LIPASAS Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a composiciones y métodos para controlar especies de insectos. Adicionalmente, la invención se relaciona a plantas y otros organismos que se han transformado genéticamente con las composiciones de la invención. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las pestes de insectos son un serio problema en la agricultura .• Ellas destruyen millones de acres de cultivos de fibra tales como maiz, soyas, guisantes y algodón.
Anualmente, estas pestes ocasionan arriba de $100 billones de dólares en el daño del cultivo en los E.ü. solamente. En una batalla de temporada actual, los granjeros deben aplicar billones de galones de pesticidas sintéticos para combatir estas pestes. Sin embargo, los pesticidas sintéticos presentan muchos problemas. Ellos son caros, costando a los granjeros de los E.ü. casi $8 billones de dólares por año.
Ellos impulsan la emergencia de pestes resistentes a insecticida, y pueden perjudicar el medio ambiente. Se han probado otros procedimientos para el control de pestes. En algunos casos, los agricultores de cultivos han introducido "predadores naturales" de la especie que se busca controlar, tales como insectos no nativos, hongos y bacterias similares a Bacillus thuringiensis . Alternativamente, los
agricultores de cultivos han introducido colonias grandes de pestes de insectos estériles con la esperanza de que en el apareamiento entre los insectos esterilizados y los insectos silvestres fecundos disminuya la población de insectos. Desafortunadamente, el éxito ha sido incierto y el costo considerable. Por ejemplo, como una materia práctica, las especies introducidas raramente permanecen en la tierra tratada - dispersándose a otras áreas como una consecuencia no propuesta. Los insectos predadores igran, y los hongos o bacterias se deslavan de las plantas en las corrientes y rios. Consecuentemente, los agricultores de cultivos necesitan soluciones más prácticas y efectivas. Una solución relativamente reciente ha sido diseñar genéticamente cultivos para expresar lipasas de plantas que tienen propiedades insecticidas. Hasta ahora, tales lipasas insecticidas solamente han sido descritas en ciertas plantas, tales como patatina de papa (Patente Norteamericana No. 5,743,477) y pentina de la catalpa de aceite (Patente Norteamericana No. 6,057,491 y Patente Norteamericana No. 6,339,144). Sin embargo, las lipasas derivadas de plantas tienen la desventaja inherente de tener presión de selección natural inducida en insectos que se alimentan en estas plantas en estado natural. Asi, las lipasas alternativas son necesarias para el manejo de resistencia de insectos. La presente invención es útil para evitar la desventaja
inherente de la presión de selección natural preexistente, mientras que confiere otras numerosas ventajas tal como el bajo costo con relación a los pesticidas de aplicación repetida y propiedades insecticidas efectivas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos y composiciones para crear o aumentar la resistencia a insectos en plantas. Las composiciones y métodos de la invención se pueden utilizar en una variedad de sistemas para controlar pestes de plantas y no de plantas, incluyendo la propagación de linajes de cultivos resistentes a insectos y la dirección de la expresión de las proteínas pesticidas a órganos de plantas que son particularmente susceptibles a la infestación, tales como raices y hojas. Estos métodos también encuentran uso en el manejo de la resistencia a insectos. Los métodos de la invención comprenden introducir en la planta de interés secuencias de nucleótidos que codifican lipasas insecticidas no de plantas, tales como las acil hidrolasas de lipido no de plantas. También se incluyen métodos para la transformación y regeneración de plantas que comprenden construcciones que codifican tales lipasas insecticidas . Las composiciones de la invención incluyen construcciones de nucleótidos capaces de expresar lipasas no de plantas insecticidas, tales como las acil hidrolasas de
lipido no de plantas, en plantas. También se proporcionan secuencias de DNA que codifican tales lipasas útiles en la práctica de la invención. En algunas modalidades las secuencias de DNA se optimizan para la expresión en plantas. Las secuencias de DNA que codifican estas lipasas insecticidas se pueden utilizar para transformar plantas y otros organismos para el control de pestes. También se proporcionan microorganismos transformados y plantas transformadas, tejidos de plantas, células de plantas y semillas de las mismas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los resultados del bioensayo del gusano de raiz de maiz del oeste (WCRW) de la alimentación de lipasa de Candida cylindracea (como se expone en la SEQ ID NO: 2) a larvas en desarrollo. La lipasa de dieta causa una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento larval como un porcentaje de los controles de tipo silvestre. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos y composiciones para crear y aumentar la resistencia a insectos en plantas al introducir transgenes no de plantas que codifican lipasas insecticidas. Como será descrito en la presente, estos métodos son útiles para conferir resistencia a insectos a una amplia variedad de plantas, incluyendo
cultivos y otras especies de plantas domésticas. En modalidades particulares, los métodos comprenden introducir una construcción de DNA que codifica una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de lipido, en una planta. Una vez que las construcciones que comprenden lipasas insecticidas se introducen en las células de planta, la lipasa codificada es transcrita y traducida por la maquinaria celular endógena. Cuando los insectos intentan alimentarse o poner huevecillos en la planta transgénica, las lipasas exterminarán los insectos o inhibirán su crecimiento. Las células de plantas, órganos, semillas y/o la planta completa de esta manera se hacen resistentes a la infestación. Debido a que las células son establemente transformadas mediante estos métodos, la invención es útil en la creación de semilla y lineas filiales que también son resistentes a insectos. Los métodos de la invención además comprenden el uso de combinaciones de lipasas insecticidas y otros pesticidas. Tales combinaciones pueden tener efectos aditivos y/o sinergisticos en la resistencia de plantas a los insectos. Las composiciones de la invención incluyen construcciones de polinucleótido que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican lipasas insecticidas. Estas construcciones incluyen, pero no están limitadas a, casetes de expresión en donde las secuencias de nucleótidos que codifican las lipasas insecticidas están operablemente
enlazan a un promotor que induce la expresión en una célula de planta. La invención además proporciona células de plantas, plantas, y semillas establemente transformadas con estas construcciones de polinucleótido. Las composiciones de la invención son útiles en proteger a una planta de las pestes de insectos, y se pueden utilizar para impactar pestes de insectos que interactúan con una planta durante una o más fases del ciclo de vida del insecto. Las lipasas son bien conocidas en la técnica. Una clase de lipasa es la acil hidrolasa de lipido, también conocida como triacilglicerol acilhidrolasa o triacilglicerol lipasa (llamadas enzimas de EC 3.1.1.3 bajo el sistema de nomenclatura de IUBMB) . Estas enzimas catalizan la reacción de hidrólisis: triacilglicerol + H20 = diacilglicerol + un carboxilato. Las acil hidrolasas de lipido todas comparten una región estructural hendible conservada llamada la triada catalítica. La triada catalítica consiste de una porción de glicina-aminoácido X-serina-aminoácido X-glicina (GxSxG) . Se ha demostrado que la sustitución de aminoácido en esta región anula la actividad enzimática. Notablemente, la acción enzimática de estas acil hidrolasas de lipido también se correlaciona con la actividad insecticida significante. Las lipasas insecticidas útiles en la práctica de algunas modalidades de la invención incluyen acil hidrolasas de lipido que pueden impactar una peste de insectos tales
como aquellas lipasas derivadas de especies no de plantas como es discutido en la presente y conocido en la técnica. El término "impacto de una peste de insectos" o "impactación de una peste de insectos" se propone para dar a entender el efecto de emplear cualquier sustancia u organismo para prevenir, destruir, repeler o mitigar una peste de insecto tal cómo por ejemplo la lipasa insecticida. Asi, muchas propiedades benéficas son conferidas a una planta transgénica que expresa proteínas insecticidas, por ejemplo, lipasa que tiene actividad insecticida (después en la presente referida como "lipasas insecticidas") . Como se utiliza en la presente, el término "actividad pesticida" se utiliza para referirse a la actividad de un organismo o una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteina) , ya sea tóxica o inhibitoria, que puede ser medida mediante, pero no está limitada a, mortalidad de la peste, pérdida de peso de la peste, repelencia de la peste, atrofiamiento del crecimiento de la peste y otros cambios de comportamiento y físicos de un peste después de la alimentación y la exposición por una duración de tiempo apropiada. De esta manera, la actividad pesticida impacta por lo menos un parámetro medible de la condición de la peste. De manera similar, "actividad insecticida" puede ser utilizada para referirse a "actividad pesticida" cuando la peste es una peste de insectos. "Atrofiamiento" se propone
para dar a entender mayor que 50% de inhibición del crecimiento como es determinado por el peso. Los procedimientos generales para monitorear la actividad insecticida incluyen la adición del compuesto experimental u organismo a la fuente de dieta en un contenedor encerrado. Los ensayos para determinar la actividad insecticida son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,570,005 y 6,339,144; incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. La etapa de desarrollo óptima para la prueba para la actividad de insecticida es las formas de larvas o inmaduras de un insecto de interés. Los insectos pueden ser creados en la oscuridad total en aproximadamente 20 °C a aproximadamente a 30 °C y de aproximadamente 30% a aproximadamente 70% de humedad relativa. Los bioensayos se pueden realizar como es descrito en Czapla y Lang (1990) J. Econ . En tomoi : 83 (6) : 2480-2485. Los métodos para crear larvas de insectos y realizar bioensayos son bien conocidos para uno de habilidad ordinaria en la técnica. El término "cantidad pesticidamente efectiva" connota una cantidad de una sustancia u organismo que tiene actividad pesticida cuando está presente en el medio ambiente de una peste. Para cada sustancia u organismo, la cantidad pesticidamente efectiva se determina empíricamente para cada peste afectada en un ambiente especifico. De manera similar,
una "cantidad insecticidamente efectiva" se puede utilizar para referir a una "cantidad pesticidamente efectiva" cuando la peste es una peste de insectos. "Creación o aumento de resistencia a insectos" se propone para dar a entender que la planta genéticamente modificada de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene resistencia incrementada a una o más pestes de insectos con relación a una planta que tiene un componente genético similar con la excepción de la modificación genética descrita en la presente. Las plantas genéticamente modificadas de la presente invención son capaces de la expresión de por lo menos una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de lipido, que protege a una planta de una peste de insectos mientras que impacta a una peste de insectos de una planta. "Protege una planta de una peste insectos" se propone para dar a entender la limitación o eliminación del daño relacionado con la peste de insectos a una planta mediante, por ejemplo, la inhibición de la habilidad de una peste de insectos a crecer, alimentarse y/o reproducirse o , al exterminar la peste de insectos. Como.se utiliza en la presente, "impacto de una peste de insectos de una planta" incluye, pero no está limitado a, el factor disuasivo de la peste de insectos la alimentación adicional sobre la planta, dañamiento de la peste de insectos mediante, por ejemplo, la inhibición de la habilidad de un insecto a crecer, alimentarse y/o
reproducirse, o la exterminación de la peste de insectos. El término "lipasa insecticida" se utiliza en su sentido más amplio e incluye, pero no está limitado a, cualquier miembro de la familia de acil hidrolasas de lipido que tiene efectos tóxicos o inhibidores de insectos. Los efectos tóxicos e inhibidores de lipasas insecticidas incluyen, pero no están limitadas a, el atrofiamiento del crecimiento larval, exterminación de huevecillos de larvas, reducción de la alimentación ya sea adulta o juvenil en plantas transgénicas con relación a aquella observada en el tipo silvestre, y la inducción de la evitación del comportamiento en un insecto conforme se relaciona a la alimentación, anidamiento, reproducción, combinaciones de los mismos, y los similares. Asi, como es descrito en la presente, la resistencia a insectos puede ser conferida a un organismo al introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una lipasa insecticida o al aplicar una sustancia insecticida, que incluye, pero no está limitada a, tal como una proteina insecticida, un organismo (por ejemplo, una planta o parte de planta de la misma) . Por ejemplo, cualquier lipasa insecticida derivada de fuentes no de planta puede ser utilizada para crear o aumenta la resistencia de insectos en una planta. Las lipasas insecticidas comprendidas por la invención pueden tener propiedades ventajosas además de
causar mortalidad y morbidez del insecto. Una propiedad ventajosa de tal clase incluye, pero no está limitada a, la incapacidad para inducir una respuesta alérgica (es decir, acil hidrolasa de lipido hipoalergénica) . Asi, en algunas modalidades, la acil hidrolasa de lipido insecticida útil en la invención además es seleccionada en base a la incapacidad para inducir o exacerbar la alergia en una población objetivo. Las lipasas insecticidas no de planta, tales como las acil hidrolasas de lipido no de plantas, incluyendo pero no limitadas a aquellas divulgadas en la presente, son menos probables que induzcan o exacerben la alergia. Las plantas que expresan una lipasa insecticida hipoalergénica tal como un acil hidrolasa de lipido, de esta manera se transforman resistentes a la infestación sin efectos perjudiciales concurrentes en la calidad de la alimento/comida. Los métodos para estimar las respuestas alérgicas al alimento son conocidos en la técnica y rutinariamente realizados. Las lipasas insecticidas comprendidas por la invención, tales como acil hidrolasas de lipido, encuentran uso como una alternativa a un método de pesticida previamente implementado tal como la aplicación de pesticida y/o la modificación genética previa de una planta. Las medidas dirigidas al reducir el potencial para las pestes de insectos a llegar a ser resistentes a un pesticida son llamadas "manejo de resistencia del insecto". Las lipasas insecticidas
no de plantas, tales como las acil hidrolasas de lipido insecticidas no de plantas, incluyendo pero no limitadas a aquellas divulgadas en la presente, son de uso en el manejo de resistencia a insectos debido a que son una alternativa a los pesticidas actuales. Por lo tanto, las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, que encuentran uso en la invención también pueden ser además seleccionadas para el . uso en los programas de manejo de resistencia a insectos. Aquellos expertos en la técnica reconocen que la selección de una lipasa insecticida particular, tal como una acil hidrolasa de lipido, dependerá del tipo de la cepa de insectos resistente que emerge (o es probable que emerja) asi como los cultivos que son probables que sufran de la infestación. Las lipasas insecticidas comprendidas por la invención incluyen acil hidrolasas de lipido que tienen actividad insecticida y que son codificadas por secuencias de ácido nucleico de fuentes no de plantas, o fragmentos o secuencias variantes de los mismos. "No de planta" se propone para dar a entender que comprende todos los reinos filogenéticos excepto Planta (es decir, comprenden el Reino Euryarcheota , Reino Crenarcheota, Reino Eubacteria, Reino Euryarcheota , Reino Crenarcheota , Reino Protozoa, Reino Mycota, Reino Chromista y Reino Animalia ) . Como un ejemplo, las lipasas insecticidas, tales
como acil hidrolasas de lipido, pueden ser derivadas de especies dentro del Reino Mycota ; por ejemplo, lipasa 1 de Candida (CLIP1) derivada de la levadura Candida cylindracea (previamente conocida como Candida rugosa) (por ejemplo, GenBank Acceso No. X16712; y la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID N0:1 que codifica la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2; ver también, Longlii y colaboradores, (1992) Biochim . Biophys . Acta 1131:227-232 y Lotti y colaboradores, (1993) Gene 124:45-55); y una lipasa de Rhizopus derivada de Rhizopus arrhizus
(también conocido como R . oryzae) (por ejemplo, GenBank
Acceso No. AF229435; y la secuencia de nucleótidos como se expone en- la SEQ ID NO: 5, con la región de nucleótidos 901- 2079 que codifica la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 6); y variantes o fragmentos funcionales de las mismas. Como otro ejemplo, las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, pueden ser derivadas de especies dentro del Reino Eubacteria ; por ejemplo, la lipasa derivada de Nitroso onas europaea (por ejemplo, GenBank Acceso No. BX321865; región de nucleótidos 4475-5422 que codifica una proteina que 'tiene GenPept Acceso No. CAD86430 y depositado como ATCC Acceso No. 19718D, y la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 7 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8), y
variantes o fragmentos funcionales de las mismas. Como todavía otro ejemplo, las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, se pueden derivar de especies dentro del Reino Animalia ; por ejemplo, la lipasa derivada de páncreas porcino (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 4 como es codifica por la secuencia de codificación optimizada de maiz mostrada en la SEQ ID NO: 3), y variantes o fragmentos funcionales de las mismas. Asi, las lipasas insecticidas comprendidas por la invención, tales como acil hidrolasas de lipido, se pueden expresar en una planta transgénica o parte de planta. Por ejemplo, en algunas modalidades, la planta es establemente transformada con una construcción de nucleótidos que comprende un cásete en donde por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de lipido, es operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión en una célula de planta. De esta manera, la expresión de lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, comprendidas por la invención puede conferir resistencia de una planta o parte de planta a la infestación por insectos. Tal cásete de expresión puede comprender una secuencia que codifica una lipasa insecticida, tal como acil hidrolasas de lipido, por ejemplo, la secuencia expuesta en la SEQ ID N0:1 (que codifica, una lipasa
insecticida fangal llamada CLIP1 como se expone en la SEQ ID NO:2); SEQ ID NO:3 (que codifica una lipasa insecticida de animal llamada lipasa pancreática porcina como se expone en la SEQ ID NO: 4); SEQ ID NO: 5 (que .codifica una lipasa insecticida fangal derivada de Rhizopus arrhizus como se expone en la SEQ ID N0:6); o SEQ ID NO:7 (que codifica una lipasa insecticida bacteriana derivada de Ni trosonionas europaea com se expone en la SEQ ID NO: 8), o una secuencia que codifica un fragmento o variante funcional de una lipasa insecticida, tal como la lipasa expuesta en la SEQ ID NO: 2, 4, 5 o 8. Asi, los fragmentos y variantes de polinucleótidos y proteínas que codifican lipasa insecticida, codificadas de esta manera también encuentran uso la preparación de composiciones y la práctica de métodos de la invención. Por el término "fragmento" se propone una porción del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos y por siguiente la proteina codificada de esta manera. Los fragmentos de un polinucleótidq pueden codificar fragmentos de proteina que retienen la actividad biológica de la proteina nativa y por consiguiente retiene la actividad de lipasa insecticida. Asi, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta el polinucleótido de longitud
completa que codifica la lipasa insecticida de interés. Un fragmento de un polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de una lipasa insecticida útil en la invención, tal como un acil hidrolasa de lipido, codificará por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteina de lipasa completa (por ejemplo, 549 aminoácidos para SEQ ID NO: 2, 450 aminoácidos para SEQ ID NO: 4, 392 aminoácidos para SEQ ID NO: 6 y 321 aminoácidos para SEQ ID NO: 8. respectivamente) . Una porción biológicamente activa de una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de lipido, se puede preparar al aislar una porción de uno de los polinucleótidos que codifica una lipasa insecticida, que expresa la porción codificada de la proteina de lipasa (por ejemplo, mediante la expresión recombinante in vitro) , y al estimar la actividad de la porción expresada de la proteina de lipasa para la actividad de acil hidrolasa de lipido y/o actividad insecticida. Por ejemplo, las acil hidrolasas de lipido retienen una secuencia de aminoácidos " conservada llamada la triada catalítica (es decir, GxSxG) como es discutido supra. Asi, un fragmento de una acil hidrolasa de lipido que tiene una triada catalítica encuentra uso en la invención, ya que retiene la actividad enzimática. Los polinucleótidos que son fragmentos de
secuencias de nucleótidos que codifican lipasas, tales como acil hidrolasas de lipido, comprenden por lo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 940 nucleótidos contiguos, o ' hasta el número de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa divulgado en la presente (por ejemplo, 1650 nucleótidos para SEQ ID NO: 1; 1,350 para SEQ ID NO: 3; 3120 nucleótidos para SEQ ID NO: 5, de los cuales 1178 nucleótidos contiguos de 901-2079 son secuencia de codificación; y 942 nucleótidos para SEQ ID NO: 7) . "Variantes" se propone para dar entender secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende un polinucleótido que- tiene supresiones (es decir, truncamientos) en el extremo 5' y/o 3' ; supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos en el polinucleótido nativo; y/o substitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se utiliza en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que ocurren naturalmente, respectivamente. Para polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácido de uno de los polipéptidos de lipasa útiles en la invención, tal como una acil hidrolasas de lipido. Las
variantes que ocurren naturalmente, tales como variantes alélicas, se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como son resumidas enseguida. Los polinucleótidos variables también incluyen polinucleótidos sintéticamente derivados, tales como aquellos generados, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida el sitio pero que todavía codifica una proteina de lipasa insecticida en la invención, tales como una acil hidrolasa de lipido. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia que el polinucleótido particular como es determinado por los programas de alineación de secuencia y parámetros como son descritos en otra parte en la presente. Las variantes de una secuencia de nucleótidos particular comprendidas por la invención (es decir, la secuencia de nucleótidos de referencia) también se puede evaluar mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos variante y el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. Asi, por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados que codifican un
polipéptido con un por ciento de identidad de secuencia dado al polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 son incluidos. El por ciento de identidad secuencia entre cualquiera de dos polipéptidos se puede calcular utilizando los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos a otra parte en la presente. Donde cualquier par dado de polinucleótidos de la invención se evalúa mediante la comparación del P°r ciento de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que ellos codifican, el por ciento de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia . Proteina "variante" se propone para dar a entender una proteina derivada de la proteina nativa mediante supresión (llamado truncamiento) de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la protéína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las proteínas variantes comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, esto es ellas continúan presentando la actividad biológica deseada de la proteina nativa, esto es, reteniendo las propiedades insecticidas y/o
actividad de lipasa como es descrito en la presente. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, el polimorfismo genético o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de proteínas de lipasa insecticidas que son útiles en la invención, tales como acil hidrolasas de lípido, tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como es determinado por los programas de alineación de secuencia descrito en otra parte en la presente. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de la proteina nativa por tan pocos como 1-15 residuos de aminoácido, tan pocos como 1-10, tales como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aun 1 residuo de aminoácido. Las lipasas insecticidas de la invención, tales como acil hidrolasas de lípido, pueden ser alteradas en varias maneras incluyendo las sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos y fragmentos de lipasas insecticidas, tales como fragmentos de acil hidrolasa de lipido, se pueden preparar mediante mutaciones en el DNA. Los métodos para la
mutagénesis y las alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel
(1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods in Enzymol . 154:367-382; la Patente Norteamericana No. 4,873,192; Walker y Gaastra, eds.
(1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing
Company, Nueva York) y las referencias citadas en las mismas.
La guía en cuanto a las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff y colaboradores, Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. , Washington, D.C.), incorporada en la presente por referencia. Las sustituciones conservativas, tal como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser óptimas. Especificamente, aquellos de habilidad en la técnica reconocerán que las regiones de la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que no son altamente conservadas en las acil hidrolasas de lípido como se comparan a otras regiones dentro de las secuencias, generalmente serán menos tolerantes a la modificación a través de sustituciones de aminoácidos. Como tales, la triada catalítica discutida previamente encontrada en las acil hidrolasas de lipido, que consisten de una porción de glicina-aminoácido X-serina-aminoácido X-glicina (GxSxG) , se puede preservar en ciertas
modalidades para retener la actividad enzimática y/o biológica. Asi, las secuencias de nucleótidos para el uso en la práctica de la invención incluyen tanto las secuencias que ocurren naturalmente así como las formas mutantes. Del mismo modo, las proteínas insecticidas de la invención comprenden tanto las proteínas que ocurren naturalmente así como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán presentando la actividad insecticida deseada. Obviamente, las mutaciones que serán hechas en el DNA que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del cuadro de lectura y óptimamente no crearán regiones complementarias que podrían producir la estructura de mRNA secundaria. Ver, la Publicación de Solicitud de Patente EP No. 75,444. Las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteína comprendidas en la presente no se esperan que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción por adelantado, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante los ensayos de clasificación de rutina. Por ejemplo, la actividad se puede evaluar mediante un bioensayo en la cual la lipasa insecticida se adiciona a la dieta de las larvas de gusano de
raíz de maíz como es descrito en el Ejemplo 1. Ver, por ejemplo, Rose y McCabe (1973) J. Econ . Entomol . 66: 393, incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Las secuencias de nucleótidos variantes y proteínas también comprenden secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el entremezclado de DNA. Con tal procedimiento, una o más secuencias deO lipasa insecticida diferentes pueden ser manipuladas para crear una nueva lipasa que posee las propiedades insecticidas deseadas. De esta manera, las librerías de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinadas in vitro o in vivo . Por ejemplo, utilizando este procedimiento, las porciones de secuencia que codifican un dominio de interés, tal como la tríada catalíticas y variantes de la misma, pueden ser entremezcladas entre secuencias de nucleótidos de la invención, tal como la SEQ ID NO: 1 y otros genes de lipasa conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteina con una propiedad mejorada de interés, tal como una actividad insecticida incrementada. Las estrategias para tal entremezclado de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Na ture 370:389-
391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech . 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol . Biol . 272:336-347 ; Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Na ture 391:288-291; y las Patentes Norteamericanas Nos, 5,605,793 y 5,837,458. Como un ejemplo, la especificidad de substrato alterada puede ser un parámetro para la selección de productos del entremezclado de gen. Las acil hidrolasas de lípido comprenden una familia de ultigenes diversa que es conservada a través de muchas especies. Las enzimas exhiben actividad hidrolizante para muchos glico- y fosfolípidos. Los substratos incluyen monogalactosildiacilglicerol, acilsterilglucosido, fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, así como muchos otros substratos de lípido. De manera similar, la composición de membrana de varios insectos asi como de plantas pueden variar de especie a especie y pueden ser afectados por las condiciones de dieta o crecimiento. Consecuentemente, la actividad de una acil hidrolasa de lipido dada para un substrato dado podría afectar tanto la especificidad como la potencia. Como otro ejemplo, la solubilidad alterada y la estabilidad de la proteína también podrían ser un parámetro para la selección de productos de entremezclado de gen. Las
lipasas insecticidas, tales como las acil hidrolasas de lípido, son activas en el ambiente áspero del lumen del intestino del insecto. Las proteínas injeridas tal como estas son digeridas por proteasas, y afectadas por las condiciones reducción u oxidación que varian de acuerdo con la especie de insecto probada.' La solubilidad y estabilidad de las acil hidrolasas de lipido tanto en la planta transgénica como en el lumen del intestino del insecto podrían afectar la actividad biológica. Por ejemplo, el pH de intestino del gusano de maíz es de 5.5-6.0. Así, la selección de productos de gen entre mezclados para la actividad enzimática hacia substratos de lípido en este intervalo de pH es otro parámetro que podria afectar la toxicidad de la proteína hacia los insectos. Asi, se reconoce que las secuencias divulgadas pueden ser utilizadas conjuntamente en experimentos de entre mezclado asi como con otras secuencias de lipasas insecticidas, particularmente otras acil hidrolasas de lípido, y los similares. Así, las variantes de un polipéptido deben retener la actividad biológica deseada de la secuencia nativa. Los métodos son disponibles en la técnica para determinar si un polipéptido variante retiene la actividad biológica deseada del polipéptido nativo. La actividad biológica puede ser medida utilizando ensayos específicamente diseñados para medir -la actividad del polipéptido o proteína nativa. Ver,
por ejemplo, Andrews y colaboradores, (1988) Biochem J 252:199-206; y la Patente Norteamericana No. 5,743,477; ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Adicionalmente, los anticuerpos creados contra el polipéptido de secuencia nativa pueden ser probados para su habilidad para enlazar al polipéptido variante, donde el enlace efectivo es indicativo de un polipéptido que tiene una conformación similar aquella del polipéptido nativo. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto en la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un cDNA de longitud completa o secuencia de gen, o el cDNA completo o secuencia de gen. (b) Como se utiliza en la presente "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones y supresiones (es decir, espacios)
comparados con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, .40, 50, 100 o más larga. Aquellos expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud de una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido una sanción de espacio es típicamente introducida y es sustraída del número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de las dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores (1981) Adv. Appl . Ma th . 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453; el método de alineación para búsqueda local de Pearson y Lipman (1988) Proc . Na ti . Acad. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc . Nati . Acad. USA 872264, como es modificado en Karlin y Altschul (1993) Proc. Na ti . USA 90:5873. Las implementaciones en computadora de estos
algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California) ; el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA) . Las alineaciones utilizando estos programas se pueden realizar utilizando los parámetros de error. El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet y colaboradores (1988) Nucleic Acids Res . 16:10881-90; Huang y colaboradores (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson y colaboradores (1994) Meth . Mol . Biol . 24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra . Una tabla de residuo ponderado PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y una sanción de espacio de 4 se puede utilizar con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. El programa BLAST de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol . Biol . 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra . Las búsquedas de nucle'ótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas , de proteína BLAST se pueden realizar en el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteina o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para .propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar como es descrito en Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul y colaboradores (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden ser utilizadas. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección. A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad de secuencia/similitud proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando la Ponderación de GAP de 50 y Ponderación de longitud de 3 y la matriz de registro nwsgapdna. cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos
utilizando la Ponderación de GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2 y la matriz de registro BLOSUM62; o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se propone cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuos de nucleótidos o de aminoácidos idénticas y un por ciento de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada mediante GAP Versión 10. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch
(1970) J. Mol . Biol . 48-443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crean la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de las igualaciones para cada espacio que este inserta. Si se selecciona una sanción de extensión de espacio mayor que cero, GAP, debe hacer, además un aprovechamiento para cada espacio insertado en la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de
sanción de extensión de espacio Versión 10 del paquete de Software Wisconsin Genetics GCG para secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es de 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es" 3. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 200, Asi, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio de extensión de espacio puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP exhibe cuatro figuras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El Por Ciento de Identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El Por Ciento de Similitud es el por ciento de símbolos que son similares . Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro
utilizada en la versión 10 del paquete de software de Genetics Wisconsin GCG es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 89:10915). (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptido hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se pueden ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren con tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Típicamente este involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que
completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y una sustitución -no conservativa se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en el cual la base de ácido nucleico idéntico o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia . Las secuencias de codificación para las lipasas
insecticidas por la invención, tales como acil hidrolasas de lípido, se pueden proporcionar en casetes de expresión para la expresión en la planta u organismo de interés. El cásete puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' operablemente enlazadas a un polinucleótido que codifica una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de lípido. "Operablemente enlazado" se propone para dar a entender un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos operablemente enlazados pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se utilizan para referirse a la unión de dos regiones de codificación de proteína, por operablemente enlazado se propone que las regiones de codificación están en el mimo cuadro de lectura. El cásete adicionalmente puede contener genes adicionales para ser cotransformados en el organismo. Alternativamente, el (los) gen(es) adicional (es) se puede proporcionar en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para la inserción de un polinucleótido que codifica una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de ' lipido, de modo que el gen está bajo la regulación transcripcional de regiones reguladoras . El cásete de
expresión adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables . El cásete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor) , una secuencia de DNA comprendida por la invención, tal como una secuencia de DNA que codifica la lipasa insecticida comprendida por la invención y una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en las plantas. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras transcripcional, y regiones de terminación traduccional) y/o los polinucleótidos que codifican lipasa útiles en la invención pueden ser nativas/análogas a la célula hospedera o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o polinucleótidos que codificación lipasa útiles en la invención pueden ser heterólogos a la célula hospedera o entre sí. Como se utiliza en la presente, "heterólogo" en referencia a una secuencia es una secuencia que origina de una especie foránea, o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificada en su forma nativa en composición y/o sitio genómico mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un polinucleótido heterólogo es una especie diferente de la especie de la cual se derivó el polinucleótido, o, si es de
la misma especie/análoga, una o ambas son sustancialmente modificados de su forma original y/o sitio genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido operablemente enlazado. Como se utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación operablemente enlazada a una región de iniciación de transcripción que es heteróloga a la secuencia de codificación . La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción, puede ser nativa con los polinucleótidos que codifican lipasa operablemente enlazados de interés, puede ser nativa con el hospedero de planta, o puede ser derivado de otra fuente (es decir, foráneo o heterólogo al promotor, el polinucleótido que codifica lipasa insecticida de interés, el hospedero de planta, o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes son disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol . Gen . Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acids
Res . 15:9627-9639. Donde es apropiado, los polinucleótidos pueden ser optimizados para la expresión incrementada en la planta transformada. Esto es, los polinucleótidos pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos de planta para la expresión mejorada. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol . 92:1-11 para una discusión de la utilización de codón preferido por el hospedero. Los métodos son disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de planta. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,380,831 y 5,436,391, y Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:477-498, incorporadas en la presente por referencia. Las modificaciones de secuencia adicionales son conocidas para aumentar la expresión del gen en un hospedero celular. Éstos incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales , de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposón, y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales a la expresión de gen. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por la referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedera. Cuando es posible, la secuencia es modifica para evitar estructuras de mRNA secundarias de horquilla
predichas . Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias guias 5' en la construcción del cásete de expresión. Tales secuencias guia pueden actuar para aumentar la traducción. Las guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guías de picornavirus, por ejemplo, guía EMCV (región de no codificación 5' de Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein y colaboradores (1989) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86:6126-6130); guias de potivirus, por ejemplo, guía TEV (Virus de Grabado de Tabaco) (Gallie y colaboradores (1995)
Gene 165 (2 ): 233-238 ) , y proteína de enlace de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y colaboradores
(1991) Nature 353:90-94); guía no traducida del mRNA de proteina de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores (1987) Na ture 325:622-625) ; guía de Virus de Mosaico de Tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); y guía de virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores (1991) Virology 81:382-385). Ver También,. Della-Cioppa y colaboradores (1987) Plant Physiol . 84:965-968. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA pueden ser manipulados para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y, como sea apropiado, en la estructura de lectura
apropiada. Hacia este fin, los adaptadores o enlazadores puede ser empleados para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones pueden ser involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de DNA superfluo, remoción de sitios de restricción o los similares. Para este propósito, la mutagénesis in vi tro, reparación de cebador, restricción, recocido, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones, pueden ser involucradas. Debido a que las secuencias que codifican lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido que son de uso particular en la invención son derivadas no de plantas, aquellos expertos en la técnica reconocen que la secuencia de DNA nativa que codifica la lipasa insecticida, tal como una secuencia de acil hidrolasas de ' lipido, puede no expresarse apropiadamente en plantas. Por lo tanto, ciertas modificaciones a la secuencia de DNA pueden ser necesarias para asegurar la expresión de la proteína apropiada y el plegamiento. Por ejemplo, Candida cylindracea tiene utilización de codón no usual. Este traduce el codón CTG como una serina en lugar de una leucina usual como en otros organismos, ver Kwaguchi y colaboradores, (1989) Nature 6238:164-166. Como una consecuencia, si se intenta expresar la secuencia de DNA nativa en plantas, la enzima contendría leucinas en lugar de serinas, en algunos casos, esta sustitución no podría afectar la actividad enzimática. Sin
embargo, debido a que la triada catalítica requiere una serina en el sitio activo, la sustitución de serina a leucina transforma la lipasa codificada nativa inactiva en plantas. Así, reemplazando el codón CTG por un codón que es leído como una serina en plantas se restaura la actividad. Por ejemplo, la sustitución de CTG con los codones TCT, TCC, TCA, TCG, AGT o AGC causará que la planta traduzca el aminoácido correcto -serina - en lugar de leucina. La secuencia de DNA expuesta en la SEQ ID NO:l, que se derivó de Candida cylindracea , incluye estas sustituciones ventajosas. Un número de promotores pueden ser utilizados en la práctica de la invención. Los promotores pueden ser seleccionados basados en el efecto deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, preferidos de tejido, u otros promotores para la expresión en plantas . Tales promotores constitutivos, incluyen, por ejemplo, el promotor de núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en WO 99/43838 y la patente norteamericana No. 6,072,050; el promotor 35S de CaMV de núcleo (Odell y colaboradores (1985) Na ture 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores (1990) Plant Cell 2:163-171); ubicuitin (Christens'en y colaboradores (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen y colaboradores (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689); pEMU (Last
y colaboradores (1991) Theor. Appl . Genet . 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente norteamericana No. 5,659,026), y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos discutidos en las patentes norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6,177,611. Generalmente, será benéfico expresar las secuencias de proteína insecticida desde un promotor inducible, particularmente desde : un promotor inducible por patógeno. Tales promotores incluyen aquellos de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR) , que son inducidas después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi y colaboradores (1983) Neth J. Plant Pathol . 89:245-254; Uknes y colaboradores (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol . Virol . 4:111-116. Ver también WO 99/43819 incorporado en la presente por referencia. De interés son los promotores que son expresados localmente en o cerca del sitio de la infección del patógeno. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores (1987) Plant Mol . Biol . 9:335-342; Matton y colaboradores (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch y colaboradores (1986) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 83:2427-2430;
Somsisch y colaboradores (1988) Mol . Gen . Genet . 2:93-98; y Yang (1996) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores (1994) Proc . Nati . Acad. Scí . USA 91: 2507-2511; Warner y colaboradores (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz y colaboradores (1989) Plant Cell 1:961-968; patente norteamericana No. 5,750,386 (inducible por nemátodo) ; y las referencias citadas en la misma. De particular interés es el promotor inducible para el gen PRms de maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium moniliforme (ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores (1992) Physiol . Mol . Plant Path . 41:189-200) . Adicionalmente, conforme los patógenos encuentran la entrada en plantas a través de lesiones o el daño por insectos, un promotor inducible por lesión puede ser utilizado para inducir la expresión de las proteínas insecticidas. Tales promotores inducibles por lesión incluyen el gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann . Rev. Plzytopath . 28:425-449; Duan y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:494- 498); win 1 y win 2, la Patente Norteamericana No. 5,428,148; win 1 y win 2 (Stanford y colaboradores, (1989) Mol . Gen . Genet . 215:200-208); sistemina (McGurl y colaboradores, (1992) Science 225:1570-1573); WIP 1 (Rohmeier y colaboradores, (1993) Plant Mol . Biol . 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores, (1993) FEBS
Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok y colaboradores, (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150) ; y los similares, incorporados en la presente por referencia. Los promotores regulados químicamente pueden ser utilizados para modular la expresión de una secuencia de proteína insecticida de insecto en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimióle químicamente, donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión del - gen. Los promotores inducibles químicamente son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, el promotor In2-2 de maíz, es activado por moderadores de herbicida de bencensulfonamida, el promotor GST de maíz, que 'es activado por los compuestos electrofílicos hidrofóbicos que son utilizados como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-la de tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés incluyen los promotores responsivos a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoide en Schena y colaboradores, (1991) Proc. Na ti .
Acad. Sci . EUA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores,
(1998) Plant J. 14 (2) : 247-257 ) y los promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (ver, por
ejemplo, Gatz y colaboradores, (1991) Mol . Gen . Genet . 227:229-237, y la Patentes Norteamericanas Nos. 5,814,618 y 5,789,156), incorporadas en la presente por referencia. Los promotores preferidos de tejido pueden ser utilizados para dirigir la expresión aumentada de lipasa insecticida dentro de un tejido de planta particular. Los promotores preferidos de tejido incluyen aquellos discutidos en Yamamoto y colaboradores, (1997) Planl J. 12 (2) : 255-265; Kawamata y colaboradores, (1997) Plant Cell Physiol . 38 (7) :792-803; Hansen y colaboradores, (1997) Mol . Gen Genet . 254 (3) :337-343; Russell y colaboradores, (1997) Transgenic Res . 6(2) :157-168; Rinehart y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112(3) :1331-1341; Van Camp y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112 (2) : 525-535; Canevascini y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112 (2) : 513-524; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol . 35 (5) : 773-778; Lam
(1994) Results Probl . Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores, (1993) Plant Mol Biol . 23 (6) : 1129-1138 ;
Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc Na ti . Acad. Sci . EUA 90 (20) : 9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores, (1993) Plant J. 4 (3) : 495-505. Tales promotores pueden ser modificados, si es necesario, para la expresión débil. Los promotores preferidos de hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12 (2) : 255-265; Kwon y colaboradores, (1994)
Plant Physiol . 105:357-67; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol . 35 (5) : 773-778 ; Gotor y colaboradores, (1993) Plant 3:509-18; Orozco y y colaboradores, (1993) Plant Mol . Biol . 23 (6) : 1129-1138; y Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 90 (20) : 9586-9590. Los promotores preferidos de raíz son conocidos y pueden ser seleccionados de los muchos disponibles de la literatura o aislado de novo de varias especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hirey colaboradores, (1992) Plant Mol . Biol . 20 (2) : 207-218 (gen de glutamina sintetasa específico de raíz de soya) ; Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) : 1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de French bean); Sanger y colaboradores, (1990) Plant Mol . Biol . 14 (3) : 433-443 (promotor específico de raíz del gen manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens; y Miao y colaboradores, (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (clon de cDNA de longitud completa que codifica glutamina sintetasa citosólica (GS) , que es expresa en raíces y nodulos de raíz de soya) . Ver también Bogusz y colaboradores, (1990) Plant Cell 2 (7) : 633-641, donde dos promotores específicos de raíz aislados de genes de hemoglobina de la no legumbre fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no legumbre no fijadora de nitrógeno relacionada Trema tomentosa son descritos. Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen reportador de ß-glucoronidasa y se introdujeron tanto en
la no legumbre Nicotiana tabacum y la legumbre Lotus cornicula tus, y en ambos casos se preservó la actividad de promotor específico de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describe en su análisis de los promotores de los genes de inducción de ' raíz rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79:69-76). Ellos concluyeron que los determinantes de DNA preferidos de tejido y de aumentadores de son disociados en estos promotores. Teeri y colaboradores, (1989) utilizó la fusión del gen lacZ para mostrar que el gen de T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de punta de raíz y que el gen TR2' es específico de raíz en la planta intacta y estimulado por la lesión y el tejido de la hoja, una combinación _ especialmente deseable de características para el uso con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8 (2) : 343-350) . El gen TRl7, fusionada a nptll (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores preferidos de raíz adicionales incluye el promotor de gen VfENOD-GRP3 (Kuster y colaboradores, (1995) Plant Mol . Biol , (1995). 29(4) :759- 772); y el promotor rolB (Capana y colaboradores, (1994) Plant Mol . Biol . 25 (4) : 681-691. Ver también las Patentes Norteamericanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; y 5,023,179. Los promotores "preferidos de semilla" incluyen
ambos de los promotores "específicos de semilla" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como promotores de "proteínas de almacenamiento de semillas" así como los promotores de "germinación de semillas" (aquellos promotores activos durante la germinación de las semillas). Ver Thompson y colaboradores, (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente por referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a, Ciml (mensaje inducido por citoquinina); cC19Bl (zeína de 19 kDa de maíz); y milps (mio-inositol 1-fosfato sintasa); (ver WO 00/11177 y la Patente Norteamericana No. 6,225,529, incorporadas en la presente por referencia). Gamma-zeína es un promotor específico de endosperma. Globulina 1 (Glb-1) es un promotor específico de embrión preferido. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, ß-faseolina de guisante, napina, ß-conglicinina, lectina de soya, cruciferina y los similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, zeína del 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver también WO 00/12733, donde los promotores preferidos de semilla de los genes endl y end2 son divulgados; incorporado en la presente por referencia. El cásete de expresión también puede comprender un
gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables son utilizados para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibiótico, tales como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT) , asi como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores seleccionables adicionales incluyen marcadores tales como ß-galactosidasa y proteínas fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su y colaboradores, (2004) Biotechnol . Bioeng 85:610-9 y Fetter y colaboradores, (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescente de ciano (CYP) (Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato y colaboradores, (2002) Plant Physiol . 129:913-42), y proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen; ver, Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores seleccionables adicionales, ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin . Biotech . 3:506-511;
Christopherson y colaboradores, (1992) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 89:6314-6318; Yao y colaboradores, (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol . Microbiol . 6:2419-2422; Barkley y colaboradores, (1980) in The Operon, páginas 177-220; Hu y
colaboradores, (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores,
(1987) Cell 49:603-612; Figge y colaboradores, (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores, (1989) Proc . Na ti . Acad. Aci EUA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores, (1989) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 86:2549-2553; Deuschle y colaboradores, (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores, (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 90:1917-1921; Labow y colaboradores, - (1990) Mol . Cell . Biol . 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores, (1992) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 89:3952-3956; Baim y colaboradores, (1991) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 88:5072-5076; Wyborski y colaboradores, (1991) Nucleic Acids Res . 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol . Struc . Biol . 10:143-162; Degenkolb y colaboradores, (1991) Antímicrob . Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt y colaboradores, (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen y colaboradores, (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 89:5547-5551; Oliva y colaboradores, (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores, (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Volumen 78 (Springer-Verlag, Berlín) ; Gilí y colaboradores,
(1988) Na ture 334:721-724. Tales descripciones son incorporadas en la presente por referencia. La lista anterior de genes marcadores
seleccionables no se propone para ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable puede ser utilizado en la presente invención. Los métodos de la invención involucran la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducción" se propone para dar a entender la presentación de la planta del polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia gana acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, solamente que el polinucleótido o polipéptido gana acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estables, métodos de transformación transientes y métodos mediados por virus. "Transformación estable" se propone para dar a entender que la construcción de nucleótidos introducida en la planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma. "Transformación transiente" se propone para dar a entender que un polinucleótido se introduce en una planta y no integra en el genoma de la planta o un polipéptido es introducido en una planta . Los protocolos de transformación así como
protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o de polinucleótido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para introducir polipéptidos y polinucleótidos en células de plantas y la inserción subsecuente en el genoma de la planta incluye la microinyección (Crossway y colaboradores (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores (1986) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 83:5602-5606) , transformación mediada por Agrobacterium (patentes norteamericanas Nos. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia de gen directa (Paszkowski y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2717-2722) , y aceleración de partícula balística (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; 5,932,782; Tomes y colaboradores (1995)
"Direct ' DNA Transfer into Intact Plant Cells via
Microprojectile Bombardment", in Plant Cell , Tissue, and
Organ Culture : Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips
(Springer-Verlag, Berlin) ; y McCabe y colaboradores (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación Lecl (WO 00/28058) . También ver Weissinger y colaboradores (1988) Ann. Rev. Genet . 22:421-477; Sanford y colaboradores (1987) Particula te Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores (1988) Plant Physiol . 87:671-674 (soya); McCabe y colaboradores (1988) Bio/Technology 6:923-
926 (soya) ; Finer and McMullen (1991) Jn Vi tro Cell Dev. Biol . 27P:175-182 (soya); Singh y colaboradores (1998) Theor. Appl . Genet . 96:319-324 (soya); Datta y colaboradores (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes norteamericanas Nos. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores (1988) Plant Physiol . 91:440-444 (maíz) ; Fromm y colaboradores (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores (1984) Na ture (London) 311:763-764; patente norteamericana No. 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet y colaboradores (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler y colaboradores (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 y Kaeppler y colaboradores (1992) Theor. Appl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por Whisker) ; D'Halluin y colaboradores (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li y colaboradores (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 y Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por la vía de Agrobacterium tumefaciens) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia.
En modalidades específicas, las secuencias de lipasa insecticidas útiles en la invención, tales como acil hidrolasas de lípido, se pueden proporcionar a una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transiente. Tales métodos de transformación transiente incluyen, pero no están limitados a, la introducción de proteínas de lipasa insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, o variantes y fragmentos de las mismas directamente en la planta o la introducción de un transcripto que codifica lipasa insecticida en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Crossway y colaboradores,
(1986) Mol . Gen . Genet . 202:179-185; Nomura y colaboradores,
(1986) Plant Sci . 44:53-58; Hepler y colaboradores, (1994) Proc. Nati . Acad. Sci . 91:2176-2180 y Hush y colaboradores,
(1994) J. Cell Sci . 107:775-784, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Alternativamente, un polinucleótido que codifica lipasa insecticida puede ser transformado transientemente en la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen el sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido en una manera que evita la liberación subsecuente del DNA. Así, la transcripción del DNA enlazado- a partícula puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual es liberado va a llegar a ser encargado en el genoma es grandemente reducida. Tales métodos
incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEÍ; Sigma # P3143) . En otras modalidades, el polinucleótido de la invención puede ser introducido en plantas al poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos involucran incorporar una construcción de nucleótidos de la invención dentro de -una molécula de DNA o RNA viral. Se reconoce que una lipasa insecticida útil en la invención, tal como un acil hidrolasa de lípido, puede ser inicialmente sintetizada como parte de una poliproteína viral, esta última puede ser procesada mediante proteólisis in vivo o in vi tro pa-ra producir la proteína recombinante deseada. Además, se reconoce que los promotores de la invención también comprenden promotores utilizados para la transcripción mediante polimerasas de RNA virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y la expresión de una proteína codifica en las mismas, que involucra moléculas de DNA o RNA virales, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, y Porta y colaboradores, (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; incorporadas en la presente por referencia. Se conocen métodos en la técnica para la inserción dirijida de un polinucleótido a una ubicación específica en
el genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra utilizando un sistema de recombinación especifica del sitio. Ver, por ejemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 y WO 99/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede ser contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos . El cásete de transferencia se introduce a una planta que tiene establemente incorporado en su genoma un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos que corresponden a los sitios de cásete de transferencia. Una recombinasa apropiada se proporciona y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleótido de interés es de esta manera integrado en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas, ya sea polinizadas con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y la progenie resultante que tiene expresión de la característica fenotípica deseada, identificada. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas
para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada sea establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada que se ha logrado. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también referida como "semilla transgénica") que tiene un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma. La invención divulgada en la presente se relaciona a composiciones y métodos para inducir la resistencia en una planta a pestes de plantas, especialmente pestes de insectos. Por consiguiente, las composiciones y métodos son útiles en la protección de plantas contra infestación y enfermedad asociada. Las pestes de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleóptera y Lepidoptera. Las pestes de insectos de relevancia particular incluyen aquellas que infestan los cultivos mayores. Por ejemplo: Maíz : Ostrinia nubilalis , barrenador de maíz Europeo; Agrotis Ípsilon , gusano cortador negro; Helicoverpa zea , gusano de masorca de maíz; Spodoptera frugiperda , gusano
devastador de otoño; Dia traea grandiosella , barrenador de maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus , barrenador del tallo de maíz menor; Diatraea saccharalis , barrenador de caña de azúcar; Diabrotica virgifera , gusano de raíz de maíz del oeste; Diabrotica longicornis barberi , gusano de raiz de maíz del norte; Diabrotica undecimpuncta ta howardi , gusano de raíz de maíz del sur; Melanotus spp., ciempiés; Cyclocephala borealis , abejorro enmascarado del norte (larva blanca); Cyclocephala immaculata , abejorro enmascarado del sur (larva blanca) ; Popillia japónica , escarabajo Japonés; Chaetocnema pulicaria , escarabajuelo de maíz; Splzenoplzorus maidis', bicho picudo de maíz; Rhopalosiphum maidis , áfido de hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis , áfido de raíz de maíz; Blissus leucopterus leucopterus , bicho chinche; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura , gusano de maíz; Agromyza parvicornis , minador manchado de maíz; Anaphothrips obscrurus , trips de hierba; Solenopsis milesta , hormiga hurtadora; Tetranychus urticae, acaro rojo de dos manchas; Sorgo: Chilo partellus , barrenador de sorgo; Spodoptera frugiperda , gusano devastador de otoño; Helicoverpa zea , gusano de mazorca de maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador de tallo de maiz menor; Fel tia subterránea , gusano cortador granulado; Phyllophaga crini ta , larva blanca; Eleodes , Conoderus y Aeolus spp., ciempiés; Oulema melanopus,
escarabajo de hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria , escarabajuelo. de maíz; Sphenophorus maidis , bicho picudo de maíz; Rhopalosiphum maidis; áfido de hoja de maíz; Sipha flava , áfido de caña de azúcar amarillo; Blissus leucopterus leucopterus , bicho chinche; Contarinia sorghicola , jején de sorgo; Tetranychus cinnabarinus , acaro rojo carmín; Tetranychus urticae, acaro rojo de dos manchas; Trigo : Pseudaletia unipuncta ta , gusano desvastador; Spodoptera frugiperda , gusano devastador de otoño; Elasmopalpus lignosellus , barrenador de tallo de maíz menor; Agrotis orthogonia , gusano cortador del oeste; Elasmopalpus lignosellus , barrenador de tallo de maíz menor; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Hypera punctata , gorgojo de hoja de trébol; Diabrotica undecimpuctata howardi , gusano de raíz de maíz del sur; áfido de trigo Ruso; Schizaphis graminum, bicho verde; Macrosiphum avenae, áfido de grano Inglés; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Melanoplus sanguinipes , langosta migratoria; Mayetiola destructor, Mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana , jején de trigo; Meromyza americana , gusano de tallo de trigo; Hylemya coarcta ta , mosca de bulbo de trigo; Frankliella fusca , trips de tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra de tallo de trigo; Acería tulipae, acaro ondeado de trigo; Girasol : Suleima helianthana , polilla de brote de girasol; Homoeosoma
electellum, polilla de girasol; zygogramma exclama tíonis, escarabajo de girasol; Bothyrus gibbosus , escarabajo de zanahoria; Neolasioptera murtfeldtíana , jején de semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens , gusano de algodón; Helicovelpa zea , gorgojo de algodón; Spodoptera exigua , gusano devastador de betabel; Pectinophora gossypiella , gorgojo rosa; Anthonomus granáis , gorgojo de algodón; Aphis gossypii , áfido de algodón; Pseuda tomoscelis seriatus , langosta pequeña de algodón; Trialeurodes abutilonea , mosca blanca con franjas; Lygus lineolaris , bicho de planta descolorido; Melalloplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus diflerentialís, langosta diferencial; Thrips tahací , trips de cebolla; Franklinkiella filsca , trips de tabaco; Tetranychus cinnabarinus , acaro rojo carmín; Tetranychus urticae, acaro rojo de dos manchas; Arroz: Dia traea saccharalis, barrenador de caña de azúcar; Spo?optera frugiperda , gusano devastador de otoño; Helicoverpa zea , gusano de mazorca de maíz; Colaseis brunnea , colaspis de uva; Lissorhoptrus oryzophilus , gorgojo de agua de arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo de arroz; Nephotettix nigropictus , saltamontes de arroz; Blissus leucopterus leucopterus , bicho chinche; Acrosternum hilare, bicho verde; Soya: Pseudoplusia includens , oruga medidora de soya; Anticarsia gemma talís , oruga de heno; Pla thypena scabra , gusano de trébol verde; Ostrinia nubilalis , barrnador de maíz
Europeo; Agrotis Ípsilon , gusano cortador negro; Spodoptera exigua , gusano devastador de betabel; Heliothis virescens, gorgojo de algodón; Helicoverpa zea , gorgojo de algodón; Epilachna varivestis , escarabajo de frijol Mexicano; Myzus persicae, áfido de durazno verde; Empoasca fabae, saltamontes de papa; Acrosternum . hilare, chinche del bosque verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes de diferencial; Hylemya pla tura , larva de semilla de maiz; Sericothrips variabilis , trips de soya; Thrips tabad, trips de cebolla; Tetranychus turkestani , acaro rojo de fresa; Tetranychus urticae, acaro rojo de dos manchas; Cebada : Ostrinia nubilalis , barrenador de maíz Europeo; Agrotis Ípsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, chinche verde; bicho chinche, por ejemplo, Blissus leucopterus leucopterus ; Acrosternum hilare, chinche del bosque verde; Euschistus servus, chinche café; Jylemya pla tura , larva de semilla de maíz; Mayetiola destructor, Mosca de Hese; Petrobia latens , acaro de trigo café; Colza de Aceite: Brevicoryne brassicae, áfido de col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo crucifero; Mamestra configura ta , gusano desvastador Berta; Plutella xylostella, polilla de espalda de diamante; Delia ssp. Maggots de raíz. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye células de plantas, protoplastos de plantas, cultivos
de tejido de célula de planta de las cuales las plantas pueden ser regeneradas, callos de plantas, agrupaciones de plantas y células de plantas que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, mazorcas, elotes, farfollas, tallos, raices, puntos de raiz, anteras y los similares. El grano se propone para dar a entender la semilla madura producida por agricultores comerciales para propósitos diferentes al cultivo o reproducción de la especie. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también son incluidas dentro del alcance de ' la invención, siempre y cuando estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican lipasas • insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, pueden ser manipuladas y utilizadas para expresar las proteínas en una variedad de hospederos incluyendo, pero no limitados a, microorganismos y plantas. Además, la presente invención se puede utilizar para transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maíz { Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B . napus, B . rapa , B . j úncea ) , particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa {Medicago sativa ) , arroz
{Oryza sativa), centeno {Sécale cereale,) sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado {Pennisetum glaucum) , mijo proso {Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra {Setaria itálica) , mijo extendido {Eleusine coracana) ) , girasol {Helianthus annuus) , cártamo {Carthamus tinctorius) , trigo {Triticum aestivum) , soya {Glycine max), tabaco {Nicotiana tabacum) , papa {Solanum tuberosum) , cacahuates {Arachis hipogaea) , algodón {Gossypium barbadense, Gossypíum hirsutum) , camote {Ipo oea batatus) , casava {Manihot esculenta) , caté {Coffea spp.), coco {Cocos nucífera), pina {Ananas comosus) , árboles cítricos {Citrus spp.), cacao (Theobroma cacaco) , te {Camellia sinensis) , plátano {Musa spp.), aguacate {Persea americana), higo {Ficus casica) , guayaba {Psidium guajava) , mango {Mangifera indica) , olivo {Olea europaea) , papaya {Carica papaya), anacardo
{Anacardium occidentale) , macadamia {Macadamia integri folia) , almendra {Prunus amyg?alus) , betabeles {Beta vulgaris) , caña de azúcar {Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), habichuelas verdes {Phaseolus vulgaris) , habas {Phaseolus limensis) , guisantes {Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón (C. meló).. Las plantas ornamentales
incluyen azalea {Rhododendron spp.), hidrángea {Macrophylia hydrangea ) , hibisco { Hibiscus rosasanensis) , rosas {Rosa spp.), tulipanes { Tulipa spp.), narcisos {Narcissus spp.), petunias { Petunia hybrida ) , clavel {Dianthus caryophyllus) , pastora roja {Euphorbia pulcherrima ) , y crisantemo. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino del incienso { Pinus taeda) , pino de tala { Pinus elliotii ) , pino ponderosa { Pinus ponderosa) , pino lodgepole { Pinus contorta ) , y pino Monterrey { Pinus radiata ) ; abeto de Douglas { Pseudotsuga menziesil ) ; pinabete del occidente { Tsuga canadensis) ; abeto Sitka { Picea glauca ) ; madera roja { Sequoia sempervirens) ; abetos típicos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies balsamea ) ; y cedros tales como cedro rojo del occidente
{ Thuja plica ta ) y cedro amarillo de Alaska { Chamaecyparis nootkatensis) . En modalidades específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica , soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras modalidades, las plantas de maíz y soya son óptimas, y en todavía otras modalidades las plantas de maíz son óptimas. Plantas de interés particular incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de
interés incluyen semillas de grano, tales como maiz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semilla de aceite incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. "Planta no oleaginosa" se propone para dar a entender cualquier planta excepto una seleccionada del grupo que consiste de semilla de colza, girasol, soya, árbol de olivo y col. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y guisantes. Los frijoles incluyen guar, algarroba, fenegreco, soya, frijoles de jardín, caupí, mungo, haba, fava bean, lentejas, garbanzo, efe. En ciertas modalidades, los polinucleótidos comprendidos por la presente invención pueden ser apilados con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés con el fin 'de crear plantas con un atributo deseado. Un atributo, como se utiliza en la presente, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia de nucleótidos expresada particular o grupos de secuencias. En ciertas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés con el fin de crear plantas con un atributo deseado. Un atributo, como se utiliza en la presente, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser apilados con cualquiera de otros polinucleótidos que
codifican polipéptidos que tienen actividad pesticida y/o insecticida, tales como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas en las Patente Norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; y Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Dam e y colaboradores, (1994) Plant Mol . Biol . 24:825, pentinas (descritas en la Patente Norteamericana No. 5,981,722) y los similares. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser apilados con cualquier otro gen o combinaciones de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de atributos deseados incluyendo, pero no limitados a, atributos deseables para el alimento de animales tales como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes Norteamericanas Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,409); cebada de alto contenido de lisina (Williamson y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem . 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas de alto contenido de metionina ((Pedersen y colaboradores, (1986) J Biol . Chem . 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71:359; y Musumura y colaboradores, (1989) Plant Mol . Biol . 12:123));
digeribilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (Solicitud Norteamericana No. De Serie 10/053,410, presentada el 7 Noviembre del 2001); y tiorredoxinas (Solicitud Norteamericana No. de Serie 10/005,429, presenta el 3 de Diciembre del 2001)); las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser apilados con atributos deseables para la resistencia a enfermedad o herbicida (por ejemplo, genes de destoxificación de fumonisina (Patente Norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia y enfermedad (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a la resistencia herbicida tal como las mutaciones S4 y/o Hra; genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar); genes que codifican para la resistencia a glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS' y el gen GAT; ver, por ejemplo, la Publicación Norteamericana No. 20040082770 y WO 03/092360) ) ; y atributos deseables para el procesamiento o productos de proceso tales como de alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 6,232,529); aceites
modificados (por ejemplo, genes de desaturasa de ácido graso
(Patente Norteamericana No. 5,952,544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas
(AGPasa) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) y enzimas de ramificación de almidón
(SDBE) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente
Norteamericana No. 5,602,321; beta-cetotiolasa sintasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa
( (Schubert y colaboradores, (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilita la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)); lasa descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que proporcionan atributos agronómicos tales como esterilidad masculina (por ejemplo, ver Patente Norteamericana No. 5,583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento o atributos de tecnología de transformación tal como la regulación del ciclo celular o las dirección del gen (por ejemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 y WO 99/25821); las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas mediante cualquier método incluyendo, pero no limitados a, a la reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross, o transformación
genética. Si las secuencias se apilan al transforma genéticamente las plantas, las secuencias de polinucleótidos de interés pueden ser combinadas en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más atributos deseados puede ser utilizada como el objetivo para introducir atributos adicionales mediante la transformación subsecuente. Los atributos pueden ser introducidos simultáneamente en un protocolo de co-transformación con los polínucleótidos de interés proporcionados mediante cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si dos secuencias serán introducidas, las dos secuencias pueden ser contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidas en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias puede ser inducida por el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto puede ser combinado con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de atributos en la planta. Además se reconoce que las secuencias de polinucleótido pueden ,ser apiladas en una ubicación genómica deseada utilizando un sistema de recombinación específico del sitio. Ver, por ejemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 y
WO 99/25853, todas las cuales son incorporados en la presente por referencia. Las composiciones y métodos de la invención se pueden utilizar para proteger cultivos de la agricultura y productos de pestes mediante la introducción de secuencias que codifican lipasa insecticida, tales como aquellas "que codifican" acil hidrolasas de lípido, por la vía de un vector adecuado en un hospedero microbiano, y luego al aplicar al hospedero al medio ambiente o a las plantas. Mientras que la invención no depende de un mecanismo biológico particular para incrementar la resistencia de una planta a un insecto, un organismo transformado puede comprender células de plantas y de insectos, bacterias, levadura, virus, tales como baculovirus, protozoarios', nematodos y algas, que comprenden una molécula de DNA de la invención, un cásete de expresión que comprende la molécula de DNA, o una molécula de vector que comprende el cásete de expresión, de manera óptima establemente incorporado en el genoma del organismo transf rmado. Se pueden seleccionar hospederos de microorganismo que son conocidos que ocupan la "fotosfera"
(filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan para ser capaces de competir exitosamente en el medio ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, proporcionar mantenimiento estable y la expresión
del gen que expresa la lipasa insecticida, y, deseablemente, proporcionar protección mejorada de la lipasa insecticida de la degradación e inactivación ambiental. Microorganismos de interés incluyen bacterias, algas y hongos . De particular interés son los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseuáomonas , Erwinia , Serratia , Klebsiella , Xanthomonas , Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas , Methylius , Agrobacterium , Acetobacter, Lactobacillus , Arthrobacter , Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes, hongos, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces , Cryptococcus , Kluyveromyces , Sporobolomyces , Rhodotorula y Aureobasidi um . De particular interés son tales especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacterxylinum, Agrobacteria , Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris , Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir y especies de levadura de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra , R. glutinis , R . marina , R. aurantiaca , Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurefatii , Saccharofnyces rosei , S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolofnyces rosues, S odous, Kluyveromyces verona y Aureobasidium pollulans . De particular interés son los microorganismos pigmentados. Un número de maneras están disponibles para
introducir un gen que expresa una lipasa insecticida, tal como una acil hidrolasa de lípido, en el hospedero de microorganismo bajo condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión de estas secuencias de codificación nucleótidos. Por ejemplo, los casetes de expresión pueden ser construidos de modo que incluyen las construcciones de nucleótido de interés operablemente enlazadas con las señales reguladoras de transcripción y de traducción para la expresión de las construcciones de nucleótido, y una secuencia de nucleótidos homologa con una secuencia en el organismo hospedero, mediante lo cual ocurrirá la integración, y/o un sistema de replicación que es funcional en el hospedero, mediante lo cual ocurrirá la integración o el mantenimiento estable. Las señales reguladoras de transcripción y traducción incluyen, pero no están' limitadas a, promotores, sitios de partida de iniciación de transcripción, operadores, activadores, aumentadores, otros elementos reguladores, sitios de enlace ribosomales, un codón de iniciación, señales de terminación y los similares. Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,039,523 y 4,853,331; EPO 0480762A2; Sambrook y colaboradores, (2000) ; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3- edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) ; Davis y colaboradores, (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY; y las referencias citadas en las mismas. Las células hospederas adecuadas pueden incluir ya sea procariotas o eucariotas, donde las células que contienen lipasa pesticida serán tratadas para prolongar la actividad de la enzima, usualmente la célula tratada es aplicada al ambiente de la(s) peste (s) objetivo, donde las células no producen sustancias tóxicas a organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias tóxicas a organismos superiores podrían ser utilizados, donde la toxina es inestable o nivel de aplicación suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un hospedero mamífero. Hospederos, de particular interés estarán las procariotas y las eucariotas inferiores, tales como hongos. Las procariotas ilustrativas, tanto gram-negativas como gram-positivas, incluyen Enterobacter íaceae, tales como Escherichia ,
Erwifaia , Shigella , Salmonella y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tal como fotobacteria, Zymomonas , Serra tia , Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spírillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacter aceae y Nitrobacteraceae . Entre las eucariotas están hongos tales como Phycomycetes y Ascomycetes , que incluye levadura, tales como Schizosaccharomyces; y levadura de Basidiomycetes, tales como Ythodotorula , Aureobasidium, Sporobolomyces y los
similares . Características de interés particular ' en la selección de una célula hospedera para propósitos de la producción incluyen la facilidad de introducción de la secuencia que codifica la lipasa insecticida, tal como una secuencia que codifica acil hidrolasa de lípido, en el hospedero, disponibilidad de los sistemas de expresión, eficiencia de expresión, estabilidad de la proteína en el hospedero, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Características de interés para el uso como una microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como las paredes de la célula gruesa, pigmentación y empaque o formación intracelular de cuerpos de inclusión; afinidad a la hoja; falta de toxicidad al mamífero, atracción a las pestes para la ingestión; facilidad de exterminación y fijación sin daño a la toxina; y los similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad en el almacenamiento, y los similares. Los organismos hospederos de interés particular incluyen levadura, tales como Rhodotorula spp. , Aureobasidium spp. , Saccharomyces spp . , y Sporoboloinyces spp. , organismos filoplanos tales como Pseudomonas spp . , Erwinia spp. , y Flavojbacte ium spp . , y otros de tales organismos, incluyendo, Pseu?omonas aeruginosa , Pseu?omonas fluoescens, Saccharomyces
cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli , Bacillus subtilis y los similares. Las secuencias que codifican las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de ' lipido, comprendidas por la invención puede ser introducidas en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitas) para suministrar lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, a pestes objetivo potenciales. Las epifitas, por ejemplo, puede ser bacterias gram-positivas o gram-negativas . Las bacterias que colonizan la raíz, por ejemplo, pueden ser aisladas de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que colonizan las raíces pueden ser aisladas de raíces de una planta (ver, por ejemplo, Handelsman y colaboradores (1991) Appl . Environ . Microbiol . 56: 713-718). Las secuencias que codifican lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, comprendidas por la invención, podrían ser introducidas en un Bacillus cereus que coloniza la raíz mediante métodos estándares conocidos en la técnica. Las secuencias que codifican lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, pueden ser introducidas, por ejemplo, en el Ba cill us que coloniza la raíz por medio de la electro-transformación. Específicamente, las secuencias que codifican las lipasas insecticidas, tales como las acil hidrolasas de lípido, pueden ser clonadas en un
vector de lanzadera, por ejemplo, pHT3101 y el vector de lanzadera puede ser transformado en el Bacillus que coloniza la raíz por medio de electroporación- (Lerecius y colaboradores, (1989) FEMS Microbiol . Letts . 60:211-218). Sistemas de expresión pueden ser diseñados de modo que las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, son secretadas fuera del citoplasma de las bacterias gram-negativas, E . coli, por ejemplo. Las ventajas de tener lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, secretadas son: (1) evitación de efectos citotóxicos potenciales de la proteína pesticida expresada y (2) mejora en la eficiencia de la purificación de la proteina que es expresada, incluyendo, pero no limitadas a, eficiencia incrementada en la recuperación y purificación de la proteína por volumen de caldo celular y tiempo disminuido y/o costos de recuperación y purificación por proteína unitaria. Las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, se pueden hacer para ser secretadas en E. coli , por ejemplo, al fusionar un péptido de señal de E. coli apropiado al extremo amino-terminal de la lipasas insecticida. El péptido de señal reconocido por E. coli se puede encontrar en proteínas ya conocidas que son secretadas en E. coli , por ejemplo la proteína OmpA (Ghrayeb y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2437-2442) . OmpA es una proteína mayor de la membrana externa de E. coli , y así su
péptido de señal se piensa que es eficiente en el proceso de translocación. También, el péptido de señal OmpA no necesita ser modificada antes del procesamiento como podría ser el caso para otros péptidos de señal, por ejemplo, el péptido de señal de lipoproteína (Duffaud y colaboradores (1987) Meth . Enzymol . 153:492) . Las lipasas insecticidas comprendidas por la invención, tales como acil hidrolasas de lípido, pueden ser fermentadas en un hospedero bacteriano y las bacterias resultantes procesadas y utilizadas como un roció microbiano de la misma manera que las cepas de Bacillus thuringiensis se han usado como roclos insecticidas. En el caso de lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, que puede ser secretada de Bacillus, la señal de secreción se remueve o se muta utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Tales mutaciones y/o supresiones previenen la secreción de las lipasas insecticidas en el medio del crecimiento durante el proceso de fermentación. Las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, son retenidas dentro de las células, y las células luego son procesadas para producir las lipasas insecticidas encapsuladas, tales como acil hidrolasas de lípido. Cualquier microorganismo adecuado puede ser utilizado para este propósito. Las pseudomonas se han utilizado para expresar endotoxinas de Bacillus thuringiensis como proteínas encapsuladas y las células resultantes
procesadas y rociadas como un insecticida. Gaertner y colaboradores (1993), in Advanced Engineered Pesticides, ed. L. Kim (Marcel Decker, Inc. ) . Alternativamente, las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, se producen al introducir genes heterólogos en un hospedero celular. La expresión de los genes heterólogos resulta, directamente o indirectamente en la producción intracelular y de mantenimiento del pesticida. Estas células luego se tratan bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de la(s) peste (s) objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de 1 atoxina. Estas lipasas insecticidas naturalmente encapsuladas, tales como acil hidrolasas de lípido, luego pueden ser formuladas de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación al ambiente que alberga una peste objetivo, por ejemplo, tierra, agua, y el follaje de las plantas. Ver, por ejemplo, EPA 0192319 y las referencias citadas en la misma. Cuando las lipasas insecticidas se expresan en un organismo hospedero, cualquier porción del organismo puede ser utilizado para preparar una composición insecticida. Así, las formulaciones pueden incluir: un microorganismo transformado, ya sea organismos completos, tejidos, células, espora (s); componente (s) insecticida (s) , componente (s) que
impacta la peste mutante (s) ; células vivas o muertas y componentes celulares, incluyendo mezclas de células vivas y muertas, y componentes celulares, incluyendo células rotas y componente celulares, o una enzima aislada. Además, los componentes adicionales se pueden adicionar a las composiciones insecticidas tales como portadores que puedan formar, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un granulo dispersable, un polvo humectable y un concentrado emulsificable, un aerosol, un granulo impregnado, un adyuvante, una pasta recubrible y también encapsulaciones en, por ejemplo, sustancias poliméricas. Tales composiciones divulgadas en lo anterior pueden ser obtenidas mediante la adición de un agente activo en la superficie, un portador inerte, un conservador, un humectante, un estimulante de alimentación, un atrayente, un agente encapsulante, un aglutinante, un emulsificante, un tinte, un protector de UV, una solución reguladora, un agente de flujo o fertilizantes, donadores de micronutrientes, u otras preparaciones que influencian el crecimiento de la planta. Uno o más agroquímicos incluyendo, pero no limitados a, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaricidas, reguladores de crecimiento de plantas, auxiliares de cosecha, y fertilizantes, puede combinados con portadores, surfactantes
o adyuvantes usualmente empleados en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar el manejo del producto y la aplicación para las pestes objetivo particulares. Los portadores adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleados en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, pegaj osificantes, aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en • la forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo o planta a ser tratada, de manera simultánea o en sucesión, con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene por lo menos una de las lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de - lípido, producidas por las cepas bacterianas comprendidas por la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, aplicación foliar, recubrimiento de semilla y aplicación a la tierra. El número de aplicaciones y la proporción de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la peste correspondiente. Los agentes activos en la superficie adecuados incluyen, pero no están limitados a, compuestos aniónicos
tales como carboxilato de, por ejemplo un metal; carb?xilato de un ácido graso de cadena larga.; un N-acilsarcosinato; mono- o di-ésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o sales de tales esteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfato de alcohol graso etoxilado; sulfatos de alquil fenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquil arilo tales como sulfonatos de alquil benceno o sulfonatos de alquil naftaleno inferior, por ejemplo, sulfonato de butil-naftaleno; sales de condensados de naftaleno-formaldehído sulfonados; sales de condensados de fenol-formaldehído sulfonado; sulfonatos más complejos, tales como sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensación sulfonada de ácido oleico y N-metil taurina; o los sulfosuccinatos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato de sodio o succinato de dioctilo. Los agentes no iónicos incluyen productos de condensación de esteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles sustituidos con alquil graso o alquenilo con óxido de etileno, esteres grasos de esteres de acohol polihidrico, por ejemplo, esteres de ácido graso de sorbitán, productos de condensación de tales esteres con óxido de etileno, por ejemplo, esteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales
como 2, 4 , 7, 9-tetraetil-5-decin-4 , 7-diol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Ejemplos de un agente activo en la superficie catiónica incluyen, por ejemplo, una mono-, di- o poliamina alifática tal como un acetato, maftenato u oleato; o -amina que contiene oxígeno tal como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina; una amina enlazada a amida preparada mediante la condensación de un ácido carboxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternaria. Ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no están limitados a, minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botánicos tales como corcho, mazorcas de maiz en polvo, vainas de cacahuate, vainas de arroz y cascaras de nuez. Las composiciones pesticidas -que comprenden la lipasa y/o proteínas insecticidas de Bt pueden estar en una forma adecuada para la aplicación directa o como un concentrado de composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración de pesticida variará dependiendo de la naturaleza de . la formulación particular, específicamente, si es un concentrado o es utilizada directamente. La composición contiene de 1 a 98% de un portador inerte sólido líquido y 0 a 50%, óptimamente 0.1 a 50% de un surfactante. Estas composiciones serán administradas en la proporción etiquetada para el producto
comercial, óptimamente aproximadamente 0.01 Ib. - 5.0 Ib. por acre cuando está en forma seca y en aproximadamente 0.01 pts. - 10 pts. por acre cuando está en forma líquida. En una modalidad adicional, las composiciones, asi como los microorganismos transformados que comprenden lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lipido, de la invención, se pueden tratar antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se aplica al medio ambiente de una peste objetivo mientras que el pretratamiento no sea perjudicial a la actividad. Tal tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos mientras que el tratamiento no afecte perjudicialmente las propiedades de la(s) composición (es) . Ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no están limitados a, agentes de halogenación; aldehidos tales como formaldehído y glutaraldehído; antiinfecciosos, tal como cloruro de zefirán; alcoholes, tal como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tal como fijador de Bouin y el fijador de Helly (ver por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.)). Las composiciones, así como los microorganismos transformados que comprenden lipasas insecticidas, tales como acil hidrolasas de lípido, se pueden aplicar al medio ambiente de una peste de insectos, mediante, por ejemplo, rociado, atomización, espolvoreamiento, dispersión, recubrimiento, vaciado, la introducción dentro o sobre la
tierra, la introducción en el agua de irrigación, mediante el tratamiento de semilla o la aplicación general o espolvoreamiento en el tiempo cuando la peste ha comenzado a aparecer o antes de la aparición de las pestes como una medida protectora. Generalmente es importante obtener buen control de las pestes en las etapas tempranas del crecimiento de la planta, ya que este es el tiempo, cuando la planta puede ser más severamente dañada. Las composiciones de la invención convenientemente pueden contener otros insecticidas si esto se cree necesario. En una modalidad de la invención, la composición se aplica directamente a la tierra, en un tiempo de plantación, en forma granular de una composición de un portador y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de la invención. Otra modalidad es una forma granular de una composición que comprende un agroquímico tal como, por ejemplo, un herbicida, insecticida, o fertilizante en un portador inerte, y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de la invención. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. EXPERIMENTAL Ejemplo 1 : Efecto de Hidrolasas de Lípido sobre Larvas de Diabrotlca Las dietas de insecto para larvas de gusanos de
raíz de maíz del sur y gusano de raíz de maíz del oeste son conocidas en la técnica, Ver, por ejemplo, Rose y McCabe (1973 J. Econ . Entomology 66:393, incorporada en la presente por referencia. La dieta de insecto se preparó y se vació sobre una charola. 1.5 ml de dieta se suministró en cada celda con 50 µl adicionales de preparación de muestra que contiene la lipasa de interés aplicada a la superficie de dieta. Alternativamente, 120 µl de solución reguladora de PBS ajustada para la concentración de sulfato de amonio se aplicó a la dieta del grupo de control. Para la clasificación del gusano de raiz de maiz del oeste, 25 µl de una solución de agar de 0.8 huevecillo se aplicó a las tapas. Las charolas se dejaron secar bajo una campana. Después de secar, las capas se colocaron sobre charolas y se almacenaron durante 3-4 días a una temperatura de 26°C. Las charolas luego se registraron contando las larvas "vivas" contra "muertas" y tabulando los resultados. Los resultados se expresaron como un porcentaje de mortalidad. Cualquier resultado arriba de 75% se consideró un resultado positivo. Utilizando los métodos descritos en lo anterior, las lipasas no de plantas se probaron para la actividad insecticida contra el gusano de raíz del oeste. Los resultados de -la alimentación de lipasas no de planta a larvas de Diabrotica se muestra en la Figura 1. La
lipasa de Candida cylindracea (Figura 1) , de Rhizopus arrhizus (Tabla IA) , y de páncreas porcino (Tabla IB) todas fueron capaces de exterminar las larvas y atrofiar el crecimiento. La Figura 1 muestra los resultados de bioensayo de gusano de raiz de maíz del oeste (WCRW) de la alimentación de la lipasa de Candida cylindracea (como se expone en la SEQ ID NO: 2) a las larvas en desarrollo. La lipasa de dieta causa una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento larval como un porcentaje de los controles de tipo silvestre. TABLA 1
La Tabla 1 muestra los resultados de -bioensayo del
gusano de raíz de maíz del oeste (WCRW) (A) de lipasa Rhizopus arrhizus (como se expone en la SEQ ID NO: 6) y (B) lipasa pancreática porcina (como se expone en la SEQ ID NO: 4) a las larvas en desarrollo. Se muestran los registros de mortalidad con relación a los controles y los efectos observados en el crecimiento larval. Ambas lipasas causan un incremento dependiente de la dosis en la mortalidad larval y el atrofiamiento del crecimiento. Ejemplo 2 : Transformación y Regeneración de Plantas \ Transgénicas Embriones de maiz inmaduros de plantas donadoras de invernadero se bombardean con un plásmido que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 operablemente enlazado a un promotor de ubicuitin o bombardeado con un plásmido que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 operablemente enlazado a un promotor de ubicuitin. Un gen marcador seleccionable tal como PAT (Wohleben y colaboradores
(1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida
Bialafos, es utilizado. Alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona en un plásmido separado. La transformación se realiza como sigue: Las recetas de los medios se muestran enseguida. Preparación del tejido objetivo Las mazorcas se despinochan y se esterilizan en la superficie en blanqueador Clorox al 30% más Micro detergente
al 0.5% durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se coloca el eje del lado del embrión hacia abajo (el lado del escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa, en el medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm, en lá preparación del bombardeo. Se hace un vector de plásmido que comprende la secuencia de DNA como se expone en la SEQ ID NO:l o la secuencia de DNA como se expone en la SEQ ID NO: 5. Este DNA de plásmido más el DNA de plásmido que contiene un marcador seleccionable PAT se precipita en pelotillas de tungsteno de 1.1 µm (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación de CaCl2 como sigue: 100 µl de partículas de tugsteno preparadas en agua; 10 µl (1 µg) de DNA en solución reguladora de EDTA (1 µg de DNA total); 100 µl de CaCl2 2.5 M y 10 µl de espermidina 0.1 M Cada reactivo se adiciona secuencialmente a la suspensión de partículas de tugsteno, mientras que se mantiene en el aparato formador de vórtice de multitubo. La mezcla final de sónica brevemente y se deja incubar bajo formación de vórtice constante durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se remueve el líquido, se lavan con 500 ml de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente el líquido se remueve y 105 µl de etanol al 100%
se adiciona a la pelotilla de partícula de tungsteno final. Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tugsteno/DNA se sonican brevemente y 10 µl se manchan sobre el centro de cada macroportador y se dejan secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestra se bombardean en el nivel #4 en la pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/DNA. Después del bombardeo, los embriones se conservan en el medio a 560Y durante 2 días, luego se transfieren en el medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialafos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a la selección se transfieren en el medio a 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 semanas después, las plantitas en desarrollo se transfieren al medio libre de hormonas 272V por 7-10 días hasta que las plantitas son bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en tapones semilleros (equivalente a maceta 2.5") que contienen tierra para maceta
y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan en 1-2 semanas adicionales al invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan hasta la madurez. Las plantas se monitorean y se registran para la resistencia del insecto y/o actividad de lipasa. El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 ml/l de Mezcla de Vitamina Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l de HCl de tiamina, 120.0 g/1 de sacarosa, 1.0 mg/l de 2,4-D, y 2.88 g/1 de 'L-prolina (llevado a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 2.0 g/1 de Gelrite (adicionado después de llevar al volumen con H20 D-I) ; y 8.5 mg/l de nitrato de plata (adicionado después de esterilizar el medio a temperatura ambiente) . El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/l de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511) , 0.5 mg/l de HCl de tiamina, 30.0 g/1 de sacarosa, y 2.0 mg/l, de 2,4-D (llevado a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/1 de Gelrite (se adicionó después de llevar a volumen con H20 D-I); y 0.85 mg/l de nitrato de plata y 3.0 mg/l de bialafos (ambos adicionados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente. El medio de regeneración de planta (288J) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de solución
de extracto de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotínico,
0.02 g/1 de HCL tiamina, 0.10 g/1 de HCL de piridoxina y 0.40 g/1 de glicina llevado a volumen con H20 D-I purificada)
' (Murashige y Skoog (1962) Physiol Plant . 15:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0.5 mg/l de zeatina, 60 g/1 de sacarosa, y 1.0 ml/l of ácido abscísico 0.1 mM (llevado a volumen con H20 D-I purificado después de ajustar a pH 5.6); 3.0 g/1 de Gelrite
(adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I) ; y 1.0 mg/l de ácido indolacético y 3.0 mg/l de bialafos (adicionado después de esterilizar el medio enfriado a 60 °C) . El medio libre de hormonas (272V) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de solución de extracto de vitamina MS (0.100 g/1 de ácido nicotínico, 0.02 g/1 de HCL de tiamina, 0.10 g/1 de HCL de piridoxina y 0.40 g/1 de glicina llevado a volumen con H20 D-I purificado), 0.1 g/1 de mío-inositol, y 40.0 g/1 de sacarosa (llevado a volumen con H20 D-I purificado después de ajustar el pH a 5.6); y 6 g/1 de bacto- agar (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I purificado) esterilizado y enfriado a 60°C. Ejemplo 3: Transformación Mediada por Agrohacterivaa. Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con un cásete de expresión que comprende la secuencia como se expone en SEQ ID NO:l operablemente enlazada a un promotor de ubicuitin, se puede emplear el método de Zhao (patente norteamericana No. 5,981,840 y la
publicación de patente internacional No. WO 98/32326; los contenidos de las cuales son incorporados en la presente por referencia) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir el cásete de expresión de lipasa a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros generalmente se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: etapa de co-cultivo). Generalmente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido después de lá etapa de infección. Después de este período de co-cultivo se contempla una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en la presencia de por lo menos un antibiótico conocido para inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (etapa 3: etapa de reposo) . Generalmente, los embriones inmaduros se cultivo en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivan en el medio que 'contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado en
crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Generalmente, los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de células transformadas. Los callos luego se regeneran en las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y, generalmente, los callos cultivados en el medio selectivo se cultivan en el medio sólido para regenerar las plantas. Las plantas transformadas luego se cultivan y se seleccionan de acuerdo con los métodos en el Ejemplo 3. Ejemplo 4: Transformación del Embrión de Soya Embriones de soya se bombardean con un plásmido, que tiene el cásete de expresión que comprende la SEQ ID NO:l operablemente enlazado a un promotor de ubicuitin como sigue. Para inducir los embriones somáticos, cotiledones de 3-5 mm en longitud disectados de semillas inmaduras esterilizadas en la superficie de la variedad de cultivo de A2872, se cultivan en la luz y oscuridad a 26°C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios que luego se agitan y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para amontonamiento de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones de etapa globular temprana, las suspensiones se mantienen como es descrito enseguida. Los cultivos de suspensión embriogénica de soya pueden ser mantenidos en 35 ml de medio líquido en un
agitador rotatorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes en un programa de día/noche a 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido. Los cultivos de suspensión embriogénica de cultivo luego pueden ser transformados mediante el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein y colaboradores (1987) Nature (London) 327:70-73, patente norteamericana ?o, 4,945,0509. Un instrumento DuPont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) se pueden utilizar para transformaciones . Un gen marcador seleccionable que puede ser utilizado para facilitar la transformación de soya de un transgen compuesto del promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell y colaboradores (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli ; Gritz y colaboradores (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen nopalina cintaza del T-D?A del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . El cásete de expresión que comprende la SEQ ID ?0:1 operablemente enlazada al promotor de ubicuitin puede ser aislado como un fragmento de restricción. Este fragmento luego puede ser insertado en un sitio de restricción único del vector que lleva el gen marcador. A 50 µl de la suspensión de partículas de oro de 1
µm de 60' mg/ml se adiciona (en orden) : 5 µl de DNA (1 µg/µl) , 20 µl de esopermidina (0.1 M= y 50 µl de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partícula luego se agita durante tres minutos, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas de DNA luego se lavan una vez en 400 µl de etanol al 70% y resuspenden en 40 µl de etanol anhidro. La suspensión de DNA/partícula puede ser sonicada tres veces por un segundo cada uno. Cinco microlitos de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan en cada disco macro portador. Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas de edad se coloca en una placa petri de 60x15 mm vacia y el líquido residual se remueve del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, aproximadamente 5-10 placas de tejido se bombardean normalmente. La presión de ruptura de membrana se ajusta a 1100 psi, y la cámara se evacúa a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3.5 pulgadas lejos de las cribas de retención y se bombardearon tres veces. Después del bombardeo, el tejido puede ser dividido a la mitad y colocado nuevamente en liquido y cultivado como es descrito en lo anterior. Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido puede ser intercambiado con medio fresco, y once a
doce días después del bombardeo con medio fresco que contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo puede ser renovado cada semana. Siete a ocho semanas después del bombardeo, el tejido transformado, verde, puede ser observado creciendo de los amontonamientos embriogénicos necróticos. No transformados. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada nueva línea puede ser tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego pueden ser subcultivadas y mantenidas como amontonamiento de embriones inmaduros o regenerados en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales . Ejemplo 5: Transformación del Tejido de Meristema de Girasol Tejidos de meristema de girasol se transforman con un cásete de expresión que comprende la SEQ ID NO:l opeablemente enlazado a un promotor de ubicuitin (ver también, la patente europea No. EP 0 486233, incorporada en la presente por referencia, y Malone-Schneberg y colaboradores (1994) Plant Science 103:199-207). Semillas de girasol maduras { Helianthus annuus L . ) se desvainan utilizando un triturador de cabeza de trigo individual. Las semillas se esterilizan en la superficie durante 30 minutos en una solución blanqueadora de Clorox al 20% con la adición
de dos gotas de Tween 20 por 50. ml de solución. Las semillas se enjuagan dos veces con agua destilada estéril. Explantas de eje embriónico dividido se preparan mediante una modificación de procedimientos descritos por Schrammeijer y colaboradores (Schrammeijer y colaboradores (1990) Plant Cell Rep . 9:55-60). Las semillas se embeben en agua destilada durante 60 minutos después del procedimiento de esterilización de la superficie. Los cotiledones de cada semilla luego se rompen,' produciendo una fractura limpia en el plano del eje embriónico. Después de la excisión de la punta de la raíz, las explantas se biseccionan longitudinalmente entre las hojas primordiales. Las dos hojas se colocan, se corta la superficie hacia arriba, en el medio GBA que consiste de elementos minerales de Murashige y Skoog (Murashige y colaboradores (1962) Physiol . Plant . 15:473- 49.7), adiciones de vitamina de Shepard (Shepard (1980) in
Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops
(University of Minnesota Press, St . Paul, Minnesota), 40 mg/l de sulfato de adenina,' 30 g/1 de sacarosa, 0.5 mg/l de 6-bencil-aminopurina (BAP), 0.25 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA) , 0.1 mg/l de ácido giberélico (GA3) , pH 5.6, y 8 g/1 Phytagar . Las explantas se someten al bombardeo de micropoyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney y colaboradoes (1992) Plant Mol . Biol . . 18:301-313).
Treinta a cuarenta explantas se colocan en un círculo en el centro de una placa de 60 X 20 mm para este tratamiento. Aproximadamente 4.7 mg de microproyectiles de tugsteno de 1.8 mm se resuspenden en 25 ml de solución reguladora TE estéril (10 mM Tris HCl, EDTA 1 mM, pH 8.0) y alícuotas de 1.5 ml se utilizan por bombardeo. Cada placa se bombardea dos veces a través de una criba nytex de 150 mm colocada 2 cm arriba de las muestras en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®. La cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens apaciguada se utiliza en todos los experimentos de transformación. Un vector de plásmido binario que comprende el cásete de expresión que contiene el cásete de expresión de lipasa y un cásete de expresión de toxina de Bt se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium por la vía de congelación como es descrito por Holsters y colaboradores (1978) Mol . Gen . Genet . 163:181-187. Este plásmido además comprende un gen marcador seleccionable de canamicina (es decir, nptll) . Las bacterias para los experimentos de transformación de planta se cultivan durante la noche (28 °C y 100 RPM de agitación continua) en medio líquido YEP (10 gm/1 de extracto de levadura, 10 gm/1 de Bactopeptona y 5 gm/1 de NaCl, pH 7.0) con los antibióticos apropiados requeridos para la cepa bacteriana y el mantenimiento del plásmido binario. La suspensión se utiliza cuando esta alcanza un ODgoo de
aproximadamente 0.4 a 0.8. Las células de Agrobacterium se forman en pelotillas y se resuspenden a un OD6oo final de 0.5 en un medio de inoculación comprendido de MES 12.5 mM pH 5.7, 1 gm/1 de NH4C1 y 0.3 gm/1 de MgS04. Explantas recientemente bombardeadas se colocan en una suspensión de Agrobacterium, se mezclan y se dejan sin alterar durante 30 minutos. Las explantas luego se transfieren al medio GBA y se co-cultivan, se corta la superficie hacia abajo, a 26°C y días de 18 horas. Después de tres días de co-cultivación, las explantas se transfieren a 374B (medio GBA que carece de reguladores de crecimiento y un nivel de sacarosa reducida de 1%) suplementado con 250 mg/l de cefotaxime y 50 mg/l de sulfato de canamicina. Las explantas se cultivan durante dos a cinco semanas se seleccionan y luego se transfieren en el medio 374B fresco que carece de canamicina durante una a dos semanas de desarrollo continuo. Las explantas con áreas existentes a antibióticos diferenciantes de crecimiento que no han producido reacciones adecuados para la excisión se transfieren al medio GBA que contiene 250 mg/l de cefotaxime dunte un segundo tratamiento de fitohormona de 3 días. Muestras de hojas de retoño resistentes a canamicina, verde, se analizan para la presencia de NPTII mediante ELISA y para la presencia de la expresión de transgen mediante el ensayo de ELISA y el bioensayo de proteína insecticida de Bt . Ver,
por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,743, 477 , incorporada en la presente por referencia en su totaidad, y Hosteller y colaboradores (1991) Methods Enzymol . 197:125-134 y Rose y McCabe (1973) J. Econ . Entomology 66:393. Retoños positivos de NPTII se injertan al rizomas de partícula de girasol cultivado in vitro Pioneer® 6440. Las semillas esterilizadas en la superficie se germinan en el medio 48-0 (sales de Murashige y Skoog de mediana concentración, sacarosa al 0.5%, gelrite al 0.3%, pH 5.6) y se cultivan bajo las condiciones descritas para el cultivo de explantas. La porción superior de la plántula se remueve, una ranura vertical de 1 cm se hace en el hipocótilo, y el retoño transformado se inserta en el corte. El área completa se envuelve con parapelícula para asegurar el retoño. Las plantas infectadas puede ser transferidas a la tierra después de una semana de cultivo in vitro . Los injertos en la tierra se mantienen bajo condiciones de alta humedad seguida por una lenta aclimatización al medio ambiente del invernadero. Los sectores transformados de plantas To (generación parental) se maduran en el invernadero y se identifican mediante NPTII ELISA y/o mediante la actividad de lipasa y de la toxina de Bt de los análisis de extractos de hojas mientras que la semilla transgénica recolectadas de las plantas To positivas de NPTII se identifican mediante el análisis de actividad de lipasa y el análisis de toxina Bt de porciones pequeñas del
cotiledón de la semilla seca. Un protocolo de transformación de girasol alternativo permite la recuperación de la progenie transgénica sin el uso de la presión de selección química. Las semillas se desvainan y se esterilizan en la superficie durante 20 minutos en una solución blanqueadora de Clorox al 20% con la adición de dos a tres gotas de Tween 20 por 100 ml de solución, luego se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se incrustan en la oscuridad a 26°C durante 20 horas sobre papel filtro humedecido con agua. Los cotiledones y el radical de raiz se remueven, y las explantas de meristema se cultivan en 374E
(medio GBA que consiste de sales MS, vitaminas Shepard, 40 mg/l de sulfato de adenina, 3% de sacarosa, 0.5 mg/l de 6-BAP, 0.25 mg/l de IaA, 0.1 mf/1 de GA y 0.8% de Phytagar a pH 5.6) durante 24 horas bajo la oscuridad. Las hojas primarias se remueven para exponer el meristema apical, alrededor de 40 explantas se colocan con el domo apical enfrentado hacia arriba en un círculo de 2 cm en el centro de 374M (medio GBA con Phytagar al 1.2%) y luego se cultiva en el medio durante 24 horas en la oscuridad. Aproximadamente 18.8 mg de partículas de tungsteno de 1.8 µm se resuspenden en etanol en 150 µl de etanol puro. Después de la sonicación, 8 µl de esto se deja caer en el centro de la superficie del macroportador . Cada placa se
bombardea dos veces con discos de ruptura de 650 psi en el primer anaquel a 26 mm de Hg de vacío de la pistola de helio. El plásmido de interés se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens por la vía de la descongelación como es descrito previamente. Las pelotillas de bacterias cultivadas durante la noche a 28 °C en un medio YEP líquido (10 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de Bactopeptona y 5 g/1 de NaCl, pH 7.0) en la presencia de 50 µg/l de canamicina se resuspende en un medio de inoculación (12.5 mM 2 mM ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico, MES, 1 g/1 de NH4-C1 y 0.3 g/1 de MgS04 a pH 5.7) para alcanzar una concentración final de 4.0 en OD600. Las explantas bombardeadas con partículas se transfieren al medio GBA (374E) y una gotita de suspensión de bacterias se coloca directamente en la parte superior del meristema. Las explantas se co-cultivan en el medio durante 4 días, después de lo cual las explantas se transfieren al medio 374C (GBA con sacarosa al 1% y no BAP, IAA, GA3 y suplementado con 250 µg/ml de cefotaxime) . Las plantitas se cultivan en el medio durante aproximadamente dos semanas bajo condiciones de incubación de día de 16 horas y 26°C. Las explantas (alrededor de 2 cm de largo) de dos semanas de cultivo en el medio 374C se clasifican para la actividad de lipasa y/o insecticida utilizando ensayos conocidos en la técnica y divulgados en la presente. Después
de que se identifican las explantas positivas, aquellos retoños que no logran exhibir actividad de lipasa se desechan, y cada explanta positiva se subdivide en explantas nodales. Una explanta nodal contiene por lo menos un nodo potencial. Los segmentos nodales se cultivan en el medio de GBA durante tres o cuatro días para promover la formación de brotes auxiliares de cada nodo. Luego se transfieren al medio 374C y se dejan desarrollar durante cuatro semanas adicionales. Los brotes en desarrollo se separan y se cultivan por cuatro semanas adicionales en el medio 374C. Muestras de hojas acumuladas de cada retoño recientemente recuperado se clasifican nuevamente mediante ensayos de actividad de proteína apropiados. En este tiempo, retoños positivos recuperados de un nodo individual generalmente se habrán enriquecido en el sector transgénico detectado en el ensayo inicial antes del cultivo nodal. Los retoños recuperados positivos para la expresión de lipasa se injertan al rizoma de plántula de girasol cultivada in vitro Pioneer Hybrid 6440. Los rizomas se preparan de la siguiente manera. Las semillas se desvainan y se esterilizan en la superficie durante 20 minutos en una solución blanqueadora de Clorox al 20% con la adición de dos a tres gotas de Tween 20 por 100 ml de solución, y se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se germinan en el filtro humedecido con agua
durante tres días, luego se transfieren en el medio 48 (sal MS de mediana concentración, sacarosa al 0.5%, gelrite al 0.3%, pH 5.0) y se cultivan a 26°C bajo la oscuridad durante tres dias, luego se incuban en condiciones de cultivo de día de 16 horas. La porción superior de la plántula seleccionada se remueve, una ranura vertical se hace en cada hipocótilo, y el retoño transformado se inserta en un corte V. El área cortada se envuelve con parapelícula. Después de una semana de cultivo en el medio, las plantas injertadas se transfieren a la tierra. En las primeras dos semanas, ellas se mantienen bajo condiciones de alta humedad para aclimatizarse a un medio ambiente de invernadero. Por toda la especificación la palabra "que comprende" o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende" será entendida que implica la inclusión del elemento, número entero o etapa establecida, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier oto elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas El articulo "un" y "una" se utiliza en la presente para referirse a más de uno (es decir, as por lo menos uno) de el objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de
aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.