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BR112015013105B1 - Agente de rnai de fita dupla capaz de inibir a expressão de pcsk9, seus usos, composição farmacêutica e método de inibição da expressão de pcsk9 em uma célula in vitro - Google Patents

Agente de rnai de fita dupla capaz de inibir a expressão de pcsk9, seus usos, composição farmacêutica e método de inibição da expressão de pcsk9 em uma célula in vitro Download PDF

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BR112015013105B1
BR112015013105B1 BR112015013105-0A BR112015013105A BR112015013105B1 BR 112015013105 B1 BR112015013105 B1 BR 112015013105B1 BR 112015013105 A BR112015013105 A BR 112015013105A BR 112015013105 B1 BR112015013105 B1 BR 112015013105B1
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rnai
cell
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BR112015013105-0A
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Anna Borodovsky
Rajev G. Kallanthottathil
Kevin Fitzgerald
Maria Frank- Kamenetsky
William Querbes
Martin Maier
Klaus Charisse
Satyanarayana KUCHIMANCHI
Muthiah Manoharan
Stuart Milstein
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Alnylam Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

agente de irna de fita dupla capaz de inibir a expressão de pcsk9, seus usos, célula, composição farmacêutica e método de inibição da expressão de pcsk9 em uma célula in vitro. a invenção refere-se a agentes de rnai, por exemplo, agentes de rnai de fita dupla, se dirigindo ao gene de pcsk9, e a métodos de uso de tais agentes de rnai para inibir a expressão de pcsk9 e a métodos de tratamento de sujeitos tendo um distúrbio de lipídeos, tal como uma hiperlipidemia.

Description

Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido Provisóriodos E.U.A. No. 61/733.518, depositado a 5 de dezembro, 2012; Pedido Provisório dos E.U.A. No. 61/793.530, depositado a 15 de março, 2013; Pedido Provisório dos E.U.A. No. 61/886.916, depositado a 4 de outubro, 2013; e Pedido Provisório dos E.U.A. No. 61/892.188, depositado a 17 de outubro, 2013. Este pedido está também relacionado com o Pedido Provisório dos E.U.A. No. 61/561.710, depositado a 18 de novembro, 2011. Os conteúdos inteiros de cada um dos pedidos de patentes provisórias anteriores são deste modo incorporados aqui por referência.
Listagem de Sequências
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências quefoi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 29 de outubro, 2013, é chamada 121301-00420_SL.txt e tem 433.512 bytes em tamanho.
Antecedentes da Invenção
[003] A pró-proteína convertase subtilisina quexina 9 (PCSK9) éum membro da família das serinas proteases subtilisinas. As outras oito proteases subtilisinas de mamífero, PCSK1-PCSK8 (também chamada PC1/3, PC2, furina, PC4, PC5/6, PACE4, PC7, e S1P/SKI-1) são pró- proteína convertases que processam uma ampla variedade de proteínas na via secretora e desempenham papéis em diversos processos biológicos (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J. 17, 12151227, e Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748).
[004] Foi proposto que PCSK9 desempenha um papel nometabolismo do colesterol. A expressão de RNAm de PCSK9 é infrarregulada por alimentação de colesterol dietético em camundongos (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), suprarregulada por estatinas em células HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459), e suprarreguladas em camundongostransgênicos com proteína de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP) (Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1202712032), similar às enzimas biossintéticas do colesterol e ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR). Além do mais se descobriu que mutações de sentido trocado de PCSK9 estão associadas a uma forma de hipercolesterolemia dominante autossômica (Hchola3) (Abifadel, M., et al. (2003) Nat. Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422). PCSK9 pode também desempenhar um papel na determinação dos níveis de colesterol LDL na população geral, porque polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram associados a níveis de colesterol em uma população japonesa (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).
[005] As hipercolesterolemias dominantes autossômicas (ADHs)são doenças monogênicas nas quais os pacientes exibem níveis de colesterol total e LDL elevados, xantomas tandem, e aterosclerose prematura (Rader, D. J., (2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803). A patogênese de ADHs e uma forma recessiva, hipercolesterolemia recessiva autossômica (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14, 121-127), é devido a deficiências na captação de LDL pelo fígado. A ADH pode ser causada por mutações de LDLR, que previnem a captação de LDL, ou por mutações na proteína em LDL, apoliproteína B, que se liga ao LDLR. A ARH é causada por mutações na proteína ARH que são necessárias para endocitose do complexo LDLR-LDL através da sua interação com clatrina. Portanto, se as mutações de PCSK9 são causais em famílias de Hchola3, parece provável que PCSK9 desempenhe um papel na captação de LDL mediada por receptores.
[006] Estudos de superexpressão apontam para o papel dePCSK9 no controle dos níveis de LDLR e, consequentemente, captação de LDL pelo fígado (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 4886548875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). Asuperexpressão mediada por adenovírus de PCSK9 de camundongo ou humano durante 3 ou 4 dias em camundongos resulta em níveis de colesterol total e LDL elevados; este efeito não é visto em camundongos nocaute em LDLR (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 4886548875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638).Adicionalmente, a superexpressão de PCSK9 resulta em uma redução acentuada na proteína LDLR hepática, sem afetar os níveis de RNAm de LDLR, níveis de proteína SREBP, ou razão de proteína SREBP nuclear em relação a citoplasmática.
[007] Embora a própria hipercolesterolemia seja assintomática, aelevação prolongada do colesterol no soro pode levar a aterosclerose. Ao longo de um período de décadas, colesterol no soro cronicamente elevado contribui para formação de placas ateromatosas nas artérias, o que levar a estenose progressiva ou mesmo oclusão completa das artérias envolvidas. Adicionalmente, as placas menores podem romper e causar a formação de um coágulo e obstruir o fluxo sanguíneo resultando em, por exemplo, infarto do miocárdio e/ou acidente vascular cerebral. Se a formação da estenose ou oclusão for gradual, o fornecimento de sangue aos tecidos e órgãos diminui lentamente até a função dos órgãos se tornar comprometida.
[008] Portanto, existe uma necessidade na técnica de tratamentoseficazes para doenças associadas a PCSK9, tais como uma hiperlipidemia, por exemplo, hipercolesterolemia.
Sumário da Invenção
[009] Como descrito em mais detalhe em baixo são divulgadas aquicomposições compreendendo agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, se dirigindo a PCSK9. São também divulgados aqui métodos usando as composições da invenção para inibição da expressão de PCSK9 e para tratamento de patologias relacionadas com expressão de PCSK9, por exemplo, hipercolesterolemia.
[0010] Portanto, em um aspecto, a presente invenção proporcionaagentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, capazes de inibirem a expressão da Pro-Proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar com parte de um RNAm codificando PCSK9, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np-Na-(X X X) i-Nb-Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'antissenso: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')rNa'- nq‘ 5' (III)
[0011] em que:
[0012] i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0013] p, p’, q, e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[0014] cada Na e Na' representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0015] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações;
[0016] cada np, np’, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estarpresente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[0017] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ representam cada umindependentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos;
[0018] as modificações em Nb diferem da modificação em Y e asmodificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e
[0019] em que a fita senso está conjugada com pelo menos umligante.
[0020] Em uma modalidade, i é 0; j é 0; i é 1; j é 1; ambos i e j são0; ou ambos i e j são 1. Em outra modalidade, k é 0; l é 0; k é 1; l é 1; ambos k e l são 0; ou ambos k e l são 1.
[0021] Em uma modalidade, XXX é complementar com X’X’X’, YYYé complementar com Y’Y’Y’, e ZZZ é complementar com Z’Z’Z’.
[0022] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre no ou próximo dosítio de clivagem da fita senso.
[0023] Em uma modalidade, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11,12 e 13 da fita antissenso a partir da extremidade 5'.
[0024] Em uma modalidade, Y’ é 2’-O-metila.
[0025] Em uma modalidade, a fórmula (III) é representada pelafórmula (IIIa):senso: 5' np -Na -Y Y Y -Na - nq 3'antissenso: 3' np’-Na’- Y’Y’Y’- Na’- nq’ 5' (IIIa).
[0026] Em outra modalidade, a fórmula (III) é representada pelafórmula (IIIb):senso: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3'antissenso: 3' np’-Na’- Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’- Na’- nq’ 5' (IIIb)
[0027] em que cada Nb e Nb’ representa independentemente umasequência de oligonucleotídeos compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados.
[0028] Ainda em outra modalidade, a fórmula (III) é representadapela fórmula (IIIc):senso: 5' np -Na -X X X -Nb -Y Y Y -Na - nq 3'antissenso: 3' np‘-Na‘- X‘X‘X‘-Nb’- Y’Y’Y’- Na’- nq‘ 5‘ (IIIc)
[0029] em que cada Nb e Nb’ representa independentemente umasequência de oligonucleotídeos compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados.
[0030] Em uma modalidade, a fórmula (III) é representada pelafórmula (IIId):senso: 5' np -Na -X X X- Nb -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na- nq 3'antissenso: 3' np‘-Na’- X’X’X’- Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’- Na’- nq’ 5' (IIId)
[0031] em que cada Nb e Nb’ representa independentemente umasequência de oligonucleotídeos compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados e cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-10 nucleotídeos modificados.
[0032] Em uma modalidade, a região de fita dupla tem 15-30 paresde nucleotídeos em comprimento. Em outra modalidade, a região de fita dupla tem 17-23 pares de nucleotídeos em comprimento. Ainda emm outra modalidade, a região de fita dupla tem 17-25 pares de nucleotídeos em comprimento. Em uma modalidade, a região de fita dupla tem 23-27 pares de nucleotídeos em comprimento. Em outra modalidade, a região de fita dupla tem 19-21 pares de nucleotídeos em comprimento. Em outra modalidade, a região de fita dupla tem 21-23 pares de nucleotídeos em comprimento. Em uma modalidade, cada fita tem 15-30 nucleotídeos.
[0033] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos sãoselecionadas do grupo consistindo em LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietila, 2'-O-alquila, 2'-O-alila, 2'-C-alila, 2'-flúor, 2'-deoxi, 2’-hidroxila, e suas combinações. Em outra modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor.
[0034] Em uma modalidade, o ligante é em um ou mais derivadosde GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente. Em outra modalidade, o ligante é
Figure img0001
[0035] Em uma modalidade, o ligante está anexado à extremidade3' da fita senso.
[0036] Em uma modalidade, o agente de RNAi está conjugado como ligante como mostrado no seguinte esquema
Figure img0002
[0037] em que X é O ou S. Em uma modalidade, X é O.
[0038] Em uma modalidade, o agente compreende adicionalmentepelo menos uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato.
[0039] Em uma modalidade, a ligação internucleotídica defosforotioato ou metilfosfonato está no terminal 3’ de uma fita. Em uma modalidade, a fita é a fita antissenso. Em outra modalidade, a fita é a fita senso.
[0040] Em uma modalidade, a ligação internucleotídica defosforotioato ou metilfosfonato está no terminal 5’ de uma fita. Em uma modalidade, a fita é a fita antissenso. Em outra modalidade, a fita é a fita senso.
[0041] Em uma modalidade, a ligação internucleotídica defosforotioato ou metilfosfonato está em ambos os terminais 5' e 3' de uma fita. Em uma modalidade, a fita é a fita antissenso.
[0042] Em uma modalidade, o par de bases na posição 1 daextremidade 5' da fita antissenso do dúplex é um par de bases AU.
[0043] Em uma modalidade, os nucleotídeos de Y contêm umamodificação de 2'-flúor.
[0044] Em uma modalidade, os nucleotídeos de Y' contêm umamodificação de 2'-O-metila.
[0045] Em uma modalidade, p‘>0. Em outra modalidade, p‘=2.
[0046] Em uma modalidade, q’=0, p=0, q=0, e os nucleotídeos dasaliência de p’ são complementares com o RNAm alvo. Em outra modalidade, q’=0, p=0, q=0, e os nucleotídeos da saliência de p’ não são complementares com o RNAm alvo.
[0047] Em uma modalidade, a fita senso tem um total de 21nucleotídeos e a fita antissenso tem um total de 23 nucleotídeos.
[0048] Em uma modalidade, pelo menos um np‘ está ligado a umnucleotídeo da vizinhança através de uma ligação de fosforotioato.
[0049] Em uma modalidade, todos os np‘ estão ligados anucleotídeos da vizinhança através de ligações de fosforotioato.
[0050] Em uma modalidade, o agente de RNAi é selecionado do grupo de agentes de RNAi listados na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 12 e Figura 12.
[0051] Em uma modalidade, o agente de RNAi é selecionado dogrupo consistindo em AD-53815, AD-56663, AD-56658, AD-56676, AD- 56666, AD-57928, e AD-60212.
[0052] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona agentesde RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, capazes de inibirem a expressão da Pro-Proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar com parte de um RNAm codificando PCSK9, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np-Na-(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na- nq 3'antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)l-Na‘- nq‘5' (III)
[0053] em que:
[0054] i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0055] p, p’, q, e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[0056] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0057] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações;
[0058] cada np, np’, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estarpresente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[0059] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ representam cada umindependentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que as modificações são modificações de 2'-O-metila ou 2'-fluoro;
[0060] as modificações em Nb diferem da modificação em Y e asmodificações em Nb’ diferem da modificação em Y'; e
[0061] em que a fita senso está conjugada com pelo menos umligante.
[0062] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporcionaagentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, capazes de inibirem a expressão da Pro-Proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar com parte de um RNAm codificando PCSK9, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np-Na-(X X X) i-Nb-Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'antissenso: 3‘ np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)i-Na‘- nq’ 5' (III)
[0063] em que:
[0064] i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0065] cada np, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estarpresente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[0066] p, q, e q’ são cada um independentemente 0-6;
[0067] np’ >0 e pelo menos um np’ está ligado a um nucleotídeo davizinhança através de uma ligação de fosforotioato;
[0068] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0069] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações;
[0070] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ representam cada umindependentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que as modificações são modificações de 2'-O-metila ou 2'-fluoro;
[0071] as modificações em Nb diferem da modificação em Y e asmodificações em Nb’ diferem da modificação em Y'; e
[0072] em que a fita senso está conjugada com pelo menos umligante.
[0073] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporcionaagentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, capazes de inibirem a expressão da Pro-Proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar com parte de um RNAm codificando PCSK9, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np-Na-(X X X) i-Nb-Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'antissenso: 3' np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’- nq’ 5' (III)
[0074] em que:
[0075] i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0076] cada np, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estarpresente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[0077] p, q, e q’ são cada um independentemente 0-6;
[0078] np’ >0 e pelo menos um np’ está ligado a um nucleotídeo davizinhança através de uma ligação de fosforotioato;
[0079] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0080] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações;
[0081] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ representam cada umindependentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que as modificações são modificações de 2'-O-metila ou 2'-fluoro;
[0082] as modificações em Nb diferem da modificação em Y e asmodificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e
[0083] em que a fita senso está conjugada a pelo menos um ligante,em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[0084] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona agentesde RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, capazes de inibirem a expressão da Pro-Proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar com parte de um RNAm codificando PCSK9, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np-Na-(X X X) i-Nb-Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'antissenso: 3' np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’- nq’ 5' (III)
[0085] em que:
[0086] i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0087] cada np, nq, e nq‘, cada um dos quais pode ou não estarpresente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[0088] p, q, e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[0089] np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo davizinhança através de uma ligação de fosforotioato;
[0090] cada Na e Na‘ representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0091] cada Nb e Nb representa independentemente uma sequênciade oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações;
[0092] XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘, e Z‘Z‘Z‘ representam cada umindependentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que as modificações são modificações de 2'-O-metila ou 2'-fluoro;
[0093] as modificações em Nb diferem da modificação em Y e asmodificações em Nb diferem da modificação em Y\
[0094] em que a fita senso compreende pelo menos uma ligação defosforotioato; e
[0095] em que a fita senso está conjugada a pelo menos um ligante,em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[0096] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporcionaagentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, capazes de inibirem a expressão da Pro-Proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar com parte de um RNAm codificando PCSK9, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III): senso: 5' np-Na-Y Y Y - Na - nq 3'antissenso: 3' np‘-Na‘- Y’Y’Y’- Na’- nq‘ 5' (IIIa)
[0097] em que:
[0098] cada np, nq, e nq’, cada um dos quais pode ou não estarpresente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[0099] p, q, e q’ são cada um independentemente 0-6;
[00100] np’ >0 e pelo menos um np’ está ligado a um nucleotídeo davizinhança através de uma ligação de fosforotioato;
[00101] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[00102] YYY e Y’Y’Y’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que as modificações são modificações de 2'-O-metila ou 2'-fluoro;
[00103] em que a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato; e
[00104] em que a fita senso está conjugada a pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00105] A presente invenção proporciona também células, vetores, células hospedeiras, e composições farmacêuticas compreendendo os agentes de RNAi de fita dupla da invenção.
[00106] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona agente de RNAi selecionado do grupo de agentes de RNAi listados na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 12 e Figura 12.
[00107] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado usando uma composição farmacêutica.
[00108] Em modalidades preferenciais, o agente de RNAi é administrado em uma solução. Em algumas tais modalidades, o siRNA é administrado em uma solução não tamponada. Em uma modalidade, o siRNA é administrado em água. Em outras modalidades, o siRNA é administrado com uma solução tampão, tal como um tampão de acetato, um tampão de citrato, um tampão de prolamina, um tampão de carbonato, ou um tampão de fosfato ou qualquer sua combinação. Em algumas modalidades, a solução tampão é salino tamponado com fosfato (PBS).
[00109] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas compreendem adicionalmente uma formulação de lipídeos. Em uma modalidade, a formulação de lipídeos compreende um LNP, ou XTC. Em outra modalidade, a formulação de lipídeos compreende um MC3.
[00110] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de inibição da expressão de PCSK9 em uma célula. Os métodos incluem contato da célula com um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de fita dupla, ou vetor da invenção; e manutenção da célula produzida no passo (a) durante um tempo suficiente para se obter degradação do transcrito de RNAm de um gene de PCSK9, inibindo deste modo a expressão do gene de PCSK9 na célula.
[00111] Em uma modalidade, a célula está dentro de um indivíduo.
[00112] Em uma modalidade, o indivíduo é um humano.
[00113] Em uma modalidade, a expressão de PCSK9 é inibiada porpelo menos cerca de 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %.
[00114] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio mediado por expressão de PCSK9. Os métodos incluem administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de fita dupla, ou do um vetor da invenção, tratando deste modo o indivíduo.
[00115] Em uma modalidade, o indivíduo é um humano.
[00116] Em uma modalidade, o humano tem hipercolesterolemia.
[00117] Em uma modalidade, o agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de fita dupla, é administrado a uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 15 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 15 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, cerca de 15 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, ou cerca de 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg.
[00118] Em uma modalidade, o agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de fita dupla, é administrado subcutaneamente ou intravenosamente.
[00119] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado em um regime de dosagem que inclui uma fase de carga seguida por um fase de manutenção, em que a fase de carga compreende administração de uma dose de 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg cinco vezes por semana, e em que a fase de manutenção compreende administração de uma dose de 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg uma vez, duas vezes, ou três vezes semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, um vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses.
[00120] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado em duas ou mais doses. Em uma modalidade específica, o agente de RNAi é administrado a intervalos selecionados do grupo consistindo em uma vez a cada cerca de 12 horas, uma vez a cada cerca de 24 horas, uma vez a cada cerca de 48 horas, uma vez a cada cerca de 72 horas, e uma vez a cada cerca de 96 horas.
[00121] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de hipercolesterolemia em um indivíduo. Os métodos incluem administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de fita dupla, ou do um vetor da invenção, tratando deste modo o indivíduo.
[00122] Em uma modalidade, o indivíduo é um primata ou roedor. Em outra modalidade, o indivíduo é um humano.
[00123] Em uma modalidade, o agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de fita dupla, é administrado a uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado a uma dose de cerca de 10 mg/kg a cerca de 30 mg/kg.
[00124] Em uma modalidade, o agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de fita dupla, é administrado subcutaneamente ou intravenosamente.
[00125] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado em um regime de dosagem que inclui uma fase de carga seguida por um fase de manutenção, em que a fase de carga compreende administração de uma dose de 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg cinco vezes por semana, e em que a fase de manutenção compreende administração de uma dose de 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg uma vez, duas vezes, ou três vezes semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, um vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses.
[00126] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado em duas ou mais doses. Em uma modalidade específica, o agente de RNAi é administrado a intervalos selecionados do grupo consistindo em uma vez a cada cerca de 12 horas, uma vez a cada cerca de 24 horas, uma vez a cada cerca de 48 horas, uma vez a cada cerca de 72 horas, e uma vez a cada cerca de 96 horas.
[00127] Em uma modalidade, os métodos compreendem adicionalmente determinação de um genótipo ou fenótipo de LDLR do indivíduo.
[00128] Em uma modalidade, a administração resulta em uma diminuição no colesterol no soro no indivíduo.
[00129] Em uma modalidade, os métodos compreendem adicionalmente determinação do nível de colesterol no soro no indivíduo.
[00130] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pela seguinte descrição detalhada e desenhos.
Breve Descrição das Figuras
[00131] A Figura 1 é um gráfico ilustrando que existe um efeito de resposta à dose com AD-48400 conjugado com GalNAc a todas as três dosagens testadas. AD-48399, conjugado com GalNAc, serve como um controle.
[00132] As Figuras 2A e 2B são gráficos ilustrando a eficácia e duração da resposta in vivo para os siRNAs indicados.
[00133] A Figura 3 é uma Tabela mostrando as sequências das fitas senso (SEQ ID NOS 1633-1642, respectivamente, por ordem de aparecimento) e antissenso (SEQ ID NOS 1643-1652, respectivamente, por ordem de aparecimento) dos dúplexes analisados quanto à eficácia in vivo e otimização do composto-protótipo.
[00134] A Figura 4 é um gráfico ilustrando os resultados dos ensaios de eficácia in vivo quanto à otimização do composto-protótipo.
[00135] A Figura 5 é um gráfico ilustrando os resultados dos ensaios de resposta à dose in vivo realizados em camundongos transgênicos quanto a PCSK9. Setenta e duas horas após uma dose única de 10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg, e 0,3 mg/kg de AD-57928, os níveis da proteína PCSK9 foram determinados por ELISA.
[00136] A Figura 6 é um gráfico ilustrando os níveis da proteína PCSK9 no soro de camundongos transgênicos quanto a PCSK9 após administração de AD-57928 em doses de 5x2 mg/kg durante a "fase de carga" e doses de 1x2 mg/kg ou 2x2 mg/kg durante a "fase de manutenção".
[00137] A Figura 7 é um gráfico ilustrando os níveis da proteína PCSK9 no soro de camundongos transgênicos quanto a PCSK9 após administração de AD-57928 em doses de 5x1 mg/kg durante a "fase de carga" e doses de 1x1 mg/kg ou 2x1 mg/kg durante a "fase de manutenção".
[00138] A Figura 8 é um gráfico ilustrando os níveis da proteína PCSK9 no soro de camundongos transgênicos quanto a PCSK9 após administração de AD-57928 em doses de 5x0,5 mg/kg durante a "fase de carga" e doses de 1x0,5 mg/kg ou 2x0,5 mg/kg durante a "fase de manutenção".
[00139] A Figura 9 é um gráfico ilustrando os resultados dos ensaios de resposta à dose in vivo realizados em camundongos transgênicos quanto a PCSK9. Setenta e duas horas após uma dose única de 0,3 mg/kg de siRNAs, os níveis da proteína PCSK9 foram determinados por ELISA.
[00140] A Figura 10 é um gráfico mostrando a quantidade de AD- 57928 e AD-58895 por nanograma de fígado de camundongos de tipo selvagem C57B6 após administração de uma dose única de 1 mg/kg de AD-57928 ou AD-58895.
[00141] A Figura 11 é um gráfico mostrando a quantidade de AD- 57928 e AD-58895 expressa como uma % da quantidade teórica no fígado de camundongos de tipo selvagem C57B6 após administração de uma dose única de 1 mg/kg de AD-57928 ou AD-58895.
[00142] A Figura 12A é uma Tabela ilustrando agentes de RNAi da invenção contendo sequências otimizadas em comparação com sequências de AD-57928. A Figura 12A divulga as sequências "Senso" como SEQ ID NOS 1653-1658, respectivamente, por ordem de aparecimento, e as sequências "Antissenso" como SEQ ID NOS 16591664, respectivamente, por ordem de aparecimento.
[00143] A Figura 12B é um gráfico mostrando os valores de IC50 dos agentes de RNAi indicados.
[00144] A Figura 13 é um gráfico mostrando o nível dos agentes de RNAi indicados no fígado de camundongos de tipo selvagem após administração de uma dose única de 1 mg/kg do agente de RNAi indicado.
[00145] A Figura 14A é um gráfico mostrando a quantidade de proteína PCSK9 no soro de primatas não humanos expressa como percentagem de PCSK9 restante em relação a níveis pré-sangramento de PCSK9 após administração dos agentes de RNAi indicados a qdx5 + qwx3.
[00146] A Figura 14B é um gráfico mostrando a quantidade absoluta de proteína PCSK9 no soro de primatas não humanos após administração dos agentes de RNAi indicados a qdx5 + qwx3.
[00147] A Figura 15 é um gráfico mostrando a quantidade de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL ou LDLc) no soro de primatas não humanos expressa como uma percentagem de LDL restante em relação a níveis pré-sangramento de LDL após administração dos agentes de RNAi indicados a qdx5 + qwx3.
[00148] A Figura 16A é um gráfico mostrando a quantidade decolesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL ou LDLc) no soro de primatas não humanos expressa como uma percentagem da quantidade média de níveis pré-sangramento de LDL após administração de AD-57928 a 2 mg/kg, q1w e 1 mg/kg, 2xw.
[00149] A Figura 16B é um gráfico mostrando a quantidade de proteína PCSK9 em relação à quantidade pré-sangramento no soro de primatas não humanos após administração de AD-57928 a 2 mg/kg, q1w e 1 mg/kg, 2xw.
[00150] A Figura 17A é um gráfico mostrando a quantidade decolesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL ou LDLc) no soro de primatas não humanos expressa como uma percentagem da quantidade média de níveis pré-sangramento de LDL após administração de AD-57928 a 2 mg/kg, 2xw e uma dose única de 25 mg/kg. A última dose para o grupo com 2 mg/kg, 2xw foi dia 36.
[00151] A Figura 17B é um gráfico mostrando a quantidade de proteína PCSK9 em relação à quantidade pré-sangramento no soro de primatas não humanos após administração de AD-57928 a 2 mg/kg, 2xw e uma dose única de 25 mg/kg.
[00152] A Figura 18 é um gráfico mostrando a quantidade de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL ou LDLc) no soro de primatas não humanos expressa como uma percentagem de LDL restante em relação a níveis pré-sangramento de LDL apósadministração dos agentes de RNAi indicados a qdx5 + qwx3.
[00153] A Figura 19 é um gráfico mostrando a quantidade decolesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL ou LDLc) no soro de primatas não humanos expressa como uma percentagem de LDLrestante em relação a níveis pré-sangramento de LDL apósadministração dos agentes de RNAi indicados a qdx5 + qwx3.
Descrição Detalhada da Invenção
[00154] A presente invenção proporciona composições compreendendo agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, se dirigindo a PCSK9. São também divulgados aqui métodos usando as composições da invenção para inibição da expressão de PCSK9 e para tratamento de patologias relacionadas com expressão de PCSK9, por exemplo, hipercolesterolemia.I. Definições
[00155] De modo a que a presente invenção possa ser mais prontamente entendida, certos termos são primeiramente definidos. Adicionalmente deve ser notado que sempre que um valor ou gama de valores de um parâmetro for recitado é pretendido que valores e gamas intermédios dos valores recitados sejam parte desta invenção.
[00156] Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referirem a um ou mais do que um (i.e., a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.
[00157] O termo "incluindo" é usado aqui para significar, e é usado indistintamente com a frase "incluindo mas não se limitando a".
[00158] O termo "ou" é usado aqui para significar, e é usado indistintamente com, o termo "e/ou", a não ser que o contexto indique claramente de outro modo.
[00159] Como usado aqui, "PCSK9" se refere ao gene da ou proteína pro-proteína convertase subtilisina quexina 9. PCSK9 é também conhecido como FH3, HCHOLA3, NARC-1, ou NARCl. O termo PCSK9 inclui PCSK9 de humano, a sequência de aminoácidos e nucleotídeos da qual pode ser encontrada, por exemplo, no Número de Acesso do GenBank GI:299523249; PCSK9 de camundongo, a sequência de aminoácidos e nucleotídeos da qual pode ser encontrada, por exemplo, no Número de Acesso do GenBank GI:163644257; PCSK9 de rato, a sequência de aminoácidos e nucleotídeos da qual pode ser encontrada, por exemplo, no Número de Acesso do GenBank GI:77020249. Exemplos adicionais de sequências de RNAm de PCSK9 estão prontamente disponíveis usando, por exemplo, GenBank.
[00160] Como usada aqui, "sequência alvo" se refere a uma porção contígua da sequência de nucleotídeos de uma molécula de RNAm formada durante a transcrição de um gene de PCSK9, incluindo RNAm que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primária.
[00161] Como usado aqui, o termo "fita compreendendo uma sequência" se refere a um oligonucleotídeo compreendendo uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura de nucleotídeos padrão.
[00162] "G", "C", "A" e "U" designam cada um geralmente umnucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, e uracila como uma base, respectivamente. "T" e "dT" são usados indistintamente aqui e se referem a um deoxirribonucleotídeo em que a nucleobase é timina, por exemplo, deoxirribotimina, 2’-deoxitimidina ou timidina. No entanto será entendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" ou "deoxirribonucleotídeo" pode também se referir a um nucleotídeo modificado, como adicionalmente detalhado em baixo, ou uma fração de substituição suplente. A pessoa perita está bem ciente de que guanina, citosina, adenina, e uracila podem ser substituídas por outras frações sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo transportando tal fração de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode sofrer emparelhamento de bases com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Consequentemente, nucleotídeos contendo uracila, guanina, ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos da invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Sequências compreendendo tais frações de substituição são modalidades da invenção.
[00163] Os termos "iRNA", "agente de RNAi", "agente de RNAi", "agente de interferência de RNA" como usados indistintamente aqui se referem a um agente que contém RNA como esse termo é definido aqui, e que medeia a clivagem direcionada de um transcrito de RNA através de uma via do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). RNAi dirige a degradação específica quanto à sequência de RNAm através de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi). O RNAi modula, por exemplo, inibe, a expressão de PCSK9 em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo mamífero.
[00164] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui um RNA de fita única que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de RNAm alvo de PCSK9, para dirigir a clivagem do RNA alvo. Sem desejar estar limitado pela teoria se acredita que o RNA de fita dupla longo introduzido nas células é degradado em siRNA por uma endonuclease do Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease III, processa o dsRNA em curtos RNAs de interferência com 19-23 pares de bases com saliências 3' de duas bases características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são depois incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar oriente o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Após ligação ao RNAm alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Assim, em um aspecto, a invenção se relaciona com um RNA de fita única (siRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo RISC para efetivar o silenciamento do gene alvo, i.e., um gene de PCSK9. Portanto, o termo "siRNA" é também usado aqui para se referir a um RNAi como descrito acima.
[00165] Em outra modalidade, o agente de RNAi pode ser um siRNA de fita única que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um RNAm alvo. O agente de RNAi de fita única se liga à endonuclease Argonauta 2 do RISC, que cliva depois o RNAm alvo. Os siRNAs de fita única têm geralmente 15-30 nucleotídeos e estão quimicamente modificados. O desenho e teste de siRNAs de fita única são descritos na Patente dos E.U.A. No. 8,101,348 e em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, os conteúdos inteiros de cada um dos quais são deste modo incorporados aqui por referência. Qualquer uma das sequências de nucleotídeos antissenso descritas aqui pode ser usada como um siRNA de fita única como descrito aqui ou como quimicamente modificada pelos métodos descritos em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894.
[00166] Em outra modalidade, um "RNAi" para uso nas composições, usos, e métodos da invenção é um RNA de fita dupla e é referido aqui como um "agente de RNAi de fita dupla", "molécula de RNA de fita dupla (dsRNA)", "agente de dsRNA", ou "dsRNA". O termo "dsRNA" se refere a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura de dúplex compreendendo duas fitas de ácidos nucleicos antiparalelas e substancialmente complementares, referido como tendo orientações "senso" e "antissenso" no que diz respeito a um RNA alvo, i.e., um gene de PCSK9. Em algumas modalidades da invenção, o RNA de fita dupla (dsRNA) desencadeia a degradação de um RNA alvo, por exemplo, um RNAm, através de um mecanismo de silenciamento de genes pós- transcricional referido aqui como interferência de RNA ou RNAi.
[00167] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada fita de uma molécula de dsRNA é ribonucleotídeos, mas, como descrito em detalhe aqui, cada uma das ou ambas as fitas podem também incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Adicionalmente, como usado em esta especificação, um "agente de RNAi" pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente de RNAi pode incluir modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos. Tais modificações podem incluir todos os tipos de modificações divulgadas aqui ou conhecidas na técnica. Quaisquer tais modificações, como usadas em uma molécula do tipo siRNA, estão englobadas por " agente de RNAi" para os propósitos desta especificação e reivindicações.
[00168] As duas fitas formando a estrutura de dúplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou podem ser moléculas de RNA separadas. Onde as duas fitas são parte de uma molécula maior, e estão portanto, conectadas por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma fita e a extremidade 5' da respectiva outra fita formando a estrutura de dúplex, a cadeia de RNA conectante é referida como uma "estrutura em gancho". Onde as duas fitas estão conectadas covalentemente por meios sem ser uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma fita e a extremidade 5' da respectiva outra fita formando a estrutura de dúplex, a estrutura conectante é referida como um "ligante". As fitas de RNA podem ter o mesmo ou um diferente número de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotídeos na fita mais curta de dsRNA menos quaisquer saliências que estejam presentes no dúplex. Adicionalmente à estrutura de dúplex, um agente de RNAi pode compreender uma ou mais saliências de nucleotídeos.
[00169] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção é um dsRNA de 24-30 nucleotídeos que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de RNAm alvo de PCSK9, para dirigir a clivagem do RNA alvo. Sem desejar estar limitado pela teoria, o RNA de fita dupla longo introduzido nas células é degradado em siRNA por uma endonuclease do Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease III, processa o dsRNA em curtos RNAs de interferência com 19-23 pares de bases com saliências 3' de duas bases características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são depois incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar oriente o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Após ligação ao RNAm alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Como usada aqui, uma "saliência de nucleotídeos" se refere ao nucleotídeo ou nucleotídeos não emparelhados que sobressaem da estrutura de dúplex de um agente de RNAi quando uma extremidade 3' de uma fita do agente de RNAi se prolonga para além da extremidade 5' da outra fita, ou vice versa. "Coesão" ou "extremidade coesiva" significa que não existem nenhuns nucleotídeos não emparelhados em essa extremidade do agente de RNAi de fita dupla, i.e., nenhuma saliência de nucleotídeos. Um agente de RNAi "de extremidades coesivas" é um dsRNA que tem fita dupla ao longo do seu comprimento inteiro, i.e., nenhuma saliência de nucleotídeos em qualquer uma das extremidades da molécula. Os agentes de RNAi da invenção incluem agentes de RNAi com saliências de nucleotídeos em uma extremidade (i.e., agentes com uma saliência e uma extremidade coesiva) ou com saliências de nucleotídeos em ambas as extremidades.
[00170] O termo "fita antissenso" se refere à fita de um agente de RNAi de fita dupla que inclui uma região que é substancialmente complementar com uma sequência alvo (por exemplo, um RNAm de PCSK9 de humano). Como usado aqui, o termo "região complementar com parte de um RNAm codificando transtiretina" se refere a uma região na fita antissenso que é substancialmente complementar com parte de uma sequência de RNAm de PCSK9. Onde a região de complementaridade não é completamente complementar com a sequência alvo, as não correspondências são mais toleradas nas regiões terminais e, se presentes, estão geralmente em uma região ou regiões terminais, por exemplo, com 6, 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos do terminal 5' e/ou 3'.
[00171] O termo "fita senso", como usado aqui, se refere à fita de um dsRNA que inclui uma região substancialmente complementar com uma região da fita antissenso.
[00172] Como usada aqui, o termo "sítio de clivagem" se refere a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. O sítio de clivagem é o local no alvo no qual ocorre clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem compreende três bases em qualquer uma das extremidades do, e imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem compreende duas bases em qualquer uma das extremidades do, e imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no local ligado pelos nucleotídeos 10 e 11 da fita antissenso, e o sítio de clivagem compreende os nucleotídeos 11, 12 e 13.
[00173] Como usado aqui, e a não ser que indicado de outro modo, o termo "complementar", quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos em relação a uma segunda sequência de nucleotídeos, se refere à capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucleotídeos de hibridar e formar uma estrutura de dúplex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência de nucleotídeos, como será entendido pela pessoa perita. Tais condições podem, por exemplo, ser condições estringentes, onde condições estringentes podem incluir: NaCl a 400 mM, PIPES a 40 mM pH 6,4, EDTA a 1 mM, 50 °C ou 70 °C durante 12-16 horas seguido de lavagem. Podem ser aplicadas outras condições, tais como condições fisiologicamente relevantes como pode ser encontrado dentro de um organismo. Por exemplo, uma sequência complementar é suficiente para permite que a função relevante do ácido nucleico proceda, por exemplo, RNAi. A pessoa perita será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridados.
[00174] As sequências podem ser "completamente complementares" no que diz respeito a cada uma quando existe emparelhamento de bases dos nucleotídeos da primeira sequência de nucleotídeos com os nucleotídeos da segunda sequência de nucleotídeos ao longo do comprimento inteiro das primeira e segunda sequências denucleotídeos. No entanto, onde uma primeira sequência é referida como "substancialmente complementar" no que diz respeito a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser completamente complementares, ou podem formar um ou mais, mas geralmente não mais do que 4, 3 ou 2, pares de bases não correspondidos após hibridação, enquanto retêm a capacidade de hibridarem sob as condições o mais relevantes à sua aplicação final. No entanto, onde dois oligonucleotídeos são desenhados para formar, após hibridação, uma ou mais saliências de fita única, tais saliências não devem ser consideradas como não correspondências no que diz respeito à determinação da complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo com 21 nucleotídeos em comprimento e outro oligonucleotídeo com 23 nucleotídeos em comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é completamente complementar com o oligonucleotídeo mais curto, pode ser ainda referido como "completamente complementar" para os propósitos descritos aqui.
[00175] Sequências "complementares", como usadas aqui, podem também incluir, ou ser inteiramente formadas de pares de bases não de Watson-Crick e/ou pares de bases formados a partir de nucleotídeos não naturais e modificados, desde que sejam cumpridos os requisitos acima no que diz respeito à sua capacidade de hibridação. Tais pares de bases não de Watson-Crick incluem, mas não estão limitados a, emparelhamento de bases Oscilantes G:U ou de Hoogstein.
[00176] Os termos "complementar", “"completamente complementar" e "substancialmente complementar" aqui podem ser usados no que diz respeito à correspondência de bases entre a fita senso e a fita antissenso de um dsRNA, ou entre a fita antissenso de um dsRNA e uma sequência alvo, como será entendido a partir do contexto do seu uso.
[00177] Como usado aqui, um polinucleotídeo que é "substancialmente complementar com pelo menos parte de" um RNA mensageiro (RNAm) se refere a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar com uma porção contígua do RNAm de interesse (por exemplo, um RNAm codificando PCSK9) incluindo uma 5' UTR, uma grelha de leitura abeta (ORF), ou uma 3' UTR. Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar com pelo menos uma parte de um RNAm de PCSK9 se a sequência for substancialmente complementar com uma porção ininterrupta de um RNAm codificando PCSK9.
[00178] O termo "inibição", como usado aqui, é usado indistintamente com "redução", "silenciamento", "infrarregulação", "supressão" e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição.
[00179] A frase "inibição da expressão de um PCSK9", como usada aqui, inclui inibição da expressão de qualquer gene de PCSK9 (tal como, por exemplo, um gene de PCSK9 de camundongo, um gene de PCSK9 de rato, um gene de PCSK9 de macaco, ou um gene de PCSK9 de humano) bem como variantes (por exemplo, variantes ocorrendo naturalmente), ou mutantes de um gene de PCSK9. Assim, o gene de PCSK9 pode ser um gene de PCSK9 de tipo selvagem, um gene de PCSK9 mutante, ou um gene de PCSK9 transgênico no contexto de uma célula, grupo de células, ou organismo geneticamente manipulado.
[00180] "Inibição da expressão de um gene de PCSK9" inclui qualquer nível de inibição de um gene de PCSK9, por exemplo, supressão pelo menos parcial da expressão de um gene de PCSK9, tal como uma inibição de pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 %.
[00181] A expressão de um gene de PCSK9 pode ser avaliada com base no nível de qualquer variável associada à expressão do gene de PCSK9, por exemplo, nível de RNAm de PCSK9, nível de proteína de PCSK9, ou níveis de lipídeos no soro. A inibição pode ser avaliada por uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais destas variáveis em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que seja utilizado na técnica, por exemplo, um nível de linha de base pré-dose, ou um nível determinado a partir de um indivíduo, célula, ou amostra similar que não é tratado ou tratado com um controle (tal como, por exemplo, controle só com tampão ou controle com agente inativo).
[00182] A frase "contato de uma célula com um agente de RNAi de fita dupla", como usada aqui, inclui contato de uma célula por quaisquer meios possíveis. Contato de uma célula com um agente de RNAi de fita dupla inclui contato de uma célula in vitro com o agente de RNAi ou contato de uma célula in vivo com o agente de RNAi. O contato pode ser feito diretamente ou indiretamente. Assim, por exemplo, o agente de RNAi pode ser colocado em contato físico com a célula pelo indivíduo realizando o método, ou, alternativamente, o agente de RNAi pode ser colocado em uma situação que irá permitir ou fazer com que entre subsequentemente em contato com a célula.
[00183] O contato de uma célula in vitro pode ser feito, por exemplo, por incubação da célula com o agente de RNAi. O contato de uma célula in vivo pode ser feito, por exemplo, por injeção do agente de RNAi no ou próximo do tecido onde a célula está localizada, ou por injeção do agente de RNAi em outra área, na corrente sanguínea ou no espaço subcutâneo, tal que o agente irá subsequentemente alcançar o tecido onde está localizada a célula a ser contatada. Por exemplo, o agente de RNAi pode conter e/ou estar acoplado a um ligante, por exemplo, um ligante de GalNAc3, que dirige o agente de RNAi para um local de interesse, por exemplo, o fígado. Combinações de métodos de contato in vitro e in vivo são também possíveis. Em conexão com os métodos da invenção, uma célula pode ser também contatada in vitro com um agente de RNAi e subsequentemente transplantada em um indivíduo.
[00184] Um "paciente" ou "indivíduo", como usado aqui, se destina a incluir um humano ou animal não humano, preferencialmente um mamífero, por exemplo, um macaco. O mais preferencialmente, o indivíduo ou paciente é um humano.
[00185] Uma "doença associada a PCSK9", como usada aqui, se destina a incluir qualquer doença associada ao gene de ou proteína PCSK9. Uma tal doença pode ser causada, por exemplo, por produção em excesso da proteína PCSK9, por mutações do gene de PCSK9, por clivagem anormal da proteína PCSK9, por interações anormais entre PCSK9 e outras proteínas ou outras substâncias endógenas ou exógenas. Doenças associadas a PCSK9 exemplares incluem lipidemias, por exemplo, uma hiperlipidemia, e outras formas de desequilíbrio de lipídeos tais como hipercolesterolemia, hipertriglice- ridemia e as condições patológicas associadas a estes distúrbios tais como doenças do coração e circulatórias.
[00186] É pretendido que "quantidade terapeuticamente eficaz", como usada aqui, inclua a quantidade de um agente de RNAi que, quando administrada a um paciente para tratamento de uma doença associada a PCSK9, é suficiente para efetivar tratamento da doença (por exemplo, por diminuição, melhoria ou manutenção da doença existente ou um ou mais sintomas de doença). A "quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, da doença e sua gravidade e do historial, idade, peso, historial familiar, constituição genética, etapa de processos patológicos mediados por expressão de PCSK9, dos tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se alguns, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[00187] É pretendido que "quantidade profilaticamente eficaz", como usada aqui, inclua a quantidade de um agente de RNAi que, quando administrada a um indivíduo que não experimenta ou exibe ainda sintomas de uma doença associada a PCSK9, mas que possa estar pré- disposto à doença, é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença. Melhoria da doença inclui abrandamento da progressão da doença ou redução da gravidade da doença com desenvolvimento posterior. A "quantidade profilaticamente eficaz" pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, do grau de risco da doença, e do historial, idade, peso, historial familiar, constituição genética, dos tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se alguns, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[00188] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade profilaticamente eficaz" inclui também uma quantidade de um agente de RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado a uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento. Os agentes de RNAi empregues nos métodos da presente invenção podem ser administrados em uma quantidade suficiente para produzir uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento.
[00189] O termo "amostra", como usado aqui, inclui uma coleção de fluidos, células, ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células, ou tecidos presentes dentro de um indivíduo. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, fluido cerebroespinhal, fluidos oculares, linfa, urina, saliva e similares. Amostras de tecidos podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, amostras podem ser derivadas de órgãos particulares, partes de órgãos, ou fluidos ou células dentro desses órgãos. Em certas modalidades, amostras podem ser derivadas do fígado (por exemplo, fígado inteiro ou certos segmentos do fígado ou certos tipos de células no fígado, tais como, por exemplo, hepatócitos). Em modalidades preferenciais, uma "amostra derivada de um indivíduo" se refere a sangue ou plasma retirado do indivíduo. Em modalidades adicionais, uma "amostra derivada de um indivíduo" se refere-se a tecido do fígado (ou seus subcomponentes) derivado do indivíduo.
II. iRNAs da Invenção
[00190] São descritos aqui agentes de RNAi de fita dupla melhorados que inibem a expressão de um gene de PCSK9 em uma célula, tal como uma célula dentro de um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tal como um humano tendo um distúrbio de lipídeos, por exemplo, hipercolesterolemia e usos de tais agentes de RNAi de fita dupla.
[00191] Os agentes de RNAi de fita dupla da invenção incluem agentes com modificações químicas como divulgado, por exemplo, no Pedido Provisório dos E.U.A. No. 61/561,710, depositado a 18 de novembro, 2011, os conteúdos inteiros dos quais são incorporados aqui por referência.
[00192] Como mostrado aqui e no Pedido Provisório No. 61/561,710 pode ser obtido um resultado superior por introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em uma fita senso e/ou antissenso de um agente de RNAi, particularmente no ou próximo do sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a fita senso e fita antissenso do agente de RNAi podem estar de outro modo completamente modificadas. A introdução destes motivos interrompe o padrão de modificação, se presente, da fita senso e/ou antissenso. O agente de RNAi pode estar opcionalmente conjugado com um ligante derivado de GalNAc, por exemplo na fita senso. Os agentes de RNAi resultantes apresentam atividade de silenciamento de gene superior.
[00193] Mais especificamente foi surpreendentemente descoberto que, quando a fita senso e fita antissenso do agente de RNAi de fita dupla estão completamente modificadas para terem um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no ou próximo do sítio de clivagem de pelo menos uma fita de um agente de RNAi, a atividade de silenciamento de gene do agente de RNAi foi superiormente intensificada.
[00194] Portanto, a invenção proporciona agentes de RNAi de fita dupla capazes de inibirem a expressão de um gene alvo (i.e., um gene de Pró-proteína convertase subtilisina quexina 9 (PCSK9)) in vivo. O agente de RNAi compreende uma fita senso e uma fita antissenso. Cada fita do agente de RNAi pode variar de 12-30 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, cada fita pode ter entre 14-30 nucleotídeos em comprimento, 17-30 nucleotídeos em comprimento, 25-30 nucleotídeos em comprimento, 27-30 nucleotídeos em comprimento, 17-23 nucleotídeos em comprimento, 17-21 nucleotídeos em comprimento, 17-19 nucleotídeos em comprimento, 19-25 nucleotídeos em comprimento, 19-23 nucleotídeos em comprimento, 19-21 nucleotídeos em comprimento, 21-25 nucleotídeos em comprimento, ou 21-23 nucleotídeos em comprimento.
[00195] A fita senso e fita antissenso formam tipicamente um RNA de fita dupla em dúplex ("dsRNA"), também referido aqui como um "agente de RNAi". A região de dúplex de um agente de RNAi pode ter 12-30 pares de nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a região de dúplex pode ter entre 14-30 pares de nucleotídeos em comprimento, 17-30 pares de nucleotídeos em comprimento, 27-30 pares de nucleotídeos em comprimento, 17-23 pares de nucleotídeos em comprimento, 17-21 pares de nucleotídeos em comprimento, 17-19 pares de nucleotídeos em comprimento, 19-25 pares de nucleotídeos em comprimento, 19-23 pares nucleotídeos em comprimento, 19-21 pares de nucleotídeos em comprimento, 21-25 pares de nucleotídeos em comprimento, ou 21-23 pares de nucleotídeos em comprimento. Em outro exemplo, a região de dúplex é selecionada de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, e 27 nucleotídeos em comprimento.
[00196] Em uma modalidade, o agente de RNAi pode conter uma ou mais regiões de saliência e/ou grupos capping na extremidade 3', extremidade 5', ou ambas as extremidades de uma das ou ambas as fitas. A saliência pode ter 1-6 nucleotídeos em comprimento, 2-6 nucleotídeos em comprimento, 1-5 nucleotídeos em comprimento, 2-5nucleotídeos em comprimento, 1-4 nucleotídeos em comprimento, 2-4nucleotídeos em comprimento, 1-3 nucleotídeos em comprimento, 2-3 nucleotídeos em comprimento, ou 1-2 nucleotídeos em comprimento. As saliências podem ser o resultado de uma fita sendo mais longa do que o outro, ou o resultado de duas fitas do mesmo comprimento estando escalonadas. A saliência pode formar uma não correspondência com o RNAm alvo ou pode ser complementar com as sequências de gene sendo dirigidas ou pode ser outra sequência. As primeira e segunda fitas podem ser também unidas, por exemplo, por bases adicionais para formar uma estrutura em grampo, ou por outros ligantes não de base.
[00197] Em uma modalidade, os nucleotídeos na região de saliência do agente de RNAi podem ser cada um independentemente um nucleotídeo modificado ou não modificado incluindo, mas não limitado a, modificado por açúcar em 2', tal como 2-F, 2’-Ometila, timidina (T), 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2'- O-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo), e quaisquer suas combinações. Por exemplo, TT pode ser uma sequência de saliência para qualquer uma das extremidades em qualquer uma das fitas. A saliência pode formar uma não correspondência com o RNAm alvo ou pode ser complementar com as sequências de gene sendo dirigidas ou pode ser outra sequência.
[00198] As saliências 5' ou 3' na fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas do agente de RNAi podem estar fosforiladas. Em algumas modalidades, a(s) região(ões) de saliência contém(êm) dois nucleotídeos tendo um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser os mesmos ou diferentes. Em uma modalidade, a saliência está presente na extremidade 3' da fita senso, fita antissenso, ou ambas as fitas. Em uma modalidade, esta saliência 3' está presente na fita antissenso. Em uma modalidade, esta saliência 3' está presente na fita senso.
[00199] O agente de RNAi pode conter apenas uma única saliência, que pode fortalecer a atividade de interferência do RNAi, sem afetar a sua estabilidade global. Por exemplo, a saliência de fita única pode estar localizada na extremidade 3'-terminal da fita senso ou, alternativamente, na extremidade 3'-terminal da fita antissenso. O RNAi pode ter também uma extremidade coesiva, localizada na extremidade 5' da fita antissenso (ou da extremidade 3' da fita senso) ou vice versa. Geralmente, a fita antissenso do RNAi tem uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3', e a extremidade 5' é coesiva. Sem desejar estar limitado pela teoria, a extremidade coesiva assimétrica na extremidade 5' da fita antissenso e saliência na extremidade 3' da fita antissenso favorece a carga da fita guia no processo de RISC.
[00200] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um bluntmer de extremidade dupla de 19 nucleotídeos em comprimento, em que a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 7, 8, 9 a partir daextremidade 5'. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5'.
[00201] Em outra modalidade, o agente de RNAi é um bluntmer de extremidade dupla de 20 nucleotídeos em comprimento, em que a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 8, 9, 10 a partir daextremidade 5'. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5'.
[00202] Ainda em outra modalidade, o agente de RNAi é um bluntmer de extremidade dupla de 21 nucleotídeos em comprimento, em que a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a partir da extremidade 5'. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5'.
[00203] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende uma fita senso de 21 nucleotídeos e uma fita antissenso de 23 nucleotídeos, em que a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a partir da extremidade 5'; a fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2'-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5', em que uma extremidade do agente de RNAi é coesiva, enquanto a outra extremidade compreende uma saliência de 2 nucleotídeos. Preferencialmente, a saliência de 2 nucleotídeos está na extremidade 3' da fita antissenso. Quando a saliência de 2 nucleotídeos está na extremidade 3' da fita antissenso podem existir duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos da saliência, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo emparelhado próximo do nucleotídeo da saliência. Em uma modalidade, o agente de RNAi tem adicionalmente duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais tanto na extremidade 5' da fita senso como na extremidade 5' da fita antissenso. Em uma modalidade, todos os nucleotídeos na fita senso e fita antissenso do agente de RNAi, incluindo os nucleotídeos que são parte dos motivos, são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, cada resíduo está independentemente modificado por um 2’-O-metila ou 3’-flúor, por exemplo, em um motivo alternado. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende adicionalmente um ligante (preferencialmente GalNAc3).
[00204] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende fitas senso e antissenso, em que o agente de RNAi compreende uma primeira fita tendo um comprimento que tem pelo menos 25 e no máximo 29 nucleotídeos e uma segunda fita tendo um comprimento que tem no máximo 30 nucleotídeos com pelo menos um motivo de três modificações de 2'-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5'; em que a extremidade 3' da primeira fita e a extremidade 5' da segunda fita formam uma extremidade coesiva e a segunda fita tem mais 1-4 nucleotídeos na sua extremidade 3' do que a primeira fita, em que a região de dúplex que tem pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento, e a segunda fita é suficientemente complementar com um RNAm alvo ao longo de pelo menos 19 nucleotídeos do comprimento da segunda fita para reduzir a expressão do gene alvo quando o agente de RNAi é introduzido em uma célula de mamífero, e em que a clivagem por dicer do agente de RNAi resulta preferencialmente em um siRNA compreendendo a extremidade 3' da segunda fita, reduzindo deste modo a expressão do gene alvo no mamífero. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende adicionalmente um ligante.
[00205] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi contém pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, onde um dos motivos ocorre no sítio de clivagem na fita senso.
[00206] Em uma modalidade, a fita antissenso do agente de RNAi pode também conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, onde um dos motivos ocorre no ou próximo do sítio de clivagem na fita antissenso.
[00207] Para um agente de RNAi tendo uma região de dúplex com 17-23 nucleotídeos em comprimento, o sítio de clivagem da fita antissenso está tipicamente em torno das posições 10, 11 e 12 a partir da extremidade 5'. Assim, os motivos de três modificações idênticas podem ocorrer nas posições 9, 10, 11; posições 10, 11, 12; posições 11, 12, 13; posições 12, 13, 14; ou posições 13, 14, 15 da fita antissenso, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo a partir da extremidade 5' da fita antissenso, ou começando contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex a partir da extremidade 5' da fita antissenso. O sítio de clivagem na fita antissenso pode também mudar de acordo com o comprimento da região de dúplex do RNAi a partir da extremidade 5'.
[00208] A fita senso do agente de RNAi pode conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeosconsecutivos no sítio de clivagem da fita; e a fita antissenso pode ter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no ou próximo do sítio de clivagem da fita. Quando a fita senso e a fita antissenso formam um dúplex de dsRNA, a fita senso e a fita antissenso podem estar tão alinhadas que um motivo dos três nucleotídeos na fita senso e um motivo dos três nucleotídeos na fita antissenso têm pelo menos uma sobreposição de nucleotídeo, i.e., pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na fita senso forma um par de bases com pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na fita antissenso. Alternativamente, pelo menos dois nucleotídeos podem se sobrepor, ou todos os três nucleotídeos podem se sobrepor.
[00209] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi pode conter mais do que um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. O primeiro motivo pode ocorrer no ou próximo do sítio de clivagem da fita e os outros motivos podem ser uma modificação em asa. O termo "modificação em asa" aqui se refere a um motivo ocorrendo em outra porção da fita que está separada do motivo no ou próximo do sítio de clivagem da mesma fita. A modificação em asa é adjacente ao primeiro motivo ou está separada por pelo menos um ou mais nucleotídeos. Quando os motivos são imediatamente adjacentes uns aos outros, então a química dos motivos é distinta uma da outra e, quando os motivos estão separados por um ou mais nucleotídeos, então as químicas podem ser as mesmas ou diferentes. Podem estar presentes duas ou mais modificações em asa. Por exemplo, quando estão presentes duas modificações em asa, cada modificação em asa pode ocorrer em uma extremidade em relação ao primeiro motivo que está no ou próximo do sítio de clivagem ou em qualquer um dos lados do motivo líder.
[00210] Como a fita senso, a fita antissenso do agente de RNAi pode conter mais do que um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, com pelo menos um dos motivos ocorrendo no ou próximo do sítio de clivagem da fita. A fita antissenso pode também conter uma ou mais modificações em asa em um alinhamento similar às modificações em asa que possam estar presentes na fita senso.
[00211] Em uma modalidade, a modificação em asa na fita senso ou fita antissenso do agente de RNAi não inclui tipicamente o primeiro um ou dois nucleotídeos terminais na extremidade 3', extremidade 5' ou ambas as extremidades da fita.
[00212] Em outra modalidade, a modificação em asa na fita senso ou fita antissenso do agente de RNAi não inclui tipicamente o primeiro um ou dois nucleotídeos emparelhados dentro da região de dúplex na extremidade 3', extremidade 5' ou ambas as extremidades da fita.
[00213] Quando a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi contêm cada uma pelo menos uma modificação em asa, as modificações em asa podem estar na mesma extremidade da região de dúplex, e têm uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos.
[00214] Quando a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi contêm cada uma pelo menos duas modificações em asa, a fita senso e a fita antissenso podem estar tão alinhadas que duas modificações cada uma de uma fita estão em uma extremidade da região de dúplex, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações cada uma de uma fita estão na outra extremidade da região de dúplex, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações uma fita estão em cada lado do motivo líder, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos na região de dúplex.
[00215] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos na fita senso e fita antissenso do agente de RNAi, incluindo os nucleotídeos que são parte dos motivos, podem estar modificados. Cada nucleotídeo pode estar modificado com a mesma ou diferente modificação que pode incluir uma ou mais alterações de um dos ou ambos os oxigênios de fosfato não ligantes e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato ligantes; alteração de um constituinte do açúcar de ribose, por exemplo, da 2' hidroxila no açúcar de ribose; substituição completa da fração fosfato com ligantes "defosfo"; modificação ou substituição de uma base ocorrendo naturalmente; e substituição ou modificação da estrutura principal do fosfato de ribose.
[00216] Como os ácidos nucleicos são polímeros de subunidades, muitas das modificações ocorrem em uma posição que está repetida dentro de um ácido nucleico, por exemplo, uma modificação de uma base, ou uma fração fosfato, ou um O não ligante de uma fração fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as presentes posições no ácido nucleico mas em muitos casos não. A título de exemplo, uma modificação pode apenas ocorrer em uma posição terminal 3' ou 5', pode apenas ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5, ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, uma região de fita única, ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de fita dupla de um RNA ou pode apenas ocorrer em uma região de fita única de um RNA. Por exemplo, uma modificação de fosforotioato em uma posição de O não ligante pode apenas ocorrer em um dos ou ambos os terminais, pode apenas ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5, ou 10 nucleotídeos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões de fita dupla e fita única, particularmente nos terminais. A extremidade ou extremidades 5' podem estar fosforiladas.
[00217] Pode ser possível, por exemplo, intensificar a estabilidade, incluir bases particulares em saliências, ou incluir nucleotídeos modificados ou suplentes de nucleotídeos, em saliências de fita única, por exemplo, em uma saliência 3' ou 5', ou em ambas. Por exemplo pode ser desejável incluir nucleotídeos de purina em saliências. Em algumas modalidades, todas as ou algumas das bases em uma saliência 3' ou 5' podem estar modificadas, por exemplo, com uma modificação descrita aqui. As modificações podem incluir, por exemplo, o uso de modificações na posição 2' do açúcar de ribose com modificações que são conhecidas na técnica, por exemplo, o uso de deoxirribonucleotídeos, 2’-deoxi-2’-flúor (2’-F) ou 2’-O-metila modificada em vez do açúcar de ribose da nucleobase, e modificações no grupo fosfato, por exemplo, modificações de fosforotioato. As saliências não necessitam de ser homólogas com a sequência alvo.
[00218] Em uma modalidade, cada resíduo da fita senso e fita antissenso está independentemente modificado com LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2'-deoxi, 2’-hidroxila, ou 2’-flúor. As fitas podem conter mais do que uma modificação. Em uma modalidade, cada resíduo da fita senso e fita antissenso está independentemente modificado com 2’-O-metila ou 2’-flúor.
[00219] Pelo menos duas modificações diferentes estão tipicamente presentes na fita senso e fita antissenso. Essas duas modificações podem ser as modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor, ou outras.
[00220] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreendem modificações de um padrão alternado. O termo "motivo alternado" como usado aqui se refere a um motivo tendo uma ou mais modificações, ocorrendo cada modificação em nucleotídeos alternados de uma fita. O nucleotídeo alternado pode se referir a um por cada todos os outros nucleotídeos ou um por cada três nucleotídeos, ou um padrão similar. Por exemplo, se A, B e e C representarem cada um um tipo de modificação ao nucleotídeo, o motivo alternado pode ser "ABABABABABAB...", "AABBAABBAABB...", "AABAABAABAAB.", "AAABAAABAAAB...", "AAABBBAAABBB.", ou "ABCABCABCABC.", etc.
[00221] O tipo de modificações contido no motivo alternado pode ser o mesmo ou diferente. Por exemplo, se A, B, C, D representarem cada um um tipo de modificação no nucleotídeo, o padrão alternado, i.e., modificações em todos os outros nucleotídeos, pode ser o mesmo, mas cada uma da fita senso ou fita antissenso pode ser selecionada de várias possibilidades de modificações dentro do motivo alternado tal como "ABABAB.", "ACACAC.", "BDBDBD." ou "CDCDCD.", etc.
[00222] Em uma modalidade, o agente de RNAi da invenção compreende o padrão de modificação para o motivo alternado na fita senso em relação ao padrão de modificação para o motivo alternado na fita antissenso é trocado. A troca pode ser tal que o grupo modificado de nucleotídeos da fita senso corresponda a um grupo de nucleotídeos diferentemente modificado da fita antissenso e vice versa. Por exemplo, a fita senso, quando emparelhada com a fita antissenso no dúplex de dsRNA, o motivo alternado na fita senso pode começar com "ABABAB" a partir de 5'-3' da fita e o motivo alternado na fita antissenso pode começar com "BABABA" a partir de 5'-3' da fita dentro da região de dúplex. Como outro exemplo, o motivo alternado na fita senso pode começar com "AABBAABB" a partir de 5'-3' da fita e o motivo alternado na fita antissenso pode começar com "BBAABBAA" a partir de 5'-3' da fita dentro da região de dúplex, tal que existe uma troca completa ou parcial dos padrões de modificação entre a fita senso e a fita antissenso.
[00223] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende o padrão do motivo alternado de modificação de 2'-O-metila e modificação de 2’-F na fita senso tem uma troca em relação ao padrão do motivo alternado de modificação de 2'-O-metila e modificação de 2’-F na fita antissenso inicialmente, i.e., o nucleotídeo modificado com 2'-O-metila na fita senso emparelhada em termos de base com um nucleotídeo modificado com 2'-F na fita antissenso e vice versa. A posição 1 da fita senso pode começar com a modificação de 2'-F, e a posição 1 da fita antissenso pode começar com a modificação de 2'-O-metila.
[00224] A introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos na fita senso e/ou fita antissenso interrompe o padrão de modificação inicial presente na fita senso e/ou fita antissenso. Esta interrupção do padrão de modificação das fitas senso e/ou antissenso por introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos nas fitas senso e/ou antissenso intensifica surpreendentemente a atividade de silenciamento de gene do gene alvo.
[00225] Em uma modalidade, quando o motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos é introduzido em qualquer uma das fitas, a modificação do nucleotídeo próximo do motivo é uma modificação diferente do que a modificação do motivo. Por exemplo, a porção da sequência contendo o motivo é "...NaYYYNb...", onde "Y" representa a modificação do motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e "Na" e "Nb" representam uma modificação ao nucleotídeo próximo do motivo "YYY" que é diferente do que a modificação de Y, e onde Na e Nb podem ser as mesmas ou diferentes modificações. Alternativamente, Na e/ou Nb podem estar presentes ou ausentes quando está presente uma modificação em asa.
[00226] O agente de RNAi pode adicionalmente compreender pelo menos uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato. A modificação de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato pode ocorrer em qualquer nucleotídeo da fita senso ou fita antissenso ou ambas as fitas em qualquer posição da fita. Por exemplo, a modificação de ligação internucleotídica pode ocorrer em todos os nucleotídeos da fita senso e/ou fita antissenso; cada modificação de ligação internucleotídica pode ocorrer em um padrão alternado na fita senso e/ou fita antissenso; ou a fita senso ou fita antissenso pode conter ambas as modificações de ligação internucleotídica em um padrão alternado. O padrão alternado da modificação de ligação internucleotídica na fita senso pode ser o mesmo ou diferente da fita antissenso, e o padrão alternado da modificação de ligação internucleotídica na fita senso pode ter uma troca em relação ao padrão alternado da modificação de ligação internucleotídica na fita antissenso.
[00227] Em uma modalidade, o RNAi compreende uma modificação de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato na região de saliência. Por exemplo, a região de saliência pode conter dois nucleotídeos tendo uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato entre os dois nucleotídeos. As modificações de ligação internucleotídica podem ser também feitas para ligar os nucleotídeos da saliência aos nucleotídeos emparelhados terminais dentro da região de dúplex. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, ou todos os nucleotídeos da saliência podem estar ligados através de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato, e, opcionalmente, podem existir ligações de internucleotídeos de fosforotioato ou metilfosfonato adicionais ligante o nucleotídeo da saliência a um nucleotídeo emparelhado que esteja próximo do nucleotídeo da saliência. Por exemplo podem existir pelo menos duas ligações de internucleotídeos de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, nas quais dois dos três nucleotídeos são nucleotídeos da saliência, e o terceiro é um nucleotídeo emparelhado próximo do nucleotídeo da saliência. Estes três nucleotídeos terminais podem estar na extremidade 3' da fita antissenso, na extremidade 3' da fita senso, da extremidade 5' da fita antissenso, e/ou na extremidade 5' da fita antissenso.
[00228] Em uma modalidade, a saliência de 2 nucleotídeos está na extremidade 3' da fita antissenso, e existem duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos da saliência, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo emparelhado próximo do nucleotídeo da saliência. Opcionalmente, o agente de RNAi pode adicionalmente ter duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais tanto na extremidade 5' da fita senso como na extremidade 5' da fita antissenso.
[00229] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende não correspondência(s) com o alvo, dentro do dúplex, ou suas combinações. A não correspondência pode ocorrer na região de saliência ou na região de dúplex. O emparelhamento de bases pode ser classificado com base na sua propensão para promover dissociação ou fusão (por exemplo, na energia livre de associação ou dissociação de um emparelhamento particular, a abordagem mais simples é examinar os pares em uma base de pares individuais, embora possa ser também usada análise do vizinho próximo ou similar). Em termos de promoção da dissociação: A:U é preferencial em relação a G:C; G:U é preferencial em relação a G:C; e I:C é preferencial em relação a G:C (I=inosina). As não correspondências, por exemplo, emparelhamentos não canônicos ou sem ser canônicos (como descrito em outro lugar aqui) são preferenciais em relação a emparelhamentos canônicos (A:T, A:U, G:C); e emparelhamentos que incluem uma base universal são preferenciais em relação a emparelhamentos canônicos.
[00230] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende pelo menos um dos primeiros 1, 2, 3, 4, ou 5 pares de bases dentro das regiões de dúplex a partir da extremidade 5' da fita antissenso independentemente selecionados do grupo de: A:U, G:U, I:C, e pares não correspondidos, por exemplo, emparelhamentos não canônicos ou sem ser canônicos ou emparelhamentos que incluem uma base universal, para promover a dissociação da fita antissenso na extremidade 5' do dúplex.
[00231] Em uma modalidade, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região de dúplex a partir da extremidade 5' na fita antissenso é selecionado do grupo consistindo em A, dA, dU, U, e dT. Alternativamente, pelo menos um dos primeiros 1, 2 ou 3 pares de bases dentro da região de dúplex a partir da extremidade 5' da fita antissenso é um par de bases AU. Por exemplo, o primeiro par de bases dentro da região de dúplex a partir da extremidade 5' da fita antissenso é um par de bases AU.
[00232] Em uma modalidade, a sequência da fita senso pode ser representada pela fórmula (I):5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I)
[00233] em que:
[00234] i e j são cada um independentemente 0 ou 1;
[00235] p e q são cada um independentemente 0-6;
[00236] cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[00237] cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00238] cada np e nq representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[00239] em que Nb e Y não têm a mesma modificação; e
[00240] XXX, YYY e ZZZ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. Preferencialmente, YYY é nucleotídeos todos modificados com 2’-F.
[00241] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreendem modificações de padrão alternado.
[00242] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre no ou próximo do sítio de clivagem da fita senso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região de dúplex com 17-23 nucleotídeos em comprimento, o motivo YYY pode ocorrer no ou na vizinhança do sítio de clivagem (por exemplo: pode ocorrer nas posições 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11,12 ou 11, 12, 13) da fita senso, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo, a partir da extremidade 5'; ou, opcionalmente, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’.
[00243] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0, ou i é 0 e j é 1, ou ambos i e j são 1. A fita senso pode ser portanto representada pelas seguintes fórmulas:5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); ou5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
[00244] Quando a fita senso é representada pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na poderepresentar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00245] Quando a fita senso é representada como fórmula (Ic), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na poderepresentar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00246] Quando a fita senso é representada como fórmula (Id), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Preferencialmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00247] Cada um de X, Y e Z pode ser o mesmo ou diferente uns dos outros.
[00248] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e a fita senso pode ser representada pela fórmula:5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia).
[00249] Quando a fita senso é representada pela fórmula (Ia), cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00250] Em uma modalidade, a sequência da fita antissenso do RNAi pode ser representada pela fórmula (II):5' nq’-Na‘-(Z’Z‘Z‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(X‘X‘X‘)i-N‘a-np‘3‘ (II)
[00251] em que:
[00252] k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[00253] p’ e q’ são cada um independentemente 0-6;
[00254] cada Na' representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[00255] cada Nb' representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00256] cada np' e nq‘ representa independentemente um nucleotídeo da saliência;
[00257] em que Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação;
[00258] e
[00259] X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00260] Em uma modalidade, o Na’ e/ou Nb’ compreendemmodificações de padrão alternado.
[00261] O motivo Y’Y’Y’ ocorre no ou próximo do sítio de clivagem da fita antissenso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região de dúplex com 17-23 nucleotídeos em comprimento, o motivo Y’Y’Y’ pode ocorrer nas posições 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 da fita antissenso, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo, a partir da extremidade 5'; ou, opcionalmente, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’. Preferencialmente, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12, 13.
[00262] Em uma modalidade, o motivo Y‘Y‘Y‘ é todos os nucleotídeos modificados com 2’-OMe.
[00263] Em uma modalidade, k é 1 e l é 0, ou k é 0 e l é 1, ou ambos k e l são 1.
[00264] A fita antissenso pode ser portanto, representada pelas seguintes fórmulas:5‘ nq’-Na‘-Z‘Z‘Z‘-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Na‘-np’ 3‘ (IIb);5‘ nq-Na-YYY-Nb-XXX-np’ 3‘ (IIc); ou5‘ nq’-Na- Z‘Z‘Z‘-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘- X‘X‘X‘-Na‘-np’ 3‘ (IId).
[00265] Quando a fita antissenso é representada pela fórmula (IIb), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00266] Quando a fita antissenso é representada como fórmula (IIc), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00267] Quando a fita antissenso é representada como fórmula(IId),cada Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0nucleotídeos modificados. Cada Na’ pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 215, ou 2-10 nucleotídeos modificados. Preferencialmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00268] Em outras modalidades, k é 0 e I é 0 e a fita antissenso pode ser representada pela fórmula:5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 3' (Ia).
[00269] Quando a fita antissenso é representada como fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00270] Cada um de X’, Y’ e Z’ pode ser o mesmo ou diferente uns dos outros.
[00271] Cada nucleotídeo da fita senso e fita antissenso pode estar independentemente modificado com LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’-hidroxila, ou 2’-flúor. Por exemplo, cada nucleotídeo da fita senso e fita antissenso está independentemente modificado com 2‘-O-metila ou 2’-flúor. Cada X, Y, Z, X’, Y’ e Z’, em particular, pode representar uma modificação de 2’-O-metila ou uma modificação de 2’-flúor.
[00272] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi pode conter o motivo YYY ocorrendo a 9, 10 e 11 posições da fita quando a região de dúplex tem 21 nt, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo a partir da extremidade 5', ou, opcionalmente, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’; e Y representa modificação de 2’-F. A fita senso pode adicionalmente conter o motivo XXX ou motivos ZZZ como modificações em asa na extremidade oposta da região de dúplex; e XXX e ZZZ representam independentemente cada um uma modificação de 2’-OMe ou uma modificação de 2’-F.
[00273] Em uma modalidade, a fita antissenso pode conter o motivo Y’Y’Y’ ocorrendo a 11, 12, 13 posições da fita, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo a partir da extremidade 5', ou, opcionalmente, começando a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’; e Y' representa modificação de 2’-O-metila. A fita antissenso pode adicionalmente conter o motivo X’X’X’ ou motivos Z’Z’Z’ como modificações em asa na extremidade oposta da região de dúplex; e X’X’X’ e Z’Z’Z’ representam independentemente cada um uma modificação de 2’-OMe ou uma modificação de 2’-F.
[00274] A fita senso representada por qualquer uma das fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), e (Id) acima forma um dúplex com uma fita antissenso sendo representada por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc), e (IId), respectivamente.
[00275] Portanto, os agentes de RNAi para uso nos métodos da invenção podem compreender uma fita senso e uma fita antissenso, tendo cada fita 14 a 30 nucleotídeos, o dúplex de RNAi representado pela fórmula (III):senso: 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'’’ ’ ’ ’’antissenso: 3 np-Na-(XXX)k-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)l-Na-nq 5(III)
[00276] em que:
[00277] i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[00278] p, p‘, q, e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[00279] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[00280] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00281] em que
[00282] cada np’, np, nq’, e nq, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência; e
[00283] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00284] Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou ambos i e j são 0; ou ambos i e j são 1. Em outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou ambos k e l são 0; ou ambos k e l são 1.
[00285] Combinações exemplares da fita senso e fita antissenso formando um dúplex de RNAi incluem as fórmulas em baixo:5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'’ ’ ’’3 np-Na-YYY-Nanq 5(IIIa)5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'3 np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na nq 5(IIIb)5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3' 3 np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 5(IIIc) 5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3 np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 5(IIId)
[00286] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00287] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 1-10, 1-7, 1-5 ou 1-4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00288] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00289] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula(IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 210 nucleotídeos modificados. Cada um de Na, Na’, Nb e Nb’ representa independentemente modificações de padrão alternado.
[00290] Cada um de X, Y e Z nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId) pode ser o mesmo ou diferentes uns dos outros.
[00291] Quando o agente de RNAi é representado pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Y pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Y'. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Y formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Y'; ou todos os três nucleotídeos Y formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Y'.
[00292] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Z'. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Z formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Z'; ou todos os três nucleotídeos Z formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Z'.
[00293] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos X pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos X'. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos X formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos X'; ou todos os três nucleotídeos X formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos X'.
[00294] Em uma modalidade, a modificação no nucleotídeo Y é diferente da modificação no nucleotídeo Y', a modificação no nucle- otídeo Z é diferente da modificação no nucleotídeo Z', e/ou a modificação no nucleotídeo X é diferente da modificação no nucleotídeo X'.
[00295] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor. Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor e np' >0 e pelo menos um np' está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de uma ligação de fosforotioato. Ainda em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor, np' >0 e pelo menos um np' está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de ligação de fosforotioato, e a fita senso está conjugada com um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente. Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor, np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de ligação de fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e a fita senso está conjugada com um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00296] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor, np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de ligação de fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e a fita senso está conjugada com um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00297] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo pelo menos dois dúplexes representados pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), em que os dúplexes estão conectados por um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende adicionalmente um ligante. Cada um dos dúplexes pode se dirigir ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos dúplexes pode se dirigir ao mesmo gene em dois locais alvo diferentes.
[00298] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo três, quatro, cinco, seis ou mais dúplexes representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), em que os dúplexes estão conectados por um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende adicionalmente um ligante. Cada um dos dúplexes pode se dirigir ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos dúplexes pode se dirigir ao mesmo gene em dois locais alvo diferentes.
[00299] Em uma modalidade, dois agentes de RNAi representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId) estão ligados um ao outro na extremidade 5’, e uma das ou ambas as extremidades 3’ e estão opcionalmente conjugados com um ligante. Cada um dos agentes pode se dirigir ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos agentes pode se dirigir ao mesmo gene em dois locais alvo diferentes.
[00300] Várias publicações descrevem agentes de RNAi multiméricos que podem ser usados nos métodos da invenção. Tais publicações incluem WO2007/091269, Patente dos EUA No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 e WO2011/031520, os conteúdos inteiros da quais são deste modo incorporadas aqui por referência.
[00301] O agente de RNAi que contém conjugações de uma ou mais frações carboidrato com um agente de RNAi pode otimizar uma ou mais propriedades do agente de RNAi. Em muitos casos, a fração carboidrato estará anexada a uma subunidade modificada do agente de RNAi. Por exemplo, o açúcar de ribose de uma ou mais subunidades de nucleotídeos de um agente de dsRNA pode estar substituído por outra fração, por exemplo, um carreador não de carboidrato (preferencialmente cíclico) à qual está anexado um ligante de carboidrato. Uma subunidade de ribonucleotídeos na qual o açúcar de ribose da subunidade foi assim substituída é referida aqui como uma subunidade de modificação de substituição de ribose (RRMS). Um carreador cíclico pode ser um sistema em anel carbocílico, i.e., todos os átomos no anel são átomos de carbono, ou um sistema em anel heterocílcico, i.e., um ou mais átomos no anel podem ser um heteroátomo, por exemplo, nitrogénio, oxigênio, enxofre. O carreador cíclico pode ser um sistema em anel monocíclico, ou pode conter dois ou mais anéis, por exemplo, anéis fundidos. O carreador cíclico pode ser um sistema em anel completamente saturado, ou pode conter uma ou mais ligações duplas.
[00302] O ligante pode estar anexado ao polinucleotídeo através de um carreador. Os carreadores incluem (i) pelo menos um "ponto de anexação à estrutura principal", preferencialmente dois "pontos de anexação à estrutura principal" e (ii) pelo menos um "ponto de anexação em corrente". Um "ponto de anexação à estrutura principal" como usado aqui se refere a um grupo funcional, por exemplo, um grupo hidroxila, ou, geralmente, uma ligação disponível para, ou que é adequada para, incorporação do carreador na estrutura principal, por exemplo, estrutura principal contendo fosfato, ou fosfato modificado, por exemplo, enxofre, de um ácido ribonucleico. Um "ponto de anexação em corrente" (TAP) em algumas modalidades se refere a um átomo no anel constituinte do carreador cíclico, por exemplo, um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que proporciona um ponto de anexação à estrutura principal), que conecta uma fração selecionada. A fração pode ser, por exemplo, um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo,oligossacarídeo e polissacarídeo. Opcionalmente, a fração selecionada está conectada por uma corrente de intervenção ao carreador cíclico. Assim, o carreador cíclico incluirá frequentemente um grupo funcional, por exemplo, um grupo amino, ou, geralmente, proporcionará uma ligação, que é adequada para incorporação ou ligação por corrente de outra entidade química, por exemplo, um ligante ao anel constituinte.
[00303] Os agentes de RNAi podem estar conjugados com um ligante através de um carreador, em que o carreador pode ser grupo cíclico ou grupo acíclico; preferencialmente, o grupo cíclico é selecionado de pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetraidrofurila e decalina; preferencialmente, o grupo acíclico é selecionado de estrutura principal de serinol ou estrutura principal de dietanolamina.
[00304] Em certas modalidades específicas, o agente de RNAi para uso nos métodos da invenção é um agente selecionado do grupo de aegntes listados na Tabela 1 e Tabela 2.
[00305] Estes agentes podem adicionalmente compreender um ligante.
A. Ligantes
[00306] Os agentes de RNA de fita dupla (dsRNA) da invenção podem estar opcionalmente conjugados com um ou mais ligantes. O ligante pode estar anexado à fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas, na extremidade 3', extremidade 5' ou ambas as extremidades. Por exemplo, o ligante pode estar conjugado com a fita senso. Em modalidades preferenciais, o ligante está conjugado com a extremidade 3' da fita senso. Em uma modalidade preferencial, o ligante é um ligante de GalNAc. Em modalidades particularmente preferenciais, o ligante GalNAc3:
Figure img0003
[00307] Em algumas modalidades, o ligante, por exemplo, ligante deGalNAc, está anexado à extremidade 3' do agente de RNAi. Em uma modalidade, o agente de RNAi está conjugado com o ligante, por exemplo, ligante de GalNAc, como mostrado no seguinte esquema
Figure img0004
[00308] em que X é O ou S. Em uma modalidade, X é O.
[00309] Uma ampla variedade de entidades pode estar acoplada aos agentes de RNAi da presente invenção. Frações preferenciais são ligantes que estão acoplados, preferencialmente covalentemente, diretamente ou indiretamente, através de uma corrente de intervenção.
[00310] Em modalidades preferenciais, um ligante altera a distribuição, direcionamento ou tempo de vida da molécula na qual é incorporado. Em modalidades preferenciais, um ligante proporciona uma afinidade intensificada para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, receptor, por exemplo, um compartimento celular ou de órgão, tecido, órgão ou região do corpo, por exemplo, em comparação com uma espécie sem um tal ligante. Os ligantes proporcionando afinidade intensificada para um alvo selecionado são também denominados ligantes de direcionamento.
[00311] Alguns ligantes podem ter propriedades endossomolíticas. Os ligantes endossomolíticos promovem a lise do endossoma e/ou transporte da composição da invenção, ou seus componentes, do endossoma para o citoplasma da célula. O ligante endossomolítico pode ser um peptídeo polianiônico ou peptideomimético que mostra atividade da membrana dependente de pH e fusogenicidade. Em uma modalidade, o ligante endossomolítico assume a sua conformação ativa ao pH endossomal. A conformação "ativa" é aquela conformação na qual o ligante endossomolítico promove a lise do endossoma e/ou transporte da composição da invenção, ou seus componentes, do endossoma para o citoplasma da célula. Ligantes endossomolíticos exemplares incluem o peptídeo GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), o peptídeo EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586), e seus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). Em uma modalidade, o componente endossomolítico pode conter um grupo químico (por exemplo, um aminoácido) que sofrerá uma mudança na carga ou protonação em resposta a uma mudança no pH. O componente endossomolítico pode ser linear ou ramificado.
[00312] Os ligantes podem melhorar o transporte, hibridação, e propriedades de especificidade e podem também melhorar a resistência a nucleases do oligorribonucleotídeo natural ou modificado resultante, ou uma molécula polimérica compreendendo qualquer combinação de monômeros descritos aqui e/ou ribonucleotídeos naturais ou modificados.
[00313] Os ligantes podem incluir em geral modificadores terapêuticos, por exemplo, para intensificação da captação; compostos de diagnóstico ou grupos repórter, por exemplo, para monitorização da distribuição; agentes de reticulação; e frações de conferição de resistência a nucleases. Exemplos gerais incluem lipídeos, esteroides, vitaminas, açúcares, proteínas, peptídeos, poliaminas, e mímicos de peptídeos.
[00314] Os ligantes podem incluir uma substância ocorrendo naturalmente, tal como uma proteína (por exemplo, albumina do soro humano (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL), ou globulina); um carboidrato (por exemplo, uma dextrana, pululana, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina ou ácido hialurônico); ou um lipídeo. O ligante pode ser também uma molécula recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, por exemplo, um poliaminoácido sintético, um oligonucleotídeo (por exemplo, um aptâmero). Exemplos de poliaminoácidos incluem poliaminoácido é uma polilisina (PLL), poliácido L-aspártico, poliácido L-glutâmico, copolímero de estireno- anidrido do ácido maleico, copolímero poli(L-lactídeo-co-glicolídeo), copolímero de éter de divinila-anidrido maleico, copolímero de N-(2- hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietileno glicol (PEG), álcool de polivinila (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N- isopropilacrilamida, ou polifosfazina. Exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, lipídeo catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina, ou um peptídeo alfa helicoidal.
[00315] Os ligantes podem também incluir grupos de direcionamento, por exemplo, um agente de direcionamento de células ou tecidos, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo especificado de células tal como uma célula dos rins. Um grupo de direcionamento pode ser uma tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioativa A, Carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manose multivalente, fucose multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídeo, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina, um peptídeo RGD, um mimético de peptídeo RGD ou um aptâmero.
[00316] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercaladores (por exemplo, acridinas), reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, diidrofenazina), endonucleases artificiais ou um quelante (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, adamantano de ácido acético, ácido 1-pireno butírico, diidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoíl)litocólico, ácido O3- (oleoíl)colênico, dimetoxitritila, ou fenoxazina e conjugados de peptídeos (por exemplo, peptídeo de antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG- 40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores do transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agregados de imidazol, conjugados acridina- imidazol, complexos de Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenila, HRP, ou AP.
[00317] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas, ou peptídeos, por exemplo, moléculas tendo uma afinidade específica para um coligando, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo que se liga a um tipo especificado de células tal como uma célula cancerígena, célula endotelial, ou célula dos ossos. Os ligantes podem também incluir hormônios e receptores de hormônios. Podem também incluir espécies não peptídicas, tais como lipídeos, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manose multivalente, fucose multivalente, ou aptâmeros. O ligante pode ser, por exemplo, um lipopolissacarídeo, um ativador de p38 MAP cinase, ou um ativador de NF-KB.
[00318] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fármaco, que pode aumentar a captação do agente de RNAi para a célula, por exemplo, por ruptura do citoesqueleto da célula, por exemplo, por ruptura dos microtúbulos, microfilamentos, e/ou filamentos intermédios da célula. O fármaco pode ser, por exemplo, taxon, vincristina, vimblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina ou mioservina.
[00319] O ligante pode aumentar a captação do oligonucleotídeo para a célula por, por exemplo, ativação de uma resposta inflamatória. Ligantes exemplares que teriam um tal efeito incluem fator da necrose tumoral alfa (TNFalfa), interleucina-1 beta, ou interferon gama.
[00320] Em um aspecto, o ligante é um lipídeo ou molécula à base de lipídeos. Um tal lipídeo ou molécula à base de lipídeos se liga preferencialmente a uma proteína do soro, por exemplo, albumina do soro humano (HSA). Um ligante de ligação à HSA permite distribuição do conjugado em um tecido alvo, por exemplo, um tecido alvo do corpo sem ser rim. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células parenquimais do fígado. Outras moléculas que podem se ligar à HSA podem ser também usadas como ligantes. Por exemplo pode ser usada neproxina ou aspirina. Um ligante de lipídeo ou à base de lipídeos pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar o direcionamento ou transporte para uma célula ou membrana da célula alvo, e/ou (c) ser usado para ajustar a ligação a uma proteína do soro, por exemplo, HSA.
[00321] Um ligante à base de lipídeos pode ser usado para modular, por exemplo, controlar a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo é menos provável que um ligante de lipídeo ou à base de lipídeos que se liga à HSA mais fortemente seja dirigido para o rim e portanto, menos provável que seja eliminado do corpo. Um ligante de lipídeo ou à base de lipídeos que se liga à HSA menos fortemente pode ser usado para dirigir o conjugado para o rim.
[00322] Em uma modalidade preferencial, o ligante à base de lipídeos se liga à HSA. Preferencialmente se liga à HSA com uma afinidade suficiente tal que o conjugado seja preferencialmente distribuído em um tecido sem ser rim. No entanto é preferencial que a afinidade não seja tão forte que a ligação HSA-ligante não possa ser revertida.
[00323] Em outra modalidade preferencial, o ligante à base de lipídeos se liga à HSA fracamente ou não de todo, tal que o conjugado será preferencialmente distribuído ao rim. Outras frações que se dirigem a células dos rins podem ser também usadas em lugar do ou adicionalmente ao ligante à base de lipídeos.
[00324] Em outro aspecto, o ligante é uma fração, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula alvo, por exemplo, uma célula em proliferação. Estes são particularmente úteis para tratamento de distúrbios caracterizados por proliferação celular indesejada, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células cancerígenas. Vitaminas exemplares incluem vitamina A, E, e K. Outras vitaminas exemplares incluem vitaminas B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidos por células cancerígenas. São também incluídos HAS, lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de elevada densidade (HDL).
[00325] Em outro aspecto, o ligante é um agente de permeação de células, preferencialmente um agente de permeação de células helicoidal. Preferencialmente, o agente é anfipático. Um agente exemplar é um peptídeo tal como tat ou de antennopedia. Se o agente for um peptídeo pode estar modificado, incluindo um mimético de peptidila, invertômeros, ligações não de peptídeo ou de pseudopeptídeo, e uso de D-aminoácidos. O agente helicoidal é preferencialmente um agente alfa-helicoidal, que tem preferencialmente uma fase lipofílica e uma lipofóbica.
[00326] O ligante pode ser um peptídeo ou peptideomimético. Um peptideomimético (também referido aqui como oligopeptideomimético) é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural. A fração de peptídeo ou peptideomimético pode ter cerca de 5-50 aminoácidos em comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50aminoácidos em comprimento. Um peptídeo ou peptideomimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação de células, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático, ou peptídeo hidrofóbico (por exemplo, consistindo principalmente em Tyr, Trp ou Phe). A fração de peptídeo pode ser um peptídeo de dendrímeros, peptídeo restringido ou peptídeo reticulado. Em outra alternativa, a fração de peptídeo pode incluir uma sequência de translocação membranar (MTS) hidrofóbica. Um peptídeo contendo MTS hidrofóbica exemplar é RFGF tendo a sequência de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 1). Um análogo de RFGF (por exemplo, sequência de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 2)) contendo uma MTS hidrofóbica pode ser também uma fração de direcionamento. A fração de peptídeo pode ser um peptídeo de "distribuição", que pode transportar grandes moléculas polares incluindo peptídeos, oligonucleotídeos, e proteína através de membranas celulares. Por exemplo se descobriu que sequências da proteína Tat do HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 3)) e da proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 4)) são capazes de funcionar como peptídeos de distribuição. Um peptídeo ou peptideomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, tal como um peptídeo identificado a partir de uma biblioteca de exibição de fagos, ou biblioteca combinatorial de uma-esférula-um- composto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferencialmente, o peptídeo ou peptideomimético preso a um agente de RNAi através de uma unidade de monômero incorporada é um peptídeo de direcionamento de células tal como um peptídeo de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), ou mímico de RGD. Uma fração de peptídeo pode variar em comprimento de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos. As frações de peptídeo podem ter uma modificação estrutural, tal como para aumentar a estabilidade ou dirigir propriedades conformacionais. Qualquer uma das modificações estruturais descrita em baixo pode ser utilizada. Uma fração de peptídeo de RGD pode ser usada para se dirigir a uma célula tumoral, tal como uma célula tumoral endotelial ou uma célula tumoral cancerígena da mama (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). Um peptídeo de RGD pode facilitar o direcionamento de um agente de RNAi a tumores de uma variedade de outros tecidos, incluindo o pulmão, rim, baço ou fígado (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Preferencialmente, o peptídeo de RGD facilitará o direcionamento de um agente de RNAi ao rim. O peptídeo de RGD pode ser linear ou cíclico, e pode estar modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado para facilitar direcionamento a tecidos específicos. Por exemplo, um peptídeo de RGD glicosilado pode distribuir um agente de RNAi a uma célula tumoral expressando αVβ3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Peptídeos que se digirem a marcadoresenriquecidos em células em proliferação podem ser usados. Por exemplo, peptídeos contendo RGD e peptideomiméticos podem se dirigir a células cancerígenas, em particular células que exibem uma integrina. Assim se poderiam usar peptídeos de RGD, peptídeos cíclicos contendo RGD, peptídeos de RGD que incluem D-aminoácidos, bem como mímicos de RGD sintéticos. Adicionalmente a RGD se podem usar outras frações que se dirigem ao ligante de integrina. Geralmente, tais ligantes podem ser usados para controlar células em proliferação e angiogênese. Conjugados preferenciais deste tipo de ligante se dirigem a PECAM-1, VEGF, ou outro gene cancerígeno, por exemplo, um gene cancerígeno descrito aqui.
[00327] Um "peptídeo de permeação de células" é capaz de permear uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, tal como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, tal como uma célula de humano. Um peptídeo de permeação de células microbianas pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (por exemplo, LL-37 ou Ceropina P1), um peptídeo contendo ligações dissulfeto (por exemplo, α-defensina, β-defensina ou bactenecina), ou um peptídeo contendo apenas um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação de células pode também incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação de células pode ser um peptídeo anfipático bipartido, tal como MPG, que é derivado do domínio do peptídeo de fusão de gp41 do HIV-1 e do NLS do antígeno T grande do SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
[00328] Em uma modalidade, um peptídeo de direcionamento pode ser um peptídeo α-helicoidal anfiático. Péptidos α-helicoidais exemplares incluem, mas não estão limitados a cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, peptídeo tipo bombinina (BLP), catelicidinas, ceratotoxinas, peptídeos de S. clava, peptídeos antimicrobianos intestinais da enguia-de-casulo (HFIAPs), magaininas, brevininas-2, dermaseptinas, melitinas, pleurocidina, peptídeos H2A, peptídeos de Xenopus, esculentinas-1, e caerinas. Um número de fatores será preferencialmente considerado para se manter a integridade da estabilidade da hélice. Por exemplo pode ser utilizado um número máximo de resíduos de estabilização da hélice (por exemplo, Leu, Ala ou Lys), e será utilizado um número mínimo resíduos de desestabilização da hélice (por exemplo, prolina, ou unidades monoméricas cíclicas). O resíduo de capping será considerado (por exemplo, Gly é um resíduo N-capping exemplar) e/ou pode ser usada aminação C-terminal para proporcionar uma ligação de H extra para estabilizar a hélice. A formação de pontes de sal entre resíduos com cargas opostas, separadas por i ± 3, ou i ± 4 posições, podeproporcionar estabilidade. Por exemplo, resíduos catiônicos tais como lisina, arginina, homo-arginina, ornitina ou histidina podem formar pontes de sal com os resíduos aniônicos glutamato ou aspartato.
[00329] Os ligantes de peptídeo ou peptideomiméticos incluem aqueles tendo peptídeos ocorrendo naturalmente ou modificados, por exemplo, peptídeos D ou L; peptídeos α, β ou Y; peptídeos de N-metila; azapeptídeos; peptídeos tendo uma ou mais amidas, i.e., peptídeo, ligações substituídas por uma ou mais ureias, tioureias, carbamatos, ou ligações de ureia de sulfonila; ou peptídeos cíclicos.
[00330] O ligante de direcionamento pode ser qualquer ligante que seja capaz de se dirigir a um receptor específico. Exemplos são: folato, GalNAc, galactose, manose, manose-6P, agregados de açúcares tais como agregado de GalNAc, agregado de manose, agregado de galactose, ou um aptâmero. Um agregado é uma combinação de duas ou mais unidades de açúcar. Os ligantes de direcionamento incluem também ligados do receptor da integrina, ligantes do receptor da Quimiocina, transferrina, biotina, ligantes do receptor da serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligantes de LDL e HDL. Os ligantes podem ser também baseados em ácido nucleico, por exemplo, um aptâmero. O aptâmero pode estar não modificado ou ter qualquer combinação de modificações divulgadas aqui.
[00331] Agentes de liberação endossomal incluem imidazóis, poli ou oligoimidazóis, PEIs, peptídeos, peptídeos fusogênicos,policarboxilatos, policátions, oligo ou policátions ou ânions mascarados, acetais, poliacetais, cetais/policetals, ortoésteres, polímeros com cargas catiônicas ou aniônicas mascaradas ou não mascaradas, dendrímeros com cargas catiônicas ou aniônicas mascaradas ou não mascaradas.
[00332] Modulador PK significa modulador farmacocinético. Moduladores PK incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídeos, peptídeos, agentes de ligação a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Moduladores PK exemplares incluem, mas não estão limitados a, colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicerídeos, diacilglicerídeo, fosfolipídeos, esfingolipídeos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. Se sabe também que oligonucleotídeos que compreendem um número de ligações de fosforotioato se ligam a proteína do soro, assim, oligonucleotídeos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos com cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas ligações de fosforotioato na estrutura principal podem ser também utilizados na presente invenção como ligantes (por exemplo, como ligantes de modulação PK).
[00333] Adicionalmente, aptâmeros que se ligam a componentes do soro (por exemplo, proteínas do soro) são também utilizados na presente invenção como ligantes de modulação PK.
[00334] Outros conjugados de ligante utilizados na invenção sãodescritos nos Pedidos de Patentes dos E.U.A. USSN: 10/916,185, depositado a 10 de agosto, 2004; USSN: 10/946,873, depositado a 21 de setembro, 2004; USSN: 10/833,934, depositado a 3 de agosto, 2007; USSN: 11/115,989, depositado a 27 de abril, 2005 e USSN: 11/944,227 depositado a 21 de novembro, 2007, que são incorporados por referência nas suas totalidades para todos os propósitos.
[00335] Quando dois ou mais ligantes estão presentes, os ligantes podem ter todos as mesmas propriedades, todos têm diferentes propriedades ou ligantes têm as mesmas propriedades enquanto outros têm diferentes propriedades. Por exemplo, um ligante pode ter propriedades de direcionamento, ter atividade endossomolítica ou ter propriedades de modulação PK. Em uma modalidade preferencial, todos os ligantes têm propriedades diferentes.
[00336] Os ligantes podem estar acoplados aos oligonucleotídeos em vários locais, por exemplo, extremidade 3', extremidade 5', e/ou em uma posição interna. Em modalidades preferenciais, o ligante está anexado aos oligonucleotídeos através de uma corrente de intervenção, por exemplo, um carreador descrito aqui. O ligante ou ligante preso pode estar presente em um monômero quando o monômero está incorporado na fita em crescimento. Em algumas modalidades, o ligante pode estar incorporado através de acoplamento a um monômero "precursor" após o monômero "precursor" ter sido incorporado na fita em crescimento. Por exemplo, um monômero tendo, por exemplo, uma corrente com terminação amino (i.e., não tendo nenhum ligante associado), por exemplo, TAP-(CH2)nNH2 pode estar incorporado em uma fita de oligonucleotídeo em crescimento. Em uma operação subsequente, i.e., após incorporação do monômero precursor na fita, um ligante tendo um grupo eletrofílico, por exemplo, um grupo éster de pentafluorofenila ou aldeído, pode ser subsequentemente anexado ao monômero precursor por acoplamento do grupo eletrofílico do ligante com o grupo nucleofílico terminal da corrente do monômero precursor.
[00337] Em outro exemplo, um monômero tendo um grupo químico adequado para tomar parte em reação de Química Click pode ser incorporado, por exemplo, uma corrente/ligante com terminação de azida ou alquino. Em uma operação subsequente, i.e., após incorporação do monômero precursor na fita, um ligante tendo grupo químico complementar, por exemplo, um alquino ou azida pode ser anexado ao monômero precursor por acoplamento do alquino e da azida em conjunto.
[00338] Para oligonucleotídeos de fita dupla, os ligantes podem ser anexados a uma das ou ambas as fitas. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de fita dupla contém um ligante conjugado com a fita senso. Em outras modalidades, um agente de RNAi de fita dupla contém um ligante conjugado com a fita antissenso.
[00339] Em algumas modalidades, o ligante pode estar conjugado com nucleobases, frações de açúcar, ou ligações internucleosídicas de moléculas de ácido nucleico. A conjugação com nucleobases de purina ou seus derivados pode ocorrer em qualquer posição, incluindo átomos endocíclicos e exocíclicos. Em algumas modalidades, as posições 2, 6, 7, ou 8 de uma nucleobase de purina estão anexadas a uma fração do conjugado. A conjugação com nucleobases de pirimidina ou seus derivados pode também ocorrer em qualquer posição. Em algumas modalidades, as posições 2, 5, e 6 de uma nucleobase de puirimidina podem estar substituídas por uma fração do conjugado. A conjugação com frações de açúcar de nucleosídeos pode ocorrer em qualquer átomo de carbono. Átomos de carbono exemplares de uma fração de açúcar que pode ser anexada a uma fração do conjugado incluem os átomos de carbono 2', 3', e 5'. A posição 1' pode estar também anexada a uma fração do conjugado, tal como em um resíduo abásico. As ligações internucleosídicas podem também carregar frações do conjugado. Para ligações contendo fósforo (por exemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditiotato, fosforoamidato e similares), a fração do conjugado pode estar anexada diretamente ao átomo de fósforo ou a um átomo de O, N, ou S ligado ao átomo de fósforo. Para ligações internucleosídicas contendo amida ou amida (por exemplo, PNA), a fração do conjugado pode estar anexada ao átomo de nitrogênio da amina ou amida ou a um átomo de carbono adjacente.
[00340] Qualquer ligante adequado na área de interferência de RNA pode ser usado, embora o ligante seja tipicamente um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo (tal como GalNac), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, polissacarídeo.
[00341] Ligantes que conjugam o ligante com o ácido nucleico incluem aqueles discutidos acima. Por exemplo, o ligante pode ser um ou mais derivados de GalNAc (N-acetilglucosamina) anexados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00342] Em uma modalidade, o dsRNA da invenção está conjugado com um ligante ramificado bivalente ou trivalente inclui as estruturas mostradas em qualquer uma das fórmulas (IV) - (VII):
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[00343] em que:
[00344] q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam independentemente para cada ocorrência 0-20 e em que a unidade de repetição pode ser a mesma ou diferente;
[00345] P2A P2B P3A P3B P4A P4B P5A P5B P5C T2A T2B T3A T3BT4A, T4B, T4A, T5B, T5C estão cada um independentemente para cada ocorrência ausentes, são CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ou CH2O;
[00346] Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C estão cada umindependentemente para cada ocorrência ausentes, são alquileno, alquileno substituído em que um ou mais metilenos podem estar interrompidos ou terminados por um ou mais de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R’’), C=C ou C(O);
[00347] R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C estão cada umindependentemente para cada ocorrência ausentes, são NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure img0006
[00348] L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B e L5C representam o ligante;i.e, cada um independentemente para cada ocorrência um monossacarídeo (tal como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo; e
[00349] Ra é H ou cadeia lateral de aminoácidos.
[00350] Derivados de GalNAc de conjugação trivalentes são particularmente úteis para uso com agentes de RNAi para inibição da expressão de um gene alvo, tal como aqueles da fórmula (VII):
Figure img0007
[00351] em que L5A, L5B e L5C representam um monossacarídeo, tal como um derivado de GalNAc.
[00352] Exemplos de grupos ligantes ramificados bivalentes e
Figure img0008
Figure img0009
[00353] Em outras modalidades, o agente de RNAi para uso nos métodos da invenção é um agente selecionado do grupo consistindo em AD-53815, AD-56663, AD-56658, AD-56676, AD-56666, AD-57928, e AD-60212.
III. Administração de um RNAi da Invenção
[00354] A administração de um agente de RNAi da invenção em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo humano (por exemplo, um indivíduo com sua necessidade, tal como um indivíduo tendo um distúrbio de lipídeos, tal como uma hiperlipidemia) pode ser alcançada em um número de maneiras diferentes. Por exemplo, a distribuição pode ser realizada por contato de uma célula com um RNAi da invenção in vitro ou in vivo. A distribuição in vivo pode ser realizada diretamente por administração de uma composição compreendendo um RNAi, por exemplo, um dsRNA, a um indivíduo. Alternativamente, a administração in vivo pode ser realizada indiretamente por administração de um ou mais vetores que codificam e dirigem a expressão do RNAi. Estas alternativas são adicionalmente discutidas em baixo.
[00355] Em geral, qualquer método de administração de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para uso com um RNAi da invenção (ver, por exemplo, Akhtar S. e Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 e WO94/02595, que sãoincorporados aqui por referência nas suas totalidades). Para administração in vivo, fatores a ter em consideração para administrar uma molécula de RNAi incluem, por exemplo, estabilidade biológica da molécula administrada, prevenção de efeitos inespecíficos, e acúmulo da molécula administrada no tecido alvo. Os efeitos inespecíficos de um RNAi podem ser minimizados por administração local, por exemplo, por injeção ou implantação direta em um tecido ou administração tópica da preparação. A administração local a um local de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente a tecidos sistêmicos que podem de outro modo ser danificados pelo agente ou que podem degradar o agente, e permite uma dose total mais baixa da molécula de RNAi a ser administrada. Vários estudos mostraram o silenciamento bem-sucedido de produtos de gene quando um RNAi é administrado localmente. Por exemplo se mostrou que a distribuição intraocular de um dsRNA de VEGF por injeção intravítrea em macacos cinomólogos (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24:132-138) e injeções subretinais em camundongos (Reich, SJ., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previnem a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada com a idade. Adicionalmente, a injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume tumoral (Pille, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos transportando tumores (Kim, WJ., et al. (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15:515-523). A interferência de RNA mostrou também êxito com administração local ao CNS por injeção direta (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) e aos pulmões por administração intranasal (Howard, KA., et al. (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administração de um RNAi sistemicamente para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou alternativamente distribuído usando um sistema de administração de fármacos; ambos os métodos atuam para prevenir a degradação rápida do dsRNA por endo- e exo-nucleases in vivo. A modificação do RNA ou do carreador farmacêutico também pode permitir direcionamento da composição de RNAi para o tecido alvo e evitar efeitos fora do alvo indesejáveis. Moléculas de RNAi podem ser modificadas por conjugação química com grupos lipofílicos tais como colesterol para intensificar a captação celular e prevenir a degradação. Por exemplo, um RNAi dirigido contra ApoB conjugado com uma fração de colesterol lipofílica foi injetado sistemicamente em camundongos e resultou em silenciamento de RNAm de apoB no fígado e jejuno (Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178). Foi mostrado que a conjugação de um RNAi com um aptâmero inibe o crescimento tumoral e medeia a regressão tumoral em um modelo de camundongo de câncer da próstata (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o RNAi pode ser distribuído usando sistemas de administração de fármacos tais como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomos, ou um sistema de distribuição catiônico. Sistemas de distribuição catiônicos positivamente carregados facilitam a ligação de uma molécula de RNAi (negativamente carregada) e intensificam também interações na membrana celular negativamente carregada para permitir captação eficaz de um RNAi pela célula. Lipídeos catiônicos, dendrímeros, ou polímeros podem ser ligados a um RNAi, ou induzidos para formar uma vesícula ou micélio (ver, por exemplo, Kim SH., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encerra um RNAi. A formação de vesículas ou micélios previne adicionalmente a degradação do RNAi quando administrado sistemicamente. Métodos para preparação e administração de complexos de RNAi catiônicos estão bem dentro das capacidades de um perito na técnica (ver, por exemplo, Sorensen, DR., et al. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade). Alguns exemplos não limitantes de sistemas de distribuição de fármacos úteis para distribuição sistêmica de RNAis incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), supra; Verma, UN., et al. (2003), supra), Oligofectamina, "partículas de lipídeo de ácido nucleico sólidas" (Zimmermann, TS., et al. (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al. (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenoimina (Bonnet ME., et al. (2008) Pharm. Res. 16 ag Epub antes da impressão; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), peptídeos de Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), e poliamidoaminas (Tomalia, DA., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). Em algumas modalidades, um RNAi forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Métodos para administração e composições farmacêuticas de RNAis e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente dos E.U.A. No. 7,427,605, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
A. RNAis da Invenção codificados por Vetores
[00356] iRNA se dirigindo ao gene de PCSK9 pode ser expresso a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (ver, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicação PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, Publicação PCT Internacional No. WO 00/22114, e Conrad, Pat. dos E.U.A. No. 6,054,299). A expressão pode ser transiente (da ordem de horas a semanas) ou sustentada (semanas a meses ou mais), dependendo do constructo específico usado e do tipo de tecido ou célula alvo. Estes transgenes podem ser introduzidos como um constructo linear, um plasmídeo circular, ou um vetor viral, que pode ser um vetor integrante ou não integrante. O transgene pode ser também construído para permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossômico (Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[00357] A fita individual ou fitas de um RNAi podem ser transcritas a partir de um promotor em um vetor de expressão. Onde duas fitas separadas são para serem expressas para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser cointroduzidos (por exemplo, por transfecção ou infecção) em uma célula alvo. Alternativamente, cada fita individual de um dsRNA pode ser transcrita por promotores, ambos os quais estão localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso comoe polinucleotídeos com repetições invertidas ligados por uma sequência de polinucleotídeos ligante tal que o dsRNA tenha uma estrutura de haste e alça.
[00358] Vetores de expressão de RNAi são geralmente plasmídeos de DNA ou vetores virais. Vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferencialmente aqueles compatíveis com células de vertebrado, podem ser usados para produzir constructos recombinantes para a expressão de um RNAi como descrito aqui. Vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis de um número de fontes comerciais. Tipicamente, tais vetores são proporcionados contendo locais de restrição convenientes para inserção do segmento de ácido nucleico desejado. A distribuição de vetores expressando RNAi pode ser sistêmica, tal como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração a células alvo explantadas do paciente seguida de reintrodução no paciente, ou por qualquer outro meio que permita introdução em uma célula alvo desejada.
[00359] Plasmídeos de expressão de RNAi podem ser transfectados em células alvo como um complexo com carreadores de lipídeos catiônicos (por exemplo, Oligofectamina) ou carreadores à base de lipídeos não catiônicos (por exemplo, Transit-TKOTM). Múltiplas transfecções de lipídeos para silenciamentos mediados por RNAi se dirigindo a diferentes regiões de um RNA alvo ao longo de um período de uma semana ou mais estão também contempladas pela invenção. A introdução bem-sucedida de vetores em células hospedeiras pode ser monitorizada usando vários métodos conhecidos. Por exemplo, a transfecção transiente pode ser sinalizada com um repórter, tal como um marcador fluorescente, tal como Proteína Verde Fluorescente (GFP). A transfecção estável de células ex vivo pode ser assegurada usando marcadores que proporcionam à célula transfectada resistência a fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), tais como resistência a higromicina B.
[00360] Sistemas de vetores virais que podem ser utilizados com os métodos e composições descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo mas não se limitando a vetores lentivirais, vírus da leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vetores de vírus adeno-associados; (d) vetores de vírus herpes simplex; (e) vetores de SV 40; (f) vetores de vírus do polioma; (g) vetores de vírus do papiloma; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de vírus da varíola tais como um como ortopox, por exemplo, vetores de vírus vacínia ou avipox, por exemplo, varíola dos canários ou varíola das aves domésticas; e (j) um adenovírus dependente de auxiliares ou gutless. Vírus deficientes quanto à replicação podem ser também vantajosos. Diferentes vetores serão ou não incorporados no genoma das células. Os constructos podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, o constructo pode ser incorporado em vetores capazes de replicação epissomal, por exemplo, vetores de EPV e EBV. Constructos para a expressão recombinante de um RNAi irão geralmente requerer elementos reguladores, por exemplo, promotores, intensificadores, etc., para assegurar a expressão do RNAi em células alvo. Outros aspectos a ter em consideração para vetores e constructos são adicionalmente descritos em baixo.
[00361] Vetores úteis para a distribuição de um RNAi incluirão elementos reguladores (promotor, intensificador, etc.) suficientes para expressão do RNAi na célula ou tecido alvo desejado. Os elementos reguladores podem ser escolhidos para proporcionarem expressão constitutiva ou regulada/induzível.
[00362] A expressão do RNAi pode ser precisamente regulada, por exemplo, por uso de uma sequência reguladora induzível que é sensível a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis de glucose em circulação, ou hormônios (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tais sistemas de expressão induzível, adequados para o controle da expressão de dsRNA em células ou em mamíferos incluem, por exemplo, regulação por ecdisona, por estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos da dimerização, e isopropil-beta-D1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). Uma pessoa perita na técnica seria capaz de escolher a sequência reguladora/promotora apropriada com base no uso pretendido do transgene de RNAi.
[00363] Podem ser usados vetores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos codificando um RNAi. Por exemplo pode ser usado um vetor retroviral (ver Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma viral e integração no DNA da célula hospedeira. As sequências de ácidos nucleicos codificando um RNAi são clonadas em um ou mais vetores, o que facilita a administração do ácido nucleico em um paciente. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados, por exemplo, em Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retroviral para distribuir o gene mdr1 em células-tronco hematopoiéticas de modo a tornar as células-tronco mais resistentes a quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais em terapia genética são: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Vetores lentivirais contemplados para uso incluem, por exemplo, os vetores baseados em HIV descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,143,520; 5,665,557; e 5,981,276, que são aqui incorporadas por referência.
[00364] Adenovírus também são contemplados para uso na distribuição de RNAis da invenção. Adenovírus são veículos especialmente atrativos, por exemplo para distribuição de genes em epitélios respiratórios. Os adenovírus infetam naturalmente epitélios respiratórios onde causam uma doença ligeira. Outros alvos de sistemas de administração baseados em adenovírus são fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais, e músculo. Os adenovírus têm a vantagem de serem capazes de infetar células não em divisão. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) apresentam uma revisão de terapia de genes baseada em adenovírus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Outros casos de uso de adenovírus em terapia de genes podem ser encontrados em Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); Publicação PCT WO94/12649; e Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Um vetor AV adequado para expressão de um RNAi apresentado na invenção, um método para construção do vetor AV recombinante, e um método para distribuição do vetor a células alvo, são descritos em Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
[00365] Vetores de vírus adeno-associados (AAV) também podem ser usados para distribuir um RNAi da invenção (Walsh et al., (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Pat. dos E.U.A. No. 5,436,146). Em uma modalidade, o RNAi pode ser expresso como duas moléculas de RNA de fita única complementares, separadas a partir de um vetor AAV recombinante tendo, por exemplo, o promotor de RNA U6 ou H1, ou o promotor do citomegalovírus (CMV). Vetores AAV adequados para expressão do dsRNA apresentado na invenção, métodos para construção do vetor AV recombinante, e métodos para distribuição dos vetores em células alvo são descritos em Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. dos E.U.A. No. 5,252,479; Pat. dos E.U.A. No. 5,139,941; Pedido de Patente Internacional No. WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional No. WO 93/24641, as divulgações inteiras dos quais são aqui incorporadas por referência.
[00366] Outro vetor viral adequado para distribuição de um RNAi da invenção é um vírus da varíola tal como um vírus vacínia, por exemplo uma vacínia atenuada tal como Vírus Ancara Modificado (MVA) ou NYVAC, um avipox tal como varíola das aves domésticas ou varíola dos canários.
[00367] O tropismo dos vetores virais pode ser modificado por pseudotipagem dos vetores com proteínas do envelope ou outros antigênios de superfície de outros vírus, ou por substituição de diferentes proteínas da cápside viral, como apropriado. Por exemplo, os vetores lentivirais podem ser pseudotipados com proteínas de superfície do vírus da estomatite vesicular (VSV), raiva, Ébola, Mokola, e similares. Os vetores AAV podem ser fabricados para se dirigireem a diferentes células por manipulação dos vetores para expressarem diferentes serótipos de proteínas da cápside; ver, por exemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, a divulgação inteira do qual é aqui incorporado por referência.
[00368] A preparação farmacêutica de um vetor pode incluir o vetor em um diluente aceitável, ou pode incluir uma matriz de liberação lenta na qual o veículo de distribuição de genes está embebido. Alternativamente, onde o vetor completo de distribuição de genes puder ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de distribuição de genes.
V. Composições Farmacêuticas da Invenção
[00369] A presente invenção inclui também composições e formulações farmacêuticas que incluem os RNAis da invenção. Em uma modalidade são proporcionadas aqui composições farmacêuticas contendo um RNAi, como descrito aqui, e um veículo farmaceuti- camente aceitável. As composições farmacêuticas contendo o RNAi são úteis para tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de um gene de PCSK9, por exemplo, um distúrbio de lipídeos. Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de distribuição. Um exemplo é composições que são formuladas para administração sistêmica através de administração parenteral, por exemplo, por administração intravenosa (IV). Outro exemplo é composições que são formuladas para distruibuião direta no parênquima do cérebro, por exemplo, por infusão no cérebro, tal como por infusão contínua com bomba.
[00370] As composições farmacêuticas compreendendo agentes de RNAi da invenção podem ser, por exemplo, soluções com ou sem um tampão, ou composições contendo veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem, por exemplo, composições aquosas ou cristalinas, formulações lipossomais, formulações micelares, emulsões, e vetores de terapia de genes.
[00371] Nos métodos da invenção, o agente de RNAi pode seradministrado em uma solução. Um agente de RNAi livre pode ser administrado em uma solução não tamponada, por exemplo, em salino ou em água. Alternativamente, o siRNA livre pode ser também administrado em uma solução tampão adequada. A solução tampão pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato, ou fosfato, ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade preferencial, a solução tampão é salino tamponado com fosfato (PBS). O pH e osmolaridade da solução tampão contendo o agente de RNAi podem ser ajustados tal que seja adequada para administração a um indivíduo.
[00372] Em algumas modalidades, a solução tampão compreende adicionalmente um agente para controle da osmolaridade da solução, tal que a osmolaridade seja mantida a um valor desejado, por exemplo, aos valores fisiológicos do plasma humano. Solutos que podem ser adicionados à solução tampão para controlar a osmolaridade incluem, mas não estão limitados a, proteínas, peptídeos, aminoácidos, polímeros não metabolizados, vitaminas, íons, açúcares, metabolitos, ácidos orgânicos, lipídeos, ou sais. Em algumas modalidades, o agente para controle da osmolaridade da solução é um sal. Em certas modalidades, o agente para controle da osmolaridade da solução é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00373] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene de PCSK9. Em geral, uma dose adequada de um RNAi da invenção estará na gama de cerca de 0,001 a cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor por dia, geralmente na gama de cerca de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, ou cerca de 50 mg/kg por dose única.
[00374] Por exemplo, o agente de RNAi, por exemplo, dsRNA, pode ser administrado a uma dose de cerca de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, ou cerca de 10 mg/kg. É também pretendido que valores e gamas intermédias dos valores recitados sejam parte desta invenção.
[00375] Em outra modalidade, o agente de RNAi, por exemplo, dsRNA, é administrado a uma dose de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 acerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 acerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 acerca de 50 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 acerca de 50 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 acerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 45mg/kg, cerca de 5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 45mg/kg, cerca de 10 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 45mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45mg/kg, cerca de 30 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 45mg/kg, cerca de 40 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 40mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 40mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 40mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 40mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 40mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 40mg/kg, cerca de 15 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 40mg/kg, cerca de 35 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 30mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 30mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 30mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 30mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 30mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 30mg/kg, cerca de 15 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30mg/kg, cerca de 25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 20mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 20mg/mg, cerca de 1,5 a cerca de 20 mg/kb, cerca de 2 a cerca de 20mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 20mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 20mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 a cerca de 20 mg/kg. É também pretendido que valores e gamas intermédias dos valores recitados sejam parte desta invenção.
[00376] Por exemplo, o agente de RNAi, por exemplo, dsRNA, pode ser administrado a uma dose de cerca de 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, ou cerca de 10 mg/kg. É também pretendido que valores e gamas intermédias dos valores recitados sejam parte desta invenção.
[00377] Em outra modalidade, o agente de RNAi, por exemplo, dsRNA, é administrado a uma dose de cerca de 0 ,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 50mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 50mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 50mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 50mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 50mg/kg, cerca de 35 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 50mg/kg, cerca de 45 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 45mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 45mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 45mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 45mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 45mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 45mg/kg, cerca de 15 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 45mg/kg, cerca de 35 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 45mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 40mg/kg, cerca de 3 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 40mg/kg, cerca de 4 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 40mg/kg, cerca de 5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 40mg/kg, cerca de 10 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 40mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40mg/kg, cerca de 30 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 40mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 30mg/kg, cerca de 1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 2 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 3 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 4 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 30mg/kg, cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 30mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 30mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 20mg/kg, cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 2 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 3 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 4 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 20mg/kg, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 a cerca de 20 mg/kg. Em uma modalidade, o dsRNA é administrado a uma dose de cerca de 10 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. É também pretendido que valores e gamas intermédias dos valores recitados sejam parte desta invenção.
[00378] Por exemplo, aos indivíduos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de RNAi, tal como cerca de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou cerca de 50 mg/kg. É também pretendido que valores e gamas intermédias dos valores recitados sejam parte desta invenção.
[00379] A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez diariamente, ou o RNAi pode ser administrado como duas, três, ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou mesmo usando infusão ou distribuição contínua através de uma formulação de liberação controlada. Em esse caso, o RNAi contido em cada subdose tem de ser correspondentemente menor para se alcançar a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode ser também composta para distribuição ao longo de vários dias, por exemplo, usando uma formulação de liberação sustentada convencional que proporciona liberação sustentada do RNAi ao longo de um período de vários dias. Formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para distribuição de agentes em um local particular, tal como poderia ser usado com os agentes da presente invenção. Em esta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.
[00380] Em outras modalidades, uma dose única das composições farmacêuticas pode ser duradoura, tal que doses subsequentes sejam administradas em intervalos de não mais do que 3, 4, ou 5 dias, ou em intervalos de não mais do que 1, 2, 3, ou 4 semanas. Em algumas modalidades da invenção, uma dose única das composições farmacêuticas da invenção é administrada uma vez por semana. Em outras modalidades da invenção, uma dose única das composições farmacêuticas da invenção é administrada bimensalmente.
[00381] O especialista perito apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e calendarização requeridas para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo a mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos prévios, o estado geral de saúde e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. Podem ser feitas estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para os RNAis individuais englobados pela invenção usando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado, como descrito em outro lugar aqui.
[00382] Progressos em genética de camundongos geraram um número de modelos de camundongo para o estudo de várias doenças humanas, tais como um distúrbio de sangramento que beneficiaria de redução da expressão de PCSK9. Tais modelos podem ser usados para teste in vivo de RNAi, bem como para determinação de uma dose terapeuticamente eficaz. Modelos de camundongo adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, um camundongo contendo um transgene expressando PCSK9 de humano.
[00383] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de um número de maneiras dependendo de se é desejado tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, por um penso transdérmico), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdérmica, por exemplo, através de um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração intraparenquimal, intratecal ou intraventricular.
[00384] O RNAi pode ser distribuído de uma maneira para se dirigir a um tecido particular, tal como o fígado (por exemplo, os hepatócitos do fígado).
[00385] Composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir pensos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e similares podem ser também úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas nas quais os RNAis apresentados na invenção estão em mistura com um agente de distribuição tópica tal como lipídeos, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensioativos. Lipídeos e lipossomas adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoílfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoílfosfatidil colina DMPC, diestearolifosfatidil colina), negativos (por exemplo, dimiristoílfosfatidil glicerol DMPG) e catiônicos (por exemplo, dioleoíltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoílfosfatidil etanolamina DOTMA). Os RNAis apresentados na invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomas ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomas catiônicos. Alternativamente, os RNAis podem ser complexados com lipídeos, em particular com lipídeos catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem mas não estão limitados a ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um éster de alquila C1-20 (por exemplo, miristato de isopropila IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou seu sal farmaceuticamente aceitável. Formulações tópicas são descritas em detalhe na Patente dos E.U.A. No. 6,747,014, que é incorporada aqui por referência.
A. Formulações de RNAi Compreendendo Montagens Moleculares Membranosas
[00386] Um RNAi para uso nas composições e métodos da invenção pode ser formulado para distribuição em uma montagem molecular membranosa, por exemplo, um lipossoma ou um micélio. Como usado aqui, o termo "lipossoma" se refere a uma vesícula composta por lipídeos anfifílicos dispostos em pelo menos uma bicamada, por exemplo, uma bicamada ou uma pluralidade de bicamadas. Os lipossomas incluem vesículas unilamelares e multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição de RNAi. O material lipofílico isola o interior aquoso de um exterior aquoso, que tipicamente não inclui a composição de RNAi, embora, em alguns exemplos, o possa. Os lipossomas são úteis para a transferência e distribuição de ingredientes ativos ao local de ação. Uma vez que a membrana lipossomal é estruturalmente similar a membranas biológicas, quando lipossomas são aplicados em um tecido, a bicamada lipossomal é fundida à bicamada das membranas celulares. À medida que a fusão do lipossoma e célula progride, os conteúdos aquosos internos que incluem o RNAi são distribuídos na célula onde o RNAi pode se ligar especificamente a um RNA alvo e pode mediar RNAi. Em alguns casos, os lipossomas são também especificamente direcionados, por exemplo, para dirigir o RNAi para tipos de células particulares.
[00387] Um lipossoma contendo um agente de RNAi pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente de lipídeo de um lipossoma é dissolvido em um detergente tal que sejam formados micélios com o componente de lipídeo. Por exemplo, o componente de lipídeo pode ser um lipídeo ou conjugado de lipídeo catiônico. O detergente pode ter uma elevada concentração de micélio crítica e pode ser não iônico. Detergentes exemplares incluem colato, CHAPS, octilglucosídeo, desoxicolato, e lauroíl sarcosina. A preparação do agente de RNAi é depois adicionada aos micélios que incluem o componente de lipídeo. Os grupos catiônicos no lipídeo interagem com o agente de RNAi e condensam em torno do agente de RNAi para formar um lipossoma. Após condensação, o detergente é removido, por exemplo, pore diálise, para originar a uma preparação lipossomal de agente de RNAi.
[00388] Se necessário, um composto carreador que auxilia a condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, por adição controlada. Por exemplo, o composto carreador pode ser um polímero sem ser um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH pode ser também ajustado para favorecer a condensação.
[00389] Métodos para produção de veículos de administração de polinucleotídeos estáveis, que incorporam um complexo polinucleotídeo/lipídeo catiônico como componentes estruturais do veículo de distribuição, são adicionalmente descritos em, por exemplo, WO 96/37194, os conteúdos inteiros da qual são incorporados aqui por referência. A formação de lipossomas pode também incluir um ou mais aspectos de métodos exemplares descritos em Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; Pat. dos E.U.A. No. 4,897,355; Pat. dos E.U.A. No. 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; e Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Técnicas comummente usadas para preparação de agregados de lipídeos de tamanho apropriado para uso como veículos de distribuição incluem sonicação e congelação-descongelação mais extrusão (ver, por exemplo, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Pode ser usada microfluidização quando forem desejados agregados consistentemente pequenos (50 a 200 nm) e relativamente uniformes (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Estes métodos são prontamente adaptados ao empacotamento de preparações de agente de RNAi em lipossomas.
[00390] Os lipossomas são classificados em duas amplas classes. Lipossomas catiônicos são lipossomas positivamente carregados que interagem com as moléculas de ácidos nucleicos negativamente carregadas para formar um complexo estável. O complexo ácido nucleico/lipossomo positivamente carregado se liga à superfície celular negativamente carregada e é internalizado em um endossoma. Devido ao pH ácido dentro do endossoma, os lipossomas sofrem rutura, liberando seus conteúdos no citoplasma da célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[00391] Os lipossomas que são sensíveis ao pH ou negativamente carregados aprisionam ácidos nucleicos em vez de se complexarem com ele. Uma vez que tanto o ácido nucleico como o lipídeo estão similarmente carregados ocorre repulsão em vez de formação de complexo. Ainda assim, algum ácido nucleico fica aprisionado dentro do interior aquoso destes lipossomas. Lipossomas sensíveis ao pH têm sido usados para distribuir ácidos nucleicos codificando o gene da timidina cinase em monocamadas de células em cultura. A expressão do gene exógeno foi detetada nas células alvo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[00392] Um grande tipo de composição lipossomal inclui fosfolipídeos sem ser fosfatidilcolina naturalmente derivada. Composições de lipossomas neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoíl fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC). Composições de lipossomas aniônicas são geralmente formadas a partir de dimiristoíl fosfatidilglicerol, enquanto lipossomas fusogênicos aniônicos são formados principalmente a partir de dioleoíl fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formada a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja, e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00393] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomas em células in vitro e in vivo incluem a Pat. dos E.U.A. No. 5,283,185; Pat. dos E.U.A. No. 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon,Biochem. 32:7143, 1993; e Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
[00394] Sistemas lipossomais não iônicos foram também examinados para se determinar a sua utilidade na distribuição de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensioativo não iônico e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo NovasomeTM I (dilaurato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) e NovasomeTM II (diestearato deglicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) foram usadas para distribuir um fármaco na derme da pele de camundongo. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossomais não iônicos foram eficazes na facilitação da deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[00395] Os lipossomas incluem também lipossomas "estericamente estabilizados", um termo que, como usado aqui, se refere a lipossomas compreendendo um ou mais lipídeos especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em tempos de vida em circulação intensificados em relação a lipossomas não tendo tais lipídeos especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles nos quais parte da porção de lipídeo formadora de vesícula do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolipídeos, tais como monossialogangliosídeo GM1, ou (B) é derivatizada com um ou mais polímeros hidrofílicos, tais como uma fração de polietileno glicol (PEG). Embora não desejando estar limitado por qualquer teoria particular se pensa na técnica que, pelo menos para lipossomas estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina, ou lipídeos derivatizados com PEG, a meia-vida em circulação intensificada destes lipossomas estericamente estabilizados deriva de uma captação reduzida em células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53,3765).
[00396] Vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolipídeos são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relataram a capacidade de monossialogangliosídeo GM1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol de melhorar as meias-vidas no sangue de lipossomas. Estas descobertas foram expostas por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). As Pat. dos E.U.A. No. 4,837,028 e WO 88/04924, ambas em nome de Allen et al., divulgam lipossomas compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo GM1 ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. A Pat. dos E.U.A. No. 5,543,152 (Webb et al.) divulga lipossomas compreendendo esfingomielina. Lipossomas compreendendo 1,2-sn-dimiristoílfosfatidilcolina são divulgados em WO 97/13499 (Lim et al.).
[00397] Em uma modalidade são usados lipossomas catiônicos. Os lipossomas catiônicos têm a vantagem de serem capazes de se fundir à membrana celular. Os lipossomas não catiônicos, apesar de não serem capazes de se fundir tão eficazmente à membrana plasmática, são absorvidos por macrófagos in vivo e podem ser usados para distribuir agentes de RNAi em macrófagos.
[00398] Vantagens adicionais de lipossomas incluem: os lipossomas obtidos de fosfolipídeos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; os lipossomas podem incorporar uma gama ampla de fármacos solúveis em água e lipídeos; os lipossomas podem proteger agentes de RNAi encapsulados em seus compartimentos internos do metabolismo e degradação (Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, volume 1, p. 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossomas são a carga superficial do lipídeo, tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
[00399] Um lipídeo catiônico sintético positivamente carregado,cloreto de N-[1-(2,3-dioleíloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), pode ser usado para formar lipossomas pequenos que interagem espontaneamente com ácido nucleico para formar complexos lipídeo- ácido nucleico que são capazes de se fundir aos lipídeos negativamente carregados das membranas celulares de células de cultura de tecidos, resultando na distribuição do agente de RNAi (ver, por exemplo, Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 e Pat. dos E.U.A. No. 4,897,355 quanto a uma descrição de DOTMA e seu uso com DNA).
[00400] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoíloxi)-3-(trimetilamônia)propano (DOTAP), pode ser usado em combinação com um fosfolipídeo para formar vesículas que complexam com DNA. Lipofectina™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) é um agente eficaz para a distribuição de ácidos nucleicos altamente aniônicos em células de cultura de tecidos vivos que compreendem lipossomas de DOTMA positivamente carregados que interagem espontaneamente com polinucleotídeos negativamente carregados para formar complexos. Quando são usados suficientes lipossomas positivamente carregados, a carga líquida dos complexos resultantes é também positiva. Complexos positivamente carregados preparados desta maneira se anexam espontaneamente a superfícies celulares negativamente carregadas, se fundem à membrana plasmática, e distribuem eficazmente ácidos nucleicos funcionais em, por exemplo, células de cultura de tecidos. Outro lipídeo catiônico comercialmente disponível, 1,2-bis(oleoíloxi)-3,3-(trimetilamônia)propano ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difere de DOTMA pelo fato de as frações oleoíla estarem ligadas por ligações éster, em vez de éter.
[00401] Outros compostos de lipídeos catiônicos relatados incluem aqueles que foram conjugados com uma variedade de frações, incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada com um de dois tipos de lipídeos e inclui compostos tais como dioctaoleoílamida de 5- carboxiespermilglicina ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) e 5-carboxiespermil-amida de dipalmitoílfosfatidiletanolamina ("DPPES") (ver, por exemplo, Pat. dos E.U.A. No. 5,171,678).
[00402] Outro conjugado de lipídeo catiônico inclui derivatização do lipídeo com colesterol ("DC-Chol") que foi formulado em lipossomas em combinação com DOPE (Ver Gao, X. e Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Foi relatado que lipopolilisina, preparada por conjugação de polilisina com DOPE, é eficaz para transfecção na presença de soro (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para certas linhagens celulares se diz que esteslipossomas contendo lipídeos catiônicos conjugados exibem toxicidade mais baixa e proporcionam transfecção mais eficaz do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos de lipídeos catiônicos comercialmente disponíveis incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, Califórnia) e Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Outros lipídeos catiônicos adequados para a distribuição de oligonucleotídeos são descritos em WO 98/39359 e WO 96/37194.
[00403] Formulações lipossomais são particularmente adequadas para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos secundários reduzidos relacionados elevada absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo aumentado do fármaco administrado no alvo desejado, e a capacidade de administrar um agente de RNAi na pele. Em algumas implementações são usados lipossomas para distruibuir um agente de RNAi em células epidérmicas e também para intensificar a penetração do agente de RNAi em tecidos da derme, por exemplo, na pele. Por exemplo, os lipossomas podem ser aplicados topicamente. A administração tópica de fármacos formulados como lipossomos na pele foi documentada (ver, por exemplo, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 e du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. e Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. e Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. e Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[00404] Sistemas lipossomais não iônicos foram também examinados para se determinar a sua utilidade na distribuição de fármacos na pele, em particular sistemas compreendendo tensioativo não iônico e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo Novasome I (dilaurato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) e Novasome II (diestearato deglicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) foram usadas para distribuir um fármaco na derme da pele de camundongo. Tais formulações com agente de RNAi são úteis para tratamento de um distúrbio dermatológico.
[00405] Os lipossomas que incluem RNAi podem ser tornados altamente deformáveis. Tal deformabilidade pode permitir que os lipossomas penetrem através de poros que são menores do que o raio médio do lipossoma. Por exemplo, os transfersomas são um tipo de lipossomas deformáveis. Os transferossomas podem ser preparados por adicão de ativadores da borda de superfície, usualmente tensioativos, a uma composição lipossomal padrão. Os transfersomas que incluem um agente de RNAi podem ser distribuídos, por exemplo, subcutaneamente por infeção de modo a distrubuir o agente de RNAi em queratinócitos da pele. De modo a atravessarem pele intacta de mamífero, vesículas de lipídeos têm de passar através de uma série de poros finos, cada um com um diâmetro menor do que 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Adicionalmente, devido às propriedades dos lipídeos, estes transferossomas podem ser auto-otimizantes (adaptação à forma dos poros, por exemplo, na pele), autorreparantes, e conseguem frequentemente alcançar seus alvos sem fragmentação, e frequentemente autocarregantes.
[00406] Outras formulações convenientes para a presente invenção são descritas nos pedidos provisórios dos Estados Unidos Nos. de série 61/018,616, depositado a 2 de janeiro, 2008; 61/018,611, depositado a 2 de janeiro, 2008; 61/039,748, depositado a 26 de março, 2008; 61/047,087, depositado a 22 de abril, 2008, e 61/051,528, depositado a 8 de maio, 2008. O pedido PCT no. PCT/US2007/080331, depositado am 3 de outubro, 2007, descreve também formulações que são convenientes para a presente invenção.
[00407] Transfersomas são ainda outro tipo de lipossomas, e são agregados de lipídeos altamente deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de distribuição de fármacos. Os transfersomas podem ser descritos como gotículas de lipídeos que são tão altamente deformáveis que conseguem facilmente penetrar através de poros que são mais pequenos do que a gotícula. Os transfersomas são adaptáveis ao ambiente no qual são usados, por exemplo, são auto-otimizantes (adaptativos à forma dos poros na pele), autorreparantes, alcançam frequentemente seus alvos sem fragmentação, e frequentemente autocarregantes. Para preparar transfersomos é possível adicionar ativadores de borda de superfície, habitualmente tensioativos, a uma composição de lipossomos padrão. Os transfersomas foram usados para distribuir albumina do soro na pele. Foi mostrado que a distribuição de albumina do soro mediada por transfersomas é tão eficaz como injeção subcutânea de uma solução contendo albumina do soro.
[00408] Os tensioativos encontram ampla aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A maneira mais comum de classificar e ordenar as propriedades dos muitos tipos diferentes de tensioativos, tanto naturais como sintéticos, é pelo uso do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como a "cabeça") proporciona o meio mais útil para categorização dos diferentes tensioativos usados em formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, p. 285).
[00409] Se a molécula de tensioativo não estiver ionizada é classificada como um tensioativo não iônico. Os tensioativos não iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são usáveis ao longo de uma ampla gama de valores de pH. Em geral, seus valores HLB variam de 2 a cerca de 18 dependendo da sua estrutura. Tensioativos não iônicos incluem ésteres não iônicos tais como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitana, ésteres de sacarose, e ésteres etoxilados. Alcanolamidas e éteres não iônicos tais como etoxilatos de álcoois graxos, álcoois propoxilados, e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados estão também incluídos em esta classe. Os tensioativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe dos tensioativos não iônicos.
[00410] Se a molécula de tensioativo transportar uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensioativo é classificado como aniônico. Tensioativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sabões, lactilatos de acila, amidas de acila de aminoácidos, ésteres do ácido sulfúrico tais como sulfatos de alquila e sulfatos de alquila etoxilados, sulfonatos tais como benzenossulfonatos de alquila, isetionatos de acila, tauratos de acila e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe dos tensioativos aniônicos são os sulfatos de alquila e os sabões.
[00411] Se a molécula de tensioativo transportar uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensioativo é classificado como catiônico. Tensioativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usados desta classe.
[00412] Se a molécula de tensioativo tiver a capacidade de transportar uma carga positiva ou negativa, o tensioativo é classificado como anfotérico. Tensioativos anfotéricos incluem derivados do ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[00413] O uso de tensioativos em produtos, formulações e em emulsões de fármacos foi revisto (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, p. 285).
[00414] O RNAi para uso nos métodos da invenção pode ser também proporcionado como formulações micelares. “Micélios” são definidos aqui como um tipo particular de montagem molecular em que moléculas anfipáticas são dispostas em uma estrutura esférica de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas estão dirigidas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa envolvente. Existe a disposição inversa se o ambiente for hidrofóbico.
[00415] Uma formulação micelar mista adequada para distribuição através de membranas transdérmicas pode ser preparada por mistura de uma solução aquosa da composição de siRNA, um sulfato de alquila C8 a C22 de metal alcalino, e um composto formador de micélios. Compostos formadores de micélios exemplificativos incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis do ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido láctico, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, mono-oleína, mono-oleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de círio-do-norte, mentol, trihidroxi oxo colanil glicina e respectivos sais farmaceuticamente aceitáveis, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e respectivos análogos, éteres de alquila de polidocanol e respectivos análogos, quenodesoxicolato, desoxicolato, e respectivas misturas. Os compostos formadores de micélios podem ser adicionados ao mesmo tempo ou após a adição do alquil sulfato de metal alcalino. Micélios mistos serão formados com substancialmente qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas mistura vigorosa para proporcionar micélios de menores dimensões.
[00416] Em um método é preparada uma primeira composição micelar que contém a composição de siRNA e pelo menos o alquil sulfato de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos formadores de micélios, para formar uma composição micelar mista. Em outro método, a composição micelar é preparada misturando a composição de siRNA, o alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um dos compostos formadores de micélios, seguido da adição dos restantes compostos formadores de micélios, com mistura vigorosa.
[00417] Fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para estabilizar a formulação e protegê-la contra crescimento bacteriano. Em alternativa, fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados com os ingredientes formadores de micélios. Um agente isotônico, como glicerina, também pode ser adicionado após a formação da composição micelar mista.
[00418] Para administração da formulação micelar como uma pulverização, a formulação pode ser colocada em um distribuidor de aerossol e o distribuidor é carregado com um propulsor. O propulsor, que está sob pressão, está em forma líquida no distribuidor. As razões dos ingredientes são ajustadas tal que as fases aquosa e propulsora se tornem uma, i.e., existe uma fase. Se existirem duas fases é necessário agitar o distribuidor antes de distribuir uma porção dos conteúdos, por exemplo através de uma válvula calibrada. A dose distribuída do agente farmacêutico é propelida da válvula calibrada em uma pulverização fina.
[00419] Propulsores podem incluir clorofluorocarbonetos contendo de hidrogênio, fluorocarbonetos contendo de hidrogênio, éter de dimetila e éter de dietila. Em certas modalidades pode ser usado HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano).
[00420] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas por experimentação relativamente simples. Para absorção através das cavidades orais é frequentemente desejável aumentar, por exemplo, pelo menos duplicar ou triplicar, a dosagem para através de injeção ou administração através do trato gastrointestinal.
B. Partículas de lipídeos
[00421] Os RNAis, por exemplo, dsRNAs, da na invenção podem ser totalmente encapsulados em uma formulação de lipídeos, por exemplo, uma LNP, ou outra partícula de ácido nucleico-lipídeo.
[00422] Como usado aqui, o termo "LNP" se refere a uma partícula estável de ácido nucleico-lipídeo. As LNPs contêm um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico, e um lipídeo que previne agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídeo). As LNPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem tempos de vida em circulação prolongados após injeção intravenosa (i.v.) e se acumulam em locais distais (por exemplo, locais fisicamente separados do local de administração). As LNPs incluem "pSPLP", que incluem um complexo de agente de condensação-ácido nucleico encapsulado como apresentado na Publicação PCT No. WO 00/03683. As partículas da presente invenção têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, o mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Adicionalmente, os ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas ácido nucleico-lipídeo da presente invenção, são resistentes em solução aquosa a degradação com uma nuclease. Partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; Publicação U.S. No. 2010/0324120 e Publicação PCT No. WO 96/40964.
[00423] Em uma modalidade, a razão de lipídeo em relação ao fármaco (razão massa/massa) (por exemplo, razão de lipídeo e dsRNA) estará na gama de cerca de 1:1 a cerca de 50:1, de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1, ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. Também é contemplado que intervalos intermédios dos intervalos listados acima façam parte da invenção.
[00424] O lipídeo catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleíl-N,N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N,N-diestearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3-dioleoíloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(1-(2,3-dioleíloxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-(2,3-dioleíloxi)propilamina(DODMA), 1,2-DiLinoleíloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2- Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-Dilinoleílcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleíoxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleíoxi- 3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoíl-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleíltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1- Linoleoíl-2-linoleíloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de 1,2-Dilinoleíloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto de 1,2-Dilinoleoíl-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2- Dilinoleíloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), ou 3-(N,N- Dilinoleílamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2- propanodio (DOAP), 1,2-Dilinoleíloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), l,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleíl-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou seus análogos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetraidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodi-il)didodecan-2-ol (Tech G1), ou uma sua mistura. O lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 20 % por mol a cerca de 50 % por mol ou cerca de 40 % por mol do lipídeo total presente na partícula.
[00425] Em outra modalidade, o composto 2,2-Dilinoleíl-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano pode ser usado para preparar nanopartículas de lipídeo-siRNA. A síntese de 2,2-Dilinoleíl-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano é descrita no pedido de patente provisória dos Estados Unidos número 61/107,998 depositada a 23 de outubro, 2008, que é aqui incorporada por referência.
[00426] Em uma modalidade, a partícula de lipídeo-siRNA inclui 2,2- Dilinoleíl-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano a 40 %: DSPC a 10 %:Colesterol a 40 %: PEG-C-DOMG a 10 % (percentagem molar) com um tamanho das partículas de 63,0 ± 20 nm e uma Razão de siRNA/Lipídeo de 0,027.
[00427] O lipídeo ionizável/não catiônico pode ser um lipídeo aniônico ou um lipídeo neutro, incluindo, mas não se limitando, a diestearoílfosfatidilcolina (DSPC), dioleoílfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC), dioleoílfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoílfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoíl-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoíloleoílfosfatidilcolina (POPC), palmitoíloleoílfosfati- diletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoíl-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoíl fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoílfosfoetanolamina (DMPE), diestearoíl- fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoíl-2-oleoíl-fosfatidietanolamina (SOPE),colesterol, ou uma sua mistura. O lipídeo não catiônico pode compreender de cerca de 5 % por mol a cerca de 90 % por mol, cerca de 10 % por mol, ou cerca de 58 % por mol se colesterol estiver incluído, do lipídeo total presente na partícula.
[00428] O lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um polietilenoglicol (PEG)-lipídeo incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquiloxipropila (DAA), um PEG-fosfolipídeo, um PEG-ceramida (Cer), ou uma respectiva mistura. O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, um PEG-dilauriloxipropila (Ci2), um PEG-dimiristiloxipropila (Ci4), um PEG- dipalmitiloxipropila (Ci6), ou um PEG- diesteariloxipropila (Ci8). O lipídeo conjugado que previne agregação de partículas pode ser de 0 % por mol a cerca de 20 % por mol ou cerca de 2 % por mol do lipídeo total presente na partícula.
[00429] Em algumas modalidades, a partícula de ácido nucleico- lipídeo inclui adicionalmente colesterol a, por exemplo, cerca de 10 % por mol a cerca de 60 % por mol ou cerca de 48 % por mol do lipídeo total presente na partícula.
[00430] Em uma modalidade, o lipidoide ND98-4HCI (PM 1487) (ver Pedido de Patente dos E.U.A. No. 12/056,230, depositada a 3/26/2008, que é incorporada aqui por referência), Colesterol (Sigma-Aldrich), e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) podem ser usados para preparar nanopartículas de lipídeo-dsRNA (i.e., partículas LNP01). Soluções de estoque de cada em etanol podem ser preparadas como se segue: ND98, 133 mg/mL; Colesterol, 25 mg/mL, PEG-Ceramida C16, 100 mg/mL. As soluções de estoque de ND98, Colesterol, e PEG- Ceramida C16 podem ser depois combinadas em uma, por exemplo, razão molar 42:48:10. A solução de lipídeo combinada pode ser misturada com dsRNA aquoso (por exemplo, em acetato de sódio pH 5) tal que a concentração final de etanol seja cerca de 35-45 % e a concentração final de acetato de sódio seja cerca de 100-300 mM. As nanopartículas de lipídeo-dsRNA são tipicamente formadas espontaneamente após mistura. Dependendo da distribuição do tamanho das partículas desejada, a mistura de nanopartículas resultante pode ser extrudada através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, limite de exclusão de 100 nm) usando, por exemplo, uma extrusora thermobarrel, tal como Extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, o passo de extrusão pode ser omitido. A remoção de etanol e mudança de tampão simultânea podem ser alcançadas por, por exemplo, diálise ou filtração com fluxo tangencial. O tampão pode ser mudado com, por exemplo, salino tamponado com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, ou cerca de pH 7,4.
Figure img0010
[00431] Formulações de LNP01 são descritas, por exemplo, naPublicação do Pedido Internacional No. WO 2008/042973, que é deste modo incorporado por referência.
[00432] Formulações de lipídeo-dsRNA exemplares adicionais são descritas na Tabela A.
Figure img0011
Figure img0012
Figure img0013
Figure img0014
DSPC: diestearoilfosfatidilcolinaDPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
[00433] PEG-DMG: PEG-didimiristoíl glicerol (C14-PEG, ou PEG- C14) (PEG com peso molecular médio de 2000)
[00434] PEG-DSG: PEG-diestiril glicerol (C18-PEG, ou PEG-C18)(PEG com peso molecular médio de 2000)
[00435] PEG-cDMA: PEG-carbamoíl-1,2-dimiristiloxipropilamina(PEG com peso molecular médio de 2000)
[00436] Formulações compreendendo LNP (1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) são descritas na Publicação Internacional No. WO2009/127060, depositada a 15 de abril, 2009, que é deste modo incorporada por referência.
[00437] Formulações compreendendo XTC são descritas, por exemplo, no Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/148,366, depositado a 29 de janeiro, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/156,851, depositado a 2 de março, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série depositado a 10 de junho, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/228,373, depositado a 24 de julho, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/239,686, depositado a 3 de setembro, 2009, e Pedido Internacional No. PCT/US2010/022614, depositado a 29 de janeiro, 2010, que são deste modo incorporados por referência.
[00438] Formulações compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, na Publicação dos E.U.A. No. 2010/0324120, depositada a 10 de junho, 2010, os conteúdos inteiros da qual são deste modo incorporados por referência.
[00439] Formulações compreendendo ALNY-100 são descritas, por exemplo, no Pedido de patente internacional número PCT/US09/63933, depositado a 10 de novembro, 2009, que é deste modo incorporado por referência.
[00440] Formulações compreendendo C12-200 são descritas no Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/175,770, depositado a 5 de maio, 2009, e Pedido Internacional No. PCT/US10/33777, depositado a 5 de maio, 2010, que são deste modo incorporados por referência.Síntese de lipídeos ionizáveis/catiônicos
[00441] Qualquer um dos compostos, por exemplo, lipídeos catiônicos e similares, usado nas partículas de ácido nucleico-lipídeo da invenção pode ser preparado por técnicas conhecidas de síntese orgânica, incluindo os métodos descritos em mais detalhe nos Exemplos. Todos os substituintes são como definidos em baixo a não ser que indicado de outro modo.
[00442] “Alquila” significa um hidrocarboneto alifático saturado, de cadeia linear ou ramificado, não cíclico ou cíclico contendo de 1 a 24 átomos de carbono. Alquilas saturadas de cadeia linear representativas incluem metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n-hexila, e afins; ao passo que alquilas saturadas ramificadas incluem isopropila, sec-butila, isobutila, tert-butila, isopentila, e afins. Alquilas cíclicas saturadas representativas incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, e similares; enquanto alquilas cíclicas insaturadas incluem ciclopentenila e ciclohexenila, e similares.
[00443] “Alquenila” significa uma alquila, como definido acima, contendo pelo menos uma ligação dupla entre átomos de carbono adjacentes. Alquenilas incluem isômeros cis e trans. Alquenilas representativas de cadeia linear e ramificadas incluem etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3-dimetil-2-butenila, e similares.
[00444] “Alquinila” significa qualquer alquila ou alquenila, como definido acima, que contém adicionalmente pelo menos uma ligação tripla entre carbonos adjacentes. Alquinilas representativas de cadeia linear e ramificadas incluem acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1 butinila, e similares.
[00445] “Acila” significa qualquer alquila, alquenila, ou alquinila em que o carbono no ponto de anexação está substituído por um grupo oxo, como definido em baixo. Por exemplo, -C(=O)alquila, -C(=O)alquenila, e -C(=O)alquinila são grupos acila.
[00446] “Heterociclo” significa um anel heterocíclico monocíclico de 5 até 7 membros, ou bicíclico de 7 até 10 membros, que é saturado, insaturado, ou aromático, e que contém desde 1 ou 2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre, e em que os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem estar opcionalmente oxidados, e o heteroátomo de nitrogênio pode estar opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos em que quaisquer dos heterociclos acima estão fundidos a um anel benzeno. O heterociclo pode estar ligado via qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Heterociclos incluem heteroarilas como definido em baixo. Heterociclos incluem morfolinila, pirrolidinonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamila, oxiranila, oxetanila, tetraidrofuranila, tetraidropiranila, tetraidropiridinila, tetraidroprimidinila, tetraidrotiofenila, tetraidrotiopiranila, tetraidropirimidinila, tetraidrotiofenila, tetraidrotiopiranila, e similares.
[00447] Os termos “alquila opcionalmente substituída”, “alquenila opcionalmente substituída”, “alquinila opcionalmente substituída”, “acila opcionalmente substituída”, e “heterociclo opcionalmente substituído” significam que, quando substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio está substituído por um substituinte. No caso de um substituinte oxo (=O), estão substituídos dois átomos de hidrogênio. A esse respeito, substituintes incluem oxo, halogênio, heterociclo, -CN, - ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, - C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy, em que n é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são iguais ou diferentes e são independentemente hidrogênio, alquila ou heterociclo, e cada um dos referidos substituintes de alquila e heterociclo pode estar adicionalmente substituído com um ou mais de oxo, halogênio, -OH, -CN, alquila, -ORx, heterociclo, -NRxRy, - NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, - SOnRx e -SOnNRxRy.
[00448] “Halogênio” significa flúor, cloro, bromo e iodo.
[00449] Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem requerer a utilização de grupos protetores. A metodologia de grupos protetores é bem conhecida daqueles peritos na técnica (ver, por exemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, Cidade de Nova Iorque, 1999). Brevemente, grupos protetores, dentro do contexto desta invenção, são qualquer grupo que reduza ou elimine a reatividade indesejada de um grupo funcional. Um grupo protetor pode ser adicionado a um grupo funcional para mascarar a sua reatividade durante certas reações e depois é removido para revelar o grupo funcional original. Em algumas modalidades é usado um “grupo protetor de álcool”. Um “grupo protetor de álcool” é qualquer grupo que diminua ou elimine a reatividade indesejada de um grupo funcional álcool. Grupos protetores podem ser adicionados e removidos usando técnicas bem conhecidas na técnica.Síntese da Fórmula A
[00450] Em algumas modalidades, partículas de ácido nucleico- lipídeo da invenção são formuladas usando um lipídeo catiônico de fórmula A:
[00451]
Figure img0015
Rl R2 onde R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, cada uma pode estar opcionalmente substituída, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é XTC (2,2-Dilinoleíl-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). Em geral, o lipídeo de fórmula A acima pode ser preparado pelos seguintes Esquemas Reacionais 1 ou 2, em que todos os substituintes são como definido acima a menos que indicado em contrário.Esquema 1
Figure img0016
[00452] O lipídeo A, em que R1 e R2 são independentemente alquila, alcenila ou alcinila, em que cada um pode estar opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila de cadeia curta ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, pode ser preparado de acordo com o Esquema 1. A cetona 1 e o brometo 2 podem ser comprados ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles com perícia ordinária na técnica. A reação de 1 e 2 origina o cetal 3. O tratamento do cetal 3 com a amina 4 origina lipídeos da fórmula A. Os lipídeos da fórmula A podem ser convertidos no correspondente sal de amônio com um sal orgânico da fórmula 5, onde X é um contraíon aniônico selecionado de halogênio, hidróxido, fosfato, sulfato, ou similares.Esquema 2
Figure img0017
[00453] Alternativamente, o material de início cetona 1 pode ser preparado de acordo com o Esquema 2. O reagente de Grignard 6 e o cianeto 7 podem ser comprados ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles com perícia ordinária na técnica. A reação de 6 e 7 origina a cetona 1. A conversão da cetona 1 nos correspondentes lipídeos de fórmula A é como descrito no Esquema 1.Síntese de MC3
[00454] A preparação de DLin-M-C3-DMA (isto é, 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila) foi realizada do modo seguinte. Uma solução de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g),hidrocloreto do ácido 4-N,N-dimetilaminobutírico (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61 g) e hidrocloreto de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,53 g) em diclorometano (5 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante uma noite. A solução foi lavada com ácido clorídrico diluído seguido de bicarbonato de sódio aquoso diluído. As frações orgânicas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro, filtradas e o solvente foi removido em um rotovap. O resíduo foi passado em uma coluna de sílica gel (20 g) usando um gradiente de eluição de metanol/diclorometano a 1-5 %. As frações contendo o produto purificado foram combinadas e o solvente removido, originando um óleo incolor (0,54 g). Síntese de ALNY-100A síntese do cetal 519 [ALNY-100] foi realizada usando o seguinte esquema 3:
Figure img0018
Síntese de 515
[00455] A uma suspensão agitada de LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) em 200 mL de THF anidro em um BFR de duas tubuladuras (1 L) foi adicionada uma solução de 514 (10 g, 0,04926 mol) em 70 mL de THF lentamente a 0 °C sob atmosfera de nitrogênio. Após adição completa, a mistura reacional foi aquecida até à temperatura ambiente e depois aquecida até ao refluxo durante 4 horas. A progressão da reação foi monitorada por TLC. Após completação da reação (por TLC), a mistura foi resfriada até 0 °C e extinta com adição cuidadosa de solução saturada de Na2SO4. A mistura reacional foi agitada durante 4 horas à temperatura ambiente e filtrada. O resíduo foi bem lavado com THF. O filtrado e as lavagens foram misturados e diluídos com 400 mL de dioxano e 26 mL de HCl conc. e agitados durante 20 minutos à temperatura ambiente. As volatilidades foram extraídas sob vácuo para originar o sal hidrocloreto de 515 como um sólido branco. Rendimento: 7,12 g 1H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ= 9,34 (largo, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H).Síntese de 516
[00456] A uma solução agitada do composto 515 em 100 mL de DCM seco em um BFR de duas tubuladuras de 250 mL foi adicionado NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) e resfriado até 0 °C sob atmosfera de nitrogênio. Após uma adição lenta de N-(benziloxi-carboniloxi)-succinimida (20 g, 0,08007 mol) em 50 mL de DCM seco, se permitiu que a mistura reacional aquecesse até à temperatura ambiente. Após completação da reação (2-3 h por TLC), a mistura foi lavada sucessivamente com solução de HCl a 1 N (1 x 100 mL) e solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL). A camada orgânica foi depois seca sobre Na2SO4 anid. e o solvente foi evaporado para dar material em bruto que foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para se obter 516 como massa pegajosa. Rendimento: 11 g (89 %). 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 7,36-7,27 (m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (la., 1H), 2,74 (s, 3H), 2.60 (m, 2H), 2,30-2,25 (m, 2H). LC-MS [M+H] -232,3 (96,94 %).Síntese de 517A e 517B
[00457] O ciclopenteno 516 (5 g, 0,02164 mol) foi dissolvido em uma solução de 220 mL de acetona e água (10:1) em um BFR de uma tubuladura de 500 mL e foi-lhe adicionado morfolina-N-óxido de N-metila (7,6 g, 0,06492 mol) seguido de 4,2 mL de solução de OsO4 a 7,6 % (0,275 g, 0,00108 mol) em tert-butanol à temperatura ambiente. Após completação da reação (~ 3 h), a mistura foi extinta com adição de Na2SO3 sólido e a mistura resultante foi agitada durante 1,5 h à temperatura ambiente. A mistura reacional foi diluída com DCM (300 mL) e lavada com água (2 x 100 mL) seguido de solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL), água (1 x 30 mL) e finalmente com salmoura (1x 50 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 an. e o solvente foi removido in vacuo. A purificação cromatográfica em coluna de sílica gel do material em bruto foi originada uma mistura de diastereômeros, que foram separados por HPLC prepa. Rendimento: - 6 g em bruto
[00458] 517A - Pico 1 (sólido branco), 5,13 g (96 %). 1H-NMR(DMSO, 400 MHz): δ= 7,39-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2H), 3,94-3,93 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 1,72-1,67 (m, 4H). LC-MS - [M+H]-266,3, [M+NH4+]-283,5 presente, HPLC-97,86 %. Estereoquímica confirmada por raios X.Síntese de 518
[00459] Usando um procedimento análogo àquele descrito para a síntese do composto 505, o composto 518 (1,2 g, 41 %) foi obtido como um óleo incolor. 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ= 7,35-7,33 (m, 4H), 7,307,27 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 8H), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m,7H), 2,06-2,00 (m, 8H), 1,96-1,91 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (m la, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65 %.Procedimento Geral para a Síntese do Composto 519
[00460] Uma solução do composto 518 (1 eq) em hexano (15 mL) foi adicionada de um modo gota a gota a uma solução gelada de LAH em THF (1 M, 2 eq). Após adição completa, a mistura foi aquecida a 40 °C ao longo de 0,5 h, depois resfriada novamente em um banho de gelo. A mistura foi cuidadosamente hidrolisada com Na2SO4 aquoso saturado, depois filtrada através de celite e reduzida a um óleo. A cromatografia em coluna proporcionou o 519 puro (1,3 g, 68 %) que foi obtido como um óleo incolor. 13C NMR δ = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 2,6, 14,1; Eletropulverização MS (+ve): Pesomolecular para C44H80NO2 (M + H)+ Calc. 654,6, Experimental 654,6.
[00461] As formulações preparadas pelo método padrão ou isento de extrusão podem ser caracterizadas de modos similares. Por exemplo, as formulações são tipicamente caracterizadas por inspeção visual. Devem ser soluções translúcidas esbranquiçadas isentas de agregados ou sedimento. O tamanho das partículas e a distribuição do tamanho das partículas de nanopartículas de lipídeo podem ser medidos por dispersão de luz usando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). As partículas devem ter um tamanho de cerca de 20300 nm, tal como 40-100 nm. A distribuição do tamanho das partículas deve ser unimodal. A concentração total de dsRNA na formulação, bem como a fração aprisionada, é estimada usando um ensaio de exclusão de corante. Uma amostra do dsRNA formulado pode ser incubada com um corante de ligação a RNA, tal como Ribogreen (Molecular Probes), na presença ou ausência de um tensioativo desagregador da formulação, por exemplo, Triton-X100 a 0,5 %. O dsRNA total presente na formulação pode ser determinado pelo sinal da amostra contendo o tensioativo, em relação a uma curva padrão. A fração aprisionada é determinada por subtração do conteúdo de dsRNA “livre” (como medido pelo sinal na ausência de tensioativo) do conteúdo de dsRNA total. A percentagem de dsRNA aprisionado é tipicamente >85 %. Paraformulação de LNP, o tamanho das partículas é pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 110 nm, e pelo menos 120 nm. A gama adequado é tipicamente cerca de pelo menos 50 nm a cerca de pelo menos 110 nm, cerca de pelo menos 60 nm a cerca de pelo menos 100 nm, ou cerca de pelo menos 80 nm a cerca de pelo menos 90 nm.
[00462] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou minicomprimidos. Podem ser desejáveis espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes. Em algumas modalidades, formulações orais são aquelas nas quais dsRNAs apresentados na invenção são administrados em conjunção com um ou mais surfactantes intensificadores da penetração e queladores. Tensioativos adequados incluem ácidos graxos e/ou seus ésteres ou sais, ácidos biliares e/ou seus sais. Ácidos biliares/sais adequados incluem ácido quenodeoxicólico (CDCA) e ácido ursodeoxiquenodeoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido deoxicólico, ácido glucocólico, ácido glicocólico, ácido glicodeoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodeoxicólico, tauro-24,25- diidro-fusidato de sódio e glicodihidrofusidato de sódio. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades são usadas combinações de intensificadores da penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação exemplar é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Intensificadores da penetração adicionais incluem éter de polioxietileno-9- laurila, éter de polioxietileno-20-cetila. DsRNAs apresentados na invenção podem ser administrados oralmente, em forma granular incluindo partículas secas pulverizadas, ou complexados para formarem micro ou nanopartículas. Agentes de complexação de dsRNA incluem poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas com DEAE, pululanas, celuloses e amidos. Agentes de complexação adequados incluem quitosana, N- trimetilquitosana, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE- acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrana, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato, e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhe na Patente dos E.U.A. 6,887,906, PubIn dos EUA No. 20030027780, e Patente dos E.U.A. No. 6,747,014, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.
[00463] Composições e formulações para administração parentérica, intraparênquima (no interior do cérebro), intratecal, intraventricular ou intrahepática podem incluir soluções aquosas esterilizadas que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como mas não se limitando a intensificadores da penetração, compostos carreadores e outros veículos ou excipientes farmacêuticamente aceitáveis.
[00464] As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a soluções, emulsões, e formulações contendo lipossomos. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem mas não estão limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes. São particularmente preferidas formulações que têm como alvo o fígado ao tratar distúrbios hepáticos, como carcinoma hepático.
[00465] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas em forma galênica unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem o passo de colocar em associação os ingredientes ativos com o(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas por colocação em associação uniforme e íntima dos ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldagem do produto.
[00466] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma de muitas formas galênicas possíveis, tais como mas não se limitando a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios, e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem adicionalmente conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão também pode conter estabilizadores.C. Formulações Adicionais
i. Emulsões
[00467] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido disperso em outro na forma de gotículas com um diâmetro usualmente excedendo 0,1 μm (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, MarcelDekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., Volume 1, p. 245; Block em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 2, p. 335; Higuchi et al., em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, emulsões podem ser da variedade água-em-óleo (w/o) ou óleo-em-água (o/w). Quando uma fase aquosa é finamente dividida e dispersa como gotículas mínimas em uma fase oleosa volumosa, a composição resultante é chamada uma emulsão água-em-óleo (w/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é finamente dividida e dispersa como gotículas mínimas em uma fase aquosa volumosa, a composição resultante é chamada uma emulsão óleo-em-água (o/w). As emulsões podem conter componentes adicionais adicionalmente às fases dispersas, e o fármaco ativo, que pode estar presente como uma solução em qualquer uma das fase aquosa, fase oleosa ou o próprio como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos, como emulsificantes, estabilizadores, corantes, e antioxidantes, também podem estar presentes em emulsões, consoante o necessário. Emulsões farmacêuticas também podem ser emulsões múltiplas que são compreendidas de mais de duas fases, tais como, por exemplo, no caso de emulsões óleo-em-água-em-óleo (o/w/o) e água- em-óleo-em-água (w/o/w). Tais formulações complexas proporcionam frequentemente certas vantagens que emulsões binárias simples não apresentam. Emulsões múltiplas nas quais gotículas de óleo individuais de uma emulsão o/w encerram pequenas gotículas de água constituem uma emulsão w/o/w. Do mesmo modo, um sistema de gotículas de óleo encerradas em glóbulos de água estabilizados em uma fase oleosa contínua proporciona uma emulsão o/w/o.
[00468] As emulsões são caracterizadas por estabilidade termodinâmica pequena ou nula. Frequentemente, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida em esta forma através dos meios de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como no caso de bases e cremes de unguentos do estilo emulsão. Outros meios de estabilizar emulsões implicam a utilização de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer uma das fases da emulsão. Os emulsificantes podem ser amplamente classificados em quatro categorias: tensioativos sintéticos, emulsificantes ocorrendo naturalmente, bases de absorção, e sólidos finamente dispersos (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199).
[00469] Os tensioativos, também conhecidos como agentes com superfície ativa, sintéticos têm encontrado ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revistos na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, volume 1, p. 199). Os tensioativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e uma hidrofóbica. A razão da natureza hidrofílica em relação à hidrofóbica do tensioativo foi denominada equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa na categorização e seleção de tensioativos na preparação de formulações. Os tensioativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI, Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 285).
[00470] Os emulsificantes ocorrendo naturalmente usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelhas, fosfatídeos, lecitina e acácia. As bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas tal que possam embeber água para formar emulsões w/o retendo no entanto suas consistências semissólidas, tais como lanolina anidra e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos têm também sido usados como bons emulsificantes, especialmente em combinação com tensioativos e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansíveis tais como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares tais como carbono ou triestearato de glicerila.
[00471] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes está também incluída em formulações de emulsão e contribui para as propriedades de emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, MarcelDekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p.199).
[00472] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas ocorrendo naturalmente e polímeros sintéticos tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenano, goma de guar, goma Karaya, e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose), e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivinila). Estes se dispersam ou dilatam em água par formar soluções coloidais que estabilizam emulsões por formação de filmes interfaciais fortes em redor das gotículas da fase dispersa e por aumento da viscosidade da fase externa.
[00473] Uma vez que emulsões contêm muitas vezes alguns ingredientes, tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos, que podem facilmente suportar o crescimento de micróbios, é frequente estas formulações incorporarem conservantes. Conservantes comummente usados incluídos em formulações de emulsão incluem parabeno de metila, parabeno de propila, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres do ácido p-hidroxibenzoico, e ácido bórico. Antioxidantes são também comummente adicionados a formulações de emulsão para prevenir deterioração da formulação. Os antioxidantes usados podem ser agentes de remoção de radicais livres, tais como tocoferóis, galatos de alquila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores, tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e agentes sinérgicos antioxidantes, como ácido cítrico, ácido tartárico, e lecitina.
[00474] A aplicação de formulações de emulsão através de rotas dermatológicas, orais e parenterais e métodos para sua preparação foram revistos na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Edits.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199). Formulações de emulsão para distribuição oral têm sido muito amplamente usadas devido à facilidade de formulação, bem como eficácia do ponto de vista da absorção e biodisponibilidade (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, MarcelDekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199). Laxantes à base de óleos minerais, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com elevado conteúdo de gordura estão entre os materiais que têm sido comummente administrados oralmente como emulsões o/w.
ii. Microemulsões
[00475] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de RNAis e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifílico que é uma solução líquida única opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245). Tipicamente, as microemulsões são sistemas que são preparados primeiramente por dispersão de um óleo em uma solução aquosa de tensioativo e depois adição de uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool com comprimento intermédio da cadeia, para formar um sistema transparente. Portanto, asmicroemulsões têm sido também descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente límpidas de dois líquidos imiscíveis que são estabilizadas por filmes interfaciais de moléculas com superfície ativa (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nova Iorque, páginas 185-215). As microemulsões são comummente preparadas através de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensioativo, cotensioativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água-em-óleo (w/o) ou óleo-em- água (o/w) está dependente das propriedades do óleo e tensioativo usados e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidrocarbonetos das moléculas de tensioativo (Schott, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
[00476] A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase tem sido extensamente estudada e originou um conhecimento abrangente, para um perito na técnica, de como formular microemulsões (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 335). Em comparação com emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilização de fármacos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que se formam espontaneamente.
[00477] Os tensioativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não estão limitados a, tensioativos iônicos, tensioativos não iônicos, Brij 96, éteres de oleíla e polioxietileno, ésteres de ácidos graxos e poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), sozinhos ou em combinação com cotensioativos. O cotensioativo, usualmente um álcool de cadeia curta tal como etanol, 1-propanol, e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial por penetração no filme de tensioativo e consequentemente criação de um filme desordenado devido ao espaço vazio gerado entre moléculas de tensioativo. No entanto, microemulsões podem ser preparadas sem a utilização de cossurfactantes, e sistemas de microemulsão autoemulsificantes desprovidos de álcool são conhecidos na área. A fase aquosa pode tipicamente ser, mas não está limitada a água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase oleosa pode incluir, mas não está limitada a materiais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di, e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácidos graxos e glicerila polietoxilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolizados, C8-C10 glicerídeos saturados poliglicolizados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00478] As microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista da solubilização de fármacos e da absorção intensificada de fármacos. Microemulsões à base de lipídeos (o/w e w/o) têm sido propostas para intensificar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (ver, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al.,Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam vantagens de solubilização melhorada de fármacos, proteção de fármacos da hidrólise enzimática, possível intensificação da absorção de fármacos devido a alterações, induzidas por tensioativos, da fluidez e permeabilidade membranares, facilidade de preparação, facilidade de administração oral em relação a formas de dosagem sólidas, potência clínica melhorada, e toxicidade diminuída (ver, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099;Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Muitas vezes, microemulsões podem se formar espontaneamente quando seus componentes são reunidos à temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso na formulação de fármacos termicamente instáveis, peptídeos ou RNAis. As microemulsões têm sido também eficazes na distribuição transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. É esperado que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitarão a absorção sistêmica aumentada de RNAis e ácidos nucleicos a partir do trato gastrointestinal, bem como melhorem a captação celular local de RNAis e ácidos nucleicos.
[00479] Microemulsões da presente invenção também podem conter componentes e aditivos suplementares, como monoestearato de sorbitana (Grill 3), Labrasol, e intensificadores da penetração para melhorar as propriedades da formulação e intensificar a absorção dos RNAis e ácidos nucleicos da presente invenção. Os intensificadores da penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco amplas categorias - tensioativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensioativos não quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uma destas classes foidiscutida acima.
iii. Micropartículas
[00480] Um agente de RNAi da invenção pode ser incorporado em uma partícula, por exemplo, uma micropartícula. Micropartículas podem ser produzidas mediante secagem por pulverização, mas também podem ser produzidas por outros métodos, incluindo liofilização, evaporação, secagem em leito fluidizado, secagem por vácuo, ou uma combinação dessas técnicas.
iv. Intensificadores da Penetração
[00481] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários intensificadores da penetração para efetuar a distribuição eficaz de ácidos nucleicos, particularmente RNAis, à pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução em ambas as formas ionizada e não ionizada. No entanto, usualmente apenas fármacos solúveis em lipídeos ou lipofílicos atravessam prontamente membranas celulares. Foi descoberto que mesmo fármacos não lipofílicos conseguem atravessar membranas celulares se a membrana a ser atravessada for tratada com um intensificador da penetração. Adicionalmente a auxiliarem a difusão de fármacos não lipofílicos através de membranas celulares, os intensificadores da penetração intensificam também a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00482] Os intensificadores da penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco amplas categorias, i.e., tensioativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensioativos não quelantes (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada uma das classes acima mencionadas de intensificadores da penetração é descrita em baixo em mais detalhe.
[00483] Surfactantes (ou "agentes com atividade de superfície") são entidades químicas que, quando dissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado de a absorção de RNAis através da mucosa ser intensificada. Adicionalmente a sais biliares e ácidos graxos, estes intensificadores da penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurila e éter de polioxietileno-20-cetila (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); e emulsões perfluoroquímicas, tais como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[00484] Vários ácidos graxos e seus derivados que atuam como intensificadores da penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoíl-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, 1-monocaprato de glicerol, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, seus ésteres de alquila C1-20 (por exemplo, metila, isopropila e t-butila), e seus mono- e di-glicerídeos (i.e., oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (ver, por exemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[00485] O papel fisiológico da bílis inclui a facilitação da dispersão e absorção de lipídeos e vitaminas solúveis em gordura (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1996, pp. 934-935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como intensificadores da penetração. Assim, o termo "sais biliares" inclui qualquer um dos componentes ocorrendo naturalmente da bílis bem como qualquer um de seus derivados sintéticos. Sais biliares adequados incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucocólico (glucocolato de sódio), ácido glicocólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodeso- xicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurode- soxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido quenodesoxicólico (queno- desoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-diidro- fusidato de sódio (STDHF), glicodiidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9-laurila (POE) (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Swinyard, Capítulo 39 Em: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[00486] Agentes quelantes, como usado em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução por formação de complexos com eles, com o resultado de a absorção de RNAis através da mucosa ser intensificada. No que respeito ao seu uso como intensificadores da penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicional de também servirem como inibidores de DNase, pois a maioria das DNA nucleases caracterizadas requer um íon metálico divalente para catálise e é assim inibida por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes adequados incluem mas não estão limitados a etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato), derivados de N-acila de colagênio, derivados de lauret- 9 e N-amino acila de beta-dicetonas (enaminas) (ver, por exemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical,biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00487] Como usado aqui, compostos intensificadores da penetração não tensioativos não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensioativos mas que ainda assim intensificam a absorção de RNAis através da mucosa alimentar (ver, por exemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de intensificadores da penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- e 1-alquenilazaciclo- alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroides tais como diclofenac sódio, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00488] Agentes que aumentam a captação de RNAis ao nível celular também podem ser adicionados à composição farmacêutica e outras composições da presente invenção. Por exemplo se sabe também que lipídeos catiônicos, tais como lipofectina (Junichi et al., Patente dos E.U.A. No. 5,705,188), derivados catiônicos de glicerol, e moléculas policatiônicas, tais como polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731), intensificam a captação celular de dsRNAs. Exemplos de reagentes de transfecção comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStile™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Reagente de Transfecção X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente de Transfecção Lipossômica DOTAP (Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente de Transfecção Lipossômica DOSPER (Grenzacherstrasse, Suíça), ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente Transfectam® (Promega; Madison, WI), Reagente de Transfecção TransFast™ (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marselha, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marselha, França), Reagente de Transfecção TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EUA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção PerFectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), reagente de Transfecção GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), reagente de Transfecção GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção Cytofectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de transfecção TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EUA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA), SureFECTOR (B- Bridge International; Mountain View, CA, EUA), ou HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EUA), entre outros.
[00489] Podem ser utilizados outros agentes para intensificar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis, como etileno glicol e propileno glicol, pirróis, como 2-pirrol, azonas, e terpenos, como limoneno e mentona.
v. Carreadores
[00490] Certas composições da presente invenção incorporam também compostos carreadores na formulação. Como usado aqui, "composto carreador" ou "carreador" pode se referir a um ácido nucleico, ou seu análogo, que é inerte (i.e., não possui atividade biológica per se) mas que é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo atividade biológica por, por exemplo, degradação do ácido nucleico biologicamente ativo ou promoção da sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto carreador, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido a competição entre o composto carreador e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente de fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando é coadministrado com ácido poliinosínico, sulfato de dextrana, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'-isotiociano- estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183). vi. Excipientes
[00491] Em contraste com um composto carreador, um “veículo farmacêutico” ou “excipiente” é um solvente, agente de suspensão farmaceuticamente aceitável ou qualquer outro veículo farmacologi- camente inerte para distribuição de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, tendo em mente o modo de administração planejado, de modo a proporcionar o volume, consistência, etc., desejados quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Veículos farmacêuticos típicos incluem, mas não estão limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou metilcelulose de hidroxipropila, etc.); enchimentos (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, celulose de etila, poliacrilatos ou hidrogeno- fosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicolato de amido sódico, etc.); e agentes molhantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.).
[00492] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos podem ser também usados para formular as composições da presente invenção. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, água, soluções salinas, álcoois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
[00493] Formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas esterilizadas ou não esterilizadas, soluções não aquosas em solventes comuns, como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases oleosas líquidas ou sólidas. As soluções também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Podem ser usados excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuti- camente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos.
[00494] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem mas, não estão limitados a, água, soluções salinas, álcool, polietileno gli- cóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silício- co, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
vii. Outros Componentes
[00495] As composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes adjuntos convencionalmente presentes em composições farmacêuticas, a seus níveis de utilização estabelecidos na área. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais, compatíveis e farmaceuticamente ativos, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas galênicas das composições da presente invenção, como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizadores. No entanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsificantes, sais para influência da pressão osmótica, tampões, substâncias corantes, aromatizantes e/ou aromáticas e similares que não interajam prejudicialmente com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00496] Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão também pode conter estabilizadores.
[00497] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem (a) um ou mais compostos de RNAi e (b) um ou mais agentes que funcionam por um mecanismo não de RNAi e que são úteis no tratamento de um distúrbio de sangramento. Exemplos de tais agentes incluem mas não estão limitados a um agente anti-inflamatório, agente antiesteatose, agente antiviral, e/ou antifibrose. Adicionalmente, outras substâncias comummente usadas para proteger o fígado, tais como silimarina, podem ser também usadas em conjunto com os RNAis descritos aqui. Outros agentes úteis para tratamento de doenças do fígado incluem telbivudina, entecavir, e inibidores de proteases tais como telaprevir, e outros divulgados, por exemplo, em Tung et al., Publicações de Pedidos dos E.U.A. Nos. 2005/0148548, 2004/0167116, e 2003/0144217; e em Hale et al., Publicação de Pedido dos E.U.A. No. 2004/0127488.
[00498] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD50 (a dose letal para 50 % da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. São preferidos compostos que exibem altos índices terapêuticos.
[00499] Os dados obtidos de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens para uso em humanos. A dosagem de composições apresentadas aqui na invenção está geralmente dentro de uma gama de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama, dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para se alcançar uma gama de concentrações no plasma em circulação do composto ou, quando apropriado, do produto de polipeptídeo de uma sequência alvo (por exemplo, alcance de uma concentração diminuída do polipeptídeo) que inclui a IC50 (i.e., a concentração do composto de teste que alcança uma inibição semimáxima de sintomas) como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteis em humanos. Níveis no plasma podem ser mensurados, por exemplo, mediante cromatografia líquida de alto desempenho.
[00500] Adicionalmente à sua administração, como discutido acima, os RNAis apresentados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados por expressão de PCSK9. Em qualquer caso, o médico administrador pode ajustar a quantidade e calendarização da administração de RNAi com base em resultados observados usando medições de eficácia padrão conhecidas na técnica ou descritas aqui.IV. Métodos para Inibição da Expressão de PCSK9
[00501] A presente invenção proporciona métodos de inibição da expressão de uma Pró-proteína Convertase Subtilisina Quexina 9 (PCSK9) em uma célula. Os métodos incluem contato de uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de fita dupla, em uma quantidade eficaz para inibir a expressão da PCSK9 na célula, inibindo deste modo a expressão da PCSK9 na célula.
[00502] O contato de uma célula com um agente de RNAi de fita dupla pode ser feito in vitro ou in vivo. O contato de uma célula in vivo com o agente de RNAi inclui contato de uma célula ou grupo de células dentro de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, com o agente de RNAi. Combinações de métodos de contato in vitro e in vivo são também possíveis. O contato pode ser direto ou indireto, como discutido acima. Além do mais, o contato de uma célula pode ser alcançado através de um ligante de direcionamento, incluindo qualquer ligante descrito aqui ou conhecido na técnica. Em modalidades, o ligante de direcionamento é uma fração carboidrato, por exemplo, um ligante de GalNAc, ou qualquer outro ligante que dirige o agente de RNAi a um local de interesse, por exemplo, o fígado de um indivíduo.
[00503] O termo "inibição", como usado aqui, é usado indistintamente com "redução", "silenciamento", "infrarregulação" e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição.
[00504] A frase "inibição da expressão de uma PCSK9" se destina a se referir a inibição da expressão de qualquer gene de PCSK9 (tal como, por exemplo, um gene de PCSK9 de camundongo, um gene de PCSK9 de rato, um gene de PCSK9 de macaco, ou um gene de PCSK9 de humano) bem como variantes ou mutantes de um gene de PCSK9. Assim, o gene de PCSK9 pode ser um gene de PCSK9 de tipo selvagem, um gene de PCSK9 mutante, ou um gene de PCSK9 transgênico no contexto de uma célula, grupo de células, ou organismo geneticamente manipulado.
[00505] "Inibição da expressão de um gene de PCSK9" inclui qualquer nível de inibição de um gene de PCSK9, por exemplo, supressão pelo menos parcial da expressão de um gene de PCSK9. A expressão do gene de PCSK9 pode ser avaliada com base no nível, ou na mudança no nível, de qualquer variável associada à expressão do gene de PCSK9, por exemplo, nível de RNAm de PCSK9, nível de proteína PCSK9, ou níveis de lipídeos. Este nível pode ser avaliado em uma célula individual ou em um grupo de células, incluindo, por exemplo, uma amostra derivada de um indivíduo.
[00506] A inibição pode ser avaliada por uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais variáveis que estão associadas à expressão de PCSK9 em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que seja utilizado na técnica, por exemplo, um nível de linha de base pré-dose, ou um nível determinado a partir de um indivíduo, célula, ou amostra similar que não é tratado ou tratado com um controle (tal como, por exemplo, controle só com tampão ou controle com agente inativo).
[00507] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a expressão de um gene de PCSK9 é inibida por pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 %.
[00508] A inibição da expressão de um gene de PCSK9 pode ser manifestada por uma redução da quantidade de RNAm expressa por uma primeira célula ou grupo de células (tais células podem estar presentes, por exemplo, em uma amostra derivada de um indivíduo) no qual um gene de PCSK9 é transcrito e que foi ou foram tratado(s) (por exemplo, por contato da célula ou células com um agente de RNAi da invenção, ou por administração de um agente de RNAi da invenção a um indivíduo no qual as células estão ou estiveram presentes) tal que a expressão de um gene de PCSK9 seja inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células mas que não foi ou foram assim tratado(s) (célula(s) de controle). Em modalidades, a inibição é avaliada por expressão do nível de RNAm em células tratadas como uma percentagem do nível de RNAm em células de controle, usando a seguinte fórmula:
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[00509] Alternativamente, a inibição da expressão de um gene de PCSK9 pode ser avaliada em termos de uma redução de um parâmetro que está funcionalmente ligado à expressão do gene de PCSK9, por exemplo, expressão da proteína PCSK9, tal como níveis de lipídeos, níveis de colesterol, por exemplo, níveis de LDLc. O silenciamento do gene de PCSK9 pode ser determinado em qualquer célula expressando PCSK9, ou constitutivamente ou por manipulação genômica, e por qualquer ensaio conhecido na técnica. O fígado é o maior local da expressão de PCSK9. Outros locais de expressão significativos incluem o pâncreas, rim, e intestinos.
[00510] A inibição da expressão de uma proteína PCSK9 pode ser manifestada por uma redução no nível da proteína PCSK9 que é expressa por uma célula ou grupo de células (por exemplo, no nível de proteína expressa em uma amostra derivada de um indivíduo). Como explicado acima para a avaliação da supressão de RNAm, a inibição dos níveis de expressão de proteína em uma célula ou grupo de células não tratado pode ser similarmente expressa como uma percentagem do nível de proteína em uma célula ou grupo de células de controle.
[00511] Uma célula ou grupo de células de controle que pode ser usado para avaliar a inibição da expressão de um gene de PCSK9 inclui uma célula ou grupo de células que não foi ainda contatado com um agente de RNAi da invenção. Por exemplo, a célula ou grupo de células de controle pode ser derivado de um indivíduo individual (por exemplo, um indivíduo humano ou animal) antes do tratamento do indivíduo com um agente de RNAi.
[00512] O nível de RNAm de PCSK9 que é expresso por uma célula ou grupo de células pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para avaliação da expressão de RNAm. Em uma modalidade, o nível de expressão de PCSK9 em uma amostra é determinado por detecção de um polinucleotídeo transcrito, ou sua porção, RNAm do gene de PCSK9. O RNA pode ser extraído de células usando técnicas de extração de RNA incluindo, por exemplo, uso de extração com fenol ácido/isotiocianato de guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparação de RNA RNeasy (Qiagen) ou PAXgene (PreAnalytix, Suíça). Formatos de ensaio típicos utilizando hibridação de ácido ribonucleico incluem ensaios de operação nucleares, RT-PCR, ensaios de proteção RNase (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), transferência de Northern, hibridação in situ, e análise por microrrede.
[00513] Em uma modalidade, o nível de expressão de PCSK9 é determinado usando uma sonda de ácido nucleico. O termo "sonda", como usado aqui, se refere a qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a uma PCSK9 específica. As sondas podem ser sintetizadas por um com perícia na técnica, ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. As sondas podem ser especificamente desenhadas para serem marcadas. Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, mas não estão limitados a, RNA, DNA, proteínas, anticorpos, e moléculas orgânicas.
[00514] RNAm isolado pode ser usado em ensaios de hibridação ou amplificação que incluem, mas não estão limitados a, análises de Southern ou Northern, análises por reação em cadeia da polimerase (PCR) e redes de sonda. Um método para a determinação de níveis de RNAm envolve contato do RNAm isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridar com RNAm de PCSK9. Em uma modalidade, o RNAm é imobilizado em uma superfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo por uso do RNAm isolado em um gel de agarose e transferência do RNAm do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. Em uma modalidade, a(s) sonda(s) são imobilizadas em uma superfície sólida e o RNAm é contatado com a(s) sonda(s), por exemplo, em uma rede de chip de genes Affymetrix. Um especialista perito consegue prontamente adaptar métodos de detecção de RNAm conhecidos para uso na determinação do nível de RNAm de PCSK9.
[00515] Um método alternativo para determinação do nível deexpressão de PCSK9 em uma amostra envolve o processo de amplificação de ácido nucleico e/ou transcriptase reversa (para preparar cDNA) de por exemplo RNAm na amostra, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental apresentada em Mullis, 1987, Pat. dos E.U.A. No. 4,683,202), e reação em cadeia da ligase (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicação de sequência autossustentada (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), replicação com círculo rolante (Lizardi et al., Pat. dos E.U.A. No. 5,854,033) ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucleicos, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conhecidas daqueles com perícia na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estiverem presentes em números muito baixos. Em aspectos particulares da invenção, o nível de expressão de PCSK9 é determinado por RT-PCR fluorogênica quantitativa (i.e., o Sistema TaqManTM).
[00516] Os níveis de expressão de RNAm de PCSK9 podem ser monitorizados usando uma transferência de membrana (tal como usada em análise de hibridação tal como Northern, Southern, dot, e similares), ou micropoços, tubos de amostra, géis, esférulas ou fibras (ou qualquer suporte sólido compreendendo ácidos nucleicos ligados). Ver Pat. dos E.U.A. Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 e 5,445,934, que são incorporadas aqui por referência. A determinação do nível de expressão de PCSK9 pode também compreender uso de sondas de ácido nucleico em solução.
[00517] Em modalidades preferenciais, o nível de expressão de RNAm é avaliado usando ensaios de DNA ramificado (bDNA) ou PCR em tempo real (qPCR). O uso destes métodos é descrito e exemplificado nos Exemplos apresentados aqui.
[00518] O nível de expressão da proteína PCSK9 pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para a medição de níveis de proteína. Tais métodos incluem, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), cromatografia em camada delgada (TLC), cromatografia por hiperdifusão, reações de precipitina de fluido ou gel, espectroscopia por absorção, um ensaio colorimétrico, ensaios espectrofotométricos, citometria de fluxo, imunodifusão (única ou dupla), imunoeletroforese, transferência de Western, radioimunoensaio (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imunofluorescentes, ensaios eletroquimioluminescentes, e similares.
[00519] O termo "amostra" como usado aqui se refere a uma coleção de fluidos, células, ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células, ou tecidos presentes dentro de um indivíduo. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, linfa, urina, fluido cerebroespinhal, saliva, fluidos oculares, e similares. Amostras teciduais podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, amostras podem ser derivadas de órgãos particulares, partes de órgãos, ou fluidos ou células no interior desses órgãos. Em certas modalidades, amostras podem ser derivadas do fígado (por exemplo, fígado inteiro ou certos segmentos do fígado ou certos tipos de células no fígado, tais como, por exemplo, hepatócitos). Em modalidades preferenciais, uma "amostra derivada de um indivíduo" se refere a sangue ou plasma retirado do indivíduo. Em modalidades adicionais, uma "amostra derivada de um indivíduo" se refere a tecido do fígado derivado do indivíduo.
[00520] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o agente de RNAi é administrado a um indivíduo tal que o agente de RNAi seja distribuído a um local específico dentro do indivíduo. A inibição da expressão de PCSL9 pode ser avaliada usando medições do nível ou mudança no nível de RNAm de PCSK9 ou proteína PCSK9 em uma amostra derivada de fluido ou tecido do local específico dentro do indivíduo. Em modalidades preferenciais, o local é o fígado. O local pode ser também uma subseção ou subgrupo de células de qualquer um dos locais acima mencionados. O local pode também incluir células que expressam um tipo particular de receptor.
V. Métodos para Tratamento ou Prevenção de uma Doença Associada a PCSK9.
[00521] A presente invenção proporciona também métodos para tratamento ou prevenção de doenças e condições que podem ser moduladas por infrarregulação da expressão do gene de PCSK9. Por exemplo, as composições descritas aqui podem ser usadas para tratar lipidemia, por exemplo, uma hiperlipidemia e outras formas de desequilíbrio de lipídeos tais como hipercolesterolemia, hipertriglice- ridemia e as condições patológicas associadas a estes distúrbios tais como doenças do coração e circulatórias. Outras doenças e condições que podem ser moduladas por infrarregulação da expressão do gene de PCSK9 incluem doenças de armazenamento lisossomal incluindo, mas não limitadas a, doença de Niemann-Pick, doença de Tay-Sachs, Deficiência de lipase ácida lisossomal, e Doença de Gaucher. Os métodos incluem administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz de um agente de RNAi da invenção. Em algumas modalidades, o método inclui administração de uma quantidade eficaz de um siRNA de PCSK9 a um paciente tendo um genótipo de LDLR heterozigoto.
[00522] O efeito do gene de PCSK9 diminuído resulta preferencialmente em uma diminuição nos níveis de LDLc (colesterol de lipoproteína de baixa densidade) no sangue, e mais particularmente no soro, do mamífero. Em algumas modalidades, os níveis de LDLs são diminuídos por pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais, em comparação com níveis pré- tratamento.
[00523] Como usado aqui, um "indivíduo" inclui um humano ou animal não humano, preferencialmente um vertebrado, e mais preferencialmente um mamífero. Um indivíduo pode incluir um organismo transgênico. O mais preferencialmente, o indivíduo é um humano, tal como um humano sofrendo de ou predisposto a desenvolver uma doença associada a PCSK9.
[00524] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a expressão de PCSK9 é diminuída durante uma duração prolongada, por exemplo, pelo menos uma semana, duas semanas, três semanas, ou quatro semanas ou mais tempo. Por exemplo, em certos casos, a expressão do gene de PCSK9 é suprimida por pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, ou 50 % por administração de um agente de RNAi descrito aqui. Em algumas modalidades, o gene de PCSK9 é suprimido por pelo menos cerca de 60 %, 70 %, ou 80 % por administração de um agente de RNAi. Em algumas modalidades, o gene de PCSK9 é suprimido por pelo menos cerca de 85 %, 90 %, ou 95 % por administração do oligonucleotídeo de fita dupla.
[00525] Os agentes de RNAi da invenção podem ser administrados a um indivíduo usando qualquer modo de administração conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraocular, intrabronquial, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial, linfática, cerebrospinal, e quaisquer suas combinações. Em modalidades preferenciais, os agentes são administrados subcutaneamente.
[00526] Em algumas modalidades, a administração é efetuada via uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o agente de RNAi de uma maneira consistente ao longo de um período de tempo prolongado. Assim, uma injeção de depósito pode reduzir a frequência de dosagem necessária para se obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de PCSK9, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção de depósito também pode proporcionar concentrações no soro mais consistentes. Injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferidas, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.
[00527] Em algumas modalidades, a administração é efetuada via uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba cirurgicamente implantada. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica implantada subcutaneamente. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosa, subcutânea, arterial, ou epidural. Em modalidades preferidas, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba cirurgicamente implantada que distribui o agente de RNAi no fígado.
[00528] Outros modos de administração incluem epidural, intracerebral, intracerebroventricular, administração nasal, intra-arterial, intracardíaca, infusão intraóssea, intratecal, e intravítrea, e pulmonar. O modo de administração pode ser escolhido com base em ser desejado um tratamento local ou sistêmico e com base na área a ser tratada. A via e sítio de administração podem ser escolhidos para aumentar o direcionamento para o alvo.
[00529] O método inclui administração de um agente de RNAi, por exemplo, uma dose suficiente para diminuir os níveis de RNAm de PCSK9 durante pelo menos 5, mais preferencialmente 7, 10, 14, 21, 25, 30 ou 40 dias; e, opcionalmente, administração de uma segunda dose única de dsRNA, em que a segunda dose única é administrada pelo menos 5, mais preferencialmente 7, 10, 14, 21, 25, 30 ou 40 dias após a primeira dose única ter sido administrada, inibindo deste modo a expressão do gene de PCSK9 em um indivíduo.
[00530] Em uma modalidade, as doses do agente de RNAi da invenção são administradas não mais do que uma vez a cada quatro semanas, não mais do que uma vez a cada três semanas, não mais do que uma vez a cada duas semanas, ou não mais do que uma vez a cada semana. Em outra modalidade, as administrações podem ser mantidas durante um, dois, três, ou seis meses, ou um ano ou mais.
[00531] Em outra modalidade, a administração pode ser proporcionada quando os níveis de colesterol de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLc) alcançam ou ultrapassam um nível mínimo pré- determinado, tal como mais do que 70 mg/dL, 130 mg/dL, 150 mg/dL, 200 mg/dL, 300 mg/dL, ou 400 mg/dL.
[00532] Em geral, o agente de RNAi não ativa o sistema imune, por exemplo, não aumenta os níveis de citocina, tais como os níveis de TNF-alfa ou IFN-alfa. Por exemplo, quando medidos por um ensaio, tal como um ensaio de PBMC in vitro, tal como descrito aqui, o aumento nos níveis de TNF-alfa ou IFN-alfa é menos do que 30 %, 20 %, ou 10 % de células de controle tratadas com um dsRNA de controle, tal como um dsRNA que não se dirige a PCSK9.
[00533] Por exemplo, a um indivíduo pode ser administrada uma quantidade terapêutica de um agente de RNAi, tal como 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, ou 2,5 mg/kg de dsRNA. O agente de RNAi pode ser administrado por infusão intravenosa ao longo de um período de tempo, tal como ao longo de um período de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, ou 25 minutos. A administração é repetida, por exemplo, em uma base regular, tal como bissemanalmente (i.e., a cada duas semanas) durante um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Por exemplo, após administração bissemanal durante três meses, a administração pode ser repetida uma vez por mês, durante seis meses ou um ano ou mais. A administração do agente de RNAi pode reduzir os níveis de PCSK9, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente por pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % ou mais.
[00534] Antes da administração de uma dose completa do agente de RNAi aos paciente pode ser administrada uma dose mais pequena, tal como uma reação de infusão a >5 %, e estes podem ser monitorizados quanto a efeitos adversos, tais como uma reação alérgica, ou quanto a elevados níveis de lipídeos ou pressão sanguínea. Em outro exemplo, o paciente pode ser monitorizado quanto a efeitos imunoestimuladores indesejados, tais como níveis de citocinas aumentados (por exemplo, TNF-alfa ou INF-alfa).
[00535] Um efeito de tratamento ou preventivo é evidente quando ocorre uma melhoria estatisticamente significativa de um ou mais parâmetros do estado de doença, ou por uma ausência do agravamento ou do desenvolvimento de sintomas que de outro modo seriam antecipados. Como exemplo, uma alteração favorável de pelo menos 10 % em um parâmetro mensurável de doença, e preferivelmente pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ou mais, pode ser indicador de tratamento eficaz. A eficácia de um dado agente de RNAi da invenção ou formulação desse agente de RNAi pode ser também avaliada usando um modelo animal experimental para a dada doença como conhecido na técnica. Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando é observada uma redução estatisticamente significativa em um marcador ou sintoma.
[00536] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado a uma dose de cerca de 0,25 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, por exemplo, entre cerca de 0,25 mg/kg e cerca de 0,5 mg/kg, entre cerca de 0,25 mg/kg e cerca de 1 mg/kg, entre cerca de 0,25 mg/kg e cerca de 5 mg/kg, entre cerca de 0,25 mg/kg e cerca de 10 mg/kg, entre cerca de 1 mg/kg e cerca de 10 mg/kg, entre cerca de 5 mg/kg e cerca de 15 mg/kg, entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 20 mg/kg, entre cerca de 15 mg/kg e cerca de 25 mg/kg, entre cerca de 20 mg/kg e cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 25 mg/kg e entre cerca de 35 mg/kg, ou entre cerca de 40 mg/kg e entre cerca de 50 mg/kg.
[00537] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado a uma dose de cerca de 0,25 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 11 mg/kg, cerca de 12 mg/kg, cerca de 13 mg/kg, cerca de 14 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 16 mg/kg, cerca de 17 mg/kg, cerca de 18 mg/kg, cerca de 19 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 21 mg/kg, cerca de 22 mg/kg, cerca de 23 mg/kg, cerca de 24 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 26 mg/kg, cerca de 27 mg/kg, cerca de 28 mg/kg, cerca de 29 mg/kg, 30 mg/kg, cerca de 31 mg/kg, cerca de 32 mg/kg, cerca de 33 mg/kg, cerca de 34 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 36 mg/kg, cerca de 37 mg/kg, cerca de 38 mg/kg, cerca de 39 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 41 mg/kg, cerca de 42 mg/kg, cerca de 43 mg/kg, cerca de 44 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 46 mg/kg, cerca de 47 mg/kg, cerca de 48 mg/kg, cerca de 49 mg/kg ou cerca de 50 mg/kg. Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado a uma dose de cerca de 25 mg/kg.
[00538] A dose de um agente de RNAi que é administrada a um indivíduo pode ser ajustada para equilibrar os riscos e benefícios de uma dose particular, por exemplo, para alcançar um nível desejado de supressão de gene de PCSK9 (como avaliado, por exemplo, com base em supressão de RNAm de PCSK9, expressão de proteína PCSK9, ou uma redução nos níveis de lipídeos) ou um efeito terapêutico ou profilático desejado, enquanto ao mesmo tempo evitando efeitos secundários indesejáveis.
[00539] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado em duas ou mais doses. Se desejado para facilitar infusões repetidas ou frequentes pode ser aconselhável implantação de um dispositivo de distribuição, por exemplo, uma bomba, stent semipermanente (por exemplo, intravenoso, intraperitoneal, intracisternal ou intracapsular), ou reservatório. Em algumas formas de realizações, o número ou quantidade de doses subsequentes é dependente do alcance de um efeito desejado, por exemplo, a supressão de um gene de PCSK9, ou o alcance de um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, redução de um sintoma de hipercolesterolemia. Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado de acordo com um programa. Por exemplo, o agente de RNAi pode ser administrado uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, ou cinco vezes por semana. Em algumas modalidades, o programa envolve administrações regularmente espaçadas, por exemplo, de hora em hora, a cada quatro horas, a cada seis horas, a cada oito horas, a cada doze horas, diariamente, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, semanalmente, bissemanalmente, ou mensalmente. Em modalidades, o programa envolve administrações estreitamente espaçadas seguidas por um período de tempo mais longo durante o qual o agente não é administrado. Por exemplo, o programa pode envolver um conjunto inicial de doses que são administradas em um período de tempo relativamente curto (por exemplo, cerca de a cada 6 horas, cerca de a cada 12 horas, cerca de a cada 24 horas, cerca de a cada 48 horas, ou cerca de a cada 72 horas) seguido por um período de tempo mais longo (por exemplo, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, ou cerca de 8 semanas) durante o qual o agente de RNAi não é administrado. Em uma modalidade, o agente de RNAi é inicialmente administrado de hora em hora e é posteriormente administrado em um intervalo mais longo (por exemplo, diariamente, semanalmente, bissemanalmente, ou mensalmente). Em outra modalidade, o agente de RNAi é inicialmente administrado diariamente e é posteriormente administrado em um intervalo mais longo (por exemplo, diariamente, semanalmente, bissemanalmente, ou mensalmente). Em certas modalidades, o intervalo mais longo aumenta ao longo do tempo ou é determinado com base no alcance de um efeito desejado. Em uma modalidade específica, o agente de RNAi é administrado uma vez diariamente durante uma primeira semana, seguido por dosagem semanal começando a partir do oitavo dia de administração. Em outra modalidade específica, o agente de RNAi é administrado a cada dois dias durante uma primeira semana seguido por dosagem semanal começando a partir do oitavo dia de administração.
[00540] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado duas vezes por semana. Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado duas vezes por semana a uma dose de 1 mg/kg. Em outra modalidade, o agente de RNAi é administrado duas vezes por semana a uma dose de 2 mg/kg.
[00541] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado uma veze a cada duas semanas. Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez a cada duas semanas a uma dose de 1 mg/kg. Em outra modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez a cada duas semanas a uma dose de 2 mg/kg.
[00542] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez por semana. Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez por semana a uma dose de 0,5 mg/kg. Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez por semana a uma dose de 1 mg/kg. Em outra modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez por semana a uma dose de 2 mg/kg.
[00543] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado em um regime de dosagem que inclui uma "fase de carga" de administrações estreitamente espaçadas que pode ser seguida por uma "fase de manutenção", na qual o agente de RNAi é administrado em intervalos espaçados mais longos. Em uma modalidade, a fase de carga compreende cinco administrações diárias do agente de RNAi durante a primeira semana. Em outra modalidade, a fase de manutenção compreende uma ou duas administrações semanais do agente de RNAi. Em uma modalidade adicional, a fase de manutenção dura 5 semanas. Em uma modalidade, a fase de carga compreende administração de uma dose de 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg cinco vezes por semana. Em outra modalidade, a fase de manutenção compreende administração de uma dose de 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg uma vez, duas vezes, ou três vezes semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses.
[00544] Qualquer um destes programas pode ser opcionalmente repetido durante uma ou mais iterações. O número de iterações pode depender do alcance de um efeito desejado, por exemplo, a supressão de um gene de PCSK9, e/ou o alcance de um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, redução dos níveis de colesterol no soro ou redução de um sintoma de hipercolesterolemia.
[00545] Em modalidades adicionais, a administração de um siRNA é administrada em combinação um agente terapêutico adicional. O siRNA e um agente terapêutico adicional podem ser administrados em combinação na mesma composição, por exemplo, parenteralmente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou por outro método descrito aqui.
[00546] Exemplos de agentes terapêuticos adicionais incluem aqueles que se sabe que tratam um distúrbio de lipídeos, tal como hipercolesterolemia, aterosclerose ou dislipidemia. Por exemplo, um siRNA apresentado na invenção pode ser administrado com, por exemplo, um inibidor da HMG-CoA reductase (por exemplo, uma estatina), um fibrato, um sequestrante de ácido biliar, niacina, um agente antiplaquetas, um inibidor de enzima de conversão da angiotensina, um antagonista do receptor II da angiotensina (por exemplo, potássio de losartan, tal como Cozaar® da Merck & Co.), um inibidor da acil CoA colesterol acetiltransferase (ACAT), um inibidor da absorção de colesterol, um inibidor da proteína de transferência de éster de colesterol (CETP), um inibidor da proteína de transferência de glicerídeo microssomal (MTTP), um modulador do colesterol, um modulador do ácido biliar, um agonista do receptor ativado de proliferação de peroxissoma (PPAR), uma terapia baseada em genes, um protetor vascular compósito (por exemplo, AGI-1067, da Atherogenics), um inibidor da glicoproteína Ilb/IIIa, aspirina ou um composto tipo aspirina, um inibidor de IBAT (por exemplo, S-8921, da Shionogi), um inibidor da esqualeno sintase, ou um inibidor da proteína quimioatrativa de monócitos (MCP)-I. Inibidores da HMG-CoA reductase exemplares incluem atorvastatina (Lipitor®/Tahor/Sortis/Torvast/Cardyl da Pfizer), pravastatina (Pravachol da Bristol-Myers Squibb, Mevalotin/Sanaprav da Sankyo), simvastatina (Zocor®/Sinvacor da Merck, Denan da Boehringer Ingelheim, Lipovas da Banyu), lovastatina (Mevacor/Mevinacor da Merck, Lovastatina, Cepa da Bexal; Liposcler da Schwarz Pharma), fluvastatina (Lescol®/Locol/Lochol da Novartis, Cranoc da Fujisawa, Digaril da Solvay), cerivastatina (Lipobay da Bayer/Baycol da GlaxoSmithKline), rosuvastatina (Crestor® da AstraZeneca), e pitivastatina (itavastatina/risivastatina) (Nissan Chemical, Kowa Kogyo, Sankyo, e Novartis). Fibratos exemplares incluem, por exemplo, bezafibrato (por exemplo,Befizal®/Cedur®/Bezalip® da Roche, Bezatol da Kissei), clofibrato (por exemplo, Atromid-S® da Wyeth), fenofibrato (por exemplo, Lipidil/Lipantil da Fournier, Tricor® da Abbott, Lipantil da Takeda, genéricos), gemfibrozil (por exemplo, Lopid/Lipur da Pfizer) e ciprofibrato (Modalim® da Sanofi-Synthelabo). Sequestrantes de ácido biliar incluem, por exemplo, colestiramina (Questran® e Questran Light™ da Bristol-Myers Squibb), colestipol (por exemplo, Colestid da Pharmacia), e colesevelam (WelChol™ da Genzyme/Sankyo). Terapias com niacina exemplares incluem, por exemplo, formulações de liberação imediata, tais como Nicobid da Aventis, Niacor da Upsher-Smith, Nicolar da Aventis, e Perycit da Sanwakagaku. Formulações de liberação prolongada de niacina incluem, por exemplo, Niaspan da Kos Pharmaceuticals e Slo-Niacin da Upsher-Smith. Agentes antiplaquetas exemplares incluem, por exemplo, aspirina (por exemplo, aspirina da Bayer), clopidogrel (Plavix da Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb), e ticlopidina (por exemplo, Ticlid da Sanofi-Synthelabo e Panaldina da Daiichi). Outros compostos tipo aspirina úteis em combinação com um dsRNA se dirigindo a PCSK9 incluem, por exemplo, Asacard (aspirina de liberação lenta, pela Pharmacia) e Pamicogrel (Kanebo/Angelini Ricerche/CEPA). Inibidores da enzima de conversão da angiotensina exemplares incluem, por exemplo, ramipril (por exemplo, Altace da Aventis) e enalapril (por exemplo, Vasotec da Merck & Co.). Inibidores da acil CoA colesterol acetiltransferase (AC AT) incluem, por exemplo, avasimiba (Pfizer), eflucimiba (BioMerieux Pierre Fabre/Eli Lilly), CS- 505 (Sankyo e Kyoto), e SMP-797 (Sumito). Inibidores da absorção de colesterol exemplares incluem, por exemplo, ezetimiba (Zetia® da Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals) e Pamaqueside (Pfizer). Inibidores de CETP exemplares incluem, por exemplo, Torcetrapib (também chamado CP-529414, Pfizer), JTT-705 (Japan Tobacco), e CETi-I (Avant Immunotherapeutics). Inibidores da proteína de transferência de triglicerídeo microssomal (MTTP) exemplares incluem, por exemplo, implitapide (Bayer), R-103757 (Janssen), e CP-346086 (Pfizer). Outros moduladores do colesterol exemplares incluem, por exemplo, NO-1886 (Otsuka/TAP Pharmaceutical), CI-1027 (Pfizer), e WAY-135433 (Wyeth-Ayerst).
[00547] Moduladores do ácido biliar exemplares incluem, por exemplo, HBS-107 (Hisamitsu/Banyu), Btg-511 (British Technology Group), BARI-1453 (Aventis), S-8921 (Shionogi), SD-5613 (Pfizer), e AZD-7806 (AstraZeneca). Agonistas do receptor ativado da proliferação de peroxissoma (PPAR) exemplares incluem, por exemplo, tesaglitazar (AZ-242) (AstraZeneca), Netoglitazona (MCC-555) (Mitsubishi/Johnson & Johnson), GW-409544 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), GW-501516 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), LY-929 (Ligand Pharmaceuticals e Eli Lilly), LY-465608 (Ligand Pharmaceuticals e Eli Lilly), LY-518674 (Ligand Pharmaceuticals e Eli Lilly), e MK-767 (Merck e Kyorin). Terapias baseadas em genes exemplares incluem, por exemplo, AdGWEGF 121.10 (GenVec), ApoAl (UCB Pharma/Groupe Fournier), EG-004 (Trinam) (Ark Therapeutics), e carreador-Al de cassete de ligação ao ATP (ABCA1) (CV Therapeutics/Incyte, Aventis, Xenon). Inibidores da Glicoproteína IIb/IIIa exemplares incluem, por exemplo, roxifiban (também chamado DMP754, Bristol-Myers Squibb), Gantofiban (Merck KGaA/Yama- nouchi), e Cromafiban (Millennium Pharmaceuticals). Inibidores da esqualeno sintase exemplares incluem, por exemplo, BMS-1884941 (Bristol-Myers Squibb), CP-210172 (Pfizer), CP-295697 (Pfizer), CP- 294838 (Pfizer), e TAK-475 (Takeda). Um inibidor de MCP-I exemplar é, por exemplo, RS-504393 (Roche Bioscience). O agente anti- aterosclerótico BO-653 (Chugai Pharmaceuticals), e o derivado do ácido nicotínico Niclina (Yamanouchi Pharmaceuticals) são também apropriados para administração em combinação com um dsRNA apresentado na invenção. Terapias de combinação exemplares adequadas para administração com um dsRNA se dirigindo a PCSK9 incluem, por exemplo, advicor (Niacina/lovastatina da Kos Pharmaceuticals), amlodipina/atorvastatina (Pfizer), e ezetimiba/simvastatina (por exemplo, comprimidos Vytorin® 10/10, 10/20, 10/40, e 10/80 pela Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals). Agentes para tratamento da hipercolesterolemia, e adequados para administração em combinação com um dsRNA se dirigindo a PCSK9 incluem, por exemplo, lovastatina, Comprimidos de Liberação Prolongada Altoprev® de niacina (Andrx Labs), Comprimidos Caduet® de lovastatina (Pfizer), besilato de amlodipina, Comprimidos Crestor® de cálcio de atorvastatina (AstraZeneca), Cápsulas Lescol® de cálcio de rosuvastatina (Novartis), Lescol® de sódio de fluvastatina (Reliant, Novartis), Comprimidos Lipitor® de sódio de fluvastatina (Parke-Davis), Cápsulas Lofibra® de cálcio de atorvastatina (Gate), Comprimidos de Liberação Prolongada Niaspan (Kos), Comprimidos Pravachol de niacina (Bristol-Myers Squibb), Comprimidos TriCor® de sódio de pravastatina (Abbott), Comprimidos Vytorin® 10/10 de fenofibrato (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals), ezetimiba, Comprimidos WelChol™ da simvastatina (Sankyo), Comprimidos Zetia® de hidrocloreto de colesevelam (Schering), Comprimidos Zetia® de ezetimiba (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals), e Comprimidos Zocor® de ezetimiba (Merck).
[00548] Em uma modalidade, um agente de RNAi é administrado em combinação com anezetimiba/simvastatina (por exemplo, Vytorin® (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)). Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado ao paciente, e depois o agente terapêutico adicional é administrado ao paciente (ou vice versa). Em outra modalidade, o agente de RNAi e o agente terapêutico adicional são administrados ao mesmo tempo.
[00549] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de instrução de um usuário final, por exemplo, um cuidador ou um indivíduo, de como administrar um agente de RNAi descrito aqui. O método inclui, opcionalmente, proporcionar ao usuário final uma ou mais doses do agente de RNAi, e instrução do usuário final como administrar o agente de RNAi em um regime descrito aqui, instruindo deste modo o usuário final.
[00550] Em um aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de um paciente por seleção de um paciente com base de que o paciente está com necessidade de diminuição de LDL, diminuição de LDL sem diminuição de HDL, diminuição de ApoB, ou diminuição de colesterol total. O método inclui administração ao paciente de um siRNA em uma quantidade suficiente para diminuir os níveis de LDL ou níveis de ApoB do paciente, por exemplo, sem diminuir substancialmente os níveis de HDL.
[00551] A predisposição genética desempenha um papel no desenvolvimento de doenças associadas a genes alvo, por exemplo, hiperlipidemia. Portanto, um paciente com necessidade de um siRNA pode ser identificado através de um historial familiar, ou, por exemplo, rastreio quanto a um ou mais marcadores ou variantes genéticos. Exemplos de genes envolvidos na hiperlipidemia incluem mas não estão limitados a, por exemplo, receptor de LDL (LDLR), as apoliproteínas (ApoAl, ApoB, ApoE, e similares), Proteína de transferência de éster de colesterila (CETP), Lipoproteína lipase (LPL), lipase hepática (LIPC), Lipase endotelial (EL), Lecitinxholesterila aciltransferase (LCAT).
[00552] Um prestador de cuidados de saúde, tal como um médico, enfermeira, ou membro da família, pode fazer um historial familiar antes da prescrição ou administração de um agente de RNAi da invenção. Adicionalmente pode ser realizado um teste para se determinar um genótipo ou fenótipo. Por exemplo pode ser realizado um teste de DNA em uma amostra do paciente, por exemplo, uma amostra de sangue, para identificar o genótipo e/ou fenótipo de PCSK9 antes de um dsRNA de PCSK9 ser administrado ao paciente. Em outra modalidade é realizado um teste para identificar um genótipo e/ou fenótipo relacionado, por exemplo, um genótipo de LDLR. Exemplos de variantes genéticas com o gene de LDLR podem ser encontrados na técnica, por exemplo, nas seguintes publicações que são incorporadas por referência: Costanza et al. (2005) Am J Epidemiol. 15;161(8):714-24; Yamada et al. (2008) J Med Genet. Jan;45(l):22-8, Epub 31 de agosto de 2007; e Boes et al. (2009) Exp. Gerontol 44: 136-160, Epub 17 de novembro de 2008.
VI. Kits
[00553] A presente invenção proporciona também kits para uso de qualquer um dos agentes de RNAi e/ou realização de qualquer um dos métodos da invenção. Tais kits incluem um ou mais agente(s) de RNAi e instruções para uso, por exemplo, instruções para inibição da expressão de uma PCSK6 em uma célula por contato da célula com o(s) agente(s) de RNAi em uma quantidade eficaz para inibir a expressão da PCSK9. Os kits podem opcionalmente adicionalmente compreender meios para contato da célula com o agente de RNAi (por exemplo, um dispositivo de injeção), ou meios para medição da inibição de PCSK9 (por exemplo, meios para medição da inibição do RNAm de PCSK9 ou proteína TTR). Tais meios para medição da inibição de PCSK9 podem compreender um meio para obtenção de uma amostra de um indivíduo, tal como, por exemplo, uma amostra de plasma. Os kits da invenção podem opcionalmente adicionalmente compreender meios para administração do(s) agente(s) de RNAi a um indivíduo ou meios para determinação da quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz.
[00554] A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comummente entendido por um com perícia ordinária na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste dos RNAis e métodos apresentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos em baixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, controlará. Adicionalmente, os materiais, métodos, e exemplos são somente ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
EXEMPLOS Materiais e Métodos
[00555] Os seguintes materiais e métodos foram usados nos Exemplos.
[00556] Síntese de cDNA usando Kit de transcrição reversa de cDNA de elevada capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # de Cát 4368813)
[00557] Uma mistura mãe de 2 μL de 10X Tampão, 0,8 μL de 25X dNTPs, 2 μL de Iniciadores aleatórios, 1 μL de Transcriptase Reversa, 1 μL de inibidor de RNase e 3,2 μL de H2O por reação foi adicionada a 10 μL de RNA total. Foi gerado cDNA usando um termociclador C-1000 ou S-1000 Bio-Rad (Hercules, CA) através dos seguintes passos: 25 oC 10 min, 37 oC 120 min, 85 oC 5 seg, manutenção a 4 oC.
Cultura e transfecções de células
[00558] Células Hep3B, HepG2 ou HeLa (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas quase até à confluência a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5 % em meio recomendados (ATCC) suplementado com FBS a 10 % e glutamina (ATCC) antes de serem liberadas da placa por tripsinação. Para dúplexes rastreados em formato de 96 poços, a transfecção foi levada a cabo por adição de 44,75 μL de Opti-MEM mais 0,25 μL de Lipofectamina RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. # de cát 13778-150) a 5 μL de cada dúplex de siRNA a um poço individual em uma placa de 96 poços. A mistura foi depois incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Cinquenta μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo ~2 x104 células foram depois adicionados à mistura de siRNA. Para dúplexes rastreados em formato de 384 poços, 5 μL de Opti-MEM mais 0,1 μL de Lipofectamina RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad CA. # de cát 13778-150) foram misturados com 5 μL de cada dúplex de siRNA por um poço individual. A mistura foi depois incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos seguida por adição de 40 μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo ~8 x103 células. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação do RNA. Experiências de dose única foram realizadas às concentrações finais dos dúplexes de 10 nM e 0,1 nM e experiências de resposta à dose foram feitas usando 8 X diluições em série de 5 vezes começando a partir de 2 nM.
Transfecção de captação livre
[00559] Cinco μL de cada siRNA conjugado com GalNac em PBS foram combinados com 3X104 hepatócitos de macaco Cynomolgus criopreservados recém-descongelados (In Vitro Technologies- Celsis, Baltimore, MD; # de lote JQD) ressuspensos em 95 μL de meio In Vitro Gro CP (In Vitro Technologies- Celsis, Baltimore, MD) em cada poço de uma placa de 96 poços ou 5 uL de siRNA e 45 μL de meio contendo 1,2x103 células para formato de placa de 384 poços. A mistura foi incubada durante cerca de 24 horas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5 %. siRNAs foram testados a concentrações múltiplas entre 500 e 0,1 nM para experiências de dose única e usando 8 X diluições em série de 5 vezes começando a partir de 500 nM para experiências de resposta à dose.
[00560] Isolamento de RNA Total usando Kit de Isolamento de RNAm DYNABEADS (Invitrogen, parte #: 610-12)
[00561] As células foram coletadas e lisadas em 150 μL de Tampão de Lise/Ligação, depois misturadas durante 5 minutos a 850 rpm usando um Termomisturador Eppendorf (a velocidade de mistura foi a mesma ao longo do processo). Dez microlitros de esférulas magnéticas e 80 μL de mistura de Tampão de Lise/Ligação foram adicionados a uma placa de fundo redondo e misturados durante 1 minuto. As esférulas magnéticas foram capturadas usando suporte magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as esférulas. Após remoção do sobrenadante, as células lisadas foram adicionadas às esférulas restantes e misturadas durante 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, as esférulas magnéticas foram lavadas 2 vezes com 150 μL de Tampão de Lavagem A e misturadas durante 1 minuto. As esférulas foram capturadas novamente e o sobrenadante removido. As esférulas foram depois lavadas com 150 μL de Tampão de Lavagem B, capturadas e o sobrenadante foi removido. As esférulas foram de seguida lavadas com 150 μL de Tampão de Eluição, capturadas e o sobrenadante removido. Se permitiu que as esférulas secassem durante 2 minutos. Após secagem, 50 μL de Tampão de Eluição foram adicionados e misturados durante 5 minutos a 70 °C. As esférulas foram capturadas em um íman durante 5 minutos. Cinquenta μL de sobrenadante foram removidos e adicionados a outra placa de 96 poços.
[00562] Para formato de 384 poços, as células foram lisadas durante um minuto por adição de 50 μL de tampão de Lise/Ligação. Foram usados dois μL de esférulas magnéticas por poço. O volume requerido de esférulas foi aliquotado, capturado em um suporte magnético, e a solução de armazenamento de esférulas foi removida. As esférulas foram depois ressuspensas no volume requerido de tampão de Lise/Ligação (25 μL por poço) e 25 μL de suspensão de esférulas foram adicionados às células lisadas. A mistura lisato-esférulas foi incubada durante 10 minutos em VibraTransaltor na definição #7 (UnionScientific Corp., Randallstown, MD). Subsequentemente, as esférulas foram capturadas usando um suporte magnético, o sobrenadante removido e as esférulas são lavadas uma vez com 90 μL de Tampão A, seguida por passos de lavagem única com 90 μL de Tampão B e 100 μL de tampão de Eluição. As esférulas foram embebidas em cada tampão de lavagem durante ~1 minuto (nenhuma mistura envolvida). Após o passo de lavagem final, as esférulas foram ressuspensas em 15 μL de tampão de eluição durante 5 minutos a 70 °C, seguido por captura de esférulas e a remoção do sobrenadante (até 8 μL) para síntese de cDNA e/ou armazenamento de RNA purificado (-20 °C).
PCR em tempo real
[00563] Dois μL de cDNA foram adicionados a uma mistura mãe contendo 0,5 μL de Sonda TaqMan de GAPDH de humano ( # de Cát 4326317E da Applied Biosystems), 0,5 μL de sonda TaqMan de PCSK9 de humano ( # de cát Hs03037355_m1da Applied Biosystems) para células humanas ou 0,5 μL de Ensaio TaqMan personalizado de GAPDH de Cynomolgus (iniciador F de GAP de cyno a 150 nM- 5’GCATCCTGGGCTACACTGA (SEQ ID NO: 5); iniciador R de GAP de cyno a 150 nM-5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC (SEQ ID NO: 6) sonda de GAP de cyno a 250 nM- 5’-5HEX-CCAGGTGGTCTCCTCC- BHQ1-Q-3’(SEQ ID NO: 7)), 0,5 μL de Ensaio TaqMan personalizado de PCSK9 de Cynomolgus (iniciador F de PCSK9 de cyno a 900 nM 5’- ACGTGGCTGGCATTGCA (SEQ ID NO: 8); ensaio R de PCSK9 de cyno a 900 nM 5’-AAGTGGATCAGTCTCTGCCTCAA (SEQ ID NO: 9); sonda de PCSK9 de cyno a 250 nM 5’-6FAM- CATGATGCTGTCTGCCGAGCCG-BHQ1-Q-3’ (SEQ ID NO: 10)) para células de Cynomolgus e 5 μL de mistura mãe de sonda Lightcycler 480 (# de Cát04887301001 da Roche) por poço em uma placa de 384 poços (# de cát04887301001 da Roche). PCR em tempo real foi realizado em um sistema de PCR em Tempo Real LC480 da Roche (Roche) usando o ensaio de ΔΔCt(RQ). Cada dúplex foi testado em duas transfecções independentes e cada transfecção foi avaliada em duplicado, a não ser que notado de outro modo.
[00564] Para calcular a mudança relativa do número de vezes, os dados de tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizados para ensaios realizados com células transfectadas com AD-1955 a 10 nM, ou células pseudotransfectadas. Para ensaios de captação livre, os dados foram normalizados em relação a células tratadas com PBS ou GalNAc-1955 (concentração mais elevada usada para compostos experimentais). As IC50s foram calculadas usando um modelo de ajustamento de 4 parâmetros usando XLFit e normalizadas em relação a células transfectadas com AD-1955 ao longo da mesma gama de doses, ou para a sua própria dose mais baixa.
[00565] As sequências senso e antissenso de AD-1955 são: SENSO: 5’-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3’ (SEQ ID NO: 11); e ANTISSENSO: 5’-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3’ (SEQ ID NO: 12).Tabela B: Abreviaturas de monômeros de nucleotídeos usadas na representação de sequências de ácidos nucleicos.
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Exemplo 1. Síntese de Oligonucleotídeos Conjugados com GalNAc
[00566] Uma série de dúplexes de siRNA abrangendo a sequência de RNAm de PCSK9 foi desenhada, sintetizada, e conjugada com um GalNAc trivalente na extremidade 3' da fita senso usando as técnicas descritas acima. As sequências destes dúplexes são mostradas na Tabela 1. Estas mesmas sequências foram também sintetizadas com várias modificações de nucleotídeos e conjugadas com um GalNAc trivalente. As sequências dos dúplexes modificados são mostradas na Tabela 2. Tabela 1. Sequências não modificadas de PCSK9
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Exemplo 2. Rastreio in vitro e in vivo.
[00567] Um subconjunto destes dúplexes foi avaliado quanto à eficácia em ensaios de captação livre de dose única em hepatócitos de macaco Cynomolgus. Brevemente, hepatócitos primários de Cynomolgus (PCH) foram tratados com os dúplexes de siRNA modificados conjugados a três concentrações, 500 nM, 100 nM e 10 nM. Os ensaios de captação livre a 100 nM e 10 nM foram realizados duas vezes e os dados são representados como mensagem restante média em relação ao controlo +/- o desvio padrão (SD). O rastreio a 500 mM foi realizado uma única vez. A Tabela 3 mostra os resultados destes ensaios.Tabela 3. Rastreio da eficácia de PCSK9 por captação livre em hepatócitos primários de macacos Cynomolgous.
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[00568] Os dúplexes de siRNA de PCSK9 modificados e conjugados foram também avaliados quanto à eficácia por ensaios de transfecção em três linhas celulares humanas. siRNAs de PCSK9 foram transfectados em três diferentes linhas celulares humanas, HeLa, Hep3B e HepG2 em duas doses, 10 nM e 0,1 nM. Os resultados destes ensaios são mostrados na Tabela 4 e os dados são expressos como uma fração da mensagem restante em relação ao controle.
[00569] A Figura 1 mostra que existe uma reprodutibilidade geral na atividade de silenciamento dos dúplexes de PCSK9 entre os ensaios de captação livre e os ensaios de transfecção.
[00570] Os valores de IC50 para dúplexes selecionados por captação livre em células de Cynomologous e por transfecção em células Hep3B são mostrados na Tabela 5.Tabela 4. Rastreio da eficácia de PCSK9 por transfecção em linhas celulares humanas.
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Tabela 5. Valores de IC50 de PCSK9 para dúplexes selecionados por captação livre em células de macaco Cynomologous e por transfecção na linah celular humana Hep3B.
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[00571] AD-48400 foi também avaliado quanto à eficácia in vivo emcamundongos fêmeas transportando um transgene de PCSK9 de humano aleatoriamente inserido no genoma sem ruptura do gene de PCSK9 endógeno. Brevemente, os camundongos foram injetados subcutaneamente com uma única dose de 20 mg/kg ao Dia 0, uma única dose de 100 mg/kg ao Dia 0, e cinco doses de 20 mg/kg aos Dias 0, 1, 2, 3, 4, e 5. Foi coletado soro aos Dias -6, -3, 0, 1, 2, 3, 4, e 7 e a quantidade de proteína PCSK9 foi determinada por ensaio ELISA. Os resultados destas análises são ilustrados na Figura 2, e mostram que existe um efeito de resposta à dose com AD-48400 conjugado com GalNAc a todas as três dosagens testadas.
[00572] Os seis dúplexes mais eficazes identificados pelos rastreios in vitro descritos acima foram avaliados quanto à eficácia in vivo e duração da resposta. Camundongos com PCSK9 transgênica foram injetados aos Dias 0, 1, 2, 3, e 4 com 5 mg/kg ou 25 mg/kg de AD-48400, AD-53830, AD-53806, AD-53815, AD-53748, ou AD-53798. Os níveis de proteína PCSK9 no soro foram determinados por ELISA aos Dias -3, 0, 1, 2, 3, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 26, 31, e 36. Os resultados são ilustrados nas Figuras 3A e 3B.
Exemplo 3. Otimização do Composto-Protótipo.
[00573] Com base nos ensaios de eficácia descritos no Exemplo 2 acima, siRNAs de PCSK9 siRNAs baseados nas sequências genitoras de AD-53815 e AD-53806 com uma variedade de modificações químicas foram avaliados quanto à eficácia em ensaios de captação livre em hepatócitos primários de macaco Cynomolgous (PCH) a 200 nM, 20 nM, 2 nM, e 0,2 nM. Para todas as doses sem ser dose de 0,2 nM, os ensaios foram realizados duas vezes e os dados são expressos como a mensagem fracional média restante em relação ao controle. A dose de 0,2 nM foi avaliada uma única vez. Os resultados destes ensaios são mostrados na Tabela 6.Tabela 6. Rastreios de eficácia para otimização do composto- protótipo de AD-53815 e AD-53806 por captação livre em hepatócitos de macaco Cynomolgous.
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[00574] siRNAs com uma variedade de modificações químicas baseados nas sequências genitoras de AD-53815 e AD-53806 foram também avaliados quanto à eficácia in vitro por transfecção em células Hep3B a 10 nM e 0,1 nM. Os resultados deste rastreio da relação estrutura-atividade são mostrados na Tabela 7, e são expressos como a mensagem fracional média restante em relação ao controle +/- SD.Tabela 7. Rastreios de eficácia para otimização do composto- protótipo de AD-53815 e AD-53806 por transfecção em uma célula humana.
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[00575] Para se determinar se qualquer um dos siRNAs do rastreio SAR in vitro é mais eficaz no silenciamento de PCSK9 do que o siRNA genitor (AD-53815), a camundongos com PCSK9 transgênica foi administrada uma dose única de 3 mg/kg dos siRNAs mostrados na Figura 4, e, 72 horas pós-dosagem, os níveis de proteína PCSK9 foram determinados por ensaio ELISA. Os resultados, mostrados na Figura 5, demonstram que AD-57928 é surpreendentemente eficaz no silenciamento de PCSK9. A Figura 6 mostra que não só uma dose única de AD-57928 silencia eficazmente a proteína PCSK9, mas existe também uma resposta à dose usando AD-57928.
Exemplo 4. Estudo de Divisão de Dosagem Usando AD-57928
[00576] A capacidade de AD-57928 de suprimir a expressão da proteína PCSK9 foi avaliada por medição dos níveis da proteína PCSK9 de humano (hPCSK9) no soro de camundongos com hPCSK9 transgênica após administração de AD-57928. AD-57928 foiadministrado subcutaneamente usando seis diferentes programas de dosagem que incluíram uma "fase de carga" durante a primeira semana (uma dose de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg ou 2 mg/kg diariamente durante 5 dias consecutivos), seguida por uma "fase de manutenção" (dosagem uma vez ou duas vezes semanalmente de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg ou 2 mg/kg durante 5 semanas), como é descrito na Tabela 8 em baixo. A última dose foi administrada ao dia 38. Cada programa de dosagem foi testada usando um grupo de 3 camundongos que incluí dois machos e uma fêmea. Um grupo de controle recebeu injeções com PBS.Tabela 8. Esquemas de Dosagem para administração de AD-57928
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[00577] Foi coletado soro 3 dias antes da administração da primeira dose e aos dias 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 45, 52, 59 e 65 após a primeira dose. Os níveis da proteína PCSK9 no soro foram avaliados por ensaio ELISA. Os resultados são mostrados nas Figuras 6, 7 e 8.
[00578] Níveis da proteína hPCSK9 no soro de reduzidos foram observados 72 horas após a primeira dose, e foram sustentados até ao dia 38. A administração de AD-57928 às cargas de dose de 5x2 mg/kg, 5x1 mg/kg e 5x0,5 mg/kg resultou em redução de ~90 %, ~70 % e ~60 % dos níveis da proteína hPCSK9 no soro, respectivamente (ver Figuras 6-8). No grupo doseado usando o programa de dosagem de manutenção 2x, os níveis reduzidos de hPCSK9 foram sustentados durante 1 semana mais do que no grupo doseado usando o programa de dosagem de manutenção 1x, e regressaram à linha de base 4 semanas após a última dose (ver Figuras 6-8).
Exemplo 5. Titulação de Fosforotioato
[00579] De modo a se determinar o efeito do número e posição de modificações de fosforotioato na capacidade de dsRNA de inibir a expressão de PCSK9, um número de siRNAs baseados nas sequências genitoras de AD-57928, AD-53806 e AD-53830 como mostrado na Tabela 9 foi preparado e testado. Para se determinar se qualquer um dos siRNAs é mais eficaz no silenciamento de PCSK9 do que AD- 57928, a camundongos com PCSK9 transgênica foi administrada uma dose única de 0,3 mg/kg do siRNA na Tabela 9, e, 72 horas pós- dosagem, os níveis de proteína PCSK9 foram determinados por ensaio ELISA. Os resultados, mostrados na Figura 9, demonstram que AD- 57928 é surpreendentemente eficaz no silenciamento de PCSK9. AD- 58893, AD-58894, AD-58896, AD-58897, AD-58898 e AD-58899 foram também capazes de silenciar PCSK9 em comparação com o controle.Tabela 9. siRNAs usados na experiência de titulação de fosforiotioato
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Exemplo 6. Níveis de Fármaco no Fígado de AD-57928 e AD-58895
[00580] O objetivo deste estudo foi quantificar níveis de siRNA no fígado de camundongos de tipo selvagem de modo a se definir condições apropriadas para rastreio do nível de fármaco. Os siRNAs usados na experiência foram AD-57928 e AD-58895 (que nãoproduziram nenhuma diminuição no nível da proteína PCSK9 no Exemplo 5). AD-58895 foi usado como um comparador para definir pontos temporais aos quais é observável uma diferença no nível de fármaco que reflete a eficácia.
[00581] Um total de 33 camundongos fêmeas C57B6 foi usado na experiência (3 camundongos por grupo). A estes camundongos foi administrada uma dose subcutânea única de AD-57928, AD-58895 ou PBS como um controle. Os fígados foram coletados às 4, 24, 48, 72, 96 e 168 horas pós-dose. Alíquotas de tecido em duplicado por amostra foram coletadas, e a concentração de siRNA no fígado foi medida usando um ensaio de pRT-PCR específico quanto a sequências antissenso recém-desenhado. A quantidade medida de AD-57928 e AD- 58895 por grama de fígado ao longo do tempo é mostrada na Figura 10, e a quantidade de AD-57928 e AD-58895 expressa como uma percentagem da dose teórica total é mostrada na Figura 11. O limite de detecção (LOD) do ensaio de qRT-PCR foi ~1 ng/ g de fígado, e o ensaio mostrou bom desempenho e reproduz precisamente a reprodutibilidade. Os resultados indicam que AD-57928 é mais estável no fígado e AD- 58895 é menos estável, e ambos podem ser detetados ao longo de todos os pontos temporais. Aos 7 dias pós-dose, o nível de AD-57928 está >100 vezes acima do LOD do ensaio de qRT-PCR, e o nível de AD-58895 está >10 acima do LOD. As concentrações de AD-57928 e AD-58895 diferem em média >10 vezes de acordo com a sua estabilidade prevista e a eficácia observada. O ponto temporal entre 72 e 120 horas pós-dose pode ser apropriado para rastreios baseados em silenciamento de siRNA.
Exemplo 7. Otimização de AD-57928
[00582] De modo a se intensificar a atividade e estabilidade in vivo de AD-57928, agentes de RNAi adicionais baseados nas sequências genitoras de AD-57928 foram preparados e testados (Tabela 10; as sequências "Senso" na Tabela 10 são divulgadas como SEQ ID NOS: 1653-1658, respectivamente, por ordem de aparecimento, e as sequências "Antissenso" são divulgadas como SEQ ID NOS: 16591664, respectivamente, por ordem de aparecimento; as mesmas sequências senso e antissenso divulgadas na Tabela 10 são também divulgadas na Figura 12A).
[00583] As sequências senso e antissenso não modificadas para AD- 60121 são:Senso - 5’- CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU - 3’ (A-122088.3; SEQ ID NO:1665); eAntissenso - 5’- ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA - 3’(A- 120190.19; SEQ ID NO:1666).
[00584] Em geral, estes compostos continham menos modificações de 2'-fluoro e as uridinas modificadas por flúor foram removidas. A potência in vitro destes dúplexes foi testada por transfecção de células HeLa e Hep3b. Como mostrado na Figura 12B, AD-59849, AD-59228, e AD-60212 têm valores de IC50 comparáveis ao genitor (AD-57928).
[00585] A capacidade destes dúplexes de persistirem in vivo no fígado foi também determinada por administração de 1 mg/kg de cada dúplex a camundongos de tipo selvagem e determinação do nível de siRNA por PCR quantitativa. Como ilustrado na Figura 13, todos os dúplexes mostram maior persistência no fígado do que o dúplex genitor começando no ponto temporal pós-120 horas de administração.
[00586] A capacidade destes dúplexes de suprimirem a expressão da proteína PCSK9 foi também avaliada in vivo por medição dos níveis da proteína PCSK9, LDL, HDL, colesterol total (Tc), triglicerídeos (Tgs), alanina transaminase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), e fosfatase alcalina (ALP) no soro de primatas não humanos (NHP). A presença de reação no local de injeção foi também monitorizada. Os dúplexes foram administrados usando um programa de dosagem que incluiu uma "fase de carga" durante a primeira semana (uma dose de 2 mg/kg diariamente durante 5 dias subsequentes, qdx5), seguida por uma "fase de manutenção" (três doses semanais de 2 mg/kg durante 3 semanas, qwx3), como é descrito na Tabela 11 abaixo.Tabela 10. Agentes de RNAi Adicionais.
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[00587] Como mostrado nas Figuras 14A e 14B, todos os compostos exceto para AD-60688 alcançam silenciamento de PCSK9 maior do que 80 % e animais individuais no grupo de AD-60212 alcançamsilenciamento de PCSK9 maior do que 90 %. A Figura 15 demonstra que, na ausência de estatinas, todos os compostos exceto para AD- 60688 alcançam diminuição de colesterol LDL de 60 % e animais individuais no grupo de AD-59223 alcançam diminuição de colesterol LDL até 77 %. Surpreendentemente, e como ilustrado na Figura 18, os agentes indicados mantiveram diminuição de colesterol 46 dias após a última dose dos agentes indicados. Ainda mais surpreendentemente, e como ilustrado na Figura 19, AD-60212 e AD-59849 mantêm diminuição de colesterol LDL até 60 % até pelo menos o dia 120 (93 dias após a última dose), mais tempo do que qualquer efeito observado para um agente de RNAi in vivo, indicando que, após uma fase de carga, estes compostos podem ser administrados a uma frequência de uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses durante a fase de manutenção.
Exemplo 8. Preparação de Sequências de PCSK9 Baseadas em AD- 57928 Adicionais
[00588] Agentes de RNAi adicionais baseados nas sequências genitoras de AD-57928 foram preparados (ver Tabela 12, em baixo) e testados in vitro quanto à potência para transfecção de células HeLa e Hep3B com estes agentes. Os valores de IC50 para estes agentes são mostrados na Tabela 13. Tabela 12. Sequências de PCSK9
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Exemplo 9. Eficácia de Dose Repetida de AD-57928
[00589] A eficácia de dose repetida de AD-57928 na supressão da expressão da proteína PCSK9 foi avaliada in vivo por medição dos níveis da proteína PCSK9, LDL, HDL, colesterol total (Tc), triglicerídeos (Tgs), alanina transaminase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), e fosfatase alcalina (ALP) no soro de primatas não humanos (NHP). A presença de reação no local de injeção foi também monitorizada. Dúplexes de AD-57928 foram subcutaneamente administrados usando os programas de dosagem descritos na Tabela 14 em baixo. Os animais do grupo 5 foram redoseados com uma dose única de 25 mg/kg ao dia 92. A um grupo de animais adicional foi administrada uma dose única de 25 mg/kg. "2xw" é duas vezes por semana; "q2w" é uma vez a cada duas semanas; e "q1w" é uma vez por semana.Tabela 14. Programas de Dosagem
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[00590] Como ilustrado na Figura 16A, o regime mais eficaz para diminuição de LDL foi um regime duas vezes semanalmente (2xw) que alcançou uma redução de cerca de 60 % nos níveis de LDL. A mesma dose cumulativa administrada menos frequentemente foi menos eficaz do que o regime duas vezes por semana. A Figura 16B demonstra que o regime 2xw alcançou silenciamento de PCSK9 maior do que 80 %.
[00591] As Figuras 17A e 17B demonstram que uma dose única de 25 mg/kg de AD-57928 tem o mesmo início de diminuição de LDL e PCSK9, o mesmo nadir da diminuição de PCSK9 e LDL, e taxa equivalente de diminuição de LDL como uma dose múltipla mais baixa de 2 mg/kg de AD-57928 administrada duas vezes por semana (2xw). Estes gráficos demonstram também que existe uma tendência na direção de diminuição mais rápida de PCSK9 com a dose única de 25 mg/kg e que a recuperação de ambos os níveis de PCSK9 e níveis de LDL começa cerca de 20 dias após ser alcançado o nadir (dia 7) para a dose única de 25 mg/kg. O nadir para a dose única de 25 mg/kg é ao Dia 7.
Exemplo 10. Tolerabilidade de Agentes de RNAi de AD-57928 Otimizados
[00592] Os agentes de RNAi adicionais preparados com base nas sequências genitoras de AD-57928 descritas na Figura 12A (e Tabela 10) foram avaliados quanto à tolerabilidade em ratos. A ratos machos foram subcutaneamente administrados 225 mg/kg dos agentes de RNAi indicados aos dias 1, 8, e 15, e foram sacrificados e necropsiados ao dia 16 (ver Tabela 15). Os animais foram observados quanto a quaisquer sintomas clínicos em uma base diária e os pesos corporais dos animais foram determinados pré-estudo e semanalmente durante o estudo. Ao dia 16, sangue dos animais foi avaliado hemotologicamente, quanto a coagulação e quanto a química do soro; o metabolismo do fármaco e farmacocinética dos agentes foram determinados usando amostras de fígado dos animais; e o coração, pulmões (insuflados), rins, fígado, baço, testículos, e primeiro e último locais de injeção foram analisados quanto a quaisquer mudanças. Não existiram nenhumas mudanças nos sinais clínicos, obervações visuais no local de injeção, química do soro, coagulação ou patologia microscópica do fígado, baço, pulmão, coração, ou testículos. A Tabela 16 proporciona um sumário dos pesos do fígado, dos pesos corporais finais, dos resultados das análises hematológicas e das pontuações de gravidade da patologia para os locais de injeção finais e rins para cada agente testado.Tabela 15. Programas de Dosagem
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Tabela 16. Sumário da Tolerabilidade
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_Pontuação de Gravidade da Patologia: 1 = mínima; 2 = ligeira; 3 = moderadaBW = Peso CorporalWBC = Glóbulos BrancosLYM = Linfócitos

Claims (20)

1. Agente de RNAi de fita dupla, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso e uma fita antissenso que formam uma região de dupla fita, em que a sequência de nucleotídeo da fita antissenso compreende 5'- asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa - 3' (SEQ ID NO: 1663), e a sequência de nucleotídeo da fita senso compreende 5'- csusagacCfuGfudTuugcuuuuguL96-3‘ (SEQ ID NO: 1657),em que a, c, g e u são nucleotídeos A, C, G e U modificados com 2'-O-metila (2'-OMe), respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são nucleotídeos A, C, G e U modificados com 2’-flúor, respectivamente; s é uma ligação fosforotioato; dT é 2'-desoxitimidina; e L96 é
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em que L96 é conjugado à extremidade 3' da fita senso, como mostrado no seguinte esquema:
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em que X é O.
2. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fita senso consiste na sequência de nucleotídeos de 5‘-csusagacCfuGfudTuugcuuuuguL96-3‘ (SEQ ID NO: 1657) e a fita antissenso consiste na sequência de nucleotídeos de 5'- asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa - 3' (SEQ ID NO: 1663),em que a, c, g e u são nucleotídeos A, C, G e U modificados com 2'-O-metila (2'-OMe), respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são nucleotídeos A, C, G e U modificados com 2'-flúor, respectivamente; s é uma ligação fosforotioato; dT é 2'-desoxitimidina; e L96 é
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em que L96 é conjugado à extremidade 3' da fita senso, como mostrado no seguinte esquema:
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em que X é O.
3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o agente de RNAi de fita dupla, como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o agente de RNAi de dupla fita está presente em uma solução não tamponada, preferencialmente em que a referida solução não tamponada é solução salina ou água.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o referido agente de siRNA de dupla fita está presente em uma solução tampão, preferencialmente em que a referida solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato, ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos, mais preferencialmente em que a referida solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
6. Método de inibição da expressão de PCSK9 em uma célula in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) contato da célula com o agente de RNAi de fita dupla, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5; e(b) manutenção da célula produzida na etapa (a) duranteum tempo suficiente para se obter degradação do transcrito RNAm de um gene de PCSK9, inibindo deste modo a expressão do gene de PCSK9 na célula.
7. Uso do agente de RNAi de fita dupla, como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, para o tratamento de uma lipidemia em um indivíduo.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano, preferencialmente em que o humano tem hipercolesterolemia.
9. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado subcutaneamente.
10. Uso do agente de RNAi de fita dupla, como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, para o tratamento de hipercolesterolemia em um indivíduo.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado subcutaneamente.
13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a determinação de um genótipo ou fenótipo de LDLR do indivíduo.
14. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a determinação do nível de colesterol no soro do indivíduo.
15. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado por via intravenosa.
16. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado em duas ou mais doses.
17. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado em um regime de dosagem que inclui uma fase de carregamento seguida de uma fase de manutenção.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado em duas ou mais doses.
19. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado em um regime de dosagem que inclui uma fase de carregamento seguida de uma fase de manutenção.
20. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado intravenosamente.
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