos (0,5 μg/mL, tempo de captura 60 segundos) foram, então, capturados utilizando esta superfície. Em seguida, PD1-Avi-His solúvel monomérico humano fluiu sobre anticorpo capturado (300 segundos de associação, 300 segundos de dissociação), utilizando uma série de diluição de três série de 500 nM a 2 nM. Anticorpo capturado e o antígeno foram removidos entre cada ciclo usando 3M de MgCl2 (tempo de contato de 60 segundos), de modo a assegurar uma superfície de ligação fresca para cada concentração de antígeno. Os sensorgramas resultantes foram ajustados globalmente utilizando um modelo 1:1 de ligação a fim de calcular as taxas de entrada e saída (ka e kd, respectivamente), bem como afinidades (KD).

[00110] As análises de afinidade com base em soluções foram realizadas utilizando um ensaio KINEXA™ 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho), e os resultados foram analisados utilizando KINEXA™ Pro Software 3.2.6. Parâmetros experimentais foram selecionados para alcançar um máximo de sinal com o anticorpo isoladamente entre 0,8 e 1,2 V, enquanto limitando sinal da ligação não específica com tampão sozinho para menos de 10% do sinal máximo. Grânulos azlactona (50 mg) foram revestidos com antígeno por diluição numa solução de PD-1-Avi-His (50 μg/mL em 1 mL) em 50 mM Na2CO3. A solução foi rodada em temperatura ambiente durante 2 horas, e os grânulos foram sedimentados numa picofuga e lavados duas vezes com solução de bloqueio (10 mg/mL de BSA, 1M de Tris-HCl, pH 8,0). Os grânulos foram ressuspensas em solução de bloqueio (1 ml), rodado à temperatura ambiente durante 1 hora, e diluído em 25 volumes de PBS/0,02% de NaN3. Para a medição da afinidade, o anticorpo secundário foi ALEXFLUOR™ IgG 647 corante-anti- humano (500 ng/mL). As concentrações de anticorpos das amostras foram mantidas constantes (50 pM ou 75 pM), enquanto que o antígeno PD1-Avi-His foi titulado utilizando uma série de diluições de três vezes a partir de 1 μM até 17 pM. Todas as amostras foram diluídas em PBS, 0,2% de NaN3, 1 mg/mL de BSA e deixado equilibrar à temperatura ambiente durante 30 horas. Adicionalmente, as amostras contendo apenas anticorpo e apenas tampão foram testadas a fim de determinar o sinal máximo e o sinal de ligação não específica, respectivamente. Os resultados das análises de afinidade são apresentados na Tabela 1. Todos os anticorpos selecionados exibiram afinidades mais elevadas para a PD-1 do que o anticorpo de referência BMS, com a maior afinidade de anticorpo sendo APE2058.

[00111] Para avaliar a ligação dos anticorpos à superfície celular de PD-1, a ligação a células CHO expressando, ou PD-1 humana ou macaco cinomolgos foi determinada por análise de citometria de fluxo como descrito acima. Além disso, o bloqueio da interação PD- 1/PD-L1 foi avaliada utilizando DyL650 marcado PD-L1 (proteína de fusão de Fc de IgG1 do camundongo) e células CHO expressando PD-1, conforme descrito acima. Foram observadas as afinidades de ligação elevadas para superfície celular PD-1 para todas as sequências de anticorpos maturados por afinidade testados, com reatividade para macacos cinomolgos PD-1 dentro de um fator de 3-4 vezes de humano. O bloqueio da interação PD-1/PD-L1 foi também eficiente com todas as sequências de anticorpos maturados por afinidade testados, com valores de IC50 na faixa nM baixa. Estes resultados foram consistentes com afinidades de ligação ensaiadas tanto pelos sistemas de BIACORE™ e KINEXA™, bem como valores de EC50 da superfície celular.

[00112] A estabilidade térmica dos anticorpos selecionados foi avaliada utilizando um ensaio Thermofluor como descrito em McConnell et al., Protein Eng. Des. Sel., 26: 151 (2013). Este ensaio avalia a estabilidade através da capacidade de um corante fluorescente hidrofóbico para se ligar os emplastros hidrofóbicos na superfície das proteínas que são expostos como se desenrola a proteína. A temperatura na qual 50% da proteína se desenrola é determinada (Tm) para medir a estabilidade térmica. Este ensaio demonstrou que todas as sequências de anticorpos maturadas por afinidade testadas tiveram uma elevada estabilidade térmica, e todos eram mais estáveis do que o anticorpo de referência. APE2058 foi o anticorpo mais estável, exibindo uma Tm superior a 10°C maior do que a Tm da versão IgG1 de BMS-936558.

[00113] Para eliminar o risco de problemas potenciais relacionados com a farmacocinética in vivo dos anticorpos testados foi realizada através de (a) avaliação da ligação não específica de células alvo negativas (ver, por exemplo, Hotzel et al., mAbs, 4: 753-760 (2012)) e (b) medição de propriedades de dissociação de receptor Fc neonatal diferencial (FcRn) (ver, por exemplo, Wang et al., Drug Metab. Disp., 39: 1469-1477 (2011)). Para avaliar a ligação não específica, os anticorpos foram testados quanto à ligação para células HEK 293F usando um ensaio baseado em citometria de fluxo. Os anticorpos testados foram comparados com dois anticorpos aprovados pela FDA, infliximabe e denosumabe. Os resultados indicaram que a ligação não específica foi baixa para todos os anticorpos. Para avaliar a ligação e dissociação ao FcRn, tanto FcRn humano quanto cinomolgo FcRn foram testados num ensaio baseados em BIACORE™. Os anticorpos foram ligados a FcRn em pH 6,0, e após ajustamento do pH para 7,4, o anticorpo ligado residual foi determinado. Os resultados deste ensaio são mostrados na Tabela 2.

[00114] Os resultados deste exemplo demonstram um método para gerar os polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulinas da invenção, que exibem estabilidade térmica e elevada afinidade para a PD-1.

EXEMPLO 4

[00115] Este exemplo demonstra a atividade dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina da invenção in vitro.

[00116] A atividade antagonista funcional das sequências de VH e VL descritos no Exemplo 3 foi testada num ensaio de MLR das células T CD4+ humano, como descrito acima. Para a determinação da potência funcional, a EC50 para cada anticorpo foi determinada em cinco experiências separadas, utilizando diferentes doadores humanos. Os resultados são mostrados na Tabela 3 e demonstram atividade potente para cada um dos anticorpos selecionados, o que era indistinguível da atividade do anticorpo de referência.

[00117] Os resultados deste exemplo demonstram que os polipeptídeos de cadeia pesada e leve das imunoglobulinas da invenção podem antagonizar a sinalização PD-1, resultando no aumento da ativação das células T.

EXEMPLO 5

[00118] Este exemplo demonstra que uma combinação do agente de ligação da PD-1 da invenção e ou um anticorpo anti-LAG-3 ou um anticorpo anti-TIM-3 aumenta a ativação de células T in vitro.

[00119] Para estabelecer parâmetros para estudos de associação, o anticorpo anti-PD-1 APE2058 foi titulado em uma resposta à dose no ensaio MLR das células T CD4+ humano descrito acima. Antagonismo de sinalização de PD-1 resultou num aumento da ativação das células T e um correspondente aumento de 4 a 5 vezes na produção de IL-2.

[00120] Com base nos resultados de titulação, o anticorpo APE2058 em múltiplos ensaios de MLR, um valor de EC50 de 20 ng/ml e uma concentração 10 vezes inferior que representa um valor de CE10 aproximado (2 ng/ml) foram selecionadas para estudos de associação com anticorpos antagonistas para as moléculas do ponto de verificação TIM- 3 ou de LAG-3.

[00121] Um anticorpo anti-TIM-3 totalmente humano foi caracterizado por uma célula T CD4+ no ensaio in vitro como tendo atividade antagonista, conforme medido pelo aumento da produção de IL-2 na presença de níveis baixos de anti-CD3 e anti-CD28. O anticorpo anti-TIM-3 demonstrou atividade no ensaio de MLR com um valor de EC50 de aproximadamente 0,3 μg/ml, como mostrado na Figura 2 e na Tabela 4, que é aproximadamente 15 vezes menos atividade do que o anticorpo anti-PD-1 APE2058 sozinho (EC50 aproximadamente 0,02 μg/mL) . Em combinação com 0,02 μg/ml de APE2058, o anticorpo antagonista anti-TIM-3 estimulou aumento da quantidade de produção de IL-2, em comparação com APE2058 ou anti-TIM-3 sozinho, resultando numa redução de 10 vezes nos valores de EC50, como mostrado na Figura 2 e na Tabela 4. Estes resultados demonstram que o aumento da ativação das células T ocorre com a combinação de inibição de vias do ponto de verificação de PD-1 e TIM-3.

[00122] Um anticorpo anti-LAG-3 antagonista totalmente humano (descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0150892) demonstrou atividade potente na ligação do bloqueio de LAG-3 solúvel recombinante às células positivas MHC de Classe II. Este anticorpo, aqui designado como APE03109, foi avaliado para a atividade funcional no ensaio de MLR das células T CD4+ humanas. APE03109 demonstrou atividade na MLR com um valor de EC50 de aproximadamente 0,05 μg/ml, como mostrado na Figura 3 e Tabela 4, o que foi semelhante para a atividade do anticorpo anti-PD-1 sozinho. Em combinação com 0,02 μg/mL do anticorpo anti-PD-1 APE2058, o anticorpo APE03109 estimulou o aumento da quantidade de produção de IL-2 sobre APE2058 ou APE03109 sozinho, resultando numa diminuição de 5 vezes nos valores de EC50.

[00123] Um curso de tempo da produção de IL-2 com o anticorpo anti-LAG-3 APE03109 sozinho e a combinação de APE2058 com APE03109 também foi caracterizada por um ensaio de células T CD4+ MLR humana. Uma diminuição semelhante no valor de EC50 para a combinação de 0,02 μg/mL APE2058 e APE03109 foi observada após 72 horas de cultura, como mostrada na Figura 3. Depois de 96 horas de cultura, as diferenças em valores de EC50 não foram tão pronunciados; no entanto, os níveis de IL-2 produzidos nas culturas tratadas com 0,02 μg/mL do anticorpo APE2058 anti-PD-1 e o anticorpo APE03109 anti-LAG-3 quase duplicou em comparação com culturas tratadas com APE03109 sozinho (2,200 pg/mL contra 1200 pg/mL). Consistente com o curso de tempo da expressão de LAG-3, não aumentou a produção de IL-2 a partir de adição de APE03109 para APE2058 foi observada após 24 horas, embora APE2058 sozinho produziu um aumento sensível da dose na produção de IL-2 no momento. Em experiências MLR separadas também foi demonstrado que a combinação de APE2058 e APE03109 reforçou os níveis de produção da citoquina das células T IFN-y por mais de 50% após 48 horas.

[00124] Para demonstrar que os efeitos combinados do anticorpo anti-TIM-3 ou o anticorpo anti-LAG-3 na célula T CD4+ de MLR foram devidas à especificidade alvo, um anticorpo IgG1 humano irrelevante, APE0422, foi testado em combinação com 0,02 μg/mL de APE2058 anticorpo anti-PD-1. Na maior concentração testada (30 μg/mL), o anticorpo APE0422 não exibiu qualquer efeito sobre a produção de IL-2 ao longo do anti-PD-1 sozinho. Tabela 4

[00125] Os resultados deste exemplo demonstram que o agente de ligação PD-1 inventivo combinado com anticorpos antagonistas dirigidos contra TIM-3 ou de LAG-3 aumenta a ativação de células T CD4+ de células T in vitro.

[00126] Todas as referências, incluindo as publicações, pedidos de patentes e patentes aqui citados, são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada referência fosse indicada individualmente e especificamente para ser incorporada por referência e foram apresentados na sua totalidade neste documento.

[00127] O uso dos termos "um" e "uma", “a” e "o" e "pelo menos um" e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) devem ser interpretados de cobrir tanto o singular quanto o plural, salvo indicação em contrário aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso do termo "pelo menos um", seguido por uma lista de um ou mais artigos (por exemplo, "pelo menos um de A e B") é para ser entendido como significando um item selecionado dentre os itens listados (A ou B) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), salvo disposição em contrário aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" são para ser interpretados como termos abertos (isto é, que significa "incluindo, mas não limitado a,"), a menos que indicado de outra forma. Recitação de faixas de valores aqui é meramente destinada a servir como um método abreviado de referir individualmente cada valor separado que cai dentro do intervalo, a menos que de outro modo aqui indicado, e cada valor separado incorporado no relatório como se fosse aqui descrito individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") aqui proporcionados, pretende apenas iluminar melhor a invenção e não constitui uma limitação do âmbito da invenção a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00128] Modalidades preferidas da presente invenção estão aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Variações destas modalidades preferidas podem tornar-se evidentes para os peritos na técnica após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam peritos especializados para empregar tais variações, como apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de modo diferente do especificamente descrito aqui. Assim, a presente invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto recitado nas reivindicações anexas, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis do mesmo é abrangida pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

Claims

1. Anticorpo da proteína de morte-1 programada (PD-1) isolada CARACTERIZADO por compreender (a) um polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (b) um polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; e (c) uma região constante de cadeia pesada de IgG4 (Fc).

2. Composição CARACTERIZADA por compreender o anticorpo PD-1 isolado, conforme definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

3. Uso de uma composição, conforme definida na reivindicação 2, CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para tratar câncer em um mamífero.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é o melanoma, carcinoma de células renais, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de vesícula biliar, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer da tireóide, câncer de estômago, câncer da glândula salivar, câncer de próstata, câncer de pâncreas, ou carcinoma de células de Merkel.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a meia-vida do anticorpo de PD-1 no mamífero está entre 30 minutos e 45 dias.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo de PD-1 liga-se ao PD-1, com uma KD entre 1 picomolar (pM) e 500 pM.