NO853433L

NO853433L - Humane lymfoblastoid-leukosytt-hybrid-interferoner.

Info

Publication number: NO853433L
Application number: NO853433A
Authority: NO
Inventors: Marvin Harry Caruthers; Yitzhak Stabinsky; Michael Leineweber
Original assignee: University Patents Inc
Priority date: 1984-08-31
Filing date: 1985-08-30
Publication date: 1986-03-03
Also published as: DK397885D0; DK397885A; ES8700694A1; EP0173935A1; IL76258A0; KR870002262A; PT81057B; PT81057A; FI853307A0; GR852100B; FI853307L; ES546525A0

Description

Foreliggende oppfinelse vedrører en fremgangsmåte til konstruksjon av en nukleotid sekvens som koder for nye humane lymfoblastoid-leukosytt hybrid interferoner og innbefatter en hybridpromotor og ribosom bindingssete som er nyttig for ekspresjon av de hybride interferonene.

De syntetiske DNA sekvensene innføres i. plasmidvektorer

og innføres deretter i mikroorganismer. Transformerte mikroorganismer og ekspresjonen av nye hybridinterferoner er beskrevet.

Som bakgrunnsmateriale er velkjent at det finnes tallrike, kommersielle anvendelser av mikroorganismer. F.eks.

har både eukaryotide og prokaryotide mikroorganismer lenge vært benyttet for behandling av avfall, som kilder for protein og medisinske produkter, og for diverse biologiske omvandlinger til både primære og sekundære metabolitter.

(Sei. Amer. 245:67-74 (1981)). Senere er det blitt mulig å overføre operative gener blant mikroorganismer og mellom mikroorganismer og forskjellige høyere former for liv. De moderne teknikkene innenfor genemalipulering,

med spesiell referanse til den rekombinante DNA/RNA-teknologien, gjør det teoretisk mulig å overføre et hvilket som helst gen eller gruppe av gener til et plasmid som er istand til å funksjonere i mikroorganismer.

Genetisk rekombinasjon er den biologiske fremgangsmåte hvorved genetisk informasjon utveksles mellom kromosomer. Feltene som omfatter både klassisk og molekylær genetikk, innbefatter oppløsning av kompleksitetene for genetisk rekombinasjon. Rekombinasjon finner vanligvis ikke sted mellom ubeslektede specis av organismer. Ikke desto mindre tillater de nye rekombinante DNA-teknikkene nå overføring av gener mellom beslektede eller ubeslektede organismer (Amer. Sei., 68^:664-674 (1980)). Den genetiske endringen av genestrukturen har spesiell anvendelse innenfor feltet industriell mikrobiologi (Sei.Amer. 245:91-102 (1981)).

Genetisk rekombinasjon innbefatter oppbryting og spleising av DNA-molekylet. Det er nå mulig å samle diverse genetisk informasjon in vitro i form av DNA-fragmenter fra forskjellige prokaryotide og eukaryotide kilder og å innføre dette genetiske materialet i en selvrepliserende genetisk del,' kalt eri klonevektor. DNA-fragementer, eller også intakte gener, kan konstrueres ved syntetiske kjemikalier slik at de tilsvarer de ønskede teoretiske genesekvensene, eller kjente genesekvenser, og deretter innføres i en utvalgt vektor. Klonevektorer er vanligvis bakterielle plasmider eller bakteriofager.Plasmider er autonome ekstra-kromosomale genetiske enheter som består av en sirkulær kjede av DNA og er tilstede i de fleste bakterier og i noen eukaryoter. Bakteriofager er DNA viruser som er parasitter bare på bakterier. De hybride genetiske vektorene innføres deretter i utvalgte mikroorganismer ved en fremgangsmåte kjent som transformasjon. Mikroorganismer som er transformert på denre måten, er potensielle fabrikker for fremstilling av støne mengder av det klonede

DNA.

Den fremmede genetiske informasjonen som er tilstede i klonevektoren, ekspremeres ofte ikke i de transformerte mikroorganismene. En ikke-ekspremerende klonevektor kan være ønskelig i de tilfeller hvor ekspresjon av det fremmede genomet kunne gi et produkt som var dødelig for verts-organismen. En ikke-ekspremerende eller lav-ekspremerende klonevektor representerer en tilgjengelig kilde for det fremmede genetiske materialet som deretter kan isoleres in vitro og innføres i en ekspresjonsvektor (dvs. et spesielt fremstilt eller utvalgt plasmid).

Det fremmede DNA plasseres på en egnet posisjon (innføres f.eks. med lakk operonet) i en ekspresjonsvektor hvor den unedbrytbare genetiske frekvensen er slik at den fremmede genetiske informasjonen transskriberes (dvs. mRNA

fremstilt fra det fremmede DNA) og translateres (dvs. proteinsyntese fra mRNA templatet) og det ønskede produktet (kodet i den fremmede DNA) oppnås. Som ved fremstillingen av klonevektoren innføres ekspresjonsvektoren i en valgt mikroorganisme og den resulterende transformerte mikroben tjener som en fabrikk for fremstillingen av det fremmede DNA-produktet.

Med utviklingen av klassen av enzymer som er kjent som restriksjonsendonukleaser, kan DNA nå kuttes in vitro ved spesifikke posisjoner ved fremstillingen for innføring i en egnet overføringsvektor. Restriksjonsendonukleaser er enzymer som er posisjonsspesifikke endonukleaser, som primært spalter dobbeltkjedet DNA, men i noen tilfeller spalter enkeltkj edet DNA. Alle restriks jonsendonukleaser gjenkjenner spesifikke DNA-sekvenser. Klasse II restriksjonsendonukleaser spalter^ved spesifikke sekvenser, mens klasse I restriksjonsendonukleaser synes å spalte DNA tilfeldig og gir heterogene produkter. Forskjellige restriksjonsendonukleaser gir DNA-fragmenter av forskjellige lengder og typer. F.eks. spalter noen restriksjonsendonuk-. leaser begge DNA-kjedene ved det samme punktet og gir "butt -ende" DNA-fragmenter, i motsetning til andre enzymer som spalter en DNA-kjede flere nukleotider borte fra spaltingen av den komplementære kjeden og gir "konesjonsende" DNA fragmenter. En fagmann på feltet rekombinant DNA-teknologi kan ved valget av endonuklease for behandling av det aktuelle DNA oppnå de ønskede DNA-fragmentene som kan settes sammen ved virkningen av en DNA'ligase. På denne måten kan kuttingen og spleisingen av genetisk informasjon (DNA) oppnås. Etter innføringen av den fremmede DNA i en mikrobe, kan de eksakte sekvensene som er klonet, bestemmes ved DNA sekvenseringsfremgangsmåter.

For å bevirke en ønsket endesekvens på de aktuelle DNA-fragmentene (f.eks. for legeringsformål), kan nukleotider tilsettes til den terminale delen av slikt DNA. F.eks.

ved fremgangsmåten kjent som homopolymer, endeslutning,

kan er serie identiske deoksyribonukleotider tilsettes på

3' endene av klonevektoren og en serie komplementære deoksyribonukleotider tilsettes på 3' endene av DNA fragmentene som skal klones. Disse DNA sekvensene kan deretter settes sammen og innføres i en mikrobiell vert.

En annen generell fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket DNA fusjonsprodukt er tilsatsen av "adapter" eller "forbindelses-fragmenter" til endene av enten den ene eller begge av klonevektoren eller DNA-fragmentene som skal klones. For-bindelsesfragmenter er små seksjoner av DNA som inneholder en eller flere gjenkjenningssekvenser for restriksjonsendonukleaser.

Etter innføringen av fremmed DNA i en mikrobe,,kan de

eksakte sekvensene som er klonet bestemmes ved DNA sekvenseringsfremgangsmåter.

Det finnes flere måter hvorved fremmed DNA-materiale kan

oppnås for innføring en overføringsvektor. DNA-fragmenter som direkte oppnås fra en moderkilde, kan føres inn i den egnede vektoren. En annen fremgangsmåte er å oppnå

mRNA fra en aktiv synteseposisjon (produktekspresjons-område) i modersystemet og å oppnå en enkeltkjedet komplementær DNA-kjede syntetisert enzymatisk (revers transkriptase) fra det isolerte mRNA'et. Et dobbelt-

kjedet DNA-molekyl syntetiseres deretter fra det enkeltkjedede templatet. Dobbeltkjedet DNA fremstilt på denne måten er kjent som komplementært DNA (cDNA).

Så snart en ønsket DNA sekvens er kjent, kan gener også syntetiseres kjemisk in vitro for kloning, ekspresjonsformål i mikrobielle, vevs- eller cellekultursystemer.

Interferoner er en stor familie av proteiner som frigjøres

av forskjellige dyreceller når de eksponeres mot et virus som setter andre celler i stand til å motså en infeksjon. Interferoner varierer fra spesis til spesis.

Selv om virkningsmåten foreløpig ikke er godt kjent,

antas den å være av antiviral natur. Antagelig kan interferoner være effektive mot virussykdommer, og muligvis kreft. Interferonet er kjent for å ha forskjellige biologiske aktiviteter i tillegg til de som bidrar til anti-virus-virkningene. Tre klasser eller grupper av humane interferoner er identifisert: alfa eller leukocytt-interferon;

beta eller fibroblast-interferon; og gamma eller immun-interferon.

Alfa eller leukocytt-interferonet er en familie av beslektede proteiner som har en kjedelengde som består av 165 eller 166 aminosyrer. Minst 8 forskjellige undertyper av alfa-interferon er detektert ved kloning av cDNA'er fra leukocytt mRNA'er. Mange forskjellige alfainterferoner er allerede isolert ogkarakterisert. Ved å anvende rekombinant DNA-teknologi, er det nå mulig å isolere og karakterisere humaninterferongener og å klone dem i bakterier eller andre mikroorganismer for produksjon av kvantitativt betydelige mengder interferoner for eksperimentelle formål og medisinske formål.

Lymfocytter er hvite blodceller (leukocytter) som dannes

i lymfoidvev, og lymfoblasder er umodne lymfocytter.

Den kjemiske sekvensen for flere humane leukocytt interferoner er kjent. Imidlertid er aminosyresekvensene i visse lymf oblastcvidinter f eroner fremdeles ikke fullstendigkarakterisert. Blant disse delvis karakteriserte interferonene er det lymfoblastoide interferonet som produseres ved induksjonen av Namalva celler med Newcastle sykdomsvirus, stamme Bl (Proe. Nati. Acad. Sei., 76:5601-5605 (1979);

J. Biol. Chem., 252:6585-6587 (1977)). En del av amino-

syre sekvensen av dette proteinet er bestemt, men hele sekvensen er ikke blant kjente alfarinterferonene. Dette lymfoblastoid interferonet er et attraktivt alternativ for genesyntese av flere grunner. For det første eksprimeres interferonene naturlig som resultat av en virusinfeksjon i tilstrekkelige mengder for isolering og forskjellige biologiske og biokjemiske studier. For det andre er genet for dette interferonet ikke blant kjente klonede interferongener. For det siste er lymfoblastoidinterferonet som oppstår naturlig blant hovedklassene av interferoner som nå undergår kliniske forsøk for medisinske forhold.

Karakteriseringen, rensingen og fremstillingen av interferoner, ved anvendelser av rekombinante DNA-fremgangsmåter,

er sammenfattet (Sei. Amer. 249:37-43 (1983)). Forskjellige humane hybridleukocyttinterferoner er beskrevet i US patent 4.414.150. I tillegg er genesekvenser, rekombinante DNA-molekyler, transformerte mikroorganismer, og fremgangsmåter til fremstilling av humane interferon-liknende polypeptider

beskrevet i Europeisk Patentsøknad nr. 32.134.

I lys av den foregående diskusjonen av noen av de senere fremskrittene innenfor feltet geneteknologi og nærmere bestemt når det gjelder identifikasjon,, kjemisk - karakterisering og fremstilling av humane interferoner,

er en forbedret fremgangsmåte for fremstillingen av nye interferongener meget ønskelige. Et formål med foreliggende oppfinnelse er å fremstille nye humane hybrid interferoner som innbefatter polypeptid seksjoner av lymfoblastoidinterferon, og leukocyttinterferon. Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å syntetisere den eukaryotide genesekvensen som koder for nye lymfoblastoid-leukocytt hybridproteiner, innbefattet syntesen av en geneseksjon som koder for egnede ribosome bindingsposisjoner og et promotorområde. Nok et formål for foreliggende oppfinnelse er å klone syntetiserte hybride lymfoblastoid-leukocytt genesekvenser i en egnet vektor, og mikrobielt system,

og deretter oppnå ekspresjon av nye hybridinterferoner som var av biologisk aktivitet. Nok et formål med foreliggende oppfinnelse er å utvikle nye transformerte mikroorganismer som inneholder den nukleotide sekvensen som koder for nye lymfoblastoid-leukocytt hybridinterferoner som er nyttige som anti-virusmidler. Disse og andre formål fremgår tydeligere av den følgende beskrivelsen og spesielt av de vedlagte patentkravene.

Syntesen av et gen som inneholder visse lymfoblastoidinter-feroner og leukocytt interferon sekvenser er beskrevet. Utførelser innbefatter enten at alfa C, hvor F eller I-type leukocytt interferonsekvenser. Syntese fremgangsmåten er angitt slik at lymfoblastoidinterferonsekvensen kan kombineres med enten alfa C, F eller I leukocytt-interferonsekvenser. Fremgangsmåten for syntese av de hybride interferongene-sekvensene ifølge oppfinnelsen innbefatter en kombinasjon av kjemiske og enzymatiske fremgangsmåter. I tillegg beskrives avledningen av en hybrid promotor og tre hybrid ribosome bindingsposisjoner som er nyttige for eksprimering av dette genet.

Det lymfoblastoidet hybrid interferon genet består av

en DNA dupleks med 5 98 basepar. Genesekvensens koder for de 166 aminosyrene i det strukturelle genet, et initieringskodon, to termineringskodoner og et kontrollområde som inneholder en promotor, en operator og en ribosombindings-posisjon. Den DNA base-parede sekvensen for dette genet, sammen med aminosyrene, som det koder for, er gjengitt i tabell 1. Direkte over DNA sekvensen er hvert 20. basepar nummerert som angir nukleotidene relativt til 5' EcoRI kutteposisjonen på sensorkjeden som er nr. 1. Over tallene er parenteser som definerer dambda Pr/T7 A2 promotoren, lakkoperatoren, RI ribosombindingsposisjonen, og det strukturelle genet. Angivelsen som definerer Ri strekker seg til og med det 8. aminosyrekodonet. Aminosyresekvense for det lymfoblastoidet hybridgenet er plassert over de tilsvarende kodonene for DNA-sensor kjeden. Nær 3'

enden av sensorkjeden finnes to termineringskodoner og vei 3 ' terminalen, EcoRI 3' kutteposisjonen..JVisse nøkkelrestriksjonsposisjoner er angitt ved understreking: EcoRI (to ganger), Alul, Haell), Ddel, og Hindlll. Hovedelementene i denne genepromotoren, ribisombindings-posisjon, og proteinkodene området av hybrid-strukturene tilsvarer ikke noen andre kjente naturlige DNA sekvenser.

Promotoren (1-71) er primært lambda av hovedpromotoren mot høyre (lambda PR) og ldck operatoren. Formålet var å utforme en transkripsjonsmessig meget aktiv promotor under lakk-kontroll. Ved det tidspunktet hvor foreliggende prosjekt ble startet, var ingen slik promotor kjent. Imidlertid ble en kombinasjon av tryptofan operon promotoren med lakk-operatoren utviklet uavhengig omtrent samtidig (takk-promotoren) og disse to konstruksjonene ble publisert samtidig (Caruthers, M.H., et al., i "Promoters, Structure and Function" (R. Rodriguez og M. Chamberlin, red.), Preager, N.Y., 1982, side 432 - 451; DeBoer, H.A., et al., i "Promoters, Structure and Function", (R. Rodriguez og M. Chamberlin, red.), Preager, N.Y., 1982, side 462 - 481). I tillegg var den spesifikke seleksjonen av en hybridpromotor som inneholder lambda PD rs. sammen med lakk operator spesielt attraktivt som et modellsystem for uavhengige studier av protein-DNA vekselvirkningsmekanismer. Denne spesielle hybridpromotoren vil gjenkjennes av E. coli RNA polymerase, lakk repressor, kro repressor, og cl repressor. Vekselvirkningen mellom disse forskjellige proteinene med den samme DNA (modifisert eller urcodifi-sert) kunne derfor studeres. Lambda PR var spesielt utvalgt fremfor lambda PT fordi den kunne utvides til å innbefatte lambda P^ promotoren. Når det først er utvidet til å inneholde to promotorer kan DNA benyttes til å studere promotorseleksjon av E. coli RNA polymerase som funksjon av sekvensmodifisering. En tidlig konstruksjon av hybridet lambda PR/T7 A2/ lakk promotor var ganske enkelt lakk operatorsekvensen (posisjon 51 - 71) kombinert med lambda P_ promotorsekvensen (ikke vist) mellom 6-50. Imidlertid var en lambda PR sekvens (dAATGGT) mellom 10 - området og transkripsjonsinitieringsposisjonen, homolog med lakk operatorsekvensene fra 51 - 56 (dAATTGT). Homologien skapte problemer når T4 DNA ligase ble benyttet

i forsøk på å sammenføye syntetiske oligodeoksynukleotider lokalisert ved dette området av genet. Homologien ble eliminert ved å forandre nukleotidene 46 - 49 til sekvensen som finnes ved disse posisjonene (relativt til transkripsjonsinitiering) i T7 A2 promotoren.

En slik substitusjon ble ikke betraktet som nedbrytende på transkripsjonsaktiviteten av hybridpromotoren fordi sekvensen i dette området er meget variabel i forskjellige promotorer. Følgelig er den .endelige promotor DNA-

sekvensen en kompositt av lambda PR (5 - 45), T7 A2

(46 - 50) og lakk (51 - 77) promotorer. Transkripsjonsaktiviteten av denne hybridpromotoren ble sammenliknet med aktiviteten av lakk promotoren. Begge promotorene ble klonet i den samme plasmidbakgrunn og analysert ved-rørende B-galaksydaseaktivitet i en lakk utslettelses-dannelse av E. coli. Lambda PR/T7 A2/ lakk hybrid promotor er funnet å være ca. 50% mer aktiv enn den fullt induserte lakk promotoren og ca. 4 ganger mer aktiv enn lakk promotoren under katabolytisk represjon (glukose som karbonkilde).

Ribosom bindingsseter ss står fremdeles tilbake som udefinerte strukturer. Translasjon fra en translasjons-bindingsposisjon i E. coli starter fra enten en AUG

eller enGUG kodon som vanligvis er lokalisert ca. 6 - 8 nukleotider fra et purin-rikt DNA segment kalt Shine og Dalgarno sekvensen. Basert på systematiske sammenlikninger

av et stort antall ribosome bindingsseter, har flere: .... andre observasjoner vedrørende viktige sekvenselementer innenfor disse posisjonene vært postulert.(Scherer, G.,

et al. Nucleic Acids Res. 8 : 3895 - 3907 (1980)).

Tabell 2 angir disse forskjellige ribosome bindings-

setene. De første åtte aminoterminale aminosyrene kodet ved det lymfoblastoide hybrid interferongenet ifølge oppfinnelsen, er vist. Gruppen av partielle ribosome bindings-

setene som vil kodes for denne proteinsekvensen er vist direkte under disse aminosyrene. Angitt er også

de ribosome bindingssetene Ri, R2, og R3 og de idealiserte eller kjente ribosome bindingssetene (R.B.S.) hvorfra de er utviklet.

Ved det tidspunktet når foreliggende arbeid ble startet

opp var visse observasjoner tilgjengelige for å lette utformingen av et hybrid ribosom bindingssete.

Sherer et al. (Nucleic Acids Res. 8: 3895 - 3907 (1980)) hadde foreslått en modell for et ribosom bindingssete basert på en datamaskinanalyse av 68 kjente E. coli ribosom bindingssete. For RI ble det valgt å benytte denne sekvensen etter ytterligere modifisering. Den første modifiseringen innbefattet plassering av aminosyrekodoner 3' til AUG som.koder for lymfoblastoid interferon aminosyrer. Når det var mulig ble de ribosome bindingssete-nukleotidsekvensene ifølge modellen konservert. Andre sekvensmodifikasjoner var basert på analysen av Iserentant og Fiers av translasjonseffektiviteten av en serie rekombinantplasmider som inneholdt forskjellige ribosombindingsseter 5' til kro genet (Gene, 9:1- 112

(1989)). De konkluderte med at et idelt ribosom bindingssete består av en foldet struktur som har et baseparet stammesløyfeområde med AUG kodonen i sløyfedelen. Fortrinnsvis er Shine og Dalgarno sekvensen 5' til stammen og i et enkeltkjedet område. Ri blir derfor modifisert slik at den inneholdt 5 basepar dannet fra nukleotider på hver side (86 - 90 og 96 - 100) av AUG initieringskodonen. Dette ble oppnådd ved ytterligere sekvensforandringer i modellen av ribosom bindingssetesekvensen mellom 86 - 90. Ri som angitt i tabell 2 inneholdt derfor, når det var mulig, nukleotider svarende til modellsekvensen. Modifikasjoner ble imidlertid innført for å innbefatte de korrekte kodonene for lymfoblastoid-interferongenet, for å plassere AUG kodonen i sløyfedelen av hårnålsløyfestrukturen, og for å plassere Shine og Dalgarno sekvensen i et enkeltkjedet område 5' til den basedeparede stammestrukturen. Ribosom bindingssete R2 og R3 ble avledet på annen måte ved modifikasjon av kjente ribosome bindingsseter. Tidligere arbeider av J. Steitz ved anvendelse av translasjonsinitieringskomplekser har vist at ca. 40 ribonukleotider av mRNA sentrert på AUG kodonen var beskyttet fra nuklease nedbrytning ved ribosomer.

(Nature New Biol. 226 : 71 - 75 (1972)).

Denne beskyttede sekvensen er nå generelt definert som

det ribosome bindingssetet. De ca. 20 nukleotidene som er plassert 3<1>til AUG initieringskodonen er svært variable og avhenger av den amino terminale aminosyresekvensen for et spesielt protein. Det første trinnet ved avledning av nukleotidsekvensen for R2 og R3 var å identifisere kjente ribosom bindingsseter med potensielle homologi til den lymfoblastoide interferon aminosyresekvensen. Dette ble oppnådd ved skille kjente ribosom bindingssetesekvenser (Scherer, G.F.E. et al. , (1980) Nucl. Acid. Res.

8 : 3895 3907) fra AUG kodonen ved de neste syv kodonene, (21 nukleotider) for DNA-sekvenshomologi med en samling potensielle ribosombindingsseter for lymfoblastoidinter-ferongen. Denne samlingen ble avledet fra alle mulige kodoner for de første åtte aminosyrene i lymfoblastoid interferonet. Følgelig ble hver nukleotid for et kjent ribosombindingssete sammenliknet med alle mulige nukleotider som kunne innføres på den samme relative posisjonen av interferongenet mens aminosyresekvensen holdes konstant. F.eks. var R3 avledet fra 0 X F proteinribosom bindingssetet. Den tredje kodonen i 0 X F ribosom bindingssetet er AAU som koder for asparagin. For lymfoblastoidgenet er den tredje aminosyren aspartinsyre som har kodoner GAU

og GAC. Følgelig, dersom GAU velges som aspartinsyrekodon er en tilpasning mulig for to av de tre nukleotidene ved den samme relative posisjonen inne i 0 X F proteinet og R3 ribosom bindingssetene. Ved å benytte denne undersøkelses-fremgangsmåten ble alle kjente ribosom bindingsseter under-søkt for mulige homologier med samlingen av potensielle lymfoblastoidgeneseter. Flere ble identifisert der hvor

den maksimale tilpasningen med lymfoblastoidsamlinaen over de første åtte kodonene (24 nukleotider) var ca.

50%. To av disse ( E. coli L11 protein og 0 X F protein-seter), som sannsynligvis benyttes til å initiere translasjon av større mengder protein, ble valgt som lymfoblastoidinterferon ribosom bindingsseter. Der hvor det var mulig innenfor de proteinkodene områdene av disse kjente setene (2 4 nukleotider) ble DNA sekvensen opprettholdt.

Visse nukleotider ble imidlertid substituert slik at lymfoblastoide aminosyresekvenser kunne eksprimeres i steden for enten LII eller 0 X F aminosyrer. Nukleotidene 5'

til AUG kodonene i både LII og 0 X F protein setene

(26 nukleotider hver), ble opprettholdt uten modifikasjon som del av henholdsvis R2 og R3 setene. Begge utførelses-strategier synes å være riktige siden interferonhybrid-protein produseres i mengder på 0,1 - 2 mg/OD^^g nm liter fra alle tre ribosome bindingssetene.

Den lymfoblastoide genesekvensen ble oppnådd fra den partielle aminosyresekvensen av et humant lymfoblastoid interferon produsert ved induksjon av Namalva celler med Newcastle sykdoms virus, stamme Bl. Analysen dekket 76% av det samlede proteinet og tydet på at dette lymfoblastoid interferonet ikke var oppført blant sekvensene av kjente humaninterferoner avledet via cDNA kloning eller ved DNA sekvensering av genomiske kloner.

(Goeddel, D. V. et al. (1981) Nature 290 : 20 - 26; Stebbing, N. og Weck, P.K. (1983). I "Recombinant DNA Products, Insulin, Interferons and Growth Hormones",

A. Bollen, ed., CRC Press; Weissmann, C. et al. (1982)

UCLA Symp. Mol. Cell Biol. 25:295-326.)

Sekvenserte områder var aminosyrer 2 - 46, 60 - 85,

og 112 - 166. Disse polypeptidene var mest analoge med DNA sekvensene av IFN-aC, IFN-al og IFN-aN. I området

2-46 var det bare en aaminosyreforskjell mellom lymfoblastoid-peptidene og aminosyresekvensen av IFN-aF (leu 26 i lymfoblastoid sekvensen var prolin i IFN-aF). Nær karboksyl-terminalen (112-166) var lymfoblastoidproteinet imidlertid mer analogt IFN-aC og IFN-al. Dersom dette humane lymfoblastoidinterferonet er analogt alle andre a^-interferoner

. når det gjelder størrelse og generell sekvens, kan et

hybrid lymfoblastoid interferon avledes. Først ble peptidsekvensene i det humane lymfoblastoid interferonet ført på linje med de analoge posisjonene i IFN-aC-og inkorporert i lymfoblastoid hybridgenet ved disse samme relative posisjonene. Deretter ble IFN-aC peptidsekvensene først benyttet i steden for de ukjente lymfoblastoid interferon-sekvensene (aminosyrer 47 - 59 og 86 - 111).

Tilsvarende sekvenser av IFN-aF eller IFN-al kan med fordel substitueres for IFN-aC innskuddene ved 47 - 59 og 86 - 111 posisjonene. Imidlertid er det kjent at IFN-aC er ekvivalent med IFN-aF ved 47 - 59 posisjonen. Følgelig er det endelige interferon hybridgenet en kompositt av disse to antatt beslektede proteinene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører den detaljerte fremgangsmåten som er innbefattet i syntesen av et hybrid interferon gen som har a C leukocytt interferoninnskudd ved 47-59

og 86 - 111 posisjonene. Imidlertid kan de tilsvarende leukocytter IFN-aF og IFN-al sekvensene ved disse posisjonene innføres ved identiske fremgangsmåter. F.eks. kan nye syntetiske DNA fragmenter som har sekvenser svarende til leukocytt IFN-aF og al ved posisjonene 47 - 59 og 86 - 111 syntetiseres. Disse segmentene kan deretter ligeres til de egnede lymfoblastoidseksjonene slik at det dannes ekstra hybridinterferoner. Ved konstruksjonen av disse nye genene må nye restriksjonsseter svarende til de nye seksjonene nyttes. Disse nye setene kan identifiseres

ved enkel undersøkelse av hele genet med henblikk på

mulige restriksjonsseter og anvendelse av de som lettest lar seg benytte.

DNA-sekvensen for lymfoblastoidhybrid interferonstruktur-genet var basert på flere betraktninger. Innledningsvis ble deoksyoligonukleotider kjemisk syntetisert og enzymatisk sammenføyet slik at det totale genet ble dannet. Denne totale DNA dupleksen som inneholdt terminale EcoRI posisjoner ble så klonet inn i det enkelte EcoRI sete på pUC8. Disse ologideoksynukleotidene ble generelt utformet slik at man fikk maksimert overlappingen mellom komplementære segmenter og minimalisert overlappingen mellom de enkeltkjedede områdene. Siden genet var utformet for ekspresjon i E. colifble kodoner som foretrekkes av denne organismen, valgt der hvor det var mulig. I tillegg ble visse kodoner valgt slik at de minimaliserte eller eliminerte inverterte eller direkte gjentakningssekvenser som kunne skape alvorlige problemer under enzymatiske ligeringsreaksjoner.

Kjemisk syntetiserte oligodeoksynukleotider ble sammenføyet enzymatisk slik at det ble dannet fire DNA duplekser som inneholdt 108 til 214 basepar hver. Disse fire dupleksene ble deretter forsterket individuelt i plasmider, isolert, sekvensert og deretter sekvensmessig sammenføyet ved hensikts-messig restriksjonsseter, og klonet til fremstilling av det endelige genet. Denne fremgangsmåten er meget generell og kan benyttes selv for mye større gener fordi da ved relativt korte duplekser (ca. 250 basepar) syntetiseres via kjemiske og enzymatiske prosedyrer.

Visse restriksjonsseter ble innført som førte til vellykket kloning av det totale genet som fire seksjoner.

Et restriksjonskart av lymfoblastoidhybrid interferon-

genet ifølge oppfinnelsen er gjengitt i tabell 3. Det er

sannsynlig at flere restrisjonsenzymer etter hvert vil bli kjent. Den øvre delen av tabellen 3 er en skjematisk representasjon av genet. Hver 100 basepar og den tilnærmede plassering av restriksjonssetet er markert. Den nøyaktige posisjonen og sekvensen for forskjellige restriks jonsseter er også oppført.

Disse restriksjonssetene som fordelaktig ble innført

er: Haelll (posisjon 149); Ddel (posisjon 246); og Hindlll (posisjon 384). Ved å benytte disse tre setene,

ble genet klonet som seksjonene I (1 - 149), II (150 - 246), III (247 - 384) , og IV (385 - 598) . Etter forsterkning

i E. coli som del av plasmidene pBR322 eller pUC8,

ble hver seksjon isolert og sekvensert. Seksjonene I og II ble deretter sammenføyet enzymatisk, klonet og forsterket som ett EcoRI og Ddel restriksjonsfragment. Dette kombinerte duplekset ble deretter sammenføyet enzymatisk til seksjon III, klonet som et EcoRI og Hindlll fragment, forsterket i

E. coli og isolert etter restriksjon med EcoRI og Hindlll.

Til sist ble dette EcoRI og Hindlll duplekset sammenføyet enzymatisk til seksjon IV. Det endelige genet ble sekvensert og undersøkt for ekspresjon av a-interferon.

Det strukturelle genet, hybrid promotoren, og tre ribosom bindingsseter krevde syntese av 92 oligodeoksynukleotider (9 til 26 mononukleotider hver). De syntetiske fremgangsmåtene for strukturgenet, hybridpromotoren og ribosom bindingssetet RI er vist i tabell 1 ovenfor. To hoved-fremgangsmåter for DNA syntese ble benyttet. Oligodeoksynukleotider forhybrid promotoren og alle tre ribosom bindingssetene ble syntetisert ved å benytte 5<1->dimetoksy-trityldoksydeoksynukleosid-3'-metoksytetrazolylfosforamiditter som syntoner og silika gel som inneholdt ett kovalent tilknyttet deoksynukleosid som polymerbærer. Etter fjernelse av beskyttelsesgrupper ble oligodeoksynukleotidene renset for forskjellige mellomprodukter ved polyakrylamidgel-elektroforese. Produktene kan deretter elueres fra gelen. Etter passasje gjennom en kort "G50/40 Sephadex" kolonne, for

å fjerne salter, buffere og oppløst gelmateriale, ble

32

oligodeoksynukleotidene fosforylert med (y- P)ATP og T4-polynukleotid kinase. Resultatene fra analytisk gel

elektroforese viste at produktene var homogene og klare for anvendelse med T4 DNA ligaser for fremstilling av større DNA duplekser.

Sammenfattet ble lymfoblastoid hybrid interferongenet ifølge oppfinnelsen syntetisert og klonet i fire seksjoner. Disse fire seksjonene ble deretter sammenføyet for dannelse av det totale genet. Følgelig ble oligodeoksynukleotider som inneholdt fra 10 til 25 mononukletider hver syntetisert kjemisk. Komplementære segmenter inneholdt fremtredende enkeltkjedede områder for å styre det neste segmentet på plass. Disse segmentene ble deretter sammenføyet enzymatisk under dannelse av DNA-dyplekser som inneholdt opp til 214 basepar hver. Ved å anvende egnede restriksjonsseter kan disse geneseksjonene forsterkes ved kloning, isoleres og sekvensvis sammenføyes med hverandre for dannelse av det fullstendige sammensatte genet. Denne fremgangsmåten er meget generell og kan benyttes til å sette sammen gener av en hvilken som helst størrelse. Hver seksjon bør være utformet svarende til seksjonene II og III.

Disse to seksjonene hvis strukturelle gene-ender hadde restriksjonskuttingsseter med høy frekvens, ble syntetisert med forbindingselementer som hadde restriksjonsseter som var unike for blasmidvektoren ( EcoRI og Hindlll). Om nødvendig kan genesegmentet deretter kuttes og separeres fra plasmidet ved å benytte gel elektroforese.

Vektoren vil migreres som et stort fragment og genseksjonen som et lite dupleks som inneholdt 108 - 214 basepar. Alternativt kan seksjonen kuttes direkte fra blasmidet,

ved å anvende høy frekvens kutteseter (i dette tilfelle Haelll og Ddel). Denne muligheten kan benyttes dersom genseksjonsduplekset.migreres i et unikt område av gelen hvor det ikke finnes plasmid duplekser. Selv om det ikke er nødvendig vil syntesen bli noe forenklet, dersom de

unike restriksjonssetene var del av strukturgenet i steden for forbindelsessekvensene. Seksjon III er et eksempel på denne fremgangsmåten. På grunn av den omfattende genetiske koden og det store antallet restriksjonsenzymer som gjenkjenner baseparsekvenser av forskjellige størrelser er dette alternativet vanligvis mulig.

Den biologiske aktiviteten av forskjellige kontrollerte områder og lymfoblastoid hybrid interferonet er av betydelig interesse. Promotoren er en kompositt av forskjellige promotorelementer og ribosom bindingssetene ble utformet for interferon genet og tilsvarer ikke noen naturlige sekvenser. Interferonproteinet er et hybridmolekyl som består av sekvenser fra lymfoblastoid og leukocyttinterferoner. Seksjoner av det nye hybridinterferonet fra aC-type interferoner representerer en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse. Eventuelt kan aF- eller al-typen leukocytt interferon seksjoner substitueres for aC-typen interferon. Alle disse strukturene (dvs. hybridkontroll elementene

og hybridinterferonet) var biologisk meget aktive.

Hybridpromotoren var utformet for å være transkripsjonsmessig aktiv, men lett kontrollert. Den inneholder elementer av ^.PR og T7 A2 promotorer og lakk operatoren. Eksperimentelle resultater vises/også at transkripsjon kan kontrolleres med lakk repressor og IPTG (isopropyl 3-D-tiogalaktosid).

Deoksynukleotid sekvenser ifølge oppfinnelsen som koder

for humane lymfoblastoid-leukocytt hybrid interferonet, innbefatter 166 aminosyrer og har eventuelt et ekstra metionin knyttet til den første ordinære aminosyren ved

• N-terminalen har pluss-kjeder representert ved følgende

formel hvor A er deoksyadenyl, G er deoksyguanyl, C er

deoksycytosyl, og T er tynidyl, og innbefatter transkripsjons-og translasjonsekvivalenter, innbefattet enkel- eller flerbasesubstitusjoner, innskudd og inversjoner:

hvor W er TGT eller TGC; X består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 2 til 46 av humant lymfoblastoidinterferon (LblF); Y består i det besentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 60 til 85 i nevnte LblF; Z består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 112 til 166 i den nevnte LblF; P består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 47 til 59 av humant aC-, aF- eller al-type leukocytt interferon (LelF) og er CAG47TTC CAA AAGj-q GCT CAG GCA ATC TCG55GTT CTG CAT GAG59, eller CAG47TTC CAA AAG^g ACC CAGGCA ATC TCG55GTT CTG CAT GAG^g; B består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 86 til 111 av de nevnte aC-, aF- eller al-type LelF og er TCCg6ACT GAA CTC TATgQCAG CAA CTG AAC GATg5

CTT GAA GCT TGC GTT,-» ATC CAG GAG GTA GGC.A[- GTT GAA GAG

ACT CCG11QCTT, TCCg6ATC GAA CTC AATg0CAG CAA CTG AAC GATg5

ATG GAA GCT TGC GTT^qq ATC CAG GAG GTA GGC1Q5GTT GAA GAG ACT

CCG11QCTT, eller TCCg6ATC GAA CTC TAT^q CAGCAA CTG AAC AACg5

CTT,GAA GCT.TGC GTT100 ATC CAG GAT GTA GGC1Q5ATG GAAGAG ACT

CCG11QCTT.

Samsvarende med dette er følgende deoksynukleotide konstruksjoner:

Deoksynukleotid sekvenser ifølge oppfinnelsen som koder for humane lymfoblastoide-leukocytt hybrid interferoner innbefatter et hybridpromotorområde, et operatorområde, et ribosom bindingssete og et polypeptid-kodene område som koder for et polypeptid av 166 aminosyrer, og som eventuelt koder for et ekstra metionin knyttet til den vanlige første aminosyren ved N-terminalen av det nevnte polypeptidet, og et termineringsområde er representert ved en plusskjede av følgende formel:

hvor L i det vesentlige består av promotorområde;

0 består i det vesentlige av operatorområde; Q er en del av en ribosom bindingssete og er A-A-A-A-A-T-T-A-A-G-G-A-G-G-A-T-C-A-C-T, T-T-A-T-T-A-C-C-C-A-A-C-T-T-G-A-G-G-A-A-T-T-T-A-T-A,

eller C-G-G-C-C-C-C-T-A-C-T-T-G-A-G-G-A-T-A-A-A-T-T; W er TGT eller TGC; X består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 2 til 4 6 av humant lymfoblastoid interferon (LblF); Y består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 60 til 85 av nevnte LblF; Z består 1 det vesentlige av deoksynukleotider som koder for amino-

syrer 112 til 166 av nevnte LblF; P består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 47 til 59

av humant aC-, aF- eller al-typer leukocytt interferon,

(LelF) og er CAG TTC CAA AAG^q GCT CAG GCA ATC TCG55

GTT CTG CAT GAG, eller CAG TTC CAA AAG^q ACC CAG GGA ATC

TCG55GTT CTG CAT GAG; B består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 86 til 111 i nevnte aC-, aF- eller al-type LelF og er TCC ACT GAA CTC TATgQ

CAG CAA CTG AAC GATg5CTT GAA GCT TGC GTT100ATC CAGGAG

GTA GGC105GTT GAAGAG ACT CCG110CTT, TCC ATC GAA CTC AATgQ

CAG CAA CTG AAC GATg5ATG GAA GCT TGC GTT^qq<C>TT,

TCC ATC GAA CTC AATgQCAG CAA CTG AAC GATg5ATG GAA

GCTTGCGTT10() ATC CAG GAG GTA GGC1Q5GTT GAA GAG ACT CCG110

CTT, eller TCC ATC GAA CTC TATgQCAG CAA CTG AAC AACg5CTT GAA GAG ACTCCG11QCTT; E består i det vesentlige av terrainerings-området; og transkripsjons- og translasjonsekvivalenter, innbefattet enkelt eller flerbaset substitusjoner,

innskudd og inversjoner; og betydelige fragmenter derav som tillater ekspresjon av det nevnte hybrid interferonet eller biologisk aktive fragmenter derav. Samsvarende med denne formelen er følgende konstruksjoner:

Rekombinante DNA molekyler som innbefatter DNA segmenter ifølge en hvilken som helst av konstruksjonene ovenfor,

kan benyttes til å transformere forskjellige verter ( Escherichia coli, dvs.' E^coli W3110, E^coli 7118,

E. coli 7902, osv.; Bacillus subtilis; andre bakterier;

gjær eller annen sopp, mus eller andre dyr eller planteverter; og innbefattet celler fra humant vev). Polypeptider eller fragmenter og derivater derav, som viser immuno-

logisk eller biologisk aktivitet, av humane lymfoblastoid-leukocytt hybrid interferoner, kan fremstilles av slike transformerte verter.

Lymfoblastoid hybrid interferonet ble avledet fra to proteiner. Ca. 76% var basert på aminosyresekvensen fra et lymfoblastoid interferon fremstilt ved induksjon av Namalva celler med Newcastle sykdomsvirus, styrke Bl.

Resten var fra C undertypen av leukocytt interferoner.

Dette hybrid proteinet var like aktivt biologisk som

kjente naturlige interferoner. Mange a-interferoner er allerede identifisert, ved cDNA kloning og sekvensering.

I tillegg er to naturlige hybrider dannet fra A og D under-typene (Week, P. K., et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:6153-6166) og et konsensus interferon syntetisert og vist å være biologisk aktive. (Alton, K. et al. "Production, Characterization and Biological Efforts of Recombinant DNA Derived from Human IFN-a and IFN-y Analogs." I "The Biology of the Interferon System" (1983) Red. E. DeMeyer og H. Schellekens, Elsevier Science Publishers B.V.).

Alle disse resultatene tyder på at a-interferonene er

en mangfoldig familie av proteiner. Flere modifikasjoner kan følgelig være mulig for å maksimere den biologiske aktiviteten, utbytte eller muligens forenkle rensefremgangs-måtene. Disse modifikasjonene kan best oppnås dersom genet er fullstendig syntetisk, kionet i seksjoner, og lett tilgjengelige via forskjellige restriksjonsenzymer.

Denne samme fremgangsmåten vil være generelt nyttig for mange forskjellige proteiner. Spørsmål vedrørende strukturfunksjonrelasjoner kan lettest løses dersom et protein kan modifiseres med aminosyreforandringer.

Denne fleksibiliteten krever i sin tur syntese av minst hoveddeler av et proteingen (muligvis mellom hensiktsmessige, naturlige restriksjonsseter).

Polypeptidsammensetninger ifølge oppfinnelsen innbefatter

16 6 aminosyrer og har eventuelt et ekstra metionin knyttet til den vanlige første aminosyren ved N-terminalen, og har sekvenser representert ved følgende formler:

hvor X i det vesentlige består av aminosyrer 2 til 46

av humant lymfoblastoidinterferon (LblF); Y består i det vesentlige av aminosyrer 60 til 85 av nevnte LblF;

Z består i det vesentlige av aminosyrer 112 til 166

av nevnte LblF; P består i det vesentlige av aminosyrer 4 7 til 5 9 av humant aC-, aF-, eller al-type leukocyttinter-47 50 55 feron (LelF) og er gin -phe-gln-lys -ala-gln-ala-ileu-ser 59 47 50

val-leu-his-glu , eller gin -phe-gln-lys -thr-gln-ala-

55 59

ileu-ser -val-leu-his-glu ; og B består i det vesentlige

av aminosyrer 86 til 111 av humant aC-, aF-, eller

86

al-type leukocytt interferon (LelF) og er ser -thr-glu-leu-tyr -gln-gln-leu-asn-asp -leu, ser -thr-glu-i 9 0 t t -i 95 . , , ,100

leu-asn -gln-gln-leu-asn-asp -met-glu-ala-cys-val , , 105 , , , 110 , 86 ileu-gln-glu-val-gly -val-glu-glu-thr-pro -leu, eller ser - 90 95

thr-glu-leu-tyr -gln-gln -leu-asn-asn -leu-glu-ala-cys-

,100 , , , , 105 . , , 110

val -ileu-gln-glu-val-gly -met-glu-glu-thr-pro

ley, og innbefatter betydelige polypeptidfragmenter og/eller derivater derav, som har biologisk eller anti-virus aktivitet som humaninterferon. Samsvarende med dette er følgende hybridinterferon polypeptidkonstruksjoner:

Følgende ikke begrensende eksempler er tilveiebragt for å illustrere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1.

TRANSKRIPSJONSAKTIVITET AV HYBRID PROMOTOREN

Hybridpromotoren ifølge oppfinnelsen er en kompositt

av lambda PR/T7 A2 promotoren, og lakk promotoren

(dvs. posisjonene henholdsvis 5 - 45, 46 - 50, og

51 - 71; se tabell 1).

Transkripsjonsaktiviteten av denne hybrid promotoren ble sammenliknet med aktiviteten av lakk promotoren.

Begge promotorene ble klonet inn i den samme plasmid-bakgrunnen og analysert vedrørende g-galaktosidase-aktivitet i en lakk -utslettelses stamme (71 - 18).

Ved å benytte denne stammen ble transkripsjonsaktiviteten av disse to promotorene sammenliknet og resultatene er gjengitt i tabell 4.

r Tabell 4. Transkripsjonsaktivitet av hybridpromotoren1

1

Den syntetiske lakk promotoren strekker seg fra posisjonen -74 til +21 i den naturlige lakk promotoren. Dette segmentet innbefattet derfor lakk promotoren, lakk operatoren, og det cykliske AMP reseptor protein-bindingssete som et fullstendig baseparet dupleks. APR/T7 A2 promotoren var det baseparede duplekset med utstrekning fra 1 til 71 i genesekvensen vist i tabell 1. Disse syntetiske promotorene ble klonet inn

■ i pRZ5605. Plasmidet inneholder lakk _Z genet, n- ..innbefattet dei ribosom bindingssetesekvensen, men uten en promotor. Ovenfor lakk _Z genet er tre restriksjonsseter ( EcoRI, Smal, og BamHI).

Disse dupleksene med butte ender ble innført ved Smal setet ogkarakterisert vedrestriksjonskartlegging og DNA sekvensering.

2

3-galaktosidase aktivitet ble målt på E. coli laboratoriestamme 71 - 18 ved å benytte enten glukose eller glycerin som er karbonkilde.

Innenfor grensen av denne analysen hvor tilsvarende promotor konstruksjoner undersøkes i den samme plasmid-vektoren, er lambda PR/T7 A2/ lakk hybrid promotoren ca. 50% mer aktiv enn den fullt induserte lakk promotoren og ca. 4 ganger mer aktiv enn lakk promotoren under katabolitisk represjon (glukose som karbonkilde).

Eksempel 2.

FREMSTILLING AV SEKSJON I I HYBRID LYMFOBLASTOID GENET

Seksjon I svarende til sekvensen fra 1-14 9 (se

tabell 1), ble fremstilt ved to forskjellige fremgangsmåter. Den ©rste fremgangsmåten innbefattet isolering av EcoRI-Haelll fragmentet fra et mislykket forsøk på å klone en AcoRI til Hindlll duplekset (nukleotider 1 - 384).

Den andre fremgangsmåten var mer direkte. Et dupleks inneholdende nukleotidene 1 - .158 ble syntetisert for å klone EcoRI til Haelll fragmentet (1 - 149).

Sekvensene og tilsvarende syntetiske oligodeoksynukleotider for den første fremgangsmåten er vist i tabell 5. DNA sekvensen fra EcoRI setet 5' til promotoren gjennom segmentet 33s er vist. Hindlll setet er også vist. Parentesene som inneslutter bokstaver og tall definerer de forskjellige DNA segmengene som ble syntetisert kjemisk. Bokstavene c og s angir henholdsvis kontrollområder og struktur gen-områder. Hybrid promotoren, lakk operatoren og Ri ribosom bindingssete inntar hovedsakelig henholdsvis sekvensene lc-llc, 9c-12c, og 13c-20c.

ATG initierings kodonsekvensen i Ri finnes i 17c.

De syntetiske fragmentene vist i tabell 5, ble først sammenføyet slik at det ble dannet tre duplekser innbefattende segmentene lc til 20c, ls til 28s', og 29s til 33s. Disse tre dupleksene ble deretter sammenføyet slik at det ble dannet et dupleks. som inneholdt lc til 33s. Syntesen av dupleks lc-20c ble fullført via T4-DNA ligase katalyserte ligeringstrinn. Segmentene 3c til 10c og lic til 20c ble syntetisert uavhengig. Hvert dupleks produkt ble renset for uligerte segmenter ved gelpermeringskolonne-kromatografi på "Sephadex G150/40" og analysert ved gelelektroforese. Sluttrinnet var en sammensatt legering som innbefattet dupleks 3c-10c (5 pmol), dupleks llc-20c (5 pmol),

32

(5'- P) segment 2c (10 pmol) og ufosforylert lc (20 pmol).

Det ble utført gelanalyse av denne ligeringsreaksjonen.

I tillegg til ureagert utgangsmateriale (duplekser lc-20c

og llc-20c) og produkt (dupleks lc-20c), ble også to ukarakteriserte mellomprodukter identifisert ved gel-

32

elektroforese. (5'- P) segment 2c migrerer fra gelet.

Dupleks lc-20c som inneholder segmenter bestående av 113 og

115 mononukleotider, blir renset for dupleksene lc-10c og llc-20c ved kromatografi på et "Sephadex G150/40" kolonne. Gel elektroforese analyser av dette rensetrinnet viser

at de to ukarakteriserte mellomproduktene fremdeles finnes i prøven av dupleks lc-20c. Utbyttet av dupleks lc-20c

var 1,5 pmol. Fjernelse av dupleks llc-20c var spesielt kritisk. Dette duplekset har det samme enkeltkjedede område i naboposisjon til strukturgenet som duplekset lc-20c. Dersom dupleks llc-20c ikke fjernes, vil det konkurrere med dupleks lc-20c om strukturgenduplekset under det neste ligeringstrinnet.

Dupleks ls-28s' som inneholder struktur gen segmentene

ls til 28s' ble syntetisert på en trinnvis måte.

Segmentene ls til 4s, 5s' til 10s, lis til 14's, 15s

til 18's, 19s' til 24s', og 25s' til 28s' ble sammenføyet slik at det ble dannet mellomproduktduplekser og renset på kolonne. Det første trinnet i den endelige sammensetningen var syntese av dupleks ls-10s ved å sammenføye dupleks ls-

4s til 5s-10s etterfulgt av gel permeringskromatografi på "Sephadex G150/40". Gel elektroforese analyser av dupleks ls-10s (90 pmol) som var renset ved kolonnekromatografi, viser klart at de fleste av dupleksene 5s-10s og ls-4s er fjernet. Denne prøven av dupleks ls-10s ble deretter sammenføyet med dupleks lls-14s' slik at duplekset ls-14s' ble dannet (45 pmol). Etter gel permerings-kromatograf i ble overskuddet av dupleks lls-14s' fjernet, dette lot seg vise ved gel elektroforese analyse. Dupleks ls-14s' var imidlertid forurenset med ureagert dupleks ls-10s. Dette voksne duplekset ble deretter omsatt trinnvis med dupleksene 15s'-18s', 19s'-24s', og 25s'-28s' til dannelse av dupleksene ls-18s; (20 pmol), ls-24s' (45 pmol), og ls-28s'., Hvert mellomdupleks ble renset med "Sephadex G150 kolonnekromatografi og analysert ved gel elektroforese.

Gel permeringsteknikken viser seg å fjerne nye, relativt

små duplekser, men fjernet ikke uomsatte, delvis for-

lengede duplekser. Disse ufullstendige dupleksene ble brakt forover og utgjør detmeste avDNA<1>en som er tilstede

i den endelige prøven av dupleks ls-28s'. Det siste trinnet var rensing av duplekset ls'-28s' ved preparativ gel elektroforese. Det riktige båndet ble kuttet fra gelen, eluert, og renset for salter og buffere.

Det isolerte utbyttet av dupleks ls-28s' var 1 pmol.

Dupleks 29s-33s ble fremstilt. Etter enzymatisk sammen-føyning av disse segmentene, ble duplekset renset ved kolonnekromatografi på "Sephadex G150/40" og analysert ved gel elektroforese.

Dupleks lc-33s ble fremstilt ved å sammenføye dupleksene lc-20c, ls'-29s'r og 29s-33s. Dupleks lc-20c (1,25 pmol), dupleks ls-28s' (0,53 pmol) og dupleks 29s-33s (5 pmol)

ble alle rekombinert fra 75°C. Dupleks ls-28s' og dupleks 29s-33s ble deretter blandet, oppvarmettil 45°C

og avkjølt til romtemperatur. Dupleks lc-20c ble deretter tilsatt. Oppløsningen ble oppvarmet til 37°C og først avkjølt til romtemperatur og deretter til 4°C. Slutt-volumet var 15ul. Etter tilsats av T4-DNA ligase (2,5 enheter) fikk reaksjonen forløpe over natten. Den totale reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelelektroforese. Størrelsesmarkører generert fra<p>BR322 nedbrytning ved Hpall ble benyttet. Sluttutbyttet av dupleks lc-33s, renset for denne gelen, var 50 femtomol.

t

Analyse ved gel elektroforese av reaksjonen viser at legeringsreaksjonen bare forløpet i et omfang på 10-20%. Hovedbånd av ureagerte duplekser lc-20c, ls-28s', og 29s-33s var tilstede på gelen. Produktet ble eluert fra den egnede geldelen og nedbrutt med Hindlll for å generere et dupleks som er klart for kloning i pBR32 5.

Syntese av seksjon 1 ved den andre fremgangsmåten fokuserer på området fra EcoRI til Haelll av strukturgenet. Sekvensen og synteseplanen er vist i tabell 6.

Lymfoblastoid interferon hybrid genet fra 5' EcoRI

setet på sensorkjeden til og med Haelll setet på 149 er angitt. Parenteser med tall inneslutter kjemisk syntetiserte segmenter. Segmentene lc til og med 20c er de samme som beskrevet i tabell 5. Følgelig inntar hybrid promotoren, lakk operatorer, og Ri ribosombinding setet hovedsakelig henholdsvis sekvensene lc - lic, 9-c-12c og 13c-20c.

ATG initieringskodon sekvensen i Ri finnes i 17c. Dupleks lc-20c (1,5 pmol), hvis syntese er beskrevet, og dupleks ls-4s (15 pmol) ble rekombinert fra 37°C og blandet. Etter rekombinasjon fra 37°C til 4°C, ble T4-DNA ligase tilsatt og reaksjonen fikk forløpe over natten. Det ble utført analyse av reaksjonsblandingen ved gel elektroforese. Størrelsesmarkører generert fra pBR322 ved restriksjon med Phall ble benyttet. Produktet, dupleks lcr4s, eluert

fra gelen, ble isolert i et utbytte på 0,6 pmol. Når det er syntetisert kan fragment I klones inn i pBR322 som er åpnet med restriksjonsenzymene EcoRI og Ball. Seksjon I

ble syntetisert fra dupleks lc-20c og dupleks ls-4s. Dupleks ls-4s ble syntetisert på vanlig måte og renset under anvendelse av en "Sephadex G 150" kolonne. Det neste trinnet var sammenføyning av dupleks ls-4s i tidobbel molar mengde til dupleks lc-20c. Den analytiske gelelektroforensen av reaksjonsblandingen viste at omdanningen til sluttproduktet (dupleks lc-4s) var meget tilfredsstillende.

Det isolerte utbyttet (40%) bekreftet disse resultatene.

Eksempel 3.

FREMSTILLING AV SEKSJON II AV HYBRIDLYMFOBLASTOID GENET

Seksjon II som inneholder EcoRI og Hindlll seter og

strekker seg fra Haelll sete (posisjon 149) til Ddel setet (posisjon 246) av interferongenet er vist i tabell 7.

Dette arrangementet av restriksjonsseter ble benyttet til

å klone seksjon II mellom de unique EcoRI og Hindlll setene på pUC8. Restriksjonsenzym spalting av det klonede genefragmentet i pUC8 med Haelll og Ddel genererte seksjon II som et unikt dupleks som inneholdt interferongensekvensene. Dupleks 5s-16s svarende til seksjon 2, ble fremstilt i to

32

trinn. I det første trinnet ble (5'- P)-merkede segmenter 5s-8s, 9s-12s, og 13s-16s rekombinert og ligert i tre

- separate forsøksrør som beskrevet ovenfor (400 pmol av

hvert segment). Disse tre ligerte dupleksene ble deretter renset på "Sephadex G150/40"-kolonne,, samlet, rekombinert sammen fra 37°C og sammenføyet ved å benytte T4-ligase (5 enheter). Resultatene fra denne ligeringen ble vurdert ved hjelp av gel elektroforese. Sluttproduktet, dupleks 5s-16s som inneholder 113 mononukleotider i hver kjede,

ble isolert og renset ved preparativ elektroforese ogkarakterisertnår det gjelder størrelse mot kalibrerte DNA markører. Det isolerte utbyttet var 60 pmol. En porsjon av det rensede duplekset ble analysert ved gel elektroforese ved å benytte pBR322 DNA kuttet med Hpall som størrelses-markører. Produktet migrerte som ventet relativt disse størrelsesmarkørene. Ved gelanalyse ble det funnet at hovedligeringsproduktet var et mellomdupleks som ikke erkarakterisert. Slike mellomprodukter kan genereres ved flere mekanismer. Den mest trivielle forklaringen er et støkio-metrisk problem. Dersom ulike molare forhold av alle (5'- 32P)-merkede oligodeoksynukleotider benyttes i en legerings-reaksjon vil hovedproduktet være et mellomprodukt som i utbytte svarer til den begrensende reagensen. Oftere fører imidlertid dannelsen av enten intramolekylære eller intermolekylære sekundære komplekser til akkumulering av mellomprodukter. Disse kompleksene kan ikke lett forutsies. Slite problemer løses enklest ved fornyet syntese under anvendelse av forskjellige posisjoner for generering av overlapping og komplementære enkeltkjedede oligodeoksynukleotider.

Eksempel 4.

FREMSTILLING AV SEKSJON III AV HYBRID LYMFOBLASTOID GENET

DNA sekvensen av strukturgenet av seksjon III, duplekset 17s-28s som inneholder EcoRI sete og strekker seg fra Ddel setet ved posisjon 246 til Hindlll setet ved posisjon 384 av interferon sekvensen, er vist i tabell 8.

Arrangementet av restriksjonsseter besrkevet i tabell

8 ble benyttet til å klone seksjon III mellom de unike EcoRI og Hindlll setene på pUC8. Restriksjonsenzym-

spalting av det klonede genefragmentet i pUC8 med Ddel og Hindlll genererte seksjon III som et unikt dupleks.

32

De (51- P)-merkede segmentene 17s til 20s (100 pmol

hver), 21s;til 24s (100 pmol hver), og 25s til 28s (100 pmol hver) ble ^.rekombinert og ligert i tre separate forsøksrør. Disse dupleksene ble deretter blandet uten rensing og enzymatisk sammenføyet ved å anvende T4 ligase. Reaksjonsblandingen ble undersøkt ved gel elektroforese.

Et hovedbånd svarende til mellomprodukter (dupleks 17s-

24s eller 21s-28s) ble observert. Genereringen av mange mellomprodukter ble antattå være forårsaket av nærværet av uligerte segmenter under sammenføyningstrinnet. Sluttproduktet, i form av to oligodeoksynukleotider som inneholder 146 mononukleotider hver, ble isolert i renset form (13 pmol; 26% utbytte) ved preparativ gel elektroforese.

En porsjon av det rensede duplekset blekarakterisertnår

det gjelder størrelse ved gel elektroforese under anvendelse av pBR322 DNA kuttet med Hp_a.II som størrelsesmarkører. Utbyttet av renset dupleks 17s-28s (seksjon III) ble

13 pmol (26% utbytte).

Eksempel 5.

FREMSTILLING AV SEKSJON IV AV HYBRIDLYMFOBLASTOIDGENET

Seksjon IV av hybridlymfoblastoid genet ifølge oppfinnelsen, strekker seg fra Hindlll (posisjon 385, se tabell 1) sete til EcoRI setet ved enden av genet. DNA sekvensen av strukturgenet er vist i tabell 9 for posisjon 351 til enden av genet ved EcoRI setet.

32

Som et første trinn ble (5'- P)-merkede segmenter

29s,til 36s, 37s til 40s, og 41s til 54s enzymatisk sammen-føyet uavhengig av hverandre under dannelse av de respektive DNA mellomprodukt dupleksene. Hvert av disse tre dupleksene ble deretter renset og sammenføyet trinnvis. Hvert dupleks ble renset for ureagerte segmenter ved kolonnekromatografi på "Sephadex G150/40" og analysert ved gel elektroforese etter rensing. Gelen som ble oppnådd etter rensing av 41s-54s viste at DNA-kjedene som inneholdt 135 og 123 mononukleotider hadde separert. Dupleksene 37s-40s (45 pmol) og 41s-54s (10 pmol) ble enzymatisk sammenføyet ved å benytte T4-DNA ligase. Produktet (dupleks 37s-54s)

av denne ligeringen ble fraksjonert fra utgangsmaterialer på en "Sephadex G150/40" kolonne. Det isolerte utbyttet var 2,5 pmol (25£). Det rensede duplekset ble analysert ved gel elektroforese. Dupleks 37s-54s (2,5 pmol)

og dupleks 29s-36s (10 pmol) ble sammenføyet enzymatisk og reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved kolonnekromatografi på "Sephadex G150/40". Sluttproduktet (dupleks 29s-54s,

1,6 pmol) ble analysert ved gel elektroforese. En serie størrelsesmarkører generert ved en HpalI kutting av pBR322 ble benyttet ved denne gelanalysen. Basert på den begrensende reagensen (dupleks 41s-54s), var det totale utbyttet av renset dupleks 29s-54s 16%. Kolonnerensings-trinnet fjernet ureagert dupleks 29s-36s, men fjernet ikke dupleks 37s-54s fra produktet.

Eksempel 6.

KLONING AV LYMFOBLASTOID HYBRID INTERFERONGENET

Vellykket kloning av de fire underfragmentene av lymfoblastoidhybrid interferongenet bestående av 598 basepar og sammensetning av det totale genet ble oppnådd ved å anvende fremgangsmåten angitt i figur 1. Den øvre delen av figuren viser skjematisk interferongenet ved nøkkel-restriksjonssetene. Den sentrale delen viser de fire seksjonene som klonet i plasmider og nedre delen angir skjematisk fremgangsmåten for trinnvis sammenføyning av disse seksjonene. Følgelig blir genet innledningsvis klonet i fire seksjoner. Disse seksjonene ble deretter trinnvis sammenføyet, og klonet i tre trinn til fremstilling av det totale genet. Resultatene som sammenfatter disse trinnene er gjengitt i figur 2. Plasmidderivater som skjematisk angir nøkkelgeneseksjoner er vist. Seksjon I som strekker seg fra 5<1>EcoRI setet til Haelll kutte sete ved posisjon 149, ble isolert fra et mislykket forsøk på

å klone fra EcoRI til Hindlll kutte sete ved posisjon 384. Når det syntetiske duplekset som strekker seg fra 5'

EcoRI setet (relativt til sensorkjeden) til Hindlll setet ble klonet inn i pBR325, kunne bare et klon som inneholdt en del av interferonsekvensen isoleres. Dette klonet hadde en utslettelse fra posisjon 223 til 372 (elle 225 til 374). Imidlertid var sekvensen fra 5' EcoRI setet til Haelll kutte setet intakt. Dette gene;. segmentet, som et pBR325 derivat (pMPl9), ble benyttet for å isolere seksjon I. Seksjon II, inneholdende strukturgenesekvenser fra Haelll setet til Ddel setet ved posisjon 246 ble klonet (pMPl)

med EcoRI og Hinlll forbindelsesledd. På denne måten kunne kloning, isolering og sekvensering av et unikt EcoRI - Hindlll dupleks lett oppnås i pUC8. På tilsvarende måte ble seksjon III som inneholder strukturgen seksjoner fra Ddel setet ved posisjon 247 til Hindlll klonet (pMP33) med et EcoRI forbindelsesledd, seksjon IV som strekker seg fra Hindlll kutte setet ved 384 til EcoRI setet ved 3' enden

av strukturgenet bli ført inn i pUC8 som er åpnet ved EcoRI og Hindlll. Det resulterende plasmidet (pMP2) ble

karakterisertsom inneholdende seksjon IV ved DNA sekvensering.

Etter forsterkning av de klonede genefragmentene in vivo,

ble segmentene isolert og samlet trinnvis i pUC8. Seksjon I ble isolert fra pMPl9 ved behandling med EcoRI og Haelll restriksjonsenzymer etterfulgt av fraksjonering under anvendelse av 10% polyakrylamid gel elektroforese. Tilsvarende ble seksjon II isolert fra pMPl etter behandling med Haelll og Hindlll. De to segmentene ble utvunnet fra gelen, sammenføyet under anvendelse av T4-DNA ligase, og klonet inn i pUC8

som var åpnet med EcoRI og Hindlll enzymer. Kloner, inneholdende de aktuelle 246 basepar dupleksene som strekker seg fra 5' EcoRI setet til Ddel setet (seksjon I - II) ble identifisert (pMP456). Seksjon I - II ble utvunnet fra pMP456 ved først : behandling av plasmid med EcoRI og Ddel enzymer og deretter preparativ gel elektroforese.

Tilsvarende ble seksjon III utvunnet fra pMP33 ved enzymatisk nedbrytning med Ddel og Hindlll. Seksjon I - II ble deretter ført sammen med seksjon III ved det felles Ddel,

setet og produktet (seksjon I - II - III) ble klonet inn i pUC8. Et plasmid som inneholdt seksjon I - II - III ble isolert (pMPl8) ogkarakterisert vedrestriksjonsanalyse. Sluttrinnet innbefattet ligering av seksjonen I - II - III

med seksjon VI. Seksjon I - II - III og seksjon IV ble isolert fra henholdsvis pMPl8 og pMP2, ved enzymatisk behandling med EcoRI og Hindlll etterfulgt av isolering ved anvendelse av preparativ polyakryl amid gel elektroforese. Etter sammenføyning av disse to seksjonene med T4-DNA ligase og kloning inn i pUC8, ble den korrekte sammensetningen av genet i pMPl05 verifisert med restriksjons enzymanalyse og DNA sekvensbestemmelse. Kloner som inneholdt interferongenet i begge orienteringer relativt til pUC8 ble oppnådd.

Eksempel 7.

INKORPORERING AV RIBOSOM BINDINGSSETER R2 OG R3

I HYBRID LYMFOBLASTOID GENET

Interferongenet inneholdt slik det innledningsvis var sammensatt (se figurene 1 og 2), ribosom bindingssetet Ri. For å maksimere muligheten for høye ekspresjons-

nivåer avdette genet ble to ekstra ribsom bindings-

seter R2 og R3 konstruert. På denne måten kunne translasjons-initiering fra tre forskjellige ribosom bindingsseter under-søkes nøyaktig siden ingen forandring i nukleotid sekvenser ble innført i hverken promotoren eller strukturgenet.

De kjemisk syntetiserte segmentene svarende til R2 og R3

ble sammensatt som EcoRI - Alul duplekser. Derfor inneholdt hver dupleks de første ni kodonene av interferon genet og hele kontrollområdet innbefattet AP /T7 A2 promotor,

lakk operator, og de egnede ribosom bindingssetene.

Fremstilling av EcoRI - Alul duplekset som inneholder

ribosom bindingssetet R2.

DNA sekvensen for R2 duplekset er vist i tabell 10.

Tabell 10 viser duplekset som strekker seg fra EcoRI

gjennom Alul og innbefatter segmentene ls og 2s av strukturgenet. Som det fremgår ved sammenlikning med Ri kontrollområdet (se tabell 5), er segmentene lc til lic og ls, 2s svarende til promotor- lakk operatoren og de to første strukturgen segmentene, henholdsvis, identiske. Ribosom bindingssete sekvensene for Ri (12c - 20c) og R2

(21c - 29c) er forskjellige. Ufosforylert lc (200 pmol)

32 o

og (5'- P)-merket 2c ble rekombinert fra 75 C i 8yl ligase buffer. Tidligere fremstilt dupleks 3c-10c med (5'- 32P)-merker (80 pmol) ble oppløst i 8 yl ligasebuffer, slått sammen med lc og 2c, og blandingen ble rekombinert fra 37°C. Disse segmentene ble deretter kombinert med tidligere fremstilt dupleks 21c-29c med (5'- P)-merker (60 pmol) og blandingen ble rekombinert fra 35°C. Slutt-volumet var 40 yl. T4-DNA ligase (5 enheter) ble tilsatt og sammenføyningsreaksjonene fikk forløpe over natten.

32

(5'- P)-merkede segmenter ls og 2s (100 pmol hver)

og T4-DNA ligase (2,5 enheter) ble tilsatt og inkubering ble fortsatt i 6 timer ved 4°C. Ligeringsblandingen ble tørket i våkum, gjenoppløst i 40 yl formamid, oppvarmet på et bad av kokende vann i 3 minutter, og belagt på en 8% akrylamid gel som inneholder 8 M urea. Båndet av akrylamid som inneholdt R2 produkt dupleksen (1c-2s) ble kuttet fra gelen og duplekset ekstrahert og utfelt med etanol. Sluttutbyttet var 6,5 pmol. Dupleks lc-2s (5 pmol) ble rekombinert fra 75°C i 10 yl restriksjonsbuffer og deretter behandlet med Alul (10 enheter) ved 37°C i 2 timer. Produktene som ble oppnådd ved denne restriksjonsspaltingen ble analysert ved gel elektroforese. Det lille duplekset som var generert fra 1 s og 2 s ved spalting ved Alul setet ble funnet nær bunnen av gelen. Det langsomst migrerende båndet svarte til det urestriksjonerte duplekset. EcoRI- Alul duplekset migrerte som separerte kjeder og var hovedbåndet av<32>P-merkede bånd. Størrelsesmarkører generert fra Hpall spalting

av pBR322 ble benyttet. Det Alul nedbrutte duplekset ble fraksjonert på en "Sephadex G150/40" kolonne og analysert ved gel elektroforese. Kolonne-elueringsmidlet inneholdt EcoRI- Alul duplekset av R2 og unedbrutt dupleks lc-2s. Utbyttet var 3,5 pmol.

Fremstilling av EcoRI- AluI duplekset som inneholder ribosom bindingssete R3.

DNA sekvensen av R3 duplekset er vist i tabell 11.

Tabell 11 viser duplekser som strekker seg fra EcoRI

gjennom Alul og innbefatter segmentene ls og 2s av strukturgenet. Som det fremgår ved sammenlikning med RI kontroll området (se tabell 5), er segmentene lc til lic og ls, 2s svarende til promotor- lakk operatoren og de to første struktur gen segmentene, henholdsvis, identiske.

Ribosom bindingssete.sekvensene for Ri (12c-20c) og R3 (30c-38c) er forskjellige. Ligering av disse segmentene til femstilling av et dupleks lc-2s som inneholder R3

ble fullført som beskrevet ovenfor for syntesen av det samme duplekset som inneholdt R2 sekvenser. Mengdene av segmenter var som følger: lc (320 pmol); 2c (160 pmol); 3c-10c (80 pmol); 29c-38c (60 pmol); ls (100 pmol): 2s (100 pmol). Sluttutbyttet var 14 pmol. Etter nedbrytning med Alul som beskrevet ovenfor, ble EcoRI- Alul duplekset som inneholdt R3 isolert i 3,5 pmols utbyttet fra 5 pmol av dupleks lc-2s. Resultatene fra denne syntesen ble analysert ved gel elektroforese.

Duplekset lc-2s ble renset ved kolonnekromatografi som angitt ovenfor. Under anvendelse av størrelsesmarkører generert ved nedbrytning av pBR322 medHaell, ble følgende bestanddeler analysert ved gel elektroforese: ligert og kolonne-renset dupleks lc-2s; reaksjonsblandingen fradupleks lc-2s etter nedbrytning med Alul; og kolonne-renset Alul. nedbrytnings-blanding. pBR322 ble åpnet med restriksjonsenzymene EcoRI

og PuuII. Ri og R2 ble klonet separat inn i det åpnede plasmidet som EcoRI- AluI fragmentene.

Sammensetning av hybridinterferon genet som inneholder ribosom bindingssetene R2 og R3.

En skjematisk angivelse som beskriver sammensetningen av interferongenet som inneholder ribosom bindingssetene R2 og R3 er gjengitt i figur 3. Den opprinnelige genekonstruksjonen

som inneholder RI er vist skjematisk øverst på figuren.

Ved restriksjon først med Hindlll og deretter Alul,

genereres et Al- uI-. HindI.il dupleks. Et EcoRI- Alul dupleks som inneholder enten R2 eller R3 sekvenser (venstre del av figuren) sammenføyes deretter med Alul-

Hindlll duplekset. Som angitt nederst i figur 3, re-syntetiseres hele genet deretter.

Interferongenet med RI og sammensatt i pMPl05 ble kuttet med EcoRI og Hindlll. EcoRI- Hindlll duplekset med 384

basepar, ble deretter kuttet med Alul. Ved først å kutte genet med Hindlll, var den eneste andre Alul gjenkjennings-posisjonen i genet ( Hindlll setet) tilstede som enkelt-

kjeder og følgelig inaktivert. Duplekset Alul- Hindlll med 267 basepar ble isolert og ligert til EcoRI- Alul duplekset som inneholdt enten R2 eller R3. De nye EcoRI-Hindlll dupleksene ble deretter klonet inn i pUC8,

forsterket, og reisolert. Til sist ble hvert EcoRI- Hindlll dupleks med 384 basepar som inneholdt ente R2 eller R3

ligert til resten av genet ( Hindlll- EcoRI) og innført i pUC8. Plasmider som inneholder duplekser med begge orienteringer av genet relativt kloningsbæreren kunne identifiseres.

Eksempel- 8.

EKSPRESJON I E. COLI OG BIOLOGISK AKTIVITET AV a-C

LYMFOBLASTOID HYBRID INTERFERON

Lymfoblastoidhybrid interferon genet ble eksprimert i E. coli som et pUC8 plasmid derivat og ble funnet å være biologisk aktivt bestemt ved en analyse for reduksjon av den cytopatiske virkningen. Tre forskjellige konstruksjoner av genet inneholdende ribosom bindingssetene RI, R2, og R3 ble analys rt. Resultater fra forskjellige forsøk er gjengitt i tabell 13 og 14.

1

Analysen ble utført med en storfe nyre.celle -linje MDBK ved anvendelse av vesikulært stomatitis virus som utfordring.

2

Celler ble analysert ved 0Drnnpå 4 - 5.

1578nmc

Hybrid interferonet har den spesifikke aktivitet 1 - 1 x 10g enheter/mg når det ble analysert på en nyrecellelinje fra storfe (MDBK) med vesikulært stomatitis virus,som utfordring. Alle de tre ribosomebindingssetene synes å være translasjons-messige aktive. Rekkefølgen for translasjonsinitierings-aktivitet er R2 > R3 j> RI.

Nivåene for ekspresjon ble undersøkt ved gel elektroforese av samlet celleprotein. Celle lysater av stammer av E. coli som hadde RI, R2 og R3 kontrollerte gener ble undersøkt. Cellelysatmaterialet ble oppnådd for denne gelanalysen ved

å gro E. coli inneholdende pMPl05 til 0,4 - 0,6 0D__o

— b / o

i næringsmedium komplementert med ampicillin og indusert

-3

med 10 M IPTG. Etter 3 timer ble cellene høstet,

lyset ved lydpåvirkning og like store porsjoner ble plassert på geler. Mengden av interferon hybrid protein produsert ved hvert ribosom bindingssete, samsvarer med resultatene oppnådd ved anvendelse av virusutfordringsanalysen. Mer interferon synes å produsere fra R2 enn fra R3 eller RI.

Eksempel 9.

KJEMISK SYNTESE AV OLIGODEOKSYNUKLEOTIDER

Oligodeoksynukleotider inneholdende kontrollområde

sekvenser (promotor, lakk operator og ribosom bindings seter) ble syntetisert på silika gel polymer bærer under anvendelse av 5<1->dimetoksytrityldeoksynukleotid-3-tetra-zoylfosforamiditer som syntoner. Alle andre oligodeoksynukleotider ble syntetisert tilsvarende på silikagel polymer-bærere, men med anvendelse av 5'-dimetoksytrityldeoksy-nukleosid-3<1->N,N-dimetylaminofosforamiditer som syntoner.

De kjemiske fremgangsmåtene er publisert ("Chemical

Synthesis of Oligodeoxynucleotides Using the Phosphite Triester Intermediates". M.H. Caruthers, i "Chemical

and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments". Red. H.G.

Gasson og Anno Lang. Verlag Chemie, Deerfield Beach, Florida, (1982)). Ved avslutning av en syntese, ble hvert oligodeoksynukleotid frigjort for beskyttelses-

grupper og isolert ved polyakrylamid gel elektroforese. Silica gel som inneholdt det syntetiske deoksyoligo-nukleotidet ble først behandlet med trietylammonium triofenoksyd for å. fjerne metyl gruppene fra internukleo-tide fosfortiestere. Det neste trinnet var hydrolyse av esteren som binder oligodeoksynukleotidet til bæreren under anvendelse av konsentrert ammoniumhydroksyd i tre timer ved 20°C. Etter sentrifugering og utvinning av overvæsken som inneholdt blandingen av feilsekvenser, og det korrekte oligodeoksynukleotidet, ble N-benzoyl-

gruppene fra deoksycytosin og deokayadenosin og N-isobutyryl-gruppen fra deoksyguanosin fjernet ved å oppvarme den konsen-trerte ammoniumhydroksyd oppløsningen til 50°C i 12 timer. 5 *-O-dimetoksytritylgruppen ble hydrolys rt ved å benytte 80% eddiksyre. Sluttproduktet ble isolert fra feil-sekvensene ved gelelektroforese. Hydrolysatet ble tørket i våkum, oppløst i formamid, oppvarmet til 100°C i 3 minutter, og belagt på en 12% polyakrylamid gel fremstilt i 7 M urea med en tris-borat buffer (pH 8,0). Etter gel elektroforese ble oligodeoksynukleotidene synliggjort på gelen ved å benytte u.v. lys av kortbølgelengde med en fluoriserende silikagel plate bak gelen. U.v. absorbsjonsbåndet svarende til DNA segmentet ble skåret fra gelen og oligodeoksynukleotidet ble eluert. Elueringsmidlet ble ekstrahert fire ganger med n-butanol, tørket, gjenoppløst i 0,2 ml vann, og frigjort for salter ved kolonnekromatografi på en "Sephadex G-150/40" kolonne (5 ml injeksjonssprøyte) bragt i likevekt med 10 niM trietylammonium bikarbonat (TEAB) . ;Eksempel , 10,. ;FREMSTILLING AV (5'-<32>P)-MERKEDE OLIGODEOKSYNUKLEOTIDER ;Oligodeoksynukleotider (100 - 500 pmol) ble fosforylert ;32 ;med T4-polynukleotid kinase og (y- . P)ATP som har en spesifikk aktivitet på 2,5 - 10 x 10 cpm/pmol. ;Reaksjonene ble fullført i 5-15 ul 33 mM tris-HCl ;(pH 7,5), 3,3 mM MgCl2og 5 mM DTT. Etter 30 - 40 minutter ved 37°C ble reaksjonsblandingene oppvarmet til 75°C for ;å innaktivere T4-kinase. Like store porsjoner ble analysert . ved polyakrylamid gel elektroforese etterfulgt av autoradiografi for å visualisere resultatene. ;Eksempel 11. ;LIGERING AV FOSFORYLERTE OLIGODEOKSYNUKLEOTIDER ;Reaksjonsblandinger som inneholdt 5 *-fosforylerte oligodeoksymukleotider (100 - 500 pmol), (y- 32P)ATP, og inaktivert T4-polynukleotid kinase ble. vanligvis benyttet uten rensing i ligeringsreaktorene. Hvert par av komplementære sekvenser ble rekombinert ved oppvarming av de kombinerte oppløsningene av fosforylerte segmenter ved 95°C og deretter langsomt avkjøling til 4°C. To serier av rekombinerte duplekser som hadde et komplementært enkeltkjedet område ble deretter slått sammen, oppvarmettil 37°C og langsomt avkjølt til 4°C. Oppløsningen ble justert til 66 mM

tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 400 yM ATP

i et sluttvolum på 20 - 30 yl. Etter tilsats av T4-DNA ligase (1-2 enheter) ble reaksjonsblandingen inkubert

i 12 - .15 timer og deretter analysert ved anvendelse av polyakrylamid gel elektroforese. Reaksjonsblandinger ble fraksjonert på "Sephadex G-150/40" kolonner. For ligerte DNA segmenter med lengde 40 til 50 nukleotider var kolonnestørrelsen 1 x 20 cm. For større molekyler var størrelsen 1 x 90 cm. Før fraksjonering, ble hver kolonne vasket grundig med 10 mM TEAB og forhåndsbelagt med 0,5 ml 95% formamid. Ligeringsblandingen ble,tørket,

oppløst i 40 yl med 95% formamid, ,oppvarmet i. 3 minutter til 100°C og påført på kolonnen. DNA ble eluert med 10 mM TEAB som 0,2 - 0,4 ml fraksjoner, samlet, og talt. Oppsamlede fraksjoner ble tørket og gjenoppløst i 10 mM

TEAB eller en buffer egnet for neste trinn.

Eksempel 12.

GEL RENSING

Polyakrylamid geler (8 - 10%) inneholdende 7 M urea ble benyttet til å isolere fullstendige homogene DNA duplekser fra ligeringsblandinger. Rutinemessig ble ligerings-blandingene tørket, gjenoppløst i 95% formamid, oppvarmet til 100°C i 3 minutter, og belagt på gelen. Etter elektroforese ble DNA lokalisert ved autoradiografi og ekstrahert fra gelene. DNA ble utfelt fra ekstraktet ved å benytte 2,5 volumdeler etanol. Etter to ekstra utfellinger ble DNA

tørket og gjenoppløst i 10 mM TEAB eller en buffer som er egnet for det neste trinnet.

Claims

1. En anti-virus og anti-celledelings sammensetningkarakterisert vedat den innbefatter et polypeptid av 166 aminosyrer og eventuelt har et ekstra metionin knyttet til den ordinære første aminosyren ved N-terminalen, og aminosyresekvensen av polypeptidforbindelsen t r har formelen

hvor X i det vesentlige består av aminosyrer 2 til 46 av humant lymfoblastoid interferon (LblF); Y består i det vesentlige av aminosyrer 60 til 85 av nevnte LblF; Z består i det vesentlige av aminosyer 112 til 166 av nevnte LblF; P består i det vesentlige av aminosyrer 47 til 59 av humant aC-, aF- eller al-type leukocytt inter-47 50 feron (LelF) og er gin -phe-gln-lys -ala-gln-ala-ileu-55 59 47 50 ser -val-leu-his-glu ; eller gin -phe-gln-lys -thr- gln-ala-ileu-ser 55 rval-leu-his-glu 59; og B består i det vesentlige av aminosyrer 86 til 111 av humant aC-, aF, eller 8 6 al-type leukocytt interferon (LelF) og er ser -thr- glu-leu-tyr 90 -gln-gln-leu-asn-asp<95>-leu-glu-ala-cys-val 100 ileu-gln-glu-val-gly105-val-glu-glu-thr-pro'I"'1"0-leu, ser^-thr-glu-leu-asn^-gln-gln-leu-asn-asp^5-met-glu-ala-cys-val<100->ileu-gln-hlu-val-gly<105->val-glu-glu-thr-pro^^-leu, eller ser^<6->thr-glu-leu-tyr<90->gln-gln-95 100 leu-asn-asn -leu-glu-ala-cys-val -ileu-gln-glu-val-gly^ ^-met-glu-gøu-thr-pro^^-leu; og betydelige polypeptid fragmenter og/eller derivater derav som har biologisk eller antivirusaktivitet som humant interferon.

2. Hybrid interferon polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat X er et LblF segment som har aminosyresekvensen asp 2 -leu-pro-gln 5-thr-his-ser-leu-gly^-asn-arg-arg-ala-leu^ ^-ileu-leu-leu-' ala-gln 20 -met-gly-arg-ileu-ser<25->leu-phe-ser-cys-i 30 , , . '35 ut o, t 40 leu -lys-asp-arg-his-asp -phe-gly-phe-pro-gln glu-glu-phe-asp-gly<45->asn; Y er et LblF segment som har aminosyresekvensen met^-ileu-gln-gln-ileu-phe^-asn-70' 75 léu-phe-ser-thr -lys-asp-ser-ser-ala -ala-trp-asn-80 R 5 glu-ser -leu-leu-asp-lys-phe ; og Z er et LblF segment 112 115 som har aminosyre sekvens met -asn-val-glu -ser- ileu-leu-ala-val 120 -ser-lys-tyr-phe.gin 125-arg-ileu-thr-leu-tyr<130->leu-ser-glu-lys-lys<135->tyr-ser-pro-cys-ala 140 -trp-glu-ileu-val-arg 145-ala-glu-ileu-met-arg1 ^-ser-leu-thr-leu-leu1 ^-thr-asn-leu-gln-glu1 arg-leu-arg-asn-lys165-asp.

3. Deoksynukleotid sekvens som koder for et humant lymfoblastoid-leukocytt hybrid interferon som innbefatter 166 aminosyrer og eventuelt har et metionin knyttet til den ordinære første aminosyren med N-terminalen med et plusskjede representert ved følgende formel:

hvor W er TGT eller TGC; X består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 2 til 46 av humant lymfoblastoid interferon (LblF); Y består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 60 til 85 av nevnte LblF; Z består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 112 til 166 av nevnte LblF; P består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 47 til 59 av humant aC-, aF- eller al-type leukocyttinterferon (LelF);og er CAG TTC CAA AAG^q GCT CAG GCA ATC TCG.-C GTT CTG CAT GAG c n,4 el ler CAG TTC CAA bb 59 47 AAGr„ ACC CAG GCA ATC TCG^CGTT CTG CAT GAG ; B består 50 55 59 i det vesentlige av deoksynukleotider som koder.for aminosyrer 86 til 111 av nevnte aC-, aF-, eller al-type LelF og er TCCg6ACT GAA CTC TATgg CAG CAA CTG AAC GATg5CTT GAA GCT TGC GTT10QATC CAG GAG GTA GGC1Q5GTT GAA GAG ACT CCG110CTT, TCCgg ATC GAA CTC AATgQCAG CAA CTG AAC GATg5ATG GAA GCT TGC GTT100 ATC CAG GAG GTA GGC1Q5GTT GAAGAG ACT CCGl1Qy CTT, eller TCCg6ATC GAA CTC TATgQCAG CAA CTG AAC AACg5CTT GAA GCT TGCGTT100ATC CAG GAT GTA GGClQ5ATG GAA GAG ACT CCG110CTT; og transkripsjons- og translasjonsekvivalenter innbefattet enkel eller flerbasesubstitusjoner, innskudd og inversjoner; og betydelige fragmenter derav som tillater ekspresjon av nevnte hybrid interferon eller biologisk aktive fragmenter derav; hvor A er deoksyadenyl, G er deoksyguanyl, C er deoksycytosyl og T er tymidyl.

4. Deoksynukleotid sekvens ifølge krav 3,karakterisert vedat X er GAT2TTG CCG CAG5ACT CAT AGC TTG GGCj q AAC CGA AGA GCA CTC15ATC CTG TTG GCC CAA2QATG GGT CGC ATT TCC25CTG TTC TCG TGC CTT30AAA GAC CGC CAC GAT^ TTC GGG TTT CCA CAG^<q><G>AA GAG TTT GAC GGC. r AAT; Y er ATG,n ATT CAG CAA ATC TTCCI- AAC 45 60 dd CTG TTC TCC ACT^q AAA GAC TCT TCG GCT75GCT TGG AAC GAA TCCg0TTG CTT GAT AAA TTCor; og Z er ATG...,,, AAT GTTGAG1 1 j- TCT ATC CTG GCT GTA.,™ TCT AAG TAT TTT CAG. oc- CGA ATT ACC CTC 1Zu1 zb TAC13QCTC AGT GAGAAGAAA135TATTCACCG TGT GCG140TGG GAA ATT GTG AGA^5GCC GAA ATC ATG CGT.,50TCC CTG ACT CTT CTG155ACG AAC CTC CAG GAA1g0CGC CTG CGT AAT AAAlg5<G>AC

5. En rekombinant DNA molekyl,karakterisertved at det innbefatter en DNA sekvense ifølge krav 1 eller 2.

6. Rekombinant DNA molekyl, ifølge krav 5,karakterisert vedat DNA sekvensen er operativ forbundet med en ekspresjonskontroll-sekvens.

7. Vert,karakterisert vedat den er transformert med et rekombinant DNA molekyl som innbefatter en DNA sekvens som koder for et humant lymfoblastoid-leukocytt hybrid interferon ifølge krav 1, og hvor DNA sekvensen er operativt forbundet med en ekspresjons-kontrollsekvens.

8. Vert ifølge krav 7,karakterisert vedat den er valgt fra gruppen bestående av Escherichia coli, Bacillus subtilis, eller andre bakterier, gjær eller annen sopp, mus eller annet dyr eller planteverter og menneskelige vevceller.

9. Vert,karakterisert vedat den er transformert med minst ett rekombinant DNA molekyl som koder for et humant lymfoblastoid-leukocytt hybrid interferon som innbefatter et hybrid promotor område, et operator område, et ribosom bindings sete og et polypeptid-kodende område som koder for et polypeptid av 166 aminosyrer og som eventuelt koder for et ekstra metionin knyttet til den første ordinære aminosyren ved N-terminalen av polypeptidet, og et termineringsområde med en pluss kjede representert ved følgende formel:

hvor L i det vesentlige består av promotor område; 0 består i det vesentlige av operatorområdet; Q er en del av et ribosom bindingssete og er A-A-A-A-A-T-T-A-A-G-G-A-G-G-A-T-C-A-C-T-, T-T-A-T-T-A-C-C-C-A-A-C-T-T-G-A-G-G-A-A-T-T-T-A-T-A, eller C-G-G-C-C-C-C-T-T-A-C-T-T-G-A-G-G-A-T-A-A-A-T-T; W er TGT eller TGC; X består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 2 til 4 6 av humant lymfoblastoid interferon (LblF); Y består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 60 til 85 av nevnte LblF; Z består i dfet vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 112 til 166 av nevnte LblF; P består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 47 til 59 av humant"aC-, aF-, eller al-type leukocytt interferon (LelF) og er CAG TTC CAA AAG^q GCT CAG GCA ATC TCGrCGTT CTG CAT GAG, eller CAG TTC CAA 55 AAG50ACC CAG GCA ATC TCG55<G>TT CTG CAT GAG; B består i det vesentlige av deoksynukleotider som koder for aminosyrer 86 til 111 av nevnte aC-, aF-, eller al-type LelF og er TCC ACT GAA CTC TATg0CAG GAA CTG AAG GATg5CTT GAA GCT TGC GTT100ATC CAG GAG GTA GGC1Q5GTT GAAGAG ACT CCG110CTT, TCC ATC GAA CTC AATgQCAG CAA CTG AAC GAT<95>ATG GAA GCT TGC GTTiAnATC CAG GAG GTA GGC.ncGTT GAA GAG ACT CCG,,- lUU lUb 110 CTT, eller TCC ATCGTA GGC1Q5ATG GAA GAG ACT CCG110CTT; E består i det vesentlige av termineringsområdet; og transkripsjons- og translasjonsekvivalenter, innbefattet enkel eller flerbasesbustitusjoner, innskudd eller inversjoner; og betydelige fragmenter derav som tillater ekspresjon av nevnte hybrid interferon eller biologisk aktive fragmenter derav; hvor A er deoksyadenyl, G er deoksyguanyl, C er deoksycytosyl og T er tymidyl.

10. Vert ifølge krav 9,karakterisertved at den er valgt fra gruppen bestående av Escherichia coli, Bacillus subtilis, eller andre bakterier, gjær eller andre sopper, mus eller andre dyr eller planteverter og menneskelige vevceller.