NO891485L

NO891485L - PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF 22 KD SGH PROTEIN AND LINEAR GENEVECTOR.

Info

Publication number: NO891485L
Application number: NO89891485A
Authority: NO
Inventors: Kathryn Ann Parker; Kotikanyadanam Sreekrishna; Motohiro Fuke
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1988-04-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1989-10-12
Also published as: GB8908125D0; NO891485D0; FI891695A; SE8901264D0; FI891695A0; SE8901264L; GB2217332A

Description

Oppfinnelsen angår området rekorabinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til ekspresjon av lakseveksthormon (sGH) i metylotrof gjær av slekten Pichia. En annen side ved oppfinnelsen angår en ny gjærstamme transformert med nye vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for lakseveksthormonet. The invention relates to the field of recorabinant DNA biotechnology. One aspect of the invention relates to a method for expressing salmon growth hormone (sGH) in methylotrophic yeast of the genus Pichia. Another aspect of the invention relates to a new yeast strain transformed with new vectors containing a DNA sequence that codes for the salmon growth hormone.

Lakseveksthormon (sGH) er blitt isolert og klonet i E. coliSalmon growth hormone (sGH) has been isolated and cloned in E. coli

av Sekine et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. 82, (1985) 4306-4310). Det sGH som ble produsert i E. coli ble vist å være biologisk aktivt til å stimulere veksten av regnbueørret. by Sekine et al. (Proe. Nat. Acad. Sci. 82, (1985) 4306-4310). The sGH produced in E. coli was shown to be biologically active in stimulating the growth of rainbow trout.

Anvendelsen av dette hormon i fiskefSr og agn for kommersiell fiskeoppdrett er omfattende. En rekke kommersielt viktige sorter fisk såsom laks og ørret reagerer på dette hormon og oppviser øket vekst når de behandles med sGH. The use of this hormone in fish feed and bait for commercial fish farming is extensive. A number of commercially important types of fish such as salmon and trout respond to this hormone and show increased growth when treated with sGH.

Uheldigvis har E. coli vist seg å være en uegnet vert for produksjonen av sGH. For eksempel produserer E. coli endotoksiner som er tilbøyelige til å forurense det sGH som produseres. Disse endotoksiner er uønskede forurensninger som må fjernes ved kostbare rensetrinn. Dessuten er mesteparten av det 25 kD sGH-protein som produseres i E. coli i en inaktiv form som må oppløseliggjøres og behandles for å denaturere og deretter renaturere proteinet. E. coli produserer også Unfortunately, E. coli has proven to be an unsuitable host for the production of sGH. For example, E. coli produces endotoxins that tend to contaminate the sGH that is produced. These endotoxins are unwanted contaminants that must be removed by expensive cleaning steps. Moreover, most of the 25 kD sGH protein produced in E. coli is in an inactive form that must be solubilized and processed to denature and then renature the protein. E. coli also produces

bare en begrenset mengde av det mer ønskelige biologisk aktive 22 kD sGH-protein, idet det i stedet er tilbøyelig til å produsere nesten utelukkende det inaktive 25 kD sGH-protein. only a limited amount of the more desirable biologically active 22 kD sGH protein, tending instead to produce almost exclusively the inactive 25 kD sGH protein.

Forsøk er også blitt gjort på å fremstille sGH i Saccharomyces cerevisiae slik som det er beskrevet i EP-søknad nr. 87104321.2. Den eneste form av protein som ble uttrykt, var imidlertid det inaktive 25 kD sGH-protein. Attempts have also been made to produce sGH in Saccharomyces cerevisiae as described in EP application no. 87104321.2. However, the only form of protein expressed was the inactive 25 kD sGH protein.

Det vil således være et betydelige bidrag til faget å skaffe en fremgangsmåte og vertsstammer til å fremme produksjonen It will thus be a significant contribution to the subject to provide a method and host strains to promote production

av 22 kD-formen av sGH som vil overflødiggjøre behovet for ytterligere behandling av 25 kD sGH-proteinet. of the 22 kD form of sGH which will obviate the need for further processing of the 25 kD sGH protein.

Det er følgelig en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til forbedret produksjon av 22 kD sGH i metylotrofe gjærstammer av slekten Pichia. It is therefore an aim of the invention to provide a method for improved production of 22 kD sGH in methylotrophic yeast strains of the genus Pichia.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for sGH. Another purpose of the invention is to obtain new vectors containing a DNA sequence that codes for sGH.

Nok en hensikt' med oppfinnelsen er å skaffe nye lineære integrative setespesifikke vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for et sGH. Another purpose of the invention is to obtain new linear integrative site-specific vectors containing a DNA sequence which codes for a sGH.

Det er dessuten en hensikt med oppfinnelsen å skaffe ny metylotrofe gjærstammer av slekten Pichia transformert med en eller flere vektorer som kan fremme produksjonen av det 22 kD sGH som er egnet til industriell fermentering. It is also an aim of the invention to obtain new methylotrophic yeast strains of the genus Pichia transformed with one or more vectors which can promote the production of the 22 kD sGH which is suitable for industrial fermentation.

Andre hensikter, sider og ytterligere fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen, kravene og tegningene. Other purposes, aspects and further advantages of the invention will be apparent from the description, claims and drawings.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der funnet en forbedret fremgangsmåte til fremstilling av 22 kD sGH-protein omfattende å transformere metylotrof gjær av slekten Pichia med kompatible vektorer inneholdende det sGH strukturelle gen som inneholdes inne i en ekspresjonskassett. Fig. IA er en representasjon av pUC18 og det universelle kloningssete som ble digerert med EcoRI og Hindlll under prepareringen for dets innsetting i EcoRI-setet av pAO804. Fig. IB er en representasjon av pAO804 som skal digereres med EcoRI og har polylinkerfragmentet fra pUC18 innsatt deri. Fig. 1C er en representasjon av pHIL201 som er produktet av innsettingen av pUC18 polylinkerfragmentet i EcoRI-setet av pAO804, idet ikke alle restriksjonssetene av EcoRI-fragmentet er vist på denne figur, skjønt de foreligger. Fig. 2A er en representasjon av psGHIB2 som skal digereres med Hindlll. Fig. 2B er en representasjon av pHIL201 som skal kløyves ved Smal-setet for innsettingen av HindIII-fragmentet inneholdende det sGH strukturelle gen, idet ikke alle restriksjonssetene på EcoRI-fragmentet er vist på denne figur, skjønt de foreligger. Fig. 2C er en representasjon av pHIL51 som er produktet avPHIL201 med det sGH strukturelle gen innsatt i Smal-setet. Dette plasmid skal deretter benyttes som lineær vektor ved According to the present invention, an improved method for the production of 22 kD sGH protein has been found comprising transforming methylotrophic yeast of the genus Pichia with compatible vectors containing the sGH structural gene which is contained within an expression cassette. Fig. 1A is a representation of pUC18 and the universal cloning site digested with EcoRI and HindIII in preparation for its insertion into the EcoRI site of pAO804. Fig. 1B is a representation of pAO804 to be digested with EcoRI and having the polylinker fragment from pUC18 inserted therein. Fig. 1C is a representation of pHIL201 which is the product of the insertion of the pUC18 polylinker fragment into the EcoRI site of pAO804, not all restriction sites of the EcoRI fragment being shown in this figure, although they are present. Fig. 2A is a representation of psGHIB2 to be digested with HindIII. Fig. 2B is a representation of pHIL201 to be cleaved at the SmaI site for the insertion of the HindIII fragment containing the sGH structural gene, not all restriction sites on the EcoRI fragment being shown in this figure, although they are present. Fig. 2C is a representation of pHIL51 which is the product of PHIL201 with the sGH structural gene inserted into the SmaI site. This plasmid will then be used as a linear vector by

at dette plasmid delvis digereres med Bglll.that this plasmid is partially digested with Bglll.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en fremgangsmåte til forbedret produksjon av 22 kD sGH i metylotrofe gjærstammer av slekten Pichia. According to the present invention, a method for improved production of 22 kD sGH in methylotrophic yeast strains of the genus Pichia has been provided.

Videre er der i henhold til oppfinnelsen skaffet nye vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for sGH. Furthermore, according to the invention, new vectors have been obtained containing a DNA sequence that codes for sGH.

Oppfinnelsen skaffer også nye lineære integrative setespesifikke vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for sGH. The invention also provides novel linear integrative site-specific vectors containing a DNA sequence encoding sGH.

Dessuten skaffer oppfinnelsen nye metylotrofe gjærstammerIn addition, the invention provides new methylotrophic yeast strains

av slekten Pichia transformert med en eller flere vektorer som kan fremme produksjonen av det 22 kD sGH som er egnet til industriell fermentering. of the genus Pichia transformed with one or more vectors capable of promoting the production of the 22 kD sGH suitable for industrial fermentation.

Det gen som koder for sGH, kan utvinnes direkte fra laks i henhold til de teknikker som anvendes av Sekine et al. Proe. Nati. Acad. Sei. Vol. 82, pp. 4306-4310, juli 1985. Andre strategier som anvender rekombinant DNA-teknologi kan også benyttes til å isolere dette gen, såsom en kunstig konstruksjon av nukleotidsekvensene. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse er det imidlertid foretrukket å isolere sGH-genet fra de plasmider som er deponert i forbindelse med US-PS The gene that codes for sGH can be extracted directly from salmon according to the techniques used by Sekine et al. Pro. Nati. Acad. Pollock. Vol. 82, pp. 4306-4310, July 1985. Other strategies using recombinant DNA technology can also be used to isolate this gene, such as an artificial construction of the nucleotide sequences. For carrying out the present invention, however, it is preferred to isolate the sGH gene from the plasmids deposited in connection with US-PS

4 689 402, nemlig plasmid pSGHl, E. coli ESGH1 (FERM BP-551) deponert 23. juni 1984; pSGH14, E. coli ESGH14 (FERM BP-611) deponert 20. september 19 84; pSGHIB2, E. coli ESGHIB2 4,689,402, namely plasmid pSGH1, E. coli ESGH1 (FERM BP-551) filed June 23, 1984; pSGH14, E. coli ESGH14 (FERM BP-611) deposited September 20, 1984; pSGHIB2, E. coli ESGHIB2

(FERM BP-612) deponert 20. september 1984; pSGHIIB9. E. coli ESGHIIB9 (FERM BP-707) deponert 8. februar 1985 og pSGHIIC2, (FERM BP-612) filed September 20, 1984; pSGHIIB9. E. coli ESGHIIB9 (FERM BP-707) deposited 8 February 1985 and pSGHIIC2,

E. coli ESGHIIC2 (FERM BP-708) deponert 8. februar 1985.E. coli ESGHIIC2 (FERM BP-708) deposited February 8, 1985.

Alle deponeringer ble gjort hos FRI.All deposits were made with FRI.

Isolering av sGH-genet fra de ovenfor angitte plasmider kan oppnås ved en hvilken som helst egnet teknikk eller kombinasjon av teknikker. For eksempel etter dyrking av en E. coli-stamme inneholdende pSGHIIC2 kan plasmid-DNA utvinnes ved bruk av fremgangsmåten i henhold til Birnboim og Doby, Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523. Plasmidet kan deretter renses ved anvendelse av CsCl-EtBr densitetssentrifugering. Og til slutt kan genet utvinnes ved endonuklease-digerering med Hindlll og Xbal, gelelektroforese og elektroeluering av det mindre HindIII/XbaI-fragment inneholdende sGH-genet. Isolation of the sGH gene from the above plasmids can be achieved by any suitable technique or combination of techniques. For example, after culturing an E. coli strain containing pSGHIIC2, plasmid DNA can be recovered using the method of Birnboim and Doby, Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523. The plasmid can then be purified using CsCl-EtBr density centrifugation. And finally, the gene can be recovered by endonuclease digestion with HindIII and XbaI, gel electrophoresis and electroelution of the smaller HindIII/XbaI fragment containing the sGH gene.

Dyrking av de E. coli-stammer som er listet opp ovenfor, kan utføres ved hvilke som helst egnede fremgangsmåter. Generelle teknikker for dyrking av E. coli er allerede kjent i faget og en hvilken som helst tilpasning av disse metoder til de spesielle behov av de stammer som inneholder sGH-genet, ligger godt innenfor en fagmanns evner. Cultivation of the E. coli strains listed above can be carried out by any suitable methods. General techniques for culturing E. coli are already known in the art and any adaptation of these methods to the particular needs of the strains containing the sGH gene is well within the capabilities of one skilled in the art.

Utvinning av plasmid-DNA fra E. coli kan oppnås ved forskjellige teknikker på grunn av dets kompakte størrelse og lukkede sfæriske superspiralform. For eksempel etter høsting kan vertsceller pelleteres ved sentrifugering og deretter resuspenderes og lyseres. Lysatet bør sentrifugeres for å fjerne celleavfall og supernatanten som inneholder DNA be-holdes. En fenolekstråksjon kan deretter utføres for å fjerne de fleste andre forurensninger fra DNA. Det fenolekstraherte DNA kan deretter behandles ytterligere ved bruk av en densi-tetgradientsentrifugering eller en gelfiltreringsteknikk for å separere plasmid DNA fra bakterielt DNA. Teknikkene for oppnåelse av separasjonen som det hentydes til ovenfor, er velkjente i faget, og en rekke forskjellige fremgangsmåter til utførelse av disse teknikker er kjent. Extraction of plasmid DNA from E. coli can be achieved by various techniques due to its compact size and closed spherical supercoil shape. For example, after harvesting, host cells can be pelleted by centrifugation and then resuspended and lysed. The lysate should be centrifuged to remove cell waste and the supernatant containing DNA retained. A phenol extraction can then be performed to remove most other contaminants from the DNA. The phenol extracted DNA can then be further processed using a density gradient centrifugation or a gel filtration technique to separate plasmid DNA from bacterial DNA. The techniques for achieving the separation referred to above are well known in the art, and a number of different methods for carrying out these techniques are known.

Nukleasedigerering av plasmidet inneholdende sGH-genet kan utføres ved valg av passende endonukleaser som vil kappe det plasmid som velges på en slik måte at det letter utvinningen av det intakte sGH-gen. Endonukleasene som benyttes vil avhenge av den kilde fra hvilken sGH-genet skal kuttes ut. For eksempel, sGH-genet som inneholdes i plasmid psGHIIC2 kan utvinnes som et HindIII/XbaI-fragment. Gelelektroforese eller en annen egnet teknikk vil være nødvendig for å separere det fra det andre fragment som foreligger. Nuclease digestion of the plasmid containing the sGH gene can be performed by selecting appropriate endonucleases that will cut the plasmid selected in such a way as to facilitate recovery of the intact sGH gene. The endonucleases used will depend on the source from which the sGH gene is to be cut out. For example, the sGH gene contained in plasmid psGHIIC2 can be recovered as a HindIII/XbaI fragment. Gel electrophoresis or another suitable technique will be necessary to separate it from the other fragment present.

Gelelektroforese av DNA kan utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker. Se P.G. Sealy og E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach Gel electrophoresis of DNA can be performed using a number of different techniques. See P.G. Sealy and E.M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach

(D. Rickwood og B. D. Hames, eds.) p. 39 (1982). Eluering kan også oppnås ved bruk av en rekke forskellige teknikker som er passende for den gel som er involvert såsom elektroeluering, diffusjon, geloppløsning (agarosegeler) eller fysisk ekstru-dering (agarosegeler). Det er dessuten anerkjent at eluering ikke nødvendigvis er påkrevet for visse geler såsom agarose av høy kvalitet som smelter ved lav temperatur. (D. Rickwood and B. D. Hames, eds.) p. 39 (1982). Elution can also be achieved using a variety of techniques appropriate to the gel involved such as electroelution, diffusion, gel dissolution (agarose gels) or physical extrusion (agarose gels). It is also recognized that elution is not necessarily required for certain gels such as high quality agarose which melts at a low temperature.

Når fragmentet inneholdende sGH-genet er isolert, kan fragmentet muligens trenge ytterligere manipulering før det innsettes i vektoren. Disse manipuleringer kan innbefatte, men er ikke begrenset til tilføyelsen av linkere eller å gi fragmentet en butt ende (blunt-ending). Once the fragment containing the sGH gene is isolated, the fragment may need further manipulation before being inserted into the vector. These manipulations may include, but are not limited to, the addition of linkers or blunt-ending the fragment.

Etter isoleringen av sGH-genet blir dette innsatt i en egnet vektor såsom et plasmid eller en lineær transformasjonsvektor som er kompatibel med Pichia. After the isolation of the sGH gene, it is inserted into a suitable vector such as a plasmid or a linear transformation vector compatible with Pichia.

Plasmider har lenge vært et av de grunnleggende elementerPlasmids have long been one of the basic elements

som anvendes i rekombinant-DNA-teknologi. Plasmider er sirku-lært ekstrakromosomalt dobbelttrådet DNA som finnes i mikro- which is used in recombinant DNA technology. Plasmids are circular extrachromosomal double-stranded DNA found in micro-

organismer. Plasmider er funnet å opptre som enkelte eller flere kopier pr. celle. Innbefattet i plasmid DNA er den informasjon som er nødvendig for plasmidreproduksjon, dvs. en autonom replikasjonssekvens eller ARS (et opprinnelsessted for replikasjon kan innlemmes for bakteriell replikasjon). organisms. Plasmids have been found to act as single or multiple copies per cell. Included in plasmid DNA is the information necessary for plasmid reproduction, i.e. an autonomous replication sequence or ARS (an origin of replication can be incorporated for bacterial replication).

En eller flere måter til fenotypisk utvelgelse av plasmidetOne or more means for phenotypic selection of the plasmid

i transformerte celler kan også innlemmes i den informasjon som er kodet inn i plasmidet. Fenotypiske markører eller seleksjons-markører såsom antibiotisk resistens eller gener som komplementerer defekte vert-biokjemiske veier, tillater at kloner av de vertceller som er blitt transformert gjen-kjennes, utvelges og opprettholdes. in transformed cells can also be incorporated into the information encoded in the plasmid. Phenotypic markers or selection markers such as antibiotic resistance or genes that complement defective host biochemical pathways allow clones of the host cells that have been transformed to be recognized, selected and maintained.

For å uttrykke sGH-genet i Pichia må genet være operabelt forbundet med et Pichia-kompatibelt regulatorisk område og 3<1->endesekvensen som danner den ekspresjonskassett som skal innsettes i verten via en vektor. In order to express the sGH gene in Pichia, the gene must be operably linked to a Pichia-compatible regulatory region and the 3<1> end sequence that forms the expression cassette to be inserted into the host via a vector.

De følgende uttrykk er her definert for klarhets skyld.The following terms are defined here for the sake of clarity.

sGH - polypeptid som fås som et resultat av sGH - polypeptide obtained as a result of

ekspresjonen av sGH-genet.the expression of the sGH gene.

Operabelt forbundet - betegner en sammenstilling hvor kompo-nentene er konfigurert slik at de utfører sin funksjon. Operably connected - denotes an assembly where the components are configured so that they perform their function.

Regulatorisk område - betegner heterogene DNA-sekvenser som reagerer på forskjellige stimuli og virker inn på hyppigheten av mRNA-tran-skripsj on. Regulatory region - denotes heterogeneous DNA sequences that respond to different stimuli and affect the frequency of mRNA transcription.

3'-endesekvens - sekvenser 3' til stoppkodonet som bevirker stabilisering av mRNA såsom sekvenser som bevirker polyadenylering eller stamløkke-strukturer. 3' end sequence - sequences 3' to the stop codon that effect stabilization of the mRNA such as sequences that effect polyadenylation or stem-loop structures.

"Pichia-kompatibel" betegner DNA-sekvenser som vil utføre deres normale funksjon i Pichia såsom regulatoriske områder og 3'-endesekvenser avledet fra Pichia eller nær beslektede "Pichia compatible" refers to DNA sequences that will perform their normal function in Pichia such as regulatory regions and 3' end sequences derived from Pichia or closely related

gjærsorter såsom Saccharomyces cerevisiae og Hansenula polymorpha. yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Hansenula polymorpha.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes integrative vektorer såsom den lineære sete-spesifikke integrative vektor ifølge Cregg som beskrevet i EP-søknad nr. '86114700.7 (publisert 1. juli 1987). Slike vektorer omfatter minst 1) et første innsettbart DNA-fragment, 2) et selekterbart markørgen og 3) et annet innsettbart DNA-fragment. For carrying out the present invention, integrative vectors such as the linear seat-specific integrative vector according to Cregg as described in EP Application No. '86114700.7 (published July 1, 1987) are preferred. Such vectors comprise at least 1) a first insertable DNA fragment, 2) a selectable marker gene and 3) another insertable DNA fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst ca. 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er arrangert i serie for dannelse av et lineært fragment av DNA slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det annet innsettbare DNA-fragment. The first and second insertable DNA fragments are each at least approx. 200 nucleotides long and have nucleotide sequences homologous to parts of the genomic DNA of species of the genus Pichia. The various components of the integrative vector are arranged in series to form a linear fragment of DNA such that the expression cassette and the selectable marker gene are arranged between the 3' end of the first insertable DNA fragment and the 5' end of the second insertable DNA -fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert i forhold til hverandre i det i serie arrangerte lineære fragment på samme måte som de er orientert i genomet av Pichia. The first and second insertable DNA fragments are oriented relative to each other in the serially arranged linear fragment in the same way as they are oriented in the genome of Pichia.

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter, er nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native Pichia genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal finne sted. For eksempel, dersom genomisk modifikasjon skal finne sted ved lokuset av alkoholoksidasegenet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være sekvenser som er homologe med separate partier av alkoholoksidasegen-lokuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted, må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert i forhold til hverandre i det lineære fragment med den samme relative orientering med hvilken de eksisterer i Pichia-genomet. Eksempler på nukleotidsekvenser som kan benyttes som første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av alkoholoksidase-genet (A0X1), dihydroksyacetonsyntase-genet (DHAS1), p40-genet og HIS4-genet. AOXl-genet, DHASl-genet, p40-genet og HIS4-genet er angitt i EP-A-183 071. Nucleotide sequences useful as the first and second insertable DNA fragments are nucleotide sequences homologous to separate portions of the native Pichia genomic site where genomic modification is to take place. For example, if genomic modification is to take place at the locus of the alcohol oxidase gene, the first and second insertable DNA fragments used will be sequences homologous to separate parts of the alcohol oxidase gene locus. In order for genomic modification according to the present invention to take place, the two insertable DNA fragments must be oriented in relation to each other in the linear fragment with the same relative orientation with which they exist in the Pichia genome. Examples of nucleotide sequences that can be used as first and second insertable DNA fragments are nucleotide sequences selected from the group consisting of the alcohol oxidase gene (AOX1), the dihydroxyacetone synthase gene (DHAS1), the p40 gene and the HIS4 gene. The AOX1 gene, the DHAS1 gene, the p40 gene and the HIS4 gene are disclosed in EP-A-183,071.

Det første innsettbare DNA-fragment kan inneholde et operabelt regulatorisk område som kan omfatte det regulatoriske område som benyttes i ekspresjonskassetten. Bruken av det første innsettbare DNA-fragment som det regulatoriske område for en ekspresjonskassett er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Fig'. 2C viser et diagram av en vektor som benytter det første innsettbare DNA-fragment som et regulatorisk område for en kassett. The first insertable DNA fragment may contain an operable regulatory region which may comprise the regulatory region used in the expression cassette. The use of the first insertable DNA fragment as the regulatory region for an expression cassette is a preferred embodiment of the invention. Fig'. 2C shows a diagram of a vector that uses the first insertable DNA fragment as a regulatory region for a cassette.

Eventuelt som vist på fig. 2C kan ett eller flere innsetnings-seter og en 3'-endesekvens anbringes umiddelbart 3' til det første innsettbare DNA-fragment. Denne konformasjon av den lineære setespesifikke integrative vektor har den ytterligere fordel at det skaffer et ferdig sete for innsetting av et strukturelt gen uten at det nødvendiggjør tilføyelsen av en kompatibel 3'-endesekvens. Possibly as shown in fig. 2C, one or more insertion sites and a 3' end sequence can be placed immediately 3' to the first insertable DNA fragment. This conformation of the linear site-specific integrative vector has the additional advantage of providing a ready-made site for the insertion of a structural gene without necessitating the addition of a compatible 3' end sequence.

De tallrike kløyvingsseter som er skaffet i pHIL201-vektoren mellom den første innsettbare sekvens og 3'-endesekvensen, The numerous cleavage sites provided in the pHIL201 vector between the first insertable sequence and the 3' end sequence,

er også fordelaktige, da færre linkere vil være nødvendige for å innsette det strukturelle gen i vektoren. are also advantageous, as fewer linkers will be required to insert the structural gene into the vector.

Det er også nødvendig å innlemme i det minste ett selekterbart markørgen i det DNA som benyttes til å transformere verts-stammen. Dette letter seleksjonen og isoleringen av de orga-nismer som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet meddeler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesiell aminosyre hvor den utransformerte verts-stamme har en defekt i den spesielle aminosyrebiosyntetiske vei eller resistens overfor antibiotika og lignende. It is also necessary to incorporate at least one selectable marker gene into the DNA used to transform the host strain. This facilitates the selection and isolation of the organisms that have incorporated the transforming DNA. The marker gene imparts to the transformed organism a phenotypic trait that the host did not have, e.g. restoration of the ability to produce a particular amino acid where the untransformed host strain has a defect in the particular amino acid biosynthetic pathway or resistance to antibiotics and the like.

Selekterbare markørgener som kan anvendes kan velges fra gruppen bestående av HIS4-genet og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae, G418-fosfotransferasegenet fra de E. coli overførbare (transposable) elementer Tn601 eller Tn903. Selectable marker genes that can be used can be chosen from the group consisting of the HIS4 gene and the ARG4 gene from Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae, the invertase gene (SUC2) from Saccharomyces cerevisiae, the G418 phosphotransferase gene from the E. coli transposable elements Tn601 or Tn903.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan innlemmes i vektorene som anvendes til utførelse av den foreliggende oppfinnelse, som f.eks. bakterielt plasmid-DNA, bakteriofag-DNA og lignende. Slike sekvenser tillater ampli-fikasjon og opprettholdelse av disse vektorer i bakterieverter. Those skilled in the art will recognize that additional DNA sequences can also be incorporated into the vectors used to carry out the present invention, such as e.g. bacterial plasmid DNA, bacteriophage DNA and the like. Such sequences allow amplification and maintenance of these vectors in bacterial hosts.

Dersom det første innsettbare DNA-fragment ikke inneholderIf the first insertable DNA fragment does not contain

et regulatorisk område, vil det være nødvendig å innsette et egnet Pichia-kompatibelt regulatorisk område operabelt forbundet med det strukturelle gen for å skaffe en operabel ekspresjonskassett. Tilsvarende, dersom ingen 3'-endesekvens er skaffet ved innsettingssetet for å komplettere ekspresjonskassetten, må en 3'-endesekvens som er operabelt forbundet med det strukturelle gen, innsettes. a regulatory region, it will be necessary to insert a suitable Pichia-compatible regulatory region operably linked to the structural gene to provide an operable expression cassette. Similarly, if no 3' end sequence is provided at the insertion site to complement the expression cassette, a 3' end sequence operably linked to the structural gene must be inserted.

Fagfolk er oppmerksom på en rekke regulatoriske områder somProfessionals are aware of a number of regulatory areas such as

er blittkarakterisertog kan anvendes i forbindelse med Pichia-slekten. Eksempler på Pichia-kompatible regulatoriske områder innbefatter, men er ikke begrenset til gjær-regulatoriske-områder valgt fra gruppen bestående av sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfa-paringsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase regulatoriske områder isolert fra Saccharomyces cerevisiae; den primære alkoholoksidase (A0X1), dihydroksyacetonsyntase (DHAS1), p40-regulatoriske områder og det HIS4-regulatoriske område som fås fra Pichia pastoris og lignende. For tiden foretrukne regulatoriske områder som anvendes til utførelse av den foreliggende oppfinnelse er de som er kjennetegnet ved deres evne til å reagere på metanolholdige media såsom regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av A0X1, DHAS1, p40 og HIS4 som angitt i det ovenfor nevnte patentskrift EP-A-183 071. has been characterized and can be used in connection with the Pichia genus. Examples of Pichia-compatible regulatory regions include, but are not limited to, yeast regulatory regions selected from the group consisting of acid phosphatase, galactokinase, alcohol dehydrogenase, cytochrome c, alpha-mating factor, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase regulatory regions isolated from Saccharomyces cerevisiae; the primary alcohol oxidase (AOX1), dihydroxyacetone synthase (DHAS1), p40 regulatory regions and the HIS4 regulatory region obtained from Pichia pastoris and the like. Currently preferred regulatory regions used for carrying out the present invention are those characterized by their ability to react to methanol-containing media such as regulatory regions selected from the group consisting of AOX1, DHAS1, p40 and HIS4 as indicated in the above-mentioned patent document EP -A-183 071.

Det mest foretrukne regulatoriske område for utførelse av oppfinnelsen er det AOXl-regulatoriske område. The most preferred regulatory region for carrying out the invention is the AOX1 regulatory region.

3'-endesekvensene kan benyttes i ekspresjonskassetten eller være en del av vektoren som angitt ovenfor. 3'-endesekvensene kan funksjonere for å avslutte, polyadenylatisere og/eller stabilisere messenger-RNA som er kodet for ved det strukturelle gen når det er operabelt forbundet med et gen. Noen eksempler som belyser, men ikke begrenser kildene for 3'-endesekvensene for utførelse av oppfinnelsen, innbefatter Saccharomyces cerevisiae-, Hånsenula polymorpha- og Pichia 3'-endesekvenser. Spesielt foretrukket er de som fås fra Pichia pastoris såsom de som er valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvensene av AOXl-genet, DHASl-genet, p40-genet og HIS4-genet. The 3' end sequences can be used in the expression cassette or be part of the vector as indicated above. The 3' end sequences can function to terminate, polyadenylate and/or stabilize the messenger RNA encoded by the structural gene when operably linked to a gene. Some examples illustrating, but not limiting, the sources of the 3'-end sequences for practicing the invention include Saccharomyces cerevisiae, Hånsenula polymorpha and Pichia 3'-end sequences. Particularly preferred are those obtained from Pichia pastoris such as those selected from the group consisting of the 3' end sequences of the AOX1 gene, the DHAS1 gene, the p40 gene and the HIS4 gene.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse er det for tiden foretrukket å benytte lineære transformasjonsvektorer såsom BglII-fragmentene av de konstruerte stykker vist på fig. IB og 1C. For carrying out the present invention, it is currently preferred to use linear transformation vectors such as the BglII fragments of the constructed pieces shown in fig. IB and 1C.

Innsettingen av sGH-genet i egnede vektorer kan utføres ved en hvilken som helst egnet teknikk som kløyver den valgte vektor ved ett eller flere passende seter og fører til at minst én operabel ekspresjonskassett inneholdende sGH-genet foreligger i vektoren. The insertion of the sGH gene into suitable vectors can be carried out by any suitable technique which cleaves the selected vector at one or more suitable sites and results in at least one operable expression cassette containing the sGH gene being present in the vector.

Ligasjon av sGH-genet kan utføres ved en hvilken som helst ligasjonsteknikk såsom anvendelse av T4 DNA-ligase. Ligation of the sGH gene can be performed by any ligation technique such as the use of T4 DNA ligase.

Den opprinnelige seleksjon, formering og eventuell amplifika-sjon av ligasjonsblandingen av sGH-genet og en vektor utføres fortrinnsvis ved transformasjon av blandingen inn i en bakte-rievert såsom E. coli (skjønt ligasjonsblandingen kan trans-formeres direkte inn i en gjærvert). Egnede transformasjonsteknikker for E. coli er velkjente i faget. Dessuten er selek-sjonsmarkører og bakterielle opprinnelsessteder for replikasjon som er nødvendig for opprettholdelsen av en vektor i en bak-terievert også velkjent i faget. The initial selection, propagation and eventual amplification of the ligation mixture of the sGH gene and a vector is preferably carried out by transformation of the mixture into a bacterial host such as E. coli (although the ligation mixture can be transformed directly into a yeast host). Suitable transformation techniques for E. coli are well known in the art. Moreover, selection markers and bacterial origins of replication necessary for the maintenance of a vector in a bacterial host are also well known in the art.

Isolering og/eller rensing av det ønskede plasmid som inneholder sGH-genet i et ekspresjonssystem kan oppnås ved en hvilken som helst egnet metode til separering av plasmid-DNA fra verts-DNA. Isolation and/or purification of the desired plasmid containing the sGH gene in an expression system can be achieved by any suitable method for separating plasmid DNA from host DNA.

På lignende måte kan vektorene som dannes ved ligasjon utprøves fortrinnsvis etter formering for å bekrefte nærværet av sGH-genet og dets operable binding til et regulatorisk område og en 3'-endesekvéns. Dette kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til endo-nukleasedigerering, gelelektroforese eller endonukleasedige-rering/Southern hybridisering. Similarly, the vectors generated by ligation can preferably be tested after propagation to confirm the presence of the sGH gene and its operable binding to a regulatory region and a 3' end sequence. This can be accomplished by a number of different techniques including but not limited to endonuclease digestion, gel electrophoresis or endonuclease digestion/Southern hybridization.

Transformasjon av plasmider eller lineære vektorer inn i gjærverter kan oppnås ved egnede transformasjonsteknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til de som er angitt av Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 75, (1978) 1929; Ito et al, J. Bacteriol 153, (1983) 163; Cregg et al Mol. Cell Biol. 5 (1985) p. 3376 eller Sreekrishna et al, Gene, 59 Transformation of plasmids or linear vectors into yeast hosts can be accomplished by suitable transformation techniques including, but not limited to, those set forth by Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Pollock. 75, (1978) 1929; Ito et al, J. Bacteriol 153, (1983) 163; Cregg et al Mol. Cell Biol. 5 (1985) p 3376 or Sreekrishna et al, Gene, 59

(1987) p. 115. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes transformasjonsteknikkene i henhold til Cregg eller Sreekrishna. Det er ønskelig for utførelse av den foreliggende oppfinnelse å benytte et overskudd av lineære vektorer og selektere for multiple innsettinger ved Southern hybridisering . (1987) p. 115. For carrying out the present invention, the transformation techniques according to Cregg or Sreekrishna are preferred. It is desirable for carrying out the present invention to use an excess of linear vectors and select for multiple insertions by Southern hybridization.

Gjærverten for transformasjon kan være en hvilken som helst egnet metylotrof Pichia-vert. For tiden foretrukne Pichia-verter er auksotrofe Pichia-stammer så som GS115 (NRRL Y-15851). Man innser imidlertid at ville typer stammer kan anvendes med like stort hell dersom SUC2 eller en egnet antibiotikaresistens-markør anvendes såsom G418. The yeast host for transformation can be any suitable methylotrophic Pichia host. Currently preferred Pichia hosts are auxotrophic Pichia strains such as GS115 (NRRL Y-15851). However, it is recognized that wild types of strains can be used with equal success if SUC2 or a suitable antibiotic resistance marker such as G418 is used.

Transformerte Pichia-celler kan selekteres for ved bruk av egnede teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til dyrking av tidligere auksotrofe celler etter transformasjon i fravær av et biokjemisk produkt som er nødvendig (på grunn av cellenes auksotrofi), seleksjon ved påvisning av en ny fenotype ("metanol-langsom") eller dyrking i nærvær av et antibiotikum som er giftig overfor Pichia i fravær av et resistensgen som inneholdes i transformanten. Transformed Pichia cells can be selected for using suitable techniques including, but not limited to, culturing previously auxotrophic cells after transformation in the absence of a biochemical product required (due to auxotrophy of the cells), selection by detection of a new phenotype ("methanol-slow") or cultivation in the presence of an antibiotic toxic to Pichia in the absence of a resistance gene contained in the transformant.

Isolerte transformerte Pichia-celler dyrkes ved passende fermenteringsteknikker såsom ristekolbe-fermentering eller fermenteringsteknikker som anvender høy tetthet som beskrevet i US-PS 4 414 329. Isolated transformed Pichia cells are cultured by suitable fermentation techniques such as shake flask fermentation or fermentation techniques using high density as described in US-PS 4,414,329.

Ekspresjon kan utføres ved fremgangsmåter som er passendeExpression can be carried out by any suitable method

for det regulatoriske område som anvendes. Fortrinnsvis, dersom på metanol reagerende regulatoriske områder anvendes, kan indusering av ekspresjon oppnås ved den teknikk som er skissert i eksempel V. for the regulatory area used. Preferably, if methanol-responsive regulatory regions are used, induction of expression can be achieved by the technique outlined in Example V.

Etter ekspresjon av sGH-genet ble nærvær av både 22 kD- ogAfter expression of the sGH gene, the presence of both 22 kD and

25 kD-protein påvist ved et Western blott. Den samlede sGH-proteinproduksjon ble anslått til mellom 1% og 3% av det samlede celleprotein. Den prosentvise del av det samlede sGH som forelå i 22 kD-formen, ble anslått til å være 5-20% av det samlede sGH som forelå som bestemt ved det modifiserte Western blott. 25 kD protein detected by a Western blot. The total sGH protein production was estimated to be between 1% and 3% of the total cell protein. The percentage of total sGH present in the 22 kD form was estimated to be 5-20% of total sGH present as determined by the modified Western blot.

De følgende ikke-begrensende eksempler er vist for ytterligere å belyse oppfinnelsen. The following non-limiting examples are shown to further illustrate the invention.

EksemplerExamples

Generell informasjon som angår eksemplene:General information regarding the examples:

StammerTribes

Pichia pastoris GS115 (his4) [NRRL Y-15851] var den gjærstamme som ble benyttet i disse eksempler. Pichia pastoris GS115 (his4) [NRRL Y-15851] was the yeast strain used in these examples.

E. coli DG75' (hsdl, leu-6, lacY, thr-1, supE44, tonA21 lambda E. coli DG75' (hsdl, leu-6, lacY, thr-1, supE44, tonA21 lambda

[-] eller JM107 (endAl, gyrA96, thil, hsdR 17, SupE44, relA, lambda (-), * (lac-ProAB), [F°, traD36, ProAB, lacI^Z^MlS1] [-] or JM107 (endAl, gyrA96, thil, hsdR 17, SupE44, relA, lambda (-), * (lac-ProAB), [F°, traD36, ProAB, lacI^Z^MlS1]

ble benyttet til plasmidkonstruksjoner samt til formering av plasmid-DNAer. was used for plasmid constructions as well as for propagation of plasmid DNAs.

Buffere, oppløsninger og medierBuffers, solutions and media

De buffere og oppløsninger som ble anvendt i de følgende eksempler, hadde de sammensetninger som er angitt nedenfor: The buffers and solutions used in the following examples had the compositions indicated below:

Eksempel I Example I

Dannelse avPHIL201Formation of PHIL201

pAO804-plasmidet er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois (aksesjonsnr. B-18021). Plasmid pHIL201 ble konstruert idet man startet fra pAO804 som følger: pAO804 (ca. 4 ug) ble digerert fullstendig i to porsjoner med 20 enheter EcoRI-restriksjonsenzym i 25 ul av meget saltholdig buffer (10 mM magnesiumklorid, 50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 100 mM natriumklorid og 100 ug/ml bovinserumalbumin. Digereringen ble utført i 1,5 h ved 37°C. The pAO804 plasmid is available in an E. coli host from the Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois (Accession No. B-18021). Plasmid pHIL201 was constructed starting from pAO804 as follows: pAO804 (approx. 4 µg) was digested to completion in two portions with 20 units of EcoRI restriction enzyme in 25 µl of high salt buffer (10 mM magnesium chloride, 50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1 mM dithiothreitol, 100 mM sodium chloride and 100 µg/ml bovine serum albumin The digestion was carried out for 1.5 h at 37°C.

Denne blanding ble deretter varmet ved 7 0°C i 6 min i et vannbad og deretter overført til et isvannbad. Det DNA som forelå i oppløsning, ble utfelt ved tilsetning av 3 pl 3M natriumacetat og 80 ul absolutt etanol. DNA-utfellingen ble gjort lettere ved inkubasjon ved -20°C i 135 min. DNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering i 3 0 min ved 4°C i en mikrosentrifuge (microfuge). DNA-pelleten ble tørket under vakuum. Hver DNA-pellet ble oppløst i 78 ul alkalisk fosfa-tasebuffer (50' mM Tris-HCl, pH 9,0 og 1 mM magnesiumklorid) og inkubert med 0,5 enheter alkalisk fosfatase fra kalvetarm i 30 min ved 37°C. Ytterligere 0,5 enheter alkalisk fosfatase ble tilsatt, og inkubering i 30 min ved 37°C ble gjentatt. Etter dette ble reaksjonsblandingen ekstrahert tre ganger med en fenol/kloroform-blanding, to ganger med kloroform og fire ganger med 500 ul eter. Residualeteren ble fordampet i vakuum. Porsjonene ble kombinert og DNA ble utfelt som beskrevet ovenfor. DNA-pelleten ble oppløst i 20 ul vann og lagret ved -20°C inntil videre bruk. Dette DNA ble betegnet som "vektor". This mixture was then heated at 70°C for 6 min in a water bath and then transferred to an ice water bath. The DNA that was present in solution was precipitated by adding 3 µl of 3M sodium acetate and 80 µl of absolute ethanol. DNA precipitation was facilitated by incubation at -20°C for 135 min. The DNA precipitate was collected by centrifugation for 30 min at 4°C in a microfuge. The DNA pellet was dried under vacuum. Each DNA pellet was dissolved in 78 µl of alkaline phosphatase buffer (50' mM Tris-HCl, pH 9.0 and 1 mM magnesium chloride) and incubated with 0.5 units of calf intestinal alkaline phosphatase for 30 min at 37°C. An additional 0.5 units of alkaline phosphatase was added, and incubation for 30 min at 37°C was repeated. After this, the reaction mixture was extracted three times with a phenol/chloroform mixture, twice with chloroform and four times with 500 µl of ether. The residual ether was evaporated in vacuo. The portions were combined and DNA was precipitated as described above. The DNA pellet was dissolved in 20 ul of water and stored at -20°C until further use. This DNA was termed "vector".

Plasmid pUC18 (ca. 10 ug) ble digerert med Bgll (20 enheter) og HindiII (10 enheter) i 20 ul buffer med høyt saltinnhold (beskrevet ovenfor) ved 37°C i 1 h. Bgll-digerering bidrar til å redusere bakgrunnen på grunn av regenerering av pUC18 i løpet av ligasjonen. Natriumklorid og Tris ble tilsatt for å bringe bufferkonsentrasjonen til høye saltbetingelser som beskrevet ovenfor, og EcoRI (20 enheter) ble tilsatt for å frigjøre det universelle kloningssete ved inkubering ved 37°C i 60 min. Etter digerering ble DNA utfelt som beskrevet ovenfor. DNA-utfellingen ble oppløst i 20 ul vann og lagret ved -20°C inntil senere bruk. Dette DNA ble betegnet som "passasj er". Plasmid pUC18 (approximately 10 µg) was digested with Bgll (20 units) and HindiII (10 units) in 20 µl of high salt buffer (described above) at 37°C for 1 h. Bgll digestion helps to reduce the background of due to regeneration of pUC18 during ligation. Sodium chloride and Tris were added to bring the buffer concentration to high salt conditions as described above, and EcoRI (20 units) was added to release the universal cloning site by incubating at 37°C for 60 min. After digestion, DNA was precipitated as described above. The DNA precipitate was dissolved in 20 ul of water and stored at -20°C until later use. This DNA was termed "passage er".

Vektor- og passasjer-DNAer ble blandet ved et vektforhold på 1:2,5 i 20 ul DNA-ligasjonsbuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,4, 10 mM magnesiumklorid, 10 mM ditiotreitol, 1 mM ATP og 100 \ ig/ ml bovinserumalbumin) ved en endelig DNA-konsentrasjon på 70 \ ig/ ml og inkubert over natten ved 4°C og 2 enheter T4DNA-ligase. Halvparten av den ligatiserte prøve ble benyttet til å transformere E. coli-stamme JM107 ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til Dagert og Ehrlich ( Gene 6, 23 Vector and passenger DNAs were mixed at a 1:2.5 weight ratio in 20 µl DNA ligation buffer (50 mM Tris-HCl - pH 7.4, 10 mM magnesium chloride, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP and 100 µg / ml bovine serum albumin) at a final DNA concentration of 70 µg/ml and incubated overnight at 4°C and 2 units of T4DNA ligase. Half of the ligated sample was used to transform E. coli strain JM107 using the method of Dagert and Ehrlich (Gene 6, 23

(1979)). En rekke ampicillinresistente kloner ble oppnådd og de ble utprøvet på minimalt medium med ampicillin, X-gal og IPTG. En blanding av hvite og blå kolonier ble oppnådd. De blå kolonier representerer pUC18-bakgrunn. Således tillot bruken av JM107 som en vert eliminering av pUC18-holdige bakgrunnskloner. En rekke hvite kloner ble underkastet lyse i liten skala og EcoRI-BamHI restriksjonsanalyse, hvilket førte til identifisering av kloner inneholdende pHIL201 (se fig. 1C). Fremstilling av plasmid i stor skala ble utført fra en slik klon for oppnåelse av en tilstrekkelig mengde pHIL201 for det neste trinn (se eksempel III). (1979)). A number of ampicillin-resistant clones were obtained and tested on minimal medium with ampicillin, X-gal and IPTG. A mixture of white and blue colonies was obtained. The blue colonies represent pUC18 background. Thus, the use of JM107 as a host allowed the elimination of pUC18-containing background clones. A number of white clones were subjected to small-scale lysis and EcoRI-BamHI restriction analysis, which led to the identification of clones containing pHIL201 (see Fig. 1C). Large-scale production of plasmid was carried out from such a clone to obtain a sufficient amount of pHIL201 for the next step (see Example III).

Eksempel IIExample II

Utvinning av sGH- gen fra psGHIB2Extraction of the sGH gene from psGHIB2

sGH-genet svarende til ca. 0,9 kb (nukleotidsammensetningen av dette fragment er angitt nedenfor) ble frigjort fra psGHIB2 ved Hindlll-digerering. Ca. 10 ug av plasmid psGHIB2 (beskrevet hos Sekine et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. vol. 82, pp. 4306-4310, juli 1985) ble digerert ved 37°C i 4 h med 10 enheter Hindlll i 40 ul middels salt buffer (10 mM Tris-HCl The sGH gene corresponding to approx. 0.9 kb (the nucleotide composition of this fragment is indicated below) was released from psGHIB2 by HindIII digestion. About. 10 µg of plasmid psGHIB2 (described in Sekine et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA. vol. 82, pp. 4306-4310, July 1985) was digested at 37°C for 4 h with 10 units of HindIII in 40 µl medium salt buffer (10 mM Tris-HCl

- pH 7,5, 10 mM magnesiumklorid, 1 mM ditiotreitol, 50 mM natriumklorid og 4 ug bovinserumalbumin). Etter digerering ble 8 ul (ca. 2 ug DNA) av reaksjonsblandingen underkastet elektroforese på 0,9% agarose. Mer enn 5 0% av plasmidet ble funnet å være kløyvet av Hindlll under disse betingelser. Gelelektroforese-mønsteret viste klart nærværet av et DNA-fragment på - pH 7.5, 10 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol, 50 mM sodium chloride and 4 µg bovine serum albumin). After digestion, 8 µl (approx. 2 µg DNA) of the reaction mixture was subjected to electrophoresis on 0.9% agarose. More than 50% of the plasmid was found to be cleaved by HindIII under these conditions. The gel electrophoresis pattern clearly showed the presence of a DNA fragment on

ca. 0,9 kb svarende til sGH-genet.about. 0.9 kb corresponding to the sGH gene.

De kohesive ender av DNA-fragmentene som var et resultat av Hindlll-kløyvingen av psGHBI2, ble gjort til butte ender ved bruk av Klenow-fragment av E. coli DNA-polymerase I som følger: 32 yl Hindlll-kløyvet psGHIB2 (ca. 8 pg DNA) ble blandet med 2,5 ul dNTP-blanding (en blanding av 2 mM av hver av dATP, dTTP, dCTP og dGTP), 5 ul av 10x nicktranslasjonsbuffer (0,5 M The cohesive ends of the DNA fragments resulting from the HindIII cleavage of psGHBI2 were blunt-ended using Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I as follows: 32 µl of HindIII-cleaved psGHIB2 (approximately 8 pg DNA) was mixed with 2.5 µl dNTP mix (a mixture of 2 mM each of dATP, dTTP, dCTP and dGTP), 5 µl of 10x nick translation buffer (0.5 M

Tris-HCl - pH 7,2, 0,1 M magnesiumsulfat, 1 mM ditiotreitolTris-HCl - pH 7.2, 0.1 M magnesium sulfate, 1 mM dithiothreitol

og 500 ug/ml bovinserumalbumin), 10 pl dobbeltdestillert vann og 0,5 ul (10 enheter) Klenow-fragment av DNA-polymerase I. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 22°C i 30 min, og reaksjonen ble avsluttet ved oppvarming til 70°C i 5 min. Etter dette ble hele prøven underkastet elektroforese på and 500 µg/ml bovine serum albumin), 10 µl double-distilled water and 0.5 µl (10 units) Klenow fragment of DNA polymerase I. The reaction mixture was incubated at 22°C for 30 min, and the reaction was terminated by heating to 70° C for 5 min. After this, the entire sample was subjected to electrophoresis

0,9% agarosegel og det parti av gelen som inneholdt DNA-fragmentet svarende til sGH-genet (ca. 0,9 kb) ble kuttet fra resten av gelen og det DNA som forelå i gelstykket, ble elek-troeluert i en dialysepose inn i 400 ul 5 mM EDTA (pH 8,0). Det eluerte DNA ble fenol/kloroform-ekstrahert, utfelt, vasket, tørket og oppløst i 50 ul dobbeltdestillert vann som beskrevet i eksempel I ovenfor. Utbyttet av sGH-DNA-fragmentet var ca. 1 ug. Dette ble benyttet som en kilde til sGH-genfragmentet for konstruksjonen av pHIL51 (se eksempel III). 0.9% agarose gel and the part of the gel that contained the DNA fragment corresponding to the sGH gene (approx. 0.9 kb) was cut from the rest of the gel and the DNA that was present in the gel piece was electro-eluted in a dialysis bag into in 400 µl 5 mM EDTA (pH 8.0). The eluted DNA was phenol/chloroform extracted, precipitated, washed, dried and dissolved in 50 µl double distilled water as described in Example I above. The yield of the sGH DNA fragment was approx. 1 ug. This was used as a source of the sGH gene fragment for the construction of pHIL51 (see Example III).

Eksempel IIIExample III

Dannelse av pHIL51- plasmidGeneration of pHIL51 plasmid

Det butte (blunt ended) sGH-fragment fra psGHIB2 oppnådd som beskrevet i eksempel II, ble innsatt i Smal-setet (butt ende) av pHIL201-plasmid (beskrevet i eksempel I) som følger: The blunt-ended sGH fragment from psGHIB2 obtained as described in Example II was inserted into the SmaI site of pHIL201 plasmid (described in Example I) as follows:

Plasmid pHIL201 (2 ug) i 20 ul middels salt buffer (beskrevetPlasmid pHIL201 (2 µg) in 20 µl medium salt buffer (desc

i eksempel II) ble kløyvet med 5 enheter Smal ved inkubering ved 37°C i 2 h. Etter dette ble 200 ng av det digererte DNA underkastet elektroforese på 0,9% agarosegel, hvilket indikerte at mesteparten av DNAet var kløyvet av Smal. Det Smal-digererte plasmid ble behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm som beskrevet i eksempel I. Det Smal-kappede og det alkalisk fosfatase-behandlede pHIL201 ble oppløst i 100 ul vann. For ligasjon ble 100 ng pHIL201 som var kløyet med Smal og behandlet med alkalisk fosfatase, blandet med 200 ng butt sGH-genfragment (eksempel II) i 20 ul volum salt ligasjonsbuffer (beskrevet i eksempel I) og ligatisert over natten ved 4°C in example II) was cleaved with 5 units of SmaI by incubation at 37°C for 2 h. After this, 200 ng of the digested DNA was electrophoresed on 0.9% agarose gel, which indicated that most of the DNA was cleaved by SmaI. The SmaI-digested plasmid was treated with alkaline phosphatase from calf intestine as described in Example I. The SmaI-capped and alkaline phosphatase-treated pHIL201 was dissolved in 100 µl of water. For ligation, 100 ng pHIL201 cleaved with SmaI and treated with alkaline phosphatase was mixed with 200 ng blunt sGH gene fragment (Example II) in 20 µl volume of salt ligation buffer (described in Example I) and ligated overnight at 4°C

med T4-DNA-ligase. Etter dette ble ligasjonsreaksjonen avsluttet ved inkubering ved 65°C i 5 min. Den ligatiserte with T4 DNA ligase. After this, the ligation reaction was terminated by incubation at 65°C for 5 min. The ligated

prøve ble digerert med 5 enheter Smal i 30 min ved 37°C som beskrevet tidligere. Smal-digereringen etter ligasjon reduserer forstyrrelsen i transformasjonen ved selvligatisert pHIL201. Den Smal-digererte ligasjonsblanding ble benyttet til å transformere E. coli DG75'. Flere ampicillinresistente kloner ble oppnådd, og de ble analysert ved alkalisk lyse for å identifisere de kloner som inneholdt det ønskede pHIL51-plasmid. Fremstilling av plasmid i stor skala ble utført fra en slik klon og benyttet til transformasjon av P. pastoris GS115. sample was digested with 5 units of Smal for 30 min at 37°C as described previously. The Smal digestion after ligation reduces the disruption of transformation by self-ligated pHIL201. The Smal-digested ligation mixture was used to transform E. coli DG75'. Several ampicillin-resistant clones were obtained and analyzed by alkaline lysis to identify those clones containing the desired pHIL51 plasmid. Production of plasmid on a large scale was carried out from such a clone and used for transformation of P. pastoris GS115.

Eksempel IVExample IV

Transformasjon av Pichia pastorisTransformation of Pichia pastoris

A. VektorprepareringA. Vector preparation

100 ug plasmid pHIL51 oppnådd fra E. coli DG75' ble underkastet partiell digerering med Bglll. Et 6,1 kb BglII-fragment ble oppnådd, se fig. 2C. Fordi sGH inneholder et internt Bglll-sete kunne en fullstendig digerering ikke utføres, da dette ville ha ført til utvinning av inoperative og ufullstendige integrative vektorer. 100 µg of plasmid pHIL51 obtained from E. coli DG75' was subjected to partial digestion with BglII. A 6.1 kb BglII fragment was obtained, see fig. 2C. Because sGH contains an internal Bglll site, a complete digestion could not be performed, as this would have resulted in recovery of inoperative and incomplete integrative vectors.

De fragmenter som ble oppnådd ved den partielle digereringThe fragments obtained by the partial digestion

av pHIL51, ble underkastet agarosegelelektroforese. 1 ug av of pHIL51, was subjected to agarose gel electrophoresis. 1 ug off

lineære seteselektive integrative sGH-vektorer forurenset med mindre BglII-fragmenter ble oppnådd ved denne fremgangsmåte. Denne blanding av DNA-fragmenter ble benyttet til å transformere Pichia pastoris stamme GS115 (his4-) som er deponert hos the Northern Regional Research Center, De forente staters landbruksdepartement, med aksesjonsnr. NRRL Y-15851. Transformasjon med vektorer inneholdende histidinol-dehydro-genasegenet komplementerer denne defekt i histidinveien, linear site-selective integrative sGH vectors contaminated with minor BglII fragments were obtained by this method. This mixture of DNA fragments was used to transform Pichia pastoris strain GS115 (his4-) deposited at the Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, under accession no. NRRL Y-15851. Transformation with vectors containing the histidinol dehydrogenase gene complements this defect in the histidine pathway,

idet de GS115-transformerte celler forandres til His<+>. Screening for transformanter kan derfor lett utføres ved dyrking av cellene etter transformasjon i et vekstmiljø som mangler histidin og utvinning av de celler som kan vokse under denne betingelse. as the GS115-transformed cells are changed to His<+>. Screening for transformants can therefore be easily performed by culturing the cells after transformation in a growth medium lacking histidine and recovering the cells that can grow under this condition.

B. CelledyrkingB. Cell culture

Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) ble podet inn i ca.Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) was inoculated into approx.

10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C i 12-20 h. 100 ml YPD-medium ble podet med startkultur (seed culture) for å gi en OD500på ca. 0,001. Mediet ble dyrket i en ristekolbe ved 30°C i 12-20 h. 10 ml of YPD medium and shaking culture at 30°C for 12-20 h. 100 ml of YPD medium was inoculated with seed culture to give an OD500 of approx. 0.001. The medium was grown in a shaking flask at 30°C for 12-20 h.

Kulturen ble høstet når ODggg var 0,2-0,3 (etter tilnærmet 16-20 h) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 min ved anvendelse av en Sorvall RC5C. The culture was harvested when the ODggg was 0.2-0.3 (after approximately 16-20 h) by centrifugation at 1500 g for 5 min using a Sorvall RC5C.

C. Preparering av sfæroplasterC. Preparation of spheroplasts

Cellene ble vasket en gang i 10 ml sterilt vann og deretter sentrifugert ved 1500 g i 5 min. (Sentrifugering utføres etter hver cellevask ved 1500 g i 5 min ved bruk av "Sorvall RT6000B" med mindre noe annet er angitt). Cellene ble deretter vasket en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml sterilt 1 M sorbitol, og til slutt resuspendert i 10 ml SCE-buffer. 7,5 ul av 3 mg/ml Zymolyase (100 00 enheter pr. g fra Miles Laboratories) ble satt til celleoppløsningen. Cellene ble deretter inkubert ved 30°C i ca. 10 min. (En reduksjon på 60% i ODgQQkan anvendes som en riktig tids- og konsentra- sjonsmarkør). Sfæroplastene ble vasket en gang i 10 ml sterilt 1 M sorbitol ved sentrifugering i 700 g i 5-10 min. (Tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere. Der bør sentrifugeres tilstrekkelig til å pelletere sfæroplastene, men The cells were washed once in 10 ml of sterile water and then centrifuged at 1500 g for 5 min. (Centrifugation is performed after each cell wash at 1500 g for 5 min using "Sorvall RT6000B" unless otherwise stated). The cells were then washed once in 10 ml of freshly prepared SED, once in 10 ml of sterile 1 M sorbitol, and finally resuspended in 10 ml of SCE buffer. 7.5 µl of 3 mg/ml Zymolyase (100,000 units per g from Miles Laboratories) was added to the cell solution. The cells were then incubated at 30°C for approx. 10 minutes (A reduction of 60% in ODgQQ can be used as a correct time and concentration marker). The spheroplasts were washed once in 10 ml of sterile 1 M sorbitol by centrifugation at 700 g for 5-10 min. (The time and speed of the centrifugation may vary. Sufficient centrifugation should be used to pellet the spheroplasts, but

ikke så meget at de brytes opp av kraften). 10 ml sterilt CaS ble benyttet som en endelig cellevask, og cellene ble sentrifugert igjen ved 700 g i 5-10 min og resuspendert i 0,6 ml CaS. not so much that they are broken up by the force). 10 ml sterile CaS was used as a final cell wash, and the cells were centrifuged again at 700 g for 5-10 min and resuspended in 0.6 ml CaS.

D. TransformasjonD. Transformation

GS115-celler ble transformert med 1 ug av de lineære sGH-vektorer ved anvendelse av sfæroplast-transformasjonsteknikken i henhold til Sreekrishna et al. i Gene 59, 115-125 (1987). DNA-prøver ble tilsatt (inntil et volum på 20 ul) til 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (DNA bør foreligge i en egnet buffer såsom TE-buffer). 100 ul sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 20 min. GS115 cells were transformed with 1 µg of the linear sGH vectors using the spheroplast transformation technique according to Sreekrishna et al. in Gene 59, 115-125 (1987). DNA samples were added (up to a volume of 20 µl) to 12 x 75 mm sterile polypropylene tubes. (The DNA should be in a suitable buffer such as TE buffer). 100 ul spheroplasts were added to each DNA sample and incubated at room temperature for approx. 20 min.

1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve og inkubert ved 1 ml of PEG solution was added to each sample and incubated at

værelsetemperatur i ca. 15 min og sentrifugert ved 700 g i 5-10 min. SOS (150 ul ble satt til pelleten og inkubert i 30 min ved værelsetemperatur. Til slutt ble 850 ul 1 M sorbitol tilsatt. room temperature for approx. 15 min and centrifuged at 700 g for 5-10 min. SOS (150 µl was added to the pellet and incubated for 30 min at room temperature. Finally, 850 µl of 1 M sorbitol was added.

E. Regenerering av sfæroplasterE. Regeneration of spheroplasts

Et bunn-agarlag på 20 ml regenereringsagar SDR ble helt på hver plate minst 30 min før transformasjonsprøvene var ferdige. Dessuten ble 8 ml's porsjoner av regenereringsagar fordelt A bottom agar layer of 20 ml regeneration agar SDR was poured onto each plate at least 30 min before the transformation samples were finished. In addition, 8 ml portions of regeneration agar were dispensed

på 15 ml's rør med konusformet bunn i et 45°C bad i løpet av den periode transformasjonsprøvene forelå i SOS. Porsjoner på 50, 250 eller 800 ul av den transformerte prøve ble satt til 8 ml's porsjonene av smeltet regenereringsagar, holdt på 45°C og helt på plater inneholdende faste 20 ml's bunn-agarlag. Platene ble inkubert ved 30°C i 3-5 dager. on 15 ml tubes with a cone-shaped bottom in a 45°C bath during the period the transformation samples were present in SOS. Aliquots of 50, 250 or 800 µl of the transformed sample were added to 8 ml aliquots of molten regeneration agar, maintained at 45°C and poured onto plates containing solid 20 ml bottom agar layers. The plates were incubated at 30°C for 3-5 days.

F. Seleksjon av transformanterF. Selection of transformants

Der ble selektert for transformanter ved dyrking på SDR, et .medium som mangler histidin. Kulturer som vokste i fravær av histidin ble dessuten undersøkt for "metanol langsom"-fenotype (hvilket indikerer seteselektiv integrasjon). De transformerte GS115-celler som viste tegn på begge fenotyper, ble deretter dyrket og analysert for produksjonen av sGH. Pichia pastoris GS115/pHIL51-62 ble selektert ved denne fremgangsmåte og ble deponert den 29. mars 1988 i henhold til Budapest-konvensjonen hos the Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, med aksesjonsnr. NRRL(Y-18353). There selection was made for transformants by cultivation on SDR, a medium which lacks histidine. Cultures grown in the absence of histidine were also examined for the "methanol slow" phenotype (indicating site-selective integration). The transformed GS115 cells showing signs of both phenotypes were then cultured and analyzed for the production of sGH. Pichia pastoris GS115/pHIL51-62 was selected by this method and was deposited on March 29, 1988 under the Budapest Convention at the Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, under accession no. NRRL(Y-18353).

Eksempel VExample V

Ekspresjon av sGHExpression of sGH

A. CellekulturA. Cell culture

Pichia pastoris GS115/pHIL51-62 ble podet inn i 2 1 IM-3-medium inneholdende 2% glycerol ved 3 0°C. Etter at denne sats med glycerol var oppbrukt, ble kontinuerlig vekst opp-rettet på FM-21-medium inneholdende 10% glycerol. Den kontinuerlige kultur ble opprettholdt ved en fortynningshastighet på 0,065 (oppholdstid = 15,4 h) inntil en celletetthet på Pichia pastoris GS115/pHIL51-62 was inoculated into 2 L of IM-3 medium containing 2% glycerol at 30°C. After this batch of glycerol was used up, continuous growth was established on FM-21 medium containing 10% glycerol. The continuous culture was maintained at a dilution rate of 0.065 (residence time = 15.4 h) until a cell density of

ca. 50 g/l regnet på tørr cellevekt ble oppnådd. Etter at fire reaktorvolumer av matningsmedium var blitt tilført gjæringsapparatet, ble gjæringens kontinuerlige trinn avsluttet. Produksjonen av lakseveksthormon ble indusert og opprettholdt ved den vedvarende injisering av metanol på 0,25-0,5% av dyrkingsvolumet slik at konsentrasjonen av metanol ble opprettholdt på mellom 0,1 og 0,8%. Prøver ble samlet opp for analyse av lakseveksthormon etter at kulturen var blitt utsatt for metanol i 0, 24, 50 og 73 h. Etter at kulturen var blitt utsatt for metanol i 73 h, ble den høstet ved sentrifugering. Ca. 300 g våt cellepasta ble oppnådd fra det gjenværende kulturvolum på 1,5 1. Dette svarte til 199 g/l våt cellepasta eller tilnærmet 50 g/l tørr cellevekt, hvilket antydet at about. 50 g/l calculated on dry cell weight was achieved. After four reactor volumes of feed medium had been added to the fermenter, the continuous step of the fermentation was terminated. The production of salmon growth hormone was induced and maintained by the continuous injection of methanol at 0.25-0.5% of the culture volume so that the concentration of methanol was maintained at between 0.1 and 0.8%. Samples were collected for analysis of salmon growth hormone after the culture had been exposed to methanol for 0, 24, 50 and 73 h. After the culture had been exposed to methanol for 73 h, it was harvested by centrifugation. About. 300 g wet cell paste was obtained from the remaining culture volume of 1.5 L. This corresponded to 199 g/l wet cell paste or approximately 50 g/l dry cell weight, suggesting that

cellemassen ikke i vesentlig grad ble redusert under gjæringens metanolinduksj onstrinn. the cell mass was not significantly reduced during the methanol induction step of the fermentation.

B. Deteksjon av sGHB. Detection of sGH

10 ml celler med en ODggg på 5-10 pr. ml ble oppnådd fra 10 ml cells with an ODggg of 5-10 per ml was obtained from

gjæringsapparatet. Cellene ble sentrifugert ved 5000 omdr./min ved bruk av en "Sorvall RT6000B" avkjølt sentrifuge. Pelleten ble vasket medl ml brytningsbuffer, sentrifugert som angitt ovenfor og resuspendert i 0,5 ml brytningsbuffer. Blandingen ble svirret i 8 min alt i alt, fra 2 til 4 min hver gang, under anvendelse av et halvt volum syrevaskede glassperler ("Sigma", 450 pi). Blandingen ble sentrifugert på nytt ved 12 000 omdr./min i 5 min ved bruk av en mikrosentrifuge for the fermenter. The cells were centrifuged at 5000 rpm using a "Sorvall RT6000B" refrigerated centrifuge. The pellet was washed with 1 ml of digestion buffer, centrifuged as above and resuspended in 0.5 ml of digestion buffer. The mixture was vortexed for a total of 8 min, from 2 to 4 min each time, using half a volume of acid-washed glass beads ("Sigma", 450 µl). The mixture was centrifuged again at 12,000 rpm for 5 min using a microcentrifuge to

å pelletere celleavfallet. Den resulterende pellet ble resuspendert i 200 pl av den følgende oppløsning: 10 mM Tris-HCl pH 8, 1,0 mM EDTA, 2,5% SDS, 5% |3-merkaptoetanol og 0,01% BPB (bromfenol blått). For deteksjon av sGH ble denne oppløsning kjørt på en 15% SDS-polyakrylamidgel i ca. 25 min. De stan-darder som ble anvendt, var renset 25 kD sGH og Biorad-standard med lav molekylvekt. Protein ble gjort synlig på gelene ved farging med Coomassie Blue. Tilnærmet 1-3% av det samlede celleprotein var sGH med 5-20% av dette i den aktive 22 kD-form. Deteksjon av nærværet av det aktive 22 kD-materiale og 25 kD-materialet av sGH ble utført ved en modifisert Western to pellet the cell waste. The resulting pellet was resuspended in 200 µl of the following solution: 10 mM Tris-HCl pH 8, 1.0 mM EDTA, 2.5% SDS, 5% β-mercaptoethanol and 0.01% BPB (bromophenol blue). For detection of sGH, this solution was run on a 15% SDS-polyacrylamide gel for approx. 25 min. The standards used were purified 25 kD sGH and Biorad standard with low molecular weight. Protein was made visible on the gels by staining with Coomassie Blue. Approximately 1-3% of the total cell protein was sGH with 5-20% of this in the active 22 kD form. Detection of the presence of the active 22 kD material and the 25 kD material of sGH was performed by a modified Western

ved anvendelse av en trippel antistoffdeteksjons-metode:using a triple antibody detection method:

sGH mus-MoAb/antimus geit-Ab/antigeit kanin Ab-alkalisk-fosfatase. Begge bånd ble synliggjort på gelene. sGH mouse MoAb/antimouse goat Ab/antigoat rabbit Ab alkaline-phosphatase. Both bands were visualized on the gels.

De eksempler som er angitt, er bare ment å belyse utførelsen av oppfinnelsen og skal ikke anses som begrensende for omfanget av oppfinnelsen eller de tilhørende krav. The examples given are only intended to illustrate the implementation of the invention and should not be considered as limiting the scope of the invention or the associated claims.

Claims

1. Process for the production of 22 kD sGH protein, . characterized in that it includes: a) transforming a methylotrophic yeast strain of the genus Pichia with at least one vector having a Pichia-compatible expression cassette containing an sGH structural gene operably linked to a regulatory region and a 3' end sequence, and then b) culturing the resulting transformed yeast strain of the genus Pichia under suitable conditions to achieve production of 22 kD sGH.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the said vector is selected from the group consisting of plasmids or linear integrative site-specific vectors.

3. Method as stated in claim 2, characterized in that the vector is a linear integrative seat-specific vector.

4. Method as stated in claim 3, characterized in that the aforementioned linear integrative seat-specific vector contains the following arrangement in series: a) a first insertable DNA fragment, b) a marker gene and at least one Pichia-compatible expression cassette containing an sGH structural gene operably linked to a regulatory region and a 3' end sequence, and c) another insertable DNA fragment, where the order of the dark gene and the cassette in component (b) can be reversed.

5. Method as stated in claim 4, characterized in that the first insertable DNA fragment and the second insertable DNA fragment are obtained from the DNA sequence of a gene isolated from Pichia pastoris and selected from the group consisting of A0X1, p4 0, DHAS and HIS4. .

6. Method as stated in claim 4, characterized in that the expression cassette comprises a) a regulatory region selected from the group consisting of A0X1, p40, DHAS and HIS4 isolated from Pichia pastoris, acid phosphatase, galactosidase, alcohol dehydrogenase, cytochrome c, alpha-pairing factor and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isolated from Saccharomyces cerevisiae operably associated with b) an sGH structural gene encoding an sGH operably linked to c) a Pichia pastoris 3'-end sequence selected from the group consisting of the 3'-tagged end sequences isolated from the AOX1 gene, the p40 gene, the DHAS gene and the HIS4 gene.

7. Method as stated in claim 4, characterized in that the said marker gene is selected from the group consisting of HIS4 and ARG4 isolated from Pichia pastoris, SUC2 isolated from Saccharomyces cerevisiae and G418 <R-> gene of bacterial Tn903 and Tn601.

8. Method as stated in claim 4, characterized in that said vector comprises a) a first insertable DNA fragment which is approximately one kilobase of the 5'A0X1 regulatory region which is isolated from Pichia pastoris and is operably connected to b) a sGH structural gene operably linked to c) the 3' end sequence of AOX1 isolated from Pichia pastoris ligated to d) a marker gene that is HIS4 isolated from Pichia pastoris ligated to e) another insertable DNA fragment that is approximately 0.65 kilobases of the 3' AOX1 end sequence.

9. Linear integrative seat-specific vector, characterized in that it comprises the following arrangement in series: a) a first insertable DNA fragment, b) a marker gene and at least one Pichia-compatible expression cassette containing an sGH structural gene operably linked to a regulatory region and a 3' end sequence, and c) another insertable DNA fragment, where the order of the marker gene and the cassette in component (b) can be reversed.

10. Vector as stated in claim 9, characterized in that the first insertable DNA fragment and the same second insertable DNA fragment are obtained from the DNA sequences of a gene isolated from Pichia pastoris and selected from the group consisting of AOX1, p40, DHAS and HIS4.

11. Vector as stated in claim 9, characterized in that the expression cassette comprises a) a regulatory region selected from the group consisting of AOX1, p40, DHAS and HIS4 isolated from Pichia pastoris, acid phosphatase, gelactosidase, alcohol dehydrogenase, cytochrome c, alpha-mating factor and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isolated from Saccharomyces cerevisiae operably linked to b) an sGH structural gene encoding sGH operably linked to c) a 3'-end sequence selected from the group consisting of the 3'-tagged end sequences isolated from the AOX1 gene, the p40 gene, the DHAS gene and the HIS4 gene isolated from Pichia pastoris.

12. Vector as stated in claim 9, characterized in that said marker gene is selected from the group consisting of HIS4 and ARG4 isolated from Pichia pastoris, SUC2 isolated from Saccharomyces cerevisiae and G418 <R-> gene of bacterial Tn903 and Tn601.

13. Vector as stated in claim 9, characterized in that said vector comprises a) a first insertable DNA fragment which is an operable regulatory region of the 5'AOX1 gene approximately one kilobase long, isolated from Pichia pastoris and operably linked to b) an sGH structural gene operably linked to c) The 3' end sequence of AOX1 isolated from Pichia pastoris ligated to d) a marker gene that is HIS4 isolated from Pichia pastoris ligated to e) another insertable DNA fragment that is approximately 0.65 kilobases of the 3' AOX1 end sequence.

14. The vector pHIL51.

15. Methylotrophic yeast of the genus Pichia transformed with a vector containing a Pichia-compatible expression cassette comprising a regulatory region operably linked to an sGH gene operably linked to a 3 <1-> end sequence.

16. Methylotrophic yeast of the genus Pichia as stated in claim 15, characterized in that the yeast is Pichia pastoris.

17. Methylotrophic yeast of the genus Pichia as stated in claim 16, characterized in that the yeast is Pichia pastoris GS115.

18. Pichia pastoris GS115 as set forth in claim 16, transformed with the linear Bglll/Bglll site-specific integrative vector cleaved from vector pHIL51.

19. Pichia pastoris transformed with the vector as set forth in claim 9.

20. Pichia pastoris GS 115/PHIL51-62 NRRL(Y-18353).