NO315976B1 - Immunokonjugater, fremgangsmåte for fremstilling derav, farmasöytiske preparater som omfatter immunokonjugatene, samt anvendelse avimmunokonjugatene for fremstilling av legemidler mot tumorer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye fusjonsproteiner, nærmere bestemt immunokonjugater som består av et tumorassosiert, målsøkende element som er et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, som gjenkjenner et molekyl som uttrykkes på humane tumorceller, nærmere bestemt den humane epidermvekstfaktorreseptor (EGFR), og en biologisk aktiv ligand som er kjemokinproteinet IL-8. Fusjonsproteinene kan anvendes til å avlevere den biologisk aktive ligand til en bestemt målcelle eller et bestemt målvev. De nye immunokonjugatene kan anvendes i tumorterapi. Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av immunokonjugatene, farmasøytiske preparater som omfatter minst ett av dem, og anvendelse av dem for fremstilling av legemidler rettet mot tumorer.

O ppfinnelsens bakgrunn

Mange forskjellige terapeutiske konsepter er blitt brukt til behandlingen av kreftpasienter. Tidligere er det blitt utført kliniske forsøk med monoklonale antistoffer som gjenkjenner spesifikt eller fortrinnsvis celleoverflatemolekyler uttrykt på maligne celler. Målet ved denne fremgangsmåten er induksjonen av antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) eller komplementmediert cytotoksisitet for å eliminere tumorceller. En andre fremgangsmåte er den cytokinmedierte aktivering av en immunrespons. Den cytokininduserte antitumoraktivitet kan medieres ved hjelp av:

1) en direkte cytotoksisk/cytostatisk effekt av cytokinet på tumorvekst,

2) slike ikke-spesifikke tumor-antigenmekanismer som LAK-aktivitet eller monocytt- eller granulocyttmediert cytotoksisitet, 3) spesifikke tumor-antigenimmunresponser mediert ved hjelp av CD4- og CD8-positive T-celler.

I denne situasjonen er det blitt observert en systemisk immunitet mot tumoren i dyremodeller.

Cytotoksisitet ved høye doser av cytokinene og utilstrekkelig in situ tilstedeværelse fører imidlertid til konseptet med målrettet tumorterapi. Prinsippet med målrettet tumorterapi er basert på den fysiske binding mellom et målmolekyl, slik som et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et tumorassosiert antigen, og et biologisk aktivt effektormolekyl. Avleveringen av effektormolekyler ved hjelp av et målmolekyl burde øke cytokinkonsentrasjonen i tumoren og redusere den maksimale dose som er påkrevd. I dyremodeller ble det demonstrert at in situ tilstedeværelse av cytokinet enten ved intratumoral injeksjon eller ved sekresjon av transfekterte tumorceller kan føre til tumorregresjon (for oversikter, se: Colombo og Forni, Immunology Today 15: 48-51, 1994). I disse systemene forstyrrer ikke cytokiner tumorproliferasjon, men er i stand til å aktivere en hurtig og sterk antitumorreaksjon. Derfor utgjør den fysikalske kombinasjon av et effektormolekyl og et målsøkende element et middel for å redusere den perifere tilstedeværelse og øke den intratumorale tilgjengelighet av den biologisk aktive ligand. Dessuten kan enkelttumorceller eller mikrometastaser også målsøkes ved hjelp av disse molekylene.

Den biologisk aktive ligand for en antistoffrettet målsøking bør indusere ødeleggelsen av målcellen enten direkte eller ved å skape et miljø som er udødelig for målcellen. Dette kan oppnås ved hjelp av cytokiner, slik som IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN-er, TNFa og CSF-er. Disse cytokinene er påvist å utløse antitumoreffekt enten direkte eller indirekte ved å aktivere vertsforsvarsmekanismer (Mire-Sluis, TIBTECH 11: 74-77,1993; Colombo et al., Cancer Res. 52: 4853-4857, 1992; Thomas & Balkwill, Pharmac. Ther. 52: 307-330,1991).

Mesteparten av disse cytokinene aktiverer imidlertid effektorceller, men oppviser ingen eller bare svak kjemotaktisk aktivitet for dem, slik at antitumoral aktivitet kan være svak i fråvær av egnede mengder av effektorceller i tumorvevet.

Kjemokiner er imidlertid kjemotaktiske for mange effektorceller og vil således øke deres tilstedeværelse på tumorstedet, og for det andre induserer de mange forskjellige effektorcellefunksjoner (se f.eks. Miller og Krangel (1992), "Biology and Biochemistry of the Chemokines: A novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines", Critical Reviews in Immunology 12,17). IL-8, MIP 2p (også kjent som GRO-p) og MIP 2P (GRO-y) er medlemmer av C-X-C-kjemokinsuperfamilien (også kjent som små cytokinsuperfamilier eller interkriner). De virker som kjemotaktiske faktorer og aktiverer effektorcellefunksjoner og vil derfor kunne utgjøre optimale effektormolekyler. Denne familien av C-X-C-kjemokiner er en gruppe av nylig karakteriserte små (8-10 kD) proteiner som oppviser 20-50 % homologi i aminosyresekvens, og som har kjemotaktiske og proinflammatoriske aktivi-teter. IL-8 har en godt definert tredimensjonal struktur (Clore et al., Biochemistry 29: 1689-1696,1990) og har et N-terminalt ELR-motiv til felles med noen av CXC-kjemokinene. Det må forventes at på grunn av sekvenshomologien blant CXC-kjemokinene vil den tredimensjonale struktur være ganske lik. Dette ble allerede demonstrert for MCAF/MCP-1 (Gronenborn & Clore Prot. Eng. 4,263-269,1991).

I oppløsning danner IL-8 stabile dimerer (Clore et al., Biochemistry 29: 1689-1696,1990), og det er mulig at et F(ab')IL-8-fusjonsprotein dimeriseres ved interaksjon av to IL-8-monomerer, slik at det dannes et toverdig immunokonjugat. Dette vil styrke interaksjonen mellom fusjonsproteinet og antigenet.

Medlemmene i C-X-C-gruppen som er blitt beskrevet hittil, virker hovedsakelig på nøytrofile granulocytter. Genene er blitt lokalisert på kromosom 4. Medlemmer av denne gruppen er PF4, blodplategrunnprotein, hIPlO, IL-8, MIP 2a og MIP 2p. Effekten av disse proteinene på nøytrofller er kjemotaktisk aktivitet, degranulering og omdannelse av oksygen til giftige oksygenmetabolitter (Sherry og Cerami, Current opinion in Immunology 3: 56-60,1991; Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol. 9:617-648,1991; Miller og Krangel, Critical Reviews in Immunology 12: 17-46,1992; Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. 266: 23128-23134,1991).

Medlemmer av den nært beslektede C-C-familie av kjemokiner virker hovedsakelig på monocytter. Gener er alle lokaliserte på kromosom 17. Disse proteinene er LD 78, Act-2, MCAF, 1309 og RANTES. Disse molekylene oppviser en sterk kjemotaktisk aktivitet på monocytter (Matsushima et al., Chem. Immunol. 51: 236-265, 1992; Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol. 9: 617-648, 1991).

Epidermal vekstfaktor (EGF) er et polypeptidhormon som er mitogent for epiderm- og epitelceller. Når EGF reagerer med sensitive celler, bindes den til membranreseptorer (EGFR). EGFR er et transmembranglykoprotein med ca. 170 kD, og er et genprodukt av c-erb-B-proto-onkogenet.

Det murine, monoklonale antistoff MAb 425 ble frembrakt mot den humane A431 karsinomcellelinje (ATCC CRL 1555) og ble funnet å bindes til en polypeptidepitop på det eksterne domenet i EGFR. Det ble funnet å inhibere bindingen av EGF og å mediere rumorcytotoksisitet in vitro, og undertrykke tumorcellevekst av epidermale og kolorektale karsinomavledede cellelinjer in vitro (Rodeck et al., 1987, Cancer Res. 47,3692). Humaniserte og kimære versjoner av MAb 425 er kjente fra WO 92/15683.

Det var derfor et formål ved denne oppfinnelsen å skape antistoffer eller fragmenter derav som omfatter en epitop rettet mot et EGFR-antigen på overflaten av en tumorcelle, og en biologisk aktiv ligand med en høy kjemotaktisk aktivitet for deres effektorceller, og derved føre til en lavtoksisk målrettet tumorterapi. Immunokonjugatene utgjør derfor en forbedring av analoge cytokin-antistoffimmunokonjugater, som er like effektive når det gjelder deres evne til å forårsake tumorlyse, men ikke med hensyn til muligheten for effektivt å tiltrekke effektorceller til et bestemt sted på grunn av dets kjemotaktiske egenskaper.

O ppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører fusjonsproteiner som kombinerer en del av et monoklonalt antistoff, minst antigengjenkjennelsessetet eller et komplett monoklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop i EGFR, med den biologisk aktive ligand, kjemokinet IL-8. Konstruksjonene som koder for disse fusjonsproteinene, genereres ved hjelp av teknologiske metoder med rekombinant DNA. Fusjonsproteinene inneholder det variable området i antistoffets tunge kjede og CHl-domenet i det konstante området (CH1-konjugater, Fab-fragmenter) og den korrekte lette kjede, eller det variable området i antistoffets tunge kjede og CH1- og CH2-domenet i det konstante området, eller det variable området i antistoffets tunge kjede og CH1-, CH2-og CH3-domenet i det konstante området, fusjonert til den biologisk aktive ligand IL-8 i hvert tilfelle. Ved samekspresjon med den korrekte lette kjede kan det genereres et fusjonsprotein som søker opp antigenbærende celler og avleverer IL-8 til et bestemt sted i kroppen.

Analogt kan et annet immunokonjugat oppnås ved å fusjonere IL-8 til C-enden av et Fv-fragment i antistoffet. I dette tilfellet uttrykkes tung og lett kjede i ett polypeptid hvor begge elementene er kombinert ved hjelp av en passende linkersekvens for å sikre korrekt folding i antigenbindingssetet. De forskjellige konstruksjonene er vist i figur 1.

Ekspresjon av immunokonjugater resulterer i nye molekyler som kombinerer to funksjoner: for det første søker de opp antigenbærende celler (EGFR) og for det andre avleverer de aktiv ligand til et bestemt sete i kroppen. IL-8 er en sterk kjemoattraktant og et aktiverende molekyl, og resulterer i infiltrasjon av effektorceller på tumorstedet og kan forårsake påfølgende tumorødeleggelse.

Ved hjelp av immunokonjugatene ifølge oppfinnelsen kan tumorer, slik som melanom, gliom og karsinom, påvises og behandles med hell i fravær av skikkelige generelle toksiske effekter.

Det er således et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et immunokonjugat som omfatter et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, rettet mot en tumorcelle som bærer en antigenepitop fra den epidermale vekstfaktorreseptor (EGFR), og en kjemokinproteinligand som er fusjonert til antistoffet eller antistofrfagmentet, hvor kjemokinet er IL-8.

Antistoffene som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er enten hele monoklonale antistoffer eller fragmenter derav. Egnede fragmenter er Fv-er, Fab-er eller F(ab')2-er (CHl-antistoffragmenter i henhold til språket ifølge denne søknaden), CH3- og CH2-antistoffragmenter (figur 1). Foretrukne utførelsesformer er Fv-er, CH1-, CH2- og CH3-antistoffragmenter.

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et immunokonjugat hvor antistoffet er et Fab-fragment eller et F(ab')2-fragment bestående hovedsakelig av det variable området i antistoffets tunge kjede, CHl-domenet i det konstante området og den passende lette kjede (antistoff-CHl-konjugat), et annet immunokonjugat hvor antistoffet er et antistoffragment bestående hovedsakelig av det variable området til antistoffets tunge kjede, CH1- og CH2-domenene i det konstante området, og den passende lette kjede (antistoff-CH2-konjugat), et annet immunokonjugat hvor antistoffet er et komplett antistoff bestående hovedsakelig av det variable området i antistoffets tunge kjede, CH1-, CH2- og CH3-domenene i det konstante området og den passende lette kjede (antistoff-CH3-konjugat) og, endelig, et ytterligere immunokonjugat hvor antistoffet består hovedsakelig av det variable området i antistoffets tunge kjede, den passende lette kjede og en polypeptidsekvens som binder sammen den lette og tunge kjede (antistoff-Fv-konjugat).

Immunokonjugatene ifølge oppfinnelsen kan eventuelt omfatte et restriksjonssete mellom antistoffet (fragmentet) og kjemokinproteinet som gjør det mulig å innføre f.eks. et spesifikt linkerpeptid for å sikre en optimal binding av konjugatet til målepitopen. Egnede linkerpeptider og fremgangsmåter for å innføre dem er godt kjent innen teknikken og beskrevet nedenunder. Ifølge oppfinnelsen velges det et restriksjonssete som er unikt i den bestemte DNA-konstruksjon. Foretrukne restriksjonsseter er Ncol og Bell.

Det er således et ytterligere formål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe et immunokonjugat som omfatter en aminosyre (sekvens) som er utledbar fra et DNA-restriksjonssete mellom antistoff/anitstoffragment og IL-8, idet restriksjonssetet er unikt i den komplette fusjonskonstruksjon.

Det er et ytterligere formål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe et immunokonjugat som omfatter et linkerpeptid mellom antistoff/antistoffragment og IL-8.

Prinsipielt er det egnet med alle monoklonale antistoffer som er rettet mot EGF-reseptorer på tumorcelleoverflater. Monoklonalt antistoff425 er imidlertid en foretrukket utførelsesform.

Dessuten er det et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et immunokonjugat hvor antistoffet eller antistoffragmentet avledes fra murint, humanisert eller kimært MAb 425, og fortrinnsvis er valgt fra gruppen MAb 425-CH1-IL-8, MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8, MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8, MAb 425-Fv-IL-8, MAb 425-CH3-IL-8.

Dessuten er det et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et immunokonjugat som definert ovenfor og nedenunder og i kravene, ved å fusjonere DNA-sekvensene som koder for antistoffet eller antistofrfagmentet, og IL-8 med hverandre på et enkelttrådet DNA ved hjelp av et oligonukleotid som er komplementært til den ønskede fusjons-DNA-sekvens, plassere den resulterende konstruksjon i en ekspresjonsvektor som transformeres inn i vertsorganismen, dyrke vertscellene i en næringsoppløsning og uttrykke fusjonsproteinet.

Immunokonjugatene ifølge denne oppfinnelsen er egnet for terapeutisk anvendelse.

Det er således et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et farmasøytisk preparat som omfatter minst ett av immunokonjugatene som definert ovenfor, nedenunder og i kravene, og en fysiologisk akseptabel bærer.

Det er et mål ved denne oppfinnelsen å frembringe et fusjonsprotein bestående av et monoklonalt antistoff som målsøkende element og kjemokinet IL-8 som effektormolekyl med kjemotaktiske og aktiverende egenskaper.

For første gang kunne det vises at IL-8 bibeholder sin biologiske aktivitet når N-enden blokkeres ved hjelp av ytterligere aminosyrer, slik som antistoffresten. Dette molekylet vil derfor være nyttig i målrettet tumorterapi ved at effektorceller styres mot de EGF-reseptorpositive tumorceller og aktiveres in situ.

Det kunne påvises at cDNA-ene som koder for den tunge kjeden i MAb 425 og IL-8-proteinet kan fusjoneres ved hjelp av molekylærbiologiske metoder og proteiner uttrykkes i passende ekspresjonssystemer, og at EGF-reseptorbindingskapasiteten konserveres i fusjonsproteinene (figur 2).

Hovedmålcellene til IL-8 er nøytrofilgranulocytter, som har tre biologiske funksjoner: kjemotaktisk bevegelse langs en kjemotaktisk gradient frigjørelse av lagrede granuler med forproduserte proteolytiske

enzymer

øyeblikkelig produksjon av superoksidanion ("respiratory burst")

Følgelig ble MAb 425/Ncol/IL8- og MAb 425/BclI/IL-8-fusjonsproteiner undersøkt med hensyn på deres kjemotaktiske aktivitet, induksjon av MPO-frigjørelse og superoksidfirgjørelse.

Dessuten kunne det påvises at fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen (f.eks. MAb 425/Ncol/IL8- og MAb 425/BclI/IL-8 forårsaker kjemotaktisk aktivitet, induksjon av MPO-frigjørelse og superoksidfrigjørelse. Resultater vist i figur 3a demonstrerer at begge fusjonsproteinene er kjemotaktiske for humane nøytrofiler i området til rekombinant IL-8 (figur 3b). I tillegg til MAb 425/Ncol/IL-8- og MAb 425/BclI/IL-8-fusjonsproteinene, som burde gå sammen til en toverdig form, ble det dannet et enverdig F(ab')-IL-8-fusjonsprotein som ble uttrykt i E. coli og renset. Figur 4 viser at F(ab')-IL-8-fusjonsproteinet er kjemotaktisk for humane nøytrofiler sammenlignet med et MAb 425 F(ab'), uttrykt i E. coli og renset tilsvarende.

MAb 425/BclI/IL-8-fusjonsproteinet har ganske sterk evne til superoksid-frigjørelse sammenlignet med fritt IL-8 (figur 5), MAb 425/Ncol/IL-8-fusjonsproteinet er mindre aktivt, men verdier er signifikant høyere enn kontrollverdier (figur 5). MAb 425 alene oppviser ingen aktivitet. Alle tester ble utført ved å bruke cytochalasin B som forsterkerstoff som alene ikke oppviser noen aktivitet (data ikke vist).

Begge fusjonsproteinene induserer myeloperoksidase(MPO)-frigjørelse, men MAb 425/Ncol/IL-8-fusjonsproteinet er mer aktivt enn MAb 425/BclI/IL-8-fusjonsproteinet (figur 6). Alle data er beregnet på samme måte som dataene for de tritonlyserte celler som er kalt 100 % enzyminnhold. Alle data ble frembrakt ved å bruke cytochalasin B som forsterkerstoff.

Det ble tidligere demonstrert at N-endedelen av IL-8-molekylet med det høykonserverte E-L-R-motiv er påkrevd for reseptorbinding og signaltransduksjon. Den tredimensjonale struktur til IL-8 er en homodimer hvor begge N-endene er i en eksponert konfigurasjon. Det var mulig at en biologisk aktivitet til IL-8 ble motvirket når N-endene blokkeres ved hjelp av ytterligere aminosyrer. Restriksjonsseter (Ncol/Bcll) ble derfor innført mellom de to cDNA-er for å innføre linker-peptider og derved gjenopprette tilgjengelighet til N-enden.

Andre fremgangsmåter for å skape fusjonsproteiner, slik som kjemisk kobling av begge elementene, fører til ganske udefinerte strukturer som kan variere mellom porsjoner. I tillegg vil kjemisk kobling kunne ødelegge sekundærstrukturen til liganden og skape en situasjon hvor mesteparten av proteinene er inaktive når det gjelder reseptorbinding på grunn av utilgjengelighet. I motsetning til dette frembringer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fusjonsproteiner med definert struktur som kan uttrykkes i reproduserbar kvalitet nesten uten noen begrensning.

For å oppsummere har fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen de følgende egenskaper:

bindes til EGFR-positive celler,

forårsaker kjemotaktisk aktivitet,

induserer MPO- og superoksidfrigjørelse,

induserer tumorlyse in situ.

Immunokonjugatene ifølge oppfinnelsen er derfor egnet for tumorterapi.

Kort beskrivelse av tabellene og fi<g>urene

Tabell 1:

Tabell 1 viser sekvensen til de primerne som anvendes til PCR for å frembringe enten et Ncol- eller et Bcll-sete for å danne fusjonsproteiner for eukaryot ekspresjon.

Figur 1:

Modeller for antistoff-cytokinimmunokonjugater:

C = cytokin; VH = variabelt område i tung kjede; VL = variabelt område i lett kjede; CH = tung kjede i konstant område; CL = lett kjede i konstant område.

Figur 2:

Demonstrasjon av MAb 425 i COS-7-transfeksjonssupernatanter ved hjelp av anti-EGF-r-

Figur 3b:

Induksjon av kjemotaksis ved hjelp av renset IL-8: Vertikal akse: antall celler pr. tellet område

Horisontal akse: konsentrasjon av IL-8 (mol/l).

Figur 4:

Induksjon av kjemotaksis ved hjelp av MAb 425-CH1-IL-8

( E. coli) :

Figur 5:

Induksjon av superoksidfrigjørelse ved hjelp av COS-7-transfeksjonssupernatanter:

<*>IL-8-konsentrasjon ble bestemt ved hjelp av ELISA (Amersham)

Vertikal akse:optisk tetthet ved 550 nm.

Figur 6:

Induksjon av MPO-frigjørelse ved hjelp av COS-7-transfeksjonssupernatanter:

Nærmere beskrivelse

Generelle bemerkninger

Alle mikroorganismer, cellelinjer, plasmider, promoterer, resistensmarkører, replikasjonsopprinnelsessteder, restriksjonsseter eller andre fragmenter av vektorer som er nevnt i søknaden, er kommersielt eller på annen måte generelt tilgjengelig. Forutsatt at det ikke er angitt noe annet, anvendes de bare som eksempler og er ikke av avgjørende betydning ifølge oppfinnelsen, og kan erstattes av andre egnede henholdsvis redskaper og

biologiske materialer.

Teknikkene som er av avgjørende betydning ifølge oppfinnelsen, er beskrevet nærmere nedenunder. Andre teknikker som ikke er beskrevet nærmere, tilsvarer kjente standardmetoder som er velkjente for fagfolk innen teknikken, eller er beskrevet nærmere i de siterte referanser og patentsøknader og i standardlitteratur (f.eks. "Antibodies, A Laboratory Manual", Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988).

Monoklonale antistoffer

MAb 425 er et murint, monoklonalt IgGl-antistoff frembrakt mot den humane A 431 karsinomcellelinje (ATCC CRL 1555). MAb 425 binder seg til en polypeptidepitop i det eksterne domenet til den humane EGF-reseptor og konkurrerer med bindingen av EGF. MAb 425 ble funnet å mediere tumorcytotoksisitet in vitro og undertrykke tumorcellevekst av epidermoid- og kolorektale karsinomavledede cellelinjer in vitro (Rodeck et al., Cancer Res. 47: 3692,1987). Humaniserte og kimære versjoner av MAb 425 er blitt beskrevet i WO 92/15683.

Kjemokiner

Kjemokinkodende cDNA-er ble enten innkjøpt fra British Biotechnology Limited (human IL-8 BBG 44: Herrmann Biermann GmbH, Bad Nauheim FRG) eller frembrakt fra mRNA isolert fra den cytokinproduserende humane cellelinje U 937 (ATCC CRL 1593). Total-RNA fra kjemokinproduserende celler ble isolert med RNAzol (WAK-Chemie, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-en ble deretter transkribert til cDNA, og kjemokinkodende sekvenser ble PCR-amplifisert under anvendelse av passende primere utledet fra publiserte DNA-sekvenser.

Vektorer

pUC 19 er en del av en serie beslektede E. cø/i-plasmidkloningsvektorer med høyt kopiantall og inneholder deler av pBR322 og M13mpl9. pUC 19 inneholder den induserbare bakterielle lac-promoteroperator, etterfulgt av et multippelkloningssete (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-109,1985). pUC-vektorer er kommersielt tilgjengelige (f.eks. New England Biolabs).

pBluescript-KS/SK+- og -KS/SK-fagemidvektorene er avledet frapUC 19. Vektorene er kommersielt tilgjengelige (Stratagene, Heidelberg). De prokaryote ekspresjonsvektorene er basert på pSWl-vektor (Ward et al., Nature 341: 544-546,1989), som er et derivat av pUC 19-vektoren. pSWl inneholder en sekvens som koder for lederpeptidet i det bakterielle pel B-gen fra Erwinia carotovora (Lei et al., J. Bact. 169: 4379-4383,1987). Fremmed-DNA-er kan innføres i rammen bak pel B-ledersekvensen for å styre proteinekspresjonen inn i periplasmaet.

Den eukaryote ekspresjonsvektor pHCMV (Gillies et al., Cell 33: 717,1983) inneholder replikasjonsoppirnnelsesstedet for apevirus 40 (SV40) og promoteren og enhancerområdet til det humane cytomegalovirus. Promoter-/enhancerområdet er etterfulgt av et multikloningssete for innføring av gener som skal uttrykkes. I denne vektoren ble den kimære form av det variable området i MAb 425-tungkjede og cylCH2-området fusjonert med kjemokinet i enden av CH2-domenet kombinert for å frembringe et MAb 425-tungkjedefusjonsprotein. Fusjons-Ig-kjeden kan settes sammen til immuno-konjugatet ved å kombinere den med den passende lette kjede for å danne et en verdig antigenbindende område som så kan forbindes slik at det fremstilles et toverdig immunokonjugat som er spesifikt for målantigenet. Tung- og lettkjedekonstruksjonene kan plasseres i én vektor eller i separate vektorer.

Ekspresjon av fusjonsproteiner i eukarvote celler

Konstruksjon av de eukarvote ekspresjonsvektorene for MAb 425- kjemokinfusions-proteinekspresjon

Fusjon av MAb 425 og kjemokinet ved hjelp av PCR- teknikk

Det humane cyl-konstantområdet ble innføyd i pUC 19 som et BamHI/BamHI-fragment. Det konstante cål-området inneholder to SacII-seter: ett lokalisert i 5'-intronet, 40 bp nedstrøms fra 5'BamHI-setet og et andre lokalisert 580 bp nedstrøms fra 5'BamHI-setet og 140 bp oppstrøms for begynnelsen av CH3-domenet. Det andre SacII-setet er egnet for ytterligere underkloning, og således ble det første SacII-setet ødelagt ved å innføre et SnaBI-sete med en adapter. I denne konstruksjonen kan (ASacIIcyl )-fragmenter nedstrøms fra SacII-setet lett byttes ut.

Det humane IL-8 ble kuttet ut fra pUC 18-vektoren (Bglll/EcoRrI) og innføyd i pBluescript SK+ (Stratagene GmbH, Heidelberg) (Smal/EcoRI), slik at Bglll-og Smal-setet ble deletert. SacII/Xbal-fragmentet i ASacIIcyl-klonen ble innføyd i pBluescript SK+. Begge genene ble amplifisert med egnede primere under anvendelse av PCR-teknikk: - for ASacIIcyl: 3'-primer: endesekvens i CH2-domenet og et Ncol-sete 5'-primer: reverssekvenserende primer

- for IL-8: 3'-primer: universalsekvenserende primer

5'-primer: et Ncol-sete og start-sekvensen i IL-8 Produktene ble kuttet og ligert med SK+-SacII/EcoRI. I den resulterende peptidsekvens endres det C-terminale lysin i CH2-domenet til metionin, og det N-terminale serin i IL-8-delen endres til glysin.

Den nyfremstilte sekvens i sammenknytningen mellom de to polypeptidene er:

Den samme fremgangsmåten ble utført ved å bruke primere (tabell 1) for å innføre et BcII-sete mellom de to genene. Det resulterende fusjonsgen var et Bcll-sete mellom genet for det konstante området i cyl og IL-8-genet, som koder for hele sekvensen til CH2-domenet, to ytterligere aminosyrer (valin, isoleucin) og IL-8-sekvensen uten de to første aminosyrene (serin, alanin).

Den nyfremstilte sekvens i sammenknytningen mellom de to polypeptidene er:

PCR-produkter ble underklonet inn i SK+ ved å bruke SacII- og EcoRI-restriksjonssetene. For eukaryot ekspresjon ble disse fusjonsgenene klonet inn i pHCMV-vektor.

Ekspresjon av immunokonjugatene i eukarvote celler

Ekspresjon av immunokonjugater i eukaryote celler krever innføringen av vektor-DNA som inneholder tung og lett kjede, i vertscellene. Mange forskjellige fremgangsmåter er blitt beskrevet, slik som elektroporasjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfat, lipofektin eller protoplastfusjon. Hvilken som helst vertscelletype kan anvendes, forutsatt at de rekombinante DNA-sekvensene som koder for immuno-konjugatet, transkriberes korrekt til mRNA i den celletypen. Vertsceller kan være musemyelomceller som ikke produserer immunglobulin, slik som Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) eller slike hamsterceller som CHO-K1 (ATCC CCL 61), eller CHO/DHFR-(ATCC CRL 9096), eller BHK-21 (ATCC CCL 10). For transient ekspresjon kan det anvendes COS-1 (ATCC CRL 1650) eller COS-7 (ATCC CRL 1651).

Transient ekspresion av immunokonjugater

Ekspresjonsvektoren pHCMV inneholder replikasjonsopprinnelsesstedet for apevirus 40 (SV40). Cellelinjen COS-7 er et derivat av apecellelinjen CV-1 som er blitt transformert med et opprinnelsesstedsmanglende SV40-virus. Plasmider som inneholder SV40-replikasjonsopprinnelsesstedet, vil derfor amplifiseres, og produksjonen av immunokonjugater vil forbedres. Supernatanter ble innhøstet 72 timer senere og testet med hensyn på EGF-reseptorbinding og kjemokinkonsentrasjon ved hjelp av ELISA.

Permanent ekspresjon av immunokoniu<g>ater

Vektorer som inneholder rekombinante konstruksjoner for ekspresjonen av immunokonjugater, innføres i passende vertsceller. Tung- og lettkjedekonstruksjonene kan plasseres i den samme vektoren eller i separate vektorer; i det sistnevnte tilfellet vil begge vektorene kunne bære identisk seleksjonsmarkør, slik som neomycinresistens eller dehydrofolatreduktase (DHFR), eller to forskjellige seleksjonsmarkører for å selektere med hensyn på tilstedeværelsen av begge vektorene. Utvelgelse med hensyn på DHFR-markør kan bare utføres i DHFR-negative cellelinjer, slik som CHO/DHFR-. Blandede populasjoner analyseres med hensyn på ekspresjon av immunokonjugater ved hjelp av EGF-reseptorspesifikk ELISA. Videre utvelgelse med hensyn på positive monoklonale antistoffer gjøres ved hjelp av begrensende fortynningskloning.

Rensing av MAb 425- kjemokinimmunokonjugater

MAb 425-immunokonjugater produsert ved hjelp av vertscellen kan samles opp og renses med hvilken som helst egnet metode, slik som affinitetskromatografi, under anvendelse av målantigen, anticytokinantistoffer eller antiidiotypiske antistoffer (f.eks. Harlow, Lane, I.c).

I foreliggende tilfelle ble rensingen oppnådd ved hjelp av antiidiotypiske antistoffer som ble produsert fra MAb 425 ved hjelp av standardmetoder (f.eks. Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148,1547).

For å oppnå rene Fv-immunokonjugater ble E. cø/i-stammer egnet for proteinekspresjon transformert med ekspresjonsplasmidene (se nedenunder). Celler ble dyrket til OD578= 0,5 og indusert med isopropyl-j3-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) (1 mM). Celler ble dyrket over natten, og supernatanter og celler ble innhøstet. Supernatanten ble tilført en anti-MAb 425-antiidiotypisk kolonne fremstilt i henhold til standardfremgangsmåter. Kolonnen ble vasket med fosfatbufret 0,5 M NaCl, og bundne proteiner ble eluert med 100 mM glysin, 0,5 M NaCl ved pH 2,5. Eluatet ble umiddelbart nøytralisert med Tris 2,5 M, pH 8,0. MAb 425-CHl-IL-8-inneholdende fraksjoner ble slått sammen, konsentrert og dialysert mot PBS.

Konstruksjon av de prokaryote ekspresjonsvektorene for

Fab 425- kjemokin- og F^ kjemokinfusjonsproteinekspresjon

Fv-fragmentet ble dannet i henhold til Glockshuber et al. (Biochemistry 29: 1362-1367, 1990). DNA-sekvensene som koder for den lette kjeden og Fd-fragmentet i den tunge kjeden eller Fv-fragmentet, er blitt innført i det multiple kloningssetet i pSWl-vektoren. Den fullt ferdige lettkjedekodende sekvens, den fullt ferdige kodende sekvens for tungkjede og den Fv-kodende sekvens kommer etter lederpeptidet fra det bakterielle pel B-gen. Den tungkjedekodende sekvens inneholder et Ncol-sete (3'-ende). De kjemokinkodende cDNA-er ble modifisert ved hjelp av PCR for å innføre Ncol- (5'-ende) og Noti- (3'-ende) eller EcoRI- (for Fv-fusjon) restriksjonssetene. Kjemokingenene ble fusjonert i ramme direkte til CH1-domenet i den tunge kjede eller Fv-fragmentet. Alter-nativt ble et slikt linkerpeptid som (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x, hvor x kan ha verdiene fra 1 til 4, innført mellom CH1-domenet og kjemokingenet. Slike linkere og fremgangsmåter for å fremstille dem er kjent i litteraturen (f.eks. Curtis et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 5809).

Disse vektorene muliggjør den virkningsfulle ekspresjon av funksjonelle F(ab')- (= CH1)- og Fv-kjemokinfusjonsproteiner i E. coli. Lettkjede- og tungkjedekjemo-kinfusjonsproteinet ble lokalisert på en enkelt dicistronbudbringer-RNA plassert under kontrollen av den induserbare lac-promoter (Skerra og Pluckthun, Science 242: 1038-1040,1988). Ekspresjon av Fab/Fv-fusjonsproteinet kan derfor induseres i henhold til kravene til dyrkningsbetingelser. Translasjonen av begge proteinene fra en dicistronbudbringer-RNA favoriserer syntese av like mengder Fd-kjemokinfusjonsprotein og lettkjede, og øker således endringene for korrekt sammensetning til virkende Fab/Fv-fusjonsproteiner. De to polypeptidene utskilles i periplasmaet til E. coli, hvor folding, dannelse av disulfidbindinger og sammensetning til funksjonelt Fab 425CH1/Fv-fusjonsprotein finner sted. Langvarig dyrkning av bakterier fører til en delvis permea-bilisering av yttermembranen til E. coli, noe som muliggjør diffusjon av fusjonsproteiner ut i dyrkningsmediet.

Bindingsegenskaper til MAb 425- immunokonjugater

Bindingsegenskapene til MAb 425-immunokonjugatene ble bestemt ved hjelp av EGF-reseptorspesifikk ELISA. I korte trekk ble mikrotiterplater belagt over natten ved 4 °C med renset EGF-reseptor. Platene ble inkubert med fusjonsproteinholdige supernatanter eller supernatanter som inneholder ukonjugerte MAb-fragmenter. Platene ble vasket for å fjerne ubundet materiale, og antistoff bundet til EGF-reseptoren ble påvist ved hjelp av inkubasjon med geite-antihumant IgG og -IgM (tung- og lettkjede) konjugert til peroksidase, etterfulgt av substrat. Mengden av bundet EGF-reseptorspesifikt protein ble bestemt ved å måle ved 490 nm.

Biologisk aktivitet av MAb 425- IL- 8- immunokonjugater

Isolering av effektorceller

For bestemmelsen av biologisk aktivitet ble nøytrofilgranulocytter fra humant perifert blod nyisolert fra helblod fra friske donorer som tidligere beskrevet av Haslett et al. (Am. J. Pathol. 119: 101-110,1985). Plasma ble fraskilt ved sentrifugering, erytrocytter ved dekstransedimentasjon, og til sist ble lymfocyttene og leukocyttene separert ved hjelp av percollgradientsentrifugering. De isolerte nøytrofiler ble brukt umiddelbart.

Bestemmelse av kjemotaktisk aktivitet

Bestemmelse av kjemotaksis ble utført i henhold til Falk et al. (J. Immunol. Methods 33: 239-247,1980). I korte trekk ble det brukt et 48-brønners Boyden-kammer og 5fim membraner. Rensede nøytrofiler ble på nytt oppslemmet i DMEM-medium (DMEM, 1 % penicillin, 1 % streptomycin, 10 % FCS, 2 mM L-glutamin, 1 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES) ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml. De nedre brønnene ble fylt med diffusjonsproteinholdige supernatanter eller kontrollsupernatantene, tildekket med membranen, og til sist ble de øvre brønnene fylt med cellesuspensjonen. Etter inkubasjon ved 37 °C i 30 minutter ble membranene fjernet og fiksert i 2 % glutar-dialdehyd i 10 minutter. Så ble celler festet til membranen farget i Weigerts jernhema-toksylin (Sigma-diagnostikum) i 3 minutter. Antallet av cellene som ble bundet til membranen, ble bestemt mikroskopisk.

Bestemmelse av evnen til å indusere enzvmfrigjørelse i nøytrofiler

For å evaluere immunokonjugatenes evne til å indusere granulfrigjørelse på nøytrofiler ble myeloperoksidaseaktivitet i supernatanten overvåket (Henson et al., J. Immunol. 121: 851,1978). Analysen ble utført i 96-brønners mikrotiterplater med 5 x IO<5>celler pr. brønn. Etter inkubasjon (37 °C) med stimulering ble platene sentrifugert, og cellefri supernatant ble overført til en annen 96-brønners mikrotiterplate. De cellefrie supernatantene ble inkubert med dianisidin (som substrat), og absorbans ble målt ved 492 nm. Som positiv kontroll ble FMLP ved 10"<7>konsentrasjon brukt. For å bestemme totalt enzyminnhold ble celler uten stimuli lysert med triton. Aktivitet ble beregnet som prosentandel i forhold til totalt enzyminnhold (lyse).

Bestemmelse av superoksidfrigiørelseskapasitet

Cytokrom c reduseres ved hjelp av O2-, og dets absorbans endres derved. Endringene i absorbans utgjør en verdifull markør for beregningen av superoksidaktivitet. Analysen ble utført i henhold til Guthrie et al. (J. Exp. Med. 160: 1656-1671, 1984) i 96-brønners mikrotiterplater med 5 x IO<5>celler pr. brønn. Etter inkubasjon med stimuli og cytokrom c ble plater sentrifugert, og absorbansen til supernatanten ble bestemt ved 550 nm.

Ytterligere immunokonjugater

Ifølge beskrivelsen ovenfor ble anti-EGFR-CHl, -CH2-, -CH3- og -Fv-immunokonjugater (med/uten restriksjonssete og linker) fremstilt og undersøkt, omfattende MIP-2a og MIP-2P som kjemokinkomponent. Disse konstruksjonene viser lignende egenskaper som IL-8-derivatene.

Terapeutisk anvendelse av immunokonjugatene

Immunokonjugatene ifølge oppfinnelsen kan administreres til menneske-pasienter for behandling. Det er derfor et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et farmasøytisk preparat som omfatter som aktiv bestanddel minst ett diffusjonsprotein definert ovenfor og i kravene, forbundet med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynningsmidler.

Typisk vil immunokonjugatene ifølge denne oppfinnelsen bli injisert intravenøst eller parenteralt. Generelt er doseringsområdene for administreringen av immunokonjugatene tilstrekkelig store til å gi den ønskede tumorundertrykkende og tumorlyserende effekt. Doseringen vil avhenge av alder, tilstand, kjønn og omfang av sykdommen hos pasienten, og kan variere fra 0,1 mg/kg til 200 mg/kg, fortrinnsvis fra 0,1 mg/kg til 100 mg/kg/dose i én eller flere daglige administreringer av doser, i én eller flere dager.

Preparater for parenteral administrering omfatter sterile, vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige opp-løsningsmidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, slik som olivenoljer, og injiserbare organiske estere, slik som etyloleat, og andre oppløsnings-midler som er kjent innen teknikken og som er egnet for disse formål. Immunokonjugatene ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes i et preparat som omfatter en fysiologisk akseptabel bærer. Eksempler på slike egnede bærere er saltoppløsning, PBS, Ringers oppløsning eller laktert Ringers oppløsning. Preserveirngsmidler og andre additiver, slik som antibiotika, antioksidanter og chelateringsmidler, kan også være til stede i farma-søytiske preparater.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for behandlingen av alle typer tumorer, inkludert melanomer, gliomer og karsinomer, samt blodtumorer og faste tumorer.

Claims (12)

1. Immunokonjugat, karakterisert vedat det omfatter et monoklonalt antistoff eller et fragment derav rettet mot en tumorcelle som bærer en antigenepitop for den epidermale vekstfaktorreseptor (EGFR), og et kjemokinprotein som er fusjonert til antistoffet eller antistoffragmentet, hvor kjemokinet er IL-8.

2. Immunokonjugat ifølge krav 1, karakterisert vedat antistoffet er et Fab-fragment eller et F(ab')2-fragment bestående hovedsakelig av det variable området i antistoffets tungkjede, CH1-domenet i det konstante området og den passende lettkjede (antistoff-CHl-konjugat).

3. Immunokonjugat ifølge krav 1, karakterisert vedat antistoffet er et antistoffragment bestående hovedsakelig av det variable området i antistoffets tungkjede, CH1- og CH2-domenene i det konstante området og den passende lettkjede (antistoff-CH2-konjugat).

4. Immunokonjugat ifølge krav 1, karakterisert vedat antistoffet er et antistoffragment bestående hovedsakelig av det variable området i antistoffets tungkjede, CH1-, CH2- og CH3-domenene i det konstante området og den passende lettkjede (antistoff-CH3-konjugat).

5. Immunokonjugat ifølge krav 1, karakterisert vedat antistoffet består hovedsakelig av det variable området i antistoffets tungkjede, den passende lettkjede og en polypepitdsekvens som binder den lette og tunge kjeden sammen (antistoff-Fv-konjugat).

6. Immunokonjugat ifølge et av kravene 1-4, karakterisert vedat det omfatter en aminosyre (sekvens) som er utledbar for et DNA-restriksjonssete mellom antistoff/anitstoffragment og IL-8, hvor restriksjonssetet er unikt innenfor hele fusjonskonstruksjonen.

7. Immunokonjugat ifølge et av kravene 1-5, karakterisert vedat det omfatter et linkerpeptid mellom antistoff/antistoffragment og IL-8.

8. Immunokonjugat ifølge et av kravene 1-6, karakterisert vedat antistoffet eller antistoffragmentet skriver seg fra murint, humanisert eller kimært MAb 425.

9. Immunokonjugat ifølge et av kravene 1-8, karakterisert vedat det er valgt fra gruppen MAb 425-CH1-IL-8, MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8, MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8, MAb 425-Fv-IL-8, MAb 425-CH3-IL-8.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunokonjugat ifølge et av kravene 1-9, karakterisert vedat DNA-sekvensene som koder for antistoffet eller antistofrfagmentet, og IL-8 fusjoneres med hverandre på et enkelttrådet DNA ved hjelp av et oligonukleotid som er komplementært til den ønskede fusjons-DNA-sekvens, den resulterende konstruksjon plasseres i en ekspresjonsvektor som transformeres i vertsorganismen, vertscellene dyrkes i en næringsoppløsning, og fusjonsproteinet uttrykkes.

11. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter minst ett av immunokonjugatene ifølge kravene 1-9 og en fysiologisk akseptabel bærer.

12. Anvendelse av et immunokonjugat ifølge et av kravene 1-9 for fremstilling av et legemiddel rettet mot tumorer.