NO326104B1 - Nye IFN-reseptor -1-bindende proteiner, DNA som koder for dem og metoder for modulering av cellulaer respons for interferoner - Google Patents

Description

Oppfinnelsens felt

Foreliggende oppfinnelse angår generelt den molekylære mekanismen ved interferonvirkningen og, mer spesifikt, nye interferonreseptor-1-bindende proteiner, rekombinante DNA-molekyler som koder for dem og metoder for modulering av cellulær respons for interferon.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Type I interferoner (IFN-a og -13 subtyper) gir pleiotropiske effekter på celler, slik som hemming av virusreplikasjon (antiviral effekt), hemming celleproliferasjonen (antitumoral effekter), og modulering av immune celleaktiviteter (immunoregulatoriske effekter). Disse multiple effektene til ets of interferoner (IFNs) er korrolert med morfologiske og biokjemiske modifikasjoner av celler (Revel, 1984, for oversikt).

Interferoner utøver sine aktiviteter ved artsspesifike reseptorer. For rype I IFNs, har to transmembrane reseptorkjeder blitt identifisert IFNAR1 (Uze et al, 1990) og IFNAR2-2 (eller IFNAR2-C, Domanski et al, 1995). Transduksjon av signalene generert av IFN-a, B, co involverer protein-tyrosine-kinaser av Janus kinase(Jak) familien og transkripsjonsfaktorer av Stat-familien (Darnell et al, 1994). Proteiner i Jak-Stat baneneblir aktivert ved binding til de intracytoplasmiske (IC) områdene av IFNAR1-og IFNAR2-reseptorkjedene. Blant proteinene som binder til IFNAR1 IC - området er tyk2 og Stat2 (Abramovich et al, 1994). Stat2 vil så rekruttere Statl for å danne det IFN-induserte ISGF3-transkcripsjonskomplekset som aktiverer IFN-induserte gener (Leung et al, 1995). Transkripsjons-komplekser inneholdende Stat3 blir også indusert av IFN-J3 (Harroch et al, 1994) og en IFN-avhengig binding av Stat3 til IFNAR1-IC ble observert (Yang et al, 1996). Protein-tyrosinefosfatase PTP1C og D assosierte reversibelt med IFNAR1 etter IFN -tilsetning (David et al, 1995a). I tillegg binder to serine/treonin-proteinkinaser, 48 kDa ERK2 MAP-kinasen (David et al, 1995b) med cAMP-aktiverte protein-kinase A (David et al, 1996) til de isolerte membran-proksimale 50 restene av IFNAR1-IC. Derfor tjener I IFN-receptor IC-områdene som "docking"-sete for multiple proteiner som tjener til å generere og regulere de biologiske effektene av IFNs på celler.

To-hybrid-screening i gjær er en kraftig metode for identifisering av nye proteiner som binder til definerte polypeptisekvenser (Fields and Song, 1989). Kort sagt blir to-hybrid-screeningen utført ved transfektering av gjærcellene med (a) et plasmid-DNA i hvilket det definerte polypeptidet (agn) er sammenkoblet til det DNA-bindende området til Gal4-transkripsjons-faktoren, og (b) et cDNA-bibliotek sammenkoblet til aktiveringsområdet for Gal4 i et pACT-plasmid. Gjærceller som er transfektert med et cDNA som koder for et protein som binder til polypeptid-åtet vil så rekonstituere Gal4-aktiviteten. Nærværet av et slik protein som binder til polypeptid-åtet blir avslørt ved ekspresjonen av en enzymaktivitet, slik som B-galactosidase, fra et GALI- lacZ - konstrukt som fortrinnsvis blir introdusert i gjærgenomet. Fra gjær som er positive i denne testen, er det mulig å isolere pACT-plasmidet, for å bestemme nukleotidsekvensen til dets insert og å identifisere proteiner som det koder for. Denne metoden har tillatt identifiseringen av nye proteiner som vekselvirker med IC-området på cytokin-receptorer (Boldin et al, 1995).

NCB1 sekvens HSU83236, Yuan, O, 2. januar 1997, beskriver nukleotid- og aminosyrsekvens for Snk, et Ser/Thr proteinkinase-assosiert protein.

Nikawa et al, Gene, 1996, vol. 171, no. 1, s. 107-111, omhandler HSP1-gener som kan undertrykke vekstdefekter av Saccaromyces cerevesiae.

Angivelse av dokumenter heri er ikke ment å være en innrømmelse av at slike dokumenter er relevant kjent teknikk, eller ansett å være foregripende for patenterbarheten for noen av foreliggende søknads krav. Et hvilket som helst utsagn om innhold eller dato for noen av dokumentene er basert på informasjon som var tilgjengelige for søkeren på søknadstidspunktet og utgjør ingen innrømmelse av riktigheten av et slik utsagn.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse et rekombinant DNA-molekyl som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et IFNARl-reseptorbindende protein som er i stand til å bli indusert av IFN-a eller IFN-B og som har aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO:2 eller SEQ ID NO:8.

I en utførelsesform omfatter det rekombinante DNA-molekylet ytterligere omfatter en promoter operativt forbundet til nevnte sekvens som koder for et IFNARl-reseptor-bindende protein i en sense-orientering slik at nevnte promoter er i stand til å uttrykke nevnte protein når det rekombinante DNA-molekylet er i en passende ekspresjonsvert.

Foreliggende oppfinnelse angår også et rekombinant DNA-molekyl som omfatter et DNA-molekylet omfattende nukleotidsekvensen SEQ ID NO:l eller SEQ ID NO:7, enten i sense eller antisense orientering, eller et fragment derav som er i stand til å hybridisere til mRNA som koder for et interferon-induserbart UFNAR1 reseptorbindende protein og derved hindre dets ekspresjon.

Foreliggende oppfinnelse angår også en vertscelle som er i stand til å uttrykke et antisense RNA som er komplementær til et sense RNA som koder for et interferon-induserbart IFNAR1 reseptorbindende protein, hvilken celle inkluderer en ekspresjonsvektor som angitt ovenfor.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser interaksjonen av IR1B1 Med IFNARl-IC-området målt ved to hybrids genetisk interaksjonsanalyse i gjær. I den innrammede nedre delen av figuren er cDNA-insertet i pACT vist som kombinert med forskjellige "åter". Figur 2 viser interaksjonen av IR1B4 med IFNARl-IC-området målt ved to-hybrid genetisk intereaksjonsanalyse i gjær. I den nedre innrammede delen av figuren er cDNA-insertet i pACT indikert kombinert med forskjellige "åter". Figur 3 viser nukleotidet (SEQ ID NO:l) og aminosyresekvensen (SEQ ID NO:2) av IR1B1. Figur 4 viser ho mo logien og tilpasningen av aminosyresekvensen til IRI Bl (SEQ ID NO:2) med aminosyresekvensen til to kalsiumbindende proteiner calcineurin B (forkortet CALB; SEQ ID NO:3) og caltractin (forkortet CATR; SEQ ID NO:4). Identiske aminosyrer i IRI Bl og CALB eller mellom CALB og CATR er vist ved symbolet " | " derimellom. Identitet mellom IRI Bl og CATR, men ikke med CALB, er vist ved symbolet":" derimellom. Regioner vist med uthevet skrift er de kalsiumbindende helix- loop-helix EF-hand-områdene. Figur 5 viser Northern blots av IRI Bl mRNA og 18S rRNA (nedre linje) i humane myeloma U266S celler hybridisert til IRI Bl cDNA og den hurtige og transiente induksjonene av IR1B1 etter behandling av cellene med enten IFN-a8 eller IFN-J3 i 2 timer eller 18 timer. Den første linjen er en kontroll uten IFN-behandling etter to timer. Figurene 6A og 6B er SDS-PAGE-spor som viser in v/Yro-interaksjonen av IR1B4 med det isolerte IFNARl-IC-området (Fig. 6A) og med celleekstrakter fra humane U266S og U266R-cellemembraner(Fig. 6B). I Fig. 6A, er de [<35>S] metionin-merkede translasjonsproduktene med eller uten flag-IRlB4 in v/Yro-transkriper enten immunopresipitert (10 ul) med anti-flag M2-perler (spor 1 og 4), eller reagert(50 ul) med glutationperler koblet til GST fusert til det 100 aminosyrers lange IFNAR1-IC-området(spor 2 og 5) elller koblet til GST alene (spor 3 og 6). Etter inkubering over natten ved 4°C (endelig volum 100 ul), ble perlene vasket og SDS-eluerte proteiner kokt under reduserende betingelser før SDS-PAGE. I Fig. 6B, ble U266S (spo 1) eller U266R celler (spor 2) ekstrahert med Brij-buffer og antiproteaser (Abramovich et al, 1994) og 0.35 ml (IO<7> celler) ble inkubert med 75 ul [<35>S]metionin-merkede translasjonsprodukter av flag-IRlB4-transkripter over natten ved 4°C. Anti-IFNARl mAb R3 immobilisert på protein-G-perler (25 ul) ble tilsatt i 2,5 timer, vasket i Brij buffer, og SDS- eluert, kokt og reduserte proteiner analysert ved SDS-PAGE. En kontroll med anti-flag M2 -perler som ovenfor ble kjørt (spor 3). De tørkede gelene ble visualisert i en Phosphor-Imager. I de tre første sporene i Fig. 6A, ble intet IR1B4 mRNA tilsatt til in v/>ø-translasjonsreaksjonen. I de neste tre sporene i Fig. 6A, ble mRNA som koder for IRlB4-protein fusert til flagproteinet, translatert i et in vitro-system. Figur 7 viser nukleotidet (SEQ ID NO:7) og avledet aminosyresekvens (SEQ ID NO:8) til IR1B4. Figur 8 viser aminosyretilpasningen for IR1B4 (SEQ ID NO:8) og PRMT1 (SEQ ID NO:9) og forskjellene dem imellom Figur 9 viser aminosyretilpasningen for IR1B4 og HCP-1 (SEQ ID NO:10) og forskjellene dem imellom. Figur 10 viser en metyltransferaseanalyse. Ekstrakter av U266S celler ble reagert med perler belagt med Protein A og anti-IFNARl antistoff (spor 1) eller med Protein A alene (spor 2). Metyltransferase-aktivitet ble målt ved merking av histon-båndet ved elektroforese på SDS-PAGE. Figur 11 viser en analyse av protein-arginin-metyltransferase-aktivitet i U266S celler. I spor 1 ble protein-arginine-metyltransferase-aktiviteten til humane U266S celler målt ved metylering av peptid RI, som har sekvensen til SEQ ID NO: 11. i spor 2 ble et anti-sense oligonukleotid med SEQ ID NO: 12, som er komplementær til sekvensen til nukleotidene 12-33 rundt initieringskodonet til IR1B4 cDNA, tilsatt. I spor 3 ble det tilsvarende oligonukleotidet tilsatt. Det kan sees at anti-sense-oligonukleotidet hovedsakelig hemmer protein-arginin-metyltransferase-aktiviteten, mens kontroll-sens-oligonukleotidet har liten effekt.Figur 12 er en kure som viser veksthemming til humane

U266S celler som respons til IFN-B-behandling i nærvær eller fravær av anti-sense-oligonukleotidet benyttet i Fig. 11 (AS-1), det tilsvarende sense-oligonukleotidet (S-3), og et annet anti-sense-oligonukleotid rettet mot midten av IR1B4 cDNA (AS-2). Celledensiteten ble kvantifisert ved en fargetest med Alamar Blue (se eksempel 7) og reduksjonen i celledensitet ble beregnet i prosent av ubehandlede kontrollbrønner og ble plottet som veksthemming.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår oppdagelsen av to nye humane proteiner som vekselvirker med det intracytoplasmiske området (IC) av IFNAR1-kjeden av interferon type 1 (IFN-a, B eller w)-reseptoren og er heri betegnet som IFN Receptor Binding protein 1 (IR1B1) og IFN Receptor Binding Protein 4 (IR1B4). Interaksjonen av disse to nye proteinene med IFNAR1 ble demonstrert med en to-hybrid genetisk test i gjær hvor transfeksjon av gjær-reporter-stammen SFY526 (Bartel et al., 1993) med IR1B1 eller IR1B4 cDNA sammensmeltet til Gal4-aktiveringsområdet resulterte i B-galactosidase-aktivitet kun når IFNARl-IC-området (sammensmeltet til det Gal4 DNA-bindende området) ble benyttet som åte..

Sekvensen av IR1B1 cDNA koder for et polypeptid på 191 aminosyrer.

Komputerundersøkelser av sekvensdatabaser avslørte at IRI Bl er et nytt protein som viser markert homologi, for eksempel kalsiumbindings-seter (E_F-skaft), med de kalsiumbindende proteinene calcineurin B og caltractin. Calcineurin B (Guerini et al, 1989)er en 19 kDa subenhet av en serin/treonin-fosfatase som spiller en nøkkelrolle i aktivering av translokasjonen av transkipsjonsfaktor NFAT til kjernen av T-lymfocytter og som blir hemmet avimmunosuppressive medikamenter slik som cyclosporin. Caltractin (Lee and Huang, 1993), et 21 kDa protein, er et cytoskjelett-assosiert protein som blir funnet i centrosomer, og er involvert i bevegelsen av kromosomer under mitosen og mer generelt i microtubuli-organiseringssentere. Således er det nye IR1B1-proteinet et nytt medlem av calcineurin- og caltractin-familien av kalsiumreguleredne proteiner.Genet for IR1B1 ble overraskende funnet å bli hurtig aktivert i humane celler ved IFN-behandling. Dette er således det første eksempelet på et kalsiumbindende som blir aktivert ved IFN-behandling. De kalsiumioner regulerer cellemorfologien, adhesjonen og delingen, kan modulering av IR1B1-aktiviteten i celler påvirke responsen til normale og maligne celler overfor IFN. Rollen til IRI Bl i mediering av virkningen av IFN i celler blir støttet av interaksjonen av IR1B1 med IC-området av IFN-reseptorkjeden.

Mens IR1B4, som IR1B1, ble funnet å være et nytt protein ifølge computersøk av sekvensdatabaser, ble det også funnet at IR1B4 har en sekvenshomologi med enzymer som benytter S-adenosyl-metionin for metylering av arginin-rester i proteiner og er betegnet som protein-arginine-metyltransferaser (PRMTl; Kagan and Clarke, 1994; Lin et al., 1996). IR1B4 ble funnet å binde direkte til IC-orådet av IFNAR1 in vitro, og den konstitutive assosieringen av PRMT-aktivitet med IFNAR-kjeden av IFN-a, B-reseptoren isolert fra humane celler ble demonstrert ved metylering av histoner. Når anti-sense-oligodeoxynukleotider fra IR1B4 cDNA ble tilsatt til humane cellekulturer, ble reduksjon av PRMT-aktivitet i cellekulturen observert. Humane myeloma-celler som var behandlet på denne måten viste en sterkt redusert respons overfor IFN målt ved vektshemming. IR1B4/PRMT er således involvert i banen ved hvilken IFN-reseptoren forårsaker veksthemming i tumorceller og er også involvert i andre funksjoner til IFN-reseptoren. Kjente substrater for PRMT omfatter et antall RNA- og DNA-bindende proteiner og spesielt heterologe nuclære ribonukleoproteiner (hnRNPs). hnRNPs er involvert i mRNA-transport fra kjernen til cytoplasma, alternativ spleising av pre-mRNA, og post-transkriptsjonelle kontroller (Liu and Dreyfuss, 1995). Følgelig kan de nye humane IR1B4/PRMT cDNA og protein . Som ble oppdaget ved dets assosiasjon med IFN-reseptoren, bli benyttet for å modifisere responsen av humane eller animalske celler overfor IFN.Et rekombinant DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder en nukleotidsekvens som koder for IR1B1- eller IRlB4-proteinet, eller et fragment derav, og kan bli benyttet enten for å øke den cellulære responsen overfor IFN ved å øke ekspresjonen av IR1B1 eller IR1B4 cDNA eller å redusere den cellulære responsen overfor IF; ved reduksjon av ekspresjonen av IRI Bl- eller IRlB4-proteiner medanti-sense RNA molekyler.

Den økede in vivo ekspresjonen av IR1B1- eller IRlB4-cDNA vil være nyttig i cancerterapi hvor den økede cellulære responsen overfor IFN vil resultere i en reduksjon av cellevekst hos maligne celler og en øket respons til eksogen IFN-terapi. For å oppnå øket in vivo ekspresjon av IRI Bl og IR1B4 ved mållokasjonen for øket cellulær respons overfor IFN, kan ekspresjonsvektorer inneholdende IR1B1 eller IR1B4 cDNA operativt bundet i en sense orientering til en sterk konstitutiv promoter bli injisert direkte ved mållokasjonen, slik som i hjernetumorer eller metastatiske tumornoduler (for eksempel melanoma- eller bryst-cancer).

Motsatt, vil reduksjonen i in vivo ekspresjon av IR1B1- eller IRlB4-proteiner være nyttig i forlenging av overlevelsen av vevsimplantater da avvisningen av disse implantatene i verden blir mediert av histokompatibilitets antigener (MHC klasse I) hvis syntese avhenger av IFN stimulus. Når cDNA av IR1B1 eller IR1B4, eller fragmenter derav, båret på passende vektorer og operativt bundet i en anti-sense orientering til en promoter, blir introdusert inn cellene i vev som skal transplanteres, fører ekspresjonen av anti-sense RNA til degraderingen av IR1B1- eller IRlB4-mRNA (eller sense RNA for IR1B1/IR1B4) og en påfølgende reduksjon i de cellulære nivåene av IR1B1- eller IRlB4-protein.

Anti-sense RNA blir transkribert fra en oppstrøms promoter operativt bundet til en kodende sekvens orientert i anti-sense-retingen, dvs. motsatt av den normale eller sense-retningen av DNA og dets transkriberte sense-RNA (mRNA). Ekspresjonen av anti-sense RNA komplementært til sense RNA er en kraftig måte for regulering av de biologiske funksjonene av RNA-molekyler. Ved dannelsen av en stabil dupleks mellom sense RNA og anti-sense RNA, blir det normale eller sense RNA-transkiptet, gjort inaktivt og ikke-tranlaterbart. Rekombinante DNA molekyler, som utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, inneholder cDNA av IR1B1 eller IR1B4, eller fragmenter derav, operativt bundet til en promoter i enten en sense eller anti-sense orientering..

Uttrykket "promoter" er ment å omfatte en dobbeltstrenget DNA- eller RNA-sekvens som er i stand til å binde RNA polymerase og promotere transkripsjonen av en "operativt bundet" nukleinsyresekvens. En DNA-sekvens vil således være operativt bundet til en promotersekvens dersom promoteren er i stand til å påvirke transkripsjonen av DNA-sekvensen, uten hensyn til orienteringen av DAN-sekvensen. Typene promoterer benyttet for å kontrollere transkripsjonen kan være en hvilken som helst som er funksjonell i verts-/målcellene. Eksempler på funksjonelle mammalske celler omfatter SV40 tidlig- promoteren, adenovirus "major late" promoter, herpes simplex (HSV) tymidin-kinase-promoter, rous sarcoma (RSV) LTR promoter, human cytomegalovirus (CMV) "immediate early" promoter, "mouse mammary tumor virus"

(MMTV) LTR promoter, interferon B promoter, varmesjokk- protein 70 (hsp70) promoter, så vel som andre som er velkjent innen teknikken.En promoter som er operativt bundet til IR1B1- eller IRlB4-cDNA i sense-orientering for ekspresjon of IR1B1- eller IRlB4-protein er fortrinnsvis en sterk konstitutiv promoter. Dette tillater høye nivåer av IRI Bl eller IR1B4 uansett nærværet av endogene cellulære mekanismer for regulering av ekspresjonen av IR1B1 eller IR1B4.

Likeledes er promoteren som er operativt bundet til IR1B1- eller IRlB4-cDNA i anti-sense orienteringen, fortrinnsvis en sterk promoter, slik aom promoteren som er til stede i Epstein-Barr Virus (EBV) regulerende region som tillater høye nivåer av anti-sense RNA-ekspresjon (Deiss og Kimchi, 1991).

Anti-sense sekvensen er fortrinnsvis kun mulig å uttrykke i verts-/målceller og det uttrykte anti-sense RNA må være stabilt (dvs. det gjennomgår ikke hurtig degradering).Anti-sense RNA må kun spesifikt hybrisere til sense mRNA uttrykt i verts-/målcellene og danne et stabilt dobbelstrenget RNA-molekyl som er hovedsakelig ikke-translaterbart. Med andre ord, forhindrer anti-sense RNA uttrykt i verts-/målcellene det uttrykte mRNA fra å bli translatert til IR1B1- eller IRlB4-proteiner. Den vektor- bårne anti-sense sekvensen kan bæret enten hele IR1B1- eller IR1B4-cDNA-sekvensen eller kun en del derav, så lenge anti-sense-delen er i stand til å hybridisere til sense mRNA og forhindre dens translasjon til IR1B1- eller IR1B4-protein. Følgelig, er en "anti-sense" som benyttet gjennom hele beskrivelsen og kravene definert som hele anti-sense-sekvensen eller en del derav som er i stand til å ble uttrykt i transformerte/transfekterteceller, og som også er i stand til spesifikt å hybridesere til "sense" IR1B1- eller IRlB4-mRNA for å danne et ikke-translaterbart dobbelstrenget RNA-molekyl.Anti-sense-sekvensen trenger ikke å hybridisere til hele lengden av IR1B1- eller IRlB4-mRNA. I stedet kan den hybridisere til utvalgte regioner slik som den 5'-ikke-translaterte ikke-kodende sekvensen, den kodende sekvensen eller den 3'-ikketranslaterte sekvensen av "sense" mRNA. Fortrinnsvis hybridiserer anti-sense sekvensen til den 5'-kodende sekvensen og/eller til den 5'-ikkekodende regionen, slik som ved cap og initierings initieringssetene, da det har blitt observert med mange eksempler på anti-sense oligonukleotider at målsøking mot initieringskodonet er mer effektivt, mens målsøking av interne sekvenser innen den kodende regionen ikke er så effektiv (Wickstrom, 1991). Effektiviteten av en anti-sense-sekvens i forhindring av translasjon av IR1B4 sense mRNA kan lett bli testet i en analyse for protein-arginine-metyltransferase-aktivitet i U266S-celler som beskrevet i eksempel 7.1 lys av størrelsen på det humane genomet, er anti-sense IR1B1- eller IRlB4-sekvensen fortrinnsvis minst 17, mer foretrukket minst 30 basepar i lengde. Imidlertdi kan kortere sekvenser også benyttes, dvs. enten hybridiserer de ikke tilfeldign til andre mammalske sekvenser, eller slik "kryss-hybridisering" interfererer ikke med metabolismen i cellene på en måte og til en grad som forhindrer oppnåelsen av foreliggende oppfinnelses mål. Både det foretrukne hybridiseringsmålets og den foretrukne anti-sense-sekvensens lengde kan lett bestemmes ved systematiske eksperimenter. Standardmetoder slik som beskrevet i Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Assoc, New York, N.Y., 1987-1996, og Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) kan bli benyttet for systematisk å fjerne en stadig økende andel av anti-sense-sekvensen fra vektoren. Ved siden av full-lengde anti- sense-sekvensen, kan en serie forskjøvne delesjoner bli generert, fortrinnsvis ved 5'-enden av sense-sekvensen. Dette skaper et sett trunkerte anti-sense-sekvenser som likevel forblir komplimentære for fortrinnsvis 5'-enden av sense mRNA og som et resultat, fremdeles dannet et RNA-molekyl som er dobbelstrenget ved 5'-enden av sense mRNA (komplementerer 3'-enden av et anti-sense RNA) og forblir ikke-translaterbart. Videre, kan anti-sense-oligonukleotider lett bli syntetisert kjemisk og innført i en vektor i operativ forbindelse med en promoter for anvendelse i reduksjonen av in vivo cellulær ekspresjon of IR1B1 eller IR1B4 protein.

Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være hvilke som helst passende eukaryote eller prokaryote vektorer som normalt benyttes for transfektering av mammalske celler, slik som episomale, repliserbare eller kromosomalt integrerbare vektorer som er velkjent innen teknikken. En spesielt foretrukket vektor for ekspresjonen av IR1B1 eller IR1B4 anti-sense RNA er det episomale plasmidet inneholdende den Epstein-Barr Virus regulerende regionen (Deiss og Kimchi, 1991) for å tjene som promoteren som er opereativt bundet til IR1B1 eller IR1B4 cDNA ararngert i en anti-sense orientering relativt til denne regulerende regionen. Anvendelsen av anti-sense vectorer og oligonukleotide-fosforotioater er omtalt i Annals of the New York of Sciences: Gene Therapv for Neoplastic Diseases, eds. B.E. Huber og J.S. Lazo, Vol. 716, 1994 (e.g. Milligan et al, pp. 228-241).

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan overlevelsen til vev eller organer som er implantert hos en pasient som har behov for et slik implantat, bli forlenger ved å redusere den cellulare responsen overfor IFN. Avvisning av implantert vev blir mediert av histokompatibilitetsantigenene, hvor syntesen av disse MHC klasse I antigenene er avhengig av IFN stimulus. En reduksjon av cellulær respns overfor IFN-stimulus vil forlenge overlevelsen av implantert vev. Fremgangsmåten for forlenging av overlevelse for implantat ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter introduksjon inn i celler i vev eller organer som skal implanteres, av et rekombinant DNA-molekyl inneholdende en IR1B1- eller IR1B4- cDNA-sekvens eller fragmenter derav, operativt bundet til en promoter i anti-sense-orienteringen, hvorved anti-sense IR1B1 eller IR1B4 RNA blir uttrykt i slike transfekterte/transformerte celler. Det rekombinante DNA-molekylet kan bli innført i celler i et vev eller organ på en hvilken som helst måte som er kjent i teknikken å være tilpasset dette formålet. Etter innføringen av det rekombinante DNA-molekylet inn i cellene i vevet eller organet, kan vevet eller organet bli transplantert til en pasient som trenger slik transplantering.

En farmasøytins sammensetning inneholdende et rekombinant DNA-molekyl, som er en ekspresjonsvektor og som bærer IR1B1- eller IRlB4-cDNA operativt bundet til en promoter i en sense-orientering, kan bli injisert direkte inn i tumorer, for eksempel hjemetumorer eller metastatiske tumornoduler, for å gjøre cellene i disse tumorene mer mottakelige for eksogen IFN-terapi som behandling for cancer. Den økede cellulare respons for eksogen IFN-terapi vil føre til en hemming av malign cellevekst. Genoverføring in vivo eller ex vivo er veldokumentert, for eksempel i Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapv for Neoplastic Diseases, Vol. 716, 1994; se, for eksempel, "Direct Gene Transfer for the Understanding and Treatment of Human Disease" by G.E. Plautz på sidene 144-153, og "Mechanisms of Action of the p53 Tumor suppressor and Prospects for Cancer Gene Therapy by Reconstitution of p53 Function" by Roemer et al., på sidene 265-282. Fremgangsmåter for innsetting av rekombinante DNA-molekyler inn i cellene i et vev eller organ somskal transplanteres, omfatter adenovirus-, retrovirus-, adenovirus-assosiert virus(AAV) -vectorer, så vel som direkte DNA-injeksjon eller oligonukleotid-liposom-injeksjon. Kliniske tester hvor retrovirale vektorer blir injesert inn i hjenetumorer eller hvor adenovirus blir benyttet for å infisere celler i den øvre respiratoriske trakt til en pasient med cystisk fibrose, er velkjent.

Farmasøytiske sammensetninger omfattende det rekombinante DNA-molekylet som koder for IRI Bl eller IR1B4 cDNA, eller et fragment derav, enten i en sense eller anti-sense orientering med hensyn på en operativt bundet promoter, er ment å omfatte alle sammensetninger hvor det rekombinante DNA-molekyler er inneholdt i en mengde som er effektiv til å oppnå den tilsiktede virkning. I tillegg kan en farmasøytisk sammensetning inneholde farmasøytisk akseptable bærere eller hjelpestoffer som stabiliserer det rekombinante DNA-molekylet eller letter dets administrasjon.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er rettet mot molekyler som omfatter en antigen-bindende del av et antistoff som er spesifikt for IFN ARI -bindende proteiner IR1B1 eller IR1B4, eller fragmenter derav, for anvendelse i diagnostika, slik som immunodeteksjonsmetoder for å analysere nivået av IR1B1- eller IRlB4-proteiner i tumorvev oppnådd fra biopsier eller for anvendelse ved affinitetskromatografisk rensing av proteinet.

Uttrykket "antistoff er ment å omfatte polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer (mAbs), kimere antistoffer, anti-idiotypiske (anti-Id) antistoffer, enkelkjede antistoffer, og rekombinant produserte humaniserte antistoffer, så vel som aktive fraksjoner derav fremstilt ved en hvilken som helst kjent teknikk, slik som, men ikke begrenset til, enzymatisk spalting, peptidsyntese eller rekombinante teknikker.

Polyklonal antistoffer er heterogene populasjoner av antistoff-molekyler som er avledet fra dyr immunisert med et antigen. Et monoklonalt antistoff inneholder en hovedsakelig homogen populasjon av antistoffer som er spesifikke for antigener hvis populasjon inneholder hovedsakelig tilsvarende epitope bindingsseter. MAbs kan bli fremskaffet ved metoder som er kjent av fagmannen. Se for eksempel Kohler og Milstein, Nature 256:495-497 (1975); U.S. Patent No. 4,376,110; Ausubel et al, eds., supra, Harlow og Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory

(1988); og Colligan et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Greene Publishing Assoc. og Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), hvor innholdet i referansene i sin helhet er innlemmet heri som referanse. Slike antistoffer kan være av en hvilken som helst immunoglobulin-klasse, inkludert IgG, IgM, IgE, IgA, GILD og en hvilken som helst subklasse derav. En hybridoma som prodserrer et mAb ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dyrket in vitro, in situ eller in vivo. Produksjon av høye titere av mAbs in vivo eller in situ makes dette den for tiden mest foretrukne fremstillingsmetoden.

Kimere antistoffer er molekyler av forskjellige deler som er avledet fra forskjellige dyrearter, slik som de som har den variable regionen avledet fra et murint mAb og en human immunoglobulin konstant region. Kimere antistoffer blir primært benyttet for å redusere immunogenisiteten ved anvendelse og å øke produksjonsutbyttet, for eksempel hvor murine mAbs gir høyere utbytte fra hybridomas, men høyere immunogenisitet i mennesker, slik at human/murin kimert mAbs blir benyttet kimere antistoffer og fremgangmåter for deres produksjon er kjent i teknikken (Cabilly et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851- 6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al, European Patent Application 125023 (publisert November 14, 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al, European Patent Application 171496 (publisert February 19, 1985); Morrison et al, European Patent Application 173494 (publisert March 5, 1986); Neuberger et al, PCT Application WO 8601533, (publisert March 13, 1986); Kudo et al., European Patent Application 184187 (publisert June 11, 1986); Morrison et al., European Patent Application 173494 (publisert March 5, 1986); Sahagan et aL, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al, International Patent Publication, WO 9702671 (publisert 7 May 1987); Liu et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:214-218 (1987); Better et al, Science 240:1041- 1043 (1988); og Harlow og Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.

Et anti-idiotypisk (anti-Id) antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter som generelt er assosiert med antigen-bindings-setet til den same arten og genetiske typen(for eksempel musestamme) som kilde for mAb med mAb til hvilket et anti-Id blir fremstilt. Det immuniserte dyret vil gjenkjenne og respondere for de idiotypiske determinantene til det immuniserende antistoff ved å produsere et antistoff overfor disse idiotypiske determinantene (anti-Id antistoffet). Se, for eksempel, U.S. patent No. 4,699,880.

Anti-Id antistoff kan også bli benyttet som et "immunogen" for å indusere en immunrespons i enda et dyr, for å produsere et såkalt anti-anti-Id antistoff. Anti-anti-Id kan være epitopisk identisk med det originale mAb som induserte anti-Id. Således, ved anvendelse av antistoffer overfor de idiotypiske determinantene av et mAb, er det muli gå identifisere andre kloner som uttrykker antistoffer med identisk spesifisitet. Det må bli forstått av antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan være intakte antistoffer, slik som monoklonale antistoffer, men det er det epitope bindings-setettil antistoffet som gir den ønskede funksjon. Ed siden av det intakte antistoffet, kan således proteolytiske fragmenter derav, slik som Fab- eller F(ab')2- fragmenter, bli benyttet.. Fab- og F(ab')2 -fragmenter som mangler Fc-fragment til intakte antistoff, forsvinner hurtigere fra sirkulasjon og kan ha mindre ikke-spesifikk vevs-binding en et intakt antistoff (Wahl et al, J. Nucl Med. 24:316-325 (1983)). Slike fragmenter blir typisk produsert ved proteolytisk spalting ved anvendelse av enzymer, slik som papain (for å gi Fab-fragmenter) eller pepsin (for å gi F(ab')2 -fragmenter).

Videre, kan DNA som koder for den variable regionen av antistoffet, bli satt inn i andre antistoffer for å gi chimere antistoffer (se, for eksempel, U.S. Patent 4,816,567) eller inn i T-celle- reseptorer for å produsere T-celler med den samme brede spesifisiteten (se Eshhar, Z. et al, Br. J. Cancer Suppl, 10:27-9, 1990; Gross, G. et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:10024-8, 1989). Enkelkjedeantistoffer kan også bli produsert of benyttet. Enkeltkjede antistoffer kan være enkelkjede kompositte polypeptider som har antigenbindende evne og omfatter et par aminosyre sekvenshomologier med de variable regionene til en immunoglobulin lett og tung kjede (bundet VH-VL eller enkelkjede Fv). BådeVH og VL kan kopiere naturlige monoklonale antistoff-sekvenser eller en eller begge kjedene kan omfatte et CDR-FR-konstrukt av typen beskrevet i U.S. Patent 5,091,513. De separate polypeptidene som er analoge til de variable regionene av de lette og tunge kjedene, blir holdt sammen av en polypeptide-linker. Fremgangsmåte for fremstilling av slike enkle antistoffer, spesielt når DNA som koder for polypeptidestrukturene for VH - og VL -kjedene er kjent, kan bli utført ifølge fremgangsmåtene beskrevet i for eksempel U.S. Patentene 4,946,778, 5,091,513 og 5,096,815.

Uttrykket "et molekyl som omfatter den antigenbindende del av et antistoff er således med å omfatte ikke kun intakte immunoglobulin-molekyler av en hvilken som helst isotype og generert ved en hvilken som helst dyrecellelinje, men også reaktive fraksjoner derav, inkludert, men ikke begrenset til, Fab-fragmentet, Fab'-fragmentet, F(ab')2-rfagirient, variable deler av de tunge og/eller lette kjeder derav, og kimere eller enkeltkjede antistoffer som er innlemmet i en slik fraksjon, så vel som alle andre typer molekyler eller celler i hvilke slike antistoff-reaktive fraksjoner har blit fysisk innsatt, slik som en chimerisk T-celle-reseptor eller en T-celle som har en slik reseptor, eller molekyler utviklet for å levere terapeutiske grupper ved hjelp av en del av molekylet som inneholder en slik reaktiv fraksjon. Etter nå fullt å ha beskrevet oppfinnelsen, vil den samme bli lettere forstått med referanse til de følgende eksemplene som er gitt som eksempler og ikke er ment å være begrensende for foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1: To humane proteiner, IR1B1 og IR1B4, binder til IFN- reseptoren

Et cDNA-fragment som koder for hele IFNARl-IC-området amplifisert ved PCR ved anvendelse av en BamHl-sense primer (5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (SEQ ID NO:5)) og en EcoRI anti-sense primer (5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (SEQ ID NO:6)), ble klonet inn i en BlueScript vector (BS-SK<+>, Stratagene). BamHI-Sall-fragmentet fra denne BS-IFNAR1-IC ble innført i pGBTio -vektoren (CloneTech) og fusert i- fase etter det Gal4 DNA-bindende området(pGBT]0-IFNARl-IC) for to-hybrid skreening.

To-hybrid-skreening-metoden (Fields og Song, 1989) ble utført med den modifiserte prosedyren til Durfee et al (1993) ved anvendelse av pACT plasmid cDNA biblioteket fira humane Epstein-Barr Virus (EBV)-transformerte B- lymfocyter for å cotransfektere gjær reporter-stammen Y153 med pGBT]0-IFNARl-IC. Gjær Y153-stammenhar to reporter-gener under kontrollen av GALI Upstream Activating Sequences (UAS) som blir transkribert kun dersom aktiviteten av Gal4-transkripsjonsfaktoren blir rekonstituert.Dette krever at fusjonsproteinet som er kodet for av pACT-plasmidet som ble innført i denne spesielle gjærklonen, har affinitet for IFNARl-IC-området fra pGBT10 -plasmidet. Ett av reproterfenene er GALI His3, som tillater vekst i et medium som mangler histidin, det andre reportergenet er GAL-LacZ, som gir B-galactosidase-aktivitet. I tillegg har pACT-plasmidene Leu2-genet og pGBT]0-plasmidet har TRP1-genet som tillater vekst i et medium som mangler henholdsvis leucin og tryptofan. Kolonier ble valgt i syntetisk medium SC minus Trp, Leu, His nærvær av 25 mM 3-aminotriazole (som ytterligere selekterer for histidin- prototrofi). De voksende koloniene ble så testet for B-galactosidase-aktivitet ved anvendelse av X-gal filteranalysen(Breeden og Naysmith, 1985).

Ni positive gjærkloner ble fremskaffet og deres pACT-plasmider ble gjenvunnet ved transfeksjon inn i E. coli HB101 og seleksjon for leu<+> transformanter. For hvert gjær-DNA, ble to slike E. coli HB101 kloner isolert. Partiell DNA-sekvensering av pACT-plasmidene fra disse E. coli klonene viste at de falt i to grupper av cDNA-sekvenser som ble betegnet IR1B1 og IR1B4. pACT-plasmidene av IR1B1- og IRlB4-gruppene ble utsatt for spesifisitetstester ved kotransformasjon av SFY526-gjær reporterstammen (Bartel et al, 1993) med pAS -plasmider som inneholder harboring lamin, cdk2 og p53 eller andre kontrollinserter (CloneTech). Kolonier som vokser i SC -trp, -leu ble testet for B-galactosidase-ekspresjon. Fra de spesifikt positive pACT-plasmidene, ble inserter skåret ut med Xhol, klonet inn i BS-KS (Stratagene) og utsatt for sekvensering fra T7-og T3- promoterene ved anvendelse av DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing settet i en 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems).

Figur 1 viser resultatene for pACT klone IR1B1 co- transfektertinn i gjær SFY526 med forskjellige pAS eller pGBT]0 plasmid-åter. Gjærceller vokser i det selektive SC medium -trp, -leu istripe 1 til 9 på filteret. Farging med X-gal reagent (5-bromo-4-kloro-3-indolyl-B-D- galactopyranosid) var positiv kun i stripene 2 og 4. Som indikert i figur 1, er stripe 4 en kontrollgjær med et aktivt lacZ-gen. Strek 2 er en kombinasjon av IR1B1- og IFNAR1-IC -fusjonsproteiner. IR1B1 alene (strek 9), eller en hvilken som helst anen kombinasjon ved siden av IR1B1 og IFNAR1-IC, viste ikke noen B-galactosidase-aktivitet. Derfor er IR1B1 spesifikt i stand til å kombinere med IC-området av IFNAR1 IFN-reseptor-kjeden.

Tilsvarende viser figur 2 resultatene for pACT klone IR1B4 co-transfektert inn i gjær SFY526 med forskjellige pAS- eller pGBT]0 -plasmid-åter. Gjærceller vokser på SC medium - trp, leu i streker 1 til 8 på filteret og farging med X- gal reagent var positiv kun i streker 3 og 7. Som indikert i den nedre innrammede delen av fig 2, er strek 7 en kontroll gjærstamme med et aktivt lacZgen. Strek 3 er en kombinasjon av IR1B4- og IFNAR1-IC -fusjons-proteinene. Som for resultatene oppnådd med IR1B1, viste IR1B4 alene (strek 1), eller noen annen kombinasjon ved siden av IR1B4 og IFNAR1-IC, ikke noen J3-galactosidase-aktivitet. IR1B4 er derfor også spesifikt i stand til å kombinere med IC-området av IFNAR1 IFN reseptor-kjeden.

Eksempel 2: IR1B1 Proteinsekvens viser kalcium- Bindende EF- hand- seter. cDNA-insertet av pACT-IRlBl- plasmidene ble skåret ut med restriksjonsenzymet Xhol, klonet inn i en Bluescript BS-KS vektor og utsatt for sekvensering fra T7 og T3 promoterene ved anvendelse av DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing setteti en 373A DNA sekvensator (Applied Biosystems). Det lengste plasmidet hadde en sekvens på 830 nukleotider (Fig. 3) som følger Gal4-aktiveringsområdet og og linker-sekvensen av pACT plasmidet og en åpen leseramme på 191 aminosyrer ble funnet deri (Fig. 3). Et online søk i en av proteindatabasenes ble utført ved anvendelse av BlastP algoritmen (Altschul et al, 1990) så vel som Bioaccelerator Alignment (Henikoff og Henikoff, 1992). Det høyeste treff ble oppnådd for (CATR_HUMAN, accession Swiss Protein SW New P41208) med 62.1 % likhet og 32.4% identitet fra aminosyrer 52 til 173, og for calcineurin B (CALB NAEGR, accession Swiss Protein P42322; CALB HUMAN, accession P06705) med 59.8% likhet og 32.5% identitet fra aminosyrer 50 ttil 171.

Figur 4 viser innrettingen av IR1B1 med humant calcineurin B (CALB) og caltractin (CATR). Kalciumbindingen, helix-loop-helix EF-hand -områdene, er vist med uthevede og understrekede bokstaver. IR1B1 har to EF-hand seter, men de to første EF-hand områdene er ikke konserverte. IRI Bl viser homo logi med både calcineurin B (representert med vertikale linjer i Fig. 4) og caltractin (representert med kolon i Fig. 4). IRI Bl er imidlertid et klart nytt og forskjellig humant protein som ikke tidligere har blitt identifisert.

Eksempel 3: IR1B1 er et IFN- Indusert Genprodukt

Humane myeloma U266S celler (omkring 3 x IO6 celler i 5 ml suspensjonskulturer) ble behandlet med rekombinant IFN-a8 (2 x 108 IU/mg fra bakterier) eller med rekombinant IFN-B (3 x 10<8> IU/mg fra CHO celler) ved 750 IU/ml i 2 timer eller i 18 timer.. Etter behandling med IFN, ble cellene oppsamlet og ekstrajhert med Tri-reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio), som er et produkt inneholdende guanidinium-thiocyanate og fenol. Det ekstraherte RNA ble felt med etanol, denaturert med formaldehyd, analysert ved elektroforese i formaldehyde-agarose geler (10ug RNA/spor), og avsatt på GeneScreen Plus (Dupont, New England Nuclear, Billerica, MA). Northern blottet ble reagert med IO<6> cpm IR1B1 cDNA merket med Rediprime settet (Amersham, UK) ved anvendelse av <32>P-dCTP og tilfeldig priming.

Figur 5 viser at IR1B1 cDNA hybridiserte til et 1.1 kb RNA. Mengden av IR1B1 mRNA var øket markert 2 timer etter IFN-B-behandling av U266S celler. Ved 18 timer etter IFN-behandling hadde imidlertid IR1B1 mRNA forsvunnet vra cellene, noe somindikerer at induksjonen er både hurtig og forbigående. Mange IFN-induserte mRNAer fortsetter å akkumulere i cellene i over 24 timer etter iFN-behandling (Revel og Chebath, 1986).

Det ble verifisert at den samme mengden RNA var til stede i hvert spor. Som vist in den nedre del av fig. 5, avslørte hybridisering av den samme U266S (rik på IFN -reseptor) RNA til en 18S ribosomal cDNA probe, den samme mengden av 18S rRNA i hvert sopr (kun den delen av blottet hvor 18S rRNA ble kjørt, er vist). I et annet eksperiment ved anvendelse av 1,200 U/ml IFN for induksjon, ble IR1B1 mRNA også observert med IFN- a8 ved 2 timer, men ikke ved 30 minutter (ikke vist).IRlBl mRNA ble funnet å ha den samme 1.1 kb størrelsen i forskjellige humane celler (U266, Daudi og THP-1 celler). Det må noteres at denne størrelsen var nær den til caltractin mRNA, men ikke den til calcineurin B mRNA (2.5 kb). Den minste størrelsen til mRNA er konsistent med at IRI Bl er et lite protein på omkring 20 kDa.

Eksempel 4: IRlB4- Protein Binder til IFN ARI in vitro

Bindingen av IR1B4 til IC-området av IFNAR1 ble testet ved syntetiseing av IR1B4-proteinet med et proteinmerke (flag-sekvens) ved anvendelse av in vitro translasjon i reticulocyt-lysater og reagereing av dette proteiner med et rekombinant IFNAR1-IC fusjons-protein i E. coli. pACT- IR1B4 DNA fra Eksempell, kuttet med Xhol og fylt inn med Klenow enzym, ble klonet inn i PECE-flag- ekspresjonsvectoren (Ellis et al, 1986) skåret ut med EcoRI og fylt inn. Notl-Æa/wHI-fragmentet inneholdende flag-IRlB4-fusjonen i leserammen, ble klonet i BS-SK skåret ut med Notl-BamHI og nedstrms for T3-promoterene. Sekvensen til flag-fusjonen ble verifisert ved sekvensering fra T3-promoteren. In vitro transkripsjon (Promega sett) ble gjort med T3 polymerase og 1 ug BamHI-linearisert BS-flag-IRlB4 DNA. In vitro translasjon ble utført i reticulocyte-lysater fra kanin (Promega sett) med [ 35S]metionin (Amersham) og 5 ug RNA transripter i 1 time ved 30°C. Produktene ble Rnase-behandlet før anvendelse.GST-IFNARl-IC-fusjonsproteinet ble preparert ved kloning av BamHI-EcoRl, insertet av BS- IFNAR1-IC (se ovenfor) inn i de samme setene av pGEX2 (Pharmacia Biotech). GST og GST-IFNAR1-IC ble uttrykt i E. coli og gjenvunnet bundet til glutationine-agarose-perler(Sigma).

Anti-flag M2 agaroseperler var fra Kodak Scientific Imaging Systems. Monoklonale antistoffer IFNaR3 til a-komponenten av IFN-reseptoren (IFNAR1) var en hyggelig gave fra Dr. O. Colamonici (Colamonici et al, 1990) og ble benyttet ved 1:100 fortynning. Kanin-antistoffer overfor det C-terminale peptidet av IFNAR1-IC (Ab 631) ble preparert og benyttet for immunopresipitasjon av IFNAR1 fira Brij-ekstrakter (0.75 ml) av 2 x IO7 human myeloma U266S og U266R celler med antiproteases som tidligere beskrevet (Ambrovich et al, 1994) bortsett fira at protein G perler (Pharmacia) ble benyttet med mAb IFNaR3 SDS-PAGE og analyseri en Fujix BAS 1000 Phosphor-Imager var som tidligere (Harroch et al, 1994).

Det ble første verifisert at et proteinprodukt på omkring 32 kDa var fremskaffet når translasjonsproduktene var immunopresipittert med anti-flag antistoffer (Figurene 6A og 6B). I Fig. 6A og 6B, når anvendelsen av antiflag antistoffer er angitt(ved + tegn), betyr det at det radioaktive translasjonsproduktet av IR 1B4-flag-fusjon- mRNA ( in vitro transkribert fra det tilsvarende DNA-konstrukt) ble reagert med anti-flag M2 antistoff bundet til agarose-perler (produkt fra Kodak Scientific Imaging Systems). Det translaterte proteinet som inneholder IR1B4 sammensmeltet til flag-aminosyresekvensen, var bundet til disse anti-flag-antistoff-perlene og etter nedsentrifugering av perlene, ble proteinet eluert med SDS buffer og satt på SDS-PAGE. Disse reaksjonene tjener som en kontroll for å demonstrere at det forventede fusjonsproteinet er til stede. Perler av Glutathione-Sepharose (Sigma), til hvilket Glutathione S-transferase (GST) sammensmeltet til IFNAR1-IC var bunder, ble tilsatt til reticulocyt-lysat-translasjons-reaksjonen. Perlene ble sentrifugert og vasket, og proteiner bundet til GST-perlene ble frigitt ved natrium-dodecyl-sulfat (SDS 1%) og analysert ved SDS-polyakrylamid gel- elektroforese (PAGE). Det 32 kDa proteinet merket med <35>S- metionin ble observert å være bundet til GST-IFNAR1-IC, men ikke til GST alene (Fig. 6A). Dette viser at IR1B4 direkte binder til den isolerte IFN ARI-IC- peptidregionen.

For å verifisere at IR1B4 vekselvirker med IFN ARI -proteinet som er til stede i humane cellemembraner, ble detergentekstrakter av human myeloma U266 celler blandet med <35>S- metionin-merkede translasjonsprodukterav IR1B4 mRNA fira reticulocyte ly sater. IFNAR1-proteinet ble immunopresipitert av et monoklonalt antistoff IFNaR3 som er spesifikt for ecto-området av IFNAR1 (fra Colamonici et al., 1990). Analyse ved SDS-PAGE viste nærværet av det 32 kDa IRlB4-flag båndet (Fig. 6B) når detergentekstraktene stammet fira U266S (rikt på IFN reseptor), men ikke når den stammer fra U266R-celler - en mutant IFN-a, J3-resistent avledet cellelinje fra U266 som mangler IFN reseptorer (Abramovich et al., 1994). 32 kDa båndet ble tilsvrende sett når U266S-ekstraktene ble reagert med Ab 631 mot det C-terminale peptide av IFNAR1, og IFNAR1 ble utfelt med anti-flag når Cos-7-celler be overført med flg-IR1B4 og humane IFN ARI cDNAer. Disse resultatene demonstrerer at IR1B4 binder til intakte IFN ARI fra humane celler på en spesifikk måte.

Eksempel 5: IR1B4 cDNA og Protein- sekvenser

Nukleotidsekvensen til IR1B4 cDNA har en åpen leseramme som koder for et 361 amino-syrer langt protein (Fig. 7). Dette humane cDNA gjenkjente et 1.5 kb konstitutivtuttrykt poly-A<+> mRNA i forskjellige humane celler inkludert U266 myelomaceller. Etonline-søk av proteindatabasene ble utført ved anvendelse av BlastP algoritmen (Altschul et al., 1990) så vel som Bioaccelerator Alignment (Henikoff og Henikoff, 1992), og det ble funnet at IR1B4 er et unikt medlem av protein-arginin-metyltransferase- familien. Rotte PRMTl cDNA beskrevetet av Lin et al. (1996, Genbank sequence LD. 1390024; Accession U60882) er kun 81.4% homologt når analysert med ALIGN-computer-programmet. På aminosyrenivå (Fig. 8), skiller der humane IR1B4/PRMT seg klart i sin aminoteminal fra PRMTl, hvor de første 19 aminosyrene er fullstendig forskjellige. N-terminal sekvensering av IR1B4 alene ville ikke ha gitt noen indikasjon på at IR1B4 er homolog med PRMTl. Et annet humante som har blitt beskrevet, HCP- 1 (Nikawa et al., 1996; Genbank accession D66904) ble også funnet på ha homologi med IR1B4. Imidlertid har HCP-1 en annen aminosyresekvens fra restene 147-175 (Fig. 9). HCP-1 ble opprinnelig identifisert basert på den evne til å komplementere ire 15 mutasjonen i gjær og dets enzymatiske funksjon var ikke tidligere identifisert (Nikawa et al., 1996). Derfor er IR1B4 et nytt humant protein.

Eksempel 6: IR1B4 Protein bundet til IFNAR1- IC har metyltransferaseaktivitet

Metyltransferaseaktivitet kan bli co- immunopresipitert fira humane celle-ekstrakter med IFNAR1-reseptoren. Brij-detergent-ekstrakter av U266S-celler ble reagert over natten ved 4°C med eller uten anti-IFNARl antistoff Ab 631 (Abramovich et al., 1994). Protein A-perler (40ul av en 50% av IPA-400 hurtigstrømmende , Repligen) ble tilsatt i en time. Perlene ble vasket og inkubert o 0.1 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 uM (0.25 uCi) <I4>C-(metyl)-S- adenosyl-metionine (Amersham), og 100 ug histonesr(Type IIA fra kalvetymus, Sigma) i 30 min. ved 30°C. In vitro -metyleringen av histoner ble utført under betingelsene beskrevet av Lin et al.

(1996). Radioaktiviteten i histonbåndet ble analysert etter SDS- PAGE (15% akrylamid) og eksponering i Phosphor-imager. En <I4>C-metyl-merking av histonene ble observert med perlene som var belagt med anti-IFNARl, men ikke hos de i kontrollreaksjonen. (Fig. 10). Protein-metyl-transferase-aktivitet er derfor konstitutivt assosiert med IFN- reseptorkjeden i disse humane cellene. En tilsvarende enzymaktivitet ble gjenvunnet når IFNAR1 ble immunopresipitert 5 minutter etter tilsetting av IFN-J3 til U266S cellene.

Eksempel 7: Involvering av IR1B4/ PRMT1 i IFN- virkning

Et anti-sense-oligodeoxynukleotid-fosforotioat (Stein et al., 1989) som var komplementært til sekvensen til nukleotidene 12-33 rundt initieringskodonet til IR1B4 cDNA (AS-1, anti-sense sekvens 5'- GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3'; SEQ ID NO: 12) ble syntetisert kjemisk. Oligonukleotidet ble tilsatt til U266S celler som var utsådd i 96-brønners mikcroplater (8000 celler/brønn/0.2 ml RPMI, 10% FCS) ved en endelig konsentrasjon på 10 uM på dag 0 og igjen tilsatt ved 5 uM på dag 2. IFN-J3 ble tilsatt ved 64 eller 125 IU/ml på dag 0. Etter 3 dager dyrking ble 20 ul Alamar Blue, enkolorimetrisk celle-densitets-indikator basert på oxido-reduksjon (BioSource, Camarillo, CA), tilsatt til hver brønn og inkuberingen ble fortsatt i 6-7 timer. Farge ble målt i en mikroplate-ELISA-leser (test-filter 530 nm, referanse-filter 630 nm) med multiple avlesninger av duplikate brønner. Korrolasjon av vekstkurver ved levende celletall og ved OD ble verifisert. For å måle metyltransferase, ble celler fra oppsamlede brønner, lysert ved fysing og tining i 25 (il/brønn av 25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 40 ug/ml leupeptin og aprotinin, 20 ug/ml pepstatin, 1 uM fenylmetylsulfonyl-fluorid (PMSF). Reaksjoner var i 50 ul med25 ul celleekstrakter, 100 uM peptid RI (Najbauer et al, 1993; anskaffet fra Genosys, Cambridge, UK), 3 uCi [<3>H](methyl)S-adenosylmetionin (Amersham, 73 Ci/mmol) i 30 min ved 30°C. Etter elektroforese i SDS- polyakrylamid(16%)-gel, fiksering i 50% metanol, 10% eddiksyre og behandling mde Amplify® (Amersham), ble autoradiografi utført i 8 dager.

Dette s AS-1 anti-sense DNA var i stand til sterkt å redusere protein-arginin-metyltransferaseaktiviteteni U266S celler målt ved inkorporering av tritierte metylgrupper på Rl-substratet(Fig. 11), og ble benyttet for å undersøke rollen dette enzymet kan spille i IFN-virkning. Den vekstinhibitoriske virkningen til IFN ble valgt da den kan bli stort sett direkte kvantifisert op celler og da en interaksjon av rotte-PRMTl med vekstrelaterte genprodukter har blitt observert (Lin et al, 1996). Tilsetning av antisense-1 oligonukleotidet AS-1, som er komplimentært til sekvensen rundt initieringskodonet for IR1B4/PRMT cDNA, reduserte den vekstinhibitoriske effekten til IFN-J3 på human myeloma U266S celler (Fig. 12). Dette betyr at i nærvær av anti-sense AS-1, viste de IFN-behandlede cellene en høyere vekst (noe som ekskluderer eventuelle toxiske effekter av fosforotioater). Veksten i fravær av IFN ble ikke signifikant påvirket. Sense-oligonukleotidet S-3 som tilsvarer den samme cDNA-region, hadde kun liten effekt(S-3, Fig. 12) sammenlignet med antisense-1. Sense S-3 hadde også kun liten inhibitorisk effekt på nivået av enzymaktivitet. Et annet anti-sense fosforotioat-oligonukleotide AS-2 (SEQ ID NO: 13), rettet mot midten av cDNA og som var komplementært til nukleotidene 572-592 i SEQ ID NO:7, hadde nesten ingen effekt (Fig. 12). Den opp til 5 ganger reduksjonen av vekstinhibitorisk effekt av IFN-J3 på myelomaceller, som var gjort partielt defisiente på PRMT-aktivitet ved antisense-1 - oligonukleotid, viste at assosieringen av IR1B4/PRMT enzymet med IC-området av

IFNARl-reseptoren, er fuksjonelt signifikant for IFN-virkning på celler.

Disse eksperimentene demonstrerte også at IRlB4-proteinet metylerer peptid-substrater av PRMT-klassen av enzymer slik som Rl-peptidet Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:l 1; Najbauer et al., 1993), som ble benyttet i eksperimentet illustrert i fig 11. Metylering av proteiner på arginin-rester ved siden av glycinrester (for eksempel som i peptidet ovenfor) kan være en type proteinmodifikasjon som på samme måte som fosforylering, tjener til å omforme signaler inn i cellen. hnRNP-gruppen proteiner er et mål for PRMT-enzymer og da disse proteinene påvirkrer mRNA-prosesseringen, spleisingen, transporten og stabiliteten (Liu og Dreyfuss, 1995), kan deres metylering spille en rolle i den post-transkirpsjonelle kontroller av genekspresjonen. IR1B4/PRMT proteinet, som her er oppdaget å binde til en kjede av IFN-reseptoren, kan mediere endringer i genekspresjonen som respons overfor IFN. Andre proteinsubstrater kan bli metylert ved IFN-reseptoren, noe som inkluderer andre komponenter av IFN-reseptor-komplekset og transkripsjonsfaktorer. Lin et al. (1996) har observert at bindingen av rotte PRMTl til vekstfaktorinduserte proteiner aktiverer PRMTl og modifiserer dets substratsspesifisitet, muligens ved fjerning av noen inhibitoriske proteiner assosiert med PRMTl i cytoplasma i celler. En tilsvarende aktivering av IR1B4 bundet til IFNARl-kjeden av IFN-reseptoren, kan bli forventet.

Konklusjoner

Et nytt protein IRI Bl er beskrevet, som vekselvirker med det intracytoplasmiske området av IFNARl-kjeden av type I interferon-reseptor. Dette proteinet blir indusert meget hurtig og transient etter IFN-behandling av humane celler. IR1B1 er kjennetegnet ved nærværet av helix- loop-helix EF-handle-seter og er kjennemerket for kasiumbindende proteiner. Kalsium-ione-flyt har blitt implisert i virkningsmekanismen til kalsiumbindende proteiner for IFN og spesielt for de initielle celleresponsene og endingene i cellemorfologi og i cytoskjelettorganisering (Tamm et al, 1987). kalsium-ion-aktiverte enzymer kan produsere "second messengers", slik som diacyl-glyserol, som respons på IFN. Videre, regulerer calmodulin-liknende proteiner et antall proteinkinaser og disse banene har blitt observert å virke i IFN-behandlede celler (Tamm et al, 1987). Det er sannsynlig at det IFN-reseptorbindende proteinet IR1B1 er involvert i slike Ca<++->avhengige effekter av IFN på celler.

To-hybrid-skreeningen for proteiner som vekselvirker med IFNARl-IC-området, identifiserte et annet protein IR1B4, som viste seg å være et medlem av protein-arginin-metyl-transferase-familien av enzymer(PRMTl; Lin et al, 1996). Dette enzymet er kjent å metylere et antall av RNA- og DNA- bindende proteiner, spesielt heterologe nukleære ribonukleoproteiner (hnRNPs). hnRNPene er involvert i mRNA-transport kjernen til cytoplasma, alternativ spleising av pre-mRNA, og post-transkripsjonelle kontroller(Liu og Dreyfuss, 1995). IR1B1- og IR1B4/PRMT1- proteinene som legger seg inntil IFNARl-IC-området, avslørte nye signaleringsmekanismer av IFN som eksisterer ved siden av den kjente Jak-Stat-banen beskrevet av Darnell et al (1994).

Etter nå å ha beskrevet oppfinnelsen fullstendig, vil det bli forstått av fagmannen at det samme kan bli utført innen et vidt område av ekvivalente parametere, konsentrasjoner og betingelser uten å forlate ånden og rammen av oppfinnelsen og uten unødvendig eksperimentering.

Mens oppfinnelsen har blitt beskrevet i sammenheng med spesifikke utførelsesformer derav, vil det bli forstått at det er mulig med ytterligere modfikasjoner. Denne søknaden er medt å dekke en hvilken som helst variasjon, anvendelse eller tilpasninge av oppfinnelsen som generelt følger prinsippene ifølge oppfinnelsen og omfatter og inkluderer slike avvik fra foreliggende beskrivelse som ligger innen kjent eller vanlig praksis innen teknikken som oppfinnelsen angår og som kan ble benyttet som de essensielle trekk som er angitt ovenfor slik det følger av rammen av de vedlagte krav. Alle referanser heri, inkludert tidskriftartikler eller sammendrag, publiserte eller tilsvarende U.S. eller utenlandske patentsøknader, utstedte E.S.- eller utenlandske patenter, eller andre referanser, er i sin helhet innlemmet som referanse heri, inkludert alle data, tabellerm figurer og tekst angitt i de siterte referanser, I tillegg er hele innholdet i de angitte referanser innen referansene sitert heri, også i sin helhet innkorporert som referanse.

Referanser tilkjente metodetrinn, konvensjonelle metodetrinn, kjente metoder eller konvensjonelle metoder er ikke på noen måte en innrømmelse av at noen aspekter, beskrivelser eller utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er beskrevet, lært eller foreslått i relevant teknikk.

Den foregående beskrivelsen av de spesifikke utførelsesformene vil således fullstendig klargjære den generelle naturen til oppfinnelsen slik at andre ved anvendelse av den generelle kunnskap innen teknikken (innkludert innholdet av referansene sitert heri) enkelt kan modifisere og/eller tilpasse for forskjellige anvendelser slike spesifike anvendelser uten unødvendig eksperimentering, uten å forlate det generelle aspekt ved oppfinnelsen. Derfor er slike tilpasninger og modifikasjoner ment å være innen betydningen av ekvivalenter av de beskrevne utførelsesformer, basert på læren og veilledningen gitt heri. Det må også forståen at frasologien eller terminologien heri er for beskrivelsesformål og ikke for begrensing, slik at terminologien eller frasologien i foreliggende beskrivelse skal tolkes av fagmannen i lys av læren og veilledningen gitt heri, i kombinasjon med kunnskapen til en med vanlige kunnskaper innen teknikken.

Referanser

Abramovich, C, Shulman, L.M, Ratovitski, E., Harroch, S., Tovey, M, Eid, P. and Revel, M. ( 1994) Differential tyrosine phosphorylation of the IFNAR chain of the type I Interferon receptorand of an associated surface protein in response to IFN-a and IFN-13. EMBO J..13:5871-5877.

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment research tool. J. Mol. Biol, 215:403-410.

Barter, P.L., Chien, C.T., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993) Elimination of false positives thatarise in using the two-hybrid system. BioTechniques, 14:920-924.

Boldin, M.P. Varfolomeev, E.E. Pancer, Z. Mett, LL. Camonis J.H. and Wallach D.

(1995) A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APOl contains a sequence motif related to the death domain. J Biol Chem, 270:7795-7798 .

Breeden, L. and Naysmith, K., (1995) Regulation of the yeast HO gene. Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol, 50:643-650.

Colamonici, O.R., D'Allessandro, F., Diaz, M.O., Gregory, S.a., Necker, L.M. and Nordan, R. (1990)Characterization of three monoclonal antibodies that recognize the Interferon-a2 receptor. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87, 7230-7234.

Darnell, J.E., Kerr, LM. and Stark, G.R. (1994) Jak-Stat pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science, 264:1415-1421.

David, M., Chen, H.E., Goelz, S., Larner, A.C. and Neel, B.G. (1995a) Differential regulation of the alpha/beta Interferon-stimulated Jak/Stat pathway by the SH2 domain-containing tyrosine phosphatase SHPTP1. MoLCell. Biol. 15:7050-7058.

David, M., Petricoin, E. III, Benjamin, C, Pine, R., Weber, M.J. and Larner, A.C.

(1995b) Requirement for MAP kinase (ERK2) activity in Interferon a- and Interferon B-stimulated gene ekspresjon through Stat proteins. Science, 269:1721-1723.

David, M., Petricoin, E. III. and Larner, A.C. (1996) Activation of Protein kinase A inhibits Interferon induction of the Jak/Stat pathway in U266 cells. J. Biol. Chem, 271:4585-4588.

Deiss, L.P. and Kimchi, A. (199) A genetic tool used to identify thiroredoxin as a mediator of a growth inhibitory signal. Science 252, 117-20.

Domanski, P., Witte, M., Kellum, M., Rubinstein, M., Hackett, R., Pitha, P. and Colamonici, O.R. (1995) Cloning and ekspresjon of a long form of the beta subunit of the Interferon alpha beta receptor that is required for signaling. J. Biol. Chem., 270:21606-21611.

Durfee, T., Becherer, K, Chen, P.-L., Yeh, S-H, Yang, Y., Kilburn, A.E., Lee, W.-H. and Elledge, S. (1993). The retinoblastoma protein associates with the protein

phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes & Devpt, 7:555-569.

Ellis, L„ Clauser, E., Morgan, D.O., Edery, M„ Roth, R.A. and Rutter, WJ. (1986) Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulin

-stimulated kinase activity anduptake of 2 -deoxyglucose. Cell, 45, 721-731.

Fields, S. and Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340:245 -246.

Guerini, D. et al (1989). DNA 8:675-682.

Harroch, S., Revel, M. and Chebath, J. (1994). Interleukin -6 signaling via four transcription factors binding palindromic enhancers of different genes. J. Biol. Chem, 269:26191-26195.

Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992). Proe. Nati. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919.

Kagan, R.M. and Clarke, S. (1994) Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse S-adenosyl methionine-dependent methyltransferases suggests a common structure forthese enzymes. Arch. Biochem. Biophys., 310, 417-427.

Lee, V.D. andHuang, B. (1993). Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:11039-11043.

Leung, S., Qureshi, S.A., Kerr, I.M., Darnell, J.E. and Stark, G.R. (1995). Role of Stat2 in the alpha Interferon signaling pathway. Mol. Cell. Biol, 15:1312-1317.

Lin, W.-J., Gary, J.D., Yang, M.C., Clarke, S. and Herschman, H.R. (1996). The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a Protein-arginine Methyltransferase. J. Biol Chem., 271:15034-15044.

Liu, Q. and Dreyfuss, G. (1995). In vivo and in vitro arginine methylation of RNA-binding proteins. Mol. Cell. Biol. 15:2800-2808.

Najbauer, J., Johnson, B.A., Young, A.L. and Asward, D.W. (1993) Peptides with sequences similar to glycine arginine rich motifs in proteins interacting with RNA are efficiently recognized by methyltransferases modifying arginine in numerous proteins. J. Biol. Chem., 268, 10501-10509.

Nikawa, J.-L, Nakano, H. and Ohi, N. (1996) Structural and functional conservation of human yeast HCPI genes which can suppress the growth defect of the Saccharomyces cerevisiae ire 15 mutant. Gene, 171, 107-111.

Revel, M. (1984). The Interferon system in man: nature of the Interferon molecules and mode of action. In Becker, I. (ed.), Antiviral Drugs and Interferon. The molecular basis of their activity. Martinus Nijhoff Publ., Boston, pp 357-433.

Revel, M. and Chebath, J. (1986) Interferon-activated genes. Trends Biochem. Sei.. 11:166-170.

Stein, C.A., Subasinghi, C, Shinozuka, K. and Cohen, J.S. (1989) Physicochemical properties of phosphorothionate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 16, 3209 -3221.

Tamm, I., Lin, S.L., Pfeffer, L.M. and Sehgal, P.B. (1987). Interferons a and B as cellular regulatory molecules. In Gresser, I. (ed.), Interferon 9, Acad. Press, London, pp 14-74.

Uze, G., Lutfalla, G. and Gresser, I. (1990). Genetic transfer of a functional human Interferon a receptor into mouse cells: cloning and ekspresjon of its cDNA. Cell, 60:225-234.

Wickstrøm, E. (1991). In: Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, pp. 7-24, Wiley-Liss, New York.

Yang, C.H., Shi, W, Basu, L., Murti, A., Constantinescu, S.N., Blatt, L., Croze, E., Mullersman, J.E. and Pfeffer, L.M. (1996). Direct association of Stat3 with the TFNAR-1 chain of the human type I Interferon receptor. J. Biol. Chem., 271:8057-8061.

Claims (13)

1. Et rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et IFNARl-reseptorbindende protein som er i stand til å bli indusert av IFN-a eller IFN-J3 og som har aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO:2 eller SEQ ID NO:8.

2. Et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert v e d at det ytterligere omfatter en promoter operativt forbundet til nevnte sekvens som koder for et IFNARl-reseptor-bindende protein i en sense-orientering slik at nevnte promoter er i stand til å uttrykke nevnte protein når det rekombinante DNA-molekylet er i en passende ekspresjonsvert.

3. Et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 2, karakterisert v e d at nevnte promoter er en sterk konstitutiv promoter i humane celler.

4. Et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte nukleotidsekvens er SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO:7.

5. Et rekombinant DNA -molekyl, karakterisert ved at det omfatter et DNA-molekylet omfattende nukleotidsekvensen SEQ ID NO:l eller SEQ ID NO:7, enten i sense eller antisense orientering, eller et fragment derav som er i stand til å hybridisere til mRNA som koder for et interferon-induserbart UFNAR1 reseptorbindende protein og derved hindre dets ekspresjon.

6. Et rekombinant DNA ifølge krav 5.

7. Et rekombinant DNA ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte sekvens er i sense orientering.

8. Et rekombinant DNA ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte sekvens er i antisense orientering.

9. Et rekombinant DNA ifølge krav 8, karakterisert ved at det omfatter et rekombinant DBA molekyl som ytterligere omfatter en promotor operativt forbundet til nevnte sekvens i en antisense orientering slik at nevnte peptidpromotor er i stand til å uttrykke et antisense RNA som er komplimentært til hele eller en del av et sense RNA som koder for et interferon-indusert IFNAR1 reseptorbindende protein.

10. Et rekombinant DNA molekyl ifølge krav 9, karakterisert v e d at nevnte nukleotidsekvens har et segment fra 5' enden av SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 7.

11. Et rekombinant DNA molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 2, 9 og 10, karakterisert ved at nevnte promotor er en interferon-induserbar promotor.

12. Et rekombinant DNA molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 og 7-10, karakterisert ved at det er en ekspresjonsvektor.

13. En vertscelle som er i stand til å uttrykke et antisense RNA som er komplementær til et sense RNA som koder for et interferon-induserbart IFNAR1 reseptorbindende protein, hvilken celle inkluderer en ekspresjonsvektor ifølge krav 12.