BR102014024587A2

BR102014024587A2 - microfluidic devices and their use

Info

Publication number: BR102014024587A2
Application number: BR102014024587A
Authority: BR
Inventors: Aline Furtado Oliveira; Lucimara Gaziola De La Torre; Reinaldo Gaspar Bastos
Original assignee: Unicamp; Univ Fed De São Carlos
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2016-04-05
Also published as: WO2016049720A1

Abstract

dispositivos microfluídicos e seu uso. a invenção refere-se a dispositivos microfluídicos estruturados para a geração de um gradiente de concentração difusivo em materiais biocompatíveis, de fácil montagem e reutilizáveis. a invenção descreve o uso do dispositivo para qualquer processo que seja necessário conhecer as condições ideais de substrato ou as condições ideais para o desempenho celular, estimativa de parâmetros cinéticos e avaliar respostas químicas, como quimiotaxia.microfluidic devices and their use. The invention relates to structured microfluidic devices for generating a diffusive concentration gradient in biocompatible, easily assembled and reusable materials. The invention describes the use of the device for any process that needs to know the ideal substrate conditions or the ideal conditions for cellular performance, estimation of kinetic parameters and evaluating chemical responses such as chemotaxis.

Description

DISPOSITIVOS MICROFLUÍDICOS E SEU USCj Campo da invenção: [1] A presente invenção se insere no campo da microbiologia e microfluidica para otimizar as etapas de seleção das condições ótimas para o crescimeito celular microbiano e, assim, melhorar o desempenho das etapas iniciais de em bioprocessos. Mais especificamente, a invenção refere-se a dispositivos microfluidicos estruturados para a geração de um gradiente de concentração difusivo em materiais biocompatíveis, de fácil montagem e reutilizáveis, para uso geral em microbiologia fara avaliar comportamento celular.Field of the Invention: [1] The present invention is in the field of microbiology and microfluidics to optimize the steps for selecting optimal conditions for microbial cell growth and thus improving the performance of the early stages of bioprocesses. . More specifically, the invention relates to structured microfluidic devices for the generation of a diffusive concentration gradient in easily assembled and reusable biocompatible materials for general use in microbiology to assess cellular behavior.

Fundamentos da invenção: [2] Atualmente, as ciências buscam por tecnologias inovadoras, as quais estejam aliadas à alta prcdutividade, τγι n fh Τ'£=> Q ΓΊ1 ς t ης P> f" ΡΤΤ1ΠΠ Ληρ-τρι p ί ΠΠ A 1 J. 11 X 1 C_/ J_ O Uü L O W L. V_» J. IL k-/ W k»/ J_ CA _L i i Ci -L. · [3] Dentro desse contexto, a microfluidica é uma ciência que aplica esses princípios e amplia alternativas de estudos em diversas áreas do conhecimento.Foundations of the invention: [2] Today, the sciences are looking for innovative technologies which are allied to high productivity, τγι n fh Τ '£ => Q ΓΊ1 ς t ης P> f "ΡΤΤ1ΠΠ Ληρ-τρι p ί ΠΠ A 1 J. 11 X 1 C_ / J_ UU LOW L. V_J_ IL k- / W k / J_ CA _L ii Ci-L · [3] Within this context microfluidics is a science that applies these principles. and expands study alternatives in various areas of knowledge.

[4] Na biotecnologia, por exemplo, a microfluidica atua no desenvolvimento de sistemas capazes de determinar as condições ideais de uma reação e auxiliar na otimização de bioprocessos.[4] In biotechnology, for example, microfluidics works on the development of systems capable of determining the optimal reaction conditions and assisting in the optimization of bioprocesses.

[5] Essa ciência opera em dispositivos microfluidicos com dimensões na escala de micrômetros, sendo necessário um pequeno volume (IO-6 a 10-18 L) de amostras e reaqentes.[5] This science operates on micrometer-sized microfluidic devices, requiring a small volume (10-18 L to 10 -18 L) of samples and reagents.

[6] Assim, os processos são rápidos em termos de transferência de massa e calor e as reações acontecem em regime de escoamento laminar, mimetizando o micro-ambiente celular e permitindo o controle e a manipulação de células no espaço de forma precisa, viabilizando as avaliações de células em situações reais.[6] Thus, the processes are rapid in terms of mass and heat transfer and reactions take place under laminar flow regime, mimicking the cellular microenvironment and allowing precise control and manipulation of cells in space, enabling cell evaluations in real situations.

[7] A microfluídica desenvolveu-se a parti.r de outras ciências que buscavam novas técnicas com resultados rápidos e confiáveis. A analítica foi a área mais influente, quando o potencial microfluidico foi utilizado a fim de otimizar os métodos analíticos. A microeletrônica, por sua vez, colaborou no desenvolvimento da plataforma microfluídica, com a aplicação da técnica de fotolitografia na construção de dispositivos microfluídicos.[7] Microfluidics developed from other sciences seeking new techniques with fast and reliable results. The analytical was the most influential area, when the microfluidic potential was used in order to optimize the analytical methods. Microelectronics, in turn, collaborated in the development of the microfluidic platform, applying the photolithography technique in the construction of microfluidic devices.

[8] Posteriormente, outros suportes e métodos de construção foram testados e as técnicas de microfabricação impulsionaram a produção de dispositivos microíluídicos em diversas geometrias e tipos de materiais, configurados de acordo com a finalidade de cada pesquisa.[8] Subsequently, other supports and construction methods were tested and microfabrication techniques boosted the production of micro-fluidic devices in various geometries and material types, configured according to the purpose of each survey.

[9] Ainda com relação à geometria, os dispositivos microfluídicos permitem a separação e a manipulação de amostras, gerando sistemas de mistura e gradientes de concentrações.[9] With regard to geometry, microfluidic devices allow sample separation and manipulation, generating mixing systems and concentration gradients.

[10] A formação de gradiente possibilita a observação do comportamento celular frente a diferentes concentrações de determinada substância, característica importante para compreender o comportamento celular e determinai parâmetros envolvidos em bioprocessos.[10] Gradient formation enables the observation of cellular behavior against different concentrations of a given substance, an important feature to understand cellular behavior and to determine parameters involved in bioprocesses.

[11] Dentre as várias aplicações da microfluídica, destacam-se os estudos com células animais, em que é possível monitorar o desenvolvimento celular em situações ideais, sequenciar o DNA em eletroforese microchip, analisar a expressão gêníca com um desempenho maior do que as técnicas convencionais e avaliar o comportamento de novos fármacos em células animais.[11] Among the many applications of microfluidics, animal cell studies stand out, where it is possible to monitor cell development in optimal situations, sequence DNA in microchip electrophoresis, and analyze gene expression with greater performance than techniques. and evaluate the behavior of new drugs in animal cells.

[12] Em bioprocessos, a microfluídica é usada para determinar os parâmetros cinéticos a fim de aumentar a produtividade dos processos. Nestes estudos, são usados dispositivos microfluidicos, com o objetivo de fornecer um ambiente promissor para o crescimento eficiente de células.[12] In bioprocesses, microfluidics are used to determine kinetic parameters to increase process productivity. In these studies, microfluidic devices are used to provide a promising environment for efficient cell growth.

[13] Os dispositivos microfluidicos apresentam a vantagem de avaliar o comportamento biológico e a cinética de reações em tempo real e simula operações de macro escala, que possibilita a otimização de processos com maior eficácia in vitro do que as técnicas tradicionais.[13] Microfluidic devices have the advantage of evaluating the biological behavior and kinetics of real-time reactions and simulating macroscale operations, which enables process optimization with greater efficiency in vitro than traditional techniques.

[14] Sendo assim, a microfluídica mosrra-se uma ferramenta importante para diversas pesguisas em biotecnologia, com destaque para bioprocessos e no desenvolvimento de novas tecnologias.[14] Therefore, microfluidics is an important tool for several biotechnology researches, especially bioprocesses and the development of new technologies.

[15] Os dispositivos atualmente utilizados na microfluídica possuem alta versatilidade e capacidade de formação de gradientes de concentração que podem contribuir para os estudos em microbiologia industrial, permitindo o aproveitamento da microfluídica para realizar ensaios e análises de etapas iniciais em bioprocessos, gerando resultados mais rápidos do que as técnicas atuais. Contudo, tais dispositivos apresentam alguns pontos críticos/problemas técnicos/limitações, dentre as quais destacam-se: não são totalmente reutilizáveis, não são versáteis quanto a utilização de sistema aeróbio ou anaeróbio, maior dificuldade na montagem do cispositivo, utilização de materiais que podem afetar a cinética de reação das células e nem tanto não consistem em si.stemas que apresentem um triplicata num mesmo ensaio.[15] The devices currently used in microfluidics have high versatility and concentration gradient formation capability that can contribute to studies in industrial microbiology, allowing the use of microfluidics to perform tests and analysis of early stages in bioprocesses, generating faster results. than current techniques. However, these devices present some critical points / technical problems / limitations, among which they stand out: they are not totally reusable, they are not versatile regarding the use of aerobic or anaerobic system, greater difficulty in the assembly of the device, use of materials that can affect the reaction kinetics of cells and do not consist of themselves.Tems that have a triplicate in the same assay.

[16] Alguns dos problemas/limitações/pontds críticos mencionados acima estão apresentados de forma detalhada nos documentos descritos a seguir.[16] Some of the issues / limitations / critical points mentioned above are detailed in the documents described below.

[17] 0 documento US 8,216,526 B2 refere-se a um dispositivo microfluídico, capaz de gerar múltiplos gradientes químicos espaciais simultaneamente dentro de uma câmara microfluídica em formato circular, coitendo três entradas por onde são inseridas as soluções de diferentes concentrações. Nesta câmara é gerado o gradiente de concentração difusivo, sem convecção, sendo aplicado para avaliar o processo de quimiotaxia bacteriana Diferentemente do documento de patente americano, a presen ;e invenção descreve um dispositivo reutilizável, o qual apresenta um gradiente de concentração difusivo em sistema de dois níveis e usando materiais de fácil montagem e que não afetam o desempenho celular.[17] US 8,216,526 B2 relates to a microfluidic device capable of generating multiple spatial chemical gradients simultaneously within a circular microfluidic chamber, with three entrances through which solutions of different concentrations are inserted. In this chamber, the diffusive, non-convective concentration gradient is generated and applied to evaluate the bacterial chemotaxis process. Unlike the US patent document, the present invention describes a reusable device which has a diffusive concentration gradient in a bacterial chemotaxis system. two levels and using easy-to-assemble materials that do not affect cellular performance.

[18] 0 ÜS 2004211054 descreve sistemas microfluídicos moldados em material polimérico. O dispositivo apresentado neste documento é composto por PDMS poroso e uma membrana com conjunto de eletrodos e tem o objetivo de gerar energia elétrica a partir de células de combustível. Neste caso, trata-se de uma aplicação da microf luídica ia área de eletroanalítica. Diferentemente do documento arericano, a presente invenção consiste em um sistema com geração de gradiente difusivo para avaliação de comportamerto celular. Os dispositivos ora propostos apresentam fácil montagem e possuem selagem reversível. Pelas propriedades dos materiais usados (hidrofílico e hidrofóbico), os mesmos podem ser empregados para avaliar o comportamento de diferentes células. Já o documento de patente canadense CA2830533, este refere-se a um dispositivo microfluidico para conduzir ensaios biológicos, o qual apresenta selagem irreversível, de PDMS em base de vidro, impedindo assim a higienização completa do sistema, contendo micro tubos e câmara pneumática nos microcanais. Por outro lado, a invenção proposta difere do documento canadense principalmente pelo fato da selagem ser reversível, o que permite a reutilização do dito c.ispositivo. Adicionalmente, a geometria do dispositivo proposto permite, além do cultivo de células, avaliar o comportamento celular frente a diferentes concentrações de um determinado substrato, determinar parâmetros cinéticos e avaliar o desempenho celular nas condições impostas.[18] 0 ÜS 2004211054 describes microfluidic systems molded from polymeric material. The device presented in this document is composed of porous PDMS and an electrode array membrane and is intended to generate electrical energy from fuel cells. In this case, it is an application of microfluidics to the electroanalytical area. Unlike the Arerican document, the present invention consists of a diffusive gradient generation system for cellular behavior evaluation. The proposed devices are easy to assemble and have reversible sealing. Due to the properties of the materials used (hydrophilic and hydrophobic), they can be used to evaluate the behavior of different cells. Canadian patent document CA2830533 refers to a microfluidic device for conducting biological assays, which features irreversible sealing of glass-based PDMS, thus preventing complete sanitation of the system, containing micro tubes and pneumatic chamber in the microchannels. . On the other hand, the proposed invention differs from the Canadian document mainly in that the sealing is reversible, which allows the reuse of said device. Additionally, the geometry of the proposed device allows, in addition to cell cultivation, to evaluate cell behavior against different concentrations of a given substrate, determine kinetic parameters and evaluate cell performance under the imposed conditions.

[19] No documento "A robust diffusion-basad gradient generator for dynamíc cell assays", de Atencia et al., os autores descrevem um dispositivo para estuda:: processos biológicos que envolvem gradientes químicos estáticos ou dinâmicos, tal como a quimiotaxia. 0 dispositivo descrito nesse artigo utiliza ímãs para sua selagem, o que pode afetar o desempenho celular microbiano. Diferentemente, os dispositivos microfluídicos proporcionados pela invenção são vedados com a pressão de presilhas de metal e apresentam entradas feitas no próprio vidro, de forma a não afetar a cinética das células.[19] In the paper "A robust diffusion-based gradient generator for dynamic cell assays" by Atencia et al., The authors describe a device for studying biological processes involving static or dynamic chemical gradients, such as chemotaxis. The device described in this article uses magnets for sealing, which may affect microbial cellular performance. In contrast, the microfluidic devices provided by the invention are sealed under metal clamp pressure and have inlets made in the glass itself so as not to affect cell kinetics.

[20] No artigo "A simple and cost-effective method for fabrication of integrated electronic-microfluidic devices usíng a laser-patterned PDMS layer" foi apresentada a viabilidade da utilização de sistemas microfluídicos formados em vidro-PDMS como um sistema reversível. Este trabalho não se aplica ao desenvolvimento de sistemas microfluídicos para a geração de gradiente de concentração e apenas analisa a pressão suportada pelo sistema. A metodologia utilizada para construção dos microcanais mostra uma estrutura feita em vidro-PDMS-vidro, sendo os microcanais construídos no PDMS (por fotolitografia).[20] In the article "A simple and cost-effective method for fabrication of integrated electronic-microfluidic devices laser-patterned PDMS layer" the feasibility of using PDMS glass-formed microfluidic systems as a reversible system was presented. This work does not apply to the development of microfluidic systems for concentration gradient generation and only analyzes the pressure supported by the system. The methodology used to construct the microchannels shows a structure made of glass-PDMS-glass, and the microchannels are built in PDMS (by photolithography).

[21] Na invenção proposta, a disposição construtiva do dispositivo compreende dois níveis, a fim de gerar gradiente de concentração difusivo, o qual permite aval:.ar células livres dentro do microcanal. Além disso, a metodologia de construção se difere quanto aos materiais e estruturas utilizadas.[21] In the proposed invention, the constructive arrangement of the device comprises two levels in order to generate diffusive concentration gradient, which allows the evaluation of free cells within the microchannel. In addition, the construction methodology differs in the materials and structures used.

[22] Diante do exposto acima, não foi encontrado nenhum documento no estado da técnica compreendendo dispositivos microfluídicos capazes de gerar gradiente difusivo, tendo com materiais biocompatíveis que não afete a oinética de reação das células, com facilidade no processo de montagem e higienização, sendo um dispositivo totalmente reutilizável e versátil quanto à sua utilização e ainda que permite realizar ensaios em paralelo.[22] In view of the above, no prior art document containing microfluidic devices capable of generating diffusive gradient has been found, having biocompatible materials that do not affect the reaction reaction of cells, with ease in the assembly and cleaning process. a fully reusable device that is versatile in its use and yet allows for parallel testing.

[23] Em vista disso, a presente invenção provê três dispositivos microfluídicos, os quais foram estruturados para gerar um gradiente de concentração difusivo em materiais biocompatíveis.[23] In view of this, the present invention provides three microfluidic devices which have been structured to generate a diffusive concentration gradient in biocompatible materials.

[24] Ainda, a invenção descreve o uso dos dispositivos microfluídicos para otimizar as etapas de seleção das condições ótimas para o crescimento celular mi;robíano e, assim, melhorar o desempenho da produção em bioprocessos.[24] In addition, the invention describes the use of microfluidic devices to optimize the steps for selecting optimal conditions for micromyrobial cell growth and thereby improving bioprocess production performance.

Breve descrição da. invenção: [25] A invenção descreve dispositivos microfluídicos estruturados para a geração de um gradiente de concentração difusivo em materiais biocompatíveis.Brief description of. [25] The invention describes structured microfluidic devices for generating a diffusive concentration gradient in biocompatible materials.

[26] Mais especificamente, a invenção faz referência a dois dispositivos que se diferenciam na composição dos materiais, em que os três apresentam perfil linear na formação de gradiente de concentração difusivo.[26] More specifically, the invention refers to two devices which differ in the composition of materials, the three of which have a linear profile in the formation of diffusive concentration gradient.

[27] 0 termo "câmara" aqui usado indica o Iscai onde as células são colocadas para serem submetidas a analise em gradiente de concentração difuso e se encontra no nivel inferior dos dispositivos. 0 termo "microcâmara" refere-se às divisões (intervalos) da câmara, feitas virtualmente para realizar a contagem celular. 0 termo "canal" refere-se o lugar por onde esçoa as soluções de diferentes concentrações e tem o formato de "y". 0 termo "selagem reversível" refere-se ao fato do dispositivo poder ser fechado por qualquer meio de fixação que não seja permanente.[27] The term "chamber" used herein denotes the Iscai where cells are placed to undergo diffuse concentration gradient analysis and are at the lower level of the devices. The term "microcamera" refers to chamber divisions (ranges) made virtually to perform cell counting. The term "channel" refers to where the solutions of different concentrations are and has the shape of "y". The term "reversible sealing" refers to the fact that the device may be closed by any non-permanent means of attachment.

[28] Os dispositivos se diferem entre si pela quantidade de camadas tanto no nível inferior quanto no superior e no tratamento do PDMS não laminado para que este fique menos hidrofóbico.[28] The devices differ in the amount of layers at both the lower and upper levels and in the treatment of unlaminated PDMS to make it less hydrophobic.

[29] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um dispositivo microfluídíco (figura IA) , denominado dispositivo microfluídico vidro-vidro, que comp:eende: - um nível inferior (i) contendo as camadas: lâmina de vidro lisa(l); PDMS laminado, recortado e vazí do contendo pelo menos uma câmara (2), mas preferencia'.mente três câmaras em que cada câmara trata-se de um ersaio, tendo assim uma triplicata em um único sistema; e lamínula com furos(3); - um nível superior (ii) contendo as canadas: PDMS laminado com canal vazado em formato Y (4); e lâmina de vidro com furos (5).[29] In a first aspect, the invention relates to a microfluidic device (Figure IA), called a glass-to-glass microfluidic device, comprising: - a lower level (i) containing the layers: plain glass slide ( l); Laminated, cut-out and poured PDMS containing at least one chamber (2), but preferably three chambers in which each chamber is a sinker, thus having a triplicate in a single system; and cover slip with holes (3); - a higher level (ii) containing the canes: Y-shaped hollow channel laminated PDMS (4); and glass slide with holes (5).

[30] Sendo que: - o recorte do PDMS laminado (2) contorna as paredes dos microcanais e lamina de vidro lísa(l) define o fundo dos microcanais (câmaras); - os furos da lamínula(3) foram feitos preferencialmente por corrosão química e se ajustam às extremidades das câmaras; - o PDMS laminado com canal vazado(4) permite o escoamento das soluções de diferentes concentrações; - a selagem é realizada pela aderência do PDMS laminado ao vidro; - os furos na lâmina de vidro (5) podem opcionalmente conter conexões para mangueiras de entrada de solução (9); - Os materiais possuem transparência, que permite visualizar o material biológico presente nas câmaras por meio de microscópio invertido, preferencialmente vidro e o PDMS laminado; - O dispositivo é reutilizável.[30] Where: - the cut-out of the laminated PDMS (2) surrounds the microchannel walls and the flat glass lamina (1) defines the bottom of the microchannels (chambers); - the coverslip holes (3) are preferably drilled by chemical corrosion and fit into the ends of the chambers; - Laminated channel PDMS (4) allows the flow of solutions of different concentrations; - sealing is performed by adhering the laminated PDMS to the glass; - the holes in the glass slide (5) may optionally contain fittings for solution inlet hoses (9); - The materials have transparency, which allows to view the biological material present in the chambers through an inverted microscope, preferably glass and laminated PDMS; - The device is reusable.

[31] Em um segundo aspecto, o dispositivo microfluidico (figura 1B e 1C) , denominado dispositivo microfluidico vidro-PMDS (ou Vidro-mPMDS quando o PDMS é modificado quimicamente), que compreende: - um nível inferior (i) contendo as camadas: lâmina de vidro com microcanais (câmaras)(6); e PDMS com o canal em formato de Y e furos vazados (7); - Um nível superior (ii) contendo a camada de lâmina de vidro com furos(5) e podem compreender conexões para mangueiras de entrada de solução (9).[31] In a second aspect, the microfluidic device (Figures 1B and 1C), called the glass-PMDS (or Glass-mPMDS when the PDMS is chemically modified) microfluidic device, comprises: - a lower level (i) containing the layers : glass slide with microchannels (chambers) (6); and PDMS with Y-shaped channel and hollow holes (7); - An upper level (ii) containing the glass sheet layer with holes (5) and may comprise fittings for solution inlet hoses (9).

[32] Sendo que: - as câmaras estão presentes na lamina de vidro (6) em baixo relevo e foram feitos preferencialmente por corrosão química; - o canal é em baixo relevo, em formato de Y, na superfície superior do PDMS(7) e permite o escoamento cas soluções de diferentes concentrações; - os furos no PDMS(7) estão dentro da região do canal e se ajustam às extremidades dos microcanais (câmaras) da lamina de vidro (6); -Opcionalmente o PDMS(2) pode ser modificado quimicamente, como por exemplo com dívinil éter com poliet.ilenoglicol (DEV-PEG), para que se torne menos hidrofcoico, sendo denominada, após modificação, de mPDMS (8); - a selagem é realizada por qualquer meio de fixação móvel, preferencialmente por pressão de presilhas de metal; - Os materiais possuem transparência, que permite visualizar o material biológico presente nas câmaras por meio de microscópio invertido, preferencialmente vidro e o PDMS-o dispositivo é reutilizável.[32] Where: - the chambers are present in the low relief glass sheet (6) and are preferably made by chemical corrosion; - the channel is in low relief, in Y shape, on the upper surface of the PDMS (7) and allows the flow of solutions of different concentrations; the holes in the PDMS (7) are within the channel region and fit the ends of the microchannels (chambers) of the glass slide (6); Optionally PDMS (2) may be chemically modified, for example with vinyl ether with polyethylene glycol (DEV-PEG), so that it becomes less hydrophobic and is called, after modification, mPDMS (8); sealing is by any movable fastening means, preferably by pressing metal clips; - The materials have transparency, which allows to view the biological material present in the chambers through an inverted microscope, preferably glass and the PDMS-the device is reusable.

[33] A invenção descreve o uso do dispositivo para qualquer processo que seja necessário conhecer es condições ideais de substrato ou as condições ideais para o desempenho celular, estimativa de parâmetros cinéticos e avaliar respostas químicas, como quimiotaxia.[33] The invention describes the use of the device for any process that needs to be known for optimal substrate conditions or ideal conditions for cellular performance, estimation of kinetic parameters, and evaluation of chemical responses such as chemotaxis.

[34] Ainda, mais especificamente, a invenção descreve o uso dos dispositivos microfluídicos para otimizar as etapas de seleção das condições ótimas para o crescimento celular microbiano e, assim, melhorar o desempenho da produção em bioprocessos. As células microbianas podem ser selecionadas dentre células livres, células aderentes, células anaeróbias ou aeróbias e células que sofrem ou não quimiotaxia.[34] Still more specifically, the invention describes the use of microfluidic devices to optimize the steps for selecting optimal conditions for microbial cell growth and thereby improving bioprocess production performance. Microbial cells can be selected from free cells, adherent cells, anaerobic or aerobic cells, and cells that do or do not undergo chemotaxis.

[35] No modelo de dispositivo vidro-vidro (Figura IA) foi usado um PDMS laminado para formar os microcanais (do nivel superior e inferior) e ainda promover a aderência entre as bases de vidro. Nos modelos vidro-PDMS (Figura 1B) e vidro-mPDMS (Figura 1C) (mPDMS é PDMS modificado quimicamente para tornar a superfície hidrofílica ou menos hidrofóbica), os microcanais inferiores (onde há o gradiente difusivo e a presença de células) foram cons iruídos por corrosão úmida no vidro (pelo método convencional) e o microcanais superiores (onde escoam as soluções de concentrações diferentes) foram feitos pelo PDMS que forma o canal.[35] In the glass-glass device model (Figure 1A) a laminated PDMS was used to form the microchannels (upper and lower level) and further promote adhesion between the glass bases. In the glass-PDMS (Figure 1B) and glass-mPDMS (Figure 1C) models (mPDMS is chemically modified PDMS to make the surface hydrophilic or less hydrophobic), the lower microchannels (where there is the diffusive gradient and the presence of cells) were cons. Damp corrosion irises on the glass (by the conventional method) and the upper microchannels (where the solutions of different concentrations flow) were made by the PDMS that forms the channel.

[36] Para selar os modelos vidro-PDMS e vidro-mPDMS foi utilizado uma presilha de metal, em ambos os lados, para não gerar diferença de pressão interna no dispositivo. E, como o microcanal onde há a geração de gradiente é ccnstruído no vidro, isso garante que não haja qualquer deformação do mesmo. Além disso, a invenção proposta apresenta, opcionalmente, conectores fixos para entrada e saída de fluxos, na lâmina superior.[36] To seal the glass-PDMS and glass-mPDMS models, a metal clip was used on both sides to avoid internal pressure difference in the device. And since the microchannel where the gradient is generated is built into the glass, this ensures that there is no deformation of it. Furthermore, the proposed invention optionally features fixed connectors for inlet and outlet streams on the upper blade.

Breve descrição das figuras: [37] Para obter um total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuias as quais se faz referências, conforme se segue.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS: [37] For a complete and complete view of the object of this invention, the figures to which reference is made are given as follows.

[38] As Figuras 1A-C representam esquematicamente os dispositivos microfluídicos ora propostos, em que (a) é o dispositivo vidro-vidro, (b) é o dispositivo vidro-PDMS e (c) é o dispositivo vidro-mPDMS.[38] Figures 1A-C schematically represent the proposed microfluidic devices, wherein (a) is the glass-glass device, (b) is the glass-PDMS device and (c) is the glass-mPDMS device.

[39] As Figuras 2A-E representam o esquema de montagem do dispositivo microfluidico vidro-vidro com selagem por aderência do PDMS laminado, em que (a) é a lamínula de vidro lisa com PDMS laminado e a lamínula de vidro com orifícios, (b) é a inoculação da suspensão de células dentro das câmaras de cultivo, (c) é a adesão do PDMS laminado em canal Y na lâmina superior, (d) é a adesão da parte superior com a inferior do dispositivo e (e) é o dispositivo microfluidico vidro-vidro montado.[39] Figures 2A-E depict the assembly scheme of the laminated PDMS adhesion-sealing microfluidic glass-glass device, where (a) is the laminated PDMS smooth glass coverslip and the apertured glass coverslip, ( b) is the inoculation of the cell suspension into the culture chambers, (c) is the adhesion of the Y-channel laminated PDMS on the upper slide, (d) is the adhesion of the upper and the lower part of the device and (e) is the glass-glass microfluidic device mounted.

[40] As Figuras 3A-C mostram o perfil linear do gradiente ao longo do microcanal (câmara) microfluidico vidro-vidro, em que (a) é a formação do gradiente linear com rodamina B e imagem em mosaico capturada após 30 min com aumento de 20x, (b) é o perfil linear pela intensidade de fluorescência e (c) é o perfil de gradiente praticamente linear pela intensidade de cor no dispositivo vidro-vidro.[40] Figures 3A-C show the linear gradient profile along the glass-to-glass microfluidic microchannel (chamber), where (a) is the linear gradient formation with rhodamine B and mosaic image captured after 30 min with magnification. 20x, (b) is the linear profile by fluorescence intensity and (c) is the nearly linear gradient profile by color intensity in the glass-glass device.

[41] As Figuras 4A-C mostram o perfil linear do gradiente ao longo do microcanal microfluídico vidro- PDMS, em que (a) é a formação do gradiente linear de corante em função do contato com as correntes do nível superior, (b) é o perfil de gradiente de intensidade de cor ao longo do microcanal e (c) é o perfil de gradiente praticarrente linear nos microcanais inferiores do dispositivo vidro-PMDS.[41] Figures 4A-C show the linear profile of the gradient along the microfluidic glass-PDMS microchannel, where (a) is the formation of the linear dye gradient as a function of contact with the upper level currents, (b) is the color intensity gradient profile along the microchannel and (c) is the practically linear gradient profile in the lower microchannels of the glass-PMDS device.

[42] A Figura 5 representa esquematícamente a câmara na qual o gradiente de concentração difusivo é gerado em dispositivo microfluídico.[42] Figure 5 schematically depicts the chamber in which the diffusive concentration gradient is generated in a microfluidic device.

[43] As Figuras 6A e 6B correspondem à imagem do crescimento de Saccharomyces cerevisiae ATCC 77 54 ao longo do microcanal(câmara)e do tempo, nos tempos 0 e 1 hora, com concentração inicial de 1,02 x 103 cel/pL.[43] Figures 6A and 6B correspond to the image of Saccharomyces cerevisiae ATCC 77 54 growth along the microchannel (chamber) and time, at times 0 and 1 hour, with initial concentration of 1.02 x 10 3 cell / pL.

[44] As Figuras 7A e 7B correspondem ao cultivo em microcanal microf luídico, em que (a) são os perfis de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 ao longo das câmaras (posição) e do tempo e (b) e o diagrama esquemático da câmara e as divisões de contagem de células, denominadas de microcâmaras.[44] Figures 7A and 7B correspond to microfluidic microchannel cultivation, where (a) are the growth profiles of Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 yeast along the chambers (position) and time and (b) and the schematic diagram. and the cell counting divisions, called microcameras.

[45] As Figuras 8A e 8B correspondem às curvas de crescimento da S. cerevisiae ATCC 7754 em (a) dispositivo microfluídico e (b) cultivo convencional em batelada.[45] Figures 8A and 8B correspond to the growth curves of S. cerevisiae ATCC 7754 in (a) microfluidic device and (b) conventional batch cultivation.

[46] A Figura 9 representa graficamente os parâmetros cinéticos estimados para a cinética de crescimento celular para S. cereviseae, descrito por Monod.[46] Figure 9 graphs the estimated kinetic parameters for cell growth kinetics for S. cereviseae described by Monod.

Descrição detalhada, da invenção: [47] A invenção descreve dispositivos microfluídicos estruturados para a geração de um gradiente de concentração difusivo em materiais biocompatíveis, de fácil montagem e reutilizáveis, para avaliação de comportamento celular.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION: [47] The invention describes structured microfluidic devices for generating a diffusive concentration gradient in biocompatible, easy-to-assemble and reusable materials for assessing cellular behavior.

[48] Os dispositivos microfluídicos ora propostos são configurados em dois níveis (inferior e superior) e as suas geometrias foram baseadas no estudo realizado po:: Atencia et al.,2012 já disponível no estado da técnica.[48] The microfluidic devices proposed here are configured in two levels (lower and upper) and their geometries were based on the study carried out by: Atencia et al., 2012 already available in the state of the art.

[49] No entanto, os novos dispositivos microfluídicos descritos se diferem na composição dos materiais usados, sendo reutilizáveis e apresentando fácil montagem, uso de conexões e métodos de vedação eficazes e simples e que não afetam as células microbianas por magnetismo.[49] However, the new microfluidic devices described differ in the composition of materials used, are reusable and easy to assemble, use effective and simple sealing methods and connections that do not affect microbial cells by magnetism.

[50] Os dispositivos microfluídicos da presente invenção são: (i) vidro-vidro (Figura IA), (ii) vidro-PMDS (polidimetilsiloxano)(Figura 1B), e (iii) vidro- mPDMS (polidimetilsiloxano modificado) (Figura 1C), em que o mPDMS corresponde a um PDMS modificado quimicamente para impedir a adesão das células, pela característica intrínseca da hidrofobicidade celular, ao polímero, também hidrofóbico.[50] The microfluidic devices of the present invention are: (i) glass-glass (Figure IA), (ii) glass-PMDS (polydimethylsiloxane) (Figure 1B), and (iii) glass-modified mPDMS (Figure 1C) ), wherein mPDMS corresponds to a chemically modified PDMS to prevent cell adhesion by the intrinsic characteristic of cellular hydrophobicity to the also hydrophobic polymer.

[51] Os materiais utilizados, vidro e PDMS, são ambos reutilizáveis sem perdas na configuração e eficácia dos sistemas, desde que não seja empregado solvente orgânico que pode deformar o PDMS.[51] The materials used, glass and PDMS, are both reusable without loss in system configuration and effectiveness, provided no organic solvent that can deform the PDMS is employed.

[52] A Tabela 1 mostra, resumidamente, os materiais que constituem cada um dos dispositivos desta onvenção. A estrutura dos mesmos é mostrada nas Figuras 1A-C .[52] Table 1 summarizes the materials that make up each of the provisions of this invention. Their structure is shown in Figures 1A-C.

Tabela 1: Resumo dos três modelos de dispositivos microfluídicos propostos.Table 1: Summary of the three proposed microfluidic device models.

[53] Nos dispositivos microfluidicos ora propostos, o nível inferior apresenta microcanais, apropriados para o cultivo das células microbianas. Tais microcanais são denominados câmaras e neles ocorre a formação do gradiente de concentração difusivo.[53] In the proposed microfluidic devices, the lower level has microchannels suitable for the cultivation of microbial cells. Such microchannels are called chambers and in them the formation of the diffusive concentration gradient occurs.

[54] No nível superior dos mesmos, ocorre o fluxo de duas soluções de diferentes concentrações, em regime laminar, que acessam o nível inferior por meio ds orifícios localizados nas extremidades das câmaras, gerando, desta forma, o gradiente difusivo no nível inferior.[54] At their upper level, two solutions of different laminar flow concentrations access the lower level through holes located at the ends of the chambers, thereby generating the diffusive gradient at the lower level.

[55] Os dispositivos microfluidicos ora propostos são mais bem descritos a seguir.[55] The microfluidic devices proposed here are best described below.

Dispositivo vidro-vidro (Figura IA): [56] 0 dispositivo vidro-vidro trata-se de um sistema hidrofílico, totalmente transparente, que permite avaliar e visualizar o comportamento de células livres em microscópio óptico.Glass-to-glass device (Figure IA): [56] The glass-to-glass device is a fully transparent hydrophilic system that allows the evaluation and visualization of free cell behavior under an optical microscope.

[57] Além disso, o vidro é um material resistente e não permite a passagem de gases, o que viabiliza os estudos com células anaeróbías ou facultativas.[57] In addition, glass is a tough material and does not allow gas to pass through, making studies with anaerobic or facultative cells possible.

[58] No dispositivo vidro-vidro, o nível inferior (i) é formado por lâmina (ou lamínula) de vidro liss(l). Acima desta lâmina, é colocado o PDMS laminado(2), que contorna as paredes dos microcanais e promove a aderência entre a base de vidro e a camada superior. As geometrias feicas no PDMS laminado foram criadas por ablação em máquina cie laser de CO2 do dispositivo vidro-vidro é feito por lamínula de vidro (3) com orifícios de 0,5 mm, que se ajustam perfeitamente aos microcanais inferiores (câmaras) e que dão acesso aos mesmos.[58] In the glass-to-glass device, the lower level (i) consists of liss glass slide (l) (l). Above this slide, laminated PDMS (2) is placed, which bypasses the walls of the microchannels and promotes adhesion between the glass base and the upper layer. The geometries made in the laminated PDMS were created by CO2 laser machine ablation of the glass-glass device and made by glass coverslip (3) with 0.5 mm holes, which fit perfectly into the lower microchannels (chambers) and which give them access.

[59] 0 nivel superior é formado por PDMS laminado na geometria de canal em Y(4), por onde escoam as soluções. Os orifícios são feitos por processo de corrosão ámida e, o PDMS, por litografia macia. E para fechar o drspositivo, utiliza-se uma lâmina de vidro (5) contendo duas entradas e uma salda, compreendendo, ainda, o encaixe das mangueiras(9) por onde serão bombeadas as soluções por bomba seringa.[59] The upper level is formed by laminated PDMS in the Y-channel geometry (4), through which the solutions flow. The holes are made by wet corrosion process and the PDMS by soft lithography. And to close the device, a glass slide (5) containing two inlets and an outlet is used, further comprising the fitting of the hoses (9) through which the solutions will be pumped by syringe pump.

[60] A selagem do dispositivo vidro-vidro è realizada pela aderência do PDMS laminado, que confere uma boa adesão e ausência de vazamentos por todo o tempo de ensaio, mesmo em vazões mais altas. O dispositivo é de selagem reversível e montado por etapas, as quais estão mostradas na Figura 2Ά-E.[60] The sealing of the glass-glass device is performed by adhering the laminated PDMS, which gives good adhesion and no leakage throughout the test time even at higher flow rates. The device is reversible sealing and step mounted, which are shown in Figure 2Ά-E.

Dispositivos vidro-PDMS (Figura 1B) e vídro-mPDMS (Figura 1C) : [61] Os dispositivos vidro-PDMS e vidro-mPDMS, além de reutilizáveis, são mais facilmente construídos e apresentam diversas possibilidades de aplicações com células livres, células aderentes, células que sofrem ou não qaimiotaxia, bem como sistemas anaeróbios ou aeróbios.Glass-PDMS (Figure 1B) and Glass-mPDMS devices (Figure 1C): [61] Glass-PDMS and glass-mPDMS devices, in addition to being reusable, are more easily constructed and offer many possibilities for free cell, adherent cell applications. , cells that suffer or not qaimiotaxia, as well as anaerobic or aerobic systems.

[62] Os dois modelos são configurados da mesma maneira e também apresentam geometria baseada no trabalhe de Atencia et al.,2012.[62] Both models are configured in the same way and also feature geometry based on the work of Atencia et al., 2012.

[63] O nível inferior(i) destes dispositivos é formado por lâmina de vidro contendo os microcanais(6) para cultivo celular (câmaras), os quais foram feitos por corrosão úmida, o que confere características de durabilidade, resistência e maior área hidrofílica; e uma peça em PDMS configurando o canal em formato de Y e contendo orifícios de 0,5 mm (7) que se encaixam nas extremidades dos microcanais inferiores para servirem de entrada para o nível inferior. A p^ça em PDMS foi feita por litografia macia.[63] The lower level (i) of these devices is formed by glass slide containing microchannels (6) for cell culture (chambers), which were made by wet corrosion, which gives durability, strength and larger hydrophilic area characteristics. ; and a PDMS part configuring the Y-shaped channel and containing 0.5 mm holes (7) that engage the ends of the lower microchannels to serve as input to the lower level. The PDMS piece was made by soft lithography.

[64] No dispositivo vidro-PDMS, usou-se o PDMS nativo, isto é, sem modificação química. Devido à hidrofobicididade do PDMS, as células, também hidrofóbicas, podem aderidir ao polímero, e como alternativa para este comportamento, o uso de um tensoativo à suspensão celular pode ser utilizado para impedir a adesão.[64] In the glass-PDMS device, native PDMS was used, ie without chemical modification. Due to the hydrophobicicity of PDMS, cells, also hydrophobic, may adhere to the polymer, and as an alternative to this behavior, the use of a cell suspension surfactant may be used to prevent adhesion.

[65] 0 PDMS pode, ainda, ser modificado qaimicamente (mPDMS) com diviníl éter com polietilenoglicol (DEV-PEG), além de outros métodos disponíveis na literatura científica, a fim de se obter uma superfície menos hidrofóbica, aqui denominado PMDS modificado(8).[65] PDMS can also be chemically modified (mPDMS) with polyethylene glycol divinyl ether (DEV-PEG) and other methods available in the scientific literature to provide a less hydrophobic surface, hereinafter modified PMDS ( 8).

[66] Para compor o nível superior(ii) e fechar ambos os dispositivos, coloca-se uma lâmina de vidro(5) contendo duas entradas e uma saída, compreendendo, ainda, o encaixe das mangueiras (9) por onde serão bombeadas as soluções por bomba seringa.[66] In order to compose the upper level (ii) and close both devices, a glass slide (5) containing two inlets and one outlet is provided, comprising the fitting of the hoses (9) through which the pumping will be pumped. solutions by syringe pump.

[67] 0 dispositivo vidro-PDMS ou mPDMS foi vedado com a pressão de presilhas de metal, que conferiu uma selagem eficiente, permitindo um escoamento estável das correntes do nível superior e capacidade de geração de gradiente no nível inferior.[67] The glass-PDMS or mPDMS device was sealed with metal clamp pressure, which provided efficient sealing, allowing stable flow of upper level currents and lower level gradient generation capability.

[68] Sendo assim, o dispositivo foi capaz de formar gradiente de concentração linear e puramente d:_fusivo nas câmaras inferiores, mostrando-se aplicável para sstudos com células.[68] Thus, the device was able to form a linear and purely fusive concentration gradient in the lower chambers, and was applicable for cell studies.

[69] Logo, a presente invenção ainda provê o uso dos dispositivos microfluídicos para otimizar as etapas de seleção das condições ótimas para o crescimer.to celular microbiano e, assim, melhorar o desempenho da produção em bioprocessos.[69] Thus, the present invention further provides the use of microfluidic devices to optimize the steps for selecting optimal conditions for microbial cell growth and thus improving bioprocess production performance.

Caracterizações operacionais dos dispositivos: - Limites de vazões para geração de fluxos constantes: [70] Após a montagem dos dispositivos, a determinação das vazões foi definida em função da geração de fluxos constantes no nível superior e, assim, formar o gradiente de concentração difusivo no nível inferior.Operating characteristics of the devices: - Flow limits for constant flow generation: [70] After mounting the devices, flow determination was defined as a function of constant flow generation at the upper level and thus forming the diffusive concentration gradient. on the lower level.

[71] Desta forma, foram determinados os limites de vazões a partir da observação da formação de oscilações dos fluxos na interface do microcanal superior, por onde escoam as correntes de diferentes concentrações. - Formação do gradiente de concentração difusivo: [72] A fim de avaliar a capacidade de geração do gradiente de concentração difusivo de moléculas para o dispositivo vídro-vidro, utilizou-se solução de rodamina B em uma das correntes e, na outra, água destilada. A câmara de cultivo de células foi preenchida com água destilada e avaliado a capacidade e o tempo de geração de: gradiente linear.[71] Thus, flow limits were determined by observing the formation of flow oscillations at the upper microchannel interface, through which currents of different concentrations flow. - Diffusive concentration gradient formation: [72] In order to evaluate the diffusive concentration gradient generation capacity of molecules for the glass-glass device, rhodamine B solution was used in one of the streams and, in the other, water. distilled. The cell culture chamber was filled with distilled water and the capacity and generation time of: linear gradient were evaluated.

[73] Nos dispositivos Vidro-PDMS e Vidro-mPDMS, foi utilizado corante alimentício líquido e hidrcfílico nas câmaras inferiores de cada dispositivo e, nas correntes de entrada, solução de 40 e 0 g/L de glicose, tendo água como solvente.[73] In the Glass-PDMS and Glass-mPDMS devices, liquid and hydrophilic food coloring was used in the lower chambers of each device and in the inlet streams 40 and 0 g / l glucose solution with water as solvent.

[74] 0 perfil de gradiente de concentração por difusão foi avaliado em função da intensidade de cor dentro do microcanal inferior (câmara para cultivo de células). - Resultados obtidos: - Limites de vazões para geração de fluxos constantes: [75] O fluxo de escoamento é constante no nível superior, porém as concentrações das duas correntes de entrada são distintas. Este procedimento é imposro no nivel superior para garantir a formação de um gradiente de concentração difusivo nas câmaras inferiores.[74] The diffusion concentration gradient profile was evaluated for color intensity within the lower microchannel (cell culture chamber). - Results obtained: - Flow limits for constant flow generation: [75] The flow flow is constant at the upper level, but the concentrations of the two input streams are distinct. This procedure is imposed at the upper level to ensure the formation of a diffusive concentration gradient in the lower chambers.

[76] Desta forma, determinou-se experimentalmente os limites de vazão que geram um fluxo de escoamento laminar e estável, pois a oscilação das correntes (no canal superior) interfere na formação de gradiente de concentração linear (gerado na câmara inferior).[76] Thus, the flow limits that generate a stable laminar flow flow were experimentally determined because the oscillation of currents (in the upper channel) interferes with the formation of linear concentration gradient (generated in the lower chamber).

[77] Assim, analisou-se o comportamento do fluxo em função das vazões das soluções, variando de 5 a 60 pL/min, observando se o perfil das correntes era oscilatório ou estável.[77] Thus, flow behavior as a function of solution flow rates was analyzed, ranging from 5 to 60 pL / min, observing whether the current profile was oscillatory or stable.

[78] O fluxo se manteve estável, macroscDpicamente, (sem oscilações) numa vazão de 15 a 25 pL/mim. - Formação do gradiente de concentração difusivo: [79] A partir das determinações dos parâmetros operacionais, analisou-se a capacidade de fsrmação de gradiente de concentração difusivo nos três dispositivos microfluidicos propostos.[78] Flow remained macroscally stable (without oscillations) at a flow rate of 15 to 25 pL / min. - Diffusive concentration gradient formation: [79] From the determinations of the operating parameters, the diffusive concentration gradient formation capability of the three proposed microfluidic devices was analyzed.

[80] A fim de avaliar a capacidade de geração do gradiente de concentração difusivo no dispositivo vidro-vidro, ao medir a intensidade de fluorescência ie rodamina (Figura 3A) , observou-se a formação de gradiente linear e estável após aproximadamente 30 minutos (vide Figura 3B).[80] In order to assess the diffusive concentration gradient generation capacity in the glass-glass device, when measuring the fluorescence intensity ie rhodamine (Figure 3A), stable and linear gradient formation was observed after approximately 30 minutes ( see Figure 3B).

[81] Ainda, a formação do gradiente foi observada também utilizando corante no microcanal inferior e impondo diferentes concentrações de glicose nas correntes (0 e 40 g/L) , onde foi observado que o perfil de gradiente nos microcanais foi linear tanto pela avaliação da ,_ntensidade de fluorescência quanto pela utilização de corante (Figura 3C) .[81] Also, gradient formation was also observed using dye in the lower microchannel and imposing different glucose concentrations in the currents (0 and 40 g / L), where it was observed that the gradient profile in the microchannels was linear both by the evaluation of the fluorescence intensity for use of dye (Figure 3C).

[82] O perfil linear do gradiente indicou a ausência de , convecção dentro dos microcanais, confirmando o gradiente de concentração difusivo. Ainda, o gradiente de concentração, indicado pela intensidade de fluorescência, se manteve estável após a geração do gradiente linear.[82] The linear gradient profile indicated the absence of convection within the microchannels, confirming the diffusive concentration gradient. Moreover, the concentration gradient, indicated by fluorescence intensity, remained stable after the generation of the linear gradient.

[83] Para os modelos de dispositivos viiro-PDMS e vidro-mPDMS, observou-se, após determinado tempo, a formação de gradiente de concentração do corante em função da variação da coloração na câmara inferior (vide Figura 4A) . Este gradiente de cor é resultado do fluxo de matéria de glicose e corante na câmara inferior, uma vez que hou^e um fluxo mássico de glicose da região de maior concentração para a região de menor concentração.[83] For the viiro-PDMS and glass-mPDMS device models, dye concentration gradient formation as a function of color variation in the lower chamber was observed after a period of time (see Figure 4A). This color gradient is a result of the flow of glucose matter and dye in the lower chamber, since there is a mass flow of glucose from the highest concentration to the lowest concentration region.

[84] A região de menor coloração de corante é a região onde há o escoamento da concentração de glicose em 40 g/L. Neste caso, uma análise qualitativa indica que a dLfusividade do corante nesta região será menor, pois uma maior resistência a transferência de massa é imposta pela presença da glicose.[84] The region with the lowest dye color is the region where the glucose concentration flows at 40 g / L. In this case, a qualitative analysis indicates that dyefusivity in this region will be lower, as greater resistance to mass transfer is imposed by the presence of glucose.

[85] No outro extremo da câmara, onde a coloração é mais intensa, indicando maior concentração do corante, é a região onde não há glicose. Neste caso, a difusividade do corante no meio será maior, criando um fluxo liquido do corante ao longo da câmara.[85] At the other end of the chamber, where coloration is most intense, indicating higher dye concentration, is the region where there is no glucose. In this case, the dye diffusivity in the medium will be higher, creating a liquid dye flow throughout the chamber.

[86] Desta forma, a resultante do fluxo total de corante (NA) ocorre no sentido da maior para a menor concentração de glicose das correntes (de escoamento na câmara superior), já que a resistência ao transporte de matéria é menor na menor concentração imposta (Figura 4B). O gradiente de cor começou a se formar após 5 min, ficando estável e linear em aproximadamente 35 min (enquanto há a presença do corante) , (Figura 4C).[86] Thus, the resultant of total dye flow (NA) occurs from highest to lowest glucose concentration of streams (upper chamber flow), as the resistance to matter transport is lower at the lowest concentration. imposed (Figure 4B). The color gradient began to form after 5 min, becoming stable and linear at approximately 35 min (while dye is present), (Figure 4C).

Aplicação do dispositivo vidro-vidro para, avaliar o comportamento celular microbiano: [87] Testes com células da levedura Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 para analisar o comportamento celular microbiano. Em vista da escala micrométrica do sistema microfluidico, a concentração de S. cerevisiae utilizada foi de 0,5xl02 cel/pL.Application of the glass-glass device to evaluate microbial cellular behavior: [87] Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 yeast cell tests to analyze microbial cellular behavior. In view of the micrometer scale of the microfluidic system, the concentration of S. cerevisiae used was 0.5x102 cell / pL.

[88] 0 sistema microfluidico foi montado em fluxo laminar e a suspensão celular foi colocada nas câmaras de cultivo. Para impor a diferença de concentração de glicose, utilizaram-se duas soluções desgaseifiçadas de meio YPD variando apenas a concentração de glicose, sendo um meio ausente de glicose.[88] The microfluidic system was mounted in laminar flow and the cell suspension was placed in the culture chambers. To impose the difference in glucose concentration, two degassed solutions of YPD medium were used, varying only the glucose concentration, being one medium absent from glucose.

[89] 0 crescimento microbiano foi observado usando microscópio confocal com sistema de controle de cemperatura a 30°C. As imagens dos microeanais foram capturadas a cada hora, num período de lOh e em condição anaeróbia.[89] Microbial growth was observed using confocal microscope with 30 ° C temperature control system. Microanalysis images were captured every hour, during a 10h period and in anaerobic condition.

[90] - Avaliação das células de S. cerevisiae: [91] A partir das imagens adquiridas do sistema microfluidico ao longo do tempo, realizou-se a contagem direta das células utilizando o software ImageJ, tanto para realizar as contagens quanto para desenhar as mizrocâmaras [92] Para as contagens diretas, determinou-se intervalos de 0,5 mm (para o gradiente de 0 a 40 g/L de glicose) e 0,25 mm (gradiente de 0 a 3 g/L), denominados de microcâmaras (Figura 30).[90] - Evaluation of S. cerevisiae cells: [91] From the images acquired from the microfluidic system over time, direct cell counting was performed using ImageJ software, both for counting and drawing. [92] For direct counts, ranges of 0.5 mm (for the 0 to 40 g / L glucose gradient) and 0.25 mm (0 to 3 g / L gradient), designated as microcameras (Figure 30).

[93] Foram excluídos os pontos extremos dos microcanais, porque não há geração de gradieate nestas regiões, uma vez que são as portas de acesso das correntes . das soluções de concentrações diferentes de glicose ao microcanal (vide Figura 5). - Cultivo em batelada: [94] Para o cultivo em batelada, foram realizados ensaios usando meio YPD,num volume de 100 mL em frascos de Erlemmeyer agitados, variando apenas a conceitração de glicose de 0 (controle) a 40 g/L de glicose.[93] Microchannel endpoints have been excluded because there is no gradieate generation in these regions as they are the access ports for the currents. solutions of different glucose concentrations to the microchannel (see Figure 5). - Batch cultivation: [94] For batch cultivation, assays were performed using YPD medium in a volume of 100 ml in shaken Erlemmeyer flasks, varying only the glucose concept from 0 (control) to 40 g / L glucose. .

[95] A concentração celular foi determinada através da leitura de absorbância (600 nm) a cada 1 h, com o auxílio de curva de calibração obtida por contagem em câmara de Neubauer.[95] Cell concentration was determined by absorbance reading (600 nm) every 1 h with the aid of a calibration curve obtained by counting in a Neubauer chamber.

Determinação dos parâmetros cinéticos: [96] Para determinar a velocidade específica de crescimento (μχ) da Sacchoromyces cerevisiae ATCG 7754, foi considerada a inclinação da região linear dc curva de crescimento semi-logaritma através da Equação 1: (Equação 1) [97] Considerando cinética de crescimento conforme Equação de Monod, a velocidade específica de srescimento máxima (pmáx) e a constante de saturação (Ks) , a gual indica afinidade do micro-organismo pelo substrato (S) podem ser determinadas de acordo com a Equação 2: (Equação 2) - Comportamento da Saccharomyces cerevisiae ATTC 7754 em ambiente de gradiente de concentração difusivo: [98] 0 dispositivo microfluidico vidro-vidio mostrou-se adequado para o cultivo de Saccharomyces cere^isiae ATCC 7754, uma vez que observou um aumento no número de células . durante o tempo, permitindo a investigação dos parâmetros cinéticos e comparação com ensaios convencionais de cultivo em batelada e dados da literatura.Determination of Kinetic Parameters: [96] To determine the specific growth velocity (μχ) of Sacchoromyces cerevisiae ATCG 7754, the slope of the linear region of the semi-logarithmic growth curve was considered using Equation 1: (Equation 1) [97] Considering growth kinetics according to the Monod equation, the specific maximum growth rate (pmmax) and saturation constant (Ks), which indicates the affinity of the microorganism for the substrate (S) can be determined according to Equation 2: (Equation 2) - Behavior of Saccharomyces cerevisiae ATTC 7754 in a diffusive concentration gradient environment: [98] The glass-glass microfluidic device was suitable for the cultivation of Saccharomyces cere ^ isiae ATCC 7754 as it observed an increase in the cell number. over time, allowing investigation of kinetic parameters and comparison with conventional batch cultivation assays and literature data.

[99] Além disso, avaliou-se o funcionamento do dispositivo para distintos intervalos de concentração, bem como a utilização de subdivisões do microcanal con dimensões diferentes para contagens de células. - Perfil de crescimento celular em iispositivo microfluidico com gradiente de concentração difusivo: [100] A levedura S. cerevisiae ATCC 7754 fo:. inoculada no dispositivo. Na câmara superior, manteve-se o escoamento de meio YPD nas duas entradas, sendo que apresentava meio YPD sem glicose e outra o meio YPD com 40 g/L de glicose.[99] In addition, the operation of the device was evaluated for different concentration ranges as well as the use of microchannel subdivisions with different dimensions for cell counts. - Cell growth profile in a diffusive concentration gradient microfluidic device: [100] S. cerevisiae yeast ATCC 7754 fo :. inoculated into the device. In the upper chamber, the flow of YPD medium was maintained in both entries, with YPD medium without glucose and another YPD medium with 40 g / L glucose.

[101] O comportamento celular foi monitorado por 10 h e observou-se o crescimento da levedura no gradiente de substrato imposto (Figura 6A e B).[101] Cell behavior was monitored for 10 h and yeast growth was observed on the imposed substrate gradient (Figure 6A and B).

[102] Em ensaio usando menor concentração celular, foi possível obter, em microscópio automatizado, as imagens das células ao longo da câmara de gradiente de concentração. A partir destas imagens, realizou-se a contagem direta das células (Figura 7A), correlacionando com a posição no microcanal e consequentemente com a concentração de glicose (Figura 7B).[102] In an assay using lower cell concentration, images of cells along the concentration gradient chamber could be obtained under an automated microscope. From these images, the direct cell count (Figure 7A) was performed, correlating with the position in the microchannel and consequently with the glucose concentration (Figure 7B).

[103] Pode-se observar, na Figura 7B, que após 3 h de acompanhamento do crescimento celular, houve maior número de células nas microcâmaras com 23 e 30 g/L de glicose e este comportamento se manteve até 10 h, o período avaliado (Figura 7A) .[103] It can be seen from Figure 7B that after 3 h of cell growth follow-up, there was a higher number of cells in the 23 and 30 g / L glucose microcameras and this behavior was maintained up to 10 h, the assessed period. (Figure 7A).

[104] Nesta faixa de concentração, o resultado observado foi correspondente ao esperado, uma vez que a concentração . ótima de glicose para o crescimento celular não deve ser maior do que 25% (p/v), pois na fase inicial de crescimento a levedura utiliza a glicose para o seu metabolismo e um elevado teor deste açúcar eleva a pressão osmótiea do meio.[104] In this concentration range, the observed result was corresponding to the expected since the concentration. The optimum glucose for cell growth should not be higher than 25% (w / v), because in the initial phase of growth the yeast uses glucose for its metabolism and a high content of this sugar increases the osmotic pressure of the medium.

[105] Desta forma, pode-se notar que as células da levedura apresentaram o mesmo comportamento espeirado em um sistema de fermentação convencional, comprovando-se a viabilidade da avaliação do crescimento microbiano nesta faixa de concentração de glicose e consequente determinação dos parâmetros cinéticos em sistema microfluídico. - Cinética de crescimento e comparação com cultivo convencional em batelada: [106] Uma vez observado o crescimento celular no dispositivo microfluídico e tendo o número de células para cada microcâmara de gradiente ao longo de 10 h, pode-se construir as curvas de crescimento microbiano para cada faixa de concentração de glicose obtidas e determinar a velocidade específica de crescimento da levedura nestas condições (Figura 8A).[105] Thus, it can be noted that yeast cells exhibited the same behavior expected in a conventional fermentation system, proving the feasibility of evaluating microbial growth in this glucose concentration range and consequently determining kinetic parameters in microfluidic system. - Growth kinetics and comparison with conventional batch cultivation: [106] Once cell growth is observed in the microfluidic device and having the number of cells for each gradient microchamber over 10 h, microbial growth curves can be constructed. for each glucose concentration range obtained and determine the specific rate of yeast growth under these conditions (Figure 8A).

[107] Para comparar os resultados obtidos com o dispositivo microfluídico, realizou-se uma série de cultivos em sistema batelada usando as concentrações de 0 (controle) a 40 g/L de glicose, tendo as mesmas condições usadas no dispositivo microf luídico e concentração celular de microorganismo. Desta forma, pode-se construir as curvas de crescimento microbiano ao longo de 10 h de ensaie em sistema batelada (Figura 8B).[107] To compare the results obtained with the microfluidic device, a series of batch cultures were performed using concentrations from 0 (control) to 40 g / l glucose, having the same conditions as those used in the microfluidic device and concentration. microorganism cell. In this way, microbial growth curves can be constructed over 10 hr of batch assay (Figure 8B).

[108] No sistema microfluidico foi observadc um perfil de crescimento com maior número de células nas condições de 23 a 30 g/L de glicose, tendo comportamento similar ao . cultivo em batelada.[108] In the microfluidic system, a growth profile with larger number of cells was observed under the conditions of 23 to 30 g / L of glucose, having a similar behavior to that. batch cultivation.

[109] No entanto, a concentração de glicose e constante na microfluidica e por isso foi utilizado um volume de 100 mL meio YPD para o cultivo em batelada, com a mesma concentração inicial de células empregada na microfluidica, a fim de tentar reproduzir a mesma condição. Sends assim, no cultivo em batelada, foi observado um menor númerc de células com maiores oscilações ao longo do tempo.[109] However, the glucose concentration is constant in microfluidics, so a volume of 100 mL YPD medium was used for batch cultivation, with the same initial cell concentration employed in microfluidics to try to reproduce the same. condition. Thus, in batch cultivation, a smaller number of cells with larger oscillations was observed over time.

[110] Ainda assim, após obter as curvas de crescimento microbiano em ambos os sistemas, foram determinadas as velocidades especificas de crescimento máximas da levedura em sistema microfluidico e em batelada convencional, conforme observado Tabela 2 abaixo.[110] Nevertheless, after obtaining microbial growth curves in both systems, the maximum specific growth rates of yeast in the conventional batch and microfluidic system were determined, as noted in Table 2 below.

Tabela 1: Comparação entre a velocidade específica de crescimento da S. cerevisiae ATCC 7754 em sistema microfluidico com gradiente de concentração e fermentação batelada.Table 1: Comparison between S. cerevisiae ATCC 7754 specific growth rate in microfluidic system with concentration gradient and batch fermentation.

[111] A partir da Tabela 2, observa-se que não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias das velocidades especificas de crescimento, uma vez que os . experimentos em microfluidica e na batelada convencional foram conduzidos a concentrações celulares baixas e qualquer valor dentro da faixa de concentração de glicose estudada correspondia a uma quantidade suficiente para sustentar o crescimento microbiano. - Cínética de Monod na microfluidica;[111] From Table 2, it can be seen that there was no statistically significant difference between the means of specific growth rates, since the. Microfluidics and conventional batch experiments were conducted at low cell concentrations and any value within the studied glucose concentration range was sufficient to sustain microbial growth. - Monod kinetics in microfluidics;

[112] As condições da microf luidica e a ottenção das velocidades especificas de crescimento celular neste sistema permitem ampliar as investigações de ciiética de crescimento, com isso pode-se investigar os parâmetros da cinética de crescimento celular descrita pela equação de Monod.[112] Microfluidic conditions and the attainment of specific cell growth rates in this system allow us to broaden the investigations of growth cynics, thereby investigating the parameters of cell growth kinetics described by the Monod equation.

[113] Ainda, é possível a avaliação do funcionamento do dispositivo em menores concentrações do substrato limitante e com intervalos menores de mierocâmaras para contagens a fim de comparar o efeito do próprio gradiente dentro da microcâmara.[113] In addition, it is possible to evaluate device operation at lower limiting substrate concentrations and with smaller counting chamber ranges to compare the effect of the gradient itself within the microcamera.

[114] Sabendo que a concentração de glicose § constante no microcanal, isso possibilita a determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento de Monod, nãc apenas nos tempos iniciais, como são feitos nos sistemas convencionais, uma vez que a variação do substrato inflaência nos resultados.[114] Knowing that the concentration of glucose in the microchannel is constant, this makes it possible to determine the kinetic growth parameters of Monod, not only in the early times, as they are done in conventional systems, since substrate variation inflates results.

[115] Desta forma, em um gradiente de 0 £ 3 g/L de glicose e com mierocâmaras de contagem com intervalos menores, determinou-se o perfil do crescimento microbiano em função do substrato limitante (S) (glicose) (Figura 9).[115] Thus, at a gradient of 0 lg / l glucose and with smaller interval counting chambers, the microbial growth profile was determined against the limiting substrate (S) (glucose) (Figure 9). .

[116] A partir da obtenção dos dados experimentais, a constante de saturação (Ks) , e a velocidade especifica máxima de crescimento (pmãx) , descritos pela Equação de Monod ^ (Equação 2), podem ser estimados.[116] From the experimental data, the saturation constant (Ks) and the maximum specific growth rate (pmmax), described by the Monod Equation (Equation 2), can be estimated.

[117] Através do ajuste não linear per mínimos quadrados, obteve-se os valores de 0,32 ± 0,01 h_1 e 0,27 ± 0,04 g/L, respectivamente, para pmáx e Ks (Figura 9) .[117] Through the nonlinear least-squares fit, the values were 0.32 ± 0.01 h_1 and 0.27 ± 0.04 g / L, respectively, for pmmax and Ks (Figure 9).

[118] Através desta curva de crescimento e os resultados para os parâmetros cinéticos, descritos pela equação de Monod (Equação 2) , observa-se que os dados cinéticos obtidos na microfluídica estão coerentes com os dados da literatura determinados pela fermentação convencional.[118] Through this growth curve and the results for the kinetic parameters, described by the Monod equation (Equation 2), it is observed that the kinetic data obtained in microfluidics are consistent with literature data determined by conventional fermentation.

[119] Desta forma, nota-se a viabilidade deste dispositivo microfluídico com formação de gradiente difusivo para investigar os parâmetros cinéticos do microrganismo e com isso aumentar a produtividade de uma reação em bioprocessos.[119] Thus, the feasibility of this diffusive gradient-forming microfluidic device is noted for investigating the kinetic parameters of the microorganism and thereby increasing the productivity of a bioprocess reaction.

[120] Diante dos testes realizados e dos resultados obtidos, os dispositivos microfluídicos aqui propostos foram capazes em gerar um gradiente com perfil linear e estável.[120] Given the tests and results obtained, the microfluidic devices proposed here were able to generate a gradient with linear and stable profile.

[121] A geometria e as composições dos três dispositivos da presente invenção apresentaram selagem eficiente, permitindo um escoamento estável das correntes do nível superior e capacidade de geração de gradiente no nível inferior.[121] The geometry and compositions of the three devices of the present invention were efficiently sealed, allowing stable flow of upper level currents and lower level gradient generation capability.

[122] Os três dispositivos apresentaram formação de gradiente de concentração linear e puramente difusivos nas câmaras (microcanais inferiores), mostrando-se aplicáveis para estudos com células.[122] The three devices showed linear and purely diffusive concentration gradient formation in the chambers (lower microchannels) and were applicable for cell studies.

[123] 0 dispositivo vidro-vidro, por apresentar superfícies hidrofílicas e ausentes de trocas gasosas, foi escolhido para estudos com células livres err condições anaeróbias, mostrando-se aplicável para a cultivo . microbiano, tendo parâmetros cinéticos semelhantes ao cultivo convencional o que pode contribuir em biaprocessos.[123] The glass-glass device, as it has hydrophilic surfaces and is free of gas exchange, was chosen for studies with free cells under anaerobic conditions and is applicable for cultivation. microbial, having kinetic parameters similar to conventional cultivation which can contribute to biaprocesses.

[124] Ainda, os dispositivos com geração de gradiente de concentração difusivo permitiram a determinação da cinética de Monod com valores coerentes aos da literatura, sendo que os resultados foram obtidos de forma mais prática quando comparados às técnicas convencionais.[124] Furthermore, devices with diffusive concentration gradient generation allowed the determination of Monod kinetics with values consistent with those in the literature, and the results were obtained more practically when compared to conventional techniques.

[125] Diante disso, os dispositivos propostos mostraram-se eficientes para a determinação de parâmetros cinéticos e viáveis para a otimização em bioprocessos.[125] Given this, the proposed devices have been shown to be efficient for determining kinetic and viable parameters for bioprocess optimization.

REIVINDICAÇÕES

Claims

Microfluidic device characterized in that it is structured to generate a diffusive concentration gradient comprising:. - a lower level (i) containing the layers: smooth glass slide (l); Rolled, cut and cast PDMS containing at least one chamber (2); and cover slip with holes (3); - a higher level (ii) containing the canes: Y-shaped hollow channel laminated PDMS (4); 3 glass slide with holes (5).

Device according to Claim 1, characterized in that the cut-off of laminated PDMS (2) surrounds the microchannel walls and the smooth glass slide (1) defines the bottom of the microchannels (chambers).

Device according to Claim 1, characterized in that the coverslip holes (3) are preferably drilled by chemical corrosion and fit to the ends of the chambers.

Device according to Claim 1, characterized in that the rolled-channel laminated PDMS (4) allows the flow of solutions of different concentrations.

Device according to claim 1, characterized in that the sealing is performed by adhering the laminated PDMS to the glass.

Device according to claim 1, characterized in that the holes in the glass slide (5) may optionally comprise solution inlet hose connections (9).

Microfluidic device comprising: - a lower level (i) containing the layers: glass slide with microchannels (chambers) (6); and PDMS with Y-shaped channel and hollow holes (7); An upper level (ii) containing the blade layer of. glass with holes (5);

Device according to Claim 7, characterized in that the chambers are present on the glass sheet (6) in low relief and preferably made by chemical corrosion.

Device according to Claim 7, characterized in that the channel is undercut, Y-shaped, on the upper surface of the PDMS (7) and allows solutions of different concentrations to flow.

Device according to Claim 7, characterized in that the holes in the PDMS (7) are within the channel region and fit the ends of the microchannels (chambers) of the glass slide (6).

Device according to Claim 7, characterized in that the PDMS (7) can be optionally chemically modified (8).

Device according to Claim 7, characterized in that the sealing is carried out by any movable fastening means, preferably by clips.

Device according to claim 7, characterized in that the holes in the glass slide (9) may optionally comprise connections for solution inlet hoses.

Use of the device as defined in claims 1 to 6, characterized in that for any process it is necessary to know the ideal substrate conditions or the ideal conditions for cell performance, estimation of kinetic parameters and to evaluate chemical responses such as chemotaxis.

Use of the device as defined in claims 7 to 13, characterized in that for any process it is necessary to know the ideal substrate conditions or the ideal conditions for cell performance, estimation of kinetic parameters and to evaluate chemical responses such as chemotaxis.