NO326561B1

NO326561B1 - Isolert polynukleotid som koder for et polypeptid med samme biologiske aktivitet som Zcyto10, isolert polypeptid og antistoff.

Info

Publication number: NO326561B1
Application number: NO20002698A
Authority: NO
Inventors: Darrell C Conklin; Betty A Haldeman; Angelica Grossman
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2009-01-12
Also published as: DE69824755T2; EP1032671B1; EP1719780A3; HUP0100436A2; NO20074516L; ES2218872T3; EP1032671A1; UA86350C2; EP1424393A3; JP5191619B2; NZ504751A; CZ20001910A3; EA010741B1; JP2010187698A; UA73275C2; EP1719780A2; ATE269902T1; AU1607799A; DK1032671T3; EA005581B1

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Proliferasjon og differensiering av celler i multi-cellulære organismer kontrolleres av hormoner og polypeptid-vekstfaktorer. Disse diffunderbare molekyler tillater celler å kommunisere med hverandre og virke sammen for dannelse av celler og organer, og å reparere og regenerere skadd vev. Eksempler på hormoner og vekstfaktorer omfatter steroid-hormonene (f.eks. østrogen, testosteron), paratyreoidhormon, follikkelstimulerende hormon, interleukinene, blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), epidermal vekstfaktor (EGF), granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), erytropoietin (EPO) og kalsitonin.

Hormoner og vekstfaktorer påvirker cellens meta-bolisme ved å bindes til proteiner. Proteinene kan være integrerte membranproteiner som er koblet til signaloverførings-veier i cellen, f.eks. sekundære budbringersystemer. Andre proteinklasser er løselige molekyler.

Av spesiell interesse er cytokinene, molekyler som fremmer proliferasjonen og/eller differensieringen av celler. Eksempler på cytokiner omfatter erytropoietin (EPO), som stimulerer utviklingen av røde blodceller, trombopoietin (TPO), som stimulerer utvikling av celler av megakaryocytt-linjen, og granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF), som stimulerer utvikling av nøytrofile celler. Disse cytokinene er anvendbare for å gjenvinne normalt blodcellenivå hos pasienter som lider av anemi eller som gis kjemoterapeujtisk behandling for cancer. De påviste in vivo-aktivitetene av disse cytokiner illustrerer det enorme kliniske potensial av og behov for andre cytokiner, cytokinagonister og cytokin-antagonister.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot dette behov ved å tilveiebringe et nytt polypeptid og beslektede preparater og fremgangsmåter.

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert polynukleotid som koder for et polypeptid, kjennetegnet ved at polypeptidet er minst 80% identisk med ett eller flere av polypeptidene utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR.:2, SEKV.ID. NR:4,. SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35, der polypeptidet har samme biologiske aktivitet som ZcytolO som definert ifølge SEKV.ID. NR:2 .

Også omfattet av oppfinnelsen er isolert polypeptid, kjennetegnet ved at det er minst 80% identisk med ett eller flere polypeptider utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35,der polypeptidet har samme biologiske aktivitet som ZcytolO som definert ifølge SEKV.ID. NR:2 .

Oppfinnelsen omfatter også antistoff, kjennetegnet ved at det selektivt bindes til et polypeptid utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34, SEKV.ID. NR:35, SEKV.ID. NR:14, SEKV.ID. NR:15, SEKV.ID. NR:16, SEKV.ID. NR:17, SEKV.ID. NR:21, SEKV.ID. NR:22, SEKV.ID. NR:23, SEKV.ID. NR:24, SEKV.ID. NR:27, SEKV.ID. NR:28, SEKV.ID. NR:29, SEKV.ID. NR:30, SEKV.ID. NR-.31 og SEKV.ID. NR:32.

I én utførelse beskrives et isolert polynukleotid som koder for et cytokin med fire alfa-helikser fra pattedyr, betegnet ZcytolO. Det humane ZcytolO-polypeptid består av en sekvens på 176 aminosyrer med den innledende Met som vist i SEKV.ID. NR:1 og SEKV.ID. NR:2. Det antas at aminosyrerestene 1-24 utgjør en signalsekvens og at det modne ZcytolO-polypeptid utgjøres av aminosyresekvensen som består av sekvensen fra aminosyrerest 25, et leucin, til aminosyrerest 176, en glutaminsyrerest, også definert ved SEKV.ID. NR:12. En annen utførelse defineres av sekvensene i SEKV.ID. NR:3 og SEKV.ID. NR:4. Polypeptidet i SEKV.ID. NR:4 utgjøres av 151 aminosyrerester hvori aminosyrene 1-24 utgjør en signalsekvens, og hvor den modne sekvens utgjøres av aminosyrerestene 25, et leucin, til aminosyrerest 151, en glutaminsyre, også definert ved-SEKV.ID. NR:13. En annen aktiv variant utgjøres av sekvensen fra aminosyrerest 33, et cystein, til aminosyrerest 176 i SEKV.ID. NR:2. Denne variant er også definert ved SEKV.ID. NR:26.

Muse-ZcytolO ér også et polypeptid som består av 176 aminosyrerester som definert ved SEKV.ID. NR:18 og 19. Muse-ZcytolO har en signalsekvens som strekker seg fra aminosyrerest 1, et metionin, til og med aminosyrerest 24, et glysin i SEKV.ID. NR:19. Således strekker det modne muse-ZcytolO seg fra aminosyrerest 25, et leucin, til og med aminosyrerest 176, et leucin i SEKV.ID. NR:19, også definert ved SEKV.ID. NR:20. En annen, aktiv variant antas å strekke seg fra aminosyre 33, et cystein, til og med aminosyre 176 i SEKV.ID. NR:19. Denne variant defineres også ved SEKV.ID. NR:25. I ytterligere en utførelse omfatter polypeptidet i tillegg en affinitetsmerkelapp.

En variant av imise-ZcytoIO defineres ved SEKV.ID. NR:33 og 34. Denne variant er 154 aminosyrerester lang og har en signalsekvens som strekker seg fra aminosyrerest 1, et metionin, til og med aminosyrerest 24, et glysin, i SEKV.ID. NR:34. Således strekker den modne sekvens seg fra aminosyrerest 25, et leucin, til og med aminosyrerest 154, et leucin i SEKV.ID. NR:34. Den modne sekvens er også definert ved SEKV.ID. NR:35.

I en annen utførelse beskrives en ekspresjonsvektor som omfatter (a) en transkripsjonspromoter, (b) et DNA-segment.som koder for ZcytolO-polypeptid, og (c) en transkripsjonsterminator hvori promoteren, DNA-segmentet og terminatoren er operativt sammenkoblet.

I en tredje utførelse beskrives en dyrket eukaryot eller prokaryot. celle i hvilken en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor, er innført, hvori cellen uttrykker et polypeptid som kodes av DNA-segmentet.

I ytterligere en utførelse beskrives et kimært polypeptid som i det vesentlige består av en første del og en andre del sammenkoblet med en peptidbinding. Den første del av det kimære polypeptid består i det vesentlige av (a) et ZcytolO-polypeptid som vist i SEKV.ID. NR:2, (b) alleliske varianter av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR: 13, SEKV.ID. NR: 19, SEKV.ID. NR-.20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 eller SEKV.ID. NR:35, og (c) proteinpolypeptider som er minst 90% identiske med (a) eller (b). Den andre del av det kimære polypeptid består i det vesentlige av et annet polypeptid, f.eks. en affinitetsmerkelapp. I én utførelse er affinitetsmerkelappen et immunoglobulin Fc-polypeptid. Oppfinnelsen tilveiebringer også ekspresjonsvektorer som koder for de kimære polypeptider og vertsceller som er transfektert slik at de produserer de kimære polypeptidene.

I ytterligere en utførelse beskrives et antistoff som spesifikt bindes til et ZcytolO-polypeptid som beskrevet ovenfor, og også et antiidiotypisk antistoff som nøytrali-serer antistoffet mot et ZcytolO-polypeptid.

I en annen utførelse beskrives et farmasøytisk preparat som omfatter renset ZcytolO-polypeptid i kombinasjon med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff. Slike preparater kan være anvendbare for modulering av celleproliferasjon, celledifferensiering eller cytokinproduksjon for forebyggelse eller behandling av tilstander som særpreges ved ukorrekt celleproliferasjon, celledifferensiering eller cytokinproduksjon, som diskutert videre heri. Nærmere bestemt kan ZcytolO-polypeptid være anvendbart for forebyggelse eller behandling av autoimmunsykdommer ved at en cellulær immun-respons inhiberes. Autoimmunsykdommer som kan være følsomme overfor ZcytolO-behandling, omfatter IDDM, multippel sklerose, reumatoid artritt og lignende. Videre kan ZcytolO-polypeptider være anvendbare for inhibering av cancer-cellevekst eller cancercelleproliferasjon.

ZcytolO-polypeptider kan også stimulere immun-systemet slik at det bedre kan bekjempe mikrobielle infek-sjoner eller virusinfeksjoner. Nærmere bestemt kan ZcytolO tilføres systemisk for å øke produksjonen av blodplater i et individ. Videre kan ZcytolO-polypeptider benyttes i trakéa-spesifikke eller trakeobronkialspesifikke anvendelser, f.eks. for opprettholdelse av eller sårreparasjon i det trakeo-bronkiale epitel eller i celler som ligger under dette, for regulering av slimproduksjon eller mukociliar fjerning av debris, eller ved behandling av astma, bronkitt eller andre sykdommer i trakeobronkialkanalen. Peptidet kan også fremme sårheling og regenerering av påvirket vev, noe som kan være spesielt anvendbart ved behandling av periodontal sykdom.. Videre kan ZcytolO-polypeptider benyttes for behandling av hudt Ustander, f .eks. psoriasis, eksem og tørr hud generelt.

Ytterligere en utførelse gjelder et peptid eller polypeptid som har aminosyresekvensen til en epitopbærende del av et ZcytolO-polypeptid med en aminosyresekvens som beskrevet ovenfor. Peptider eller polypeptider med aminosyresekvensen til en epitopbærende del av et ZcytolO-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter deler av slike polypeptider med minst 9, fortrinnsvis minst 15 og mer foretrukket minst 30 til 50 aminosyrer, selv om epitopbærende polypeptider av enhver lengde opp til og innbefattet den fullstendige aminosyresekvens til et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som beskrevet ovenfor, også omfattes av foreliggende oppfinnelse. Også med i kravene er ethvert av disse polypeptider som er koblet til et annet polypeptid eller bærermolekyl. Slike epitopvarianter omfatter, men er ikke begrenset til, SEKV.ID. NR:25-32. Antistoffer.fremstilt fra disse epitopbærende deler av ZcytolO, kan benyttes for rensing av ZcytolO fra celledyrkningsmedium.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Læren til alle referanser som siteres heri, inkorporeres i sin helhet ved referanse.

Før oppfinnelsen beskrives i detalj, kan det være nyttig for forståelsen av den å definere følgende begreper: Begrepet "affinitetsmerkelapp" benyttes heri for å beskrive et polypeptidsegment som kan kobles til et annet polypeptid for å fremme rensing eller påvisning av det andre polypeptid eller tilveiebringe seter for tilkobling av det andre polypeptid til et substrat. Prinsipielt kan ethvert peptid eller protein for hvilket et antistoff eller et annet spesifikt bindende middel er tilgjengelig, benyttes som en affinitetsmerkelapp. Affinitetsmerkelapper omfatter et polyhistidinstrekk, protein A, Nilsson et al., EMBO J. 4:1075

(1985), Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991), glutation S-transferase, Smith og Johnson, Gene 57:31 (1988), Glu-Glu-affinitetsmerkelapp, Grussenmeyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:7952-4 (1985), substans P, "Flag"-peptid, Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988), streptavi-dinbindende peptid eller en annen antigen epitop eller et bindingsdomene. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991). DNA som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelige fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Begrepet "allelisk variant" benyttes heri for å betegne enhver av to eller flere alternative former av et gen som sitter i det samme kromosomale lokus. Allelisk variasjon oppstår naturlig ved mutasjon og kan føre til fenotypisk polymorfi i populasjoner. Genmutasjoner kan være tause (ingen endring i det kodede polypeptid), eller de kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet allelisk variant benyttes også heri for å betegne et protein som kodes av en allelisk variant av et gen.

Begrepene "aminoterminal" og "karboksylterminal" benyttes heri for å betegne posisjoner i polypeptider. Dersom sammenhengen tillater det, benyttes disse begreper med henvisning til en gitt sekvens eller en del av et polypeptid for å betegne nærhet eller relativ posisjon. For eksempel ligger en gitt sekvens som er plassert karboksylterminalt for en referansesekvens i et polypeptid, proksimalt til karboksyl-enden av referansesekvensen, men ikke nødvendigvis i kar-boksylenden av det fullstendige polypeptid.

Begrepet "komplement/antikomplementpar" betegner ikke-identiske grupper som danner et ikke-kovalent sammenbundet, stabilt par under egnede betingelser. For eksempel er biotin og avidin (eller streptavidin) prototypiske medlemmer av et komplement/antikomplementpar. Andre eksempler på komplement/antikomplementpar omfatter reseptor/ligandpar, antistoff/antigen (eller hapten eller epitop)-par, sense/antisense-polynukleotidpar og lignende. Dersom på-følgende dissosiering av komplement/antikomplementparet er ønskelig, har komplement/antikomplementparet fortrinnsvis en bindingsaffinitet på <10<9> M"<1>.

Begrepet "komplementer av et polynukleotidmolekyl" er et polynukleotidmolekyl med en komplementær basesekvens og revers orientering, .sammenlignet med- en, referansesekvens. For eksempel er sekvensen 5' ATGCACGGG 3<1> komplementær til 5' CCCGTGCAT 3'. Begrepet "kontig" betegner et polynukleotid som har et kontinuerlig strekk av sekvens som er identisk med eller komplementær til sekvensen til et annet polynukleotid. Kontinuerlige sekvenser sies å "overlappe" et gitt strekk av en polynukleotidsekvens, enten i sin fullstendighet eller langs et gitt strekk av polynukleotidet. For eksempel er representative kontiger til polynukleotidsekvensen 5'-ATGGCTTAGCTT-3' 5'-TAGCTTgagtct-3' og 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Begrepet "degenerert nukleotidsekvens" betegner en sekvens av nukleotider som omfatter ett eller flere degenererte kodoner (sammenlignet med et referanse-polynukleotidmolekyl som koder for et polypeptid). Degenererte kodoner inneholder forskjellige nukleotidtripletter, men koder for samme aminosyrerest (f.eks. koder triplettene GAU og GAC begge for Asp).

Begrepet "ekspresjonsvektor" benyttes for å betegne et lineært eller sirkulært DNA-molekyl som omfatter et segment som koder for et polypeptid av interesse, operativt koblet til ytterligere segmenter som sørger for sekvensens transkripsjon. Slike tilleggssegmenter omfatter promotersekvenser og terminatorsekvenser og kan også omfatte ett eller flere replikasjonsorigi, én eller flere seleksjonsmar-kører, en enhancer, et polyadenyleringssignal, etc. Ekspresjonsvektorer er generelt avledet fra plasmid-DNA eller virus-DNA, eller de kan inneholde elementer fra begge disse.

Begrepet "isolert" anvendt på et polynukleotid, angir at polynukleotidet er blitt fjernet fra sitt naturlige genetiske miljø og således er fritt for andre tilleggs-sekvenser eller uønskede kodende sekvenser, og at det foreligger i en form som er egnet for anvendelse i proteinpro-duksjonssystemer fremstilt ved genetisk modifisering. Slike isolerte molekyler er separert fra sitt naturlige miljø og omfatter cDNA og genomiske kloner. Isolerte DNA-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er fri for andre gener med hvilke de vanligvis er forbundet, men kan omfatte naturlig forekommende 5' og 3' ikke-translaterte områder, f.eks. promoterer og terminatorer. Identifiseringen av assosierte områder vil være åpenbar for gjennomsnittsfagmannen innen faget (se f.eks. Dynan og Tijan, Nature, 316:774-78 (1985)).

Et "isolert" polypeptid eller protein er et polypeptid eller protein som forefinnes i en tilstand som er forskjellig fra dets native miljø, f.eks. fjernet fra blod og dyrevev. I en foretrukket form er det isolerte polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig andre polypeptider med opphav i dyr. Det foretrekkes å tilveiebringe polypeptidene i høyt renset tilstand, dvs. mer enn 95% rene, mer foretrukket mer enn 99% rene. Når det benyttes i denne sammenheng, utelukker begrejpet "isolert" ikke nærvær av det samme polypeptid i alternative fysiske tilstander, f.eks. som dimerer eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former.

Ved henvisning til DNA-segmenter angir begrepet "operativt sammenkoblet" at segmentene er arrangert slik at de fungerer sammen for sine påtenkte formål, f.eks. at transkripsjonen initieres i promoteren og forløper gjennom det kodende segment til terminatoren.

Begrepet "ortolog" betegner et polypeptid eller protein som er erholdt fra én art og er det funksjonelle motstykke til et polypeptid eller protein fra en annen art. Sekvensforskjeller mellom ortologer er en følge av arts-dannelse . "Paraloger" er atskilte, men strukturelt beslektede, proteiner som fremstilles av en organisme. Paraloger antas å oppstå ved genduplikasjon. For eksempel er a-globin, P-globin og myoglobin paraloger av hverandre.

Et "polynukleotid" er en enkelttrådet eller dobbelttrådet polymer av deoksyribonukleotid- eller ribonukleotid-baser lest fra 5'- til 3'-enden. Polynukleotider omfatter RNA og DNA og kan isoleres fra naturlige kilder, syntetiseres in vitro eller fremstilles fra en kombinasjon av naturlige og syntetiske molekyler. Størrelsen av polynukleotider angis som basepar (forkortet "bp"), nukleotider ("nt") eller kilobaser ("kb"). Dersom sammenhengen tillater det, kan de siste to begreper beskrive polynukleotider som er enkelttrådede eller dobbelttrådede. Dersom begrepet benyttes på dobbelttrådede molekyler, benyttes "det for å :=angi tota-llengden og vil forstås å være ekvivalent med begrepet "basepar". Fagfolk vil forstå at de to tråder i et dobbelttrådet polynukleotid kan . ha noe forskjellig lengde og at endene kan være forskjøvet i forhold til hverandre som en følge av enzymatisk kutting; således må ikke nødvendigvis alle nukleotider i et dobbelttrådet polynukleotidmolekyl inngå i basepar. Slike uparede ender vil generelt ikke være mer enn 20 nt lange.

Et "polypeptid" er en polymer av aminosyrerester sammenbundet med peptidbindinger, enten fremstilt naturlig eller syntetisk. Polypeptider med mindre enn tilnærmet 10 aminosyrerester, betegnes.vanligvis som "peptider".

Begrepet "promoter" benyttes heri i sin anerkjente betydning innen faget for å betegne en del av et gen som inneholder DNA-sekvenser som sørger for binding av RNA-polymerase og initiering av transkripsjon. Promotersekvenser finnes vanligvis, men ikke alltid, i genenes 5' ikke-kodende områder.

Et "protein" er et makromolekyl som omfatter én eller flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptidbestanddeler, f.eks. karbohydratgrupper. Karbo-hydrater og andre ikke-peptidbestanddeler kan tilsettes til et protein av cellen i hvilket proteinet fremstilles, og vil variere med celletypen. Proteiner defineres heri ut fra sine aminosyreryggradsstrukturer; substituenter som karbohydratgrupper spesifiseres generelt ikke, men de kan likevel foreligge.

Begrepet "reseptor" angir et celleassosiert protein som bindes til et bioaktivt molekyl (dvs. en ligand) og for-midler ligandens virkning på cellen. Membranbundne reseptorer særpreges ved en flerdomenestruktur som omfatter et ekstra-cellulært, ligandbindende domene og et intracellulært effek-tordomene som typisk deltar i signaloverføring. Binding av ligand til reseptoren fører til en konformasjonsendring i reseptoren som forårsaker en interaksjon mellom effektor-domenet og ett eller flere andre molekyler i cellen. Denne interaksjonen fører i sin tur til en endring av cellens meta-bolisme. Metabolske begivenheter som er koblet til reseptor-ligandinteraksjoner, omfatter gentranskripsjon, fosforyle-ring,-defosforylering, ,økt produksjon av syklisk AMP, mobilisering av cellulært kalsium, mobilisering av membran-lipider, celleadhesjon, hydrolyse av inositollipider og hydrolyse av fosfolipider. Generelt kan reseptorer være membranbundne, cytosoliske eller kjernelokalisert; monomere (f.eks. tyreoidstimulerende hormonreseptor, beta-adrenerg reseptor) eller multimere (f.eks. PDGF-reseptor, vekst-hormonreseptor, IL-3-reseptor, GM-CSF-reseptor, G-CSF-reseptor, erytropoietinreseptor og IL-6-reseptor).

Begrepet "sekretorisk signalsekvens" angir en DNA-sekvens som koder for et polypeptid (et "sekretorisk peptid") som, som en bestanddel av et større polypeptid, styrer det større polypeptid gjennom en sekretorisk vei i en celle i hvilken det syntetiseres. Det større polypeptid kløyves ofte for å fjerne det sekretoriske peptid under transport gjennom den sekretoriske vei.

Begrepet "spleisevariant" benyttes heri for å betegne alternative former av RNA transkribert fra et gen. Spleisevariasjon oppstår naturlig ved anvendelse av alternative spleiseseter i et transkribert RNA-molekyl, eller, mindre vanlig, mellom separat transkriberte RNA-molekyler, og kan føre til at flere mRNA transkriberes fra det samme gen. Spleisevarianter kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet spleisevariant benyttes også heri for å betegne et protein som kodes av en spleisevariant av et mRNA transkribert fra et gen.

Molekylvekter og lengder av polymerer bestemt ved unøyaktige analytiske fremgangsmåter (f.eks. gelelektrofor-ese), vil forstås å være tilnærmede verdier. Dersom en slik verdi uttrykkes som "rundt" X eller "tilnærmet" X, vil det forstås at den angitte verdi for X er nøyaktig til ±10%.

Konserverte aminosyrer i heliks D i ZcytolO kan benyttes som et middel for identifisering av nye familie-medlemmer. Heliks D er den mest konserverte, med tilnærmet 32% identitet med heliks D i IL-10. For eksempel kan revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) benyttes for amplifisering av sekvenser som koder for den konserverte del [domenet, området eller motivet fra ovenfor] fra RNA erholdt fra en rekke vevskilder eller, cellelinjer. Svært degenererte primere utformet fra ZcytolO-sekvensene, er spesielt anvendbare for dette formål.

I foretrukne utførelser av oppfinnelsen vil de isolerte polynukleotider hybridisere til områder med lignende størrelse med SEKV.ID. NR:1, SEKV.ID. NR:3, SEKV.ID. NR:18, SEKV.ID. NR:33 eller en sekvens som er komplementær til disse, under stringente betingelser. Generelt velges stringente betingelser til å være tilnærmet 5 °C lavere enn smeltepunktet (TJ for den angjeldende sekvens ved definert ionestyrke og pH. Tm er den temperatur (under definert ionestyrke og pH) ved hvilken 50% av målsekvensen hybri-diserer til en perfekt tilpasset probe. Typiske stringente betingelser er betingelser hvor saltkonsentrasjonen er tilnærmet 0,02 M eller lavere ved pH 7, og temperaturen er minst tilnærmet 60 °C. Som angitt tidligere, omfatter de isolerte polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse, DNA og RNA. Fremgangsmåter for isolering av DNA og RNA er velkjente innen faget. Total-RNA kan fremstilles ved benyttelse av guanidin-HCl-ekstraksjon, fulgt av isolering ved sentrifugering i en CsCl-gradient [Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94,

(1979)]. Poly (A) +-RNA fremstilles fra total-RNA ved benyttelse av fremgangsmåten til Aviv og Leder, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:1408-1412 (1972). Komplementært DNA (cDNA) fremstilles fra poly (A) +-RNA ved benyttelse av kjente fremgangsmåter. Polynukleotider som koder for ZcytolO-polypeptider, identifiseres og isoleres så ved f.eks. hybridisering eller PCR.

I tillegg kan polynukleotidene syntetiseres ved bruk av et DNA-synteseinstrument. I dag er den foretrukne fremgangsmåte fosforamidittmetoden. Dersom kjemisk syntetisert, dobbelttrådet DNA er nødvendig for en anvendelse, f.eks. syntese av et gen eller genfragment, fremstilles de komplementære trådene hver for seg. Fremstilling av korte gener (60 til 80 bp) er teknisk ukomplisert og kan oppnås ved å syntetisere de komplementære tråder og så la disse hybridisere. For.fremstilling av lengre gener'(>300 bp) må imidlertid spesielle strategier benyttes da koblings-effektiviteten for hver syklus under kjemisk DNA-syntese sjelden er 100%. For å overvinne dette problem settes syntetiske gener (dobbelttrådede) sammen i modulær form fra enkelttrådede fragmenter som er mellom 20 og 100 nukleotider lange. Se Glick, Bernard R. og Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C. 1994), Itakura, K. et al., Synthesis and use of synthetic oligonucleotides., Annu. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), og Climie, S. et al., Chemical synthesis of the thymidylate synthase gene., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:633-637 (1990).

Fagfolk vil forstå at sekvensene som beskrives i SEKV.ID. NR:1, 2, 3 og 4, representerer to alleler fra mennesket, mens SEKV.ID. NR:18, 19, 33 og 34 representerer to alleler fra mus. Ytterligere alleliske varianter av disse sekvenser kan klones ved å gjennomsøke cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer ifølge standard fremgangsmåter. Alleliske varianter av denne sekvens kan klones ved å gjennomsøke cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker ifølge standard fremgangsmåter. Alleliske varianter av DNA-sekvensen vist i SEKV.ID. NR:1, innbefattet sekvenser med tause mutasjoner og sekvenser i hvilke muta-sjonene fører til aminosyresekvensendringer, ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område, likeså proteiner som er alleliske varianter av SEKV.ID. NR:2. cDNA fremstilt fra alternativt spleisede mRNA som bibeholder egenskapene til ZcytolO-polypeptidet, omfattes innenfor foreliggende oppfinnelses område, likeså polypeptider som kodes av slike cDNA og mRNA. Alleliske varianter og spleisevarianter av disse sekvenser kan klones ved å gjennomsøke cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer eller vev ifølge standard fremgangsmåter kjent innen faget.

Det beskrives videre tilsvarende proteiner og polynukleotider fra andre arter ("artsortologer"). Av spesiell interesse er ZcytolO-polypeptider fra andre patte-dyrarter, heriblant mus, svin, fjærfe, storfe, hund, katt, hest samt andre primater. Artsortologer av det humane ZcytolO-protein kan klones ved benyttelse av informasjon og preparater som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse, kombinert med konvensjonelle kloningsteknikker. For eksempel kan et.cDNA klones ved benyttelse av mRNA erholdt fra et vev eller en celletype som uttrykker proteinet. Egnede mRNA-kilder kan. identifiseres ved å analysere Northern-blot med prober utformet fra sekvensene som beskrives heri. Et bibliotek fremstilles så fra mRNA fra et positivt vev eller en positiv cellelinje. Et proteinkodende cDNA kan så isoleres ved en rekke fremgangsmåter, f.eks. ved benyttelse av et fullstendig eller partielt, humant cDNA eller muse-cDNA som probe, eller med ett eller flere sett av degenererte prober basert på de beskrevne sekvenser. Et cDNA kan også klones ved benyttelse av polymerasekjedereaksjonen eller PCR (Mullis et al., US patentskrift nr. 4 683 202), ved benyttelse av primere utformet fra sekvensene som beskrives heri. I ytterligere en fremgangsmåte kan cDNA-biblioteket benyttes for transformasjon eller transfeksjon av vertsceller, og ekspresjon av cDNA av interesse kan påvises med et antistoff mot proteinet. Tilsvarende teknikker kan også benyttes for isolering av genomiske kloner. Som benyttet her og i kravene, omfatter uttrykket "et isolert polynukleotid som koder for et polypeptid, hvor polynukleotidet er definert ved SEKV.ID. NR:2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 og 35", alle alleliske varianter og artsortologer av disse polypeptider.

Det beskrives også isolerte polypeptider som er i det vesentlige identiske med proteinpolypeptidene ifølge SEKV.ID. NR:2 og artsortologer av denne. Med "isolert" menes et protein eller polypeptid som foreligger i en tilstand forskjellig fra sitt native miljø, f.eks. fjernet fra blod og dyrevev. I en foretrukket form er det isolerte polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig polypeptider med opphav i dyr. Det foretrekkes å tilveiebringe polypeptidene i svært ren tilstand, f.eks. mer enn 95% rene, mer foretrukket mer enn 99% rene. Begrepet "i det vesentlige identisk" benyttes heri for å betegne polypeptider som har 50%, fortrinnsvis 60%, mer foretrukket minst 80%, sekvensidentitet med sekvensen vist i SEKV.ID. NR:2, 4, 12, 13, 19, 20,. 25, 26, 34 og 35, eller disses artsortologer. Slike polypeptider vil fortrinnsvis være minst 90% identiske og mest foretrukket 95% eller mer identiske med SEKV.ID. NR:2 eller dennes artsortologer. Prosent sekvensidentitet bestemmes ved konvensjonelle fremgangsmåter. Se f.eks. Altschul et al.-, Bull. Matn. Bio. 48:603-616- (1986) og Henikoff og Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 8S:10915t 10919 (1992). Kort beskrevet, oppstilles to aminosyre-sekvenser slik at oppstillingspoengene optimaliseres ved benyttelse av en gapåpningsstraff på 10, en gapforleng-elsesstraff på 1 og "Blosum 62"-poengmatriksen til Henikoff og Henikoff (ibid.) som vist i tabell 1 (aminosyrene er angitt med standard enbokstavskoder). Prosent identitet beregnes så som:

Sekvensidentitet mellom polynukleotidmolekyler bestemmes ved tilsvarende fremgangsmåter ved benyttelse av et forhold som beskrevet ovenfor.

Varianter av ZcytolO-polypeptider eller i det vesentlige identiske proteiner og polypeptider særpreges ved at de har én eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner. Disse endringer er fortrinnsvis mindre omfattende, dvs. konservative aminosyresubstitusjoner (se tabell 2) og andre substitusjoner som ikke i vesentlig grad påvirker foldingen eller aktiviteten av proteinet eller polypeptidet, små delesjoner, typisk omfattende fra 1 til tilnærmet 30 aminosyrer, og små amino- eller karboksylter-minale forlengelser, f.eks. en aminoterminal metioninrest, et kort linkerpeptid med opp til tilnærmet 20-25 aminosyrerester, eller en liten forlengelse som letter rensing (en affinitetsmerkelapp), f.eks. et polyhistidinstrekk, protein A, Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985), Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991), glutation S-transferase, Smith og Johnson, Gene 67:31 (1988), eller andre antigeniske epi-toper eller bindingsdomener. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991). DNA som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelige fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Det beskrives videre en rekke andre polypeptidfusjoner [og beslektede multimere proteiner som omfatter én eller flere polypeptidfusjoner]. For eksempel kan et ZcytolO-polypeptid fremstilles som en fusjon med et dimeriserings-protein som beskrevet i US patentskrifter nr. 5 155 027 og 5 567 584. Foretrukne dimeriseringsproteiner i denne sammenheng omfatter konstant område-domener fra immunoglobulin. Immunoglobulin-ZcytolO-polypeptidfusjoner kan uttrykkes i genetisk modifiserte celler [for fremstilling av en rekke multimere ZcytolO-analoger]. Hjelpedomener kan kobles til ZcytolO-polypeptider for å målstyre dem mot spesifikke celler, vev eller makromolekyler (f.eks. kollagen). For eksempel kunne et ZcytolO-polypeptid eller -protein målstyres mot en på forhånd bestemt celletype ved å koble polypeptidet til en ligand som spesifikt bindes til en reseptor på overflaten av målcellen. På denne måte kan polypeptider og proteiner målstyres for terapeutiske eller diagnostiske formål. Et ZcytolO-polypeptid kan kobles til to eller flere grupper, f.eks. en affinitetsmerkelapp for rensing og et målstyringsdomene. Polypeptidfusjoner kan også omfatte ett eller flere kløyvingsseter, særlig mellom domener. Se Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1- 9 (1996).

Proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte ikke-naturlig forekommende aminosyrerester. Ikke-naturlig forekommende aminosyrer omfatter, uten å være begrenset til, trans-3-metylprolin, 2,4-metanprolin, cis-4-hydroksyprolin, trans-4-hydroksyprolin, N-metylglysin, allo-treonin, metyltreonin, hydroksyetylcystein, hydroksyetyl-homocystein, nitroglutamin, homoglutamin, pipekolsyre, tiazolidinkarboksylsyre, dehydroprolin, 3- og 4-metylprolin, 3,3-dimetylprolin, tert.-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin og 4-fluorfenylalanin. Flere fremgangsmåter er kjent innen faget for innføring av - ikke-naturlig forekommende aminosyrerester i proteiner. For eksempel kan et in vi tro-system hvori "nonsense"-mutasjoner undertrykkes ved hjelp av kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA, benyttes. Fremgangsmåter for syntese av aminosyrer og aminoacylering av tRNA er kjent innen faget. Essensielle aminosyrer i polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan identifiseres ifølge fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. setestyrt mutagenese eller alaninskannende mutagenese [Cunningham og Wells, Science 244:1081-1085

(1989)], Bass et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:4498-4502

(1991). I denne siste teknikk innføres alaninmutasjoner enkeltvis i enhver aminosyrerest i molekylet, og de resulterende mutante molekyler analyseres for biologisk aktivitet (f.eks. ligandbinding og signaloverføring) for å identifisere aminosyrerester som er avgjørende for molekylets aktivitet. Seter for ligand-proteininteraksjon kan også bestemmes ved analyse av krystallstruktur bestemt ved teknikker som kjerne-magnetisk resonans, krystallografi eller fotoaffinitets-merking. Se f.eks. de Vos et al., Science 255:306-312 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992), Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64 (1992). Hvilke aminosyrer som er essensielle, kan også utledes fra analyse av homologi med beslektede proteiner.

Substitusjon av flere aminosyrer kan utføres og undersøkes ved benyttelse av kjente mutageneseteknikker og analyse, f.eks. teknikkene beskrevet av Reidhaar-Olson og Sauer, Science 241:53-57 (1988) eller Bowie og Sauer, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:2152-2156 (1989). Kort beskrevet, beskriver disse forfattere fremgangsmåter for samtidig randomisering av to eller flere posisjoner i et polypeptid, seleksjon for funksjonelt polypeptid og sekvensering av de mutageniserte polypeptider for å bestemme omfanget av tillatte substitusjoner i hver posisjon. Andre fremgangsmåter som kan benyttes, omfatter bakteriofagfremvisning (se f.eks. Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837 (1991), Ladner et al., US patentskrift nr. 5 223 409, Huse, WIPO-publikasjon WO 92/06204) og områdestyrt mutagenese, Derbys.hire et ål., Gene 46:145 (1986), Ner et al., DNA 7:127 (1988).

Mutagenesefremgangsmåter som dem beskrevet ovenfor, kan kombineres med fremgangsmåter for effektiv analyse av . mange prøver for påvisning av aktivitet av klonede, mutageniserte proteiner i vertsceller. Foretrukne analyser i denne sammenheng omfatter celleproliferasjonsanalyser og bio-sensorbaserte ligandbindingsanalyser, som beskrevet nedenfor: Mutageniserte DNA-molekyler som koder for aktive proteiner eller deler av slike (f.eks. ligandbindende fragmenter), kan gjenvinnes fra vertscellene og sekvenseres hurtig ved benyttelse av. moderne utstyr. Disse fremgangsmåter tillater hurtig bestemmelse av de enkelte aminosyreresters betydning i et polypeptid av interesse og kan benyttes på polypeptider med ukjent struktur.

Ved benyttelse av fremgangsmåtene diskutert ovenfor, kan en gjennomsnittsfagmann fremstille et bredt utvalg av polypeptider som er i det vesentlige identiske med SEKV.ID. NR:2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 og 35 eller alleliske varianter av disse og som bibeholder villtypeproteinets egenskaper. Som benyttet heri, også i kravene, omfatter uttrykket "et polypeptid som definert ved SEKV.ID. NR:2" alle alleliske varianter og artsortologer av polypeptidet.

Proteinpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefattet fullengdeproteiner, proteinfragmenter (f.eks. ligandbindende fragmenter) og fusjonspolypeptider, kan fremstilles i genetisk modifiserte vertsceller ifølge konvensjonelle teknikker. Egnede vertsceller er celletyper som kan transformeres eller transfekteres med eksogent DNA og dyrkes i kultur, og omfatter bakterier, soppceller og dyrkede celler fra høyere eukaryoter. Eukairyote celler foretrekkes, særlig dyrkede celler fra flercellulære organismer. Teknikker for manipulering av klonede DNA-molekyler og innføring av eksogent DNA i en rekke vertsceller beskrives av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,

1989), og Ausubel et al., ibid.

Polynukleotider, nærmere bestemt en cDNA-sekvens, som beskrevet heri koder for de ovenfor beskrevne polypeptider. En DNA-sekvehs som koder for et polypeptid som beskrevet heri, består av en serie kodoner hvor hver aminosyrerest i polypeptidet kodes av et kodon og hvor hvert kodon består av tre nukleotider. Aminosyrerestene kodes av sine respektive kodoner som følger: Alanin (Ala) kodes av GCA, GCC, GCG eller GCT;

Cystein (Cys) kodes av TGC eller TGT;

Asparaginsyre (Asp) kodes av GAC eller GAT;

Glutaminsyre (Glu) kodes av GAA eller GAG;

Fenylalanin (Phe) kodes av TTC eller TTT;

Glysin (Gly) kodes av GGA, GGC, GGG eller GGT;

Histidin (His) kodes av CAC eller CAT;

Isoleucin (Ile) kodes av ATA, ATC eller ATT;

Lysin (Lys) kodes av AAA eller AAG;

Leucin (Leu) kodes av TTA, TTG, CTA, CTC, CTG eller

CTT;

Metionin (Met) kodes av ATG;

Asparagin (Asn) kodes av AAC eller AAT;

Prolin (Pro) kodes av CCA, CCC, CCG eller CCT;

Glutamin (Gin) kodes av CAA eller CAG;

Arginin (Arg) kodes av AGA, AGG, CGA, CGC, CGG eller

CGT;

Serin (Ser) kodes av AGC, AGT, TCA, TCC, TCG eller

TCT ;

Treonin (Thr) kodes av ACA, ACC, ACG eller ACT;

Valin (Val) kodes av GTA, GTC, GTG eller GTT;

Tryptofan (Trp) kodes av TGG; og

Tyrosin (Tyr) kodes av TAC eller TAT.

Det bør innses at det dersom et cDNA kreves som beskrevet ovenfor, er underforstått at det som kreves er både "sense-tråden" "antisense-tråden" og dobbelttrådet DNA med både "sense"- og "antisense"-tråd hybridisert sammen ved hjelp av hydrogenbindinger. Også krevet er budbringer-RNA (mRNA) som koder for polypeptidene som beskrevet heri og som er kodet av det ovenfor beskrevne cDNA. Et budbringer-RNA (mRNA) vil kode for et polypeptid ved benyttelse av de samme kodoner som er definert ovenfor, bortsett fra at hvert thyminnukleotid (T) er erstattet med et uracinnukleotid (U).

Generelt er en DNA-sekvens som koder for et ZcytolO-polypeptid, operativt koblet til andre genetiske elementer som er nødvendige for dens ekspresjon, generelt omfattende en transkripsjonspromoter og en terminator, i en ekspresjonsvektor. Vektoren vil også ofte inneholde én eller flere seleksjonsmarkører og ett eller flere replikasjonsorigi, selv om fagfolk vil vite at seleksjonsmarkører i visse systemer kan foreligge på separate vektorer og at replikasjon av det eksogene DNA kan oppnås ved integrering i vertscellegenomet.. Utvelgelse av promoterer, terminatorer, seleksjonsmarkører, vektorer og andre elementer er et spørsmål om rutinemessig utforming som ligger innenfor gjennomsnittsfagmannens kunn-skaper. Mange slike elementer er beskrevet i litteraturen og er tilgjengelige gjennom kommersielle leverandører.

For å styre et ZcytolO-polypeptid inn i vertscellens sekresjonsvei tilveiebringes en sekresjonssignalsekvens (også betegnet en ledersekvens, en preprosekvens eller en pre-sekvens) i ekspresjonsvektoren. Sekresjonssignalsekvensen kan være proteinets egen eller være avledet fra et annet utskilt protein (f.eks. t-PA) eller syntetisert de novo. Sekresjonssignalsekvensen kobles til ZcytolO-DNA-sekvensen i .korrekt leseramme. Sekresjonssignalsekvenser ligger vanligvis 5' for DNA-sekvensen som koder for polypeptidet av interesse, selv om visse signalsekvenser kan ligge andre steder i DNA-sekvensen av interesse (se f.eks. Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743, Holland et al., US patentskrift nr. 5 143 830) .

Fremgangsmåter for innføring av eksogent DNA i pattedyrvertsceller omfatter kalsiumfosfatformidlet transfeksjon, Wigler et al., Cell 14:725 (1978), Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981, Graham og Van der Eb, Virology 52:456 (1973), elektroporering, Neumann et al., EMBO J. 1:841-845 (1982), DEAE-dekstranformidlet transfeksjon, Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), og liposom-formidlet transfeksjon, Hawley-Nelson et al., Focus 15:73

(1993), Ciccarone et al., Focus 15:80 (1993). Fremstilling av rekombinante polypeptider i dyrkede pattedyrceller er f.eks. beskrevet av Levinson et al., US patentskrift nr. 4 713 339, Hagen et al., US patentskrift nr. 4 784 950, Palmiter et al., US patentskrift nr. 4 579 821' og Ringold, US -patentskrift nr.

4 656 134. Egnede dyrkede pattedyrceller omfatter celle-linjene COS-1 (ATCC nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC nr. CRL 1651), BHK (ATCC nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr. CRL 10314), 293 [ATCC nr. CRL 1573, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72

(1977) og kinesiske hamsterovarieceller (f.eks. CHO-K1, ATCC nr. CCL 61). Ytterligere egnede cellelinjer er kjent innen faget og tilgjengelige fra offentlige deponeringsinstitu-sjoner, f.eks. American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Generelt foretrekkes kraftige transkripsjonspro-moterer, f.eks. promoterer fra SV-40 eller cytomegalovirus. Se f.eks. US patentskrift nr. 4 956 288. Andre egnede promoterer omfatter promoterer fra metallotioneingener (US patentskrifter nr. 4 579 821 og 4 601 978) og den sene hovedpromoter fra adenovirus.

Seleksjon med medikamenter benyttes generelt for å selektere dyrkede pattedyrceller i hvilke fremmed DNA er innført. Slike celler betegnes vanligvis som "transfektanter". Celler som er dyrket i nærvær av seleksjonsmidlet og kan overføre genet av interesse til sitt avkom, betegnes "stabile transfektanter". En foretrukket seleksjonsmarkør er et gen som koder for resistens mot det antibiotiske stoff neomycin. Seleksjonen utføres i nærvær av et medikament av neomycintype, f.eks. G-418 eller lignende. Seleksjonssystemer kan også benyttes for å forhøye ekspresjonsnivået av genet av interesse, en prosess som betegnes "amplifisering". Amplifisering utføres ved å dyrke transfektanter i nærvær av et lavt nivå av seleksjonsmidlet og deretter øke mengden selek-sjonsmiddel for seleksjon av celler som produserer høyt nivå av produktet fra de innførte gener. En foretrukket ampii-fiserbar seleksjonsmarkør er dihydrofolatreduktase som gir resistens mot metotreksat. Andre medikamentresistensgener (f.eks. hygromycinresistens, flermedikamentresistens, puro-mycinacetyltransferase) kan også benyttes. Alternative markører som innfører en endret fenotype, f.eks. grønt fluorescerende protein, eller celleoverflateproteiner som CD4, CD8, klasse I MHC, eller alkalisk fosfatase fra placenta, kan benyttes for å skille transfekterte celler fra ikke-transfekterte celler ved benyttelse av FACS-sortering eller separåsjonsteknologi basert på magnetiske kuler.

Andre høyere eukaryote celler kan også benyttes som verter, innbefattet insektsceller, planteceller og fugle-celler. Transformasjon av insektsceller og fremstilling av fremmede polypeptider i disse beskrives av Guarino et al., US patentskrift nr. 5 162 222, Bang et al., US patentskrift nr.

4 775 624, og WIPO-publikasjon WO 94/06463. En oversikt over anvendelse av AgroJbacterium rhizogenes som vektor for ekspresjon av gener i planteceller gis av Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58 (1987). Insektsceller kan infiseres med rekombinant baculovirus, vanligvis avledet fra Autographa californica- kjernepolyhedrosevirus (AcNPV). Se King, L.A. og Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London), 0'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (University Press., New York, Oxford, 1994), og Richardson, C.D., red., Baculovirus Expression Protocols., Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ, 1995). En annen fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant ZcytolO-baculovirus benytter et transposonbasert system beskrevet av Luckow, V.A. et al., J. Virol. 67:4566-79, 1993). Dette system, som benytter overføringsvektorer, selges i "Bac-to-Bac"-settet (Life Technologies, Rockville, MD). Dette system benytter en overføringsvektor, "pFastBacl"

(Life Technologies) som inneholder et Tn7-transposon for å overføre DNA som koder for ZcytolO-polypeptidet til et baculovirusgenom som opprettholdes i E. coli som et stort plasmid betegnet et "bacmid". Se Hill-Perkins, M.S. og Possee, R.D., J Gen Virol 71:971-6 (1990), Bonning, B.C. et al., J Gen Virol 75:1551-6 (1994), og Chazenbalk, G.D., og Rapoport, B., J Biol Chem 270:1543-9 (1995). I tillegg kan overføringsvektorer omfatte en fusjon i korrekt leseramme med DNA som koder for en epitopmerkelapp i C- eller N-enden av det uttrykte ZcytolO-polypeptid, f.eks. en Glu-Glu-epitopmerkelapp, Grussenmeyer, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 82:7952-4 (1985) . Ved benyttelse av en teknikk som er kjent innen faget, transformeres en overføringsvektor som inneholder ZcytolO, inn i E. coli, og det analyseres for bacmider som inneholder et avbrutt lacZ-gen, noe som tyder på rekombinant baculovirus. Bacmid-DNA inneholdende det rekom-

binante baculovirusgenom, isoleres ved benyttelse av vanlige teknikker og benyttes for transfeksjon av Spodoptera frugiperda-celler, f.eks. Sf9-celler. Rekombinant virus som uttrykker ZcytolO, fremstilles så. Lagringssuspensjoner av rekombinant virus fremstilles ved fremgangsmåter som vanligvis benyttes innen faget.

Det rekombinante virus benyttes for infeksjon av vertsceller, typisk en cellelinje avledet fra høsthærormen Spodoptera frugiperda. Se generelt Glick og Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, . ASM Press, Washington, D.C. (1994). En annen egnet cellelinje er "High FiveO" (Invitrogen) avledet fra Trichoplusia ni (US patentskrift nr. 5 300 435). Kommersielt tilgjengelig, serumfritt medium benyttes for dyrking og. opprettholdelse av cellene. Egnede medier er "Sf900 II" (Life Technologies) eller "ESF 921" (Expression Systems) for Sf9-cellene og "Ex-cell0405;" (JRH Biosciences, Lenexa, KS) eller "Express FiveO" (Life Technologies) for T. ni-cellene. Cellene oppdyrkes fra en inokulasjonstetthet på tilnærmet 2-5 x 10<5> celler til en tetthet på 1-2 x IO<6> celler, da rekombinant virussuspensjon tilsettes med en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 0,1 til 10, mer typisk i nærheten av 3. De benyttede fremgangsmåter beskrives generelt i tilgjengelige labora-toriehåndbøker (King, L.A. og Possee, R.D., ibid., 0'Reilly, D.R. et al., ibid., Richardson, C.D., ibid.). Påfølgende rensing av ZcytolO-polypeptidet fra supernatanten kan oppnås ved benyttelse av fremgangsmåter beskrevet i disse.

Soppceller,. innbefattet gjærceller, og nærmere bestemt celler fra slekten Saccharomyces, kan også benyttes i foreliggende oppfinnelse, f.eks. for fremstilling av proteinfragmenter eller polypeptidfusjoner. Fremgangsmåter for transformering av gjærceller med eksogent DNA og fremstilling av rekombinante polypeptider fra disse beskrives f.eks. av Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311, Kawasaki et al., US patentskrift nr. 4 931 373, Brake, US patentskrift nr.

4 870 008, Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743 og Murray et al., US patentskrift nr. 4 845 075. Transformerte celler utvelges ut.fra fenotypen som bestemmes av seleksjons-markøren, vanligvis medikamentresistens eller evnen til å

vokse i fravær av.et gitt næringsstoff (f.eks. leucin). Et foretrukket vektorsystem for anvendelse i gjær er P0T1-vektorsysternet som beskrives av Kawasaki et al. (US patentskrift nr. 4 931 373) som tillater seleksjon av transformerte celler ved dyrking i glukoseholdig medium. Egnede promoterer og terminatorer for anvendelse i gjær omfatter promoterer og terminatorer fra genene til glykolyseenzymer (se f.eks. Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311, Kingsman et al., US patentskrift nr. 4 615 974 og Bitter, US patentskrift nr. 4 977 092 og alkoholdehydrogenasegener. Se også US patentskrifter nr. 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 og 4 661 454. Transformasjonssystemer for andre gjærtyper, innbefattet Hansenula polymorpha, Schizosaccharomycea pombe, Kluyvero-mycea lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydia, Pichia paatoria, Pichia methanolica, Pichia guillermondii og Candida maltoaa, er kjent innen faget. Se f.eks. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465 (1986) og Cregg, US patentskrift nr. 4 882 279. Aapergillua-celler kan benyttes ifølge fremgangsmåtene til McKnight et al., US patentskrift nr. 4 935.349. Fremgangsmåter for transformering av Acremonium chryaogenvm beskrives av Sumino et al., US patentskrift nr. 5 162 228. Fremgangsmåter for transformering av Neuroapora beskrives av Lambowitz, US patentskrift nr. 4 486 533.

Anvendelse av Pichia methanolica som vert for fremstilling av rekombinante proteiner beskrives i WlPO-publi-kasjonene WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 og WO 98/02565. DNA-molekyler for anvendelse ved transformering av P. methanolica vil vanligvis fremstilles som dobbelttrådede, sirkulære plasmider som fortrinnsvis lineariseres før transformasjonen. For fremstilling av polypeptid i P. methanolica foretrekkes det at promoteren og terminatoren i plasmidet stammer fra et P. methanolica-gen, f.eks. et alkoholutnyttelsesgen fra P. methanolica (AUG1 eller AUG2). Andre anvendbare promoterer omfatter promoterer fra genene for dihydroksyacetonsyntase (DHAS), formiatdehydrogenase (FMD) og katalase (CAT). For å lette integrering av DNA i vertskromosomet foretrekkes det at hele ekspresjonssegmentet av plasmidet flankeres i begge ender av verts-DNA-sekvenser. En foretrukket seleksjonsmarkør for anvendelse i Pichia methanolica er et P. methanolica ADE2-gen som koder for fosforibosyl-5-aminoimidazolkarboksylase (AIRC, EC 4.1.1.21), som tillater ade2-vertsceller å vokse i fravær av adenin. For - industrielle prosesser i stor skala hvor det er ønskelig å minimalisere anvendelsen av metanol, foretrekkes det å benytte vertsceller hvor de to metanolanvendelsesgenene (AUG1 og AUG2) er delert. For fremstilling av utskilte proteiner foretrekkes vertsceller som mangler genene for vakuolar protease (PEP4 og PRB1). Elektroporering benyttes for å lette innføring av et plasmid som inneholder DNA som koder for et polypeptid av interesse i P. methanolica- celler. Det foretrekkes å transformere P. mefchanolica-celler ved elektroporering ved benyttelse av et eksponensielt avtagende, pulset, elektrisk felt med feltstyrke mellom 2,5 og 4,5 kV/cm, fortrinnsvis tilnærmet 3,75 kV/cm, og en tidskonstant (t) på mellom 1 og 40 millisekunder, mest foretrukket tilnærmet 20 millisekunder.

Prokaryote vertsceller, innbefattet stammer av bakteriene Escherichia coli, Bacillus og andre slekter, er også anvendbare vertsceller i foreliggende oppfinnelse. Teknikker for transformasjon av disse verter og ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser klonet i disse, er velkjente innen faget (se f.eks. Sambrook et al., ibid.). Ved ekspresjon av et ZcytolO-polypeptid i bakterier som E. coli, kan polypeptidet tilbakeholdes i cytoplasma, typisk som uløselige granuler, eller styres til periplasmarommet ved hjelp av en bakteriell sekresjonssekvens. I det første tilfellet lyseres cellene, og granulene gjenvinnes og denatureres ved f.eks. benyttelse av guanidinisotiocyanat eller urea. Det denatur-erte polypeptid kan så gjenfoldes og dimeriseres ved å for-tynne denatureringsmidlet, f.eks. ved dialyse mot en løsning av urea og en blanding av redusert og oksidert glutation, fulgt av dialyse mot en bufret saltløsning. I det andre tilfellet kan polypeptidet gjenvinnes fra periplasmarommet i løselig og funksjonell form ved å bryte opp cellene (ved f.eks. ultralydbehandling eller osmotisk sjokk) for fri-givelse av innholdet i periplasmarommet og gjenvinning av proteinet, noe som ikke krever denaturering og gjenfolding.

Transformerte eller transfekterte vertsceller dyrkes ifølge konvensjonelle fremgangsmåter i et dyrkningsmedium som inneholder næringsstoffer og andre bestanddeler som kreves for vekst av de valgte vertsceller. En lang rekke egnede medier, innbefattet definerte medier og komplekse medier, er kjent innen faget og omfatter generelt en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer og miner-aler. Medier kan også inneholde bestanddeler som vekstfaktorer eller serum etter behov. Dyrkningsmediet vil generelt selektere celler som inneholder det eksogent tilsatte DNA, f.eks. ved medikamentseleksjon eller fravær av et essensielt næringsstoff som komplementeres av seleksjonsmarkøren som sitter i ekspresjonsvektoren eller som kotransfekteres inn i vertscellen. P. methanolica-celler dyrkes i et medium som omfatter tilstrekkelige kilder for karbon, nitrogen og spornæringsstoffer ved en temperatur mellom tilnærmet 25 °C og 35 °C. Væskekulturer forsynes med tilstrekkelig lufttilførsel ved konvensjonelle midler, f.eks. risting av små kolber eller gjennombobling av fermentorer. Et foretrukket dyrkningsmedium for P. methanolica er YEPD (2% D-glukose, 2% "Bacto"-pepton

(Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% "Bacto"-gjærekstrakt (Difco Laboratories), 0,004%. adenin og 0,006% L-leucin).

I én utførelse fremstilles et nytt protein av en

dyrket celle, og cellen benyttes for søk etter én eller flere reseptorer for proteinet, innbefattet den naturlige reseptor, så vel som agonister og antagonister av den naturlige ligand.

Proteinisolering:

Det foretrekkes å rense polypeptidene som beskrevet heri til >80% renhet, mer foretrukket til >90% renhet, enda mer foretrukket >95% renhet, og spesielt foretrukket er en farmasøytisk ren tilstand, dvs. mer enn 99,9% ren når det gjelder kontaminerende makromolekyler, særlig andre proteiner og nukleinsyrer, og fri for infeksiøse og pyrogene midler. Fortrinnsvis er et renset polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig for andre polypeptider med opphav i dyr.

Uttrykte, rekombinante polypeptider (eller kimære polypeptider) kan renses ved benyttelse,av fraksjonering og/eller konvensjonelle rensefremgangsmåter og medier. Ammoniumsulfatutfelling og syreekstraksjon eller kaotrop ekstraksjon kan benyttes for fraksjonering av prøver. Eksempler på rensetrinn kan omfatte hydroksyapatittkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, FPLC og revers fase-høyytelsesvæskekromatografi. Egnede anionbyttermedier omfatter derivatiserte dekstraner, agarose, cellulose, poly-akrylamid, spesielle kiselgeler og lignende. PEI-, DEAE-, QAE- og Q-derivater foretrekkes, med DEAE "Fast-Flow Sepharose" (Pharmacia, Piscataway/ NJ) som spesielt foretrukket. Eksempler på kromatografimedier omfatter medier derivatisert med fenyl-, butyl- eller oktylgrupper, f.eks. "Phenyl-Sepharose FF" (Pharmacia), "Toyopearl butyl 650"

(Toso Haas, Montgomeryville, PA), "Octyl-Sepharose"

(Pharmacia) og lignende, eller polyakrylresiner, f.eks. "Amberchrom CG 71" (Toso Haas) og lignende. Egnede, faste støttemidler omfatter glasskuler, kiselgelbaserte resiner, celluloseresiner, agarosekuler, kryssbundne agarosekuler, polystyrenkuler, kryssbundne polyakrylamidresiner og lignende, som er uløselige under betingelsene ved hvilke de skal benyttes. Disse støttemidler kan modifiseres med reaktive grupper som tillater tilkobling av proteiner via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper, hydroks-ylgrupper og/eller karbohydratgrupper. Eksempler på fremgangsmåter for kjemisk kobling omfatter cyanogenbromidakti-vering, N-hydroksysuccinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktivering, hydrazidaktivering og anvendelse av karboksyl- og aminoderivater for kjemisk karbodiimidkobling. Disse og andre faste medier er velkjente og hyppig benyttet innen faget og er tilgjengelige fra kommersielle leveran-dører. Fremgangsmåter for binding av reseptorpolypeptider til støttemedier er velkjente innen faget. Utvelgelse av en spesiell fremgangsmåte er et spørsmål om rutinemessig utforming og bestemmes delvis av egenskapene til det valgte støtte-middel. Se f.eks. Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige, 1988) .

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres ved å utnytte deres egenskaper. For eksempel kan immobilisert metallionadsorpsjonskromatografi (IMAC) benyttes for rensing av histidinrike proteiner. Kort beskrevet, lades først en gel med divalente metallioner slik at det dannes et chelat (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7 (1985)). Histidinrike proteiner vil adsorberes til denne matriks med variabel affinitet avhengig av det benyttede metallion, og vil elueres ved konkurrerende eluering, reduksjon av pH eller benyttelse av kraftige chelateringsmidler. Andre rensefremgangsmåter omfatter rensing av glykosylerte proteiner ved lektinaffinitetskromatografi og ionebytterkromatografi (Methods in Enzymol., bind 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (red.), s. 529-539 (Acad. Press, San Diego, 1990). Alternativt kan en fusjon mellom polypeptidet av interesse og en affinitetsmerkelapp (f.eks. polyhistidin, maltosebindende protein, et immunglobulindomene) utformes for å lette rensingen.

Anvendelser

Polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse har de strukturelle egenskaper til et cytokin med en fire-heliksbunt. Et protein karakteriseres generelt som et cytokin ut fra dets løselighet og evne til å fungere via celleover-flatereseptorer til å signalisere og modulere celleproliferasjon. Cytokiner kan inndeles i flere klasser med forskjellig tertiær, strukturell folding, innbefattet cystein-rike dimerer (f.eks. insulin, PDGF), beta-kløverbladfolding (f.eks. FGF, IL-1), og hel-alfa fire-heliksbunter. Disse siste særpreges ved fire helikser betegnet A, B, C og D, i en spesiell opp-opp-ned-ned-topologi, hvor to halvstikkiakker sammenbinder heliksene A og B og heliksene C og D. Se f.eks. Manavalan et al., Journal of Protein Chemistry 11(3):321-31

(1992). Cytokiner med fire-heliksbunt inndeles av og til videre i kortkjedede (f.eks. IL-4, IL-2, GM-CSF) og lang-kjedede (f.eks. TPO, veksthormon, leptin, IL-10), hvor den siste gruppe generelt har lengre A- og D-helikser og halv-stikkløkker. I det påfølgende skal vi benytte begrepet "cytokin" som synonymt med "cytokin med fire-heliksbunt". Heliks A i zcytolO omfatter sekvensen fra aminosyrerest 35, et ispleucin> til og med aminosyrerest 49,. et isoleucin, også definert ved SEKV.ID. NR:14, heliks B omfatter sekvensen fra aminosyrerest 91, et leucin, til og med aminosyrerest 105,. et treonin, også definert ved SEKV.iD. NR:15, heliks C omfatter sekvensen fra aminosyrerest 112, et leucin, til og med aminosyrerest 126, et cystein, også definert ved SEKV.ID. NR:16, heliks D omfatter sekvensen fra aminosyrerest 158, et valin,• til og med aminosyrerest 172, et metionin, også definert ved SEKV.ID. NR:17. Humant ZcytolO har en intramolekylær disulfidbinding mellom Cys33 og Cysl26. De fire andre cysteinene, Cys80, Cysl32, Cys81 og Cysl34, antas-å danne to intramolekylære disulfidbindinger med arrangementet Cys80-Cysl32 og Cys81-Cysl34. Aminosyrerester som antas å være avgjørende for den strukturelle stabilitet av ZcytolO, omfatter Cys33, Cysl26, Cys80, Cysl32, Cys81 og Cysl34. Mutasjon av hvilken som helst av disse aminosyrerester til hvilken som helst aminosyrerest forventes å inaktivere funksjonen av ZcytolO. Den strukturelle stabilitet av ZcytolO avhenger også av opprettholdelse av et begravd, hydrofobisk grensesnitt mellom de fire alfa-helikser. Aminosyrerestene Ile42, Phe46, Ile49, Leu91, Val94, Phe95, Tyr98, Leull2, Phell6, Ilell9, Leul23, Vall58, Leul62, Leul65, Leul68, Leul69 og Met172 antas å være begravd i proteinets kjerne, og dersom disse endres, må den substituerte aminosyrerest være en hydrofob aminosyre. Aminosyrerester som forventes å delta i binding av ZcytolO til en celleoverflatereseptor, omfatter Asp57 i halvstikkløkken mellom heliks A og B, og Lysl60 og Glul64, som er ladede aminosyrerester som forventes å være eksponert på overflaten av heiiks D. På proteinets overflate, i løkken AB og områder i heliks D, ligger et hydrofobt overflateområde som omfatter aminosyrerestene Ile62, Leu71, Ilel67 og Trpl71. Disse aminosyrerester kan interagere med et hydrofobt overflateområde på en celleoverflatereseptor. Det humane ZcytolO-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse har tilnærmet 28% identitet med interleukin-10 (IL-10). ZcytolO-polypeptid fra mus har tilnærmet 24% identitet med humant IL-10 og tilnærmet 27% identitet med IL-10 fra mus. Humant ZcytolO-polypeptid har tilnærmet 76% identitet med ZcytolO-polypeptid fra mus. Heliks A i muse-ZcytolO omfatter sekvensen fra aminosyrerest 35, et isoleucin, til og med aminosyrerest 50, et arginin, i SEKV.ID. NR:19, også definert ved SEKV.ID. NR:21. Heliks B i muse-ZcytolO omfatter sekvensen fra aminosyrerest 91, et leucin, til og med aminosyrerest 105, et treonin, i SEKV.ID. NR:19, også definert ved SEKV.ID. NR:22. Heliks C i muse-ZcytolO omfatter aminosyresekvensen fra aminosyrerest 112, et leucin, til og med aminosyrerest 126, et cystein, i SEKV.ID. NR:19, også definert ved SEKV.ID. NR-.23. Heliks D i muse-ZcytolO omfatter sekvensen fra aminosyrerest 158, et valin, til og med aminosyrerest 172, et metionin, i SEKV.ID. NR:19, også definert ved SEKV.ID. NR:24. IL-10 er et cytokin som inhiberer produksjonen av andre cytokiner, induserer proliferasjon og differensiering av aktiverte B-lymfocytter, inhiberer HIV-1-replikasjon og viser virkninger som antagoniserer virkningene av gamma-interferon. IL-10 foreligger tilsynelatende som en.dimer som dannes fra to polypeptidområder i alfa-helikskonformasjon, rotert 180° i forhold til hverandre. Se f.eks. Zdanov et al., Structure: 3(6):591-601 (1996). IL-10 er blitt rapportert å være et produkt fra aktiverte Th2 T-celler, B-celler, keratinocytter og monocytter/makrofager som er i stand til å modulere en Thl T-cellerespons. Slik modulering kan oppnås ved å inhibere Thl T-cellenes cytokinsyntese. Se f.eks. Hus et al., Int. Immunol. 4:563 (1992) og D'Andrea et al., J. Exp. Med. 178:1042 (1992). IL-10 er også blitt rapportert å inhibere cytokinsyntesen til naturlige dreperceller og monocytter/makrofager. Se f.eks. Hus et al., sitert ovenfor, og Fiorentino et al., J. Immunol. 146:3444 (1991). I tillegg er det blitt funnet at IL-10 har en beskyttende virkning når det gjelder insulinavhengig diabetes mellitus. Ved analyse av vevsfordelingen av mRNA som tilsvarer dette nye DNA, ble et enkelt transkript på tilnærmet 1,2 kb observert. Ved benyttelse av "Clontech Multiple Tissue Northerns" ble det humane transkript påvist i luftrør, placenta, testis, hud, spyttkjertel, prostata og skjoldbrusk-kjertel, med lavere ekspresjon observert i mage og bukspyttkjertel. ZcytolO ble uttrykt i følgende musevev: nyre, skjelettmuskel, spyttkjertel, lever og hud. Vevsspesifisiteten for ZcytolO-ekspresjonen tyder på at ZcytolO kan være en vekstfaktor og/eller vedlikeholdsfak-tor i luftrør og spyttkjertler, mage, bukspyttkjertel og muskel, og kan være viktig for lokale immunresponser. Videre tyder ZcytolO-genets lokalisering på kromosom lq32.2 på at ZcytolO er en vekstfaktor/differensieringsfaktor eller av viktighet for regulering av immunresponsen, på samme måte som IL-10. Det beskrives også reagenser som vil være av nytte i kliniske anvendelser. En probe som omfatter ZcytolO-DNA eller -RNA eller en undersekvens av disse, kan benyttes for å fastslå hvorvidt ZcytolO-genet foreligger på kromosom 1 eller om en mutasjon har forekommet. Det beskrives også reagenser med vesentlig terapeutisk nytteverdi. ZcytolO-polypeptidet (naturlig forekommende eller rekombinant), fragmenter av dette, antistoffer og åntiidiotypiske antistoffer mot dette, samt forbindelser som er vist å ha bindingsaffinitet til ZcytolO-polypeptidet,. bør være anvendbare ved behandling av tilstander forbundet med unormal fysiologi eller utvikling, innbefattet unormal proliferasjon, f.eks. cancertUstander, eller degenererende tilstander eller endret immunitet. Antistoffer mot ZcytolO-polypeptidet kan renses og så tilføres til en pasient. Disse reagenser kan kombineres for terapeutisk anvendelse med ytterligere aktive eller ikke-reaktive ingredienser, f.eks. i farmasøytisk aksepterbare bærerstoffer eller fortynningsmidler, sammen med fysiologisk aksepterbare stabilisatorer og eksipienser. Disse kombina-sjoner kan sterilfiltreres og plasseres i doseringsformer, f.eks. ved frysetørking i doseringsampuller eller lagring i stabiliserte, vandige preparater. Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av antistoffer, bindende fragmenter av slike eller enkeltkjedede antistoffer fremstilt fra antistoffene, innbefattet former som ikke binder komplement. Mengden av reagenser som er nødvendig for effektiv behandling, vil avhenge av mange forskjellige faktorer, innbefattet' tilførselsvei, målsete, pasientens fysiologiske tilstand og annen medikasjon som tilføres. Således bør behandlingsdosene titreres for optimalisering av sikkerhet og effektivitet. Doser benyttet in vitro, kan typisk gi nyttige retningslinjer vedrørende mengdene som er anvendbare for in vivo-tilførsel av disse reagenser. Analyse i forsøksdyr av effektive behandlingsdoser for gitte forstyrrelser vil ytterligere kunne bidra til å bestemme doser i mennesket. Fremgangsmåter for tilførsel omfatter oral, intravenøs, peri-toneal, intramuskulær eller transdermal tilførsel eller til-førsel til lunge eller luftrør i forstøvet tilstand ved hjelp av en nebulisator eller forstøver. Farmasøytisk aksepterbare bærerstoffer vil omfatte vann, saltvann og buffere, for å nevne bare noen få. Doseringsområdene vil vanligvis forventes å ligge mellom l ug til 1 000 ug pr. kilogram kroppsvekt pr. dag. Dosene kan imidlertid være høyere eller lavere, noe som kan bestemmes av en lege med gjennomsnittskunnskaper innen faget. For en fullstendig diskusjon av medikamentpreparater og doseringsområder, se Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996), og Goodman og Gilman's: The Pharmacological Bases of Thera-peutics, 9. utg. (Pergamon Press 1996).

Nukleinsyrebasert, terapeutisk behandling

Dersom et pattedyr har et mutert ZcytolO-gen eller mangler genet, kan ZcytolO-genet innføres i pattedyrets celler. I én utførelse utføres et gen som koder for et ZcytolO-polypeptid in vivo i en virusvektor. Slike vektorer omfatter et svekket eller defekt DNA-virus, f.eks., men ikke begrenset til, herpes simplex-virus (HSV), papillomavirus, Epstein Barr-virus (EBV), adenovirus, adeno-assosiert virus (AAV), og lignende. Defekte virus som fullstendig eller nesten fullstendig mangler virusgener, foretrekkes. Et defekt virus er ikke infeksiøst etter innføring i en celle. Anvendelse av defekte, virale vektorer tillater tilførsel til celler i et spesifikt, lokalisert område uten at man behøver å ta hensyn til at vektoren kan infisere andre celler. Eksempler på spesielle vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, en defekt herpes-virus 1 (HSV1)-vektor [Kaplitt et al.,"Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330.(1991)], en svekket adenovirusvektor, f.eks. vektoren beskrevet av Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90:626-630

(1992), og en defekt adeno-assosiert virusvektor [Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987), Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)].

I en annen utførelse kan genet innføres i en retro-viral vektor, f.eks. som beskrevet i Anderson et al., US patentskrift nr. 5 399 346, Mann et al., Cell, 33:153 (1983), Temin et al., US patentskrift nr. 4 650 764, Temin et al., US patentskrift nr. 4 980 289, Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988), Temin et al., US patentskrift nr. 5 124 263, internasjonal patentpublikasjon nr. WO 95/07358, publisert 16. mars 1995 av Dougherty et al., og Blood, 82:845 (1993). Alternativt kan vektoren innføres ved lipofeksjon in vivo ved benyttelse av liposomer. Syntetiske, kationiske lipider kan benyttes for fremstilling av liposomer for in vivo-transfeksjon av et gen som koder for en markør [Felgner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:7413-7417 (1987), se Mackey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Anvendelse av lipofeksjon for innføring av eksogene gener i spesifikke organer in vivo har visse praktiske fordeler. Molekylær målstyring av liposomer til spesifikke celler representerer et fordelaktig område. Det er åpenbart at direkte transfeksjon til spesielle celler representerer et fordelaktig område. Det er klart at styring av transfeksjonen til gitte celletyper vil være spesielt fordelaktig i et vev med cellulær heterogenitet, f.eks. bukspyttkjertel, lever, nyre og hjerne. Lipider kan kobles kjemisk til andre molekyler for å målstyre dem. Målstyrende peptider, f.eks. hormoner eller neurotransmittere, og proteiner som antistoffer eller ikke-peptidmolekyler, kan kobles kjemisk til liposomer. Disse liposomene kan også tilføres i sprayform i lunge eller luft-rør ved hjelp av en forstøver eller nebulisator.

Det er mulig å fjerne cellene fra kroppen og innføre vektoren som et nakent DNA-plasmid og deretter reimplantere de transformerte celler i kroppen. En naken DNA-vektor for genterapi kan.innføres i de ønskede vertsceller ved fremgangsmåter som-er kjent innen faget, f.eks. transfeksjon, eléktroporering,. mikroinjeksjony transduksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfatutfelling, benyttelse av en genpistol eller benyttelse av en DNA-vektortransportør [se f.eks. Wii et al., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988)].

ZcytolO-polypeptider kan også benyttes for fremstilling av antistoffer som spesifikt bindes til ZcytolO-polypeptider. Disse antistoffene kan så benyttes for fremstilling av antiidiotypiske antistoffer. Som benyttet heri, omfatter begrepet "antistoffer" polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, antigenbindende fragmenter av disse, f.eks,, F(ab'J2- og Fab-fra^menter, og lignende, innbefattet genetisk modifiserte antistoffer. Antistoffer defineres som spesifikt bindende dersom de bindes til et ZcytolO-polypeptid med en Ka som er større enn eller lik 10<7>/M. Et monoklonalt antistoffs affinitet kan lett bestemmes av en gjennomsnittsfagmann (se f.eks. Scatchard, ibid.).

Fremgangsmåter for fremstilling av polyklonale og monoklonale antistoffer er velkjente innen faget (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. (Cold Spring Harbor, NY, 1989), og Hurrell, J.G.R., red., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982), som inkorporeres heri ved referanse). Gjennomsnittsfagmannen vil vite at polyklonale antistoffer kan frembringes fra en rekke varmblodige dyr, f.eks. hest, ku, geit, sau, hund, kylling, kanin, mus og rotte. Immunogenisiteten av et ZcytolO-polypeptid kan forsterkes ved benyttelse av en adjuvans, f.eks. Freunds fullstendige eller ufullstendige adjuvans. En rekke analysefremgangsmåter kjent innen faget, kan benyttes for å påvise antistoffer som spesifikt bindes til ZcytolO-polypeptider. Eksempler på slike analyser beskrives i detalj .i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) . Representative eksempler på slike analyser omfatter samtidig immunelektro-forese, radioimmunanalyser, radioimmunutfellinger, enzym-koblede immunadsorpsjonsanalyser (ELISA), dot blot-analyser, inhiberings- eller konkurranseanalyser og "sandwich"-analyser.

Antistoffer mot ZcytolO kan benyttes for merking av celler som uttrykker proteinet, for affinitetsrensing, i diagnostiske analyser for å bestemme nivået i sirkulasjonen av løselige proteinpolypeptider og som antagonister for blokkering av signalbinding og signaloverføring in vi tro og in vivo.

Det beskrives også et farmasøytisk preparat som omfatter renset ZcytolO-polypeptid i kombinasjon med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff. Slike preparater kan være anvendbare for modulering av celleproliferasjon, celledifferensiering eller cytokinproduksjon for forebyggelse eller behandling av tilstander som særpreges ved ukorrekt celleproliferasjon, celledifferensiering eller cytokinproduksjon, som diskutert videre heri. Videre kan ZcytolO-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes i luft-rørsspesifikke eller trakeobronkialspesifikke anvendelser, f.eks. for opprettholdelse av eller sårheling i, det trakeo-bronkiale epitel eller celler som ligger under dette, for regulering av slimproduksjon eller mukociliær rensing for debris eller ved behandling av astma, bronkitt eller andre sykdommer i trakeobronkialkanalen. Det forventes at ZcytolO-polypeptid vil tilføres i en dose som ligger mellom dosene som benyttes for ZcytolO-Fc-konstruksjon og doser som er 100 ganger høyere, avhengig av ZcytolO-polypeptidets stabilitet. Terapeutiske doser av ZcytolO vil ligge mellom 5 og

5 000 ug/kg/dag.

ZcytolO-polypeptidet som beskrevet heri uttrykkes i høyt nivå i spyttkjertel og luftrør og er påvist i spytt ved Western-blot-analyse. Spyttkjertlene syntetiserer og ut-skiller en rekke proteiner med forskjellige biologiske funksjoner. Slike proteiner bidrar til å smøre munnhulen (f.eks. muciner og prolinrike proteiner), til remineraliser-ing (f.eks. statherin og ioniske, prolinrike proteiner) og til fordøyelse (f.eks. amylase, lipase og proteaser) og tilveiebringer antimikrobielle (f.eks. prolinrike proteiner, lysozym, histatiner og laktoperoksidase) evner og evnen til å opprettholde slimhinnenes integritet (f.eks. muciner). I tillegg er spytt en rik kilde for vekstfaktorer som syntetiseres av spyttkjertlene. Det vites at spytt f.eks. inneholder epidermal vekstfaktor (EGF), nervevekstfaktor (NGF), transformerende vekstfaktor-alfa (TGF-a), transformerende vekstfaktor-beta (TGF-P), insulin, insulinlignende vekstfaktorer I og II (IGF-I og IGF-II) og fibroblastvekstfaktor (FGF). Se f.eks. Zelles et al., J. Dental. Res. 74(12):1826-32, 1995. Syntese av vekstfaktorer i spyttkjertelen antas å være androgenavhengig og være nødvendig for sunnhetstil-standen til munnhulen og mage-tarmkanalen.

Således kan ZcytolO-polypeptider, agonister eller antagonister av disse være terapeutisk anvendbare for regenerering av mage-tarmkanalen eller munnhulen. For å bekrefte nærvær av denne evne i ZcytolO-polypeptider, agonister eller antagonister ifølge foreliggende oppfinnelse evalueres slike ZcytolO-polypeptider, agonister eller antagonister av disse når det gjelder evne til å nedbryte stivelse ifølge fremgangsmåter som er kjent innen faget. ZcytolO-polypeptider, agonister eller antagonister av disse kan være anvendbare for behandling av astma og andre sykdommer i trakeobronkialkanalen, f.eks. bronkitt og lignende, ved at de inngriper i kryssreguleringen av Thl- og Th2-lymfocytter, vekstreguler^ ing, differensiering og cytokinproduksjon i andre inflamma-toriske, cellulære formidlere, f.eks. eosinofile celler, mastceller, basofile celler, nøytrofile celler og makrofager. ZcytolO-polypeptider, agonister eller antagonister av disse kan også modulere muskeltonus i trakeobronkialkanalen.

ZcytolO-polypeptider kan også benyttes for behandling av en rekke hudtilstander, enten systemisk eller lokalt ved plassering i en salve eller krem, f.eks. eksem, psoriasis eller tilstander med tørr hud generelt, eller for beslektede hudtilstander. Videre kan ZcytolO-polypeptidet injiseres direkte i muskel for behandling av muskelatrofi hos eldre, syke eller sengeliggende.

Strålingshybridkartlegging er en somatisk, celle-genetisk teknikk utviklet for fremstilling av kontinuerlige kart med høy resolusjon over pattedyrkromosomer [Cox et al., Science 250:245-250 (1990)]. Delvis eller fullstendig kjennskap til et gens sekvens tillater utforming av PCR-primere som er anvendbare for benyttelse med kromosomale strålingshybridkartleggingspaneler. Kommersielt tilgjengelige strålingshybridkartleggingspaneler som dekker hele det humane genom, er tilgjengelige, f.eks. "Stanford G3 RH"-panelet og "GeneBridge 4 RH"-panelet (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Disse paneler tillater hurtig PCR-basert kromosomlokalisering og ordning av gener, sekvensmerkede seter (STS) og andre ikke-polymorfe og polymorfe markører innenfor et område av interesse. Dette omfatter å etablere direkte proporsjonale, fysiske avstander mellom nylig opp-dagede gener av interesse og tidligere kartlagte markører. Nøyaktig kjennskap til et gens posisjon kan være nyttig på en rekke måter, innbefattet: 1) å bestemme hvorvidt en sekvens er del av et eksisterende kontig og erholdelse av ytterligere omliggende, genetiske sekvenser i forskjellige former, f.eks. som YAC-, BAC- eller cDNA-kloner, 2) å tilveiebringe et mulig kandidatgen for en arvelig sykdom som viser kobling til det samme kromosomale område, og 3) for kryssreferanse til modellorganismer, f.eks. mus, noe som kan være nyttig for å bidra til å bestemme hvilken funksjon et gitt gen kan ha.

Resultatene viste at ZcytolO-genet kan kartlegges til 889.26 cR_3000 fra toppen i den humane kromosom 1-koblingsgruppe på WICGR-strålingshybridkartet. De proksimale og distale rammeverksmarkører var D1S504, hhv. WI-9641 (D1S2427). Anvendelsen av de omliggende markører plasserer ZcytolO-genet i lq32.2-området i det integrerte LDB kromosom 1-kart (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW-server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/pub-lic_html/). Flere gener er kartlagt til lq32.2-området på kromosom 1. Nærmere bestemt er mutasjoner i dette området blitt vist å føre til van der Woude-syndrom, forbundet med misdannelse av underleppen som noen ganger er forbundet med hareskår. Således kan ZcytolO-genet, som uttrykkes i spyttkjertelen, benyttes for genterapi av dette syndrom. Dersom et pattedyr har et mutert ZcytolO-gen eller mangler genet, kan ZcytolO-genet innføres i pattedyrets celler.

En annen utførelse som beskrives omfatter antisense-polynukleotidpreparater som er komplementære til en del av polynukleotidet som beskrives i SEKV.ID. NR:1, 3, 18 og 33. Slike syntetiske antisense-oligonukleotider er utformet slik at de bindes til mRNA som koder for ZcytolO-polypeptider og inhiberer translasjonen av slike mRNA. Slike antisense-oligonukleotider er anvendbare for inhibering av ekspresjonen av ZcytolO-polypeptidkodende gener i cellekultur eller i et individ.

Det beskrives også reagenser som kan anvendes i diagnostiske anvendelser. For eksempel kan ZcytolO-genet, en probe som omfatter ZcytolO-DNA eller -RNA eller en undersekvens av dette, benyttes for å fastslå hvorvidt ZcytolO-genet foreligger på kromosom 1 eller hvorvidt en mutasjon har skjedd. Påvisbare kromosomforstyrrelser ved lokus for ZcytolO-genet omfatter, men er ikke begrenset til, aneuplodi, endret genkopitall, insersjoner, delesjoner, restriksjons-seteendringer og omordninger. Slike unormaliteter kan påvises ved å benytte polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse i molekylærgenetiske teknikker, f.eks. analyse av restrik-sjonsfragmentlengdepolymorfi (RFLP), analyse av korte tandem-repetisjoner (STR) med PCR-teknikker, og andre teknikker for analyse av genetisk kobling som er kjent innen faget [Sambrook et al., ibid., Ausubel et al., ibid., Marian, A.J., Chest, 108:255-265 (1995)].

Fagfolk vil forstå at sekvensene som beskrives i SEKV.ID. NR:2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 og 35, representerer et enkelt allel av ZcytolO-genene og -polypeptidene fra mus og menneske, og at allelisk variasjon og alternativ spleising forventes å forekomme. Alleliske varianter kan klones ved å gjennomsøke cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer ifølge standard fremgangsmåter. Alleliske varianter av DNA-sekvensen vist i SEKV.ID. NR:1, 3, 18 og 33, innbefattet slike som inneholder tause mutasjoner og dem i hvilke mutasjoner fører til aminosyresekvensendringer, er også beskrevet.

Sekvensen til ZcytolO har 7 motiver som gjør mRNA ustabil i det 3' ikke-translaterte område i posisjonene 706, 813, 855 og 906 i SEKV.ID. NR:1. Behandling av celler som uttrykker ZcytolO med sykloheksimid, kan redusere ustabil-iteten av mRNA. Se Shaw, G. et al., Cell 46:659-667 (1986). Videre kan det AT-rike 3' ikke-translaterte område endres genetisk eller -fjernes for ytterligere å fremme stabilitet av mRNA..'-

Anvendelse av ZcytolO for å fremme sårheling

Resultatene i eksempel 4 viser at ZcytolO spiller en rolle i sårheling. ZcytolO kan således påføres et sår eller brannsår for å fremme sårheling. ZcytolO kan tilføres systemisk i en dose på mellom 1 og 100 ug pr. kilogram kroppsvekt av pasienten. ZcytolO kan også påføres et sår ved hjelp av en salve eller krem som inneholder mellom 1 ng og 1 mg ZcytolO pr. gram salve eller krem. Se Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg. (Mack Publishing Co., Easton, Pennv, 199.6) . ZcytolO bør^plasseres på et rengjort sår daglig inntil.såret er helet.

Anvendelse av ZcytolO for å øke blodplatetallet

Som vist nedenfor i eksempel 7, har vi oppdaget at ZcytolO kan benyttes for å øke blodplatetallet. Dette er spesielt viktig for caricerpasienter som gjennomgår trombo-cytopeni grunnet kjemoterapi eller strålebehandling. ZcytolO kan tilføres terapeutisk sammen med et farmasøytisk aksepterbart bære rs t off.

Oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av de påfølgende eksempler.

Eksempel 1

Kloning av ZcytolO

Fullengdesekvensen av zcytolOxl (den lengste form) og zcytol0x2 (den korteste form) ble utledet ved benyttelse av 3' "RACE" og sekvensering av to dannede fragmenter (SEKV.ID. NR:10 og SEKV.ID. NR:11), fulgt av kunstig sammen-spleising av est-sekvensen vist i SEKV.ID. NR:5 med den overlappende sekvens fra de to 3' race-fragmentene ved hjelp av en datamaskin.

Et oligonukleotid, zcl5907 (SEKV.ID. NR:6) ble tilpasset området like oppstrøms (5') for det antatte metionin i zcytolO. Lengre nedstrøms ble et annet oligonukleotid, zcl5906 (SEKV.ID. NR:7), tilpasset området like oppstrøms for signalsekvenskløyvingssetet. Disse oligonukleotider ble benyttet.i 3' RACE-reaksjoner på "marathon"-cDNA

.fra humant luftrør. ZC15907 ble benyttet i den primære 3'

race-reaksjon og zcl5906 ble benyttet i den nestede 3' race-reaksjon. "MARATHON"-cDNA ble fremstilt ved benyttelse av "Marathon cDNA Amplification Kit" (Clontech, Palo Alto, CA) ifølge produsentens instruksjoner, med utgangspunkt i mRNA fra humant luftrør erholdt fra Clontech.

PCR-reaksjonene ble utført ifølge produsentens instruksjoner i "Marathon cDNA"-amplifiseringssettet med noen modifikasjoner i parametrene for varmesyklusene. Syklusparametrene som ble benyttet i den primære PCR-reaksjon, var:

94 °C 1 min 30 sek lx

94 °C 15 sek 68 °C 1 min 30x

72 °C 7 min 1 x

Syklusparametrene benyttet i den nestede PCR-reaksjon, var: 94 °C 1 min 30 sek lx, 94 °C 15 sek 68 °C 1 min 20 sek, 3 0X 72 °C 7 min lx.

De resulterende produkter ble fraksjonert i en 1,2% agarosegel (Gibco agarose), og to hovedbånd kunne observeres med tilnærmet 80 bp avstand. Båndene ble kuttet ut og gelrenset ved hjelp av "QIAEX"-resin (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Disse fragmenter ble så sekvensert, noe som tillot utledning av den fullstendige sekvens for zcytolO.

Eksempel 2

Northern- blot- analyse

"Human multiple tissue blots I, II, III" og "RNA Master Dot Blot" (Clontech) ble analysert for å bestemme vevsfordelingen av zcytolO. Et 45-mert antisenseoligonukleo-tid, SEKV.ID. NR:9, ble utformet ved benyttelse av est-sekvensen (SEKV.ID. NR:5 bp 100-145) og benyttet som probe.

15 pm av SEKV.ID. NR: 9 ble endemerket med <32>P ved benyttelse av T4-polynukleotidkinase (Gibco-BRL). Merkings-reaksjonen inneholdt 2 ul 5X "forward" kinasereaksjonsbuffer (Gibco-BRL), 1 ul T4-kinase, 15 pm SEKV.ID. NR:9, 1 ul 6 000 Ci/mmol <32>P gamma-ATP (Amersham) og vann til 10 ul. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 3 0 minutter ved 37 °C. Ikke-inkorporert radioaktivitet ble fjernet med en "NucTrap"-proberensingskolonne (Stratagene). Northern-blot fra flere vev og et humant RNA master-blot (Clontech) ble prehybridis-ert ved 50 °C i 3 timer i 10 ml "ExpressHyb" (Clontech) som inneholdt 1 mg 1aksernelke-DNA og 0,3 mg humant cot1-DNA (Gibco-BRL) som begge var blitt kokt i 3 minutter, satt på is i 2 minutter og så tilsatt til "ExpressHyb"-løsningen. Hybridiseringen ble utført over natten ved 50 °C. De innledende vaskebetingelser var som følger: 2X SSC, 0,1% SDS ved romtemperatur i 40 minutter med flere gangers skifte av vaskeløsning, og deretter IX SSC, 0,1% ved 64 °C (Tm-10) i 30 minutter. Filtrene ble så pålagt røntgenfilm i to dager.

Ekspresjon av zcytolO i northern-blotene viste et bånd på tilnærmet 1,2 kb i luftrør, et svakt bånd på 1,5 kb i mage og svakere bånd av begge størrelser i bukspyttkjertel. Dot-blotene viste nærvær av zcytolO i luftrør, spyttkjertel, placenta, testis, hud, prostatakjertel, binyrekjertel og skj oldbruskkj ertel.

Hos mus ble transkriptet funnet i nyre, skjelettmuskel, spyttkjertel, lever og hud.

Eksempel 3

Kromosomal plassering av ZcytolO

ZcytolO ble kartlagt til kromosom 1 ved benyttelse av den kommersielt tilgjengelige versjon av "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel" (Research .Genetics,. Inc., Huntsville, AL). "Stanford G3 RH-Panel" inneholder DNA i PCR-bar tilstand fra 83 strålingshybridklorier som dekker hele det humane genom, samt to kontroll-DNA (RM-donoren og A3-mottageren). En offentlig tilgjengelig WWW-server (http://shgc- www.stanford.edu) tillater kromosomlokalisering av markører.

For kartlegging av ZcytolO med "Stanford G3 RH Panel" ble 2 0 ul reaksjoner satt opp i en PCR-bar 96-brønners mikrotiterplate (Stratagene, La Jolla, CA) og benyttet i en "RoboCycler Gradient 96" programmerbar varmeblokk (Stratagene) . Hver av de 85 PCR-reaksjoner besto av 2 ul 10X KlenTaq PCR-reaksjonsbuffer (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 ul dNTP-blanding (2,5 mM av hver, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1 ul sense-primer, SEKV.ID. NR:6, 5' ATT CCT AGC TCC TGT GGT CTC CAG 3', 1 |nl antisense-primer, (SEKV.ID. NR:8) 5' TCC CAA ATT GAG TGT CTT CAG T 3', 2 ul "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 ul 50X Advantage KlenTaq-polymeraseblanding (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA fra en enkelt hybridklon eller kontroll og x ul ddH20 for et totalvolum på 20 ul. Reaksjonsblandingene ble tildekket med et likt volum mineralolje og forseglet. Betingelsene i PCR-varmeblokken var som følger: en innledende første syklus med 5 minutters denaturering ved 95 °C, 35 sykluser bestående av 1 minutts denaturering ved 95 °C, 1 minutts hybridisering ved 66 °C og 1,5 minutts primerforlengelse ved 72 °C, fulgt av en avsluttende primerforlengelse på 7 minutter ved 72 °C. Reaksjonsblandingene ble fraksjonert ved elektroforese i en 2% agarosegel (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Resultatene viste kobling av ZcytolO til ramme-verksmarkøren SHGC-36215 med en LOD-poengsum på >10 og i en avstand på 14.67cR_10000 fra markøren. Anvendelse av omliggende markører plasserer ZcytolO i lq32.2-området i det integrerte LDB-kart over kromosom 1 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW-server: http://cedar.genetics. soton.ac.uk/public_html/).

Eksempel 4

Anvendelse av ZcytolO for å fremme sårheling

Normale, voksne Balb/C-hunnmus ble benyttet i den foreliggende undersøkelse. Musene ble holdt i en dyrestall med 12 timers lys/mørkesyklus og ble gitt vann og labora-toriegnagerfor ad libiturn under undersøkelsen. De ble plassert enkeltvis i bur fra det kirurgiske inngrep.

På dagen for det kirurgiske inngrep ble dyrene bedøvet med ketamin (Vetalar, Aveco Inc., Ft. Dodge, IA)

104 mg/kg pluss xylazin (Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KS)

7 mg/kg i sterilt (filtrert gjennom 0,2 um filter) fosfatbufret saltvann (PBS) ved intraperitoneal injeksjon. Rygg-håret ble kuttet og huden befridd for hår med "NAIR" (Carter-Wallace, New York, NY) og deretter vasket med vann. 100% aloe vera-gel ble påført for å motvirke det alkaliske brannsår fra "NAIR"-behandlingen, hvoretter-dyrene, ble plassert på puter oppvarmet med sirkulerende vann inntil huden og den omliggende pels var tørr.

Dyrene ble så bedøvet med metofan (Pittman Moore, Mundelein, NJ) og den hårfrie rygg vasket med 70% etanol. Fire snitt, hvert på 0,5 x 0,5 cm, ble gjort gjennom huden og panniculus carnosus over det paravertebrale område på nivå med den lumbotoraksale ryggvirvel. Sårene og den omliggende, hårfrie hud ble dekket med et klebrig, semipermeabelt, tettende plaster, "BIOCLUSIVE" (Johnson & Johnson, Arlington, TX). Snittprofilen av snittene ble oppstreket gjennom plasteret over på en acetatfilm for senere vurdering av sårlukkingsparametrene.

Kontrollhud og sårhud ble prosessert på forskjellige tidspunkter (7 timer, 15 timer og 24 timer) ved benyttelse av "Qiagen RNeasy Midi"-settet. Kort beskrevet, ble hud (kontrollhud og sårområder) innveid og homogenisert i et passende volum lysisbuffer (RLT). Lysatene ble sentrifugert for å fjerne vevsrester, og et likt volum 70% etanol ble tilsatt til lysatene. Prøvene ble grundig sammenblandet og påsatt kolonner. Prøvene ble sentrifugert i 5 minutter og vasket én gang med 3,8 ml RWl-buffer og deretter to ganger med RPE

(2,5 ml hver gang). Total-RNA ble eluert med RNase-fritt vann. Ekspresjonsnivået i hudprøvene ble målt ved benyttelse av sanntids-PCR ("Perkin Eimer ABI Prism 7700"-sekvens-detektor).

Eksperimentet var utformet med en ikke-templat-kontroll, et standardsett og hudprøvene. Total-RNA fra musenyre ble benyttet for standardkurven. Tre sett av total-RNA fra hud (25 ng) ble benyttet i dette eksperiment i 7 timer (kontroll og sårvev), 15 timer (kontroll og sårvev) og 24 timer (kontroll og sårvev). Hver prøve ble utført in triplo ved entrinns RT-PCR på 7700-sekvensdetektoren. Den hjemmelagde "forward"-primer SEKV.ID. NR:36, revers primer SEKV.ID. NR:37 og "TaqMan"-proben fra Perkin Eimer (ZG-7-FAM) ble benyttet i eksperimentet. Betingelsene for entrinns RT-PCR var som følger: (RT-trinnet) 48 °C i 30 minutter, (PCR-trinn på 40 sykluser) 95 °C i 10 minutter, 95 °C i 15 sek-under, 60 °C i 1 minutt.

Ekspresjonsnivået av cytolO i kontroilhudprøvene • etter 7 og 15 timer var sammenlignbare, med 2,46 ng/ml hhv. 2,61 ng/ml. I kontroilhudprøven etter 24 timer var ekspresjonsnivået av ZcytolO null. Ekspresjonsnivået av cytolO i skadd hud etter 7 timer var 5,17 ng/ml (mer enn to gangers økning sammenlignet med kontrollprøven). Ekspresjonsnivået av cytolO i skadd hud etter 15 timer var 14,45 ng/ml (5,5 gangers økning sammenlignet med kontrollprøven).. Ekspresjonsnivået av cytolO i skadd hud etter 24 timer var 5,89 ng/ml. Et gjentatt forsøk som også omfattet en negativ kontroli . Cgjær-tRNA) , viste tilsvarende tendens, og resul-tåtet for gjaer-tRNA var nær null. Resultatet tyder på at amplifikasjonen var reell og musespesifikk.

Disse resultater tyder på at ZcytolO spiller en rolle i sårheling siden ekspresjonsnivået av ZcytolO i skadd vev var forhøyet, sammenlignet med kontrollprøven, og at nivået økte og avtok méd tiden. Således kan ZcytolO påføres sår for å fremme sårheling.

Eksempel 5

Transgene mus

Transgene mus som uttrykte ZcytolO, enten kontroll-ert av albuminpromoteren eller metallotioninpromoteren, ble fremstilt. Ved fødselen hadde mange av musene et glinsende utseende og begrenset bevegelsesevne. Huden til disse musene var stram og rynket, flere hadde også et værhår1ignende hår på underleppen. Områdene rundt nesebor og munn, ekstremi-tetene og halen var oppsvulmet.

Én transgen mus i hvilken albuminpromoteren ble benyttet, overlevde inntil dag 3 og viste alvorlig vekst-hemming. Øret var ikke utviklet, og utvikling av tær var redusert. Alle dyr ble avlivet da de var nær døden på dag 1, 2 eller 3. Haler og leverprøver ble oppsamlet, og disse ble fiksert in situ i 10% nøytralt formalin, innstøpt i paraffin, og 3 mikrometer snitt fremstilt og farget med H&E. Alle mus med denne fenotype var transgene og hadde lav til høy ekspresjon av ZcytolO.

Ingen signifikante endringer ble observert i de fleste vev, bortsett fra huden. Huden hos zcytolO-uttrykkende museunger, særlig hos mus med høy ekspresjon av ZcytolO, var noe tykkere enn hos ikke-uttrykkende unger. Stratum granulo-sum hos disse museungene var tilsynelatende redusert i tykkelse sammenlignet med de ikke-uttrykkende ungene, mens stratum spinosum var tykkere grunnet økt antall cellelag og/eller økt cellediameter.

I tillegg til endringene i epidermis var dermis hos én mus med middels høy ekspresjon av ZcytolO moderat utvidet fokalt av slimaktig materiale.

Eksempel 6

Rensing av ZcytolO fra et celledyrkningsmedium

ZcytolO fremstilt av CHO-celler, ble isolert fra celledyrkningsmediet ved benyttelse av en totrinnsmetode som omfattet kationbytterkromatografi og størrelseseksklusjons-kromatografi.

A. Kationbytterkromatografitrinn

Benyttede materialer

2,2 cm diameter (D) x 6 cm høyde (H) kolonne (AMICON), pakket med et SP-650M kationbytterresin, som er et "TOYOPEARL"-ionebytterresin med kovalent bundne sulfopropyl (SP)-grupper.

15 1 dyrkningsmedium fra "baby hamster kidney"

(BHK)-celler transfektert med et ZcytolO-holdig plasmid, ble oppsamlet. pH i dyrkningsmediet ble justert til pH 5 med 2 N HC1. Den ovenfor beskrevne, pakkede kolonne ble ekvilibrert med 50 mM natriumacetat, NaAc, pH 5,0. Dyrkningsmediet ble påsatt kolonnen med en gjennomstrømningshastighet på 20 kol-onnevolumer (cv)/time, tilsvarende tilnærmet 8 ml/min. Etter påsetting av prøven ble kolonnen vasket med 10 cv 50 mM NaAc, pH 5,0. Materialet i kolonnen ble så eluert med 2 0 cv NaCl-gradient i 50 mM NaAc, pH 5,0. NaCl-gradienten gikk fra 0 til 0,5 M NaCl. Dette konsentrerte materialet i dyrkningsmediet fra 15 1 til 170 ml.

De resulterende 170 ml ble videre konsentrert til tilnærmet 5 ml med en sentrifugekonsentrator (Millipore, Inc., Bedford, MA) med grenseverdi 5 000 dalton.

B. Størrelseseksklusjons (S-100)-gelfiltreringstrinn

Benyttede materialer

Kolonne 1,6 cm (diameter) x 93 cm (høyde)

S-100-gel (Pharmacia, Piscataway, NJ)

De 5 ml med produkt fra forrige trinn ble så påsatt den ovenfor beskrevne kolonne som inneholdt S-100-gel. Kolonnen var ekvilibrert med 5X fosfatbufret saltvann slik at kolonnens pH var tilnærmet 7,0. ZcytolO ble isolert fra forurensende stoffer ved benyttelse av IX PBS ved en gjennom-strømningshastighet på 1,5 ml/min. Fraksjoner på 2 ml ble oppsamlet. ZcytolO-polypeptidet kornut i fraksjonene 52-64, tilnærmet 90 minutter etter at elueringen ble startet, bestemt ved natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel-elektroforese farget med Coomassie Blue. Gelen viste ett bånd med den forventede molekylvekt på tilnærmet 14 kDa.

Eksempel 7

Kloning av ZcytolO fra mus

PCR-primerne 5' "MARATHON RACE" (Clontech, Palo Alto, CA) primersett SEKV.ID. NR:38 koblet til "MARATHON" API-adapter, nestet med SEKV.ID. NR:39 koblet til AP2 "MARATHON"-adapter med 3' "MARATHON RACE"-primersett SEKV.ID. NR:40 koblet til "MARATHON RACE" APl-adapter, nestet med SEKV.ID. NR:41 koblet til "MARATHON RACE" AP2-adapter, og 5" og 3' race ble utført på "MARATHON RACE"-cDNA fra musehud. Flere fragmenter fra disse reaksjoner ble .gelrenset og sekvensert, noe som tillot utledelse av fullengde kodende sekvens for zcytolO fra mus samt noe 5' og 3<1> UTR-sekvens. To muse-ZcytolO-varianter ble oppdaget, nemlig SEKV.ID. NR:18 og 19 og SEKV.ID. NR:33 og 34. Klonene ble amplifisert ved PCR ved benyttelse av primerne SEKV.ID. NR:42 og 43.

Eksempel 8

Tilførsel av ZcytolO til normale mus ved hjelp av adenovirus

ZcytolO ble tilført ved hjelp av adenovirus som inneholdt ZcytolO-genet. Tre grupper med mus ble benyttet som beskrevet nedenfor. Adenovirus ble injisert intravenøst i C57B1/6 hann- og hunnmus. Alle mus ble gitt bromdeoksyuridin (BrdU) i drikkevannet 3 dager før avlivning. Dette tillot påvisning av celleproliferasjon ved histologiske metoder. De målte parametere omfattet vektendring, komplette blodcelletall, serumkjemi, histologi, organvekt og celleproliferasjon, målt med BrdU.

Eksperimentelt oppsett

Resultater

Den mest slående virkning var en signifikant økning i blodplatetallet som ble observert i hannmus og hunnmus be-handlet med ZcytolO-adenovirus, sammenlignet med tom adeno-viruskontroll. Dette ble ledsaget i hannmus av en redusert hematokritt og forhøyet vekt av milt og lever. Vekten av thymus var også redusert hos hanner. I motsetning til dette viste ZcytolO-adenovirusbehandlede hunnmus signifikant for-høyede hvite blodcelletall, primært grunnet forhøyet antall av lymfocytter og nøytrofile celler sammenlignet med den tomme viruskontroll.

Disse resultater tyder på at hematopoesen påvirkes av ZcytolO-behandling, men bortsett fra det forhøyede blodplatetall som påvirket begge kjønn, er andre virkninger kjønnsspesifikke.

Andre virkninger omfattet følgende:

Glukosenivået hos hunnmus var lavere i behandlede grupper, mens gruppene av behandlede hanner ikke viste signifikant endring.

Ureanitrogen i blod (BUN) var høyere både i gruppen med behandlede hanner og gruppen med behandlede hunner.

Alkalisk fosfatåse var høyere hos hunnmus i den behandlede gruppe, mens hannmusene ikke viste signifikant endring.

Blodplatetallet var høyere både i gruppen med behandlede hanner og gruppen med behandlede hunner.

Totalt antall hvite blodceller (WBC) hos hunner var høyere i de behandlede grupper, mens hannmusene ikke viste signifikant endring.

Claims

1. Isolert polynukleotid som koder for et polypeptid, karakterisert ved at polypeptidet er minst 80% identisk med ett eller flere av polypeptidene utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR: 2 0., SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35, der polypeptidet har samme biologiske aktivitet som ZcytolO sqm definert ifølge SEKV.ID. NR:2.

2. Isolert polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidet koder for et polypeptid som inneholder en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV^ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35.

3. Isolert polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:1, SEKV.ID. NR:3, SEKV.ID. NR:18 og SEKV.ID. NR:33.

4. Isolert polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det koder for et . polypeptid utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:14, SEKV.ID. NR:15, SEKV.ID. NR:16, SEKV.ID. NR:17, SEKV.ID. NR:21, SEKV.ID. NR:22, SEKV.ID. NR:23, SEKV.ID. NR:24, SEKV.ID. NR:27, SEKV.ID. NR:28, SEKV.ID. NR:29, SEKV.ID. NR:30, SEKV.ID. NR:31 og SEKV.ID. NR:32.

5. Isolert polynukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at det koder for et polypeptid som er minst 90% identisk med ett eller flere polypeptider utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19,. SEKV.ID. NR: 20, SEKV. ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35, der polypeptidet har samme biologiske aktivitet som ZcytolO som definert ifølge SEKV.ID. NR: 2.

6. Isolert polypeptid, karakterisert ved at det er minst 80% identisk med ett eller flere polypeptider utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35,der polypeptidet har samme biologiske aktivitet som ZcytolO som definert ifølge SEKV.ID. NR:2.

7. Isolert polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV,ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR:35.

8. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:14, SEKV.ID. NR:15, SEKV.ID. NR:16, SEKV.ID. NR:17, SEKV.ID. NR:21, SEKV.ID. NR:22, SEKV.ID. NR:23, SEKV.ID. NR:24, SEKV.ID. NR:27, SEKV.ID. NR:28, SEKV.ID. NR:29, SEKV.ID. NR-.30, SEKV.ID. NR: 31 og SEKV.ID. NR:32.

9. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det er minst 90% identisk med et polypeptid utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34 og SEKV.ID. NR.-35, der polypeptidet har samme biologiske aktivitet som ZcytolO som definert ifølge SEKV.ID. NR:2.

10. Antistoff, karakterisert ved at det selektivt bindes til et polypeptid utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR:2, SEKV.ID. NR:4, SEKV.ID. NR:12, SEKV.ID. NR:13, SEKV.ID. NR:19, SEKV.ID. NR:20, SEKV.ID. NR:25, SEKV.ID. NR:26, SEKV.ID. NR:34, SEKV.ID. NR:35, SEKV.ID. NR:14, SEKV.ID. NR:15, SEKV.ID. NR:16, SEKV.ID. NR:17, SEKV.ID. NR:21, SEKV.ID. NR:22, SEKV.ID. NR:23, SEKV.ID. NR:24, SEKV.ID. NR:27, SEKV.ID. NR:28, SEKV.ID. NR:29, SEKV.ID. NR:30, SEKV.ID. NR:31 og SEKV.ID. NR:32.