BR102021000794A2 - CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSING LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION - Google Patents
CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSING LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION Download PDFInfo
- Publication number
- BR102021000794A2 BR102021000794A2 BR102021000794-0A BR102021000794A BR102021000794A2 BR 102021000794 A2 BR102021000794 A2 BR 102021000794A2 BR 102021000794 A BR102021000794 A BR 102021000794A BR 102021000794 A2 BR102021000794 A2 BR 102021000794A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- leishmaniasis
- chimeric protein
- group
- enzyme
- Prior art date
Links
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 title claims abstract description 97
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 74
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 57
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 22
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 11
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000178949 Leishmania chagasi Species 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 4
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 4
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 4
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 4
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 4
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims description 4
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 claims description 4
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 claims description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 abstract description 25
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 21
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 40
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 18
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 18
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 12
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 11
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 11
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 10
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 10
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 9
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 7
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000003108 parasitologic effect Effects 0.000 description 7
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 description 6
- 208000024699 Chagas disease Diseases 0.000 description 6
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 6
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 206010011668 Cutaneous leishmaniasis Diseases 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000222727 Leishmania donovani Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 101000978703 Escherichia virus Qbeta Maturation protein A2 Proteins 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 206010033767 Paracoccidioides infections Diseases 0.000 description 4
- 201000000301 Paracoccidioidomycosis Diseases 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 4
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 4
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 4
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 241000222724 Leishmania amazonensis Species 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101150029664 PELO gene Proteins 0.000 description 2
- 101710132455 Protein A2 Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OPGTXAUDXWCGFI-UHFFFAOYSA-N [1-[[6-[[3-(3-dodecanoyloxytetradecanoylamino)-6-(hydroxymethyl)-5-phosphonooxy-4-(3-tetradecanoyloxytetradecanoyloxy)oxan-2-yl]oxymethyl]-2,4,5-trihydroxyoxan-3-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] hexadecanoate Chemical compound OC1C(O)C(NC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)OC1COC1C(NC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)C(OC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(OP(O)(O)=O)C(CO)O1 OPGTXAUDXWCGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 229940075564 anhydrous dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNHOJBNSNUXZQA-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GNHOJBNSNUXZQA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 101710134681 40 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005892 Deltamethrin Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001039157 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing protein 25 Proteins 0.000 description 1
- 101710134930 Import motor subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- 102100040695 Leucine-rich repeat-containing protein 25 Human genes 0.000 description 1
- 241000255134 Lutzomyia <genus> Species 0.000 description 1
- 101100018862 Mus musculus Ifnar1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 102000010722 N-Glycosyl Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010063372 N-Glycosyl Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000722350 Phlebotomus <genus> Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 101100020251 Trypanosoma cruzi KMP-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002483 decamethrin Drugs 0.000 description 1
- OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N deltamethrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](C=C(Br)Br)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000004503 fine granule Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098453 inhalant powder Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- XOGYVDXPYVPAAQ-SESJOKTNSA-M meglumine antimoniate Chemical compound O[Sb](=O)=O.CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO XOGYVDXPYVPAAQ-SESJOKTNSA-M 0.000 description 1
- 229940005559 meglumine antimoniate Drugs 0.000 description 1
- PQLXHQMOHUQAKB-UHFFFAOYSA-N miltefosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C PQLXHQMOHUQAKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003775 miltefosine Drugs 0.000 description 1
- 208000037971 neglected tropical disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000024241 parasitism Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N pentamidine Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OCCCCCOC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004448 pentamidine Drugs 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 235000003784 poor nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- YQDGWZZYGYKDLR-UZVLBLASSA-K sodium stibogluconate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].O1[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O2)[C@H](C([O-])=O)O[Sb]21([O-])O[Sb]1(O)(O[C@H]2C([O-])=O)O[C@H]([C@H](O)CO)[C@@H]2O1 YQDGWZZYGYKDLR-UZVLBLASSA-K 0.000 description 1
- 229960001567 sodium stibogluconate Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/008—Leishmania antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
PROTEÍNA QUIMÉRICA, KIT, MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, USO DE UMA PROTEÍNA QUIMÉRICA, COMPOSIÇÃO VACINAL CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO VACINAL A presente invenção refere-se ao campo da medicina diagnóstica, vacinologia e da biotecnologia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma proteína quimérica para aplicação diagnóstica de leishmaniose visceral em seres humanos e cães, incluindo indivíduos coinfectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e uma vacina contendo a referida proteína quimérica para uso profilático ou terapêutico.CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSIS OF LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION The present invention relates to the field of diagnostic medicine, vaccinology and biotechnology. More specifically, the present invention relates to a chimeric protein for diagnostic application of visceral leishmaniasis in humans and dogs, including human immunodeficiency virus (HIV) coinfected individuals, and a vaccine containing said chimeric protein for prophylactic or therapeutic use.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina diagnóstica, vacinologia e da biotecnologia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma proteína quimérica para aplicação diagnóstica de leishmaniose visceral em seres humanos e cães, incluindo indivíduos co-infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e uma vacina contendo a referida proteína quimérica para uso profilático ou terapêutico.[001] The present invention relates to the field of diagnostic medicine, vaccinology and biotechnology. More specifically, the present invention relates to a chimeric protein for diagnostic application of visceral leishmaniasis in humans and dogs, including individuals co-infected with the human immunodeficiency virus (HIV) and a vaccine containing said chimeric protein for prophylactic or therapeutic.
[002] As leishmanioses são doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, sendo conhecidas mais de 20 espécies. A transmissão ocorre através da picada do inseto infectado dos gêneros Phlebotomus e Lutzomyia. Três tipos principais de leishmanioses são descritos: leishmaniose visceral, a forma mais grave; cutânea; e mucocutânea. A doença, se não tratada, pode levar à morte em até dois anos em 95% dos casos.[002] Leishmaniasis are diseases caused by parasites of the genus Leishmania, with more than 20 species being known. Transmission occurs through the bite of an infected insect of the genera Phlebotomus and Lutzomyia. Three main types of leishmaniasis are described: visceral leishmaniasis, the most severe form; cutaneous; and mucocutaneous. The disease, if left untreated, can lead to death within two years in 95% of cases.
[003] Atualmente, as leishmanioses constituem um importante problema de saúde pública global. Dados epidemiológicos da Organização Mundial de Saúde mostram que 900.000 a 1,3 milhão de novos casos e 20 a 30 mil mortes ocorrem anualmente. Países da África, Ásia e América Latina são os mais acometidos, sendo que, em 2017, mais que 90% dos casos de leishmaniose visceral foram reportados por sete países: Brasil, Etiópia, Índia, Quênia, Somália, Sudão e Sudão do Sul. A ocorrência da leishmaniose é mais frequente em populações de baixa renda e está associada à má nutrição, pobreza e baixa funcionalidade do sistema imunológico, sendo as crianças e os adultos jovens os mais afetados.[003] Currently, leishmaniasis constitute an important global public health problem. Epidemiological data from the World Health Organization show that 900,000 to 1.3 million new cases and 20 to 30 thousand deaths occur annually. Countries in Africa, Asia and Latin America are the most affected, and in 2017, more than 90% of visceral leishmaniasis cases were reported by seven countries: Brazil, Ethiopia, India, Kenya, Somalia, Sudan and South Sudan. The occurrence of leishmaniasis is more frequent in low-income populations and is associated with poor nutrition, poverty and low functionality of the immune system, with children and young adults being the most affected.
[004] Segundo dados do Ministério da Saúde disponíveis no DATASUS, foram confirmados quase quatro mil casos de leishmaniose visceral no Brasil em 2018, sendo a maior incidência nas regiões nordeste e norte, seguido pelo Sudeste. Nesse mesmo ano, foram notificados quase trezentos óbitos causados pela leishmaniose visceral no país.[004] According to data from the Ministry of Health available on DATASUS, almost four thousand cases of visceral leishmaniasis were confirmed in Brazil in 2018, with the highest incidence in the northeast and north, followed by the Southeast. In that same year, almost three hundred deaths caused by visceral leishmaniasis were reported in the country.
[005] As estratégias atuais do Ministério da Saúde do Brasil para prevenção da leishmaniose visceral estão centradas no diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos, além da prevenção e controle dos casos humanos, vetores e reservatórios, ou seja, cães com sorologia positiva e/ou parasitológico positivo.[005] The current strategies of the Ministry of Health of Brazil for the prevention of visceral leishmaniasis are focused on the diagnosis and early treatment of human cases, in addition to the prevention and control of human cases, vectors and reservoirs, that is, dogs with positive serology and / or positive parasitological.
[006] A eficácia do tratamento é baixa, sendo influenciada tanto por fatores relacionados ao hospedeiro quanto pela espécie do parasita causadora da doença. Os fármacos utilizados no tratamento incluem: antimônios pentavalentes, como o estibogluconato de sódio e antimoniato de meglumina, anfotericina B e suas formulações lipossomais, miltefosina, paramomicina, alopurinol e pentamidina, sendo utilizados em monoterapia ou em combinação. Todos possuem limitações, como por exemplo longa duração do tratamento, resistência, adquirida, toxicidade alta, efeitos colaterais e alto custo.[006] The effectiveness of treatment is low, being influenced by both host-related factors and the species of parasite causing the disease. The drugs used in the treatment include: pentavalent antimonies, such as sodium stibogluconate and meglumine antimoniate, amphotericin B and its liposomal formulations, miltefosine, paramomycin, allopurinol and pentamidine, being used in monotherapy or in combination. All have limitations, such as long duration of treatment, resistance, acquired, high toxicity, side effects and high cost.
[007] Os cães desempenham importante papel na manutenção da doença, já que número crescente de infecção em cães pode acarretar o aumento da incidência da doença em humanos. Portanto, a detecção precoce dos cães infectados é fator essencial no controle da propagação da doença em humanos. As medidas de prevenção preconizadas pelo Ministério da Saúde brasileiro incluem cuidados com os cães, tais como realizar exames sorológicos antes da adoção, aplicação de inseticidas, uso de telas em canis e uso de coleiras com deltametrina a 4%. Falhas no diagnóstico, decorrentes por exemplo da baixa sensibilidade dos testes aplicados e da permanência prolongada de cães assintomáticos e infectados em áreas endêmicas, impactam negativamente o controle da leishmaniose.[007] Dogs play an important role in the maintenance of the disease, since an increasing number of infections in dogs can lead to an increase in the incidence of the disease in humans. Therefore, early detection of infected dogs is an essential factor in controlling the spread of the disease in humans. Prevention measures recommended by the Brazilian Ministry of Health include care for dogs, such as performing serological tests before adoption, application of insecticides, use of screens in kennels and the use of collars with 4% deltamethrin. Diagnostic failures, resulting for example from the low sensitivity of the tests applied and the prolonged stay of asymptomatic and infected dogs in endemic areas, negatively impact the control of leishmaniasis.
[008] O diagnóstico precoce é de suma importância também nos casos humanos, já que há alto índice de letalidade no Brasil, sendo especialmente importante em pacientes com HIV (Human Immunodeficiency Viruses), uma vez que a coinfecção com leishmaniose visceral acelera o aparecimento dos primeiros sintomas da SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida) e reduz a expectativa de vida de pacientes infectados com o vírus (Thakur S, Joshi J, Kaur S. Leishmaniasis diagnosis: an update on the use of parasitological, immunological and molecular methods [published online ahead of print, 2020 Mar 16] . J Parasit Dis. 2020;44(2):1‐20).[008] Early diagnosis is also of paramount importance in human cases, since there is a high lethality rate in Brazil, being especially important in patients with HIV (Human Immunodeficiency Viruses), since co-infection with visceral leishmaniasis accelerates the appearance of first symptoms of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) and reduces the life expectancy of patients infected with the virus (Thakur S, Joshi J, Kaur S. Leishmaniasis diagnosis: an update on the use of parasitological, immunological and molecular methods [published online ahead of print, 2020 Mar 16] . J Parasit Dis. 2020;44(2):1‐20).
[009] O diagnóstico clínico da leishmaniose visceral humana é pouco útil, pois existem casos assintomáticos, e os casos brandos ou mesmo graves apresentam sinais e sintomas comuns a outras doenças como, por exemplo, malária, doenças de Chagas, leucemia, toxoplasmose e esquistossomose. Dessa forma, os métodos laboratoriais são a única forma de confirmação do diagnóstico.[009] The clinical diagnosis of human visceral leishmaniasis is not very useful, as there are asymptomatic cases, and mild or even severe cases have signs and symptoms common to other diseases, such as malaria, Chagas disease, leukemia, toxoplasmosis and schistosomiasis. . Thus, laboratory methods are the only way to confirm the diagnosis.
[0010] O diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral canina é normalmente baseado em técnicas parasitológicas e sorológicas. Os testes de diagnóstico sorológicos recomendados pelo Ministério da Saúde são os testes imunocromatográfico de duplo percurso (DPP® CVL rapid test - manufaturado por Bio-Manguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro), como triagem, e o ELISA com extrato total, como teste confirmatório. Os testes disponíveis no momento na rede pública de saúde brasileira para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana são a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o imunocromatográfico OnSiteTM Leishmania – Beijing Genese Biotech Inc, que utiliza rK39 e K28 como antígenos.[0010] The laboratory diagnosis of canine visceral leishmaniasis is usually based on parasitological and serological techniques. The serological diagnostic tests recommended by the Ministry of Health are the dual-path immunochromatographic tests (DPP® CVL rapid test - manufactured by Bio-Manguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro), as a screening, and the ELISA with total extract, as a confirmatory test. . The tests currently available in the Brazilian public health network for the diagnosis of human visceral leishmaniasis are the indirect immunofluorescence reaction (IFAR) and the immunochromatographic OnSiteTM Leishmania – Beijing Genese Biotech Inc, which uses rK39 and K28 as antigens.
[0011] As técnicas moleculares são ferramentas úteis no diagnóstico da leishmaniose visceral em casos com resultados inconclusivos, sendo possível a realização em laboratórios de referência a fim de ter a confirmação do diagnóstico. É possível obter resultados altamente sensíveis e específicos utilizando a técnica de PCR em tempo real. Entretanto, o uso de PCR é uma ferramenta valiosa para estudos moleculares e epidemiológicos, sendo pouco utilizado na rotina laboratorial por ser um método de difícil execução, alto custo, inviável em laboratório com baixa infraestrutura e de difícil execução no campo.[0011] Molecular techniques are useful tools in the diagnosis of visceral leishmaniasis in cases with inconclusive results, being possible to perform in reference laboratories in order to have the diagnosis confirmation. It is possible to obtain highly sensitive and specific results using the real-time PCR technique. However, the use of PCR is a valuable tool for molecular and epidemiological studies, being little used in laboratory routine because it is a difficult method to perform, high cost, unfeasible in a laboratory with low infrastructure and difficult to perform in the field.
[0012] Nesse contexto, as técnicas sorológicas se mostram extremamente relevantes. O desenvolvimento de um antígeno bruto ou recombinante espécieespecífico de Leishmania é uma etapa valiosa para o diagnóstico sorológico, pois a sensibilidade e especificidade do teste dependem do antígeno utilizado.[0012] In this context, serological techniques are extremely relevant. The development of a Leishmania species-specific crude or recombinant antigen is a valuable step for serological diagnosis, as the sensitivity and specificity of the test depend on the antigen used.
[0013] Falhas no diagnóstico podem levar à morte de pacientes com leishmaniose visceral. Um método de diagnóstico confiável e eficiente para leishmaniose visceral requer a detecção de casos sintomáticos e assintomáticos, alta sensibilidade e especificidade, ser de fácil execução, baixo custo, viável em laboratório com baixa infraestrutura e de fácil execução no campo. Os testes diagnósticos atualmente disponíveis não atendem todos esses quesitos e ainda é possível alcançar sensibilidade e especificidade mais altas aprimorando os antígenos empregados. Além disso, é necessário desenvolver um método mais sensível para o diagnóstico de leishmaniose visceral em casos de coinfecção com HIV.[0013] Misdiagnosis can lead to death in patients with visceral leishmaniasis. A reliable and efficient diagnostic method for visceral leishmaniasis requires the detection of symptomatic and asymptomatic cases, high sensitivity and specificity, being easy to perform, low cost, feasible in the laboratory with low infrastructure and easy to perform in the field. The diagnostic tests currently available do not meet all these requirements and it is still possible to achieve higher sensitivity and specificity by improving the antigens used. In addition, it is necessary to develop a more sensitive method for the diagnosis of visceral leishmaniasis in cases of co-infection with HIV.
[0014] Em relação à prevenção da doença, é importante ressaltar que até o momento não existe no mundo uma vacina licenciada para leishmaniose visceral humana, mas somente contra a infecção em cães. A Leish-Tec®, que utiliza como antígeno recombinante a proteína A2, é a única vacina disponível comercialmente para uso em cães, no Brasil. A Leish-Tec® possui eficácia de 72%-80%, assim como as outras vacinas disponíveis na Europa (Canileish e Letifend). As vacinas Canileish e Leish-Tec são aplicadas em 3 doses, o que ainda é um inconveniente para se alcançar máxima proteção rapidamente e, portanto, ainda há espaço para melhorar a eficácia vacinal e a forma de administração das vacinas em cães.[0014] Regarding the prevention of the disease, it is important to note that so far there is no licensed vaccine in the world for human visceral leishmaniasis, but only against infection in dogs. Leish-Tec®, which uses the A2 protein as a recombinant antigen, is the only commercially available vaccine for use in dogs in Brazil. Leish-Tec® has an efficacy of 72%-80%, like the other vaccines available in Europe (Canileish and Letifend). Canileish and Leish-Tec vaccines are administered in 3 doses, which is still an inconvenience to achieve maximum protection quickly and, therefore, there is still room to improve vaccine efficacy and the way of administering vaccines in dogs.
[0015] A proteína quimérica da presente invenção, denominada DTL4, compreende fragmentos imunogênicos repetitivos das proteínas A2 e K39. A2 é expressa majoritariamente em formas amastigotas de espécies viscerotrópicas, sendo predominantemente composta por sequências repetitivas de 10 aminoácidos. K39 contém sequências repetitivas de 39 aminoácidos e está relacionada à cinesina de cinetoplasto de Leishmania.[0015] The chimeric protein of the present invention, called DTL4, comprises repetitive immunogenic fragments of the A2 and K39 proteins. A2 is mainly expressed in amastigote forms of viscerotropic species, being predominantly composed of repetitive sequences of 10 amino acids. K39 contains repeating sequences of 39 amino acids and is related to Leishmania kinesin kinesin.
[0016] Diversos estudos investigam a utilização de A2 e seus epítopos para uso vacinal (Resende D.M., Caetano B.C., Dutra M.S., et al (2008) Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: correlation with IFN-gamma and cytolytic activity by CD8+ T cells. Vaccine 26, 4585-4593; Coelho E.A., Tavares C.A., Carvalho F.A., et al (2003) Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect.Immun. 71, 3988-3994; Zanin F.H., Coelho E.A., Tavares C.A., et al (2007) Evaluation of immune responses and protection induced by A2 and nucleoside hydrolase (NH) DNA vaccines against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis experimental infections. Microbes.Infect. 9, 1070- 1077; Fernandes A.P., Costa M.M., Coelho E.A., et al (2008) Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein. Vaccine 26, 5888-5895; Fernandes AP, Coelho EA, Machado-Coelho GL, et al. 2012 Making an antiamastigote vaccine for visceral leishmaniasis: rational, update and perspectives. Curr Opin Microbiol.;15(4):476-85). A2 também vem sendo utilizada como antígeno alvo em vários ensaios para a detecção da leishmaniose visceral, sendo o único marcador proteico específico de amastigota em L. donovani (Coura-Vital W, Ker HG, Roatt BM, et al. Evaluation of change in canine diagnosis protocol adopted by the visceral leishmaniasis control program in Brazil and new proposal for diagnosis. PloS One. 2014; 9 (3): e91009; Technical note, N.11/2016/CPV/DFIP/DAS/GM/MAPA. [Internet] ; 2018. Available from: http://www.sbmt.org.br/portal/wp-content/uploads/2016/09/nota-tecnica.pdf; Sundar S, Rai M. Laboratory diagnosis of visceral Leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol. 2002; 9 (5): 951–958). Anticorpos anti-A2 podem ser detectados por ELISA em amostras de soro, tanto humano, quanto canino. A detecção varia entre 60 e 82% das amostras, sendo maior em indivíduos sintomáticos (Ghedin et al. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clin. Diagn. Lab. immunol. 4:530-535; Porrozzi et al. Comparative Evaluation of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays Based on Crude and Recombinant Leishmanial Antigens for Serodiagnosis of Symptomatic and Asymptomatic Leishmania infantum Visceral Infections in Dogs. Clin Vaccine Immunol. 2007;14(5):544–548).[0016] Several studies investigate the use of A2 and its epitopes for vaccine use (Resende D.M., Caetano B.C., Dutra M.S., et al (2008) Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: correlation with IFN -gamma and cytolytic activity by CD8+ T cells. Vaccine 26, 4585-4593; Coelho E.A., Tavares C.A., Carvalho F.A., et al (2003) Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 antigen, but not by the LACK antigen , are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect.Immun. 71, 3988-3994; Zanin F.H., Coelho E.A., Tavares C.A., et al (2007) Evaluation of immune responses and protection induced by A2 and nucleoside hydrolase (NH ) DNA vaccines against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis experimental infections. Microbes.Infect. 9, 1070-1077; Fernandes A.P., Costa M.M., Coelho E.A., et al (2008) Protective immunity against challenge with Leishmania ( Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein. Vaccine 26, 5888-5895; Fernandes AP, Coelho EA, Machado-Coelho GL, et al. 2012 Making an antiamastigote vaccine for visceral leishmaniasis: rational, update and perspectives. Curr Opin Microbiol.;15(4):476-85). A2 has also been used as a target antigen in several assays for the detection of visceral leishmaniasis, being the only amastigote-specific protein marker in L. donovani (Coura-Vital W, Ker HG, Roatt BM, et al. Evaluation of change in canine diagnosis protocol adopted by the visceral leishmaniasis control program in Brazil and new proposal for diagnosis. PloS One. 2014; 9 (3): e91009; Technical note, N.11/2016/CPV/DFIP/DAS/GM/MAPA. [Internet] ] ; 2018. Available from: http://www.sbmt.org.br/portal/wp-content/uploads/2016/09/nota-tecnica.pdf; Sundar S, Rai M. Laboratory diagnosis of visceral Leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol. 2002; 9(5): 951-958 ). Anti-A2 antibodies can be detected by ELISA in both human and canine serum samples. Detection varies between 60 and 82% of samples, being higher in symptomatic individuals (Ghedin et al. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clin. Diagn. Lab. immunol. 4:530- 535; Porrozzi et al. Comparative Evaluation of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays Based on Crude and Recombinant Leishmanial Antigens for Serodiagnosis of Symptomatic and Asymptomatic Leishmania infantum Visceral Infections in Dogs. Clin Vaccine Immunol. 2007;14(5):544–548).
[0017] A proteína K39 é o antígeno recombinante utilizado no teste rápido disponível na rede pública de saúde brasileira. Esse teste consiste em um ensaio imunocromatográfico e apresenta sensibilidade e especificidade de 91,2% e 94,5%, respectivamente. Em testes por ELISA, o diagnóstico com rK39 apresenta sensibilidade e especificidade de até 98% e 100%, respectivamente.[0017] The K39 protein is the recombinant antigen used in the rapid test available in the Brazilian public health network. This test consists of an immunochromatographic assay and has a sensitivity and specificity of 91.2% and 94.5%, respectively. In ELISA tests, diagnosis with rK39 has sensitivity and specificity of up to 98% and 100%, respectively.
[0018] No entanto, a sensibilidade de testes utilizando esse antígeno é significativamente reduzida em pacientes com coinfecção com HIV. Bangert e colaboradores, por exemplo, descrevem que a sensibilidade do teste rápido imunocromatográfico baseado em rK39 foi de 83.1% em pacientes HIV negativos e 67.3% em pacientes HIV-positivos (Bangert M, Flores-Chávez MD, Llanes-Acevedo IP et al. Validation of rK39 immunochromatographic test and direct agglutination test for the diagnosis of Mediterranean visceral leishmaniasis in Spain. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Mar; 12(3):e0006277). Já Cota e colaboradores relatam em pacientes HIV positivos uma sensibilidade de 60.9% e 45.6% para testes imunocromatográfico e de imunofluorescência indireta (IFA) baseados em K39, respectivamente (Cota GF, de Sousa MR, de Freitas Nogueira BM, et al. Comparison of parasitological, serological, and molecular tests for visceral leishmaniasis in HIV-infected patients: a cross-sectional delayed-type study. Am J Trop Med Hyg. 2013 Sep; 89(3):570-7.).[0018] However, the sensitivity of tests using this antigen is significantly reduced in patients with HIV coinfection. Bangert et al., for example, report that the sensitivity of the rK39-based rapid immunochromatographic test was 83.1% in HIV-negative patients and 67.3% in HIV-positive patients (Bangert M, Flores-Chávez MD, Llanes-Acevedo IP et al. Validation of rK39 immunochromatographic test and direct agglutination test for the diagnosis of Mediterranean visceral leishmaniasis in Spain. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Mar; 12(3):e0006277). Cota et al. reported in HIV positive patients a sensitivity of 60.9% and 45.6% for immunochromatographic and indirect immunofluorescence (IFA) tests based on K39, respectively (Cota GF, de Sousa MR, de Freitas Nogueira BM, et al. Comparison of parasitological, serological, and molecular tests for visceral leishmaniasis in HIV-infected patients: a cross-sectional delayed-type study. Am J Trop Med Hyg. 2013 Sep; 89(3):570-7.).
[0019] Além disso, quando usado para diagnóstico de leishmaniose visceral em cães assintomáticos, os ensaios por ELISA com rK39 também apresentam sensibilidade e especificidade reduzida, com valores em torno de 69,4% e 96%, respectivamente (Reithinger R, Quinnell RJ, Alexander B, et al. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbent assay, and PCR. J Clin Microbiol. 2002; 40 (7): 2352-2356; Mettler M, Grimm F, Capelli G, et al. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays, an immunofluorescent-antibody test, and two rapid tests (immunochromatographicdipstick and gel tests) for serological diagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infection in dogs. J Clin Microbiol. 2005; 43 (11): 5515-5519; Grimaldi GJr, Teva A, Ferreira AL, et al. Evaluation of a novel chromatographic immunoassay based on Dual-Path Platform technology (DPP® CVL rapid test) for the serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2012; 106 (1): 54-59; Laurenti MD, de Santana LMVJr, Tomokane TY, et al. Comparative evaluation of the DPP®CVL rapid test for canine serodiagnosis in area of visceral leishmaniasis. Vet Parasitol. 2014; 205 (3-4): 444-450.).[0019] In addition, when used for diagnosing visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs, rK39 ELISA assays also have reduced sensitivity and specificity, with values around 69.4% and 96%, respectively (Reithinger R, Quinnell RJ , Alexander B, et al. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: a comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbent assay, and PCR. J Clin Microbiol. 2002; 40 (7): 2352-2356; Mettler M , Grimm F, Capelli G, et al.Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays, an immunofluorescent-antibody test, and two rapid tests (immunochromatographicdipstick and gel tests) for serological diagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infection in dogs.J Clin Microbiol. 2005; 43 (11): 5515-5519; Grimaldi GJr, Teva A, Ferreira AL, et al. Evaluation of a novel chromatographic immunoassay based on Dual-Path Platform technology (DPP® CVL rapid test) for the serodiagnosis of can ine visceral leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2012; 106 (1): 54-59; Laurenti MD, de Santana LMVJr, Tomokane TY, et al. Comparative evaluation of the DPP®CVL rapid test for canine serodiagnosis in the area of visceral leishmaniasis. Vet Parasitol. 2014; 205 (3-4): 444-450.).
[0020] Apesar de K39 ser utilizado em teste diagnósticos, esse antígeno não é normalmente utilizado em formulações vacinais. Segundo Reed e colaboradores, 2018, a maioria dos componentes imunodominantes de Leishmania, como os antígenos repetitivos representados por K39, não são capazes de induzir proteção em modelos animais, independente da formulação de adjuvante ou forma de inoculação (Reed et al, Leishmania Vaccine Development: Exploiting the Host-Vector-Parasite Interface. 2018).[0020] Although K39 is used in diagnostic tests, this antigen is not normally used in vaccine formulations. According to Reed et al., 2018, most of the immunodominant components of Leishmania, such as the repetitive antigens represented by K39, are not able to induce protection in animal models, regardless of the adjuvant formulation or inoculation method (Reed et al, Leishmania Vaccine Development : Exploiting the Host-Vector-Parasite Interface. 2018).
[0021] As proteínas A2 e K39 já foram anteriormente utilizadas em combinação para uso diagnóstico, mas não na forma de proteína quimérica como na presente invenção. Abaixo estão citados estudos que fazem uso desses dois antígenos em conjunto.[0021] Proteins A2 and K39 have previously been used in combination for diagnostic use, but not in the chimeric protein form as in the present invention. Below are cited studies that make use of these two antigens together.
[0022] O documento de patente PI1013447-6 - Peptídeos recombinantes, método e kit para teste imunodiagnóstico de leishmaniose, por exemplo, se refere a uma composição e kit para diagnosticar leishmaniose visceral utilizando como base a associação dos antígenos recombinantes A2 e rK39. Mais especificamente, são utilizados epítopos desses antígenos, denominados peptídeos 47 e 13, respectivamente. Esses peptídeos foram sintetizados isoladamente e testados em associação (adsorvidos em um mesmo poço da placa de microtitulação)[0022] Patent document PI1013447-6 - Recombinant peptides, method and kit for immunodiagnostic test of leishmaniasis, for example, refers to a composition and kit for diagnosing visceral leishmaniasis based on the association of recombinant antigens A2 and rK39. More specifically, epitopes of these antigens, called peptides 47 and 13, respectively, are used. These peptides were synthesized alone and tested in association (adsorbed in the same well of the microtiter plate)
[0023] Costa e colaboradores avaliaram combinações de peptídeos derivados de A2, K39, NH e LACK buscando otimizar o imunodiagnóstico de leishmaniose visceral humana e canina (Costa et al. Improved canine and human visceral leishmaniasis immunodiagnosis using combinations of synthetic peptides in enzyme-linked immunosorbent assay. PLoS neglected tropical diseases vol. 6,5 (2012): e1622). Foram utilizados peptídeos sintéticos, isoladamente ou combinados em uma mesma reação. A combinação dos peptídeos 13 (derivado de A2) e 47 (derivado de K39) resultou em um aumento de sensibilidade e especificidade no teste de ELISA utilizando soros caninos com baixos títulos de anticorpos. Vale destacar que a sensibilidade do peptídeo 47 não foi afetada pela combinação com o peptídeo 13 em soros caninos com níveis intermediários de anticorpos, se mantendo em 85%. Em humanos, a combinação dos peptídeos 13 e 47 resultou em aumento de sensibilidade e especificidade em pacientes na fase aguda de infecção, atingindo 100% e 96%, respectivamente.[0023] Costa et al. evaluated combinations of peptides derived from A2, K39, NH and LACK seeking to optimize the immunodiagnosis of human and canine visceral leishmaniasis (Costa et al. Improved canine and human visceral leishmaniasis immunodiagnosis using combinations of synthetic peptides in enzyme-linked immunosorbent assay PLoS neglected tropical diseases vol 6,5 (2012): e1622). Synthetic peptides were used, alone or combined in the same reaction. The combination of peptides 13 (derived from A2) and 47 (derived from K39) resulted in an increase in sensitivity and specificity in the ELISA test using canine sera with low antibody titers. It is worth noting that the sensitivity of peptide 47 was not affected by the combination with peptide 13 in canine sera with intermediate levels of antibodies, remaining at 85%. In humans, the combination of peptides 13 and 47 resulted in increased sensitivity and specificity in patients in the acute phase of infection, reaching 100% and 96%, respectively.
[0024] Existem também no estado da técnica estudos que tratam do uso vacinal ou diagnóstico de proteínas quiméricas obtidas a partir da fusão de A2 ou K39 (ou seus epítopos) a outros peptídeos. Vale ressaltar que é conhecido no estado da arte que a combinação de dois ou mais antígenos, obtidos de forma isolada, pode aumentar a resposta imunológica induzida por composições vacinais ou a capacidade de detecção de kits diagnóstico. No entanto, a combinação de dois ou mais antígenos na forma de uma proteína quimérica não segue a mesma premissa, uma vez que a quimera obtida apresenta estrutura tridimensional única e imprevisível, o que pode alterar completamente a sua capacidade de ligação a anticorpos, podendo tanto aumentar quanto reduzir a antigenicidade e/ou a capacidade de detecção sorológica de anticorpos em uma amostra biológica (Hollingshead et al. Structure-based design of chimeric antigens for multivalent protein vaccines. Nat Commun 9, 1051 (2018)).[0024] There are also studies in the state of the art dealing with the vaccine or diagnostic use of chimeric proteins obtained from the fusion of A2 or K39 (or their epitopes) to other peptides. It is worth mentioning that it is known in the state of the art that the combination of two or more antigens, obtained in isolation, can increase the immune response induced by vaccine compositions or the detection capacity of diagnostic kits. However, the combination of two or more antigens in the form of a chimeric protein does not follow the same premise, since the chimera obtained has a unique and unpredictable three-dimensional structure, which can completely alter its ability to bind antibodies. increase or decrease the antigenicity and/or serological detectability of antibodies in a biological sample (Hollingshead et al. Structure-based design of chimeric antigens for multivalent protein vaccines. Nat Commun 9, 1051 (2018)).
[0025] Há também relatada a aplicação de diferentes proteínas recombinantes para o diagnóstico sorológico de Leishmaniose Visceral em humanos e cães, mais especificamente, proteínas recombinantes desenvolvidas a partir das proteínas recombinantes rkE16, rk26, rK39 e rA2 foram relatadas (Farahmand M, Nahrevanian, H. (2016). Application of Recombinant Proteins for Serodiagnosis of Visceral Leishmaniasis in Humans and Dogs. Iranian Biomedical Journal 20(3): 128-134 July 2016. doi: 10.7508/ibj.2016.03.001). Há ainda no estado da técnica o desenvolvimento de ensaio imunoenzimático (ELISA) e testes imunocromatográficos (ICT) para o diagnóstico sorológico de LV humana (LVH) e LV canina (LVC), a partir do uso de três proteínas recombinantes de Leishmania infantum (rFc, rC9 e rA2) selecionadas a partir de análises proteômicas e genômicas (dos Santos ARR, Serufo AV, Figueiredo MM, Godoi LC, Vitorio JG, Marcelino AP, de Avelar DM, Rodrigues FTG, Machado-Coelho GLL, Medeiros FAC, Jerônimo SMB, de Oliveira EJ, Nascimento FC, Texeira SMR, Gazzinelli RT, Nagem RAP, Fernandes AP. (2019). Evaluation of three recombinant proteins for the development of ELISA and immunochromatographic tests for visceral leishmaniasis serodiagnosis. Memória Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 114: e180405, 2019).[0025] There has also been reported the application of different recombinant proteins for the serological diagnosis of Visceral Leishmaniasis in humans and dogs, more specifically, recombinant proteins developed from the recombinant proteins rkE16, rk26, rK39 and rA2 have been reported (Farahmand M, Nahrevanian, H. (2016). Application of Recombinant Proteins for Serodiagnosis of Visceral Leishmaniasis in Humans and Dogs. Iranian Biomedical Journal 20(3): 128-134 July 2016. doi: 10.7508/ibj.2016.03.001 ). There is still in the state of the art the development of enzyme immunoassay (ELISA) and immunochromatographic tests (ICT) for the serological diagnosis of human VL (LVH) and canine VL (LVC), using three recombinant proteins of Leishmania infantum (rFc , rC9 and rA2) selected from proteomic and genomic analyzes (dos Santos ARR, Serufo AV, Figueiredo MM, Godoi LC, Vitorio JG, Marcelino AP, de Avelar DM, Rodrigues FTG, Machado-Coelho GLL, Medeiros FAC, Jerônimo SMB , de Oliveira EJ, Nascimento FC, Texeira SMR, Gazzinelli RT, Nagem RAP, Fernandes AP. (2019). Evaluation of three recombinant proteins for the development of ELISA and immunochromatographic tests for visceral leishmaniasis serodiagnosis. Memória Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro , Vol. 114: e180405, 2019).
[0026] A patente US8911746 - Recombinant polyprotein vaccines for the treatment and diagnosis of leishmaniasis, por exemplo, descreve polipeptídeos de fusão compreendendo combinações dos antígenos A2, KMP11, SMT e CPB (ou porções imunogênicas ou variantes das mesmas) para uso na prevenção, tratamento e detecção de leishmaniose. Esses mesmos antígenos são utilizados na construção da proteína quimérica revelada na patente US10364274 - Expression of chimeric KSAC protein and method of producing soluble proteins by high pressure, que descreve uma composição vacinal compreendendo tal proteína quimérica e um método de produção da mesma utilizando alta pressão.[0026] Patent US8911746 - Recombinant polyprotein vaccines for the treatment and diagnosis of leishmaniasis, for example, describes fusion polypeptides comprising combinations of the A2, KMP11, SMT and CPB antigens (or immunogenic portions or variants thereof) for use in the prevention, treatment and detection of leishmaniasis. These same antigens are used in the construction of the chimeric protein disclosed in patent US10364274 - Expression of chimeric KSAC protein and method of producing soluble proteins by high pressure, which describes a vaccine composition comprising such a chimeric protein and a method of producing the same using high pressure.
[0027] A patente US9909114 - Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis, descreve um peptídeo de fusão para uso vacinal compreendendo polipeptideos ou variantes de NH e SMT combinados a polipeptideos ou variantes de CPB, mtHSP70, H2BN, A2, p21 ou LeiF.[0027] Patent US9909114 - Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis, describes a fusion peptide for vaccine use comprising polypeptides or variants of NH and SMT combined with polypeptides or variants of CPB, mtHSP70, H2BN, A2, p21 or LeiF.
[0028] A patente US8771710 - Fusion proteins and their use in the diagnosis and treatment of leishmaniasis, descreve método para diagnóstico de leishmaniose visceral canina ou humana baseado em uma proteína quimérica denominada rK28. rK28 é formada por porções imunogênicas dos peptídeos rK39, rK9 e rK26. A porção de rK39 utilizada compreende os resíduos 2110- 2343 de K39 de L. donovani. Os resultados obtidos sugerem que rK28 detecta casos assintomáticos ou subclínicos de leishmaniose com maior sensibilidade que os respectivos antígenos que formam a proteína quimérica isoladamente. A patente descreve ainda um possível uso vacinal dessa proteína. Vale ressaltar que rK28 é utilizada no teste Dual-Path Platform (DPP®) CVL rapid test.[0028] Patent US8771710 - Fusion proteins and their use in the diagnosis and treatment of leishmaniasis, describes a method for diagnosing canine or human visceral leishmaniasis based on a chimeric protein called rK28. rK28 is formed by immunogenic portions of peptides rK39, rK9 and rK26. The portion of rK39 used comprises residues 2110-2343 of K39 from L. donovani. The results obtained suggest that rK28 detects asymptomatic or subclinical cases of leishmaniasis with greater sensitivity than the respective antigens that form the chimeric protein alone. The patent also describes a possible vaccine use of this protein. It is worth mentioning that rK28 is used in the Dual-Path Platform (DPP®) CVL rapid test.
[0029] Boarino e colaboradores também desenvolveram uma proteína quimérica multiepítopo formada pelos antígenos K26, K9 e K39. Entretanto, foi utilizado nessa construção um fragmento correspondente a uma única subunidade de 39 aminoácidos de K39. Esses autores avaliaram o uso dessa proteína quimérica no diagnóstico sorológico de leishmaniose visceral (Boarino et al. Development of Recombinant Chimeric Antigen Expressing Immunodominant B Epitopes of Leishmania infantum for Serodiagnosis of Visceral Leishmaniasis, 12(5), 647–653. 2005).[0029] Boarino and collaborators also developed a multiepitope chimeric protein formed by the K26, K9 and K39 antigens. However, a fragment corresponding to a single subunit of 39 amino acids of K39 was used in this construction. These authors evaluated the use of this chimeric protein in the serological diagnosis of visceral leishmaniasis (Boarino et al. Development of Recombinant Chimeric Antigen Expressing Immunodominant B Epitopes of Leishmania infantum for Serodiagnosis of Visceral Leishmaniasis, 12(5), 647–653. 2005).
[0030] Em vista da necessidade de um ensaio para diagnóstico de leishmaniose visceral humana e canina que seja rápido, e possua boa precisão e exatidão, a presente tecnologia consiste de um método e um kit para diagnóstico sorológico de leishmaniose visceral, baseados em uma proteína quimérica, que permite a determinação qualitativa de anticorpos IgG anti-Leishmania em soro ou plasma canino e humano. Anticorpos específicos para Leishmania infantum, quando presentes na amostra, se ligam aos antígenos recombinantes imobilizados na placa, formando complexos antígeno-anticorpo que são posteriormente identificados por enzima e substrato. O método diagnóstico da presente invenção é um método confiável e eficiente, de fácil execução, baixo custo, viável em laboratório com baixa infraestrutura e de fácil execução no campo.[0030] In view of the need for an assay for the diagnosis of human and canine visceral leishmaniasis that is fast, and has good precision and accuracy, the present technology consists of a method and a kit for the serological diagnosis of visceral leishmaniasis, based on a protein chimeric, which allows the qualitative determination of anti-Leishmania IgG antibodies in canine and human serum or plasma. Antibodies specific to Leishmania infantum, when present in the sample, bind to recombinant antigens immobilized on the plate, forming antigen-antibody complexes that are later identified by enzyme and substrate. The diagnostic method of the present invention is a reliable and efficient method, easy to perform, low cost, feasible in the laboratory with low infrastructure and easy to perform in the field.
[0031] Em vista da ausência de uma vacina disponível para leishmaniose visceral humana e da necessidade de melhoramento vacinal para a vacina canina (vacinas disponíveis para cães apresentam 70-80% de eficácia em testes clínicos), a proteína de fusão da presente invenção pode ainda compor formulações vacinais contra leishmaniose visceral humana e canina. Devido à crescente evidência do surgimento de resistência ao tratamento para leishmaniose, o que limita o número dos já escassos fármacos disponíveis, uma vacina profilática eficaz seria a melhor forma de reduzir a infecção e doença. Uma vacina terapêutica seria também de grande valia para desenvolver um tratamento mais eficaz.[0031] In view of the absence of a vaccine available for human visceral leishmaniasis and the need for vaccine improvement for the canine vaccine (vaccines available for dogs show 70-80% efficacy in clinical trials), the fusion protein of the present invention can to compose vaccine formulations against human and canine visceral leishmaniasis. Due to the growing evidence of the emergence of resistance to treatment for leishmaniasis, which limits the number of already scarce drugs available, an effective prophylactic vaccine would be the best way to reduce infection and disease. A therapeutic vaccine would also be of great help in developing a more effective treatment.
[0032] A proteína quimérica DTL4, de que trata a presente invenção, foi construída após extensa experimentação e é o resultado da fusão de fragmentos imunogênicos repetitivos das proteínas A2 e K39. Dentre as vantagens de utilizar uma proteína quimérica ao invés de vários peptídeos sintéticos ou de duas proteínas recombinantes separadamente estão a maior facilidade, rastreabilidade e menor custo de produção, além da maior homogeneidade entre diferentes lotes.[0032] The chimeric protein DTL4, which the present invention deals with, was constructed after extensive experimentation and is the result of the fusion of repetitive immunogenic fragments of the A2 and K39 proteins. Among the advantages of using a chimeric protein instead of several synthetic peptides or two recombinant proteins separately are greater ease, traceability and lower production cost, in addition to greater homogeneity between different batches.
[0033] Em relação ao uso diagnóstico, a estrutura secundária formada por vários peptídeos alinhados e ligados covalentemente levou ao aumento da sensibilidade e especificidade do teste utilizando DTL4 comparado aos antígenos A2 e K39, possibilitando melhor detecção de IgG anti-Leishmania infantum inclusive em pacientes HIV positivos, sem interferência de outras doenças como leishmaniose cutânea, doença de Chagas, fator reumatoide aumentado, lúpus, malária, paracoccidioidomicose, sífilis, tuberculose e toxoplasmose.[0033] Regarding diagnostic use, the secondary structure formed by several aligned and covalently linked peptides led to increased sensitivity and specificity of the test using DTL4 compared to A2 and K39 antigens, allowing better detection of anti-Leishmania infantum IgG even in patients HIV positive, without interference from other diseases such as cutaneous leishmaniasis, Chagas disease, increased rheumatoid factor, lupus, malaria, paracoccidioidomycosis, syphilis, tuberculosis and toxoplasmosis.
[0034] Em relação ao uso vacinal, a imunização com DTL4 resultou em uma redução significativa da carga parasitária no baço e fígado dos animais imunizados, evidenciando a capacidade dessa proteína quimérica em induzir proteção para leishmaniose visceral. Além disso, observou-se maior produção de IgG2a após a imunização com DTL4 se comparado à imunização com A2, sugerindo que a proteína da presente invenção possui um maior potencial de desencadear um perfil de resposta Th1 em camundongos, característica valiosa em um candidato vacinal contra a leishmaniose. A vacina da presente invenção pode ainda ser utilizada no tratamento da leishmaniose.[0034] Regarding vaccine use, immunization with DTL4 resulted in a significant reduction in the parasite load in the spleen and liver of immunized animals, evidencing the ability of this chimeric protein to induce protection against visceral leishmaniasis. In addition, higher IgG2a production was observed after immunization with DTL4 compared to immunization with A2, suggesting that the protein of the present invention has a greater potential to trigger a Th1 response profile in mice, a valuable feature in a vaccine candidate against to leishmaniasis. The vaccine of the present invention can also be used in the treatment of leishmaniasis.
[0035] A presente invenção tem por objetivo prover uma proteína, definida pela SEQ ID NO 1, para diagnóstico, profilaxia e tratamento de leishmaniose visceral em humanos e cães.[0035] The present invention aims to provide a protein, defined by SEQ ID NO 1, for the diagnosis, prophylaxis and treatment of visceral leishmaniasis in humans and dogs.
[0036] A referida proteína está na forma de construção de uma proteína quimérica compreendendo antígenos eficientes para o diagnóstico, profilaxia e tratamento da leishmaniose visceral.[0036] Said protein is in the form of a chimeric protein construct comprising efficient antigens for the diagnosis, prophylaxis and treatment of visceral leishmaniasis.
[0037] Particularmente, a presente invenção se refere ao fornecimento e uso de uma proteína quimérica para diagnóstico, profilaxia e tratamento de leishmaniose visceral em humanos e cães.[0037] Particularly, the present invention relates to the provision and use of a chimeric protein for the diagnosis, prophylaxis and treatment of visceral leishmaniasis in humans and dogs.
[0038] Em uma primeira concretização, a presente invenção se refere a uma proteína quimérica compreendendo regiões antigênicas de proteínas eficientes para o diagnóstico de leishmaniose visceral, inclusive em pacientes coinfectados com HIV.[0038] In a first embodiment, the present invention relates to a chimeric protein comprising antigenic regions of proteins efficient for the diagnosis of visceral leishmaniasis, including in patients coinfected with HIV.
[0039] Em uma segunda concretização, a presente invenção fornece um kit para o diagnóstico de leishmaniose visceral, o kit compreendendo:
- a) a proteína quimérica da presente invenção;
- b) um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados ou não a uma enzima ou a um marcador; e
- c) um reagente para detectar o anticorpo secundário ou a proteína.
- a) the chimeric protein of the present invention;
- b) a secondary antibody or a protein, whether or not conjugated to an enzyme or a label; and
- c) a reagent to detect the secondary antibody or protein.
[0040] Em uma terceira concretização, a presente invenção fornece um método para diagnóstico de leishmaniose visceral compreendendo as etapas de:
- a) expor uma amostra à proteína quimérica da presente invenção;
- b) identificar as amostras contendo anticorpos reativos à proteína quimérica apontada acima utilizando reagentes apropriados.
- a) exposing a sample to the chimeric protein of the present invention;
- b) identifying the samples containing antibodies reactive to the chimeric protein noted above using appropriate reagents.
[0041] Em uma terceira concretização, a presente invenção fornece o uso da referida proteína quimérica na preparação de uma composição para a profilaxia e tratamento de leishmaniose visceral humana e canina.[0041] In a third embodiment, the present invention provides the use of said chimeric protein in the preparation of a composition for the prophylaxis and treatment of human and canine visceral leishmaniasis.
[0042] Em uma quarta concretização, a presente invenção fornece uma composição de vacina compreendendo a proteína definida pela SEQ ID NO 1 para profilaxia e tratamento de leishmaniose visceral humana e canina.[0042] In a fourth embodiment, the present invention provides a vaccine composition comprising the protein defined by SEQ ID NO 1 for the prophylaxis and treatment of human and canine visceral leishmaniasis.
[0043] Nas descrições a seguir, a proteína definida pela SEQ ID NO 1 encontra-se referenciada como DTL4.[0043] In the descriptions below, the protein defined by SEQ ID NO 1 is referred to as DTL4.
[0044] A Figura 1 se refere ao teste de expressão e solubilidade para a etapa de purificação da proteína quimérica DTL4. O asterisco e a seta sinalizam a expressão de DTL4 solúvel em células de Escherichia coli BL21 (DE3).[0044] Figure 1 refers to the expression and solubility test for the purification step of the chimeric protein DTL4. The asterisk and arrow signal the expression of soluble DTL4 in Escherichia coli BL21 (DE3) cells.
[0045] A Figura 2 se refere ao teste de cromatografia de afinidade em uma coluna HisTrap HP (GE) de 5ml no sistema Akta. O asterisco indica a eluição de DTL4 na faixa de 40 kDa.[0045] Figure 2 refers to the affinity chromatography test on a 5ml HisTrap HP (GE) column in the Akta system. The asterisk indicates the elution of DTL4 in the 40 kDa range.
[0046] A Figura 3 se refere à etapa de purificação de DTL4. Pode-se observar a faixa de 40kDa indicando a DTL4 purificada.[0046] Figure 3 refers to the DTL4 purification step. The 40kDa band can be seen indicating purified DTL4.
[0047] A Figura 4 se refere a ensaios de ELISA para detecção de IgG total anti-DTL4 em soros de pacientes e cães. (A) Detecção de IgG anti-DTL4 em um pool de amostras de soros de paciente positivos (n=10) e negativos (n=10) para leishmaniose visceral, utilizando diferentes concentrações da proteína DTL4. (B) Comparação do desempenho de DTL4, A2 e K39 na detecção de IgG anti-DTL4 em um pool de amostras de soros de paciente positivos (Pos) (n=10) e negativos (Neg) (n=10) para leishmaniose visceral, utilizando diferentes diluições de proteína (C) Avaliação do ELISA-DTL4 usando 469 amostras de pacientes (154 positivas e 315 negativas). A linha pontilhada representa o ponto de corte. Todas as amostras positivas foram diagnosticadas por reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ELISA in house com rK39 e/ou imunocromatografia - It Leish® (rK39). (D) Detecção de IgG anti-DTL4 em um pool de amostras de soros de cães positivos (Pos) (n=10) e negativos (Neg) (n=10) para leishmaniose visceral, utilizando diferentes concentrações da proteína DTL4 (E) Comparação do desempenho de DTL4, A2 e K39 na detecção de IgG anti-DTL4 em um pool de amostras de soros de cães positivos (Pos) (n=10) e negativos (Neg) (n=10) para leishmaniose visceral, utilizando diferentes diluições de proteína.[0047] Figure 4 refers to ELISA assays for detection of anti-DTL4 total IgG in patient and dog sera. (A) Detection of anti-DTL4 IgG in a pool of patient sera samples positive (n=10) and negative (n=10) for visceral leishmaniasis, using different concentrations of the DTL4 protein. (B) Comparison of the performance of DTL4, A2 and K39 in detecting anti-DTL4 IgG in a pool of positive (Pos) (n=10) and negative (Neg) (n=10) patient sera samples for visceral leishmaniasis , using different protein dilutions (C) ELISA-DTL4 evaluation using 469 patient samples (154 positive and 315 negative). The dotted line represents the cut point. All positive samples were diagnosed by indirect immunofluorescence reaction (IFAT), in-house ELISA with rK39 and/or immunochromatography - It Leish® (rK39). (D) Detection of anti-DTL4 IgG in a pool of sera samples from positive (Pos) (n=10) and negative (Neg) (n=10) dogs for visceral leishmaniasis, using different concentrations of the DTL4 protein (E) Comparison of the performance of DTL4, A2 and K39 in the detection of anti-DTL4 IgG in a pool of sera samples from positive (Pos) (n=10) and negative (Neg) (n=10) dogs for visceral leishmaniasis, using different protein dilutions.
[0048] A Figura 5 se refere a um ensaio de ELISA para detecção de IgG total anti-DTL4 em soros de pacientes HVL+/HIV- (n=167), HVL+/HIV+ (n = 62) e de doadores saudáveis (negativos) (n=169). Todas as amostras positivas foram diagnosticadas por teste parasitológico e de HIV. A linha pontilhada representa o ponto de corte. HVL =leishmaniose visceral humana. HIV = vírus da imunodeficiência humana.[0048] Figure 5 refers to an ELISA assay for detection of anti-DTL4 total IgG in sera from HVL+/HIV- (n=167), HVL+/HIV+ (n=62) and healthy (negative) donors. (n=169). All positive samples were diagnosed by parasitological and HIV test. The dotted line represents the cut point. HVL = human visceral leishmaniasis. HIV = human immunodeficiency virus.
[0049] A Figura 6 se refere a um ensaio de ELISA para detecção de IgG anti-DTL4 em amostra de soro de pacientes com Leishmaniose visceral (controle positivo), Leishmaniose cutânea, Doença de Chagas, Fator reumatoide, Lúpus, Malária, Paracoccidiodoimicose, Sífilis, Tuberculose, Toxoplasmose. Amostras de doadores saudáveis foram usadas como controle negativo.[0049] Figure 6 refers to an ELISA assay for detection of anti-DTL4 IgG in a serum sample from patients with Visceral Leishmaniasis (positive control), Cutaneous Leishmaniasis, Chagas Disease, Rheumatoid Factor, Lupus, Malaria, Paracoccidioidomycosis, Syphilis, Tuberculosis, Toxoplasmosis. Samples from healthy donors were used as a negative control.
[0050] A Figura 7 corresponde ao esquema de interpretação dos resultados do teste rápido para detectar IgG anti-Leishmania infantum. No painel à esquerda (A) foi desenvolvido um esquema de teste rápido para detecção de IgG anti-L. infantum. Uma amostra positiva e uma amostra negativa estão representadas em B e C, respectivamente.[0050] Figure 7 corresponds to the interpretation scheme of the results of the rapid test to detect IgG anti-Leishmania infantum. In the left panel (A) a rapid test scheme for detecting IgG anti-L. infantum. A positive sample and a negative sample are represented in B and C, respectively.
[0051] A Figura 8 corresponde à resposta específica das imunoglobulinas IgG total e IgG2a induzidos à (A) DTL4 e à (B) A2 30 dias após a última imunização. Diferenças estatísticas p<0,05, analisadas por ANOVA: (a) Salina (b) Poly-IC (c) A2+CPG+Alumen (d) DTL4+Poly-IC (e) DTL4+CPG+Alumen.[0051] Figure 8 corresponds to the specific immunoglobulin total IgG and IgG2a response induced to (A) DTL4 and (B) A2 30 days after the last immunization. Statistical differences p<0.05, analyzed by ANOVA: (a) Saline (b) Poly-IC (c) A2+CPG+Alumen (d) DTL4+Poly-IC (e) DTL4+CPG+Alumen.
[0052] A Figura 9 corresponde aos níveis de (A) INF-γ e de (B) IL-10 em sobrenadantes de esplenócitos de camundongos Balb/c 30 dias após a última imunização. As culturas foram estimuladas por 48 horas com DTL4 ou RPMI. Diferenças estatísticas p<0,05, analisadas por ANOVA: (a) Salina (b) A2+CPG+Alumen (c) DTL4+CPG+Alumen.[0052] Figure 9 corresponds to the levels of (A) INF-γ and (B) IL-10 in splenocyte supernatants from Balb/c mice 30 days after the last immunization. Cultures were stimulated for 48 hours with DTL4 or RPMI. Statistical differences p<0.05, analyzed by ANOVA: (a) Saline (b) A2+CPG+Alumen (c) DTL4+CPG+Alumen.
[0053] A Figura 10 avalia a carga parasitária no (A) baço e (B) fígado pelo ensaio de diluição limitante, 30 dias após o desafio de infecção por L. infantum. Os resultados foram expressos como o logaritmo negativo do número de parasitos e as diferenças estatísticas p<0,05, foram analisadas por ANOVA: (a) Salina (b) Poly-IC (c) A2+CPG+ALUMEN (d) DTL4+POLY-IC[0053] Figure 10 evaluates the parasite load in (A) spleen and (B) liver by the limiting dilution assay, 30 days after the challenge of L. infantum infection. The results were expressed as the negative logarithm of the number of parasites and statistical differences p<0.05 were analyzed by ANOVA: (a) Saline (b) Poly-IC (c) A2+CPG+ALUMEN (d) DTL4+ POLY-IC
[0054] A presente invenção se refere a uma proteína quimérica para diagnóstico, profilaxia e tratamento da leishmaniose visceral canina ou humana. A invenção se refere ainda a um kit para diagnóstico de leishmaniose visceral contendo essa proteína e outros reagentes necessários para detecção. Ainda, a invenção se refere a um método para diagnóstico da leishmaniose visceral baseado na proteína quimérica e/ou no kit diagnóstico da presente invenção. Finalmente, a invenção se refere a uma composição vacinal para profilaxia e tratamento de leishmaniose visceral contendo a proteína quimérica.[0054] The present invention relates to a chimeric protein for the diagnosis, prophylaxis and treatment of canine or human visceral leishmaniasis. The invention further relates to a kit for the diagnosis of visceral leishmaniasis containing this protein and other reagents necessary for detection. Furthermore, the invention relates to a method for diagnosing visceral leishmaniasis based on the chimeric protein and/or the diagnostic kit of the present invention. Finally, the invention relates to a vaccine composition for the prophylaxis and treatment of visceral leishmaniasis containing the chimeric protein.
[0055] A proteína quimérica da presente invenção é caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à sequência definida pela SEQ ID NO 1.[0055] The chimeric protein of the present invention is characterized by comprising an amino acid sequence with at least 85% identity to the sequence defined by SEQ ID NO 1.
[0056] Em uma realização preferencial, a proteína quimérica da presente invenção é caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos como definida pela SEQ ID NO 1, aqui referenciada como DTL4.[0056] In a preferred embodiment, the chimeric protein of the present invention is characterized in that it comprises an amino acid sequence as defined by SEQ ID NO 1, referred to herein as DTL4.
[0057] O Kit para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção compreende:
- a) Uma proteína quimérica cuja sequência compreende a sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à sequência definida pela SEQ ID N° 1;
- b) Um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados ou não a uma enzima ou a um marcador;
- c) Um reagente para detectar o anticorpo secundário ou a proteína.
- a) A chimeric protein whose sequence comprises the amino acid sequence with at least 85% identity to the sequence defined by SEQ ID NO: 1;
- b) A secondary antibody or a protein, whether or not conjugated to an enzyme or a label;
- c) A reagent to detect the secondary antibody or protein.
[0058] No Kit para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção, a proteína quimérica pode estar imobilizada em um suporte sólido. Este suporte sólido pode ser composto por um material selecionado do grupo compreendendo fibra de celulose, nitrocelulose, fibra de vidro, plástico, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno, consistindo o suporte sólido em microplacas, placas de microtitulação, tubos, esferas ou membranas.[0058] In the Leishmaniasis Diagnosis Kit of the present invention, the chimeric protein can be immobilized on a solid support. This solid support can be composed of a material selected from the group comprising cellulose fiber, nitrocellulose, fiberglass, plastic, nylon, latex, polypropylene and/or polystyrene, the solid support consisting of microplates, microtiter plates, tubes, spheres or membranes.
[0059] O Kit para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção pode conter ainda um carreador selecionado do grupo compreendendo nanomateriais e/ou micromateriais de ouro, prata e/ou carbono, e/ou micropartículas (beads) simples ou recobertas com materiais diversos, preferencialmente nanomateriais e/ou micromateriais de ouro.[0059] The kit for diagnosis of leishmaniasis of the present invention may also contain a carrier selected from the group comprising nanomaterials and/or micromaterials of gold, silver and/or carbon, and/or microparticles (beads) simple or coated with different materials, preferably gold nanomaterials and/or micromaterials.
[0060] O anticorpo secundário do kit para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção pode ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses; a proteína pode ser selecionada do grupo compreendendo Proteína A, Proteína G e/ou lectinas; a enzima pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, betagalactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase, preferencialmente peroxidase; e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.[0060] The secondary antibody of the leishmaniasis diagnostic kit of the present invention can be selected from the group comprising IgG, IgM, IgA, IgE and their subclasses; the protein may be selected from the group comprising Protein A, Protein G and/or lectins; the enzyme may be selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase, preferably peroxidase; and the label may be selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents.
[0061] O reagente para detectar o anticorpo secundário ou a proteína, quando estes estiverem conjugados a uma enzima ou um marcador, do Kit para diagnóstico de leishmaniose visceral da presente invenção podem ser selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos, preferencialmente solução contendo peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina.[0061] The reagent for detecting the secondary antibody or the protein, when they are conjugated to an enzyme or a marker, of the Visceral Leishmaniasis Diagnostic Kit of the present invention can be selected from the group comprising chromogenic substrates, preferably solution containing hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine.
[0062] O Kit para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção pode ser para ensaio de imunoabsorção enzimática, teste imunoenzimático ou teste imunocromatográfico rápido.[0062] The Leishmaniasis Diagnostic Kit of the present invention may be for enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunosorbent assay, or rapid immunochromatographic assay.
[0063] Em uma realização preferencial, o Kit para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção é um kit para o diagnóstico da leishmaniose visceral.[0063] In a preferred embodiment, the Leishmaniasis Diagnosis Kit of the present invention is a visceral leishmaniasis diagnosis kit.
[0064] O Método para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção contém as seguintes etapas:
- a) Expor amostra a uma proteína quimérica cuja sequência compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à sequência definida pela SEQ ID N°1;
- b) Identificar as amostras contendo anticorpos reativos à proteína quimérica da etapa “a” utilizando reagentes apropriados.
- a) Exposing sample to a chimeric protein whose sequence comprises an amino acid sequence with at least 85% identity to the sequence defined by SEQ ID NO:1;
- b) Identify the samples containing antibodies reactive to the chimeric protein from step “a” using appropriate reagents.
[0065] A identificação das amostras contendo anticorpos reativos à proteína quimérica, realizada na etapa “b” do Método para diagnóstico de leishmaniose visceral da presente invenção pode ser feita por meio de anticorpos secundários ou uma proteína que serão posteriormente identificados utilizando reagentes apropriados. Esses anticorpos secundários ou proteínas podem estar conjugados a uma enzima ou a um marcador, sendo que a identificação dos anticorpos secundários ou proteínas pode ser por meio de reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador conjugados aos anticorpos ou às proteínas. Os reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador conjugados aos anticorpos secundários ou às proteínas do método para diagnóstico de leishmaniose visceral da presente invenção podem ser selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos, preferencialmente solução contendo peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina. Os anticorpos secundários podem compreender IgG, IgM, IgA, IgE ou respectivas subclasses; a proteína pode compreender Proteína A e/ou Proteína G e/ou lectinas; a enzima pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase, preferencialmente peroxidase; e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.[0065] The identification of samples containing antibodies reactive to the chimeric protein, performed in step "b" of the Method for diagnosing visceral leishmaniasis of the present invention can be done by means of secondary antibodies or a protein that will be later identified using appropriate reagents. Such secondary antibodies or proteins may be conjugated to an enzyme or a label, and the identification of secondary antibodies or proteins may be by means of reagents capable of detecting the enzyme or label conjugated to the antibodies or proteins. Reagents capable of detecting the enzyme or the label conjugated to the secondary antibodies or proteins of the method for diagnosing visceral leishmaniasis of the present invention can be selected from the group comprising chromogenic substrates, preferably solution containing hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine. Secondary antibodies may comprise IgG, IgM, IgA, IgE or subclasses thereof; the protein may comprise Protein A and/or Protein G and/or lectins; the enzyme may be selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase, preferably peroxidase; and the label may be selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents.
[0066] A amostra da etapa “a” do método para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção pode ser sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal, podendo a amostra ser humana ou canina.[0066] The sample of step "a" of the method for diagnosis of leishmaniasis of the present invention can be blood, serum, plasma and/or other body fluid, and the sample can be human or canine.
[0067] O método para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção pode ser por ensaio de imunoabsorção enzimática, teste imunoenzimático ou teste imunocromatográfico rápido.[0067] The method for diagnosing leishmaniasis of the present invention can be by enzyme immunosorbent assay, enzyme immunoassay or rapid immunochromatographic test.
[0068] Em uma realização preferencial, o método para diagnóstico de leishmaniose da presente invenção é um método para o diagnóstico da leishmaniose visceral.[0068] In a preferred embodiment, the method for diagnosing leishmaniasis of the present invention is a method for diagnosing visceral leishmaniasis.
[0069] Em outra realização preferencial, o Kit para diagnóstico de leishmaniose e o método para o diagnóstico da leishmaniose da presente invenção são um kit e um método para o diagnóstico da leishmaniose visceral causada por infecção parasitária de L. infantum, L. donovani, L. chagasi e/ou L. amazonensis[0069] In another preferred embodiment, the Leishmaniasis Diagnosis Kit and the Leishmaniasis Diagnosis Method of the present invention are a kit and a method for the diagnosis of visceral leishmaniasis caused by parasitic infection of L. infantum, L. donovani, L. chagasi and/or L. amazonensis
[0070] A presente invenção refere-se ainda a uma composição vacinal contendo a proteína quimérica definida pela SEQ ID Nº 1.[0070] The present invention further relates to a vaccine composition containing the chimeric protein defined by SEQ ID NO: 1.
[0071] Em uma forma de realização preferencial, a composição vacinal compreende uma proteína cuja sequência compreende a sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à sequência definida pela SEQ ID N° 1.[0071] In a preferred embodiment, the vaccine composition comprises a protein whose sequence comprises the amino acid sequence with at least 85% identity to the sequence defined by SEQ ID No. 1.
[0072] Em uma outra forma de realização, a composição vacinal compreende ainda adjuvantes.[0072] In another embodiment, the vaccine composition further comprises adjuvants.
[0073] Dentre os exemplos não limitantes de adjuvantes que podem ser empregados na presente composição vacinal estão Poly-IC e derivados, emulsão agua e óleo ou alumen com oligonucleotídeo CpG não metilado, emulsão água e óleo ou alumen com lipídeo A; esqualeno; agonista sintético de TLR4; lipossomas associados com TLR CpG não metilado ou agonista de TLR4, Montanide e Monophosporyl Lipid A (MPL), ou um outro adjuvante que induza resposta imune do tipo Th1.[0073] Among the non-limiting examples of adjuvants that can be used in the present vaccine composition are Poly-IC and derivatives, water and oil emulsion or alum with unmethylated CpG oligonucleotide, water and oil emulsion or alum with lipid A; squalene; synthetic TLR4 agonist; liposomes associated with unmethylated CpG TLR or TLR4 agonist, Montanide and Monophosporyl Lipid A (MPL), or another adjuvant that induces Th1-type immune response.
[0074] De acordo com essa forma de realização, os adjuvantes são, preferencialmente, selecionados do grupo compreendendo Poly-IC e derivados, CpG e hidróxido de alumínio.[0074] According to this embodiment, the adjuvants are preferably selected from the group comprising Poly-IC and derivatives, CpG and aluminum hydroxide.
[0075] De forma preferencial, as composições da presente invenção, podem ser administradas por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Mais preferencialmente, as composições da presente invenção são administradas por via parenteral.[0075] Preferably, the compositions of the present invention can be administered intravenously, intramuscularly or subcutaneously. More preferably, the compositions of the present invention are administered parenterally.
[0076] Mais especificamente, exemplos de uma preparação adequada para administração parenteral incluem injeção, fluido intravenoso, solução ou suspensão para infusão, pó liofilizado para suspensão ou solução, pó inalante, e semelhantes.[0076] More specifically, examples of a preparation suitable for parenteral administration include injection, intravenous fluid, solution or suspension for infusion, lyophilized powder for suspension or solution, inhalant powder, and the like.
[0077] Além disso, formulação de acordo com a presente invenção pode estar em uma forma para administração oral.[0077] Furthermore, formulation according to the present invention may be in a form for oral administration.
[0078] Mais especificamente, exemplos de uma preparação adequada para administração oral incluem comprimido, tablete, cápsula, pó, grânulo fino, grânulo, solução, suspensão, xarope e semelhantes.[0078] More specifically, examples of a preparation suitable for oral administration include tablet, tablet, capsule, powder, fine granule, granule, solution, suspension, syrup and the like.
[0079] Contudo, a forma da preparação não deve ser limitada apenas a essas.[0079] However, the form of preparation should not be limited to these alone.
[0080] Em geral, a dose adequada pode ser administrada em de uma a várias porções, ou pode ser administrada a cada poucos dias de acordo com protocolo de iniciação - reforço (prime-boost) definido.[0080] In general, the appropriate dose can be administered in one to several portions, or can be administered every few days according to a defined prime-boost protocol.
[0081] Em uma forma preferencial da invenção, a composição compreende 10 a 30 µg de DTL4 por dose, podendo ser utilizada uma faixa de 1µg a 1mg da dita proteína. Além disso, pode-se empregar de 10µg a 1mg de adjuvante Poly:IC por dose, sendo preferencialmente utilizada 50µg do dito adjuvante por dose. Na formulação com os adjuvantes CPG e Alúmen, utiliza-se preferencialmente 18µg de CpG e 30% (v/v) de Alúmen, podendo ser adotada a faixa de 1ug a 10 mg de CpG, bem como a faixa de 10% a 90% de Alúmen.[0081] In a preferred form of the invention, the composition comprises 10 to 30 µg of DTL4 per dose, a range of 1µg to 1mg of said protein may be used. Furthermore, 10µg to 1mg of Poly:IC adjuvant can be used per dose, preferably 50µg of said adjuvant per dose is used. In the formulation with the adjuvants CPG and Alum, 18µg of CpG and 30% (v/v) of Alum are preferably used, and the range from 1ug to 10 mg of CpG can be adopted, as well as the range from 10% to 90% of Alum.
[0082] A presente invenção refere-se também a um método para prevenção e tratamento de leishmaniose em que uma proteína cuja sequência compreende a sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade em relação à sequência definida pela SEQ ID N° 1, ou uma composição vacinal de acordo com a presente invenção, administrada a um indivíduo.[0082] The present invention also relates to a method for preventing and treating leishmaniasis wherein a protein whose sequence comprises the amino acid sequence having at least 85% identity to the sequence defined by SEQ ID NO: 1, or a vaccine composition according to the present invention, administered to a subject.
[0083] A presente invenção pode ser mais bem compreendida pelos seguintes exemplos, não limitantes.[0083] The present invention can be better understood by the following non-limiting examples.
[0084] A proteína quimérica da presente invenção possui tamanho de 40 kDa com tag de histidina. O gene sintético que codifica essa proteína foi adquirido comercialmente e clonado em vetor de expressão em E. coli. O vetor utilizado para produção da proteína da presente invenção foi o pET24a (+) em um sistema de expressão de E. coli BL21 (DE3), em meio de cultura LB (Lysogeny broth) com 50µg/ml do antibiótico Canamicina e diluição do inóculo de 1:100. O volume de cultivo utilizado no protocolo de expressão foi de 2 litros. A Figura 1 mostra o resultado do teste de expressão. Após expressão por 3 h a 37°C, a cultura foi centrifugada por 10 minutos a 8000 rpm. Na etapa de lise, o pellet de células gerado foi ressuspenso em 100 mL do tampão consistindo de 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl pH 8, 5 mM DTT, 5 mM de benzamidina e 1 mM de PMSF. Após a ressuspensão, a suspensão resultante foi incubada no homogeneizador e, em seguida, centrifugada a 40.000 g por 30 minutos. Por fim, o sobrenadante foi recolhido para purificação da proteína por cromatografia líquida rápida (FPLC, do inglês Fast Protein Liquid Chromatography). Nesse processo, foi utilizada coluna de afinidade HisTrap HP (GE) de 5 ml em sistema Akta Prime (GE). As etapas de purificação foram realizadas seguindo instruções do fabricante da coluna em tampão de ligação contendo 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl pH8 e tampão de eluição contendo 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 500 mM de Imidazol, pH 8. Inicialmente a coluna foi equilibrada com 25 ml de tampão de ligação em fluxo de 5 ml por minuto, seguida por passagem da amostra em fluxo de 3 ml por minuto. Após essa etapa, a coluna foi lavada com 25 ml de tampão de ligação em fluxo de 5 ml por minuto e finalmente a proteína foi eluída em gradiente de 0 a 100% de tampão de eluição feito em volume final de 50 ml a 3 ml por minuto em frações de 2 ml.[0084] The chimeric protein of the present invention has a size of 40 kDa with histidine tag. The synthetic gene that encodes this protein was commercially acquired and cloned into an expression vector in E. coli. The vector used to produce the protein of the present invention was pET24a (+) in an E. coli BL21 (DE3) expression system, in LB (Lysogeny broth) culture medium with 50µg/ml of the antibiotic Kanamycin and inoculum dilution. of 1:100. The culture volume used in the expression protocol was 2 liters. Figure 1 shows the expression test result. After expression for 3 h at 37°C, the culture was centrifuged for 10 minutes at 8000 rpm. In the lysis step, the generated cell pellet was resuspended in 100 ml of the buffer consisting of 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl pH 8, 5 mM DTT, 5 mM benzamidine and 1 mM PMSF. After resuspension, the resulting suspension was incubated in the homogenizer and then centrifuged at 40,000 g for 30 minutes. Finally, the supernatant was collected for protein purification by Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). In this process, a 5 ml HisTrap HP (GE) affinity column was used in an Akta Prime (GE) system. Purification steps were performed following the column manufacturer's instructions in binding buffer containing 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl pH8 and elution buffer containing 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 8. Initially the column was equilibrated with 25 ml of binding buffer at a flow rate of 5 ml per minute, followed by passage of the sample at a flow rate of 3 ml per minute. After this step, the column was washed with 25 ml of binding buffer at a flow rate of 5 ml per minute and finally the protein was eluted in a gradient from 0 to 100% of elution buffer made in a final volume of 50 ml to 3 ml per minute in 2 ml fractions.
[0085] O resultado das etapas de eluição é mostrado na Figura 2 e a proteína purificada de 40 kDa na Figura 3.[0085] The result of the elution steps is shown in Figure 2 and the purified 40 kDa protein in Figure 3.
[0086] O kit e o método para diagnóstico por ELISA foram validados utilizando amostras humanas e caninas. As amostras foram coletadas de pacientes com suspeita de infecção ou sadios. As amostras adquiridas foram classificadas como sendo de população geral, sem distinção de sexo, faixa etária ou etnia. Os pacientes suspeitos apresentavam sintomatologia clínica para leishmaniose visceral humana e foram submetidos ao diagnóstico clínico e laboratorial, utilizando os seguintes métodos: reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ELISA in house com rK39 e/ou imunocromatografia - It Leish® (rK39). As amostras de cães foram submetidas ao diagnóstico clínico e laboratorial, utilizando os seguintes métodos: reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ELISA in house com rK39, Kalasar Detect™, Parasitológico de medula e reação em cadeia da polimerase (PCR).[0086] The kit and method for diagnosis by ELISA have been validated using human and canine samples. Samples were collected from patients with suspected infection or healthy patients. The samples acquired were classified as being from the general population, without distinction of sex, age group or ethnicity. Suspected patients presented clinical symptoms of human visceral leishmaniasis and underwent clinical and laboratory diagnosis using the following methods: indirect immunofluorescence reaction (IFAT), in-house ELISA with rK39 and/or immunochromatography - It Leish® (rK39). Dog samples were submitted to clinical and laboratory diagnosis, using the following methods: indirect immunofluorescence reaction (IFAT), in-house ELISA with rK39, Kalasar Detect™, Bone marrow parasitology and polymerase chain reaction (PCR).
[0087] O ensaio de ELISA foi realizado em uma microplaca (Corning® 1x8 StripwellTM, 96 well plates, high binding surface, clear #2592) sensibilizada aplicando-se à cada cavidade 100µL de tampão carbonato (carbonato de sódio 15mM, bicarbonato de sódio 85mM, pH 9,5) contendo 10ng/100µL da proteína recombinante DTL4. Após adição da solução de sensibilização, a microplaca foi submetida à incubação overnight, em temperatura entre 2-8ºC e ao final do tempo de incubação a solução foi descartada e 280µL da solução bloqueio (sacarose 10%p/v, cloreto de sódio 150mM e albumina bovina 1%p/v) foi adicionada à cada cavidade da microplaca. A solução de bloqueio permaneceu na microplaca por duas horas, à temperatura ambiente (entre 15 e 30ºC), quando foi descartada e a microplaca submetida à secagem, em sala com baixa umidade e à temperatura ambiente. A microplaca sensibilizada e seca foi armazenada em temperatura entre 2-8ºC, em envelope de alumínio devidamente lacrado. No momento da execução do teste, foram separadas as cavidades a serem utilizadas considerando: controles e amostras (podendo ser testados em duplicata). Foi separada a primeira cavidade para o Branco. Foram pipetados 1000µL de diluente de amostra (fosfato de sódio dibásico anidro 100mM, fosfato de potássio monobásico anidro 17mM, cloreto de sódio 150mM, cloreto de potássio 28mM, albumina bovina 1%p/v, sacarose 2%p/v, D-manitol 1%p/v, solução BND 50%p/v em dimetilsufóxido 0,04%v/v e tween 80 0,05%v/v) em um tubo de ensaio (considerando o número de amostras e controles a serem ensaiados). Foram diluídos 10µL da amostra e dos controles no diluente de amostra previamente pipetado. Foi adicionada a cada cavidade da placa 100µL da amostra e dos controles previamente diluídos e homogeneizados. As cavidades foram cobertas com o selador de placa e incubadas por 45 minutos a 37°C ± 2°C. Após o tempo de incubação, foi retirado o selador de placa das cavidades, e descartado o conteúdo das cavidades por aspiração (por meio da lavadora de microplacas) ou por decantação (manualmente). Cada uma das cavidades foi preenchida com 350µL de solução de lavagem (fosfato de sódio dibásico anidro 100mM, fosfato de potássio monobásico anidro 18mM, cloreto de sódio 1500mM, cloreto de potássio 28mM, proclin 0,1%v/v e tween 20 1%v/v) e descartada em seguida (aproximadamente 30 segundos depois). Um total de cinco desses ciclos de lavagem foi realizado. Em seguida, foram pipetados 100µL de conjugado (anticorpo de cabra anti-IgG humano conjugado à peroxidase - FAPON Biotech, Inc BEEIGGI201, diluído 1:5000 em diluente de peroxidase MOSS, Inc) em cada cavidade. As cavidades foram cobertas com o selador de placa e incubadas por 30 minutos a 37°C ± 2°C. Após a incubação, o procedimento de lavagem foi repetido, enchendo cada uma das cavidades com 350µL de solução de lavagem, e descartando-a em seguida (aproximadamente 30 segundos depois) por um total de cinco ciclos de lavagem. Na etapa seguinte foram pipetados 100 µL de substrato (TMB Ultra Sensitive Substrate 2.08mMol - MOSS, Inc #TMBUS) em todas as cavidades. As cavidades foram cobertas com o selador de placas e incubadas por exatamente 15 minutos à temperatura ambiente. Para interromper a reação, após os 15 minutos, foi adicionado 100µL de solução de parada (solução de ácido sulfúrico 0,5M) em todas as cavidades, e gentilmente homogeneizados durante ± 30 segundos. A leitura da absorbância foi feita em 450 nm em até 30 minutos após a adição da solução de parada.[0087] The ELISA assay was performed in a sensitized microplate (Corning® 1x8 StripwellTM, 96 well plates, high binding surface, clear #2592) by applying to each well 100µL of carbonate buffer (15mM sodium carbonate, sodium bicarbonate 85mM, pH 9.5) containing 10ng/100µL of the DTL4 recombinant protein. After adding the sensitizing solution, the microplate was incubated overnight at a temperature between 2-8ºC and at the end of the incubation time the solution was discarded and 280µL of the blocking solution (10%w/v sucrose, 150mM sodium chloride and 1%w/v bovine albumin) was added to each well of the microplate. The blocking solution remained in the microplate for two hours at room temperature (between 15 and 30ºC), when it was discarded and the microplate was dried in a room with low humidity and at room temperature. The sensitized and dried microplate was stored at a temperature between 2-8ºC, in a properly sealed aluminum envelope. When performing the test, the wells to be used were separated considering: controls and samples (which could be tested in duplicate). The first cavity was separated for the Blank. 1000µL of sample diluent was pipetted (100mM anhydrous dibasic sodium phosphate, 17mM anhydrous potassium phosphate monobasic, 150mM sodium chloride, 28mM potassium chloride, 1%w/v bovine albumin, 2%w/v sucrose, D-mannitol 1%w/v, 50%w/v BND solution in 0.04%v/v dimethyl sulfoxide and 0.05%v/v tween 80) in a test tube (considering the number of samples and controls to be assayed). 10µL of the sample and controls were diluted in the previously pipetted sample diluent. 100µL of the sample and controls previously diluted and homogenized was added to each well of the plate. The wells were covered with the plate sealer and incubated for 45 minutes at 37°C ± 2°C. After the incubation time, the plate sealer was removed from the wells, and the contents of the wells were discarded by aspiration (using the microplate washer) or by decanting (by hand). Each well was filled with 350µL of washing solution (100mM anhydrous dibasic sodium phosphate, 18mM anhydrous potassium phosphate monobasic, 1500mM sodium chloride, 28mM potassium chloride, 0.1%v/v proclin and 1%v tween 20 /v) and then discarded (approximately 30 seconds later). A total of five such wash cycles were performed. Then, 100µL of conjugate (peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibody - FAPON Biotech, Inc BEEIGGI201, diluted 1:5000 in MOSS peroxidase diluent, Inc) was pipetted into each well. The wells were covered with the plate sealer and incubated for 30 minutes at 37°C ± 2°C. After incubation, the washing procedure was repeated, filling each well with 350µL of wash solution, then discarding it (approximately 30 seconds later) for a total of five wash cycles. In the next step, 100 µL of substrate (TMB Ultra Sensitive Substrate 2.08mMol - MOSS, Inc #TMBUS) were pipetted into all wells. The wells were covered with the plate sealer and incubated for exactly 15 minutes at room temperature. To stop the reaction, after 15 minutes, 100µL of stop solution (0.5M sulfuric acid solution) was added to all wells, and gently homogenized for ± 30 seconds. The absorbance reading was taken at 450 nm within 30 minutes after addition of the stop solution.
[0088] A reatividade de anticorpos específicos anti-DTL4 presentes em amostras humanas e caninas foi testada por ELISA usando um pool de dez amostras de soros positivos e um pool de dez amostras negativas para leishmaniose visceral humana (Figura 4A) e canina (Figura 4D), para determinar a melhor concentração de proteína e qual a diluição dos soros poderiam ser aplicadas na avaliação de soros individuais. Ambos ensaios (soro humanos e soro canino) demonstraram que a proteína DTL4 é capaz de discriminar com alta precisão as amostras positivas das negativas de leishmaniose visceral, mesmo quando baixa concentração de proteína foi utilizada. As figuras 4B e 4E trazem uma comparação do desempenho da DTL4 com as proteínas recombinantes A2 e a K39, utilizando soros humanos e caninos, respectivamente. Esses ensaios demonstram que DTL4 é mais eficaz que A2 e K39 em discriminar amostras humanas e caninas positivas para leishmaniose visceral de amostra negativas. Além disso, deve ser ressaltado que a reatividade de soros humanos positivos com DTL4 permanece alta mesmo em altas diluições de soros, não ocorrendo o mesmo com A2 ou K39. Na figura 4C, 469 amostras humanas (154 positivas 315 negativas) foram avaliadas. Como visto na figura, a DTL4 discrimina amostras negativas e positivas em alta proporção.[0088] The reactivity of specific anti-DTL4 antibodies present in human and canine samples was tested by ELISA using a pool of ten positive sera samples and a pool of ten negative samples for human (Figure 4A) and canine visceral leishmaniasis (Figure 4D ), to determine the best protein concentration and which sera dilution could be applied in the evaluation of individual sera. Both assays (human serum and canine serum) demonstrated that the DTL4 protein is able to discriminate with high precision between positive and negative samples of visceral leishmaniasis, even when low protein concentration was used. Figures 4B and 4E provide a comparison of the performance of DTL4 with recombinant proteins A2 and K39, using human and canine sera, respectively. These assays demonstrate that DTL4 is more effective than A2 and K39 in discriminating human and canine samples positive for visceral leishmaniasis from negative samples. Furthermore, it should be noted that the reactivity of positive human sera with DTL4 remains high even at high dilutions of sera, while the same is not true for A2 or K39. In Figure 4C, 469 human samples (154 positive 315 negative) were evaluated. As seen in the figure, DTL4 discriminates negative and positive samples in a high proportion.
[0089] A sensibilidade e especificidade da proteína DTL4 foi avaliada utilizando um painel de amostras humanas e comparada a A2 e K39. DTL4 apresentou sensibilidade e especificidade 89,5% e 93,7%, respectivamente, utilizando um painel de 100 amostras negativas e 245 amostras positivas, testadas pelo kit It-Leish. Já a proteína A2 revelou sensibilidade de 53,5% e especificidade de 67,3% (100 amostras negativas e 141 amostras positivas, testadas pelo kit It-Leish), enquanto a proteína K39 apresentou sensibilidade de 71,4% e especificidade de 79,1% (100 amostras negativas e 159 amostras positivas, testadas pelo kit It Leish).[0089] The sensitivity and specificity of the DTL4 protein was evaluated using a panel of human samples and compared to A2 and K39. DTL4 showed sensitivity and specificity of 89.5% and 93.7%, respectively, using a panel of 100 negative samples and 245 positive samples, tested by the It-Leish kit. The A2 protein showed a sensitivity of 53.5% and a specificity of 67.3% (100 negative samples and 141 positive samples, tested by the It-Leish kit), while the K39 protein showed a sensitivity of 71.4% and a specificity of 79 .1% (100 negative samples and 159 positive samples, tested by the It Leish kit).
[0090] Os níveis de anticorpos anti-DTL4 foram avaliados em soros de pacientes previamente diagnosticados com coinfecção por leishmaniose visceral e HIV. Essas amostras foram testadas por DAT e teste parasitológico.[0090] Anti-DTL4 antibody levels were evaluated in sera from patients previously diagnosed with co-infection with visceral leishmaniasis and HIV. These samples were tested by DAT and parasitological test.
[0091] Para a reação, todos os reagentes foram colocados para estabilizar em temperatura ambiente (entre 15 e 30ºC) por no mínimo 20 minutos. Em seguida, foram separadas as cavidades a serem utilizadas testados em duplicata, conforme o ensaio de ELISA descrito no exemplo 2.[0091] For the reaction, all reagents were placed to stabilize at room temperature (between 15 and 30ºC) for at least 20 minutes. Then, the wells to be used were separated and tested in duplicate, according to the ELISA assay described in example 2.
[0092] A sensibilidade e a especificidade dos pacientes co-infectados com leishmaniose e HIV (LVH+/HIV+) foram 92,31% e 82,25%, respectivamente, ao passo que em pacientes com leishmaniose, mas sem HIV (LVH+/HIV-) a sensibilidade foi de 94,61% e a especificidade foi 99,41% (Figura 5). Essa análise foi feita com 62 pacientes co-infectados e 167 pacientes com leishmaniose visceral cuja infecção foi detectada pelo método parasitológico, considerado padrão ouro, e 169 doadores saudáveis.[0092] The sensitivity and specificity of patients co-infected with leishmaniasis and HIV (LVH+/HIV+) were 92.31% and 82.25%, respectively, whereas in patients with leishmaniasis but without HIV (LVH+/HIV -) the sensitivity was 94.61% and the specificity was 99.41% (Figure 5). This analysis was performed with 62 co-infected patients and 167 patients with visceral leishmaniasis whose infection was detected by the parasitological method, considered the gold standard, and 169 healthy donors.
[0093] Para avaliação de interferentes, amostras classificadas em 11 grupos distintos foram submetidas ao ensaio de ELISA seguindo a metodologia descrita no exemplo 2. Foram avaliadas: (i) amostras positivas para leishmaniose visceral (Leishmania chagasi) – Indivíduo infectado; amostras negativas para leishmaniose visceral e (ii) positivas para leishmaniose cutânea, (iii) positivas para Doença de Chagas (Trypanosoma cruzi), (iv) com níveis aumentados de fator reumatoide, (v) positivas para lúpus, (vi) positivas para malária (Plasmodium vivax e/ou Plasmodium falciparum), (vii) positivas para paracoccidioidomicose, (viii) positivas para sífilis (Treponema pallidum), (ix) positivas para tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), (x) positivas para toxoplasmose (Toxoplasma gondii); e (xii) amostras negativas para leishmaniose visceral (Leishmania chagasi) - Doador saudável;[0093] For the evaluation of interferents, samples classified into 11 different groups were submitted to the ELISA assay following the methodology described in example 2. The following were evaluated: (i) positive samples for visceral leishmaniasis (Leishmania chagasi) - Infected individual; samples negative for visceral leishmaniasis and (ii) positive for cutaneous leishmaniasis, (iii) positive for Chagas disease (Trypanosoma cruzi), (iv) with increased levels of rheumatoid factor, (v) positive for lupus, (vi) positive for malaria (Plasmodium vivax and/or Plasmodium falciparum), (vii) positive for paracoccidioidomycosis, (viii) positive for syphilis (Treponema pallidum), (ix) positive for tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), (x) positive for toxoplasmosis (Toxoplasma gondii); and (xii) negative samples for visceral leishmaniasis (Leishmania chagasi) - Healthy donor;
[0094] A absorbância média obtida para cada um dos grupos está representada na Figura 6. Considerando o valor de cut-off para o teste (aproximadamente 0,2670, conclui-se que as condições clínicas testadas (leishmaniose cutânea, doença de Chagas, fator reumatoide aumentado, lúpus, malária, paracoccidioidomicose, sífilis, tuberculose e toxoplasmose) não interferem no kit e método de diagnóstico de leishmaniose visceral da presente invenção.[0094] The average absorbance obtained for each of the groups is represented in Figure 6. Considering the cut-off value for the test (approximately 0.2670, it is concluded that the clinical conditions tested (cutaneous leishmaniasis, Chagas disease, increased rheumatoid factor, lupus, malaria, paracoccidioidomycosis, syphilis, tuberculosis and toxoplasmosis) do not interfere with the visceral leishmaniasis diagnostic kit and method of the present invention.
[0095] Nesse ensaio utilizou-se proteína A conjugada ao ouro coloidal, antígeno (DTL4) imobilizado na linha teste (LT) e proteína A na linha controle (LC) (Figura 7). O objetivo do teste é detectar anticorpos anti-DTL4 presentes no soro positivo para leishmaniose visceral, por meio da captura inicial dos anticorpos pela proteína A conjugada ao ouro coloidal e posteriormente pela captura dos anticorpos específicos (anti-DTL4) pelo antígeno, fixado previamente, na linha teste.[0095] This assay used protein A conjugated to colloidal gold, antigen (DTL4) immobilized in the test line (LT) and protein A in the control line (LC) (Figure 7). The purpose of the test is to detect anti-DTL4 antibodies present in serum positive for visceral leishmaniasis, by means of the initial capture of antibodies by protein A conjugated to colloidal gold and later by the capture of specific antibodies (anti-DTL4) by the previously fixed antigen, on the test line.
[0096] Para obtenção do kit, primeiramente, foram preparadas as nanopartículas de ouro com diâmetro de 15 nm. Para tal, 10 mL de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) 1% e 10 mL de citrato de sódio 4% foram solubilizados separadamente em 480 mL de água destilada. Essas soluções foram adicionadas em água em ebulição sob constante agitação. Foram mantidos o aquecimento e a agitação até que a solução apresentasse a cor vermelha alaranjada e a absorbância entre 1,8 e 2 (520 nm). Posteriormente, foi ajustado o pH 9 do coloide com K2CO3 0,1M e realizada a conjugação da proteína A com as nanopartículas de ouro obtidas. Após determinação da quantidade ideal de antígeno para a conjugação, agitou-se manualmente o recipiente com o ouro coloidal, adicionou-se a quantidade determinada de proteína, já ressuspendida, e manteve-se a agitação por 20 minutos. Por fim, acrescentou-se 1% do volume final de albumina (por meio de solução 10% de BSA) e manteve a agitação por 30 minutos. Ao final adicionou-se 3% de sacarose e 1,5 mL de conjugado em 30 cm de fibra de vidro para secagem em estufa a 37°C por 2 horas, e posteriormente manteve o conjugado em sala com controle de umidade <40%.[0096] To obtain the kit, first, gold nanoparticles with a diameter of 15 nm were prepared. For this, 10 ml of 1% tetrachloroauric acid (HAuCl4) and 10 ml of 4% sodium citrate were separately solubilized in 480 ml of distilled water. These solutions were added to boiling water under constant stirring. Heating and stirring were continued until the solution showed a red-orange color and an absorbance between 1.8 and 2 (520 nm). Subsequently, the pH 9 of the colloid was adjusted with 0.1M K2CO3 and the conjugation of protein A with the gold nanoparticles obtained was performed. After determining the ideal amount of antigen for conjugation, the container with the colloidal gold was manually shaken, the determined amount of protein was added, already resuspended, and the agitation was maintained for 20 minutes. Finally, 1% of the final volume of albumin was added (using a 10% BSA solution) and stirring was maintained for 30 minutes. At the end, 3% sucrose and 1.5 mL of conjugate were added to 30 cm of glass fiber for drying in an oven at 37°C for 2 hours, and then the conjugate was kept in a room with humidity control <40%.
[0097] Para montagem do teste rápido, podem ser usadas membranas capazes de absorver a amostra do início ao final da fita, fixar as linhas teste e controle e permitir o fluxo da amostra e do conjugado para reagir com as linhas. Podem ser usadas membranas de fibra de celulose absorvente, nitrocelulose, fibra de vidro ou suporte plástico, podem ainda ser usadas camadas sobrepostas destas membranas para agrupar todas as funções necessárias (Tabela 2). [0097] For quick test assembly, membranes capable of absorbing the sample from the beginning to the end of the tape, fixing the test and control lines and allowing the flow of the sample and the conjugate to react with the lines can be used. Membranes of absorbent cellulose fiber, nitrocellulose, glass fiber or plastic backing can be used, even overlapping layers of these membranes can be used to group all necessary functions (Table 2).
[0098] Para impregnação das membranas de nitrocelulose, a proteína DTL4 foi diluída em tampão de diálise (tampão fosfato, pH 7,4) de modo a atingir uma concentração final conhecida. Da mesma forma, a proteína A a ser impregnada na linha controle foi diluída em tampão fosfato (10mM, PH 7.4) de modo a atingir concentração conhecida.[0098] For impregnation of nitrocellulose membranes, the DTL4 protein was diluted in dialysis buffer (phosphate buffer, pH 7.4) in order to reach a known final concentration. In the same way, the protein A to be impregnated in the control line was diluted in phosphate buffer (10mM, pH 7.4) in order to reach a known concentration.
[0099] Posteriormente, as membranas de nitrocelulose foram impregnadas com a proteína DTL4 [320 ng/tira (1mg/mL)] na linha teste e a proteína A (0,3 mg/mL) na linha controle.[0099] Subsequently, the nitrocellulose membranes were impregnated with DTL4 protein [320 ng/strip (1mg/mL)] in the test line and protein A (0.3 mg/mL) in the control line.
[00100] Após o processo de impregnação, procedeu-se à secagem e sobreposição das membranas, corte e embalagem das tiras-teste em cassetes e então os kits estavam prontos para o uso.[00100] After the impregnation process, the membranes were dried and overlapped, the test strips were cut and packaged in cassettes, and then the kits were ready for use.
[00101] Após a montagem, corte e embalagem, as tiras foram testadas aplicando-se 10 µL de soro humano (positivo ou negativo para leishmaniose visceral) e 60 µL de tampão de corrida. A leitura visual foi realizada após 10 minutos. O teste é considerado positivo quando ocorre o aparecimento das linhas teste e controle; e considerado negativo quando somente a linha controle fica visível. O teste é considerado inválido quando a linha controle não fica visível (Figura 7).[00101] After assembly, cutting and packaging, the strips were tested by applying 10 µL of human serum (positive or negative for visceral leishmaniasis) and 60 µL of running buffer. Visual reading was performed after 10 minutes. The test is considered positive when the test and control lines appear; and considered negative when only the control line is visible. The test is considered invalid when the control line is not visible (Figure 7).
[00102] Para avaliação do desempenho do kit, diferentes parâmetros foram avaliados, dentre eles a definição do método de conjugação, o volume de conjugado utilizado (5 µL a 20 µL), o volume da amostra aplicada (5 e 10 µL), a concentração de antígeno na linha teste, diferentes diluições da proteína A na linha controle, o tipo de membrana de nitrocelulose, o tampão de corrida e o tempo de leitura.[00102] To evaluate the performance of the kit, different parameters were evaluated, among them the definition of the conjugation method, the volume of conjugate used (5 µL to 20 µL), the volume of the applied sample (5 and 10 µL), the antigen concentration in the test line, different dilutions of protein A in the control line, the type of nitrocellulose membrane, the running buffer and the reading time.
[00103] Diferentes tampões de corrida foram testados, sendo: (1) Tetraborato de sódio 20 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,1% de azida de sódio e 1% BSA, pH 8,5; e (2) Tetraborato de sódio 0,01 M, Tween 20 0,5%, pH 8,2.[00103] Different running buffers were tested, being: (1) 20 mM sodium tetraborate, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium azide and 1% BSA, pH 8.5; and (2) 0.01 M Sodium Tetraborate, 0.5% Tween 20, pH 8.2.
[00104] O tampão que apresentou o melhor desempenho foi o 2, tetraborato de sódio 0,01M, Tween 20 0,5%, pH 8,2.[00104] The buffer that showed the best performance was 2, 0.01M sodium tetraborate, 0.5% Tween 20, pH 8.2.
[00105] Para a padronização do teste imunocromatográfico foram testados vários parâmetros e os mesmos foram otimizados para se ter o melhor funcionamento do ensaio.[00105] For the standardization of the immunochromatographic test, several parameters were tested and they were optimized to have the best performance of the assay.
[00106] Os parâmetros definidos foram: o método de conjugação da proteína A com as partículas de ouro coloidal (15 nm) em suspensão, tamanho de poro da membrana de nitrocelulose, concentração de antígeno na linha teste, composição da linha controle, volume do conjugado, volume da amostra, tipo do tampão de corrida, volume do tampão de corrida e tempo de leitura.[00106] The parameters defined were: the method of conjugation of protein A with the particles of colloidal gold (15 nm) in suspension, pore size of the nitrocellulose membrane, antigen concentration in the test line, composition of the control line, volume of the conjugate, sample volume, running buffer type, running buffer volume and read time.
[00107] Foram selecionados os parâmetros que apresentaram maior intensidade de cor nas linhas teste e controle, sem comprometer a especificidade do ensaio. Sendo assim, foi definida a melhor combinação dos parâmetros que resultou em positividade com o soro humano positivo para leishmaniose visceral e negatividade com o soro humano negativo para leishmaniose[00107] The parameters that presented the highest color intensity in the test and control lines were selected, without compromising the specificity of the assay. Therefore, the best combination of parameters that resulted in positivity with positive human serum for visceral leishmaniasis and negativity with negative human serum for leishmaniasis was defined.
[00108] Os testes mostraram os melhores resultados utilizando os parâmetros padronizados, descritos na Tabela 3. [00108] The tests showed the best results using the standardized parameters, described in Table 3.
[00109] Para avaliar o desempenho do kit de teste rápido para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana foram aplicadas amostras biológicas (100 positivas para leishmaniose visceral humana e 100 negativas de doadores saudáveis). A sensibilidade e especificidade alcançadas com essas amostras foram de 95 e 100%, respectivamente. A fim de avaliar a especificidade do diagnóstico, a reatividade cruzada foi avaliada aplicando amostras de doenças como: Leishmaniose Tegumentar, doença de Chagas, malária, toxoplasmose e fator reumatoide. Não ocorreu reatividade cruzada em nenhum caso, comprovando a alta especificidade desse produto em diagnosticar a leishmaniose visceral humana.[00109] To evaluate the performance of the rapid test kit for the diagnosis of human visceral leishmaniasis, biological samples were applied (100 positive for human visceral leishmaniasis and 100 negative from healthy donors). The sensitivity and specificity achieved with these samples were 95 and 100%, respectively. In order to assess the specificity of the diagnosis, cross-reactivity was evaluated by applying samples of diseases such as: Cutaneous Leishmaniasis, Chagas' disease, malaria, toxoplasmosis and rheumatoid factor. There was no cross-reactivity in any case, proving the high specificity of this product in diagnosing human visceral leishmaniasis.
[00110] Com a finalidade de explorar o potencial da proteína quimérica DTL4 como antígeno candidato a uma formulação vacinal contra a leishmaniose visceral humana, testes em camundongos foram realizados em combinação com dois adjuvantes imunológicos já aprovados para vacinação humana, o ácido Polinosinico-policitidilico (Poly-IC) e CPG associado a Alumen. O ensaio de imunização está descrito a seguir.[00110] In order to explore the potential of the chimeric protein DTL4 as a candidate antigen for a vaccine formulation against human visceral leishmaniasis, tests in mice were performed in combination with two immunological adjuvants already approved for human vaccination, Polynosinic-polycytidyl acid ( Poly-IC) and CPG associated with Alumen. The immunization assay is described below.
[00111] Camundongos BALB/c, fêmeas, com idade de 6 a 8 semanas, foram divididos em cinco grupos e imunizados com três doses subcutâneas de DTL4 (com os adjuvantes Poly-IC ou CPG+Alumen), solução salina, Poly-IC ou A2: Grupo 1 (n=10) - imunização com formulação composta por 10µg de DTL4 e 50µg de Poly-IC; Grupo 2 (n=10) - imunização com doses constituídas de10µg de DTL4 associada a 18µg de CpG e a 30% (v/v) de Alumen; Grupos 3 (n=10) e 4 (n=10) - considerados grupos de controle negativo – foram submetidos à salina estéril a 0,9% e 50µg de Poly-IC, respectivamente; Grupo 5 (n=10) - grupo controle positivo, recebeu 10µg da proteína recombinante A2 (A2) associada a 18µg de CpG e a 30% (v/v) de Alumen. O volume total de 100μL/camundongo foi adotado como dose e o intervalo de 21 dias foi o estabelecido entre cada uma das três doses.[00111] Female BALB/c mice, aged 6 to 8 weeks, were divided into five groups and immunized with three subcutaneous doses of DTL4 (with Poly-IC or CPG+Alumen adjuvants), saline, Poly-IC or A2: Group 1 (n=10) - immunization with a formulation composed of 10µg of DTL4 and 50µg of Poly-IC; Group 2 (n=10) - immunization with doses consisting of 10µg of DTL4 associated with 18µg of CpG and 30% (v/v) of Alumen; Groups 3 (n=10) and 4 (n=10) - considered negative control groups - were submitted to sterile saline at 0.9% and 50µg of Poly-IC, respectively; Group 5 (n=10) - positive control group, received 10µg of recombinant protein A2 (A2) associated with 18µg of CpG and 30% (v/v) of Alumen. The total volume of 100μL/mouse was adopted as the dose and the interval of 21 days was established between each of the three doses.
[00112] Para avaliação da imunogenicidade da DTL4, quatro animais de cada grupo foram eutanasiados trinta dias após a última dose de vacinação. Amostras de soro e o baço de todos os animais foram coletados e utilizados para examinar, respectivamente, as respostas imunes das células B e T. Ao mesmo tempo, seis camundongos imunizados (n=6) foram, então, desafiados com a inoculação de 1x107 promastigotas de L. infantum (cepa PP75) em salina estéril, por via subcutânea. Por fim, trinta dias após o desafio, os animais foram eutanasiados, sendo coletadas as amostras de soro, o baço e o fígado para análises. O número de parasitos viáveis por miligrama de tecido (fígado e baço) foi determinado por meio de ensaios de diluição limitante (LDA).[00112] To evaluate the immunogenicity of DTL4, four animals from each group were euthanized thirty days after the last vaccination dose. Serum and spleen samples from all animals were collected and used to examine, respectively, the immune responses of B and T cells. At the same time, six immunized mice (n=6) were then challenged with inoculation of 1x107 L. infantum promastigotes (strain PP75) in sterile saline, subcutaneously. Finally, thirty days after the challenge, the animals were euthanized, and serum, spleen and liver samples were collected for analysis. The number of viable parasites per milligram of tissue (liver and spleen) was determined using limiting dilution (LDA) assays.
[00113] Com o objetivo de prever o perfil de resposta desencadeado pela imunização com a proteína DTL4, os níveis das imunoglobulinas IgG total e IgG2a foram avaliados nos animais imunizados. É sabido que níveis de imunoglobulinas do isotipo IgG2 implicam em um padrão de resposta do tipo T auxiliar 1 (Th1), com altos níveis de Interferon-gama (IFN-γ). A indução desse tipo de resposta é uma característica desejável a candidatos vacinais contra a leishmaniose, haja vista que IFN-γ leva à ativação de macrófagos, necessária para a eliminação dos parasitos. Poly-IC e seus derivados, CPG, saponina, MPLA (monophosphoryl lipid A) e GLA (Glucopyranosyl Lipid A) são exemplos de adjuvantes capazes de induzir resposta imune do tipo Th1.[00113] In order to predict the response profile triggered by immunization with the DTL4 protein, the levels of total IgG and IgG2a immunoglobulins were evaluated in the immunized animals. It is known that IgG2 isotype immunoglobulin levels imply a T-helper 1 (Th1) type response pattern, with high levels of Interferon-gamma (IFN-γ). The induction of this type of response is a desirable feature for vaccine candidates against leishmaniasis, given that IFN-γ leads to macrophage activation, which is necessary for the elimination of parasites. Poly-IC and its derivatives, CPG, saponin, MPLA (monophosphoryl lipid A) and GLA (Glucopyranosyl Lipid A) are examples of adjuvants capable of inducing Th1-type immune response.
[00114] Os níveis das imunoglobulinas IgG total e IgG2a foram determinados pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Resumidamente, placas de 96 poços foram sensibilizadas com a proteína DTL4 (2,5ng/ 100 ul/poço) ou com a proteína A2 (50ng/100ul/poço) por 12 horas, diluídos em tampão carbonato, sob refrigeração. Após lavagem dos poços, o bloqueio (leite desnatado 5% diluído em tampão fosfato 1x + 0,005% de Tween 20) foi adicionado e a placa foi incubada por 2h a temperatura ambiente. O soro dos camundongos, diluídos 1:500 (em leite desnatado a 2% diluído em tampão fosfato 1x + 0,005% de Tween 20) foi incubado por 1 hora a 37°C, conforme estabelecido pela curva de titulação sugerida pelo fabricante e analisado em duplicata. Os anticorpos anti-camundongo IgG total e IgG2a, conjugados com peroxidase (Southern Biotech), foram utilizados em uma diluição 1:40.000 após lavagem dos poços, e adicionados às placas por 1 hora a 37°C. Na etapa seguinte, após lavagem os poços, foram pipetados 100 µL de substrato (TMB Ultra Sensitive Substrate 2.08mMol – MOSS) e a placa foi incubada por 15 minutos ao abrigo da luz. Para interromper a reação, foi adicionado 100µL de solução de parada (solução de ácido sulfúrico 0,5M). Finalmente, as densidades óticas foram lidas a 450nm no leitor de microplacas Multiskan-Go.[00114] Total IgG and IgG2a immunoglobulin levels were determined by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Briefly, 96-well plates were sensitized with DTL4 protein (2.5ng/100ul/well) or A2 protein (50ng/100ul/well) for 12 hours, diluted in carbonate buffer, under refrigeration. After washing the wells, the block (5% skim milk diluted in 1x phosphate buffer + 0.005% Tween 20) was added and the plate was incubated for 2 h at room temperature. The mouse serum, diluted 1:500 (in 2% skimmed milk diluted in 1x phosphate buffer + 0.005% Tween 20) was incubated for 1 hour at 37°C, as established by the titration curve suggested by the manufacturer and analyzed in duplicate. Total IgG and IgG2a anti-mouse antibodies, conjugated with peroxidase (Southern Biotech), were used in a 1:40,000 dilution after washing the wells, and added to the plates for 1 hour at 37°C. In the next step, after washing the wells, 100 µL of substrate (TMB Ultra Sensitive Substrate 2.08mMol – MOSS) were pipetted and the plate was incubated for 15 minutes in the dark. To stop the reaction, 100µL of stop solution (0.5M sulfuric acid solution) was added. Finally, optical densities were read at 450nm on the Multiskan-Go microplate reader.
[00115] Os resultados demonstraram que camundongos imunizados com DTL4 apresentaram níveis mais elevados de IgG e IgG2a que o grupo de camundongos imunizados com a proteína A2 e controles (Figura 8A e 8B). Além disso, convém destacar que a proteína DTL4, quando associada ao adjuvante Poly-IC, induziu secreção superior de IgG2a em relação aos demais grupos experimentais, mesmo quando o antígeno usado no ELISA foi A2 (Figura 8 B).[00115] The results demonstrated that mice immunized with DTL4 had higher levels of IgG and IgG2a than the group of mice immunized with protein A2 and controls (Figure 8A and 8B). Furthermore, it is worth noting that the DTL4 protein, when associated with the Poly-IC adjuvant, induced higher IgG2a secretion compared to the other experimental groups, even when the antigen used in the ELISA was A2 (Figure 8 B).
[00116] Portanto, de forma surpreendente, os resultados demonstraram que a imunização com a proteína DTL4 foi mais eficaz que a imunização com A2 para a indução da produção de IgG2a. Esse dado sugere que a imunização com DTL4 desencadeia um perfil de resposta Th1 em camundongos, característica valiosa em um candidato vacinal contra a leishmaniose[00116] Therefore, surprisingly, the results demonstrated that immunization with the DTL4 protein was more effective than immunization with A2 for inducing IgG2a production. This data suggests that immunization with DTL4 triggers a Th1 response profile in mice, a valuable feature in a vaccine candidate against leishmaniasis.
[00117] Interferon-gama (IFN-γ) e Interleucina-10 (IL-10) possuem papel essencial na imunidade celular contra a infecção por Leishmania. A citocina IFN-γ é o principal marcador Th1 associado à proteção do hospedeiro na infecção por L. infantum, induzindo a ativação de macrófagos e ocasionando a morte de patógenos intracelulares. Por outro lado, a IL-10 é uma citocina relacionada à persistência do parasito no hospedeiro, inibindo a ativação macrofágica e, consequentemente, modulando a resposta celular e ocasionando o aparecimento das formas clínicas da doença.[00117] Interferon-gamma (IFN-γ) and Interleukin-10 (IL-10) play an essential role in cellular immunity against Leishmania infection. The cytokine IFN-γ is the main Th1 marker associated with host protection in L. infantum infection, inducing macrophage activation and causing the death of intracellular pathogens. On the other hand, IL-10 is a cytokine related to the persistence of the parasite in the host, inhibiting macrophage activation and, consequently, modulating the cellular response and causing the appearance of clinical forms of the disease.
[00118] Para avaliar a produção de Interferon-gama (IFN-γ) e de Interleucina-10 (IL-10), 1x106 esplenócitos de camundongos vacinados foram incubados a 37°C com 5% de CO2 durante 48 horas na presença de 10ug/mL de DTL4, ou de meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (controle não estimulado). Os kits Duoset® ELISA (R&D Systems), foram empregados para quantificar a secreção de IL-10 e de IFN-γ nos sobrenadantes da cultura de células, conforme as instruções do fabricante.[00118] To evaluate the production of Interferon-gamma (IFN-γ) and Interleukin-10 (IL-10), 1x106 splenocytes from vaccinated mice were incubated at 37°C with 5% CO2 for 48 hours in the presence of 10ug /mL of DTL4, or Roswell Park Memorial Institute (RPMI) culture medium (unstimulated control). Duoset® ELISA kits (R&D Systems) were used to quantify IL-10 and IFN-γ secretion in cell culture supernatants, according to the manufacturer's instructions.
[00119] Os resultados mostraram que tanto a imunização com o antígeno DTL4 quanto a imunização com A2 são capazes de induzir a produção de IFN-γ após estimulação in vitro com DTL4 por 48 horas (Figura 2-A). Os níveis de IL10 detectados após a estimulação com ambos antígenos foram baixos, sem diferença estatística entre eles (Figura 2-B).[00119] The results showed that both immunization with DTL4 antigen and immunization with A2 are able to induce IFN-γ production after in vitro stimulation with DTL4 for 48 hours (Figure 2-A). IL10 levels detected after stimulation with both antigens were low, with no statistical difference between them (Figure 2-B).
[00120] Para avaliar o efeito da imunização com DTL4 na infecção por Leishmania, os animais foram eutanasiados trinta dias após o desafio com L. infantum, e os órgãos (fígado e baço) foram colhidos para quantificação dos parasitos viáveis por miligrama de tecido, mediante ensaio de diluição limitante (LDA). O fígado e o baço dos camundongos foram triturados e homogeneizados com 5 mL de meio Schneider. Os detritos do tecido foram removidos por centrifugação a 50xg e a 4°C por 1 minuto. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 1540xg e a 4°C por 10 minutos. O sedimento obtido foi ressuspendido em 500μL de meio Schneider e submetido à diluição de 1:10 (em duplicata) em microplacas de 96 poços com volume final de 200 μL. As microplacas foram incubadas a 26°C por 14 dias, e a presença de parasitos foi avaliada semanalmente. A última diluição em que pelo menos um parasito pôde ser identificado no poço foi considerada com o título final. Os resultados foram expressos sendo o logaritmo negativo do número de parasitos.[00120] To evaluate the effect of immunization with DTL4 on Leishmania infection, the animals were euthanized thirty days after the challenge with L. infantum, and the organs (liver and spleen) were harvested for quantification of viable parasites per milligram of tissue, by limiting dilution assay (LDA). The liver and spleen of the mice were ground and homogenized with 5 mL of Schneider medium. Tissue debris was removed by centrifugation at 50xg and 4°C for 1 minute. The supernatant was collected and centrifuged at 1540xg and 4°C for 10 minutes. The obtained pellet was resuspended in 500μL of Schneider medium and subjected to a 1:10 dilution (in duplicate) in 96-well microplates with a final volume of 200 μL. The microplates were incubated at 26°C for 14 days, and the presence of parasites was evaluated weekly. The last dilution in which at least one parasite could be identified in the well was considered as the final titer. The results were expressed as the negative logarithm of the number of parasites.
[00121] Os resultados demonstraram que a imunização com o antígeno DTL4, assim como o antígeno A2, resultou na diminuição significativa na carga parasitária após desafio em comparação aos grupos controle (salina e poly-IC) (Figura 3). Vale ressaltar que, a partir da análise da média dos resultados encontrados no ensaio de diluição limitante, é possível perceber uma maior redução do parasitismo no baço e fígado pela imunização com DTL4 em comparação com a proteína A2 (tabela 1). [00121] The results demonstrated that immunization with the DTL4 antigen, as well as the A2 antigen, resulted in a significant decrease in the parasite load after challenge compared to the control groups (saline and poly-IC) (Figure 3). It is worth mentioning that, based on the analysis of the average of the results found in the limiting dilution assay, it is possible to perceive a greater reduction of parasitism in the spleen and liver by immunization with DTL4 compared to protein A2 (Table 1).
[00122] Os resultados obtidos demonstram, portanto, o sucesso das formulações contendo o antígeno DTL4 para o desenvolvimento de novas formulações de vacinas para leishmaniose visceral humana, com resultados superiores em relação a A2 no que diz respeito ao potencial de indução de resposta imune Th1 e redução de parasitas no fígado e baço.[00122] The results obtained demonstrate, therefore, the success of formulations containing the DTL4 antigen for the development of new vaccine formulations for human visceral leishmaniasis, with superior results in relation to A2 with regard to the potential for inducing a Th1 immune response and reduction of parasites in the liver and spleen.
[00123] Para avaliação do potencial terapêutico de DTL4, camundongos BALB/c, fêmeas, com idade de 6 a 8 semanas foram infectados com 107 promastigotas de L.infantum (cepa PP75) em salina estéril, por via subcutânea. Trinta dias após a infecção, os animais foram tratados com DTL4 + Poly:IC Poly:IC (entre 10 e 100 µg de DTL4 e 25 e 50 µg do adjuvante Poly:IC, por dose). Anfotericina B e salina foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. O tratamento foi realizado durante 1 mês. Após o tratamento, os animais foram eutanasiados, sendo coletadas as amostras de soro, o baço e o fígado para análises. O número de parasitos viáveis por miligrama de tecido (fígado e baço) foi determinado por meio de ensaios de diluição limitante (LDA).[00123] To evaluate the therapeutic potential of DTL4, female BALB/c mice aged 6 to 8 weeks were infected with 107 L.infantum promastigotes (strain PP75) in sterile saline, subcutaneously. Thirty days after infection, animals were treated with DTL4 + Poly:IC Poly:IC (between 10 and 100 µg of DTL4 and 25 and 50 µg of Poly:IC adjuvant, per dose). Amphotericin B and saline were used as positive and negative controls, respectively. The treatment was carried out for 1 month. After treatment, the animals were euthanized, and serum, spleen and liver samples were collected for analysis. The number of viable parasites per milligram of tissue (liver and spleen) was determined using limiting dilution (LDA) assays.
Claims (19)
- a) uma proteína quimérica como definida na reivindicação 1 ou 2;
- b) um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados ou não a uma enzima ou a um marcador;
- c) um reagente para detectar o anticorpo secundário ou a proteína.
- a) a chimeric protein as defined in claim 1 or 2;
- b) a secondary antibody or a protein, whether or not conjugated to an enzyme or a label;
- c) a reagent to detect the secondary antibody or protein.
- a) expor uma amostra a uma proteína quimérica como definida na reivindicação 1 ou 2;
- b) identificar as amostras contendo anticorpos reativos à proteína quimérica da etapa “a” utilizando reagentes apropriados.
- a) exposing a sample to a chimeric protein as defined in claim 1 or 2;
- b) identifying the samples containing antibodies reactive to the chimeric protein of step “a” using appropriate reagents.
- a) em que os reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador conjugados aos anticorpos secundários ou às proteínas serem selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos, preferencialmente solução contendo peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina,
- b) em que o dito anticorpo secundário é IgG, IgM, IgA, IgE ou respectivas subclasses; a proteína é Proteína A e/ou Proteína G e/ou lectinas; a enzima é selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase, preferencialmente peroxidase; e o marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
- a) wherein the reagents capable of detecting the enzyme or the label conjugated to secondary antibodies or proteins are selected from the group comprising chromogenic substrates, preferably solution containing hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine,
- b) wherein said secondary antibody is IgG, IgM, IgA, IgE or subclasses thereof; the protein is Protein A and/or Protein G and/or lectins; the enzyme is selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase, preferably peroxidase; and the label is selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents.
10 µg a 1 mg do adjuvante ácido poliinosínico-policitidílico, mais preferencialmente 50 µg do dito adjuvante por dose, ou
1 µg a 10 mg de CPG e 10% a 90% de Alúmen, mais preferencialmente 18 µg de CpG e 30% (v/v) de Alúmen.Vaccine composition according to claims 16 and 17, characterized in that it comprises 1 µg to 1 mg of the protein as defined in claim 1 or 2, more preferably 10-100 µg of said protein per dose, and
10 µg to 1 mg of the polyinosinic-polycytidyl acid adjuvant, more preferably 50 µg of said adjuvant per dose, or
1 µg to 10 mg CPG and 10% to 90% Alum, more preferably 18 µg CpG and 30% (v/v) Alum.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BR102021000794-0A BR102021000794A2 (en) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSING LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION |
PCT/BR2022/050013 WO2022150899A1 (en) | 2021-01-15 | 2022-01-14 | Chimeric protein, kit, method of diagnosis of leishmaniasis, use of a chimeric protein, vaccine composition against visceral leishmaniasis and use of a vaccine composition |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BR102021000794-0A BR102021000794A2 (en) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSING LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BR102021000794A2 true BR102021000794A2 (en) | 2022-07-26 |
Family
ID=82446318
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BR102021000794-0A BR102021000794A2 (en) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSING LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
BR (1) | BR102021000794A2 (en) |
WO (1) | WO2022150899A1 (en) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI1013447B8 (en) * | 2010-11-29 | 2021-07-27 | Univ Federal De Minas Gerais Ufmg | recombinant peptides, method and kit for immunodiagnostic test of leishmaniasis |
ES2415516B2 (en) * | 2011-12-23 | 2014-01-28 | Universidad Complutense De Madrid | CHEMERA MULTICOMPONENT FOR USE AS A VACCINE AGAINST INFECTION BY LEISHMANIA SPP. IN MAMMALS. |
CN104768577B (en) * | 2012-08-30 | 2020-06-09 | 梅里亚有限公司 | High pressure apparatus and method for preparing inactivated vaccines and for refolding/solubilizing recombinant proteins |
WO2014160985A2 (en) * | 2013-03-28 | 2014-10-02 | Infectious Disease Research Institute | Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis |
EP2978447B1 (en) * | 2013-03-28 | 2019-05-08 | Infectious Disease Research Institute | Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis |
-
2021
- 2021-01-15 BR BR102021000794-0A patent/BR102021000794A2/en not_active Application Discontinuation
-
2022
- 2022-01-14 WO PCT/BR2022/050013 patent/WO2022150899A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022150899A1 (en) | 2022-07-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fujiwara et al. | Immunogenicity in dogs of three recombinant antigens (TSA, LeIF and LmSTI1) potential vaccine candidates for canine visceral leishmaniasis | |
Darko et al. | The clinical-grade 42-kilodalton fragment of merozoite surface protein 1 of Plasmodium falciparum strain FVO expressed in Escherichia coli protects Aotus nancymai against challenge with homologous erythrocytic-stage parasites | |
Rosoff et al. | Isolation and identification of a Giardia lamblia-specific stool antigen (GSA 65) useful in coprodiagnosis of giardiasis | |
Celeste et al. | Leishmania infantum heat shock protein 83 for the serodiagnosis of tegumentary leishmaniasis | |
US6855322B2 (en) | Isolation and purification of P. falciparum merozoite protein-142 vaccine | |
TW201803907A (en) | Biofusion proteins as anti-malaria vaccines | |
Bargieri et al. | Immunogenic properties of a recombinant fusion protein containing the C-terminal 19 kDa of Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 and the innate immunity agonist FliC flagellin of Salmonella typhimurium | |
Montenegro-James et al. | Bovine babesiosis: induction of protective immunity with culture-derived Babesia bovis and Babesia bigemina immunogens | |
Younas et al. | Expression and Purification of Recombinant Multi-epitope Protein of Rhipicephalus microplus Tick and its Antigenicity in the rabbit model. | |
EP3156798B1 (en) | A novel assay for the diagnosis of helminth infections | |
Vasquez et al. | Serological diagnosis of Trypanosoma rangeli infected patients. A comparison of different methods and its implications for the diagnosis of Chagas' disease | |
Ferreira et al. | Hemagglutination test for the diagnosis of human neurocysticercosis: development of a stable reagent using homologous and heterologous antigens | |
EP0976763A1 (en) | Antigens and immunoassays for diagnosing Chagas' disease | |
Umezawa et al. | Trypanosoma cruzi defined antigens in the serological evaluation of an outbreak of acute Chagas disease in Brazil (Catole do Rocha, Paraiba) | |
Carcy et al. | A 37-kilodalton glycoprotein of Babesia divergens is a major component of a protective fraction containing low-molecular-mass culture-derived exoantigens | |
Arab-Mazar et al. | Cloning, expression and immunoreactivity of recombinant Toxoplasma gondii GRA5 protein | |
Ballesteros et al. | Chagas disease: an overview of diagnosis | |
BR102021000794A2 (en) | CHIMERIC PROTEIN, KIT, METHOD FOR DIAGNOSING LEISHMANIASIS, USE OF A CHIMERIC PROTEIN, VACCINE COMPOSITION AGAINST VISCERAL LEISHMANIASIS, AND, USE OF A VACCINE COMPOSITION | |
Matsumoto et al. | Trypanosoma cruzi: isolation of an immunodominant peptide of TESA (trypomastigote excreted-secreted antigens) by gene cloning | |
Vendrame et al. | Evaluation of anti-Schistosoma mansoni IgG antibodies in patients with chronic schistosomiasis mansoni before and after specific treatment | |
US7256281B2 (en) | Recombinant P. falciparum merozoite protein-142 vaccine | |
Kilejian | Immunological cross-reactivity of the histidine-rich protein of Plasmodium lophurae and the knob protein of Plasmodium falciparum | |
ZHUANG et al. | Characterization of epitopes on a 32 kDa merozoite surface protein of Theileria sergenti | |
US7306806B2 (en) | Recombinant P. falciparum merozoite protein-142 vaccine | |
US9783583B2 (en) | Antigenic polypeptides of Trichinella and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
B11A | Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing | ||
B11Y | Definitive dismissal - extension of time limit for request of examination expired [chapter 11.1.1 patent gazette] |