NO329816B1

NO329816B1 - Antistoffer mot humant IL-10, anvendelse av disse, DNA konstruksjoner, ekspresjonsvektor, fremgangsmate for fremstilling og farmasoytisk sammensetning

Info

Publication number: NO329816B1
Application number: NO20023266A
Authority: NO
Inventors: Hermann Gram; Franco E Di Padova
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2010-12-27
Also published as: HUP0204156A3; CA2396212C; JP2003520595A; PE20011219A1; CZ20022531A3; DK1248804T4; PL207642B1; US20090232803A1; WO2001053353A3; KR100697126B1; CO5261584A1; CZ302738B6; DE60124863D1; HK1050013A1; CN1395581B; GB0001448D0; CY1107989T1; US20060251660A1; NZ519936A; HUP0204156A2

Description

Oppfinnelsen vedrører antistoffer mot humant interleukin I beta (IL-ip) og anvendelsen av slike antistoffer for fremstilling av et medikament for behandling av IL-1-formidlede sykdommer og forstyrrelser.

Interleukin 1 (IL-1) er en aktivitet produsert av celler i immunsystemet som virker som en formidler av akutt fase inflammatorisk respons. Uhensiktsmessig eller overskudds-produksjon av IL-1, spesielt IL-ip, er assosiert med patologien til forskjellige sykdommer og forstyrrelser, slik som septicemi, septisk eller endotoksisk sjokk, allergier, astma, bentap, ischemi, hjerteinfarkt, rheumatoid artritt og andre inflammatoriske sykdommer. Antistoffer mot IL-ip har blitt foreslått for anvendelse i behandlingen av IL-1-formidlede sykdommer og forstyrrelser; se f.eks. WO 95/01997 og diskusjonen i intro-duksjonen.

Vi har nå preparert forbedrede antistoffer mot human IL-ip for anvendelse i fremstilling av et medikament for behandling av IL-1-formidlede sykdommer og forstyrrelser.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse,

antistoff til IL-ip, kjennetegnet ved at det har antigen-bindingsspesifisitet for et antigen-epitop til det modne humane IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor og hvori IL-ip bindingsmolekylet omfatter et antigen -bindingssete som omfatter minst ett immunoglobulin tungkjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvenshypervariable regioner CDR1, CDR2 og CDR3 som vist i SEKV ID NR 1, det vil si at nevnte CDR1 har aminosyresekvensen Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile og hvori IL-ip-bindingsmolekylet omfatter et antigenbindingssete som omfatter minst ett immunoglobulin lett kjedevariabelt domene (Vl) som omfattes i sekvenshypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3' som vist i SEKV ID NR 2, det vil si at nevnte CDR1' har aminosyresekvensen Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr, og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro.

Opprinnelsen omfatter videre en anvendelse av IL-ip-bindingsmolekylet ifølge ethvert av kravene 1 - 2 for fremstilling av et medikament for forebygging av eller behandling av IL-1-mediert sykdom eller forstyrrelser, akutte og hyperakutte inflammatorisk reaksjoner, akutte infeksjoner, septisk sjokk, endotoksisk sjokk, voksenrespiratorisk "distress" syndrom, meningitt, lungebetennelse og alvorlige forbrenninger, kakeksi eller "wasting" syndrom, cancer, organdysfunksjon, AIDS-relatert kakeksi eller for forebygging eller behandling av inflammatoriske tilstander, allergier og allergiske tilstander, hypersensitive reaksjoner, autoimmune sykdommer, alvorlige infeksjoner, organ- eller vevstransplantatsavstøtning, autoimmun sykdom, artritt, rheumatorid artritt, fremskreden kronisk artritt, deformativ artritt, reumatiske sykdommer, inflammatoriske smerter, hypersensitivitet, luftveishypersensitivitet, hudhypersensitivitet, allergier, autoimmune hematologiske sykdommer, hemolytisk anemi, aplastisk anemi, genuin rødcelleanemi og idiopatisk trombocytopeni, systemisk lupuserythematose, polykondritt, sklerodoma, Wegener ganulomatose, dermatomyositis, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrom, idiopatisk "sprue", autoimmun inflammatorisk tarmsykdom, ulkerøs kolitt, Crohns sykdom, irritabel Bowel-syndrom, endokrin oftalmopati, Graves sykdom, sarcoidosis, multippel sklerose, primær gallecirros, juvenil diabetes, diabetes mellitus type I, uveititt (anterior og posterior), keratokonjunktiv sicca, vernal keratoconjunctivitt, interstitiell lungefibrose, psoriatrisk artritt og glomerulonefritt, idiopatisk nefrotisk syndrom, minimal "change" neuropati, astma, bronkitt, pneumoconiosis, lungeemfysem og andre obstruktive eller inflammatoriske sykdommer i luftveiene, sykdommer i benmetabolismen, osteoartritt, osteoporose, andre inflammatoriske artritter, generelt bentap, aldersrelatert bentap, periodental sykdom, cancer og IL-1-avhengige tumorer.

Omfattet av oppfinnelsen er også en første DNA-konstruksjon som koder for en tung kjede eller fragment derav, kjennetegnet ved at det omfatter

i) en første del som koder for et variabelt domene som omfatter en alternativ rammestruktur og hypervariable regioner, hvor nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1, CDR2 og CDR3, aminosyresekvensene som er vist i SEKV ID NR 1, denne første delen starter med et codon som koder for den første aminosyren til det variable domenet og ender ved et codon som koder for den siste aminosyren til det variable domenet, og

ii) en andre del som koder for en tung kjedekonstant del som starter med et codon som koder for den første aminosyren til den konstante delen av den tunge kjeden, og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren i den konstante delen, etterfulgt av et stoppcodon,

og

en andre DNA-konstruksjon som koder for en lett kjede som omfatter

iii) en første del som koder for et variabelt domene som omfatter en alternativ rammestruktur og hypervariable regioner; hvor nevnte hypervariable regioner er CDR3' og eventuelt CDR1' og CDR2', hvis aminosyresekvenser er vist i SEKV ID NR 2, hvor første del starter med et codon som koder for den første aminosyren til det variable domenet og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren til det variable domenet, og

iv) en andre del som koder for en lett kjedekonstant del, som starter med et codon som koder for den første aminosyren til den konstante delen i den lette kjeden og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren i den konstante delen etterfulgt av et stoppcodon.

Ekspresjonsvektor er omfattet av oppfinnelsen og er kjennetegnet ved at den er i stand til å replikere i en prokaryot eller eukaryot cellelinje som omfatter DNA-konstruksj onene ifølge krav 5.

Videre er en fremgangsmåte for produksjon av IL-ip-bindingsmolekyl, som omfatter i) å dyrke en organisme som er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 6, og (ii) gjenvinne IL-ip-bindingsmolekylet fra kulturen.

Til slutt omfatter foreliggende oppfinnelse farmasøytisk sammensetning , kjennetegnet ved at den omfatter et antistoff mot IL-ip i følge krav 1 i kombinasjon med et farmasøytisk hjelpestoff, fortynningsmiddel eller bærer.

Hvis ikke annet er indikert, er en hvilken som helst polypeptidkjede heri beskrevet som å ha en aminosyresekvens som starter med det N-terminale ytterpunkt og som ender i det C-terminale ytterpunktet. Når antigen-bindingssetet omfatter både Vh- og VL-domenene, kan disse lokaliseres på det samme polypeptidmolekylet eller, fortrinnsvis, kan hvert domene være på en forskjellig kjede, hvor Vn-domenet er en del av en immunoglobulin-tungkjede eller fragment derav, og Vler en del av en immunoglobuli-lettkjede eller fragment derav.

"IL-1 p-bindingsmolekylet" betyr et hvilket som helst molekyl som er i stand til å binde IL-ip-antigenet enten alene eller assosiert med andre molekyler. Bindingsreaksjonen kan ses ved standardmetoder (kvalitative analyser) som inkluderer, f.eks., en bioanalyse for å bestemme inhiberingen av IL-ip-binding til dets reseptor, eller en hvilken som

helst type av bindingsanalyser, med referanse til en negativ kontrolltest hvori et antistoff av ubeslektet spesifisitet, men av samme isotype, f.eks. et anti-CD25-antistoff, blir brukt. Bindingen av IL-ip-molekyler ifølge oppfinnelsen til IL-ip kan vises i en kon-kurransebindingsanalyse.

Eksempler på antigenbindingsmolekyler inkluderer antistoffer som produsert av B-celler eller hybridomer og kimære, CDR-transplanterte eller humane antistoffer eller et hvilket som helst fragment derav, f.eks. F(ab')2- og F ab-fragmenter, så vel som enkle kjeder eller enkle domenantistoffer.

Et enkelt kjedeantistoff består av de variable domenene til de tunge og lette kjedene til et antistoff kovalent bundet ved en peptidlinker som vanligvis består av fra 10 til 30 aminosyrer, fortrinnsvis fra 15 til 25 aminosyrer. Derfor inkluderer en slik struktur ikke den konstante delen av de tunge og lette kjedene og man tror at den lille peptid-spaceren skulle være mindre antigen enn den hele konstante delen. "Kimært antistoff betyr et antistoff hvor de konstante regionene til de tunge eller lette kjedene begge er av human opprinnelse, mens de variable domenene av både tunge og lette kjeder er av ikke-humane (f.eks. murine) opprinnelse, eller av human opprinnelse, men avledet fra et annet, humant antistoff. "CDR-transplantert antistoff betyr et antistoff hvor de hypervariable regionene (CDR) er avledet fra et donorantistoff, slik som et ikke-humant (f.eks. murint) antistoff eller et annet, humant antistoff, mens hele eller i det vesentlige hele av de andre delene av immunoglobulinet, f.eks. de konstante regionene og de høyt konser-verte delene av de variable domenene, dvs. rammestrukturregionene, er avledet fra et akseptorantistoff, f.eks. et antistoff av human opprinnelse. Et CDR-transplantert antistoff kan imidlertid inneholde få aminosyrer av donorsekvensen i rammestruktur-regionene, f.eks. i delene av rammestruktur-regionene nær de hypervariable regionene. "Humant antistoff betyr et antistoff hvor de konstante og variable regionene til både de tunge og lette kjedene alle er av human opprinnelse, eller i det vesentlige identisk til sekvensene til den humane opprinnelsen, ikke nødvendigvis fra det samme antistoffet og inkluderer antistoffet produsert av mus hvori de murine immunoglobulin-variable og konstante delgenene har blitt erstattet av deres humane motparter, f.eks. som beskrevet generelt i EP 0546073 Bl, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 Bl og EP 0 463151 Bl.

I WO 9006371 Al beskrives en fremstilling av anti-IL-alfa og -beta antistoffer og anvendelse av slike som diagnostiske og terapeutiske agenser, imidlertid blir ikke bindingsmolekyl med de spesifikke CDR områdene beskrevet.

Spesielt foretrukne IL-ip-bindingsmolekyler ifølge oppfinnelsen er humane antistoffer spesielt AAL 160-antistoffet, som beskrevet heri i eksemplene.

Skjønt i foretrukne kimære antistoffer er de variable domenene til både tunge og lette kjeder av human opprinnelse, f.eks. de fra AAL 160-antistoffet som er vist i Seq.Id.Nr. 1 og Seq.Id.Nr 2. De konstante regiondomene omfatter fortrinnsvis også egnede humane, konstante regiondomener, f.eks. som beskrevet i "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.A. et al., US Department of Health and Human Ser-vices, Public Health Service, National Institute of Health.

Hypervariable regioner kan assosieres med hvilke som helst rammestruktur-regioner, skjønt fortrinnsvis av human opprinnelse. Egnede rammestruktur-regioner er beskrevet i Kabat E.A. et al., ibid. Den foretrukne tungkjede-rammestrukturen er en human tungkjede-rammestruktur, f.eks. den til AAL 160-antistoffet som er vist i Seq.Id.Nr. 1. Den består av sekvensen til FRI-, FR2-, FR3- og FR4-regionene.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen et IL-ip-bindingsmolekyl som omfatter minst ett antigen-bindingssete som omfatter enten et første domene som har en aminosyresekvens som i det vesentlige er identisk til den vist i Seq.Id.Nr. 1 som starter med aminosyre i posisjon 1 og som ender med aminosyre i posisjon 118 eller et første domene som beskrevet over og et andre domene som har en aminosyresekvens som i det vesentlige er identisk til den vist i Seq.Id.Nr. 2, som starter med aminosyre i posisjon 1 og som ender med aminosyre i posisjon 107.

Monoklonale antistoffer som reises mot et protein som naturlig finnes i alle mennesker er de typisk utviklet i et ikke-humant system, f.eks. i mus. Som en direkte konsekvens av dette, reiser et xenogent antistoff produsert av et hybridom, når den administreres til mennesker, en uønsket immunrespons som fortrinnsvis blir formidlet av den konstante delen av det xenogene immunoglobulinet. Dette begrenser klart anvendelsen av slike antistoffer siden de ikke kan administreres i en lengre tidsperiode. Derfor er det spesielt foretrukket å anvende enkelkjede, enkeltdomene, kimære, CDR-transplanterte, eller spesielt humane antistoffer som ikke kan reise en vesentlig allogen respons når den blir ad-ministrert til mennesker.

I lys av det foregående, er et mer foretrukket IL-ip-bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen valgt fra et humant anti- IL-ip-antistoff som omfatter minst a) en immunoglobulin tungkjede eller fragment derav som omfatter (i) et variabelt domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 og (ii) den konstante delen eller fragment derav av en human tungkjede; hvor nevnte CDR1 har aminosyresekvensen Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile og

b) en immunoglobulin-lettkjede eller fragment derav som omfatter (i) et variabelt domene som omfatter CDR3"hypervariabel region og eventuelt også

CDR1', CDR2' hypervariable regioner og (ii) den konstante delen eller fragment derav av en human lettkjede, hvor nevnte CDR1' har aminosyresekvensen Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu Ala, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr, og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen Gln-GlnArg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro;

og direkte ekvivalenter derav.

Alternativt kan et IL-ip-bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen bli valgt fra et enkelkjede bindingsmolekyl som omfatter et antigenbindingssete som omfatter

a) et første domene som omfatter i sekvens de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3, hvor nevnte hypervariable regioner har aminosyresekvensene som vist i Seq.Id.Nr. 1, b) et andre domene som omfatter de hypervariable regionene CDR3' og eventuelt CDR1' og CDR2', hvor nevnte hypervariable regioner har aminosyresekvensene som vist i Seq.Id.Nr. 2 og c) en peptidlinker som er bundet enten til det N-terminale ytterpunktet til det første domenet og det C-terminale ytterpunktet til det andre domenet, eller til

det C-terminale ytterpunktet til det første domenet og til det N-terminale ytterpunktet til det andre domenet;

og direkte ekvivalenter derav.

Det er vel kjent at mindre endringer i en aminosyresekvens slik som delesjon, addisjon eller substitusjon av én eller et fåtall eller til og med flere aminosyrer, kan føre til en allelisk form av utgangsproteinet som har i det vesentlige identiske egenskaper. Derfor betyr "direkte ekvivalenter derav" enten et hvilken som helst enkelt domene i IL-ip-bindingsmolekylet (molekyl X). (i) hvori de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 sett på som et hele er minst 80% homologe, fortrinnsvis minst 90% homologe, mer foretrukket minst 95% homologe til de hypervariable regionene som vist i Seq.Id.Nr. 1 og, (ii) som er i stand til å inhibere bindingen av IL-1 p til dets reseptorer i det vesentlige i samme grad som et referansemolekyl som har rammestrukturregionene identisk til den hos molekyl X, men som har hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 identisk til de som er vist i Seq.Id.No. 1 eller et hvilket som helst IL-ip-bindingsmolekyl som har minst to domener pr. bindingssete (molekyl X') (i) hvor de hypervariable regionene CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' og eventuelt CDR1' og CDR2' sett under ett, er minst 80% homologe, fortrinnsvis minst 90% homologe, mer foretrukket minst 95% homologe, til de hypervariable regionene som vist i Seq.Id.No. 1 og 2, og (iii) som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptorer i det vesentlige til samme grad som et referansemolekyl som har rammestrukturregionene og kontante deler identisk til molekyl X', men som har de hypervariable regionene CDR1, CDR2, CDR3 og CDR3', og eventuelt CDR1' og CDR2' identisk til de vist i Seq.Id.No. 1 og 2.

I den foreliggende beskrivelse er aminosyresekvensene minst 80% homolog til hver-andre hvis de har minst 80% identiske aminosyreresidier i en lik posisjon når de blir sekvensert og oppstilt optimalt, mellomrommene eller insersj onene i aminosyresekvensene blir beregnet som ikke-identiske residier.

Inhiberingen av bindingen av IL-ip til dets reseptor kan lett testes i forskjellige analyser som inkluderer slike analyser som er beskrevet nedenfor i teksten. IL-ip-reseptoren som anvendes er fortrinnsvis IL-ip-type-1-reseptoren. Betegnelsen "i samme grad" betyr at referansen og de ekvivalente molekylene utviser, på et statistisk grunnlag, det vesentlige identisk IL-ip-bindingsinhibisjonskurve i én av analysene som er referert til over. Analysen som anvendes kan f.eks. være en analyse for konkurrerende inhibering av binding IL-ip ved løselig IL-1-reseptorer og IL-ip-bindingsmolekylene ifølge oppfinnelsen.

Mest foretrukket omfatter det humane IL-ip-antistoffet minst

a) en tung kjede som omfatter et variabelt domene som har en aminosyresekvens som i det vesentlige er identisk til den vist i Seq.Id.No. 1 som starter

med aminosyren i posisjon 1 og som slutter ved aminosyren i posisjon 118, og den konstante delen av en human tung kjede; og

b) en lett kjede som omfatter et variabelt domene som har en aminosyresekvens som i det vesentlige er identisk til den vist i Seq.Id.No. 2 som begynner med

aminosyren i posisjon 1 og som ender ved aminosyren i posisjon 107, og den konstante delen av en human lett kjede.

Den konstante delen av en human tungkjede kan være yi,72,73, j4, u, ai,0,2, 5 eller e-typen, fortrinnsvis av y-typen eller mer foretrukket av yi-typen, mens den konstante delen av en human lett kjede kan være av%eller X,-typen (som inkluderer X,i, X2og Å^-sub-typene), men er fortrinnsvis av x-typen. Aminosyresekvensene til alle disse konstante delene er gitt i Kabat et al. ibid.

Et IL-ip-bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen kan produseres ved rekombinante DNA-teknikker. I lys av dette, må ett eller flere DNA-molekyler som koder for bindingsmolekylet konstrueres, plasseres under egnede kontrollsekvenser og overført inn i en egnet vertsorganisme for ekspresjon.

På en svært generell måte er det følgelig tilveiebrakt:

(i) DNA-molekyler som koder for et enkelt domene IL-1 p-bindingsmolekyl fra oppfinnelsen, et enkeltkjedet IL-ip-bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen, en tung eller lett kjede eller fragmenter derav av et IL-ip-bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen og (ii) Anvendelsen av DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen for produksjon av et IL-ip-bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen ved rekombinante meto-der.

Den foreliggende oppfinnelsen innen fagfeltet er slik at en som kjenner fagfeltet er i stand til å syntetisere DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen, gitt den informasjonen som tilveiebringes heri, dvs. aminosyresekvensene til de hypervariable regionene og DNA-sekvensene som koder for disse. En fremgangsmåte for å konstruere et variabelt dome-negen er f.eks. beskrevet i EPA 239 400, og kan i korthet oppsummeres som følger: Et gen som koder for et variabelt domene av MAb av en hvilken som helst spesifisitet er klonet. DNA-segmentene som koder for rammestrukturen og de hypervariable regionene er bestemt og DNA-segmentene som koder for de hypervariable regionene blir fjernet slik at DNA-segmentene som koder for rammestrukturregionene blir satt sam-men med egnede restriksjonsseter i koblingene. Restriksjonssetene kan fremstilles i de egnede posisjonene ved mutagenese av DNA-molekylet ved standardprosedyre. Dob-belttrådede syntetiske CDR-kassetter blir fremstilt ved DNA-syntese ifølge sekvensene gitt i Seq.Id. nr. 1 eller 2. Disse kassettene er tilveiebrakt med "sticky" ender, slik at de kan ligeres i koblingene til rammestrukturen.

Dessuten er det ikke nødvendig å ha tilgang til mRNA fra en produserende hybridom-cellelinje for å erverve en DNA-konstruksjon som koder for IL-ip-bindingsmolekylene ifølge oppfinnelsen. Derfor gir PCT-søknad WO 90/07861 fullverdige instruksjoner for produksjonen av et antistoff ved rekombinante DNA-teknikker, bare gitt som skriftlig informasjon for nukleotidsekvensene til genet. Fremgangsmåten omfatter syntese av et antall av oligonukleotider, deres amplifisering ved PCR-metoden, og deres spleising slik at det gir den ønskede DNA-sekvensen.

Ekspresjonsvektorene omfatter en egnet promoter eller gener som koder for tung og lett kjedekonstantdeler er offentlig tilgjengelig. Når et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen blir fremstilt, kan det derfor lett overføres til en egnet ekspresjonsvektor. DNA-molekylene som koder for enkel-kjedeantistoffer kan også bli fremstilt ved standardmetoder, feks. som beskrevet i WO 88/1649.

I lys av det foregående er ingen hybridom eller cellelinjedeponering nødvendig for å etterkomme kriteriene for tilstrekkelig beskrivelse.

I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen inkluderes første og andre DNA-konstruk-sjoner for produksjon av et IL-ip-bindingsmolekyl som beskrevet under

Den første DNA-konstruksjonen koder for en tungkjede eller fragment derav, og omfatter a) en første del som koder for et variabelt domene som omfatter alternative rammestruktur og hypervariable regioner, hvor nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1, CDR2 og CDR3 aminosyresekvensen som er vist i Seq.id.nr. 1; denne første delen som starter med et codon som koder for den første aminosyren i det variable domene, og ender i et codon som koder for den siste aminosyren i det variable domenet, og b) en andre del som koder for en tungkjede, konstant del eller fragment derav som starter med et codon som koder for den første aminosyren i den konstante delen til den tunge kjeden, og som ender med et codon som koder for den siste aminosyren i den konstante delen eller fragment derav, etterfulgt av et stoppcodon.

Fortrinnsvis koder denne første delen et variabelt domene som er en aminosyresekvens som i det vesentlige er identisk til aminosyresekvensen som vist i seq.id nr. 1 som starter ved aminosyren i posisjon 1 og som ender med aminosyren i posisjon 118. Mer foretrukket har nukleotidsekvensen som vist i seq.id.nr. 1, som starter med nukleotidposisjon 1 og som stopper ved nukleotidposisjon 354. Fortrinnsvis koder den andre delen den konstante delen av en human tung kjede, mer fortrinnsvis den konstante delen av human yl-kjede. Den andre delen kan være et DNA-fragment av genomisk opprinnelse (som omfatter introner) eller et cDNA-fragment (uten introner).

Den andre DNA-konstruksjonen som koder for en lett kjede eller fragment derav og omfatter a) en første del som koder for et variabelt domene som omfatter alternativ rammestruktur og hypervariable regioner; hvor nevnte hypervariable regioner er CDR3' og eventuelt CDR1' og CDR2', aminosyresekvensene som er vist i Seq.id.nr. 2; denne første delen som starter med et codon som koder for den første aminosyren i det variable domenet og som slutter ved et codon som koder for den siste aminosyren i det variable domenet, og b) en andre del som koder for en lett kjedekonstant del eller fragment derav som starter med et codon som koder for den første aminosyren i den konstante delen til den lette kjeden og slutter ved et codon som koder for den siste aminosyren til den konstante delen eller fragmenter derav etterfulgt av et stoppcodon.

Fortrinnsvis koder denne første delen et variabelt domene som har en aminosyresekvens som i det vesentlige er identisk til aminosyresekvensen som vist i Seq.id.nr. 2 som starter med aminosyren i posisjon 1 og som slutter ved aminosyren i posisjon 107. Mer foretrukket har den første delen nukleotidsekvensen som vist i Seq.id. nr. 2 som starter med nukleotidet i posisjonl og som slutter ved nukleotidet i posisjon 321. Foretrukket er også den andre delen som koder for den konstante delen av en human lett kjede, mer foretrukket den konstante delen av den humane x-kjeden.

Oppfinnelsen inkluderer IL-ip-bindingsmolekyler hvor én eller flere av residiene til CDR1, CDR2, CDR3, CDR1' CDR2' eller CDR3' er byttet ut fra residiene vist i Seq.id.nr. 1 og Seq.id.nr. 2; f.eks. ved mutasjon, f.eks. setedirigert mutagenese til de korresponderende DNA-sekvensene. Oppfinnelsen inkluderer DNA-sekvenser som koder for slike endrede IL-ip-bindingsmolekyler. Spesielt omfatter oppfinnelsen IL-ip-bindingsmolekyler hvori én eller flere residier av CDR1' eller CDR2' har blitt endret fra residiene vist i Seq.id.nr. 2.

I de første og andre DNA-konstruksjonene kan de første og andre delene bli separert av et intron, og en enhancer kan lokaliseres i intronet mellom første og andre del. Tilstedeværelse av en slik enhancer som blir transskribert, men ikke translatert kan assistere i effektiv transskripsjon. I spesielle utførelsesformer omfatter de første og andre DNA-konstruksj onene enhanceren til et tungkjedegen, fortrinnsvis av human opprinnelse.

Hvert av DNA-konstruksj onene er satt under kontroll av egnede kontrollsekvenser, spesielt under kontroll av en egnet promoter. En hvilken som helst type av promoter kan

anvendes, forutsatt at den er tilpasset til vertsorganismen hvor DNA-konstruksj onene vil bli overført for ekspresjon. Hvis ekspresjonen imidlertid skal finne sted i en mammalsk celle, er det spesielt foretrukket å anvende promotere til et immunoglobulingen, eller en cytomegalovirus (CMV) promoter, f.eks. en human CMV-promoter.

Det ønskede antistoffet kan produseres i en cellekultur eller i et transgent dyr. Et egnet, transgent dyr kan erverves ifølge standardmetoder som inkluderer mikroinjeksjon inn i egg, de første og andre DNA-konstruksj onene plassert under egnede kontrollsekvenser, overføring av de preparerte eggene inn i egnede pseudo-gravide hunner og selektere et-terkommere som uttrykker det ønskede antistoffet.

Når antistoffkj edene blir produsert i en cellekultur, må DNA-konstruksj onene først set-tes inn i en enkel ekspresjonsvektor eller i to separate, men kompatible ekspresjonsvektorer, det siste er muligens mest foretrukket.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen også en ekspresjonsvektor som er i stand til å replikere i en prokaryot eller eukaryot cellelinje som omfatter minst ett av DNA-konstruksjonene som er beskrevet over.

Hver ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-konstruksj on blir deretter overført til en egnet vertsorganisme. Når DNA-konstruksj onene separat blir satt inn i to ekspresjonsvektorer, kan det blir overført separat, dvs. én type av vektor pr. celle, eller co-overført, hvor den siste er foretrukket. En egnet vertsorganisme kan være en bakterie, gjær eller en mammalsk cellelinje, hvor den siste er foretrukket. Mer foretrukket er den mammalske cellelinjen av lymfoid opprinnelse, dvs. et myelom, hybridom eller en nor-mal, immortalisert B-celle som ikke uttrykker noe endogent antistoff tung eller lett kjede.

For ekspresjon i mammalske celler er det foretrukket at IL-ip-bindingsmolekyl-kodende sekvens er integrert i vertcelle-DNA inne i et locus som tillater eller favoriserer høy-nivåekspresjon av IL-ip-molekylet. Celler hvori IL-ip-bindingsmolekyl-kodende sekvens er integrert inn i et slikt favoriserbart loci, kan identifiseres og selekteres på basis av nivåene til IL-ip-bindingsmolekylet som de uttrykker. En hvilken som helst egnet, selekterbar markør kan bli brukt for fremstilling av vertceller som inneholder IL-ip-bindingsmolekyl-kodende sekvens; f.eks. et dhfr-gen/metotrexat eller ekvivalent seleksjonssystem kan anvendes. Foretrukne systemer for ekspresjon av IL-1 p-bindingsmolekylet ifølge oppfinnelsen inkluderer GS-basert amplifisering/seleksjons-systemer, slik som de beskrevet i EP 0256055 B, EP 0323997 B og europeisk patentsøknad 89303964.4. Fortrinnsvis inneholder vektoren andre sekvenser som fremmer ekspresjon, prosessering og eksport av det uttrykte protein; f.eks. kan vektoren inneholde en ledersekvens assosiert med den kodende sekvensen.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en prosess for produktet av et IL-ip-bindingsmolekyl som omfatter (i) å dyrke en organisme som blir transformer med en ekspresjonsvektor som definert over, og (ii) gjenvinne i IL-1 P-bindingsmolekylet fra kulturen.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse har det blitt funnet at AAL 160-antistoffet har bindingsspesifisitet for det antigene epitopet fra human IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene, Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 av modent, humant IL-lp. (Residiene, Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 til modent, humant IL-lp som korresponderer til residiene 138, 139, 140 og 141 respektivt fra den humane IL-ip-forløper.) Dette epitopet ser ut til å være på utsiden av gjenkjenningssetet til IL-1-reseptoren og det er derfor mest overraskende at antistoffene til dette epitopet, f.eks. AAL 160-antistoffet, er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor. Antistoffene, spesielt kimære og CDR-transplanterte antistoffer, og spesielt humane antistoffer, som har bindingsspesifisitet for det antigene epitopet til det modne, humane IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene, Gly 22, Pro 23, Tyr24 og Glu 25 og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor; og anvendelse av slike antistoffer for fremstilling av et medikament for behandling av IL-1-formidlede sykdommer og forstyrrelser, er nye og er inkludert innenfor området av foreliggende oppfinnelse.

Følgelig inkluderer foreliggende oppfinnelse i et ytterligere aspekt et antistoff til IL-ip som har antigen-bindingsspesifisitet for et antigenepitop av IL-ip som inkluderer løk-ken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 av modent, humant IL-ip fra modent, humant IL-ip som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor.

Enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen inkluderer:

i) anvendelse av et antistoff til IL-1 p, som har antigen-bindingsspesifisitet for et antigenepitop fra modent, humant IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25, og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor, for behandling av en IL-1-formidlet sykdom eller forstyrrelse;

ii) en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff til IL-ip, som har antigen-bindingsspesifisitet for et antigenepitop fra modent, humant IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25, og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel eksipient, diluent eller bærer;

og

iii) anvendelse av et antistoff til IL-1 p som har antigen-bindingsspesifisitet for et antigent epitop av modent, humant IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 og som er i stand til å inhibere

bindingen av IL-ip til dets reseptor, for fremstilling av et medikament for behandlingen av en IL-1-formidlet sykdom eller forstyrrelse.

Foreliggende oppfinnelse kan benyttes i en fremgangsmåte for å behandle en IL-1-formidlet sykdom eller forstyrrelse hos en pasient som omfatter å administrere til pasienten en effektiv mengde av et antistoff til IL-ip, som har antigen-bindingsspesifisitet for et antigenisk epitop til modent, humant IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25, og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor;

For formålene ifølge den foreliggende oppfinnelse er beskrivelsen av et antistoff "i stand til å inhibere bindingen av IL-1 P" hvis antistoffet er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor som i det vesentlige har samme utstrekning som AAL 160-antistoffet, hvor "til samme grad" har betydningen som definert over.

I den foreliggende beskrivelsen omfatter betegnelsen "IL-1-formidlet sykdom", alle sykdommer og medisinske tilstander hvor IL-1 spiller en rolle, enten direkte eller indi-rekte, i sykdommen eller i medisinsk tilstand, som inkluderer årsaksforhold, utvikling, progresjon, vedholdenhet eller patologi for sykdommen eller tilstanden.

I den foreliggende beskrivelse refererer betegnelsene "behandling" eller "behandle" seg til både profylaktiske eller forebyggende behandling så vel som kurativ eller sykdoms-modifiserende behandling, som inkluderer behandling av pasient som har risiko for å kontrahere sykdommen eller er mistenkt å ha kontrahert sykdommen, så vel som pasi-entene som er syke eller har blitt diagnostisert til å lide av en sykdom eller medisinsk tilstand, og inkluderer suppresjon av klinisk tilbakefall.

Antistoffer som har bindingsspesifisitet for antigent epitop fra modent, humant IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-ip til dets reseptor, blir heretter referert til som antistoffer ifølge oppfinnelsen. Foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen er antistoffer som har bindingsspesifisitet for dette epitopet hos humant IL-ip, når det humane IL-ip er under nativ, f.eks. normale fysiologiske tilstander, men ikke under denaturerende tilstander, f.eks. ikke med tilstedeværelse av et denaturerende middel, slik som SDS. Anti stoffer ifølge oppfinnelsen kan kryssreagere med ikke-human IL-1(3, som har antigene epitoper som inkluderer Gly ved residiet 22, Pro ved residiet 23, Tyr ved residiet 24 og Glu ved residiet 25, og som er svært likt det korresponderende humane epitopet. F.eks. kan antistoffene ifølge oppfinnelsen kryssreagere med primat IL-ip, slik som rhesus-ape, cynomolgus-ape IL-1 eller marmoset-ape IL-1.

Fortrinnsvis er antistoffene ifølge oppfinnelsen IL-ip-bindingsmolekyler ifølge første og andre aspekter ifølge oppfinnelsen. Antistoffene ifølge oppfinnelsen er humane antistoffer, mest foretrukket AAL160-antistoff eller direkte ekvivalent derav.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen blokkerer effektene av IL-ip på dets målceller og kan derfor benyttes i behandlingen av IL-1-formidlede sykdommer og forstyrrelser. Disse og andre farmakologiske aktiviteter av antistoffene ifølge oppfinnelsen, kan vises i standardtestfremgangsmåten, f.eks. som beskrevet under: 1. Nøytralisering av humant IL-1 P-formidlet aktivering av IL-8-promoter Potensialet til å nøytralisere IL-ip-avhengig cellulære signaler blir bestemt i en reporter-genanalyse.

Den humane melanoma-cellelinjen G361 er stabilt transfektert med en luciferase-repor-tergenkonstruksjon basert på den humane IL-8-promoteren. Reporter-genekspresjonen og aktiviteten er avhengig av IL-ip eller TNFa i denne cellelinjen. Cellene blir stimulert med 300 pg/ml med rekombinant humant IL-ip eller ekvivalenten med 100 pg/ml i kondisjonert medium med tilstedeværelse av forskjellige konsentrasjoner av antistoff ifølge oppfinnelsen eller IL-l-reseptorantagonist, som varierer mellom 6 og 18000 pM. Det kimære antistoffet Simulect® (basiliximab) blir brukt som en matchende isotype-kontroll. Luciferase-aktiviteten blir kvantifisert i en kjemiilluminiscens-analyse. Antistoffer ifølge oppfinnelsen har IC50på omtrent 1 nM (f.eks. fra omtrent 0,2 til omtrent 5 nM) når den blir testet i denne analysen.

2. Nøytralisering av IL-1 P-avhengig produksjon av PGE2og interleukin-6 ved primære, humane fibroblaster

Produksjonen av PGE2og IL-6 i primære, humane, dermale fibroblaster er avhengig av IL-ip. TNFa alene kan ikke effektivt indusere disse inflammatoriske formidlerne, men ha en synerg med IL-1. Primære, dermale fibroblaster blir brukt som surrogatmodell for IL-1-indusert cellulær aktivering. Primære, humane fibroblaster blir stimulert med re kombinant IL-ip eller kondisjonert medium ervervet fra LPS-stimulerte, humane PBMC ved tilstedeværelse av forskjellige konsentrasjoner av antistoff ifølge oppfinnelsen, eller IL-IRA varierende fra 6 til 18000 pM. Det kimære anti-CD25-antistoffet Simulect® (basiliximab) blir brukt som matchende isotype-kontroll. Supernatanten blir tatt etter 16 timer med stimulering og analysert for IL-6 ved ELISA eller PGE2ved RIA. Antistoffene ifølge oppfinnelsen har IC50Sfor inhibering av IL-6-produksjon på omtrent 1 nM eller mindre (f.eks. fra omtrent 0,1 til omtrent 1 nM) og for inhibering av PGE2-produksjon på omtrent 1 nM (f.eks. fra omtrent 0,1 til omtrent 1 nM) når den blir testet som over.

Som indikert i de ovenfor nevnte analysene, blokkerer antistoffene ifølge oppfinnelsen effektene til IL-ip. Følgelig har antistoffene ifølge oppfinnelsen farmasøytisk utnyttelse som følger: Antistoffene ifølge oppfinnelsen er nyttige for profylakse og behandling av IL-1-for-midlede sykdommer eller medisinske tilstander, f.eks. inflammatoriske tilstander, allergier og allergiske tilstander, hypersensitivitetsreaksjoner, autoimmunsykdommer, alvorlige infeksjoner og organ- og vevstransplantatavstøtning.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan f.eks. anvendes for behandling av resipienter av hjerte, lunge, kombinert hjerte-lunge, lever, nyre, bukspyttkjertel, hud eller corneal-tran-splantater og for å forebygge transplantatavstøtningssykdom ("graft-versus-host disease"), slik som etter en benmargstransplantasjon.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige og kan anvendes i behandling, forebygging eller bedre autoimmun sykdom og inflammatoriske tilstander, spesielt inflammatoriske tilstander med en etiologi som inkluderer en autoimmun komponent, slik som artritt (f.eks. rheumatoid artritt, artritt chronica progediente og artriitt deformans), og reumatiske sykdommer som inkluderer inflammatoriske tilstander og reumatiske sykdommer som involverer bentap, inflammatorisk smerte, hypersensitivitet (som inkluderer både luftveishypersensitivitet og dermal hypersensitivitet) og allergier. Spesifikke autoimmune sykdommer for hvilke antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes, inkluderer autoimmune hematologiske sykdommer (som inkluderer f.eks. hemolytisk anemi, aplastisk anemi, rene røde celle-anemi og ideopatisk trombocytopeni), systemisk lupus erytematosus, polykondritt, sclerodom, Wegener granulomatosis, dermatomyositt, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrom, ideopatisk sprue, autoimmun inflammatorisk tarmsykdom

(som inkluderer f.eks. ulcerativ colit, Crohns sykdom og irritabel Bowel syndrom), endokrin oftalmopati, Graves sykdom, sarkoidosis, multippel sklerose, primær gallecirrhose, juvenil diabetes (diabetes mellitus type I), uveitis (anterior og posterior), kertoconjunctivit sicca og vernal keratoconjunctivit og, interstitiell lungefibrose, psoriasis artritt og glomerulonephritt (med og uten nephrotisk syndrom, f.eks. som inkluderer idiopatisk nephrotisk syndrom eller minimalendrings nephropati).

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i behandling, forebygging og forbedring av astma, bronkitt, pneumokoniose, lungeemfysem og andre obstruktive eller inflammatoriske sykdommer i luftveiene.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i behandling av uønskede akutte og hyperakutte inflammatoriske reaksjoner som er formidlet av IL-1 eller involvere IL-1-produksjon, spesielt IL-ip, eller fremme TNF-frigjøring ved IL-1, f.eks. akutte infeksjoner, f.eks. septisk sjokk (f.eks. endotoksisk sjokk og voksen respiratorisk "distress"-syndrom), meningitt, pneumoni; og alvorlige forbrenninger; og for behandling av kakeksi eller "wasting"-syndrom assosiert med morbid TNF-frigivelse, konsekvenser av infeksjoner, cancer eller organdysfunksjon, spesielt AIDS-relatert kakeksi, f.eks. assosiert med eller en konsekvens av HIV-infeksjon.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å behandle sykdommer med ben-metabolisme som inkluderer osteartritt, osteoporose og andre inflammatoriske artritides, og bentap generelt som inkluderer aldersrelatert bentap, og spesielt periodontal sykdom.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli brukt for behandling av cancere, spesielt IL-1-avhengige tumorer.

For disse indikasjonene vil selvfølgelig den egnede dosen variere, f.eks. på grunnlag av det spesielle antistoffet ifølge oppfinnelsen som anvendes, verten, måten for administrering og egenskapene og alvorlighetsgraden til tilstanden som blir behandlet. For profylaktisk anvendelse vil imidlertid tilfredsstillende resultater generelt erverves ved daglige doser fra omtrent 0,1 mg til omtrent 5 mg pr. kg kroppsvekt. Antistoff ifølge oppfinnelsen kan administreres parenteralt, intravenøst, f.eks. inn i antecubital eller andre perifere vener, intramuskulært eller subkutant. En profylaktisk behandling omfatter å administrere molekylet ifølge oppfinnelsen én gang daglig til én gang i uken i 2 til 4 uker. Farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på konvensjonelle måter. Sammensetningen ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis tilveiebrakt i lyofilisert form. For umiddelbar administrering blir den løst i en egnet vandig bærer, f.eks. sterilt vann for injeksjon, eller sterilt buffret, fysiologisk saltvann. Hvis det er ønskelig å fremstille en løsning med større volum for administrering ved infusjon, f.eks. iv-infusjon, heller enn en bolusinjeksjon, f.eks. en subkutan bolusinjeksjon, er det fordelaktig å in-korporere humant serumalbumin eller pasientens eget heparinisert blod i saltvannet på tidspunktet for formuleringen. Tilstedeværelse av et overskudd av slikt fysiologisk, inert protein hindrer tap av antistoff ved absorpsjon til veggene i beholderen og røret som brukes ved infusjonsløsning. Hvis albumin blir brukt, er en egnet konsentrasjon fra 0,5 til 4,5 vektprosent med saltvannsløsning.

Oppfinnelsen blir ytterligere beskrevet ved følgende eksempler som refererer til vedlagte figurer: Fig. 1 er en graf som viser konkurranse-inhibering av AAL160-binding til IL-ip ved lø-selig IL-1-type I og type II-reseptorer; Fig. 2 er en graf som viser inhibering av IL-ip-indusert feber i en rottemodell ved AAL 160, og Fig. 3 er en graf som viser varighet av virkningen til AAL160 i rotte-IL-ip-indusert feber.

EKSEMPLER

Transgene mus genmodifiserte for å uttrykke IgG/x-repertoiret i stedet for murint immunoglobulint repertoire (Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851) blir brukt for å fremstille antistoffer til humant IL-ip. B-cellene fra disse musene blir immortalisert ved standard hybridomteknologi og murine hybridom-celler erverves, som sekreterer det humane IgGl/x-antistoffet AAL160.

Eksempel 1: Fremstilling av hybridom og rensning av antistoff

Genetisk modifiserte mus 66 (Medarex Inc. Annadale, NJ) blir immunisert med rekombinant IL-ip (50 ug) subkutant på flere steder i adjuvant. Musene blir boosted fem ytterligere ganger med den siste injeksjonen tre dager før fusjon. På dagen for fusjonen blir mus 66 drept ved C02-inhalasjon og miltcellene (4,1 x IO<7>) blir fusert ved en ruti-nemetode ved å bruke PEG 4000 med et likt antall av PAI-O-celler, en musemyelom-cellelinje. Fuserte celler blir platet ut på en 624 brønner (1 ml/brønn) som inneholder et "forings"-lag av museperitoneale celler (Balb C-mus), i HAT supplert RPMI 1640,10% varmeinaktivert føtalt kalveserum 5 x 10"<5>M p-merkaptoetanol. Supernatantene blir samlet og testet i ELISA og screenet for IL-ip-reaktive monoklonale antistoffer. Fem monoklonale antistoffer fra IgG/^-subklassen blir identifisert. Kloningen utføres ved å bruke 4 x 96 brønners mikrotiterplater, hvor en plater 0,5 celler pr. brønn. Etter to uker blir brønnene inspisert med et invertert mikroskop. Supernatanten blir samlet fra brøn-nene positive for vekst og produksjon av anti- IL-1 p-monoklonale antistoffer blir evalu-ert med ELISA. 1-2L av kondisjonert supernatant fra fire subkloner av den i utgangs-punktet identifiserte hybridoma # 476 blir preparert og antistoffene renset ved affinitets-kromatografi på en protein A-kolonne.

Rensning og partiell aminosyresekvenser av tung- og lett-kjede aminosyresekven-sering

Lette og tunge kjeder av det rensede antistoffet AAL 160 blir separert ved SDS-PAGE og de amino-terminale aminosyrene bestemt ved Edman degradering. Renheten til antistoffet som brukes i disse studiene er >90 % ved sekvensering. cDNA-sekvensene som koder for de tunge og lette kjedevariable domenene blir ervervet ved PCR-amplifisering av cDNA ervervet fra mRNA fra de klonede hybridomcellene og fullstendig sekvensert. Amino-terminale sekvenser av tunge og lette kjedevariable domener og korresponderende DNA-sekvenser er gitt under, hvor CDR blir vist med uthevet skrift. DNA-sekvensene som koder for de tunge og lette kjedevariable domenene og korresponderende aminosyresekvenser for AAL 160 er også gitt i de vedlagte sekvenslistene som Seq.Id. numrene 1 til 4.

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer for tung og lett kjede

De klonede Vlog Vh kodende sekvenser ble amplifisert ved PCR og satt inn via egnede restriksjonsseter inn i kasett-vektorene som tilveiebringer immunoglobulinpromoteren, ledersekvensene fra RFT2-antistoffer (Heinrich et al., (1989) J.Immunol. 143, 3589-97), del av J-segmentene og et spleiset donorsete. Den lette kjede-kassetten som inneholder den fullstendige VL-regionen, promoter og ledersekvens for ekspresjon ble overført til en ekspresjonsvektor som inneholdt det humane Ck-genet, immunoglobulin tung kjede-enhancer, og den modifiserte murine dhfr cDNA for seleksjon ved metotrexat (MTX). Tungkjedekassetten ble overført i en ekspresjonsvektor som koder for det humane IgGl-genet, immunoglobulin tungkjede-enhanceren og neomycin-resistensgenet for seleksjon.

Både den tunge og lette kjeden er i konfigurasjon i ekspresjonsvektorene som ligner den genomiske konfigurasjonen av rearrangert immunoglobulingener som man tror er viktig for høynivå-ekspresjon.

For antistoffproduksjon blir de ovenfor nevnte vektorene også ko-transfektert inn i en egnet vertscellelinje, f.eks. SP2/0-cellelinjen, cellene som inneholder vektorsekvensene blir selektert ved metotrexat-seleksjon, og utvalgte cellelinjer blir dyrket for å uttrykke AAL160-antistoff. Alternativt kan et GS-basert amplifisering/seleksjonssystem slik som den beskrevet i EP 0256055 B, EP 0323997 B eller europeisk patentsøknad 89303964.4 anvendes, i dette tilfellet er dhfr-selekterbar markør erstattet av en GS-kodende sekvens.

Eksempel 2: Biokjemiske og biologiske data

Det monoklonale antistoffet AAL 160 er funnet å nøytralisere aktiviteten til interleukin-ip in vitro. Det monoklonale antistoffet er ytterligerekarakterisertfor dets binding til rekombinant humant IL-ip Biacore-analyse. Metoden for nøytralisering blir vurdert ved konkurrende bindingsstudier ved løselige IL-1-reseptor. Den biologiske aktiviteten til antistoffet AAL160 mot rekombinant og naturlig IL-ip, blir bestemt i primære, humane celler (eksempel 3), som responderer på stimulering av IL-ip.

2.1 Bestemmelse av dissosierings-ekvilibreringskonstant

Assosiering og dissosierings-ratekonstanten for bindingen av rekombinant, humant IL-ip til AAL160 ble bestemt av BIAcore analyse. AAL160 ble immobilisert, og bindingen av rekombinant IL-ip i et konsentrasjonsområde fira 0,5 til 12 nM ble målt ved overflate plasmonresonans. Det valgte formatet tillater behandling av bindingshendelsen av IL-ip til AAL160 ifølge en l:l-støkiometri. Data-analyse ble utført ved å bruke BIAevaluation software.

AAL 160 bindes til rekombinant, humant IL-ip med en høy affinitet.

2.2 Konkurrerende inhibering av binding til løselig IL-l-reseptorer

Bindingskonkurransestudiet med løselig IL-1 type I og II-reseptorer

Konkurranse mellom AAL 160 og løselig, human IL-1 type I og II-reseptorer ble målt Biacore. AAL 160 ble immobilisert på "chip"-overflaten og rekombinant, human IL-ip (8 nM) ble injisert på binding til AAL 160 ved fravær eller tilstedeværelse av økende konsentrasjoner av rekombinant, humant løselig reseptor I (0 - 10 nM) eller reseptor II (0 - 80 nM). Resultatene som ble ervervet er vist i fig. 1. Binding av NVP AAL 160 NX-1 til IL-ip er konkurrerende ved både IL-l-resptor type I og type II.

2.3 Reaktivitetsprofil mot humant IL-1 a, humant IL-1RA og IL-ip fra gnagere

og apearter

Reaktivitetsprofilen til AAL160 mot humant IL-la, IL-IRA og murine, rotte, kanin og cynomolgus-ape IL-ip er bestemt ved Biacore-analyse. AAL 160 ble mobilisert, og cytokinene som ble undersøkt ble anvendt i en konsentrasjon på 8 nM (eller 20 nM når det gjelder IL-lp).

AAL160 gir ingen signifikant kryssreaksjon med human IL-la, human IL-1RA, eller murine, rotte eller kanin IL-ip. Reaktiviteten mot cynomolgus-ape IL-ip er praktisk talt identisk med det humane cytokinet.

Eksempel 3: Nøytralisering av IL-ip-avhengig produksjon av PGE2og

interleukin-6 ved primære humane fibroblaster.

Produksjonen av PGE2og IL-6 i primære, humane dermale fibroblaster er avhengig av IL-ip. TNF-a alene kan effektivt indusere disse inflammatoriske mediatorene, men har synergi med IL-1. Primære, dermale fibroblaster blir brukt som en surrogatmodell for IL-1-indusert cellulær aktivering.

Primære, humane fibroblastere blir stimulert med rekombinant IL-ip eller kondisjonert medium ervervet fra LPS-stimulerte humane PBMC ved tilstedeværelse av forskjellige konsentrasjoner av AAL160 eller IL-1RA, varierende fra 6 til 18000 pM. Det kimære anti-CD25 antistoffet Simulect® blir brukt som en matchende isotype-kontroll. Supernatanten blir tatt 16 timer etter stimuleringen, og blir analysert for IL-6 med ELISA eller PGE2med RIA.

AAL 160 blokkerer effektivt produksjonen av IL-6 og PGE2i humane, dermale fibroblaster med en IC50lik for både det rekombinante og naturlige IL-ip.

Eksempel 4: In vivo-effektivitet og varighet av virkningen av AAL160

Effektivitet:

In vivo-effektiviteten til anti-huIL-ip-antistoff, AAL160 ble testet gjennom en rottemodell hvor feber blir indusert ved en iv-injeksjon av huIL-ip (100 ng/rotte). Antistoffet forårsaker en dose relatert inhibering av feberresponsen i et doseområde på 1, 3 og 10 ug/kg intravenøst (n = 6 rotter) - se fig. 2. CHI621 (Simulect® , basiliximab) blir brukt som kontrollantistoffet.

Varighet av virkning:

Varigheten av virkningen til AAL160 ble undersøkt i rotte- IL-ip-indusert feber som følger: Antistoffet blir injisert intravenøst enten 24 timer eller 30 minutter (standard protokoll) før induksjon av feber ved en intravenøs injeksjon av humant IL-ip, og kroppstemperaturen målt 2 og 4 timer senere. En lik grad av inhibering av feberresponsen ses ved begge tider (se fig. 3). Som forventet, er kontroll-antistoffet CHI621 (Simulect®, basiliximab) ikke effektivt ved begge tidspunkter. Dette funnet indikerer at AAL 160 humant antistoff er tilstede i en aktiv form i minst 24 timer i rotten, og blir ikke metabolisert, utskilt eller bundet i vevet i dette tidsrommet.

Eksempel 5: Røntgenstudier av AAL160 Fab og dets kompleks med IL-ip-struk-turbestemmelser av AAL160 Fab ved 2,0Å oppløsning: Et 2,0Å oppløsningsdata-sett av svært god kvalitet (Rsym=0,051, fullstendiggjøring = 99,9%, overskudd (redundancy) = 8,2) ble samlet fra en Fab-krystall dyrket ved damp-diffusjon "hanging drop"-teknikk ved pH 9,5 i 50% PEG 200, 0,1 M CHES. Krystallen var i "space"-gruppe P2i2i2imed enhet-celledimensjoner a = 62,17Å b=89,83Å c=123,73Å og ett Fab-molekyl pr. symmetrisk enhet (Matthew koeffisient: 3,6Å<3>/Da, estimert oppløsningsinnhold: 66%). Strukturen ble bestemt ved molekylær erstatning og ble foredlet til en sluttkrystallografisk R-faktor på 0,209 (fri R-faktor = 0,261). Slutt-modellen inkluderer residiene 1 - 213 på den lette kjeden, 1 - 131 og 138 - 218 på den tunge kjeden, 387 vannmolekyler og 1 PEG-molekyl. Slutt-elektrontettheten er godt definert for alle CDR-residier unntatt Trp 94 (CDR3) fra den lette kjeden. Posisjonen til sidekjeden til denne residien er ikke godt definert i de to krystallformene som har blitt undersøkt til dags dato, skjønt den foreslår at den er svært mobil ved fravær av et bundet antigen.

Krystallisering av Fab-komplekset med IL-ip og preliminær eksperimentell modell av komplekset: noen få krystaller fra AAL 160 Fab i kompleks med antigenet IL-ip ble ervervet fra en 76 mg/ml stokkløsning fra l:l-komplekset i 2,0 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris pH 8,5. Krystallene vokste svært langsomt i en tidsperiode på flere uker. De dif-frakterte svakt til omtrent 3,2Å på hjemmekilden. Preliminære datasett ble samlet og molekylærerstatning ble utført ved å bruke høy-resulosjonsstrukturer til det frie Fab og til humant IL-lp (J.P. riestle et al, EMBO J. 7,339 (1988)) som utgangsmodeller. Be-regningene ga en svært klar og utvetydig løsning når Fv og Fc-delene på Fab ble brukt som separate moduler (korrelasjon 67,1%, R-faktor 0,354 etter "AMORE FITTING"-trinn, ved å bruke data mellom 8,0 og 3,5Å). Den etterfølgende sammenligningen av de frie og bundne former av Fab viste at albuevinkelen er svært forskjellig i de to struktu-rene. Resultatene av de molekylære erstatningsberegningene tilveiebrakte en første molekylær modell av interaksjonene mellom antigenet IL-ip og det monoklonale antistoffet AAL160. En preliminær analyse av disse interaksjonene indikerer at 1) IL-ip utgjør tette interaksjoner med alle tre CDR til den tunge kjeden og til CDR3 på den lette kjeden. I motsetning involverer få interaksjoner, hvis noen i det hele tatt, CDR1 og CDR2 på den lette kjeden. 2) Løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 fra modent IL-ip bindes til senteret for antigen-kombinerende sete, og ser derved ut til å være en nøkkelkomponent i epitopet. Denne løkken er ikke lokalisert til regionen til molekylet som er forskjellig fra de fleste muse- IL-ip. Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 er kon-servert, men residiet 22 er en Gly i human IL-1 p, og en Asp i muse- IL-ip. Sammenlig-ning av krystallstrukturene til humant (PDB entry 2ilb) og muse- IL-ip (PDB entry 8ilb) viser at denne punktmutasjonen resulterer i en svært forskjellig konformasjon i hovedkjeden rundt Pro 23. Denne lokale, strukturelle forskjellen er konsistent med den observerte mangelen på kryssreaktivitet hos AAL160 når det gjelder musecytokine.

Claims

1. Antistoff til IL-1 p,karakterisert vedat det har antigen-bindingsspesifisitet for et antigen-epitop til det modne humane IL-ip som inkluderer løkken som omfatter residiene Gly 22, Pro 23, Tyr 24 og Glu 25 og som er i stand til å inhibere bindingen av IL-1 p til dets reseptor og hvori IL-1 p bindingsmolekylet omfatter et antigen -bindingssete som omfatter minst ett immunoglobulin tungkjede variabelt domene (Vh) som omfatter i sekvenshypervariable regioner CDR1, CDR2 og CDR3 som vist i SEKV ID NR 1, det vil si at nevnte CDR1 har aminosyresekvensen Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, nevnte CDR2 har aminosyresekvensen Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly, og nevnte CDR3 har aminosyresekvensen Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile og hvori IL-ip-bindingsmolekylet omfatter et antigenbindingssete som omfatter minst ett immunoglobulin lett kjedevariabelt domene (Vl) som omfattes i sekvenshypervariable regioner CDR1', CDR2' og CDR3' som vist i SEKV ID NR 2, det vil si at nevnte CDR1' har aminosyresekvensen Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, nevnte CDR2' har aminosyresekvensen Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr, og nevnte CDR3' har aminosyresekvensen Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro.

2. IL-ip-bindingsmolekyl ifølge krav 1,karakterisertv e d at det er et humant antistoff.

3. IL-ip-bindingsmolekyl ifølge et hvert av kravene 1-2,karakterisert vedat det anvendes som et medikament.

4. Anvendelse av IL-ip-bindingsmolekylet ifølge ethvert av kravene 1 - 2 for fremstilling av et medikament for forebygging av eller behandling av IL-1-mediert sykdom eller forstyrrelser, akutte og hyperakutte inflammatorisk reaksjoner, akutte infeksjoner, septisk sjokk, endotoksisk sjokk, voksenrespiratorisk "distress" syndrom, meningitt, lungebetennelse og alvorlige forbrenninger, kakeksi eller "wasting" syndrom, cancer, organdysfunksjon, AIDS-relatert kakeksi eller for forebygging eller behandling av inflammatoriske tilstander, allergier og allergiske tilstander, hypersensitive reaksjoner, autoimmune sykdommer, alvorlige infeksjoner, organ- eller vevstransplantatsavstøtning, autoimmun sykdom, artritt, rheumatorid artritt, fremskreden kronisk artritt, deformativ artritt, reumatiske sykdommer, inflammatoriske smerter, hypersensitivitet, luftveishypersensitivitet, hudhypersensitivitet, allergier, autoimmune hematologiske sykdommer, hemolytisk anemi, aplastisk anemi, genuin rødcelleanemi og idiopatisk trombocytopeni, systemisk lupuserythematose, polykondritt, sklerodoma, Wegener ganulomatose, dermatomyositis, kronisk aktiv hepatitt, myasthenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndrom, idiopatisk "sprue", autoimmun inflammatorisk tarmsykdom, ulkerøs kolitt, Crohns sykdom, irritabel Bowel-syndrom, endokrin oftalmopati, Graves sykdom, sarcoidosis, multippel sklerose, primær gallecirros, juvenil diabetes, diabetes mellitus type I, uveititt (anterior og posterior), keratokonjunktiv sicca, vernal keratoconjunctivitt, interstitiell lungefibrose, psoriatrisk artritt og glomerulonefritt, idiopatisk nefrotisk syndrom, minimal "change" neuropati, astma, bronkitt, pneumoconiosis, lungeemfysem og andre obstruktive eller inflammatoriske sykdommer i luftveiene, sykdommer i benmetabolismen, osteoartritt, osteoporose, andre inflammatoriske artritter, generelt bentap, aldersrelatert bentap, periodental sykdom, cancer og IL-1-avhengige tumorer.

5. En første DNA-konstruksj on som koder for en tung kjede eller fragment derav,karakterisert vedat det omfatter v) en første del som koder for et variabelt domene som omfatter en alternativ rammestruktur og hypervariable regioner, hvor nevnte hypervariable regioner er i sekvens CDR1, CDR2 og CDR3, aminosyresekvensene som er vist i SEKV ID NR 1, denne første delen starter med et codon som koder for den første aminosyren til det variable domenet og ender ved et codon som koder for den siste aminosyren til det variable domenet, og vi) en andre del som koder for en tung kjedekonstant del som starter med et codon som koder for den første aminosyren til den konstante delen av den tunge kjeden, og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren i den konstante delen, etterfulgt av et stoppcodon, og en andre DNA-konstruksj on som koder for en lett kjede som omfatter vii) en første del som koder for et variabelt domene som omfatter en alternativ rammestruktur og hypervariable regioner; hvor nevnte hypervariable regioner er CDR3' og eventuelt CDR1' og CDR2', hvis aminosyresekvenser er vist i SEKV ID NR 2, hvor første del starter med et codon som koder for den første amino syren til det variable domenet og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren til det variable domenet, og viii) en andre del som koder for en lett kjedekonstant del, som starter med et codon som koder for den første aminosyren til den konstante delen i den lette kjeden og slutter med et codon som koder for den siste aminosyren i den konstante delen etterfulgt av et stoppcodon.

6. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den er i stand til å replikere i en prokaryot eller eukaryot cellelinje som omfatter DNA-konstruksj onene ifølge krav 5.

7. Fremgangsmåte for produksjon av IL-1 p-bindingsmolekyl,karakterisert vedat den omfatter i) å dyrke en organisme som er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 6, og (ii) gjenvinne IL-ip-bindingsmolekylet fra kulturen.

8. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et antistoff til IL-1 p i følge krav 1 i kombinasjon med et farmasøytisk hjelpestoff, fortynningsmiddel eller bærer.