BE1024634A1 - Compositions immunogenes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des conjugués comprenant des fragments du polysaccharide capsulaire du streptocoque du groupe B (SGB) de type III. Les fragments appropriés peuvent être produits par synthèse ou par dépolymérisation du polysaccharide natif.
Description
(30) Données de priorité :
05/04/2016 EP 16020113.3 (71) Demandeur(s) :
GSK Vaccines S.R.L. 53100, SIENA Italie (72) Invente u r(s) :
ADAMO Roberto 53100 SIENA Italie
BERTI Francesco 53100 SIENA Italie
CARBONI Filippo 53100 SIENA Italie
MARGARIT Y ROS Immaculada
53100 SIENA
Italie (54) COMPOSITIONS IMMUNOGENES (57) La présente invention concerne des conjugués comprenant des fragments du polysaccharide capsulaire du streptocoque du groupe B (SGB) de o i /4 a PI H i type III. Les fragments appropriés peuvent être P”L3ar\ Jp produits par synthèse ou par dépolymérisation du polysaccharide natif.
[C^-ß-GIcNAc f
ß-Gal t
a-ReuNAc
FIG. 1
BE2017/5163
COMPOSITIONS IMMUNOGÈNES
Domaine technique
La présente invention concerne des conjugués comprenant des fragments du polysaccharide capsulaire du streptocoque du groupe B (SGB) du sérotype III. Les conjugués comprenant les fragments confèrent des taux d'immunoprotection supérieurs à ceux déclenchés par des conjugués comprenant le polysaccharide natif. Des fragments appropriés peuvent être produits par synthèse ou par dépolymérisation du polysaccharide natif.
Contexte
Streptococcus agalactiae (également connu sous le nom de « streptocoque du groupe B » ou « SGB ») est un micro-organisme β-hémolytique, Gram positif encapsulé qui colonise le système anogénital de 25 à 30 % des femmes en bonne santé. Il représente la cause principale de la septicémie et de la méningite néonatale, particulièrement chez les nourrissons nés de mères porteuses de la bactérie. Le pathogène peut également affecter des adultes souffrant d'une maladie sousBE2017/5163 jacente, particulièrement les personnes âgées. Chez les individus sensibles, tels que les personnes âgées, les enfants et les individus immunodéprimés, la bactérie peut devenir pathogène et provoquer une maladie telle que la méningite ou la septicémie.
La capsule du SGB est un facteur de virulence majeur permettant à la bactérie d'échapper aux défenses immunitaires innées de l'être humain. Elle est constituée de polymères de masse moléculaire élevée répétitives (UR) des vaccins, antigènes Τ'constitués de multiples unités identiques de quatre à sept monosaccharides. Le SGB peut être classé en dix sérotypes (la, lb, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, et IX) différant dans la composition chimique et le profil des liaisons glycosidiques de leurs unités répétitives du polysaccharide capsulaire.
Les saccharides capsulaires du SGB sont en cours d'études pour une utilisation dans
Toutefois, les saccharides sont des indépendants et ils sont généralement faiblement immunogènes. La conjugaison à un support peut convertir les antigènes T-indépendants en antigènes T-dépendants, amplifiant de cette façon les réponses de mémoire et permettant le développement d'une immunité protectrice. Par conséquent, les vaccins saccharidiques les plus efficaces sont à base de glycoconjugués. Un grand nombre de travaux sur les vaccins à base de polysaccharides capsulaires du SGB ont été effectués par Dennis Kasper et ses collègues (voir, par exemple, les références Paoletti et al. (1990), J. Biol. Chem 265: 18278-83 ;
(1990) J Clin Invest 86: 1428-33 ;
Wessels et al
Paoletti et al.
(1992) Infect Immun 60: 400914 ; Paoletti
BE2017/5163
| et al | ., (1992) | J | Clin Invest 89: 203-9 ; | Wessels | et | al. |
| (1987 | ) Proc Natl | Acad Sei USA 84: 9170-4 | ; Wang | et | al. | |
| (2003 | ) Vaccine | 21 | : 1112-7 ; Wessels et al | . (1993) | Infect | |
| Immun | 61: 4760 | -6 | ; Wessels et al. (1995 | ) J Infect | Dis | |
| 171 : | 879-84. | |||||
| Il a été | montré que les vaccins | conj ugués | pour |
chacun des sérotypes la, lb, II, III, et V du SGB sont sans risque et immunogènes chez les êtres humains. Toutefois, il demeure un besoin de développer d'autres vaccins améliorés contre le SGB.
Résumé
Les demandeurs ont découvert que des conjugués comprenant certains fragments du polysaccharide capsulaire du streptocoque du groupe B du sérotype III peuvent déclencher des titres en anticorps supérieurs aux conjugués comprenant le polysaccharide capsulaire natif.
Ainsi, dans un premier aspect de l'invention, il est fourni un conjugué comprenant un fragment d'un polysaccharide capsulaire du SGB du sérotype III est une protéine de support dans lequel le fragment et un oligosaccharide comportant de 2 à 15 unités répétitives. En particulier, le conjugué présente un degré de glycosylation de 2 à 20. Dans un mode de réalisation, l'oligosaccharide est un oligosaccharide synthétique. Dans un autre mode de réalisation, l'oligosaccharide est préparé par dépolymérisation du PSC du SGB. En particulier, l'oligosaccharide comprend de 2 à 11 unités répétitives. De façon encore davantage particulière, l'oligosaccharide comprend de 3 à 9 unités répétitives.
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En particulier, la protéine de support est choisie dans le groupe constitué de l'anatoxine diphtérique,
CRM197 et l'anatoxine tétanique.
Dans un deuxième aspect de l'invention, il est fourni une composition comprenant le conjugué du premier aspect et un support pharmaceutiquement acceptable. En particulier, la composition est une composition immunogène. De façon encore davantage particulière, la composition est une composition vaccinale.
Dans un troisième aspect de l'invention, il est fourni un procédé de traitement d'un sujet infecté par le streptocoque du groupe B comprenant l'administration à un sujet d'un conjugué du premier aspect ou de la composition du deuxième aspect.
Dans un quatrième aspect de l'invention, il est fourni une composition du deuxième aspect pour une utilisation dans un procédé de traitement ou de prévention d'une maladie.
Brève description des figures
Figure 1 - La structure de l'unité répétitive du polysaccharide capsulaire du SGB du sérotype III (Gai = galactose, Glc = glucose, GlcNAc = N-acétylglucosamine, NeuNAc = acide N-acétylneuraminique (acide sialique).
Figure 2 - Chromatogramme de CLHP des oligosaccharides élués (polysaccharides capsulaires du SGB du sérotype III dépolymérisés (DP) ) avec une longueur de chaîne différente, où DP2 indique des oligosaccharides comportant deux unités répétitives, DP3 indique des oligosaccharides comportant 3 unités répétitives, etc.
Figure 3 - RMN ΧΗ (400 MHz, D2O) du matériau de polysaccharide capsulaire du SGB du sérotype III dépolymérisé contre le polysaccharide pleine longueur.
Figure 4A - Fournit la structure de l'unité répétitive du polysaccharide du SGB du sérotype III.
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| Figure 4B - Fournit | la | structure | du | fragment | 1 | du |
| pentasaccharide linéaire | DPI | (composé | D . | |||
| Figure 4C - Fournit | la | structure | du | fragment | 2 | du |
| pentasaccharide ramifié | DPI | (composé 2 | ) . | |||
| Figure 4D - Fournit | la | structure | du | fragment | 3 | du |
synthétique 2 synthétique 3 pentasaccharide en forme de Y DPI (composé 3).
Figure 5 - Schéma de la synthèse du fragment synthétique 1 (composé 1).
Figure 6 - Synthèse du fragment (composé 2).
Figure 7 - Synthèse du fragment (composé 3).
Figures 8A-B - Spectres MALDI TOF des oligosaccharides conjugués.
Figure 9A - Expériences ELISA par compétition montrant une capacité dépendante de la longueur des oligosaccharides à inhiber la liaison d'un Acm antiPSIII au PSIII natif.
Figure 9B - Compétition par RPS de la liaison du PSIII natif au Fab par les oligosaccharides.
Figure 10 - Titres ELISA des anti-PSIII mesurés dans des sérums de souris immunisées avec le GBS59-PSIII (5 gg) en utilisant des conjugués de CRM197 de trois fragments synthétiques en tant que réactifs de sensibilisation.
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Figures 11A-B - Titres des anti-PSIII (11A) et OPKA (11B) dans les sérums de souris immunisées avec des glycoconjugués d'oligosaccharides.
Figure 12A - Effet du rapport saccharide/protéine dans les DP 2 et 3 conjugués mesuré par un test ELISA. Le diagramme montre le calcul de la valeur P (test de Mann-Whitney). Les valeurs entre parenthèses représentent le rapport molaire saccharide/protéine (degré de glycosylation).
Figure 12B - Effet du rapport saccharide/protéine dans les DP 2 et 3 conjugués mesuré par OPKA. Les valeurs entre parenthèses représentent le rapport molaire saccharide/protéine (degré de glycosylation).
précises des des SGB des quatre à et une ou
Description détaillée
Les structures chimiques polysaccharides capsulaires (PSC) sérotypes la, lb, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX sont bien décrites dans la littérature. Elles sont composées d'unités répétitives de sept monosaccharides avec un squelette deux chaînes latérales. Une unité répétitive (UR) est la partie du polysaccharide capsulaire dont la répétition par liaison des unités répétitives ensemble successivement produit le polysaccharide complet.
Le PSC du SGB du sérotype III (également appelé ici PSIII) possède un squelette d'unités répétitives du trisaccharide [^6)-β-D-N-acétyl-glucosamine-(1^3)-ß-Dgalactose-( 1^4 )-ß-D-glucose-( 1^] . Chaque unité répétitive porte une chaîne latérale disaccharidique d'acide a-D-N-acétylneuraminique-(2^3)-ß-D-galactose,
BE2017/5163 liée en U4 par l'intermédiaire du galactose au squelette de N-acétyl-glucosamine (figure 1).
Alors que certains fragments du polysaccharide du SGB du sérotype III sont connus dans l'art, les inventeurs ont découvert une population spécifique ou un sous-ensemble de fragments présentant une immunogénicité amplifiée comparativement à d'autres fragments ou au polysaccharide capsulaire pleine longueur, par exemple.
Généralement, le terme « polysaccharide » (PS) se rapporte à un saccharide comportant d'environ 50 à environ 2000 unités répétitives ou plus. Le terme « fragment » se rapporte à une partie du polysaccharide capsulaire, particulièrement un « oligosaccharide » comportant d'environ 2 à environ 20 unités répétitives, particulièrement de 2 à 15 unités répétitives, de façon encore davantage particulière de 2 à 11 unités répétitives, 2 à 9 unités répétitives, 2 à 7 unités répétitives, de 3 à 7 unités répétitives, par exemple, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 unités répétitives. Le terme « dérivé » tel qu'utilisé ici se rapporte de façon générale à toute molécule apparentée structuralement comportant le même échafaudage que l'unité répétitive mais qui est modifiée par l'addition, la délétion ou la substitution d'un ou de plusieurs groupes fonctionnels. Par exemple, un dérivé de l'unité répétitive peut comprendre un remplacement d'un ou de plusieurs des groupes hydroxyle par un groupe fonctionnel différent ou par l'addition d'un substituant tel qu'un groupe lieur. Dans certains modes de réalisation, la réduction du groupe aldéhyde des oligosaccharides du SGB III peut être obtenue par traitement avec du NaBH4 pour produire répétitive modifiée ayant la structure une unité suivante :
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Dans d'autres répétitive modifiée modes de réalisation, a la structure suivante une unité
Préparation des oligosaccharides
Les saccharides capsulaires peuvent être purifiés par des techniques connues, telles que décrites, par exemple, dans Wessels et al. (1990) J. Clin. Invest. 86: 1428-33 et Wessels et al. (1989) Infect Immun 57: 108994. Un procédé type implique une extraction par une base, une centrifugation, une filtration, un traitement à la RNase/DNase, un traitement aux protéases, une concentration, une chromatographie d'exclusion, une ultrafiltration, une chromatographie d'échange d'anions, et une autre ultrafiltration. Le traitement des cellules
BE2017/5163 de SGB avec l'enzyme mutanolysine, qui clive la paroi de la cellule bactérienne pour libérer les composants de la paroi bactérienne, est également utile. Comme variante, le procédé de purification décrit dans le document WO 2006/082527 peut être utilisé. Celui-ci implique une extraction par une base, un traitement à 1 'éthanol/CaCl2, une précipitation au CTAB, et une resolubilisation. Une autre variante de procédé est décrite dans le document WO 2009/081276.
Les oligosaccharides de l'invention sont plus courts que le polysaccharide capsulaire natif, et ils peuvent être chimiquement modifiés. Les polysaccharides pleine longueur peuvent être dépolymérisés pour donner des fragments plus courts pour une utilisation avec l'invention, par exemple, par hydrolyse dans un acide doux, par chauffage, par chromatographie d'exclusion, etc. En particulier, le polysaccharide capsulaire du sérotype III utilisé dans l'invention peut être dépolymérisé comme il est décrit dans Michon et al. (2006) Clin. Vaccine Immunol. Août 2006; 13(8): 936-43. Ce document décrit la dépolymérisation partielle des saccharides capsulaires du sérotype III par clivage avec désamination douce en fragments antigéniques comportant des résidus 2,5-anhydro-D-mannose terminaux réducteurs. En bref, le saccharide capsulaire est dissous dans du NaOH 0,5 N et chauffé à 70 °C pendant une période située entre 1 et 4 h. La longueur de cette incubation contrôle le degré de dépolymérisation, qui peut être déterminé par des procédés classiques (par exemple, par CLHP comme il est décrit dans le document WO 96/40795) . L'échantillon est placé dans un bain de glace-eau avant
BE2017/5163 l'addition d'acide acétique glacial pour amener le pH à
4. Le produit partiellement N-désacylé est ensuite désaminé par l'addition de NaNCq à 5 % (p/v) avec agitation à 4 °C pendant 2 h. Les aldéhydes libres des résidus de 2,5-anhydro-D-mannose nouvellement formés peuvent être utilisés pour la conjugaison à une protéine de support. Il a été rapporté la dépolymérisation du saccharide capsulaire du sérotype III par l'endo-ßgalactosidase (Paoletti et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 18278-83 ; Paoletti et al. (1992) J Clin Invest 89: 2039 ; Wessels et al. (1987) Proc Natl Acad Sei USA 84: 9170-4 ; Wang et al. (2003) Vaccine 21: 1112-7) comprenant l'utilisation du matériau dépolymérisé pour former des conjugués avec un support d'anatoxine tétanique. L'ozonolyse des polysaccharides capsulaires issus des SGB des sérotypes III et VIII a été également utilisée pour la dépolymérisation (US 6 027 733 et US 6 274 144).
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à des oligosaccharides purifiés à partir de sources naturelles, et les saccharides peuvent être obtenus par d'autres procédés, tels qu'une synthèse totale ou partielle.
Dans certains modes de réalisation, l'oligosaccharide comprend au moins un lieur pour la conjugaison à une protéine de support. Dans d'autres modes de réalisation, l'oligosaccharide comprend au moins une unité répétitive modifiée pour la conjugaison à une protéine de support.
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Conjugaison des oligosaccharides
En général, une conjugaison covalente des oligosaccharides à des supports amplifie l'immunogénicité des oligosaccharides car elle les convertit d'antigènes T-indépendants en antigènes Tdépendants, permettant ainsi l'amorçage de la mémoire immunologique. Le terme « conjugué » se rapporte à un oligosaccharide lié de façon covalente à une protéine de support. Dans certains modes de réalisation, un oligosaccharide est lié directement à une protéine de support. Dans d'autres modes de réalisation, un oligosaccharide est lié indirectement à une protéine par l'intermédiaire d'un espaceur ou d'un lieur. Tel qu'utilisé ici, le terme « lié directement » signifie que les deux entités sont reliées par une liaison chimique, de préférence une liaison covalente. Tel qu'utilisé ici, le terme « lié indirectement » signifie que les deux entités sont reliées par un radical de liaison (par opposition à une liaison covalente directe) Dans certains modes de réalisation, le lieur est le dihydrazide de l'acide adipique. Dans d'autres modes de réalisation, le lieur est un dérivé d'une unité répétitive. Les conjugués représentatifs conformément à la présente invention comprennent ceux formés en joignant ensemble l'oligosaccharide avec la protéine de support. La liaison covalente des oligosaccharides aux protéines est connue dans l'art et est généralement obtenue par ciblage des amines des lysines, des groupes carboxyliques des acides aspartique/glutamique ou des sulfhydryles des cystéines. Par exemple, les esters cyanates formés de façon aléatoire à partir des
BE2017/5163 hydroxyles des sucres peuvent être mis à réagir avec les lysines de la protéine ou 1'hydrazine d'un espaceur qui sont ensuite condensés en acides carboxyliques de la protéine de support par 1'intermédiaire de la chimie des carbodiimides. En variante, les aldéhydes produits par l'oxydation aléatoire de periodate peuvent être soit utilisés directement pour une amination réductrice sur les amines de la protéine de support, soit convertis en amines à la suite de l'insertion d'un espaceur permettant l'étape de conjugaison à la protéine par l'intermédiaire de la formation de liaisons thioester ou amide. Une autre stratégie emploie l'hydrolyse partielle de l'oligosaccharide purifié et un fractionnement subséquent pour sélectionner la population de fragments ayant une taille moyenne définie. Un groupe amino primaire peut être ensuite introduit aux extrémités réductrices de l'oligosaccharide à utiliser finalement pour l'insertion soit d'un diester soit d'un lieur bifonctionnel pour la conjugaison à la protéine.
Le terme « protéine de support » se rapporte à une protéine à laquelle l'oligosaccharide est couplé ou fixé ou conjugué, généralement dans l'objectif d'amplifier ou de faciliter la détection de l'antigène par le système immunitaire. Les oligosaccharides sont des antigènes Tindépendants qui sont faiblement immunogènes et ne conduisent pas à des réponses immunoprotectrices à long terme. La conjugaison de l'antigène oligosaccharidique à une protéine de support change le contexte dans lequel les cellules immunitaires effectrices répondent aux oligosaccharides. Le terme protéine de support est censé couvrir à la fois les petits peptides et les gros
BE2017/5163 polypeptides (> 10 kDa) . La protéine de support peut comprendre un ou plusieurs épitopes de lymphocytes T auxiliaires.
Les protéines de support utiles comprennent des toxines ou des anatoxines bactériennes, telles que l'anatoxine diphtérique ou l'anatoxine tétanique. Des fragments des toxines ou des anatoxines peuvent être également utilisés, par exemple, le fragment C de l'anatoxine tétanique (référence 8). Le mutant CRMxgv de la toxine diphtérique (références 9 à 11) est particulièrement utile avec l'invention. D'autres protéines de support appropriées comprennent la protéine de la membrane externe de N. meningitidis (référence 12), des peptides synthétiques (références 13 et 14), des protéines de choc thermique (références 15 et 16), des protéines pertussiques (références 17 et 18), des cytokines (référence 19), des lymphokines (référence 19), des hormones (référence 19), des facteurs de croissance (référence 19), la sérumalbumine humaine (de préférence recombinante), des protéines artificielles comprenant de multiples épitopes de lymphocytes T CD4+ humains provenant de divers antigènes dérivés de pathogènes (référence 20) telles que N19 (référence 21), la protéine D de H. Influenzae (références 22 et 23) , la protéine de surface pneumococcique PspA (référence 24), la pneumolysine (référence 25), des protéines de capture du fer (référence 26), la toxine A ou B de C. difficile (référence 27), 1'exoprotéine A recombinante de
Pseudomonas aeruginosa (rEPA) (référence 28), protéine du SGB, etc.
une
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Les protéines de support particulièrement appropriées comprennent CRM197, l'anatoxine tétanique (TT), le fragment C de l'anatoxine tétanique, la protéine D, les mutants non toxiques de la toxine tétanique et l'anatoxine diphtérique (DT). D'autres protéines de support appropriées comprennent les antigènes protéiniques GBS80, GBS67 et GBS59 de Streptococcus agalactiae et des protéines de fusion, par exemple, GBS59(6xD3) divulguée dans le document WO 2011/121576 et GBS59(6xD3)-1523 divulguée dans le document EP 14179945.2. L'utilisation de tels antigènes protéiniques du SGB peut être avantageuse pour un vaccin contre le SGB parce que, au contraire des supports hétérologues comme CRM197, la protéine a un rôle double d'augmentation de l'immunogénicité de l'oligosaccharide tout en provoquant également une réponse immunoprotectrice. Par conséquent, la réponse immunologique déclenchée contre le support peut fournir une réponse immunologique protectrice supplémentaire contre le SGB, particulièrement contre une protéine du SGB.
Tel qu'utilisé ici, le terme « degré de glycosylation » se rapporte au nombre d'oligosaccharides par molécule de protéine de support et il est calculé sur la base de la concentration en protéine et glucide. Il a été trouvé qu'un chargement situé entre 2 et 9 oligosaccharides par molécule de protéine de support est optimal. Il faudra comprendre que de telles valeurs de chargement, et ainsi le degré de glycosylation, sont des valeurs moyennes reflétant tous les conjugués dans l'échantillon. En variante, le degré de glycosylation
BE2017/5163 peut être décrit en référence au rapport oligosaccharide/protéine (p/p). Par exemple, un rapport situé entre 1/5 (c'est-à-dire, un excès de protéine) et
10/1 (c'est-à-dire, un excès d'oligosaccharide).
Les compositions peuvent comprendre une petite quantité de support libre (référence 29). Lorsqu'une protéine de support donnée est présente sous forme à la fois libre et conjuguée dans une composition de l'invention, la forme non conjuguée est de préférence de pas plus de 5 % de la quantité totale de la protéine de support dans la composition comme un tout, et de façon davantage préférée présente à moins de 2 % en poids.
Après la conjugaison, les oligosaccharides libres et conjugués peuvent être séparés. Il existe de nombreux procédés appropriés, y compris la chromatographie hydrophobe, l'ultrafiltration tangentielle, la diafiltration, etc. (voir également les références 30 et 31, etc.). Un procédé préféré est décrit dans la référence 32.
En particulier, les conjugués de l'invention auront la formule générale :
( [UR] m-O-X) n2-P
Dans laquelle UR représente l'unité répétitive du PS III du SGB, l<nl<12, Kn2<20, P représente une protéine de support.
Compositions immunogènes
L'invention fournit en outre une composition immunogène comprenant un conjugué qui comprend au moins
BE2017/5163 un oligosaccharide conjugué à une protéine de support. Les compositions immunogènes peuvent comprendre toute quantité appropriée d'oligosaccharide(s) par dose unitaire. Les quantités appropriées d'oligosaccharide(s) peuvent être de 0,1 à 50 pg par dose unitaire. Généralement, chaque oligosaccharide est présent à une quantité de 1 à 30 pg, par exemple, de 2 à 25 pg, et en particulier de 5 à 20 pg.
Les procédés d'administration des compositions immunogènes de l'invention sont discutés ci-dessous. En bref, les compositions immunogènes de l'invention peuvent être administrées dans des doses simples ou multiples. Les inventeurs ont découvert que l'administration d'une dose simple des compositions immunogènes de l'invention est efficace. En variante, une dose unitaire suivie d'une seconde dose unitaire peut être efficace. Généralement, la seconde (ou troisième, quatrième, cinquième, etc.) dose unitaire est identique à la première dose unitaire. La seconde dose unitaire peut être administrée à tout moment approprié après la première dose unitaire, en particulier après 1, 2 ou 3 mois. Généralement, les compositions immunogènes de l'invention seront administrées par voie intramusculaire, par exemple, par administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras comme il est décrit ci-dessous.
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. Toutefois, l'utilisation de compositions non adjuvées est également envisagée, par exemple, il peut être avantageux d'omettre les adjuvants afin de réduire la toxicité potentielle. Par conséquent, des compositions immunogènes qui ne contiennent aucun adjuvant ou qui ne contiennent aucun adjuvant à base de sel d'aluminium sont envisagées.
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Combinaisons de conjugués et d'autres antigènes Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs autres antigènes. Le ou les autres antigènes peuvent comprendre d'autres conjugués comprenant des oligosaccharides dérivés des polysaccharides capsulaires du SGB. Les différents conjugués du SGB peuvent comprendre différents types de conjugués issus du même sérotype du SGB et/ou des conjugués issus de sérotypes différents du SGB. La généralement produite par composrtron sera generaiement produite par la préparation des conjugués séparés (par exemple, un conjugué différent pour chaque sérotype) et ensuite la combinaison des conjugués.
Le ou les autres antigènes peuvent comprendre des antigènes protéiniques issus du SGB. Le ou les autres antigènes peuvent comprendre des antigènes provenant de pathogènes non-SGB. Ainsi, les compositions de l'invention peuvent comprendre en outre un ou plusieurs antigènes non-SGB, y compris des antigènes bactériens, viraux ou parasitaires supplémentaires. Ceux-ci peuvent être choisis parmi les suivants :
- un antigène protéinique de N. meningitidis du sérogroupe B, tel que ceux dans les références 33 à 39, avec la protéine '287' (voir ci-dessous) et ses dérivés (par exemple, 'AG287') étant particulièrement préférés ;
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- une préparation de vésicules de la membrane externe (OMV) de N. meningitidis du sérogroupe B, telle que celles divulguées dans les références 40 à 43, etc. ;
- un antigène saccharidique de N. meningitidis du sérogroupe A, C, W135 et/ou Y, tel que l'oligosaccharide divulgué dans la référence 44 issu du sérogroupe C ou les oligosaccharides de la référence 45 ;
- un antigène saccharidique de Streptococcus pneumoniae (par exemple, références 46 à 48, chapitres 22 et 23 de la référence 55) ;
- un antigène du virus de l'hépatite A, tel qu'un virus inactivé (par exemple, références 49 et 50, chapitre 15 de la référence 55) ;
- un antigène du virus de l'hépatite B, tel que les antigènes de la surface et/ou core (par exemple, références 50, 51, chapitre 16 de la référence 55) ;
- un antigène du virus de l'hépatite C (par exemple, référence 52) ;
- un antigène de Bordetella pertussis, tel que l'holotoxine pertussique (PT) et 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA) de B. pertussis, éventuellement aussi en combinaison avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3 (par exemple, références 53 et 54, chapitre 21 de la référence 55) ;
- un antigène diphtérique, tel que l'anatoxine exemple, diphtérique (par référence 55) ;
- un antigène tétanique, chapitre 13 de la tel que l'anatoxine tétanique (par exemple, chapitre 25 de la référence 55) ;
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- un antigène saccharidique de Haemophilus influenzae B (Hib) (par exemple, chapitre 14 de la référence 55) ;
- un antigène de N. gonorrhoeae (par exemple, références 33 à 35) ;
- un antigène de Chlamydia pneumoniae (par exemple, références 56 à 62) ;
- un antigène de Chlamydia trachomatis (par exemple, référence 63) ;
- un antigène de Porphyromonas gingivalis (par exemple, référence 64) ;
- un ou plusieurs antigènes de la polio [par exemple, références 65 et 66 ; chapitre 24 de la référence 55) tel que l'IPV ;
- un ou plusieurs antigènes de la rage (par exemple, référence 67) tel que le virus inactivé lyophilisé (par exemple, référence 68, RABAVERT™] ;
- des antigènes de la rougeole, des oreillons et/ou de la rubéole (par exemple, chapitres 19, 20 et 26 de la référence 55) ;
- un ou plusieurs antigènes grippaux (par exemple, chapitres 17 et 18 de la référence 55) , tels que les protéines de la surface hémagglutinine et/ou neuraminidase ;
- un antigène de Moraxella catarrhalis (par exemple, référence 69) ;
- un antigène de Streptococcus pyogenes (streptocoque du groupe A) (par exemple, références 70 à 72) ;
- un antigène de Staphylococcus aureus (par exemple, référence 73) .
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Lorsqu'un antigène saccharidique ou glucidique est utilisé, il est conjugué de préférence à un support afin d'amplifier l'immunogénicité. La conjugaison des antigènes saccharidiques de H. influenzae B, méningococciques et pneumococciques est bien connue. Les antigènes protéiniques toxiques peuvent être détoxifiés lorsque c'est nécessaire (par exemple, détoxification de la toxine pertussique par des moyens chimiques et/ou génétiques (voir la référence 54)). Lorsqu'un antigène diphtérique est inclus dans la composition, il est également préféré d'inclure un antigène tétanique et des antigènes pertussiques. De façon similaire, lorsqu'un antigène tétanique est inclus, il est également préféré d'inclure des antigènes diphtériques et pertussiques. De façon similaire, lorsqu'un antigène pertussique est inclus, il est également préféré d'inclure des antigènes diphtériques et tétaniques. Les antigènes peuvent être absorbés sur un sel d'aluminium. Lorsqu'il y a plus d'un conjugué dans une composition, tous les conjugués n'ont pas besoin d'être adsorbés.
Un type de composition préférée comprend d'autres antigènes qui touchent les personnes âgées et/ou les immunodéprimés, et ainsi les antigènes du SGB de l'invention peuvent être combinés avec un ou plusieurs antigènes issus des pathogènes non-SGB suivants : le virus de la grippe, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, et le virus parainfluenza .
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Les antigènes dans la composition seront généralement présents à une concentration d'au moins pg/ml chacun. En général, la concentration de tout antigène donné sera suffisante pour déclencher une réponse immunitaire contre cet antigène.
En termes pratiques, il peut y avoir une limite supérieure au nombre d'antigènes inclus dans les compositions de l'invention. Le nombre d'antigènes (y compris les antigènes du SGB) dans une composition de l'invention peut être inférieur à 20, inférieur à 19, inférieur à 18, inférieur à 17, inférieur à 16, inférieur à 15, inférieur à 14, inférieur à 13, inférieur à 12, inférieur à 11, inférieur à 10, inférieur à 9, inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, inférieur à 4, inférieur à 3, ou inférieur à 2. Le nombre d'antigènes du SGB dans une composition de l'invention peut être inférieur à 6, inférieur à 5, inférieur à 4, inférieur à 3, ou inférieur à 2.
Procédés pharmaceutiques et utilisations
Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre en acceptable. acceptables » outre un support pharmaceutiquement Les « supports pharmaceutiquement types comprennent tout support qui comprennent n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement des grosses macromolécules métabolisées lentement comme des protéines, des polysaccharides, des polyacides lactiques, des polyacides glycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose (voir, par
BE2017/5163 exemple, la référence 74), le tréhalose (voir, par exemple, la référence 75), le lactose, et des agrégats de lipides (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes) . De tels supports sont bien connus d'une personne de compétence moyenne dans le domaine. Les vaccins peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances tampons du pH, et analogues, peuvent être présentes. La solution saline physiologique tampon phosphate apyrogène stérile est un support type. Une discussion approfondie sur les excipients pharmaceutiquement acceptables est disponible en référence (voir, par exemple, la référence 76).
Les compositions de l'invention peuvent être sous forme aqueuse (c'est-à-dire, des solutions ou des suspensions) ou sous une forme séchée (par exemple, lyophilisée). Si un vaccin séché est utilisé alors il sera reconstitué dans un milieu liquide avant injection. La lyophilisation de vaccins conjugués est connue dans l'art, par exemple, le produit MENJUGATE™ est présenté sous forme lyophilisée. Lorsque les compositions immunogènes de l'invention comprennent d'autres conjugués, il est typique que les conjugués soient préparés séparément, mélangés et ensuite lyophilisés. De cette façon, des compositions lyophilisées comprenant deux, trois ou quatre, etc. conjugués tels que décrits ici peuvent être préparées. Pour stabiliser les conjugués durant la lyophilisation, il peut être préféré d'inclure un alcool de sucre (par exemple, du mannitol) et/ou un disaccharide (par exemple, du saccharose ou du
BE2017/5163 tréhalose), par exemple, dans une concentration de 1 mg/ml et 30 mg/ml (par exemple, environ 25 mg/ml) dans la composition. L'utilisation de saccharose a été recommandée en tant que stabilisant pour les vaccins à base de conjugués du SGB (voir, par exemple, la référence 77) . Toutefois, il est typique que le stabilisant de la présente invention soit du mannitol. Lorsque le vaccin séché est reconstitué dans un milieu liquide avant injection, la concentration du mannitol résiduel sera généralement d'environ 2 à 20 mg/ml, par exemple, 3,75 mg/ml, 7,5 mg/ml ou 15 mg/ml. L'utilisation de mannitol est avantageuse parce que le mannitol est chimiquement distinct des unités répétitives de monosaccharide des saccharides capsulaires du SGB. Ceci signifie que la détection des saccharides capsulaires, par exemple, pour l'analyse de contrôle de qualité, peut être basée sur la présence des unités répétitives des saccharides sans interférence du mannitol. Au contraire, un stabilisant comme le saccharose contient du glucose, qui peut interférer avec la détection des unités répétitives de glucose dans les saccharides.
Les compositions peuvent se présenter dans des flacons, ou elles peuvent se présenter dans des seringues déjà remplies. Les seringues peuvent être fournies avec ou sans aiguille. Une seringue comprendra une dose simple de la composition, tandis qu'un flacon peut comprendre une dose simple ou des doses multiples. Les compositions aqueuses de 1'invention sont également appropriées pour reconstituer d'autres vaccins à partir d'une forme lyophilisée. Lorsqu'une composition de l'invention doit
BE2017/5163 être utilisée pour une telle reconstitution extemporanée, l'invention fournit un kit, qui peut comprendre deux flacons, ou peut comprendre une seringue déjà remplie et un flacon, avec le contenu de la seringue étant utilisé pour réactiver le contenu du flacon avant injection.
Les compositions de l'invention peuvent être conditionnées sous une forme de dose unitaire ou sous une forme de doses multiples. Pour les formes de doses multiples, les flacons sont préférés aux seringues déjà remplies. Les volumes posologiques efficaces peuvent être établis en routine, mais une dose humaine type de la composition a un volume de 0,5 ml, par exemple, pour une injection intramusculaire.
Le pH de la composition se situe de préférence entre 6 et 8, de préférence environ 7. Un pH stable peut être maintenu par l'utilisation d'un tampon. Les compositions immunogènes de 1'invention comprennent généralement un tampon de dihydrogénophosphate de potassium. Le tampon de dihydrogénophosphate de potassium peut comprendre environ 1 à 10 mM de dihydrogénophosphate de potassium, par exemple, 1,25 mM, 2,5 mM ou 5,0 mM. Si une composition comprend un sel d'hydroxyde d'aluminium, il est préféré d'utiliser un tampon histidine (voir, par exemple, la référence 78) . La composition peut être stérile et/ou apyrogène. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques par rapport aux êtres humains.
Les compositions de l'invention sont immunogènes, et sont de façon davantage préférée des compositions vaccinales. Les vaccins selon l'invention peuvent être soit prophylactiques (c'est-à-dire, pour prévenir une infection ou une maladie) soit thérapeutiques (c'est-à25
BE2017/5163 dire, pour traiter une infection ou une maladie) , mais ils seront généralement prophylactiques. Les compositions immunogènes utilisées en tant que vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace d'antigène(s), ainsi que tout autre composant, selon les besoins. Par « quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, soit dans une dose simple soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon la santé et l'état physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'estimation du médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée par l'intermédiaire d'essais de routine.
Au sein de chaque dose, la quantité d'un antigène saccharidique individuel sera généralement située entre 0,1 et 50 pg (mesurée en masse de saccharide), particulièrement entre 1 et 50 pg ou 0,5 à 25 pg, plus particulièrement 2,5 à 7,5 pg, par exemple, environ 1 pg, environ 2,5 pg, environ 5 pg, environ 10 pg, environ 15 pg, environ 20 pg ou environ 25 pg. Au sein de chaque dose, la quantité totale de saccharides capsulaires chimériques sera généralement < 70 pg (mesurée en masse de saccharide), par exemple, < 60 pg. En particulier, la quantité totale peut être < 40 pg (par exemple, < 30 pg)
BE2017/5163 ou < 20 pg (par exemple, < 15 pg). Il peut être avantageux de minimiser la quantité totale de saccharide(s) capsulaire(s ) chimérique(s ) par dose unitaire afin de réduire la toxicité potentielle. Par conséquent, une quantité totale < 20 pg peut être utilisée, par exemple, < 15 pg, <7,5 pg ou < 1,5 pg.
Le SGB touche différentes zones du corps et ainsi les compositions de l'invention peuvent être préparées sous diverses formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous la forme d'injectables, sous la forme soit de solutions soit de suspensions liquides. La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme d'une pulvérisation, de gouttes, d'un gel ou de poudre (par exemple, références 79 et 80). Le succès d'une administration nasale de saccharides pneumococciques (références 81 et 82), de saccharides de Hib (référence 83), de saccharides de MenC (référence 84) et de mélanges de conjugués saccharidiques de Hib et de MenC (référence 85) a été rapporté.
Les compositions de l'invention peuvent comprendre un antimicrobien, particulièrement lors d'un conditionnement sous format de doses multiples.
Les compositions de l'invention peuvent comprendre un détergent, par exemple, un TWEEN™ (polysorbate), tel
BE2017/5163 que TWEEN™ 80. Les détergents sont généralement présents à des taux bas, par exemple, < 0,01 %.
Les compositions de l'invention peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, du chlorure de sodium) pour donner la tonicité. Une concentration de 10 ± 2 mg/ml de NaCl est typique. Dans certains modes de réalisation, une concentration de 4 à 10 mg/ml de NaCl peut être utilisée, par exemple, 9,0, 7,0, 6,75 ou
4,5 mg/ml. Les compositions de l'invention comprendront généralement un tampon. Un tampon phosphate est typique. Les compositions de l'invention peuvent être administrées conjointement avec d'autres agents immunorégulateurs. En particulier, les compositions peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants. De tels adjuvants sont connus dans l'art et comprennent, mais n'y sont pas limités, des sels d'aluminium tels que 1'alun et MF5 9.
Procédés de traitement
L'invention fournit également un procédé pour soulever une réponse immunitaire chez un mammifère approprié, comprenant l'administration d'une composition pharmaceutique de l'invention au mammifère approprié. La réponse immunitaire est de préférence protectrice et elle implique de préférence des anticorps. Plus particulièrement, la réponse immunitaire est protectrice contre le SGB est de préférence elle implique des anticorps contre le SGB. Le procédé peut soulever une réponse à un rappel.
Le mammifère approprié est de préférence un être humain. Lorsque le vaccin est destiné à une utilisation
BE2017/5163 prophylactique, l'être humain est de préférence un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson) ou un adolescent ; lorsque le vaccin est destiné à une utilisation thérapeutique, l'être humain est de préférence un adulte. Un vaccin prévu pour des enfants peut être également administré à des adultes, par exemple, pour estimer l'innocuité, le dosage, l'immunogénicité, etc. Une classe préférée d'êtres humains pour le traitement sont des femmes en âge de procréer (par exemple, des adolescentes et au-delà). Une autre classe préférée consiste en des femmes enceintes. Les patients âgés (par exemple, ceux d'un âge supérieur à 50, 60, 70, 80 ou 90, etc. ans, particulièrement de plus de 65 ans), spécialement ceux vivant dans des maisons de repos où le risque d'infection par le SGB peut être accru (référence 86), constituent une autre classe préférée d'êtres humains pour le traitement. Les femmes avec des taux indétectables d'anticorps contre le ou les saccharides capsulaires du SGB peuvent présenter des taux supérieurs d'infection par le SGB chez leur nouveauné. Ceci est dû au fait que des taux supérieurs d'anticorps maternels dirigés contre les saccharides capsulaires du SGB sont corrélés avec un risque réduit de maladie chez les nouveau-nés (références 87 et 88) . Par conséquent, l'administration à ces femmes est spécifiquement envisagée dans la présente invention.
L'invention fournit également une composition de l'invention pour une utilisation en tant que médicament. Le médicament est de préférence capable de soulever une réponse immunitaire chez un mammifère approprié (c'est29
BE2017/5163 à-dire qu'il s'agit d'une composition immunogène) et il est de façon davantage préférée un vaccin.
L'invention fournit également l'utilisation d'une composition de l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné à soulever une réponse immunitaire chez un mammifère approprié.
Ces utilisations et procédés peuvent être destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par S. agalactiae, par exemple, la septicémie ou la bactériémie néonatale, la pneumonie néonatale, la méningite néonatale, l'endométrite, l'ostéomyélite, l'arthrite septique, etc. Ces utilisations et procédés peuvent être destinés à la prévention et/ou au traitement d'une maladie provoquée par S. pneumoniae, par exemple, la bronchite, la rhinite, la sinusite aiguë, l'otite moyenne, la conjonctivite, la méningite, la bactériémie, la septicémie, l'ostéomyélite, l'arthrite septique, l'endocardite, la péritonite, la péricardite, la cellulite, et l'abcès cérébral.
Le sujet chez lequel la maladie est prévenue peut ne pas être le même que le sujet qui reçoit le conjugué de l'invention. Par exemple, un conjugué peut être administré à une femme (avant ou durant la grossesse) afin de protéger sa descendance (la dite « immunisation maternelle », références 89 à 91).
Une façon de vérifier l'efficacité d'un traitement thérapeutique implique le suivi de l'infection par le SGB après l'administration de la composition de l'invention. Une façon de vérifier l'efficacité d'un traitement prophylactique implique le suivi des réponses immunitaires contre le pathogène ciblé, par exemple, les
BE2017/5163 antigènes du SGB après l'administration de la composition.
Les compositions préférées de l'invention peuvent conférer un titre en anticorps chez un patient qui est supérieur au critère pour la séroprotection pour chaque composant antigénique pour un pourcentage acceptable de sujets humains. Les antigènes avec un titre en anticorps associé au-dessus duquel un hôte est considéré comme ayant subi une séroconversion contre l'antigène sont bien connus, et de tels titres sont publiés par des organisations telles que 1'OMS. De préférence, plus de 80 % d'un échantillon statistiquement significatif de sujets ont subi une séroconversion, de façon davantage préférée plus de 90 %, de façon encore davantage préférée plus de 93 % et de façon préférée entre toutes 96 à 100 %
Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. L'administration directe peut être accomplie par injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre mucosale. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut être réalisée à l'aide d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Une dose intramusculaire type est de 0,5 ml.
L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale. Le traitement
BE2017/5163 posologique peut être un calendrier d'une dose simple ou un calendrier de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un calendrier d'immunisation primaire et/ou dans un calendrier d'immunisation de rappel. Un calendrier de dose primaire peut être suivi d'un calendrier de dose de rappel. Le temps approprié entre les doses de sensibilisation (par exemple, entre 4 et 16 semaines), et entre la sensibilisation et le rappel, peut être déterminé en routine.
Généralités
Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou peut inclure quelque chose de supplémentaire, par exemple, X + Y.
Le terme « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme
| « | sensiblement | » peut | être omis | de la définition de | |
| 1 1 | 'invention. | ||||
| Dans certaines | mises en | œuvre, le | terme | ||
| « | comprenant » | se rapporte à 1 ' | inclusion de | 1'agent |
actif indiqué, tel que les polypeptides cités, ainsi que l'inclusion d'autres agents actifs, et de supports, excipients, émollients, stabilisants, etc. pharmaceutiquement acceptables, qui sont connus dans l'industrie pharmaceutique. Dans certaines mises en œuvre, le terme « constitué essentiellement de » se rapporte à une composition, dont le seul principe actif
BE2017/5163 est le(s) principe (s) actif(s) indiqué (s), toutefois, il peut être inclus d'autres composés qui sont destinés à la stabilisation, la conservation, etc. de la formulation, mais qui ne sont pas impliqués directement dans l'effet thérapeutique du principe actif indiqué. L'utilisation de la phrase de transition « constitué essentiellement » signifie que l'étendue d'une revendication doit être interprétée comme englobant les matériaux ou les étapes spécifiés cités dans la revendication, et ceux qui n'affectent matériellement pas la ou les caractéristiques basiques et nouvelles de l'invention revendiquée. Voir, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (en italique dans l'original) ; voir également MPEP § 2111.03. Ainsi, le terme « constitué essentiellement de », lorsqu'il est utilisé dans une revendication de cette invention, n'est pas censé être interprété comme étant équivalent à « comprenant ». Le terme « constitué de » et ses variations comprend « incluant et limité à » sauf précision expressément contraire. Dans certains territoires, le terme « comprenant un principe actif constitué de » peut être utilisé à la place de « constitué essentiellement ». Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x signifie, par exemple, x + 10 %, x + 5 %, x + 4 %, x + 3 %, x + 2 %, x + 1 %. Le terme « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme « sensiblement » peut être omis de la définition de 1'invention.
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Sauf indication spécifique, un procédé comprenant une étape de mélange de deux composants ou plus ne nécessite pas un ordre spécifique quelconque de mélange. Ainsi, les composants peuvent être mélangés dans un ordre quelconque. Lorsqu'il y a trois composants, alors deux composants peuvent être combinés l'un avec l'autre, et ensuite la combinaison peut être combinée avec le troisième composant, etc.
Les anticorps seront généralement spécifiques de leur cible. Ainsi, ils présenteront une affinité supérieure pour la cible par rapport à une protéine témoin non pertinente, telle que la sérumalbumine bovine
Exemples
Exemple 1
Souches bactériennes - La souche du SGB du sérotype III COH1 (sérotype III) a été obtenue auprès de Dennis Kasper (Harvard Medical School, Boston, MA) .
Isolement et purification du polysaccharide capsulaire du sérotype III - La souche du SGB COH1 a été utilisée pour la préparation du PSC III à partir de 1 litre de culture bactérienne développée jusqu'à la phase exponentielle dans du bouillon de Todd Hewitt. Le procédé de purification était basé sur des procédures décrites auparavant (Wessels M. R., 1990 J. Clin. Investig. 86, 1428-1433) . En bref, le culot bactérien a été récupéré par centrifugation à 4000 tr/min pendant 20 min et incubé avec du NaOH 0,8 N à 37 °C pendant 36 h. Après centrifugation à 4000 tr/min pendant 20 min, du tampon Tris 1 M (1/9, v/v) a été ajouté au surnageant et
BE2017/5163 dilué avec du HCl (1/1, v/v) pour atteindre un pH neutre. Pour encore purifier le PSC du sérotype III, 2 M de CaCl2 (concentration finale de 0,1 M) et de l'éthanol (concentration finale de 30 % (v/v)) ont été ajoutés à la solution. Après centrifugation à 4000 x g pendant 20 min, le surnageant a été soumis à une filtration à flux tangentiel avec un seuil de masse moléculaire de 10 000 (Hydrosart Sartorius ; surface de 0,1 m2) contre 14 volumes de 50 mM de Tris, 500 mM de NaCl, pH 8,8 et 7 volumes de 10 mM de phosphate de sodium, pH 7,2.
Exemple 2 - Fragments_des_polysaccharides_du sérotype III préparés par désamination
Le PS du sérotype III natif a été partiellement Ndésacylé comme suit : le polysaccharide a été dissous dans 3 ml de 0,5 M de NaOH, chauffé en 70 °C pendant 2 à 4 h, et ensuite glacé dans un bain de glace-eau. De l'acide acétique glacial a été ajouté à l'échantillon pour amener le pH à 4,5. Le produit partiellement Ndésacylé a été désaminé par l'addition de 200 μΐ de NaNÛ2 à 5 % (p/v) et agité à 4 °C pendant 2 h. Le matériau a été purifié par une colonne G25 s'éluant avec de l'eau.
Pour reconstituer la pleine N-acétylation des résidus d'acide sialique, une solution diluée à 1/1 de
4,15 μΐ/ml d'anhydride acétique dans de l'éthanol a été ajoutée, et la réaction a été incubée à température ambiante pendant 2 h. Le matériau a été purifié par une colonne G25 s'éluant avec de l'eau.
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Exemple 3 - Purification des oligosaccharides
Les fragments de longueur différente ont été séparés par chromatographie d'échange anionique en utilisant une CLHP semi-préparative avec une colonne MONO Q™. En augmentant le pourcentage de NaCl du tampon d'élution avec un gradient en escalier, il a été possible d'isoler les oligosaccharides présentant une différence de longueur de chaîne (degré de polymérisation ou DP) dans la plage de 1 à 2 unités répétitives (UR) (figure 2) Ces fragments étaient composés d'une UR modifiée et d'un nombre variable d'UR non modifiées.
La longueur des oligosaccharides a été déterminée par une analyse de RMN ΧΗ (figure 3) . Le rapport entre l'intégrale du signal du proton de l'aldéhyde du cycle furanoside généré durant la réaction de dépolymérisation (à 6,62 ppm sous la forme d'hémi-acétal) et les signaux des protons associés aux autres monosaccharides a été utilisé pour mesurer la longueur de l'oligosaccharide.
La longueur du DP2 a été confirmée par spectrométrie de masse (MALDI TOF) en mode négatif en utilisant de
BE2017/5163 l'acide dihydroxybenzoïque comme matrice (MS trouvée :
1938,21 ; calculée : 1937,70) . Le DP2 contient deux unités répétitives : une unité répétitive et un appendice composé d'une unité répétitive modifiée. Cette nomenclature (par exemple, DP3, DP4) sera utilisée cidessous .
Pour corroborer l'intégrité des DP2 et DP3 obtenus observée par l'analyse de RMN, une analyse HPAEC-PAD a été effectuée avec un Dionex ICS3000 équipé d'une colonne CarboPac PA1. Le PSIII a été utilisé comme témoin. Le rapport relatif des différents sucres composant le polymère a été déterminé (tableau 1), indiquant qu'aucune perte significative d'acide sialique n'a été produite durant la dépolymérisation. En considérant qu'un résidu GlcNAc a été perdu dans la molécule entière (celui qui devait devenir un résidu 2,5-anhydro-Dmannose durant la réaction), la longueur de l'oligosaccharide a été estimée en utilisant la formule :
DP = [X] / ( [X] - [GlcNAc] ) où [X] représente la concentration de Glc ou la moitié de la concentration de Gai. Les DP estimées (tableau 4.1) par ce procédé concordaient bien avec la longueur estimée par l'intermédiaire de l'analyse de RMN et de MS.
Tableau 1
Quantification par HPAEC-PAD des composants monosaccharidiques et estimation de la longueur relative
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| Echantillon | GlcNAc pmol/ml | Glc pmol/ml | Gai pmol/ml | NeuNAc pmol/ml | DP calculée par GlcNAc |
| DP2 | 7,71 | 13,79 | 30,75 | 12,91 | 2,1 |
| DP3 | 9, 81 | 14,86 | 29,46 | 14,31 | 3, 0 |
| PSIII | 5, 86 | 5, 97 | 12,06 | 5, 83 | n. a. |
PSIII se rapporte au polysaccharide natif du SGB du sérotype III.
Exemple 4 - Structures synthétiques (figures 4A à D)
Procédés généraux pour la synthèse chimique des oligosaccharides
Tous les produits chimiques étaient de qualité réactive, et ils ont été utilisés sans autre purification. Les réactions ont été suivies par chromatographie sur couche mince (CCM) sur gel de silice 60 F254 (Sigma
Aldrich) ; après examen sous lumière UV, les composés ont été visualisés par chauffage avec du H2SO4 éthanolique à 10 (v/v)
Dans les procédures de préparation, les solutions organiques ont été lavées avec les quantités des solutions aqueuses indiquées, puis séchées avec du Na2SÛ4 anhydre, et concentrées sous pression réduite à une température de 30 à 50 °C sur un bain-marie. La chromatographie sur colonne a été effectuée sur des cartouches préremplies de silice REDISEP™ (Teledyne-Isco, 0,040 à 0,063 nm) ou BIOTAGE™
SNAP Ultra (0,050 nm de silice irrégulière). Sauf précision contraire, un gradient de 0 100 % du mélange d'élution a été appliqué dans un instrument COMBIFLASH™
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Rf (Teledyne-Isco) ou ISOLERA™ (Biotage). Des mélanges de solvants moins polaires que ceux utilisés pour la CCM ont été utilisés au début de la séparation. Les spectres de RMN 3H ont été mesurés à 400 MHz et 298 K avec un spectromètre Bruker AVANCE™ III ; les valeurs de δΗ ont été rapportées en ppm, par rapport à l'étalon interne Me4Si (δΗ = 0,00, CDCI3) ou le signal de l'eau (δΗ = 4,79 ppm, D2O) . Les spectres de RMN 13C ont été mesurés à 100 MHz et 298 K avec un spectromètre Bruker Avance111 ; les valeurs de ôc sont rapportées en ppm par rapport au signal du CDCI3 (ôc = 77,0, CDCI3) . Les signaux de RMN ont été attribués par spectroscopie dimensionnelle à corrélation homonucléaire et hétéronucléaire. Lors du rapport des attributions des signaux de RMN, les résidus de sucre dans les oligosaccharides sont indiqués avec des lettres majuscules, les attributions incertaines sont indiquées par Les noyaux associés au lieur sont indiqués avec un prime. Les masses exactes ont été mesurées par spectroscopie seuil à ionisation par électronébulisation, en utilisant un instrument Q-Tof fflicroMacromass (Waters). La rotation optique a été mesurée avec un P2000 Jasco à 25 °C.
La figure 4A fournit la structure de l'unité répétitive du polysaccharide du SGB du sérotype III (PSIII du SGB) . Les figures 4B à 4D fournissent les structures des fragments pentasaccharidiques synthétiques du PSIII du SGB (composés 1, 2, et 3, respectivement).
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Exemple 5 - Synthèse du fragment 1 (figure 5)
Schéma 1. Réactifs et conditions : a. NaOMe, MeOH ; (CH3) 2C (OCH3) 2, DMF, PTSA, 50 °C, puis TEA, mélange 9/1 de MeOH-H2O, 90 °C ; BnBr, 60 % NaH, DMF, 57 % (sur étapes) ; b. mélange 4/1 d'AcOH-H2O, 70 °C ; (EtO)3CCH3, PTSA, CH3CN, puis mélange 4/1 d'AcOH-H2O, 65 % (sur étapes) ; c. NIS, TfOH, DCM, -20 °C, 72 % ; d. mélange 4/1 d'AcOH-H2O, 70 °C ; TBDPSC1, DMAP, Py, 60 °C, 80 % (sur 2 étapes) ; e. Cs2CO3, CF3CClNPh, DCM, 82 % ;
f. TMSOTf, DCM, 55 % ; g. Lil, Py, 120 °C ; H2NCH2CH2NH2, EtOH, 90 °C ; Ac2O-Py ; NaOMe, MeOH ; H2, Pd-C, 31 %.
il·
Trifluoroacétimidate de 2,4,6-tri-0-benzoyl-3-0(4,7,8,9-tétra-O-acétyl-5-(N-acétamido)3,5-didésoxy-Dglycéro-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate de méthyle)-D-galactopyranosyl-N-phényle (α,β) 11
A une solution du composé 10 (1,5 g, 1,4 mmol) dans du DCM (10 ml) et de chlorure de 2,2,2-trifluoro-Nphénylacétimidoyle (3 équivalents), du Cs2CO3 (1 équivalent) a été ajouté à 0 °C, et la réaction a été agitée à TA pendant 3 h. Le solide a été séparé par filtration et le solvant a été évaporé. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 8/2 de toluène/acétone) pour produire le composé 11 sous la forme d'une mousse brune dans un rendement de 82 % (1,15 g). HR EST-MS m/z C55H55F3N2O21 [M+Na]+ 1159, 3147 ;
trouvé 1159,3065. (Ando et al. Carbohydrate Research 338 (2003) 503-514) .
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2,6-Di-O-benzyl-3,4-di-0-isopropylidène-3-Dgalactopyranosyl-(U4)-2,3,6-tri-0-benzyl-3-D-glucopyranoside de 3-azidopropyle 5
Le composé 4 connu (5,0 g, 11,7 mmol) a été dissous dans 100 ml de mélange 9/1 de 2,2-diméthoxy-propane/DMF. Du PTSA catalytique (0,2 équivalent) a été ajouté et la réaction a été réchauffée à 50 °C pendant 3 h. Une CCM (mélange 9/1 de DCM/MeOH) a montré la disparition du matériau de départ et la formation de 2 taches, accompagnées d'autres sous-produits. La réaction a été neutralisée avec de la TEA jusqu'à pH neutre, et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été dissous dans 150 ml de mélange 9/1 de MeOH/EhO et réchauffé à 90 °C pendant 2 h, lorsque la présence d'une tache majeure a été détectée par CCM. Le solvant a été éliminé sous pression réduite, et le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 9/1 de DCM/MeOH) pour donner le galactose isopropylé dans un rendement de 72 % (3,9 g).
Le composé à venir a été dissous dans du DMF sec (50 ml) sous une atmosphère d'azote. La solution a été refroidie à 0 °C, et du NaH à 60 % (2,2 g, 55,25 mmol) a été ajouté par parties. Après 20 min, du BnBr (10,3 ml, 85 mmol) et du TBAI (7,8 g, 21,25 mmol) ont été ajoutés.
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La réaction a été agitée pendant une nuit à TA, puis neutralisée par l'addition de MeOH et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été dissous dans du CH2CI2, lavé 2 fois avec du NaHCO3 aqueux et une fois avec de l'eau. La phase organique a été recueillie, séchée avec du Na2SO4 et évaporée sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 8/2 de cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 5 dans un rendement de 79 % sous la forme d'une huile jaune pâle (6,1 g) . HR ESI-MS m/z
| N30h [M+Na] + | 938,4204 | ; trouvé 938,4200 | • | |
| RMN 3Η (400 | MHz, | CDC1 | 3) : δ 7,50-7,20 | (m, 25H, H- |
| 4,99 - 4,35 | (m, | 12H, | CfhPh, y compris, | 4,45, d, H- |
la, J = 8,0 Hz, 1H ; 4,39, d, H-lb, J = 8,7 Hz, 1H) ,
4,15 (dd, 1H, J= 5,5, 1,1 Hz, H-4a) , 4, 07-3, 96 (m, 3H,
OCH2a, H-3, H-4), 3,86 (dd, 1H, J= 10,9, 4,1 Hz, H-6b),
3, 80-3,70 (m, 3H, H-6b, H-6a, H-3), 3,67 (m, 1H, OCH2b) , 3, 64-3,54 (m, 2H, H-6a, H-5), 3,48-3,35 (m, 5H, H-2a, H2b, CH2N3, H-5), 1,93 (m, CH2CH2N3, 2H) , 1,45 (s, 3H,
C (CH3) ) , 1,40 (s, 3H, C (CH3) ) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 138, 95-12 6, 96 (50 x C-Ar, C(CH3) 2), 109, 78, 103,58 (Clb) , 101,85 (Cia), 82, 98, 81,80 (C2b) , 80, 63 (C2a) , 79, 37, 77,25, 76, 29, 75,43, 75,07-73,20 (5xCH2Ph), 72,01, 68,94
66, 48 (OCH2), 65,30, 48,33 (CH2N3),
27, 98, 26, 42 (2 x C (CH3) ) .
(C6a), 68,18 (C6b), 29, 27 (CH2CH2N3),
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4-O-Acétyl-2,6-di-O-benzyl-ß-D-galactopyranosyl(1^4)-2,3,6-tri-O-benzyl-ß-D-glucopyranoside de 3azidopropyle 6
Le lactoside 5 (6,1 g, 6,7 mmol) a été mis en suspension dans un mélange 4/1 de AcOH/thO (200 ml) . La réaction a été réchauffée à 70 °C pendant 2 h. Une CCM (mélange 7/3 de cyclohexane/acétate d'éthyle) a montré la disparition du matériau de départ et la formation d'une tâche avec un Rf inférieur. Le solvant a été éliminé à pression réduite et le produit brut a été coévaporé avec du toluène (3 x 100 ml). Le produit brut a été dissous dans du CH3CN (100 ml), puis de l'orthoacétate de triéthyle (3,7 ml, 20,1 mmol) et du PTSA (270 mg, 1,34 mmol) ont été ajoutés. La réaction a été agitée à TA pendant 4 h, puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été dissous dans un mélange 4/1 d'AcOH/EhO (100 ml) et après 2 h, le solvant a été éliminé à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 6/4 de cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 6 dans un rendement global de 65 % (3,9 g) sous la forme d'une huile jaune pâle. HR ESI-MS m/z C52H59N3O12 [M+Na]+ 939,3996 ; trouvé 940,4030.
RMN ΧΗ (400 MHz, CDCI3) δ 7,47-7,13 (m, 25H, H-Ar),
5,37 (d, J = 3,2 Hz, 1H, H-4B) , 5,01-4,63 (m, 7H, 7 x CHHPh), 4,53-4,43 (m, 3H, y compris, 2 x CHHPh, H-la ; 4,39, d, J = 7,8 Hz, 1H, H-1B) , 4,27 (d, J = 12,0 Hz, 1H, CHHPh), 4,01 (m, 2H, 1 x OCH2ar H-4A) , 3,82 (dd, J = 10,9,
3,9 Hz, 1H, H-6A), 3,75 (d, J = 9,7 Hz, 1H, H-6a), 3,693,49 (m, 5H, H-3B, OCH2b, H-6b, H-4B, H-5B) , 3,48 - 3,31
BE2017/5163 (m, 7H, CH2N3, H-2a, H-2b, H-3 CH3CO) , 1,92 (m, 2H, CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13)
| 126 | , 97 | (C-Ar) | , 103, | 57 (C-l |
| 80, | 08 | (C-2A, | C-2A) , | 76, 28, |
| 72, | 43, | 71, 98 | (C-3A | , C-3A) |
| 67, | 23 | (OCH2) , | 66, 50 | (C-6A) , |
| 20, | 78 | (CH3CO) |
-, H-5A, H-6A), 2,06 (s, 3H, δ 171,00 (COCH3), 138,99102,30 (C-1B), 82,71, 81, 68, j, 25, 75, 04, 73,39, 73,23,
9,63 (C-4B) , 68, 09 (C-6B) , ,30 (CH2N3), 29, 25 (CH2CH2N3),
...... GBn
a
3-O-Benzyl-4,6-0-benzylidène-2-désoxy-2phtalimido-glucopyranosyl-(1^3)-4-O-acétyl-2, 6-di-Obenzyl-ß-D-galactopyranosyl-(1^4)-2,3,6-tri-O-benzyl-ßD-glucopyranoside de 3-azidopropyle 8
Une solution de l'accepteur 6 (800 mg, 0,87 mmol) et du donneur 7 connu (655 mg, 1,13 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 1,0 g) dans du DCM (10 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du NIS (508 mg, 2,26 mmol) et du TfOH (20 μΐ, 0,23 mmol) ont été ajoutés à -20 °C. Après agitation du mélange réactionnel pendant 24 h à température ambiante, de la TEA a été ajoutée jusqu'à pH neutre, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 4/1 de toluène/EtOAc) pour donner le composé 8 dans un rendement de 72 % (870 mg) sous la forme d'une
BE2017/5163 huile incolore. HR ESI-MS m/z C80H82N4O18 [M+Na] +
1409,5522 ; trouvé 1409,5604.
RMN 3Η (400 MHz, CDC13) δ 7,47-7,13 (m, 39H, H-Ar),
5,55 (s, 1H, CHPh) , 5,31-5,27 (m, 2H, H-lc, H-4B) , 4,834,52 (m, 5H, CHHPh) , 4,45-4,33 (m, 5H, 4 x CHHPh, H-4C) , 4,21-3,39 (m, 6H, H-1A, H-lb, H-2C, 3 x CHHPh) , 3,85-3,71 (m, 5H, H-2A_B, H-6a A_c), 3,62-3,18 (m, 15H, H3A’C, Η-4Α-°, x H-5, H-6b A_c, OCH2, CH2N3), 2, 97-2, 90 (m, 1H, H-5),
2,02 (s, 3H, CH3CO) , 1,82-1, 69 (m, 2H, CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13)
139,04-123,14 (C-Ar), 103,46
101,27 (CHPh) , 99, 20 (C-lcc) , 82,83 (C-2A) , 82, 65, 78, 88, 78, 63, 75, 66, 75, 16, 75, 04, 74, 68, 74,43 (C-2B) , 74,31 (CH2Ph) , 74,26 (CH2Ph) , 74, 04 (CH2Ph) , 73,55 (CH2Ph) ,
73,11 (CH2Ph) , 72, 82 (CH2Ph) , 72,49 (C-3C) , 69, 85 (C-4C) , 68,76, 68,50, 68,21, 67, 61, 66, 25, 65, 91 (C-6A) , 65,91 (C-6B) , 66, 39 (OCH2), 65,91 (C-6C) , 56,11 (C-2C) , 48,29 (CH2N3), 29,21 (CH2CH2N3), 20,88 (CH3CO) .
δ 169, 90, 167,50 (CO), (C-1A), 101,87 (C-1B),
3-O-Benzyl-6-0-t-butyldiphénylsilyl-2-désoxy-2phtalimido-glucopyranosyl-(1^3)-4-O-acétyl-2,6-di-Obenzyl-ß-D-galactopyranosyl-(1^4)-2,3,6-tri-O-benzyl-ßD-glucopyranoside de 3-azidopropyle 9
Le trisaccharide 7 (0,29 mmol, 400 mg) a été mis en suspension dans un mélange 4/1 d'AcOH/H2O (25 ml) . La
BE2017/5163 réaction a été réchauffée à 70 °C et agitée pendant 4 h.
Le solvant a été éliminé à pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange
6/4 de cyclohexane/EtOAc) pour produire le trisaccharide debenzylidiné dans un rendement de 87 % (325 mg,
0,25 mmol) sous la forme d'une huile jaune pâle.
Le matériau a été dissous dans de la pyridine (10 ml). Du TBDPSC1 (0,50 mmol, 140 μΐ) et de la DMAP (0,05 mmol, 10 mg) ont été ajoutés et la réaction a été agitée pendant une nuit à 60 °C, lorsque la CCM (mélange 7/3 de cyclohexane/EtOAc) a montré une réaction complète. Le solvant a été éliminé à pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 9 dans un rendement de 92 % (675 mg) sous la forme d'une huile jaune. HR ESI-MS m/z CggHgsUOxgSi [M+Na]+ 1159, 6387 ;
trouvé 1559,6224.
RMN 3Η (400 MHz, CDC13) δ 7,31-7,14 (m, 44H, H-Ar),
5,38-5,32 (m, 2H, H-lc, H-4b), 4,91 (d, J= 10,5 Hz, 1H, CHHPh) , 4, 86-4,36 (m, 7H, CHHPh) , 4,33 (dd, J = 11,4,
2,8 Hz, 1H, H-4C) , 4,30-4,18 (m, 6H, H-1A, H-lb, 4 x CHHPh) , 4,17-4,08 (m, 2H, H-2C, H-6a), 4,02 (m, 2H, H-6C, H-3), 3, 95-3, 83 (m, 3H, H-4A, OCH2a) , 3,63 (m, 1H, H-5), 3, 60-3,45 (m, 3H, H-5B, H-6a, OCH2b) , 3,45-3,23 (m, 9H,
CH2N3, H-6a, 2 x H-6b, H-2A, H-2B, 2 x H-3), 3,04 (d, J =
9,5 Hz, 1H, H-5), 2,02 (s, 3H, CH3CO) , 1,92-1,82 (m, 2H, CH2CH2N3), 1,12 (s, 9H, t-Bu) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 169, 80, 166, 70 (CO),
135,59-120,48 (C-Ar), 103,41 (C-1A) , 101,82 (C-1B) , 98,41 (C-lc), 82,58, 81,53, 79, 11, 78,44, 77,72, 75, 48, 75, 09,
75,00, 74,96, 74,69, 74,33, 74,20, 73,90, 73,38, 73,07,
BE2017/5163
72,71, 69, 93 (C-4C) , 68,34 (C-6b) , 67, 62 (C-6a), 66,35 (OCH2), 65,31 (C-6C), 55,75 (C-2C) , 48,25 (CH2N3), 31,07 (C(CH3)3), 29,18 (CH2CH2N3), 26, 83 (C(CH3) 3), 20, 66 (CH3CO).
0- [4,7,8,9-Tétra-O-acétyl-5-(N-acétamido)-3,5didésoxy-D-glycéro-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate de méthyle]-(2^3)-Ο-(2,4,6-tri-O-benzoyl-ß-D-galactopyranosyl)-(1^4)-3,6-0-benzyl-2-d0soxy-2-phtalimido-ßD-glucopyranoside)-(1^3)-4-O-acétyl-2,6-O-benzyl-ß-Dgalactopyranosyl-(1^4)-2,3,6-tri-O-benzyl-ß-D-glucopyranoside de 3-azidopropyle 12
Une solution du trisaccharide accepteur 9 (675 mg, 0,23 mmol) et du disaccharide donneur 11 (261 mg,
0,23 mmol) avec des tamis moléculaires 4 Â activés (800 mg) dans du DCM (8 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du TMSOTf (0,046 mmol, 9 μΐ) a été ajouté à 0 °C. Ensuite le mélange réactionnel a été agité pendant 10 h à TA, lorsque la CCM (mélange 7/3 de toluène/acétone) a montré une réaction complète. De la TEA a été ajoutée jusqu'à pH neutre, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/acétone) pour donner le composé 12 dans un rendement de 55 % (314 mg) sous la forme d'un solide amorphe. HR ESI-MS m/z CisgH^sNsOsgSi [M+Na]+ 2506, 9235 ; trouvé 2506,9224.
BE2017/5163
RMN BH (400 MHz, CDC13) δ 8,28-7,11 (m, 59H, H-Ar),
5,73 (ddd, J = 2,2, 6,0, 9,2 Hz, 1H, H-8E) , 5,54 (dd,
J= 8,0, 10,2 Hz, 1H, H-2D) , 5,37 (m, J= 3,5 Hz, 1H, H7e), 5,28-5,22 (m, 3H, H-1D, H-4B, H-4D) , 5,17 (d, J =
8,4 Hz, 1H, H-lc) , 4,96-4,61 (m, 9 H, y compris m, 4,81, H-4E et m, 4,62, H-6E) , 4,48-4, 00 (m, 15H) , 3, 89-3,79 (m, 7H, y compris m, 5,02, H-5E, et s, 3,83, COOCH3) , 3,653,62 (m, 1H) , 3,59-3,50 (m, 1H, OCH2b) , 3,45-3,24 (m,
| 10H), 2,97-2,95 | (m, | 1H) , | 2,46 (dd, J | =4,5, 12,6 Hz, 1H, |
| H-3e E), 2,18, 2, | 15, | 2, 11, | 2,03, 1,96 | (5 x s, 3H chacun, |
| 5 CH3CO) , 1, 89-1 | ,80 | (m, 5 | H, CH2CH2N3, | y compris s, 1,83, |
| CH3CO) , 1,70 (t, | J = | 12,0 | Hz, H-3a E), | 1,60 (s, 9H, t-Bu) . |
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 17 0,70-164, 81 (C=O) ,
138, 91-125,28 (C-Ar), 103,39 (C-1A/B) , 102,00 (C-1A/B) ,
| 99, 88 | (C-1D) , | 97,45 | (C-lc) , | 82,48, | 81,61, 80,05, | 78,43, |
| 78,31, | 77,32, | 77,21 | , 77,01, | 76, 69, | 75,52, 75,43, | 75,08, |
| 75,00, | 74,85, | 74,72 | , 74,30, | 74,14, | 73,31, 73,00, | 72,61, |
| 72,27, | 72,21, | 71,71 | , 70,80, | 69,78, | 69, 30, 68,58, | 68,14, |
| 67,83, | 67,69, | 66, 54 | , 66,35, | 62,51, | 62,11, 56, 54 | (C-2C) , |
| 53, 04 | (C-5E) , | 49, 02 | (COOCH3) , | 48,27 | (CH2N3), 37,39 | (C-3E) , |
| 29,26 | (C(CH3)3 | ), 29, | 21 (CH2CH2N3), 26, 80 (C(CH3)3), | 23, 16, | ||
| 21,44, | 21,21, | 20,75 | , 20,71, | 19,36 | (6 x CH3CO) . |
Exemple 6 - Synthèse du fragment 2 (figure 6)
Schéma 2. Réactifs et conditions : a. HO(CH2)3N3,
NIS, TfOH, 84 % ; b. mélange 4/1 d'AcOH-H2O, 70 °C ; TBDPSC1, DMAP, Py, 60 °C, 70 % (sur 2 étapes) ;
c. TMSOTf, DCM, 70 % ; d. HF-Py, mélange 4/1 de THF-Py, °C à TA, 78 % ; e. AgOTf, DCM, 68 % ; f. LU, Py,
120 °C ; H2NCH2CH2NH2, EtOH, 90 °C ; Ac2O-Py ; NaOMe,
MeOH ; H2, Pd-C, 42 %.
BE2017/5163
4,6-0-Benzylidène-3-0-benzyl-2-désoxy-2phtalimido-ß-D-glucopyranoside de 3-azidopropyle 13
Une solution du composé 7 (2,0 g, 3,45 mmol) et de 3-azido-l-propanol (707 mg, 7,0 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 3,0 g) dans du DCM (25 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du NIS (1,57 g, 7,0 mmol) et du TfOH (61 μΐ, 0,7 mmol) ont été ajoutés à -10 °C. Après 12 h (CCM ; mélange 7/3 de cyclohexane/ EtOAc), la réaction a été neutralisée avec de la TEA, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 13 dans un rendement de 84 % (1,65 g) sous la forme d'une huile jaune. Les données de RMN concordaient avec celles rapportées dans la littérature (J Carbohydr Chem 24: 755-769, 2005).
Îianir
E!
3-O-Benzyl-6-0-t-butyldiphénylsilyl-2-désoxy-2phtalimido-ß-D-glucopyranoside de 3-azidopropyle 14
Le monosaccharide 13 (1,65 g, 2,9 mmol) a été mis en suspension dans un mélange 4/1 d'AcOH/thO (40 ml). La
BE2017/5163 réaction a été réchauffée à 70 °C et laissée sous agitation pendant 4 h. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 6/4 de cyclohexane/EtOAc) pour produire du 3-0-benzyl-2-d0soxy-2-phtalimido-ß-Dglucopyranoside de 3-azidopropyle dans un rendement de 89 % (1,24 g, 2,6 mmol) sous la forme d'une huile jaune pâle.
Le matériau a été dissous dans de la pyridine (20 ml) . Du TBDPSC1 (1,34 ml, 5,2 mmol) et de la DMAP (65 mg, 0,52 mmol) ont été ajoutés et la solution a été agitée pendant une nuit à 60 °C, moment auquel la réaction a été complète (CCM, mélange 8/2 de cyclohexane/EtOAc) . Le mélange a été dilué avec du DCM et lavé avec de l'eau. La phase organique a été séchée avec du Na2SC>4 et évaporée à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 17 dans un rendement de 79 % (1,48 g) sous la forme d'une huile jaune pâle. HR ESI-MS m/z C4oH44N407Si [M+Na]+ 743,2877 ; trouvé 743,2819.
| RMN | 3Η (400 | MHz, | CDC13) δ 8, 12-6, 84 (m, | 19H, H-Ar), | ||
| 5, | 17 | (d, | J = 8,4 | Hz, 1H, H-l), 4,82, 4,59 (2 | d, J = 12,2 | |
| Hz | r | 1H, | CH2Ph) , | 4,30 | (dd, J = 10,7, 8,5 Hz | , 1H, H-3), |
| 4, | 17 | (dd | , J = 10 | ,7, 8 | ,5 Hz, 1H, H-2), 4,06-3 | , 96 (m, 2H, |
| 2 | x | H-6) | , 3,92 | (t, J | = 9,0 Hz, 1H, H-4), 3, | 76-3,82 (m, |
1H, OCH2a) , 3,63 (dt, J= 9,8, 5,1 Hz, 1H, H-5) , 3,543,40 (m, 1H, OCH2b) , 3,12 (m, 2H, CH2CH2N3) , 1,78-1,57 (m, 2H, CH2N3), 1,13 (s, 9H, t-Bu) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 167,81 (CO), 138,22127,41 (C-Ar), 98,14 (C-l), 78,79 (C-3), 74,60, 74,38,
74,33 (CH2Ph, C-4, C-5), 65, 82 (OCH2) , 65, 09 (C-6), 55,35 (C-2), 48, 00 (CH2N3), 31,04 (C(CH3)3), 28,81 (CH2CH2N3),
26, 82 (C(CH3)3).
BE2017/5163
0- [4,7,8,9-Tétra-O-acétyl-5-(N-acétamido)-3,5didésoxy-D-glycéro-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate de méthyle]-(2^3)-Ο-(2,4,6-tri-O-benzoyl-ß-D-galactopyranosyl)-(1^4)-3-O-benzyl-6-O-t-butyldiphénylsilyl-2d0soxy-2-phtalimido-ß-D-glucopyranoside de 3-azidopropyle 16
Une solution du disaccharide donneur 11 (500 mg,
0,44 mmol) et de l'accepteur 14 (320 mg, 0,44 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 800 mg) dans du DCM (8 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du TMSOTf (16 μΐ, 0,088 mmol) a été ajouté à -10 °C. Après agitation pendant 10 h à TA, la CCM a montré une réaction complète (mélange 7/3 de toluène/acétone). De la TEA a été ajoutée jusqu'à pH neutre, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/acétone) pour donner le composé 16 dans un rendement de 70 % (520 mg) sous la forme d'un solide vitreux. HR ESI-MS m/z C87H93N5O27Si [M+Na]+ 1690,5275 ; trouvé 1690,5801.
RMN ΧΗ (400 MHz, CDC13) δ 8,32-6, 52 (m, 34H) , 5,57 (dd, J = 7,2, 9,0 Hz, 1H, H-2B) , 5,45 (d, J = 3,3 Hz, 1H,
H-4B) , 5,35 (d, J= 7,8 Hz, 1H, H-1A) , 5,27 (dd, J= 9,2,
BE2017/5163
2,4 Hz, 1H, H-8C), 5,02 (d, J= 10,0 Hz, H-1B) , 5,04-4,93 (m, 1H) , 4, 80-4,77 (m, 2H) , 4,71 (d, J = 12,4 Hz, 1H,
CHHPh) , 4,43-4,17 (m, 8H) , 4,10 (dd, J= 10,6, 8,6 Hz, 1H) , 4,02 (dd, J= 12,6, 4,6 Hz, 1H) , 3, 92-3,77 (m, 3H) ,
3,73 (s, 3H, COOCH3), 3,66 (dd, J = 10,8, 2,5 Hz, 1H) ,
3,58-3,53 (m, 1H, OCH2b) , 3,31 (d, J = 9, 6 Hz, 1H, H-6b A),
3,23-3,17 (m, 1H, H-5B) , 3,01 (t, J= 6,8 Hz, 2H, CH2N3) ,
2,41 (dd, J= 12,7, 4,6 Hz, 1H, H-3e c) , 2,12, 1,98, 1,91,
1,81 (5 x s, 3H chacun, 5 x CH3CO) , 1,70-1, 67 (m, 2H,
CH2CH2N3), 1, 62-1, 60 (m, 4H, CH3CO, H-3a c) , 1,07 (s, 9H, t-Bu).
O- [4,7,8,9-Tétra-O-acétyl-5-(N-acétamido)-3,5didésoxy-D-glycéro-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate de méthyle]-(2^3)-O-(2,4,6-tri-O-benzoyl-ß-D-galactopyranosyl)-(1^4)-3-0-benzyl-2-d0soxy-2-phtalimido-ß-Dglucopyranoside de 3-azidopropyle 17
Le trisaccharide 16 (520 mg, 0,31 mmol) a été mis en suspension dans un mélange 4/1 de THF/pyridine (10 ml) Du HF-py (930 μΐ) a été ajouté à 0 °C. La solution a été agitée pendant une nuit (CCM, mélange 7/3 de toluène/acétone), puis la réaction a été diluée avec du DCM et lavée avec de l'eau. La phase organique a été séchée avec du Na2SC>4 et évaporée à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/acétone) pour donner le composé 17 (345 mg) dans un rendement de 78 % sous la forme d'un solide
BE2017/5163 vitreux. HR ESI-MS m/z C7iH75N5O27 [M+Na]+ 1452,4547 ;
trouvé 1452,4557.
RMN 3Η (400 MHz, CDC13) δ 8,51-6,53 (m, 24H, H-Ar),
5,83 (td, J = 9,3, 2,4 Hz, IH, H-8C) , 5,55 (dd, J = 8,3,
| 10,5 H | z, | IH, | H-2B) | , 5,32 (d, J = 3,2 Hz, | IH, H-4B) , 5,20 |
| (d, J | = | 10,2 | Hz, IH, H-1A) , 5,13 (m, 2H, | H-7C, NH) , 5,02 | |
| (d, J | = | 8,5 | Hz, | IH, H-1B), 4,91 (d, J | = 12,5 Hz, IH, |
| CHHPh) | r | 4,87 | (dd, | J = 3,0, 10,5 Hz, IH, H | -3B) , 4,80 (dd, |
| J = 4, | 5, | 10, | 7 Hz, | IH, H-4C, ) , 4,61 (d, J | = 12,5 Hz, IH, |
| CHHPh) | r | 4,55 | (dd, | J = 11,9, 2,4 Hz, IH, | H-6C), 4,49 (t, |
| J = 9, | 0 | Hz, | IH, H | -6a B), 4,30-4, 09 (m, 5H, | H-2B, H-3A, H- |
5B, H-6bB, H-6aA), 3,95 (dd, J= 3,2, 9,0 Hz, IH, H-9ac) , 3, 89-3,75 (m, 7H, H-2A, H-4A, H-9bc, OCH2a, y compris s,
3,82, COOCH3), 3,63 (dd, J = 10,7, 2,7 Hz, IH, H-5A) ,
3,39-3,29 (m, 2H, OCH2b, H-6b A), 3,16-2,99 (m, 2H, CH2N3) ,
2,47 (dt, J = 13,6, 6,8 Hz, IH, H-3e c) , 2,18, 2,12, 1,75 (4 x s, 3H chacun, 4 x CH3) , 1,70-1,57 (m, 3H, H-3a E,
CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 172,22, 171,43, 170, 98,
170,78, 170,60, 170,37, 170,25, 170,12, 169,17, 168,02,
| 167,58, 165,94, 165,83, | 165 | , 68, 165,49, | 165,20 | (C=O), | |||
| 138,59-123, 18 | (C-Ar), | 100 | , 97 | (C-1B) , | 98,19 | (C-1A) , | 96, 82 |
| (C-2C) , 78,04 | (C-3A) , | 76, | 47 | (C-4A) , | 75,20 | (C-5A) , | 74, 44 |
| (CH2Ph) , 71,73 | (C-3B) | , 71 | ,59 | (C-2B) , | 71,46 | (C-5B) , | 70, 62 |
| (C-6C) , 69,39 | (C-4B) , | 68, | 30 | (C-8C) , | 67,36 | (C—4e) , | 66, 78 |
(C-7C) , 65, 87 (OCH2), 63,77 (C-9C), 61,71 (C-6A/B), 60,16 (C-6A/B), 55, 67 (C-2A) , 53,17 (C-5C) , 48,53 (COOCH3) ,
47,91 (CH2N3), 37,31 (C-3C) , 28,72 (CH2CH2N3), 23, 02,
21,41, 21,35, 20,81, 20, 68, 20,45 (CH3CO).
BE2017/5163
Ο- [4,7,8,9-Tétra-O-acétyl-5-(N-acétamido)-3,5didésoxy-D-glycéro-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate de méthyle]-(2^3)-O-(2,4,6-tri-O-benzoyl-ß-D-galactopyranosyl)-(1^4)-[ (2,3,4,6-tétra-0-acétyl-p-D-galactopyranosyl)-(1^4)-(2,3,6-tri-0-ac0tyl-ß-D-glucopyranosyl)-(1^6)]-3-0-benzyl-2-d0soxy-2-phtalimido-ß-Dglucopyranoside de 3-azidopropyle 18
Une solution du trisaccharide accepteur 18 (345 mg, 0,24 mmol) et du donneur 17 (420 mg, 0,60 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 800 mg) dans du DCM (8 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. De 1'AgOTf (77 mg, 0,30 mmol) a été ajouté à 0 °C. Puis le mélange réactionnel a été agité pendant 10 h à TA, lorsque la CCM (mélange 7/3 de toluène/acétone) a montré une réaction complète. De la TEA a été ajoutée, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé à pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/acétone) pour donner le composé 18 (300 mg, 0,14 mmol) dans un rendement de 68 % sous la forme d'un solide vitreux. HR ESI-MS m/z C97H109N5O44 [M+Na]+ 2070, 6343 ; trouvé 2070, 6296.
RMN 2Η (400 MHz, CDC13) δ 8,26-6, 73 (m, 24H, H-Ar) ,
5,73 (ddd, J = 2,2, 6,0, 9,2 Hz, 1H, H-8E) , 5,53 (dd,
J = 8,3, 10,5 Hz, 1H, H-2B) , 5,36-5,31 (m, 2H) , 5,2554
BE2017/5163
4,79 (m, 11H), 4-59-4,40 (m, 5H), 4,30-3,62 (m, 20 H, y compris s, 3,82, COOCH3) , 3,41-3,38 (m , 1H) , 3,15-3,07 (m, 2H, CH2N3), 2,47 (dt, J = 12,8, 4,6 Hz, 1H, H-3e c) ,
2,28, 2,19, 2,18, 2,17, 2,16, 2,11, 2,06, 2,05, 2,03, 1, 98, 1, 91, 1,75 (12 x s, 3H chacun, 12 x CH3) , 1, ΙΟΙ, 59 (m, 3H, H-3a E, CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 170, 91, 170,76, 170,52,
170,38, 170,22, 170,16, 170,10, 169,34, 168,15, 165,50, 164, 99 (C=O) , 133,76-123,28 (C-Ar), 101,34 (C-1D/E) ,
| , 03 | (C-1D/E), 100,72 (C-1B), 97,69 | (C-1A), 96, 91, 79, 63 | ||||
| 18, | 75,05, | 74,69, | 72,96, | 72,37, | 71,74, 71,59, 71, | 44, |
| 35, | 71,16, | 71,05, | 70,97, | 70, 86, | 70, 69, 70,57, 69, | 40, |
| 00, | 68,19, | 6 6, 69, | . 66,58, | 66, 17 | (4 x C-6) , 55, 68 | (C- |
2A) , 53,19 (C-5C) , 48,70 (COOCH3) , 47,96 (C-3C) , 28, 67 (CH2CH2N3), 23, 11, 22, 68,
20,80, 20,75, 20,73, 20,65, 20,54, 20,52 (CH2N3), 37,25
21,44, 20, 86, (12 x CH3CO) .
Exemple 7 - Synthèse du fragment 3 (composé 3) (figure 7) Schéma 3. Réactifs et conditions : a. NaOMe, MeOH ;
mélange 9/1 de (CH3) 2C (OCH3)2-DMF, PTSA, 50 °C, puis TEA, mélange 9/1 de MeOH-H2O, 90 °C ; BnBr, Na H à 60 %, DMF, 59 % (sur 3 étapes) ; b. mélange 4/1 d'AcOH-H2O, 70 °C ; (EtO)3CCH3, PTSA, CH3CN, puis mélange 4/1 d'AcOH-H2O, 80 % (sur 3 étapes) ; c. NIS, TfOH, DCM, -20 °C, 72 % ; d. BH3-Me3, BF3-Et2O, CH3CN, 64 % ; e. TMSOTf, DCM, 72 % ; f. DDQ, mélange 4/1 de DCM-MeOH, 85 % ; e. 65 % ; g. Lil, Py, 120 °C ; H2NCH2CH2NH2, EtOH, 90 °C ; Ac2O-Py ; NaOMe, MeOH ; H2, Pd-C, 55 % ; h. NaOMe, MeOH ; acétal diméthylique de naphtylidène, DMF, PTSA, 50 °C ; BnBr,
NaH à 60 %, DMF, 63 % (sur 3 étapes).
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2,6-O-Benzyl-3,4-0-isopropylidöne-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 20
Le composé 19 (3,0 g, 6,77 mmol) a été dissous dans du DMF sec (40 ml) sous une atmosphère d'azote. La solution a été refroidie à 0 °C, et une dispersion dans de l'huile minérale de NaH à 60 % (704 mg, 17,6 mmol) a été ajoutée par parties. Après 20 min, du BnBr (3,2 ml, 27,08 mmol) et du TBAI (2,5 g, 6,7 mmol) ont été ajoutés. La réaction a été agitée pendant une nuit à TA (CCM, mélange 8/2 de cyclohexane-EtOAc), puis neutralisée par l'addition de MeOH et de TEA. Après élimination du solvant sous pression réduite, le produit brut a été dissous dans du DCM et lavé deux fois avec du NaHCCg aqueux et deux fois avec de l'eau. Les phases organiques ont été combinées, séchées avec du Na2SO4, filtrées et évaporées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash pour donner le composé
| 20 dans | un rendement de 8 5 | % (2, | 75 g) . HR | ESI | -MS | m/z |
| C26H33N3O6 | [M+Na]+ 506,2267 ; | trouvé | 506,2214. | |||
| RMN | 3Η (400 MHz, CDCI3) | δ 7,54 | -7,23 (m, | 10H, | c- | Ar) , |
| 4,84 (s, | 2H, CH2Ph) , 4,67, | 4, 60 | (d, J = 12 | ,0 | Hz, | IH, |
| CH2Ph) , 4 | , 34 (d, J = 8, 0 Hz, | IH, H- | -1), 4,24-4 | ,12 | (m, | 2H, |
| H-3, H-4) | , 4,05-4,03 (m, IH, | OCH2a) | , 3,96 (t, | J = | 5, 9 | Hz, |
| IH, | H-6a), 3,86-3,79 | (m, | 2H, | H-5, H-6b) , 3, 68-3, 64 | (m, |
| IH, | OCH2b) , 3,49-3,39 | (m, | 3H, | CH2N3, H-2), 2,04-1,83 | (m, |
| 2H, | CH2CH2N3) , 1,41, 1 | ,37 | (2 x | s, 3H chacun, 2 x CH3) | • |
BE2017/5163
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 12 8,50-127, 62 (C-Ar,
C(CH3)2), 102,81 (C-l), 79, 59 (C-2), 79, 06 (C-4), 73,81 (C-3), 73,58 (CH2Ph), 73,55 (CH2Ph), 72,24 (C-5), 69,51 (C-6) , 66, 37 (OCH2), 48,33 (CH2N3) , 29, 22 (CH2CH2N3), 27,79, 26, 33 (2 x CH3) .
>]:iï «
4-O-Acétyl-2,6-O-benzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 21
Le composé 20 (2,75 g, 5,7 mmol) a été mis en suspension dans un mélange 4/1 d'AcOH/H2O (50 ml) . La réaction a été réchauffée à 70 °C pendant 2 h, lorsque la CCM (mélange 7/3 de cyclohexane/EtOAc) a montré la disparition du matériau de départ et la formation d'une tache avec un Rf inférieur. Le solvant a été éliminé à pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/EtOAc) pour produire le 2,6-O-benzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle dans un rendement de 92 % sous la forme d'une huile (2,30 g). HR ESI-MS m/z C23H29N3O6 [M+Na]+ 446, 1954 ; trouvé 446,1954.
| RMN 3Η (400 MHz, CDC13) | δ 7,43-7,19 (m, 10H, H-Ar) | |||
| 4, 89, 4, 67 (2 x | d, J = 11,5 | Hz, IH, CH2Ph) , 4,56 | (s, | IH |
| CH2Ph) , 4,33 (d, | J = 7,6 Hz, | IH, H-l), 4,06-3,89 | (m, | 2H |
| H-4, OCH2a) , 3,74 (m, 2H, 2 | x H-6), 3,60 (m, 3H, | H-3 | , H | |
| 5, OCH2b), 3,49 | (m, IH, H-2 | ), 3,38 (t, J = 6,8 | Hz, | 2H |
CH2N3), 1, 92-1, 88 (m, 2H, CH2CH2N3) .
BE2017/5163
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 13 8,44-127, 67 (C-Ar),
103, 60 (C-l), 79, 30 (C-2), 74, 67 (CH2Ph) , 73, 60 (CH2Ph) ,
73,37 (C-5), 73,15 (C-3) , 69, 36 (C-6) , 68, 99 (C-4) , 66,39 (OCH2), 48,31 (CH2N3), 29,21 (CH2CH2N3).
Le diol a été dissous dans du CH3CN (30 ml) , puis de l'orthoacétate de triéthyle (2,8 ml, 15,6 mmol) et du PTSA (208 mg, 1,04 mmol) ont été ajoutés. La réaction a été agitée à TA pendant 4 h (CCM, mélange 6/4 de cyclohexane/EtOAc), puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été dissous dans un mélange 4/1 d'AcOH/H2O (50 ml) et après 2 h, le mélange a été concentré. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 21 dans un rendement de 87 % (2,20 g) sous la forme d'une huile jaune pâle. HR ESI-MS m/z C2sH31N3O7 [M+Na]+ 508,2060 ; trouvé 508,2072.
RMN 3H (400 MHz, CDC13) δ 7,38-7,28 (m, 10H, H-Ar),
5,38 (dd, J = 3,6, 0,8 Hz, H-4), 4,94, 4,71 (2 x d, J =
| 10, 9 Hz, 2H, CH2Ph) , | 4,58, 4,48 | (2 x d, J = | 11,9 Hz, 2H, |
| CH2Ph) , 4,41 (d, J = | 7,8 Hz, 1H | , H-l), 4,12- | -4,09 (m, 1H, |
| H-6a), 4,07-4,01 (m, | 1H, OCH2a) | , 3,79-3,76 | (m, 2H, H-5, |
| H-6b) , 3, 69-3, 67 (m, | 1H, OCH2b) | , 3,61-3,49 | (m, 1H, H-2, |
| H-3), 3,42 (t, J = 6, | 6 Hz, 2H, | CH2N3), 2,09 | (s, 3H, CH3), |
1, 95-1, 90 (m, 2H, CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 171,26 (CO), 138,27127,78 (C-Ar), 103, 88 (C-l), 79, 37 (C-2), 74, 93 (CH2Ph) ,
| 73, 64 | (CH2Ph), 72,46 (C-5 | ) , 71, | 94 (C-3) | I, 68,48 (C-6), |
| 68,06 | (C-4), 64, 99 (OCH2), | 48,30 | (CH2N3) , | 2 9,19 (CH2CH2N3), |
| 21,07 | (CH3) . |
BE2017/5163
Phénylthio-4,6-0-naphtylidène-2-désoxy-2phtalimido-glucopyranoside 23
La phénylthio-glucosamine protégée 22 (5 g,
13,1 mmol) a été désacétylée par traitement pendant une nuit avec du NaOMe dans du MeOH jusqu'à pH 9 à 10. Le mélange a été neutralisé avec de la Dowex H+, puis il a été filtré. Le filtrat a été concentré et dissous dans du CH3CN (20 ml) auquel de 1 ' acétal diméthylique de naphtyl-benzaldéhyde fraîchement préparé (5 équivalents) et du PTSA (0,2 équivalent) ont été ajoutés. Après agitation pendant une nuit, le mélange brut a été purifié sur gel de silice (cyclohexane-EtOAc) pour donner 3,5 g de produit, qui a été utilisé directement pour la benzylation.
A une solution du sucre 3-OH (3,7 g, 9,4 mmol) dans du DMF (20 ml), du NaH à 60 % dans de l'huile minérale (587 mg, 14,1 mmol) a été ajouté à 0 °C sous une atmosphère d'azote. Après agitation pendant 20 min, du BnBr (3,3 ml, 28,5 mmol) a été ajouté et le mélange a été agité pendant une nuit. Le mélange brut a été partagé dans de l'eau (x 3), et les phases organiques combinées ont été concentrées et purifiées sur du gel de silice (cyclohexane-EtOAc) pour fournir le monosaccharide 23 (5,3 g) sous la forme d'un solide blanc (rendement de 69 % sur trois étapes) . HR ESI-MS m/z C3gH31NO6S [M+Na] + 626,1613 ; trouvé 626,1607.
RMN ΧΗ (400 MHz, CDC13) δ 7,78-6, 77 (m, 21H, H-Ar) ,
5,70 (s, 1H, CHNap), 5,58 (d, J= 10,5 Hz, H-l), 4,70,
BE2017/5163
| 4,42 (2 x | d, J = | = 12 | ,3 Hz, 2H, CH2Ph) , | 4,41-4,32 | (m, 2H, |
| H-3, H-6a) | , 4,24 | (t, | J = 10,0 Hz, H-2), | 3,82 (t, | J = 10,1 |
| Hz, H-6b), | 3,79 | (t, | J = 8,9 Hz, H, 4) , | 3,72-3,65 | (m, 1H, |
H-5) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 167,82 (CO), 137,70123,40 (C-Ar), 101,53 (CHNap), 84,16 (C-l), 82,93 (C-4), 75,46 (C-3), 74,23 (CH2Ph), 70,44 (C-5), 68,77 (C-6),
54,75 (C-2) .
3-O-Benzyl-4,6-0-naphtylidène-2-désoxy-2phtalimido-glucopyranosyl-(IAS )-4-O-acétyl-2,6-di-Obenzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 24
Une solution du donneur 23 (800 mg, 1,27 mmol) et de l'accepteur 21 (514 mg, 1,05 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 1,2 g) dans du DCM (12 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du NIS (570 mg, 2,54 mmol) et du TfOH (22 μΐ, 0,254 mmol) ont été ajoutés à -20 °C. Après agitation pendant 3 h (CCM, mélange 7/3 de toluène/EtOAc), le mélange réactionnel a été neutralisé avec de la TEA, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/EtOAc) pour donner le composé 24 dans un rendement de 72 % (7 60 mg) sous la forme d'une huile jaune. HR ESI-MS m/z C57H56N4O43 [M+Na] +
1027,3742 ; trouvé 1027,3769.
BE2017/5163
RMN 3Η (400 MHz, CDC13) δ 8,15-6,71 (m, 26H, H-Ar),
5,81 (s, 1H, CHNap), 5,46 (d, J= 8,3 Hz, 1H, H-1B) , 5,42 (d, J= 3,3 Hz, 1H, H-4A) , 4,83 (t, J= 11,4 Hz, 2H, 2 x CHHPh) , 4, 69-4,33 (m, 5H, 4 x CHHPh, H-3B) , 4,26 (d, J =
8,0 Hz, 1H, H-1A) , 4,22 (dd, J = 7,9, 10,2 Hz, 1H, H-2B) ,
3, 97-3, 80 (m, 5H, 2 x H-6A'B, OCH2a) , 2,3 4 (dd, J = 9,6,
3,4 Hz, 1H, H-3A) , 3,72-3, 60 (m, 1H, H-5A) , 3,58-3,42 (m,
4H, OCH2b, H-5B, H-2A, H-4B) , 3,18 (dd, J= 10,1, 6,4 Hz, 2H, CH2N3), 2,14 (s, 3H, CH3CO) , 1,75-1, 69 (m, 2H, CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 171,48, 167,38 (CO),
134,00-123, 16 (C-Ar), 103,47 (C-1B) , 101,60 (CHNap),
99, 07 (C-1A), 82, 91, 82,73, 78, 71, 78,39, 74,50, 74,35, 74,30, 74,20, 74, 01, 73, 67, 72,76, 69, 72 (C-4A) , 69, 03, 68,71 (2xC-6), 68,55 (OCH2) , 56, 07 (C-2B) , 48,05 (CH2N3) , 28, 99 (CH2CH2N3), 20,89 (CH3CO).
3-O-Benzyl-4-0-(2-naphtyl)méthylène-2-désoxy-2phtalimido-glucopyranosyl-(1^3)-4-O-acétyl-2,6-di-Obenzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 25
Le disaccharide 24 (760 mg, 0,75 mmol) a été
| dissous dans | du CH3CN | (15 ml). La solution | a | été | |
| refroidie | à | 0 °C et du complexe BH3-NMe3 | (275 | mg, | |
| 3,75 mmo1) | et | du BF3Et2O | (470 μΐ, 3,75 mmol) | ont | été |
| aj outés . | La | solution a | été agitée pendant | 6 h | en |
| maintenant | la | température | à 0 °C (CCM, mélange | 7/3 | de |
toluène/EtAOc), puis la réaction a été neutralisée par
BE2017/5163 l'addition de TEA et de MeOH. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/EtOAc) pour donner le composé 25 dans un rendement de 64 % (483 mg, 0,48 mmol) sous la forme d'une huile jaune. HR ESI-MS m/z C57H58N4O13 [M+Na]+ 1029,3898 ; trouvé 1029,3902.
RMN BH (400 MHz, CDC13) δ 7, 86-7,37 (m, 26H, H-Ar),
5.64 (d, J= 3,4 Hz, 1H, H-4A) , 5,41 (d, J= 8,5 Hz, 1H,
H-1B), 5, 04, 4, 92 (2 d, J = 11,1 Hz, 2H, CH2Ar) , 4,864,73 (m, 2H, 2 CHHPh) , 4,48-4,25 (m, 5H, 4 CHHPh, H-3B) ,
4,21 (d, J = 9, 0 Hz, 1H, H-1A) , 4,18 (dd, J = 8, 0, 10,1 Hz, 1H, H-2B) , 4, 06-3, 88 (m, 2H, 2 x H-6aA'B), 3, 87-3, 82 (m, 1H, OCH2a) , 2,12 (t, J= 9,0 Hz, 2H, H-6bA'B), 3,69-3,67 (m, 1H, OCH2b) , 3,50-3,34 (m, 5H, H-2A, H-3A, H-4B, H5A'B) , 3,17-2,98 (m, 2H, CH2N3) , 2,08 (s, 3H, CH3CO) , 1,721.65 (m, 2H, CH2CH2N3) .
| RMN 13C | (101 MHz, CDC13) δ 171,51, | 167,42 | (CO) , | |||
| 134 | ,11-123,13 | (C-Ar), 103,44 | (C-1B) , | 99,56 | (C-1A) , | 81,11, |
| 79, | 15, 78,77, | 78,42, 77,79, | 77,23, | 75,71, | 75,20, | 74, 89, |
| 73, | 76, 73,38, | (4 x CH2Ar), | 72,38, | 69, 92 | (C-4A) , | 68,08, |
| 68, | 81 (2 x C-6) , 61,50 (OCH2) | , 56,11 | (C-2B) | , 48,01 | (CH2N3) |
28, 96 (CH2CH2N3), 21,23 (CH3CO).
2-O-Acétyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ß-D-glucopyranosyl(1^6)-3-O-benzyl-4-O-(2-naphtyl)méthylène-2-désoxy-262
BE2017/5163 phtalimido-ß-D-glucopyranosyl-(1^3)-4-O-acétyl-2,6-diO-benzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 27
Une solution des composés 25 (483 mg, 0,48 mmol) et 26 (413 mg, 0,62 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 800 mg) dans du DCM (8 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du TMSOTf (23 μΐ, 0,12 mmol) a été ajouté à -10 °C. Après agitation du mélange réactionnel pendant 12 h à TA, de la TEA a été ajoutée jusqu'à pH neutre, le solide a été séparé par filtration et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (mélange 8/2 de toluène/EtOAc) pour donner le composé 27 dans un rendement de 72 % (504 mg). HR ESI-MS m/z C86H88N4O19 [M+Na]+ 1503, 5940 ; trouvé 1503,5855.
RMN 3H (400 MHz, CDC13) δ 7,76-6, 55 (m, 41H, H-Ar),
5,42 (d, J = 3,2 Hz, 1H, H-4A) , 5,34 (d, J = 8,3 Hz, 1H,
| H-1B | ) , 5,06 (t, J = 8,8 | Hz, | 1H, H-2C) , | 4,97-4,72 | (m, | 5H, |
| 5 x | CHHPh) , 4,65 (d, J | = 12,5 Hz, 1H, | CHHPh), 4, | 60-4 | ,39 | |
| (m, | 9H, 8 x CHHPh, H-lc) , | r 3, | 88-3,64 (m, | 9H), 3,583 | , 30 | (m, |
| 9H) , | 3,26-3, 09 (m, 3H, | y | compris, 3, | 10, CH2N3), | > 2, | 65, |
| 2,10 | (2 x s, 3H chacun | , 2 | x CH3CO) , | 1, 82-1,71 | (m, | 2H, |
CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 171,38, 170,37, 169, 72, 169, 49 (C=O) , 133,59-123, 10 (C-Ar), 103,54 (C-1A) ,
101,34 (C-lc), 98,56 (C-1B) , 82,88, 79, 94, 79, 07, 78, 64,
78,07, 77,60, 77,23, 75,25, 74,92, 74,74, 74,10, 73,69,
73,47 (7 x CH2Ar) , 72,21, 69, 78 (C-4A) , 68, 68, 68,53,
68, 04 (3 x C-6) , 66,71 (OCH2) , 56, 26 (C-2B) , 48, 09 (CH2N3) ,
29, 03 (CH2CH2N3), 22,28, 22,10 (2 x CH3CO) .
BE2017/5163
2-O-Acétyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ß-D-glucopyranosyl(1^6)-3-0-benzyl-2-däsoxy-2-phtalimido-ß-D-glucopyranosyl-(1^3)-4-O-acétyl-2,6-di-O-benzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 28
A une solution du composé 27 (504 mg, 0,34 mmol) dans un mélange 4/1 de DCM/CH3OH (12 ml), de la DDQ (235 mg, 1,02 mmol) a été ajoutée. Le mélange réactionnel a été agité à TA pendant 5 h (CCM, mélange 7/3 de cyclohexane/EtOAc) , puis il a été dilué avec du DCM et partagé avec du NaHCO3 aqueux. La phase aqueuse a été extraite 3 fois avec 20 ml de DCM, puis les phases organiques combinées ont été séchées avec du Na2SO4 et évaporées sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/EtOAc) pour donner le composé 28 sous la forme d'une huile jaune dans un rendement de 85 % (390 mg, 0,29 mmol). HR ESIMS m/z C86H84N4O19 [M+H]+ 1341,5495 ; trouvé 1341,5532.
RMN ΧΗ (400 MHz, CDC13) δ 7,76-6, 55 (m, 34H, H-Ar) ,
5,36 (m, 2H, H-1B, H-4A) , 5,07 (t, J= 8,2 Hz, 1H, H-2C) , 4,89-4,75 (m, 3H, 3 x CHHPh), 4,71-4,41 (m, 8 H, CHHPh, y compris d, 4,66, d, J = 7,9 Hz, H-lc) , 4,24-4, 09 (m,
4H, H-6aA/c, 2 x CHHPh, y compris, 4,12, d, J = 7,0 Hz, H-1A), 4,03-3,61 (m, 10H), 3,59-3, 67 (m, 7H) , 3,15-3,09 (m, 2H, CH2N3) , 2, 02, 2,00 (2 x s, 3H chacun, 2 x CH3CO) ,
1,73-1, 66 (m, 2H, CH2CH2N3) .
RMN 13C (101 MHz, CDC13) δ 171,40, 170,35, 169, 72,
BE2017/5163
| 169,56 | (C=O), | 138,42-123,08 (C-Ar), 103,46 | (C-1A) , |
| 100,42 | (C-1C), | 98,38 (C-1B), 82,70, 78,49, 78,29, | 77,91, |
| 75,03, | 74,78, | 74,23, 74,17, 74,07, 73,88, 73,71, | 73,57, |
| 73,53, | 72,80 | (6 X CH2Ph) , 72,54, 72,26, 69,65 | (C —4A) , |
| 69,12, | 68,20, | 67, 96 (3 x C-6), 66, 76 (OCH2) , 55 | ,72 (C- |
2B) , 48, 07 (CH2N3), 29, 23 (CH2CH2N3), 20, 96, 20,77 (2 x
CH3CO) .
O- [4,7,8,9-Tétra-O-acétyl-5-(N-acétamido)-3,5didésoxy-D-glycéro-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate de méthyle]-(2^3)-O-(2,4,6-tri-O-benzoyl-ß-D-galactopyranosyl)-(1^4)-[(2-O-acétyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ß-Dglucopyranosyl)-(1^6)]-3-0-benzyl-2-désoxy-2phtalimido-ß-D-glucopyranosyl-(1^3)-4-O-acétyl-2,6-diO-benzyl-ß-D-galactopyranoside de 3-azidopropyle 29
Une solution du trisaccharide 28 (390 mg, 0,29 mmol) et du disaccharide donneur (329 mg, 0,29 mmol) avec des tamis moléculaires activés (4 Â, 700 mg) dans du DCM (8 ml) a été agitée pendant 20 min sous azote. Du TMSOTf (11 μΐ, 0,058 mmol) a été ajouté à -10 °C. Après agitation du mélange réactionnel pendant 10 h à TA, suivi par CCM (mélange 7/3 de toluène/acétone), de la TEA a été ajoutée jusqu'à pH neutre, le solide a été séparé
BE2017/5163 par filtration et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit brut a été purifié par chromatographie flash (toluène/acétone) pour donner le composé 29 dans un rendement de 65 % (430 mg) sous la forme d'une mousse. HR ESI-MS m/z C122H129N3O39 [M+Na] + 2310,8162 ; trouvé 2310,8175.
RMN 3Η (400 MHz, CDCI3) δ 8,10-6,62 (m, 49H, H-Ar),
5,59-5, 56 (m, 1 H, H-8E) , 5,41 (dd, J = 7,8, 9,2 Hz, 1H, H-2D) , 5,29-5,27 (s, 2H, H-7E, NH) , 5,18 (dd, J= 2,3,
9,4 Hz, 1H, H-3D) , 5,13 (d, J= 8,3 Hz, 1H, H-1B) , 5,02 (d, J= 7,8 Hz, 1H, H-1D) , 4, 92-4,88 (m, 2H, H-4A, H-4D) , 4,87-4,57 (m, 7H), 4,51-4,25 (m, 9H, y compris d, 4,46,
J= 7,8 Hz, H-lc, et d, 4,26, J= 9,0 Hz, H-1A) , 4,153,94 (m, 8H) , 3,81-3,57 (m, 13H, y compris s, 3,74,
COOCH3), 3,53 (dd, J= 2,3, 10,8 Hz, 1H) , 3, 47-3,26 (m, 5H) , 3,19 (t, J= 8,2 Hz, 1H) , 3,07-3, 02 (m, 2H, CH2N3) , 2,45 (dd, J= 12,5, 4,4 Hz, 1H, H-3e E) , 2,11, 1, 96, 1,85,
1,83, 1,70 (5 x s, 3H chacun, 6 x CH3CO), 1,64-1,53 (m,
3H, H-3a E, CH2CH2N3) , 1,35, 1,18 (2 x s, 3H chacun, 2 x
CH3CO) .
| RMN 13C (101 MHz | ,, CDCI3) δ 17i | 0,73, 17 | 0,55, | 170,27, | ||
| 170 | ,21, | 169, 96, 169, | 13, 168,12, 16 | 7,77, 16 | ,5,71, | 165,55, |
| 165 | ,12 | (C=O), 138, | 55-122,99 (C- | Ar) , 103,41 | (C-1A), | |
| 101 | ,54 | (C-lc), 101,00 | (C-1D), 98,45 | (C-1B), | 96,91, | 82,61, |
| 79, | 17, | 78,55, 78,18, | 77,73, 76, 82, | 75,00, | 74,82, | 74,75, |
| 74, | 62, | 74,50, 74,02, | 73,58, 73,48, | 73,31, | 72,48, | 71,85, |
| 71, | 80, | 71, 65, 70, 67, | 69, 91, 69, 37, | 68,77, | 68,68, | 68,23, |
| 67, | 93, | 67, 61, 66, 61, | 66,20, 62,10, | 61,59 (4 | x C-6) | , 56,11 |
| (C- | 2E) , | 53, 09 (C-5E) , | 48, 87 (COOCH3) | , 48,05 | (CH2N3) | , 37,26 |
(C-3C) , 28, 97 (CH2CH2N3) , 23, 15, 21,43, 21,08, 20, 80,
20,75, 20,71, 20,24 (7 x CH3CO) .
BE2017/5163
Exemple 8 - Déprotection finale des oligosaccharides et des composés 12, 18 et 29
Un mélange de pentasaccharide protégé (0,1 mmol) et de Lil (3 mmol) dans de la pyridine (5 ml) a été chauffé pendant 24 h à 120 °C. Le mélange réactionnel a été concentré sous vide, et le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (gradient de 2 % de MeOH dans du DCM) pour donner le produit déméthylé. Ce matériau a été dissous dans de l'éthanol (4 ml), et de 1'éthylènediamine (400 ml) a été ajoutée. Après agitation pendant 16 h à 90 °C, le mélange réactionnel a été ensuite concentré sous vide, et le résidu a été coévaporé à partir de toluène (2 x 10 ml) et d'EtOH (2x5 ml) . Le mélange brut a été redissous dans de la pyridine (5 ml), et de l'anhydride acétique (5 ml) a été ajouté. Après agitation pendant 16 h à température ambiante, le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du MeOH et du MeONa a été ajouté jusqu'à pH = 13. Après 48 h, la réaction a été neutralisée et le solvant a été éliminé sous vide. Le résidu a été dissous dans du MeOH et du Pd/C (1/1 p/p par rapport au sucre) a été ajouté. Le mélange réactionnel a été agité sous pression de H2 (3 bars) pendant 72 h. Puis, le catalyseur a été séparé par filtration et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le mélange réactionnel a été purifié par chromatographie d'exclusion sur colonne G-10 en utilisant de l'eau pour l'élution. Les fractions contenant le sucre ont été quantifiées par dosage de l'acide sialique et cryodesséchées pour donner les
BE2017/5163 composés oligosaccharidiques déprotégés 1 à 3 sous la forme d'une poudre amorphe (rendement de 31 à 55 %).
O-[5-N-Acétamido-3,5-didésoxy-D-glycéro-a-Dgalacto-non-2-ulopyranosyl-(2AS)-O-(ß-D-galactopyranosyl)- (U4)-0-2-acétamido-2-désoxy-p-D-glucopyranosyl-(U3)-O-ß-D-galactopyranosyl)- (U4)-O-ß-Dglucopyranoside de 3-aminoopropyle 1
HR ESI-MS m/z C4oH69N309 [M+H]+ 1056, 3971 ; trouvé
1056,3966.
O-[5-N-Acétamido-3,5-didésoxy-D-glycéro-a-Dgalacto-non-2-ulopyranosyl-(2AS)-O-( ß-D-galactopyranosyl) - (U4) -O- [ (ß-D-glucopyranosyl) (U6) ] -0-2ac0tamido-2-d0soxy-ß-D-glucopyranosyl-(U3)-O-ß-Dgalactopyranoside de 3-aminoopropyle 2
HR ESI-MS m/z C40H69N3O9 [M+Na]+ 1078,3810 ; trouvé
1078,3810.
O-[5-N-Acétamido-3,5-didésoxy-D-glycéro-a-Dgalacto-non-2-ulopyranosyl-(2AS)-O-( ß-D-galactopyranosyl)- (U4)-O-[ (ß-D-galactopyranosyl)- (U4)-Ο-(ßD-glucopyranosyl)- (U6)]-0-2-ac0tamido-2-d0soxy-ß-Dglucopyranoside 3-aminoopropyle 3
HR ESI-MS m/z C40H69N3O9 [M+H]+ 1056, 3969 ; trouvé
1056,3966.
Les spectres de RMN des composés 1 à 3 sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous :
Table 2
Signaux de RMN 3H et 13C (ppm) des composés 1 à 3 dans de la D2Oa
Composé 2 Composé 1 Composé 3
Résidu m 13C m 13C 3H 13C
Gai î 4,45 103,28 4,43 103, 77 4,39 103, 72
BE2017/5163
| J 7,8 Hz | J 8,2 Hz | J 8,0 Hz | |||||
| 2 | 3,55 | 71,58 | 3,57 | 70, 68 | 3,57 | 70,49 | |
| 3 | 3, 68 | 73, 18 | 3, 72 | 82, 85 | 3, 72 | 83, 08 | |
| 4 | 3, 93 | 6 9,48 | 4,16 | 6 9,05 | 4,16 | 6 9,16 | |
| 5 | 3, 68 | 72, 96 | 3, 66 | 75, 10 | 3, 69 | 75, 70 | |
| 6 | 3, 71 | 61,58 | 3, 65 | 63,16 | 3, 73 | 62,35 | |
| 6 ' | 3,76 | 3, 88 | 3,76 | ||||
| 4,52 | 4,69 | 4, 71 | |||||
| 1 | 101,98 | 103,72 | 103,63 | ||||
| J 7,8 Hz | J 8,2 Hz | J 8,0 Hz | |||||
| 2 | 3, 75 | 5 5,68 | 3, 81 | 55,89 | 3, 80 | 56, 08 | |
| 3 | 3, 72 | 74,23 | 3, 73 | 72, 82 | 3, 73 | 73,40 | |
| GlcNAc | |||||||
| 4 | 3,86 | 77, 98 | 3,76 | 78,50 | 3, 88 | 78,28 | |
| 5 | 3, 72 | 76, 02 | 3, 72 | 7 5,69 | 3, 73 | 74,38 | |
| 6 | 4, 00 | 68, 18 | 3, 95 | 68, 18 | 3, 97 | 68,51 | |
| 6 ' | 4,31 | 3, 95 | 4,30 | ||||
| 4,55 | 4,50 | 4,52 | |||||
| 1 | 103,00 | 102,74 | 103,66 | ||||
| J 7,8 Hz | J 8,5 Hz | J 8,0 Hz | |||||
| 2 | 3,37 | 73,35 | 3,32 | 73,51 | 3,31 | 73, 88 | |
| 3 | 3, 67 | 75, 15 | 3, 64 | 75,38 | 3,52 | 76, 78 | |
| Glc | |||||||
| 4 | 3, 67 | 78, 75 | 3, 65 | 78,58 | 3,40 | 70, 78 | |
| 5 | 3, 68 | 75,54 | 3, 66 | 75,38 | 3,53 | 76,58 | |
| 6 | 3, 84 | 60, 73 | 3, 81 | 60, 62 | 3, 73 | 61,38 | |
| 6 ' | 3, 99 | 3, 96 | 3, 93 | ||||
| 4, 61 | 4,56 | 4, 62 | |||||
| 1 | 102,78 | 103,00 | 102,95 | ||||
| J 7,6 Hz | J 9, 0 Hz | J 7,8 Hz | |||||
| 2 | 3,56 | 69, 89 | 3,57 | 70,22 | 3,57 | 70,28 | |
| 3 | 4, 10 | 75, 93 | 4, 12 | 76, 18 | 4, 10 | 76,48 | |
| Gais | |||||||
| 4 | 3, 96 | 68,27 | 3, 92 | 68, 78 | 3, 97 | 68,40 | |
| 5 | 3, 67 | 75,33 | 3, 71 | 75,56 | 3, 70 | 76, 08 | |
| 6 | 3, 71 | 61, 80 | 3, 74 | 61,85 | 3, 73 | 61, 78 | |
| 6 ' | 3, 75 | 3, 71 | 3,76 | ||||
| 3 | 2,76 | 40,36 | 2,76 | 40,35 | 2,76 | 40,38 | |
| 3 ' | 1, 83 | 1, 80 | 1, 82 | ||||
| 4 | 3, 67 | 69,30 | 3, 68 | 6 9,05 | 3, 68 | 69,38 | |
| 5 | 3, 85 | 52,34 | 3, 85 | 52,36 | 3, 85 | 52,58 | |
| NeuNAc | 6 | 3, 63 | 73, 60 | 3, 62 | 73, 70 | 3, 64 | 74, 05 |
| 7 | 3, 60 | 6 9,05 | 3, 65 | 68, 78 | 3, 60 | 69,25 | |
| 8 | 3, 87 | 72,45 | 3, 87 | 72,59 | 3, 88 | 72, 70 | |
| 9 | 3,86 | 63, 18 | 3, 88 | 63,27 | 3, 87 | 3,54 | |
| 9 ' | 3, 66 | 3, 65 | 3, 66 |
a. Les expériences de RMN ont été réalisées sur un instrument de RMN 500 MHz Bruker équipé d’une sonde TBI refroidie à température contrôlée (± 0,1 °C). L’acquisition et le traitement des données ont été effectués en utilisant le loqiciel TOPSPIN™ 1.3 et 3.1, respectivement.
b. Gais se rapporte au résidu lié à NeuNAc
BE2017/5163
Conjugaison à CRM197
Une solution de SIDEA (10 équivalents) et de TEA (0,2 équivalent) dans du DMSO a été ajoutée au pentasaccharide 13. La réaction a été agitée pendant 3 h, puis le produit a été précipité à 0 °C par addition d'acétate d'éthyle (9 volumes). Le solide a été lavé 10 fois avec de l'acétate d'éthyle (2 volumes à chaque fois) et lyophilisé. Le sucre activé a été conjugué à CRM197 dans du NaPi 100 mM à une concentration de protéine de 5 mg/ml, en utilisant un rapport de 50 à 100/1 de mol de saccharide/mol de protéine.
Exemple 9 - Conjugaison d'oligosaccharides PSIII semisynthétiques à une protéine de support
Pour la réaction de conjugaison à CRM197, des oligosaccharides purifiés provenant d'une dépolymérisation chimique ont été dissous dans 100 mM de tampon phosphate de sodium à pH 7.2. Du CRM197 a été ajouté à la solution dans un rapport molaire ester actif sur protéine variant de 10/1 à 70/1 et une concentration finale de 10 mg/ml en protéine. Puis, du NaBCNH3 a été ajouté à la solution ( saccharide/NaBCNH3, 1/1, p/p) et incubé pendant une nuit à 37 °C. La conjugaison a été suivie par SDS-PAGE avec 4 à 12 % de polyacrylamide dans du MOPS. Les conjugués ont été purifiés à partir du saccharide qui n'a pas réagi sur une colonne d'hydroxyapatite CHT, en utilisant pour l'élution 2 mM de phosphate de sodium/300 mM de NaCl à pH 7,2 (20 ml, 1 ml/min) , ceci suivi de 400 mM de phosphate de sodium à pH 7,2 (40 ml, 1 ml/min) . Lorsque du CRM197 qui n'avait
BE2017/5163 pas réagi était présent, le conjugué a été purifié par chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite CHT en utilisant un programme d'élution en 4 étapes : 2 mM de phosphate de sodium/ 300 mM de NaCl à pH 7,2 (20 ml, 1 ml/min), 10 mM de phosphate de sodium à pH 7,2 (20 ml, 1 ml/min), 35 mM de phosphate de sodium à pH 7,2 (20 ml, 1 ml/min), et 400 mM de phosphate de sodium à pH 7,2 (40 ml, 1 ml/min). Le conjugué a été détecté par mesure de l'absorption UV à 215, 254 et 280 nm. La teneur en protéine dans les glycoconjugués purifiés a été déterminée par micro-BCA (Thermo-scientific). La teneur en saccharide a été estimée par une analyse HPAEC-PAD. Les spectres MALDI TOF des oligosaccharides conjugués sont fournis sur la figure 8A (conjugués des fragments synthétiques 1 à 3) et 8B (conjugués des oligosaccharides), où GD indique le degré de glycosylation.
Tableau 3
Caractéristiques physico-chimiques des glycoconjugués préparés
| Concentration en protéine (pg/ml) | Concentration en saccharide (pg/ml) | Degré de glycosylation (mol/mol) | |
| CRM-f ragraent synthétique III 1 | 1428 | 75 | 3, 0 |
| CRM-f ragraent synthétique III 2 | 1268 | 64 | 3, 0 |
| CRM-f ragraent synthétique III 2 | 1035 | 409 | 23, 0 |
| CRM-f ragraent synthétique III 3 | 1518 | 700 | 27,0 |
| CRM-III DP2 | 1122 | 140 | 3,5 |
BE2017/5163
| CRM-III DP2 | 535 | 160 | 9, 0 |
| CRM-III DP3 | 383 | 44 | 2,0 |
| CRM-III DP3 | 484 | 130 | 4,5 |
| CRM-III DP5 | 639 | 159 | 3, 0 |
| CRM-III DP5 | 349 | 161 | 5,5 |
| CRM-III DP6,5 | 456 | 79 | 1,5 |
| CRM-III DP6,5 | 289 | 110 | 3,5 |
| CRM-III DP11 | 531 | 235 | 2,5 |
| CRM-III PSIII | 725 | 836 | 0,4 |
Exemple 10 - Immunogénicité des conjugués chez des souris
Deux groupes de huit souris BALB/c femelles ont été immunisés par injection intrapéritonéale de 0,5 pg de teneur en saccharide de chague glycoconjugué formulé avec 400 pg d'hydroxyde d'aluminium en tant gu'adjuvant. De l'hydroxyde d'aluminium et CRM-PSIII ont été utilisés en tant gue témoins. Les souris ont reçu les vaccins aux jours 1, 21 et 35. Les sérums ont été prélevés aux jours 1, 21, 35 et 49.
Analyse ELISA : les titres du test ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) indirect des IgG spécifigues du PS ont été déterminés en utilisant du HSA-PSIII en tant gue réactif de sensibilisation. Des plagues de microtitrage (NUNC Maxisorp ; Nalge Nunc International Corp., Rochester, NY) ont l'addition de 100 pi par sensibilisation (1 pg/ml) dans du PBS IX à pH 7,2. Les plagues ont été incubées pendant une nuit à 4 °C et elles ont été lavées avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20 (PBS-T) puis bloguées avec 2 % de sérumalbumine bovine dans du PBS-T pendant 1,5 h à 37 °C. Les puits ont été par de été sensibilisées puits de réactif ensuite remplis avec 100 pi de sérum dilué dans du PBS72
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T + 2 % de BSA et incubés à 37 °C pendant 1 h. Après 3 lavages, 100 μΐ/puits d'IgG anti-souris-phosphatase alcaline ou d'IgG anti-lapin- phosphatase alcaline diluée dans du PBST + 2 % de BSA ont été ajoutés (SigmaAldrich) et les plaques ont été incubées pendant 1,5 h à 37 °C. Les plaques ont été à nouveau lavées 3 fois avec du PBS-T, et finalement 100 μΐ de substrat de peroxydase (4 mg/ml en diéthanolamine pH 9,8) ont été ajoutés dans chaque puits, ceci suivi d'une incubation des plaques pendant 30 min à TA. La réaction a été neutralisée par l'addition de 100 μΐ d'une solution de 7 % d'EDTA et les plaques ont été lues immédiatement à 405 nm.
Test ELISA par compétition : des tests d'inhibition par compétition ont été effectués en suivant la procédure ELISA telle que décrite ci-dessus avec les modifications suivantes. Après l'étape de blocage, en utilisant une plaque de microtitrage en polypropylène à liaison faible (NUNC), le PS III ou ses fragments ont été dilués dans du tampon de dilution (PBS-T + 2 % de BSA) avec une étape de dilution au demi débutant à partir de 2 mg/ml. Ensuite, le même volume d'Acm à une concentration fixée a été ajouté aux puits et la réaction a été laissée interagir pendant 20 min à TA. Après un léger mélange, la réaction a été transférée (100 μΐ/puits) aux plaques sensibilisées et saturées et incubée pendant 1 heure à 37 °C. Le reste de la procédure a été suivi comme il a été décrit ci-dessus.
Test de destruction par opsonophagocytose (OPKA) : l'activité fonctionnelle des sérums a été déterminée dans un test OPKA. Des cellules HL-60 ont été cultivées
BE2017/5163 dans du RPMI 164 0 avec 20 % de sérum de veau fœtal. L'incubation a été réalisée à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules HL-60 se sont différenciées en neutrophiles avec 0,78 % de DMF et après 4 à 5 jours, elles ont été utilisées comme source de phagocytes. Les sérums dilués en série dans du HBSS rouge ont été mélangés avec 6 x 104 CFU par puits de la souche de SGB du sérotype III COH1. Des cellules HL-60 (2 x 106 cellules/puits) et du complément de lapin (dilué à 2 % dans de l'eau) ont été ajoutés et incubés à 37 °C pendant 1 h sous agitation. Avant (T0) et après (T60) l'incubation, les mélanges ont été dilués et plaqués sur des plaques de gélose au sang (Becton-Dickinson). Chaque plaque a été ensuite incubée pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2, comptage des CFU le jour suivant. Le titre OPA a été exprimé sous la forme de l'inverse de la dilution de sérum conduisant à 50 % de destruction des bactéries, et le pourcentage de destruction est calculé comme suit : % de destruction = (T0 - T60)/T0 où T0 représente la moyenne des CFU comptées à T0, et T60 représente la moyenne des CFU comptées à T60 pour les deux réplicats de chaque dilution de sérum.
Analyse par résonance plasmonique de surface (RPS) : les cinétiques et les affinités de liaison ont été déterminées par RPS en utilisant un système BIACORE X100. Les glycoconjugués du PSIII et de ses fragments ont été immobilisés sur des puces de capteurs CM5 de qualité recherche (Biacore) en utilisant le kit de couplage d'amine fourni par le fabricant (Biacore). Les immobilisations ont été conduites dans 10 mM d'acétate de sodium (pH 4,5) à des concentrations de conjugués de
BE2017/5163 mg/ml. La densité de surface immobilisée était de -250 unités de résonance dans chaque cas. Les mesures ont été conduites dans 10 mM de HEPES (pH 7,2), 150 mM de NaCl, 3 mM d'EDTA, 0,005 % de Tween 20 à 25 °C et à un débit de 45 μΐ/min. À la suite de la liaison de l'Acm ou du Fab, les surfaces des conjugués ont été régénérées avec 3,5 M de MgCl2 et un temps de contact de 120 s. Les données des sensorgrammes ont été analysées en utilisant le logiciel BIAevaluation (Biacore) .
Inhibition de la liaison des Fab par RPS : des tests d'inhibition ont été effectués en suivant la procédure de RPS telle que décrite ci-dessus en utilisant une puce de capteur CM5 avec du HSA-PSIII immobilisé. L'analyse de la liaison a été effectuée avec des échantillons de Fab à une concentration fixée préincubés avec le PSIII ou ses fragments dilués en série (2x) en débutant partir d'une concentration de 2 mg/ml.
Résultats
Les données montrent que les conjugués de l'invention comprenant des oligosaccharides fournissent des caractéristiques équivalentes ou améliorées comparativement aux conjugués comprenant des polysaccharides capsulaires natifs pleine longueur.
Les expériences ELISA par compétition utilisant l'Acm de lapin NVS l-19-5m montrent la dépendance à la longueur de la capacité du polysaccharide à inhiber la liaison aux Acm protecteurs anti-PSIII (figure 9a). L'inhibition de la liaison des Acm a légèrement augmenté avec la taille des PS de DP2 à 13 jusqu'à 1 log et se sont retrouvés 5 log supérieurs lorsque le PSIII a été utilisé en tant qu'inhibiteur.
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Pour exclure l'effet de l'interaction des IgG bivalentes des Acm sur l'avidité, il a été effectué un test de RPS par compétition dans lequel des fragments oligosaccharidiques (plage de DPI à 13) ont été testés en tant que compétiteurs pour la liaison du fragment Fab soluble au PSIII conjugué à de la sérumalbumine humaine (HSA) immobilisé sur la puce. Deux populations majeures d'inhibiteurs, DP > 2 et DP < 2, ont été différenciées (figure 9b). Les oligosaccharides DP > 2 ont montré une augmentation de façon asymptotique de l'affinité pour le PSIII natif, avec une différence de seulement 2 log entre le PSIII et le DP2 (figures 9A et 9B). Cette observation a été corroborée par une différence inférieure à un log du Kd pour l'interaction du PSIII et d'un Fab protecteur de lapin-HSA calculé par RPS (comme il est montré dans le tableau 4) . Ces données suggèrent que la partie impliquée dans la liaison n'est pas différente pour les fragments avec une DP > 2.
0 Tableau 4
Constantes cinétiques et d'affinité pour la liaison du
Fab de lapin aux conjugués de CRM
| ka (MU1) | kd (s’1) | Kd (M) | |
| PSIII | 1,4 x 105 (± l,4)a | 3, 6 x ΙΟ’3 (± 0,8) | 2, 6 x ΙΟ’8 |
| DP2 | 3,9 x 104 (± 1,4) | 4,4 x ΙΟ’3 (± 6,1) | 1,1 x ΙΟ’7 |
a Les nombres entre parenthèses sont les ET en %
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Exemple 11 - Analyse ELISA du sérum immun de souris en utilisant des fragments synthétiques en tant que réactifs de sensibilisation
Les glycoconjugués issus des fragments synthétiques DPI 1 à 3 ont été utilisés pour mesurer par un test ELISA les anticorps spécifiques présents dans le sérum murin anti-PSIII produits par immunisation avec le polysaccharide natif conjugué à une protéine des poils des SGB (figure 10) . Les composés conjugués 2 et 3, présentant un résidu Glc ß-(1^6)lié à GlcNAc, ont affiché la liaison la plus élevée. À l'opposé, l'oligosaccharide linéaire conjugué 1 a été reconnu ~10 fois moins que 2 et 3, et seulement légèrement mieux que le témoin négatif CRM197. Comme on s'y attendait, le taux le plus élevé d'anticorps anti-PSIII a été détecté pour le témoin positif PSIII-CRMxgv. En somme, ces données ont indiqué que la présence de la ramification est un motif structural pertinent pour la reconnaissance des anticorps anti-PSIII.
Exemple 12 - Analyse_in vivo_des_con j ugués oligosaccharidiques de longueur différente (figures 11A et B)
L'effet de la longueur de la chaîne sur l'immunogénicité des glycoconjugués de PSIII a été testé in vivo. Les souris ont été immunisées avec des conjugués de CRM197 des différents fragments. Un rappel a été donné après deux semaines, suivi d'un second rappel après trois semaines. Après la troisième immunisation, les sérums ont été examinés pour la teneur en IgG anti-PSIII et leur activité opsonophagocytaire.
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Le conjugué de DP 2 a été le fragment le plus court déclenchant des anticorps anti-PSIII (figure 11A) . Une souris a donné des anti-PSIII dirigés contre l'unité répétitive ramifiée (structure 2). Ce sérum était doté d'une fonctionnalité modeste dans l'analyse OPKA. Les fragments avec une DP > 3 ont induit des IgG anti-PSIII à des taux significativement supérieurs par rapport au PSIII natif pleine longueur. Les titres OPKA ont été 4 à 5 fois supérieurs à celui du PSIII natif (tableau 4 et figure 11B) . Ces données ont indiqué que les fragments avec une DP > 2 peuvent être utilisés pour préparer des vaccins anti-SGB du sérotype III efficaces, puisqu'ils contiennent la partie minimale qui est nécessaire pour soulever des anticorps protecteurs.
Tableau 5
Moyenne géométrique et titres OPKA pour les sérums dérivant des différents conjugués
| Degré de glycosylation (mol/mol) | Titre ELISA (UE/ml) Moyenne géométrique (IC à 95 %) | Titre OPK moyen | |
| CRM-f ragraent synthétique III 1 | 3, 0 | 10 | < 30 |
| CRM-f ragraent synthétique III 2 | 3, 0 | 10 | < 30 |
| CRM-f ragraent synthétique III 2 | 23, 0 | 15 (10-29) | < 30 |
| CRM-f ragraent synthétique III 3 | 27,0 | - | < 30 |
| CRM-III DP2 | 3,5 | 13 (10-19) | < 30 |
| CRM-III DP2 | 9, 0 | 237 (101-556) | 590 |
| CRM-III DP3 | 2,0 | 61 (23-161) | 176 |
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| CRM-III DP3 | 4, | 5 | 1946 (953- 3977) | 1862 |
| CRM-III DP5 | 3, | 0 | 3124 (1780- 5484) | 2499 |
| CRM-III DP5 | 5, | 5 | 1179 (159- 8771) | 3321 |
| CRM-III DP6,5 | 1, | 5 | 540 (196-1484) | 1250 |
| CRM-III DP6,5 | 3, | 5 | 2262 (1467- 3490) | 1501 |
| CRM-III DP11 | 2, | 5 | 756 (332-1723) | 461 |
| CRM-III PSIII | 0, | 4 | 517 (345-774) | 484 |
Pour les fragments les plus courts (DP 2 et 3) , un paramètre qui s'est révélé crucial pour induire des bons taux d'anticorps fonctionnels a été le rapport molaire saccharide/protéine. Comme il est montré sur la figure 12, lorsque ce rapport a été bas (3,5 pour DP 2 et 4,5 pour DP 3), les glycoconjugués ont été inefficaces Toutefois, lorsque le rapport molaire saccharide/protéine a été augmenté jusqu'à 9,0 et
4,5 mol de saccharide/mol de protéine pour les DP2 et 3, respectivement, les glycoconjugués sont devenus comparables ou supérieurs au polysaccharide pleine longueur en termes de titres à la fois en IgG et OPKA (figures 12A et 12B, degré de glycosylation indiqué entre parenthèses sur les figures).
Alors que certains modes de réalisation de la présente invention ont été décrits et illustrés spécifiquement ci-dessus, il n'est pas prévu que l'invention soit limitée à de tels modes de réalisation. Diverses modifications peuvent y être apportées sans s'écarter de l'étendue et de l'esprit de la présente
BE2017/5163 invention telle que présentée dans les revendications suivantes.
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Claims (7)
- REVENDICATIONS1. Conjugué comprenant un fragment d'un polysaccharide capsulaire (PSC) d'un streptocoque du groupe B (SGB) du sérotype III et une protéine de support, dans lequel le fragment est un oligosaccharide5 comportant de 2 à 11 unités répétitives du PSC du SGB du sérotype III et où le conjugué présente un degré de glycosylation de 2 à 9.
- 2. Conjugué ayant la formule : (1) dans laquelle P représente une protéine de support, X représente soit :(i) soitBE2017/5163 (U)5 n' est un nombre entier de 1 à 10, n est un nombre entier de 2 à 9 et dans lequel n' vaut 1.
- 3. Conjugué selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la protéine de support est choisie dans le groupe constitué de l'anatoxine diphtérique, CRM197 et10 l'anatoxine tétanique.
- 4. Conjugué selon la revendication 3, dans lequel l'oligosaccharide est un oligosaccharide synthétique.
- 5. Conjugué selon la revendication 3, dans lequel l'oligosaccharide est préparé par dépolymérisation du15 PSC du SGB du sérotype III.
- 6. Composition comprenant le conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
- 7. Composition selon la revendication 6, où ladite composition est un vaccin.20 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes pour une utilisation dans un procédé permettant de générer une réponse immunitaire chez un mammifère.BE2017/5163
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