BG62985B1

BG62985B1 - Method for diagnostics and treatment of squamous cell carcinoma

Info

Publication number: BG62985B1
Application number: BG102513A
Authority: BG
Inventors: Karl-Heinz Heider; Guenther Adolf; Elinborg Ostermann; Erik Patzelt; Marlies Sproll
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh; Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2000-12-29
Also published as: KR100473824B1; CN1151377C; SK284378B6; HK1011560A1; KR19990071952A; EP0865609B1; PL184521B1; BG102513A; DE59610248D1; WO1997021104A1; NZ324314A; EP0865609A1; NO319903B1; AU726704B2; PL327066A1; TR199801027T2; MX9804459A; CZ174198A3; BR9611901A; CA2239709A1

Abstract

The method is based on the expression of the variable exon v6 of the CD44 gene as a molecular target. In a preferred application antibodies specific for v6 are used, in particular the monoclinal antibody BIWA-1 (VFF-18) which is produced from a hybridome cellular line with depositary number DSM ACC2174. The antibody is bound to the amino acid sequence W F G N R W H E G Y R. 12 claims, 5 figures

Description

Изобретението се отнася до методи за диагностика и лечение на плоскоклетьчен рак, които се основават на експресията на вариабилния екзон v6 на гена за CD44, до средства за такива методи, както и до тяхното приложение.The invention relates to methods for the diagnosis and treatment of squamous cell carcinoma based on the expression of the variable exon v6 of the CD44 gene, to agents for such methods, and to their application.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Известно е, че експресията на варианти на повърхностния гликопротеин CD44 е необходима и достатъчна, за да предизвика така нареченото поведение на спонтанно образуване на метастази (разсейки) както в необразуваща метастази клетъчна линия от панкреатичен аденокарцином на плъх, така и в неформираща метастази фибросаркомна плъша клетъчна линия (Gnther et al., 1991). Докато най-малката изоформа на CD44, стандартната форма CD44s, се експресира обилно в редица различни тъкани, в това число епителни клетки, то определени сплайсингови варианти на CD44 (CD44v) се експресират само в една подгрупа епителни клетки. Изоформите на CD44 се получават чрез алтернативен сплайсинг, при което напълно се отстраняват последователностите на 10 екзона (vl-vlO) от CD44s, но при повечето варианти те могат да се явят в различни комбинации (Screaton et al., 1992; Heideretal., 1993; Hofmanetal., 1991). Вариантите се различават по това, че на определено място в извънклетъчния участък на белтъка са включени различни аминокиселинни последователности. Такива варианти можаха да бъдат доказани в различни човешки туморни клетки и в човешка туморна тъкан. Така наскоро беше изследвана експресията на варианти на CD44 в хода на колоректалната карциногенеза (Heider et al., 1993). В нормален човешки епител на колона (дебелото черво) липсва експресия на варианти на CD44, като се доказва само слаба експресия в пролифериращите клетки на подепитела. В покъсни стадии от развитието на тумора, напр. в аденокарциноми, всички малигнени разсейки експресират варианти на CD44. Известна е и експресията на сплайсингови варианти на CD44 в активирани лимфоцити, както и в случаи на неХодчкинови лимфоми (Kooptnan et al., 1993).Expression of CD44 surface glycoprotein variants is known to be necessary and sufficient to induce the so-called spontaneous metastasis (scattering) behavior in both non-metastatic rat pancreatic adenocarcinoma cell line and non-forming cell metastasis. line (Gnther et al., 1991). While the smallest isoform of CD44, the standard CD44s form, is abundantly expressed in a number of different tissues, including epithelial cells, certain CD44 splicing variants (CD44v) are expressed in only one subset of epithelial cells. CD44 isoforms are obtained by alternative splicing, completely sequencing 10 exons (vl-vlO) sequences from CD44s, but in most variants they can occur in different combinations (Screaton et al., 1992; Heideretal., 1993 Hofmanetal., 1991). The variants differ in that different amino acid sequences are included at a particular site in the extracellular region of the protein. Such variants could be demonstrated in various human tumor cells and in human tumor tissue. Thus, expression of CD44 variants in the course of colorectal carcinogenesis has recently been examined (Heider et al., 1993). Normal human colon epithelium (colon) lacks expression of CD44 variants, demonstrating only low expression in the proliferating cells of the subtype. In the later stages of tumor development, e.g. in adenocarcinomas, all malignancies express variants of CD44. The expression of CD44 splicing variants in activated lymphocytes and in cases of non-Hodgkin's lymphomas is also known (Kooptnan et al., 1993).

Станаха известни редица подходи, чрез които диференциалната експресия на вариабилните екзони на гена за CD44 в туморите и нормалните тъкани да се използва в диагностични и терапевтични методи (WO 94/02633, WO 94/ 12631, WO 95/00658, WO 95/00851, ЕР 0531300).A number of approaches have become known for using differential expression of the CD44 gene exons in tumors and normal tissues in diagnostic and therapeutic methods (WO 94/02633, WO 94/12631, WO 95/00658, WO 95/00851, EP 0531300).

Вече е изследвана също и експресията на варианти на молекулата на CD44 в случаи на плоскоклетьчен рак. Salmi et al. (1993) намериха със специфичното за v6 антитяло Var3.1 едно покачване в експресията на v6 в туморни клетки в сравнение с нормални клетки. Brooks et al. (1995) получиха със специфичното за v6 антитяло 11,9 хетерогенно оцветяване на назофарингиален карцином. Само в 2/12 случая беше постигнато силно оцветяване, докато в по-голямата част от случаите може да бъде доказана имунохистохимично само слаба фокална експресия на v6.The expression of CD44 molecule variants in cases of squamous cell carcinoma has also been investigated. Salmi et al. (1993) found an increase in v6 expression in tumor cells with v6 specific Var3.1 antibody compared to normal cells. Brooks et al. (1995) obtained with the v6 specific antibody 11.9 heterogeneous staining of nasopharyngeal carcinoma. In only 2/12 cases, strong staining was achieved, whereas in most cases only weak focal expression of v6 could be demonstrated by immunohistochemistry.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

Задачата на изобретението е разработването на нови методи за диагностика и лечение на плоскоклетьчен рак, както и получаването на средства за такива методи.It is an object of the invention to develop new methods for the diagnosis and treatment of squamous cell carcinoma and to obtain means for such methods.

Задачата е решена с методи за диагностика и лечение на плоскоклетьчен рак, които се основават върху експресията на вариабилния екзон v6 на гена за CD44 като молекулен маркер, респ. като прицел. По-конкретно изобретението се отнася за методи, които почиват върху силната и хомогенна експресия на v6 в случаи на плоскоклетьчен рак, което е установено изненадващо и е в противовес на известното от областта на техниката. Антитела със съответна специфичност са особено подходящи като вектори за селективно откриване на плоскоклетьчен рак in vivo.The problem is solved by methods for the diagnosis and treatment of squamous cell carcinoma, which are based on the expression of the variable exon v6 of the CD44 gene as a molecular marker, respectively. as a target. More specifically, the invention relates to methods that rely on the strong and homogeneous expression of v6 in cases of squamous cell carcinoma, which is surprisingly found to be contrary to the prior art. Antibodies of corresponding specificity are particularly suitable as vectors for the selective detection of squamous cell carcinoma in vivo.

При това се предпочитат методи, които се характеризират с това, че при тях се използва антитяло, което разпознава аминокиселинната последователност QWFGNRWHEGYRQT, като особено се предпочита аминокиселинната последователност WFGNRWHEGYR. При това особено се предпочита моноклоналното антитяло BIWA-1 (клон VFF-19), което се секретира от хибридомна клетъчна линия, която е депозирана на 7.6.1994 под депозитния номер DSM АСС2174 в немската колекция на микроорганизми и клетъчни линии DSM, GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Deutschland (WQ 95/ 33771), или производни на това антитяло.Methods are characterized in that they employ an antibody that recognizes the amino acid sequence QWFGNRWHEGYRQT, with particular preference for the amino acid sequence WFGNRWHEGYR. Particularly preferred is the monoclonal antibody BIWA-1 (clone VFF-19), which is secreted by a hybridoma cell line deposited on 7.6.1994 under DSM deposit number ACC2174 in the German collection of microorganisms and cell lines DSM, GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland (WQ 95/33771), or derivatives of this antibody.

Други аспекти на изобретението се отнасят до използването на такива антитела в методите на изобретението като средства за прилагането на тези методи.Other aspects of the invention pertain to the use of such antibodies in the methods of the invention as a means of administering these methods.

Нуклеотидната и аминокиселинната последователност на вариабилния екзон v6 на гена за CD44 са известни (Screaton et al., 1992, Tolg et 5 al., 1993). Съществуването на изродени или алелни варианти е без значение за изпълнение на изобретението, поради което такива варианти определено са включени в изобретението.The nucleotide and amino acid sequences of the variable exon v6 of the CD44 gene are known (Screaton et al., 1992, Tolg et al., 1993). The existence of degenerate or allelic variants is irrelevant to the implementation of the invention, therefore such variants are definitely included in the invention.

Последователността на екзон v6 на човешкия ген за CD44 е следната:The exon v6 sequence of the human CD44 gene is as follows:

Q Q А A Т T. Р R. S S S S т t Т T. Е Well Е Well Т T. А A Т T. Q Q тс ts CAG CAG GCA GCA ACT ACT сст Art AGT AGT AGT AGT АСА ACG ACA ACG GAA GAA GAA АСА GAA ACA GCT GCT АСС ACC CAG CAG К AAG To AAG Е Q GAA CAG E Q GAA CAG W TGG W TGG F ттт F tt G N GGA AAC G N GGA AAC R : AGA R: AGA И ?GG And? GG Н CAT H CAT Е GAG It's GAG G Y GGA ТАТ G Y GGA TAT R CGC R CGC Q САА Q CAA т t Р R. R R Е Well D D S S Η Η S S Т T. т t G Mr Т T. А A

АСА ССС AGA GAA GAC TCC CAT TCG АСА АСА GGG АСА GCT GACA CCA AGA GAA GAC TCC CAT TCG ACA ACA GGG ACA GCT G

Изобретението може да се изпълни с поликлонални или моноклонални антитела, които са специфични за епитоп, който се кодира от екзон v6 и по-конкретно за епитоп в рамките на аминокиселинната последователност QWFGNRWHEGYRQT, като особено се предпочита епителът да е в рамките на аминокиселинната последователност WFGNRWHEGYR. Получаването на антитела срещу известни аминокиселинни последователности може да се извърши чрез известни за това методи (Catty, 1989). Например пептид с тази последователност може да се получи по синтетичен път и да се приложи в протокол на имунизация. Друг начин е получаването на слят белтък, който съдържа желаната аминокиселинна последователност, при което нуклеинова киселина (която може да се получи синтетично или напр. чрез полимеразна верижна реакция (PCR) от подходяща проба), която кодира тази последователност, се интегрира в експресионен вектор и се експресира в гостоприемник под формата на слят белтък. Евентуално пречистеният слят белтък може след това да се използва в протокол за имунизация и чрез подходящи методи да се отберат антитела, специфични за инсерта или, в случай на моноклонални антитела, хибридоми, експресиращи специфични за инсерта антитела. Подобни методи са познати в областта на техниката. Heider et al. (1993,1996а) и Koopman et al. (1993) описват получаването на антитела срещу варабилни епитопи на CD44.The invention can be implemented with polyclonal or monoclonal antibodies that are specific for an epitope encoded by exon v6 and more specifically for an epitope within the amino acid sequence QWFGNRWHEGYRQT, with particular preference for the epithelium to be within the aminoGEG sequence. The production of antibodies against known amino acid sequences can be accomplished by known methods (Catty, 1989). For example, a peptide of this sequence can be synthetically produced and administered in an immunization protocol. Another way is to produce a fusion protein that contains the desired amino acid sequence, whereby a nucleic acid (which can be synthetically or e.g. obtained by polymerase chain reaction (PCR) from a suitable sample) that encodes that sequence is integrated into an expression vector and is expressed in a host in the form of a fusion protein. The possibly purified fusion protein can then be used in an immunization protocol and, by appropriate methods, antibody-specific inserts or, in the case of monoclonal antibodies, hybridoma expressing antibody-specific antibodies. Such methods are known in the art. Heider et al. (1993, 1996a) and Koopman et al. (1993) describe the production of antibodies against CD44 variable epitopes.

За методите на изобретението могат обаче да се използват също антитела, които са производни на поли- или моноклонални антитела, напр. Fab- или F(ab’)₂- фрагменти от имуноглобулини, получени по рекомбинантен път едноверижни антитела (scFv), химерни, респ. хуманизирани антитела, както и други молекули, които се свързват специфично с епитопи, кодирани от екзон v6. От пълния имуноглобулин на антитяло BIWA-l (VFF-18) или от други антитела могат например да се получат Fab- или F(ab’)₂фрагменти, както и други фрагменти (Kreitman et al., 1993). Освен това специалистът е в състояние да получи рекомбинантни антитела, специфични за v6. По-конкретно той може след анализ на аминокиселинната последователност на антитялото BIWA-l (VFF-18) и/или чрез използването на хибридомна клетъчна линия, която произвежда това антитяло и особено на съдържащата се в нея генетична информация, да получи рекомбинантни антитела със същия идиотип, както BIWA1 (VFF-18), т.е. антитела, които в областта на антигенсвързващото място (complementarity-determining regions, CDR) показват същата аминокиселинна последователност като антитялото BIWA-l (VFF-18). Съответните методи са известни.However, antibodies that are derivatives of poly- or monoclonal antibodies can be used for the methods of the invention, e.g. Fab- or F (ab ') ₂ - fragments of immunoglobulins obtained by recombinant single-chain antibodies (scFv), chimeric, respectively. humanized antibodies, as well as other molecules that bind specifically to epitopes encoded by exon v6. From the complete immunoglobulin of an antibody BIWA-1 (VFF-18) or other antibodies, for example, Fab- or F (ab ') ₂ fragments can be obtained, as well as other fragments (Kreitman et al., 1993). In addition, one skilled in the art will be able to obtain recombinant antibodies specific for v6. In particular, it may, after analysis of the amino acid sequence of the BIWA-1 antibody (VFF-18) and / or by using a hybridoma cell line that produces this antibody and, in particular, the genetic information contained therein, obtain recombinant antibodies with the same idiotype as BIWA1 (VFF-18), i.e. antibodies which in the complementarity-determining regions (CDR) region exhibit the same amino acid sequence as the BIWA-1 antibody (VFF-18). Suitable methods are known.

Такива антитела могат например да представляват хуманизирани антитела (Shin et al., 1989; Gussow et Seemann, 1991), биспецифични или бифункционални антитела (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989, Featherstone, 1996), едноверижни антитела (scFv, Johnson et Bird, 1991), цели или фрагментирани имуноглобулини (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), или антитела, получени чрез прекомбиниране на веригите (chain shuffling) (Winter et al., 1994). Ху манизирани антитела могат да се получат например чрез “присаждане” на CDR (CDR-grafting) (ЕР 0239400). Скелетните области (framework-regions) също могат да бъдат модифицирани (ЕР 0519596; WO 9007861). За хуманизирането на антитела днес могат да се приложат методи като PCR (виж напр. ЕР 0368684; ЕР 043310; WO 9207075) или компютърно моделиране (виж напр. WO 9222653). Могат също така да се получат и да се използват слети белтъци, например слети белтъци едноверижно (single-chain) антитяло/токсин (Chaudhary etal., 1990, Fridmann et al., 1993). Под понятията “антитяло” и “антитялова молекула” трябва да попаднат освен поликлоналните и моноклонални антитела и всички дискутирани в този раздел съединения и други съединения, които се извеждат структурно от имуноглобулините и които могат да се получат чрез познати методи.Such antibodies may for example be humanized antibodies (Shin et al., 1989; Gussow et Seemann, 1991), bispecific or bifunctional antibodies (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989; Featherstone, 1996), single-stranded antibodies (scFv, Johnson et Bird, 1991), whole or fragmented immunoglobulins (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992), or antibodies obtained by chain shuffling (Winter et al. , 1994). Humanized antibodies can be obtained, for example, by "grafting" a CDR (CDR-grafting) (EP 0239400). Framework regions can also be modified (EP 0519596; WO 9007861). Methods such as PCR (see, e.g., EP 0368684; EP 043310; WO 9207075) or computer modeling (see, e.g., WO 9222653) can be used to humanize antibodies today. Fusion proteins can also be prepared and used, for example single-chain antibody / toxin fusion proteins (Chaudhary etal., 1990, Fridmann et al., 1993). The terms "antibody" and "antibody molecule" should include, in addition to polyclonal and monoclonal antibodies, all of the compounds and other compounds discussed in this section that are derived structurally from immunoglobulins and which can be prepared by known methods.

По силите на един обикновен специалист е, познавайки епитопа (сравни фиг. 1, фиг. 4) на BIWA-1 (VFF-18), да получи еквивалентни антитела със същата специфичност на свързване. Поради това такива антитела също са включени в изобретението.It is within the skill of the ordinary person skilled in the art, knowing the epitope (cf. FIG. 1, FIG. 4) of BIWA-1 (VFF-18), to obtain equivalent antibodies with the same binding specificity. Therefore, such antibodies are also included in the invention.

За диагностични методи антителата, напр. антитялото BIWA-1, негови фрагменти или рекомбинантни антитела със същия идиотип, могат да се свържат например с радиоактивни изотопи като ^1И1,¹³¹1, “Чп, Те или с радиоактивни съединения (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), c ензими като пероксидаза или алкална фосфатаза (Catty et Raykundalia, 1989), с флуоресцентни багрила (Johnson, 1989) или с биотинови молекули (Guesdon et al., 1979). За терапевтично приложение антителата, специфични за v6, напр. антитялото BIWA-1 (VFF-18) или антитела, получени от VFF-18, напр. техни фрагменти или рекомбинантни антитела със същия идиотип, могат да се свържат с радиоактивни изотопи като «Υ, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ^lJ3Sm, Cu, ^2l2Bi, ²¹³Bi, ¹⁷⁷Lu (Quadri et al., 1993p; Lenhard et al., 1985; Vriesendorp etal., 1991; Wilbur etal., 1989; Maraveyas et al., 1995a, Jurcic et Scheinberg, 1994), токсини (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), цитостатици (Schrappe et al., 1992), промедикаменти (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989), фотоактивируеми вещества (Hemming et al., 1993), c антитяло c друга специфичност или c радиоактивни съединения. Антитялото може понататък да се свърже с цитокин или с друг имуномодулаторен полипептид, напр., тумор-некрозис фактор, лимфотоксин (Reisfeld et al., 1996) или интерлевкин-2 (Becker et al., 1996). За приложение антителата е възможно също така да се модифицират в една преприцелна система, например със стрептавидин или биотин (Goodwin, 1995).For diagnostic methods, antibodies, e.g. the BIWA-1 antibody, fragments thereof, or recombinant antibodies of the same idiotype, may bind, for example, to radioactive isotopes such as ^IL 1, ¹³¹ 1, Nn, Te, or radioactive compounds (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), with enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), with fluorescent dyes (Johnson, 1989), or with biotin molecules (Guesdon et al., 1979). For therapeutic use, antibodies specific for v6, e.g. the BIWA-1 antibody (VFF-18) or antibodies derived from VFF-18, e.g. fragments or recombinant antibodies of the same idiotype can be coupled to radioactive isotopes such as Υ, ¹³¹ I, ¹⁸⁶ Re, ^IJ Sm, Cu, ^2l Bi, ²¹³ Bi, ¹⁷⁷ Lu (Quadri et al., 1993p; Lenhard et al. ., 1985; Vriesendorp et al., 1991; Wilbur etal., 1989; Maraveyas et al., 1995a, Jurcic et Scheinberg, 1994), toxins (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), cytostatics (Schrappe et al., 1992), prodrugs (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989), photoactivated substances (Hemming et al., 1993), with antibody with other specificity or with radioactive compounds. The antibody may further bind to a cytokine or other immunomodulatory polypeptide, e.g., tumor necrosis factor, lymphotoxin (Reisfeld et al., 1996) or interleukin-2 (Becker et al., 1996). For administration, antibodies may also be modified in a single targeting system, for example with streptavidin or biotin (Goodwin, 1995).

Диагностичните методи на изобретението са подходящи за изследването на проби от пациенти, например биопсии, за които съществува подозрението за плоскоклетъчен рак или вече е налице диагноза, но туморът трябва да се охарактеризира по-точно. Доказването на варианти на CD44 молекулата, които съдържат аминокиселинна последователност, която се кодира от вариабилния екзон v6, може да се осъществи на равнище белтък чрез антитела или на равнище нуклеинови киселини чрез сонди от нуклеинови киселини или праймери за полимеразна верижна реакция (PCR). Следователно изобретението се отнася също така и до антитела и нуклеинови киселини, които са приспособени като сонди, респ. праймери, за такива методи, както и за използването на такива антитела и нуклеинови киселини за диагностика и анализ на плоскоклетъчен рак. Например, тьканни срези могат да се изследват имунохистохимично с антитела чрез известни методи. Екстракти, получени от тьканни проби или телесни течности, могат по-нататък да се изследват чрез други имунологични методи при използването на антитела, например чрез белтъчни преноси (Western Blots), ензимно свързан имуноисорбентен тест (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), радиоимунологичен тест (RIA Catty et Murphy, 1989) или чрез родствени имунологични тестове. Изследванията могат да бъдат качест- , вени, полуколичествени или количествени.The diagnostic methods of the invention are suitable for the examination of patient specimens, for example, biopsies suspected of having squamous cell carcinoma or already diagnosed, but the tumor should be more accurately characterized. Demonstration of variants of a CD44 molecule containing an amino acid sequence that is encoded by the variable exon v6 can be accomplished at the protein level by antibodies or at the nucleic acid level by nucleic acid probes or polymerase chain reaction (PCR) primers. Therefore, the invention also relates to antibodies and nucleic acids that are adapted as probes, respectively. primers, for such methods, and for the use of such antibodies and nucleic acids for the diagnosis and analysis of squamous cell carcinoma. For example, tissue sections may be immunohistochemically probed with antibodies by known methods. Extracts obtained from tissue samples or body fluids can be further tested by other immunological methods using antibodies, for example, by protein transfer (Western Blots), enzyme-linked immunoisorbent assay (ELISA, Catty et Raykundalia, 1989), radioimmunological test (RIA Catty et Murphy, 1989) or by related immunological tests. The studies may be qualitative, vein, semi-quantitative or quantitative.

Освен за диагностика in vitro антителата със специфичност съгласно изобретението са при- .. годни също и за диагностика in vivo на плоско- - клетъчен рак. Ако антитялото носи белег, който може да се открива, то детекцията на белега , може да се използва за диагностични цели, напр. за визуализиране на тумора in vivo (образна диагностика) или за радионаправлявана хирургия (radioguided surgery). За използването на антитела, конюгирани с радиоактивни изотопи, в имуносцинтиграфията (imaging) например има редица протоколи, на чиято основа специалистът може да изпълни изобретението (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins et Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).In addition to in vitro diagnostics, antibodies with specificity according to the invention are also suitable for in vivo diagnosis of squamous cell carcinoma. If the antibody carries a detectable marker, then the detection of the marker can be used for diagnostic purposes, e.g. for imaging the tumor in vivo (imaging) or radioguided surgery. For the use of radioactive isotope conjugated antibodies in imaging, for example, there are a number of protocols upon which a person skilled in the art can implement the invention (Siccardi et al., 1989; Keenan et al., 1987; Perkins et Pimm, 1992; Colcher et al., 1987; Thompson et al., 1984).

Така чрез доказване и/или околичествяване на експресията на вариабилния епитоп v6 на CD44 в диагностиката и терапията могат да се влеят съществени данни. При това предимства може да има комбинирането им с други прогностични параметри, донякъде и със степента на развитие на тумора.Thus, essential evidence can be inferred by demonstrating and / or quantifying the expression of the CD44 variable epitope v6 in diagnosis and therapy. However, combining them with other prognostic parameters may be advantageous, in part with the degree of tumor development.

Антитела със специфичност съгласно изобретението и свързани с цитотоксични агенти могат да се използват успешно за лечение на плоскоклетъчен рак. При това приложението може да се извърши системно или локално, например чрез интравенозна (балус или продължително вливане), интраперитонеална, мускулна, подкожна о.а. инжекция/вливане. Протоколи за прилагането на конюгирани или неконюгирани антитела (било то като цели имуноглобулини, фрагменти, рекомбинантни хуманизирани молекули) са известни (Mulshine etal., 1991; Larson etal., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, 1995; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982). Немодифицирани моноклонални антитела могат да се прилагат непосредствено за лечение, когато проявяват вътрешно присъща ефекторна функция, необходима за цитотоксично действие, например за индуцирана от комплемента или за индуцирана от антитялото клетъчна цитотоксичност (Riethmuller et al., 1994). Подходящи моноклонални антитела за такова приложение са миши антитела от изотип IgG2a или антитела от човешкия тип IgGl. Немодифицирани антитела могат да се прилагат още за индукция на противотуморна реакция в пациентите чрез антииндиотипичен механизъм (Baum et al., 1993; Khazaeli et al., 1994).Antibodies with specificity according to the invention and related cytotoxic agents can be successfully used for the treatment of squamous cell carcinoma. In this case, the administration can be performed systemically or locally, for example, by intravenous (balus or continuous infusion), intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous o.a. injection / infusion. Protocols for the administration of conjugated or unconjugated antibodies (be it whole immunoglobulins, fragments, recombinant humanized molecules) are known (Mulshine etal., 1991; Larson etal., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Vitetta et al., 1991; Breitz et al., 1992, 1995; Press et al., 1989; Weiner et al., 1989; Chatal et al., 1989; Sears et al., 1982). Unmodified monoclonal antibodies can be used directly for treatment when they exhibit an intrinsic effector function required for cytotoxic action, for example, complement-induced or antibody-induced cell cytotoxicity (Riethmuller et al., 1994). Suitable monoclonal antibodies for such administration are mouse IgG2a isotype antibodies or human IgG1 antibodies. Unmodified antibodies can also be used to induce an antitumor response in patients through an anti-indiotypic mechanism (Baum et al., 1993; Khazaeli et al., 1994).

Едно предпочетено приложение на метод за лечение се състои в следното. Хуманизиран специфичен за v6 имуноглобулин или негов Р(аЬ’)₂-фрагмент се свързва с ”Y (Quadri et al., 1993; Vriesendorp et al., 1995), ¹³¹I (Maraveyaset al., 1995a, 1995b; Juweid et al., 1995; Press et al., 1995; Thomas et al., in: Catty 1985, S. 230-239), ¹⁸⁶Re (Breitz et al., 1992,1995) или c друг подходящ радиоизотоп и се използва за радиоимунологично лечение на плоскоклетьчен рак. Например антитялото BIWA-1, хуманизирана версия на BIWA-1 или Р(аЬ’)₂-фрагмент на BIWA-1 или на хуманизираното антитяло може да се свърже с ’’Ύ при използването на хелатобразуващ линкер като ITCB-DTPA (изотиоцианатбензил-диетилентриаминопентаацетат), при което би трябвало да се постигне специфична активност от 5-20 mCi/mg, за предпочитане 10 mCi/mg. Това вещество след това може да се приложи на пациент с антигенположителен тумор в дозировка от 0,1 до 1 mCi/mg телесно тегло, за предпочитане от 0,3 до 0Л mCi/kg телесно тегло. Ако антитялото е свързано с ¹³ⁱI при специфична активност от 2 mCi/mg, една възможна схема на дозиране може да бъде, напр. 2 х 150 mCi в разстояние на 6 седмици. Специалистът може чрез известни методи да определи максимално възможната доза (Maraveyas et al., 1995а, 1995b). Когато общото количество белтък, което трябва да се приложи е от 2 до 5 mg, приложението може да стане под формата на бърза интравенозна болус инжекция. При поголеми количества белтък вливането може да представлява по-благоприятната форма на приложение. При моноклоналните антитела може да бъде необходимо преди приложението веществото да се смеси с излишък (напр. десеткратен мсларен излишък) от нерадиоактивно антитяло; в този случай е по-добре приложението да стане под формата на интравенозно вливане, напр. за 15 min. Приложението може да се повтори. Лечението може да се комбинира с външна лъчетерапия. То може по-нататък да се подпомогне чрез трансплантация на костен мозък; това е необходимо особено тогава, когато при лечението се достига до доза, по-голяма от 1,6 Gy в костния мозък.One preferred application of a treatment method is the following. The humanized v6 specific immunoglobulin or its P (a '') ₂ fragment binds to 'Y (Quadri et al., 1993; Vriesendorp et al., 1995), ¹³¹ I (Maraveyaset al., 1995a, 1995b; Juweid et al. ., 1995; Press et al., 1995; Thomas et al., In: Catty 1985, S. 230-239), ¹⁸⁶ Re (Breitz et al., 1992,1995) or with another suitable radioisotope and used for radioimmunology treatment for squamous cell carcinoma. For example, the BIWA-1 antibody, a humanized version of BIWA-1 or the P (a '') ₂ fragment of BIWA-1 or the humanized antibody, can be linked to a '' Ύ using a chelating agent such as ITCB-DTPA (isothiocyanatebenzylenetetenyltriacetate triethylenetetrienate diethylenetetenate ), where a specific activity of 5-20 mCi / mg, preferably 10 mCi / mg, should be achieved. This substance can then be administered to a patient with an antigen-positive tumor at a dosage of 0.1 to 1 mCi / mg body weight, preferably 0.3 to 0L mCi / kg body weight. If the antibody is linked to ¹³ⁱ I at a specific activity of 2 mCi / mg, a possible dosing regimen may be, e. 2 x 150 mCi over 6 weeks. The person skilled in the art can determine the maximum possible dose by known methods (Maraveyas et al., 1995a, 1995b). When the total amount of protein to be administered is 2 to 5 mg, administration may be given as a rapid intravenous bolus injection. For larger amounts of protein, infusion may be a more advantageous form of administration. For monoclonal antibodies, the substance may need to be mixed with an excess (e.g. tenfold molar excess) of a non-radioactive antibody before administration; in this case it is better to administer the administration in the form of an intravenous infusion, e.g. in 15 min. The application can be repeated. Treatment may be combined with external radiation therapy. It can further be aided by bone marrow transplantation; this is necessary especially when treatment reaches a dose greater than 1.6 Gy in the bone marrow.

Антителата на изобретението могат да се използват също и ex vivo за пречистването на положителни за CD44 препарати от стволови клетки или клетки предшественици (immunopurging) . Лъчевата терапия или химиотерапията на плоскоклетьчен рак могат да се съчетаят с автоложна трансплантация на костен мозък. Прилаганият при това препарат от хематопоетични стволови клетки или клетки предшественици не трябва да съдържа туморни клетки. Това може да се постигне чрез инкубирането с антитела на изобретението, например с конюгати антитялотоксин (Myklebust et al., 1994; DE P 196 48 209.7).The antibodies of the invention may also be used ex vivo for the purification of CD44-positive stem or immunopurging preparations. Radiation therapy or chemotherapy for squamous cell carcinoma can be combined with autologous bone marrow transplantation. The preparation of hematopoietic stem or precursor cells used herein should not contain tumor cells. This can be achieved by incubating with antibodies of the invention, for example, with antibodies to antibody toxoid (Myklebust et al., 1994; DE P 196 48 209.7).

По-нататък антителата от изобретението могат да се въведат под формата на рекомбинантни конструкции в Т-клетъчния рецептор на Т-лимфоцитите. Такива препрограмирани Т-лимфоцити се свързват избирателно с туморните клетки, експресиращи антигена, и проявяват цитотоксично действие, така че те могат да се използват за лечение на плоскоклетьчен рак (РСТ/ЕР 9604631); Altenschmidt et al., 1996).Further, the antibodies of the invention can be introduced in the form of recombinant constructs into the T-cell receptor of T lymphocytes. Such reprogrammed T-lymphocytes selectively bind to tumor cells expressing the antigen and exhibit cytotoxic action so that they can be used to treat squamous cell carcinoma (PCT / EP 9604631); Altenschmidt et al., 1996).

Кратко описание на приложените фигуриBrief description of the attached figures

Фигура 1. Определяне на епитопната специфичност на BIWA-1 чрез свързване със синтетични пептиди, които са изведени от последователността на човешкия CD44v6. Съответният пептид от плъши CD44v6 се тестува с антитялото 1.1ASML. Свързването се определя в ELISA, при което пептидите се имобилизират върху микротитърни плаки (Heider et al., 1996b, Fig. 2). -: липса на свързване, +/-: слабо свързване, +: силно свързване.Figure 1. Determination of the epitope specificity of BIWA-1 by binding to synthetic peptides derived from the human CD44v6 sequence. The corresponding CD44v6 rat peptide was tested with the 1.1ASML antibody. The binding was determined by ELISA whereby the peptides were immobilized on microtiter plates (Heider et al., 1996b, Fig. 2). -: no connection, +/-: poor connection, +: strong connection.

Фигура 2. Имунохистохимичен анализ на плоскоклетъчен рак на ларинкса (а) и на чернодробен метастаз от рак на хранопровода (б) със специфичното за CD44v6 моноклонално антитяло BIWA-1. В двата случая може да се наблюдава реакцията на антитялото с мембраната на туморните клетки. Първоначално увеличение 40х, противооцветяване с хематоксилин.Figure 2. Immunohistochemical analysis of squamous cell carcinoma of the larynx (a) and liver metastasis of esophageal cancer (b) with the CD44v6 specific monoclonal antibody BIWA-1. In both cases, the antibody response to the tumor cell membrane can be observed. Initial 40x magnification, hematoxylin anti-staining.

Фигура 3. Сравняване на свързването с антигена на различни mAbs, специфични за CD44v6. Свързването на четири различни mAbs, специфични за CD44v6, с човешки клетки SCC А-431 се измерва с клетъчна ELISA. Mab BIWA1 показва по-висок афинитет към туморните клетки в сравнение с другите mAbs.Figure 3. Comparison of antigen binding to different CD44v6-specific mAbs. The binding of four different CD44v6-specific mAbs to human cells SCC A-431 was measured by cellular ELISA. Mab BIWA1 shows a higher affinity for tumor cells than other mAbs.

Фигура 4. Прецизирано епитопно картиране на тАЬ BIWA-1. В конкурентна ELISA се измерва свързването на BIWA-1 с различни препокриващи се синтетични пептиди, които обхващат аминокиселини 18-32 от областта, кодираща CD44v6. Минималната свързваща последователност (пептид v6 (19-29)) е подчертана.Figure 4. Precise epitope mapping of tA BIWA-1. Competitive ELISA measures the binding of BIWA-1 to various overlapping synthetic peptides that span amino acids 18-32 of the CD44v6 coding region. The minimum binding sequence (peptide v6 (19-29)) is emphasized.

Фигура 5. Биолоразпределение на ^Ι2ίΙBIWA-1 в голи мишки, ксенотрансплантирани с А-431. Натрупването на антитялото е представено като %ID (средна стойност ± SEM) 4, 24, 48, 120 и 168 h след инжектирането.Figure 5. Biodistribution of ^ί2ί ΙBIWA-1 in nude mice xenografted with A-431. The antibody accumulation is represented as% ID (mean ± SEM) 4, 24, 48, 120 and 168 h after injection.

Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of carrying out the invention

Пример 1. Експресия на CD44v6 в случаи на плоскоклетъчен ракExample 1. Expression of CD44v6 in cases of squamous cell carcinoma

ТъканиFabrics

За експресията на CD44v6 се анализират хистохимично с mAb BIWA-1 (клон VFF-18) общо 126 случая на включени в парафин туморни проби. Пробите включват 31 случая на първичен плоскоклетъчен рак (15 случая на ларинкс, 16 случая на кожа), 91 случая на метастази в лимфните възли (ларинкс, п™38; бял дроб, п=27; хранопровод, η-ll; устна кухина, п=11, сливици, п*»4) и 4 случая на метастази в черния дроб (хранопровод).A total of 126 cases of paraffin-embedded tumor samples were analyzed histochemically for mAb BIWA-1 (clone VFF-18) for CD44v6 expression. Samples included 31 cases of primary squamous cell carcinoma (15 cases of larynx, 16 cases of skin), 91 cases of lymph node metastases (larynx, n ™ 38; lung, n = 27; esophagus, η-ll; oral cavity, n = 11, tonsils, n * »4) and 4 cases of liver metastases (esophagus).

АнтителаAntibodies

Цялата вариабилна област на CD44v, тип НРКП (Hofmann et al., 1991) се амплифицира от човешка кератиноцитна кДНК чрез полимеразна верижна реакция (PCR). Двата праймера за PCR 5’-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3’, позиции 25-52, и 5’TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3’, позиции 1013-984 на вариабилната област LCLThe entire CD44v-type CDKV variable region (Hofmann et al., 1991) is amplified by human keratinocyte cDNA by polymerase chain reaction (PCR). The two PCR primers 5'-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3 ', positions 25-52, and 5'TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3', positions 1013-984 of the LCL variable region

С97, както е описана от Hofman et al., съдържат разпознавателно място за EcoRI, което се използва за директно клониране на PCR продукта във вектора pGEX-2T (Smith et al., 1988). Получената конструкция (pGEX CD44v HPKII, v3vlO) кодира слят белтък от ~ 70 кД, състоящ се от глугатион-Б-трансферазата на Schistostoma japonicum и от екзони v3-vl0 на човешкия CD44 (фиг. 1; Heider et al., 1993). Слетият белтък се експресира в Е. coli, след което се пречиства афинитетно на глутатион-агароза (Smith et al., 1988).C97, as described by Hofman et al., Contains an EcoRI recognition site that is used to directly clone the PCR product in the vector pGEX-2T (Smith et al., 1988). The resulting construct (pGEX CD44v HPKII, v3v10) encodes a ~ 70 kD fusion protein consisting of the glutathione-B transferase of Schistostoma japonicum and exons v3-vl0 of human CD44 (Fig. 1; Heider et al., 1993). The fusion protein is expressed in E. coli, then purified affinity with glutathione agarose (Smith et al., 1988).

Женски мишки Balb/c се имунизират интраперитонеално с афинитетно пречистения слят белтък по следната схема:Female Balb / c mice were immunized intraperitoneally with the affinity-purified fusion protein according to the following scheme:

1. Имунизация 90 pg слят белтък в пълен адювант на Фройнд.1. Immunization 90 pg fusion protein in Freund's complete adjuvant.

2. и 3. Имунизация 50 pg слят белтък в непълен адювант на Фройнд.2. and 3. Immunization 50 pg fusion protein in incomplete Freund's adjuvant.

Имунизациите се извършват в интервал от по 4 седмици. 14 дни след последната имунизация животните се имунизират в още три последователни дни с по 10 g слят белтък в PBS. На следващия ден се провежда фузия на далачни клетки от животно с висок тигър на антитялото с миши миеломни клетки РЗ. X63-Ag8.653 с помощта на полиетиленгликол 4000. След това хибридомните клетки се селекционират в микротитьрни плаки в НАТ-среда.Immunizations are performed at intervals of 4 weeks. 14 days after the last immunization, the animals were immunized for a further three consecutive days with 10 g of fusion protein in PBS. The next day a spleen cell fusion was performed on a high-tiger animal animal with mouse myeloma cells P3. X63-Ag8.653 using polyethylene glycol 4000. The hybridoma cells were then selected in microtiter plates in a NAT medium.

Определянето тигрите на антителата в серума, респ. скринингьт на хибридомните надутайки, се провежда с помощта на ELISA. При този тест микротитърните плаки се покриват найнапред със слетия белтък (GST-CD44v3-10) или с глутатион-Б-трансфераза. Впоследствие се инкубира със серийни разреждания на серумните проби, респ. на хибридомните надутайки и специфичните антитела се доказват с антитела срещу миши имуноглобулин, конюгирани с пероксидаза. Хибридомите, които реагират само с глутатионS-трансферазата, се изхвърлят. Останалите хибридоми най-напред се характеризират в ELISA с домен-специфични слети белтъци (екзон v3, екзон v5+v6, екзон v6+v7, екзон v8-vl0) (Koopman et al., 1993). За по-нататъшно ограничаване на епитопа на антитялото в ELISA тестове по свързване се използват различни синтетични пептиди, представляващи части от домена v6 (фиг. 1). Пептидът от 14 аминокиселини v6D показва най-силно свързване. От това следва, че епитопът на BIWA1 лежи изцяло или отчасти вътре в последователността QWFGNRWHEGYRQT на домена, кой то се кодира от екзон a ν6. Тази последователност е хомоложна на свързващия епитоп на антитяло 1.1ASML, което се използва в терапевтичен плъши модел и което е специфично за плъши CD44v6 (фиг. 1).Determination of antibody tigers in serum or resp. screening of hybridoma swellings was performed using ELISA. In this test, the microtiter plates are first coated with the fusion protein (GST-CD44v3-10) or glutathione-B-transferase. Subsequently incubated with serial dilutions of serum samples, respectively. of hybridoma swellings and specific antibodies are demonstrated with peroxidase-conjugated antibodies to murine immunoglobulin. Hybridomas that react only with glutathione S-transferase are discarded. The rest of the hybridomas are first characterized in the domain-specific fusion protein ELISA (exon v3, exon v5 + v6, exon v6 + v7, exon v8-vl0) (Koopman et al., 1993). To further limit the antibody epitope in ELISA binding assays, various synthetic peptides representing portions of the v6 domain are used (Fig. 1). The 14 amino acid v6D peptide exhibits the strongest binding. It follows that the BIWA1 epitope lies wholly or partly within the QWFGNRWHEGYRQT sequence of the domain, which is encoded by exon a ν6. This sequence is homologous to the binding epitope of antibody 1.1ASML, which is used in the therapeutic rat model and which is specific for rat CD44v6 (Fig. 1).

ИмунохистохимияImmunohistochemistry

Преди инкубирането с първото антитяло парафиновите срези (4 pm) се депарафинират в Rotihistol (Roth, Deutschland) 3 пъти за по 10 min и след това се дехидратират в нарастваща алкохолна концентрация. Срезите се промиват за кратко с дестилирана вода и след това се кипват в микровълнова печка (Sharp Model R6270) 3 пъти за по 10 min при 600 W в 0,01 М Na-цитратен буфер. След всяка инкубация в микровълновата печка срезите се охлаждат в продължение на 20 min. След последната стъпка на охлаждане носителите се промиват в PBS и се преинкубират с нормален кози серум (10% в PBS). След три промивки с PBS срезите се инкубират 1 h с първото антитяло (BIWA-1: 5 pg/ml; мишиIgG (съответстваща на изотипа отрицателна контрола): 5 gg/ml в PBS/1 % BSA). Като положителна контрола за реакцията на оцветяване се използват нормални човешки кожни срези, тъй като кератиноцитите експресират изоформа на CD44, която съдържа v3-vl0. Ендогенните пероксидази се блокират с 0,3 % Н₂О₂ в PBS и срезите се инкубират 30 min с биотинилираното второ антитяло (анти-миши IgG-F(ab’)₂, DAKO Corp.). За проявяване на оцветяването срезите се инкубират 30 min с пероксидаза от хрян, която е конюгирана с биотина под формата на стрептавидин-биотин-пероксидазен комплекс (DAKO Corp.). След това срезите се инкубират 5-10 min в субстрат 3,3-амино-9-етил-карбазол (Sigma Immunochemicals), реакцията се спира с Н₂О и срезите се противооцветяват с хематоксилин. Оценката на оцветяването се извършва със светлинен микроскоп Zeiss-Axioskop като интензивността на оцветяването се околичествява, както следва: +++, силна експресия; ++, умерена експресия; +, слаба експресия; - детектира се нееднозначна експресия или липса на такава. Като положителни се оценяват само туморни клетки с ясно оцветяване на мембраната. Процентът на положителните туморни клетки във всеки срез се преценява грубо, като се образуват две групи: фокално положителни тумори (по-малко от 10% от туморните клетки реагират с антитялото) и положителни тумори (10 или повече % от туморните клетки са положителни). Когато с антитялото реагират по-малко от 80% от туморните клетки в положителните тумори, се посочва съответният процент.Before incubation with the first antibody, paraffin sections (4 pm) were deparaffinized in Rotihistol (Roth, Deutschland) 3 times for 10 minutes each and then dehydrated to increasing alcohol concentration. The sections were washed briefly with distilled water and then boiled in a microwave oven (Sharp Model R6270) 3 times for 10 min at 600 W in 0.01 M Na-citrate buffer. After each incubation in the microwave, the sections were cooled for 20 min. After the last cooling step, the media were washed in PBS and reincubated with normal goat serum (10% in PBS). After three washes with PBS, sections were incubated for 1 h with the first antibody (BIWA-1: 5 pg / ml; mouse IgG (corresponding to the isotype negative control): 5 gg / ml in PBS / 1% BSA). Normal human skin sections were used as a positive control for the staining reaction, since keratinocytes express an isoform of CD44 containing v3-vl0. Endogenous peroxidases were blocked with 0.3% H ₂ O ₂ in PBS and sections incubated for 30 min with the biotinylated second antibody (anti-mouse IgG-F (ab ') ₂ , DAKO Corp.). For staining, sections were incubated for 30 min with horseradish peroxidase conjugated with biotin in the form of streptavidin-biotin-peroxidase complex (DAKO Corp.). The sections were then incubated for 5-10 minutes in 3,3-amino-9-ethyl-carbazole (Sigma Immunochemicals) substrate, quenched with H ₂ O, and sections were counterstained with hematoxylin. The staining evaluation is performed with a Zeiss-Axioskop light microscope, and the staining intensity is characterized as follows: +++, strong expression; ++, moderate expression; +, poor expression; - ambiguous expression or lack thereof is detected. Only tumor cells with clear membrane staining were evaluated as positive. The percentage of positive tumor cells in each slice was roughly estimated, forming two groups: focally positive tumors (less than 10% of tumor cells responded with the antibody) and positive tumors (10 or more% of tumor cells positive). When less than 80% of the tumor cells respond to the positive tumors with the antibody, indicate the appropriate percentage.

Със специфичното за CD44v6 моноклонално антитяло BIWA-1 се анализират 126 случая на плоскоклетъчен рак с различен произход. Експресията на изоформи, съдържащи CD44v6, се наблюдава във всички туморни проби с изключение на една. По-голямата част от пробите показват експресия на антигена върху 80-100% от туморните клетки, оцветяването се ограничава върху мембраната на туморните клетки. С тъкани от стромата, лимфоцити, мускулни клетки или ендотел не се наблюдава никаква реакция.The CD44v6 specific monoclonal antibody BIWA-1 analyzed 126 cases of squamous cell carcinoma of different origin. Expression of isoforms containing CD44v6 was observed in all but one tumor sample. Most of the samples show antigen expression on 80-100% of the tumor cells, staining is limited to the membrane of the tumor cells. No stroma, lymphocyte, muscle cell, or endothelial tissue was observed.

За да се направи количествена оценка на CD44v6 молекулите, върху тези туморни клетки, успоредно с туморните срези се оцветяват и срези от нормална човешка кожа. Нормалните кожни кератиноцити експресират високи равнища от изоформи на CD44 и се причисляват към нормалните клетки, експресиращи най-силно CD44v6, които са описани до днес. Поради това оцветяването на кератиноцитите се приема за стандарт и се квалифицира като “силно” (+++) в настоящата система за оценяване. В по-голямата част от изследваните туморни проби оцветяването на туморните клетки е сравнимо или дори по-силно от оцветяването на кожните кератиноцити, само малко случаи показват слабо (3 случая на метастази в лимфните възли) или умерено (2 първични карцинома, 10 метастази) оцветяване на лимфните възли. В рамките на даден туморен срез реакцията на оцветяване е много хомогенна, при което повечето туморни клетки от среза показват еднаква интензивност на оцветяване. Между първичните тумори и метастазите не се наблюдават значителни различия в профила на експресия на CD44v6. Таблица 1 показва подробно обобщение на резултатите, примери са показани във фигура 2.In order to quantify CD44v6 molecules, sections of normal human skin are stained on these tumor cells in parallel with tumor sections. Normal cutaneous keratinocytes express high levels of CD44 isoforms and are classified as normal cells expressing the most CD44v6, which have been described to date. Therefore, keratinocyte staining is considered as a standard and qualifies as "strong" (+++) in the current evaluation system. In most of the tumor samples tested, the staining of the tumor cells was comparable or even stronger than the staining of skin keratinocytes, with only a few cases showing little (3 cases of lymph node metastases) or moderate (2 primary cancers, 10 metastases). staining of lymph nodes. Within a given tumor slice, the staining reaction is very homogeneous, with most slice tumor cells showing the same intensity of staining. No significant differences in the expression profile of CD44v6 were observed between primary tumors and metastases. Table 1 shows a detailed summary of the results, examples are shown in Figure 2.

Таблица 1: експресия на <jU44vt> в случаи на плоскоклш ьчон ракTable 1: Expression of <jU44vt> in cases of squamous cell carcinoma

Проба Sample Тип тумор Type of tumor Реакция с biwa-i Reaction with biwa-i 46937 46937 86 86 първичен primary ларинкс larynx +++* +++ * 4687 4687 90 90 първичен primary ларинкс larynx +++ +++ 8372 8372 90 90 първичен primary ларинкс larynx +++ +++ 17427 17427 90 90 пъовичен associate лаоинкс laoins +++ +++ 27298 27298 90 90 първичен primary ларинкс larynx +++ +++ 46908 46908 90 90 първичен primary ларинкс larynx ++ + ++ + 51334 51334 90 90 първичен primary ларинкс larynx + + + + + + 51402 51402 91 91 първичен primary ларинкс larynx ++ + ++ + 60414 60414 91 91 първичен primary ларинкс larynx +++ +++ 61733 61733 91 91 първичен primary ларинкс larynx + + + + + + 12280 12280 92 92 първичен primary ларинкс larynx +++ +++ 23140 23140 92 92 първичен primary ларинкс larynx ++ + ++ + 31792 31792 92 92 първичен primary ларинкс larynx ++ + ++ + 32214 32214 92 92 първичен primary ларинкс larynx ++ + ++ + 10209 10209 95 95 първичен primary ларинкс larynx + + + + + + 2366 2366 86 86 първичен primary кожа leather + + + + + + 2574 2574 86 86 първичен primary кожа leather +++ +++ 9916 9916 86 86 първичен primary кожа leather + +/++ + + + / ++ + 2696 2696 87 87 .първичен .primary кожа leather ++ + ++ + 8906 8906 87 87 първичен primary кожа leather +++ +++ 8191 8191 88 88 първичен primary кожа leather +++ +++ 8354 8354 88 88 първичен primary кожа leather + +50% + + 50% 11936 11936 88 88 първичен primary кожа leather + + + + 5590 5590 90 90 първичен primary кожа leather + +/+ + + + + / + + + 530 530 92 92 първичен primary кожа leather + + + + + + 2583 2583 94 94 първичен primary кожа leather +++ +++ 11337 11337 94 94 първичен primary кожа leather + + + + + + 10901 10901 95 95 първичен primary кожа leather + + + + + + 11557 11557 95 95 първичен primary кожа leather + + + + + + 11744 11744 95 95 първичен primary кожа leather + + + + + + 11917 11917 95 95 първичен primary кожа leather + + + + + + 4688 4688 90 90 I I метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + +/+ + + + + / + + + 4688 4688 90 90 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx - - 8374 8374 90 90 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 17428 17428 90 90 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 27300 27300 90 90 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 36942 36942 90 90 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 46909 46909 90 90 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx ++ ++ 51336 51336 90 90 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 41108 41108 91 91 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 51398 51398 91 91 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 60416 60416 91 91 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 61734 61734 91 91 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 1318 1318 92 92 I I метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 1318 1318 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + + + + + + 1318 1318 92 92 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 1318 1318 92 92 IV IV метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 2863 2863 92 92 I I метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 2863 2863 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 5745 5745 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 5745 5745 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 8969 8969 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 8969 8969 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 8969 8969 92 92 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx ++ ++ 8969 8969 92 92 IV IV метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 8969 8969 92 92 2/1 2/1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 8969 8969 92 92 2/11 2/11 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 8969 8969 92 92 2/111 2/111 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx ++ ++ 8969 8969 92 92 2/IV 2 / IV метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +/++ + / ++ 9366 9366 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 9509 9509 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 9566 9566 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 12283 12283 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++

14046 14046 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 31787 31787 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++ +++ 49228 49228 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx +++50% +++ 50% 29228 29228 93 93 метастаз в лимфни^в възли lymph node metastasis ларинкс larynx ++ + ++ + 29829 29829 93 93 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx ++ ++ 29804 29804 95 95 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis ларинкс larynx + +/+ + + + + / + + + 15293 15293 91 91 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung +25% + 25% 1667 1667 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung +20% + 20% 2757 2757 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 2757 2757 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 2757 2757 92 92 III III метастаз а лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung ++ + ++ + 2757 2757 92 92 IV IV метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 4790 4790 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 6168 6168 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + +50% + + 50% 6168 6168 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 6168 6168 92 92 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 6168 6168 92 92 IV IV метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 7206 7206 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 7531 7531 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 7531 7531 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 7531 7531 92 92 III III метастаз а лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + +/+ + + + + / + + + 7531 7531 92 92 IV IV метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 10324 10324 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 10519 10519 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 10519 10519 92 92 RMII RMII метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 10958 10958 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 11425 11425 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 11425 11425 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung + + + + + + 13055 13055 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung ++/+ + + ++ / + + + 13055 13055 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung фокално+++ focal +++ 13055 13055 92 92 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung +++ +++ 16663 16663 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung +++ +++ 16713 16713 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis бял дроб lung +++ +++ 14980 14980 91 91 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus + + + + + + 14980 14980 91 91 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus + + + + + + 16641 16641 91 91 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus +++ +++ 16641 16641 91 91 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хреюпроаод hrayuproaod ++ + ++ + 16641 16641 91 91 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus + + + + + + 1059 1059 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis храмосровод chromatologist + + 1710 1710 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus + + + + + + 1710 1710 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus ++ + ++ + 1710 1710 92 92 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus +++ +++ 11502 11502 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus ++ + ++ + 11502 11502 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis хранопровод esophagus ++ ++ 202 202 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухим hollow lip + +60% + + 60% 6030 6030 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устт кухина mouth cavity +/++/+ + +25% + / ++ / + + + 25% 7335 7335 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity + + + + + + 7335 7335 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устнакухина of the mouth + + + + + + 15324 15324 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity + ++70% + ++ 70% 16164 16164 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity ++ + ++ + 16164 16164 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity + ++50% + ++ 50% 16412 16412 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухит the mouth is hollow + +/+ + + + + / + + + 16836 16836 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity + + + + + + 16836 16836 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity + + + + + + 16836 16836 92 92 III III метастаз в лимфните възли lymph node metastasis устна кухина oral cavity + + + + + + 6228 6228 92 92 1 1 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis сливици tonsils + + + + + + 6228 6228 92 92 II II метастаз в лимфните възли lymph node metastasis сливици tonsils ++ + ++ + 6618 6618 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis сливици tonsils + + + + + + 11840 11840 92 92 метастаз в лимфните възли lymph node metastasis сливици tonsils ++ ++ 14172 14172 91 91 4 4 метастаз в черния дроб liver metastasis хранопровод esophagus + + + + + + 14172 14172 91 91 5 5 метастаз в черния дроб liver metastasis хранопровод esophagus + + + + + + 4131 4131 94 94 1 1 метастаз в черния дроб liver metastasis хранопровод esophagus +/+ + + / + + 8438 8438 94 94 метастаз в черния дроб liver metastasis хранопровод esophagus фокално+ +/+ + + focal + + / + + +

80-100% от туморните клетки реагират положително с BIWA-1. В случаите, в които помалко туморни клетки реагират с антитялото, е показан съответният процент.80-100% of tumor cells respond positively with BIWA-1. In cases where fewer tumor cells react with the antibody, the corresponding percentage is shown.

Пример 2. Експресия на CD44v6 в случаи 5 на рак на бъбрека, рак на простатата и на чернодробни метастази от рак на дебелото червоExample 2. Expression of CD44v6 in Cases 5 of Kidney Cancer, Prostate Cancer and Liver Metastases of Colon Cancer

ТъканиFabrics

Анализирани са 19 случая на рак на бъбрека (12 бистроклетьчни случая, 5 хромофилни случая, 1 хромофобен случай, 1 онкоцитом), 16 първични аденокарцинома на простатата и 19 случая на метастази в лимфните възли от рак на простатата, както и 30 на чернодробни метастази от рак на дебелото черво.19 cases of kidney cancer were analyzed (12 bistro cases, 5 chromophilic cases, 1 chromophobic case, 1 oncocytoma), 16 primary prostate adenocarcinomas and 19 cases of prostate lymph node metastases, as well as 30 liver metastases from colon cancer.

АнтителаAntibodies

BIWA-1 (виж пример 1)BIWA-1 (see example 1)

ИмунохистохимияImmunohistochemistry

За провеждането виж пример 1.For example, see example 1.

За разлика от случаите на плоскоклетъчен рак в по-голямата част от изследваните случаи на рак на бъбрека и на простатата може да се докаже само фокална експресия на изоформи на CD44v6. В случай на по-силна експресия от фокалната при рак на простатата оцветяването е предимно дифузно цитоплазматично и слабо, респ. хетерогенно, в сравнение с оцветяването на нормалния епител на простатата. В 50% от изследваните случаи на метастази от рак на дебелото черво се доказва експресия на изоформи на CD44v6, по-силна от фокалната. Оцветяването в по-голямата част от случаите е слабо до умерено, при което далеч под 100% от туморните клетки на дадена проба показват оцветяване с BIWA-1. Обобщение на резултатите е дадено отново в таблица 2.In contrast to squamous cell carcinoma, only focal expression of CD44v6 isoforms can be demonstrated in the majority of renal and prostate cancer cases studied. In the case of stronger expression than focal prostate cancer, staining is mainly diffuse cytoplasmic and weak, respectively. heterogeneous compared to the staining of the normal epithelium of the prostate. In 50% of cases of colon cancer metastases examined, expression of CD44v6 isoforms stronger than focal was demonstrated. The staining in most cases is poor to moderate, with far less than 100% of the tumor cells in a sample showing staining with BIWA-1. A summary of the results is given again in Table 2.

Таблица 2: Експресия на CD44v6 в случаи на простатни аденокарциноми, бъбречни карциноми и на чернодробни метастази от колоректални карциномиTable 2: Expression of CD44v6 in cases of prostate adenocarcinomas, renal carcinomas and liver metastases from colorectal carcinomas

тип тумор type of tumor п n реакция с BIWA-1 reaction with BIWA-1 отркцмш m otrktsmsh m фокамо ПОАОМС. focus POAOMS. ПОАСМИ' BRIDGES ' простатен аденокариином prostate adenocarine първичен primary 16 16 8 8 3 3 5 5 простатен аденокариином prostate adenocarine мтстми * лимфна· мзли mtstmi * lymphatic nodule 19 19 15 15 2 2 2 2 бъбречен карцином renal carcinoma първичен primary 19 19 17 17 0 0 2 2 колоректален карцином colorectal carcinoma чернодробни метастази liver metastases 30 30 7 7 8 8 15 15

Пример 3. Характеристика на антитела, специфични за CD44Example 3. Characterization of antibodies specific for CD44

Клетъчна линияCell line

Човешката SCC клетъчна линия А-431 (спонтанен епидермоиден карцином на вулвата) е получена от Американската колекция на типовите култури (Rockwell MD) и култивирана съгласно указанията на производителя. Повърхностната експресия на изоформи, съдържащи CD44v6, се определя чрез FACS анализ (флуоресцентно активирано клетъчно сортиране), при което се използва антитялото BIWA-1, конюгиранос FITC (флуоресцинизотиоцианат).Human SCC cell line A-431 (spontaneous vulvar epidermoid carcinoma) was obtained from the American Type Culture Collection (Rockwell MD) and cultured according to the manufacturer's instructions. Surface expression of CD44v6 containing isoforms was determined by FACS analysis (fluorescence activated cell sorting) using the BIWA-1 antibody conjugated FITC (fluorescentisothiocyanate).

Анализ на кинетичните константиAnalysis of kinetic constants

Определянето на афинитета и кинетиката на взаимодействието моноклонално антитялоCD44v6 се провежда чрез повърхностен плазмонен резонанс (SPR), при което се използва BIAcoге 2000-System (Pharmacia Biocensor). Слят белтък глутатион-5-трансфераза-СО44, който съдържа областта, която се кодира от екзони v3-vl0 (GST/ CD44 v3-vl0), се имобилизира върху сензорен чип (sensor chip) СМ5, при което методът на аминокопелуване се провежда съгласно указа нията на производителя. Антитяло в различни концентрации (8-132 пМ) в HBS (10 mM Hepes pH 7,4, 150 тМ натриев хлорид, 3,4 тМ EDTA, 0,05% BIA core surfactant P20) се инжектира върху антигенспецифичната повърхност при скорост на потока 5 μΙ/min. Взаимодействието се регистрира като промяна на SRP сигнала. Дисоциацията на антитялото се наблюдава за 5 min в буферен поток (HBS). Повърхността на чипа се регенерира с единичен пулс от 15 μΐ 30 мМ НС1. Анализът на данните и изчисляването на кинетичните константи се извършва с програмния продукт за оценка на Pharmacia Biosensor BIA, версия 2.1.The affinity and interaction kinetics of monoclonal antibody CD44v6 were determined by surface plasmon resonance (SPR) using the BIAcoge 2000-System (Pharmacia Biocensor). The glutathione-5-transferase-ML44 fusion protein, which contains the region encoded by exons v3-vl0 (GST / CD44 v3-vl0), is immobilized on a sensor chip CM5, whereby the aminocapulation method is performed according to manufacturer's instructions. An antibody at various concentrations (8-132 nM) in HBS (10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM sodium chloride, 3.4 mM EDTA, 0.05% BIA core surfactant P20) was injected onto the antigen-specific surface at a flow rate 5 μΙ / min. The interaction is recorded as a change in the SRP signal. Antibody dissociation was monitored for 5 min in buffer flow (HBS). The surface of the chip is regenerated with a single pulse of 15 μΐ 30 mM HCl. Data analysis and calculation of kinetic constants are performed with the Pharmacia Biosensor BIA software version 2.1.

По този начин се сравнява антигенният афинитет на B1WA-1 с други mAbs, специфични за CD44v6 (VFF4, VFF7, ВВА-13 (IgGl R&D Systems, Abingdon, U.K.)). Кинетичните и афинитетни константи на различните антитела се определят в два независими експеримента. Таблица 3 показва стойностите на асоциационните константи (к_а), дисоциационните скорости (k_d) и дисоциационните константи (K_d) за 4-те mAbs. Всички mAbs показват сходни к_а и k_d, с изкл. на ВВА-13, което има трикратно по-ниска к_а и VFF7, което показва значително по-висока скорост на дисоциация (фактор 5) в сравнение с другите mAbs. Това се изразява в по-нисък афинитет на свързване за VFF7 и ВВА-13 в сравнение с VFF4 и BIWA-1. BIWA-1 показва най-ниската K_d от всички изследвани антитела.Thus, the antigenic affinity of B1WA-1 was compared with other mAbs specific for CD44v6 (VFF4, VFF7, BBA-13 (IgG1 R&D Systems, Abingdon, UK)). The kinetic and affinity constants of the different antibodies were determined in two independent experiments. Table 3 shows the values of association constants (k _a ), dissociation rates (k _d ) and dissociation constants (K _d ) for the 4 mAbs. All mAbs show similar k _a and k _d , with the exception of. of BBA-13, which has a three times lower _ka and VFF7, indicating a significantly higher dissociation rate (factor 5) than the other mAbs. This translates into lower binding affinity for VFF7 and BBA-13 compared to VFF4 and BIWA-1. BIWA-1 showed the lowest K _d of all antibodies tested.

Таблица 3: Кинетични и афинитетни константи на различни тАЬеуспецифични за CD44V6Table 3: Kinetic and affinity constants of various TIEs specific for CD44V6

антитяло antibody ^Μ) ^ Μ) VFF4 VFF4 ΓΐχϊΟ⁵ ΪΟχϊΟ ⁵ 2,6x10’ 2,6x10 ' 2,4х10’^и 2,4x10 ' ^and VFF7 VFF7 1,1x10’ 1,1x10 ' 1.2x10” 1.2x10 ” 1,1x10“ 1,1x10 " BIWA-1 BIWA-1 ЕЗхЮ⁵ ECHR ⁵ 2,2x10* 2,2x10 * 1,7х10'^|и 1,7x10 ' ^{| and} ВВА-13 BBA-13 3,7x10’ 3,7x10 ' 2,3x10” 2,3x10 ” 6,2x10”° 6.2x10 ”°

Анализ на взаимодействието антитялобелтък чрез ELISAAntibody interaction analysis by ELISA

Клетки А-431, експресиращи CD44v6, се култивират в 96-ямкови плаки (Falcin Microtest 111, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) на брой 5 x 10⁴ на ямка в RPM11640 с 10% фетален телешки серум през нощта на 37’С. След една промивка с PBS/0,05% Tween 20 клетките се фиксират за 1 min с леденостуден етанол, след което следва стъпка на промивка. Инкубирането с първо антитяло (VFF4, VFF7, BIWA-1, ВВА-13, 1 ng/ml до 600 ng/ml, всеки път буфер за тестуване: PBS/ 0,5% BSA/0,05% Tween 20) се извършва за 1 h на стайна температура и е последвано от 3 стъпки на промиване. Като второ антитяло се използва заешко антимише-^С-антитяло, конкюгирано с пероксидаза от хрян (DAKO Corporation, Коpenhagen, Danemark; разреждане 1:6000 в буфер за тестуване) (1 h на стайна температура). След три стъпки на промиване се провежда реакцията на оцветяване с разтвор на ТМВ (Kirkegaard + Perry, Gaithersburg, USA). Екстинкцията се измерва с брояч на ELISA-плаки на HewlettPacuard.A-431 cells expressing CD44v6 were cultured in 96-well plates (Falcin Microtest 111, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) 5 x 10 ⁴ per well in RPM11640 with 10% fetal calf serum overnight at 37'C. . After one wash with PBS / 0.05%, Tween 20 cells were fixed for 1 min with ice-cold ethanol followed by a washing step. Incubation with the first antibody (VFF4, VFF7, BIWA-1, BBA-13, 1 ng / ml to 600 ng / ml, each time buffer for testing: PBS / 0.5% BSA / 0.05% Tween 20) for 1 h at room temperature followed by 3 washing steps. Rabbit antimouse-C-antibody conjugated with horseradish peroxidase (DAKO Corporation, Copenhagen, Danemark; dilution 1: 6000 in test buffer) (1 h at room temperature) was used as the second antibody. After three washing steps, the staining reaction was performed with TMB solution (Kirkegaard + Perry, Gaithersburg, USA). Extinction was measured with a HewlettPacuard ELISA plate counter.

На фигура 3 е показано, че относителните афинитета на антителата, както са определени чрез BIAcore анализа, се отразяват във взаимодействието им с туморните клетки, при което BIWA-1 ясно показана най-висок афинитет на свързване.Figure 3 shows that the relative affinities of antibodies, as determined by BIAcore analysis, are reflected in their interaction with tumor cells, with BIWA-1 clearly showing the highest binding affinity.

Белтъчният домен, който се кодира от екзона на CD44v6, се състои от 45 аминокиселини (фигура 4). За да се дефинира по-прецизно епитопът, който се разпознава от BIWA-1, в тестовете по ELISA се използва серия от синтетични пептиди. Предварителни експерименти показват свързване с централно локализиран 14-мер (аминокиселинни остатъци 18-31; фигура 4; сравни също с фигура 1), но не и с пептиди извън тази област. Ето защо се синтезира втора серия от пептиди, които се тестуват в конкурентни ELISAs (фигура 4). Резултатите показват, че пептадьт 19-29 (WFGNRWHEGYR) представлява минималната структура, която се изисква за високафинитетно свързване. Отстраняването на С-крайните аминокиселинни остатъци дава приблизително повече от 100 пъта по-слабо свързване.The protein domain encoded by the exon of CD44v6 consists of 45 amino acids (Figure 4). In order to more precisely define the epitope recognized by BIWA-1, a series of synthetic peptides is used in ELISA tests. Preliminary experiments show binding to a centrally located 14-mer (amino acid residues 18-31; Figure 4; compare also with Figure 1), but not to peptides outside this region. Therefore, a second series of peptides was synthesized, which was tested in competitive ELISAs (Figure 4). The results indicate that peptadate 19-29 (WFGNRWHEGYR) represents the minimum structure required for high-fidelity binding. Removal of the C-terminal amino acid residues yields approximately more than 100-fold less binding.

Пример 4. Биоразпределение на радиоактивно йодирани антитела срещу CD44v6 в голи мишки, носители на ксенотрансплантатиExample 4. Biodistribution of radioactively iodinated antibodies against CD44v6 in nude xenograft-bearing mice

А-431 -ксенотрансплантатен моделA-431 xenograft model

Женски голи мишки Balb/cnu/nu на осемседмична възраст (В& К Universal, Renton, WA) се инжектират подкожно в лявостранната средна линия с 5 х 10⁶ култивирани клетки А-431 (човешки епидермоиден карцином на вулвата). Хсенотрансплантарани животни, носещи А-431-тумори, се използват в експериментите по биоразпределение в рамките на две седмици (тегло на туморите: 40-50 mg).Eight-week-old female Balb / cnu / nu nude mice (B & K Universal, Renton, WA) were injected subcutaneously into the left midline with 5 x 10 ⁶ cultured A-431 cells (human epidermoid carcinoma of the vulva). Xenotransplanted animals carrying A-431 tumors were used in biodistribution experiments within two weeks (tumor weight: 40-50 mg).

Радиоактивно йодиране на BIWA-1Radioactive iodination of BIWA-1

Пречистено върху G-протеин mAb BIWA1 (миши IgGl) се конюгира със стрептавидин, при което се използва хетеробифункционалното съшиващо вещество сукцинимидил 4-^-меламидо-метил) циклохексан-1-карбоксилат. Стрептавидин-лизиновите остатъци се свързват с цистеиновите остатъци на антитялото, които се получават чрез предварително обработване на антитялото с дитиотреитол. Получените 1:1 конюгати (>90%) се пречистват по-нататък с йонообменна хроматография. За експериментите по биоразпределение BIWA-11/SA се бележи по първичния амин на лизина с ^12ίΙ, при което се използва реактивът за бележене р-йодофенил (PIPi NEN Dupont, Wilmington, DE) съгласно метода на Willbur et al. (1989). Бележенето на BIWA-1 с SA или с ^ι2ίΙ не променя имунологичната реак11 тивоспособност или фармакокинетиката на антитялото в мишки.Purified G-protein mAb BIWA1 (mouse IgG1) was conjugated with streptavidin using the heterobifunctional cross-linker succinimidyl 4- (N-melamidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate. The streptavidin-lysine residues bind to the cysteine residues of the antibody, which are obtained by pretreatment of the antibody with dithiothreitol. The resulting 1: 1 conjugates (> 90%) were further purified by ion exchange chromatography. For biodistribution experiments, BIWA-11 / SA was labeled with the primary amine of lysine with ^12ί Ι using the p-iodophenyl labeling reagent (PIPi NEN Dupont, Wilmington, DE) according to the method of Willbur et al. (1989). The labeling of BIWA-1 with SA or ^ι2ί Ι does not alter the immunological reactivity or pharmacokinetics of the antibody in mice.

Експерименти по биоразпределениеBiodistribution experiments

Голи мишки, ксенотрансплантирани с човешки тумори, се инжектират интравенозно (i.v.) в латералната опашна вена с 5-7 тКи ^l2JI, 50 g mAb BIWA-1 (специфична активност 0,1-0,14 mCi/mg. Изследвания на биоразпределението с течение на времето се провеждат в групи от п=3 животни на времева точка при 4, 24, 48, 120 и 168 h след инжектирането. В избрани точки от време мишките се претеглят, обезкървяват се през ретроорбиталния сплит и се умъртвяват чрез цервикална дислокация. Събират се и се претеглят девет органа и тъкани, кръв, опашка, бял дроб, черен дроб, далак, стомах, бъбрек, черво и тумор. Радиоактивността в тъканите в сравнение със стандарти на инжектирания препарат на антитялото се преброява в гама-сцинтилационен брояч (Packard instrument Company, Meriden, CT), при което се използва енергийният прозорец от 2580 kev. Изчислява се процентът инжектирана доза на грам тъкан (% ID/g.Naked mice xenotransplanted with human tumors are injected intravenously (iv) into the lateral tail vein with 5-7 mKi ^l2J I, 50 g mAb BIWA-1 (specific activity 0.1-0.14 mCi / mg. Biodistribution studies with During the course of time, they were carried out in groups of n = 3 animals at a time point at 4, 24, 48, 120 and 168 h after injection, At selected time points the mice were weighed, bled through the retro-orbital plexus and killed by cervical dislocation. Nine organs and tissues are collected and weighed, blood, tail, lungs, liver, spleen, stomach, kidney, that The radioactivity in the tissues compared to the standards of the injected antibody preparation was counted in a Gamma Scintillation counter (Packard instrument Company, Meriden, CT) using an energy window of 2580 kev. The percentage injected dose per gram was calculated. tissue (% ID / g.

Предварителни експерименти показват, че BIWA-1 не реагира кръстосано с миши антиген CD44v6. Таблица 4 и фигура 5 показват поемането на радиоактивност в туморите и нормалните тъкани. Йодираното BIWA-1 показва бързо усвояване в тумора (7,6% инжектирана доза/g на 4 h след инжектирането), което нараства на повече от 18% на 48h, след което до 120 h остава постоянно. Седем дни след инжектирането (168 Ютуморът все още съдържа 15,3% ID на грам тъкан. Отношенията тумор: тъкан се изчисляват за индивидуални точки от време и са показани в таблица 4. На 24 h след инжектирането отношението тумор: кръв е 0,48 и нараства на 3,13 в ден 7-ми. Усвояването от нормалните тъкани е ниско и най-вероятно причина за това е кръвният фон в тьканните биопсии. Избирателното натрупване in vivo на белязаното с ^,25I BIWA-1 в човешките SCC-ксенотранспллантати в мишки показва, че това моноклонално антитяло проявява висок потенциал на прицелващ вектор за диагностично и терапевтично приложение в SCC-пациенти.Preliminary experiments show that BIWA-1 does not cross-react with murine CD44v6 antigen. Table 4 and Figure 5 show the uptake of radioactivity in tumors and normal tissues. The iodized BIWA-1 shows rapid uptake in the tumor (7.6% injected dose / g at 4 h after injection), which increases to more than 18% at 48 h and then remains constant until 120 h. Seven days after injection (168 The tumor still contains 15.3% ID per gram of tissue. Tumor: tissue ratios are calculated at individual time points and are shown in Table 4. At 24 hours after injection, the tumor to blood ratio is 0.48 and increases to 3.13 on day 7. Normal tissue absorption is low and is most likely the cause of blood background in tissue biopsies Selective in vivo accumulation of labeled with ^{, 25} I BIWA-1 in human SCC xenografts shows in mice that this monoclonal antibody exhibits high targeting vector for di agnostic and therapeutic administration in SCC patients.

Таблица 4: Отношения тумор:тъкан на ^12SI-BIWA-1 в голи мишк^тумороносители А-431 в различни точки от време след инжектиранетоTable 4: Tumor Ratios: ^12S I-BIWA-1 Tissue in Naked Mouse A-431 Tumor Carriers at Different Time After Injection

отношение на тумор към relation of tumor to 4 часа 4 hours 24 часа 24 hours 48 часа 48 hours 120 часа 120 hours 168 часа 168 hours кръв blood 0,22¹ 0.22 ¹ 0,48 0.48 1,31 1.31 2.60 2.60 3,16 3.16 опашка tail 1.18 1.18 2,62 2.62 7,70 7.70 12,28 12,28 13,06 13.06 бял дроб lung 0,40 0.40 1,03 1.03 2,65 2.65 7,04 7.04 4,82 4.82 черен дроб liver 0,94 0.94 1,18 1.18 2,28 2.28 3,75 3.75 3,24 3.24 далак springs 1,40 1,40 1.84 1.84 4,00 4,00 4,86 4.86 4,42 4,42 стомах stomach 3,89 3.89 7,37 7.37 19,40 19.40 25,56 25.56 33,96 33.96 бъбрек kidney 0,82 0.82 1,31 1.31 2,72 2.72 2,79 2.79 2,53 2,53 черво intestines 3,54 3.54 6,24 6,24 11,94 11,94 19,24 19,24 27,78 27.78

’ Средни стойности (n=3); SD са 7%.'Mean values (n = 3); SDs are 7%.

Пример 5. Различна експресия на CD44v6 в голям брой човешки тумориExample 5. Different expression of CD44v6 in a large number of human tumors

В един разширен експеримент за експресията на CD44v6 се изследват имунохистохимично с моноклоналното антитяло BIWA-1 (IuiohVFF18) общо 544 туморни проби. Пробите са или включени в парафин, или веднага след хирургичното отстраняване се замразяват в течен азот и се съхранява при -70°С до използването им. Анализират се следните тумори: базилома (п-16), аденокарцином (АС) на гърдата (п^ж55), АС на дебело черво (83), плоскоклетъчен карцином (SCC) на главата и шията (п“125), белодробен карцином (п=120), простатен АС (гт-34), бъбречен карцином (п“27), SCC на кожата (п“15) и АС на стомаха (п=69). Тъканите се получават чрез рутинна хирургия или биопсия, нормалните тъкани се получават успоредно с туморните проби. Имунохистохимичното изследване се провежда, както в пример 1.In an extended CD44v6 expression experiment, a total of 544 tumor samples were immunohistochemically examined with the monoclonal antibody BIWA-1 (IuiohVFF18). Samples are either paraffin-embedded or immediately after surgical removal frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C until used. Analyzed the following tumors: baziloma (n-16), adenocarcinoma (AC), breast (n ^g 55), the AU of the colon (83), squamous cell carcinoma (SCC) of head and neck cancer (n '125), lung carcinoma ( n = 120), prostate AC (rm-34), renal carcinoma (n "27), skin SCC (n" 15) and gastric AC (n = 69). Tissues are obtained by routine surgery or biopsy, normal tissues are obtained in parallel with tumor samples. The immunohistochemical study was performed as in Example 1.

Таблица 5 показва преглед на имунохистохимичния анализ на 397 различни туморни проби с mAb BIWA-1.Table 5 shows an overview of immunohistochemical analysis of 397 different tumor samples with mAb BIWA-1.

Таблица S:Експресия на CD44v6 в човешки тумориTable S: Expression of CD44v6 in human tumors

Тип Type общп community положителни случаи* positive cases * η η % % базалиома basaloma 16 16 10 10 62 62 АС на гърдата AU on the breast първичен тумор primary tumor 17 17 15 15 88 88 метастази в лимфните възли lymph node metastases 34 34 91 91 чернодробни метастази liver metastases 4 4 4 4 100 100 АС на колона AC on a column метастази в лимфните възли lymph node metastases 51 51 21 21 41 41 чернодробни метастази liver metastases 26 26 13 13 50 50 мозъчни метастази brain metastases 6 6 6 6 100 100 ларинкс see larynx see метастази в лимфните възли lymph node metastases 18 18 18 18 100 100 бял дроб АС lungs ac първичен тумор primary tumor 35 35 15 15 43 43 бял дроб SCC lung SCC първичен тумор primary tumor 9 9 9 9 100 100 хранопровод SCC esophageal SCC първичен тумор primary tumor 20 20 20 20 100 100 простата АС prostate OS първичен тумор primary tumor 16 16 5 5 31 31 метастази в лимфните възли lymph node metastases 18 18 0 0 0 0 RCC RCC първичен тумор primary tumor 27 27 5 5 18 18 SCLC SCLC първичен тумор primary tumor 31 31 7 7 23 23 стомах АС stomach ac първичен тумор primary tumor 22 22 15 15 68 68 метастази в лимфните възли lymph node metastases 43 43 16 16 37 37 чернодробни метастази liver metastases 4 4 4 4 100 100 общ η total η 397 397 *: 2:10% от туморните клетки положителни *: 2: 10% of tumor cells positive АС: аденокарцином; RCC: бъбречен карцином AC: adenocarcinoma; RCC: renal carcinoma

SCLC: дребноклетъчен рак на белия дроб; SCC: плоскоклетьчен карциномSCLC: small cell lung cancer; SCC: squamous cell carcinoma

При дребноклетъчните белодробни карциноми, бъбречни карциноми и АС на простатата не се наблюдава никаква или само слаба реакция. Всички други изследвани туморни проби експресират изоформи, съдържащи CD44v6 в различни количества. Повечето от изследваните АС на гърдата реагират с BIWA-1, а тестуваните SCC (ларинкс, бял дроб и хранопровод) експресират CD44v6 100% във всички случаи.In the small cell lung carcinoma, renal carcinoma and prostate AS, no or only mild response was observed. All other tumor samples tested expressed isoforms containing CD44v6 in different amounts. Most of the breast ACs tested responded with BIWA-1, and the tested SCCs (larynx, lung, and esophagus) expressed CD44v6 100% in all cases.

За реакция с BIWA-1 се изследват общо 185 случая на SCC от различен вид и класификация. Те включват 67 случая на първичен SCC (ларинск, п=15; устна кухина, п=16; орофаринкс, п=3; кожа, η=15), ΊΊ проби от метастази в лимфните възли (ларинкс, п^ш12; бял дроб, п=27; хранопровод, п=11; устна кухина, п=6, орофаринкс, п=7; хипофаринкс, п=10, сливици, п=4) и три проби от чернодробни метастази (хранопровод). Таблица 6 показва преглед на имунихистохимичния анализ на всички изследвания SCCпроби.A total of 185 cases of SCC of different types and classification are investigated for reaction with BIWA-1. These included 67 cases of primary SCC (larynx, n = 15; oral cavity, n = 16; oropharynx, n = 3; skin, η = 15), ΊΊ lymph node metastases (larynx, n ^w 12; lung , n = 27; esophagus, n = 11; oral cavity, n = 6, oropharynx, n = 7; hypopharynx, n = 10, tonsils, n = 4) and three liver metastases (esophagus). Table 6 shows an overview of the immunohistochemical analysis of all SCC assay studies.

Таблица 6: Експресия на CD44v6 в случаи на плоскоклетьчен ракTable 6: Expression of CD44v6 in cases of squamous cell carcinoma

ТИП TYPE общп community отрицателни negative фокално полож. focal position. положителни positive η η % % η η % % п n % % хипофаринкс hypopharynx LNM LNM 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10 100 100 орофаринкс oropharynx РТ RT 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 100 100 LNM LNM 7 7 0 0 0 0 0 0 0 0 7 7 100 100 ларинкс larynx РТ RT 15 15 0 0 0 0 0 0 0 0 15 15 100 100 LNM LNM 30 30 1 1 3 3 0 0 0 0 29 29 97 97 бял дроб lung РТ RT 18 18 2 2 11 11 0 0 0 0 16 16 89 89 LNM LNM 27 27 0 0 0 0 1 1 4 4 26 26 96 96 хранопровод esophagus РТ RT 20 20 0 0 0 0 1 1 5 5 19 19 95 95 LNM LNM 11 11 0 0 0 0 0 0 0 0 11 11 100 100 LM LM 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 100 100 устна кухина oral cavity РТ RT 16 16 0 0 0 0 0 0 0 0 16 16 100 100 LM LM 6 6 0 0 0 0 0 0 0 0 6 6 100 100 кожа leather РТ RT 15 15 0 0 0 0 0 0 0 0 15 15 100 100 сливици tonsils LNM LNM 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 100 100 общ η total η 185 185

фокално полож.: < 10% от туморните клетки положителни; метастази в лимфните възли; РТ: първичен тумор; LM: чернодробни метастазиfocal position: <10% of tumor cells positive; lymph node metastases; PT: primary tumor; LM: liver metastases

Експресия на изоформи, съдържащи CD44v6, се открива във всички, с изкл. на три от туморните проби (един случай на ларинкс, 2 случая на бял дроб). По-голямата част от пробите показва експресия на антигена от порядъка на 5 80% до 100% от туморните клетки в рамките на отделен срез, при което оцветяването е съсредо точено главно върху мембраната на туморните клетки. Най-силен хомогенен профил на оцветяване се открива в карциноми на ларинкса, хранопровода и хипофаринкса, при което повечето туморни клетки показват една и съща интензивност на оцветяване.Expression of CD44v6-containing isoforms was detected in all exceptions. on three of the tumor samples (one case of larynx, 2 cases of lung). Most of the samples show antigen expression in the range of 5 80% to 100% of the tumor cells within a single slice, with staining focusing mainly on the tumor cell membrane. The strongest homogeneous staining profile is found in cancers of the larynx, esophagus, and hypopharynx, with most tumor cells showing the same intensity of staining.

ПРОТОКОЛ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:CONSOLIDATED PROTOCOL (1) GENERAL INFORMATION:

(i) ЗАЯВИТЕЛ:(i) APPLICANT:

(A) ИМЕ: Boehringer Ingelheim International GmbH (B) УЛИЦА: Rheinstrasse (C) ГРАД: Ingelheim (E) СТРАНА: Deutschland (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 55216 (G) ТЕЛЕФОН: +49-(0)-6132-772770 (H) ТЕЛЕФАКС: +49-(0)-6132-774377 (A) ИМЕ: Forschungscentrum Karlsruhe GmbH (B) УЛИЦА: Postfach 3649 (C) ГРАД: Karlsruhe (E) СТРАНА: Deutschland (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 76021 (A) ИМЕ: Heider, Karl-Heinz (B) УЛИЦА: Hervicusgasse 4/3/21 (C) ГРАД: Wien (E) СТРАНА: Oesterreich (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 1120 (A) ИМЕ: Adolf, Guenther (B) УЛИЦА: Stiftgasse 15-17/10 (C) ГРАД: Wien (E) СТРАНА: Oesterreich (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 1070 (A) ИМЕ: Oestermann, Elinborg (B) УЛИЦА: Mauerbachstr. 56/6 (C) ГРАД: Wien (E) СТРАНА: Oesterreich (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 1140 (A) ИМЕ: Patzelt, Erik (B) УЛИЦА: Hans-Buchmueller-Gasse 8 (C) ГРАД: Purkersdorf (E) СТРАНА: Oesterreich (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 3002 (A) ИМЕ: Sproll, Marties (B) УЛИЦА: Schwenkgasse 3 (C) ГРАД: Wien (E) СТРАНА: Oesterreich (F) ПОЩЕНСКИ КОД: 1120 (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: Метод за диагностика и лечение на плоскоклетьчен рак (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 16 (iv) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ:(A) NAME: Boehringer Ingelheim International GmbH (B) STREET: Rheinstrasse (C) CITY: Ingelheim (E) COUNTRY: Deutschland (F) ZIP CODE: 55216 (G) PHONE: + 49- (0) -6132-772770 ( H) TELEFAX: + 49- (0) -6132-774377 (A) NAME: Forschungscentrum Karlsruhe GmbH (B) STREET: Postfach 3649 (C) CITY: Karlsruhe (E) COUNTRY: Deutschland (F) ZIP CODE: 76021 (A ) NAME: Heider, Karl-Heinz (B) STREET: Hervicusgasse 4/3/21 (C) CITY: Wien (E) COUNTRY: Oesterreich (F) ZIP code: 1120 (A) NAME: Adolf, Guenther (B) STREET : Stiftgasse 15-17 / 10 (C) CITY: Wien (E) COUNTRY: Oesterreich (F) POSTAL CODE: 1070 (A) NAME: Oestermann, Elinborg (B) STREET: Mauerbachstr. 56/6 (C) CITY: Wien (E) COUNTRY: Oesterreich (F) ZIP: 1140 (A) NAME: Patzelt, Erik (B) STREET: Hans-Buchmueller-Gasse 8 (C) CITY: Purkersdorf (E) COUNTRY: Oesterreich (F) POSTAL CODE: 3002 (A) NAME: Sproll, Marties (B) STREET: Schwenkgasse 3 (C) CITY: Wien (E) COUNTRY: Oesterreich (F) POSTAL CODE: 1120 (ii) TITLE HA : Method for the diagnosis and treatment of squamous cell carcinoma (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 16 (iv) FORM FOR COMPUTER READING:

(A) ТИП СРЕДА: Флопи диск (B) КОМПЮТЪР: IBM РС-съвместим (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) ПРОГРАМЕН ПРОДУКТ: Patentin Release #1.0, Версия #1.30 (ЕРА) (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:1:(A) ENVIRONMENT TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC-compatible (C) OPERATION SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.30 (EPA) (2) SEQ ID NO: 1:

(I) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) ДЪЛЖИНА: 129 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: двете (D) ТОПОЛОГИЯ: двете (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: геномна ДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:(A) LENGTH: 129 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) CHAIN: both (D) TOPOLOGY: both (ii) MOLECULAR TYPE: genomic DNA (ix) FEATURE:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: екзон (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 1..129 (C) ДРУГА ИНфОРМАЦИЯ:/продукт=„С044 /белег = v6 /забележка= „база данни GenBank, кодов No. L05411 (ix) ОСОБЕНОСТ:(A) NAME / KEY: exon (B) LOCALIZATION: 1..129 (C) OTHER INFORMATION: / product = "C044 / mark = v6 / note =" GenBank database code no. L05411 (ix) FEATURE:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 3..128 (x) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (A) АВТОРИ: Screaton.GR(A) NAME / KEY: CDS (B) LOCALIZATION: 3..128 (x) PUBLISHING DATA (A) AUTHORS: Screaton.GR

Bell, MVBell, MV

Jackson, DGJackson, DG

Cornells, FBCornells, FB

Gerth, UGerth, U

Bell, JI (B) 3Ar/\ABHE:Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons (C) СПИСАНИЕ: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.Bell, JI (B) 3Ar / \ ABHE: Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons (C) DESCRIPTION: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

(D) TOM: 89 (F) СТРАНИЦИ: 121160-12164 (G) ДАТА: Декември-1992 (K) СЪЩЕСТВЕНИ ОСТАТЪЦИ В SEQ ID N0:1 ОТ 1 ДО 129 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА HA ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (x) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1:(D) TOM: 89 (F) PAGES: 121160-12164 (G) DATE: December-1992 (K) ESSENTIAL RESIDUES IN SEQ ID NO: 1 FROM 1 TO 129 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 195 45 472.3 (I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (OCTOBER-1956 (OCTOBER) 1956 (x) SEQ ID NO: 1:

ТС CAG GCA ACT CCT AGT AGT АСА ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 15 10 15TC CAG GCA ACT CCT AGT AGT ACA ACG GAA GAA ACA GCT ACC CAG AAG Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 15 10 15

GAA Glu GAA Glu CAG TGG TTT GGC AAC AGA CAG TGG TTT GGC AAC AGA TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA АСА CCC TGG CAT GAG GGA TAT CGC CAA ACA CCC Gin Trp Phe Gly Asn 20 Gin Trp Phe Gly Asn 20 Arg Arg Trp Trp His His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Pro 25 25 30 30 AGA AGA GAA GAA GAC GAC TCC TCC CAT CAT TCG TCG ACA ACA ACA ACA GGG GGG ACA ACA GCT GCT G Mr Arg Arg Glu Glu Asp Asp Ser Sir His His Ser Sir Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala 35 35 40 40

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:2:(2) SEQ ID NO: 2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:(i) HA SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) ДЪЛЖИНА: 42 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (vi) ОРИГИНАЛЕН ИЗТОЧНИК:(A) LENGTH: 42 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: protein (vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0: 2:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Gin Gin Ala Ala Thr Thr Pro Pro Ser Sir Ser Sir Thr Thr Thr Thr Glu Glu Glu Glu Thr Thr Ala Ala Thr Thr Gin Gin Lys Lys Glu Glu 1 1 5 5 10 10 15 15 Gin Gin Trp Trp Phe Phe Gly Gly Asn Asn Arg Arg Trp His Trp His Glu Glu Gly Gly Tyr Tyr Arg Arg Gin Gin Thr Thr Pro Pro Arg Arg 20 20 25 25 30 30 Glu Glu Asp Asp Ser Sir His His Ser Sir Thr Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Ala Ala 35 35 40 40

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:3:(2) SEQ ID NO: 3 INFORMATION:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 196 15 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 3:(A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (DE) 45 TO (H) 195 (N) 195: I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 196 15 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: NOQ DESCRIPTION: NO : 3:

Gin Trn Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 1'5 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:4:Gin Trn Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 1'5 10 (2) SEQ ID NO: 4:

(A) ДЪЛЖИНА: 27 базови двойки (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 4:(A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:5:CAGGCTGGGA GCCAAATGAA GAAAATG (2) SEQ ID NO: 5:

(A) ДЪЛЖИНА: 30 базови двойки (B) ТИП: нуклеотид (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: друга нуклеинова киселина (А) ОПИСАНИЕ: /desc = „PCR primer“ (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19545472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1996 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0: 5:(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "PCR primer" (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19545472.3 (I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE19615 07E4 074 074 1996 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:6:TGATAAGGAA CGATTGACAT TAGAGTTGGA (2) SEQ ID NO: 6:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (x) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 6:(A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DATA 47 H (45) 195 (H) I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: NO 6:

Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Gly Tyr Arg 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:7:Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Gly Tyr Arg 15 10 (2) SEQ ID NO: 7:

(A) ДЪЛЖИНА: 43 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19545472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0: 7:(A) LENGTH: 43 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 195 TO (H) 195.3 APPLICATION DATE: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: SEQ: SEQ: 7Q

Gin Gin Ala Ala Thr Thr Pro Pro Ser Sir Ser Sir Thr Thr Thr Thr Glu Glu Glu Glu Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gin Gin Lys Glu Lys Glu 1 1 5 5 10 10 15 15 Gin Gin Trp Trp Phe Phe Gly Gly Asn Asn Arg Arg Trp Trp His His Glu Glu Gly Gly Tyr Arg Tyr Arg Gin Gin Thr Thr Pro Arg Pro Arg 20 20 25 25 30 30 Glu Glu Asp Asp Ser Sir His His Ser Sir Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala Ala Ala 35 35 40 40

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:8:(2) SEQ ID NO: 8:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0: 8:(A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 45 TO (195) I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: 8:

Ser Ser Thr Thr Siu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:9:Ser Ser Thr Thr Siu Glu Thr Ala Thr Gin Lys 15 10 (2) SEQ ID NO: 9:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:9:(A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 45 TO (195) I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: 9:

Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin TrpGlu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp

10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:10:10 (2) SEQ ID NO: 10:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:10:(A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 45 TO (195) I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: 10:

Thr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp Phe Gly AsnThr Ala Thr Gin Lys Glu Gin Trp Phe Gly Asn

10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:11:10 (2) SEQ ID NO: 11:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 11:(A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (DE) 45 TO (H) NO. ) DATE OF APPLICATION: DECEMBER 06, 1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: SEQ: 11

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:12:Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 15 10 (2) SEQ ID NO: 12:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 12:(A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 45 TO (H) NO. ) DATE OF APPLICATION: DECEMBER 06, 1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: SEQ: 12 :

Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:13:Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro 15 10 (2) SEQ ID NO: 13:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13:(A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 45 TO (195) I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: 13:

Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg Glu Asp Ser 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:14:Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg Glu Asp Ser 15 10 (2) SEQ ID NO: 14:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:14:(A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (H) 45 TO (195) I) DATE OF APPLICATION: 06-DECEMBER-1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: 14:

Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser His Ser Thr Gly 15 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:15:Thr Pro Arg Glu Asp Ser His Ser His Ser Thr Gly 15 10 (2) SEQ ID NO: 15:

(A) ДЪЛЖИНА: 42 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 15:(A) LENGTH: 42 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (DE) 45 TO (H) NO. ) DATE OF APPLICATION: DECEMBER 06, 1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: SEQ: 15

Тгр 1 Tr 1 Ala Ala Asp Asp Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Pro Asn Ser Thr Thr Glu Glu Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gin Gin Lys 15 Lys 15 Glu Glu 5 5 10 10 Lys Lys Trp Trp Phe Phe Glu Glu Asn Asn Glu Glu Trp Trp Gin Gin Gly Gly Lys Lys Asn Asn Pro Pro Pro Pro Thr Thr Pro Pro Ser Sir 20 20 2 = 2 = 30 30 Glu Glu Asp Asp Ser Sir His His Vai Vai Thr Thr Glu Glu Gly Gly Thr Thr Thr Thr 35 35 43 43

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:16:(2) SEQ ID NO: 16:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE195 45 472.3 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 06-ДЕКЕМВРИ-1995 (х) ДАННИ ЗА ПУБЛИКУВАНЕ (H) НОМЕР НА ДОКУМЕНТА: DE 19615 074.4 (I) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 17-АПРИЛ-1956 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 16:(A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) CHAIN: single stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: peptide (x) PUBLICATION DETAILS (DE) 45 TO (H) NO. ) DATE OF APPLICATION: DECEMBER 06, 1995 (x) PUBLICATION DATA (H) DOCUMENT NUMBER: DE 19615 074.4 (I) DATE OF APPLICATION: 17-APRIL-1956 (xi) DESCRIPTION: SEQ: 16 :

Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp G 1 5Lys Trp Phe Glu Asn Glu Trp G 1 5

Claims

A method for treating squamous cell carcinoma based on the binding of an antibody to an epitope encoded by the variable exon v6 of the CD44 gene, characterized in that it uses an antibody that recognizes the amino acid sequence WFGNRWHEGYR.

A method according to claim 1, characterized in that it utilizes the BIWA-1 multiclonal antibody (VFF-18), which is obtained from the hybridoma cell line with deposit number DSM ACCC2174, or a derivative thereof.

A method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody, a Fab or P (αb ') 2-fragment of an immunoglobulin, recombinantly produced antibody, obtained recombinantly chimerically, or respectively. humanized antibody, bifunctional or single chain antibody (scFv).

Gly Lys Asn Pro Pro Thr

Use of an antibody that binds to the WFGNRWHEGYR amino acid sequence in a method according to any one of claims 1 to 3.

Method for carrying out a method according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is an antibody or antibody molecule that binds to the amino acid sequence WFGNRWHEGYR.

Use according to claim 4, characterized in that the antibody is the monoclonal antibody BIWA-1 (VFF-18), which is obtained from the hybridoma cell line with deposit number DSM ACC2174, or a derivative thereof.

Use according to any one of claims 4 or 5, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody, a Fab- or F (ab ') ₂ fragment of an immunoglobulin, recombinantly produced antibody, recombinantly obtained chimerically, or respectively. humanized antibody, bifunctional or single chain antibody (scFv).

Use of an antibody that binds to the amino acid sequence WFGNRWHEGYR for the treatment of squamous cell carcinoma.

The use according to claim 7, xa 22 wherein the antibody is the monoclonal antibody BIWA-1 (VFF-18) derived from the hybridoma cell line with deposit number DSM ACC 2174, or a derivative thereof.

Use according to claim 7 or 8, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody, a Fab or P (a ') _2- fragment of an immunoglobulin, recombinantly produced antibody, recombinantly obtained chimerically, or respectively. humanized antibody, bifunctional or single chain antibody (scFv).

Use according to any one of claims 7 to 9, characterized in that the antibody is conjugated with a radioactive isotope, a photoactivated compound, a radioactive compound, an enzyme, a fluorescent dye, a biotin molecule, a toxin, a cytostatic agent, an intermediate, an antibody with other specificity or with another immunomodulatory polypeptide.

12. Use of an antibody that binds to the amino acid sequence WFGNRWHEGYR for the manufacture of a pharmaceutical preparation for the treatment of squamous cell carcinoma.