BR112015025256B1

BR112015025256B1 - Cepas probióticas para uso no tratamento ou prevenção da osteoporose

Info

Publication number: BR112015025256B1
Application number: BR112015025256-7A
Authority: BR
Inventors: Anna Berggren; Niklas Larsson; Gunilla Önning; Irini Lazou Ahrén; Klara Sjögren; Claes Ohlsson
Original assignee: Probi Ab
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2021-10-13
Also published as: US20160067289A1; HRP20201139T1; DK2981274T3; EP2981274B1; BR112015025256A8; KR20170141820A; ES2804615T3; CA2908051A1; RU2015147106A; CN105188723A; WO2014163568A1; JP2016521123A; MX371418B; EP2981274A4; HK1220129A1; JP6103675B2; KR102129934B1; NZ712959A; KR102000514B1; PL2981274T3

Abstract

cepas probióticas para uso no tratamento ou prevenção da osteoporose. a presente invenção refere-se a pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de lactobacillus paracasei, ou pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir da combinação de lactobacillus paracasei com pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de lactobacillus plantarum, para uso no tratamento ou prevenção da osteoporose ou para uso no aumento da absorção de íons de ca2+, em um mamífero, preferencialmente em um ser humano.

Description

Campo técnico da invenção

[001] A presente invenção refere-se a pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei, ou pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei em combinação com pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus plantarum, para uso no tratamento ou prevenção da osteoporose ou para uso no aumento da absorção de íons de Ca2+em um mamífero, preferencialmente em um ser humano.

Antecedentes da Invenção

[002] A osteoporose é uma doença em que os ossos se tornam frágeis e mais suscetíveis a fratura. Normalmente, o osso perde densidade, o que mede a quantidade de cálcio e minerais no osso. A osteoporose é o tipo mais comum de doença óssea. Cerca de metade de todas as mulheres com idade superior a 50 anos terá uma fratura do quadril, punho ou vértebra (ossos da coluna) durante sua vida. O osso é um tecido vivo. Osso existente está constantemente sendo substituído por osso novo. A osteoporose ocorre quando o corpo não consegue formar novo osso suficiente, quando muito osso existente é reabsorvido pelo corpo, ou ambos. O cálcio é um dos minerais importantes, necessários para os ossos para se formar. Se você não obter o suficiente de cálcio e vitamina D, ou seu corpo não absorver cálcio suficiente de sua dieta, seus ossos podem se tornar quebradiços e mais propensos a fraturas. Uma queda de estrogênio em mulheres na altura da menopausa e uma queda nos níveis de testosterona em homens é uma das principais causas de perda de massa óssea.

[003] Fraturas causadas pela osteoporose constituem uma grande preocupação da saúde e resultam em um enorme fardo econômico sobre os sistemas de cuidados de saúde. O risco de qualquer fratura osteoporótica é alto no mundo ocidental (cerca de 50% para as mulheres e 20% para os homens), e fraturas são associadas com a mortalidade e morbidade significativa. O osso cortical constitui aproximadamente 80% do osso no corpo, e vários estudos mostraram que o osso cortical é o principal determinante de resistência óssea e, assim, a suscetibilidade da fratura. A perda óssea após a idade de 65 anos é principalmente devido à perda de osso cortical e não de osso trabecular (Lancet, 2010, May 15; 375(9727): 1729-1736).

[004] O esqueleto é remodelado pelo osso formando osteoblastos (OBs) e osteoclastos de reabsorção óssea (OCLs). O fator estimulante de colônias de macrófagos (M- CSF) aumenta a proliferação e sobrevivência das células precursoras de OCLs, bem como regula positivamente a expressão de ativador do receptor do fator nuclear-KB (RANK) em OCL. Isto permite o ligante de RANK (RANKL) a ligar e iniciar a cascata de sinalização que conduz à formação do OCL. O efeito de RANKL pode ser inibido pela osteoprotegerina (OPG), que é um receptor de atração para RANKL.

[005] A associação entre a inflamação e a perda óssea está bem estabelecida e a reabsorção óssea osteoclástica em doenças autoimunes é acionada por citocinas inflamatórias produzidas por células T ativadas. Além disso, vários estudos demonstram que a inflamação sistêmica de baixo grau, indicada por níveis séricos moderadamente elevados de proteína C reativa (hsCRP), associado à baixa BMD, reabsorção óssea elevada e aumento do risco de fratura. A deficiência de estrogênio que ocorre após a menopausa resulta em aumento da formação e sobrevivência prolongada de osteoclastos. Isto é sugerido como sendo devido a um número de fatores, incluindo a perda dos efeitos imunossupressores de estrogênio, resultando no aumento da produção de citocinas que promovem a osteoclastogênese, e os efeitos diretos do estrogênio sobre OCLS. De acordo com estes dados, o bloqueio das citocinas inflamatórias TNFα e IL-1 conduz a uma diminuição nos marcadores de reabsorção óssea em mulheres em pós-menopausa precoce.

[006] Nos últimos anos, a importância da microbiota intestinal (GM), tanto para a saúde e doença tem sido intensivamente estudada. A GM é composta de trilhões de bactérias que contêm coletivamente 150 vezes mais genes do que o nosso genoma humano. É adquirida no nascimento e, embora uma entidade distinta, claramente co-evoluiu com o genoma humano, e pode ser considerado um órgão multicelular que comunica com e afeta o seu hospedeiro de várias maneiras. A composição do GM é modulada por um certo número de fatores ambientais tais como a dieta e tratamentos com antibióticos. Moléculas produzidas pelas bactérias do intestino podem ser simultaneamente benéficas e prejudiciais, e são conhecidas por afetarem células endócrinas no intestino, o sistema nervoso entérico, a permeabilidade do intestino e o sistema imunológico. Composição microbiana perturbada tem sido postulada para estar envolvida em uma variedade de condições inflamatórias, dentro e fora do intestino incluindo a doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, alergias alimentares, eczema e asma, bem como a obesidade e a síndrome metabólica.

[007] As bactérias probióticas são definidas como microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas conferem um benefício à saúde do hospedeiro e são acreditadas para alterar a composição da microbiota intestinal. Os mecanismos subjacentes sugeridos são múltiplos, incluindo o aumento da solubilidade e absorção de minerais, a função de barreira melhorada e a modulação do sistema imunológico.

[008] Em Gilman et al., The effect of Probiotic Bacteria on Transepithelial Calcium Transport and Calcium uptake in Human Intestinal-like Caco-2 cells, Curr. Issues Intestinal Microbial. 7: 1 -6, uma de Lactobacillus salivarius (UCC 118), e uma cepa de Bifidobacterium infantis (UCC 35624) foi testada sobre a absorção de cálcio e o transporte de cálcio transepitelial em células Caco-2 do tipo intestinal humanas em cultura. As referidas cepas não tiveram efeito sobre o transporte transepitelial de cálcio em células Caco-2 antigas 16-d totalmente diferenciadas. Influxo de cálcio para as monocamadas de células Caco-2 após 24 h foi significativamente mais elevado nas células expostas a Lactobacillus salivarius.

[009] O documento WO99/02170 descreve o uso de lactobacilos na preparação de composições entéricas não fermentadas para facilitar ou aumentar a absorção de minerais da dieta, tais como cálcio, zinco, ferro e magnésio. As experiências aí realizadas, em suporte à referida absorção reivindicada, são um modelo in vitro de transporte de cálcio utilizando linhagens intestinais de Caco-2 (uma linhagem celular carcinogênica).

[0010] KR101279852 descreve composições para a prevenção ou tratamento da osteoporose contendo cálcio e magnésio em adição às cepas bacterianas específicas de ácido lático, tais como Streptococcus thermophilus com número de depósito KCTC11870BP, Lactobacillus rhamnosus, com número de depósito KCTC 11868BP, e Lactobacillus paracasei com número de depósito KCTC11866BP.

[0011] Existe ainda uma necessidade na técnica de encontrar métodos de prevenção e terapêuticos eficazes contra a osteoporose em seres humanos.

Descrição resumida da invenção

[0012] A presente invenção refere-se, em um aspecto, a pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei, ou pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei em combinação com pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus plantarum para uso no tratamento ou prevenção de osteoporose, ou para uso no aumento da absorção de íons de Ca2+em um mamífero, preferencialmente em um ser humano.

Breve descrição das figuras

[0013] Fig. 1 descreve o transporte de Ca2+testado com as diferentes cepas de bactérias tal como descrito no experimento 1 e 2.

[0014] Fig. 2 descreve o Ca2+intracelular restante nas células após 2 h, como descrito nos experimentos 1 e 2.

[0015] Fig. 3 descreve o delineamento experimental e peso corporal do experimento 3. Esboço de projeto de experimentos (A). Camundongos com oito semanas de idade foram tratados ou com veículo (veh), uma cepa de Lactobacillusúnica (L) (L. para) ou uma mistura de três cepas (L. Mix) durante 6 semanas, começando duas semanas antes da cirurgia ovx ou sham. As cepas de L. foram dadas na água potável em uma concentração de 109unidades formadoras de colônias (ufc)/ml enquanto que os camundongos de controle receberam água da torneira com veículo. Os camundongos tinham 14 semanas de idade no final do estudo, quando os tecidos foram recolhidos para análise posterior. Ovx resultou em um aumento do peso corporal esperado em comparação com os ratos sham, que não foi diferente após o tratamento probiótico (B). Os resultados são apresentados como média ± SEM (n = 9-10),**p <0,01. Teste t de Student ovx vs. sham.

[0016] Fig. 4 revela que os probióticos protegem os camundongos de perda óssea induzida cortical ovx. Camundongos com oito semanas de idade foram tratados ou com veículo (veh), uma cepa de Lactobacillus (L) única (L. para) ou uma mistura de três cepas (L. Mix) durante 6 semanas, começando duas semanas antes da cirurgia sham ou ovx para estudar o efeito preventivo do tratamento probiótico em perda de osso induzida por ovx. No fim do experimento, os fémures dissecados foram analisados com μOT de alta-resolução e tomografia computorizada quantitativa periférica (pQCT). Imagens de μOT representativas de uma seção cortical de veh e grupos L. mix tratados sham e ovx (A). Conteúdo mineral ósseo cortical (BMC) (B) e a área cortical (C) foram medidos por pQCT na região centro- diáfise do fêmur. Os valores são apresentados como média ± SEM (n=9-10). **p<0,01,*p<0,05. Teste tde Student ovx vs.sham. # p<0,05. ANOVA seguido por teste post hoc de Dunnet dentro dos grupos, ovx L. Para e L. mix vs. ovx veh.

[0017] Fig. 5 revela que os probióticos reduzem a expressão de citocinas inflamatórias e a relação de RANKL/OPG no osso cortical. Análise de qRT-PCR da expressão de genes conhecido para promover a reabsorção óssea; (A) Fator de Necrose alfa do Tumor (TNFα), (B) lnterleucina-1β (IL-I β), (C) lnterleucina-6 (IL-6), (D) Relação do ativador receptor do ligante de kappa B fator nuclear (RANKL) e Osteoprotegerina (OPG), e gráficos individuais de (E) OPG, (F) RANKL e genes conhecidos para promover a formação óssea; (G) Osterix, (H) Colágeno do tipo I, α1 (Col1α1) e (I), osteocalcina no osso cortical em camundongos ovariectomizados (ovx) de 14 semanas de idade tratados com ou veículo (veh) ou uma mistura de três cepas probióticas de Lactobacillus (L. Mix) durante 6 semanas, começando duas semanas antes da cirurgia sham ou ovx para estudar o efeito preventivo do tratamento probiótico na perda óssea induzida por ovx. Os valores são apresentados como média ± SEM, n=9-10.*P<0,05 versus tratamento veh, teste t de Student.

[0018] Fig. 6 revela que a excreção fracionada de Ca foi aumentada em ovx no veh tratado, mas não no L. para ou camundongos tratados com L. mix. Ca e creatinina foram medidas no soro e na urina de camundongos de 14 semanas de idade que foram tratados com veículo (veh), uma cepa de Lactobacillus única (L) (L. para) ou uma mistura de três cepas (L. mix) durante 6 semanas, a partir de duas semanas antes da cirurgia ovx ou sham. Excreção de Ca urinária fracionária foi calculada com a fórmula FECa = (Ca na urina x creatinina sérica)/(Ca no soro x creatinina na urina). Os valores são apresentados como média ± SEM, n=5-10 em cada grupo. *p<0,05. Teste tde Student ovx vs. sham. #p<0,05, ANOVA seguido por teste post hoc de Dunnett, dentro dos grupos ovx L. Para e L. mix vs ovx veh.

Descrição da invenção

[0019] A presente invenção refere-se, em uma modalidade, a pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei, ou a pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei em combinação com pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus plantarum, para uso no tratamento ou prevenção da osteoporose ou para uso no aumento da absorção de íons de Ca2+em um mamífero, preferencialmente em um ser humano.

[0020] A presente invenção refere-se, em uma modalidade da invenção, a pelo menos uma cepa probiótica para uso no tratamento ou prevenção de osteoporose, prevenção da perda de osso cortical, ao impedir a perda do conteúdo mineral do osso, e evitar a reabsorção óssea.

[0021] O osso cortical constitui aproximadamente 80% do osso no corpo e vários estudos mostraram que o osso cortical é o principal determinante de resistência óssea e, assim, à suscetibilidade de fratura. Tem sido demonstrado nas experiências da presente invenção, que uma cepa probiótica de Lactobacillus paracasei da espécie ou isoladamente ou em combinação com cepas de espécies de Lactobacillus plantarum evita a perda de osso cortical. Também é indicado nas experiências da presente invenção que o tratamento probiótico altera o estado imunológico no osso resultando na reabsorção óssea atenuada. Além disso, mostra-se também nas experiências da presente invenção que o teor mineral ósseo não foi reduzido no grupo de probióticos, em comparação com o grupo de cortical foi mais elevado em ambos os grupos probióticos em comparação com o grupo veículo (p <0,05, Figura 4b).

[0022] A presente invenção refere-se a pelo menos uma cepa probiótica escolhido a partir de Lactobacillus paracasei, ou pelo menos um Lactobacillus paracasei em combinao com pelo menos uma cepa probiótica escolhido a partir de Lactobacillus plantarum, para uso no tratamento ou prevenção da osteoporose, para a prevenção da perda do conteúdo mineral do osso, para prevenir a perda de osso em um mamífero, em especial em um ser humano.

[0023] A presente invenção refere-se a pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus paracasei, ou pelo menos uma Lactobacillus paracasei em combinação com pelo menos uma cepa probiótica escolhida a partir de Lactobacillus plantarum, para uso na prevenção da perda do conteúdo mineral do osso, para prevenir a perda de osso em um mamífero, em especial em um ser humano.

[0024] Em uma modalidade da invenção, pelo menos, duas ou mais cepas de Lactobacillus plantarumsão usadas em conjunto em uma combinação com pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei. Em outra modalidade, pelo menos duas ou mais, por exemplo, três ou mais, cepas de Lactobacillus paracaseisão usadas em conjunto em uma combinação com pelo menos uma cepa de Lactobacillus plantarum.

[0025] Em uma modalidade da invenção, a cepa probiótica é viável, inativada ou morta. Em uma modalidade da invenção as referidas cepas estão presentes em uma composição compreendendo adicionalmente pelo menos um veículo. O veículo pode ser qualquer veículo convencionalmente usado em, por exemplo, um suplemento dietético. O veículo pode ser qualquer veículo a base de cereais, tais como um veículo de aveia ou veículo de cevada, que pode ser usado em um alimento funcional ou qualquer outro tipo de alimento. O veículo pode ser água ou qualquer outro solvente aquoso no qual a cepa probiótica é misturada antes da ingestão.

[0026] Em uma modalidade da invenção, a composição é suplementada com Ca2+adicional sob a forma de, por exemplo, um sal, por exemplo, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, sais de cálcio de ácido cítrico, gliconato de cálcio, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio, óxido de cálcio, sulfato de cálcio. A ingestão diária recomendada (RDI) de Ca2+ é de 800 mg. A quantidade de Ca2+ na composição pode estar no intervalo de 10-40% do RDI, de preferência no intervalo de 15-30% de RDI. Assim, a quantidade de Ca2+, por exemplo, sob a forma de um sal na composição pode estar no intervalo de 80 a 320 mg, de preferência de 120 a 240 mg. A quantidade de Ca2+qualquer quantidade dentro do intervalo acima, de modo que a composição ainda é estável e proporciona os seus efeitos benéficos.

[0027] A composição pode ser uma composição não- seca fermentada ou uma composição fermentada. No caso de uma composição seca, não fermentada, a fermentação ocorre após ingestão da composição por um indivíduo, isto é, no trato gastrointestinal. Além disso, as cepas podem estar presentes na composição tal como cepas liofilizadas.

[0028] A cepa probiótica de Lactobacillus paracasei pode ser escolhida a partir de Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, e Lactobacillus paracasei 02:A, DSM 13432 e a cepa probiótica de Lactobacillus plantarum pode ser escolhida a partir de Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 e Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.

[0029] Lactobacillus paracasei 8700: 2, DSM 13434 e Lactobacillus paracasei 02:A, DSM 13432, ambas foram depositadas em 10 de Abril de 2000 na Deutsche Sammlung von Mikroorganimsen und Zellkulturen GmbH.

[0030] Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 e Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 foram depositadas no Deutsche Sammlung von Mikroorganimsen und Cell Cultures GmbH em 28 de Novembro de 2002.

[0031] Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, foi depositada em 21 de Março de 1995 e Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, foi depositada em 5 de Julho de 1991, no Deutsche Sammlung von Mikroorganimsen und Zellkulturen GmbH.

[0032] Em uma modalidade da invenção, a composição incluindo pelo menos uma cepa pode ser escolhida a partir do grupo que consiste de um produto alimentar, um suplemento alimentar, um alimento medicinal, um alimento funcional e um produto nutricional.

[0033] No caso em que a referida composição é um produto alimentar, ela pode ser escolhida a partir do grupo que compreende bebidas, iogurtes, sucos, sorvetes, pães, biscoitos, cereais, barras de cereais, e pastas para barrar.

[0034] Quando qualquer uma das cepas acima mencionadas é usada em uma composição tal como um suplemento dietético, o veículo(s) a ser adicionado é conhecido por um técnico especialista no assunto. Quaisquer outros ingredientes que são normalmente utilizados em suplementos alimentares são conhecidos por um técnico especialista no assunto, e podem também serem adicionados convencionalmente em conjunto com as cepas.

[0035] Em uma modalidade da invenção, a cepa(s) probiótica acima mencionada estão presentes em uma composição em uma quantidade de cerca de 1x106a cerca de 1x1014UFC, de preferência 1x108a 1x1012, e mais de preferência de 1x109a 1x1011. As cepas podem ser também ser utilizadas isoladamente na quantidade acima em água ou qualquer outro veículo aquoso em que as cepas são adicionadas ou misturadas antes da ingestão.

[0036] A invenção é adequada para ser utilizada pelos mamíferos, de preferência seres humanos, quaisquer tais como os idosos, mulheres pós-menopáusicas e mulheres pré-menopáusicas, em que a perda óssea, perda do conteúdo mineral do osso, e perda de osso aumentada ou reabsorção óssea são ou podem se tornar um problema.

[0037] As pessoas saudáveis podem naturalmente também se beneficiar com a invenção, a fim de se manterem saudáveis, e evitar ficar doente por osteoporose.

Experimental Experimento 1 Materiais e métodos "Soluções de Transporte”; volume total de 6 ml

[0038] As soluções de transporte continham solução salina equilibrada de Hank (HBSS) com Ca e Mg, Hepes (2%), Glutamina (4 mM), D-Glc (3, 5 g/l) e CaCl2 2 H2O (1,47 g/l). A análise da solução deu uma [Ca2+] em 10,65 mM.

"Solução Basal”

[0039] Semelhante à solução de transporte, mas sem a adição de cálcio externo. A análise desta solução deu uma [Ca2+] em 1,22 mM. Experimento 1: 1. Controle da solução de transporte apenas 2. Lactobacillus plantarum liofilizada 299v. 0788 mg correspondente a 4,02 x 108bactérias/6 ml em solução de transporte 3. Lactobacillus plantarum 299v. 4,02 x 108 bactérias/6 ml em solução de transporte 4. Lactobacillus plantarum 299. 4,95 x 108 bactérias/6 ml em solução de transporte 5. Lactobacillus plantarum HEAL 19, 4,95 x 108 bactérias/6 ml em solução de transporte 6. AMJ 1277. 4,95 x 108bactérias/6 ml em solução de transporte. AMJ 1277 é uma forma mutada de Lactobacillus plantarum 299v. Experimento 2: 1. CNCM I-2332, Lactobacillus acidophilus (La10); + 4,95 x 108bactérias/6 ml em solução de transporte 2. Lactobacillus plantarum 299 v. 4,02 x 108 bactérias/6 ml de solução de transporte 3. Controle - solução de transporte apenas

[0040] Todas as cepas exceto a cepa La10 foram cultivadas aerobicamente em 30 ml de MRS. (30° C, 210 rpm). La10 foi cultivada em 37°C e coberta com nitrogênio filtrado estéril antes da selagem. Número de células inoculadas foi de 3 x 108/balão. As bactérias foram pré- cultivadas durante a noite, e estavam em fase exponencial na inoculação. As células foram colhidas em OD600=0,1-0,5 e para cada cepa um volume correspondente a 4,02 x 108 células foi recolhido. Estas amostras foram centrifugadas a 5000 rpm, 3 min, o sobrenadante foi vertido, e as células re-suspensas em NaCl (0,9%). As células foram novamente centrifugadas e o sobrenadante foi decantado. O sedimento agora lavado foi então suspenso na solução de transporte.

[0041] As células Caco-2 foram lavadas com PBS (2 vezes) antes do teste. 45Ca Cl2 (74kBq/ml) foram adicionados às soluções de transporte. A mistura foi, em seguida, adicionada em um volume de 0,5 ml, apicalmente a células Caco-2 crescentes em inserções. Cada poço foi então obtido 6.7 x 107bactérias/ml. Apenas a solução basal (1,5 ml) que contêm apenas o [Ca 2+] endógeno em HBSS (1,22 mM) foi adicionada à Seção basal. Suspensões e controles foram deixados a funcionar nas células Caco-2 durante 2 h. Eles foram, em seguida, aspirados e as células foram lavadas com tampão de lavagem-gelado 3 vezes de acordo com o método descrito no documento WO99/02170. As células Caco-2 foram subsequentemente lisadas em 0,5 ml de NaOH (0,5 M). As soluções nas câmaras basais foram coletadas para mensuração de transporte com a ajuda de Cintilador (Tri-carb 2800TR, Perkin Elmer). Os lisados foram analisados para 45Ca, mas também para o teor de proteína. Todos os valores medidos para transporte de Ca2+/absorção foram normalizados contra o teor de proteínas nas respectivas células. Todos os poços foram verificados antes e após a incubação com as soluções de ensaio em relação à resistência transepitelial (TEER). Nenhuma diferença na TEER, antes e depois dos ensaios, pode ser vista. TEER é medida para assegurar que o epitélio não está vazando. A diferença de resistência depois de um ensaio pode levar à suspeita de que as ligações intercelulares podem ter sido danificadas pelas soluções utilizadas.

Resultados

[0042] Para permitir a comparação dos resultados dos experimentos 1 e 2, o transporte e os dados de captação das cepas estudadas foram normalizados contra a solução de controle sem bactérias. Todos os resultados são, portanto, apresentados como uma percentagem do controle (tal como feito em WO99/02170). Deve também notar-se que as experiências 1 e 2 foram feitas nos dias 16 e 21 de cultura celular, respectivamente. Em geral, observa-se que os desvios padrão dos resultados obtidos são relativamente grandes. Isto pode ser devido a alguma forma de agregação de bactérias e Ca2+, conduzindo a uma variação na disponibilidade de Ca2+. Isto não é observado para as bactérias liofilizadas, onde os desvios padrão foram relativamente pequenos em comparação com as amostras restantes.

Transporte de Ca2+

[0043] Os resultados do experimento 1 mostraram uma melhoria significativa do transporte de Ca2+quando a cepa AMJ1277 estava presente (134,7 ± 18,9%, p=0,002), ver fig. 1. Nenhuma das outras cepas (Lp299v liofilizado e viável, Lp299, Lp HEAL 19) deu diferenças significativas no transporte de Ca 2+, ver a tabela 1. .No experimento 2, onde La10 e Lp299v foram testados nenhuma diferença significativa no transporte de Ca2+foi detectada ao comparar as amostras com Lp299v vs controle sem bactérias (p=0,2). Para La10 uma ligeira diminuição do transporte de Ca2+foi observada na presença da mesma bactéria (79,5 ± 19,3%), e esta mudança foi significativa (p=0,049).

Absorção de Ca2+

[0044] Captação de dados aqui apresentados demonstram a quantidade de Ca2+presente nas células após 2 horas. Para uma estimativa dos dados de atualização reais, as quantidades intracelulares de Ca2+devem ser adicionadas à quantidade de Ca2+detectada nos compartimentos laterais. A soma destes dados descreve a quantidade total de Ca2+que foi transportada através da membrana apical. Os resultados destas experiências mostram geralmente uma redução na [Ca 2+] intracelular na presença de bactérias, em comparação com as soluções de controle livres de bactérias, ver Figura 2. No entanto, somente as diferenças de Lp299v liofilizada e viável, foram significativos ( p = 0,04 e p = 0,02). Note que os níveis de Ca2+intermediários intracelulares são apenas uma pequena porcentagem em comparação com a quantidade transportada de Ca2+. Devido a isto, o efeito demonstrado da absorção de Ca2+não tem o mesmo impacto que os efeitos sobre o transporte. Isto pode ser observado para Lp 299v liofilizada e viável, que tem uma maior [Ca2+] intracelular, mas não demonstrara uma melhoria no transporte.

Conclusão

[0045] Na presença da cepa AMJ1277, um mutante de Lactobacillus plantarum 299v, um aumento do transporte e até um total de absorção do cálcio é observado tanto em comparação com o controle quanto com as cepas restantes. Assim, há uma variação entre as cepas olhadas.

Experimento 3 Modelo de camundongo ovariectomizado e tratamento probiótico

[0046] Ovariectomia (OVX) resulta na perda óssea associada com o estado imunológico alterado. O objetivo deste experimento foi determinar se o tratamento probiótico protege os camundongos de perda óssea induzida por ovx. Os camundongos foram tratados com uma única cepa de Lactobacillus (L), L. paracasei DSM13434 (L. para), ou uma mistura de três cepas, L. paracasei DSM 13434, L. plantarum DSM 15312 e DSM 15313 (L. mix) dadas na água potável durante 6 semanas, começando duas semanas antes de ovx.

[0047] Camundongos fêmeos C57BL/6N de seis semanas de idade foram adquiridas de Charles River (Alemanha). Os camundongos foram alojados em um biotério padrão sob temperatura controlada (22°C), e com fotoperíodo (12h de luz, 12h de escuro), e tiveram livre acesso à água fresca e pelletes de alimento livre de soja R70 (Lactamin AB, Estocolmo, Suécia). O modelo ovariectomizado (OVX) para a osteoporose está incluído nas diretrizes do FDA para a avaliação pré-clínica e clínica para os agentes utilizados para o tratamento da osteoporose pós-menopáusica. O tratamento probiótico iniciado duas semanas antes de ovx para estudar o efeito preventivo do tratamento probiótico sobre a perda óssea induzida de ovx. Os camundongos foram tratados com uma única cepa de Lactobacillus (L), L .paracasei DSM13434 (L. para) ou uma mistura de três cepas, L. paracasei DSM13434, L. plantarum DSM 15312 e DSM 15313 referida como L. mix durante 6 semanas. As cepas probióticas foram selecionadas com base nas suas propriedades anti-inflamatórias. As cepas de L. foram dadas na água para beber em uma concentração de 109unidades formadoras de colônias (ufc)/ml, enquanto que os camundongos de controle receberam água da torneira com veículo. Garrafas de água foram trocadas a cada tarde. A sobrevivência das cepas L. nas garrafas de água foi verificada regularmente, e após 24 h a concentração caiu uma unidade de log para aproximadamente 108ufc/ml. Cada camundongo bebia em média 4,5 ml de água/dia. Após duas semanas de tratamento probiótico, os ratos eram ou sham- operados ou ovx sob anestesia inalatória com isoflurano (Forene; Abbot Escandinávia, Solna, Suécia). Quatro semanas após a cirurgia, o sangue foi recolhido a partir da veia axilar, sob anestesia com Ketalar/Domitor vet, e os camundongos foram subsequentemente sacrificados por deslocamento cervical. Tecidos para a preparação de RNA foram imediatamente removidos e congelados em nitrogênio líquido para posterior análise. Os ossos foram excisados e fixados em paraformaldeído a 4%. Todos os experimentos animais haviam sido aprovados pelos Comitês de Ética locais para Pesquisa Animal da Universidade de Gotemburgo. Tomografia computadorizada quantitativa periférica (pQCT)

[0048] Exames de tomografia computadorizada foram realizados com o pQCT XCT RESEARCH M (versão 4.5B, Norland, Fort Atkinson, WI, EUA), que opera com uma resolução de 70μm, como. Parâmetros ósseos corticais foram analisados ex vivo na região centro-diáfise do fêmur.

μCT de alta resolução

[0049] Análises de μCT de alta resolução foram realizadas no fémur distal, utilizando um modelo 1172 de μCT (Bruker micro-CT, Aartselaar, Bélgica). Os fêmures foram fotografadas com uma tensão de tubo de raios-X de 50 kV e corrente de 201 μA, com um filtro de alumínio de 0,5 mm. A rotação angular de varrimento foi de 180° e os incrementos angulares de 0,70°. O tamanho do voxel foi 4,48 μm isotropicalmente. O NRecon (versão 1.6.9) foi contratado para executar a reconstrução após os exames. No fémur, o proximal do osso trabecular à placa de crescimento distal foi selecionado para análises dentro de um volume de conformação de interesse (osso cortical excluído) com início a uma distância de 538,5 μm a partir da placa de crescimento, e estendendo-se mais uma distância longitudinal de 134,5 μm no sentido proximal. As medições corticais foram realizadas na região da diáfise do fémur a partir de uma distância de 3,59 mm a partir da placa de crescimento, e estendendo-se ainda mais uma distância longitudinal de 134,5 μm, no sentido proximal. Para a análise de DMO, o equipamento foi calibrado com amostras padrão de cerâmica.

Isolamento de RNA e PCR em Tempo Real

[0050] O RNA total foi preparado a partir de osso cortical (fémur com as extremidades removidas e medula óssea lavada com PBS antes de congelamento), e medula óssea usando Reagente Trizol (Invitrogen, Lidingo, Suécia). O RNA foi transcrito reversamente em cDNA utilizando o Kit High- Capacity cDNA de Transcrição Reversa (#4368814, Applied Biosystems, Estocolmo, Suécia). A análise de RT-PCR foi realizada utilizando o Sistema de Detecção de Sequência ABI Prism 7000 (PE Applied Biosystems).Utilizou-se ensaios de RT-PCR pré-desenhados a partir de Applied Biosystems (Suécia) para a análise da IL-6 (Mm00446190_m1), IL-1β (Mm00434228_m1), TNFα (Mm00443258_m1), RANKL (Mm00441908_m1), OPG (Mm00435452_m1), Runx2 (Mm00501580_m1 ), Col1α1 (Mm00801666_g1), osteocalcina (Mm01741771_g1) e níveis de mRNA de TGFβ1 (Mm03024053_m1). A abundância de mRNA de cada gene foi calculada usando o “método de curva padrão” (Boletim de usuário 2; PE Applied Biosystems) e ajustada para a expressão de RNA ribossomal 18S (4.308.329).

Análise de sangue

[0051] As análises foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante para cálcio no soro e urina (Kit de Ensaio QuantiChrom™Calcium (DICA-500), sistemas de Bioensaios, Hayward, CA, EUA), creatinina no soro e na urina (Kit Creatinina de Camundongos, Cristal Chem, Downers Grove, IL, EUA). Como um marcador da reabsorção óssea, níveis séricos de fragmentos de colágeno tipo I foram avaliados utilizando um kit de ELISA RatLaps (Nordic Bioscience Diagnostics, Herlev, Dinamarca). Os níveis séricos de osteocalcina, um marcador da formação óssea, foram determinados com um kit de ensaio imunoradiométrico de osteocalcina de camundongo (Immutopics, San Clemente, Califórnia).

Citometria de Fluxo

[0052] Células da medula óssea foram recolhidas por lavagem 5 ml de PBS através da cavidade do osso de um fémur usando uma seringa. Após centrifugação a 515 g durante 5 min, as células peletizadas foram ressuspensas em Tris 0,83% de solução de NH4Cl (pH 7,29) durante 5 minutos para lisar os eritrócitos e depois lavadas em PBS. Células da medula óssea foram ressuspensas em meio de cultura RPMI (PAA Laboratories, Pasching, na Áustria) antes da utilização. O número total de leucócitos da medula óssea foi calculado utilizando um contador de células automático (Sysmex, Hamburgo, Alemanha). Para as análises de citometria de fluxo , as células foram coradas com anticorpos conjugados a aloficocianina (APC) para CD4 para a detecção de células T auxiliares (Beckton-Dickinson) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) para anticorpos conjugados a células T CD8 citotóxicas (Beckton-Dickinson), ou proteínas peridinina-clorofila (PerCP) anticorpos conjugados a Gr-1/Ly-6G (BioLegend) para eliminar granulócitos e anticorpos conjugados com FITC para CD11b para a detecção de células precursoras OCL (Beckton- Dickinson). As células foram então submetidas a análise de fluorescência de separação de células ativadas (FACS) em um FACSCalibur (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, EUA) e analisadas utilizando o software FlowJo. Os resultados são expressos como a frequência de células (%).

Analises estatísticas

[0053] Todos os resultados estatísticos são apresentados como médias ± SEM. Diferenças entre os grupos foram calculadas por meio de testes t não pareados. Comparações entre vários grupos foram calculadas usando uma análise de uma via de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Dunnett para corrigir para as comparações múltiplas. Um p<0,05 bicaudal foi considerado significativo.

Resultados - tratamento probiótico protege camundongos contra a perda de osso cortical induzida por ovx e aumento da reabsorção óssea

[0054] Para determinar o efeito preventivo do tratamento probiótico na perda de osso induzida por ovx, camundongos com oito semanas de idade foram tratados com veículo (veh), uma cepa de Lactobacillus única (L) (L. para) ou uma mistura de três cepas (L. mix) durante 6 semanas, começando duas semanas antes da cirurgia sham ou ovx (Figura 3A). Peso do útero pode ser utilizado como um indicador do estado de estrogênio, e ovx resultou em um decréscimo esperado em peso do útero, que foi semelhante em todos os tratamentos (Tabela 2). Além disso, ovx aumentou o peso corporal, massa gorda e o peso do timo em todos os grupos de tratamento (Figura 3B, Tabela 2).

[0055] Nos camundongos tratados com veículo, ovx diminuiu o conteúdo mineral ósseo cortical e área óssea seccional cortical atravessada na região do médio- diafisário do fêmur (p <0,01, Figura 4a-c). De forma importante, ovx não reduziu o conteúdo mineral ósseo cortical ou área de osso seccional transversal cortical na L. para ou camundongos tratados com L. mix (Figura 4a-c). O teor mineral ósseo cortical foi mais elevado em ambos camundongos ovx tratados L. para e L. mix em comparação com camundongos ovx tratados veh (p <0,05, Figura 4b). Para determinar se o efeito preventivo de probióticos no osso cortical é causado por uma reabsorção óssea afetada, foram analisados os níveis séricos de telopeptídeos C-terminal (RatLaps). Os níveis aumentados de ovx de RatLaps em camundongos tratados com veh (+45±11%, p<0,05 sobre sham), mas não em L. para tratada (20±9%, não significativo) ou tratado com L. mix (23±9 %, não significativa). A formação óssea, como indicado por osteocalcina no soro, não foi significativamente afetada pelo tratamento probiótico (dados não mostrados). Parâmetros de osso trabecular (BV/TV e BMD trabecular) na região metafisária distal do fêmur foram significativamente reduzidos pelo ovx em todos os grupos de tratamento (p<0,05 Tabela 1). Estes resultados demonstram que o tratamento probiótico protege camundongos contra a perda de osso cortical induzida por ovx e aumento da reabsorção óssea.

Probióticos reduzem a expressão de citocinas inflamatórias e a relação de RANKL/OPG no osso cortical

[0056] Para investigar o mecanismo para o efeito de tratamento probiótico sobre a perda óssea cortical induzida por ovx, medimos transcritos de mRNA relacionados com osso no osso cortical (Figura 5). Os níveis de mRNA de TNFα, uma citocina inflamatória produzida por células mielóides que promove a osteoclastogênese, e IL-1β, um regulador a jusante dos efeitos do TNFα sobre o osso, foram significativamente diminuídos por tratamento probiótico em comparação com tratamento com veículo em camundongos ovx (TNFα - 46%, p<0,05; IL-1β-61%, p<0,05, Figura 5A e 5B). A expressão de IL-6 não diferiu entre os tratamentos, embora houvesse uma tendência para a diminuição da expressão no grupo de tratamento probiótico (-20%, p = 0,12, Figura 5c).

[0057] A relação de RANKL/osteoprotegerina (OPG) é um dos principais determinantes da osteoclastogeneisis e, desse modo, a reabsorção óssea. Mais importante, o tratamento probiótico diminuiu a proporção de RANKL/OPG (45%, p<0,05 em comparação com veh, Figura 5D) e este foi causado por um aumento da expressão de OPG (OPG; + 28%, p<0,05 e RANKL; 1%, não significativo, Figura 5e, f).Em contraste, os níveis de mRNA de três genes associados a osteoblastos, Osterix, Col1α1 e osteocalcina, não foram afetados pelo tratamento probiótico (Figura 5g-h).

Estado imunológico na Medula Óssea

[0058] Alguns dos efeitos anti-inflamatórios exercidos pelas bactérias probióticas são acreditados em serem mediados através da indução de células T reguladoras (Treg). Análise FACS da medula óssea mostrou que a frequência de células Treg (CD4+CD25 +Foxp3 +)foi diminuída por ovx nos camundongos tratados com veh, mas não nos camundongos tratados com probióticos (Tabela 2). As células Treg são dependentes de TGFβ para sua indução e manutenção, e a expressão de TGFβ1 foi aumentada na medula óssea a partir de camundongos tratados com ovx probióticos comparada com os tratados com ovx veículo.

[0059] Foi igualmente examinado se o tratamento probiótico modulou a frequência de células precursoras de osteoclastos (preOCLs) na medula óssea. A frequência de preOCLs (CD11b+Gr1-) na medula óssea não foi afetada por ovx em qualquer um dos grupos de tratamento (Tabela 2).

Metabolismo Mineral

[0060] A excreção fracionada urinária de cálcio (FECa = (Ca na urina x creatinina)/(Ca no plasma x creatinina na urina)) foi aumentada por ovx em em camundongos tratados com veh (+ 86%, p <0,05, Figura 6). O aumento induzido por FECa foi completamente prevenido pelo tratamento probiótico sugerindo reforçada acreção de Ca (Figura 6). Houve uma tendência de aumento dos níveis séricos de Ca após ovx em veh, mas não em camundongos tratados com probióticos (+13%, p = 0,05, Tabela 3). A razão de Ca na urina/creatinina não foi afetada por ovx em qualquer um dos grupos de tratamento (Tabela 3). Tabela 1

*se p<0,05 a alteração é considerado significativa. Tabela 2

[0061] Tabela 1. Pesos de Órgãos Responsivos de Estrogênio, Osso Trabecular e Células Imunológicas em Camundongos de Oito Semanas de Idade de Medula Óssea. Parâmetros do osso trabecular foram analisados por μCT de alta resolução na região metafisária distal do fêmur; Volume de osso trabecular como uma percentagem do volume de tecido (BV/TV); A densidade mineral óssea trabecular (BMD). Células da medula óssea do fémur foram coradas com anticorpos que reconhecem CD4, Foxp3, CD25, CD11b e Gr1. Os valores representam a percentagem de Treg (CD4+ CD25+ Foxp3+) ou preOCLs (CD11b+ Gr1-) na população total de medula óssea. Os resultados são apresentados como média±SEM, n = 6-10 em cada grupo.**p<0,01,*p<0,05, teste t de Student ovx vs. sham, #p<0,05, ANOVA-Dunnets dentro de grupos. Tabela 3

[0062] Tabela 2. Cálcio de Metabolismo Mineral e creatinina foram medidos no soro e urina a partir de camundongos velhos de 14 semanas. Os resultados são apresentados como média±SEM, n=5-10 em cada grupo. **p<0,01, *p<0,05, (*) p 0,05. Teste t de Student ovx vs. sham, # p<0,05, ANOVA-Dunnets com grupos.

[0063] Em conclusão, os dados da presente invenção mostram que os probióticos na água potável reduzem a perda de osso cortical induzida por ovx, sugerindo um potencial terapêutico para probióticos no tratamento da osteoporose pós-menopáusica. Além disso, os resultados apoiam um papel da microbiota intestinal para a regulação da massa óssea.

[0064] Ambos os tratamentos com L. para e L.mix protegeram os camundongos da perda de osso cortical induzida por ovx, e aumentaram a reabsorção óssea. Conteúdo mineral do ósseo cortical foi maior em ambos os camundongos ovx tratados com L. para e L. mix em comparação com camundongos ovx tratados com veículo (veh). A excreção fracionada urinária de cálcio e os marcadores de reabsorção RatLaps foram aumentadas por ovx no veh tratado, mas não nos camundongos tratados com L. para e L. mix. Assim, os probióticos inibem excreção induzida de ovx de cálcio na urina. Tratamento probiótico reduziu a expressão das duas citocinas inflamatórias, TNFα e IL-1β, e aumentou a expressão de OPG em osso cortical de camundongos ovx. Além disso, ovx diminuiu a frequência de células T regulatórias (CD4+ CD25+ Foxp3+) na medula óssea de camundongos tratados com veh, mas não nos tratados com probióticos. Assim, os probióticos inibem a diminuição induzida por ovx na frequência de células T reguladoras na medula óssea. Além disso, os probióticos aumentaram a expressão de TGFb1 na medula óssea, e probióticos inibem o aumento induzido por OVX do marcador da reabsorção Rat Lap. Em conclusão, o tratamento com L. para ou L. mix impede a perda de osso cortical induzida por ovx. As verificações da presente invenção indicam que estes tratamentos probióticos alteram o estado imunológico no osso, como demonstrado pela redução da expressão de citocinas inflamatórias e aumento da expressão de OPG, resultando na reabsorção óssea atenuada em camundongos ovx.

Experimento 4

[0065] Neste experimento será testado se os mesmos probióticos como mencionados acima irão afetar os mesmos parâmetros como acima (ou seja, massa óssea cortical, teor mineral ósseo, reabsorção óssea), em camundongos fêmeos que já foram ovariectomizados e, portanto, já perderam massa óssea. Camundongos fêmeos ovariectomizados é um modelo bem estabelecido de perda óssea pós-menopausa nas mulheres. A linha do tempo dos experimentos será conforme indicada abaixo.

[0066] Camundongos ovariectomizados => 4 semanas => tratamento probiótico durante 6 semanas => Fim

[0067] Probióticos serão dados em água potável e começará pela primeira vez após 4 semanas após ovariectomização. A dose será de 109UFC/ml/dia, e a ovariectomização terá lugar às 9-10 semanas de idade. As análises após o experimento final será (CT) de osso para medição da densidade e espessura, bem como a análise do soro e marcadores ósseos.

Claims

1. Uso da cepa probiótica de Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para aumentar a absorção de íons Ca2+no tratamento ou prevenção da osteoporose e/ou para aumentar a absorção de íons Ca2+no tratamento ou prevenção da perda óssea em um mamífero.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cepa probiótica de Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, está em combinação com pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarum.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma cepa probiótica de Lactobacillus plantarumé escolhida a partir de Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, e Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida cepa probiótica de Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, está em combinação com Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312 e Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido mamífero é um ser humano.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a(s) referida(s) cepa(s) probiótica(s) está(ão) presente(s) em uma composição compreendendo adicionalmente pelo menos um veículo.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida composição é fornecida na forma de um produto alimentar, um suplemento dietético, um alimento médico, um alimento funcional e um produto nutricional.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a(s) referida(s) cepa(s) está(ão) presente(s) em uma quantidade desde cerca de 1x106até cerca de 1x1014CFU, ou em uma quantidade desde cerca de 1x108até cerca de 1x1012CFU, ou mais preferencialmente, em uma quantidade de cerca de 1x109a cerca de 1x1011CFU.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a osteoporose é osteoporose pós-menopausa.