INTERFERON DE FIBROBLASTES HUMAINS
SOUS LA FORME D'UNE PROTEINE HOMOGENE;
ET SA PREPARATION
La présente invention concerne l'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène et un procédé pour sa production en combinant la chromatographie d'affinité et la chromatographie
en phase liquide à haute pression (HPLC).
Depuis sa découverte initiale par Isaacs et
<EMI ID=1.1>
forme des leucocytes ou des fibroblastes, a résisté aux tentatives des chercheurs dans les institutions de l'ensemble du inonde, au cours de deux décennies, en vue de son isolement sous la forme d'un peptide homogène
<EMI ID=2.1>
sation et l'identification de ses propriétés biologiques et chimiques particulières. Bien que plusieurs auteurs affirment avoir purifié des interférons de souris ou humains à un état homogène, ils n'ont donné aucune des preuves classiques d'homogénéité des matières protéiques et n'ont décrit non plus aucune des propriétés des composés purs qu'ils prétendent avoir obtenus.
L'utilisation de chromatographie en phase liquide à hautes performances pour la purification de protéines est connue d'une manière générale dans la technique. Les références décrivent spécifiquement des colonnes des types à échange d'ions et à exclusion de grosseurs dans la purification de protéines (par exemple Régnier et Noël, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976J et Chang et autres, Anal. Biochem. 48, 1839
[1976] et l'utilisation de Lichrosorb RP-18 (colonne de microparticules de silice liée à des groupes octadécyle) dans une chromatographie de partage à phase inverse a été employée efficacement pour purifier des peptides tels que la (3-endorphine (Rubinstein et autres, <EMI ID=3.1> Il est connu dans la technique d'utiliser la <EMI ID=4.1> la purification de l'interfère:! de fibroblastes humains. Ainsi, Davey et autres, J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), décrivent l'utilisation d'une chromatcgraphie d'affini- <EMI ID=5.1> <EMI ID=6.1> <EMI ID=7.1> même but un système Blue Dextran-Sepharose. Enfin, selon le brevet des E.U.A.
N[deg.] 4 172 071 (de Maeyer et autres), la purification de diverses solutions brutes d'interféron de leucocytes et de fibroblastes est effectuée par chromatographie d'affinité sur une colonne de Blue Dextran-Sepharose donnant des préparations qui ont une activité spécifique comprise entre 1 et 5 x 108 Unités Internationales d'interféron. Aucune étape de purification supplémentaire n'est décrite et les prérarations d'interféron obtenues sont indiquées comme ayant une haute teneur en produits présentant une activité du type interféron, dépouillés dans une mesure majeure des protéines polluantes. <EMI ID=8.1> vention utilise une combinaison d'étapes de chromatographie d'affinité et de chromatographie en phase liquide à haute pression pour effectuer une purification efficace de l'interféron de fibroblastes humains.
Plus particulièrement, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes en combinaison : A. On fait passer une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humains dans un état impur à travers une colonne à chromatographie d'affinité de ma-nière à adsorber l'interféron sur la colonne,et ensuite on élue l'interféron de la colonne et on obtient l'interféron dans des fractions choisies de l'éluat dans un état de pureté accrue; et B.
On fait passer les fractions choisies d'interféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plusieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure équilibrées par un tampon dans des conditions de chromatographie en phase liquide à haute pression, les groupes d'hydrocarbure étant choisis parmi les groupes cyclohexyle, phényle, diphényle, octyle, octadécyle et cyanopropyle, de manière à absorber l'interféron sur la colonne, et ensuite on élue l'interféron de cette colonne au moyen d'un gradient d'un mélange acide aqueux tamponné de solvants misci- <EMI ID=9.1> forme d'un pic distinct unique dans des fractions choisies de l'éluat à l'état d'une protéine homogène.
Dans l'opération de chromatographie d'affinité selon la présente invention, on peut utiliser un <EMI ID=10.1> Sepharbse, l'utilisation de ce dernier étant préférée en raison du fait que l'on obtient avec lui des rendement s sensiblement plus élevés qu'avec le système Concanavalin A-Sepharose 4B et on obtient aussi un produit plus stable. Avec le système Concanavalin A-Sepharose 4B, on peut utiliser le mode opératoire suivant :
(a) 20 à 30 volumes de colonne d'interféron de fibroblastes humains (activité spécifique environ
10 unités/mg) dans du milieu essentiel minimal d'Eagle contenant 5 % de sérum foetal de veau sont refoulés sur une colonne de Concanavalin A-Sepharose 4B à un débit de 30 à 60 cm�/h ; <EMI ID=11.1> phosphate (PBS), pH 7,2 ;
(c) on lave avec PBS-0,1M a-méthyl mannoside <EMI ID=12.1> <EMI ID=13.1> d'éthylèneglycol.
L'interféron purifié résultant obtenu après l'étape (d) présente une activité spécifique d'environ
<EMI ID=14.1>
ron.
Un mode opératoire approprié pour l'utilisation de Blue Dextran-Sepharose dans l'étape de chromatographie d'affinité est le suivant :
(a) 10 à 40 volumes de colonne du liquide surna- <EMI ID=15.1>
d'une solution saturée de NaCl et ensuite refoulés sur la colonne à une vitesse linéaire d'écoulement de
20-40 cm/h ;
(b) on lave la colonne avec 5-15 volumes de co- <EMI ID=16.1> phosphate contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol (pH 7,2).
<EMI ID=17.1>
fique d'environ 3 x 10[deg.] unités/mg et peut être obtenu
<EMI ID=18.1>
Le Blue Dextran-Sephar�se utilisé dans l'étape de chromatographie d'affinité ci-dessus peut être préparé commodément par copulation de Blue Dextran
(produit de couplage de Cibacron Blue F3GA et de Dextran) avec un Sepharose 4B activé par le bromure
<EMI ID=19.1>
L'opération de copulation ci-dessus, ainsi que le lavage et le vieillissement de la résine, le mode opératoire pour le chargement de la colonne et pour l'élution sont importants pour l'obtention du rendement maximal et du plus haut degré de pureté du produit interféron de fibroblastes humains.
Dans les cas où l'échantillon d'interféron est récolté à partir d'un milieu exempt de sérum, la purification à un état homogène est effectuée par un seul ou deux passages à travers une colonne de Blue Sepharose-4B en éluant avec une solution aqueuse tamponnée à 30-�0 % (v/v) d'éthylène-glycol (pH 7,2).
Pour obtenir une purification supplémentaire de l'interféron produit dans l'étape de chromatographie par affinité, on traite l'interféron par une ou plusieurs étapes de chromatographie en phase liquide à haute pression avec une haute résolution et un rendement élevé à une échelle de préparation. L'opération de chromatographie en phase liquide utilise des colonnes contenant une matrice de silice poreuse à laquelle sont liés des groupes cyclohexyle, octyle, octadécyle, phényle, diphényle ou cyanopropyle. Ces colonnes, qui peuvent être utilisées successivement
et dans des conditions variables de pH et de gradient de solvant organique, peuvent purifier l'interféron
de fibroblastes humains jusqu'à un état homogène comme déterminé par l'obtention d'une seule bande lors d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl-
<EMI ID=20.1>
constante et d'un seul pic en HPLC avec l'activité et les niveaux de protéine superposables.
Les colonnes de microparticules de silice totalement poreuses, de forme irrégulière (grosseur des particules 10 microns environ et une grosseur de pores
o
ie 1CO A environ) ayant des groupes cyclohexyle, oc-
<EMI ID=21.1> sées dans la mise en oeuvre de l'invention sont des articles du commerce.
Un système commode de chromatographie en phase liquide à haute pression utilisable dans les colonnes indiquées ci-dessus est décrit dans le brevet des
<EMI ID=22.1>
Dans la aise en oeuvre du présent procédé, la solution d'interféron de fibroblastes humains purifiée par chromatographie d'affinité dans un tampon aqueux de pH 4-8 est passée à travers une colonne de matrice de silice. Un tampon préféré pour les buts de la présente invention est un tampon pyridine/acide formique/ eau (8:8:84, v/v). Habituellement, on met en oeuvre
le procédé sous pression, de préférence une pression comprise entre environ 3,4 et environ 540 atm. L'interféron est absorbé sur la colonne et on l'élue ensuite d'une manière sélective en utilisant un gradient d'un tampon aqueux plus des quantités variables d'un solvant miscible avec l'eau. Des solvants miscibles avec l'eau utilisables à cet effet sont, par exemple, des alca-
<EMI ID=23.1>
le tert-butanol, l'éthanol, le méthanol, etc. On préfère particulièrement pour l'élution d'interféron de fibroblastes humains un mélange de propanol et de butanol.
On effectue le fractionnement de l'éluat en
<EMI ID=24.1>
en elle-même connue avec contrôle concomitant de la teneur en protéine de chaque fraction par des contr8leurs de peptides fonctionnant avec une grande sensibilité. Un système utilisable à cet effet est décrit
<EMI ID=25.1>
On notera aussi le brevet des E.U.A. n[deg.] 3 876 881.
Le choix des types particuliers de résines à utiliser dans les étapes de chromatographie en phase liquide à haute pression dépend de la source et de la pureté de la matière de départ interféron de fibroblastes humains qu'on utilise pour cette étape. Ainsi, la matière produite par chromatographie d'affinité
sur uno colonne de Concanavalin A-Sepharose est purifiée commodément jusqu'à un état homogène en utilisant une chromatographie en phase liquide à haute pression sur une colonne de silice à groupes cyclohexyle liés
et ensuite sur une colonne de silice à groupes octyle liés. Par ailleurs, quand on utilise une colonne de Blue Dextran dans l'étape de chromatographie d'affinité, la purification à un état homogène peut être effectuée par un ou plusieurs passages à travers une colonne de silice à groupes octyle liés ou en variante par passage à travers la colonne de silice à groupes octyle liés suivie d'un passage à travers une colonne de silice à groupes cyanopropyle liés et ensuite, si nécessaire,
à travers une colonne de silice à groupes diphényle liés. Quand on utilise une colonne de Blue Sepharose-4B et une préparation exempte de sérum, un seul passage à travers une colonne de silice à groupes octyle liés donnera une préparation homogène.
En raison de la sensibilité de l'activité de l'interféron de fibroblastes humains en présence de solvants organiques, par exemple en présence des propanols, du butanol ou du 2-méthoxy-éthanol à un pH neutre,
<EMI ID=26.1>
l'interféron de fibroblastes humains a une nature plus hydrophobe que l'interféron de leucocytes et comme il y a d'autres protéines plus hydrophobes présentes dans les préparations d'interféron de fibroblastes partiel-
<EMI ID=27.1>
et de butanol constitue le solvant préféré pour l'élution des colonnes à phase inverse, plutôt que le n-propanol. L'utilisation d'un tel solvant sert à liai-ter la concentration d�olvant organique nécessaire pour l'élution complète de toutes les protéines absorbées et réduit ainsi les produits artificiels se formant à une haute charge en raison de la solubilité plus faible des protéines.
L'interféron de fibroblastes humains obtenu dans un état homogène selon la présente invention est dérivé d'un pic unique dans la dernière colonne de chromatographie en phase liquide à hautes performances et donne une seule bande étroite lors d'une électrophorèse sur gel de NaDodS04 polyacrylamide en présence de 2-mercaptoéthanol. L'extraction du gel donne un seul pic d'activité antivirale coïncidant avec la
<EMI ID=28.1>
porte quelle détermination antivirale classique pour l'activité de l'interféron de fibroblastes humains.
La masse moléculaire de l'interféron de fibroblastes humains homogène telle que déterminée par la méthode au gel de polyamide a été de 20 500 environ. L'activité spécifique de cette matière purifiée était
<EMI ID=29.1>
l'extrémité côté azote obtenue sur un échantillon d'interféron de fibroblastes humains homogène a été
<EMI ID=30.1>
Les interférons ont présenté une activité antivirale, anti-tumeurs, d'inhibition de croissance et d'immunosuppression. Ces activités ont été obtenues
<EMI ID=31.1>
par jour avec des préparations relativement brutes,
<EMI ID=32.1>
féron de fibroblastes- humains purifié homogène selon la présente invention peut être utilisé de la même manière que les préparations brutes utilisées antérieurement avec ajustement des doses de manière à donner le niveau équivalent désiré d'unités d'interféron.
Les aspects procédé et produit de la présente invention sont encore illustrés par référence aux exemples suivants. Tous les titres des interférons sont
<EMI ID=33.1>
par mg par comparaison avec un étalon de référence pour l'interféron de leucocytes humains (G023-901-527) fourni par The National Institutes of Health des E.U.A.
Exemple 1
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
équipée d'un disque de polyéthylène fritté, on intro-
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
On la charge à un débit de 180 cm�/h (35,5 cm/h) de
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
féron est finalement élue avec le tampon ci-dessus contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol. Le rendement
<EMI ID=40.1>
<EMI ID=41.1>
plus large comprenant des fractions supplémentaires
<EMI ID=42.1>
Un/total de 120 cm<3> d'éluat de la colonne de Concanavalin A-Sepharose 4B (2,5 x 10[deg.] unités; environ 2-4 x 10[deg.] unités/mg) est appliqué directement à une
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
male au-dessous de 306 atm. Le système utilisé pour <EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
Le gradient suivant depuis le' tampon A de mise en équilibre jusqu'à un tampon B final (pyridine/acide
<EMI ID=48.1>
fractions 26 à 29 (2 x 10[deg.] unités) au centre du pic
<EMI ID=49.1>
fornique. On applique cette solution au moyen de la
<EMI ID=50.1>
octyle (4,6 x 300 mm). les conditions d'élution sont les mêmes que pour la colonne à groupes cyclohexyle ci-dessus. L'activité spécifique dans le centre du pic
<EMI ID=51.1>
production totale d'interféron de fibroblastes humains
<EMI ID=52.1>
Il y a lieu de noter que la position d'élution de l'interféron sur les colonnes tant à groupes cyclohexyle qu'à groupes octyle est très proche du pic central principal quand l'interféron purifié sur Concana-
<EMI ID=53.1>
une colonne à groupes octyle, l'interféron est élue juste avant le pic central principal, tandis qu'il est élue immédiatement après ce pic dans les mêmes conditions de chromato�raphie sur la colonne à groupes cyclohexyle.
Des échantillons d'interféron de fibroblaste humain purifié par HPLC sont passés sur des gels de
<EMI ID=54.1>
Après électrophorèse, cn obtient une seule bande par coloration au bleu de Coomassie. Un échantillon de la mène matière est passé dans un gel en parallèle et on coupe le gel en tranches pour des déterminations anti-
<EMI ID=55.1>
avec le centre de la bande colorée. On détermine une masse moléculaire d'environ 20 500 en utilisant de l'albumine de sérum bovin, de la chymotrypsine, du cytochrome C et de la ribonucléase comme étalons. La mobilité relative de l'interféron de fibroblastes humains est la même qu'il y ait du mercaptoéthanol dans l'échantillon ou qu'il n'y en ait pas.
Exemple 2
Préparation de la résine Blue Dextran-Sepharose 4B
50 grammes de Sepharose 4B dans un état tassé sont lavés avec 1 litre d'eau et recis en suspension
<EMI ID=56.1>
bromure de cyanogène finement divisé à la solution agitée lentement et le pH est immédiatement réglé et maintenu à 11 � 0,2 par addition goutte à goutte de
<EMI ID=57.1>
de petites additions de glace pilée. Quand la réaction se calme (15-20 min) on ajoute environ 1 volume d'eau glacée, on transfère la solution dans un entonnoir de Buchner et on la lave de nuaveau avec 5 volumes de 0,C1N HC1.
La résine activée est immédiatement mise en
<EMI ID=58.1>
et on la fait tourner toute une nuit dans un ballon à fond rond. On lave ensuite la résine avec 10 volumes
<EMI ID=59.1> <EMI ID=60.1>
nouveaux lavages avec 3 volumes de solution aqueuse à
80 % d'éthylène-glycol contenant 1M NaCl et ensuite
<EMI ID=61.1>
<EMI ID=62.1>
ti on.
<EMI ID=63.1>
On mélange 1,5 litre d'interféron de fibro-
<EMI ID=64.1>
activité spécifique 2 x 104 unités/mg protéine) avec 0,27 volume de solution saturée de NaCl (environ 6,3M).
<EMI ID=65.1>
Dextran-Sepharose tassés dans une colonne de poly-
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
NaCl contenant du phosphate de sodium 0,C5M (pH 7,2)
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1> <EMI ID=74.1> élué de la colonne de Blue Dextran-Sepharose 4B
<EMI ID=75.1>
col. Immédiatement après l'application de l'échantillon, on refoule sur la colonne du tampon A (pyridine/acide
<EMI ID=76.1>
que l'activité d'interféron coïncide essentiellement avec un seul pic de protéine présent dans les fractions
<EMI ID=77.1>
(B) Quand on applique à la même colonne environ un quart de la charge de l'essai (A) ci-dessus et on utilise les conditions d'élution utilisées pour la colonne à groupes cyclohexyle dans l'exemple 1, on trouve que l'activité d'interféron coïncide avec un pic de protéine présent dans les fractions 24 à 26.
(C) En utilisant la même charge, le même programme échelonné et la même vitesse linéaire d'écoulement que dans (A) et en utilisant les tampons A et B <EMI ID=78.1>
de Chromagabond à groupes octyle, ce qui donne donc environ 1/9ème de la charge par volume de colonne, on obtient une meilleure qualité de la séparation.
<EMI ID=79.1>
lonne à groupes cyanopropyle en utilisant un système pyridine/acide formique/eau (8:8:84, v/v) et un gra-
<EMI ID=80.1>
cm�/min, pour donner un pic principal symétrique.
<EMI ID=81.1>
L'électrophorèse effectuée comme décrit dans l'exemple 1 avec des échantillons des produits des opérations (A), (B) et CC) ci-dessus présente comme bande
<EMI ID=82.1> coupés en tranches et soumis à la détermination, coincide avec le centre du pic d'activité. La bande la plus
<EMI ID=83.1>
comme estimé d'après l'intensité de coloration) varie d'un échantillon à un. autre et n'a pas d'activité antivirale. Si les échantillons ne sont pas traités au
<EMI ID=84.1>
qui ne sont pas distinguables, tandis que l'analyse de
<EMI ID=85.1>
L'électrophorèse d'un échantillon obtenu en
(D) ci-dessus donne une seule bande qui a une masse <EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
ce peptide homogène effectuée sur un hydrolysat de
<EMI ID=88.1>
tats suivants par rapport à la leucine prise arbitrairement comme 25,0 :
<EMI ID=89.1>
* valeur non corrigée
<EMI ID=90.1>
(a) Cinq litres du liquide surnageant d'une culture contenant 19 400 unités/cm� d'interféron de <EMI ID=91.1>
et ensuite appliqués à une colonne contenant un volume
<EMI ID=92.1>
le liquide surnageant à 1,25� NaCl par l'addition de <EMI ID=93.1>
Environ 4-6 % de l'interféron passe à travers la colonne dans la fraction passant directement qui n'est pas retenue par la colonne.
(b) Cn lave ensuita la colonne avec 1300 car d'une solution aqueuse contenant 15 % (v/v) d'éthylène- <EMI ID=94.1>
appliqué à la colonne est élue.
(c) On élue ensuite l'interféron avec une solution aqueuse contenant 50% (v/v) d'éthylène-glycol, <EMI ID=95.1>
bit de 420 cm<3>/h. Peu d'interféron est élue avec les
<EMI ID=96.1>
l'interféron appliqué à la colonne est éluée avec les
<EMI ID=97.1>
bleau suivant :
<EMI ID=98.1>
Le rendement total en interféron recueilli
<EMI ID=99.1>
riabilité de la détermination).
"
<EMI ID=100.1> <EMI ID=101.1>
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
silice à groupes octyle liés à un débit de 4 cm�/min.
<EMI ID=104.1>
n-butanol/eau, 8/8/20/2,5/61,5, v/v) est refoulé à travers la colonne à un débit de 2 cm<3>/min pendant
12 minutes. Ensuite, on applique un gradient d'élution comme suit pour arriver au tampon B (pyridine/acide
<EMI ID=105.1>
à un débit de 1,25 cm<3>/min . 0-20 % B, 18 minutes;
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
L'activité d'interféron sort dans la région isocratique du gradient et est éluée en même temps qu'un pic détecté avec un système de contrôle à la
<EMI ID=108.1>
ron (rendement 35 %) et une activité spécifique de
2 x 108 unités/mg est obtenue pour l'ensemble (50 cm<3>). Après deux mois de stockage à -20[deg.]C dans des flacons de polypropylène bouchés, l'activité tombe à 10 % de la valeur après l'étape HPLC. Il n'y a pas du tout de protéine perdue.
Le total des 50 en* provenant de la colonne de
<EMI ID=109.1>
unités/mg) est mélangé avec 1 cm<3> de thiodiglycol et
20 cm<3> de n-propanol. On trouve un total de 4.26 x 106 unités dans la détermination pour ce mélange. Cn y
<EMI ID=110.1>
libre avec un mélange de pyridine/acide formique/eau
(8:8:84, v/v, tampon A), à un débit de 1,5 cm'/h pendant 30 minutes. On applique le gradient suivant pour passer au tampon B, pyridine/acide formique/n-propanol/eau
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
féron émerge en même temps que le seul pic observé. On recueille 4,2 x 106 unités (82 %) en trois fractions de 1 cm' .
L'ensemble ci-dessus représentant 69 % de la protéine totale appliquée sur la première colonne à
<EMI ID=113.1>
0,1 % et le mélange est refoulé sur la même colonne à groupes cyano qu'utilisée ci-dessus. On applique le même gradient que ci-dessus avec une durée totale réduite de moitié. Toute l'activité (11,75 x 10[deg.] unités;
<EMI ID=114.1>
seul pic.
Le volume total de liquide contenant l'activité d'interféron provenant de la deuxième colonne à
<EMI ID=115.1>
4,6 x 250 mm de matrice de silice à groupes diphényle liés, soumise au préalable à un gradient linéaire de 2 heures du tampon A au tampon B (même tampons que pour la colonne à groupes cyano) et mise en équilibre avec le tampon A, à un débit de 1,5 cm<3>/min.
On effectue l' élution à gradient suivante à
<EMI ID=116.1>
Le deuxième pic, qui est élue tandis que l'instrument du gradient indique 33 % de tampon B, coïncide avec la courbe d'activité d'interféron. Un total de 2, 6 x 106
<EMI ID=117.1>
pic.
La colonne de matrice de silice à groupes diphényle liés est préparée comme suit :
Un support de silice (10/u, pores de 10 nm) est trempé dans 6N HCl (1C:1, volume/poids) pendant 24 heures tandis qu'on secoue de temps à autre. On lave le support sur un filtre en verre fritte d'abord avec de l'eau jusqu'à ce que l'eau de lavage soit neutre
et ensuite on le lave à l'acétone et au méthanol pour éliminer l'eau. Après séchage sous vide toute une nuit, le support (10 g) est chauffé au reflux dans du toluène
<EMI ID=118.1>
silane pendant 6 heures. Le support lié est séparé de la solution au toluène au moyen d'un filtre en verre
<EMI ID=119.1>
support lié est traité dans un extracteur Soxhlet suc-
<EMI ID=120.1>
méthanol pendant 8 heures chaque fois et est traité en-
<EMI ID=121.1>
opératoires que décrit ci-dessus.
Le support lié est tassé dans des colonnes en acier inoxydable de 4,6 x 250 mm à 340 atm en utilisant un mélange de chloroforme (10,7 cm<3>) et de n-butanol
<EMI ID=122.1>
colonnes sont: ensuite lavées à l'éthanol (75 cet).
Un échantillon de la fraction centrale du pic d'interféron résultant est analysé en ce qui concerne la composition des amino-acides dans diverses conditions d'hydrolyse. Les résultats sont résumés ci-après:
<EMI ID=123.1>
tubes en verre sous vide lavés à l'acide. On a soustrait les résultats obtenus dans les essais à blanc avec le tampon et HCl .
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
* valeurs non corrigées
** valeur arbitraire
n. d. pas déterminé
<EMI ID=126.1>
utilisant l'éluant provenant de la fraction du pic central de la colonne à groupes diphényle indique que l'interféron de fibroblastes contient environ 3 rési-
<EMI ID=127.1>
ni de mannosamine.
La détermination des groupes terminaux est effectuée avec un échantillon de 90 pmoles de la fraction centrale du pic d'interféron de fibroblaste de
i la colonne à groupes diphényle et entraîne la détec-
<EMI ID=128.1>
Des échantillons de 150 pmoles chacun d'interféron de fibroblastes et d'interféron de leucocytes sont soumis à une digestion tryptique. On chromatographie les produits de digestion et on ne trouve aucun fragment de peptide commun aux deux interférons. La détermination de séquence d'une quantité de 1,25 nmole
<EMI ID=129.1>
naison du côté azote et confirme aussi la séquence 3-10
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
<EMI ID=134.1>
Exemple 4
On prépare de l'interféron brut à partir de fibroblastes humains (ligne de cellules GM 2504A). La matière brute est mise à la concentration 1M dans du chlorure de sodium par addition d'une solution saturée de chlorure de sodium. Ou fait passer cette matière à travers une colonne de Blue Sepharose-4B
<EMI ID=135.1>
<EMI ID=136.1>
le chargement. Après le chargement, on lave la colonne avec 250 CET* de la solution suivante (2,5 cm�/min) .
<EMI ID=137.1>
Résultats de détermination typiques :
<EMI ID=138.1>
10 % d'activité dans le liquide du lavage à 30 % 85 % d'activité dans le liquide du lavage à 5C %
Les fractions du pic de la prenière colonne de Blue Sepharose sont combinées et diluées à 10 % d'éthylène-glycol avec la solution suivante :
<EMI ID=139.1>
On charge cette matière sur une colonne de
<EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
7,2) et 30 % d'éthylène-glycol et on l'élue avec une
<EMI ID=143.1>
Résultats de déterminations typiques :
10 % d'activité dans le liquide sortant directement
<EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
HPLU
Echantillon : Le premier échantillon utilisé est la fraction à 50 % d'éthylène-glycol provenant de la colonne de Blue Sepharose. Les autres échantillons sont des échantillons ayant passé deux fois à travers la colonne de Blue Sepharose, auquel cas on a pu utiliser l'interféron dans le liquide à 30 % ou dans ce-
<EMI ID=146.1>
<EMI ID=147.1>
Lichrosorb RP-8. On lave la colonne d'abord avec de
<EMI ID=148.1>
colonne de Blue Sepharose. On utilise avant la pompe
<EMI ID=149.1>
colonne de HPLC un débit de 22 cm<3>/h avec le gradient échelonné suivant de n-propanol, à un pH constant de
<EMI ID=150.1>
pyridine.
<EMI ID=151.1>
On lave ensuite la colonne avec 60 % de n-propanol et on la remet en équilibre avec 0 % pour l'essai suivant.
L'interféron est élué à la fin de l'étape à
32 % (entre 80 et 90 minutes). Cette matière est homogène, comme déterminé par électrophorèse sur gel
<EMI ID=152.1>
Blue ou en marquant préalablement l'échantillon avec Fluram.
On effectue des analyses des amino-acides
<EMI ID=153.1>
sur neuf échantillons séparés comprenant quatre préparations séparées. La composition moyenne des aminoacides est indiquée ci-après avec les valeurs par rapport à la leucine prise arbitrairement comme 22,0. Les résultats sont les suivants :
<EMI ID=154.1>
valeur non corrigée
D'après les divers échantillons préparés par des procédés différents et analysés à différents moments confie décrit ci-dessus dans le présent exemple et dans les exemples précédents, une analyse représen-
<EMI ID=155.1>
fibroblastes homogène en utilisant un hydrolysat de
24 heures dans 6N HCl avec 0,2 % d'acide thioglycolique est la suivante :
<EMI ID=156.1>
* valeur non corrigée
** valeur arbitraire
<EMI ID=157.1>
Forme de dosage uarentérale avec l'interféron de fibroblastes humains
On dissout un total de 1,5 mg d'interféron de fibroblastes humains homogène ayant une activité spéci-
<EMI ID=158.1>
<EMI ID=159.1>
travers un filtre bactériologique et ensuite subdivisée
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
ministration parentérale. Les flacons sont de préférence conservés à froid (-2C[deg.]C) avant utilisation.
- REVENDICATIONS -
1 - Interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène caractérisé par
(a) une activité spécifique d'environ 4 x 10 unités/mg;
(b) une masse moléculaire apparente d'environ <EMI ID=162.1>
dodécylsulfate de sodium;
(c) la composition suivante en amino-acides <EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
valeur non corrigée
** valeur arbitraire
(d) la séquence partielle suivante d'amino- <EMI ID=166.1> lécule.
2 - Interféron de fibroblastes humains tel
INTERFERON OF HUMAN FIBROBLASTS
IN THE FORM OF A HOMOGENEOUS PROTEIN;
AND ITS PREPARATION
The present invention relates to human fibroblast interferon in the form of a homogeneous protein and a process for its production by combining affinity chromatography and chromatography
in high pressure liquid phase (HPLC).
Since its initial discovery by Isaacs and
<EMI ID = 1.1>
form of leukocytes or fibroblasts, resisted the attempts of researchers in institutions throughout the world, over two decades, with a view to its isolation in the form of a homogeneous peptide
<EMI ID = 2.1>
sation and identification of its particular biological and chemical properties. Although several authors claim to have purified interferons from mice or humans in a homogeneous state, they have given none of the classical proofs of homogeneity of protein materials and have neither described any of the properties of the pure compounds which they claim to have obtained.
The use of high performance liquid chromatography for the purification of proteins is generally known in the art. The references specifically describe columns of the ion exchange and size exclusion types in protein purification (eg Régnier and Noël, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976J and Chang et al., Anal. Biochem. 48, 1839
[1976] and the use of Lichrosorb RP-18 (column of silica microparticles linked to octadecyl groups) in reverse phase partition chromatography has been used effectively to purify peptides such as (3-endorphin (Rubinstein and others, <EMI ID = 3.1> It is known in the art to use <EMI ID = 4.1> the purification of the interferer: of human fibroblasts. Thus, Davey et al., J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), describe the use of affinity chromatography <EMI ID = 5.1> <EMI ID = 6.1> <EMI ID = 7.1> same purpose a Blue Dextran-Sepharose system. USA
N [deg.] 4,172,071 (from Maeyer and others), the purification of various crude solutions of interferon of leukocytes and fibroblasts is carried out by affinity chromatography on a Blue Dextran-Sepharose column giving preparations which have a specific activity between 1 and 5 x 108 International Units of interferon. No additional purification step is described and the interferon prerarations obtained are indicated as having a high content of products having an activity of the interferon type, stripped to a major extent of the polluting proteins. <EMI ID = 8.1> vention uses a combination of affinity chromatography and high pressure liquid chromatography to perform efficient purification of human fibroblast interferon.
More particularly, the method according to the present invention comprises the following steps in combination: A. An aqueous interferon solution of human fibroblasts is passed in an impure state through an affinity chromatography column in order to adsorb the interferon on the column, and then the interferon is eluted from the column and interferon is obtained in selected fractions of the eluate in a state of increased purity; and B.
The selected interferon fractions obtained in step A are passed through one or more columns of silica matrix linked to hydrocarbon groups balanced by a buffer under high pressure liquid chromatography conditions, the groups of hydrocarbon being chosen from cyclohexyl, phenyl, diphenyl, octyl, octadecyl and cyanopropyl groups, so as to absorb the interferon on the column, and then the interferon is eluted from this column by means of a gradient of a aqueous acid mixture buffered with miscible solvents <EMI ID = 9.1> forms a single distinct peak in selected fractions of the eluate as a homogeneous protein.
In the affinity chromatography operation according to the present invention, it is possible to use a <EMI ID = 10.1> Sepharbse, the use of the latter being preferred because of the fact that substantially greater yields are obtained with it high than with the Concanavalin A-Sepharose 4B system and a more stable product is also obtained. With the Concanavalin A-Sepharose 4B system, the following procedure can be used:
(a) 20 to 30 column volumes of human fibroblast interferon (specific activity approximately
10 units / mg) in Eagle's minimum essential medium containing 5% fetal calf serum are discharged onto a column of Concanavalin A-Sepharose 4B at a flow rate of 30 to 60 cm / h; <EMI ID = 11.1> phosphate (PBS), pH 7.2;
(c) washed with PBS-0.1M a-methyl mannoside <EMI ID = 12.1> <EMI ID = 13.1> of ethylene glycol.
The resulting purified interferon obtained after step (d) has a specific activity of approximately
<EMI ID = 14.1>
Ron.
A suitable procedure for using Blue Dextran-Sepharose in the affinity chromatography step is as follows:
(a) 10 to 40 column volumes of the supernatant liquid - <EMI ID = 15.1>
saturated NaCl solution and then pumped back onto the column at a linear flow rate of
20-40 cm / h;
(b) the column is washed with 5-15 volumes of co- <EMI ID = 16.1> phosphate containing 50% (v / v) of ethylene glycol (pH 7.2).
<EMI ID = 17.1>
about 3 x 10 [deg.] units / mg and can be obtained
<EMI ID = 18.1>
Blue Dextran-Sephar � used in the above affinity chromatography step can be conveniently prepared by copulation of Blue Dextran
(coupling product of Cibacron Blue F3GA and Dextran) with a Sepharose 4B activated by bromide
<EMI ID = 19.1>
The above coupling operation, as well as the washing and aging of the resin, the procedure for loading the column and for the elution are important for obtaining the maximum yield and the highest degree of purity. of the interferon product of human fibroblasts.
In cases where the interferon sample is collected from a serum-free medium, the purification to a homogeneous state is carried out by a single or two passages through a column of Blue Sepharose-4B eluting with a solution aqueous buffered to 30 - 0% (v / v) ethylene glycol (pH 7.2).
To obtain additional purification of the interferon produced in the affinity chromatography step, the interferon is treated by one or more high pressure liquid phase chromatography steps with high resolution and high yield on a preparation scale. . The liquid chromatography operation uses columns containing a porous silica matrix to which cyclohexyl, octyl, octadecyl, phenyl, diphenyl or cyanopropyl groups are linked. These columns, which can be used successively
and under variable conditions of pH and gradient of organic solvent, can purify interferon
of human fibroblasts to a homogeneous state as determined by obtaining a single band during electrophoresis on polyacrylamide gel with dodecyl-
<EMI ID = 20.1>
constant and a single peak in HPLC with overlapping protein activity and levels.
Columns of totally porous silica microparticles, irregular in shape (particle size approximately 10 microns and pore size
o
ie approximately 1CO A) having cyclohexyl groups, oc-
<EMI ID = 21.1> sées in the implementation of the invention are articles of commerce.
A convenient high pressure liquid chromatography system usable in the columns indicated above is described in the US Pat.
<EMI ID = 22.1>
In carrying out the present process, the interferon solution of human fibroblasts purified by affinity chromatography in an aqueous buffer of pH 4-8 is passed through a column of silica matrix. A preferred buffer for the purposes of the present invention is a pyridine / formic acid / water buffer (8: 8: 84, v / v). Usually, we implement
the process under pressure, preferably a pressure between about 3.4 and about 540 atm. Interferon is absorbed on the column and then eluted selectively using a gradient of an aqueous buffer plus varying amounts of a water-miscible solvent. Water-miscible solvents which can be used for this purpose are, for example, alka-
<EMI ID = 23.1>
tert-butanol, ethanol, methanol, etc. Particularly preferred for the elution of interferon from human fibroblasts is a mixture of propanol and butanol.
The eluate is split up into
<EMI ID = 24.1>
in itself known with concomitant control of the protein content of each fraction by peptide controllers operating with high sensitivity. A system usable for this purpose is described
<EMI ID = 25.1>
Note also the US patent. n [deg.] 3,876,881.
The choice of particular types of resins to be used in the high pressure liquid chromatography steps depends on the source and purity of the human fibroblast interferon starting material used for this step. So the material produced by affinity chromatography
on a column of Concanavalin A-Sepharose is conveniently purified to a homogeneous state using high pressure liquid chromatography on a column of silica with linked cyclohexyl groups
and then on a column of silica with linked octyl groups. Furthermore, when a Blue Dextran column is used in the affinity chromatography step, the purification in a homogeneous state can be carried out by one or more passages through a column of silica with bound octyl groups or, alternatively, by passage through the silica column with bonded octyl groups followed by passage through a column of silica with bonded cyanopropyl groups and then, if necessary,
through a column of silica with linked diphenyl groups. When using a Blue Sepharose-4B column and a serum-free preparation, a single pass through a column of silica with bound octyl groups will give a homogeneous preparation.
Due to the sensitivity of the interferon activity of human fibroblasts in the presence of organic solvents, for example in the presence of propanols, butanol or 2-methoxy-ethanol at a neutral pH,
<EMI ID = 26.1>
human fibroblast interferon is more hydrophobic in nature than leukocyte interferon and as there are other more hydrophobic proteins present in preparations of partial fibroblast interferon-
<EMI ID = 27.1>
and butanol is the preferred solvent for eluting the reverse phase columns, rather than n-propanol. The use of such a solvent serves to bind the concentration of organic solvent necessary for the complete elution of all the proteins absorbed and thus reduces the artificial products forming at a high charge due to the higher solubility. low protein.
The interferon of human fibroblasts obtained in a homogeneous state according to the present invention is derived from a single peak in the last column of high performance liquid chromatography and gives a single narrow band during electrophoresis on NaDodSO4 polyacrylamide gel. in the presence of 2-mercaptoethanol. The extraction of the gel gives a single peak of antiviral activity coinciding with the
<EMI ID = 28.1>
carries what conventional antiviral determination for the interferon activity of human fibroblasts.
The molecular mass of homogeneous human fibroblast interferon as determined by the polyamide gel method was approximately 20,500. The specific activity of this purified material was
<EMI ID = 29.1>
the nitrogen end obtained from a homogeneous human fibroblast interferon sample was
<EMI ID = 30.1>
Interferons have exhibited antiviral, anti-tumor, growth inhibition and immunosuppressive activity. These activities were obtained
<EMI ID = 31.1>
per day with relatively crude preparations,
<EMI ID = 32.1>
Homogeneous purified human fibroblast feron according to the present invention can be used in the same way as the crude preparations used previously with adjustment of the doses so as to give the desired equivalent level of interferon units.
The process and product aspects of the present invention are further illustrated by reference to the following examples. All interferon titles are
<EMI ID = 33.1>
per mg compared to a reference standard for human leukocyte interferon (G023-901-527) supplied by The National Institutes of Health of the U.S.A.
Example 1
<EMI ID = 34.1>
<EMI ID = 35.1>
fitted with a sintered polyethylene disc, we introduce
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
It is charged at a rate of 180 cm / h (35.5 cm / h) of
<EMI ID = 38.1>
<EMI ID = 39.1>
feron is finally eluted with the above buffer containing 50% (v / v) of ethylene glycol. The yield
<EMI ID = 40.1>
<EMI ID = 41.1>
wider including additional fractions
<EMI ID = 42.1>
A / total of 120 cm <3> of eluate from the Concanavalin A-Sepharose 4B column (2.5 x 10 [deg.] Units; approx. 2-4 x 10 [deg.] Units / mg) is applied directly to one
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
male below 306 atm. The system used for <EMI ID = 46.1>
<EMI ID = 47.1>
The next gradient from buffer A for equilibration to final buffer B (pyridine / acid
<EMI ID = 48.1>
fractions 26 to 29 (2 x 10 [deg.] units) at the center of the peak
<EMI ID = 49.1>
fornicates. We apply this solution using the
<EMI ID = 50.1>
octyl (4.6 x 300 mm). the elution conditions are the same as for the column with cyclohexyl groups above. Specific activity in the center of the peak
<EMI ID = 51.1>
total interferon production of human fibroblasts
<EMI ID = 52.1>
It should be noted that the elution position of the interferon on the columns with both cyclohexyl groups and octyl groups is very close to the main central peak when the interferon purified on Concana-
<EMI ID = 53.1>
a column with octyl groups, the interferon is eluted just before the main central peak, while it is eluted immediately after this peak under the same conditions of chromato-raphie on the column with cyclohexyl groups.
Human fibroblast interferon samples purified by HPLC are run on
<EMI ID = 54.1>
After electrophoresis, a single strip is obtained by staining with Coomassie blue. A sample of the lead material is passed through a gel in parallel and the gel is cut into slices for anti-determination.
<EMI ID = 55.1>
with the center of the colored strip. A molecular weight of about 20,500 is determined using bovine serum albumin, chymotrypsin, cytochrome C and ribonuclease as standards. The relative mobility of human fibroblast interferon is the same whether there is mercaptoethanol in the sample or there is none.
Example 2
Preparation of Blue Dextran-Sepharose 4B resin
50 grams of Sepharose 4B in a packed state are washed with 1 liter of water and re-suspended
<EMI ID = 56.1>
finely divided cyanogen bromide in the slowly stirred solution and the pH is immediately adjusted and kept at 11 # 0.2 by dropwise addition of
<EMI ID = 57.1>
small additions of crushed ice. When the reaction calms down (15-20 min), about 1 volume of ice water is added, the solution is transferred to a Buchner funnel and washed with new water with 5 volumes of 0, C1N HCl.
The activated resin is immediately set
<EMI ID = 58.1>
and spin it overnight in a round bottom flask. The resin is then washed with 10 volumes
<EMI ID = 59.1> <EMI ID = 60.1>
new washes with 3 volumes of aqueous solution to
80% ethylene glycol containing 1M NaCl and then
<EMI ID = 61.1>
<EMI ID = 62.1>
ti on.
<EMI ID = 63.1>
1.5 liters of fibro interferon are mixed
<EMI ID = 64.1>
specific activity 2 x 104 units / mg protein) with 0.27 volume of saturated NaCl solution (approximately 6.3M).
<EMI ID = 65.1>
Dextran-Sepharose packed in a poly column
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
<EMI ID = 70.1>
NaCl containing sodium phosphate 0, C5M (pH 7.2)
<EMI ID = 71.1>
<EMI ID = 72.1>
<EMI ID = 73.1> <EMI ID = 74.1> eluted from the Blue Dextran-Sepharose 4B column
<EMI ID = 75.1>
collar. Immediately after application of the sample, the column A is discharged onto the buffer (pyridine / acid
<EMI ID = 76.1>
that the interferon activity essentially coincides with a single protein peak present in the fractions
<EMI ID = 77.1>
(B) When one applies to the same column about a quarter of the load of test (A) above and the elution conditions used for the column with cyclohexyl groups in example 1 are used, it is found that the interferon activity coincides with a protein peak present in fractions 24 to 26.
(C) Using the same load, the same stepped program and the same linear flow velocity as in (A) and using buffers A and B <EMI ID = 78.1>
of Chromagabond with octyl groups, which therefore gives approximately 1 / 9th of the charge per column volume, a better quality of separation is obtained.
<EMI ID = 79.1>
lone to cyanopropyl groups using a pyridine / formic acid / water system (8: 8: 84, v / v) and a gra-
<EMI ID = 80.1>
cm � / min, to give a symmetrical main peak.
<EMI ID = 81.1>
The electrophoresis carried out as described in Example 1 with samples of the products of operations (A), (B) and CC) above presented as a strip
<EMI ID = 82.1> cut into slices and subjected to determination, coincides with the center of the activity peak. The most
<EMI ID = 83.1>
as estimated from the color intensity) varies from sample to sample. other and has no antiviral activity. If the samples are not processed
<EMI ID = 84.1>
which are not distinguishable, while the analysis of
<EMI ID = 85.1>
The electrophoresis of a sample obtained in
(D) above gives a single band which has a mass <EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
this homogeneous peptide carried out on a hydrolyzate of
<EMI ID = 88.1>
following states compared to leucine taken arbitrarily as 25.0:
<EMI ID = 89.1>
* value not corrected
<EMI ID = 90.1>
(a) Five liters of the culture supernatant liquid containing 19,400 units / cm � <EMI ID = 91.1> interferon
and then applied to a column containing a volume
<EMI ID = 92.1>
the supernatant liquid at 1.25 # NaCl by adding <EMI ID = 93.1>
About 4-6% of the interferon passes through the column in the directly passing fraction which is not retained by the column.
(b) The column is then washed with 1300 because of an aqueous solution containing 15% (v / v) of ethylene- <EMI ID = 94.1>
applied to the column is elected.
(c) The interferon is then eluted with an aqueous solution containing 50% (v / v) of ethylene glycol, <EMI ID = 95.1>
bit of 420 cm <3> / h. Little interferon is eluted with
<EMI ID = 96.1>
the interferon applied to the column is eluted with the
<EMI ID = 97.1>
next bleau:
<EMI ID = 98.1>
The total yield of interferon collected
<EMI ID = 99.1>
reliability of determination).
"
<EMI ID = 100.1> <EMI ID = 101.1>
<EMI ID = 102.1>
<EMI ID = 103.1>
silica with octyl groups linked at a flow rate of 4 cm / / min.
<EMI ID = 104.1>
n-butanol / water, 8/8/20 / 2.5 / 61.5, v / v) is discharged through the column at a flow rate of 2 cm <3> / min for
12 minutes. Then, an elution gradient is applied as follows to arrive at buffer B (pyridine / acid
<EMI ID = 105.1>
at a flow rate of 1.25 cm <3> / min. 0-20% B, 18 minutes;
<EMI ID = 106.1>
<EMI ID = 107.1>
The interferon activity exits in the isocratic region of the gradient and is eluted at the same time as a peak detected with a control system at the
<EMI ID = 108.1>
ron (35% yield) and a specific activity of
2 x 108 units / mg is obtained for the whole (50 cm <3>). After two months of storage at -20 ° C. in capped polypropylene bottles, the activity drops to 10% of the value after the HPLC step. There is no protein lost at all.
The total of 50 in * from the column of
<EMI ID = 109.1>
units / mg) is mixed with 1 cm <3> of thiodiglycol and
20 cm <3> of n-propanol. A total of 4.26 x 106 units are found in the determination for this mixture. Cn y
<EMI ID = 110.1>
free with a mixture of pyridine / formic acid / water
(8: 8: 84, v / v, buffer A), at a flow rate of 1.5 cm '/ h for 30 minutes. The following gradient is applied to switch to buffer B, pyridine / formic acid / n-propanol / water
<EMI ID = 111.1>
<EMI ID = 112.1>
Feron emerges at the same time as the only peak observed. 4.2 x 106 units (82%) are collected in three 1 cm 'fractions.
The above set representing 69% of the total protein applied to the first column to
<EMI ID = 113.1>
0.1% and the mixture is discharged onto the same column with cyano groups as used above. The same gradient is applied as above with a total duration reduced by half. All activity (11.75 x 10 [deg.] Units;
<EMI ID = 114.1>
single peak.
The total volume of liquid containing interferon activity from the second column to
<EMI ID = 115.1>
4.6 x 250 mm of silica matrix with linked diphenyl groups, subjected beforehand to a linear gradient of 2 hours from buffer A to buffer B (same buffers as for the column with cyano groups) and equilibrated with buffer A , at a flow rate of 1.5 cm <3> / min.
The following gradient elution is carried out at
<EMI ID = 116.1>
The second peak, which is eluted while the gradient instrument indicates 33% buffer B, coincides with the interferon activity curve. A total of 2.6 x 106
<EMI ID = 117.1>
peak.
The silica matrix column with linked diphenyl groups is prepared as follows:
A silica support (10 / u, 10 nm pores) is soaked in 6N HCl (1C: 1, volume / weight) for 24 hours while shaking from time to time. The support is washed on a sintered glass filter first with water until the washing water is neutral
and then washed with acetone and methanol to remove the water. After drying under vacuum overnight, the support (10 g) is heated to reflux in toluene
<EMI ID = 118.1>
silane for 6 hours. The bonded support is separated from the toluene solution by means of a glass filter
<EMI ID = 119.1>
bonded support is treated in a Soxhlet extractor suc-
<EMI ID = 120.1>
methanol for 8 hours each time and is treated
<EMI ID = 121.1>
as described above.
The bonded support is packed in 4.6 x 250 mm stainless steel columns at 340 atm using a mixture of chloroform (10.7 cm <3>) and n-butanol
<EMI ID = 122.1>
columns are: then washed with ethanol (75 cc).
A sample of the central fraction of the resulting interferon peak is analyzed for the composition of amino acids under various hydrolysis conditions. The results are summarized below:
<EMI ID = 123.1>
acid-washed vacuum glass tubes. The results obtained in the blank tests were subtracted with the buffer and HCl.
<EMI ID = 124.1>
<EMI ID = 125.1>
* values not corrected
** arbitrary value
not. d. not determined
<EMI ID = 126.1>
using the eluent from the central peak fraction of the diphenyl group column indicates that the fibroblast interferon contains about 3 residues
<EMI ID = 127.1>
nor mannosamine.
The determination of the terminal groups is carried out with a sample of 90 pmoles of the central fraction of the fibroblast interferon peak of
i the diphenyl group column and detects
<EMI ID = 128.1>
Samples of 150 pmol each of fibroblast interferon and leukocyte interferon are subjected to tryptic digestion. The digestion products are chromatographed and no fragment of peptide common to the two interferons is found. 1.25 nmole sequence determination
<EMI ID = 129.1>
nitrogen side and also confirms the 3-10 sequence
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1>
<EMI ID = 132.1>
<EMI ID = 133.1>
<EMI ID = 134.1>
Example 4
Crude interferon is prepared from human fibroblasts (GM cell line 2504A). The raw material is brought to a concentration of 1M in sodium chloride by adding a saturated solution of sodium chloride. Or pass this material through a column of Blue Sepharose-4B
<EMI ID = 135.1>
<EMI ID = 136.1>
the loading. After loading, the column is washed with 250 CET * of the following solution (2.5 cm / min).
<EMI ID = 137.1>
Typical determination results:
<EMI ID = 138.1>
10% activity in washing liquid at 30% 85% activity in washing liquid at 5C%
The fractions of the peak of the first column of Blue Sepharose are combined and diluted to 10% ethylene glycol with the following solution:
<EMI ID = 139.1>
We load this material on a column of
<EMI ID = 140.1>
<EMI ID = 141.1>
<EMI ID = 142.1>
7.2) and 30% ethylene glycol and eluted with a
<EMI ID = 143.1>
Typical determination results:
10% activity in the liquid leaving directly
<EMI ID = 144.1>
<EMI ID = 145.1>
HPLU
Sample: The first sample used is the 50% ethylene glycol fraction from the Blue Sepharose column. The other samples are samples that passed twice through the Blue Sepharose column, in which case it was possible to use interferon in the 30% liquid or in this
<EMI ID = 146.1>
<EMI ID = 147.1>
Lichrosorb RP-8. The column is washed first with
<EMI ID = 148.1>
Blue Sepharose column. We use before the pump
<EMI ID = 149.1>
HPLC column a flow rate of 22 cm <3> / h with the following graded gradient of n-propanol, at a constant pH of
<EMI ID = 150.1>
pyridine.
<EMI ID = 151.1>
The column is then washed with 60% n-propanol and returned to equilibrium with 0% for the following test.
Interferon is eluted at the end of the step at
32% (between 80 and 90 minutes). This material is homogeneous, as determined by gel electrophoresis
<EMI ID = 152.1>
Blue or by marking the sample beforehand with Fluram.
Amino acid analyzes are performed
<EMI ID = 153.1>
on nine separate samples comprising four separate preparations. The average composition of the amino acids is indicated below with the values relative to the leucine taken arbitrarily as 22.0. The results are as follows:
<EMI ID = 154.1>
uncorrected value
From the various samples prepared by different methods and analyzed at different times described above described in this example and in the previous examples, an analysis represents
<EMI ID = 155.1>
homogeneous fibroblasts using a hydrolyzate of
24 hours in 6N HCl with 0.2% thioglycolic acid is as follows:
<EMI ID = 156.1>
* value not corrected
** arbitrary value
<EMI ID = 157.1>
Oral dosage form with human fibroblast interferon
A total of 1.5 mg of homogeneous human fibroblast interferon with specific activity is dissolved.
<EMI ID = 158.1>
<EMI ID = 159.1>
through a bacteriological filter and then subdivided
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
parenteral administration. The bottles are preferably kept cold (-2C [deg.] C) before use.
- CLAIMS -
1 - Interferon of human fibroblasts in the form of a homogeneous protein characterized by
(a) a specific activity of approximately 4 x 10 units / mg;
(b) an apparent molecular mass of approximately <EMI ID = 162.1>
sodium dodecyl sulfate;
(c) the following amino acid composition <EMI ID = 163.1>
<EMI ID = 164.1>
<EMI ID = 165.1>
uncorrected value
** arbitrary value
(d) the following partial sequence of amino- <EMI ID = 166.1> molecule.
2 - Interferon from human fibroblasts such