NO171416B - Anvendelse av gamma-glutamyltranspeptidase - Google Patents

Abstract

Ved hjelp av en --glutamyltranspeptidase som er å. fremstille fermentativt, kan adiplnyl- eller glutaryl-monoamlnoforblndelser, spesielt a-keto-adipinyl- eller glutaryl-7-amlnocephalosporansyre hydrolyseres.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av "y-glutamyl-transpeptidase fra bakterier for enzymatisk hydrolyse av adipinyl- eller glutarylmonoaminoforbindelser. •y-glutamyltranspeptidaser (i det følgende -y-GTP) er allerede blitt isolert av mikroorganismer [Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 1980, 131 A, s. 181]. De spiller en viktig rolle i dyriske vev og i mikroorganismer i aminosyrestoffskiftet og i glutation-syklusen [Meth. Enzymol. 77, 237 (1981)], og de er ansvarlige for transporten av forskjellige aminosyrer i form av deres -y-gluatamylderivater, dannelsen av polyglutaminsyre i bacilli, samt nedbygningen av glutation ('y-glutamyl-cysteinyl-glycin).

Det ble nu overraskende funnet at noen mikroorganismer syntetiserer 7-GTP, som kan anvendes for hydrolyse av adipinyl- eller glutarylmonoaminoforbindelser.

Oppfinnelsen vedrører således

1. Anvendelse av -y-glutamyl-transpeptidase (-y-GTP) oppnådd ved fermentering av bakterier og som videre er karakterisert ved

- et molekylvektsområde på 20.000 til 60.000,

et isoelektrisk punkt på pH 5,0 til 6,5,

et pE-optimum på 6,5 til 10, ved L-^y-glutamyl-p-nitro-anilid som substrat,

- en Km-verdi på 9 til 36 pM ved pH 8,

for enzymatisk hydrolyse av adipinyl- eller glutarylmonoaminoforbindelser .

I det følgende omtales oppfinnelsen detaljert spesielt i deres foretrukkede utførelsesformer. Videre defineres oppfinnelsen i patentkravene.

-Y-glutamyltranspeptidase (7-GTP) katalyserer hydrolysen av glutaryl- eller adipinyl-monoamino-forbindelser med eksempelvis den generelle formel

hvori R<*> betyr en karboksyl- eller karboksykarbonyl- ;eller en karboksymetylgruppe og R<2> betyr aminosy- ;rer, dipeptider, cephemer, cephamer eller deres derivater, til den tilsvarende syre og monoaminoforbindelsen. Det anvendes fortrinnsvis 7-aminocephalosporansyre-derivater som substrat, spesielt a-keto-adipinyl- eller glutaryl-7-aminocephalosporansyre. ;Enzympreparatet forekommer periplasmatisk i mikroorganismer og lar seg karakterisere ved en molekylvekt på 20.000 til 60.000, fortrinnsvis 23.000 til 40.000, spesielt 30.000 til 35.000, samt ved et isoelektrisk punkt, som ligger ved en pH-verdi på 5,0 til 6,5, fortrinnsvis 5,7 til 6,1. Enzymproduk-tets pH-optimum ligger i pH-området 6,5 til 10 ved L-"Y-glutamylparanitroanilid som substrat. For det samme substrat har transpeptidasen en høy Km-verdi på 9 til 36 pM, fortrinnsvis 15 til 20 jiM, spesielt 8,1 pM ved pH 8. ;I nærvær av azaserin eller Jodacetamid, hemmes -y-GTP irreversibelt. I nærvær av kobber, kvikksølv og en blanding av serin og borat samt i nærvær av 7-aminocephalosporansyre viser enzymet en reversibel hemming. ;Fremstillingen foregår ved hjelp av mikroorganismer. I en screening ble det funnet bakterier, spesielt slektene Pseudomonas, Proteus, Arthrobacter og Bacillus, som gir de gode utbytter av -y-GTP, fortrinnsvis egner det seg eksempelvis: Pseudonomas fragi DSM 3881 og Bacillus subtilis IFO 3025. Spesielt foretrukket utvinnes enzymet fra Psedumonas fragi DSM 3881. Også mutanter og varianter av de nevnte mikroorganismer er egnet. ;Dyrkningen av mikroorganismene foregår aerobt, enkeltvis eller i blandingskultur, eksempelvis nedsenket, under risting eller omrøring i ristekolber eller fermentorer, evt. under innføring av luft eller oksygen. Fermenteringen kan foregå i et temperaturområde på ca. 20-37°C, fortrinnsvis vedca. 25-30°C, spesielt ved 28-30°C. De fermenteres i et pH-område på mellom 5 og 8,5, fortrinnsvis mellom 5,5 og 8,0. Under disse betingelser viser kulturmediet vanligvis etter 1-3 dager en nevneverdig akkumulasjon av enzymet. Syntesen av *y-GTP begynner i den sene logfase, og oppnår sitt maksimum i den stasjonære vekstfase. Produksjonen avdet periplasmat-iske enzym kan følges ved hjelp av aktivitetsprøve ved hjelp av HPLC-analyse resp. fotometrisk.

Den til produksjon av 7-GTP anvendte næringsoppløsning inneholder 0,2-5$, fortrinnsvis 0,5-2$ organiske nitrogenfor-bindelser samt uorganiske salter. Som organiske nitrogenfor-bindelser kommer det i betraktning: aminosyrer, peptoner, videre kjøttekstrakter, malte frø, eksempelvis av mais, hvete, bønner, soya eller bomullsplante, destillasjonsresi-duer av alkoholfremstillingen, kjøttmei eller gjærekstrakter. Av uorganiske salter kan næringsoppløsningen eksempelvis inneholde klorider, karbonater, sulfater eller fosfater av alkali- eller jordalkalimetaller, jern, sink og mangan, men også ammoniumsalter og nitrater.

Tilsetningen av assimiliserbare karbohydrater øker biomasse-utbyttet. Karbohydrater tilsettes likeledes i de ovennevnte konsentrasjoner. Som foretrukkede karbonkilder kan det eksempelvis tilsettes sukkere, som glukose eller sakkarose, samt karbohydratholdige naturprodukter som maltekstrakt til næringsoppløsningen.

De optimale fermenteringsbetingelser er for hver mikroorga-nisme riktignok forskjellig, men enten allerede kjent for fagfolk eller lette å fastslå.

Rensningen kan foregå etter klassiske fremgangsmåter over lysozym-oppslutning, ammoniumsulfat-felling, ionebytte- og gelpermeasjonskromatografi. Enzymets kobling er mulig etter vanlige metoder (Colowick og Kaplan, Meth. Enzymol., Vol.

XLIV).

For den enzymatiske omsetning kan det anvendes såvel hele celler i fri eller immobilisert form, under tilsetning av 3-laktamase-inaktivatorer, eksempelvis clavulansyre eller tienamycin, som også isolerte enzymprodukt, som likeledes kan være bærebundet. Egnede materialer for immobiliseringen av hele celler er eksempelvis chitosan, alginat, x-carrageenan, polyakrylhydrazider og ytterligere kjente stoffer, fra litteraturkjente fremgangsmåter (K.Venkatsubramanian, Immob. Cells (1979), ACS Symposium Serier, side 106)).

■y-GTP har spesielt teknisk betydning for utvinning av 7-aminocephalosporansyre fra cephalosporin C, nemlig spesielt siden det er blitt kjent en gjær, nemlig Trigonopsis variabilis (DOS 2 219 454 ), med hvis hjelp det fra Cephalosporin C i høye utbytter kan frembringes glutaryl-7-aminocephalosporansyre. Denne forbindelse kan nu ifølge oppfinnelsen bli hydrolysert med "y-glutamyltranspeptidase i gode utbytter til 7-aminocephalosporansyre. Dermed er det en åpning lukket i den enzymatiske avbygning av cephalosporin C til de for det halvsyntetiske cephalosporinet teknisk viktige 7-aminocephalosporansyre.

Oppfinnelsen omtales videre i de følgende eksempler. Prosent-angivelser refererer seg som også i den ovennevnte beskriv-else til vekt når intet annet er angitt.

Eksempel 1.

Stamholding av -y-GTP-produserende mikroorganismer foregår på skråagar med følgende sammensetning:

De små skrårør dyrkes to dager ved 28°C. Deretter avsvømmes cellene med 10 ml fysiologisk kokesaltoppløsning og 1 ml av denne suspensjon anvendes til podning av 50 ml forkultur av følgende sammensetning i en Erlenmeyerkolbe på. 300 ml:

Kolben inkuberes ved 190 omdr./min. på en rotasjonsrister i 24 timer ved 30° C. 2,5 ml av denne kultur tjener som inokulum av 50 ml hovedkultur:

Kulturen inkuberes 24 timer ved 28° C og en ristefrekvens på 190 omdr./min, og høstes deretter ved sentrifugering.

I følgende tabell er det oppført "y-GTP-aktiviteter av noen stammer:

Eksempel 2.

Analogt eksempel 1 dyrkes en forkultur med Ps.fragi DSM 3881. 50 ml av denne kultur tjener som inokulum for 2 liter hovedkulturoppløsningd i en 5-liters fermenterer. Dyrkningen av stammen foregår ved 28°C, og et oksygen partialtrykk på 70$. Dannelsen av -y-GTP følges fotometrisk og kulturen høstes ved maksimal enzymtiter. Under de gitte betingelser oppnås en -y-GTP titer på 50 mU/ml kulturoppløsning.

Eksempel 3.

1 g av de ifølge eksempel 1 fremstilte celler blandes med 2 ml oppslutningsbuffer av følgende sammensetning:

20 mM TRIS

10 mM EDTA pH 7,6

12 mM MgS04 x 7 H20.

Etter oppsiemmingen foretas følgende tilsetninger:

Lysozym: 0,8 mg/ml

DNAse : 10 mg/ml, herav 30 pl som 1 ml suspensjon.

Det inkuberes 15 min. ved værelsestemperatur. De lyserte celler sentrifugeres ved 30.000 g. Det overstående blandes til 20 vol-$ med en 2$-ig protaminsulfatoppløsning. Utfellingen kasseres etter sentrifugering. Det overstående underkastes en fraksjonert ammoniumsulfatfelling (50-80$ av metningen). Peiletet opptas igjen i 1/20 av det opprinnelige volum med 0,1 M citratbuffer, pH 5,0. Deretter gjennomfører man en varmebehandling, (1 time, 37°C), sentrifugerer og dialyserer mot 20 mM citratbuffer, pH 5,0. Retentatet påføres på en karboksymetylcellulosesøyle. Det anvendes pr. ml enzymoppløsning 6 ml CM-cellulose 52 fra Whatman. Som eluens benyttes 20 mM citratbuffer, pH 5,0, med lineær kokesaltgradient (0 til 0,5 M).

De aktive fraksjoner (HPLC-prøve) dialyseres mot 10 mM TRIS-buffer, pH 8,09, og renses videre over en DEAE-cellulosesøyle (DE 52, Whatman). Som eluens tjener 20 mM_ TRIS-buf f er, pH 8,0, med lineær NaCl-gradient (0 til 0,3 M).

Den mest aktive fraksjon (fotometerprøve) tjener for videre undersøkelser.

Eksempel 4.

1 ml av et ifølge eksempel 3 fremstilte enzympreparat konsentreres 5:1 og has på en søyle med kryssbundet agarose ("Superose 12", Pharamacia). Som mobil fase tjener 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,0 med 0,15 M NaCl. Pumpehastigheten utgjør 0,3 ml/min. Ved hjelp av 15,4 ml buffer elueres •y-glutamyltranspeptidasen. Den kan påvises ved L-^-glutamyl-p-NC^-anilid og spaltning av glutaryl-7-aminocephalosporansyre til 7-aminocephalosporansyre. "y-GTP tilsvarer et molekylvektsområde på 30.000 - 35.000.

Eksempel 5.

Biomasse som er blitt fremstilt ifølge eksempel 2, opparbei-des analogt eksempel 3, inntil innbefattende varmebehandlin-gen. Deretter dialyseres mot 20 mM kaliumfosfatbuffer, pH 5,5. Til retentatet settes så meget karboksymetylcellulose (CM 52 fra Whatman) inntil det ovenstående er laktamasefritt. Etter dialyse mot 10 mM TRIS, pH 8,0, kromatograferes over en DEAE-cellulose-søyle (DE 52, Whatman), med fire gang volumet. Som eluens tjener 20 mM TRIS-buf f er, pE 8,0, med ekstra 0,1 molar NaCl som lineær gradient. Ved hjelp av fotometerprøven fastslås de aktive fraksjoner, hvoretter enzymet utfelles med 80$ ammoniumsulfat. Peiletet opptas 1 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,0, og 0,15 M NaCl, (25:1 konsentrert).

En ytterligere rensning foregår over en søyle fylt med en kopolymer av Dextran og akrylamid, ("Sephaacryl", Pharmacia). For 3,5 ml konsentrat benyttes en søyle med 2,5 c 82 cm dimensjoner. Eluensbuffer er 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,0. De med PHLC-prøven fastslått aktive fraksjoner, konsentreres med ammoniumsulfat. Peiletet^ opptas i 20 mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,0.

Eksempel 5.

For en preparativ omsetning av glutaryl-7-aminocephalosporansyre velges følgende blanding: 100 pl enzymkonsentrat fremstilt ifølge eksempel 3 og 100 pl 40 mM glutaryl-7-aminocephalosporansyre, oppløst i 20

mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,0.

inkuberes ved en temperatur på 33°C.

Etter resp. 1 time uttas aliquoter og undersøkes ved hjelp av HPLC på dannelsen av 7-aminocephalosporansyre. Etter ca. 2,5 time er 52$ av blandingen omsatt. En trinnvis pH-økning til 7,0 bringer en maksimal omsetning på 70$ etter tilsammen 8 timer.

Eksempel 6.

Åktivitetsbestemmelse av -y-TGP.

a) HPLC-prøve.

50 pl 80 mM glutaryl-7-aminocephalosporansyre blandes med

100-140 pl 250 mM kaliumfosfatbuffer, pH 5,0, og 10-50 pl enzymoppløsning og inkuberes ved 33°C. Etter respektivt 10 minutter uttas 20 pl prøve. Reaksjonen stoppes emd 20 pl metanol. Det sentrifugeres og fortynnes iforhold 1:10 med vann. Ved en prøve på 10 pl undersøkes ved hjelp av HPLC og innholdet av 7-aminocephalosporansyre.

Stasjonær fase: C-18-kieselgel.

Mobil fase: KH2P04 50 mM i H20,MeOH (80:20) + 0,001 <t>

tetrabutylammoniumsulfat.

b) Fotometrisk prøve:

600 pl L-^-glutamyl-p-nitroanilid (166 jjM)

300 pl kaliumfosfatbuffer, pH 5,7, 50 mM og

100 pl kulturoppløsning, blandes med hverandre og inkuberes 37°C.

Claims (4)

1. Anvendelse av -y-glutamyl-transpeptidase (-y-GTP) oppnåelig ved fermentering av bakterier og er videre kjennetegnet ved - et molekylvektsområde på 20.000 til 60.000 et isoelektrisk punkt på pH 5,0 til 6,5 - et pH-optimum på 6,5 til 10 ved L--y-glutamylparanitroani- lid som substrat en Km-verdi på 9 til 36 pm ved pH 8, for enzymatisk hydrolyse av adipinyl- eller glutarylmonoaminoforbindelser .

2. Anvendelse av -y-GTP ifølge krav 1, oppnåelig ved fermentering av Pseudomonas fragi DSM 3881 og/eller Bacillus subtilis IFO 3025.

3. Anvendelse av -y-GTP ifølge krav 1 eller 2, for enzymatisk hydrolyse av adipinyl- eller glutarylmonoaminoforbindelser.

4. Anvendelse av -y-GTP ifølge krav 1 eller 2, for enzymatisk hydrolyse av a-keto-adipinyl- eller glutaryl-7-aminocephalosporansyre.