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BE895431A - AGENT FOR DECOMPOSING VEGETABLE REMANENCE, PROCESS FOR PREPARING PURIFIED VEGETABLE PROTEIN AND PURIFIED VEGETABLE PROTEIN OBTAINED - Google Patents

AGENT FOR DECOMPOSING VEGETABLE REMANENCE, PROCESS FOR PREPARING PURIFIED VEGETABLE PROTEIN AND PURIFIED VEGETABLE PROTEIN OBTAINED Download PDF

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BE895431A
BE895431A BE6/47757A BE6047757A BE895431A BE 895431 A BE895431 A BE 895431A BE 6/47757 A BE6/47757 A BE 6/47757A BE 6047757 A BE6047757 A BE 6047757A BE 895431 A BE895431 A BE 895431A
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BE
Belgium
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sps
emi
protein
ase
activity
Prior art date
Application number
BE6/47757A
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French (fr)
Inventor
J L Adler-Nissen
G W Jensen
S Riisgaard
H Gurtler
H A S Olsen
M Schulein
Original Assignee
Novo Industri As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

       

  Agent de décomposition de la rémanence végétale, procédé

  
 <EMI ID=1.1> 

  
protéine végétale purifiée obtenue.

  
La présente invention, concerne un agent amélioré pour la décomposition de la rémanence végétale, particulièrement la rémanence de soja ; elle concerne également un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée ainsi que la protéine végétale purifiée. 

  
Un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée (pvp) par élimination enzymatique de la rémanence, sans dissolution et reprécipitation de la protéine, est décrit dans le brevet belge n[deg.] 882 769.

  
Dans ce brevet, on décrit également l'importance du fait que l'activité protéolytique doit être maintenue aussi basse que possible. La pureté de la pvp pouvant être obtenue par le procédé connu n'est pas satisfaisante et demande donc à être améliorée. Dans les exemples, on a montré une pureté de la pvp d'environ 85%. Même s'il

  
est possible d'obtenir une pvp présentant une pureté d'environ 90 % suivant le procédé connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines substances de départ prétraitées, par exemple un concentré de protéines de soja. Il serait souhaitable d'obtenir une pureté de

  
pvp supérieure à 90 % en utilisant une gamme de substances de départ beaucoup plus large, particulièrement de la farine de soja décortiquée et dégraissée.

  
La présente invention repose sur la découverte surprenante consistant en ce qu'une certaine partie du produit de la décomposition de la rémanence tel qu'il apparaît pendant le traitement enzymatique indiqué ci-dessus, à savoir un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé soluble dans l'eau se fixe lui-même sur une partie de la protéine ainsi qu'il sera expliqué plus en détail ciaprès. Il en résulte, bien entendu, une pureté moins bonne de la protéine.

  
Par conséquent, un objet de l'invention  consiste à fournir un agent pour la décomposition de la rémanence végétale, en présence d'une protéine végétale, la rémanence végétale étant particulièrement la rémanence de soja, de manière à obtenir une pureté améliorée de la pvp ; un autre objet consiste en un procédé de préparation d'une pvp.

  
Le principe de l'invention peut être décrit de la manière suivante en référence à la figure 1 qui n'indique que des substances existant en tant que solides nondissous alors que tous les surnageants, sont omis. Une charge de farine de soja a été divisée en deux parties égales, partie I et partie II (colonne a dans la figure 1). La partie I a été décomposée par voie protéolytique à un

  
 <EMI ID=2.1> 

  
tique produite au moyen de B. licheniformis et vendue par NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd, Danemark) et a ensuite été lavée à un pH d'environ 8 afin d'éliminer la quantité totale de protéine et.la rémanence a été séparée du surnageant et a été lavée (voir partie I, colonne a et b, figure 1). De cette manière, on a isolé une rémanence pure (désignée par rémanence I) (colonne b à la figure 1).

  
 <EMI ID=3.1> 

  
plus de brièveté, la rémanence de la partie II est dénommée rémanence II (colonne b à la figure 1). Ensuite, la

  
 <EMI ID=4.1> 

  
 <EMI ID=5.1> 

  
pectolytique produite par Schweizerische Ferment A/G, Baie, Suisse) (voir colonnes b et c à la figure 1). On a découvert de manière inattendue, que la partie non dissoute de

  
 <EMI ID=6.1> 

  
dissoute de la rémanence II, sur base des bilans d'azote et de la masse des matières sèches (voir figure 1 dans laquelle les surfaces hachurées de la colonne c correspondent aux substances insolubles différentes des protéines dans l'étape indiquée ci-dessus). En outre, si le

  
 <EMI ID=7.1> 

  
; ajouté à la suspension de protéine de soja à pH 4,5, un polysaccharide du surnageant est lié à la protéine de

  
 <EMI ID=8.1> 

  
qui est une partie du produit de décomposition de la rémanence et qui est nettement soluble dans l'eau en absence de protéine de soja mais est lié à la protéine de soja au point isoélectrique de la protéine de soja ou autour de ce point si celle-ci est présente, est désigné  par SPS (soluble polysaccharide), voir figure 1. Le SPS présente une distribution de poids moléculaire comprise entre 5 x 106 et 4,9 x 104. La préparation de SPS isolé apparaît dans le diagramme synoptique représenté à la figure 2 qui recouvre également certains des procédés <EMI ID=9.1> 

  
trouver un agent qui est capable de décomposer le SPS de telle manière que les produits de décomposition de SPS ne lient pas la protéine de soja ou lient celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS ne lie la protéine de soja.

  
Bien que la description concerne principalement la décomposition d'une protéine de soja, l'invention n'est pas limitée à une telle protéine mais concerne toutes

  
les espèces de protéines végétales, notamment par exemple les protéines citées dans le brevet belge n[deg.] 882.769,page
1.

  
Suivant la présente invention, on a, à présent, trouvé qu'en examinant l'aptitude à décomposer du SPS de soja, il est possible de sélectionner des micro-organismes qui sont aptes à produire un composé qui présente une activité enzymatique, qui décompose effectivement le SPS

  
de soja, composé désigné ci-dessous, pour plus de concision, SPS-ase. 

  
Par conséquent, on peut dire que la SPS-ase est

  
 <EMI ID=10.1> 

  
soja dans des conditions adéquates en des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes à la protéine végétale, en milieu aqueux, en une mesure moindre

  
que le SPS de soja avant décomposition ne se serait fixé lui-même à la même protéine végétale dans des conditions correspondantes.

  
Suivant un premier aspect, la présente invention vise donc à fournir un agent pour la décomposition de la rémanence végétale, notamment de la rémanence de soja, en présence d'une protéine végétale, particulièrement la protéine de soja, cet agent convenant bien pour la préparation d'une pvp présentant une pureté de la protéine d'environ 90 % à partir d'une protéine végétale dégraissée ou partiellement dégraissée, servant de substances de départ et contenant une enzyme à activité de solubilisation de la rémananence, caractérisé, en ce que l'agent contient une enzyme capable de décomposer le SPS de soja (SPS-ase) et en ce qu'il est essentiellement

  
exempt d'activité protéolytique. L'agent est essentiellement exempt d'activité protéolytique lorsque celle-ci est égale ou inférieure à l'activité protéolytique qui entraînerait une perte de protéine totale dans la pvp obtenue non supérieur à 30 %, de préférence non supérieure à

  
 <EMI ID=11.1> 

  
environ 65 % de la rémanence a été solubilisée sur base du bilan d'azote et de la masse de matière sèche.

  
On a trouvé que la SPS-ase, capable de décomposer le SPS de soja, permet de décomposer de manière plus complète que le font les pectinaaes et cellulases commerciales, les polysaccharides semblables au SPS d'origine végétale ou provenant de fruits.

  
La pureté de la protéine végétale finale nécessairement améliorée par une élimination totale ou partielle du SPS de la protéine végétale finale par rapport a la pureté de la protéine végétale finale obtenue suivant le procédé du brevet belge n[deg.] 882.769 dans la . mesure où cette protéine végétale connue était contaminée par du SPS.

  
On ne sait pas à présent si la SPS-ase décrite ci-après développe son activité enzymatique à partir d'une seule enzyme ou à partir d'un complexe d'enzymes comprenant au moins deux enzymes. Certaines recherches semblent indiquer qu'au moins deux enzymes sont responsables de l'effet de décomposition de la SPS-ase, une de ces enzymes étant capable de n'effectuer qu'une légère décomposition du SPS, après quoi une ou plusieurs enzymes sont capables d'effectuer une décomposition plus importante du SPS. Une telle hypothèse ou des hypothèses semblables ne doivent cependant pas limiter la portée de l'invention. 

  
Suivant un mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent, la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre Aspergillus.

  
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent, le composé actif est dérivé des enzymes pouvant être obtenues au moyen de Asp. aculeatus CBS 101.43. La même SPS-ase peut être obtenue par Asp. japonicus IFO 4408. On a trouvé que Asp. aculeatus CBS
101.43 produit également des enzymes très puissantes solubilisant la rémanence, des çellulases, des pectinases et des hemicellulases. En outre, on a trouvé que toute souche appartenant-à l'espèce Asp. aculeatus ou à

  
 <EMI ID=12.1> 

  
SPS-ase nécessaire dans le but de l'invention. Ainsi comme il apparaît dans un paragraphe* ultérieur- de la

  
 <EMI ID=13.1>  ATCC 20236 ne produit pas suffisamment de SPS-ase pour être détectée par la détermination enzymatique de la SPSase décrite dans le présent mémoire descriptif.

  
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent, la SPS-ase est identique au point

  
 <EMI ID=14.1> 

  
de Asp.aculeatus CBS 101.43 et identifiable au moyen de la technique de recouvrement électrophorétique, cf. parties 6 et 7.

  
Suivant un autre mode de réalisation préféré de l'agent suivant la présente invention, le rapport de l'activité protéolytique en unités HUT et de l'activité solubilisante de la rémanence en unités SRUM-120 est inférieur à environ 2:1, de préférence inférieur à 1:1 et

  
 <EMI ID=15.1> 

  
qu'il existe une relation nette entre l'activité de la 

  
 <EMI ID=16.1> 

  
pH 3,2 (pH d'activité optimale de la protéase) et la perte en protéine. Cette relation est spécifique pour la préparation de SPS-ase obtenue au moyen de Asp. aculeatus CBS 101.43. Il est à noter que cette relation ne peut

  
 <EMI ID=17.1> 

  
une SPS-ase qui diffère de la SPS-ase obtenue au moyen de CBS 101.43, mais qu'un homme de l'art peut trouver une relation semblable qui remplit les exigences en ce qui concerne la perte en protéine définie dans la revendication principale. L'activité SRUM-120 (à définir plus loin) est une mesure des activités classiques de solubilisation de la rémanence, de cellulase, de pectinase et d'hémicellulase et d'autres activités. Les unités SRUM-120 sont mesurées à pH 4,5. Il est a noter qu'on a' choisi ce pH, étant donné que la décomposition de la rémanence s'effectue à la valeur isoélectrique du pH de la protéine de soja ou aux environs de celle-ci et qu'il faut utiliser un autre procédé de mesure de l'activité enzymatique dans le cas où la décomposition de la rémanence est effectuée à un autre pH.

  
Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'agent suivant la présente invention, l'agent comporte une activité de cellulase et celle-ci est partiellement ou totalement dérivée de Trachoderma reseei. Cette cellulase permet de dissoudre la cellulose cristalline et cet agent produit une pvp présentant une pureté élevée.

  
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent suivant la présente invention,

  
 <EMI ID=18.1> 

  
se (VECU).

  
Dans Agr. Biol. Chem. 40 (1), 87 - 92, 1976, on

  
 <EMI ID=19.1> 

  
un complexe d'enzymes qui est capable d'effectuer une dégradation partielle d'un polysaccharide acide dans la sauce de soja, nommée APS, dont une fraction est désignée par APS-I. Ce polysaccharide acide n'est pas identique au

  
 <EMI ID=20.1> 

  
ce mémoire descriptif à la partie 3. Ainsi, les chroma-

  
togrammes HPLC de filtration sur gel du SPS et de l'APS sont nettement différents et, en outre, les chromatogrammes de filtration sur gel de l'APS décomposé par la pectinase. commerciale Pectolyase et du SPS traité avec la pectinase commerciale Pectolyase sont nettement différents. En outre, il n'apparaît pas dans cet article que le polysaccharide acide est lié à la protéine de soja et que le polysaccharide acide décomposé n'est pas lié à la protéine de soja

  
ou y est lié à un degré nettement inférieur à celui d'un polysaccharide acide non décomposé. On a également prouvé que cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantité suffisante pour une détection au moyen d'une détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans ce mémoire. Ceci

  
 <EMI ID=21.1> 

  
en tant que producteur de SPS-ase 1 cependant, suivant l'invention, on a trouvé de manière inattendue que

  
 <EMI ID=22.1> 

  
de SPS-ase.

  
Suivant un deuxième aspect, la présente invention vise à fournir un procédé pour la préparation d'une protéine végétale purifiée en éliminant la rémanence d'une protéine végétale brute servant de substance de départ, caractérisé en ce que la substance de départ est traitée avec l'agent suivant l'invention dans un milieu aqueux,

  
 <EMI ID=23.1> 

  
point isoélectrique de la partie principale de la fraction de protéine de la substance de départ, à une température

  
 <EMI ID=24.1> 

  
qu'au moins environ 60 % de la rémanence/ sur base du bilan d'azote et de la masse de matière sèche, de préférence au moins environ 70 % de celle-ci, plus particulièrement au moins environ 80 % de celle-ci, aient été solubilisés et en ce qu'on sépare du produit surnageant, la phase solide contenant la protéine végétale purifiée.

  
Suivant un mode particulièrement préféré du procédé de la présente invention, la séparation est effectuée à une température comprise entre la température ambiante et le point de congélation du surnageant. On obtient ainsi un haut rendement en protéines.

  
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est une protéine végétale dégraissée ou une protéine végétale dégraissée et de plus partiellement purifiée. Cette substance de départ est facile à obtenir.

  
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est de la farine de soja. Cette substance de départ est bon marché et facile à obtenir. 

  
Suivant un autre mode d'exécution particuliè-rement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est une farine de soja traitée thermiquement, de préférence une farine de soja cuite au jet. Dans ce cas, on peut utiliser un dosage moins important de l'enzyme et on peut, en outre, obtenir un rendement plus élevé.

  
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ peut traverser un tamis ayant une ouverture de mailles d'environ 2,5 mm. Ceci assure un temps de réaction raisonnablement court.

  
On ne peut fournir que le rapport de dosage (en unités SAE) pour l'activité de SPS-ase dans le traitement de la farine de soja ; au moins environ 35 unités SAE par
100 grammes de farine de soja cuite au jet, et 350 unités SAE par 100 grammes de farine de soja non cuite. En  pratique, la relation exacte des activités enzymatiques nécessaires pour décomposer le SPS n'est pas connue et c'est pourquoi on ne peut fournir des dosages et proportions minimum pour la pectinase, la cellulase et

  
 <EMI ID=25.1> 

  
le traitement de 1,-. farine de soja en unités SRUM peut être fournie, il savoir au moins environ 60 unités SRUM-
120 par 100 grammes pour la farine de soja cuite, environ
600 unités SRUM-L20 par 100 grammes- pour la farine non chauffée. Les valeurs données à titre d'exemples ciaprès semblent être supérieures au dosage minimum. On peut utiliser des essais d'arrêt-mesure pour établir les proportions et temps de réaction opératoires optimum pour convertir le substrat de soja en pvp.

  
Suivant un troisième aspect, la présente invention vise à fournir une protéine végétale purifiée produite par le procédé suivant la présente invention. 

  
Afin de mieux expliciter la nature de la présente invention, on se référera à la description qui suit et qui est divisée en différentes parties numérotées de 1 à 10 décrivant chacune les détails spécifiques relatifs à la présente invention. Les différentes parties sont comme suit :

  
1. Préparation du SES.

  
2. Caractérisation du SPS, en particulier

  
distribution du poids moléculaire de celui-ci.

  
3. Essais prouvant la différence entre SPS et APS.

  
4. Sélection de microorganismes produisant de la

  
SPS-ase.

  
5. Caractérisation de certains microorganismes

  
formant de la SPS-ase.

  
6. Description générale de la technique de

  
recouvrement associée à des immunoêlectrophorèses.

  
 <EMI ID=26.1> 

  
la SPS-ase avec un anticorps polyspécifique et recouvrement.

  
8. Purification d'une préparation de SPS-ase.

  
9. Dépendance de l'activité à l'égard du pH et

  
de la température et stabilité d'une SPS-ase.

  
10 Détermination de l'activité enzymatique. 

  
PARTIE 1.

PREPARATION DU SPS.

  
Comme déja mentionné précédemment, la substance de départ pour la préparation du SPS peut être la rémanence de soja. C'est pourquoi, on décrira d'abord la préparation d'une rémanence de soja.

  
La rémanence de soja est une fraction d'hydrate de carbone exempte de protéines (qui, en pratique, peut contenir de faibles quantités de lignine et matières minérales), contenue dans la farine de soja dégraissée et décortiquée, ladite fraction d'hydrate de carbone étant insoluble.dans un milieu aqueux à pH 4,5 et pouvant être préparée de la manière suivante, en référence au tableau synoptique n[deg.] 1.

  
La farine de soja dégraissée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est mise en suspension dans de l'eau

  
 <EMI ID=27.1> 

  
soja à l'eau de 1:5, dans un réservoir contenant un équipement de stabilisation de pH et de température. On règle

  
 <EMI ID=28.1> 

  
hydrolyse à pH stationnaire au moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme protéolytique à base de B. licheniformis ayant une activité de 0,6 unités Anson par gramme, l'activité étant déterminée suivant la méthode Anson, comme décrit dans NOVO ENZYME INFORMATION IB No. 058 e-GB). Le rapport enzyme/ substrat correspond à 4 % de la quantité de protéines dans la farine de soja (II). Après une hydrolyse pendant une heure, la boue est séparée par centrifugation (III) et on lave (IV), cette opération étant effectuée deux fois (V, VI, VII). La boue ainsi traitée est ensuite hydrolysée une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6 L (VIII, IX), de manière similaire à ce qui a été dit ci-dessus. Ensuite la boue séparée par centrifugation (X) est lavée deux fois (XI, XII, XIII, XIV), la boue finalement lavée (6) étant sèchée par pulvérisation (XV).

   La poudre ainsi produite, sèchée par pulvérisation est la rémanence de soja servant de matériau brut pour la production de SPS.

  
Le SPS est la fraction soluble à l'eau de polysaccharide qui est obtenue par un traitement classique de la rémanence de soja susmentionnée avec de la pectinase. Le SPS est préparé de la manière suivante au moyen des 14 étapes réactionnelles indiquées ci-dessous, en référence au tableau synoptique n[deg.] 2.

  
1. On détermine la teneur en matière sèche de la rémanence

  
susmentionnée et on dilue la rémanence de soja dans de l'eau à raison de 2 % de matière sèche et ladite rémanence de soja est maintenue en suspension à 50[deg.]C dans un réservoir comportant un réglage de température.

  
 <EMI ID=29.1> 

  
du Pectinex Super concentré L (pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse) présentant une activité en pectinase'de 750.000 MOU, déterminée suivant le feuillet "Détermination of the Pectinase units of Apple Juice (MOU)" du 12.6.1981, disponible à la Schweizerische Ferment AG, Baie, Suisse et on ajoute également en quantité de 20 g/kg de matière sèche du Celluclast 200L (cellulase commerciale décrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB 1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S, 

  
 <EMI ID=30.1> 

  
heures en agitant.

  
5. Les enzymes sont inactivées en augmentant le pH à 9 ,0

  
au moyen de NaOH 4N. Le mélange réactionnel est maintenu tel quel pendant 30 minutes et le pH est ensuite réglé à 4,5 au moyen de HC1 6N.

  
 <EMI ID=31.1> 

  
produit de centrifugation ainsi que la boue.

  
7. Le produit de centrifugation de l'étape 6 subit une

  
filtration de contrôle sur un filtre presse (le filtre. est lavé à l'eau avant la filtration de contrôle).

  
 <EMI ID=32.1>  à une diafiltration et ensuite encore à une ultrafiltration sur une membrane présentant une valeur de coupure de 30.000. (DDS GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker), en ayant recours aux paramètres suivants :

  
1. Ultrafiltration correspondant à une concentration de

  
volume de 6.

  
2. Diafiltration jusqu'à ce que le pourcentage en 

  
 <EMI ID=33.1> 

  
3. Ultrafiltration jusqu'à environ 15 % de matière sèche

  
dans le concentrat.

  
 <EMI ID=34.1> 

  
pression moyenne de 3 bars.

  
9. Le concentrat soumis à l'ultrafiltration est refroidi

  
 <EMI ID=35.1> 

  
10.On récupère le précipité au moyen d'une centrifugeuse.

  
11.. Le précipité est lavé deux fois par de l'éthanol dans

  
l'eau à 50 % v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'étape 10, c'est-à-dire qu'on effectue deux centrifugations.

  
12.Le précipité lavé est remis en solution dans l'eau en un

  
volume qui correspond au volume de concentrat de l'étape 9 soumis à ultrafiltration.

  
13.Le liquide de l'étape 12 est soumis à une filtration de

  
contrôle sur un filtre de verre.

  
14.Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylisé. 

  

 <EMI ID=36.1> 
 

  
TABLEAU SYNOPTIQUE N[deg.] 2
 <EMI ID=37.1> 
 PARTIE 2

CARACTERISATION DU SPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DUPOIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI.

  
On a déterminé (fig. 4), la distribution du poids moléculaire du SPS dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, au moyen d'une chromatographie sur gel dans un équipement HPLC (pompe Waters, modèle 6000, module de données 730 de Waters et réfractomètre R 401 de Waters). On a également déterminé (fig. 5) la distribution du poids moléculaire des produits de décomposition du SPS par la SPS-ase suivant le même procédé. En outre, on a montré pala même méthode, l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS (fig. 6) et l'absence de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé par l'agent suivant l'invention (fig. 7),

  
La courbe de calibrage (le logarithme du poids moléculaire en fonction de Rf, où la valeur Rf pour le glucose est arbitrairement définie comme étant 1 et où la valeur R f d'un dextrane spécifique est définie en tant que temps de rétention de ce dextrane divisé par le temps de rétention du glucose) a été établie au moyen de plusieurs dextranes

  
 <EMI ID=38.1> 

  
Boite 175, S-75104, Uppsala, Suède. On a trouvé la valeur Rf pour le maximum de chaque pic de dextrane et le poids

  
 <EMI ID=39.1> 

  
culaire. On a utilisé du NaN03 0,1 M comme éluant pour ce processus chromatographique. Les,colonnes utilisées dans ce processus chromatographique sont la colonne PW 5000 de
60 cm suivie par une colonne PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Manufacturinq Co., Japon. On a établi la relation

  
 <EMI ID=40.1> 

  
dextranes indiqués ci-dessus de cette manière, cfr. fig. 3.

  
A partir de la fig. 4, on peut calculer que le SPS présente une distribution de poids moléculaire qui est  <EMI ID=41.1> 

  
une valeur M d'environ 4,2 x 10 . Il apparaît également dans cette figure que le chromatogramme présente deux pics distincts 1 un temps de rétention de 34,5 minutes (6 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 5 x 106 et à un temps de rétention de 47,12 minutes (67 %) correspon-

  
 <EMI ID=42.1> 

  
apparaît également de cette courbe qu'il existe un épaulement entre ces deux pics à un temps de rétention de 41,25 minutes (27 %) correspondant à un poids moléculaire de 2,8 x 105.

  
-Après la décomposition du SPS par la SPS-ase, le mélange d'hydrolyse a été filtré sur membrane et le filtrat a été soumis à la chromatographie. On a trouvé qu'environ
55 % du SPS est décomposé en monosaccharide, disaccharide et trisaccharide et que le résidu de 45 % a été décomposé en un polymère présentant trois pics correspondant au poids <EMI ID=43.1> 

  
5.

  
Dans le but de démontrer l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS et la réduction substantielle de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé au moyen de la SPS-ase, on a effectué les essais suivants.

  
3 % de SPS dans un tampon acétate 0,10 M à pH 4,5 est ajouté à une boue d'un isolat de soja (Purina E 500)  afin de générer une suspension présentant le rapport isolat/ SPS correspondant à 10:1. On fait incuber cette suspension

  
 <EMI ID=44.1> 

  
incubation, la suspension est centrifugée et le surnageant clair est analysé par HPLC comme décrit précédemment. En comparant la fig. 6 à la fig. 4, il apparaît que le SPS est complètement adsorbé sur l'isolat de soja.

  
Le même processus que celui mentionné dans le paragraphe précédent est mis en oeuvre avec une solution à 3 % de SPS hydrolysé avec une SPS-ase produite par CBS LOI.43 (fig. 7) . En comparant la fig. 7 et la fig. 5, on constate qu'aucun composé du SPS hydrolysé présentant un poids moléculaire inférieur à 10 4 n'est adsorbé sur l'isolat de soja. L'hydrolyse réduit la liaison quantitative jusqu'à environ 10 à 15 % par rapport à la liaison du SPS à la protéine de soja.

  
Une analyse RMN du SPS, dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, révèle la composition approximative suivante du SPS :

  
1) acide a-galacturonique en une quantité d'environ 45 %,

  
approximativement 40 % de la quantité totale d'acide a-galacturonique étant présents en tant qu'ester méthylique.

  
2) rhamnopyranose en une quantité d'environ 20 %,

  
3) galactopyranose en une quantité d'environ 15 %, et

  
4) P-xylopyranose en une quantité d'environ 20 %.

  
Les constituants semblent être présents suivant une structure comprenant une chaîne principale rhamnogalacturonique et des chaînes latérales de xylose et de galactose.

  
L'hydrolyse acide complète du SPS (8 heures dans

  
 <EMI ID=45.1> 

  
également de faibles quantités de monosaccharides fucose et arabinose dans le SPS hydrolysé.

  
Une analyse HPLC du SPS décomposé par le complexe d'enzymes SPS-ase formé par CBS 101.43 montre une importante réduction du poids moléculaire. De manière semblable, le spectre RMN du SPS décomposé comme indiqué ci-dessus montre qu'une majeure partie des groupes ester a disparu et que, également, la teneur en xylose et galactose dans la substance à poids moléculaire plus élevé a diminué. Le spectre RMN de la partie du produit de décomposition de SPS qui précipite par addition.d'un volume d'éthanol à un volume de produit de décomposition de SPS est semblable au spectre RMN du SPS qui a subi les modifications susmentionnées concernant les groupes ester et la teneur en xylose et galactose. 

  
PARTIE 3

ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS

  
On a préparé le APS comme mentionné dans Agr.

  
Biol. Chem., Vol. 36, No. 4, p. 544 - 550 (1972).

  
On a ensuite hydrolysé ce polysaccharide et le SPS avec différentes enzymes , puis on a soumis le mélange de décomposition à une chromatographie sur gel par. un équipement HPLC, comme mentionné dans la deuxième partie, "Caractérisation du SPS, en particulier la distribution du poids moléculaire de celle-ci".

  
Plus précisément, on a effectué l'hydrolyse par un traitement d'une solution de 25 ml de 2% de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon acétate 0,1 M ayant un pH de 4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de Pectolyase KRF 68 est une préparation de SPS-ase dont la fabrication est

  
 <EMI ID=46.1> 

  
tableau suivant : - 

  

 <EMI ID=47.1> 


  
PARTIE 4.

SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE.

  
Le microorganisme à tester est soumis à une incubation sur un substrat incliné d'agar présentant une composition qui permet la croissance du microorganisme. Après une croissance initiale sur le substrat incliné d'agar, le microorganisme est transféré dans un substrat principal liquide dans lequel la source de carbone principale est le SPS (préparé comme indiqué), dans lequel la  <EMI ID=48.1> 

  
libres, des protéines ou d'autres composés contenant de l'azote, le substrat contenant en outre un mélange des sels et vitamines nécessaires, de préférence sous la forme d'un extrait de levure. La composition du substrat principal dépend du genre de microorganisme, la considération principale étant que le substrat soit capable de supporter la croissance et le métabolisme du microorganisme. Lorsque la croissance a eu lieu pendant une période de temps adéquate, de l'ordre de 1 à 7 jours, dépendant de la vitesse de croissance du microorganisme en question, on analyse un échantillon du bouillon de fermentation pour déterminer la SPS-ase suivant la détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans ce mémoire.

  
Afin d'avoir une technique plus sensible pour déterminer l'activité enzymatique, on peut abaisser la température à 40[deg.]C et augmenter le temps d'incubation à 20 heures pendant la détermination de l'activité de la SPS-as&#65533; tout en ajoutant aussi des antibiotiques au substrat afin d'empêcher une infection.

  
Par cette technique, on peut trouver d'autres nicroorganismes produisant' de la SPS-ase pouvant apparteair au genre Aspergillus et à d'autres genres.

  
?ARTIE 5.

:ARACTERISATION DE CERTAINS MICROORGANISMES FORMANT DE LASPS-ASE.

  
Par la technique de sélection pour des microorgaiismes produisant de la SPS-ase indiquée dans ce mémoire descriptifs on a trouvé que les microorganismes cités dans La partie supérieure du tableau suivant sont des producteurs le SPS-ase. Le tableau contient également une souche tppartenant à l'espèce Asp. japonicus qui n'est pas un 'réducteur de SPS-ase. 

  

 <EMI ID=49.1> 


  
Une identification courte des souches indiquées ci-dessus peut être trouvée dans les catalogues de culture suivants :

  
List of Cultures 1978, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas.

  
 <EMI ID=50.1> 

  
The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14è édition 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Amérique.

  
Toutes les souches du tableau indiqué ci-dessus correspondent étroitement à la description taxonomique des espèces Asp. japonicus et Asp. aculëatus décrites dans "The genus Aspergillus" de Raper and Fennell, 1965, voir particulièrement les pages 327 à 330.

  
PARTIE 6

DESCRIPTION GENERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENTASSOCIEE ADESIMMUNOELECTROPHORESES.

  
On a développé un procédé dénommé technique de recouvrement de top-agar pour identifier les composants

  
 <EMI ID=51.1> 

  
composants d'enzyme du complexe d' enzymes. Le procédé est basé sur le fait que les enzymes sont encore actives après la liaison spécifique entre l'enzyme et l'anticorps ou, exprimé de manière différente, le procédé est basé sur le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de la liaison enzyme-anticorps. Les complexes enzyme-anticorps précipitent en tant qu'arcs distincts dans le gel pendant l'électrophorèse. La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble dans du top-agar. Après chauffage à 45[deg.]C pendant 20 heures dans une atmosphère ayant une humidité relative de 100 %, l'arc qui possède une activité de SPS-ase apparaît en tant que zone claire dans la couverture de SPS après précipitation par un mélange de parts égales en-'volume d'éthanol et d'acétone, lorsqu'on regarde du dessus contre ur fond noir.

   Les arcs qui ne présentent pas d'activité SPS-ase restent invisibles.

  
PARTIE 7.

CARACTERISATION IMMUNOELECTROPHORETIQUE DE LA SPS-ASE AVECUN ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUVREMENT.

  
On a immunisé des lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase obtenu par fermentation de

  
 <EMI ID=52.1> 

  
l'exemple 1 (KRF 68) et on a récupéré l'anticorps polyspécifique d'une manière connue en soi. Au moyen de cet anticorps polyspécifique on a effectué une immunoélectrophorèse croisée du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de l'Aspergillus aculeatus CBS 101.43, comme indiqué à l'exemple 1 (KRF 68), l'immunoélectrophorèse

  
 <EMI ID=53.1> 

  
 <EMI ID=54.1> 

  
1977. On se réfère à la fig. 11 qui montre les arcs correspondant aux différentes protéines produites par le microorganisme. On a trouvé, au moyen de la technique de recouvrement de top-agar décrite précédemment, que la surface hachurée correspond à la SPS-ase. 

  
Si l'hypothèse susmentionnée supposant que la SPS-ase consiste en au moins deux enzymes est correcte,

  
la surface hachurée est la surface dans laquelle se  trouvent toutes les enzymes responsables de l'activité de SPS-ase. Si, suivant d'autres modes d'exécution de la présente invention, on peut séparer des enzymes par immunoêlectrophorèse de telle manière qu'elles ne couvrent aucune surface mutuelle, on peut encore identifier une

  
 <EMI ID=55.1> 

  
phorèse avec un recouvrement avec à la fois le SPS et une pectinase commerciale.

  
PARTIE 8.

PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE.

  
On a effectué la purification de la préparation de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par échange d'ions.

  
Le tampon est le Tris 50 mMolaire (tris-hydroxyméthylamino-

  
 <EMI ID=56.1> 

  
est une colonne K 5/30 vendue par Pharmacia, Suède. La substance d'échange d'ions est du DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suède (300 ml). La vitesse de passage est de
100 ml/heure.

  
On a dissous 15 g de la préparation de SPS-ase

  
 <EMI ID=57.1> 

  
On règle le pH à 7,0 au moyen de Tris 1 Molaire. La colonne a été équilibrée au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'échantillon de SPS-ase dans la colonne. On a mesuré OD280 et la conductivité de l'éluat; voir à

  
la fig. 12. La fraction 1 correspond à l'éluat qui n'est pas lié à la substance d'échange d'ions,. Ensuite la colonne a été lavée avec 2000 ml de tampon, ce qui donne la fraction 2. On a ensuite établi un gradient de NaCl 0-500 mMolaire ce qui donne les fractions 3 - 9. Les neuf fractions ont été concentrées à 200 ml et ont été dyalisées contre l'eau aune conductivité de 2mSi par dialyse (Hollow Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U.S.A.). Ensuite les neuf fractions ont été lyophilisées. Uniquement les fractions 1 et 2 présentaient une activité de SPS-ase.

  
La fraction 1 a été purifiée ultérieurement par une filtration sur gel. On a dissous 1,5 g de la fraction 1 dans 10 ml d'acétate de sodium 50mMolaire ayant un pH de

  
 <EMI ID=58.1> 

  
x 100 cm de LKB.. La substance servant à la filtration sur gel est le Sephacryl S-200 de Pharmacia, Suède. La vitesse de passage est de 30 ml/heure. Les fractions contenant des substances ayant un poids moléculaire compris entre 70.000 et 100..000, calibrées avec des protéines globulaires, contenaient un complexe d'enzymes désigné pàr facteur G qui ne peut décomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai suivant le test qualitatif d'agar.; cependant, le SPS est décomposé suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on mélange le facteur G avec une pectinase. On a trouvé que le facteur G est capable de séparer le galactose, le ,fucose et certains acides galacturoniques du SPS ; mais le produit de décomposition principal suivant l'analyse HPLC est un produit à poids moléculaire élevé ressemblant très fort au SPS.

  
PARTIE 9.

DEPENDANCE DE L'ACTIVTE A L'EGARD DU.pH ET DE LA TEMPERA-TURE ET STABILITE D'UNE SPS-ASE

  
La fig. 13 montre l'activité en fonction du pH  de la préparation de SPS-ase KRF 68. De pH 2,7 à 3,5 on a utilisé un système de tampon à l'acide formique et de pH 3,7 à 5,5 on a utilisé un système de tampon à l'acétate.

  
La fig. 14 montre l'activité en fonction- de la  température delà préparation de SPS-ase KRF 68.

  
La fig. 15 montre la stabilité thermique de la. préparation de SPS-ase KRF 68. 

  
PARTIE 10

DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE.

  
Le tableau repris ci-dessous donne un aperçu des différentes déterminations de l'activité enzymatique relevant de la présente invention.

  

 <EMI ID=59.1> 

Les références indiquées dans la dernière

  
.colonne du tableau susmentionné sont détaillées dans le tableau suivant. 

  

 <EMI ID=60.1> 


  
En ce qui concerne la détermination de l'activi.té de cellulase, il est à noter que l'analyse a été effectuée comme indiqué dans AF 149/6-GB et que les principes de détermination sont expliques dans Analytical Biochemistry. 

A. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE.

  
La détermination enzymatique de SPS-ase est effectuée en deux étapes, c'est-à-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une détermination quantitative de l'activité SPS-ase, basée sur la mesure de la quantité totale de sucres libérée. Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est négatif, l'activité SPS-ase est nulle quelle  que soit la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase. Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est positif, l'activité en SPS-ase est égale à la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase.

  
I. Essai qualitatif sur plaque d'agar.

  
On a préparé une plaque de SPS-agar de la manière suivante. On a préparé un tampon (B) en amenant de

  
 <EMI ID=61.1> 

  
On dissout 1. g de SPS dans 20 ml de B. On mélange 1 g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe jusqu'au point d'ébullition en agitant. Lorsque l'agarose est dissoute,la solution de SPS est lentement ajoutée. La solution qui en résulte à 1 % SPS-agarose. est disposée dans un bain d'eau à 60[deg.]C. Les plaques sont ensuite coulées en versant 15 ml de la solution à 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les dimensions de 10 cm x 10 cm. Ensuite 

  
on estampe 9 "puits" dans la couche solidifiée de SPS-agarose à une distance de 2,5 cm. Dans chaque

  
 <EMI ID=62.1> 

  
téine d'enzyme à tester en ce qui concerne l'activité en SPS-ase. On fait incuber la plaque pendant 18 heures à
50[deg.]C et à une humidité relative de 100 %: Ensuite le SPS . non encore décomposé est précipité par une solution à parts égales en volumesd'éthanol et d'acétone. L'essai de la SPS-ase sur plaque d'agar est positif pour un échantillon placé dans un puits spécifique si une zone annulaire claire apparaît autour de ce puits.

  
II. DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-asa

  
Le but de cet essai est de déterminer les activités enzymatiques qui sont capables de décomposer le SPS d'une telle façon.. que les produits de décomposition présentent une affinité à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja fortement réduite ou ne présentent pas d'affinité, à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja. Des essais ont montré que la partie des produits de décomposition de SPS qui n'est pas précipitée par le mélange de parts égales en volumes d'eau et d'éthanol ne présente aucune affinité à l'adsorption ou à la liaison à la protéine de soja. 

  
La détermination de la SPS-ase est basée sur une hydrolyse du SPS dans des conditions standard suivie par une précipitation de la partie de SPS qui n'a pas été hydrolysée par l'éthanol. Après la précipitation, la teneur en hydrate de carbone qui n'est pas précipitée est déterminée par une analyse quantitative pour le sucre total (suivant AF 169/1, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvaerd).

  
Les conditions standard sont : 

  
 <EMI ID=63.1> 

  
pH 4,5

  
Temps de réaction : contrôle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat, suivi par 2 minutes l'enzyme étant additionnée.

  
Temps de réaction : valeur principale 212 minutes L'équipement comprend :

  
 <EMI ID=64.1> 

  
Agitateur Whirlimixer

  
Centrifugeuse

  
Un bain d'eau glacé.

  
Les réactifs comprennent :

  
Tampon : acide acétique 0,6 M dans l'eau  <EMI ID=65.1> 

  
Substrat :la valeur pH de 50 ml de a est

  
réglée à 4,5 au moyen de b, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et après dissolution de celui-ci, le pH est réglé une nouvelle fois à 4,5 et le volume

  
 <EMI ID=66.1> 

  
désionisée.

  
Réactif d'arrêt Ethanol absolu.

  
Une unité d'activité SPS-ase (SAE ou SPSu) est définie comme l'activité SPS-ase qui libéré

  
une quantité d'hydrate de carbone soluble dans de l'éthanol à 50 % équivalente à 1 mole de galactose par minute, dans les conditions standard susmentionnées.

  
Même si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une ligne droite, il faut noter qu'elle

  
 <EMI ID=67.1> 

B. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE SOLUBILISANT

  
LA REMANENCE EXPRIMEE EN SRUM 120.

  
Principe.

  
Dans le procédé pour la détermination de l'activité d'hydrolyse, la partie insoluble de la farine de soja dégraissée, déprotéinisée et décortiquée est hydrolysée dans des conditions standard. La réaction de l'enzyme est arrêtée avec un réactif d'arrêt. et la fraction insoluble.est séparée par filtration. La quantité de polysaccarides dissous est déterminée par spectrophotométrie après une hydrolyse acide suivant AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S, 2880 Bagsvaerd.

  
Les carbohydrases présentant une activité endo ainsi que celles présentant une activité exo sont déterminées suivant le procédé.

  
Le substrat faisant partie de cette détermination enzymatique est identique au substrat de la rémanence décrit pour la méthode SRU. Le substrat est -dissous sous forme d'une solution à 3 % dans le tampon au citrate indiqué ci-dessous :

  
 <EMI ID=68.1> 

  
Art 6580)

  
Amené à 1 litre par de l'eau déminéralisée

  
 <EMI ID=69.1> 

  
Stable pendant 14 jours.

  
Le réactif d'arrêt . présente la composition suivante :

  
 <EMI ID=70.1> 

  
200 ml d' éthanol à 96 %

  
A garder dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'utilisation. 

  
Conditions standard :

  

 <EMI ID=71.1> 


  
Définition de l'unité :

  
Une unité d'activité solubilisante la rémanence de soja (SRUM) 120 (M pour manuel) correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de réaction données, libère, par minute, des polysaccharides solubilisés équivalant à une micro-mole de galactose.

C. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE

MESURE HUT

  
Procédé pour la détermination de protêinase dans un milieu acide. 

  
Le procédé est basé sur la digestion d'hémoglo-

  
 <EMI ID=72.1> 

  
pendant 30 minutes. L'hémoglobine non digérée est précipitée au moyen d'acide trichloracétique à 14 %
(poids/volume) .

  
Tous les échantillons d'enzymes sont préparés en dissolvant celles-ci dans un tampon acétate 0, 1M, à pH 3,2.

  
Le substrat d'hémoglobine est préparé en utilisant 5,0 g de poudre d'hémoglobine bovine lyophilisée,

  
 <EMI ID=73.1> 

  
déminéralisée qui est agitée pendant 10 minutes, avant de règler le pH à 1,7 au moyen de HC1 0,33 N.

  
Après une agitation ultérieure de 10 minutes, on

  
 <EMI ID=74.1> 

  
cette solution est porté à 200 ml au moyen d'un tampon acétate 0,2 M. Ce substrat d'hémoglobine doit être refroidi pour être gardé pendant 5 jours.

  
'Le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante. Au temps zéro, 5 ml du substrat sont introduitsdans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme. Après agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40[deg.]C pendant 30 minutes. Après exactement
30 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à
14 % dans l'éprouvette, qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes.

  
Pour l'essai à blanc, le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante. Au temps zéro, on ajoute 5 ml du substrat dans l'éprouvette contenant 1 ml d'enzyme. Après une agitation d'une seconde,

  
 <EMI ID=75.1> 

  
5 minutes. Après exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique â 14 % dans l'éprouvette, qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes.

  
Après 40 minutes, les essais à blanc et les échantillons sont agités, filtrés une ou deux fois à

  
 <EMI ID=76.1> 

  
spectrophotomètre. L'échantillon est lu par rapport à l'essai à blanc à 275 nm en ajustant le spectrophotomètre ;par rapport à de l'eau.

  
Etant donné que l'absorbance de la tyrosine à 275 nm est un facteur connu, il n'est pas nécessaire d'établir une courbe standard de tyrosine à moins qu'il ne soit nécessaire de contrôler le speetrophotomètre de Beckman.

  
Calculs:

  
1 HUT est la quantité d'enzyme, qui forme, en une minute, un hydrolisat équivalent en ce qui concerne l'absorbance à 275 nm à une solution de 1,10 microgramme/ml de tyrosine dans du HC1 0,006 N. Cette valeur de l'absorbance est de 0,0084. La réaction s'effectue à 40[deg.]C, à pH 3,2 et pendant 30 minutes.

  

 <EMI ID=77.1> 


  
Un essai pour déterminer la dépendance de la stabilité du pH de la protëase dans le KRF 68, effectué

  
 <EMI ID=78.1> 

  
8,0 a montré que la stabilité de la protéase à pH supérieur à 8,0 était très faible, cfr. fig. 16.

  
Dans le but d'illustrer la présente invention,on se référera . aux exemples suivants 1 à 10, dans lesquels l'exemple 1 illustre la préparation de SPS-ase et dans lesquels les exemples 2 à 10 illustrent l'application de la SPS-ase. 

  
On a effectué de nombreuses fermentations avec des

  
 <EMI ID=79.1> 

  
laboratoire. Ainsi on a obtenu des préparations qui contenaient la SPS-ase suivant les essais de SPS-ase indiqués ci-dessus. Cependant, étant donné qu'on a besoin de quantités assez importantes de SPS-ase afin d'exécuter les essais, on a effectué des fermentations

  
 <EMI ID=80.1> 

  
exemple 1 suivant. 

Exemple 1

  
Production d'une SPS-ase à l'échelle d'une installation pilote.

  
On a préparé une SPS-ase par fermentation submergée d'Aspergillus aculeatus CBS 101.43.

  
On a préparé un substrat d'agar présentant la composition suivante dans un flacon Fernbach :

  

 <EMI ID=81.1> 


  
On a réglé le pH à une valeur entre 5,30 et 5,35. Ensuite on a ajouté 40 g d'agar Difco et on a maintenu le  mélange dans un autoclave pendant 20 minutes à 120[deg.]C (le substrat est dénommé E-agar).

  
La souche CBS 101.43 a été cultivée sur un plan incliné de E-agar (37[deg.]C). Les spores du plan incliné ont été mis en suspension dans du lait écrémé stérilisé et la suspension a été lyophilisée dans des fioles. La teneur d'une fiole lyophilisée a été transvasée dans un flacon de Fernbach. Le flacon a ensuite été soumis à une incubation

  
 <EMI ID=82.1> 

  
On a préparé un substrat ayant la composition suivante, dans un réservoir de fermentation de 500 litres :

  

 <EMI ID=83.1> 


  
On a ajouté de l'eau de robinet jusqu'à un volume

  
 <EMI ID=84.1>  le fermentateur d'inoculation pendant, une heure à 121[deg.]C.

  
Le volume final avant inoculation était d'environ 300 litres.

  
La suspension de spores dans le flacon de

  
 <EMI ID=85.1> 

  
tion. Les.conditions de fermentation de l'inoculât étaient :

  
Type de fermentateur ,: Réservoir de fermentation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,3.

  

 <EMI ID=86.1> 


  
Environ 28 heures après l'inoculation, on a transféré 150 litres du fermentateur d'inoculationvers le réservoir de fermentation principal.

  
On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation principal de
2500 litres :

  

 <EMI ID=87.1> 


  
On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 900 1. La farine de soja grillé a été mise en suspension dans l'eau. On a réglé le pH à 8,0 au moyen

  
 <EMI ID=88.1> 

  
une pression relative de zero atmosphère relative et une

  
 <EMI ID=89.1> 

  
ajouté les composants restants de substrat et on a réglé le pH à environ 6 au moyen d'acide phosphorique. On a stérilisé le substrat dans le réservoir de fermentation principal pendant 1 1/2 heure à 123[deg.]C. Le volume final avant inoculation était d'environ 1080 litres.

  
Ensuite on a ajouté 150 litres de culture ' d'inoculation.

Les conditions de fermentation sont :

  
Type de fermentateur : Réservoir de fermentation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,7.

  

 <EMI ID=90.1> 


  
A partir de 24 heures de fermentation jusqu'à environ 116 heures de fermentation on a ajouté une solution de pectine de manière. aseptique au réservoir de fermentation principal à raison d'une vitesse constante d'environ

  
8 litres par heure. La solution de pectine ayant la composition suivante a été préparée dans un réservoir de dosage de 500 litres.

  
 <EMI ID=91.1> 

  

 <EMI ID=92.1> 


  
x Genu pectin (du genre citrus NF de "The Copenhagen

  
pectin factory Ltd").

  
On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 325 litres. Le substrat a été stérilisé dans un réservoir de dosage pendant 1 heure à 121[deg.]C. Le volume final avant le début du dosage était d'environ 360 litres. Lorsque cette partie a été épuisée, on a préparé une autre partie similaire. Le volume total de la solution de pectine pour une fermentation était d'environ 725 litres.

  
Après environ 151 heures de fermentation on a arrêté le processus de fermentation. Le bouillon de culture d'environ 1850 litres a été refroidi à environ 5[deg.]C et on a récupéré les enzymes selon la technique ..suivante.

  
Le bouillon de culture a été filtré sur un titre tambour sous vide (Dorr Oliver), qui était enrobé d'une terre de diatomées Hy-flo-super-cel (adjuvant de filtration). Le filtrat a été concentré par évaporation à environ 15 % du volume du bouillon de culture. Le concentré a été filtré sur une feuille de filtre Seitz
(type supra 100) comportant 0,25 % de Hy-flo-super-cel à

  
 <EMI ID=93.1> 

  
le tableau suivant). Le filtrat a été précipité au moyen

  
 <EMI ID=94.1> 

  
filtration. Le précipité et l'adjuvant de filtration sont séparés par filtration sur un. filtre à cadre. Le 

  
gâteau de filtre est dissous dans de l'eau et les fractions insolubles sont séparées par filtration sur un. filtre à cadre. Le filtrat est soumis à un essai de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec 0,25 % de Hy-flo-super-cel à titre d'adjuvant de filtration (dénommé filtration II dans le tableau suivant). Le

  
 <EMI ID=95.1> 

  
d'ultrafiltration. Après diafiltration, le liquide est concentré jusqu'à une teneur en matière sèche de 12,7 %
(dénommée, dans le tableau suivant, teneur en matière sèche du concentré).

  
,Un traitement de base facultatif pour éliminer partiellement l'activité de protéase peut être effectué à cette étape. Dans le cas d'un traitement de base, celui-ci est effectué à un pH de 9,2 pendant une heure, le pH étant ensuite règle à 5,0.

  
Ensuite le liquide est soumis à une filtration d'essai et filtré dans le but d'une réduction de germes et le filtrat est lyophilisé dans un équipement de lyophilisation de Stokes.

  
On a effectué quatre fermentations de la manière indiquée ci-dessous; la souche utilisée pour la fermentation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres paramètres variant, comme indiqué dans le tableau suivant.

  

 <EMI ID=96.1> 


  
.x Après filtration de réduction des germes, le filtrat est, concentré par évaporation en un rapport de 1:2,3. Une faible partie du filtrat concentré a été séchée par pulvérisation et la partie restante a été lyophilisée.

  
Afin de réduire encore plus l'activité de protéase, certaines préparations indiquées ci-dessus sont traitées comme indiqué ci-dessous, en n'utilisant qu'une des trois possibilités A, B, ou C.

  
A. On dissout 100 g de préparation de SPS-ase

  
 <EMI ID=97.1> 

  
règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. On règle ensuite le pH à 4,5 au moyen d'acide acétique glacial et on dialyse en

  
 <EMI ID=98.1> 

  
té de 3 mSi. Ensuite on effectue la congélation et la lyophilisation.

  
B. On dissout une préparation de 500 g de SPS-

  
 <EMI ID=99.1> 

  
de base est effectué pendant une heure. On règle ensuite le pH à 5,0 au moyen d'acide acétique glacial. La substance obtenue est lyophilisée. 

  
C. On dissout 50 g d'une préparation de SPS- ase dans 400 ml d'eau désionisée en agitant à 10 [deg.]C + 2[deg.]C. On règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4 N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. Ensuite on règle - le pH à 5,7 au moyen d'acide acétique glacial. La substance obtenue est lyophilisée.

  

 <EMI ID=100.1> 


  
Les préparations indiquées ci-dessus sont caractérisées par leur activité des enzymes selon la. présente invention dans le..tableau suivant. 

  

 <EMI ID=101.1> 
 

  
Exemple 2 (exemple d'application)

  
Cet exemple décrit la fabrication de p.v.p. à partir de farine de soja dégraissée et décortiquée, "Sojamel 13" (disponible dans le commerce de Aarhus Oliefabrik A/S). La teneur en matière sèche de cette farine était de 94,0 % et la teneur en (N x 6,25) sur base des matières sèches était de 58,7 %. La farine de soja a été traitée avec les préparations de SPS-ase KRF 68 BII
(exemple 1) de la manière suivante :

  
On a mis 85,29 g de la farine de soja en suspen-

  
 <EMI ID=102.1> 

  
d'eau et on a réglé le pH à 4,5 au moyen de 7,5 ml de HC1 6 N. On y a ajouté 50 g d'une solution contenant 4,00 g de ladite préparation de SPS-ase et on a ensuite agité le

  
 <EMI ID=103.1> 

  
a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse de laboratoire 

  
 <EMI ID=104.1> 

  
pesé le surnageant et on l'a analysé suivant la méthode de Kjeldahl afin de déterminer l'azote et les matières sèches. La phase solide a ensuite été lavée avec un volume d'eau équivalent à la masse de surnageant obtenue lors de la première centrifugation. Cette opération a été effectuée deux fois. La phase solide a ensuite été lyophilisée, pesée et analysée suivant la méthode de Kjeldahl pour déterminer l'azote et les matières sèches chez Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark.

  
Ce laboratoire est agrée par l'E.tat pour les analyses d'aliments pour bétail et des produits laitiers. Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 2.1 : 

  
Tableau 2.1 Résultats obtenus 

  

 <EMI ID=105.1> 


  
On a donc obtenu une p.v.p. présentant une pureté de protéine, c'est-à-dire N x 6,25 sur base des matières sèches, de 91,4 % et avec un rendement total- en protéine de 83 %.

  
Exemple 3 (exemple d'application)

  
Cet exemple a été effectué afin de comparer les rendements en protéine, la qualité nutritive et certaines propriétés fonctionnelles de produits à base de protéine de soja préparés suivant les trois techniques suivantes :

  
A: La précipitation isoélectrique classique 

  
pour la préparation d'un isolat de protéine de soja.

  
B: Le lavage isoélectrique classique pour la

  
préparation de concentré de protéine de soja.

  
C: Le lavage isoélectrique suivant l'invention

  
 <EMI ID=106.1> 

  
nence, pour la préparation d'une p.v.p.

  
Afin de créer une comparaison valable du procédé

  
de l'invention (C) avec les procédés classiques de préparation de protéine de soja (A et B), on a utilisé la même substance brute dans les trois cas. De même, les essais ont été effectués de telle manière que les températures correspondantes et les durées de traitement soient les mêmes dans les trois cas. Uniquement les valeurs de pH étaient différentes étant donné les différences fondamentales entre les trois essais.

  
A. La précipitation isoélectrique classique pour la

  
préparation d'un isolat de protéine de soja.

  
On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel
13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'eau

  
 <EMI ID=107.1> 

  
NaOH 4 N. Après une agitation d'1 heure, on a centrifugé la suspension à 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant

  
 <EMI ID=108.1> 

  
à une nouvelle extraction avec de l'eau jusqu'à atteindre Un poids total de 4000 g. On a maintenu la

  
 <EMI ID=109.1> 

  
4 N et on a agité la suspension pendant 1 heure. On a effectué la centrifugation et le pesage du produit de centrifugation II et du précipité II comme décrit ci-dessus. On a retiré des échantillons des produits de centrifugation I et II et du précipité II pour les analysés . suivant Kjeldahl et pour la mesure des matières sèches. Ensuite, les produits de centrifugation I et II ont été agités et maintenus à 50[deg.]C. La protéine a ensuite été précipitée isolélectriquement à pH 4,5 au moyen de 45 g de HC1 6 N.

  
 <EMI ID=110.1> 

  
protéine par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation III a été pesé et analysé pour les déterminations Kjeldahl-N et les mesures de  matière sèche. La phase solide III a été pesée et lavée

  
à l'eau en une quantité correspondant au poids du produit

  
 <EMI ID=111.1> 

  
par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation IV et la phase solide IV ont été pesés. Le produit de centrifugation IV a été analysé pour la détermination de Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. La phase solide a été mise en suspension

  
 <EMI ID=112.1> 

  
moyen de 17 g de NaOH 4 N. Le mélange a été maintenu en agitation pendant 1 heure et on a de nouveau règle le pH à 6,5, si nécessaire. Finalement, le produit a été lyophilisé, pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. Les calculs de bilan massique sont représentés au tableau 3.1.

  
Tableau 3.1 :Calculs du bilan massique de la précipitation

  
isolélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja.

  

 <EMI ID=113.1> 
 

  
B. Lavage isoélectrique pour la préparation d'un concentré

  
de protéine de soja.

  
On a lavé 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13

  
 <EMI ID=114.1> 

  
C. On a réglé le pH à 4,5 au moyen de 44,8 g de HC1 6 N. On a effectué le lavage pendant 4 heures en agitant. La suspension a ensuite été centrifugée à 3000 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6B) utilisant 4 bechers d'1 1. Le produit de centrifuga-

  
 <EMI ID=115.1> 

  
suivant Kjeldahl-N et la mesure des matières sèches. La

  
 <EMI ID=116.1> 

  
l'eau jusqu'à un poids total de 4000 g. Le pH a de nouveau été règle à 4,5 au moyen de 1,7 g de HC1 6N et on a main-

  
 <EMI ID=117.1> 

  
On a effectué une centrifugation et une pesée du produit de centrifugation II et des solides II comme précédemment.

  
La phase solide II a été remise en suspension dans 1575 g

  
 <EMI ID=118.1> 

  
C pendant une heure et on a de nouveau règle le pH à 6,5, si nécessaire. Finalement le produit de protéine a été lyophilisé, pesé et analysé suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. Le bilan massique est '. représenté dans le tableau 3.2. 

  
 <EMI ID=119.1>  . pour la préparation d'un concentré de protéine de soja.

  

 <EMI ID=120.1> 


  
C. Lavage isoélectrique comprenant une enzyme solubilisant

  
la rémanence, pour la préparation d'une p.v.p.

  
On a lavé 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3524,2 g d'eau à

  
 <EMI ID=121.1> 

  
6 N. On a dissous 24 g de la préparation SPS-ase, KRF
68 Bill .(exemple 1) dans 26 g d'eau et on l'a ajoutée au mélange de lavage. On a ensuite effectué le lavage pendant 4 heures sous agitation. On a ensuite effectué la purifi-

  
 <EMI ID=122.1> 

  
de NaOH 4 N et d'eau pour la nouvelle suspension étant les seuls paramètres présentant des valeurs différentes. Le bilan massique est représenté dans le tableau 3.3. 

  
Tableau 3.3.: Calcul du bilan massique du lavage isoélec-

  
trique comportant une enzyme solubilisant la rémanence pour la préparation d'une p.v.p.

  

 <EMI ID=123.1> 


  
1) Analysé par Bioteknisk Institut, Holbersvej 10, DK-6000

  
Kolding, Danemark

  
2) Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169,

  
DK-8000, Aarhus C, Danemark

  
Propriétés nutritives

  
Les compositiors en acides aminés des trois produits de protéine ont été déterminées, voir tableau 3.4. La teneur totale en acides aminés essentiels, la teneur chimique et l'indice d'acides aminés essentiels (EAAI) sont calculés en utilisant le document de référence FAO de 1957.

  
La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a été déterminée au moyen de la méthode décrite dans A.O.C.S. Tentative Method Ba 12-75 (A.O.C.S. est une abréviation pour American Oil Chemists' Society). Les résultats sont représentés dans le tableau 3.5 qui comporte également les rendements et le rapport protéine/matière sèche des trois produits.

  
Tableau 3.4.: Conposition d'acides aminés et évaluation nutritive

  
des trois produits de protéine A, B, et C

  

 <EMI ID=124.1> 


  
 <EMI ID=125.1> 

  
sur le- document de référence FAO de 1957. 

  
Tableau 3.5.: Caractéristiques du processus et teneur en

  
inhibiteur de trypsine des trois produits de protéine A, B et C

  

 <EMI ID=126.1> 


  
Propriétés fonctionnelles

  
 <EMI ID=127.1> 

  
Nitrogen solubility index) a été déterminé respectivement, dans une dispersion de protéine à 1 % à pH 7,0 dans NaCl 0,2M et dans l'eau distillée. Après avoir agité pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnétique, on a centrifugé la suspension à 4000 x g pendant 30 minutes et on a analysé le surnageant pour déterminer l'azote. La solubilité de l'azote a été calculée c omme , le rapport ... % N soluble/ % N total. Les résultats de cette détermination effectuée sur les trois produits sont représentés dans le tableau 3.6.

  
 <EMI ID=128.1> 

  
trois fois sur chaque produit par un titrage de Swift légèrement modifié. 4,0 g de (N x 6,25) du produit ont été

  
 <EMI ID=129.1> 

  
la suspension dans un récipient mélangeur en verre et on y a ajouté 50 ml d'huile de soja. Le mélange total a ensuite été pesé. Le mélange huile-eau a ensuite été homogénéisé à 10.000 tours/minute, le récipient étant disposé dans un bain de glace. On a ajouté une quantité supplémentaire d'huile de soja à une vitesse de 0,3 ml par seconde jusqu'à ce que l'émulsion s'effondre. La quantité totale d'huile ajoutée avant le "point final" a été déterminée par pesage.

  
La capacité d'émulsification est calculée comme le nombre de ml d'huile par gramme de protéine

  
(N x 6,25). La densité de l'huile a été supposée égale à Or 9 g/ml.

  
Les résultats moyens de la détermination de la capacité d'émulsification des trois produits sont représentés au tableau 3.6.

  
 <EMI ID=130.1> 

  
250 ml d'une dispersion aqueuse des échantillons de protéine à la vitesse III pendant 4 minutes dans un agitateur Hobart (modèle N-50) comportant un fouet en forme de fil. L'expansion au fouettement a été calculée selon la formule

  
Expansion au fouettement = V-250 x 100 %

  
250

  
dans laquelle V représente le volume de fouettement final en ml.

  
 <EMI ID=131.1> 

  
cipient mélangeur avec de l'eau. On a doublé les essais de chacun des trois échantillons. Les résultats moyens sont représentés au tableau 3.6.

  
La_stabilité_de_la mousse est déterminée en tant que rapport entre la quantité de mousse abandonnée après égouttage pendant 30 minutes et la quantité de mousse à l'origine. Un gramme de mousse produite parle procédé précédent a été introduit dans un cylindre en plastique
(diamètre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet à mailles de 1 mm x lmm. Le cylindre a été disposé au-dessus d'un entonnoir monté sur un cylindre en verre et le poids (B) du liquide égoutté dans le cylindre en verre est mesuré. La stabilité de la mousse FS (foam stability) est déterminée par l'équation 

  

 <EMI ID=132.1> 


  
Les résultats de la mesure sont représentés au tableau 3.6.

  
 <EMI ID=133.1> 

  
description en tant que la viscosité de Brookfield mesurée au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield .  Helipath. Les gels sont produits par traitement thermique de suspensions de protéine à 12 % dans du NaCl 0,5 M. Le traitement thermique a été effectué dans des bidons fermés ayant un diamètre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm, plongés dans un bain d'eau, pendant 30 minutes, maintenus à
80 et 100[deg.]C. Les bidons ont été refroidis et thermostati-

  
 <EMI ID=134.1> 

  
mesures. Les résultats de ces mesures sont représentés dans le tableau 3.6.

  
Tableau 3.6.: Propriété fonctionnelles des trois substances

  
de protéine A, B, et C
 <EMI ID=135.1> 
 Exemple 4 (exemple d'application) 

  
On a produit une p.v.p. suivant.le processus décrit à l'exemple 3 C sauf que l'activité de cellulase était partiellement dérivée du Trichoderma reseei. La préparation de cette cellulase commerciale CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a été traitée au moyen d'une base à faible température de lamanière suivante. Le pH d'une solution à 10 % de CELLUCLAST dans l'eau a été réglé à 9,2 au moyen de NaOH, et la solution résultante a été

  
 <EMI ID=136.1> 

  
pendant la nuit et ensuite été filtrée de manière stérile. Le produit de filtration a été lyophilisé. On a ajouté 4g du produit lyophilisé à la préparation ae SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1). Les deux enzymes ont été dissoutes dans 172 g d'eau avant d'être ajoutées au mélange de lavage. Les déterminations du bilan massique de cet :  exemple sont.représentées dans le tableau 4.1.

  
L'essai prouve que cette préparation particulière de SPS-ase contient déjà une ceLlulase efficace étant donné qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport protéine/matière sèche. Cependant, d'autres préparations de SPS-ase peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le tableau précédant immédiatement l'exemple 2. 

  
Tableau 4.1: Calculs du bilan massique du lavage isoélectrique comportant une préparation de SPS-ase

  
 <EMI ID=137.1> 

  

 <EMI ID=138.1> 


  
Exemple 5 (exemple d'application)

  
On a produit une p.v.p. suivant le procédé décrit dans l'exemple 3 C sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur de 5 et que le mélange réactionnel est  <EMI ID=139.1> 

  
des résultats analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient un rendement théorique en protéine précipitée, comme montré dans le tableau 5.1. Tableau 5.1.: Rendements théoriques en protéine obtenus

  
lors de la prpduction d'une p.v.p.

  

 <EMI ID=140.1> 


  
aMoyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et 86,9 (Qvist's Laboratorium) ; la teneur en matière sèche est respectivement 97,6 et 98,0 %.

  
Calculé en tant que masse totale de protéine - la perte en protéine dans les produits de centrifuqations.

  
Exemple 6 : (exemple d'application)

  
Démonstration de la liaison protéique du SPS.

  
 <EMI ID=141.1> 

  
On a dissous 40 g de (Nx6,25) d'un isolat d'une protéine de soja commerciale (Purina 500E de Ralston Purina) dans 680 g d'eau. On a chauffé le mélange dans un bain d'eau à 50 [deg.]C et on a réglé le pH à 4,50 au moyen de

  
 <EMI ID=142.1> 

  
solution aqueuse contenant respectivement 0 g, 0,2 g, 0,4g 0,8 g et 1,6 g du SPS préparé comme décrit précédemment dans ce mémoire. Les flacons ont ensuite été maintenus sous agitation au moyen d'un aimant dans un bain

  
 <EMI ID=143.1>  pendant 15 minutes et les produits de centrifugation I ont été analyses suivant Kjeldahl-N et pour la détermination des matières sèches. Les phases solides ont été lavées à l'eau à température ambiante et centrifugées une nouvelle fois. Cette étape a été répétée. Ensuite on a dispersé les solides dans 50 ml d'eau et on a règle le pH à 6,50 par une addition goutte à goutte de NaOH 6 N. Les produits neutralisés ont été lyophilisés et analysés suivant Kjeldahl-N et pour déterminer les matières sëches(MS). En se basant sur les analyses représentées au tableau 6.1, on a calculé le pourcentage de protéine récupérée et le pourcentage de SPS qui a été lié à la protéine au moyen des formules représentées en relation au tableau 6.2.

  
Cet exemple démontre que le SPS est lié intimement à la protéine de telle sorte que le rapport protéine/ matière sèche diminue pour une teneur croissante en SPS.

  
Le rapport protéine/SPS présent dans la farine de soja correspond à une teneur en SPS comparable à environ 0,4 g dans 10 g d'eau, ajouté à 5 g d'isolat de protéine.

  
Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculée. Le pourcentage de liaison du SPS diminue à cause de la saturation de la protéine en SPS aux faibles rapports protéines/SPS.'.

  
rableau 6.1.: Mesures suivant l'exemple 6
 <EMI ID=144.1> 
 Tableau 6.2.: Récupération de protéine et pourcentage de

  
liaison du SPS

  

 <EMI ID=145.1> 


  
Pourcentage de récupération de protéine =

  

 <EMI ID=146.1> 


  
NC 1 = pourcentage d'azote dans le produit de centrifugation I.

  
<2>) pourcentage de liaison du SPS =

  

 <EMI ID=147.1> 


  
où,. (%, P/H) est le rapport protéine/matière sèche dans le précipité séché, et

  
(% P/H)&#65533; se rapporte au précipité sans addition de SPS. Exemple 7 (exemple d'application)

  
Cet exemple décrit la préparation d'une p.v.p. en utilisant la préparation de SPS-ase KRF 92 B-I comportant 5 % de matière sèche. Le procédé de préparation est le même que celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur 5. La p.v.p. a été analysée comme décrit à l'exemple 2. Les résultats obtenus dans l'essai apparaissent dans le tableau 7.1. 

  
Tableau 7.1.: Résultats obtenus à l'exemple 7

  

 <EMI ID=148.1> 


  
 <EMI ID=149.1> 

  
Kolding.

  
Analyse par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C.

  
Exemple 8 (exemple d'application) :

  
Cet exemple montre l'effet d'un pré-traitement de la farine de soja par une cuisson au jet de vapeur avant la préparation de la p.v.p.

  
 <EMI ID=150.1> 

  
Une suspension de farine de soja dans l'eau consistant en 10 kg de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) par 100 kg a été pompée à travers un êjecteur de vapeur (type Hydroheater B-300) et mélangée avec de la vapeur à 8 Bar en une telle quantité et à une telle vitesse qu'on a pu maintenir une température finale

  
 <EMI ID=151.1> 

  
pressurisé. Ensuite la pression a été réduite dans une chambre de détente (un cyclone) d'où la suspension a été envoyée dans un échangeur de chaleur à plaque dans lequel elle a été refroidie à environ 50[deg.]C. La boue refroidie a pu être utilisée telle quelle pour la préparation de p.v.p. suivant l'invention, mais, dans ce cas, la suspension a été sèchée par pulvérisation à une température d'entrée

  
 <EMI ID=152.1> 

  
Préparation de la p.v.p.

  
Cette préparation a été effectuée de la manière suivante :

  
On a mis 70 g de matière sèche de farine de soja cuite au jet de vapeur et sèchée en suspension et on a

  
 <EMI ID=153.1> 

  
règle le pH à 4,50 au moyen de 6,5 ml d'HCl 6N. On a transféré 6 x 90 g de cette suspension dans 6 Erlenmeyexs de

  
 <EMI ID=154.1> 

  
d'eau au moyen d'agitateurs magnétiques. A chaque flacon d' Erlenmeyer on a ajouté 10 g d'une solution contenant respectivement 0 g, 0,025 g, 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g et

  
0,40 g de la préparation de SPS-ase KRF-68-B-III. Les mélanges réactionnels sont ensuite agités pendant 240 minutes

  
 <EMI ID=155.1> 

  
15 minutes à 3000 x g.

  
Le surnageant a ensuite été analysé suivant la méthode de Kjeldahl-N et la phase solide a été lavée à l'eau à volumes égaux et a été centrifugée. cette opération

  
a été effectuée deux fois. La phase solide a ensuite été lyophilisée et analysée pour la détermination de Kjeldahl-N et des matières sèches.

  
Un essai semblable a été effectué avec une farine de soja non traitée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) utilisée en tant que substance de départ. Dans ce cas, les rapports de l'enzyme au substrat étaient de 0 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % et 8 %.

  
En se basant sur la teneur en protéine des surnageants, on a pu calculer le pourcentage de protéine récupérée . Le rendement en protéine est basé sur l'hypothèse: que la substance d'enzyme est solubilisée à 100 % après la réaction. Le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus par les deux essais.

  
Tableau 8.1.: Rendements en protéine et rapport protéine/

  
matière sèche pour une p.v.p. préparée à partir de farina de soja cuite ou brute.

  

 <EMI ID=156.1> 

Exemple 9

  
Isolement de protéine à partir du gluten de mais.

  
Le gluten de mais est habituellement produit en tant que produit secondaire dans le processus de fabrication d'amidon de mais. Ce gluten de maïs brut n'est pas efficacement séparé de la fraction fibreuse et c'est là

  
une des raisons pour lesquelles il ne présente aucune propriété fonctionnelle intéressante.De même, différents polysaccharides dégradables accompagnent le gluten de mais brut.

  
 <EMI ID=157.1> 

  
avec une préparation de SPS-ase produite suivant l'exemple 1, sauf qu'une ultrafiltration a été effectuée au lieu de

  
 <EMI ID=158.1> 

  
isolée a été soumise à un traitement de base suivant le procédé A (pour des raisons de brièveté cette préparation de SPS-ase soumise à un traitement de base est dénommée dans la suite PPS 1305). La PPS 1305 ne contient pratiquement pas d'activité protéolytique.

  
 <EMI ID=159.1> 

  
utilisées :

  

 <EMI ID=160.1> 


  
La substance de protéine a été purifiée par centrifugation, lavée deux fois et finalement lyophilisée.

  
Les résultats sont repris dans le tableau 9. Tableau 9.

  

 <EMI ID=161.1> 


  
Exemple 10 : Isolement de protéine à partir de farine de

  
coton brut, de farine de tournesol ou de farine de colza

  
Les protéines provenant de farine de graines de coton, de farine de tournesol ou de farine de colza peuvent être séparées de la même manière que les protéines provenant d'une farine de soja ou de gluten de mais. L'isolement de protéines provenant de différentes autres substances brutes végétales renfermant des protéines peut être effectué de la même manière. Naturellement, l'isolement et/ou la séparation doivent être effectués de préférence au point isolélectrique de la partie principale de la part de protéine de la substance de départ, le rendement en

  
protéine étant de cette façon maximal.

  
Afin d'être plus clair, on donne ci-dessous un aperçu des figures auxquelles on a déjà fait référence.

  

 <EMI ID=162.1> 
 

  

 <EMI ID=163.1> 
 

  
 <EMI ID=164.1> 
1. Agent pour la décomposition de la rémanence végétale, notamment de la rémanence de soja, en présence d'une protéine végétale, en particulier de la protéine de soja, et convenant pour la préparation d'une p.v.p.

  
 <EMI ID=165.1> 

  
partir d'une protéine végétale qui peut être dégraissée ou partiellement dégraissée, agent contenant une enzyme à activité de 'solubilisation de la rémanence, caractérisé*  en ce qu'il contient une enzyme capable de décomposer le SPS de soja (SPS-ase) et en ce qu'il est essentiellement exempt d'activité protéolytique.



  Agent for decomposition of plant remanence, process

  
  <EMI ID = 1.1>

  
purified vegetable protein obtained.

  
The present invention relates to an improved agent for the decomposition of vegetable persistence, particularly soy persistence; it also relates to a process for the preparation of a purified vegetable protein as well as the purified vegetable protein.

  
A process for the preparation of a purified vegetable protein (pvp) by enzymatic elimination of remanence, without dissolution and reprecipitation of the protein, is described in Belgian patent n [deg.] 882,769.

  
This patent also describes the importance of the fact that the proteolytic activity must be kept as low as possible. The purity of the pvp which can be obtained by the known process is not satisfactory and therefore needs to be improved. In the examples, a purity of the pvp of about 85% was shown. Even if he

  
is possible to obtain a pvp having a purity of approximately 90% according to the known method, this is only possible by using certain pretreated starting substances, for example a soy protein concentrate. It would be desirable to obtain a purity of

  
pvp greater than 90% using a much wider range of starting materials, particularly husked and defatted soy flour.

  
The present invention is based on the surprising discovery that a certain part of the product of the decomposition of remanence as it appears during the enzymatic treatment indicated above, namely a carbohydrate of high molecular weight soluble in the water fixes itself on part of the protein as will be explained in more detail below. This results, of course, in a poorer purity of the protein.

  
Therefore, an object of the invention is to provide an agent for the decomposition of vegetable persistence, in the presence of a vegetable protein, the vegetable persistence being particularly soy persistence, so as to obtain an improved purity of pvp ; another object is a process for preparing a pvp.

  
The principle of the invention can be described in the following manner with reference to FIG. 1 which indicates only substances existing as nondissolved solids while all the supernatants are omitted. A load of soy flour was divided into two equal parts, Part I and Part II (column a in Figure 1). Part I has been broken down proteolytically to a

  
  <EMI ID = 2.1>

  
tick produced using B. licheniformis and sold by NOVO INDUSTRI A / S, 2880 Bagsvaerd, Denmark) and was then washed to a pH of about 8 to remove the total amount of protein and the remanence was separated of the supernatant and was washed (see part I, column a and b, Figure 1). In this way, a pure remanence (designated by remanence I) was isolated (column b in FIG. 1).

  
  <EMI ID = 3.1>

  
more brevity, the remanence of part II is called remanence II (column b in figure 1). Then the

  
  <EMI ID = 4.1>

  
  <EMI ID = 5.1>

  
pectolytic produced by Schweizerische Ferment A / G, Baie, Switzerland) (see columns b and c in Figure 1). It was unexpectedly discovered that the undissolved part of

  
  <EMI ID = 6.1>

  
dissolved from afterglow II, based on the nitrogen balance and the mass of dry matter (see Figure 1 in which the hatched areas of column c correspond to the insoluble substances different from the proteins in the step indicated above). In addition, if the

  
  <EMI ID = 7.1>

  
; added to the soy protein suspension at pH 4.5, a polysaccharide of the supernatant is linked to the protein of

  
  <EMI ID = 8.1>

  
which is a part of the decomposition product of afterglow and which is clearly soluble in water in the absence of soy protein but is linked to soy protein at or around the isoelectric point of soy protein this is present, is designated by SPS (soluble polysaccharide), see FIG. 1. The SPS has a molecular weight distribution of between 5 × 10 6 and 4.9 × 10 4. The preparation of isolated SPS appears in the block diagram represented in the Figure 2 which also covers some of the processes <EMI ID = 9.1>

  
find an agent that is capable of breaking down SPS in such a way that the breakdown products of SPS do not bind or bind soy protein to a much lesser extent than SPS binds soy protein.

  
Although the description mainly relates to the decomposition of a soy protein, the invention is not limited to such a protein but relates to all

  
vegetable protein species, in particular for example the proteins cited in Belgian patent n [deg.] 882.769, page
1.

  
In accordance with the present invention, it has now been found that by examining the ability to decompose soybean SPS, it is possible to select microorganisms which are capable of producing a compound which exhibits enzymatic activity, which decomposes actually the SPS

  
soybean, compound designated below, for brevity, SPS-ase.

  
Therefore, it can be said that SPS-ase is

  
  <EMI ID = 10.1>

  
soybeans under suitable conditions into decomposition products which bind themselves to vegetable protein, in aqueous medium, to a lesser extent

  
that the soybean SPS before decomposition would not have fixed itself to the same vegetable protein under corresponding conditions.

  
According to a first aspect, the present invention therefore aims to provide an agent for the decomposition of vegetable persistence, in particular soy persistence, in the presence of a vegetable protein, particularly soy protein, this agent being well suited for the preparation of a pvp having a purity of the protein of approximately 90% from a defatted or partially defatted vegetable protein, serving as starting materials and containing an enzyme with activity of solubilization of remanence, characterized, in that the agent contains an enzyme capable of breaking down soybean SPS (SPS-ase) and in that it is essentially

  
free of proteolytic activity. The agent is essentially free of proteolytic activity when this is equal to or less than the proteolytic activity which would cause a total protein loss in the pvp obtained not more than 30%, preferably not more than

  
  <EMI ID = 11.1>

  
about 65% of the remanence was solubilized on the basis of the nitrogen balance and the mass of dry matter.

  
It has been found that SPS-ase, capable of decomposing soybean SPS, makes it possible to decompose in a more complete manner than do commercial pectinaaes and cellulases, polysaccharides similar to SPS of vegetable origin or coming from fruits.

  
The purity of the final vegetable protein necessarily improved by a total or partial elimination of the SPS of the final vegetable protein compared to the purity of the final vegetable protein obtained according to the method of Belgian patent n [deg.] 882,769 in the. extent that this known plant protein was contaminated with SPS.

  
It is not known at present whether the SPS-ase described below develops its enzymatic activity from a single enzyme or from an enzyme complex comprising at least two enzymes. Some research suggests that at least two enzymes are responsible for the decomposing effect of SPS-ase, one of which is capable of only slightly decomposing SPS, after which one or more enzymes are capable to carry out a larger decomposition of the SPS. Such a hypothesis or similar hypotheses should not however limit the scope of the invention.

  
According to a particularly preferred embodiment of the agent, the SPS-ase is produced by means of a microorganism belonging to the genus Aspergillus.

  
According to another particularly preferred embodiment of the agent, the active compound is derived from the enzymes obtainable by means of Asp. aculeatus CBS 101.43. The same SPS-ase can be obtained by Asp. japonicus IFO 4408. It was found that Asp. aculeatus CBS
101.43 also produces very powerful enzymes solubilizing remanence, cellulases, pectinases and hemicellulases. In addition, it has been found that any strain belonging to the species Asp. aculeatus or to

  
  <EMI ID = 12.1>

  
SPS-ase necessary for the purpose of the invention. Thus, as it appears in a subsequent paragraph * of the

  
  <EMI ID = 13.1> ATCC 20236 does not produce enough SPS-ase to be detected by the enzymatic determination of SPSase described in this specification.

  
According to another particularly preferred embodiment of the agent, the SPS-ase is identical to the point

  
  <EMI ID = 14.1>

  
of Asp.aculeatus CBS 101.43 and identifiable by means of the electrophoretic covering technique, cf. parts 6 and 7.

  
According to another preferred embodiment of the agent according to the present invention, the ratio of the proteolytic activity in HUT units and the solubilizing activity of the persistence in SRUM-120 units is less than about 2: 1, preferably less than 1: 1 and

  
  <EMI ID = 15.1>

  
that there is a clear relationship between the activity of the

  
  <EMI ID = 16.1>

  
pH 3.2 (pH of optimal protease activity) and protein loss. This relationship is specific for the preparation of SPS-ase obtained by means of Asp. aculeatus CBS 101.43. Note that this relationship cannot

  
  <EMI ID = 17.1>

  
an SPS-ase which differs from the SPS-ase obtained by means of CBS 101.43, but which a person skilled in the art can find a similar relation which fulfills the requirements as regards the loss of protein defined in the main claim. The SRUM-120 activity (to be defined later) is a measure of the classic activities of remanence solubilization, cellulase, pectinase and hemicellulase and other activities. SRUM-120 units are measured at pH 4.5. It should be noted that this pH was chosen, since the decomposition of the afterglow takes place at the isoelectric value of the pH of the soy protein or around it and it is necessary to use another method for measuring the enzymatic activity in the case where the decomposition of the remanence is carried out at another pH.

  
According to another preferred embodiment of the agent according to the present invention, the agent comprises a cellulase activity and this is partially or totally derived from Trachoderma reseei. This cellulase dissolves the crystalline cellulose and this agent produces a pvp having a high purity.

  
According to another particularly preferred embodiment of the agent according to the present invention,

  
  <EMI ID = 18.1>

  
se (Lived).

  
In Agr. Biol. Chem. 40 (1), 87 - 92, 1976, on

  
  <EMI ID = 19.1>

  
an enzyme complex that is capable of partially degrading an acidic polysaccharide in soy sauce, called APS, a fraction of which is designated by APS-I. This acidic polysaccharide is not identical to

  
  <EMI ID = 20.1>

  
this descriptive brief in part 3. Thus, the chroma

  
HPLC gel filtration topsrams of SPS and APS are markedly different and, in addition, the gel filtration chromatograms of APS decomposed by pectinase. Commercial Pectolyase and SPS treated with Commercial Pectolyase Pectolyase are significantly different. Furthermore, it does not appear in this article that the acidic polysaccharide is linked to the soy protein and that the decomposed acid polysaccharide is not linked to the soy protein.

  
or is bound to it to a degree significantly lower than that of an undecomposed acidic polysaccharide. It has also been proven that this strain does not form SPS-ase in an amount sufficient for detection by means of an enzymatic determination of the SPS-ase described in this specification. This

  
  <EMI ID = 21.1>

  
as a producer of SPS-ase 1 however, according to the invention, it was unexpectedly found that

  
  <EMI ID = 22.1>

  
from SPS-ase.

  
According to a second aspect, the present invention aims to provide a process for the preparation of a purified vegetable protein by eliminating the persistence of a crude vegetable protein serving as starting material, characterized in that the starting substance is treated with l agent according to the invention in an aqueous medium,

  
  <EMI ID = 23.1>

  
isoelectric point of the main part of the protein fraction of the starting material, at a temperature

  
  <EMI ID = 24.1>

  
that at least approximately 60% of the remanence / on the basis of the nitrogen balance and the mass of dry matter, preferably at least approximately 70% thereof, more particularly at least approximately 80% thereof, have been dissolved and in that the solid phase containing the purified vegetable protein is separated from the supernatant.

  
According to a particularly preferred mode of the process of the present invention, the separation is carried out at a temperature between room temperature and the freezing point of the supernatant. A high protein yield is thus obtained.

  
According to another particularly preferred embodiment of the process of the invention, the starting substance is a defatted vegetable protein or a defatted and also partially purified vegetable protein. This starting material is easy to obtain.

  
According to another particularly preferred embodiment of the process of the invention, the starting substance is soy flour. This starting material is inexpensive and easy to obtain.

  
According to another particularly preferred embodiment of the process of the invention, the starting substance is a heat-treated soy flour, preferably a soy flour cooked with a jet. In this case, a lower dosage of the enzyme can be used and, in addition, a higher yield can be obtained.

  
According to another particularly preferred embodiment of the process of the invention, the starting substance can pass through a sieve having a mesh opening of approximately 2.5 mm. This ensures a reasonably short reaction time.

  
Only the dosage ratio (in SAE units) for the activity of SPS-ase in the treatment of soybean meal can be provided; at least about 35 SAE units per
100 grams of soybean flour, and 350 SAE units per 100 grams of uncooked soybean flour. In practice, the exact relationship of the enzymatic activities necessary to break down SPS is not known and that is why we cannot provide minimum dosages and proportions for pectinase, cellulase and

  
  <EMI ID = 25.1>

  
the processing of 1, -. soy flour in SRUM units can be supplied, it know at least about 60 SRUM units-
120 per 100 grams for cooked soy flour, approximately
600 SRUM-L20 units per 100 grams - for unheated flour. The values given as examples below seem to be greater than the minimum dosage. Stop-measure tests can be used to establish the optimum operating reaction times and proportions for converting the soybean substrate to pvp.

  
According to a third aspect, the present invention aims to provide a purified vegetable protein produced by the method according to the present invention.

  
In order to better explain the nature of the present invention, reference will be made to the description which follows and which is divided into different parts numbered from 1 to 10 each describing the specific details relating to the present invention. The different parts are as follows:

  
1. Preparation of the SES.

  
2. Characterization of the SPS, in particular

  
molecular weight distribution of it.

  
3. Tests proving the difference between SPS and APS.

  
4. Selection of microorganisms producing

  
SPS-ase.

  
5. Characterization of certain microorganisms

  
forming SPS-ase.

  
6. General description of the technique

  
recovery associated with immunoelectrophoresis.

  
  <EMI ID = 26.1>

  
SPS-ase with a polyspecific antibody and recovery.

  
8. Purification of an SPS-ase preparation.

  
9. Activity dependence on pH and

  
temperature and stability of an SPS-ase.

  
10 Determination of the enzymatic activity.

  
PART 1.

PREPARATION OF SPS.

  
As already mentioned previously, the starting substance for the preparation of the SPS may be soy persistence. This is why, we will first describe the preparation of a soy persistence.

  
Soybean persistence is a protein-free carbohydrate fraction (which in practice may contain small amounts of lignin and minerals), contained in defatted and shelled soybean flour, said carbohydrate fraction being insoluble. in an aqueous medium at pH 4.5 and which can be prepared in the following manner, with reference to the synoptic table n [deg.] 1.

  
Degreased soy flour (Sojamel 13 from Aarhus Oliefabrik A / S) is suspended in water

  
  <EMI ID = 27.1>

  
1: 5 water soybeans in a tank containing pH and temperature stabilization equipment. We settle

  
  <EMI ID = 28.1>

  
hydrolysis at stationary pH using 0.6 L ALCALASE (a proteolytic enzyme based on B. licheniformis having an activity of 0.6 Anson units per gram, the activity being determined according to the Anson method, as described in NOVO ENZYME INFORMATION IB No. 058 e-GB). The enzyme / substrate ratio corresponds to 4% of the amount of protein in soy flour (II). After hydrolysis for one hour, the sludge is separated by centrifugation (III) and washed (IV), this operation being carried out twice (V, VI, VII). The sludge thus treated is then hydrolyzed once more for one hour using 0.6 L ALCALASE (VIII, IX), in a similar manner to what has been said above. Then the mud separated by centrifugation (X) is washed twice (XI, XII, XIII, XIV), the finally washed mud (6) being spray dried (XV).

   The powder thus produced, spray dried is the persistence of soybeans serving as raw material for the production of SPS.

  
SPS is the water-soluble fraction of polysaccharide which is obtained by conventional treatment of the above-mentioned soy persistence with pectinase. The SPS is prepared in the following manner by means of the 14 reaction stages indicated below, with reference to the synoptic table n [deg.] 2.

  
1. The dry matter content of the remanence is determined

  
mentioned above and the soybean persistence is diluted in water at a rate of 2% of dry matter and said soybean persistence is kept in suspension at 50 [deg.] C in a tank comprising a temperature control.

  
  <EMI ID = 29.1>

  
Pectinex Super concentrated L (commercial pectinase from the Schweizerische Ferment AG, Basel, Switzerland) with a pectinase activity of 750,000 MOU, determined according to the leaflet "Determination of the Pectinase units of Apple Juice (MOU)" of 12.6.1981, available at Schweizerische Ferment AG, Bay, Switzerland and Celluclast 200L (commercial cellulase described in the NOVO enzymes leaflet, information sheet B-153 e-GB 1000 July 1981, is also added in an amount of 20 g / kg of dry matter) at NOVO INDUSTRIE A / S,

  
  <EMI ID = 30.1>

  
hours shaking.

  
5. Enzymes are inactivated by increasing the pH to 9.0

  
using 4N NaOH. The reaction mixture is kept as it is for 30 minutes and the pH is then adjusted to 4.5 using 6N HCl.

  
  <EMI ID = 31.1>

  
centrifuge product as well as mud.

  
7. The centrifuge product from step 6 undergoes a

  
control filtration on a filter press (the filter is washed with water before the control filtration).

  
  <EMI ID = 32.1> to a diafiltration and then again to an ultrafiltration on a membrane having a cut-off value of 30,000. (DDS GR 60-P from De Danske Sukkerfabrikker), using the following parameters:

  
1. Ultrafiltration corresponding to a concentration of

  
volume of 6.

  
2. Diafiltration until the percentage in

  
  <EMI ID = 33.1>

  
3. Ultrafiltration up to around 15% dry matter

  
in the concentrate.

  
  <EMI ID = 34.1>

  
average pressure of 3 bars.

  
9. The concentrate subjected to ultrafiltration is cooled

  
  <EMI ID = 35.1>

  
10. The precipitate is recovered using a centrifuge.

  
11 .. The precipitate is washed twice with ethanol in

  
water at 50% v / v, corresponding to the volume of the centrifugation product from step 10, that is to say that two centrifugations are carried out.

  
12.The washed precipitate is redissolved in water in one

  
volume which corresponds to the volume of concentrate from step 9 subjected to ultrafiltration.

  
13.The liquid from step 12 is subjected to a filtration of

  
control on a glass filter.

  
14.The clear filtrate containing pure SPS is lyophilized.

  

  <EMI ID = 36.1>
 

  
SYNOPTIC TABLE N [deg.] 2
  <EMI ID = 37.1>
 PART 2

CHARACTERIZATION OF THE SPS, IN PARTICULAR DISTRIBUTION OF MOLECULAR WEIGHT THEREOF.

  
We have determined (fig. 4), the molecular weight distribution of the SPS, the production of which is carried out as indicated in this specification, by means of gel chromatography in HPLC equipment (Waters pump, model 6000, data module 730 of Waters and refractometer R 401 of Waters). The molecular weight distribution of the SPS decomposition products by SPS-ase was also determined (Fig. 5) according to the same process. In addition, the same method was shown, the binding effect between soy protein and SPS (Fig. 6) and the absence of the binding effect between soy protein and SPS broken down by agent according to the invention (fig. 7),

  
The calibration curve (the logarithm of the molecular weight as a function of Rf, where the Rf value for glucose is arbitrarily defined as 1 and where the R f value of a specific dextran is defined as the retention time of this dextran divided by glucose retention time) was established using multiple dextrans

  
  <EMI ID = 38.1>

  
Box 175, S-75104, Uppsala, Sweden. We found the Rf value for the maximum of each dextran peak and the weight

  
  <EMI ID = 39.1>

  
cular. 0.1 M NaNO3 was used as the eluent for this chromatographic process. The columns used in this chromatographic process are the PW 5000 column from
60 cm followed by a 60 cm PW 3000 column sold by Toyo Soda Manufacturinq Co., Japan. We established the relation

  
  <EMI ID = 40.1>

  
dextrans indicated above in this manner, cf. fig. 3.

  
From fig. 4, we can calculate that the SPS has a molecular weight distribution which is <EMI ID = 41.1>

  
an M value of approximately 4.2 x 10. It also appears in this figure that the chromatogram has two distinct peaks 1 a retention time of 34.5 minutes (6%) corresponding to a molecular weight of approximately 5 × 10 6 and a retention time of 47.12 minutes ( 67%) correspon-

  
  <EMI ID = 42.1>

  
It also appears from this curve that there is a shoulder between these two peaks at a retention time of 41.25 minutes (27%) corresponding to a molecular weight of 2.8 x 105.

  
-After the decomposition of the SPS by the SPS-ase, the hydrolysis mixture was filtered through a membrane and the filtrate was subjected to chromatography. We found that about
55% of the SPS is broken down into monosaccharide, disaccharide and trisaccharide and the residue of 45% has been broken down into a polymer having three peaks corresponding to the weight <EMI ID = 43.1>

  
5.

  
In order to demonstrate the binding effect between soy protein and SPS and the substantial reduction in the binding effect between soy protein and SPS decomposed using SPS-ase, the tests were carried out following.

  
3% SPS in a 0.10 M acetate buffer at pH 4.5 is added to a slurry of a soy isolate (Purina E 500) in order to generate a suspension having the isolate / SPS ratio corresponding to 10: 1. We incubate this suspension

  
  <EMI ID = 44.1>

  
incubation, the suspension is centrifuged and the clear supernatant is analyzed by HPLC as described above. By comparing fig. 6 in fig. 4, it appears that the SPS is completely adsorbed on the soy isolate.

  
The same process as that mentioned in the previous paragraph is implemented with a 3% solution of SPS hydrolyzed with an SPS-ase produced by CBS LOI.43 (fig. 7). By comparing fig. 7 and fig. 5, it can be seen that no hydrolyzed SPS compound having a molecular weight of less than 10 4 is adsorbed on the soy isolate. Hydrolysis reduces quantitative binding by up to about 10 to 15% compared to the binding of SPS to soy protein.

  
An NMR analysis of the SPS, the production of which is carried out as indicated in this memo, reveals the following approximate composition of the SPS:

  
1) α-galacturonic acid in an amount of approximately 45%,

  
approximately 40% of the total amount of α-galacturonic acid being present as a methyl ester.

  
2) rhamnopyranose in an amount of about 20%,

  
3) galactopyranose in an amount of about 15%, and

  
4) P-xylopyranose in an amount of about 20%.

  
The constituents seem to be present in a structure comprising a main rhamnogalacturonic chain and side chains of xylose and galactose.

  
Complete acid hydrolysis of SPS (8 hours in

  
  <EMI ID = 45.1>

  
also small amounts of fucose and arabinose monosaccharides in the hydrolyzed SPS.

  
An HPLC analysis of the SPS decomposed by the SPS-ase enzyme complex formed by CBS 101.43 shows a significant reduction in molecular weight. Similarly, the NMR spectrum of the SPS decomposed as indicated above shows that a major part of the ester groups has disappeared and that, also, the content of xylose and galactose in the higher molecular weight substance has decreased. The NMR spectrum of the part of the SPS decomposition product which precipitates by addition of one volume of ethanol to one volume of SPS decomposition product is similar to the NMR spectrum of SPS which has undergone the abovementioned modifications concerning the ester groups. and the xylose and galactose content.

  
PART 3

TESTS PROVIDING THE DIFFERENCE BETWEEN SPS AND APS

  
The APS was prepared as mentioned in Agr.

  
Biol. Chem., Vol. 36, No. 4, p. 544 - 550 (1972).

  
This polysaccharide and the SPS were then hydrolyzed with different enzymes, then the decomposition mixture was subjected to gel chromatography. HPLC equipment, as mentioned in the second part, "Characterization of the SPS, in particular the molecular weight distribution thereof".

  
More specifically, the hydrolysis was carried out by treatment of a 25 ml solution of 2% APS or 2% SPS in 0.1 M acetate buffer having a pH of 4.5 per 10 mg of KRF 68 or 30 mg of Pectolyase KRF 68 is a preparation of SPS-ase whose manufacture is

  
  <EMI ID = 46.1>

  
following table: -

  

  <EMI ID = 47.1>


  
PART 4.

SELECTION OF SPS-ASE-PRODUCING MICROORGANISMS.

  
The microorganism to be tested is subjected to an incubation on an inclined agar substrate having a composition which allows the growth of the microorganism. After initial growth on the inclined agar substrate, the microorganism is transferred to a liquid main substrate in which the main carbon source is SPS (prepared as shown), in which the <EMI ID = 48.1>

  
free, proteins or other nitrogen-containing compounds, the substrate further containing a mixture of the necessary salts and vitamins, preferably in the form of a yeast extract. The composition of the main substrate depends on the kind of microorganism, the main consideration being that the substrate is able to support the growth and metabolism of the microorganism. When the growth has taken place for an adequate period of time, of the order of 1 to 7 days, depending on the growth rate of the microorganism in question, a sample of the fermentation broth is analyzed to determine the SPS-ase according to the enzymatic determination of SPS-ase described in this thesis.

  
In order to have a more sensitive technique for determining the enzymatic activity, one can lower the temperature to 40 [deg.] C and increase the incubation time to 20 hours during the determination of the activity of SPS-as &#65533; while also adding antibiotics to the substrate to prevent infection.

  
By this technique, other SPS-ase producing microorganisms may be found which may belong to the genus Aspergillus and other genera.

  
? PART 5.

: ARACTERIZATION OF CERTAIN MICROORGANISMS FORMING LASPS-ASE.

  
By the selection technique for microorganisms producing SPS-ase indicated in this specification, it has been found that the microorganisms cited in the upper part of the following table are producers of SPS-ase. The table also contains a strain belonging to the Asp species. japonicus which is not an SPS-ase reducer.

  

  <EMI ID = 49.1>


  
A short identification of the strains indicated above can be found in the following culture catalogs:

  
List of Cultures 1978, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Netherlands.

  
  <EMI ID = 50.1>

  
The American Type Culture Collection Catalog of Strains I, 14th edition 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America.

  
All the strains in the table indicated above correspond closely to the taxonomic description of the Asp species. japonicus and Asp. aculëatus described in "The genus Aspergillus" of Raper and Fennell, 1965, see in particular pages 327 to 330.

  
PART 6

GENERAL DESCRIPTION OF THE ASSOCIATED TECHNIQUE OF ADESIMMUNOELECTROPHORUS.

  
We have developed a process called top-agar coating technique to identify the components

  
  <EMI ID = 51.1>

  
enzyme components of the enzyme complex. The method is based on the fact that the enzymes are still active after the specific binding between the enzyme and the antibody or, expressed differently, the method is based on the fact that the active enzymatic site is not identical to the enzyme-antibody binding site. The enzyme-antibody complexes precipitate as separate arcs in the gel during electrophoresis. The gel plate is covered with SPS soluble in top-agar. After heating at 45 [deg.] C for 20 hours in an atmosphere having a relative humidity of 100%, the arc which has an SPS-ase activity appears as a clear zone in the SPS cover after precipitation by a mixture. equal parts in volume of ethanol and acetone, when viewed from above against a black background.

   Bows that do not show SPS-ase activity remain invisible.

  
PART 7.

IMMUNOELECTROPHORETIC CHARACTERIZATION OF SPS-ASE WITH A POLYSPECIFIC ANTIBODY AND COVERAGE.

  
Rabbits were immunized with the enzyme complex containing SPS-ase obtained by fermentation of

  
  <EMI ID = 52.1>

  
Example 1 (KRF 68) and the polyspecific antibody was recovered in a manner known per se. By means of this polyspecific antibody, a cross-immunoelectrophoresis was carried out of the enzyme complex obtained by fermentation of Aspergillus aculeatus CBS 101.43, as indicated in Example 1 (KRF 68), immunoelectrophoresis.

  
  <EMI ID = 53.1>

  
  <EMI ID = 54.1>

  
1977. Reference is made to fig. 11 which shows the arcs corresponding to the various proteins produced by the microorganism. It has been found, using the top-agar covering technique described above, that the hatched surface corresponds to the SPS-ase.

  
If the above assumption that SPS-ase consists of at least two enzymes is correct,

  
the hatched area is the area in which all the enzymes responsible for the activity of SPS-ase are found. If, according to other embodiments of the present invention, enzymes can be separated by immunoelectrophoresis in such a way that they do not cover any mutual surface, one can still identify a

  
  <EMI ID = 55.1>

  
phoresis with overlap with both SPS and a commercial pectinase.

  
PART 8.

PURIFICATION OF A SPS-ASE PREPARATION.

  
Purification of the SPS-ase KRF 92 preparation (see Example 1) was carried out by ion exchange.

  
The buffer is Tris 50 mMolar (tris-hydroxymethylamino-

  
  <EMI ID = 56.1>

  
is a K 5/30 column sold by Pharmacia, Sweden. The ion exchange substance is DEAE-trisacryl sold by LKB, Bromma, Sweden (300 ml). The speed of passage is
100 ml / hour.

  
15 g of the SPS-ase preparation were dissolved

  
  <EMI ID = 57.1>

  
The pH is adjusted to 7.0 using Tris 1 Molar. The column was equilibrated with buffer and the SPS-ase sample was then introduced into the column. OD280 and the conductivity of the eluate were measured; see to

  
fig. 12. Fraction 1 corresponds to the eluate which is not linked to the ion exchange substance. Then the column was washed with 2000 ml of buffer, which gives fraction 2. A gradient of NaCl 0-500 mMolar was then established, which gives fractions 3 - 9. The nine fractions were concentrated to 200 ml and were dyalized against water with a conductivity of 2mSi by dialysis (Hollow Fiber DP 2 from Amicon, Massachussetts, USA). Then the nine fractions were lyophilized. Only fractions 1 and 2 showed SPS-ase activity.

  
Fraction 1 was further purified by gel filtration. 1.5 g of fraction 1 were dissolved in 10 ml of 50 mMolar sodium acetate having a pH of

  
  <EMI ID = 58.1>

  
x 100 cm LKB .. The substance used for gel filtration is Sephacryl S-200 from Pharmacia, Sweden. The passage speed is 30 ml / hour. The fractions containing substances having a molecular weight of between 70,000 and 100,000, calibrated with globular proteins, contained an enzyme complex designated by factor G which cannot decompose the SPS when the test according to the qualitative agar test .; however, the SPS is broken down according to the qualitative agar test when the factor G is mixed with a pectinase. Factor G has been found to be able to separate galactose, le, fucose and certain galacturonic acids from SPS; but the main decomposition product following HPLC analysis is a high molecular weight product very similar to SPS.

  
PART 9.

DEPENDENCE ON ACTIVITY WITH RESPECT TO.pH AND TEMPERATURE AND STABILITY OF AN SPS-ASE

  
Fig. 13 shows the activity as a function of the pH of the preparation of SPS-ase KRF 68. From pH 2.7 to 3.5 a formic acid buffer system was used and from pH 3.7 to 5.5 an acetate buffer system was used.

  
Fig. 14 shows the activity as a function of the temperature of the preparation of SPS-ase KRF 68.

  
Fig. 15 shows the thermal stability of the. preparation of SPS-ase KRF 68.

  
PART 10

DETERMINATION OF ENZYMATIC ACTIVITY.

  
The table below gives an overview of the various determinations of the enzymatic activity relating to the present invention.

  

  <EMI ID = 59.1>

The references given in the last

  
.column of the above table are detailed in the following table.

  

  <EMI ID = 60.1>


  
With regard to the determination of the activity of cellulase, it should be noted that the analysis was carried out as indicated in AF 149/6-GB and that the principles of determination are explained in Analytical Biochemistry.

A. ENZYMATIC DETERMINATION OF SPS-ASE.

  
The enzymatic determination of SPS-ase is carried out in two stages, that is to say a qualitative test on an agar plate and a quantitative determination of the SPS-ase activity, based on the measurement of the total amount of sugars. released. If the qualitative agar plate test is negative, the SPS-ase activity is zero whatever the value originating from the quantitative determination of the SPS-ase activity. If the qualitative agar plate test is positive, the activity in SPS-ase is equal to the value coming from the quantitative determination of the activity in SPS-ase.

  
I. Qualitative test on agar plate.

  
An SPS-agar plate was prepared as follows. A buffer (B) was prepared by bringing

  
  <EMI ID = 61.1>

  
1. g of SPS are dissolved in 20 ml of B. 1 g of agarose (HSB Litex) is mixed with 80 ml of B and the mixture is heated to the boiling point with stirring. When the agarose is dissolved, the SPS solution is slowly added. The resulting 1% SPS-agarose solution. is placed in a water bath at 60 [deg.] C. The plates are then poured by pouring 15 ml of the 1% SPS-agarose solution onto a horizontal glass plate having the dimensions of 10 cm × 10 cm. Then

  
9 "wells" are stamped in the solidified layer of SPS-agarose at a distance of 2.5 cm. In each

  
  <EMI ID = 62.1>

  
enzyme enzyme to be tested for SPS-ase activity. The plate is incubated for 18 hours at
50 [deg.] C and a relative humidity of 100%: Then the SPS. not yet decomposed is precipitated by a solution in equal parts by volume of ethanol and acetone. The agar plate SPS-ase test is positive for a sample placed in a specific well if a clear annular zone appears around this well.

  
II. QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE ACTIVITY OF SPS-asa

  
The aim of this test is to determine the enzymatic activities which are capable of decomposing SPS in such a way that the decomposition products exhibit an affinity for the adsorption or the binding of soy protein greatly reduced or do not exhibit no affinity, adsorption or binding of soy protein. Tests have shown that the part of the decomposition products of SPS which is not precipitated by the mixture of equal parts by volume of water and ethanol has no affinity for adsorption or for binding to the protein of soy.

  
The determination of SPS-ase is based on hydrolysis of SPS under standard conditions followed by precipitation of the part of SPS which has not been hydrolyzed with ethanol. After precipitation, the carbohydrate content which is not precipitated is determined by a quantitative analysis for total sugar (according to AF 169/1, available from NOVO INDUSTRIE A / S, 2880 Bagsvaerd).

  
The standard conditions are:

  
  <EMI ID = 63.1>

  
pH 4.5

  
Reaction time: control for 210 minutes only with the substrate, followed by 2 minutes with the enzyme being added.

  
Reaction time: main value 212 minutes The equipment includes:

  
  <EMI ID = 64.1>

  
Whirlimixer shaker

  
Centrifuge

  
An ice water bath.

  
Reagents include:

  
Buffer: 0.6 M acetic acid in water <EMI ID = 65.1>

  
Substrate: the pH value of 50 ml of a is

  
adjusted to 4.5 by means of b, then 4.0 g of SPS are added and after dissolution of the latter, the pH is again adjusted to 4.5 and the volume

  
  <EMI ID = 66.1>

  
deionized.

  
Stop reagent Absolute ethanol.

  
An SPS-ase activity unit (SAE or SPSu) is defined as the SPS-ase activity which released

  
a quantity of carbohydrate soluble in 50% ethanol equivalent to 1 mole of galactose per minute, under the standard conditions mentioned above.

  
Even if the initial part of the standard curve of the enzyme is a straight line, it should be noted that it

  
  <EMI ID = 67.1>

B. ENZYMATIC DETERMINATION OF SOLUBILIZING ACTIVITY

  
REMANENCE EXPRESSED IN SRUM 120.

  
Principle.

  
In the method for determining the hydrolysis activity, the insoluble part of the defatted, deproteinized and shelled soybean flour is hydrolyzed under standard conditions. The reaction of the enzyme is stopped with a stop reagent. and the insoluble fraction is separated by filtration. The amount of dissolved polysaccharides is determined by spectrophotometry after acid hydrolysis according to AF 169/1, available from Novo Industri A / S, 2880 Bagsvaerd.

  
The carbohydrases exhibiting endo activity as well as those exhibiting exo activity are determined according to the method.

  
The substrate forming part of this enzymatic determination is identical to the substrate of the remanence described for the SRU method. The substrate is dissolved in the form of a 3% solution in the citrate buffer indicated below:

  
  <EMI ID = 68.1>

  
Art 6580)

  
Brought to 1 liter by demineralized water

  
  <EMI ID = 69.1>

  
Stable for 14 days.

  
The stop reagent. has the following composition:

  
  <EMI ID = 70.1>

  
200 ml of 96% ethanol

  
Store in a refrigerator until ready to use.

  
Standard conditions:

  

  <EMI ID = 71.1>


  
Unit definition:

  
One unit of soybean remanence solubilizing activity (SRUM) 120 (M for manual) corresponds to the amount of enzyme which, under the given reaction conditions, releases, per minute, solubilized polysaccharides equivalent to a micro-mole of galactose.

C. ENZYMATIC DETERMINATION OF PROTEOLYTIC ACTIVITY

HUT MEASUREMENT

  
Method for the determination of proteinase in an acid medium.

  
The process is based on the digestion of hemoglo-

  
  <EMI ID = 72.1>

  
during 30 minutes. Undigested hemoglobin is precipitated using 14% trichloroacetic acid
(weight / volume).

  
All the enzyme samples are prepared by dissolving these in a 0.1 M acetate buffer, at pH 3.2.

  
The hemoglobin substrate is prepared using 5.0 g of lyophilized bovine hemoglobin powder,

  
  <EMI ID = 73.1>

  
demineralized which is stirred for 10 minutes, before adjusting the pH to 1.7 using 0.31 N HCl.

  
After further stirring for 10 minutes,

  
  <EMI ID = 74.1>

  
this solution is brought to 200 ml using a 0.2 M acetate buffer. This hemoglobin substrate must be cooled to be kept for 5 days.

  
'The hemoglobin substrate is brought to room temperature. At time zero, 5 ml of the substrate are introduced into a test tube containing 1 ml of enzyme. After stirring for one second, the test piece is placed in a water bath at 40 [deg.] C for 30 minutes. After exactly
30 minutes, 5 ml of trichloroacetic acid are added to
14% in the test tube, which is then stirred and brought to room temperature for 40 minutes.

  
For the blank test, the hemoglobin substrate is brought to room temperature. At time zero, 5 ml of the substrate are added to the test tube containing 1 ml of enzyme. After a second's agitation,

  
  <EMI ID = 75.1>

  
5 minutes. After exactly 5 minutes, 5 ml of 14% trichloroacetic acid is added to the test tube, which is then stirred and brought to room temperature for 40 minutes.

  
After 40 minutes, the blank tests and the samples are agitated, filtered once or twice at

  
  <EMI ID = 76.1>

  
spectrophotometer. The sample is read in relation to the blank test at 275 nm by adjusting the spectrophotometer; in relation to water.

  
Since the absorbance of tyrosine at 275 nm is a known factor, there is no need to establish a standard tyrosine curve unless it is necessary to monitor the Beckman speetrophotometer.

  
Calculations:

  
1 HUT is the quantity of enzyme, which forms, in one minute, a hydrolyzate equivalent with regard to absorbance at 275 nm to a solution of 1.10 microgram / ml of tyrosine in HCl 0.006 N. This value of the absorbance is 0.0084. The reaction is carried out at 40 [deg.] C, pH 3.2 and for 30 minutes.

  

  <EMI ID = 77.1>


  
An attempt to determine the dependence of the stability of the pH of the protease in KRF 68, carried out

  
  <EMI ID = 78.1>

  
8.0 showed that the protease stability at pH above 8.0 was very low, cf. fig. 16.

  
For the purpose of illustrating the present invention, reference will be made. in the following examples 1 to 10, in which example 1 illustrates the preparation of SPS-ase and in which examples 2 to 10 illustrate the application of SPS-ase.

  
Many fermentations were carried out with

  
  <EMI ID = 79.1>

  
laboratory. Thus, preparations which contained SPS-ase were obtained according to the SPS-ase tests indicated above. However, since we need fairly large quantities of SPS-ase in order to carry out the tests, we fermented

  
  <EMI ID = 80.1>

  
example 1 below.

Example 1

  
Production of an SPS-ase at the scale of a pilot installation.

  
An SPS-ase was prepared by submerged fermentation of Aspergillus aculeatus CBS 101.43.

  
An agar substrate having the following composition was prepared in a Fernbach flask:

  

  <EMI ID = 81.1>


  
The pH was adjusted to between 5.30 and 5.35. Then 40 g of Difco agar was added and the mixture was kept in an autoclave for 20 minutes at 120 [deg.] C (the substrate is called E-agar).

  
The strain CBS 101.43 was cultivated on an inclined plane of E-agar (37 [deg.] C). The inclined plane spores were suspended in sterilized skim milk and the suspension was lyophilized in vials. The content of a lyophilized flask was transferred to a Fernbach flask. The bottle was then incubated

  
  <EMI ID = 82.1>

  
A substrate having the following composition was prepared in a fermentation tank of 500 liters:

  

  <EMI ID = 83.1>


  
Tap water was added to a volume

  
  <EMI ID = 84.1> the inoculation fermenter for one hour at 121 [deg.] C.

  
The final volume before inoculation was approximately 300 liters.

  
The suspension of spores in the vial of

  
  <EMI ID = 85.1>

  
tion. The inoculate fermentation conditions were:

  
Type of fermenter: Classic aerated and agitated fermentation tank with a height / diameter ratio of approximately 2.3.

  

  <EMI ID = 86.1>


  
About 28 hours after inoculation, 150 liters were transferred from the inoculation fermenter to the main fermentation tank.

  
A substrate having the following composition was prepared in a main fermentation tank of
2500 liters:

  

  <EMI ID = 87.1>


  
Tap water was added to a total volume of about 900 l. The roasted soybean flour was suspended in water. The pH was adjusted to 8.0 using

  
  <EMI ID = 88.1>

  
a relative pressure of zero relative atmosphere and a

  
  <EMI ID = 89.1>

  
added the remaining substrate components and the pH was adjusted to about 6 using phosphoric acid. The substrate was sterilized in the main fermentation tank for 1 1/2 hours at 123 [deg.] C. The final volume before inoculation was approximately 1080 liters.

  
Then 150 liters of inoculation culture was added.

The fermentation conditions are:

  
Type of fermenter: Classic aerated and agitated fermentation tank with a height / diameter ratio of about 2.7.

  

  <EMI ID = 90.1>


  
From 24 hours of fermentation up to approximately 116 hours of fermentation a pectin solution was added in a manner. aseptic to the main fermentation tank at a constant speed of approximately

  
8 liters per hour. The pectin solution having the following composition was prepared in a 500 liter dosing tank.

  
  <EMI ID = 91.1>

  

  <EMI ID = 92.1>


  
x Genu pectin (from the citrus NF genus from "The Copenhagen

  
pectin factory Ltd ").

  
Tap water was added to a total volume of about 325 liters. The substrate was sterilized in a dosing tank for 1 hour at 121 [deg.] C. The final volume before the start of dosing was approximately 360 liters. When this part was exhausted, another similar part was prepared. The total volume of the pectin solution for fermentation was approximately 725 liters.

  
After approximately 151 hours of fermentation, the fermentation process was stopped. The culture broth of about 1850 liters was cooled to about 5 [deg.] C and the enzymes were recovered according to the following technique.

  
The culture broth was filtered on a vacuum drum titer (Dorr Oliver), which was coated with Hy-flo-super-cel diatomaceous earth (filter aid). The filtrate was concentrated by evaporation to about 15% of the volume of the culture broth. The concentrate was filtered on a Seitz filter sheet
(supra 100 type) with 0.25% Hy-flo-super-cel at

  
  <EMI ID = 93.1>

  
the next board). The filtrate was precipitated using

  
  <EMI ID = 94.1>

  
filtration. The precipitate and the filter aid are separated by filtration on one. frame filter. The

  
filter cake is dissolved in water and the insoluble fractions are separated by filtration through a. frame filter. The filtrate is subjected to a filtration test on a Seitz filter sheet (of the supra 100 type) with 0.25% of Hy-flo-super-cel as a filter aid (designated filtration II in the following table). The

  
  <EMI ID = 95.1>

  
ultrafiltration. After diafiltration, the liquid is concentrated to a dry matter content of 12.7%
(referred to in the following table as the dry matter content of the concentrate).

  
An optional basic treatment to partially eliminate the protease activity can be performed at this stage. In the case of a basic treatment, this is carried out at a pH of 9.2 for one hour, the pH then being adjusted to 5.0.

  
Then the liquid is subjected to a test filtration and filtered in order to reduce germs and the filtrate is lyophilized in a Stokes lyophilization equipment.

  
Four fermentations were carried out as indicated below; the strain used for fermentation, optional use of basic treatment and other varying parameters, as shown in the following table.

  

  <EMI ID = 96.1>


  
.x After germ reduction filtration, the filtrate is concentrated by evaporation in a ratio of 1: 2.3. A small part of the concentrated filtrate was spray dried and the remaining part was lyophilized.

  
In order to further reduce the protease activity, some of the preparations indicated above are treated as indicated below, using only one of the three possibilities A, B, or C.

  
A. 100 g of SPS-ase preparation are dissolved

  
  <EMI ID = 97.1>

  
set the pH to 9.1 using 4N NaOH. This basic treatment is carried out for one hour. The pH is then adjusted to 4.5 using glacial acetic acid and dialyzed to

  
  <EMI ID = 98.1>

  
3 mSi tee. Then the freezing and freeze-drying are carried out.

  
B. A preparation of 500 g of SPS- is dissolved

  
  <EMI ID = 99.1>

  
basic is carried out for one hour. The pH is then adjusted to 5.0 using glacial acetic acid. The substance obtained is freeze-dried.

  
C. Dissolve 50 g of an SPS-ase preparation in 400 ml of deionized water with stirring at 10 [deg.] C + 2 [deg.] C. The pH is adjusted to 9.1 using 4N NaOH. This basic treatment is carried out for one hour. Then the pH is adjusted to 5.7 using glacial acetic acid. The substance obtained is freeze-dried.

  

  <EMI ID = 100.1>


  
The preparations indicated above are characterized by their activity of enzymes according to the. present invention in the following table.

  

  <EMI ID = 101.1>
 

  
Example 2 (application example)

  
This example describes the production of p.v.p. from defatted and shelled soy flour, "Sojamel 13" (commercially available from Aarhus Oliefabrik A / S). The dry matter content of this flour was 94.0% and the (N x 6.25) dry matter content was 58.7%. Soy flour has been treated with SPS-ase KRF 68 BII preparations
(example 1) as follows:

  
85.29 g of soybean flour was suspended

  
  <EMI ID = 102.1>

  
of water and the pH was adjusted to 4.5 using 7.5 ml of 6N HCl. 50 g of a solution containing 4.00 g of said SPS-ase preparation were added thereto and then stirred the

  
  <EMI ID = 103.1>

  
was then centrifuged in a laboratory centrifuge

  
  <EMI ID = 104.1>

  
Weighed the supernatant and analyzed it by the Kjeldahl method to determine nitrogen and dry matter. The solid phase was then washed with a volume of water equivalent to the mass of supernatant obtained during the first centrifugation. This was done twice. The solid phase was then lyophilized, weighed and analyzed according to the Kjeldahl method to determine nitrogen and dry matter at Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Denmark.

  
This laboratory is approved by the State for the analysis of animal feed and dairy products. The results obtained appear in Table 2.1:

  
Table 2.1 Results obtained

  

  <EMI ID = 105.1>


  
So we got a p.v.p. having a protein purity, that is to say N × 6.25 on the basis of dry matter, of 91.4% and with a total protein yield of 83%.

  
Example 3 (application example)

  
This example was carried out in order to compare the protein yields, the nutritional quality and certain functional properties of soy protein products prepared according to the following three techniques:

  
A: Classic isoelectric precipitation

  
for the preparation of a soy protein isolate.

  
B: Conventional isoelectric washing for

  
preparation of soy protein concentrate.

  
C: The isoelectric washing according to the invention

  
  <EMI ID = 106.1>

  
nence, for the preparation of a p.v.p.

  
In order to create a valid comparison of the process

  
of the invention (C) with the conventional methods of preparing soy protein (A and B), the same crude substance was used in all three cases. Likewise, the tests were carried out in such a way that the corresponding temperatures and the treatment times were the same in the three cases. Only the pH values were different due to the fundamental differences between the three tests.

  
A. Conventional isoelectric precipitation for

  
preparation of a soy protein isolate.

  
We extracted 425.8 g of soy flour (Sojamel
13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) in 3574.2 g of water

  
  <EMI ID = 107.1>

  
4N NaOH. After stirring for 1 hour, the suspension was centrifuged at 3000 x g for 15 minutes using

  
  <EMI ID = 108.1>

  
to a new extraction with water until reaching A total weight of 4000 g. We maintained the

  
  <EMI ID = 109.1>

  
4 N and the suspension was stirred for 1 hour. Centrifugation and weighing of the centrifuge product II and precipitate II was carried out as described above. Samples of centrifugation I and II and precipitate II were removed for analysis. according to Kjeldahl and for the measurement of dry matter. Then, the products of centrifugation I and II were agitated and maintained at 50 [deg.] C. The protein was then precipitated electrically to pH 4.5 using 45 g of 6N HCl.

  
  <EMI ID = 110.1>

  
protein by centrifugation at 3000 x g for 15 minutes. Centrifugation product III was weighed and analyzed for Kjeldahl-N determinations and dry matter measurements. Solid phase III was weighed and washed

  
with water in an amount corresponding to the weight of the product

  
  <EMI ID = 111.1>

  
by centrifugation at 3000 x g for 15 minutes. The centrifuge product IV and the solid phase IV were weighed. Centrifugation product IV was analyzed for the determination of Kjeldahl-N and for the measurement of dry matter. The solid phase has been suspended

  
  <EMI ID = 112.1>

  
using 17 g of 4N NaOH. The mixture was stirred for 1 hour and the pH was again adjusted to 6.5, if necessary. Finally, the product was lyophilized, weighed and analyzed for the determination according to Kjeldahl-N and for the measurement of dry matter. The mass balance calculations are shown in Table 3.1.

  
Table 3.1: Precipitation mass balance calculations

  
conventional isolelectric for the preparation of a soy protein isolate.

  

  <EMI ID = 113.1>
 

  
B. Isoelectric washing for the preparation of a concentrate

  
soy protein.

  
425.6 g of soy flour was washed (Sojamel 13

  
  <EMI ID = 114.1>

  
C. The pH was adjusted to 4.5 using 44.8 g of 6N HCl. Washing was carried out for 4 hours with stirring. The suspension was then centrifuged at 3000 x g for 15 minutes in a laboratory centrifuge (Beckman J-6B model) using 4 11 l beakers.

  
  <EMI ID = 115.1>

  
according to Kjeldahl-N and the measurement of dry matter. The

  
  <EMI ID = 116.1>

  
water up to a total weight of 4000 g. The pH was again adjusted to 4.5 using 1.7 g of 6N HCl and

  
  <EMI ID = 117.1>

  
Centrifugation and weighing of centrifuge product II and solids II was performed as before.

  
Solid phase II was resuspended in 1575 g

  
  <EMI ID = 118.1>

  
C for one hour and the pH is again adjusted to 6.5, if necessary. Finally the protein product was lyophilized, weighed and analyzed according to Kjeldahl-N and for the measurement of dry matter. The mass balance is'. shown in Table 3.2.

  
  <EMI ID = 119.1>. for the preparation of a soy protein concentrate.

  

  <EMI ID = 120.1>


  
C. Isoelectric washing comprising a solubilizing enzyme

  
afterglow, for the preparation of a p.v.p.

  
425.8 g of soy flour (Sojamel 13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) was washed in 3524.2 g of water.

  
  <EMI ID = 121.1>

  
6 N. 24 g of the preparation SPS-ase, KRF were dissolved
68 Bill. (Example 1) in 26 g of water and added to the wash mixture. The washing was then carried out for 4 hours with stirring. Then we purified

  
  <EMI ID = 122.1>

  
of NaOH 4 N and of water for the new suspension being the only parameters presenting different values. The mass balance is shown in Table 3.3.

  
Table 3.3 .: Calculation of the mass balance of isoelectrical washing

  
stick containing an enzyme solubilizing the persistence for the preparation of a p.v.p.

  

  <EMI ID = 123.1>


  
1) Analyzed by Bioteknisk Institut, Holbersvej 10, DK-6000

  
Kolding, Denmark

  
2) Analyzed by Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169,

  
DK-8000, Aarhus C, Denmark

  
Nutritional properties

  
The amino acid composites of the three protein products have been determined, see Table 3.4. The total content of essential amino acids, the chemical content and the index of essential amino acids (EAAI) are calculated using the FAO reference document of 1957.

  
The trypsin inhibitor content of the three products was determined using the method described in A.O.C.S. Tentative Method Ba 12-75 (A.O.C.S. is an abbreviation for American Oil Chemists' Society). The results are shown in Table 3.5 which also includes the yields and the protein / dry matter ratio of the three products.

  
Table 3.4 .: Amino acid composition and nutritional evaluation

  
of the three protein products A, B, and C

  

  <EMI ID = 124.1>


  
  <EMI ID = 125.1>

  
on the FAO reference document of 1957.

  
Table 3.5 .: Process characteristics and content

  
trypsin inhibitor of the three protein products A, B and C

  

  <EMI ID = 126.1>


  
Functional properties

  
  <EMI ID = 127.1>

  
Nitrogen solubility index) was determined, respectively, in a 1% protein dispersion at pH 7.0 in 0.2M NaCl and in distilled water. After stirring for 45 minutes using a magnetic stirrer, the suspension was centrifuged at 4000 x g for 30 minutes and the supernatant was analyzed for nitrogen. The nitrogen solubility was calculated as the ratio ...% N soluble /% N total. The results of this determination carried out on the three products are shown in Table 3.6.

  
  <EMI ID = 128.1>

  
three times on each product by a slightly modified Swift titration. 4.0 g of (N x 6.25) of the product was

  
  <EMI ID = 129.1>

  
the suspension in a glass mixing container and 50 ml of soybean oil was added. The total mixture was then weighed. The oil-water mixture was then homogenized at 10,000 rpm, the container being placed in an ice bath. Additional soybean oil was added at a rate of 0.3 ml per second until the emulsion collapsed. The total amount of oil added before the "end point" was determined by weighing.

  
The emulsification capacity is calculated as the number of ml of oil per gram of protein

  
(N x 6.25). The oil density was assumed to be Gold 9 g / ml.

  
The average results of the determination of the emulsification capacity of the three products are shown in Table 3.6.

  
  <EMI ID = 130.1>

  
250 ml of an aqueous dispersion of the protein samples at speed III for 4 minutes in a Hobart shaker (model N-50) comprising a wire-shaped whisk. The whipping expansion was calculated using the formula

  
Whipping expansion = V-250 x 100%

  
250

  
in which V represents the final whipping volume in ml.

  
  <EMI ID = 131.1>

  
mixing container with water. The tests for each of the three samples were doubled. The average results are shown in Table 3.6.

  
The_stability_of_the foam is determined as the ratio between the amount of foam left after draining for 30 minutes and the amount of foam originally. One gram of foam produced by the previous process was introduced into a plastic cylinder
(diameter 7 cm, height 9 cm) with a mesh net of 1 mm x lmm. The cylinder was placed above a funnel mounted on a glass cylinder and the weight (B) of the liquid drained into the glass cylinder is measured. The stability of FS (foam stability) is determined by the equation

  

  <EMI ID = 132.1>


  
The results of the measurement are shown in Table 3.6.

  
  <EMI ID = 133.1>

  
description as the Brookfield viscosity measured using T mandrels on a Brookfield stand. Helipath. The gels are produced by heat treatment of 12% protein suspensions in 0.5 M NaCl. The heat treatment was carried out in closed cans having a diameter of 7.3 cm and a height of 5.0 cm, immersed in a water bath, for 30 minutes, kept at
80 and 100 [deg.] C. The cans have been cooled and thermostati-

  
  <EMI ID = 134.1>

  
measures. The results of these measurements are shown in Table 3.6.

  
Table 3.6 .: Functional properties of the three substances

  
protein A, B, and C
  <EMI ID = 135.1>
 Example 4 (application example)

  
We produced a p.v.p. next.the process described in Example 3 C except that the cellulase activity was partially derived from Trichoderma reseei. The preparation of this CELLUCLAST commercial cellulase, produced by Novo Industri A / S, was treated with a base at a low temperature in the following manner. The pH of a 10% solution of CELLUCLAST in water was adjusted to 9.2 using NaOH, and the resulting solution was

  
  <EMI ID = 136.1>

  
overnight and then filtered sterile. The filtration product was lyophilized. 4 g of the lyophilized product were added to the preparation a SPS-ase, KRF 68 BIII (Example 1). The two enzymes were dissolved in 172 g of water before being added to the washing mixture. The mass balance determinations of this example are shown in Table 4.1.

  
The test shows that this particular preparation of SPS-ase already contains an effective ceLlase since an addition of CELLUCLAST does not seem to affect the protein / dry matter ratio. However, other SPS-ase preparations may contain less cellulase, for example KRF 92, see the table immediately preceding Example 2.

  
Table 4.1: Calculation of the mass balance of isoelectric washing comprising an SPS-ase preparation

  
  <EMI ID = 137.1>

  

  <EMI ID = 138.1>


  
Example 5 (application example)

  
We produced a p.v.p. according to the process described in Example 3 C except that all the masses are divided by a factor of 5 and that the reaction mixture is <EMI ID = 139.1>

  
analytical results relating to the centrifugation products, a theoretical yield of precipitated protein is obtained, as shown in table 5.1. Table 5.1 .: Theoretical protein yields obtained

  
during the production of a p.v.p.

  

  <EMI ID = 140.1>


  
aAverage of 87.5 (Bioteknisk Institut) and 86.9 (Qvist's Laboratorium); the dry matter content is respectively 97.6 and 98.0%.

  
Calculated as total protein mass - protein loss in centrifugation products.

  
Example 6: (application example)

  
Demonstration of the protein binding of the SPS.

  
  <EMI ID = 141.1>

  
40 g of (Nx6.25) of a commercial soy protein isolate (Purina 500E from Ralston Purina) were dissolved in 680 g of water. The mixture was heated in a water bath at 50 [deg.] C and the pH was adjusted to 4.50 using

  
  <EMI ID = 142.1>

  
aqueous solution containing respectively 0 g, 0.2 g, 0.4 g 0.8 g and 1.6 g of the SPS prepared as described previously in this specification. The bottles were then kept under stirring by means of a magnet in a bath.

  
  <EMI ID = 143.1> for 15 minutes and the centrifugation products I were analyzed according to Kjeldahl-N and for the determination of dry matter. The solid phases were washed with water at room temperature and centrifuged again. This step has been repeated. The solids were then dispersed in 50 ml of water and the pH was adjusted to 6.50 by adding dropwise 6N NaOH. The neutralized products were lyophilized and analyzed according to Kjeldahl-N and to determine the materials. dry (MS). Based on the analyzes shown in Table 6.1, the percentage of protein recovered and the percentage of SPS that was bound to the protein were calculated using the formulas shown in relation to Table 6.2.

  
This example demonstrates that the SPS is intimately linked to the protein so that the protein / dry matter ratio decreases with an increasing content of SPS.

  
The protein / SPS ratio present in soybean flour corresponds to an SPS content comparable to approximately 0.4 g in 10 g of water, added to 5 g of protein isolate.

  
The SPS binding percentage is a calculated value. The percentage of SPS binding decreases due to the saturation of the protein with SPS at low protein / SPS ratios. '.

  
table 6.1 .: Measures according to example 6
  <EMI ID = 144.1>
 Table 6.2 .: Protein recovery and percentage of

  
SPS liaison

  

  <EMI ID = 145.1>


  
Protein recovery percentage =

  

  <EMI ID = 146.1>


  
NC 1 = percentage of nitrogen in the centrifuge product I.

  
 <2>) percentage of SPS binding =

  

  <EMI ID = 147.1>


  
or,. (%, W / H) is the protein / dry matter ratio in the dried precipitate, and

  
(% W / H) &#65533; refers to the precipitate without addition of SPS. Example 7 (application example)

  
This example describes the preparation of a p.v.p. using the preparation of SPS-ase KRF 92 B-I comprising 5% dry matter. The preparation process is the same as that of Example 3 C, except that all the masses are divided by a factor of 5. The p.v.p. was analyzed as described in Example 2. The results obtained in the test appear in Table 7.1.

  
Table 7.1 .: Results obtained in Example 7

  

  <EMI ID = 148.1>


  
  <EMI ID = 149.1>

  
Kolding.

  
Analysis by Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C.

  
Example 8 (application example):

  
This example shows the effect of a pre-treatment of soy flour by steam cooking before the preparation of the p.v.p.

  
  <EMI ID = 150.1>

  
A suspension of soy flour in water consisting of 10 kg of soy flour (Sojamel 13 produced by Aarhus Oliefabrik A / S) per 100 kg was pumped through a steam ejector (type Hydroheater B-300) and mixed with steam at 8 Bar in such a quantity and at such a speed that we were able to maintain a final temperature

  
  <EMI ID = 151.1>

  
pressurized. Then the pressure was reduced in an expansion chamber (a cyclone) from where the suspension was sent to a plate heat exchanger in which it was cooled to about 50 [deg.] C. The cooled mud could be used as it is for the preparation of p.v.p. according to the invention, but in this case the suspension was spray dried at an inlet temperature

  
  <EMI ID = 152.1>

  
Preparation of the p.v.p.

  
This preparation was carried out as follows:

  
We put 70 g of dry matter of soya flour cooked with a steam jet and dried in suspension and we

  
  <EMI ID = 153.1>

  
adjust the pH to 4.50 using 6.5 ml of 6N HCl. 6 x 90 g of this suspension were transferred to 6 Erlenmeyexs of

  
  <EMI ID = 154.1>

  
of water by means of magnetic stirrers. To each Erlenmeyer flask was added 10 g of a solution containing respectively 0 g, 0.025 g, 0.050 g, 0.10 g, 0.20 g and

  
0.40 g of the preparation of SPS-ase KRF-68-B-III. The reaction mixtures are then stirred for 240 minutes

  
  <EMI ID = 155.1>

  
15 minutes at 3000 x g.

  
The supernatant was then analyzed according to the Kjeldahl-N method and the solid phase was washed with water at equal volumes and was centrifuged. this operation

  
was performed twice. The solid phase was then lyophilized and analyzed for the determination of Kjeldahl-N and dry matter.

  
A similar test was carried out with untreated soy flour (Sojamel 13 from Aarhus Oliefabrik A / S) used as the starting material. In this case, the enzyme to substrate ratios were 0%, 1%, 2%, 3%, 4% and 8%.

  
Based on the protein content of the supernatants, it was possible to calculate the percentage of protein recovered. The protein yield is based on the assumption: that the enzyme substance is 100% solubilized after the reaction. The table below indicates the results obtained by the two tests.

  
Table 8.1 .: Protein yields and protein / ratio

  
dry matter for a p.v.p. prepared from cooked or raw soy flour.

  

  <EMI ID = 156.1>

Example 9

  
Isolation of protein from corn gluten.

  
Corn gluten is usually produced as a by-product in the corn starch manufacturing process. This raw corn gluten is not effectively separated from the fibrous fraction and this is where

  
one of the reasons why it has no interesting functional properties. Likewise, various degradable polysaccharides accompany raw corn gluten.

  
  <EMI ID = 157.1>

  
with an SPS-ase preparation produced according to Example 1, except that an ultrafiltration was carried out instead of

  
  <EMI ID = 158.1>

  
isolated was subjected to a basic treatment according to method A (for reasons of brevity this preparation of SPS-ase subjected to a basic treatment is hereinafter called PPS 1305). PPS 1305 contains practically no proteolytic activity.

  
  <EMI ID = 159.1>

  
used:

  

  <EMI ID = 160.1>


  
The protein substance was purified by centrifugation, washed twice and finally lyophilized.

  
The results are shown in Table 9. Table 9.

  

  <EMI ID = 161.1>


  
EXAMPLE 10 Isolation of Protein from Flour

  
raw cotton, sunflower flour or rapeseed flour

  
Protein from cottonseed meal, sunflower meal or rapeseed meal can be separated in the same way as protein from soybean meal or corn gluten meal. The isolation of proteins from various other crude protein-containing plant substances can be performed in the same manner. Naturally, the isolation and / or the separation must preferably be carried out at the isolelectric point of the main part of the protein part of the starting substance, the yield in

  
protein being that maximum.

  
In order to be clearer, an overview of the figures to which reference has already been made is given below.

  

  <EMI ID = 162.1>
 

  

  <EMI ID = 163.1>
 

  
  <EMI ID = 164.1>
1. Agent for the decomposition of vegetable persistence, in particular soy persistence, in the presence of a vegetable protein, in particular soy protein, and suitable for the preparation of a p.v.p.

  
  <EMI ID = 165.1>

  
starting from a vegetable protein which can be defatted or partially defatted, agent containing an enzyme with activity of remanence solubilization, characterized * in that it contains an enzyme capable of breaking down the SPS of soybean (SPS-ase) and in that it is essentially free of proteolytic activity.

Claims (1)

2. Agent suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre Aspergillus, de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger. 2. Agent according to claim 1, characterized in that the SPS-ase is produced by means of a microorganism belonging to the genus Aspergillus, preferably belonging to the group Aspergillus niger. 3. Agent suivant les revendications 1 du 2, caractérisé en ce que le composant actif est dérivé de l'enzyme qui peut être produite par Aspergillus aculeatus CBS 101.43. 3. Agent according to claims 1 to 2, characterized in that the active component is derived from the enzyme which can be produced by Aspergillus aculeatus CBS 101.43. 4. Agent suivant les revendications 1 à 3, carac- <EMI ID=166.1> 4. Agent according to claims 1 to 3, charac- <EMI ID = 166.1> identique à la SPS-ase qui peut être produite par Asp. aculeatus CBS 101.43 et en ce qu'elle peut être identifiée au moyen de la technique de recouvrement immunoélectrophorétique. identical to SPS-ase which can be produced by Asp. aculeatus CBS 101.43 and in that it can be identified by means of the immunoelectrophoretic recovery technique. 5. Agent suivant l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le rapport entre l'activité protéolytique,=en unités HUT et l'activité de solubilisation de la rémanence en unités SRUM-120 est inférieur- à environ 2:1, de préférence inférieur à 1:1, tout particulièrement inférieur à 0,25:1. 5. Agent according to one of claims 3 or 4, characterized in that the ratio between the proteolytic activity, = in HUT units and the activity of solubilization of the remanence in SRUM-120 units is less than about 2: 1, preferably less than 1: 1, most particularly less than 0.25: 1. 6. Agent suivant les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comporte une activité de cellulase et an ce que ladite activité de cellulase est dérivée partiellement ou totalement de Trichoderma reseei. 6. Agent according to claims 1 to 5, characterized in that it comprises a cellulase activity and in that said cellulase activity is derived partially or completely from Trichoderma reseei. 7. Agent suivant les revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte une* activité de cellulose 7. Agent according to claims 1 to 6, characterized in that it comprises * cellulose activity <EMI ID=167.1>  <EMI ID = 167.1> une activité d'hémicellulase (VHCU). hemicellulase activity (HCV). 8. Procédé pour la préparation d'une protéine végétale purifiée produite en éliminant la rémanence d'une protéine végétale brute servant de substance de départ, caractérisé en ce que la substance de départ est traitée avec l'agent suivant les revendications 1 à 7 dans un milieu aqueux, à une valeur de pH qui ne diffère pas de . plusde 1, 5 unité de pH du point isoélectrique de la partie principale de la part de protéine de la substance de départ et 8. Process for the preparation of a purified vegetable protein produced by eliminating the persistence of a crude vegetable protein serving as starting material, characterized in that the starting substance is treated with the agent according to claims 1 to 7 in an aqueous medium, at a pH value which does not differ from. more than 1.5 pH units from the isoelectric point of the main part of the protein part of the starting substance and <EMI ID=168.1>  <EMI ID = 168.1> C, jusqu'à ce qu'au moins environ 60 % de la rémanence; sur base du b ilan en azote et en matières sécher? de préférence au moins environ 70 % de celle -ci, plus particulièrement au moins environ 80 % de celle.-ci ont été solubilisées, et en ce qu'on sépare ensuite la phase solide contenant la protéine végétale purifiée du surnageant. C, until at least about 60% of the remanence; on the basis of nitrogen and dry matter? preferably at least about 70% thereof, more particularly at least about 80% thereof, have been dissolved, and in that the solid phase containing the purified vegetable protein is then separated from the supernatant. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation à une température comprise entre la température ambiante et le point de congélation du surnageant. 9. Method according to claim 8, characterized in that the separation is carried out at a temperature between room temperature and the freezing point of the supernatant. 10. Procédé suivant l'une des revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que la substance de départ est une protéine végétale partiellement dégraissée ou dégraissée et encore partiellement purifiée. 10. Method according to one of claims 8 or 9, characterized in that the starting substance is a partially defatted or defatted vegetable protein and still partially purified. 11. Procédé suivant les revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la substance de départ est de la farine de soja. 11. Method according to claims 8 to 10, characterized in that the starting substance is soy flour. 12. Procédé suivant les revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la substance de départ est une farine de soja traitée à la chaleur, de préférence, une farine de soja cuite au jet de vapeur. 13. Procédé suivant les revendications 8 à 12, caractérisé en ce que la substance de départ est capable de passer à travers un tamis présentant une ouverture de mailles d'environ 2,5 mm. 12. Method according to claims 8 to 11, characterized in that the starting substance is a heat-treated soy flour, preferably a soy flour cooked with a steam jet. 13. Method according to claims 8 to 12, characterized in that the starting substance is capable of passing through a sieve having a mesh opening of about 2.5 mm. 14. Substance à base de protéine végétale purifiée préparée par le procédé suivant les revendication 8 à 13. 14. Substance based on purified vegetable protein prepared by the process according to claims 8 to 13.
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