MXPA06008812A

MXPA06008812A - Metodo de replegamiento de glicosiltransferasas de mamiferos.

Info

Publication number: MXPA06008812A
Application number: MXPA06008812A
Authority: MX
Inventors: Karl F Johnson; Shawn Defrees; Sami Saribas; David Hakes; Scott Willett; Daniel James Bezila
Original assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2005-02-04
Publication date: 2008-03-07
Also published as: IL177179A; EP2484759B1; IL177179A0; EP1718739B1; EP2484759A2; JP4892358B2; NZ548893A; EP1718739A4; CA2555109A1; ES2501642T3; AU2005222782A1; EP1718739A2; WO2005089102A9; JP2007535309A; WO2005089102A2; EP2484759A3; AU2005222782B2; WO2005089102A3; ATE516349T1; CA2555109C

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para replegar glicosiltransferasas de mamifero que han sido producidas en celulas bacteriales, y metodos para usar dichas glicosiltransferasas replegadas, que incluyen mutantes de glicosiltransferasas que tienen la habilidad mejorada de poder replegarse. La invencio tambien proporciona metodos para replegar mas de una glicosiltransferasa en un solo recipiente, metodos para usar dichas glicosiltransferasas replegadas, y mezclas de reaccion que comprenden las glicosiltransferasas replegadas.

Description

MÉTODOS DE REPLEGAMIENTO DE GLICOSILTRANSFERAS S DE MAMÍFEROS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS [0001] Esta solicitud reclama beneficio de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. Número de Serie 60/542,210 presentada en febrero 4, 2004, y de la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/599,406 presentada en agosto 6, 2004, y de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. Número de Serie 60/627,406 presentada en noviembre 12,2004; cada una de las cuales, aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos . CAMPO DE LA INVENCIÓN [0002] La presente invención proporciona métodos para replegamiento de glicosiltransferasas de mamíferos que se han producido en células bacterianas, incluyendo mutantes de glicosiltransferasa que tienen mejorada habilidad para ser replegadas, y métodos para utilizar estas glicosiltransferasas replegadas. La invención también proporciona métodos para replegamiento de más de una glicosiltransferasa en un solo recipiente, a métodos para utilizar estas glicosiltransferasas replegadas y mezclas de reacción que comprenden las glicosiltransferasas replegadas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0003] Organismos eucarióticos sintetizan estructuras de oligosacáridos o glicoconjugados, tales como glicolípidos o glicoproteínas, que son útiles comercial y terapéuticamente. Síntesis in vivo de oligosacáridos o glicoconjugados, puede llevarse a cabo utilizando glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes . El método más eficiente para producir glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes para síntesis de oligosacáridos, es expresar la proteína en bacterias. Sin embargo, en bacterias muchas glicosiltransferasas eucarióticas se expresan como proteínas insolubles en cuerpos de inclusión bacteriana y los rendimientos de proteína activa de los cuerpos de inclusión pueden ser muy bajos. De esta manera, hay necesidad por métodos mejorados para producir glicosiltransferasas eucarióticas en bacterias. La presente invención resuelve estas y otras necesidades. BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN [0004] La presente invención proporciona un método para replegamiento de una glicosiltransferasa eucariótica insoluble y recombinante, que comprende un dominio de proteína de enlace maltosa (MBD = Maltose Binding Protein) . La glicosiltransferasa eucariótica recombinante insoluble se solubiliza en un amortiguador de solubilización y después se contacta con un amortiguador de replegamiento que comprende un par redox, tal que la glicosiltransferasa eucariótica replegada cataliza la transferencia de un azúcar de un sustrato donador a un sustrato aceptor. En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica se trunca para retirar todo o una porción de una región raíz de la proteína. En otra modalidad, una cisteína no apareada en la glicosiltransferasa eucariótica se retira por sustitución con un aminoácido no-cisteína. En una modalidad adicional, una cisteína no apareada en la glicosiltransferasa eucariótica se retira por sustitución con un aminoácido sin-cisteína y la glicosiltransferasa eucariótica también se trunca para retirar todo o una porción de una región raíz de la proteína. [0005] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica se elige del grupo que consiste de GnTl, GalTI, StlII Gal3, St3GalI, St6 GalNAcTI , Core GalITI, GalNAcT2. [0006] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica además comprende un dominio de purificación, por ejemplo un dominio de enlace almidón (SBD = Starch Binding Domain) , un dominio de tioredoxina, un dominio SUMO, un dominio poli-His, un dominio epítopo myc y un dominio glutationa-S-transferasa. [0007] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica además comprende un dominio de auto escisión. [0008] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica se expresa en una célula anfitriona bacteriana como un cuerpo de inclusión insoluble. [0009] En una modalidad, una segunda glicosiltransferasa eucariótica insoluble recombinante se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariótica. En una modalidad adicional, una tercera glicosiltransferasa eucariótica recombinante insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariótica y la segunda glicosiltransferasa eucariótica. Puede agregarse adicional glicosiltransferasa eucariótica recombinante insoluble y replegarse en conjunto dependiendo de las necesidades del usuario, por ejemplo replegamiento de 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 glicosiltransferasas en conjunto. [0010] En una modalidad, el par redox se elige del grupo que consiste de glutationa reducida/glutationa oxidada (GSH/GSSG) y cisteína/cistamina . [0011] En una modalidad, el sustrato aceptor se elige de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido . [0012] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica es una sialiltransferasa. Las sialiltransferasas pueden incluir, por ejemplo StlII Gal3, St3GalI, St6 GalNAcTI . En un aspecto adicional, el sustrato donador es una molécula de PEG ácido siálico-CMP y el sustrato aceptor se elige de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido. [0013] La presente invención también proporciona una glicosiltransferasa eucariótica recombinante en donde una región ancla raíz y un dominio de trans-membrana se han eliminado de la proteína y en donde la glicosiltransferasa se fusiona en marco a un dominio de proteína de enlace de maltosa (MBP) . En una modalidad, la fusión de la glicosiltransferasa eucariótica recombinante y el dominio MBP se expresa como un cuerpo de inclusión insoluble en bacteria, por ejemplo E. coli . [0014] En una modalidad, todo o una porción de la región raíz se elimina de la glicosiltransferasa eucariótica recombinante. En otra modalidad, una cisteína no apareada en la glicosiltransferasa eucariótíca recombinante se retira por sustitución con un aminoácido sin-cisteína. [0015] En una modalidad adicional, glicosiltransferasa eucariótica recombinante es uno de los siguientes: una proteína St6 GalNAcTI, una proteína GalITI o una proteína GalNAcT2. [0016] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante es una proteína GnTl . En un aspecto, la proteína GnTl es una proteína GnTl humana truncada seleccionada de GnTl?35 y GnTl?l03. En otro aspecto, la proteína GnTl es una proteína Gntl humana que comprende una sustitución cisteína no apareada seleccionada del grupo que consiste de CYS121ALA, CYS121ASP, y ARG120ALA, CYS121HIS. En un aspecto adicional, la proteína GnTI está tanto truncada como tiene un residuo cisteína no apareado retirado por una mutación de sustitución. [0017] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante es una proteína GalTl . En un aspecto, la proteína GalTl es una proteína GalTl bovina truncada seleccionada de GalTl ? 70 y GalTl?l29. En otro aspecto, la proteína GalTl es una proteína GalTl bovina que comprende una sustitución cisteína no apareada de CYS342THR. En un aspecto adicional, la proteína GalTl está tanto truncada como tiene un residuo cisteína no apareado retirado por mutación de sustitución. [0018] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante es una proteína ST3GalIII . En un aspecto, la proteína ST3GalIII es una proteína ST3GalIII de rata, truncada, seleccionada de ST3GalIII 28, ST3GalIII ? 73 , ST3GalIII ? 85 y ST3GalIII ?86. En otro aspecto, la proteína ST3GalIII comprende una sustitución de aminoácido de un residuo cisteína no apareado. En un aspecto adicional, la proteína ST3GalIII está tanto truncada como tiene un residuo cisteína no apareado retirado por una mutación de sustitución. [0019] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante de la reivindicación 15, en donde la glicosiltransferasa es una proteína Corel GalTl. En un aspecto, la proteína Corel GalTl es una proteína de Drosophila, truncada, o una proteína humana truncada. En otro aspecto, una proteína de Drosophila o Corel GalTl comprende una sustitución de aminoácido para un residuo cistelna no apareado. En un aspecto adicional, una proteína de Drosophila o Corel GalTl humana está tanto truncada como que tiene un residuo de cisteína no apareado retirado por una mutación de sustitución. [0020] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante es una proteína ST3Gall . En un aspecto, la proteína ST3Gall es una proteína humana truncada seleccionada de ST3Gall ?29, ST3Gall ?45, y ST3Gall ?56. En otro aspecto la proteína ST3Gall comprende una sustitución de aminoácido para un residuo de cisteína no apareado. En un aspecto adicional, la proteína ST3Gall está tanto truncada como que tiene un residuo cisteína no apareado retirado por una mutación de sustitución.

[0021] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante es una proteína ST6GalNAcl . En un aspecto, la proteína ST6GalNAcl es una proteína de ratón, truncada, una proteína de pollo, truncada o una proteína humana, truncada, por ejemplo uno de los truncados citados en la tabla 14. En otro aspecto, una proteína ST6GalNAcl de ratón, pollo o humano comprende una sustitución de aminoácido para un residuo de cisteína no apareado. En un aspecto adicional, una proteína ST6GalNAcl de ratón, pollo o humano está tanto truncada como que tienen un residuo de cisteína no apareado retirado por una mutación de sustitución. [0022] En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante de la reivindicación 15 , en donde la glicosiltransferasa es una proteína GalNAcT2. En un aspecto, la proteína GalNAcT2 es una proteína humana truncada seleccionada de GalNAcT2 ?40, GalNAcT2 ?51, GalNAcT2 ? 74 y GalNAcT2 ? 95. En otro aspecto, la proteína GalNAcT2 humana comprende una sustitución de aminoácido de un residuo cisteína no apareado. En un aspecto adicional , la proteína GalNAcT2 humana está tanto truncada como tiene un residuo cisteína no apareado retirado por una mutación de sustitución. [0023] La presente invención también proporciona un método para remodelar una proteína, un péptido, una glicoproteína, o un glicopéptido utilizando glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes citadas anteriormente, después de que las proteínas se han replegado y tienen actividad enzimática. [0024] La presente invención proporciona métodos mejorados para replegamiento de glicosiltransferasas eucarióticas insolubles en una forma activa y también proporciona glicosiltransferasas, por ejemplo, enzimas N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI) que tiene propiedades de replegamiento mejoradas. [0025] En un aspecto, la invención proporciona una enzima N-acetilglucosaminiltransferasa I eucariótica recombinante (GnTI) que se ha mutado para reemplazar un residuo cisteína no apareado con un aminoácido que mejora replegamiento de la enzima a partir de un precipitado insoluble, por ejemplo cuerpos de inclusión bacteriana. La enzima GnTl incluye al menos un dominio catalítico de la enzima GnTl . La enzima GnTl es biológicamente activa es decir, capaz de catalizar la transferencia de un sustrato donador a un sustrato aceptor. [0026] En una modalidad, la enzima GnTl es una proteína humana. Algunas mutaciones del residuo CYS121 en GnTl humano mejoran el replegamiento. Esos mutantes incluyen por ejemplo mutación CYS 121 SER, una mutación CYS121ALA, mutación CYS121ASP y un doble mutante, ARG120ALA, CYS121HIS. Secuencias representativas de mutantes GnTl se ilustran en las Figuras 7-11. En otras eucariotas, por ejemplo mutaciones similares de un residuo cisteína no apareado, mejoran replegamiento de la enzima GnTl. [0027] En otra modalidad, la enzima GnTl incluye también una etiqueta aminoácido, por ejemplo una proteína de enlace maltosa (MBP) , una etiqueta polihistidina, una glutationa S transferasa (GST) , una proteína de enlace de almidón (SBP) y un epítopo myc. [0028] En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican una enzima GnTI eucariótica recombinante que se ha mutado para reemplazar un residuo cisteína no apareado con un aminoácido que mejora replegamiento de la enzima a partir de un precipitado insoluble, por ejemplo cuerpos de inclusión bacteriana. Como con anterioridad, la enzima GnTl codificada incluye al menos el dominio catalítico de la enzima GnTl y es biológicamente activa, es decir es capaz de catalizar la transferencia de un sustrato donador a un sustrato aceptor . [0029] En una modalidad, los ácidos nucleicos codifican una enzima GnTI humana. Algunas mutaciones del residuo CYS121 en GnTl humano mejoran el replegamiento. Estos mutantes incluyen por ejemplo la mutación CYS121SER, una mutación CYS121ALA, una mutación CYS121ASP y un doble mutante ARG120ALA, CYS121HIS. Secuencias de ácidos nucleicos representativas de proteínas mutantes GnTl y ácido nucleico, se ilustran en las figuras 7-11. En otras eucariotas, por ejemplo mutaciones similares de un residuo cisteína no apareado, CYS123 mejoran replegamiento de la enzima GnTl. [0030] En una modalidad adicional, la enzima GnTI codificada también incluye una etiqueta aminoácido, por ejemplo una proteína de enlace maltosa (MBP), una etiqueta polihistidina, una glutationa S transferasa (GST) , una proteína de enlace de almidón (SBP) y epítopo myc . [0031] La invención también incluye vectores de expresión que incluyen los ácidos nucleicos GnCl mutados, células anfitrionas que incluyen los vectores de expresión GnTl y métodos para producir las enzimas GnTl mutadas utilizando el sistema de vector de expresión/anfitrión . [0032] En otra modalidad, la invención proporciona un método para agregar residuos N-acetilglucosamina a una molécula aceptora con un residuo mannosa terminal, al contactar la molécula aceptora con una molécula de N-acetilglucosamina activada y una enzima GnTl eucariótica que se ha mutado para mejorar el replegamiento. La molécula aceptora puede ser por ejemplo un polisacárido, un oligosacárido, un glicolípido o una glicoproteína . [0033] En otro aspecto, la invención proporciona un método para replegamiento de al menos dos proteínas de glicosiltransferasa eucarióticas recombinantes insolubles en un solo recipiente, al contactar las glicosiltransferasas con un amortiguador de replegamiento que incluye un par redox. Después de replegamiento, al menos dos de las glicosiltransferasas replegadas tienen actividad biológica, por ejemplo son capaces de catalizar la transferencia de un sustrato donador con un sustrato aceptor. [0034] El amortiguador de replegamiento puede también incluir un detergente o un agente caotrópico o arginina o PEG. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 6.0 y 10.0. En una modalidad, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 6.5 y 8.0. En otra modalidad, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 8.0 y 9.0. [0035] En otra modalidad, las glicosiltransferasas incluyen una etiqueta aminoácido, por ejemplo una proteína de enlace maltosa (MBP), una etiqueta polihistidina, una glutationa S transferasa (GST) , una proteína de enlace de almidón (SBP) y un epítopo myc . [0036] En una modalidad, más de una glicosiltransferasa desde una ruta glicano N-enlazado biosintético se repliegan en conjunto. [0037] En una modalidad, una sialiltransf rasa se pliega con otra glicosiltransferesa utilizando los métodos de la invención. [0038] En una modalidad, una N-acetilglucosaminiltransferasa se pliega con otra glicosiltransferasa utilizando los métodos de la invención . [0039] En una modalidad, una galactosiltransferasa se pliega con otra glicosiltransferasa utilizando los métodos de la invención. [0040] En otra modalidad, una sialiltransferasa, una N-acetilglucosaminiltransferasa y una galactosiltransferasa se repliegan en conjunto en un solo recipiente utilizando los métodos de la invención. [0041] En una modalidad, más de una glicosiltransferasa de una ruta biosintética glicano 0-enlazada se pliegan en conjunto. En una modalidad adicional , una primera enzima es una N-acetilgalactosaminiltransferasa. En una modalidad preferida, una primera enzima es una N-acetilglucosaminiltransferasa 2(GaINAcT2) . [0042] La presente invención también proporciona una mezcla de reacción que incluye una enzima GnTl eucariótica recombinante que se ha mutado para reemplazar un residuo cisteína no apareado con un aminoácido que mejora replegamiento de la enzima a partir de un precipitado insoluble, por ejemplo cuerpos de inclusión bacterianos y al menos otra glicosiltransferasa que se ha replegado en el mismo recipiente . La segunda glicosiltransferasa puede ser por ejemplo una sialiltransferasa o una galactosiltransferasa. En una modalidad, la mezcla de reacción incluye la enzima GnTl eucariótica mutada, una sialiltransferasa y una galactosiltransferasa. Las mezclas de reacción pueden emplearse como una molécula aceptora con un azúcar donador, para producir por ejemplo un polisacárido, un oligosacárido, un glicolípido o una glicoproteína. [0043] en otro aspecto, la invención proporciona un método para replegar una sialiltransferasa eucariótica recombinante insoluble; al (a) solubilizar la sialiltransferasa; y después (b) contactar la sialiltransferasa soluble con un amortiguador de replegamiento incluyendo un par redox. La sialiltransferasa replegada es biológicamente activa y cataliza la transferencia de ácido siálico de un sustrato donador a un sustrato aceptor. En una modalidad, la sialíltransferasa replegada se dializa o diafiltra. [0044] El amortiguador de replegamiento también puede incluir un detergente o un agente caotrópico o arginina. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 6.0 y 10.0. En una modalidad, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 6.5 y 8.0. En otra modalidad, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 8.0 y 9.0. En otra modalidad, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 7.5 y 8.5. [0045] En una modalidad, el par redox del amortiguador de replegamiento es glutationa reducida/glutationa oxidada (GSH/GSSG) . En una modalidad adicional, la proporción molar de GSH/GSSG está entre 100:1 y 1:10. En una modalidad preferida, la proporción molar de GSH/GSSG es 10:1. En una modalidad aún adicional, el amortiguador de replegamiento comprende aproximadamente GSH 0.02-10 mM, GSSG 0.005-10 mM, lauril maltosida 0.005-10 M, NaCl 50-250 mM, KCl 2-10 mM, PEG 3350 0.01-0.05%, y L-arginina 150-550 mM. [0046] En otra modalidad, la sialiltransferasa incluye una etiqueta aminoácido, por ejemplo proteína de enlace maltosa (MBP) , una etiqueta polihistidina, una glutationa S transferasa (GST) , una proteína de enlace de almidón (SBP) , y un epítopo myc. En una modalidad adicional, la sialiltransferasa se purifica utilizando una molécula de enlace de etiqueta que liga a la etiqueta aminoácido. Por ejemplo, la etiqueta aminoácido puede ser MBP y la molécula de enlace de etiqueta puede ser amilosa, maltosa o una ciclodextrina. [0047] En otra modalidad, la sialiltransferasa replegada cataliza la transferencia de ácido siálico de CMP-ácido siálico a una glicoproteína. [0048] En una modalidad adicional, la sialiltransferasa replegada cataliza la transferencia de PEG 10K o PEG 20K de CMP-SA-PEG (10 kDa) o CMP-SA-PEG (20 kDa) a una glicoproteína. [0049] En otra modalidad, la sialiltransferasa es ST3GalIII de hígado de rata. [0050] En otro aspecto, la invención proporciona un método para agregar una porción sialilo a una glicoproteína, al contactar la glicoproteína con CMP-ácido siálico con una sialiltransferasa de mamífero replegada que se pliega utilizando los métodos aquí descritos . [0051] En otro aspecto, la invención proporciona un método para agregar una porción PEG a una glicoproteína, el método comprende contactar la glicoproteína con CMP-SA-PEG (10 kDa) o CMP-SA-PEG (20 kDa) y una sialiltransferasa de mamífero replegada que se repliega utilizando los métodos aquí descritos. [0052] En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para replegar una N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 eucariótica recombinante insoluble (GalNAcT2) al solubilizar la GalNAcT2 en un amortiguador de solubilización; y después contactar la GalNAcT2 soluble con un amortiguador de replegamiento que incluye un par redox para replegar la GalNAcT2. Después de replegar, la GalNAcT2 replegada cataliza la transferencia de N-acetilgalactosamina desde un sustrato donador a un sustrato aceptor. EL método puede incluir opcionalmente etapas para dializar o diafiltrar la GalNAcT2 replegada o mayor purificación de la GalNAcT2 replegada. [0053] En algunas modalidades, el par redox del amortiguador de replegado es glutationa reducida/glutationa oxidada (GSH/GSSG) o cisteína/cistamina. El amortiguador de replegamiento también puede incluir los siguientes: un detergente, un agente caotrópico o arginina. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de replegamiento está entre 6.0 y 10.0. En una modalidad preferida, el pH del amortiguador de replegamiento es aproximadamente 8.0.

[0054] En modalidades preferidas, el pH del el pH del amortiguador de solubilización está entre 6.0 y 10.0. En una modalidad más preferida, el pH del amortiguador de solubilización es aproximadamente 8.0. [0055] La GalNAcT2 expresada recombinantemente puede incluir una etiqueta aminoácido. La etiqueta aminoácido puede ser, por ejemplo una proteína de enlace maltosa (MBP) , una etiqueta polihistidina, una glutationa S transferasa (GST) , una proteína de enlace de almidón (SBP) , o un epítopo myc. Una molécula de enlace de etiqueta puede emplearse para purificar la GalNAcT2 replegada. Cuando la etiqueta aminoácido es MBP y la molécula de enlace de etiqueta generalmente es una de las siguientes: amilosa, maltosa o una ciclodextrina. [0056] En una modalidad preferida, la GalNAcT2 replegada cataliza la transferencia de N-acetilgalactosamina desde un sustrato donador a un péptido, proteína, glicopéptido o glicoproteína. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0057] La Figura 1 proporciona las condiciones de amortiguador probadas en replegar MBP-ST3GalIII de cuerpos de inclusión bacterianos . La actividad de las enzimas replegadas también se proporciona.

[0058] La Figura 2 proporciona un perfil de elución de MBP-ST3GalIII replegada y dialízada desde una columna amilasa. [0059] La Figura 3 proporciona las actividades ST3GalIII de las fracciones de elución de la columna de amilosa . [0060] La Figura 4 proporciona los resultados de un ensayo de modificación con glicopolietilenglicol de transferrina utilizando MBP-ST3GalIII purificada replegada. Las pistas son como sigue: (1) marcadores MW [250, 148, 98, 64, 50 kD] ; (2) asioalotransferrina de control sin enzima, indicada por flecha sólida; (3) producción de transferrina-SA-PEG (20 kDa) con Fracción #5, productos indicados por una cabeza de flecha; (4) producción de transferrina-SA-PEG (20 kDa) con Fracción #6, productos indicados por la cabeza de flecha; (5) MBP-ST3GalIII purificada, replegada Fr #6, indicada por flecha punteada; (6) marcadores MW; (7) igual que 2; (8) producción de transferrína-SA-PEG (10 kDa) con Fr #4, productos indicados por paréntesis cuadrados; y (9) producción de transferrina-SA-PEG (10 kDa) con Fr #5, productos indicados por paréntesis cuadrados . [0061] La Figura 5 proporciona los resultados de un ensayo de modificación con glicoPEG de EPO utilizando SuperGlycoMix replegada. Las pistas son como sigue: (1) marcadores MW, SeeBlue2 Invitrogen, (250, 148, 98, 64, 50, 36, 22, 16, 6 kD) ; (2) control positivo con EPO, GalTl expresada + NSO, BV GnTl, Aspergillus ST3GalIII y nucleótidos de azúcar; (3) control negativo, igual que 2 sin UDP-GIcNAc; (4) EPO, MBP- GalTl (?129) C342Teb replegada por separado y purificada, MBP-GnTl (?103) replegada, y ST3GalIII expresado con aspergillus niger; (5) EPO, SuperGlycoMix (mezcla de MBP-ST3GalIII, MBP-GalTl (?129) C342T, MBP-GnTl (?103) C123A y nucleótidos de azúcar. [0062] La Figura 6 proporciona un alineamiento de una secuencia de aminoácidos GnTl humana (línea superior, NP_002397; SEQ ID NO:l) y una secuencia de aminoácidos GnTl de conejo (línea de fondo, P27115; SEQ ID NO: 2). Las cisteínas no apareadas conservadas son texto subrayado y con negritas . [0063] La Figura 7 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO : 3 ) de un mutante GnTl Cysl21 y la secuencia ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 4) que codifica la proteína mutante GnTl . La secuencia de aminoácidos ilustrada empieza con un residuo aminoácido 104 de la proteína humana de longitud íntegra y es representativa de proteínas GnTl de mamífero con la siguiente mutación de cisteína no apareada: ... stvrrsldkllh.... (SEQ ID NO: 5) , en donde el residuo con negritas se muta a partir de la cisteína tipo silvestre. [0064] La Figura 8 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de un mutante GnTl Cysl21Asp y una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 7) que codifica la proteína mutante GnTl . La secuencia de aminoácidos ilustrada empieza con un residuo aminoácido 104 de la proteína humana de longitud íntegra y es representativa de proteínas GnTl de mamífero con la siguiente mutación de cisteína no apareada: ... stvrrdldkllh... (SEQ ID NO: 8) , en donde el residuo con negritas se muta de la cisteína tipo silvestre. [0065] La Figura 9 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un mutante GnTl Cysl21Thr y una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 10) que codifica la proteína GnTl mutante. La secuencia de aminoácidos ilustrada empieza con un residuo aminoácido 104 de la proteína humana de longitud íntegra y es representativa de proteínas GnTl de mamífero con la siguiente mutación de cisteína no apareada: ... stvrrtldkllh... (SEQ ID NO:ll), en donde el residuo con negritas se muta de la cisteína tipo silvestre. [0066] La Figura 10 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un mutante GnTl Cysl21Ala y una secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 13) que codifica la proteína GnTl mutante. La secuencia de aminoácidos ilustrada empieza con un residuo aminoácido 104 de la proteína humana de longitud íntegra y es representativa de proteínas GnTl de mamífero con la siguiente mutación de cisteína no apareada: ... stvrraldkllh... (SEO ID NO: 14) , en donde el residuo con negritas se muta de la cisteína tipo silvestre. [0067] La figura 11 proporciona la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de un mutante GnTl Argl20Ala, Cysl21 y una secuencia ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 16) que codifica la proteína GnTl . La secuencia de aminoácidos ilustrada empieza con residuo aminoácido 104 de la proteína humana de longitud íntegra y es representativa de proteínas GnTl de mamífero con la siguiente doble mutación: ... stvrahldkllh... (SEQ ID NO: 17) , en donde el residuo con negritas se muta de la cisteína* de tipo silvestre. [0068] La figura 12 proporciona la secuencia de aminoácidos de ST3GalIII de hígado de rata (SEQ ID NO: 18) . La secuencia subrayada y con itálicas se elimina para realizar la eliminación ?28. [0069] Las figuras 13A y 13B proporcionan secuencias de longitud integral de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 19) y aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de UDP-N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 (GaINAcT2). El número de acceso del ácido nucleico de proteína NM_004481. [0070] Las figuras 14A y 14B proporcionan secuencias de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 22) y aminoácidos (SEO ID NO:21) de una ? 51GalNAcT2. La numeración se basa en las secuencias de longitud integral de aminoácido y ácido nucleico mostradas en las figuras 13A y B. [0071] La figura 15 proporciona una demostración de la concentración de proteína de MBP-GalNAcT2 (D51) replegada, después de solubilizar a pH 6.5 o pH 8.0 y replegar a pH 6.5 o pH 8.0. Los valores de pH probados se expresan como pH de solubilización-pH replegado . Concentraciones de proteínas se midieron inmediatamente después de replegar (barras gris claro) , después de diálisis (barras gris oscuro) , y después de concentración (barras blancas) . [0072] La figura 16 proporciona una demostración de la actividad enzimática de MBP-GalNAcT2 (D51) replegada después de solubilización a pH 6.5 a pH 8.0 y replegar a pH 6.5 o pH 8.0. Los valores de pH probados se expresan como pH de solubilización-pH de replegado. La actividad se mide después de diálisis (barras gris claro) y después de concentración (barras gris oscuro) .

[0073] La figura 17 proporciona una demostración de la actividad específica de MBP-GalNAcT2 (D51) replegada después de solubílización a pH 6.5 o pH 8.0 y replegado a pH 6.5 o pH 8.0. Los valores de pH probados se expresan como pH de solubilización-pH de replegado. Actividad específica se mide después de diálisis (barras blancas) y después de concentración (barras gris oscuro) . [0074] Las figuras 18A y 18B proporcionan resultados de remodelación de factor de estímulo de colonia de granulocitos recombinantes (GCSF) utilizando MBP-GaINAcT2 (D51) replegado después de solubilización a pH 6.5 o pH 8.0 y replegado a pH 6.5 o pH 8.0. la figura 8A muestra los resultados utilizando una MBP-GalNAcT2 (D51) a purificado de control, o un control negativo que carece de un substrato, o MBP-GaINAcT2 (D51) expresado bacterialmente que se solubiliza a pH 6.5 y pliega a pH 6.5. La figura 18B muestra los resultados experimentales. [0075] La figura 19 proporciona un perfil de proteína MBP-GalNAcT2 (D51) replegadas después de elución de una columna Q Sepharose XL (QXL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La parte superior de la figura muestra un cromatograma que ilustra la elución de MBP-GalNAcT2 (D51) a partir de la columna QXL. Números de fracción se indican en el eje X y la absorbancia relativa de cada fracción se indica en el eje Y. el fondo muestra la imagen de dos geles electroforéticos empleados para visualizar las fracciones eluídas . Los contenidos de cada pista en el gel se describen en la figura. [0076] La figura 20 proporciona la actividad GalNAcT2 de fracciones de columna específicas de la columna QXL mostrada en la figura 19. Las fracciones más activas se aplicaron a una columna de Hidroxiapatita tipo I (80 m) (BioRad, Hercules, CA) . [0077] La figura 21 proporciona un perfil de proteínas MBP-GaINAcT2 (D51) replegadas después de elución de la columna HA tipo I . La parte superior de la figura muestra un cromatograma que ilustra la elución de MBP-GalNAcT2 (D51) de la columna HA tipo I. Números de fracción se indican en el eje X y la absorbancia relativa de cada fracción se indica en el eje Y. El fondo muestra una imagen de un gel electroforético empleado para visualizar las fracciones eluídas. Los contenidos de cada pista en el gel se describen en la figura. [0078] La figura 22 proporciona la actividad GalNAcT2 de fracciones eluídas con HA tipo I. [0079] La figura 23 proporciona una comparación de purificación de actividad de proteínas ST3Gal3 fusionadas ya sea a una etiqueta MBP o a una etiqueta MBP-SBD.

[0080] La figura 34 proporciona una secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión MBP-ST3Gall (SEO ID NO: 23) (A) y la proteína de fusión MBP~SBD-ST3Gall (SEQ ID NO:24) (B) . [0081] La figura 25 proporciona la actividad de sialitransferasa y la proteína de fusión MBP-ST3Gal3. También se ilustran controles positivo y negativo. [0082] La figura 26 proporciona la secuencia aminoácidos de proteínas ST6GalNAcI de ratón y humano fusionadas a MBP. La parte A muestra la secuencia de una fusión de truncado de ratón: MBP-mST6GalNAcIS127 (SEQ ID NO: 25) . La parte B muestra la secuencia de una fusión de truncado humana: MBP-hST6GalNAcI K36 (SEQ ID NO: 26) . [0083] La figura 27 proporciona geles SDS-PAGE de concentraciones de enzima de glicosiltransferasa O-enlazado (A) después de co-replegado y (B) resultado de un ensayo de enzima después de co-replegado. MBP-GaINAcT2 y MBP-ST3GalI se co-replegaron en conjunto. La actividad de enzimas se prueba después de adición de enzima Core I Gal Tl. Los substratos fueron IFa-2b y 20K-Peg-CMP- NAN. [0084] La figura 28 proporciona un gel SDS-PAGE que muestra expresión de la proteína SiaA en E. coli antes y después de inducción con IPTG.

[0085] La figura 29 proporciona un gel SDS-PAGE que muestra expresión de una proteína de fusión MBP-SiaA en E . coli antes y después de inducción con IPTG. [0086] La figura 30 proporciona la secuencia aminoácidos de la proteína GalTl bovina de longitud integral (SEQ ID NO: 27) . [0087] La figura 31 ilustra esquemáticamente mutantes GalTl así como una proteína de control GalTl (40) (S96A+C342T) . [0088] La figura 32 proporciona los resultados de ensayes enzimáticos de la proteína MBP-GalTl (D70) replegada y purificada. El ensayo midió conversión de LNT2 (Lacto-N-Triosa-2) en LNnT (Lacto-N-Neotetraosa) utilizando UDP-Gal (Uridina 5 ' -Difosfogalactosa) como un substrato donador . [0089] La figura 33 proporciona un ensayo de remodelación RNAse B de MBP-GalTl (D70) y una propiedad de control GalTl (40) (S96A+C342T) , también referida como GalTl de Quasba . [0090] La figura 34 proporciona cinéticas de glicosilación de RNAse B utilizando la proteína MBP-GalTl (D70) replegada y purificada o NSO GalTl, una forma soluble de la proteína GalTl bovina que se expresó en un sistema celular de mamífero.

[0091] La figura 35 proporciona un esquemático de las proteínas de fusión MBP-GnTI y truncado, por ejemplo ? 103 o ?35, o la mutación Cysl21 (superior) . El fondo de la figura proporciona la proteína GnTI humana de longitud integral (SEQ ID NO:l) . [0092] La figura 36 proporciona un gel SDS-PAGE que muestra en el panel derecho, las proteínas de fusión MBP- GnTl replegadas: y MBP-GnTl (D35) C121A, MBP-GnTl (D103) R120A + C121H, y MBP-GnTl (D103) C121A. El panel izquierdo muestra actividades GnTl de dos lotes diferentes (Al y A2) de MBP-GnTl (D35) C121A replegada en diferentes puntos en tiempo . [0093] La figura 37 proporciona una secuencia de longitud íntegra de ST3Gall porcino (SEQ ID NO: 28) . [0094] La figura 38 proporciona secuencias de aminoácidos de longitud íntegra para A) ST6GalNAcI humano (SEQ ID NO: 29) y para B) ST6GalNAcI de pollo (SEQ ID NO: 30) y C) una secuencia de la proteína ST6GalNAcI de ratón que empieza en el residuo 32 de la proteína de ratón nativo (SEQ ID NO: 31) . [0095] La figura 39 proporciona un esquemático de una cantidad de mutantes de truncado ST6GalNAcI humanos preferidos .

[0096] La figura 40 muestra un esquemático de proteínas de fusión MBP incluyendo los mutantes de truncado ST6GalNAcI humano. [0097] La figura 41 proporciona la secuencia de longitud íntegra de proteína Core 1 GalTl humano (SEQ ID NO: 32) . [0098] La figura 42 proporciona las secuencias de dos proteínas Core 1 GalTl Drosophila (SEQ ID NOS: 33 y 34) . [0099] La figura 43 proporciona las secuencias de proteínas MBP bacterianas ejemplares que pueden fusionarse con glicosiltransferasas para mejorar el replegado. A. MBP Yersinia (SEQ ID NO:35); B. MBP E. coli (SEQ ID NO: 36); C. MBP Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 37) ; D. MBP Thermococcus li toralis (SEO ID NO: 38); E. MBP Ther atoga mari time (SEQ ID NO: 39); y F. MBP Vibrio cholera (SEQ ID NO: 40) . [0100] La figura 44 proporciona un alineamiento de a proteínas GalNAcTI humana (SEQ ID NO: 41) y GalNAcT2 (SEQ ID NO: 19) . Debido a que los programas de alineamiento toman en cuenta las inserciones de eliminaciones de secuencia, la numeración de residuo cisteína no es la misma como las secuencias mencionadas de texto y publicadas. En el caso de hGalNAc-T2 cisteína 227 (publicada) corresponde a la posición 235 en el alineamiento y cisteína 229 (publicada) es 237 en el alineamiento. Las GalNAc-Tl cisteínas son 212 (publicada) que corresponde a cisteína 235 (alineamiento) y 214 (publicada) que corresponde a cisteína 237 (alineamiento) . Los residuos cisteína relevantes se indican por un tamaño de tipo de letra más grande. Péptidos consenso = SEQ ID NOS: 42-65. [0101] La figura 45 muestra una posición de residuos cisteína apareados y no apareados y una proteína ST6GalNAcI humana. Sustitución de cisteínas sencillas y dobles también se muestra en C280S, C362S, C362T, (C280S + C362S) , y (C280S + C362T) . DEFINICIONES [0102] Las proteínas de glicosiltransferasa recombinante de la invención son útiles para transferir un sacárido de un substrato donador a un substrato aceptor. La adición en general se lleva a cabo en el extremo no reductor de una porción oligosacárido o carbohidrato en una biomolécula. Biomolécula se define aquí que incluye pero no está limitada a moléculas biológicamente significantes tales como carbohidratos, proteínas (por ejemplo glicoproteínas) y lípidos (por ejemplo glicolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y gangliósidos) . Las siguientes abreviaturas se emplean aquí : Ara= arabinosilo; Fru= fructosilo; Fuc= fucosilo; Gal= galactosilo; GalNAc= N-acetilgalactosilamino; Glc= glucosilo; GlcNAc= N-acetilglucosilamino; Man= mannosilo; y NE.U.A.c = sialilo (N-acetilneuraminilo) ; FT o FucT = fucosiltransferasa* ; ST = sialiltransferasa*; GalT= galactosiltransferasa* . [0103] Los números arábigos o romanos se emplean aquí de forma intercambiable de acuerdo con la convención de nomenclatura empleada en la técnica para indicar la identidad de una glicosiltransferasa específica (por ejemplo FTVII y FT7 se refieren a la misma fucosiltransferasa) . [0104] Los oligosacáridos se considera que tienen un extremo de reducción y un extremo sin reducción, ya sea que el sacárido o no en el extremo reducción de hecho es una azúcar de reducción. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se ilustran aquí con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor en la derecha.

[0105] Todos los oligosacáridos aquí descritos se describen con el nombre o abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo Gal), seguido por la configuración de enlace glicosídico ( a o ß ) el enlace de anillo, la posición de anillo del sacárido reductor involucrado en la unión y después el nombre o abreviaturas del sacárido reductor (por ejemplo GIcNAc) . El enlace entre dos azúcares puede ser expresado, por ejemplo como 2, 3, 2->3, o (2,3). Cada sacárido es una piranosa o furanosa. [0106] El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve átomos de carbono. El miembro más común de la familia de ácido siálico es ácido N-acetil~neuramínico ácido (2-ceto-5-acetamido-3 , 5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico) (a menudo abreviado como Neu5Ac, NE.U.A.c, o NANA) . Un segundo miembro de la familia es ácido N-glicolili-neuramínico (Neu5Gc or NeuGc) en donde el grupo N-acetilo de NE.U.A.c está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia de ácido siálico es ácido 2-ceto-3-deoxi-nonulosonico (KDN) (Nadano et al . (1986) J. Biol . Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al . , J. Biol . Chem. 265:21811-21819 (1990)).

También se incluyen ácidos siálicos 9 substituidos tales como 9-O-Ci-Cg acil-Neu5Ac like 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-deoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-deoxy-Neu5Ac . Para revisión de la familia de ácido siálico, ver por ejemplo Varki , Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemisty, Metabolism y Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)) . La síntesis y uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se describe en la solicitud internacional WO 92/16640 publicada en octubre 1, 1992. [0107] Un "substrato aceptor" para una glicosiltransferasa es una porción oligosacárido que puede actuar como un aceptor para una glicosiltransferasa particular. Cuando el substrato aceptor se contacta con la glicosiltransferasa correspondiente y substrato donador de azúcar, y otros componentes de mezcla de reacción necesarios y la mezcla de reacción se incuba por un periodo de tiempo suficiente, la glicosiltransferasa transfiere residuos de azúcar del substrato donador de azúcar al substrato aceptor. El substrato aceptor a menudo variará para diferentes tipos de glicosiltransferasa particular. Por ejemplo, el substrato aceptor para una galactósido 2-L-fucosiltransferasa de mamífero ( a 1, 2 fucosiltransferasa) incluirá una Gal/?1, 4-GlcNAc-R en un extremo no reductor de un oligosacárido; esta fucosiltransferasa conecta un residuo fucosa al Gal mediante un enlace a l , . Gal/?1, 4-GlcNAc-R y Gal ?1 , 3-GlcNAc-R terminales y sus análogos sialilados, son substratos aceptores para a 1 , 3 y 1,4-fucosiltransferasa, respectivamente. Estas enzimas sin embargo conectan el residuo fucosa al residuo GlcNAc del substrato aceptor. De acuerdo con esto, el término "substrato aceptor" se toma en contexto con la glicosiltransferasa particular de interés para una aplicación particular. Substratos aceptores para glicosiltransferasa tradicionales aquí se describen. Substratos aceptores también incluyen por ejemplo, péptidos, proteínas, glicopéptidos y glicoproteínas. [0108] Un "substrato donador" para glicosiltransferasas es un azúcar de nucleótido activada. Estos azúcares activados en general consisten de derivados uridina, guanosina y citidina monofosfato de los azúcares (UMP, GMP y CMP respectivamente) o derivados difosfato de los azúcares (UDP, GDP y CDP respectivamente) en donde el nucleósido monofosfato o difosfato sirven como un grupo saliente. Por ejemplo, un substrato donador para fucosiltransferasas es GDP-fucosa. Substratos donadores para sialiltransferasas por ejemplo son nucleótidos de azúcar activados que comprenden el ácido siálico deseado. Por ejemplo, en el caso de NE.U.A.c, la azúcar activada es CMP-NE .U.A. c . Otros substratos donadores incluyen, por ejemplo GDP mannosa, UDP-galactosa, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-NE .U.A. c-PEG (también referido como CMP ácido siálico PEG) UDP-N-acetilglucosamina, UDP-glucosa, UDP ácido glucorionico, y UDP-xilosa. Azúcares incluyen por ejemplo NE.U.A.c, mannose, galactosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, glucosa, ácido glucoriónico y xilosa. Sistemas bacterianos de plantas y fúngales en ocasiones se utilizan otros azúcares nocleótido activados. [0109] Un "método para remodelar una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido" como se emplea aquí, se refiere a la adición de un residuo azúcar a una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido, utilizando una glicosiltransferasa. En una modalidad preferida, el residuo azúcar se conecta covalentemente a una molécula PEG. [0110] Una "glicosiltransferasa eucariótica" como se emplea aquí, se refiere a una enzima que se deriva de un organismo eucariótico y que cataliza la transferencia de un residuo azúcar de un substrato donador, es decir un azúcar de nucleótido activada con un substrato aceptor, por ejemplo un oligosacárido, un glicolípido, un péptido, una proteína, un glicopéptido o una glicoproteína. En modalidades preferidas, una glicosiltransferasa eucariótica transfiere un azúcar de un substrato donador a un péptido, una proteína, un glicopéptido o una glicoproteína. En otra modalidad preferida, una glicosiltransferasa eucariótica es una glicosiltransferasa de transmembrana tipo II . Una glicosiltransferasa eucariótica puede derivarse de un organismo eucariótico, por ejemplo, un organismo eucariótico multicelular, una planta, un animal invertebrado tal como Drosophila o C. elegans, un animal vertebrado, un anfibio o reptil, un mamífero, un roedor, un primate, un humano, un conejo, una rata, un ratón, una vaca o un cerdo y así en adelante. [0111] Una "N-acetilglucosaminiltransferasa eucariótica I (GnTI or GNTI) " como se emplea aquí, se refiere a una ß -1 , 2 -N-acetilglucosaminiltransferasa I aislada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de N- acetilglucosamina (GIc?Ac) de un donador a una molécula aceptora que comprende un azúcar mannosa. Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, GnTI tiene un dominio de transmembrana, una región raíz, y un dominio catalítico. Las proteínas GnTI eucarióticas incluyen, por ejemplo de humano, número de acceso ?P_002397; de hámster chino, número de acceso AAK61868; de conejo, número de acceso AAA31493; rata, número de acceso ?P_110488; de hámster dorado, número de acceso AAD04130; de ratón, número de acceso P27808; de pez cebra, número de acceso AAH58297; Xenopus, número de acceso CAC51119; Drosophila, número de acceso NP_525117; Anópheles, número de acceso XP_315359; C. elegans, número de acceso NP_497719; Phsycomi trella patens , número de acceso CAD22107; Solarium tuberosum, número de acceso CAC80697; Nicotiana tabacum, número de acceso CAC80702; Oryza sativa, número de acceso CAD30022; Nicotiana benthamiana, número de acceso CAC82507 y Arabidopsis thaliana, número de acceso NP_195537, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. [0112] Una "N-acetilgalactosaminil transf erasa eucariótica (GalNAcT) " como se emplea aquí, se refiere a una N-acetilgalactosaminil transf erasa aislada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de N-acetilgalactosamina (GalNAc) de una UDP-GalNAc de un donador a una molécula aceptora. Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas GalNAcT tienen un dominio de transmembrana, una región raíz y un dominio catalítico. Una cantidad de enzimas se han aislado y caracterizado, por ejemplo GalNAcTI, número de acceso X85018; GalNAcT2 , número de acceso X85019 (ambas descritas por White et al . , J. Biol. Chem. 270: 24156-24165 (1995)); y GalNAcT3 , número de acceso X92689 (descrita por Bennett et al . , J. Biol . Chem . 271: 17006-17012 (1996) , cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia.

[0113] Una " ß - 1 , 4-galactosiltransferasa eucariótica" como se emplea aquí, se refiere a una ß-1 , 4-galactosiltransferasa aislada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de galactosa de un donador UDP-Gal a una molécula aceptora. Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas de GalTl tienen un dominio de transmembrana, una región raíz y un dominio catalítico. Una cantidad de enzimas GalTl se han aislado y caracterizado, por ejemplo la secuencia bovina de longitud íntegra D'Agostaro et al . , Eur. J. Biochem . 183: 211-217 (1989) y el número de acceso CAA32695, cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia. [0114] Una " a ( 2 , 3) sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal3)" como se emplea aquí, se refiere a una a (2 , 3) sialiltransferasa aislada de un organismo eucariótico. Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico a Gal de un glicósido Gal ß1 , 3GlcNAc, Gal l,3GalNAc o Gal l,4GlcNAc glycoside (ver Wen et al . (1992) J". Biol . Chem . 267: 21011; Van den Eijnden et al . (1991) J. Biol . Chem . 256: 3159). El ácido siálico está enlazado a Gal con la formación de un a -enlace entre los dos sacáridos. La unión (enlace) entre los sacáridos es entre la posición 2 de NE.U.A.c y la posición 3 de Gal. Con otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas ST3GalIII tienen un dominio de transmembrana, una región raíz y un dominio catalítico. Esta enzima particular puede aislarse de hígado de rata (Weinstein et al . (1982) J. Biol . Chem . 257: 13845); de ADNc humano (Sasaki et al. (1993) J\ Biol . Chem . 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol . Chem. 269: 1394-1401) y secuencias de ADN genómicas (Kitagawa et al . (1996) J. Biol . Chem . 271: 931-938) son conocidas, facilitando la producción de esta enzima por expresión recombinante. RatST3GalIII de rata se ha clonado y la secuencia se conoce. Ver por ejemplo Wen et al . , J. Biol . Chem . 267: 21011-21019 (1992) y número de acceso M97754, cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia. [0115] Una a -N-acetilgalactosaminida a-2,6-sialiltransferasa I eucariótica (ST6GaINAcTl) como se emplea aquí se refiere a una a -2 , 6-sialiltransferasa aislada de una raíz eucariótica. La enzima cataliza la transferencia de ácido siálico de un donador CMP ácido siálico a una molécula aceptora. La transferencia es un a-2,6- enlace con N-acetilgalactosamina-O-Thr/Ser . Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas ST6GalNAcTl tienen un dominio transmembrana, una región raíz y un dominio catalítico. Una cantidad de enzimas ST6GalNAcTl se han aislado y caracterizado, por ejemplo la secuencia de ratón de longitud íntegra, Kurosawa et al . , J. Biochem . 127: 845-854 (2000) y número de acceso JC7248, cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia. Otra secuencia de aminoácidos ST6GalNAcTl ejemplares se encuentran en la figura 38. [0116] Una gal ?l,3GalNac a 2 , 3sualiltransferasa eucariótica (ST3GalI) como se emplea aquí, se refiere a gal ?l,3GalNAc G.2,3-sialiltransferasa aislada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de ácido siálico de un donador CMP-ácido siálico a una molécula acpetora. La transferencia es un o; 2, 3 enlace a N-acetilgalactosamina-O-Thr/Ser. Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas ST3GalI tienen un dominio transmembrana, una región raíz y un dominio catalítico. Un número de enzimas ST3GalI se han empleado y, por ejemplo la secuencia porcina de longitud íntegra, Gillespie et al . , J. Biol . Chem . 267: 21004-21010 (1992) y número de acceso A45073 cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia. [0117] Una galactosiltransferasa núcleo 1 eucariótica (Core 1 GalTl), como se emplea aquí, se refiere a una proteína con actividad Core 1 ß l X galacotsiltransferasa. Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas Core 1 GalTl tienen un dominio transmembrana, una región raíz, y un dominio catalítico.

Una cantidad de enzimas Core 1 GalTl se han aislado y caracterizado, por ejemplo las secuencias Drosophila y humana de las figuras 41 y 42. La proteína humana se caracteriza en Ju et al . , J. Biol . Chem. 277 (1), 178-186 (2002), que aquí se incorpora por referencia para todos los propósitos . [0118] Un "residuo cisteína no apareado" como se emplea aquí, se refiere a un residuo cisteína que en una proteína correctamente replegada (es decir, una proteína por actividad biológica) no forma un enlace de sulfuro con otro residuo cisteína. [0119] Una "glicosiltransferasa insoluble" se refiere a una glicosiltransferasa que se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos. Glicosiltransferasas insolubles típicamente se solubilizan o desnaturalizan utilizando por ejemplo detergentes o agentes caotrópicos o alguna combinación. "Replegamiento" se refiere a un proceso de restaurar estructura de una glicosiltransferasa biológicamente activa a una glicosiltransferasa que se ha solubilizado o desnaturalizado. De esta manera, un amortiguador de replegamiento se refiere a un amortiguador que mejora o acelera el replegamiento de una glicosiltransferasa. [0120] "Un par redox" se refiere a una mezcla de reactivos tiol reducidos y oxidados e incluye reducidos y oxidados glutationa (GSH/GSSG) cisteína/cistina, cisteamina/cistamina, DTT/GSSG, y DTE/GSSG. (ver e . g . , Clark, Cur . Op . Biotech . 12: 202-207 (2001) ) . [0121] El término "contactar" se emplea aquí en forma intercambiable con lo siguiente: combinado con, agregado a, mezclado con, pasado a, incubado con, con flujo sobre, etc. [0122] El término "PEG" se refiere a poli (etilen glicol) . PEG es un polímero ejemplar que se ha conjugado en péptidos. El uso de PEG para derivatizar terapéuticos de péptido se ha mostrado para reducir la inmunogenicidad de los péptidos y prolongar el tiempo de liberación en la circulación. Por ejemplo, la patente de los E.U.A. número 4,179,337 (Davis et al . ) se refiere a péptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas péptido acopladas con polietilen glicol (PEG) o polipropilen glicol. Entre 10 y 100 moles de polímeros se emplean por mol de péptido y se mantiene al menos 15 por ciento de la actividad fisiológica. [0123] El término "actividad específica" como se emplea aquí, se refiere a la actividad catalítica de una enzima, por ejemplo una proteína de fusión glicosiltransferasa recombinante de la presente invención, y puede expresarse en unidades de actividad.

Como se emplea aquí, una unidad de actividad cataliza la formación de un µmol de producto por minuto a una temperatura determinada (por ejemplo a 37 grados C) y valor de pH (por ejemplo a pH 7.5) . De esta manera 10 unidades de enzima es una cantidad catalítica de esta enzima en donde 10 µmoles de substrato se convierte en una 10 µmoles de producto en un minuto a una temperatura por ejemplo de 37 grados C y un valor de pH de por e emplo 7.5. [0124] Oligosacáridos "N-enlazados" son aquellos oligosacáridos que se enlazan a una estructura principal péptido a través de asparagina, medíante un enlace asparagina-N-acetilglucosamina . Oligosacáridos N-enlazados también se denominan "N-glicanos" . Todos los oligosacáridos N-enlazados tienen un núcleo pentasacárido común de Man3GlcNAc2. difieren en la presencia de, y en el número de ramificaciones (también denominadas antenas) de azúcares periféricos tales como N-acetilglucosamina, galactosa, N-acetilgalactosamina, fucosa y ácido siálico. Opcionalmente, esta estructura también puede contener una molécula núcleo fucosa y/o una molécula xilosa. [0125] Oligosacáridos "O-enlazados" son aquellos oligosacáridos que se enlazan a una estructura principal péptido a través de treonina, serina, hidroxiprolina, tirosina u otros aminoácidos que contienen hidroxi . [0126] Una "glícoforma substancialmente uniforme" o un "patrón de glicosilación sustancialmente uniforme" cuando se refiere a una especie de glicoproteína, se refiere al por ciento de sustratos aceptores que se glicosilan por la glicosiltransferasa de interés (por ejemplo fucosiltransferasa) . Se entenderá por una persona con destreza en la técnica que el material de partida puede contener sustratos aceptores glicosilados . De esta manera la cantidad calculada de glicosilación incluirá sustratos aceptores que se glicosilan por los métodos de la invención, así como aquellos sustratos aceptores ya glicosilados en el material de partida. [0127] El término "actividad biológica" se refiere a una actividad enzimática de una proteína. Por ejemplo, la actividad biológica de una sialiltransferasa se refiere a la actividad de transferir una porción de ácido siálico de una molécula donadora a una molécula aceptora. Actividad biológica de una GalNAcT2 se refiere a la actividad de transferir una porción N-acetilgalactosamina de una molécula donadora a una molécula aceptora. Para proteínas Gal?AcT2 , una molécula aceptora puede ser una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido. Actividad biológica de una proteína GhTl se refiere a la actividad de transferir una porción N-acetilglucosamina de una molécula donadora a una molécula aceptora. Actividad biológica de una galactosiltransferasa, se refiere a la actividad de transferir una porción galactosa de una molécula donadora a una molécula aceptora . [0128] "Escala comercial" se refiere a una producción a escala de gramos de un producto sacárido en una sola reacción. En modalidades preferidas, escala comercial se refiere a la producción mayor de aproximadamente 50, 75, 80, 90 o 100, 125, 150, 175, o 200 gramos. [0129] El término "substancialmente" en las definiciones anteriores de "substancialmente uniforme", en general significa que se glicosilan al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o más de preferencia al menos aproximadamente 90%, y aún más de preferencia al menos aproximadamente 95% de los sustratos aceptores para una glicosiltransferasa particular. [0130] El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan en una forma similar a los aminoácidos de origen natural . Aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que posteriormente se modifican, por ejemplo hidroxiprolina, ? -carboxiglutamato y 0-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que los aminoácidos de origen natural , es decir un carbono que se liga a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo norleucina) o estructuras principales péptido modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural . Miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una forma similar a un aminoácido de origen natural . [0131] "Proteína", "polipéptido" o "péptido" se refieren a un polímero en donde los monómeros son aminoácidos y se reúnen en conjunto a través de enlaces amida, referidos en forma alterna como un polipéptido. Cuando los aminoácidos son a -aminoácidos, pueden emplearse ya sea el isómero L óptico o el isómero D óptico. Adicionalmente, aminoácidos no naturales, por ejemplo .-alanina, fenilglicina y homoarginina también se incluyen. Aminoácidos que no son de codificación de genes también pueden emplearse en la presente invención. Además, aminoácidos que se han modificado para incluir grupos reactivos también pueden emplearse en la invención. Todos los aminoácidos empleados en la presente invención pueden ser el D- o L-isómero. Los L-isómeros en general se prefieren. Además, otros peptidomiméticos son también útiles en la presente invención. Para una revisión general ver Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ÁCIDOS, PÉPTIDOS AND PROTEÍNAS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983) . [0132] El término "recombinante" cuando se emplea con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificada por un ácido nucleico heterólogo. Células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Células recombinantes también pueden contener genes que se encuentran en la forma nativa de las células en donde los genes se modifican y reintroducen en la célula por medios artificiales . El término también abarca células que contienen un ácido nucleico endógeno para la célula que se ha modificado sin retirar el ácido nucleico de la célula; estas modificaciones incluyen aquellas que se obtienen por reemplazo de genes, mutación específica de sitio y técnicas relacionadas . Una "proteína recombinante" es aquella que se ha producido por una célula recombinante. En modalidades preferidas, una glicosiltransferasa eucariótica recombinante se produce por una célula bacteriana recombinante. [0133] Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína que comprende secuencias de aminoácidos que están además de, en lugar de, menos que, y/o diferentes de las secuencias de aminoácidos que codifican la proteína de longitud íntegra original o nativa o sus subsecuencias . [0134] Componentes de proteínas de fusión incluyen "enzimas de accesorio" y/o "etiquetas de purificación" . Una "enzima de accesorio" como se refiere aquí, es una enzima que se involucra en catalizar una reacción que, por ejemplo forma un sustrato para una glicosiltransferasa. Una enzima de accesorio puede por ejemplo catalizar la formación de un azúcar nucleótido que se utiliza como una porción donadora por una glicosiltransferasa. Una enzima accesorio también puede ser aquella que se utiliza en la generación de un trifosfato nucleótido requerido para la formación de un azúcar nucleótido, o en la generación del azúcar que se incorpora en el azúcar nucleótido. La proteína de fusión recombinante de la invención puede construirse y expresarse como una proteína de fusión con una "etiqueta de purificación" molecular en un extremo, que facilita la purificación de la proteína. Estas etiquetas también pueden emplearse para inmovilización de una proteína de interés durante la reacción de glicosilación. Etiquetas convenientes incluyen "etiquetas epítopo", que son una secuencia de proteína reconocida específicamente por un anticuerpo . Etiquetas epítopo en general se incorporan en proteínas de fusión, para permitir el uso de un anticuerpo fácilmente disponible, para detectar o aislar en forma no ambigua la proteína de fusión. Una "etiqueta FLAG" es una etiqueta epítopo comúnmente empleada, específicamente reconocida por un anticuerpo anti-FLAG monoclonal, que consiste de la secuencia AspTyrLysAspAspAspAspLys (SEQ ID NO: 66) o su variante sustancialmente idéntica. Otras etiquetas convenientes se conocen por aquellos con destreza en la técnica e incluyen por ejemplo una etiqueta de afinidad tal como una péptido hexahistidina (SEQ ID NO: 67), que ligará a iones de metal tales como iones níquel o cobalto. Proteínas que comprenden etiquetas de purificación pueden purificarse utilizando un socio de enlace que liga la etiqueta de purificación, iones níquel o cobalto o resinas, y amilasa, maltosa o una ciclodextrina. Etiquetas de purificación también incluyen dominios de enlace de almidón, dominios tioredoxina E. coli (vectores y anticuerpos comercialmente disponibles por ejemplo de Santa Cruz Biotechnology, Inc. y Alpha Diagnostic International, Inc.), y la mitad carboxi-terminal de la proteína SUMO (vectores y anticuerpos comercialmente disponibles de por ejemplo Life Sensors Inc.) Dominios de enlace maltosa de preferencia se emplean por su habilidad para mejorar ligamiento de glicosiltransferasas eucarióticas insolubles, pero también pueden emplearse para ayudar la purificación de una proteína de fusión. Purificación de proteínas de dominio de enlace maltosa se conoce por aquellos con destreza en la técnica. Dominios de enlace almidón se describen en WO 99/15636, aquí incorporada por referencia. La purificación de afinidad de una proteína de fusión que comprende un dominio de enlace almidón utilizando una resina betaciclodextrina (BCD) se describe en la solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 60/468,374, presentada en mayo 5, 2003, aquí incorporada por referencia totalmente. [0135] El término "dominio funcional" con referencia a glicosiltransferasas, se refiere a un dominio de la glicosiltransferasa que confiere o modula una actividad de la enzima, por ejemplo especificidad de sustrato aceptor, actividad catalítica, afinidad de enlace, localización dentro del aparato de Golgi, anclado a una membrana celular u otra actividad biológica o bioquímica. Ejemplos de dominios funcionales de glicosiltransferasas incluyen pero no están limitados al dominio catalítico, región raíz y dominio de ancla-señal. [0136] El término "nivel de expresión" con referencia a una proteína, se refiere a la cantidad de una proteína producida por una célula. La cantidad de proteína producida por una célula puede medirse por los ensayos y unidades de actividad descritos aquí o conocidos por una persona con destreza en la técnica. Una persona con destreza en la técnica sabrá cómo medir y describir la cantidad de proteína producida por una célula, utilizando una variedad de ensayos y unidades respectivamente. De esta manera, la cuantificación y descripción cuantitativa del nivel de expresión de una proteína, por ejemplo una glicosiltransferasa, no se limita a los ensayos empleados para medir la actividad o las unidades utilizadas para describir la actividad, respectivamente. La cantidad de proteína producida por una célula puede determinarse por ensayos conocidos estándar, por ejemplo el ensayo de proteína por Bradford (1976) , el equipo de ensayo de proteína ácido bicinchonínico de Pierce (Rockford, Illinois) o como se describe en la patente de los E.U.A. número 5,641,668. [0137] El término "actividad enzimática" se refiere a una actividad de una enzima y puede medirse por los ensayos y unidades aquí descritos o conocidos por un apersona con destreza en la técnica. Ejemplos de la actividad de una glicosiltransferasa, incluyen pero no están limitados a aquellos asociados con los dominios funcionales de la enzima, por ejemplo especificidad de sustrato aceptor, actividad catalítica, afinidad de enlace, localización dentro del aparato de Golgi, anclado a una membrana celular u otra actividad biológica o bioquímica. [0138] Una "región raíz" con referencia a glicosiltransferasas, se refiere a un dominio de proteína o una sub-secuencia de la misma, que en las glicosiltransferasas nativas se localiza adyacente al dominio de transmembrana, y se ha reportado que funciona como una señal de retención para mantener la glicosiltransferasa en el aparato de Golgi y como un sitio de escisión proteolítica. Regiones raíz en general empiezan con el primer aminoácido hidrofílico siguiendo al dominio de transmembrana hidrofóbico y terminan en el dominio catalítico, o en algunos casos el primer residuo cisteína después del dominio de transmembrana. Regiones raíz ejemplares incluyen pero no están limitadas a la región raíz de fucosiltransferasa VI, residuos aminoácidos 40-54; la región raíz de GnTl de mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 36 a aproximadamente 103 (ver por ejemplo la enzima humana); la región raíz de GalTl de mamíferos, residuos aminoácidos de aproximadamente 71 a aproximadamente 129 (ver por ejemplo la enzima bovina) ; la región raíz de T3GalIII de mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 29 a aproximadamente 84 (ver por ejemplo la enzima de rata) ; la región raíz de CorelGalTl de invertebrados, residuos aminoácidos de aproximadamente 36 a aproximadamente 102 (ver por ejemplo la enzima Drosophila) ; la región raíz de CorelGalTl de mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 32 a aproximadamente 90 (ver por ejemplo la enzima humana); la región raíz de ST3Gall de mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 28 a aproximadamente 61 (ver por ejemplo la enzima porcina) o para los residuos aminoácidos de enzima humana de aproximadamente 18 a aproximadamente 58; la región raíz de ST6GalNAcI en mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 30 a aproximadamente 207 (ver por ejemplo la enzima murina) , aminoácidos 35-278 para la enzima humana o aminoácidos 37-253 para la enzima de pollo; la región raíz de GalNAcT2 en mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 71 a aproximadamente 129 (ver por ejemplo la enzima de rata) . [0139] Un "dominio catalítico" se refiere a un dominio de proteína, o su sub-secuencia, que cataliza una reacción enzimática realizada por la enzima. Por ejemplo, un dominio catalítico de una sialiltransferasa incluirá una sub-secuencia de la sialiltransferasa, suficiente para transferir un residuo de ácido siálico de un donador a un sacárido aceptor. Un dominio catalítico puede incluir toda una enzima, una sub-secuencia de la misma, o puede incluir secuencias de aminoácidos adicionales que no se conectan a la enzima, o una subsecuencia de la misma como se encuentra en la naturaleza. Una región catalítica ejemplar, es pero no está limitada al dominio catalítico de fucosiltransferasa VII, residuos aminoácidos 39-342; el dominio catalítico de GnTl en mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 104 a aproximadamente 445 (ver por ejemplo la enzima humana) ; el dominio catalítico de GalTl en mamíferos, residuos aminoácidos de aproximadamente 130 a aproximadamente 402 (ver por ejemplo la enzima bovina) ; y el dominio catalítico de ST3GalIII de mamífero, residuos aminoácidos de aproximadamente 85 a aproximadamente 374 (ver por ejemplo la enzima de rata) . Dominios catalíticos y mutantes de truncado de proteínas GalNAcT2 se describen en la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/576,530 presentado en junio 3, 2004; y en la solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de expediente de agente 040853-01-5149-P 1, presentado en agosto 3, 2004; ambas de las cuales aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos. Dominios catalíticos también pueden identificarse por alineamiento con glicosiltransferasas conocidas . [0140] Una "sub-secuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprenden una parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo proteína) respectivamente. [0141] Un "truncado de glicosiltransferasa" o una "glicosiltransferasa truncada" o variantes gramaticales de las mismas, se refieren a una glicosiltransferasa que tiene menos residuos aminoácido que una glicosiltransferasa de origen natural, pero retienen actividad enzimática. Glicosiltransferasas truncadas incluyen por ejemplo enzimas GnTl truncadas, enzimas GalTl truncadas, enzimas ST3GalIII truncadas, enzimas GalNAcT2 truncadas, enzimas Core 1 GalTl truncadas, residuos aminoácido de aproximadamente 32 a aproximadamente 90 (ver por ejemplo la enzima humana) ; enzimas ST3Gall truncadas, enzimas ST6GalNAcI truncadas y enzimas GalNAcT2 truncadas . Cualquier cantidad de residuos aminoácidos pueden eliminarse siempre que la enzima retenga actividad. En algunas modalidades, dominios o porciones de dominios pueden eliminarse, por ejemplo un dominio de ancla-señal puede eliminarse dejando un truncado que comprende una región raíz, y un dominio catalítico; un dominio de ancla-señal y una porción de una región raíz pueden eliminarse dejando un truncado que comprende una región raíz restante y un dominio catalítico; o un dominio de ancla-señal y una región raíz pueden eliminarse dejando un truncado que comprende un dominio catalítico. [0142] El término "ácido nucleico" se refiere a deoxribonucleótido o polímero ribonucleótido ya sea en una forma de una sola o doble hebra, y a menos que se limite de otra forma, abarca análogos conocidos o de nucleótidos naturales que hibridizan ácidos nucleicos en una forma similar a nucleótidos de origen natural . A menos que se indique de otra forma, una secuencia de ácido nucleico particular incluye su secuencia complementaria . [0143] Un "cásete de expresión recombinante" o simplemente un "cásete de expresión" es una construcción de ácido nucleico, generada en forma recombinante o sintética, con elementos de ácido nucleico que son capaces de afectar la expresión de un gen estructural en anfitriones compatibles con estas secuencias . Casetes de expresión incluyen cuando menos promotores y opcionalmente señales de terminación de transcripción. Típicamente el cásete de expresión recombinante incluye un ácido nucleico a transcribirse (por ejemplo un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado) , y un promotor. Factores adicionales necesarios o que ayudan para efectuar la expresión también pueden emplearse como aquí se describe. Por ejemplo, un cásete de expresión también puede incluir secuencias de nucleótido que codifican una secuencia de señal que dirige la secreción de una proteína expresada de la célula anfitriona. Señales de terminación de transcripción, mejoradores y otras secuencias de ácido nucleico que influencian la expresión de gen también pueden incluirse en un cásete de expresión. En modalidades preferidas, un cásete de expresión recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos comprende una glicosiltransferasa eucariótica, se expresa en una célula anfitriona bacteriana. [0144] Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", como se emplea aquí, es aquel que se origina de una fuente ajena a la célula anfitriona particular, o de la misma fuente, se modifica de su forma original. De esta manera, un gen de glicoproteína heteróloga en una célula anfitriona eucariótica incluye un gen que codifica glicoproteína que es endógeno a la célula anfitriona particular que se ha modificado. La modificación de la secuencia heteróloga puede ocurrir por ejemplo por tratamiento del ADN con una enzima de restricción, para generar un fragmento de ADN que es capaz de enlazarse operativamente con el promotor. Técnicas tales como mutagénesis dirigida por sitio también son útiles para modificar una secuencia heteróloga. [0145] El término "aislado" se refiere a material que sustancial o esencialmente está libre de componentes que interfieren con la actividad de una enzima. Para un sacárido, proteína o ácido nucleico de la invención, el término "aislado" se refiere a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan el material como se encuentra en su estado nativo. Típicamente, un sacárido, proteína o ácido nucleico aislado de la invención es al menos aproximadamente 80% puro, usualmente al menos aproximadamente 90%, y de preferencia al menos aproximadamente 95% puro, como se mide por intensidad de banda en un gel teñido con plata u otro método para determinar pureza. La pureza u homogeneidad pueden indicarse por un número de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína o ácido nucleico en una muestra puede ser resuelto por gel de electroforesis en gel de poliacrilamida, y después la proteína o ácido nucleico puede visualizarse por tinción. Para ciertos propósitos puede ser conveniente alta resolución de la proteína o ácido nucleico y HPLC o un medio similar para purificación por ejemplo podrá emplearse. [0146] El término "enlazado operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, secuencia de señal o conjunto de sitios de enlace de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión afecta transcripción y/o traducción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia. [0147] Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de proteína o ácidos nucleicos, se refiere a dos o más secuencias o sub-secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de amino ácido o nucleótidos que son el mismo, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. [0148] La frase "substancialmente idéntico" en el contexto de dos proteínas o ácidos nucleicos, se refiere a dos o más secuencias o sub-secuencias que tienen cuando menos más de aproximadamente 60% de identidad de secuencia de amino ácido o ácido nucleico, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, de preferencia 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de residuos amino ácidos o nucleótidos, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. De preferencia, la identidad substancial existe sobre una región de las secuencias que es al menos de aproximadamente 50 residuos de longitud, más preferible sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y más preferible las secuencias son substancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son substancialmente idénticas sobre toda la longitud de las regiones de codificación. [0149] Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan secuencias de prueba.

Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, secuencias de prueba y referencia se alimentan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, de ser necesario y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces el por ciento de identidad de secuencia para la o las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa designados. [0150] Alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede conducirse por ejemplo por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math . 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48: 443 (1970) , por la búsqueda por el método de similaridad de Pearson & Lipman, Proc . Nat 'l . Acad. Sci . USA 85: 2444 (1988) , por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr . , Madison, Wl), o por inspección visual (ver en general, Cur-rent Protocols in Molecular Biology, F . M. Ausubel et al . , eds., Current Protocols, a joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1995) (Ausubel)).

[0151] Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen por Altschul et al . (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410 y Altschuel et al . (1977) Nucleic Acids Res . 25: 3389-3402, respectivamente. Programa para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través de National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencias de alta calificación (HSPs) al identificar palabras cortas con longitud W en la secuencia de consulta, que ya corresponden o satisfacen alguna calificación umbral de valor positivo T alineada con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos . T se refiere como el umbral de calificación de palabra vecina (Altschul et al , supra) . Estos aciertos de palabra vecinos iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los aciertos de palabras después se extienden en ambas direcciones sobre cada secuencia tan lejos como la calificación de alineamiento acumulativo pueda incrementarse. Calificaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (calificación de recompensa para un par de residuos de correspondencia; siempre > 0) y N (calificación de penalidad para residuos de apareamientos incorrectos; siempre < 0) . Para las secuencias de amino ácidos, una matriz de calificación se utiliza para calcular la calificación acumulativa. La extensión de aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la calificación de alineamiento acumulativo disminuye en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la calificación acumulativa pasa a cero o inferior, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo de calificación negativa; o se alcanza el fin de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST, W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras . Para secuencias de amino ácidos, el programa BLASTP utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 89: 10915 (1989) ) . [0152] Además de calcular el por ciento de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (ver, por ejemplo Karlin & Altschul, Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una correspondencia entre dos secuencias nucleótido o amino ácidos ocurrirá al azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.1, más preferiblemente menor a aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menor a aproximadamente 0.001. [0153] Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido o proteínas son substancialmente idénticas es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico es inmunológicamente de reacción cruzada con la proteína codificada por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. De esta manera, una proteína típica es substancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo en donde los dos péptidos difieren solo por substituciones conservadoras . Otra indicación que dos secuencias de ácidos ácido son substancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridizan entre sí bajo condiciones estrictas, como se describe a continuación. [0154] La frase "que hibridiza específicamente a" se refiere al enlace, duplejado o hibridización de una molécula solo a una secuencia de nucléotidos particular bajo condiciones estrictas, cuando esta secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, total celular) ADN o ARN. [0155] El término "condiciones estrictas" se refiere a condiciones en las cuales una sonda hibridizará a su sub-secuencia diana, pero no a otras secuencias. Condiciones estrictas dependen de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias . Secuencias más largas hibridizan específicamente a superiores temperaturas. En general, condiciones estrictas se eligen para ser de aproximadamente 15 grados C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica y pH definidos . La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) en la cual 50% de las sondas complementarias con la secuencia diana hibridizan a la secuencia diana en equilibrio. (Como las secuencias diana generalmente están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Típicamente, condiciones estrictas serán aquellas en donde la concentración de sal es menos que aproximadamente 1.0 M de ion Na, típico aproximadamente 0.01 a 1.0 M concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 grados C para cortas sondas (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 grados C para sondas largas (por ejemplo mayores a 50 nucleótidos) . Condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridización selectiva o específica, una señal positiva típicamente es al menos dos veces el fondo, de preferencia 10 veces hibridización de fondo. Condiciones de hibridización estrictas ejemplares pueden ser como sigue: 50% de formamida, SSC 5x, y SDS 1%, incubar a 42 grados C, o SSC 5x, SDS 1%, incubar a 65 grados C, con lavado en SSC 0.2x, y SDS 0.1% a 65 grados C. Para PCR, una temperatura de aproximadamente 36 grados C es típica para amplificación de baja severidad, aunque temperaturas de fijado pueden variar de entre aproximadamente 32-48 grados C, dependiendo de la longitud del cebador. Para amplificación PCR de alta severidad, típicamente una temperatura es de 62 grados C aproximadamente, aunque temperaturas de fijado de alta severidad pueden estar en el intervalo de aproximadamente 50 grados C a aproximadamente 65 grados C, dependiendo de la longitud y especificidad del cebador. Condiciones de ciclo típicas para amplificaciones de alta y baja severidad incluyen una fase de desnaturación de 90-95 grados C por 30-120 segundos, una fase de fijación que dura 30-120 segundos y una fase de extensión de aproximadamente 72 grados C por 1-2 min. Protocolos y guías para reacciones de amplificación de alta y baja severidad están disponibles, por ejemplo en Innis, et al. (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods y Applications Academic Press, N. Y. [0156] Las frases "liga específicamente una proteína" o "específicamente inmunoreactivo con", cuando se refieren a un anticuerpo, se refieren a una reacción de enlace que es determinante de la presencia de la proteína en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. De esta manera, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados ligan preferencialmente a una proteína particular y no ligan en una cantidad significante a otras proteínas presentes en la muestra. Enlace específico a una proteína bajo estas condiciones requiere un anticuerpo que se elige por su especificidad para una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoensayo puede emplearse para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, inmunoensayos ELISA de fase sólida se emplean rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína. Ver Harlow y Lañe (1988) Antihodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden emplearse para determinar inmunoreactividad específica. [0157] "Variaciones modificadas en forma conservadora" de una secuencia de polinucleótidos particular se refiere a aquellos polinucleótidos que codifican secuencias de amino ácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el polinucleótido no codifica una secuencia de amino ácidos, con secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG todos codifican el amino ácido arginina. De esta manera, en toda posición en donde se especifica una arginina por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar la proteína codificada. Estas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son una especie de "variaciones conservadoramenté modificadas" .

Toda secuencia de polinucleótidos aquí descrita que codifica una proteína también describe toda variación silenciosa posible, excepto cuando se anota de otra forma. Una persona con destreza reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina y UGG que ordinariamente es el único codón para triptofano) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica por técnicas estándar. De acuerdo con esto, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica una proteína es implícita en cada secuencia descrita. [0158] Además, una persona con destreza reconocerá que substituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un solo amino ácido o un pequeño porcentaje de amino ácidos (típicamente menor a 5%, más típicamente menor a 1%) en una secuencia codificada, son "variaciones modificadas en forma conservadora" en donde las alteraciones resultan en la substitución de un amino ácido con un amino ácido químicamente similar. Tablas de substitución conservadoras que proporcionan amino ácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. [0159] Una persona con destreza se apreciará que muchas variaciones conservadoras de proteínas, por ejemplo glicosiltransferasas, y ácido nucleico que codifica proteínas, dan por resultado esencialmente productos idénticos. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, "substituciones silenciosas" (es decir, substituciones de una secuencia de ácidos nucleicos que no resultan en una alteración en una proteína codificada) son una característica implicada de toda secuencia de ácidos nucleicos que codifica a un amino ácido. Como aquí se describe, secuencias de preferencia se optimizan para expresión en una célula anfitriona particular empleada para producir las glicosiltransferasas quiméricas (por ejemplo, levadura, humana, y semejantes) . Similarmente, "substituciones de amino ácidos conservadoras" en uno o unos cuantos amino ácidos en una secuencia de amino ácidos, se substituyen con diferentes amino ácidos con propiedades altamente similares (ver, la sección de definiciones, arriba), y también fácilmente identificado como ser altamente similar a una secuencia de amino ácido particular, o a una secuencia de ácidos nucleicos particular que codifica un amino ácido. Estas variaciones substituidas en forma conservadora de cualquier secuencia particular, son una característica de la presente invención. Ver también, Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman y Company. Además, substituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un amino ácido sencillo o un pequeño porcentaje de amino ácidos en una secuencia codificada son también "variaciones modificadas en forma conservadora" . [0160] La práctica de esta invención puede involucrar la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células anfitrionas, de preferencia células anfitrionas bacterianas . Técnicas de clonación molecular para lograr estos fines se conocen en la especialidad. Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vi tro adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes tales como vectores de expresión son bien conocidos por las personas con destreza en la especialidad. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas con destreza a través de muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Berger y Kimmel , Guide to Molecular Closiing Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) ; y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al . , eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1999 Supplement) (Ausubel) . Células anfitrionas convenientes para expresión de los polipéptidos recombinantes se conocen por aquellos con destreza en la especialidad e incluyen por ejemplo, células procarióticas, tales como E. coli , y células eucarióticas incluyendo células de insectos, mamíferos y fúngales (por ejemplo Aspergillus niger) . [0161] Ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a personas con destreza a través de métodos de amplificación in vi tro, incluyendo la reacción de cadena polimerasa (PCR) , la reacción de cadena ligasa (LCR) , Amplificación Q/?-replicasa y otras técnicas mediadas con RNA polimerasa y que se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel al igual que en Mullís et al. (1987) patente de los E.U.A. número 4,683,202; PCJ? Protocols A Guide to Methods y Applications (knis et al . eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis) ;Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al . (1989) Proc. Natl . Acad.

Sci . USA 86: 1173; Guatelli et al . (1990) Proc . Natl .

Acad . Sci . USA 87: 1874; Lomell et al . (1989) J. Clin .

Chem . 35: 1826; Landegren et al . (1988) Sci ence 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; y Barringer et al . (1990) Gene 89 : 117. Métodos mejorados de clonación de ácidos nucleicos amplificados in vi tro, se describen en Wallace et al . , patente de los E.U.A. Número 5,426,039. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Introducción. [0162] La presente invención proporciona condiciones para replegamiento de glicosiltransferasas eucarióticas que se expresan como proteínas insolubles en cuerpos de inclusión bacterianos. Amortiguadores de replegamiento que comprenden pares redox, se utilizan para mejorar el replegamiento de glicosiltransferasas eucarióticas insolubles. El replegamiento también puede mejorarse al fusionar un dominio de enlace maltosa con la glicosiltransferasa eucariótica insoluble. Para algunas glicosiltransferasas eucarióticas insolubles, el replegamiento también puede mejorarse por muta génesis dirigida en el sitio para retirar cisteínas no apareadas . Mejoras de replegamiento adicional pueden proporcionarse al truncar una glicosiltransferasa eucariótica para retirar por ejemplo un dominio de ancla-señal, un dominio de transmembrana y/o todo o una porción de una región raíz de la proteína. La invención también proporciona métodos para replegar más de una glicosiltransferasa en un solo recipiente, mejorando de esta manera el replegamiento de las proteínas e incrementando la eficiencia de la producción de proteínas. Las glicosiltransferasas eucarióticas replegadas pueden utilizarse para producir o remodelar polisacáridos, oligosacáridos, glicolípidos, proteínas, péptidos, glicopéptidos y glicoproteínas. Las glicosiltransferasas eucarióticas replegadas también pueden utilizarse para glico-modificación con polietilenglicol de proteínas, péptidos, glicopéptidos, o glicoproteínas como se describe en PCT/US02/32263 que aquí se incorpora por referencia para todos los propósitos. II. Replegamiento de glicosiltransferasas insolubles. [0163] Muchas proteínas recombinantes expresadas en bacterias, se expresan como agregados insolubles en cuerpos de inclusión bacterianos . Cuerpos de inclusión son depósitos de proteínas que se encuentran tanto en el espacio citoplásmico como periplásmico de bacterias. Ver Clark, Cur. Op . Biotech . 12:202-207 (2001) ) . Glicosiltransferasas eucarióticas frecuentemente se expresan en cuerpos de inclusión bacterianos. Algunas glicosiltransferasas eucarióticas son solubles en bacterias, es decir no se producen en cuerpos de inclusión, cuando solo el dominio catalítico de la proteína se expresa. Sin embargo, muchas glicosiltransferasas eucarióticas permanecen insolubles y se expresan en cuerpos de inclusión bacterianos, incluso si solo se expresa el dominio catalítico y métodos para replegamiento de estas proteínas para producir glicosiltransferasas activas se proporcionan aquí .

A. Condiciones para replegamiento de glicosiltransferasas activas . [0164] Para producir glicosiltransferasas eucarióticas activas de células bacterianas, se expresan glicosiltransferasas eucarióticas en cuerpos de inclusión bacterianos, las bacterias se recolectan, rompen y los cuerpos de inclusión se inflan y lavan. Las proteínas dentro de los cuerpos de inclusión se solubilizan entonces. La solubilización puede realizarse utilizando desnaturalizantes, por ejemplo cloruro de guanidina o urea; extremos de pH, tales como condiciones acídicas o alcalinas; o detergentes. [0165] Después de solubilización, se retiran desnaturalizantes de la mezcla de glicosiltransferasa. La relación de desnaturalizante puede realizarse por una variedad de métodos, incluyendo dilución en un amortiguador de replegamiento o métodos de intercambio de amortiguador . Métodos de intercambio de amortiguador incluyen diálisis, diafiltración, filtración en gel e inmovilización de proteínas en un soporte sólido. (Ver Clark, Cur. Op . Biotech . 12:202-207 (2001)). Cualquiera de los métodos anteriores puede combinarse para combinar desnaturalizantes . [0166] Formación de enlaces disulfuro en la glicosiltransferasa eucariótica se promueve por adición de un amortiguador de replegamiento que comprende un par redox. Pares redox incluyen glutationa reducida y oxidada (GSH/GSSG) , cisteína/cistina, cisteamina/cistamina, DTT/GSSG y DTE/GSSG. (Ver Clark, Cur. Op . Biotech . 12:202-207 (2001), que aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos). En algunas modalidades, pares redox se agregan en una proporción particular de componente reducido a oxidado, por ejemplo 1/20, 20/1, 1/4, 4/1, 1/10, 10/1, 1/2, 2/1, 1/5, 5/1, o 5/5. [0167] El replegamiento puede realizarse en amortiguadores a valores de pH en el intervalo desde por ejemplo 6.0 a 10.0. Amortiguadores de replegamiento pueden incluir otros adhesivos para mejorar el replegamiento, por ejemplo L-arginina (0.4-1M); PEG; bajas concentraciones de desnaturalizantes, tales como urea (1-2M) y cloruro de guanidina (0.5-1. 5 M) y detergentes por ejemplo Chaps , SDS, CTAB, laurel maltosida y Tritón X-100. [0168] El replegamiento puede ser sobre un periodo de tiempo determinado, por ejemplo por 1-48 horas, o durante la noche. El replegamiento puede realizarse de aproximadamente 4 grados C a aproximadamente 40 grados C incluyendo temperaturas ambiente .

[0169] Una proteína glicosiltransferasa eucariótica que comprende un dominio catalítico, se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos y después pliega utilizando los métodos anteriores . Glicosiltransferasas eucarióticas que comprenden todo o una porción de una región raíz y un dominio catalítico también pueden emplearse en los métodos descritos aquí, al igual que glicosiltransferasas eucarióticas que comprenden un dominio catalítico fusionado a una proteína MBP. [0170] Aquellos con destreza reconocerán que la proteína se ha replegado correctamente cuando la proteína replegada tiene actividad biológica detectable. Para una actividad biológica de glicosiltransferasa es la actividad para catalizar la transferencia de un substrato donador a un substrato aceptor, por ejemplo una ST3GalIII replegada es capaz de transferir ácido siálico a un substrato aceptor. Actividad biológica incluye por ejemplo actividades específicas de al menos 1, 2, 5, 7, o 10 unidades de actividad. La unidad se define como sigue: una unidad de actividad cataliza la formación de l /mol de producto por minuto a una temperatura determinada (por ejemplo 37 grados C) y un valor de pH (por ejemplo a pH 7.5) . De esta manera, 10 unidades de una enzima es una cantidad catalítica de esa enzima en donde 10 /moles de substrato se convierten en 10 /./moles de producto en un minuto a una temperatura de por ejemplo 37 grados C y un valor de pH de 7.5. [0171] En una modalidad, ST3GalIII eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína . [0172] En una modalidad, GnTl eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0173] En una modalidad, GalTl eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0174] En una modalidad, St3GalI eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redx, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0175] En una modalidad, St6GalNAcTI eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína .

[0176] En una modalidad, CoreGalITI eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0177] En una modalidad, GalNAcT2 eucariótica se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. B . Fusión de glicosiltransferasas eucarióticas a dominios de proteína de enlace mal tosa para mejorar repl egami ento . [0178] Dominios de proteína de enlace maltosa (MBP) típicamente se fusionan a proteínas para mejorar la solubilidad de la proteína con la célula. Ver por ejemplo Kapust y Waugh Pro . Sci . 8:1668-1674 (1999). Sin embargo, muchas glicosiltransferasas eucarióticas, incluyendo glicosiltransferasas eucarióticas truncadas, permanecen insolubles cuando se expresan en bacterias, incluso después de fusión a un dominio MBP. Sin embargo, esta aplicación describe que los dominios MBP pueden mejorar replegamientos de glicosiltransferasas eucarióticas insolubles después de solubilización de las proteínas por ejemplo de un cuerpo de inclusión. Dominios MBP de una variedad de fuentes bacterianas pueden utilizarse en la invención, por ejemplo Yersinia E. coli , Pyrococcus furiosus, Thermococcus li toralis, Thermatoga mari time, and Vibrio cholerae ver por ejemplo figura 43. En una modalidad preferida, una proteína MBP de E. coli se fusiona a una glicosiltransferasa eucariótica. Enlazadores aminoácido pueden colocarse entre el dominio MBP y la glicosiltransferasa. En otra modalidad preferida, el dominio MBP se fusiona al extremo amino de la proteína glicosiltransferasa. Los métodos anteriormente descritos pueden utilizarse para replegar las proteínas de fusión glicosiltransferasa MBP. [0179] En una modalidad, una proteína ST3GalIII eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0180] En una modalidad, una proteína GnTI eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0181] En una modalidad, una proteína GalTl eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína.

[0182] En una modalidad, una proteína St3GalI eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0183] En una modalidad, una proteína St6 GalNAcTI eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0184] En una modalidad, una proteína Core GalITI eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0185] En una modalidad, una proteína GalNAcT2 eucariótica se fusiona a un dominio MBP expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubiliza y repliega en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0186] Etiquetas aminoácido adicionales pueden agregarse a una fusión MBP-glicosiltransferasa. Por ejemplo, pueden agregarse etiquetas de purificación para mejorar la purificación de la proteína replegada. Etiquetas de purificación incluyen por ejemplo una etiqueta poliestidina, una glutationa S transferasa (GST) , una proteína de enlace almidón (SBP) , un dominio tioredoxina E. coli , una mitad terminal carboxi de la proteína SUMO, un epítopo FLAG, y un epítopo myc. Glicosiltransferasas replegadas pueden ser además purificadas utilizando un socio de enlace que liga a la etiqueta de purificación. En una modalidad preferida, una etiqueta MDP se fusiona a la glicosiltransferasa eucariótica para mejorar el replegamiento. Etiquetas de purificación pueden fusionarse a la proteína de fusión MBP glicosiltransferasa incluyendo por ejemplo GnTl, GalTl, StlII Gal3 , St3GalI , StdGalNAcTI, Core GalITI, o GalNAcT2. [0187] En otra modalidad, la adición de un dominio MBP a una proteína puede aumentar la expresión de la proteína. Ver por ejemplo, ejemplo 12 en donde la fusión de la proteína SiaA a un dominio MBP incrementa la expresión de la proteína. Otras proteínas con expresión mejorada en fusión ABMP incluyen GnTI , GalTl, StlII Gal3, St3GalI, St6 GalNAcTI, Core GalITI, o GalNAcT2. [0188] En otra modalidad, una etiqueta de proteína auto escindible tal como inteína, se incluye entre el dominio MBP y la glicosiltransferasa para facilitar la remoción del dominio MBP después que proteína de fusión se ha replegado. Inteínas y equipos para su uso están comercialmente disponibles, por ejemplo de New England Biolabs . C. Mutagénesis de glicosil transferasas para mejorar repl egami ento . [0189] El replegamiento de glicosiltransferasas también puede mejorarse por mutagénesis de la secuencia aminoácido glicosiltransferasa. En una modalidad, un residuo cisteína no apareado se identifica y muta para mejorar el replegamiento de una glicosiltransferasa. En otra modalidad, el extremo amino de la glicosiltransferasa se trunca para retirar un dominio de transmembrana, o para retirar un dominio de transmembrana y todo o una porción de la raíz de la proteína. En una modalidad adicional, una glicosiltransferasa se muta para retirar al menos un residuo cisteína no apareado y para truncar el extremo amino de la proteína, por ejemplo para retirar un dominio de transmembrana, o para retirar un dominio de transmembrana y todo o una porción de la región raíz de la proteína. Una vez que se ha aislado una secuencia de ácido nucleico glicosiltransferasa, métodos de biología molecular estándar pueden emplearse para cambiar la secuencia de ácido nucleico y de esta manera codificar la secuencia aminoácido en una forma aquí descrita. 1 . Mutagénesis de cisteínas no apareadas en glicosil transferasas para mejorar replegamiento . [0190] Conforme ocurre el replegamiento, residuos cisteína en una proteína desnaturalizada, forman enlaces disulfuro, que ayudan a reproducir la base de la estructura de la proteína activa. Apareamiento incorrecto de residuos cisteína pueden llevar a error en replegamiento de proteínas . Proteínas con residuos cisteína no apareados son susceptibles a mal replegamiento debido a que una cisteína normalmente no apareada puede formar un enlace disulfuro con una cisteína normalmente apareada haciendo un apareamiento correcto cisteína y replegamiento de proteína imposible. De esta manera, un método para mejora de replegamiento de una glicosiltransferasa particular es identificar residuos cisteína no apareados y retirarlos. [0191] Residuos cisteína no apareados pueden ser identificados al determinar la estructura de la glicosiltransferasa de interés. La estructura proteína puede determinarse con base en datos actuales para la glicosiltransferasa de interés, por ejemplo dicroísmo circular, RMN y cristalografía de rayos X. La estructura de proteína también puede determinarse utilizando modelado por computadora . El modelado por computadora es una técnica que puede emplearse para modelar estructuras relacionadas con base en estructuras tridimensionales conocidas de moléculas homologas . Programa estándar está comercialmente disponible. (Ver por ejemplo www.accelrys.com para la multitud del soporte lógico disponible para realizar modelado por computadoras) . Una vez que se identifica un residuo cisteína no apareado, el ADN que codifica la glicosiltransferasa de interés puede mutarse utilizando técnicas de biología molecular estándar para retirar la cisteína no apareada por eliminación o por sustitución con otro residuo aminoácido. Modelado por computadora se utiliza de nuevo para seleccionar un aminoácido de tamaño, forma y carga para sustitución apropiados. Cisteínas no apareadas también pueden determinarse por cartografía de péptidos. Una vez que la glicosiltransferasa de interés se muta, la proteína se expresa en cuerpos de inclusión bacterianos y se determina la capacidad de replegamiento. Una glicosiltransferasa replegada correctamente tendrá actividad biológica. [0192] En modalidades preferidas, los residuos aminoácidos siguientes se sustituyen por un residuo cisteína no apareado en una glicosiltransferasa eucariótica para mejorar replegamiento: Ala, Ser, Thr, Asp, lie, o Val. Gly también puede emplearse si la cisteína no apareada no está en una estructura helicoidal . [0193] N-acetilglucosaminiltransferasa humana I (GnTI , número de acceso NP_002397) es un ejemplo de una glicosiltransferasa que exhibe replegamiento mejorado después de mutagénesis de una cisteína no apareada, (ver por ejemplo, ejemplo 2, a continuación). GNTI humana está cercanamente relacionada con un número de proteínas GNTI eucarióticas, por ejemplo de hámster chino, número de acceso AAK61868; conejo número de acceso AAA31493; rata número de acceso Nu-110488; hámster dorado, número de acceso AAD04130; ratón, número de acceso P27808; pez cebra, número de acceso AAH58297; Xenopus , número de acceso CAC51119; Drosophila, número de acceso NP_525117; Anopheles, número de acceso XP_315359; C. elegans, número de acceso NP_497719; Physcomi trella patens, número de acceso CAD22107; Solanum tuberosum, número de acceso CAC80697; Nicotiana tabacum, número de acceso CAC80702; Oryza sativa, número de acceso CAD30022; Nicotiana benthamiana, número de acceso CAC82507; y Arabidopsis thaliana, número de acceso NP_195537. [0194] La estructura de la proteína N~ acetilglucosaminiltransf erasa I de conejo (GnTI) se ha determinado y mostrado que CYS123 no estaba apareada. (Números de residuos de aminoácidos se refieren a la secuencia de proteína de longitud íntegra aún cuando una proteína GNTI se ha truncado) . Modelación por computadora con base en GnTI de conejo, se utiliza para determinar la estructura de la proteína GnTI humana. Un alineamiento se ilustra en la figura 6. En la proteína GnTI humana, CYS121 no está apareada. Sustituciones para CYS121 se realizaron en GnTI humana. Un mutante CYS121 SER y un mutante CYS121 ALA fueron activos. En contraste, un mutante CYS121 THR no tuvo actividad detectable y un mutante CYS121 ASP tuvo baja actividad. Un doble mutante, ARG120ALA, CYS121HIS, se construye con base en la estructura pronosticada de la proteína GnTI C. elegans y tuvo actividad. [0195] Las secuencias de aminoácidos de las proteínas GnTI eucarióticas anteriormente citadas pueden utilizarse para determinar la estructura de proteína con base en modelado de computadora y la función conservada de CYS123 de conejo y CYS121 de humano. Con base en ese análisis, el residuo 123 es una cisteína no apareada en las siguientes proteínas: GnTI de hámster chino, GnTI de conejo, GnTI de rata, GnTI de hámster dorado, y GnTI de ratón. De esta manera CYS123 puede mutarse en cada una de las enzimas GNTI en serina, alanina o arginina, para producir una proteína activa con actividad de replegamiento mejorada. El siguiente doble mutante en las proteínas anteriores ARG122ALA CYS123HIS, también exhibirá replegamiento mejorado. [0196] En una modalidad, cualquiera de las proteínas GnTI eucarióticas citadas anteriormente se muta para retirar un residuo cisteína no apareado, por ejemplo CYS121SER, CYS121ALA, CYS121ASP o el doble mutante ARG120ALA CYS121HIS, expresado en cuerpos de inclusión bacterianos solubilizados y replegados en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0197] Otra glicosiltransferasa que exhibe replegamiento mejorado ante mutación de cisteínas no apareadas es Gal Tl . La cisteína 342 se muta a un residuo treonina en Gal Tl bovino y la enzima mutada exhibe replegamiento mejorado después de solubilización. Ver por ejemplo Ramakrishnan et al . J. Biol . Chem . 276:37666-37671 (2001). De interés, la mutación de una cisteína no apareada en treonina en la enzima GnTI elimina la actividad. [0198] En una modalidad, una proteína Gal Tl se muta para retirar un residuo cisteína no apareado, por ejemplo CYS342THR, expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubilizados y replegados en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína.

[0199] Otra glicosiltransferasa que exhibe replegamiento mejorado al mutar proteínas no apareadas es GalNAc T2. Muchos residuos aminoácidos son compartidos entre la proteína GalNAc T2 y la proteína GalNAc Tl . Después de mutación de dos residuos cisteína CYS212 y CYS214, la proteína GalNAc Tl humana permaneció activa cuando se expresa de células COS. Ver por ejemplo, Tenno et al . , Eur. J. Biochem . 269: 4308-4316 (2002). Las mutaciones activas incluyen CYS212ALA, CYS214ALA, CYS212SER, CYS214SER, y un doble mutante CYS212SER CYS214SER. Residuos cisteína correspondientes a los residuos CYS212 y CYS214 de GalNac Tl humano se conservan en la proteína GalNAc T2 humana, es decir residuos CYS227 y CYS229. Ver por ejemplo figura 44. De esta manera, una proteína GalNAc T2 que comprende una de las siguientes mutaciones, puede utilizarse para mejorar el replegamiento de la proteína insoluble: CYS227ALA, CYS229ALA, CYS227SER, CYS229SER, y un doble mutante CYS227SER CYS229SER. La numeración de los residuos se refiere a proteínas GalNAc T2 humanas, pero los residuos cisteínas conservados que corresponden a CYS227 y CYS229 pueden identificarse en otras proteínas GalNAc T2 eucarióticas, por ejemplo ratón, rata, conejo, cerdo, y mutan para mejorar replegamiento.

[0200] En una modalidad, una proteína GalNAc T2 se muta para retirar un residuo cisteína no apareado, por ejemplo CYS227ALA, CYS229ALA, CYS227SER, CYS229SER, o un doble mutante CYS227SER CYS229SER, expresado en cuerpos de inclusión bacterianos, solubilizados y replegados en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. [0201] Otra glicosiltransferasa que exhibe replegamiento mejorado al mutar de cisteínas no apareadas es Core 1 Gal Tl . En una modalidad, la Core 1 Gal Tl Drosophila está mutada. En otra modalidad, la Core 1 Gal Tl humana está mutada. La proteína Core 1 Gal Tl Drosophila tiene varios residuos cisteínas. Cada residuo cisteína se muta individualmente ya sea a seina o alanina . Las proteínas Core 1 Gal Tl Drosophila mutadas se expresan en cuerpos de inclusión E. coli, solubilizan y pliegan. Actividad enzimática del Core 1 Gal Tl Drosophila mutante replegada, se ensaya y compara con actividad Core 1 Gal Tl Drosophila replegada tipo silvestre. Replegamiento mejorado se indica por un aumento en actividad enzimática en un Core 1 Gal Tl Drosophila mutante en comparación con la proteína de tipo silvestre . [0202] En una modalidad, una proteína 1 Gal Tl se muta para retirar un residuo cisteína no apareado, por ejemplo ya sea la proteína de Drosophila o la proteína humana, expresada en cuerpos de inclusión bacterianos, solubilizada y replegada en un amortiguador que comprende un par redox, por ejemplo GSH/GSSG o cistamina/cisteína. Residuos cisteína para substitución en Core 1 Gal Tl Drosophila son C103, C127, C208, C246, C261, C315 y C316. 2. Truncado de glicosiltransferasas para mej orar repl ega i ento. [0203] Glicosiltransferasas eucarióticas generalmente incluyen los siguientes dominios : un dominio catalítico, una región raíz, un dominio de transmembrana y un dominio de ancla-señal. Cuando se expresa en bacterias, el dominio de ancla-señal y los dominios de transmembrana se eliminan típicamente. Glicosiltransferasas eucarióticas empleadas en los métodos de la invención pueden incluir todo o una porción de la región raíz y el dominio catalítico. En algunas modalidades, las glicosiltransferasas eucarióticas comprenden solo el dominio catalítico. [0204] Los dominios de glicosiltransferasa pueden identificarse para mutagénesis de eliminación. Por ejemplo, aquellos con destreza en la técnica pueden identificar una región raíz en una glicosiltransferasa eucariótica y eliminar aminoácidos de región raíz uno por uno, para identificar proteínas glicosiltransferasa eucarióticas truncadas con alta actividad en replegamiento . [0205] Los mutantes de eliminación en esta solicitud se refieren de dos formas: ? o D seguido por el número de residuos eliminados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de longitud integral activa, o por el símbolo y numero de residuo del primer residuo aminoácido producido de la secuencia aminoácidos de longitud integral nativa. Por ejemplo, ST6GalNAcI ? o D35 y ST6GalNAcI K36, ambos se refieren al mismo truncado de la proteína ST6GalNAcI humana. [0206] Por ejemplo, la proteína ST3GalIII de rata incluye una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 29-84. El dominio catalítico de la proteína comprende los aminoácidos de aproximadamente el residuo 85-374. De esta manera, una proteína ST3GalIII de rata truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, o 85 residuos. [0207] Mutaciones de eliminación también pueden realizarse en una proteína GnTl. Por ejemplo, la proteína GnTI humana incluye una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 31-112. De esta manera, una proteína GnTI humana truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, o 111 residuos. [0208] Mutantes de eliminación también pueden realizarse en una proteína Gal Tl . Por ejemplo, la proteína GalTl bovina incluye una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 71-129. De esta manera, la proteína GalTl bovino truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino desde aproximadamente 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 017, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, o 128 residuos. [0209] Mutaciones de eliminación también pueden realizarse en una proteína CorelGalTl. Por ejemplo, la proteína CorelGalTl Drosophila incluye una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 36- 102. De esta manera, una proteína Corel GalTl Drosophila truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, o 102 residuos. Como otro ejemplo, la proteína Corel GalTl humana incluye una región raíz desde aproximadamente los residuos aminoácido 32-90. De esta manera, una proteína Corel GalTl humana truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o 90 residuos. [0210] Mutantes de eliminación también pueden realizarse en una proteína ST3Gall . Por ejemplo, la proteína ST3Gall humana incluye una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 18-58. De esta manera, una proteína ST3Gall humana truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, o 58 residuos. Como otro ejemplo, la proteína ST3Gall porcina incluye una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 28-61. De esta manera, una proteína ST3Gall porcina truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, o 61 residuos . [0211] Mutantes de eliminación también pueden elaborarse en una proteína GalNAcT2. Por ejemplo, la proteína GalNAcT2 de rata incluye una región raíz desde aproximadamente los residuos aminoácidos 40-95. De esta manera, una proteína GalNAcT2 de rata, truncada, puede tener eliminaciones en los extremos amino de aproximadamente por ejemplo 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, o 95 residuos. [0212] Mutantes de eliminación también pueden elaborarse en una proteína ST6GalNAcI . Por ejemplo, la proteína ST6GalNAcI de ratón incluye una región raíz desde aproximadamente los residuos aminoácidos 30-207. De esta manera, una proteína ST6GalNAcI de ratón, truncada, puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, o 207 residuos. Como otro ejemplo, la proteína ST6GalNAcI humana incluye una región raíz desde aproximadamente residuos aminoácido 35-278. De esta manera, una proteína ST6GalNAcI humana truncada puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 , 105 , 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, , 116 , 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, , 127 , 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, , 138 , 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, , 149 , 150, 151, 152, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 160, , 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, , 172 , 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, , 183 , 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193 , 194 , 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, , 205 , 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, , 216 , 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, , 227 , 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, , 238 , 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 24í , 249 , 250, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, , 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, , 272 , 273, 274, 275, 276, 277, o 278 residuos. Como todavía otro ejemplo, proteínas ST6GalNAcI de pollo incluyen una región raíz de aproximadamente los residuos aminoácidos 37-253. De esta manera una proteína ST6GalNAcI de pollo, truncada, puede tener eliminaciones en el extremo amino de aproximadamente por ejemplo 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 156, 157, 158, 159; 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, o 253 residuos . D. Replegamiento en un recipiente de glicosiltransferasas . [0213] Estas modalidades de la invención se basan en la observación sorprendente que múltiples glicosiltransferasas eucarióticas expresadas en cuerpos de inclusión bacterianos pueden replegarse en un solo recipiente, es decir un método en un recipiente. Utilizando este método al menos dos glicosiltransferasas pueden replegarse en conjunto resultando en ahorros de tiempos y materiales . Las condiciones de replegamiento se describieron anteriormente. Las condiciones de replegamiento se optimizan para la mezcla de glicosiltransferasas, de esta manera las condiciones pueden no ser óptimas para cualquier enzima particular en la mezcla. Sin embargo, debido a que el replegamiento se optimiza para la combinación de glicosiltransferasas, cada una de las glicosiltransferasas replegadas en el producto final tiene actividad biológica detectable. Actividad biológica se refiere a actividad enzimática de las enzimas replegadas y puede ser expresada como actividad específica. Actividad biológica incluye por ejemplo actividades específicas de al menos 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 7, o 10 unidades de actividad. La unidad se define como sigue: una unidad de actividad cataliza la formación de 1 /mol de producto por minuto a una temperatura determinada (por ejemplo a 37 grados C) y valor de pH (por ejemplo a pH 7.5) . De esta manera, 10 unidades de una enzima es una cantidad catalítica de esa enzima donde 10 /moles de substrato se convierten en 10 /moles de producto en un minuto, a una temperatura por ejemplo de 37 C y un valor de pH de por ejemplo 7.5. La mezcla de reacción que comprende glicosiltransferasas replegadas puede luego utilizarse por ejemplo para sintetizar oligosacáridos, para sintetizar glicolípidos, para remodelar glicoproteínas y para glico-modificar con polietilenglicol a glicoproteínas . [0214] En algunas modalidades, las glicosiltransferasas pueden solubilizarse individualmente a partir de cuerpos de inclusión y después combinarse bajo condiciones apropiadas para replegamiento. En otras modalidades, cuerpos de inclusión que contienen glicosiltransferasas se combinan, solubilizan y después pliegan bajo condiciones apropiadas. [0215] Amortiguadores de replegamiento típicamente incluyen un par redox. El replegamiento puede realizarse a valores de pH en el intervalo por ejemplo de 6.0 a 10.0. Amortiguadores de replegamiento pueden incluir otros aditivos para mejorar el replegamiento, por ejemplo L-arginina (0. 4-1M) ; PEG; bajas concentraciones de desnaturalizantes tales como urea (1-2M) y cloruro de guanidina (0.5-1. 5 M) ; y detergentes (Chaps, SDS, CTAB, y Tritón X-100) . [0216] En algunas modalidades, el replegamiento se realiza en un recipiente estacionario, es decir sin mezclado, agitación, batido o de otra forma movimiento de la mezcla de reacción. [0217] La combinación de enzimas replegadas puede incluir enzimas para construir una estructura de oligosacárido particular. Aquellos con destreza serán capaces de identificar glicosiltransferasas apropiadas para inclusión en la mezcla una vez que se identifica un producto final deseado. [0218] Las mezclas de reacción de enzimas replegadas pueden incluir glícosiltransferasas que se han mutado para mejorar el replegamiento, por ejemplo las enzimas GnTI descritas anteriormente . [0219] En una modalidad preferida, enzimas que realizan etapas de glicosilación N-enlazadas se repliegan en conjunto en un solo recipiente. Por ejemplo N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI) , ß -1 , 4 galactosiltransferasa I (Gal TI) , y N-acetillactosaminida -2 , 3-sialiltransferasa (ST3GalIII) pueden expresarse en cuerpos de inclusión bacterianos, solubilizarse y replegarse en forma conjunta en un solo recipiente. El producto final exhibe actividad de todas las tres proteínas, indicando que todas se replegaron correctamente. El replegamiento también ocurrió cuando GnTI y Gal TI se replegaron en conjunto con ST3GalIII . Los experimentos se describen en detalle en el Ejemplo 3. [0220] En otra modalidad preferida, glicosilación O-enlazada de un péptido o proteína, se logra utilizando las glicosiltransferasas bacterialmente expresadas y replegadas de esta descripción. Por ejemplo, una enzima replegada MBP-GaINAcT2 (D51) puede utilizarse para agregar GalNAc a polipéptidos. Por ejemplo, el Ejemplo 4 proporciona una demostración que MBP-GalNAcT2 (D51) replegada se puede utilizar para agregar GalNAc a la proteína GCSF. Combinaciones de glicosiltransferasas O-enlazadas pueden ser utilizadas para remodelar, por ejemplo proteínas, péptidos, glicoproteínas o glicopéptidos. Estas combinaciones incluyen por ejemplo GalNAc-T2 y ST6GalNAcl; o GalNAc-T2, core lGalTl y ST3Gall o ST3GalT2. III. Glicosiltransferasas [0221] Las glicosiltransferasas de uso en la práctica de la presente invención son glicosiltransferasas eucarióticas. Ejemplos de estas glicosiltransferasas incluyen aquellas descritas en Staudacher, E. (1996) Trends in Glycoscience y Glycotechnology, 8: 391-408, afinb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf.html y www.vei.co.uk/TGN/gt~guide. htm, pero no se limitan a estas . Glicosiltransferasas eucarióticas [0222] Algunas glicosiltransferasas eucarióticas tienen dominios topológicos en sus extremos amino que no se requieren para actividad catalítica (ver, patente de los E.U.A. No . 5,032,519). De las glicosiltransferasas caracterizadas a la fecha, el "dominio citoplásmico" más comúnmente está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 amino ácidos de longitud, y es el dominio más amino-terminal; el dominio adyacente denominado el "dominio de ancla-señal" , generalmente está entre aproximadamente 10-26 amino ácidos de longitud; adyacente al dominio ancla-señal está una "región raíz" que generalmente es de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 amino ácidos de longitud, y se conoce que funciona como una señal de retención para mantener la glicosiltransferasa en el aparato de Golgi; y en el lado carboxilo de la región raíz está el dominio catalítico . [0223] Muchas glicosiltransferasas de mamíferos se han clonado y expresado y las proteínas recombinantes se han caracterizado en términos de especificidad de substrato donador y aceptor y también se han investigado a través de mutagénesis dirigida por sitio, en intentos para definir residuos o dominios involucrados ya sea en especificidad de substrato de donador o aceptor (Auki et al . (1990) EMBO. J. 9:3171-3178; Harduin-Lepers et al . (1995) Glycobíology 5(8): 741-758; Natsuka y Lowe (1994) Current Opinión in Structural Biology 4:683-691; Zu et al. (1995) Biochem. Biophys . Res . Comm. 206 (1) -.362-369; Seto et al . (1995 ) Eur. J. Biochem . 234: 323-328; Seto et al . (1997) J". Biol . Chem . 272: 14133-141388).

[0224] En un grupo de modalidades, un dominio funcional de las proteínas de glicosíltransferasa recombinante de la presente invención se obtiene a partir de una sialiltransferasa conocida. Ejemplos de sialiltransferasas que son adecuados para utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, ST3GalIII, ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, y ST6GalNAc III (la nomenclatura de sialiltransferasa aquí empleada es como se describe en Tsuj i et al . (1996) Glycobiology 6: v-xiv) . Una ejemplar a -2 , 3-sialiltransferasa (EC 2.4. 99.6) se transfiere ácido siálico a la terminal no reductora Gal de un Gal/?l-4GlcNAc disacárido o glicósido. Ver, Van den Eijnden et al . , J. Biol . Chem. , 256: 3159 (1981), Weinstein et al . , J. Biol . Chem . , 257:13845 (1982) y Wen et al . , J. Biol . Chem . , 267: 21011 (1992). Otra a -2 , 3-sialiltransferasa ejemplar (EC 2.4.99.4) transfiere ácido siálico a la terminal no reductora Gal de un Gal ?1 3GalNAc disacárido o glicósido. Ver, Rearick et al . , J. Biol . Chem . , 254:4444 (1979) y Gillespie et al., J. Biol. Chem., 267:21004 (1992). Enzimas ejemplares adicionales incluyen Gal- ß -1, 4-GlcNAco. -2 , 6 sialiltransferasa (Ver, Kurosawa et al . Eur. J. Biochem . 219: 375-381 (1994)). Nomenclatura de sialiltransferasa se describe en Tsuji, S. et al. (1996) Glycobiology 6: v-vii . [0225] Un ejemplo de una sialiltransferasa que es útil en los métodos reivindicados es ST3GalIII, que también se refiere como a(2,3) sialiltransferasa (EC 2.4. 99.6). Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico a Gal de un Galßl, 3GlcNAc, Galßl, 3GalNAc o Galpl, 4GlcNAc glicósido (ver, por ejemplo Wen et al . (1992) J. Biol . Chem . 267: 21011; Van den Eijnden et al. (1991) J. Biol . Chem . 256: 3159). El ácido siálico se enlaza a Gal con la formación de un a -enlace entre los dos sacáridos. La unión (enlace) entre los sacáridos es entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal .

Esta enzima particular puede aislarse de hígado de rata (Weinstein et al . (1982) J. Biol . Chem. 257: 13845); el ADNc humano (Sasaki et al . (1993) J". Biol . Chem . 268:22782-22787 ; Kitagawa & Paulson (1994) J". Biol . Chem . 269:1394-1401) y secuencias de ADN genómicas (Kitagawa et al . (1996) J". Biol . Chem . 271:931-938) se conocen, facilitando la producción de esta enzima por expresión recombinante. En una modalidad preferida, los métodos de sialilación reivindicados utilizan una ST3GalIII de rata.

ST3GalIII de rata se clonaron y la secuencia se conoce.

Ver, por ejemplo Wen et al . , J. Biol . Chem . 267: 21011-21019 (1992) y Número de Acceso M97754.

[0226] En otro grupo de modalidades, un dominio funcional de las proteínas de glicosiltransferasa recombinantes de la presente invención, se obtiene de una fucosiltransferasa. Una cantidad de fucosiltransferasas se conoce por aquellos con destreza en la técnica. Brevemente, fucosiltransferasas incluye cualquiera de estas enzimas que transfieren L-fucosa de GDP-fucosa a una posición hidroxi de un azúcar aceptor. En algunas modalidades, por ejemplo, el azúcar aceptor es un GlcNAc en un grupo a Galß (1 4)GlcNAc en una glicósido oligosacárido. Adecuadas fucosiltransferasas para esta reacción incluyen la conocida Galß (1 3,4)GlcNAc (1 3,4) fucosiltransferasa (FTIII,E. C. No. 2.4. 1.65) que se obtiene del leche humana (ver, Palcic, et al . , Carbohydrate Res . 190:1-11 (1989); Prieels, et al . , J.

Biol . Chem . 256:10456-10463 (1981); y Nunez, et al . , Can .

J. Chem. 59: 2086-2095 (1981)) y las Gal (1 4)GlcNAc (1 3) fucosiltransferasas (FTIV, FTV, y FTVI , E. C. No. 2.4.1.65) y NeuAca. (2 , 3 ) Gal (1 4) ßGlcNAcce (1 3) fucosiltransferasas (FTVII) que se encuentran en suero humano. También está disponible c.1,3-fucosiltransferasa IX (secuencias nucleótido de FTIX de humano y ratón) como se describe en Kaneko et al . (1999 ) FEBS Lett . 452:237-242. Además, una forma recombinante de Galß (1 3,4)GlcNAc a (1 3,4) fucosiltransferasa está disponible (ver, Dumas, et al . , Bioorg Med. Letters 1:425-428 (1991) y Kukowska-Latallo, et al . , Genes y Development 4:1288-1303 (1990)). Otras fucosiltransferasas ejemplares incluyen l,2 fucosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.69). Fucosilación enzimática puede llevarse a cabo por los métodos descritos en Mollicone, et al . , Eur. J. Biochem . 191:169-176 (1990) o en la patente de los E.U.A. No. 5,374,655. [0227] En otro grupo de modalidades, un dominio funcional de las proteínas de glicosiltransferasa recombinantes de las presentes invenciones, se obtiene a partir de galactosiltransferasas conocidas . Galactosiltransferasas ejemplares incluyen ß-1,4 galactosiltransferasa I, a 1 , 3-galactosiltransferasas (E.C. No. 2.4.1.151, ver, por ejemplo Dabkowski et al . , Transplant Proc . 25:2921 (1993) y Yamamoto et al . Nature 345:229-233 (1990), bovina (GenBank J04989, Joziasse et al . (1989) J. Biol . Chem . 264:14290-14297) , murina (GenBank m26925; Larsen et al . (1989) Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA 86: 8227-8231), porcina (GenBank L36152; Strahan et al (1995) Immunogenetics 41:101-105)). Otra adecuada a l , 3 -galactosiltransferasa es aquella que está involucrada en la síntesis del antígeno de grupo de sangre B (EC 2.4. 1.37, Yamamoto et al . (1990) J. Biol . Chem . 265:1146-1151 (humano)). También adecuado para utilizar en las proteínas de fusión de la invención son a 1, 4-galactosiltransferasas , que incluyen por ejemplo, EC 2.4.1.90 (LacNAc synthetase) y EC 2.4.1.22 (lactose synthetase) (bovina (D'Agostaro et al (1989) Eur. J. Biochem . 183: 211-217), human (Masri et al . (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 157:657-663), murina (Nakazawa et al (1988) J. Biochem . 104:165-168), así como E.C. 2.4. 1.38 y la ceramida galactosiltransferasa (EC 2.4. 1.45, Stahl et al . (1994) J. Neurosci . Res . 38: 234-242) . Otras galactosiltransferasas convenientes incluyen por ejemplo a 1, 2-galactosiltransferasas (por ejemplo Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al (1994) Mol . Biol . Cell 5: 519-528). [0228] Otras glicosiltransferasas que son útiles en las proteínas de fusión recombinantes de la presente invención se han descrito en detalle, tales como las sialiltransferasas, galactosiltransferasas y fucosiltransferasas . En particular, la glicosiltransferasa también puede ser por ejemplo, una glucosiltransferasa, por ejemplo Alg8 (Stagljov et al . , Proc . Natl . Acad. Sci . USA 91: 5977 (1994)) o Alg5 (Heesen et al . Eur. J. Biochem . 224:71 (1994)), N-acetilgalactosaminiltransferasas tales como por ejemplo, (1,3) -N-acetilgalactosaminiltransferasa, ß (1,4) -N-acetilgalactosaminiltransferasas (patente de los E.U.A.

No. 5,691, 180, Nagata et al . J. Biol . Chem . 267: 12082-12089 (1992), y Smith et al . J. Biol Chem . 269: 15162 (1994)) y la proteína N-acetilgalactosaminiltransferasa (Homa et al . J. Biol Chem . 268: 12609 (1993)). Adecuadas N-acetilglucosaminiltransferasas incluyen GnTI (2.4. 1.101, Hull et al . , BBRC 176: 608(1991)), GnTII , y GnTIII (Ihara et al . J. Biochem. 113: 692 (1993)), GnTV (Shoreiban et al . J. Biol . Chem . 268: 15381 (1993)), N-acetilglucosaminiltransferasa O-enlazada (Bierhuizen et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 9326 (1992)), ?-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa (Rajput et al . Biochem J. 285: 985 (1992), e hialuronan sintasa. También son de interés enzimas involucradas en la síntesis de proteoglicano, tales como ejemplo ?-acetilgalactosaminiltransferasa I (EC 2.4. 1.174), y enzimas involucradas en síntesis de condroitina sulfato, tales como ?-acetilgalactosaminiltransferasa II (EC 2.4. 1.175). Mannosiltransferasas adecuadas incluyen (1,2) mannosiltransferasa, a(l,3) mannosiltransferasa, (1,4) mannosiltransferasa, Dol-P-Man sintasa, OChl , y Pmtl . Xilosiltransferasas incluyen por ejemplo proteína xilosiltransferasa (EC 2.4. 2.26). [0229] En algunas modalidades, N-acetilgalactosaminiltransferasas eucarióticas se expresan en bacterias y se repliegan utilizando los métodos de esta descripción. Una cantidad de enzimas GalNAcT se han aislado y caracterizado, por ejemplo GalNAcTI, número de acceso X85018; GalNAcT2 , número de acceso X85019 (ambas descritas en White et al . , J. Biol . Chem . 270: 24156-24165 (1995)); y GalNAcT3 , número de acceso X92689 (descrito en Bennett et al . , J. Biol . Chem. 271: 17006-17012 (1996) ) . IV. Ácidos Nucleicos [0230] Ácidos nucleicos que codifican glicosiltransferasas y métodos para obtener estos ácidos nucleicos, se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Ácidos nucleicos adecuados (por ejemplo, ADNc, genómico, o sub-secuencias (sondas) ) pueden clonarse o amplificarse por métodos in vi tro, tales como la reacción de cadena polimerasa (PCR) , la reacción de cadena ligasa (LCR) , el sistema de amplificación basado en transcripción (TAS) , o el sistema de replicación de secuencia auto-sostenida (SSR) . Una amplia variedad de metodologías de amplificación in vi tro y clonación son bien conocidas por personas con destreza en la especialidad. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas con destreza a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd ed. ) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al . , eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel); Cashion et al., patente de los E.U.A. No. 5,017,478; y Carr, patente europea No. 0,246,864. [0231] Un ADN que codifica una glicosiltransferasa, o una de sus sub-secuencias, puede prepararse por cualquier método conveniente descrito anteriormente, incluyendo por ejemplo clonación y restricción de secuencias apropiadas con enzimas de restricción. En una modalidad preferida, ácidos nucleicos que codifican glicosiltransferasas se aislan por métodos de clonación rutinaria. Una secuencia de nucleótido de una glicosiltransferasa como se dispone por ejemplo, GenBank u otras bases de datos de secuencia (ver arriba) puede utilizarse para proporcionar sondas que hibridizan específicamente a un gen de glicosiltransferasa en una muestra de ADN genómico, o a un ARNm, que codifica una glucosiltransferasa, en una muestra de ARN total (por ejemplo en una tinción Southern o Northern) . Una vez que el ácido nucleico objetivo o diana que codifica una glicosiltransferasa se identifica, puede aislarse de acuerdo con métodos estándar conocidos por aquellos con destreza en la técnica (ver, por ejemplo Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd Ed. , Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger y Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.; o Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York) . Además, los ácidos nucleicos aislados pueden escindirse con enzimas de restricción para crear ácidos nucleicos que codifican la glicosiltransferasa de longitud íntegra, o sus subsecuencias, por ejemplo que contienen sub-secuencias que codifican al menos una sub-secuencia de una región raíz o un dominio catalítico de una glicosiltransferasa. Estos fragmentos de enzima de restricción, que codifican una glicosiltransferasa o sus sub-secuencias, pueden entonces ligarse por ejemplo para producir un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de glicosiltransferasa recombinante . [0232] Un ácido nucleico que codifica una a glicosiltransferasa, o una sub-secuencia del mismo, puede caracterizarse por ensayo del producto expresado. Ensayos con base en la detección de las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de la proteína expresada pueden ser utilizados. Por ejemplo, se puede identificar una glicosiltransferasa clonada, incluyendo una proteína de fusión de glicosiltransferasa, por la capacidad de una proteína codificada por el ácido nucleico para catalizar la transferencia de un sacárido de un substrato donador a un substrato aceptor. En un método preferido, se emplea electroforesis capilar para detectar los productos de reacción. Este ensayo altamente sensible involucra utilizar ya sea derivados aminofenil sacárido o disacárido que se etiquetan con fluoresceína como se describe en Wakarchuk et al . (1996) J. Biol . Chem . 271 (45) : 28271-276. Por ejemplo, para ensayar una enzima Neisseria IgtC, ya sea FCHASE-AP-Lac o FCHASE-AP- Gal puede utilizarse, mientras que para la enzima Neisseria IgtB un reactivo apropiado es FCHASE-AP-GlcNAc (Id.) . [0233] También, un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa o su sub-secuencia, puede sintetizarse químicamente. Métodos adecuados incluyen el método de fosfotriéster de Narang et al . (1919 ) Meth . Enzymol . 68: 90-99; el método de fosfodiéster de Brown et al . (1979) Meula . Enzymol . 68: 109-151; el método dietilfosforamidita de Beaucage et al . (191) Tetra. Lett . , 22:1859-1862; y el método de soporte sólido de la patente de los E.U.A. No. 4,458,066. Síntesis química produce un oligonucleótido de una sola hebra. Esta puede convertirse en ADN de doble hebra por hibridización con una secuencia complementaria o por polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como una plantilla o patrón. Una persona con destreza reconoce que mientras que la síntesis química de ADN a menudo está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas por la ligación de secuencias más cortas . [0234] Ácidos nucleicos que codifican glicosiltransferasas o sus sub-secuencias , pueden clonarse utilizando métodos de amplificación de ADN tales como reacción de cadena polimerasa (PCR) . De esta manera, por ejemplo la secuencia de ácido nucleico o subsecuencia es amplificada PCR, utilizando un cebador sentido que contiene un sitio de enzima de restricción (por ejemplo Ndel) y un cebador antisentido que contiene otro 'sitio de enzima de restricción (por ejemplo HindIII) . Esto producirá un ácido nucleico que codifica la glicosiltransferasa deseada o sub-secuencia que tiene sitios de enzima de restricción terminal . Este ácido nucleico puede ligarse fácilmente en un vector que contiene un ácido nucleico que codifica la segunda molécula y que tiene los sitios de enzima de restricción correspondientes apropiados . Cebadores PCR convenientes pueden determinarse por una persona con destreza en la técnica utilizando la información de secuencia que se proporciona en GenBank u otras fuentes . Sitios de enzima de restricción apropiados también pueden agregarse al ácido nucleico que codifica la proteína glicosiltransferasa o sub-secuencia de proteína por mutagénesis dirigida por sitio. El plásmido que contiene la secuencia o sub-secuencia de nucleótidos que codifica glicosiltransferasa se escinde con la endonucleasa de restricción apropiada y después se liga en el vector apropiado para amplificación y/o expresión, de acuerdo con métodos estándar. Ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a personas con destreza a través de métodos de amplificación in vi tro se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullís et al . , (1987) patente de los E.U.A. No. 4,683,202; PCJ? Protocols A Guide to Methods y Applicaci tions (Innis et al . , eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1,1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al . (1989) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 86: 1173; Guatelli et al . (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al . (1989) J. Clin . Chem . , 35: 1826; Landegrenetal . , (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990 ) Biotechnology 8 : 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; y Barringer et al . (1990) Gene 89: 117. [0235] Otras propiedades físicas de una proteína de glicosiltransferasa clonada, incluyendo proteína de fusión glicosiltransferasa, expresada a partir de un ácido nucleico particular, pueden compararse con propiedades de glicosiltransferasas conocidas para proporcionar otro método de identificar secuencias adecuadas o dominios de la glicosiltransferasa que son determinantes de especificidad de sustrato aceptor y/o actividad catalítica. De forma alterna, un gen de glicosiltransferasa putativo o gen de glicosiltransferasa recombinante puede ser mutado, y su papel como glicosiltransferasa, su capacidad para replegar, o el papel de secuencias o dominios particulares establecido al detectar una variación en la estructura de un carbohidrato normalmente producido por la glicosiltransferasa no mutada, de origen natural o de control . [0236] Dominios funcionales de glicosiltransferasas clonadas pueden identificarse al utilizar métodos estándar para mutar o modificar las glicosiltransferasas y probar las proteínas modificadas o mutadas por actividades tales como actividad de sustrato aceptor y/o actividad catalítica, como se describe aquí.

Los dominios funcionales de las diversas glicosiltransferasas pueden utilizarse para construir ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión de glicosiltransferasa recombinantes, que comprende los dominios funcionales de una o más glicosiltransferasas. Estas proteínas de fusión pueden ser probadas para la actividad catalítica o sustrato aceptor deseado. [0237] En un enfoque ejemplar a clonar proteínas de fusión de glicosiltransferasa recombinantes, las secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos conocidas de glicosiltransferasas clonadas, se alinean y comparan para determinar la cantidad de identidad de secuencia entre diversas glicosiltransferasas . Esta información puede utilizarse para identificar y seleccionar dominios de proteínas que confieren o modulan actividades de glicosiltransferasa, por ejemplo actividad de sustrato aceptor y/o actividad catalítica, con base en la cantidad de identidad de secuencia entre las glicosiltransferasas de interés. Por ejemplo, dominios que tienen identidad de secuencia entre las glicosiltransferasas de interés y que se asocian con una actividad conocida, pueden ser utilizados para construir proteínas de fusión de glicosiltransferasa recombinantes que contienen ese dominio y tienen la actividad asociada con ese dominio (por ejemplo especificidad de sustrato aceptor y/o actividad catalítica) . V. Expresión de glicosiltransferasas recombinantes [0238] Glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes pueden expresarse en una variedad de células anfitrionas, incluyendo E. coli , otros anfitriones bacterianos, levadura y diversas células eucarióticas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO y HeLa y líneas celulares de mieloma. Las células anfitrionas pueden ser células de mamíferos, células de plantas o microorganismos tales como por ejemplo células de levadura, células bacterianas o células fúngales filamentosas. Ejemplos de células anfitrionas convenientes incluyen por ejemplo Azotobacter sp . (por ejemplo A . vinelandii ) , Pseudomonas sp . , Rhizobium sp . , Erwinia sp . , Escherichia sp . (por ejemplo E. coli) , Bacillus, Pseudomonas , Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vi treoscilla, Paracoccus y Klebsiella sp . , entre muchos otros. Las células pueden ser de cualquiera de varios géneros, incluyendo Saccharomyces (por ejemplo S . cerevisiae) , Candida (por ejemplo C. utilis, C. parapsilosis , C. krusei , C. versatilis , C. lipolytica, C. zeylanoides, C. guilliermondii , C. albicans, y C. humicola) , Pichia (por ejemplo P. farinosa y P. ohmeri) , Torulopsis (por ejemplo T. candida , T. sphaerica, T. xylinus, T. famata, y T. versatilis) , Debaryomyces (por ejemplo D . subglobosus , D . cantar ellii , D. globosus, D . hansenii , y D. japonicus) , Zygosaccharomyces (por ejemplo Z . rouxii y Z . bailii ) , Kluyveromyces (por ejemplo K marxianus) , Hansenula (por ejemplo H. anómala y H. jadinii), y Brettanomyces (por ejemplo B. lambicus y B. anomalus) . Ejemplos de bacterias útiles incluyen, pero no están limitadas a Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Klebsielia. [0239] Típicamente, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión se coloca bajo el control de un promotor que es funcional en la célula anfitriona deseada. Una variedad extremadamente amplia de promotores es bien conocida y pueden utilizarse en los vectores de expresión de la invención, dependiendo de la aplicación particular. Ordinariamente, el promotor seleccionado depende de la célula en donde va a estar activo el promotor. Otras secuencias de control de expresión tales como sitios de enlace ribosoma, sitios de terminación de transcripción y semejantes también se incluyen opcionalmente . Construcciones que incluyen una o más de estas secuencias de control se denominan "casetes de expresión" . De acuerdo con esto, la invención proporciona casetes de expresión en los cuales los ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión, se incorporan para alto nivel de expresión en una célula anfitriona deseada. [0240] Secuencias de control de expresión que son adecuadas para utilizar en una célula anfitriona particular, a menudo se obtienen al clonar un gen que se expresa en esa célula. Secuencias de control procarióticas comúnmente empleadas, que se definen aquí para incluir promotores para inicio de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de enlace ribosoma, incluyen los promotores comúnmente empleados como el promotor ß-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) sistemas promotores (Change et al., Nature (1977) 198: 1056), el sistema promotor triptofano ( trp) (Goeddel et al . , Nucleic Acids Res . (1980) 8: 4057), el promotor tac (DeBoer, et al . , Proc . Natl . Acad. Scí . U. S. A . (1983) 80: 21-25); y el promotor PL derivado A y el sitio de enlace ribosoma de gen N (Shimatake et al . , Nature (1981) 292: 128). El sistema promotor particular no es crítico para la invención, cualquier promotor disponible que funciona en procariotas puede ser utilizado. [0241] Para expresión de glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes en células procarióticas diferentes a E. coli , se requiere un promotor que funciona en la especie procariótica particular. Estos promotores pueden obtenerse de genes que se han clonado de las especies, o pueden utilizarse promotores heterólogos. Por ejemplo, el promotor híbrido rp-lac funciona en Bacilus además de E. coli . [0242] Un sitio de enlace ribosoma (RBS) se incluye convenientemente en los casetes de expresión de la invención. Un RBS en E. coli , por ejemplo consiste de una secuencia de nucleótidos de 3-9 nucleótidos de longitud ubicados a 3-11 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio (Shine y Dalgarno, Nature (1975) 254: 34; Steitz, In Biological regulation and development : Gene expression (ed. R. F. Goldberger) , vol. 1, p. 349,1979, Plenum Publishing, NY) . [0243] Para expresión de las glicotransferasas eucarióticas recombinantes en levadura, promotores convenientes incluyen GAL1-10 (Johnson y Davies (1984) Mol . Cell . Biol . 4: 1440- 1448) ADH2 (Russell et al . (1983) J. Biol . Chem . 258: 2674-2682), PH05 (EMBO J. (1982) 6: 675-680), y MFcc (Herskowitz y Oshima (1982) en The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (eds. Strathem, Jones, y Broach) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N. Y., pp. 181-209) . Otro promotor conveniente para utilizar en levadura es el promotor híbrido ADH2/GAPDH como se describe en Cousens et al . , Gene 61: 265-275 (1987). Para hongos filamentosos tales como por ejemplo cepas del hongo Aspergillus (McKnight et al . , patente de los E.U.A. número 4,935,349), ejemplos de promotores útiles incluyen aquellos derivados de los genes glicolíticos de Aspergillus nidulans , tales como el promotor ADH3 (McKnight et al . , EMBO J. 4: 2093 2099 (1985)) y el promotor tpiA . Un ejemplo de un terminador conveniente es el terminador ADH3 (McKnight et al . ) . [0244] Promotores constitutivos convenientes para utilizar en plantas incluyen por ejemplo el virus de mosaico de coliflor (CaMV) 35C región de inicio de transcripción y promotores de región VI, el 1'- o 2'-promotor derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, y otros promotores activos en células de plantas que se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Otros promotores convenientes incluyen el promotor de transcripción de longitud íntegra del virus mosaico de escrofularia, promotores de actina, promotores de histona, promotores de tubulina o el promotor manopina sintasa (MAS) . Otros promotores de plantas constitutivas incluyen diversos promotores de ubiquitina o poliubiquitina derivados de, entre otros, Arabidopsis (Sun y Callis, Plant J. , 11 (5) : 1017-1027 (1997)), los promotores mas, Mac o DobleMac (descritos en la patente de los E.U.A. número 5,106,739 y por Comai et al . , Plant Mol . Biol . 15:373-381 (1990)) y otras regiones de inicio de transcripción de diversos genes de plantas, conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Promotores útiles para plantas también incluyen aquellos obtenidos de Ti- o Ri-plásmidos de células de plantas, virus de plantas u otros anfitriones, en donde los promotores se encuentran funcionales en plantas . Promotores bacterianos que funcionan en plantas, y de esta manera son adecuados para utilizar en los métodos de la invención incluyen el promotor octopina sintetasa, el promotor nopalina sintasa y el promotor manopina sintetasa. Promotores de plantas endógenas convenientes incluyen el promotor de pequeña subunidad (ssu) ribulosa-1 , 6-bifosfato (RUBP) carboxilasa, el promotor ( a -conglicinina) , el promotor faseolina, el promotor ADH y los promotores de choque térmico. [0245] Ya sea promotores constitutivos o regulados pueden emplearse en la presente invención. Promotores regulados pueden ser ventajosos debido a que las células anfitrionas pueden desarrollarse en altas densidades antes que se induzca la expresión de las proteínas de fusión. Un alto nivel de expresión de proteínas heterólogas frena el crecimiento celular en algunas situaciones. Un promotor inducible es un promotor que dirige la expresión de un gen en donde el nivel de expresión se altera por factores ambientales o de desarrollo tales como por ejemplo temperatura, pH, condiciones anaeróbicas o aeróbicas, luz, factores de transcripción y productos químicos . Estos promotores se refieren aquí como promotores "inducibles", que nos permiten controlar la sincronización de la expresión de la glicosiltransferasa o enzima involucrada en la síntesis de nucleótido-azúcar . Para E. coli y otras células anfitrionas bacterianas, promotores inducibles se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Estos incluyen por ejemplo el promotor lac, el promotor bacteriófago ? PL, el promotor híbrido trp-lac (Amann et al . (1983) Gene 25: 167; de Boer et al . (1983) Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA 80: 21), y el promotor bacteriófago T7 (Studier et al . (1986) J. Mol . Biol . ,- Tabor et al . (1985) Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA 82: 1074-8). Estos promotores y su uso se discuten en Sambrook et al . , supra . Un promotor invisible particularmente preferido para expresión en procariotas es un promotor dual que incluye un componente promotor tac enlazado a un componente promotor que se obtiene de un gen o genes que codifican enzimas involucradas en el metabolismo de galactosa (por ejemplo un promotor de un gen UDP galactosa 4-epimerasa (galE) ) . El promotor dual tac-gal , que se describe en la publicación de la solicitud de patente número W098/20111, proporciona un nivel de expresión que es mayor que el que se proporciona ya por cualquier promotor solo. [0246] Promotores inducibles para utilizar en plantas se conocen por aquellos con destreza en la técnica (ver por ejemplo referencias citadas en Kuhlemeier et al (1987) Ann . Rev. Plant Physiol . 38:221), e incluyen aquellos de los genes de pequeña subunidad 1,5-ribulosa bisfosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana (el promotor "ssu"), que son inducibles con luz y activos sólo en tejido fotosintético. [0247] Promotores inducibles para otros organismos son también bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Éstos incluyen por ejemplo el promotor arabinosa, el promotor lacZ, el promotor metalotioneina y el promotor de choque térmico, así como muchos otros . [0248] Una construcción que incluye un polinucleótido de interés enlazado con el control de expresión de gen señala que, cuando se coloca en una célula anfitriona apropiada, dirige la expresión del polinucleótico, se denomina un "cásete de expresión" . Los casetes de expresión que codifican las proteínas de fusión de la invención a menudo se colocan en vectores de expresión para introducción en la célula anfitriona. Los vectores típicamente incluyen, además de un cásete de expresión, una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar independientemente en una o más células anfitrionas selectas. En general, esta secuencia es aquella que permite al vector replicar independientemente del ADN cromosomal anfitrión e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas. En forma alterna, el vector puede replicar al integrarse en el complemente genómico de célula anfitriona y se replica conforme la célula se somete a replicación de ADN. Un vector de expresión preferido para expresión de las enzimas en células bacterianas es pTGK, que incluye un promotor tac-gal dual y se describe en la publicación de la solicitud de patente número W098/20111. [0249] También puede ser conveniente el agregar secuencias regulatorias, que permiten la regulación de la expresión del polipéptido respecto al crecimiento de la célula anfitriona. Ejemplos de sistemas regulatorios son aquellos que provocan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulatorio . Sistemas regulatorios en sistemas procarióticos incluyen el sistema operador lac, tac, y trp. En levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 puede utilizarse. En hongos filamentosos, el promotor TAKA a-amilasa, promotor glucoamilasa Aspergillus Niger, y el promotor glucoamilasa Aspergillus oryzae pueden utilizarse como secuencias regulatorias . [0250] La construcción de construcciones polinucleótido en general requiere el uso de vectores capaces de replicar en bacterias . Una plétora de equipos están comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos de bacterias (ver por ejemplo EasyPrepJ, FlexiPrepJ, ambas de Pharmacia Biotech; StrataCleanJ, de Stratagene; y QIAexpress Expression System, Qiagen) . Los plásmidos aislado y purificado pueden entonces ser manipulados para producir otros plásmidos, y utilizarlos para transfectar células . Clonación en Streptomyces o Bacillus también es posible. [0251] Marcadores seleccionables al menos se incorporan en los vectores de expresión utilizados para expresar los polinucleótidos de la invención. Estos genes pueden codificar un producto de gen, tal como la proteína, necesaria para la supervivencia o crecimiento de células anfitrionas transformadas que se desarrollan en un medio de cultivo selectivo. Células anfitrionas no transformadas con el vector que contienen el gen selectivo no sobrevivirán en el medio de cultivo. Genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a anticuerpos u otras toxinas, tales como ampicilina, neomicina, canamicina, cloranfenicol, o tetraciclina. De forma alterna, marcadores seleccionables pueden codificar proteínas que complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos. A menudo, el vector tendrá un marcador seleccionable que es funcional en, por ejemplo, E. coli , u otras células en donde el vector se replica antes de ser introducido en la célula anfitriona. Una cantidad de marcadores seleccionables se conocen por aquellos con destreza en la técnica y se describen por ejemplo en Sambrook et al . , supra . Un marcador seleccionable preferido para utilizar en células bacterianas es un marcador de resistencia a canamicina (Vieira y Messing, Gene 19:259 (1982)). El uso de selección de canamicina es ventajoso sobre, por ejemplo, selección de ampicilina debido a que la ampicilina se degrada rápidamente por ß-lactamasa en medio de cultivo, retirando de esta manera presión selectiva y permitiendo que el cultivo se desarrolle en exceso con células que no contienen el vector.

[0252] La construcción de vectores convenientes que contiene uno o más de los componentes anteriormente citados, emplea técnicas de ligación estándar como se describe en las referencias citadas anteriormente. Plásmidos aislados o fragmentos de ADN se extinguen, ajustan a la medida y re-ligan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos . Para confirmar secuencias correctas en plásmidos construidos, los plásmidos pueden analizarse por técnicas estándar tales como por digestión de endonucleosa restricción, y/o secuenciado de acuerdo con métodos conocidos . Técnicas de clonación molecular para lograr estos objetivos se conocen en la especialidad. Una pluralidad de métodos amplificación in vi tro y clonación adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes, son bien conocidos por las personas con destreza en la especialidad. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas con destreza en la especialidad a través de muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Métodos in Enzymology, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1998) (Ausubel). [0253] Una variedad de vectores comunes adecuados para utilizar como materiales de partida para construir los vectores de expresión de la invención son bien conocidos en la especialidad. Para clonar bacterias, vectores comunes incluyen vectores derivados pBR322 tales como pBLUESCRIPTMR, y vectores derivados de /l-fage. En levadura, vectores incluyen plásmidos de Integración de Levadura (por ejemplo, YIp5) y plásmidos de replicación de Levadura (los plásmidos de serie YRp) y pGPD-2. Expresión en células mamífero puede lograrse utilizando una variedad de plásmidos comúnmente disponibles, incluyendo pSV2 , pBC12BI, y p91023, así como vectores de virus lítico (por ejemplo, virus vaccinia, adeno virus, y vacuno virus) , vectores de virus episomales (por ejemplo, papilomavirus bovinos) , y vectores retrovirales (por ejemplo, retrovirus murinos) . [0254] Los métodos por introducción de los vectores de expresión en una célula anfitriona selecta no son particularmente críticos, y estos métodos se conocen por aquellos con destreza en la especialidad. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden introducirse en células procarióticas, incluyendo E. coli , por transformación con cloruro de calcio y en células eucarióticas por tratamiento con fosfato de calcio o electroporación. Otros métodos de transformación también son adecuados . [0255] El acoplamiento de traducción puede emplearse para mejorar la expresión. La estrategia utiliza un marco de lectura abierto corriente arriba corto, derivado de un gen altamente expresado nativo al sistema de traducción, que se coloca corriente abajo del promotor, y un sitio de enlace de ribosoma seguido después de unos cuantos condones amino ácidos por un codón de terminación. Justo antes del codón de terminación esta un segundo sitio de enlace ribosoma, y siguiendo al codón de terminación esta un codón de partida para el inicio de la traducción. El sistema disuelve estructura secundaria en el ARN, permitiendo el inicio eficiente de la traducción. Ver Squires, et. al . (1988), J". Biol . Chem . 263: 16297-16302. [0256] Las glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes de la invención también pueden ser adicionalmente enlazadas con otras proteínas bacterianas . Este enfoque a menudo resulta en alto rendimientos, debido a que las secuencias de control procarióticas normales dirigen la transcripción y traducción. En E. coli , fusiones lacZ a menudo se emplean para expresar proteínas heterólogas . Vectores convenientes están fácilmente disponibles, tales como la series pUR, pEX, y pMRlOO (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , supra . ) . Para ciertas aplicaciones, puede ser conveniente escindir la non-glicosiltransferasa y/o amino ácidos de enzimas de accesorio de la proteína fusión, después de purificación. Esto puede lograrse por cualquiera de varios métodos conocidos en la especialidad, incluyendo escisión por bromuro de cianógeno, una proteasa o por el Factor Xa (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , supra . ; Itakura et al . , Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al . , Proc .

Natl . Acad . Sci . USA (1979) 76: 106; Nagai et al . , Nature (1984) 309: 810; Sung et al . , Proc . Natl . Acad. Sci . USA (1986) 83: 561) . Sitios de escisión pueden someterse a ingeniería en el gen para la proteína de fusión en el punto deseado de escisión. [0257] Más de una glicosiltransferasa eucariótica recombinante puede expresarse en una sola célula anfitriona al colocar múltiples casetes de transcripción en un solo vector de expresión, o al utilizar diferentes marcadores seleccionable para cada uno de los vectores de expresión que se emplean en la estrategia de clonación. [0258] Un sistema conveniente para obtener proteínas recombinantes de E. coli que mantiene la integridad de sus extremos N se ha descrito por Miller et al . Biotechnology 7 : 698-704 (1989). En este sistema, el gen de interés se produce como una fusión C-terminal a los primeros 76 residuos del gen ubicuitina de levadura que contiene un sitio de escisión peptidasa. La escisión en la unión de los dos porciones, resulta en la producción de una proteína que tiene un residuo N-terminal auténtico intacto. [0259] Los vectores de expresión de la invención pueden ser transferidos en la célula anfitriona selecta por métodos bien conocidos tales como transformación de cloruro de calcio para tratamiento de fosfato de calcio y E. coli o electroporación para células de mamífero. Células transformadas por los plásmidos pueden seleccionarse por resistencia a antibióticos conferida por los genes contenidos en los plásmidos, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg. VI. Proteínas y purificación de proteína [0260] Las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante pueden ser purificadas de acuerdo con procedimientos estándar de la especialidad, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y semejantes (ver en general, R. Scopes, proteína Purificación, Springer-Verlag, N. Y. (1982) , Deutscher, Métodosin Enzymology Vol . 182: Guide to Protein Purification . , Academic Press, Inc. N. Y. (1990)). En modalidades preferidas, la purificación de las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante, ocurre después de replegamiento de la proteína. Composiciones substancialmente puras de al menos aproximadamente 70 a 90%, homogeneidad se prefieren; más preferible al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, o 97%; y 98 a 99% o más de homogeneidad se prefiere más . Las proteínas purificadas también pueden utilizarse, por ejemplo como inmunógenos para producción de anticuerpos . [0261] Para facilitar la purificación de las proteínas glicosiltransferasa eucariótica recombinante de la invención, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante también pueden incluir una secuencia de codificación para un epítopo o "etiqueta" para lo cual esta disponible un reactivo de enlace de afinidad, es decir una etiqueta de purificación. Ejemplos de epítopos convenientes incluyen los genes reporteros V-5 y myc; vectores de expresión útiles para producción recombinante de proteínas de fusión que tiene estos epítopos están comercialmente disponibles (por ejemplo, vectores Invitrogen (Carlsbad CA) pcADN3. 1/Myc-His y pcADN3. 1/V5-HÍS son adecuados para expresión en células de mamífero) . Vectores de expresión adicionales adecuados para conectar una etiqueta a las proteínas de fusión de la invención, y sistemas de detección correspondientes, se conocen por aquellos con destreza en la especialidad y varios están comercialmente disponibles (por ejemplo, FLAG" (Kodak, Rochester NY) . Otro ejemplo de una etiqueta conveniente es una secuencia polihistidina que es capaz de ligar a ligandos de afinidad quelato metal. Típicamente, se emplean seis histidinas adyacentes (SEQ ID NO: 67), aunque se pueden utilizar más o menos que seis. Ligandos de afinidad quelatos de metal convenientes que pueden servir como la porción de enlace para una etiqueta polihistidina incluyen ácido nitrilo-tri-acético (NTA) (Hochuli, E. (1990) "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" In Genetic Engineering: Principies y Methods, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; comercialmente disponible de Qiagen (Santa Clarita, CA) ) . [0262] Etiquetas de purificación también incluyen dominios de enlace maltosa y dominios de enlace almidón. Purificación de proteínas DE dominio de enlace maltosa se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Dominios de enlace almidón se describen en WO 99/15636, aquí incorporados por referencia. Purificación de afinidad de una proteína de fusión que comprende un dominio de enlace almidón utilizando una resina deribatizada betacilodextrina (BCD) se describe en la Solicitud de Patente de los E.U.A No. de Serie 60/468,374, presentada en mayo 5, 2003, aquí incorporada por referencia totalmente. [0263] Otros haptenos adecuados para uso con etiquetas se conocen por aquellos con destreza en la técnica y se describe, por ejemplo, en el Handbook of Fluorescent Probes y Research Chemicals (6th Ed. , Molecular Probes, Inc., Eugene OR) . Por ejemplo, dinitrofenol (DNP) , digoxigenina, barbituratos (ver, por ejemplo, Patente de los E.U.A No. 5,414,085) y varios tipos de fluoróforos son útiles como haptenos, al igual que derivados de estos compuestos . Están comercialmente disponibles equipos para enlazar haptenos y otras porciones a proteínas y otras moléculas. Por ejemplo, cuando el hapteno incluye un tiol, puede utilizarse un enlazador heterobifuncional tal como SMCC para conectar la etiqueta a residuos lisina presentes en el reactivo de captura . [0264] Una persona con destreza reconocerá que pueden realizarse modificaciones a los dominios funcionales o catalíticos glicosiltransferasa y/o dominios catalíticos de enzima de accesorio, sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden realizarse para facilitar la clonación, expresión o incorporación del dominio catalítico en una proteína de fusión. Estas modificaciones son bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad e incluyen por ejemplo, la adición de codones en cualquier extremo del polinucleótido que codifica el dominio catalítico para proporcionar por ejemplo una metionina agregada en el extremo amino, para proporcionar un sitio de inicio o amino ácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocados en cualquier extremo para crear sitios de enzima restricción convenientemente ubicado o codones de terminación o secuencias de purificación. VII. Usos de glicosiltransferasas replegadas [0265] La invención proporciona proteínas de glicosiltransferasa eucariótíca recombinante y métodos para utilizar las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante para sintetizar enzimáticamente glicoproteínas, glicolípidos y porciones oligosaccaridas, y para glico-PEG-ilar (glico modificar con polietilen glicol) a glicoproteínas. Las reacciones de glicosiltransferasa de la invención se llevan a cabo en un medio de reacción que comprenda al menos una glicosiltransferasa, substrato aceptor y substrato donor, y típicamente un catión de metal divalente soluble. En algunas modalidades, enzimas de accesorio y substratos para la porción catalítica de enzima de accesorio también están presentes, de manera tal que las enzimas de accesorio puedan sintetizar al substrato donor para la glicosiltransferasa. Las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante y métodos de la presente invención, se basan en el uso de proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante para catalizar la adición de un sacárido a un substrato aceptor . [0266] Se conoce una cantidad de métodos para utilizar glicosiltransferasas en sintetizar glicoproteínas y glicolípidos que tienen porciones oligosacáridos deseadas. Métodos ejemplares se describen por ejemplo en WO 96/32491, Ito et al . (1993) Puré Appl . Chem . 65: 753, y las Patentes de los E.U.A Nos. 5,352,670, 5,374,541, y 5, 545,553. [0267] Las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante preparadas como se describe aquí, pueden utilizarse en combinación con glicosiltransferasas adicionales, que pueden o no tener pegamento requerido para actividad. Por ejemplo, se puede utilizar una combinación de proteína glicosiltransferasa eucariótica recombinante replegada y una glicosiltranferasa bacteriana, que puede o no haber sido replegada después de aislamiento de una célula anfitriona. Similarmente, la glicosiltransferasa eucariótica recombinante puede utilizarse con enzimas de accesorio recombinantes que pueden o no ser parte de la proteína de fusión. [0268] Los productos producidos por el procesos anterior, pueden utilizarse sin purificación. En algunas modalidades, se producen oligosacáridos. Técnicas estándar, bien conocidas, por ejemplo cromatografía de capa delgada o gruesa, cromatografía de intercambio de iones, o filtración de membrana, pueden utilizarse para recuperación de sacáridos glicosilados. También, por ejemplo filtración de membrana, utilizando una membrana nanofiltración u osmótica inversa como se describe en la Patente AU comúnmente cedida No. 735695 pueden emplearse. Como un ejemplo adicional, filtración de membrana en donde las membranas tienen un corte de peso molecular de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10,000 pueden emplearse para retirar proteínas. Como otro ejemplo, nanofiltración u osmosis inversa puede entonces emplearse para retirar sales. Membranas de nanofiltro son una clase de membranas de osmosis inversa que pasan sales monovalentes pero retiene sales polivalentes y solutos sin carga más grandes que aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 Daltons, dependiendo de la membrana empleada. De esta manera, por ejemplo los oligosacáridos producidos por las composiciones y métodos de la presente invención pueden ser retenidos en la membrana y las sales contaminantes pasaran. VIII. Substrato Donor/ substratos Aceptores [0269] Substratos donadores convenientes empleados por las proteínas de fusión de glicosiltransferasa recombinante y métodos de la invención incluyen, pero no están limitados a, UDP-Glc, UDP-GlcNAc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, GDP-Man, GDP-Fuc, UDP-GlcUA, y CMP ácido siálico. Guo et al . , Applied Bioclaem . and Biotech . 68: 1-20 (1997). [0270] Substratos aspersores convenientes utilizados por las proteínas de fusión de glicosiltransferasa recombinante y métodos de la invención incluyen pero no están limitados a polisacáridos, oligosacáridos, proteínas, lípidos, gangliósidos y otras estructuras biológicas (por ejemplo, células enteras) que pueden ser modificadas por los métodos de la invención. Estructuras ejemplares, que pueden ser modificadas por los métodos de la invención incluyen cualquiera de una cantidad de glicolípidos, glicoproteínas y estructuras carbohidrato en células conocidas por aquellos con destreza en la especialidad, como se establece en la Tabla 1. Tabla 1 quiméricas • MAb-anti-EGF • Interleuquina -1 (IL-1), • MAb-anti-Her~2 receptor IB, 2,3, 4 • Interferona- a (IFN- ) Células • IFN-a-2b • Glóbulos rojos • IFN-ß • Glóbulos blancos (por ejemplo células T, células B, células dendríticas, • IFN-X macrógratos, células NK, neutrófilos, monocitos y semejantes • Toxina difteria • Células madre quimérica-IL-2.

[0271] Ejemplos de substratos aceptores convenientes empleados en reacciones catalizadas con fucosiltransferasa, y ejemplos de substratos aceptores adecuados utilizados en reacciones catalizadas por sialiltransferasa, se describen en Guo et al . , Applied Biochem . and Biotech . 68: 1-20 (1997), pero no se limitan a esta. IX. Reacciones de Glicosiltransferasa [0272] Las proteínas de glicosiltransferasa eucariótica recombinante, substratos aceptores, substratos donadores y otros ingredientes de mezcla de reacción se combinan por mezcla en un medio de reacción acuoso. El medio generalmente tiene un valor de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.5. La selección de un medio se basa en la capacidad del medio para mantener el valor de pH al nivel deseado. De esta manera, en algunas modalidades, el medio se amortigua a un valor de pH de aproximadamente 7.5. Si no se utiliza un amortiguador, el pH del medio deberá mantenerse a aproximadamente 5 a 8.5, dependiendo de la glicosiltransferasa particular empleada. Para fucosiltransferasas, el intervalo de pH de preferencia se mantiene de aproximadamente 6.0 a 8.0. Para sialiltransferasas , el intervalo de preferencia es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5. [0273] Cantidades o concentraciones de enzima se expresan en unidades de actividad, que es una medida de la velocidad inicial de catálisis. Una unidad de actividad cataliza la formación de 1 µmol de producto por minuto a una temperatura determinada (típicamente 37 grados C) y un valor de pH (típicamente 7.5) . De esta manera, 10 unidades de una enzima es una cantidad catalítica de esta enzima en donde 10 µmoles de substrato se convierten a 10 µmoles de producto en un minuto a una temperatura de 37 grados C y un valor de pH de 7.5.

[0274] La mezcla de reacción puede incluir cationes de metales divalentes (Mg2+, Mn2+) . El medio de reacción también puede comprender detergentes solubilizantes (por ejemplo Tritón o SDS) y solventes orgánicos tales como metanol o etanol, de ser necesario. Las enzimas pueden ser utilizadas libres en solución o pueden ligarse a un soporte tal como un polímero . La mezcla de reacción de esta manera es substancialmente homogénea al inicio, aunque puede formarse algo de precipitado durante la reacción. [0275] La temperatura en la cual un proceso anterior se lleva a cabo, puede estar en el intervalo de solo sobre la de congelamiento a la temperatura en la cual se desnaturaliza la enzima más sensible. Este intervalo de temperatura de preferencia es aproximadamente 0 grados C a aproximadamente 45 grados C, y más preferible a aproximadamente 20 grados C a aproximadamente 37 grados C. [0276] La mezcla de reacción así formada se mantiene por un periodo de tiempo suficiente para obtener el alto rendimiento deseado de determinantes oligosacárido deseados presentes en grupos oligosacárido conectados a la glicoproteína a glicosilar. Para preparaciones a gran escala, la reacción a menudo se permitirá que proceda entre aproximadamente 0.5-240 horas y más típicamente entre aproximadamente 1-18 horas. [0277] Una o más de las reacciones de glicosiltransferasa pueden llevarse a cabo como parte de un ciclo de glicosiltransferasa. Condiciones y descripciones preferidas de ciclos de glicosiltransferasa se han descrito. Una cantidad de ciclos de glicosiltransferasa (por ejemplo, ciclos de sialiltransferasa, ciclos de galactosiltransferasa y ciclos de fucosiltransferasa) se describen en las patentes de los E.U.A. No. 5,374,541 y la WO 9425615 A. Otros ciclos de glicosiltransferasa se describen por Ichikawa et al . J. Am . Chem . Soc . 114: 9283 (1992), Wong et al . J. Org. Chem . 57: 4343 (1992), DeLuca, et al . , J. Am . Chem . Soc . 117: 5869-5870 (1995), y Ichikawa et al . In Carbohydrates and Carbohydrate Polymers . Yaltami, ed. (ATL Press, 1993) . [0278] Otras glicosiltransferasas pueden ser substituidas en ciclos de transferencia similares como se ha descrito en detalle para las fucosiltransferasas y sialiltransferasas . En particular, la glicosiltransferasa también puede ser por ejemplo glucosiltransferasa, por ejemplo Alg8 (Stagljov et al . , Proc . Natl . Acad. Sci . USA 91:5977 (1994)) o Alg5 (Heesen et al . Eur. J. Biochem . 224:71 (1994)), N-acetilgalactosaminiltransferasas tales como por ejemplo, (1,3 ) N-acetilgalactosaminiltransferasa, ß (1, 4)N-acetilgalactosaminiltransferasas (Nagata et al . J. Biol . Chem . 267:12082-12089 (1992) y Smith et al . J. Biol Chem . 269:15162 (1994)) y polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa (Homa et al . J. Biol Chem . 268:12609 (1993)). N-acetilglucosaminiltransferasas convenientes incluyen GnTI (2.4. 1.101, Hull et al . , BBRC 176: 608 (1991)), GnTII , y GnTIII (Ihara et al . J. Biochem. 113:692 (1993)), GnTV (Shoreiban et al . J. Biol . Chem . 268:15381 (1993)), N-acetilglucosaminiltransferasa O-enlazada (Bierhuizen et al . Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:9326 (1992)), N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa (Rajput et al . Biochem J. 285:985 (1992), y hialuronan sintasa. Mannosiltransferasas convenientes incluyen (1,2) mannosiltransferasa, a (1 , 3) mannosiltransferasa, (1,4) mannosiltransferasa, Dol-P-Man sintasa, OChI, y Pmtl . [0279] Para los ciclos de glicosiltransferasa anteriores, las concentraciones o cantidades de los diversos reactivos empleados en los procesos, dependen de numerosos factores incluyendo condiciones de reacción tales como temperatura y valor de pH, y la selección y cantidad de sacáridos aceptores a glicosilar. Debido a que el proceso de glicosilación permite regeneración de nucleótidos de activación, azúcares donadores activados y depuración de PPi producido en la presencia de cantidades catalíticas de las enzimas, el proceso se limita por las concentraciones o cantidades de los substratos estequiométricos anteriormente discutidos . El límite superior para concentraciones de reactivos que pueden emplearse de acuerdo con el método de la presente invención, se determina por la solubilidad de estos reactivos . [0280] De preferencia, las concentraciones de nucleótidos de activación, donador de fosfato, el azúcar donador y enzimas, se eligen de manera tal que la glicosilación procede hasta que el aceptor se consuma. Las consideraciones discutidas a continuación, mientras que en el contexto de una sialiltransferasa, en general se aplican a otros ciclos de glicosiltransferasa. [0281] Cada una de las enzimas está presente en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía de acuerdo con la concentración de este substrato de enzima así como las condiciones de reacción tales como temperatura, tiempo y valor de pH. Medios para determinar la cantidad catalítica para una enzima determinada bajo concentraciones de substrato previamente seleccionadas así como condiciones de reacción, son bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad. X. Síntesis de Oligosacárido de Múltiples Enzimas [0282] Como se discutió anteriormente, en algunas modalidades, dos o más enzimas pueden emplearse para formar un determinante oligosacárido deseado en una glicoproteína o glicolípido. Por ejemplo, un determinante oligosacárido particular puede requerir adición de una galactosa, un ácido siálico y una fucosa a fin de exhibir una actividad deseada. De acuerdo con esto, la invención proporciona métodos en los cuales dos o más enzimas, por ejemplo glicosiltransferasas, trans-sialidasas, o sulfotransferasas, se utilizan para obtener síntesis de alto rendimiento de un determinante oligosacárido deseado. [0283] En una modalidad particularmente preferida, una de las enzimas empleada es una sulfotransferasa que sulfona el sacárido o el péptido. Aún más prefiere el uso de una sulfotransferasa para preparar un ligando para una selectina (Kimura et al . , Proc Natl Acad Sci USA 96 (8) : 4530-5 (1999)) . [0284] En algunos casos, un oligosacárido enlazado con glicoproteína o glicolípido incluirá un substrato aceptor para la glicosiltransferasa particular de interés ante biosíntesis in vivo de la glicoproteína o glicolípido. Estas glicoproteínas o glicolípidos pueden glicosilarse utilizando las proteínas de fusión de glicosiltransferasa recombinante y métodos de la invención sin previa modificación del patrón de glicosilación de la glicoproteína o glicolípido, respectivamente. En otros casos, sin embargo, una glicoproteína o glicolípido de interés carecerá de un substrato aceptor conveniente. En estos casos, los métodos de la invención pueden utilizarse para alterar el patrón de glicosilación de la glicoproteína o glicolípido, de manera que los oligosacáridos enlazados con glicoproteína o glicolípido incluyan entonces un substrato aceptor para la conexión o enlace catalizado por glicosiltransferasa de una unidad sacárido preseleccionada de interés, para formar una porción oligosacárido deseada. [0285] Oligosacáridos enlazados con glicoproteína o glicolípido, opcionalmente pueden ser primero "recortados", ya sea total o parcialmente para exponer ya sea un substrato aceptor para la glicosiltransferasa o una porción en la cual uno o más residuos apropiados pueden agregarse para obtener un substrato aceptor conveniente . Enzimas tales como glicosiltransferasas y endoglicosidasas son útiles para reacciones de conexión y recorte. Por ejemplo, una glicoproteína que exhibe oligosacáridos tipo "alto contenido de mañosa" pueden someterse a recorte por una mannosidasa para obtener un substrato aceptor que, por enlace de una o más unidades sacárido preseleccionadas, forma el determinante oligosacárido deseado. [0286] Los métodos son también útiles para sintetizar una porción oligosacárido deseada en una proteína o lípido que no está glicosilada en su forma nativa. Un substrato aceptor conveniente para la glicosiltransferasa correspondiente puede conectarse a estas proteínas o lípidos antes de glicosilación utilizando los métodos de la presente invención. Ver, por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,272,066 de métodos para obtener polipéptidos que tienen adecuados aceptores para glicosilación. [0287] De esta manera, en algunas modalidades, la invención proporciona métodos para sialilación ín vitro de grupos sacárido presentes en un glicoconjugado que primero involucra modificar el glícoconjugado para crear un aceptor conveniente. XI. Conjugación de azúcares modificadas en péptidos [0288] Los azúcares modificados se conjugan a un péptido o proteína glicosilado o no glicosilado utilizando una enzima apropiada para mediar la conjugación. De preferencia, las concentraciones del o los azúcares, enzimas y péptidos o proteínas aceptoras modificadas se eligen de manera tal que avanza la glicosilación hasta que se consuma el aceptor. Las consideraciones discutidas a continuación, mientras que se establecen en el contexto de una sialiltransferasa, en general se aplican a otras reacciones de glicosiltransferasa . [0289] Una cantidad de métodos de utilizar glicosiltransferasas para sintetizar estructuras oligosacárido deseadas, se conocen y en general se aplican a la presente invención. Métodos ejemplares se describen por ejemplo en WO 96/32491, Ito et al . , Puré Appl . Chem . 65: 753 (1993), y en la patente de los E.U.A. Nos. 5,352,670, 5,374,541, y 5,545,553. [0290] En algunas modalidades, una endoglicosidasa se utiliza en la reacción en combinación con glicosiltransferasas. Las enzimas se emplean para alterar una estructura sacárido en el péptido en un punto ya sea antes o después de la adición del azúcar modificado al péptido. [0291] En otra modalidad, el método utiliza una o más exo- o endoglicosidasas . La glicosidasa típicamente es un mutante, que se somete a ingeniería para formar enlaces glicosilo en vez de romperlo. La glicanasa mutante típicamente incluye una substitución de un residuo de amino ácido por un residuo amino ácido acídico de sitio activo. Por ejemplo, cuando la endoglicanasa es endo-H, los residuos de sitio activo substituido típicamente serán Asp en la posición 130, Glu en la posición 132 o una combinación de estos. Los amino ácidos en general se reemplazan con serina, alanina, asparagina o glutamina. [0292] La enzima mutante cataliza la reacción, usualmente por una etapa de síntesis que es análoga a la reacción inversa de la etapa de hidrólisis de endoglicanasa. En estas modalidades, la molécula donadora glicosilo (por ejemplo, una estructura oligo- o mono-sacárido deseada) contiene un grupo saliente y la reacción avanza con la adición de la molécula donadora a un residuo GlcNAc en la proteína. Por ejemplo, el grupo saliente puede ser un halógeno, tal como fluoruro. En otras modalidades, el grupo saliente es una porción Asn, o una porción Asn-péptido. Todavía en adicionales modalidades, el residuo GlcNAc en la molécula glicosilo se modifica. Por ejemplo, el residuo GlcNAc puede comprender una porción 1,2 oxazolina. [0293] En una modalidad preferida, cada una de las enzimas utilizadas para producir un conjugado de la invención están presentes en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía de acuerdo con la concentración del substrato de esta enzima así como las condiciones de reacción tales como temperatura, tiempo y valor de pH. Medios para determinar la cantidad catalítica para una enzima determinada bajo concentraciones de substrato y condiciones de reacción preseleccionadas, son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. [0294] La temperatura en la cual un proceso anterior se lleva a cabo, puede estar en el intervalo de solo sobre la temperatura de congelamiento a la temperatura a la cual se desnaturaliza la enzima más sensible. Temperaturas preferidas están en el intervalo de aproximadamente 0 grados C a aproximadamente 55 grados C, y más preferible aproximadamente 20 grados C a aproximadamente 30 grados C. En otra modalidad ejemplar, uno o más componentes del presente método se conducen a una temperatura elevada utilizando una enzima termofílica. [0295] La mezcla de reacción se mantiene por un periodo de tiempo suficiente para que el aceptor se glicosile, formando de esta manera el conjugado deseado. Algo del conjugado a menudo puede detectarse después de unas cuantas horas, con cantidades recuperables que usualmente se obtienen dentro de 24 horas o menos. Aquellos con destreza en la técnica comprenden que la velocidad de reacción depende de una cantidad de factores -variables (por ejemplo concentración de enzima, concentración de donador, concentración de aceptor, temperatura, volumen de solvente) , que se optimizan para un sistema selecto. [0296] La presente invención también proporciona la producción a escala industrial de péptidos modificados. Como se emplea aquí, una escala industrial en general produce cuando menos un gramo de conjugado purificado terminado. [0297] En la discusión siguiente, la invención se ejemplifica por la conjugación de porciones de ácido siálico modificadas a un péptido glicosilado. El ácido siálico modificado ejemplar se etiqueta con PEG. El foco de la siguiente discusión en el uso de ácido siálico modificado con PEG y péptidos glicosilados es para claridad de ilustración y no se pretende que implique que la invención se limite a la conjugación de estos dos socios . Una persona con destreza comprende que la discusión en general se aplica a las adiciones de porciones glicosilo modificadas diferentes a ácido siálico. Aún más, la discusión es igualmente aplicable a la modificación de una unidad glicosilo con agentes diferentes a PEG, incluyendo otros polímeros solubles en agua, porciones terapéuticas y biomoléculas.

[0298] Un enfoque enzimático puede emplearse para la introducción selectiva de carbohidratos modificados con PEG o modificados con PPG en un péptido o glicopéptido. El método utiliza azúcares modificados que contienen PEG, PPG, o un grupo funcional reactivo enmascarado, y se combina con la apropiada glicosiltransferasa o glicosintasa. Al seleccionar la glicosiltransferasa que hará el enlace carbohidrato deseado y utiliza el azúcar modificado como el sustrato donador, el PEG o PPG puede introducirse directamente en la estructura principal péptido sobre residuos azúcar existentes de un glicopéptido o sobre residuos de azúcar que se han agregado a un péptido. [0299] Un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el péptido a modificar por los métodos de la presente invención, ya sea como una estructura de origen natural, o una colocada en forma recombinante, enzimática o química. Aceptores convenientes incluyen por ejemplo aceptores galactosilo tales como Galß, 4GlcNAc, Galßl, 4GalNAc, Galßl, 3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Galßl, 3GlcNAc, Galßl, 3Ara, Galßl, 6GlcNAc, Galßl, 4Glc (lactosa) y otros aceptores conocidos por aquellos con destreza en la técnica (ver Paulson et al . , J. Biol . Chem . 253: 5617- 5624 (1978)).

[0300] En una modalidad, un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el glicopéptido a modificarse ante síntesis in vivo del glicopéptido. Estos glicopéptidos pueden sialilarse utilizando los métodos reivindicados sin modificación previa del patrón de glicosilación del glicopéptido. En forma alterna, los métodos de la invención pueden utilizarse para sialilar un péptido que no incluye un aceptor conveniente; uno primero modifica el péptido para incluir un aceptor por métodos conocidos por aquellos con destreza en la técnica. En una modalidad ejemplar, un residuo GalNAc se agrega por la acción de una GalNAc transferasa . [0301] En una modalidad ejemplar, el aceptor galactosilo se ensambla al conectar un residuo galactosa con un aceptor apropiado enlazado al péptido, por ejemplo un GIcNAc. El método incluye incubar el péptido a modificarse con una mezcla de reacción que contiene una cantidad conveniente de una galactosiltransferasa (por ejemplo galßl, 3 o galßl, 4) y un donador galactosilo conveniente (por ejemplo UDP-galactosa) . La reacción se deja que avance sustancialmente a terminación o en forma alterna se termina la reacción, cuando una cantidad previamente seleccionada del residuo galactosa se agrega. Otros métodos de ensamblar un aceptor sacárido selecto serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica.

[0302] Todavía en otra modalidad, oligosacáridos enlazados con glicopéptido primero se "recortan" ya sea totalmente o en forma parcial para exponer ya sea un aceptor para la sialiltransferasa o una porción en la cual uno o más residuos apropiados pueden agregarse para obtener un aceptor conveniente. Enzimas tales como glicosiltransferasas y endoglicosidasas (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 5,716,812) son útiles para las reacciones de conexión y recorte. [0303] Métodos para conjugar azúcares modificados en péptidos o proteínas se encuentran por ejemplo en la solicitud de patente de los E.U.A. Número de serie 60/328,523 presentada en octubre 10, 2001; la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/387,292, presentada en junio 7, 2002; la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/391,777 presentada en junio 25, 2002; la solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 60/404,249 presentada en agosto 16,2002; y PCT/US02/32263 ; cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos . EJEMPLOS Ejemplo 1: Replegamiento de ST3GalIII de hígado de rata expresada en bacteria.

Plegamiento de proteína de fusión GST-ST3GalIII de hígado de rata [0304] N-acetillactosaminida a - 2 , 3-sialiltransferasa de hígado de rata (ST3GalIII) se clonó en el vector pGEX-KT-Ext y expresó como cuerpos de inclusión GST-ST3-Gal III en células BL21 de E . coli .

Cuerpos de inclusión se replegaron utilizando un sistema redox GSH/GSSG. La enzima replegada, GST-ST3-GalIII, fue activa y transfiere ácido siálico a un sustrato de azúcar LNnT y a glicoproteínas asialiladas, por ejemplo transferina y Factor IX. Clonación de ST3GalIII en el vector pGEX-XT-KT [0305] El gen ST3-GalIII de hígado de rata se clonó en los sitios BamHl y EcoRl del vector pGEX- KT-Ext después de amplificación PCR utilizando los siguientes cebadores : Sentido Sial 5'Tm 5 ' -TTTGGATCCAAGCTACACTTACTCCAATGG (SEQ ID NO: 68) Antisentido: Sial 3' Whole 51-TTTGAATTCTCAGATACCACTGCTTAAGTC (SEQ ID NO: 69) Expresión de GST-ST3GalIII en células BL21 de E. coli [0306] pGEX-ST3GalIII, un vector de expresión que comprende la fusión ST3GalIII GST, se transforma en células BL21 de E. coli químicamente competentes. Colonias sencillas se seleccionaron, inocularon en 5 ml de medio LB con 100 //g/ml de carbenicilina, y desarrollaron durante la noche a 37 grados C con agitación. El día siguiente, un ml de cultivo durante la noche se transfiere en un litro de medio LB con 100 µg/ml de carbenicilina. Se desarrollaron bacterias hasta un OD620 de 0.7, después IPTG 150 µM (final) se agrega al medio. Se desarrollaron bacterias a 37 grados C por una a dos horas más, después se cambiaron a temperatura ambiente y desarrollaron durante la noche con agitación. Se recolectaron células por centrifugación; pero suspendieron precipitados bacterianos en amortiguador PBS y lisaron utilizando una prensa francesa. Fracciones solubles e insolubles se separaron por centrifugación por treinta minutos a 10,000 RPM en un rotor Sorvall SS 34 a 4 grados C . Purificación de cuerpos de inclusión [0307] Cincuenta ml de amortiguador wash de Novagen (Tris. HCl 20 mM, pH 7.5, EDTA 10 mM, Tritón X-100 1%) se agregan a la fracción insoluble, es decir los cuerpos de inclusión (IB = inclusión bodies) . La fracción insoluble se sometió a torbellino para suspender el precipitado. Los IB suspendidos se centrifugaron y lavaron al menos el doble al resuspender en amortiguador wash. (IB) precipitados limpios se recuperan y almacenan a -20 grados C hasta usar.

Plegamiento de cuerpos de inclusión [0308] Los IB se pesaron (144 mg) y disolvieron en amortiguador Genotech IBS (1.44 ml) . Los IB resuspendidos se incubaron a 4 grados C por una hora en un tubo de centrífuga Eppendorf . Material insoluble se retira por centrifugación a velocidad máxima en una centrífuga Eppendorf. IB solubilizados se diluyeron a un volumen final de 4 ml . El replegamiento de GST-ST3GalIII se probó en soluciones de amortiguador de replegamiento que contienen ciclodextrina, polietilen glicol (PEG) , ND SB-201, o un sistema redox GSH/GSSG. Un ml de IB solubilizado se diluye rápidamente por adición con pipeta en la solución de replegado, mezclan vigorosamente por 30-40 segundos, y después se agitan ligeramente por dos horas a 4 grados C. Alícuotas de tres ml de las soluciones de GST-ST3GalIII replegada se dializan contra amortiguador PBS frío o un amortiguador que contiene Tris. HCL 50 mM, pH 7.0; NaCl 100 mM; y glicerol al 1% utilizando Pierce Slide-A-lyzers (MWCO: 3.5 kDa). Después de diálisis, las soluciones de GST-ST3GalIII se concentraron a 3, 6 y 12 veces utilizando concentradores Vivaspin 5 K (VivaScience) en centrífuga Jouan a 4,000 rpm a 4 grados C. [0309] Después de replegamiento y diálisis, las proteínas GST-ST3GalIII se analizaron por electrofóresis en gel de poliacrilamida-SDS . La fusión de GST-ST3GalIII , con un peso molecular de aproximadamente 63-64 kDa, estuvo presente bajo todas las condiciones de replegado (no se muestran datos) . Sialilación de oligosacáridos utilizando GST-ST3 Gal III replegada. [0310] Ensayos enzimáticos utilizando sustratos oligosacáridos se llevaron a cabo utilizando fluorescencia inducida por láser-electrofóresis capilar (CE-LIF = Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence) . Enzimas ST3 Gal III replegadas se ensayaron por habilidad para transferir ácido siálico de histidina 5-monofosfato- ß-D-ácido siálico (CMP-NAN) a L?nT-APTS (Lacto-?-?eotetraosa-9-aminopireno 1-4, 6 ácido trisulfónico) para formar Lactosiálico-Tetrasacárido-d-APTS (LSTd-APTS) . Se realizaron reacciones en placas de microtitulación de 96 pozos en 100 µ 1 de un amortiguador que contiene MOPS 20 mM, pH 6.5; CMP-?A? 0.8 mM;L?nT 22.1 mM; L?nT-APTS 25 µ M; MnCl2 2.5 mM. Las reacciones se iniciaron al agregar 20 µ l de ST3 Gal III replegado a 30 grados C por treinta minutos . Las reacciones se neutralizaron con una dilución 1 a 25 con agua. La reacción diluida se analiza por CE- LIF utilizando un capilar revestido con ?-CHO de acuerdo con las guías del fabricante. Las actividades se calcularon como la proporción de las áreas pico normalizadas de LNnT-APTS a LSTd-APTS . Resultados que comparan diferentes condiciones de replegamiento se ilustran en la Tabla 2. Dos experimentos adicionales utilizando el sistema GSH/GSSG, se ilustran en la Tabla 3. Tabla 2. Actividad de GST-ST3-Gal III después de supervisión de diferentes sistemas de replegamiento. Las proteínas se ensayaron directamente sin concentración .

Ciclodextrina PEG ND SB-201 GSH/GSSG 0 0 0 7.8 U/L* *Actividades reportadas aquí son unidades por L de enzima replegada . Tabla 3. Actividades GST-ST3GalIII después de dos experimentos de replegado separados utilizando el sistema GSH/GSSG.

GSH/GSSG Conc Actividad Prueba de replegado 12x 182 U/L* 1 Prueba de replegado 40x 531 U/L* 2 *Actividades reportadas aquí son unidades por L de enzima replegada.

Sialilación de glicoproteínas utilizando GST-ST3 Gal III replegada [0311] Veinte // L de Transferina asialilada (2 µ g/ µ L) de factor IX asialilado (2 µ g/ µ L) , se agregan a 50 µ L de un amortiguador que contiene Tris 50mM, pH 8.0; y NaCl 150 mM, con 10 µ L de MnCl2 100 mM; 10 µ L de CMP-NAN 200 mM; y azida de sodio 0.05%. La mezcla de reacción se incubó con 30 //L de GST-ST3GalIII replegada a 30 grados C durante la noche o más, con agitación a 250 rpm. Después de que se detienen las reacciones, las proteínas sialiladas se separan en IEF a pH 7-3 gel de enfoque isoeléctrico, (Isoelectric focusing gel, Invitrogen) y tiñen con azul de Comassie de acuerdo con las guías del fabricante . Se sialilaron tanto transferina como factor IX por GST-ST3GalIII (datos no mostrados) . Plegamiento de ST3GalIII de hígado de rata fusionada a una etiqueta MBP [0312] ST3GalIII de hígado de rata se clonó en vector pMAL-c2x y expresa como una fusión de proteína de enlace maltosa (MBP), MBP-ST3GalIII , en cuerpos de inclusión de células TBI de E. coli . MBP-ST3GalIII replegada se activa y transfiere ácido siálico a LNnT, un sustrato de azúcar, y a glicoproteína asialiladas, por ejemplo asíalo-transferina.

Clonación de ST3GalIII en vector pMAL-c2x [0313] El ácido nucleico ST3-GalIII de hígado de rata se clona en sitios J3amHl y XfoaEI del vector pMAL-c2x después de amplificación PCR utilizando los siguientes cebadores : Sentido ST3BAMH1 5 ' -TAATGGATTCAAGCTACACTTACTCCAATGG (SEQ ID NO:70) Antisentido: ST3XBA1 5 ' -GCGCTCTAGATCAGATACCACTGCTTAAGT (SEO ID NO: 71) [0314] Nucleótidos que codifican los aminoácidos 28-374, por ejemplo la región raíz y dominio catalítico de ST3GalIII se fusionaron a la etiqueta aminoácido MBP . [0315] Otros tres truncados de ST3GalIII se construyeron y fusionaron a MBP. Los tres insertos ST3Gal III ( ? 73 , ?85, ? 86) aislados por PCR utilizando los siguientes cebadores 5' (ST3 BamHl ? 73) TGTATCGGATCCCTGGCCACCAAGTACGCTAACTT (SEQ ID NO: 72); (ST3 BamHl ? 85) TGTATCGGATCCTGCAAACCCGGCTACGCTTCAGCCAT (SEQ ID NO:73); y (ST3 BamHl ? 86) TGTATCGGATCCAAACCCGGCTACGCTTCAGCCAT (SEQ ID NO: 74) respectivamente, en pares con el cebador 3' común (ST3-Xhol- GGTCTCCTCGAGTCAGATACCACTGCTTAA (SEQ ID NO: 75). Cada producto PCR se digiere con BamHl y Xhol, subclona en vector pCWin2-MBP Kanr digerido con BamHl-Xhol, transformado en células TBI y supervisado para construcción correcta. [0316] Reacciones PCR se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones . Un ciclo a 95 grados C por 1 minuto. Un ml de vent polimerasa se agrega. Diez de los siguientes ciclos se realizaron: 94 grados C por 1 minuto; 65 grados C por 1 minuto; y 72 grados C por 1 minuto. Después de 10 minutos finales a 72 grados C, la reacción se enfría a 4 grados C. [0317] Todos los truncados ST3GalIII tienen actividad después de replegado . Los experimentos descritos a continuación se realizaron utilizando el truncado MBP 073ST3GalIII . Expresión de MBP-ST3GalIII en células TBI de E. coli [0318] El plásmido pMAL-ST3GalIII se transforma en células TBI de E. coli químicamente competente. Tres colonias aisladas que contienen la construcción TB l/pMAL-ST3GalIII se seleccionaron de placas de agar LB . Las colonias se desarrollaron en 5 ml de medio LB suplementado con 60 //g/ml de carbenicilina a 37 grados C con agitación hasta que los cultivos de líquido alcanzaron un OD620 de 0.7. Dos alícuotas de un ml se retiraron de cada cultivo y utilizaron para inocular medio fresco con o sin IPTG 500 //M (final) . Los cultivos se desarrollaron a 37 grados C por dos horas. Células bacterianas se recolectaron por centrifugación. Lisados de células totales se prepararon calentando los precipitados celulares en la presencia de SDS y DTT. IPTG induce expresión de MBP-ST3GalIII (datos no mostrados) . Expresión de MBP-ST3GalIII y purificación de los cuerpos de inclusión: [0319] Una alícuota de un ml de cultivo nocturno de TBl/pMAL-ST3GalIII , se inocula en 0.5 litro de medio LB con 50 µg/ml de carbenícilina y desarrolla a un ODS20 de 0.7. La expresión de MBP-ST3GalIII se induce por adición de IPTG 0.5 mM, seguido por incubación durante la noche a temperatura ambiente . El día siguiente se cosecharon células bacterianas por centrifugación. Precipitados celulares se resuspendieron en un amortiguador que contiene Tris HCl 75 mM, pH 7.4; NaCl 100 mM; y glicerol al 1%. Células bacterianas se lisaron utilizando una prensa francesa. Fracciones solubles e insolubles se separaron por centrifugación por treinta minutos, 4 grados C, 10,000 rpm, Sorvall, SS 34 rotor) . Fracciones solubles e insolubles se separaron por centrifugación por treinta minutos a 10,000 RPM en un rotor Sorvall, SS 34 a 4 grados C. Purificación de los cuerpos de inclusión y replegado de MBP-ST3GalIII utilizando GSH/GSSG [0320] Los cuerpos de inclusión MBP-ST3GalIII se purificaron y suspendieron utilizando los mismos métodos y amortiguadores empleados para las proteínas de fusión GST-ST3GalIII descritas anteriormente. MBP-ST3GalIII se replegó utilizando el sistema GSH/GSSG descrito anteriormente. Las enzimas MBP-ST3GalIII replegadas se dializaron contra Tris.HCl 65 mM frío pH 7.5, NaCl 100 mM, glicerol al 1% utilizando bolsas de Diálisis Pierce SnakeSkin (MWCO: 7 kDa) . El MBP-ST3GalIII replegado y dializado se concentró de 3-14 veces utilizando Vivaspin 5 K (VivaScience) en centrífuga Jouan a 4,000 rpm a 4 grados C. Las proteínas MBP-ST3GalIII replegadas se analizaron por electroforesis SDS-Gel de Poliacrilamida. Se detectó un MBP-ST3GalIII de 81 kDa (Datos no mostrados) . Ensayo de actividad enzimática de MBP-ST3 Gal III [0321] Enzimas MBP-ST3 Gal III replegadas se ensayaron por habilidad para transferir ácido siálico de CMP-NAN a LNnT-APTS para formar LSTd-APTS, como se describió anteriormente. Las enzimas MBP-ST3 Gal III replegadas fueron activas y transfirieron ácido siálico a LNnT-APTS para formar LSTd-APTS . (Datos no mostrados) . [0322] Enzimas MBP-ST3 Gal III replegadas se ensayaron por habilidad para transferir ácido siálico de CMP-NAN en glicoproteínas. La transferencia de ácido siálico en asialo-transferina se ensayó como se describió anteriormente, para enzimas GST-ST3-GaIIII . Las enzimas MBP-ST3 Gal III replegadas fueron activas y transfirieron ácido siálico en asialo-transferina. (Datos no mostrados) . Aunque enzimas GST-ST3 Gal III y MBP-ST3 Gal III replegadas tuvieron actividades similares para transferencia de ácido siálico a una molécula aceptora oligosacárido soluble, enzimas MBP-ST3 Gal III replegadas fueron más activas en transferencia de ácido siálico a una molécula aceptora de glicoproteína. Ensayos adicionales de condiciones para replegar MBP-ST3Gal III [0323] MBP-ST3GalIII se pliega utilizando las condiciones mostradas en la . Figura 1. El amortiguador, par redox y detergente (si se emplean) , se mezclaron antes de adición de IB solubilizados para iniciar la reacción de replegado. IB se diluyeron 1/20. Replegamiento de MBP-ST3GalIII también fue exitoso utilizando diferentes pares redox, por ejemplo Cistamina 2HC1/Cisteína en proporciones molares de 1/4, 4/1, 1/10 o 5/5. (Datos no mostrados) . Ensayos de actividad enzimática ST3 Gal III [0324] Enzimas MBP-ST3 Gal III replegadas se ensayaron por habilidad para transferir ácido siálico de CMP-NAN a LNnT-APTS para formar LSTd-APTS, como se describió anteriormente. Los resultados se ilustran en la Figura 1. Las actividades de MBP-ST3 Gal III de replegado más altas se vieron utilizando las condiciones 8, 11, 13 y 16. Cuando se aumenta en escala el replegado a cinco ml, las proteínas MBP-ST3 Gal III replegadas utilizando las condiciones 8 y 16, tuvieron la más alta actividad. (Ver, por ejemplo Tabla 4) . Tabla 4.

Condición U/L proteína replegada U/g IB 8 70 37.0 6 50 40.5 Purificación de MBP-ST3GalIII en columna de amilosa [0325] Proteínas MBP-ST3 GalIII replegadas de la preparación de replegado de 5 ml se combinaron y dializaron contra Tris HCl 100 mM de pH 7.4, NaCl 100 mM y glicerol al 1%. Las proteínas MBP-ST3GalIII replegadas se aplicaron a una columna de amilosa. La mayoría de la proteína MBP-ST3GalIII replegada se ligó a la columna de amilosa y eluyó con maltosa a 10 mM. Un perfil de elución se muestra en la Figura 2. Actividad enzimática de las fracciones MBP-ST3GalIII se determina utilizando el ensayo LnNT y se muestra en la Figura 3. GlicoPEGilación de asialotransferina con MBP-ST3GalIII de replegado: [0326] Asialo-transferina (2 mg/ml) se incuba con fracciones purificadas de 100 µl de MBP-ST3GaIIII en la presencia de CMP-SA-PEG (10 kDa, 1.6 mM) o CMP-SA-PEG (20 kDa, 1.06 mM) en 230 µl de reacción. Reacciones de GlicoPEGilación se llevaron a cabo a 30 grados C durante la noche o por tres días. Se retiraron alícuotas de las reacciones y analizaron en 4-SDS-gel de poliacrilamida al 20%. Los resultados se muestran en la Figura 4. MBP-ST3GalIII purificada replegada transfiere 10 o 20 K ácidos siálicos PEGilados a asialo-transferina. Replegado de MBP-ST3GalIII a gran escala [0327] El siguiente método se empleó para producir MBP-ST3GalIII replegada a gran escala. [0328] IB húmedos (470 mg) se disuelven en Amortiguador de solubilización IB (13 ml) en un tubo de cultivo de 15 ml . Amortiguador de solubilización IB incluye lo siguiente: HCl Guanidina 4M; TrisHCl 100 mM, pH 9; y NaCl 100 mM. Se incubaron IB en amortiguador de solubilización IB a 4 grados C por aproximadamente 1 hora con ligera agitación. Cualquier material insoluble se retiró por centrifugación en tubos Eppendorf de 1.5 mL, a 4 grados C a máxima velocidad, por 30 minutos. Los IB solubilizados se transfieren a tubos limpios y se determina la concentración de proteína utilizando absorbancia a 280 n .

[0329] La siguiente solución de replegado se prepara y mantiene a 4 grados C: amortiguador MES 55 mM, pH 6.5; NaCl 264 mM; KCl 11 mM; PEG 550 0.055 %; Arginina 550 mM. El amortiguador se suplementa con lauril maltosida 0.3 mM (LM) ; glutationa oxidada 0.1 mM (GSSG) ; glutationa reducida 1 mM (GSH) inmediatamente antes de la adición de IB solubilizado. Dos ml de IB solubilizado se agregan en 43 ml de amortiguador de replegado en 50 ml de tubo de cultivo estéril . El tubo se coloca en un agitador-aparato de oscilación y se agita ligeramente por 24 horas a 4 grados C. La proteína replegada se dializa en tubos de diálisis (MWCO: 7 kD) contra amortiguador de diálisis (TrisHCl 100 mM, pH 7.5; NaCl 100 mM; y glicerol al 5%) dos veces (en amortiguador en exceso 10-20 volúmenes) . [0330] ST3GalIII replegada, dializada a gran escala se analiza por actividad de MBP-Gal III y exhibe aproximadamente 53.6 U/g de IB. Ejemplo 2: Mutagénesis Dirigida en Sitio de GnTI Humano para Mejorar el replegado. [0331] Una N-acetilglucosaminiltransferasa humana truncada I (103 amino ácidos terminales amino eliminado) se expresa en E. coli , como una proteína de fusión de enlace maltosa (GnTl/MBP) . La proteína de fusión fue insoluble y se expresó en cuerpos de inclusión. Después de solubilización y replegado, la proteína de fusión GnTl/MBP tuvo baja actividad. La estructura de cristal de una forma truncada de GnTI de conejo (105 amino ácidos amino terminal eliminados) mostró un residuo cisteína no apareado (CYS123) cerca del sitio activo. (Ver, por ejemplo Unligil et al . , EMBO J. 19: 5269-5280 (2000)). La cisteína no apareada correspondiente en GnTI humano se identifica como CYS121 y se reemplaza con una serie de amino ácidos que son similares en tamaño y en características químicas. Los amino ácidos empleados incluyen serina (Ser) , treonina (Thr), alanina (Ala) y ácido aspártico (Asp) . Además, un doble mutante, ARG120ALA, CYS121HIS, también se elaboró. Las proteínas de fusión GnTl/MBP mutante se expresaron en E. coli , replegaron y ensayaron para actividad GnTI hacia glicoproteínas . [0332] Se realizó mutagénesis utilizando un Equipo de Mutagénesis de Guía de Sitio (Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene) . Sitios de restricción adicionales se introdujeron con algo de las mutaciones GnTl. For ejemplo, un sitio Apal (subrayado, GGGCCCAC) se introduce en el mutante GnTI ARG120ALA, CYS121HIS, es decir CGC CTG GCC CAC (cambios en negritas) . Los siguientes oligonucleótidos mutagénicos se emplearon para producir el doble mutante: GnTl R120A, C121H+, ' CCGCAGCACTGTTCGGGCCCACCTGGACAAGCTGCTG3 ' (SEQ ID NO: 76); y GnTI R120A, C121H- 5 ' CAGCAGCTTGTCCAGGTGGGCCCGAACAGTGCTGCGG 3 ' (SEQ ID NO: 77) (cambios mostrados en negritas) . Un sitio Ascí (subrayado, GGCGCGCC) se introduce en el mutante GnTI CYS121ALA, es decir CTG->GCC (cambios en negritas) . Los siguientes oligonucleótidos mutagénicos se emplearon para producir el mutante GnTlC123A+ 5 ' GGACTGTTCGGCGCGCCCTGGACAAGCTGCTG 3 (SEQ ID NO: 78); y GnTlC123A-5'CAGCAGCTTGTCCAGGGCGCGCCGAACAGTGCT 3 ' (SEQ ID NO: 79) . [0333] La actividad de las proteínas mutantes expresadas en E . coli se compara con la actividad de GnTl de tipo silvestre expresado en baculovirus . Un mutante ACYS 121 SER GNTI fue activo en un ensayo base TLC. En contraste, un mutante CYS121THR no tuvo actividad detectable y un mutante CYS121ASP tuvo baja actividad. Un mutante CYS121ALA fue muy activo y un doble mutante, ARG120ALA, CYS121HIS, basado en la secuencia de amino ácidos de la proteína GnTI C. elegans (Glyl4) , también exhibió actividad, incluyendo transferencia de GlcNAc en glicoproteínas. Secuencias de amino ácidos y de ácido nucleico de codificación de los mutantes GnTl se proporcionan en las Figuras 7-11.

[0334] Un segundo truncado GnTl se elaboró y fusionó con MBP: MBP-GnTl (D35) . La Figura 35 proporciona un esquemático de las proteínas de fusión MBP-GnTl e ilustra los truncados, por ejemplo ? 103 o A 35, y la mutación Cysl21Ser (superior) . La base o el fondo de la figura proporciona la proteína GnTl humana de longitud ¿? . Mutaciones de Cysl21 también se elaboraron en la proteína MBP-GnTl (D35) . [0335] Ambas proteínas de fusión se expresaron en E. coli y ambas tuvieron actividad para remodelar lak glicoproteína B RNAsa. La Figura 36 proporciona un gel SDS-PAGE que muestra en el panel derecho las proteínas de fusión MBP-GnTI replegadas: MBP-GnTl (D35) C121A, MBP-GnTl (D103) R120A + C121H, y MBP-GnTl (D103) C121A. El panel izquierdo muestra las actividades para remodelar la glicoproteína B RNAsa de dos lotes diferentes (Al y A2) de MBP-GnTl (D35) C121A replegaron en diferentes puntos en tiempo. MBP-GnTI (D103) C121A también se remodeló la glicoproteína B RNAsa . ?o se muestran datos. Ejemplo 3: Fusiones MPB con GalTl. [0336] Las siguientes fusiones entre GalTl y MBP bovino truncado se construyeron: MBP-GalTl (D129) wt, (D70) wt o (D129 C342T) . (Para la secuencia bovino de longitud íntegra, ver por ejemplo D'Agostaro et al . , Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989) y número de acceso CAA32695) . Cada construcción tuvo actividad después de replegado. La secuencia de amino ácidos de la proteína GalTl bovina de longitud íntegra se proporciona en la Figura 30. Los mutantes se ilustran esquemáticamente en la Figura 31 con una proteína de control GalTl (40) (S96A+C342T) . Ver, por ejemplo Ramakrishnan et al . , J. Biol . Chem . 276: 37666-37671 (2001). [0337] MBP-GalTl (D70) se expresa en la cepa JM109 E. coli . Después de inducción durante la noche con IPTG, cuerpos de inclusión se aislaron del precipitado insoluble después de que las células se lisaron utilizando una prensa francesa. Los IB se lavaron dos veces y luego solubilizaron en GndHCl 4M, NaCl 100 mM, TrisHCl 0.1 M pH 9.0. El replegado se realizó a pH 6.5 con GSSH/GSH (10/1) por dilución en amortiguador de replegado (1/20, 0.1-0.2 mg/ml de proteína), seguido por incubación durante la noche a 4 grados C, sin agitación. Las proteínas replegadas se dializaron contra TrisHCl 50 mM pH 8.0 dos veces (MWCO: 7 kD) . Las proteínas MBP-GalTl (D70) dializadas se cargaron en una columna de amilosa; lavaron y después eluyeron con maltosa 10 mM. [0338] Actividad GalTl se ensayó utilizando oligosacáridos como un aceptor. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo utilizando cromatografía de líquido de alto desempeño con detección amperométrica pulsada (HPLC/PAD= High Performance Liquid Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) . La conversión de LNT2 (Lacto-N-Triosa-2 ) en LNnT (Lacto-N-Neotetraosa) utilizando UDP-Gal (Uridina 5 ' -Difosfogalactosa) por la enzima GalTl se realizó como sigue: la reacción se llevó a cabo en 100 pi de amortiguador Hepes 50 mM, pH 7 que contiene UDP-Gal 6 mM, LNT-2 5 mM, MnCl2 5 mM y 100 µ l de enzima replegada a 37 grados C por 60 minutos. La reacción se neutralizó (dilución 1 a 10) con agua y centrifugó a través de un filtro de centrifugado de ,000 MWCO. El filtrado después se diluyó 1 a 10. Esta reacción diluida se analizó por HPLC utilizando un sistema Dionex DX-500 y una columna CarboPac PAl con hidróxido de sodio. El área pico para producto muestra se comparó con una curva de calibración LNnT y la actividad se calculó con base en la cantidad de LNnT producido por µ 1 de enzima de la reacción. [0339] Las proteínas MBP-GalTl purificadas (D70) tuvieron actividad utilizando tanto oligosacáridos como glicoproteínas (RNAseB) solubles como moléculas aceptoras. Los resultados se muestran en las figuras 32 y 33. En el ensayo de remodelación RNAse B, MBP-GalTl (D70) se comparó con una proteína de control GalTl (40) (S96A+C342T) , que es un truncado sin fusión de la proteína GalTl bovina que también se expresó en E. coli y replegó. La proteína MBP-GalTl (D70) tuvo más actividad hacia la glicoproteína RNAse B que GalTl (40) (S96A+C342T) . El truncado MBP-GalTl (D129) tuvo también más actividad hacia la glicoproteína RNAse B que la proteína GalTl (40) (S96A+C342T) . (Datos no mostrados) . [0340] La cinética de la proteína MBP-GalTl (D70) replegada y purificada para glicosilación de RNAse B se determinó y comparó con NSOGalTl, una forma soluble de la proteína GalTl bovina que se expresó en un sistema de células de mamífero. Como se muestra en la figura 34, la MBP-GalTl (D70) replegada y purificada tuvo cinética mejorada en comparación con la proteína NSO GalTl. Ejemplo 4: Métodos de un recipiente para replegar múltiples Glicosiltransferasas. [0341] Enzimas eucarióticas ST3GalIII, GalTl, y GnTl construyen cadenas N-glicano en glicoproteínas. Modificaciones adicionales por ejemplo GlicoPEGilación pueden realizarse utilizando NAN-PEG como un substrato donador. Enzimas eucarióticas ST3GalIII, GalTl, y GnTI se expresan típicamente en sistemas de expresión eucarióticos, por ejemplo células fúngales o de mamífero. [0342] Enzimas eucarióticas ST3GalIII, GalTl, y GnTl cada una se fusionan a un dominio de proteína de enlace maltosa (MBP) , se solubilizan, combinan y repliegan conjunto en un solo recipiente. Las enzimas fusionadas y replegadas MBP fueron activas y se utilizaron para agregar N-glicanos a glicoproteínas o para glicoPEGilar glicoproteínas. El amortiguador de replegado incluye un par redox, por ejemplo glutationa oxidada/reducida (GSH/GSSG) . El replegado se mejora por adición de arginina y polietilenglicol 3350 (PEG) . Los IB pueden ser solubilizados individualmente y agregados a amortiguador de replegado en diferentes proporciones o solubilizados en conjunto de IB y agregados al amortiguador de replegado directamente. La purificación o inmovilización de una etapa de estas enzimas también puede realizarse utilizando la etiqueta de fusión MBP. Preparación de una mezcla glicosil transferasa replegada ( SuperGlycoMix) . Preparación de las IB de glicosiltransferasas. [0343] Cepas bacterianas utilizadas para producir enzimas eucarióticas ST3GalIII, GalTl, y GnTl se ilustran en la tabla 5. La tabla también muestra el peso molecular estimado de las propiedades de fusión MBP. (MW con base en composición de aminoácido, soporte lógico o programa Vector NTI) . Todos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas eucarióticas se expresaron de vectores de expresión inducibles por IPTG. Tabla 5. cepa/Construcción Proteína MW (kD) expresada (IBS's) JM109/pCWori-MBP- MBP-GalTl (?129) 74.2 GaTl (?129) C342T C342T JM109/pCWIN2-MBP- MBP-GnTl ( ? 103 ) 82.4 GnTl(?l03) C121A C121A TBl/pMAL- MBP-ST3GalIII 82 ST3GalIII

[0344] Siguiendo la inducción de IPTG de cultivos de E. coli , IBs que contienen enzimas GnTl , GalTl y ST3GalIII aisladas (lisis) de las células utilizando una prensa francesa o lisis detergente (reactivo Bugbuster de Novagen) . Los precipitados se recuperaron después de centrifugación y procesaron para obtener IBs como se describió previamente. IBs se lavaron al menos dos veces utilizando amortiguador de lavado de IB Novagen. IBs lavados se almacenaron a -20 grados C hasta que están listos para utilizarse en experimentos de replegado . [0345] IBs que contienen ST3GalIII, GalTl, o GnTl se disolvieron por separado en un amortiguador que contiene guanidina HCl 6 M, TrisHCl 50 mM pH 8.0, EDTA 5 mM, DTT 10 mM a 0 grados C por una hora. Se obtuvieron sobrenadantes aclarados después de centrifugación (velocidad máxima en Micro-centrífuga Eppendorf) . El contenido de proteína de los IBs solubilizados se determina al medir la absorbancia a 280 nm. Los contenidos de proteínas en la tabla 6 se determinaron con base en los coeficientes de extinción de cada MBP-Glicosiltransferasa. Los coeficientes de extinción se calcularon utilizando el programa o soporte lógico Vector NTi (ver tabla 5) . Tabla" 6. Concentraciones de proteína en IBs solubilizados.

Proteína A280 a 1 mg/ml mg/ml MBP-ST3GalIII 1.49 4.23 MBP-GalTl (? 129) C342T 1.39 6.80 MBP-GnTl(? 103) C121A 1.7 3.29 Plegado en un recipiente de glicosiltransferasas. [0346] IBs solubilizados se mezclaron en cantidades iguales como se ilustra en la tabla 7. Tabla 7. IBs solubilizados se mezclaron en las siguientes cantidades antes de replegar.

Proteína V ( L) mg % de proteina total MBP-ST3GalIII 0.8 3.4 36 MBP-GalTl (?129) C342T 0.5 3.4 36 MBP-GnTl (?103) C121A 0.8 2.6 28 Total 2.1 9.4 100 [0347] La concentración de proteína de la mezcla de IB solubilizada total fue 4.5 mg/ml. La mezcla se diluyó aproximadamente 1/20 en amortiguador de replegado haciendo la concentración final de la mezcla de proteínas total 0.22 mg/mL. Amortiguador de replegado contiene MES 55mM, pH 6.5; arginina 550 mM; PEG3350 0.055%; NaCl 264 mM; KCl 11 mM; GSH 1 mM; y GSSG 0.1 mM . El replegado también puede realizarse en un amortiguador con Tris HCl, pH 8.2 y par redox cisteína/cistamina puede ser substituido por GSH/GSSG. La mezcla IB se diluyó en el amortiguador de replegado e incubó a 4 grados C durante la noche (16-18 horas) . Concentraciones estimadas de las glicosiltransferasas en la región de replegado: MBP-ST3GalIII 0.081 mg/mL MBP-GalTl (? 129) C342T 0.081 mg/mL MBP-GnTl (?103) C121A 0.062 mg/mL [0348] Después de replegado durante la noche, la mezcla de glicosiltransferasa replegada se realizó para retirar agente caotrópico (es decir HClguanidina) . Se llevó a cabo diálisis dos veces contra TrisHCl 50 mM pH 8.0 a 4 grados C (20 veces por diálisis) en una bolsa de diálisis (SnakeSkin, MWCO: 7 kD, Pierce) . La mezcla de glicosiltransferasa replegada dializada (Superglycomix, SGM) se concentra seis veces utilizando concentradores centrífugos Vivaspin 6 mL (MWCO: 10 kD) . Después de concentración, todas las tres glicoproteínas estuvieron presentes en la mezcla como se determina por análisis SDS- PAGE (datos no mostrados) . Después de concentrar el SGM, actividades enzimáticas de GnTl, GalTl, y ST3GalIII se determinaron. Actividades enzimáticas de SuperGlycoMix [0349] Superglycomix (SGM) , la mezcla de glicosiltransferasa de replegado en un recipiente contiene tres glicosiltransferasas: ST3GalIII, GalTl y GnTI . Estas enzimas se ensayaron individualmente por sus actividades enzimáticas y analizaron utilizando los métodos indicados a continuación. Las actividades enzimáticas se citan en la tabla 8. Ensayos de actividad enzimática de ST3 Gal III [0350] Ensayos de ST3GalIII se llevan a cabo utilizando cromatografía de líquido con alto desempeño con detecciones ultravioleta (HPLC/UV= High Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection) . Las conversiones de LNnT (Lacto-N-Neotetraosa) en LSTd (Lactosiálico-Tetrasacárido-d) utilizando CMP-NAN (citidine 5 ' -Monofosfato-p-D-ácido siálico) por enzima ST3GalIII se realizó como sigue. La reacción se llevó a cabo en una placa de micro titulación de 96 pozos en 100 µL de amortiguador MOPS 20 mM, pH 6.5 que contiene CMP-NAN 2 mM, LNnT 30 mM, MnCl2 lOmM y 20 µl de enzima replegada a 30 grados C por 120 minutos. La reacción de neutralizó al calentar a 98 grados C por un minuto. La placa de micro titulación se centrifugó a 3600 rpm por 10 minutos para formar cualquier precipitado. 75 µl de sobrenadante se diluye en 1:1 con 75 µl de agua. La reacción diluida se analiza por LC/UV utilizando una columna YMC-Pack Polyamine II con un gradiente de amortiguador fosfato de sodio/acetonitrilo y detección a 200 nm. El área pico del producto de muestra se compara a una curva de calibración LSTd y la actividad se calcula con base en la cantidad de LSTd producida por minuto por µl de enzima de la reacción. Ensayos de actividad enzimática GalTl: [0351] Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo utilizando HPLC/PAD. La conversión de LNT2 (Lacto-N- Triosa-2) en LNnT (Lacto-N-Neotetraosa) utilizando UDP-Gal (Uridina 5 ' -Difosfogalactosa) por la enzima GalTl se realizó como sigue. La reacción se llevó a cabo en 100 µl de amortiguador Hepes 50 mM, pH 7 que contiene UDP-Gal 6 mM, LNT-2 5 mM, MnCl2 y 100 µl de enzima replegada a 37 grados C por 60 minutos. La reacción se neutralizó (dilución 1 a 10) con agua y centrifugó a través de un filtro de centrifugado de 10,000 MWCO. El filtrado después se diluyó 1 a 10. Esta reacción diluida se analiza por HPLC utilizando un sistema Dionex DX-500 y una columna CarboPac PAl con amortiguador hidróxido de sodio. El área pico de producto de muestra se comparó con una curva de calibración LNnT y la actividad se calculó con base en la cantidad de LNnT producido por minuto por µl de enzima de la reacción. Ensayos de actividad enzimática GnTI : [0352] La actividad GnTI se determina al medir la transferencia de un azúcar tritiada de UDP-3H-GlcNAc (Uridina difosfato N-acetil-D-glucosamina [6-3H(N)]) a N-octil 3 , 6-Di-O- ( a -mannopiranosil) -D-mannopiranoside (0M3), un núcleo trimanosil con una cola octil. La reacción se lleva a cabo en 20 µl de amortiguador MES 100 mM, pH 6.0 que contiene UDP-GlcNAc 3 mM, UDP-3H-GlcNAc 0.1 mM, OM3 0.5 mM, MNC1220 mM y 10 µl de enzima replegada a 37 grados C por 60 minutos. La reacción se neutralizó (dilución 1 a 6) con agua y aplicó a una resina de fase inversa polimérica en un formato de 96 pozos que se acondicionó previamente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La resina se lava dos veces con 200 µl de agua y el producto se eluyó con 50 µl de MeOH 100% en una placa de captura. Fluido de destelleo (200 µl) se agrega a cada pozo y la placa se mezcla y cuenta utilizando un contador de destelleo de mícroplacas PerkinElmer TopCount NXT. La actividad se calcula con base en la cantidad de 3H-GlcNAc incorporada en el producto por minuto por µl de enzima en la reacción. Tabla 8. Actividades enzimáticas de glicosiltransferasas replegadas en SGM.

Actividad enzimática mU/mL GnTl 1 GalTl 165 ST3GalIII 10 [0353] Las actividades reportadas en la tabla anterior son cercanas o están en el intervalo cuando estas enzimas se replegaron por separado. Actividades de GnTl y GalTl son cercanas a aquellas obtenidas utilizando sistemas de expresión de baculovirus o de mamífero. Actividades de ST3GalIII son algo menores que en preparación de ST3GalIII obtenida después del sistema de expresión fungal . El ensayo ST3GalIII empleado aquí se modifica del procedimiento y valores reportados aquí aproximadamente 4-5 veces menores que los obtenidos por un método basado en electroforesis capilar-fluorescencia inducida por láser (CE-LIF= Capillary electrophoresis-Láser induced Fluorescence) .

Remodelación de RNAseB-Man5 utilizando Superglycomix. [0354] Una pequeña glicoproteína, RNAseB con un azúcar Man5 enlazada con N, se remodeló por SGM en la presencia de UDP-azúcares (UDP-GIcNAc y UDP-Gal) . La reacción de remodelado se llevó a cabo ya sea utilizando UDP-GlcNAc o tanto UDP-GIcNAc como UDP-Gal para probar ambas actividades de GnTl y GalTl . Ocho // 1 de SGM se agregan a amortiguador MES 10 mM pH 6.5 que contiene UDP-GlcNAc 5 mM o/y UDP-Gal 5 mM, 9 ig de RNAseBMan5, MnCl2 5 mM en 25 µ l de ensayo incubados a 33 grados C durante la noche hasta 48 horas. Al final de la reacción, alícuotas de 10 µ l se dializaron contra H20 y muestras de 1.5 µ l se aplicaron por puntos en placas MALDI-TOF. Se analizaron muestras en MALDI-TOF después de tratarse con TFA y ácido cinapínico. [0355] El remodelado de RNAseBman5 se realiza al transferir GlcNAc y Gal en Man5 de RNaseB . Después de 48 horas de incubación a 33 grados C, la mayoría de la transferencia de Glc?Ac y Gal en R?AseB se logra como se indica en espectros MALDI-TOF de R?AseBMan5 remodelado. Los resultados se resumen en la Tabla 9. Tabla 9. Espectros MALDI-TOF de las especies después de reacciones SGM. m/z R?AseB Reacción Man. Man5-GlcNAc Man5GlcNAc - Gal Sin enzima 14983 SGM+ UDP- 14973 15177 GlcNAc SGM+ UDP- 14982 15170 15348 GIcNAc +UDP- Gal GlicoPEGilación de remodelado EPO utilizando SGM [0356] GlicoPEGilación (20 K) se llevó a cabo en reacción del recipiente compuesta por los siguientes componentes: MES 10 mM pH 6.5, MgCl2 5 mM, UDP-GlcNAc 5 mM, UDP-GalNAc 5 M, CMP-SA-PEG 0.5 mM (20 kDa), 24 µ g de EPO, 8 µ l de SGM concentrado. En reacciones de control, SGM se reemplaza por enzimas individuales ya sea replegadas o expresadas en células de mamífero o células de insecto o Aspergillus . Después de incubaciones durante la noche, se analizaron las reacciones en SDS-gel de poliacrilamida. Los resultados se muestran en la Figura 5. SGM agregó 20K de PEG a EPO. Evaluación de condiciones de replegado en un recipiente para múltiples glicosiltransferasas .

[0357] Se evaluaron condiciones para replegar múltiples glicosiltransferasas, incluyendo pH y replegar dos o tres enzimas a la vez . Preparación de cuerpos de inclusión de glicosiltransferasa [0358] Cepas de E . coli transformadas con plásmidos de expresión de glicosiltransferasa se describieron previamente, con una excepción. MBP-ST3GalIII se expresó en células JM109 a partir de un plásmido pCWori-ST3GalIII . Los cuerpos de inclusión se aislaron y solubilizaron como se describió anteriormente. Contenidos de proteínas se estimaron como se describió anteriormente y se muestran en la Tabla 10. Tabla 10. IB solubilizados se mezclaron a las siguientes cantidades antes de replegar.

Proteína A280 A280 (at 1 mg % (de mg/ml) proteina de solución) MBP-ST3GalIII 32.3 1.49 21 . 7 13 . 6 MBP-GalTl 35.7 1.39 25 . 7 13 . 7 (?129) C342T MBP-GnTl 42.8 1.7 25.2 9.7 (?103) C121S Plegado en un recipiente de mezclas de glicosiltransferasa IB [0359] Después de determinar sus contenidos de proteínas, IB solubilizados se mezclaron en las cantidades mostradas antes de diluir en los amortiguadores de replegado (Tabla 11) . Experimentos de replegado de los GT se llevan a cabo en volumen de 44 ml a 4 grados C en fase estacionaria utilizando amortiguador A o B (a continuación) y GSSG 0.1 mM y GSH 1 mM. Amortiguador A: MES 55 mM pH 6.5, Arginina 550 mM, PEG3350 0.055%, NaCl 264 mM, KCl 11 mM, suplementado con GSH 1 mM, GSSG 0.1 mM. Amortiguador B: TrisHCl 55 mM pH 8, Arginina 550 mM, PEG3350 0.055%, NaCl 264 mM, KCl 11 mM, suplementado con GSH 1 mM, GSSG 0.1 mM. Tabla 11. Cantidades mezcladas de GT IB solubilizados en 2 mL de IBSB Plegado en amortiguador A Plegado 1 (A-2x) Conc (mg/mL) V(mL) mg MBP-GnTl(? 103) C121S 25.2 0.2 5 MBP-GalTl (? 129) C342T 25.7 0.2 5 IBSB - 1.6 - Plegado 2 (A-3x) Conc (mg/mL) V (mL) mg MBP-GnTl (? 103) C121S 25.2 0.2 5 MBP-GalTl (? 129) C342T 25.7 0.2 5 MBP-ST3 GalIII 21.7 0.4 8.7 IBSB - 1.2 Plegado en amortiguador B Plegado 3 (B-2x) Conc (mg/mL) V(mL) mg MBP-GnTI (? 103) C121S 25.2 0.2 5 MBP-GalTl (? 129) C342T 25.7 0.2 5 IBSB - 1.4 - Plegado 4 (B-3x) Conc (mg/mL) V(mL) mg MBP-GnTl(? 103) C121S 25.2 0.2 5 MBP-GalTl (?129) C342T 25.7 0.2 5 MBP-ST3GalIII 21.7 0.4 8.7 IBSB _ 1.2

[0360] Para replegado doble (2x, 2 glicosiltransferasas, 10 mg de proteína total en 2 mM se agregan en 41 mL de amortiguador de replegado (anterior) 0.45 ml de GSH 100 mM, 0.45 mL de GSSG 10 mM, después de dilución de proteína total fue 0.44 mg/ml. Para replegado triple (3x, 3 glicosiltransferasas (18. mg de proteína totales 2 mL se agregan en 41 mL de amortiguador de replegado (anterior) 0.45 mM de GSH 100 mM, 0.45 mL de GSSG 10 mM. Después de dilución la proteína total fue 0.83 mg/mL. Las concentraciones de proteína fueron superiores al experimento de triple replegado previo (0.22 mg/mL en SGM) . Concentraciones estimadas de las glicosiltransferasas en la reacción de replegado siguen: MBP-ST3GalIII 0.39 mg/mL MBP-GalTl (? 129) C342T 0.23 mg/mL MBP-GnTl(? 103) C121S 0.23 mg/mL [0361] Después de replegado durante la noche, se dializa la mezcla de glicosiltransferasa replegada.

Se lleva a cabo diálisis dos veces contra TrisHCl 50 mM a pH 8.0 a 4 grados C en una bolsa de diálisis (SnakeSkin, MWCO: 7 kD, Pierce) . Después de diálisis, la mezcla de glicosiltransferasa se concentra 9-12 veces utilizando 6 mL de concentradores de centrífuga VIVA-Spin (MWCO: 10 K) . [0362] Análisis SDS-PAGE demuestra que las proteínas estuvieron presentes después de replegar, diálisis y concentración. Ensayos enzimáticos de mezclas de glicosiltransferasa replegadas [0363] Se realizaron ensayos enzimáticos como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 12. Tabla 12. Actividades enzimáticas glicosiltransferasas replegadas después de experimentos de replegado dobles y triples .

Plegado Concentración de Pl. Actividad mU/mL enzimática Amortiguador A (A-2x) GnTl 0.84 GalTl 598 Amortiguador A (A-3x) GnTI 0.16 GalTl 306 ST3GalIII 4 Amortiguador B (B-2x) GnTl 3.32 GalTl 747 Amortiguador B (B-3x) GnTl 0.47 GalTl 425 ST3GalIII 11

[0364] La más alta actividad se ve al mezclar GnTl y GalTl fusionadas con MBP en cantidades iguales y equilibrar en amortiguador B. El agregar cantidad no equivalente de ST3GalIII fusionado con MBP afecta la eficiencia de replegado debido al total de alta proteína. Sin embargo, dos diferentes amortiguadores de replegado utilizando ya sea dos GT o tres GT pueden emplarse para obtener proteínas solubles activas . Ejemplo 5: Replegado de GalNAcT2 eucariótica. [0365] Una enzima GalNAcT2 humana truncada se expresa en E. coli y utiliza para determinar condiciones óptimas para solubilización y replegado utilizando los métodos descritos anteriormente. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de GalNAcT2 humana de longitud íntegra se proporciona en las Figuras 13A y B.

Las secuencias de la proteína mutante GalNAcT2 (D51) , se muestran en las Figuras 14A y B. El mutante se expresó en E. coli como una proteína de fusión MBP, MBP-GalNAcT2 (D51) . Otros mutantes GalNAcT2 se elaboraron, expresaron en E. coli y fueron capaces de replegarse: MBP-GalNAcT2 (D40) , MBP-GalNAcT2 (D73), y MBP- GalNAcT2 (D94) . Los datos no se muestran. Detalles de la construcción de los mutantes de eliminación adicional se encuentran en la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/576,530, presentada en junio 3, 2004 y la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/598,584, presentada en agosto 3, 2004, ambas de las cuales aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos. [0366] Cultivos de bacterias que expresan MBP-GalNAcT2 (D51) se desarrollaron y cosecharon como se describió anteriormente. Se purificaron cuerpos de inclusión de bacterias como se describió anteriormente. La solubilización de los cuerpos de inclusión se realiza a pH 6.5 o a pH 8.0. Después de solubilización, proteína MBP-GaINAcT2 (D51) se replega ya sea a pH 6.5 o pH 8.0 utilizando los amortiguadores A y B, es decir, Amortiguador A: MES 55 mM pH 6.5, Arginina 550 mM, PEG3350 0.055%, NaCl 264 mM, KCl 11 mM, suplementado con GSH 1 mM, GSSG 0.1 mM; y Amortiguador B: TrisHCl 55 mM pH 8, Arginina 550 mM, PEG3350 0.055%, NaCl 264 mM, KCl 11 mM, suplementado con GSH 1 mM, GSSG 0.1 mM. Después de replegar, la proteína MBP-GaINAcT2 (D51) se dializa y concentra. La Figura 15 proporciona una demostración de la concentración de proteína de MBP-GaINAcT2 (D51) replegada después de solubilización a pH 6.5 o pH 8.0 y replegado a pH 6.5 o pH 8.0. [0367] Un ensayo [3H] -UDP-GalNAc radioetiquetado se realiza para determinar la actividad de la MBP-GaINAcT2 (D51) expresada en E. coli , al supervisar la adición de GalNAc radioetiquetada a un aceptor de péptido. El aceptor fue un péptido tipo MuC-2 que tiene la secuencia MVTPTPTPTC (SEQ ID NO: 80). El péptido se disolvió en Tris-HCl ÍM pH=8.0. Ver por ejemplo la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/576,530 presentada en junio 3, 2004; y la solicitud de patente provisional de los E.U.A. Número de expediente del agente 040853-01-5149-P1, presentada en agosto 3, 2004; Ambas de las cuales aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos . La Figura 16 proporciona una demostración de la actividad enzimática de MBP-GalNAcT2 (D51) replegada después de solubilización a pH 6.5 o pH 8.0 y replegado a pH 6.5 o pH 8.0. La Figura 17 proporciona una demostración de la actividad específica de MBP-GaINAcT2 (D51) replegada después de solubilización a pH 6.5 o pH 8.0 y replegado a pH 6.5 o pH 8.0. Los más altos niveles de actividad se observaron con MBP-GaINAcT2 (D51) que se ha solubilizado a pH 8.0 y replegado a pH 8.0. Los niveles de más alta actividad específica también se observaron con solubilización a pH 8.0 y replegado a pH 8.0. [0368] MBP-GalNAcT2 (D51) solubilizada y replegada se ensaya por solubilidad para agregar GalNAc a la proteína G-CSF. El ensayo consiste de un alícuota de enzima y un amortiguador de reacción (MES 27mM, pH=7, NaCl 200mM, MgCl2 20mM, MnCl2 20mM y Tween 80 0.1%), proteína G-CSF (2 mg/ml en H20) , y UDP-GalNAc lOOmM. Para cada muestra de replegado, 4.4 µ L de muestra se agregan a 15 µ L de solución de reacción. Para el control positivo, 1 //L de baculovirus GalNAcT2 estándar se agrega junto con 3.4 µ L de H20 a un tubo. Se incubaron reacciones a 32 grados C en un agitador rotatorio por varios días, durante ese tiempo, un punto en tiempo durante la noche y un punto en tiempo a cinco días se ensayaron por MALDI . Ver por ejemplo la solicitud de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/576,530 presentada en junio 3, 2004; y la solicitud de patente provisional de los E.U.A. Número de expediente de Agente 040853-01-5149-P1, presentada en agosto 3, 2004; ambas de las cuales aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos . [0369] Las Figuras 18A y 18B proporcionan resultados de remodelado de factor de estímulo de colonia de granulocitos recombinante (GCSF) utilizando MBP-GaINAcT2 (D51) replegada después de solubilización a pH 6.5 o pH 8.0 y replegado a pH 6.5 o pH 8.0. Un control positivo, es decir, MBP- GalNAcT2 (D51) purificado que se ha expresado en baculovirus, y un control negativo, es decir, mezcla de reacción que carece de un sustrato se incluyeron. Los más altos niveles de actividad de remodelación GCSF se vieron utilizando MBP-GaINAcT2 (D51) que se solubilizaron a pH 8.0 y replegado a pH 8.0. Ejemplo 6: replegado y purificación de GalNAcT2 eucariótica. [0370] Cuatro litros de bacterias que expresan MBP-GaINAcT2 (D51) recombinantes se desarrollan y cosechan. Se aislaron cuerpos de inclusión, lavaron y dos gramos en peso seco de cuerpo de inclusión se solubilizaron a 4 grados C en 200 L de amortiguador de solubilización (urea 7M/Tris 50mM /DTT lOmM/EDTA 5mM a pH 8.0) . Después de solubilización, la mezcla se diluye a 4L de amortiguador de replegado (Tris 50mM /L-Arginina 550mM /NaCl 250mM /KCl lOmM /PEG 3350 0.05%/L-cisteína 4mM /dihidrocloruro de cistamina lmM a pH 8.0). El replegado se lleva a cabo a 4-10 grados C por aproximadamente 20 horas, con agitación. La mezcla después se filtra utilizando un filtro CUNO 10SP, concentra 5 veces en membrana 4ft2 , diafiltra 4 veces con Tris lOmM/NaCl 5mM a pH 8.0. La conductividad de la solución de MBP-GalNAcT2 (D51) replegada final fue 1.4 mS/cm. La proteína replegada se almacena a 4 grados C por varios días . [0371] Las proteínas replegadas se aplicaron a una columna Q Sepharose XL (QXL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Un perfil de elución se muestra en la Figura 19 y la actividad enzimática de fracciones de columna específica se muestra en la Figura 20. Las fracciones activas se combinaron y aplicaron a una columna de Hidroxiapatita Tipo I (80 µm) (BioRad, Hercules, CA) . Un perfil de elución se muestra en la Figura 21 y la actividad de fracciones eluidas HA tipo se muestra en la Figura 22. La combinación de cromatografía QXL y HA tipo I resultó en MBP-GalNAcT2 (D51) altamente purificada activa. Ejemplo 7: Purificación de MBP-SBDST3Gal3 eucariótica. [0372] El truncado ? 73 ST3GalIII se fusiona en cuadro con la proteína de enlace maltosa y un dominio de enlace de almidón, para formar una proteína doble etiquetada: MBP-SBD-ST3Gal3 (?73). El MBP estaba en el extremo amino, seguido por SBD, y luego la proteína ST3GalIII truncada. Replegado y purificación de la proteína MBP-SBD-ST3Gal3 (?73) se compara con una proteína de una sola etiqueta: MBP-ST3GalIII (?73). Ambas proteínas se expresaron en E. coli como cuerpos de inclusión insolubles y se solubilizaron y replegaron como se describe aquí. Las proteínas fueron dializadas y sometieron a purificación de afinidad, utilizando una columna de ciclodextrina que liga a ambas etiquetas MBP y SBD. Los resultados se muestran en la Figura 23. La proteína MBP-SBD-ST3Gal3 (?73) tuvo superior actividad específica después de diálisis y retuvo más actividad específica después de elución de la columna con ciclodextrina . Ejemplo 8: replegado de proteínas MBP-ST3Gall y MBPSBD-ST3Gall [0373] ST3Gall eucariótica se fusiona con MPB o MBP y SBD. La secuencia de ADN del gen ST3Gall porcino se utiliza como una plantilla para el diseño de las construcciones pcWINMBP-pST3Gall y pcWINMBP/SBD-pST3Gall aquí descritas. La secuencia ST3Gall porcina de longitud íntegra se proporciona en la Figura 37. Para expresión en E. coli , se emplea una versión optimizada y truncada de codón de pST3Gall, es decir pST3Gall ? 45. Las secuencias de amino ácidos codificadas se proporcionan en la Figura 24. La secuencia de codificación del gen ST3Gall a continuación se digiere y transfiere a los vectores pcWIN2-MBP y pcWINMBP/SBD utilizando los sitios de clonación BamHl y Xhol . Estas construcciones se confirmaron correctas por análisis de restricción y secuencia y fueron empleadas para transformar la cepa JM109 de E. coli utilizando 50 µg/ml de selección de Canamicina. Una colonia individual de cada una se utiliza para inocular un cultivo de 2 ml de Maritone-10 µg/ml de Kanamicina que se incuba por 16 horas a 37 grados C. Cada cultivo se mezcla por separado 1:1 con 50% de glicerol y congela a -80 grados C y refiere como la ampolleta de material . Una pequeña cantidad de cada ampolleta de material se utiliza para rayar una placa Maritone-Kan. Después de 16 horas de incubación a 37 grados C, una sola colonia de cada una se utiliza para inocular un cultivo de 25 ml de Maritone-10 µg/ml Canamicina que se incuba por 16 horas a 37 grados C. El cultivo de 25 ml luego se utiliza para inocular un cultivo de 1 L de Maritone-10 µg/ml de Canamicina que se incuba a 37 grados C y supervisa por OD600. Cuando ODS00 alcanzó 0.8, IPTG se agrega a 1 mM y las células se incuban por 16 horas adicionales. Las células se cosechan entonces por centrifugación a 7000 xG por 15 minutos .

[0374] Se aislaron entonces cuerpos de inclusión, se solubilizaron las proteínas de fusión ST3Gall y replegaron. Precipitados de células bacterianas se resuspendieron en una proporción de 1 g de precipitado de células húmedas por 10 mL de Tris 20 mM pH 8, EDTA 5 mM y lisaron por ruptura mecánica con dos pasos a través de un microfluidizador. Material insoluble, es decir los cuerpos de inclusión o IB, se nodulizaron por centrifugación a 7000 xg a 4 grados C en Sorvall RC3 por 30 minutos, y se descartó el sobrenadante. Un ciclo de lavado típico consistió en resuspender en forma completa el precipitado en el amortiguador de lavado y repetir la centrifugación por 15 minutos. El precipitado se lavó una vez en un exceso de volumen (al menos 10 mL (hasta 20) por g de precipitado de células original) de amortiguador de alto contenido de sal (lavado I: Tris 10 mM pH 7.4, NaCl 1M, EDTA 5 mM) , una vez en amortiguador detergente (lavado II: Tris 25 mM pH 8, NaCl 100 mM, Tritón X100 1%, Na-deoxicolato al 1%, EDTA 5 mM) y (para retirar trazas de detergente además de lavar los IBs) tres veces en amortiguador de lavado (lavado III: Tris 10 mM pH 8, EDTA 5 mM) . [0375] Los IB lavados se resuspendieron en amortiguador de solubilización (Urea 8M, BisTris 50 mM pH 6.5, EDTA 5 mM, DTT 10 mM) y ajustaron a 2 mg/ml de concentración de proteína. El replegado se realizó como una dilución rápida de 20 veces en amortiguador de replegado (Tris 55 mM pH 8.2, NaCl 10.56 mM, KCl 0.44 mM, MgCl2 2.2. mM, CaCl2 2.2 mM, Peg3350 0.055%, L-Arginina 550 mM, GSH lmM, GSSG 100 mcM) y agitaron por 16 horas a 4 grados C. El amortiguador se intercambió entonces por desalificado utilizando G50 Sephadex a BisTris 50 mM pH 6.5, NaCl 75 mM, Tween 80 0.05%. [0376] Para determinar si las enzimas replegadas fueron activas, un ensayo de sialiltransferasa se realizó. Transferencia de ácido siálico al donador (asialo-mucina submaxilar bovina) se supervisó utilizando CMP-N7AN radioetiquetado. ST6GalNacl de pollo expresada en sistema baculovirus se empleó como un control positivo. [0377] Brevemente, 40 µL de la mezcla de reacción se agregan a 10 µL de muestra de enzima e incuban a 37 grados C por 1 hora. La glicoproteína se precipitó al agregar 100 µL de ácido fosfotúngstico/TCA al 15% a la reacción, con mezclado. Después de centrifugación, se aspiraron y descartaron los sobrenadantes . Quinientos µL de TCA al 5% se agregan para lavar CMP-14C-ácido siálico no incorporado del precipitado. Las reacciones se centrifugaron de nuevo y se aspiraron y descartaron los sobrenadantes . Los precipitados se resuspendieron utilizando 100 µL de NaOH 10 N. Un mL de amortiguador Tris ÍM, pH 7.5 se agregan al precipitado resuspendido y después la mezcla se transfiere a una ampolleta de destelleo. Cinco mL de fluido de destelleo (Ecolume, ICN Biomedicals) se agregan y mezclan bien. El conteo total agregado a una reacción se determina al agregar 40 µL de mezcla de reacción en una ampolleta de destelleo y agregar 100 µL de NaOH 10 N, 1 mL de agua y 5 mL de fluido de destelleo y mezclan bien. Se contaron las ampolletas por 1 minuto. Las condiciones de reacción se proporcionan en la Tabla 13. TABLA 13 Volumen de Mezcla de Reacción Total por Tubo de Ensayo : 40 µL [0378] Se muestran resultados en la Figura 25. Ambas proteínas de fusión replegadas, MBP-pST3Gall y MBP- SBD-pST3Gall tuvieron actividad detectable de sialiltransferasa . Ejemplo 9: replegado de proteínas MBP-ST6GalNAcl [0379] ST6GalNAc I eucariótica se fusiona con MPB . Brevemente, cinco construcciones de ST6GalNAc I de ratón fueron generadas: D32, E52, S127, S186 y S201. Cada construcción se expresó tras la etiqueta MBP del vector pcWin2-MBP, y difieren en la extensión de la región "raíz" incluida en la construcción. D32 es la forma más larga, partiendo inmediatamente corriente abajo del dominio de transmembrana amino-terminal pronosticado. S201 es la más corta, empezando brevemente antes del inicio pronosticado del dominio catalítico conservado. [0380] Además de las construcciones de ratón, ST6GalNAc I K36 humana también se expresa como una fusión con MBP. La construcción humana empieza justo después del dominio de transmembrana. ADN que codifica ST6GalNAcl humana de K36 a su extremo-c se aisla por PCR utilizando el vector de expresión baculovirus existente como patrón o plantilla, y clona en los sitios BamHl -Xhol dentro de pcWin2-MBP. [0381] Para referencia, las secuencias para MBP-mST6GalNAcI S127 y MBP-hST6GalNAcI K36 se incluyen en la Figura 26. Además, la Figura 38 proporciona secuencia de amino ácidos de longitud íntegra para ST6GalNAcI humana y para ST6GalNAcI de pollo y una secuencia de la proteína ST6GalNAcI de ratón que empieza en el residuo 32 de la proteína de ratón nativa. [0382] Mutantes de eliminación adicionales a aquellos descritos anteriormente se han elaborado y una vista completa de ST6GalNAcI preferidas para utilizar en la invención, se encuentra en la Tabla 14. La Figura 39 proporciona un esquemático de una cantidad de mutantes de truncado ST6GalNAcI de humano preferido. La Figura 40 muestra un esquemático de proteínas de fusión MBP incluyendo los mutantes de truncado STdGalNAcI de humano. Tabla 14: Mutantes ST6GalNAcI

[0383] La Figura 45 muestra la posición de residuos cisteína apareados y no apareados en la proteína ST6GalNAcI humana. Substitución de cisteína sencilla y doble también se muestra por ejemplo en C280S, C362S, C362T, (C280S + C362S) , y (C280S + C362T) . [0384] Estudios de expresión inicial mostraron que las proteínas de fusión ST6GalNAcI se expresaron como proteínas insolubles . Para recuperar enzima recombinante activa, las proteínas insolubles inactivas se aislaron y replegaron como se describe: [0385] Cultivos de 0.5 L de crecimiento logarítmico de células JM109 que contienen ya sea pcWin2-MBP-mST6GalNAcI D32, E52 , S127, S186 o pcWin2-MBP-hST6GaINAcI K36, se inducen con IPTG 1 mM durante la noche a 37 grados C. Las células se recolectaron por centrifugación y lisaron por ruptura mecánica en un microfluidizador en 100 mL de Tris 20 mM pH 8, EDTA 5 mM. Materia insoluble se recolecta por centrifugación a 7000 x g por 20 minutos. Los sobrenadantes se descartan y los precipitados se lavan con amortiguador de alto contenido de sal (Tris 20 mM pH 7.4, NaCl ÍM, EDTA 5 mM) , amortiguador de detergente (Tris 25 mM pH 8, Na-deoxicolato al 1%, Tritón X100 al 1%, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM) , y TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) . Cada lavado fue de 100 mL y el precipitado se recolectó por centrifugación como se describe anteriormente . Siguiendo el lavado, los precipitados de cuerpo de inclusión se tomaron en alícuotas y almacenaron a -80 grados C.

[0386] Para supervisar condiciones que permiten adecuado replegado y de esta manera recuperación de la actividad de ST6GalNAc I, alícuotas de los cuerpos de inclusión de proteína de fusión ST6GalNAcI de ratón y humano, se solubilizaron en guanidina 6M, DTT 10 mM, TBS lx. La concentración de proteína se normalizó por ensayo Bradford, y las proteínas solubilizadas se transfirieron a una serie de amortiguadores de replegado de proteína comercialmente disponibles. replegados se llevaron a cabo en 0.25 mL a 0.2 mg/mL durante la noche a 4 grados C en una placa de 96-pozos con agitación. Los replegados se transfirieron a una placa de diálisis de 96-pozos (25000 MWCO) y dializaron contra TBS lx, Tween-80 0.05% por cuatro horas a 4 grados C, seguido por diálisis durante la noche contra BisTris 10 mM pH 7.1, NaCl 100 mM, Tween- 80 0.05% a 4 grados C. [0387] Proteínas de fusión ST6GalNAcI recombinantes replegadas se probaron por actividad en un ensayo de actividad de fase sólida de 384-pozos. Brevemente, el ensayo de actividad detecta la transferencia mediada con ST6GalNAcI de un ácido siálico biotinilado de CMP-NAN biotinilado a la superficie de un pozo revestido con asialo-mucina submaxilar bovina en una placa de 384-pozos. Cada reacción (13.5 µL de replegado + 1.5 µL de amortiguador de reacción lOx) se realiza en cuadruplicado. Amortiguador de reacción lOx fue BisTris 0.2 M pH 6.7, MgCl2 25 mM, MnCl2 25 mM, Tween-80 0.5%, y donador 1 mM. Después de incubación durante la noche a 37 grados C, la placa se lavó con exceso de TBS lx, Tween-20 0.05% y biotina se detecta con estreptavidina etiquetada con europio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer) . Niveles de fluorescencia de europio retenido en la placa, indicativo de actividad de ST6GalNAcI, se documentaron con un lector de placas Perkin Elmer Victor3V, y los resultados de expresión y actividad se resumen en la Tabla 15. Tres de las proteínas de fusión ST6GalNAcI replegadas tuvieron actividad detectable. Tabla 15 : Resumen de proteínas de fusión ST6GalNAcI replegadas probadas por actividad por ensayo en fase sólida.

Ejemplo 10: Replegado de proteínas Core 1 GalTl [0388] Core 1 GalTl eucariótica se fusiona con MBP o la doble etiqueta MBPSPD. Las proteínas Core 1 GalTl humana y de Drosophila se emplean. La Figura 41 proporciona la secuencia entera de proteína Core 1 GalTl humana. La Figura 42 proporciona las secuencias de dos proteínas Core 1 GalTl de Drosophila . Truncados de cada enzima se elaboran a través de la región raíz, es decir partiendo con la región raíz entera y eliminando un aminoácido a la vez, de manera tal que el truncado más pequeño comprende sólo un dominio catalítico Core 1 GalTl. Residuos cisteína a través del dominio catalítico de la proteína también se mutan uno a la vez a cualquiera de los residuos serina o alanina. Fusiones MBP se elaboran utilizando las proteínas truncadas, los mutantes de cisteína o combinaciones de los dos . Proteínas se expresan en E. coli como cuerpos de inclusión, se solubilizan y después se pliegan utilizando los métodos aquí descritos . El replegado se determina al medir actividad enzimática. Enzimas activas se han replegado correctamente. Actividad enzimática de Core 1 GalTl se mide como se describe en Ju et al., J. Biol . Chem . 277: 178-186 (2002), que aquí se incorpora por referencia para todos los propósitos . Ej emplo 11 : replegado en un recipiente de glicosiltransferasas O-enlazadas [0389] Las glicosiltransferasas O-enlazadas GalNAcT2, Core 1 y ST3Gall pueden emplearse colectivamente para agregar una estructura núcleo 1 incluyendo un ácido siálico terminal o ácido siálico-PEG en residuos serina o treonina de proteínas selectas incluyendo proteínas terapéuticas . La expresión de estas enzimas en E. coli y recuperación de las enzimas activas de replegar cuerpos de inclusión, es útil para desarrollar un proceso para ajuste de escala efectivo en costo. Aquí describimos co-replegado de dos de estas enzimas (MBP-GaINAcT2 y MBP-ST3Gall) de cuerpos de inclusión de E . coli . Las ventajas de co-replegar incluyen uso de reactivo disminuido e incrementada eficiencia de replegado. [0390] Dos cepas de JM109 se seleccionaron para resistencia a canamicina y determinan para transportar los plásmidos de expresión apropiados que acumulan cuerpos de inclusión de MBP- GalNAcT2 y MBP-ST3Gall ante inducción con IPTG. [0391] Después de inducciones durante la noche separadas con IPTG 1 mM, precipitados de células bacterianas se resuspenden en una proporción de 1 g de precipitado de células húmedas por 10 mL de Tris 20mM pH 8, EDTA 5mM y lisan por ruptura mecánica con dos pasos a través de un microfluidizador. Material insoluble, es decir los cuerpos de inclusión o IB, se precipitan por centrifugación a 7000xG a 4 grados C en el Sorvall RC3 por 30 minutos, y se descarta el sobrenadante. Un ciclo de lavado típico consistió de resuspensión completa del precipitado en el amortiguador de lavado, y repetir la centrifugación por 15 minutos . El precipitado se lava una vez en un exceso de volumen (al menos 10 mL) hasta 20 (por g de precipitado de células original) de amortiguador de alto contenido en sal (lavado I: Tris 10 mM pH 7.4, MNaCl lmM, EDTA 5 mM) , una vez en amortiguador detergente (lavado II: Tris 25 mM pH 8, NaCl 100 mM, TritonX 100 1%, Na-deoxicolato 1%, EDTA 5 mM) , y (para retirar rastros de detergente además de lavar los IBs) tres veces en amortiguador de lavado (lavado III : Tris 10 mM pH 8, EDTA 5 mM) . [0392] IBs lavados se resuspendieron en amortiguador de solubilización (Urea 8M, BisTris 50mM pH 6.5, EDTA 5mM, DTT lOmM) y ajustaron a 4 mg/ml de concentración de proteína. La solución de proteína urea se aclara por centrifugación a 14000xG por 5 minutos. El replegado se realiza como una dilución rápida a 0.1 mg/ml en amortiguador de replegado (Tris 55mM pH 8.2, NaCl 10.56 mM, KCL 0.44 mM, MgCl2 2.2 mM, CaCl2 2.2 mM, Peg3350 0.055%, L-Arginina 550 mM, GSH lmM, GSSG 100 cM) y agita por 16 horas a 4 grados C. [0393] EL sistema experimental se configuró como sigue: condiciones de replegado se mantuvieron constantes mientras que se repliegan ya sea MBP-GaINAcT2 y MBP-ST3Gall separadamente o co-replegado en el mismo recipiente. Después de replegado, las mezclas se desalifican por centrifugación a baja velocidad utilizando G50 Sephadex equilibrado en BisTris 50mM pH 6.5, NaCl 75mM, Tween 80 0.05%. Material soluble se recupera después de centrifugación a velocidad máxima en una microcentrífuga. [0394] Para determinar el rendimiento de enzimas solubles después de replegado, cada reacción se somete a análisis SDS-PAGE, seguido por tinción con azul de Coomassie para visualizar los polipéptidos (Figura 27A) . Los resultados muestran que el co-replegado aumenta el rendimiento de enzimas solubles (pistas para co-replegado contra separado) . [0395] En el segundo experimento, 6 µ g de la proteína terapéutica IFa-2b se someten a una reacción de modificación con polietilen glicol de tres enzimas en un recipiente . La concentración de las enzimas empleadas para esta reacción es 1.4 µ g de MBP-GaINAcT2 , 0.5 mu BV Core 1, y 1.4 µ g de MBP-ST3Gall, los azúcares empleados son 1.2 µ g de UDP-GalNac y 1.2 µ g de UDP-Gal y 1.25 µ g de 2OK-Peg-CMP-NAN en una reacción de 20 µ l para cualquiera de 0 horas o 16 horas utilizando el siguiente amortiguador de reacción (MES 50mM pH 6.2, NaCl 150mM, MnCl210 mM) . La extensión de modificación con polietilen glicol de IFo.-2b a la mitad de la reacción se visualizó por tinción con azul de Coomassie o siguiendo SDS-PAGE (Fig. 27B) . El experimento se diseñó para comparar directamente la modificación con polietilen glicol en un recipiente utilizando ya sea la combinación de enzimas replegadas individualmente a las enzimas co-replegadas manteniendo a todos los otros componentes y concentraciones constantes . Los resultados demuestran un aumento en producto modificado con polietilen glicol en la reacción en donde las enzimas se co-replegaron en comparación con replegado por separado (pista 5 contra 7) . Ejemplo 12: Expresión mejorada de proteína de fusión MBP-SiaA [0396] El gen SiaA de Haemophilus influenzae no tipificable, se optimizó en codón para expresión en E. coli . El gen se digirió con Ndel y EcoRI, gel de agarosa purificado y ligado en pcWin2 digerido con Ndel/EcoRI, antes de transformación en la cepa JM 109 o W3110 de E. coli . ADN plásmico se aisló de los recombinantes y supervisó con Ndel y EcoRI . Una colonia de JM109 y una de W3110, cada una que contiene la construcción correcta se siembran en 2 ml de LB libre de animal que contiene 10 //g/ml de sulfato de camicina y desarrolla por 6 h a 37 grados C a 250 RPM de agitación. Un alícuota de 100 µ l se retira, centrifuga 2 minutos a 10,000 x g y el sobrenadante se descarta. Este precipitado se congela a -20 grados C y representa la célula no inducida. IPTG se agrega al resto del cultivo a una concentración final de IPTG 1 mM e incuba por 2 h a 37 grados C y 250 RPM de agitación. Una alícuota de 100 µ l se retira y procesa como se describió (representa célula inducida) . [0397] Los sitios de restricción en los extremos del gen SiaA se cambiaron a 5 'BamHl y el extremo 3 ' se mantiene como EcoRI utilizando PCR. El producto PCR se digiere con BamHl y EcoRI, purifica por electroforesis en gel de agarosa y liga en pcWin2MBP digerido con BamHl/EcoRI . Células JM109 transformadas con esta reacción de ligado se cultivan y se aisla ADN plásmido. El ADN plásmido se supervisa utilizando BamHl y EcoRI . Tres colonias que contienen la estructura correcta se sembraron en 2 ml de LB libre de animal que contienen 10 //g/ml de sulfato de canamicina y desarrollan por 6 h a 37 grados C a 250RPM de agitación. Un alícuota de 100 µ l se retira, centrifuga 2 minutos a 10,000 x g y el sobrenadante se descarta. Este precipitado se congela a -20 grados C y representa la célula no inducida. IPTG se agrega al resto del cultivo a una concentración final de IPTG 1 mM e incuba por 2 h a 37 grados C y 250 RPM de agitación. Una alícuota de 100 µ l se retira y procesa como se describió (representa célula inducida) . [0398] Cada alícuota de 100 µ l se hierve por 5 minutos en 100 µ l de amortiguador de muestra SDS-PAGE que contiene DTT 50 mM. Las muestras se cargaron en gel de archilamida Tris-glicina 4-20% (Invitrogen) y someten a electroforesis por aproximadamente 2h, tiñen con Invitrogen Simply Blue Safestain, destiñen con agua y exploran. La Figura X muestra niveles indetectables de expresión de SiaA nativa ante inducción, mientras que la Figura Y muestra altos de niveles de expresión de SiaA fusionada a MBP ante inducción con IPTG. Este resultado demuestra que MBP suministrado del vector pcWin2MBP dirige expresión de proteína de alto nivel . [0399] Se entiende que los ejemplos y modalidades aquí descritas son para propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos se sugerirán a personas con destreza en la especialidad y habrá de incluirse dentro del espíritu y objetivo de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para replegar una primera glicosiltransferasa eucariótica insoluble, recombinante, en donde la glicosiltransferasa comprende un dominio de proteína de enlace maltosa (MBD) , el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) solubílizar la glicosiltransferasa eucariótica insoluble, recombinante en un amortiguador de solubilización; y (b) contactar la glicosiltransferasa eucariótica soluble con un amortiguador de replegado que comprende un par redox para replegar la glicosiltransferasa eucariótica, en donde la glicosiltransferasa eucariótica replegada cataliza la transferencia de un azúcar de un sustrato donador a un sustrato aceptor.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera glicosiltransferasa eucariótica se trunca para retirar todo o una porción de una región raíz.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una cisteína no apareada en la primera glicosiltransferasa eucariótica se retira por sustitución con un aminoácido sin-cisteína.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera glicosiltransferasa eucariótica se elige del grupo que consiste de GnTl , GalTl, StlII Gal3, St3GalI, St6GaINAcTI, CoreGalITI, GalNAcT2.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera glicosiltransferasa eucariótíca además comprende un dominio de purificación seleccionada del grupo que consiste de un dominio de enlace almidón, un dominio tioredoxina, un dominio SUMO, un dominio poly-His, un dominio epítopo myc, y un dominio glutationa-S-transferasa.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera glicosiltransferasa eucariótica además comprende un dominio de auto escisión.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera glicosiltransferasa eucariótica se expresa en una célula anfitriona bacteriana como un cuerpo de inclusión insoluble .
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una segunda glicosiltransferasa eucariótica insoluble, recombinante se pliega con una primera glicosiltransferasa eucariótica.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque una tercera glicosiltransferasa eucariótica insoluble, recombinante se pliega con la primera glicosiltransferasa eucariótica y la segunda glicosiltransferasa eucariótica.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el par redox se elige del grupo que consiste de glutationa reducida/glutationa oxidada (GSH/GSSG) y cisteína/cistamina.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato aceptor se elige de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera glicosiltransferasa eucariótica es una sialiltransferasa.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la sialiltransferasa se elige del grupo que consiste de Stlll Gal3, St3GalI, St6GaINAcTI .
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el sustrato donador es una molécula de CMP-ácido siálico PEG y el sustrato aceptor se elige de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido.
15. Una glicosiltransferasa eucariótica recombinante, en donde una región ancla raíz y un dominio transmembrana se eliminan de la glicosiltransferasa eucariótica recombinante y en donde la glicosiltransferasa se fusiona en cuadro a un dominio de enlace maltosa.
16. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque toda o una porción de la región raíz se elimina.
17. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque una cisteína no apareada en la glicosiltransferasa eucariótica recombinante, se retira por sustitución con un aminoácido no-cisteína.
18. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa se elige del grupo que consiste de una proteína GnTI , una proteína GalTl, una proteína Stlll Gal3, una proteína St3GalI, una proteína St6GalNAcTI, una proteína CoreGalITI, y una proteína GalNAcT2.
19. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína GnTl .
20. La proteína GnTl de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque es una proteína GnTl humana truncada seleccionada de GnTl? 35 y GnTl? 103.
21. La proteína GnTl de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la proteína GnTl es una proteína GnTl humana que comprende una sustitución de cisteína no apareada seleccionada del grupo que consiste de CYS121ALA, CYS121ASP y ARG120ALA, CYS121HIS.
22. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína GalTl .
23. La proteína GalTl de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la proteína GalTl es una proteína GalTl bovina truncada seleccionada de GalTl ? 70 y GalTl?l29.
24. La proteína GalTl de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la proteína GalTl es una proteína GalTl bovina que comprende una sustitución cisteína no apareada de CYS342THR.
25. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína ST3 GalIII.
26. La proteína ST3GalIII de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la proteína ST3GalIII es una proteína ST3GalIII de rata, truncada, seleccionada de ST3GalIII ?28, ST3GalIII ?73, ST3GalIII ? 85 y ST3GalIII ? 86.
27. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15 , caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína Core 1 GalTl .
28. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína ST3Gall .
29. La proteína ST3Gall de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la proteína ST3Gall es una proteína ST3Gall humana truncada seleccionada de ST3Gall ?29, ST3Gall ?45, y ST3Gall ? 56.
30. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína ST6GalNAcl .
31. La glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la glicosiltransferasa es una proteína GalNAcT2.
32. La proteína GalNAcT2 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la proteína GalNAcT2 es una proteína GalNAcT2 humana truncada seleccionada de GalNAcT2?40, GalNAcT2?51, GalNAcT2?74 y GalNAc 2 ? 95.
33. Un método para remodelar una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido utilizando la glicosiltransferasa eucariótica recombinante de conformidad con la reivindicación 15.