MXPA06002894A

MXPA06002894A - Metodo para enlazar secuencias de interes

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Publication number: MXPA06002894A
Application number: MXPA/A/2006/002894A
Authority: MX
Inventors: B Oleksiewicz Martin; S Nielsen Lars; S Andersen Peter; H Hansen Margit
Original assignee: Symphogen A/S
Priority date: 2003-09-18
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2006-12-13

Abstract

La presente invención se refiere a una TI-RCP de traslape-extensión múltiple, que proporciona un método eficiente para enlazar dos o más secuencias de nucleótido que codifican para dominios o subunidades de una proteína heteromérica, en una reacciónúnica. Especialmente, el enlace de la región variable que codifica las secuencias de, por ejemplo, inmunoglobulinas, receptores de células T o receptores de células B, es fácil con el método de la presente invención. Esto permite una forma más eficiente para generar bibliotecas de secuencias que codifican una región variable. La capacidad para realizar la TI-RCP de traslape-extensión múltiple, usando una plantilla derivada de una célulaúnica aislada capaz de generar bibliotecas de pares cognados en un formato de alto rendimiento.

Description

MÉTODO PARA ENLAZAR SECUENCIAS DE INTERÉS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un procedimiento de amplificación molecular múltiple, capaz de enlazar secuencias de nucleótidos de interés en conjunto con la amplificación, en particular la reacción de cadena de polimerasa (CRP múltiple) . El método es particularmente ventajoso para la generación de bibliotecas de pares cognados, asi como también bibliotecas combinatoriaes de secuencias que codifican la región variable, a partir de inmunoglobulinas, receptores de células T o receptores de células B. Antecedentes de la Invención Las proteínas de enlace a antígenos involucradas en la respuesta inmune están presentes en mamíferos como receptores policlonales grandes, que representan una amplia diversidad de especificidades de enlace. Esta diversidad es generada por el reacomodo de secuencias del gen que codifican regiones variables de estas proteínas de enlace. Tales proteínas de enlace a la región variable incluyen formas solubles y unidas a la membrana del receptor de células B (también conocidas como inmunoglobulinas o anticuerpos) y los receptores de células T unidos a la membrana (TcR) . Con respecto a inmunoglobulinas, su afinidad es mejorada REF. :170083 subsecuente al reconocimiento de un antígeno por un receptor antígeno de células B, a través de un proceso llamado maduración de afinidad, el cual involucra ciclos de hipermaduración somática de estos genes variables. Notablemente, las inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fv, y moléculas Fv de cadena única (scFv) , han sido sometidas a clonación y expresión recombinante. Sin embargo, todas las otras proteínas de enlace a la región variable pueden en principio, también ser clonadas y expresadas usando los mismos conceptos como para anticuerpos. Procedimientos conocidos para aislar anticuerpos con una especificidad de enlace deseado, la mayoría a menudo involucra la generación de hibridomas a partir de hospederos inmunizados, seguido por selección para clones específicos o involucra la generación de bibliotecas de expresión combinatoria en E. coli , compuestas de dominios variables de inmunoglobulina, los cuales son subsecuentemente enriquecidos usando técnicas, tales como por ejemplo, exhibición de fago. La restricción principal en el uso de la tecnología de hibridoma para hacer anticuerpos terapéuticos, es la ausencia de un linfoma humano adecuado como patrones de fusión para linfocitos B humanos. Los heterohibridomas (es decir, fusión de células B humanas con linfomas de ratón) , son notoriamente inestables y de este modo, raramente conducen a líneas celulares adecuadas para propósitos de producción. Las células humanas B inmortalizadas a través de la infección con virus Epstein-Barr, exhiben cambios similares de inestabilidad. La carencia de metodología celular sólida para elaborar anticuerpos humanos para terapia, puede ser compensada con ventajas más recientes en biología molecular. El uso de bibliotecas combinatoriaes y exhibición de fago, permite la generación de grandes repertorios de clones de anticuerpos con una diversidad potencial en exceso de 1010. Se puede realizar a partir de esta selección de repertorio para enlazarse a un objetivo específico, con ello, generando una sub-biblioteca. Esta sub-biblioteca puede ser usada para generar anticuerpos ya sea policlonales o monoclonales. Las secuencias codificantes de región variable (por ejemplo, región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y secuencias codificantes de región variable de cadena ligera) , las cuales constituyen la biblioteca, pueden ser amplificadas a partir de linfocitos, células de plasma, hibridomas o cualquier otra población de células que expresan inmunoglobulinas . Las tecnologías actuales para generar bibliotecas combinatoriaes involucran aislamiento separado de las secuencias que codifican la región variable a partir de una población de células. De este modo, el apareamiento original de por ejemplo, secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, se perderá. Preferentemente, en una biblioteca combinatoria, dichas secuencia son aleatoriamente apareadas y las combinaciones originales de estas secuencias variables ocurrirán solamente por oportunidad. De este modo, para aislar secuencias que codifican la región variable responsables de una especificidad de enlace deseada, es necesaria una cantidad considerable de selección. Esto es realizado típicamente en combinación con métodos para enriquecimiento de clones que presentan una especificidad deseada, tal como exhibición de ribosa o exhibición de fago. Aún entonces, la diversidad lograda no podrá ser suficientemente grande para aislar pares de secuencia que codifican la región variable, dando origen a proteínas de enlace de alta afinidad similar como aquellas encontradas en las células originadas. Además, los procedimientos de enriquecimiento normalmente usados para seleccionar bibliotecas combinatoriaes, introducen una fuerte distorsión por ejemplo, para polipéptidos de toxicidad baja particular en E. coli , plegado eficiente, velocidades lentas, u otros parámetros dependientes del sistema, que reducen la diversidad de la biblioteca aún más. Además, los clones derivados a partir de tales bibliotecas combinatoriaes serán más propensos a producir proteínas de enlace con reactividad cruzada contra los auto-antígenos debido a que son pares, contrario a sus pares originales (posteriormente llamados pares cognados) , ninguno ha sido a través de la selección negativa in vivo, contra auto-antígenos, tal como es el caso para receptores de linfocitos B y T durante los estados particulares de su desarrollo. Por lo tanto, la clonación de pares originales de secuencias que codifican la región variable, es un procedimiento deseable. Sin embargo, la frecuencia de clones que exhiben una especificidad de enlace deseado, se espera, sea considerablemente superior dentro una biblioteca de pares cognados que en una biblioteca combinatoria convencional, particularmente si las células del material de partida se derivan de un donador con alta frecuencia de células que codifican pares de enlace por ejemplo, donadores inmunes o inmunizados. Después que el tamaño de la biblioteca del par cognado no necesitará ser tan grande como una biblioteca combinatoria: un tamaño de biblioteca de par cognado de 104 a 105 clones o aún tan pequeño como 102 hasta 103 clones derivados de un donador con una respuesta inmune relevante progresiva, podría ser muy bien adecuado para obtener proteínas de enlace que representan una amplia diversidad de especificidades de enlace deseadas . Para generar bibliotecas de par cognado, se requiere el enlace de las secuencias que codifican la región variable derivado de la misma célula. En la actualidad, se han descrito dos diferentes procedimientos los cuales pueden lograr el apareamiento cognado de secuencias que codifican la región variable . La RCP en células, es un procedimiento en donde una población de células se fija e impermeabiliza, seguida por enlace en la célula de las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera de imunoglobulinas . Este enlace puede ser realizado ya sea por TI-RCP de traslape-extensión (documento WO 93/03151) o por recombinación (Chapal, N. et al . , 1997 BioTechniques 23, 518-524) . El proceso de amplificación como se describe en estas publicaciones, es un proceso de tres o cuatro etapas que consiste de i) transcripción inversa utilizando cebadores de región constante que generan Anda de inmunoglobulina, ii) amplificación por RCP de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y pesada, utilizando series de cebadores que contienen ya sea diseños de traslape-extensión o sitios de recombinación, iii) enlace por recombinación, si este procedimiento es elegido, iv) RCP anidada de los productos que generan sitios de restricción por clonación. Puesto que las células son permeabilizadas, existe un riesgo considerable de que los productos de amplificación puedan salirse de las células, con ellos, introduciendo aleatorización de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada, resultando en la pérdida del apareamiento cognado. Por lo tanto, el procedimiento incluye etapas de lavado después de cada reacción, lo cual hace al proceso laborioso y reduce la eficiencia de las reacciones. De manera más general, la RCP en células es notoriamente ineficiente, resultando en baja sensibilidad. Por consiguiente, en la técnica de enlace por RCP en células, no se ha encontrado empleo distribuido, y el estudio original nunca en efecto, ha sido confiablemente repetido en una forma la cual puede ser usada para verificar que el enlace ocurre actualmente dentro de la célula. Esto, sin embargo, es absolutamente crucial para evitar aleatorización de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada y con ello, interrumpir los pares cognados. Un procedimiento en célula diferente se describe en el documento WO 01/92291. Este procedimiento se basa en el trans-empalme de ARN y logra unión de VH y VL que codifica al ARNm dentro de la célula. Este procedimiento requiere la presencia de un constructo de ADN que acciona el trans-empalme dentro de las células . La RCP en células únicas, es un procedimiento diferente para lograr el apareamiento cognado de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada (véase por ejemplo, Coronelía, J.

A. et al . 2000 Nucleic Acids Res. 28, E85; Wang, X., et al. 2000 J. Immunol. Methods 20, 217-225) . En estas publicaciones, una población de células que expresan inmunoglobulinas son distribuidas diluyendo a una densidad de una célula por reacción, con ello, eliminando la aleatorización de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada durante el proceso de clonación. Básicamente, el proceso descrito es un procedimiento de tres a cuatro etapas que consiste de i) transcripción inversa utilizando oligo-dT, hexámero aleatorio o cebadores de la región constante que generan ADNc, ii) fraccionamiento del producto de ADNc en varios tubos y realizar amplificación por RCP en las secuencias que codifican la cadena variable individual (en tubos separados) , con series de cebadores que contienen sitios de restricción para clonación, iii) RCP anidada de los productos que generan sitios de restricción para clonación (opcionalmente) y iv) enlace de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada, a partir de los tubos separados clonándolas en un vector apropiado, el cual en el mismo, es un proceso de etapas múltiples. En humanos existen dos tipos de cadenas ligeras : lambda (?) y kappa (K) . Esto significa que con el ADNc generado de cada célula única, al menos tres reacciones de RCP separadas deben ser realizadas, seguidas por análisis y clonación de los fragmentos apropiados en un vector único para lograr el apareamiento cognado. De este modo, el procedimiento de RCP de célula única como se describe, requiere un gran número de manipulaciones para generar una biblioteca de pares cognados. Aunque, una biblioteca de pares cognados no necesita ser tan grande como una biblioteca combinatoria para obtener proteínas de enlace que representan una amplia diversidad de especificidades de enlace, como podría ser todavía una tarea laboriosa generar una biblioteca de por ejemplo, 104 hasta 105 clones por el procedimiento de RCP en células únicas descrito. Además, el gran número de manipulaciones incrementa altamente el riesgo de contaminación y error humano . Para obtener proteínas de enlace de alta afinidad, que corresponden a las afinidades normalmente observadas durante una respuesta inmune, el apareamiento cognado de las secuencias de región variable en asociación con su amplificación, es altamente ventajoso. Para generar una biblioteca de gran diversidad, es necesario tener una técnica de clonación que pueda ser ajustada a un formato de alto rendimiento y en donde el riesgo de contaminación y aleatorización sea mínimo. Una reducción del número de etapas de clonación que permite la generación de bibliotecas combinatoriaes a ser ajustadas a un formato de alto rendimiento, es del mismo modo, deseado. Sumario de la Invención La presente invención proporciona un método eficiente para enlazar dos o más secuencias de nucleótidos de interés, por ejemplo, secuencias que codifican la región variable, utilizando un procedimiento de amplificación molecular múltiple, tal como TI-RCP de traslape-extensión múltiple o TI-RCP múltiple, seguido por enlace por ligación o recombinación. El método es aplicable en una célula única, con ello, permitiendo la clonación de pares cognados en un formato de alto rendimiento . Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es un diagrama que ilustra los tipos diferentes de extremos de traslape-extensión. La línea negrita corresponde a una parte específica del gen del cebador y la línea regular corresponde al extremo traslapante . Las barras verticales ilustran regiones complementarias . Los cebadores facilitan el enlace de dos secuencias de oligonucleótidos de interés. La Figura 1 (1), ilustra dos variedades de extremos de traslape-extensión tipo I, en donde solamente el extremo de extensión se traslapa, ya sea completamente o parcialmente; Figura 1 (II) ilustra los extremos de traslape-extensión tipo II, en donde algunos de los 5' -nucleótidos del extremo de extensión del primer cebador, son complementarios a la parte específica del gen del cebador cercano; Figura 1 (III) , ilustra los extremos de traslape-extensión tipo III, en donde los extremos de traslape-extensión completos, son complementarios a la región específica del gen del cebador cercano. La Figura 2 es un diagrama que muestra una revisión esquemática de una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple, aplicable en el enlace de las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina. El ADNc que codifica la cadena ligera (CL) y la región variable de cadena pesada (VH) a ser enlazadas, se ilustra como tubos con indicación de sus extremos 5' y 3' de la hebra sentido, así como también el tamaño esperado del producto amplificado. Las series de cebador de traslape-extensión múltiple usadas para amplificar las secuencias codificantes, son ilustradas por las flechas. Los extremos de las flechas dobladas con prolongaciones del 5' trazadas que ilustran los extremos de clonación. Los extremos de traslape-extensión están en negritas. Los sitios de restricción presentes en los extremos son nombrados en conjunto con los extremos. El número total de cebadores en la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple es dieciséis, distribuidos en los cebadores externos que comprenden un cebador Ck y uno CH? y los cebadores de extensión de traslape que comprenden seis cebadores VL y ocho VH. El cebador CH? templa al extremo 5' del domino constante de cadena pesada. El producto resultante de la TI-RCP de traslape-extensión múltiple, se espera sea de aproximadamente 1070 pb, que constituye la cadena ligera kappa compuesta de la región constante, uniendo al gen y gen variable (Ck + JL + VL) y la región variable de cadena pesada, compuesta del gen variable, segmento de diversidad y gen de unión (VH + D +JH) . El 5' y 3' indican la dirección de la estructura lectora abierta. Solamente una pequeña porción de la secuencia que codifica la región CH? es amplificada por esta mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple, debido a que la posición templada del cebador CH? es cercana a la región J de cadena pesada . Las Figuras 3A-3D son una serie de diagramas que ilustran la dirección de enlace diferente de los productos que se pueden obtener dependiendo de cuales cebadores están equipados con el extremo de enlace. El negro sólido ilustra la región de traslape. El 5' y 3' indican la dirección de la estructura lectora abierta. La Figura 3A es un diagrama que ilustra una orientación principio a principio de los productos. La Figura 3B es un diagratta que ilustra una orientación extremo a extremo. La Figura 3C es un diagrama que ilustra una orientación principio a extremo con la primera secuencia que codifica la cadena ligera. La Figura 3D es un diagrama que ilustra una orientación principio con extremo con la primera secuencia que codifica la cadena pesada.

La Figura 4 es un diagrama esquemático del vector de expresión de inmunoglobulina pLL113 , en donde las secuencias codificantes están en una orientación principio a extremo. El vector comprende los siguientes elementos: bla = promotor que permite la expresión del gen de resistencia a la ampicilina. Amp = gen que codifica para la resistencia de ampicilina. pUCori = origen de replicación de pUC. AdMLP = Promotor tardío principal de adenovirus . IgGl humana = Secuencia que codifica para la cadena pesada Gl de isotipo de inmunoglobulina. pA de hGH = secuencia señal poli A de la hormona de crecimiento humano poliA hGH = secuencia poli A de la hormona de crecimiento bovino. LC kappa humana = secuencia que codifica la cadena ligera de kappa inmunoglobulina. FRT = Un sitio objetivo de reconocimiento Flp. Higromicina = gen que codifica la resistencia a la higromicina. Poli SV40 = secuencia señal poli A del Virus de Simio 40. Las Figuras 5A-5B ilustran un gel electroforético que muestra los resultados de una TI-RCP de traslape-extensión múltiple de dos etapas, seguida por una RCP semi-anidada. Los productos de amplificación son derivados de ADNc aislado a partir de células pLL113 Flp-IN CHO únicas. Las líneas 1-12 son líneas muestra y las flechas indican productos TI-RCP de traslape-extensión múltiple anidados, de 1076 pb; Ml es una escala de 100 pb que ha sido representada con menos contraste para resolver los fragmentos de ADN individuales. La Figura 5B es un bosquejo del gel mostrado en la Figura 5A, que ilustra los fragmentos relevantes del gel . Las Figuras 6A-6D son una serie de fotografías y una representación gráfica de geles electroforéticos que muestran los resultados de una reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única, sin amplificación por RCP adicional. En cada panel, Ml es una escala de 100 pb y M2 es una escala de 500 pb. La Figura 6A es un gel electroforético que muestra los productos de amplificación derivados de lisado que corresponde a 100, 10, 1 ó 0 células. Las flechas indican el producto de traslape-extensión. La Figura 6B es un bosquejo del gel en la Figura 6A. La Figura 6C es un gel electroforético que verifica la presencia del producto de traslape-extensión en las líneas de células 100 y 1 en la Figura 6A. La Figura 6D es un gel electroforético que muestra el desdoblamiento de la enzima de restricción con Nhel y Ncol, respectivamente, del producto de traslape-extensión de la línea de célula 1 en la Figura 6C. La Figura 7 es un gel electroforético que muestra los resultados a partir de TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única, seguido por una amplificación por RCP semi-anidada. Ml es una escala de 100 pb y M2 es una escala de 500 pb . Los resultados de las mezclas de cebadores de traslape-extensión que contienen ya sea CH?, CH2, CH3/ CH ó CH5 como el cebador externo en la reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple. Las reacciones fueron realizadas en lisados celulares que corresponden a 100, 10, 1 ó 0 células. El tamaño del producto de traslape-extensión está indicado con una flecha. La Figura 8 es un gel electroforético que muestra los resultados de una TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única, seguida por una amplificación por RCP semi-anidada usando linfocitos B humanos enriquecidos como plantillas. Ml es una escala de 100 pb. Las líneas 5 y 6 muestran bandas del tamaño esperado para el producto de traslape-extensión. Las Figura 9A-9C son diagramas esquemáticos de los vectores de expresión (Em465/01P582/Em465/01P581) , usados para la generación de líneas celulares que expresan IgGl-lambda, en donde las secuencias codificantes están en una orientación principio a principio. Los vectores comprenden los siguientes elementos : Amp = gen que codifica para la resistencia de ampicilina. pUCori = origen de replicación de pUC. AdMLP = Promotor tardío principal de adenovirus. EFP = promotor del factor de elongación. Líder AP = secuencia líder de fosfatasa alcalina. VH = secuencia que codifica la región variable de cadena pesada. HC de IgGl = secuencia que codifica para la región constante de cadena pesada Gl de isotipo inmunoglobulina. poliA de rBG = secuencia señal poli A de beta-globina de Conejo. poliA de bGH = secuencia poli A de la hormona de crecimiento bovino. Líder IgK = secuencia que codifica para el líder kappa de murina. IgL (Ib ó le) = secuencia que codifica la familia de cadena ligera lambda de inmunoglobulina Ib ó le. FRT = Un sitio objetivo de reconocimiento Flp. Higromicina = gen que codifica la resistencia a la higromicina. Poli SV40 = secuencia señal poli A del Virus de Simio 40. Las Figuras 9B y 9C son geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio cargados con productos de RCP aislados de la línea de células CHO Flp-In/Em464/01P581 y CHO Flp-In/Em464/01P582 , respectivamente. Las líneas 1 a 4 corresponden a concentraciones de plantillas de ARN total de 50 pg, 50 pg, 0.5 pg o 0 pg, usadas para la reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple. M es una escala de 100 pb (New Englands Biolabs, New England, USA) . Las flechas indican el producto de RCP de traslape-extensión. La Figura 10 es un diagrama de flujo que muestra las etapas aplicadas para generar una biblioteca de expresión de anticuerpo cognado, a partir de la cual se pueden expresar anticuerpos monoclonales o policlonales. La Figura 11 es un diagrama esquemático de JSK301, un vector de E. coli usado para generar una biblioteca de vectores Fab, insertando los fragmentos de traslape-extensión que comprenden las secuencias que codifican la región variable cognada en el vector en los sitios de restricción Notl/Xhol indicados. El vector comprende los siguientes elementos: Amp y Amp pro = gen de resistencia a ampicilina y su promotor. pUC19 Ori = origen de replicación. CH1 humana = secuencia que codifica el domino 1 de cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina humana. Relleno = un inserto de secuencia irrelevante, el cual es cortado después de la inserción de los fragmentos de traslape-extensión. tacP y lac Z = promotores bacterianos, los cuales pueden ser escindidos en los sitios de restricción Nhel y Ascl. La Figura 12 es un diagrama esquemático que ilustra la generación de una biblioteca de vectores de expresión Fab cognados . La etapa I ilustra la inserción de pares cognados de las secuencias que codifican la región variable (VH?-VL? hasta VHx-VLx) en el vector JSK301 de E. coli por digestión Xhol-Notl. La etapa II ilustra la inserción de un promotor bacteriano y un cásete líder (promotor pelB líder-P tac, que acciona la expresión de VHx y promotor P lac - pelB líder que acciona la expresión de VLx) por digestión Ascl-Nhel. La Figura 13 ilustra el enlace de subunidades a, ß y ? que constituyen una proteína G, utilizando la TI-RCP de traslape de extensión múltiple de etapa única, seguida por amplificación por RCP adicional . Se dan los tamaños de las regiones codificantes individuales, así como también el tamaño del producto ligado. Los sitios de restricción introducidos por los extremos cebadores durante la amplificación, están indicados por el producto final.

Las Figuras 14A-14C muestran diagramas de punto de un teñido FACS analítico de (fig.l4A) PBMC purificado de sangre donadora; (fig.l4B) la fracción de células negativas CD19 no etiquetadas magnéticamente clasificadas y (fig.l4C) fracción de células CD19+ magnéticamente clasificadas. Un diagrama de dispersión, un diagrama CD19/CD38 y un diagrama CD38/CD45, se muestran para cada fracción. La Figura 15 muestra la fracción CDl9+ de la Figura 9C, la cual ha sido almacenada en nitrógeno líquido, descongeladas y teñidas con anti-CD19, anti-CD38 y anti-CD45. Se muestran diagramas de punto que corresponden a la Figura 9C. Las Figuras 16A-16B muestran entradas usadas para clasificación en la fracción de células CD19+. Una entrada de dispersión y una entrada de fluorescencia basada en CD38 y CD45, fueron usadas para aislar el CD38 alto (CD38hi) , CD45intermedio (CD45in) en células. Las Figuras 17A-17B ilustran un gel electroforético que muestra la reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple exitoso en el donador TT03 (fig.l7A, cavidad 1-12 de ocho placas de 96 cavidades) . Las muestras han sido aplicadas al gel de agarosa en dos filas (fig 17A y figl7B) con 48 muestras en cada una. El tamaño esperado del fragmento de traslape-extensión fue de aproximadamente 1070pb. Los fragmentos de traslape-extensión putativos, son marcados con flechas.

La Figura 18 muestra análisis de ELISA de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA fue revestida con Kappa de cabra (gt) -anti-humano, y los fragmentos Fab capturados fueron detectados con un anticuerpo específico de Fab de gt-anti-humano conjugado a HRP. La Figuras 19 muestra análisis de ELISA de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA fue revestida con 10 µg/ml de Ovalbúmina (Sigma A-5503) , y los fragmentos Fab capturados fueron detectados con anticuerpo específico de Fab de gt-anti-humano conjugado a HRP. La Figura 20 muestra análisis de ELISA de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA fue revestida con Toxoide tetánico, y los fragmentos Fab capturados fueron detectados con un anticuerpo específico de Fab gt-anti-humano conjugado a HRP. La Figura 21 muestra un análisis de ELISA de competición de una etapa de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA fue revestida con Toxoide tetánico (TT) , y el TT soluble se agregó a cada cavidad a 10"7M para competir por el enlace de fragmentos Fab a partir de sobrenadantes bacterianos, a TT inmovilizados. Los fragmentos Fab capturados fueron detectados con anticuerpo específico de Fb gt-anti-humano conjugado a HRP. Las Figuras 22A-22H muestran la alineación de las secuencias de proteína de cadena pesada variable a partir de clones de enlace al antígeno TT de placas G060. El grado de homología de secuencia fue representado por matices diferentes; 100%, 80% y 60% fueron representados con negro, gris y ligeramente gris, respectivamente, CDR1 está localizado en la posición de alineación 34 a 41. CDR2 se localiza en la posición de alineación 55 a 73. CDR3 está localizado en la posición de alineación 107 a 127. Los codones de detención prematuros fueron denotados por un asterisco. La alineación se divide en 8 figuras separadas (a-h) , distribuidas en dos filas de izquierda a derecha con la figura 22a hasta d en la fila superior y Figura 22e hasta h en la fila inferior. Las Figuras 23A-23H muestran la alineación de las secuencias de proteína de cadena ligera variable a partir de clones de enlace al antígeno TT de placas G060. El grado de homología de secuencia fue representado por matices diferentes; 100%, 80% y 60% fueron representados con negro, gris y ligeramente gris, respectivamente, CDR1 está localizado en la posición de alineación 26 a 42. CDR2 se localiza en la posición de alineación 58 a 64. CDR3 está localizado en la posición de alineación 97 a 106. Los codones de detención prematuros fueron denotados por un asterisco. La alineación se divide en 8 figuras separadas (a-h) , distribuidas en dos filas de izquierda a derecha con la figura 23A hasta 23D en la fila superior y Figura 23E hasta 23H en la fila inferior.

La Figura 24 muestra un ensayo de ELISA de competición para determinación de las afinidades aparentes de clones seleccionados de la placa G060. Las diluciones de TT soluble en concentraciones desde 10 nM hasta 25 pM (diluciones de cuatro partes) , fueron agregadas a los fragmentos Fab, con ello, compitiendo el enlace de los fragmentos Fab a TT inmovilizado. Las extensiones de las reacciones se dan como la relación del enlace observado a una concentración de TT soluble dada al enlace encontrado cuando el TT no soluble se agrega a las reacciones. Las Figuras 25A-25B muestran un diagrama de matriz de puntos filogenéticos dobles, que muestra la relación intra e intergenética entre secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada de anticuerpo. Tres filogenéticos de secuencias VH y VL, son apareados en una matriz de puntos para indicar el apareamiento actual de genes particulares B. Fig. 25A) Clones de enlace a TT obtenidos a partir de una biblioteca combinatoria usando exhibición de fago. Fig. 25B) clones de enlace TT obtenidos a partir de una biblioteca de pares cognados usando la presente invención. Descripción Detallada de la Invención La presente invención expuesta, proporciona un proceso de amplificación y enlace de dos o más secuencias de nucleótidos no contiguos de interés, los cuales permiten la clonación de tales secuencias a ser ajustadas a un formato de alto rendimiento. Esto se logra básicamente, reduciendo el número de etapas necesarias para amplificar y secuencias de enlace a ser clonadas . Un aspecto de la invención es un método para enlazar una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguos que comprende, amplificar en un procedimiento de amplificación molecular múltiple, secuencias de nucleótido de interés usando una plantilla derivada de una célula única aislada, una población de células isogénicas o una población de células genéticamente diversas y efectuar un enlace subsecuente de las secuencias amplificadas. Si la plantilla es una célula única aislada o una población de células isogénicas, el enlace resulta en un segmento de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de interés, asociadas entre sí de una manera cognada. Si la plantilla es una población de células genéticamente diversas, el enlace resulta en una biblioteca de segmentos en donde cada segmento comprende secuencias de ácido nucleico de interés, asociadas de una manera aleatoria, esto es también llamado biblioteca combinatoria. En una modalidad de la presente invención, este procedimiento de amplificación molecular múltiple es una amplificación por RCP múltiple, preferiblemente precedida por una etapa de transcripción inversa. En una modalidad preferida, la transcripción inversa amplificación y enlace, se realizan en una etapa única, usando TI-RCP de traslape-extensión múltiple, o alternativamente, en dos etapas usando TI-RCP múltiple, seguida por enlace por ligación o recombinación. Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a la generación de bibliotecas de pares cognados que comprenden secuencias que codifican la región variable ligada, en particular, secuencias que codifican la cadena ligera y región variable de cadena pesada particular o secuencias que codifican la cadena alfa del receptor de células T (TcR) y secuencias que codifican la cadena beta. El proceso involucra obtener una fracción de células que contienen linfocitos de al menos, un donador adecuado y opcionalmente, enriquecidos por una población de linfocitos particulares a partir de esta fracción, por ejemplo, linfocitos B o linfocitos T, dependiendo si las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas o TcRs son deseadas. La fracción de células que contienen linfocitos o la fracción de células enriquecidas, es distribuida en un arreglo de recipientes, obteniendo una célula en cada recipiente . El arreglo de células únicas es sometido a una etapa de transcripción inversa (TI) o un procedimiento de generación de ADNc alternativo, usando los ácidos nucleicos derivados de la población de células únicas como plantillas. La etapa de TI es seguida por procedimientos de amplificación molecular múltiple y enlace de pares de secuencias que codifican la región variable, generadas a partir de cada célula de conformidad con uno de los métodos de la presente invención. Las técnicas de clonación descritas en la presente invención omiten procedimientos de clonación laboriosos e ineficientes, y reducen adicionalmente, el riesgo de contaminación y pérdida de diversidad durante las etapas de clonación múltiples . Otro aspecto de la invención se refiere a bibliotecas de pares cognados producidos por los procesos de amplificación y enlace molecular múltiple . La biblioteca inicial de los pares cognados (biblioteca original) , generada por el método de la presente invención, puede ser sometida a selección, con ello, generando una sub-biblioteca de pares cognados que codifican dominios variables de proteína de enlace específica del objetivo o proteínas de enlace de longitud completa. En una modalidad adicional de la invención, las bibliotecas y sub-bibliotecas de la presente invención, pueden ser usadas en la expresión de proteínas monoclonales o policlonales recombinantes , en donde se preservan las afinidades de enlace original y especificidades presentes en el donador . Definiciones El término "par cognado" describe un par original de ácidos nucleicos no contiguos de interés , que están contenidos dentro o derivados de una célula única . En modalidades preferidas, un par cognado comprende dos secuencias que codifican regiones variables, las cuales en conjunto, codifican para un dominio variable de proteína de enlace y en las cuales las secuencias del gen se derivan de la misma célula. De este modo, cuando se expresan ya sea como una proteína de enlace completo o como un fragmento estable de la misma, preservan la afinidad de enlace y especificidad de la proteína de enlace originalmente expresada a partir de esta célula. Un par cognado puede por ejemplo, estar comprendido de una secuencia que codifica la cadena pesada variable de anticuerpo asociada con una secuencia que codifica la cadena ligera variable, a partir de la misma célula, o una secuencia que codifica la cadena OÍ del receptor de células T, asociada con una cadena ß que codifica la secuencia a partir de la misma célula. Una biblioteca de pares cognados es una colección de tales pares cognados . El término "polimerasa de inicio caliente" , describe polimerasas que son inactivas o tienen muy baja actividad a temperaturas usadas para transcripción inversa. Tales polimerasas necesitan ser activadas por altas temperaturas (90 a 95°C) para llegar a ser funcionales. Este es por ejemplo, una ventaja en procedimientos de TI-RCP de etapa única, puesto que esto prohibe interferencia de la polimerasa con la reacción de transcriptasa inversa. El término "población isogénica de células" , describe una población de células genéticamente idénticas. En particular, una población isogénica de células derivadas por expansión clonal de una célula única aislada es de interés en la presente invención. El término "célula única aislada" describe una célula que ha sido físicamente separada de una población de células que corresponden a una "célula única en un recipiente único" . Cuando se distribuye una población de células individualmente entre una pluralidad de recipientes, se obtiene una población de células únicas aisladas. Como se especifica en la sección titulada "Fuentes de Plantillas" , la proporción de vasos con una célula única no es necesariamente un 100% para llamar a una población de células únicas . Los términos derivados de "enlace", o "enlaces" con relación a amplificación, describen la asociación de las secuencias de ácido nucleico amplificadas que codifican las secuencias de ácido nucleico de interés en un segmento único. Con relación a pares cognados, un segmento comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable, por ejemplo, una región variable de cadena pesada de anticuerpo asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo, se derivan de la misma célula. El enlace puede ser ya sea activado simultáneamente con la amplificación, o como una etapa inmediata después de la amplificación. No existen requerimientos a la forma o funcionalidad del segmento, pueden ser lineales, circulares, de hebra única o doble hebra. Ni es el enlace necesariamente permanente, una de las secuencias de ácido nucleico de interés puede ser aislada del segmento si se desea, una de las secuencias que codifica la región variable puede ser por ejemplo, aislada de un segmento de par cognado. Sin embargo, tan pronto como las regiones variables originales que constituyen el par cognado no son aleatorizadas con otras regiones variables, son todavía consideradas un par cognado, aunque no están ligadas juntas en un segmento único. El enlace es preferiblemente un enlace de fosfodiéster de nucleótido. Sin embargo, el enlace puede también obtenerse por procedimientos de reticulación química diferentes . El término "amplificación molecular múltiple" , describe la amplificación simultánea de dos o más secuencias objetivo en la misma reacción. Los métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (documento Estadounidense 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (LCR) (Wu y Wallace, Genomics 4, 560-9) , técnica de amplificación por desplazamiento de hebra (ADE) (Walker et al., 1992, Nucí. Acids Res. 20, 1691-6), replicación de secuencia auto-sostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 87, 1874-8) y amplificación de secuencia a base de ácido nucleico (NASBA) (Compton J. , 1991, Nature 350, 91-2). Los dos métodos de amplificación últimos, involucran reacciones isotérmicas basadas en transcripción isotérmica, la cual produce ARN tanto de hebra única (ARNss) como ADN de doble hebra (ADNds) . El término "RCP múltiple" , describe una variante de RCP en la cual dos o más secuencias objetivo son amplificadas simultáneamente, incluyendo más de una serie de cebadores en la misma reacción, por ejemplo, una serie de cebador adaptada para amplificación de la región variable de cadena pesada y una serie de cebador adaptada para amplificación de la región variable de cadena kappa en la misma reacción de RCP. Adicional ente, una primera serie adaptada para amplificación de la región variable de cadena lambda, puede ser combinada con estas series de cebadores . El término "TI-RCP múltiple", describe una reacción de RCP múltiple, la cual es precedida por una etapa de transcripción inversa (TI) . La TI-RCP múltiple, puede ya sea, ser realizada como un proceso de dos etapas con una etapa de TR separada previo a la RCP múltiple, o como un proceso de etapa única, en donde todos los componentes para tanto TI como RCP múltiple, son combinados en un tubo único. Los términos "RCP de traslape-extensión múltiple" y "TI-RCP de traslape-extensión múltiple", implican que la RCP múltiple o TI-RCP múltiple, se realizan utilizando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple para amplificar las secuencias objetivo, con ello permitiendo la amplificación simultánea y enlace de las secuencias objetivo. El término "una pluralidad de recipientes", describe cualquier objeto (o colección de objetos) , los cuales permiten la separación física de una célula única a partir de una población de células. Estos pueden ser tubos, placas de cavidades múltiples (por ejemplo, 96 cavidades, 384 cavidades, placas microtituladoras u otras placas de cavidades múltiples) , arreglos, microarreglos, microchips, geles o una matriz de gel. Preferiblemente, el objeto es aplicable por amplificación de RCP. El término "proteína policlonal" o "policlonalidad" , como se usa en este documento, se refiere a una composición de proteína que comprende moléculas de proteínas diferentes pero homologas, preferiblemente seleccionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas. De este modo, cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la composición, pero también contiene una o más extensiones de secuencias de polipéptidos variables, las cuales son/están caracterizadas por diferencias en la secuencia de aminoácido entre los elementos individuales de la proteína policlonal. Ejemplos conocidos de tales proteínas policlonales incluyen moléculas de inmunoglobulinas o anticuerpos, receptores de células T y receptores de células B. Una proteína policlonal puede consistir de una subserie definida de moléculas de proteínas, las cuales han sido definidas por una característica común, tal como la actividad de enlace portada hacia un objetivo deseado, por ejemplo, un anticuerpo policlonal que exhibe especificidad de enlace hacia un antígeno objetivo deseado. El término "una población de células genéticamente diversas" como se usa en este documento, se refiere a una población de células, en donde las células individuales en la población, difieren entre sí en el nivel genómico. Tal población de células genéticamente diversas son por ejemplo, una población de células derivadas de un donador, o una fracción de tales células, por ejemplo, una fracción de células que contiene un linfocito B o un linfocito T. El término "serie de cebador", es usado intercambiablemente con el término "par de cebador" , y describe dos o más cebadores los cuales en conjunto son capaces de cebar la amplificación de una secuencia de nucleótido de interés (es decir, un elemento de un par cognado) . Una primera serie de la presente invención, puede ser diseñada para cebar una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican la región variable. Ejemplos de familias diferentes son cadenas ligeras kappa de anticuerpos, cadenas ligeras lambda, regiones variables de cadenas pesadas, y regiones variables de receptores de células T a, ß, ? ó d. Una serie cebadora para la amplificación de una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican la región variable, a menudo constituyen una pluralidad de cebadores, en donde varios cebadores pueden ser cebadores degenerados . El término "identidad de secuencia" , es expresado como un porcentaje, el cual indica el grado de identidad entre secuencias de ácido nucleico sobre la longitud de la más corta de las dos secuencias. Se puede calcular como (Nref-Naif) x 100/Nref, en donde Nref es el número de residuos en la más corta de las secuencias, y en donde aif es el número total de residuos no idénticos en un Nref largo, óptimamente alineado igualado entre las dos secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC, tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia TAATCAATCGG (Ndif = 2 y Nref=8) (lo subrayado muestra la alineación óptima y las negritas indican los dos residuos no idénticos de 8) . Los términos "aleatoriamente" o "aleatorio" , con respecto al enlace, se refieren al enlace de secuencias de nucleótidos las cuales no se derivan de la misma célula, pero están ligadas transversalmente entre una población de células genéticamente diversas . Si las secuencias de nucleótidos de interés son secuencias que codifican la región variable, esto resultará en una biblioteca combinatoria de secuencias ligadas. Si, por el otro lado, las secuencias de nucleótidos de interés codifican para una proteína heteromérica no diversa, las secuencias aleatoriamente enlazadas parecerán similares a las secuencias ligadas de una célula única. El término "plantilla derivada de una célula única aislada", con respecto a la transcripción inversa, se refiere a los ácidos nucleicos dentro de tales células aisladas. Los ácidos nucleicos pueden por ejemplo, estar en la forma de ARN, ARMm, ADN o ADN genómico. Los ácidos nucleicos pueden ser ya sea aislados de la célula o todavía estar dentro de los contenidos restantes de la célula, en donde las células están en una forma intacta o una forma usada. Proceso de Amplificación y Enlace Una característica de la presente invención reduce el número de tubos necesarios para amplificar las secuencias de nucleótidos de interés, utilizando una variante de RCP en la cual, dos o más secuencias objetivo son amplificadas simultáneamente en el mismo tubo, incluyendo más de una serie de cebadores, por ejemplo, todos los cebadores necesarios para amplificar las secuencias que codifican la región variable en la misma reacción. De manera general, este procedimiento es conocido como reacción en cadena de polimerasa múltiple (RCP múltiple) . La amplificación por RCP múltiple y RCP múltiple, precedidas por transcripción inversa (TI-RCP múltiple) , son técnicas bien conocidas dentro del campo de diagnóstico, por ejemplo, en el análisis de mutaciones, supresiones y polimorfismos de ADN, para ensayos cuantitativos de niveles de ARNm y para identificación de virus, bacterias y parásitos (revisado en Markoulatos, P. et al . , 2002. J. Clin. Lab.

Anal. 16, 47-51) . Sin embargo, existen solamente muy pocos ejemplos en donde las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina han sido amplificadas en el mismo recipiente como secuencias que codifican la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, usando una mezcla de cebador múltiple, compuesta de más de cuatro cebadores que constituyen una serie de cebador VK y/o V?, junto con una serie de cebador VH (Chapal, N. et al . , 1997. BioTechniques 23, 518-524; Liu, A.H. et al . 1992. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 89, 7610- 7614; Embleton, M. J. et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20, 3831-3837) . La razón de esto, podría ser que las series de cebadores adaptados para la amplificación de secuencias que codifican los dominios variables de proteínas que se enlazan al antígeno, están constituidas de manera general, de una pluralidad de cebadores degenerados para capturar la diversidad de estas secuencias que codifican la región variable. De este modo, la complejidad de la reacción RCP es altamente incrementada cuando se realizan amplificación por RCP múltiple en secuencias que codifican la región variable. Una característica adicional de la presente invención es que dos o más secuencias objetivo amplificadas por RCP múltiples, están ligadas en proximidad cercana en el proceso de amplificación. En particular, pares cognados de secuencias que codifican la región variable, están ligadas por este proceso. Una modalidad de la presente invención aprovecha que una mezcla de cebador múltiple puede ser diseñada para funcionar en un procedimiento de RCP de traslape-extensión, resultando en una amplificación y enlace simultáneos de las secuencias de nucleótidos de interés. Esta técnica de RCP de traslape-extensión múltiple, sirve para reducir el número de reacciones necesarias para aislar y enlazar secuencias de nucleótidos de interés en particular, pares cognados de regiones variables ligadas. Otras modalidades de la presente invención aplican enlaces por ligación o por recombinación como una alternativa para enlace por RCP de traslape-extensión múltiple. En estos procedimientos, el enlace no se realiza simultáneamente con la amplificación por RCP múltiple, sino como una etapa inmediata después de la amplificación. Sin embargo, el enlace puede todavía ser realizado en el mismo tubo como la RCP múltiple se realiza dentro. Para realizar RCP de traslape-extensión múltiple, la presencia de dos o más series de cebadores (una mezcla de cebador múltiple) , en donde es necesario al menos un cebador de cada serie que está equipado con un extremo de traslape-extensión. Los extremos de traslape-extensión, permiten el enlace de los productos generados por cada una de las series de cebadores durante la amplificación. Tal mezcla de cebador es llamada una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple. La RCP de traslape-extensión múltiple, difiere de la RCP de traslape-extensión convencional, en que las secuencias a ser ligadas son generadas simultáneamente en el mismo tubo, con ello proporcionando enlace inmediato de las secuencias objetivo durante la amplificación, sin cualquier purificación intermedia. Además, la RCP de traslape-extensión convencional, requiere una reacción de RCP de enlace separado ya sea con o fuera de la serie de cebador o una serie de cebador anidado para generar el producto ligado (Horton, R.M. et al . , 1989. Gene 77, 61-68). Tal etapa de amplificación adicional es opcional en la RCP de traslape-extensión múltiple de la presente invención. Una característica de la presente invención es una etapa de transcripción inversa (TI) que precede la amplificación de RCP de traslape-extensión múltiple o RCP múltiple, utilizando una plantilla derivada de una célula única aislada o una población de células isogénicas. Una característica adicional de la presente invención es el uso de secuencias de nucleósidos derivadas de una célula única aislada o una población de células isogénicas como plantillas para la amplificación por RCP múltiple. Preferiblemente, el ARN a partir de una célula única es transcrito inverso en el ADNc previo a la RCP múltiple. Para la amplificación de algunas secuencias de ácido nucleico de interés, el ADN genómico puede ser usado como una alternativa al ARNm. Usando células aisladas únicas o una población de células isogénicas derivadas por expansión clonal de una célula única aislada como fuente de plantilla, es posible evitar aleatorización de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína heteromérica de interés, con secuencias de nucleótidos derivadas de diferentes células dentro de una población de células . Esto es de importancia si uno quiere obtener la composición original de las secuencias de interés . Especialmente para la generación de un par cognado de secuencias que codifican la región variable, es una característica importante, el uso de una célula única aislada o una población de células isogénicas como fuente de plantillas . La RCP de traslape-extensión múltiple es una tecnología raramente usada. El documento WO 99/16904 describe el enlace de exones a partir de una secuencia genómica en una reacción única, con ello, generando ADNc sin utilizar transcripción inversa. El proceso como se describe, utiliza una serie de cebador (constituida de dos cebadores) por exón a ser ligado, con ello, componiendo una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple. Cada serie de cebador individual fue capaz de traslaparse con la serie de cebador adyacente por extremos de traslape-extensión complementarios. El ADNc se generó a partir de una plantilla de ADN genómico realizando una reacción de TI-RCP de traslape-extensión, utilizando la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple, seguida por una RCP anidada, la cual se describe como una etapa necesaria. La generación del ADNc a partir de los exones de ADN genómicos como se describe en el documento WO 99/16904, es un campo diferente que la clonación de secuencias que codifican para proteínas heteroméricas. Primero de todo, las proteínas heteroméricas son expresadas generalmente de diferentes genes, mientras los enlaces de exón como se describe en el documento WO 99/16904, se refieren al enlace de exones a partir de un gen único. Adicionalmente, la presente invención facilita la generación de bibliotecas de secuencias de ácido nucleico ligadas de interés, en particular, bibliotecas combinatoriaes y bibliotecas de pares cognados de regiones variables; una situación completamente diferente que enlazar una serie de exones a partir de un gen único, que resulta en un ADNc no variable único. Además, la presente invención utiliza ácidos nucleicos derivados de células únicas, preferiblemente en la forma de ARN que no necesita ser aislado de los contenidos de células restantes antes de que pueda ser utilizado como plantilla.

Existen algunas publicaciones, en donde la TI-RCP de traslape-extensión múltiple ha sido descrita con relación al enlace de secuencias que codifican la región variable . La forma más simple de TI-RCP de traslape-extensión múltiple fue descrita para el aislamiento de una secuencia que codifica a scFv de una línea celular de hibridoma (Thirion, S. et al . , 1996, Eur. J. Cáncer Prev. 5, 507-511 y Mullinax, R. L et al . 1992. BioTechniques 12, 864-869). Los métodos descritos por Thirion y Mullinax, utilizan transcripción inversa de ARMm con cebadores oligo-dT en ARM total extraído de la línea de células de hibridoma, seguidos por una etapa separada de enlace . La etapa de enlace se realiza con un total de cuatro cebadores, constituyendo dos pares cebadores para amplificación de las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera, respectivamente. El cebador delantero VL y el cebador inverso VH o CH, contienen extremos de traslape-extensión complementarios, con ello, permitiendo la amplificación simultánea y enlace des secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera. Estos métodos no usan una RCP anidada para incrementar la sensibilidad del método de enlace. El otro ejemplo de TI-RCP de traslape-extensión múltiple con relación al enlace de las secuencias que codifican la región variable, fue descrito en el documento WO 93/03151, mencionado previamente, proporciona un método de clonación de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada que se originan de la misma célula, sin tener que aislar células únicas previo a la clonación. El método descrito en el documento WO 93/03151 requiere lavado entre la etapa de TI y la etapa de RCP de traslape-extensión múltiple. Además, uno de los objetivos específicos llevado cerca por el documento WO 93/03151, fue resolver el problema de tener que aislar células únicas para obtener pares cognados de secuencias que codifican la región variable. Ninguna de estas técnicas de TI-RCP de traslape-extensión múltiple conocidas, fueron desarrolladas para funcionar en plantillas derivadas de una célula única aislada. Ni fueron algunos de los métodos capaces de realizarlos como reacciones de TI-RCP de etapa única. Una modalidad de la presente invención abarca el enlace de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguos de interés. El método comprende amplificar, en un procedimiento de RCP múltiple o TI-RCP múltiple, secuencias de nucleótidos de interés, usando una plantilla derivada de una célula única aislada o una población de células isogénicas y efectuar el enlace de las secuencias de nucleótidos amplificadas de interés. Además, el método comprende una etapa opcional de realizar una amplificación adicional de los productos ligados . Una modalidad adicional de la presente invención abarca un método para producir una biblioteca de pares cognados que comprende, secuencias que codifican la región variable ligada. El método comprende proporcionar una fracción de células que contienen linfocitos a partir de un donador, el cual es opcionalmente enriquecido por una población de linfocitos particulares a partir de dicha fracción celular. Además, una población de células únicas aisladas se obtiene distribuyendo las células a partir de la fracción de células que contienen linfocitos, o la fracción celular enriquecida, individualmente entre una pluralidad de recipientes. Se realiza la amplificación molecular múltiple (amplificación por TI-RCP múltiple) , de las secuencias que codifican la región variable contenidas en la población de células únicas aisladas, y se efectúa el enlace de los pares de secuencias que codifican la región variable, en donde un par individual se deriva de una célula única, dentro de la población de células únicas aisladas. Además, la técnica comprende dos etapas opcionales: en la primera etapa, la célula única aislada individual en la población de células únicas se expande a una población de células isogénicas previo a realizar la amplificación por TI-RCP múltiple. Con ello, obteniendo una pluralidad de recipientes con una población diversa de células isogénicas (una población de células isogénicas en un recipiente) . La segunda etapa opcional abarca realizar una amplificación adicional de las secuencias que codifican la región variable enlazada. En modalidades preferidas de la presente invención, un elemento individual de dicha biblioteca de pares cognados comprendido de una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, está asociado con una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, que se origina de la misma célula o de secuencias que codifican un dominio de enlace al receptor de células T, constituido de una región variable de cadena alfa asociada con una región variable de cadena beta, o una región variable de cadena gamma, asociada con una región variable de cadena delta, en donde las regiones variables asociadas se originan de la misma célula. La amplificación por TI-RCP múltiple de la presente invención, puede ser realizada ya sea como un proceso de dos etapas, en donde la transcripción inversa (TI) se realiza separada de la amplificación de RCP múltiple (o amplificación molecular múltiple alternativa) , o como un proceso de etapa única, en donde las etapas de amplificación por RCP múltiple y TI son realizadas con los mismos cebadores en un tubo. La transcripción inversa (TI) se realiza con una actividad de transcriptasa inversa que contiene enzima, que resulta en la generación de ADNc a partir del ARN total, ARNm o ARN específico objetivo a partir de una célula única aislada. Los cebadores los cuales pueden ser utilizados para la transcripción inversa son por ejemplo, cebadores oligo-dT, hexámeros aleatorios, decámeros aleatorios, otros cebadores aleatorios, o cebadores que son específicos para las secuencias de nucleótidos de interés. El procedimiento de amplificación por TI-RCP múltiple de dos etapas, permite para el ADNc generado en la etapa de TI, ser distribuido a más de un recipiente permitiendo el almacenamiento de una fracción de plantilla antes de proceder con la amplificación. Adicionalmente, la distribución de ADNc a más de un tubo, permite el funcionamiento de más de una amplificación por RCP múltiple de ácido nucleico derivado de la misma plantilla. Aunque esto resulta en un número incrementado de reacciones separadas, se debe desear abrir la posibilidad para disminuir la complejidad de mezcla cebadora múltiple de estas. Este procedimiento de dos etapas puede por ejemplo, ser aplicado para amplificar y enlazar secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera kappa en un tubo, y secuencias que codifican la región variable de cadena ligera lambda y región variable de cadena pesada en un tubo diferente, utilizando la misma plantilla. Una célula única usualmente solamente expresa una de las cadenas ligeras. Sin embargo, a menudo será más fácil realizar las reacciones simultáneamente en lugar de esperar el resultado de una de las reacciones antes de realizar la otra. Además, la amplificación de tanto kappa como lambda, sirve como un control negativo interno, puesto que podría esperarse que solamente kappa o lambda se amplifiquen de una célula única. En el procedimiento de TI-RCP múltiple de etapa única, la amplificación por RCP múltiple y transcripción inversa, se lleva a cabo en el mismo recipiente. Todos los componentes necesarios para realizar tanto la transcripción inversa como la RCP múltiple en una etapa única, son inicialmente agregados en los recipientes y al reacción es realizada. De manera general, no hay necesidad de agregar componentes adicionales una vez que la reacción ha sido iniciada. La ventaja de la amplificación por TI-RCP múltiple, es que reduce el número de etapas necesarias para generar las secuencias de nucleótidos ligadas de la presente invención aún adicionalmente. Esto es particularmente útil cuando se realiza la TI-RCP múltiple en un arreglo de células únicas, en donde la misma reacción necesita llevarse a cabo en una pluralidad de recipientes. Se realiza TI-RCP múltiple de etapa única utilizando cebadores inversos presentes en una mezcla de cebador múltiple, necesarios para la amplificación por RCP múltiple como cebadores para la transcripción inversa también. De manera general, la composición necesaria para la TI-RCP múltiple de etapa única, comprende una plantilla de ácido nucleico, una enzima con actividad de transcriptasa inversa, una enzima con actividad de polimerasa de ADN, mezcla de trifosfato de desoxinucleótidos (mezcla de dNTP que comprende dATP, dCTP, dGTP, y dTTP) y una mezcla cebadora múltiple. La plantilla de ácido nucleico es preferiblemente ARN total o ARN derivado de una célula única aislada ya sea en una forma purificada, como un lisado de la célula o todavía dentro de la célula intacta. De manera general, la composición exacta de la mezcla de reacción requiere alguna optimización para cada mezcla de cebador múltiple a ser usada dentro de la presente invención. Esto aplica para los procedimientos de TI-RCP múltiple tanto de etapa única como de dos etapas . En modalidades alternativas de la presente invención, puede ser apropiado usar ADN genómico en lugar de ARM como plantilla. En tales casos, la etapa de transcripción inversa es omitida, y las etapas restantes de la invención son realizadas como se describe a través de la solicitud. Para algunas reacciones de TI-RCP múltiple de etapa única, puede ser ventajoso agregar componentes adicionales durante la reacción. Por ejemplo, la adición de polimerasa después de la etapa de TI . Otros componentes podrán por ejemplo, ser una mezcla de dNTP o una mezcla de cebador múltiple posiblemente con una composición de cebador diferente. Esto puede entonces ser considerado como una TI-RCP múltiple de un tubo, la cual generalmente tiene las mismas ventajas como la TI-RCP múltiple de etapa única, puesto que también limita el número de tubos necesarios para obtener los productos enlazados deseados . Las secuencias de nucleótidos de interés, amplificada por TI-RCP múltiple, pueden ser ligadas a otras por varios métodos, tales como TI-RCP de traslape-extensión múltiple, ligación o recombinación, usando mezclas de cebadores múltiples diferentes. Preferiblemente, la amplificación por TI-RCP múltiple y proceso de enlace, es un proceso de etapa única o de dos etapas. Sin embargo, el proceso de enlace puede también ser realizado como un proceso de etapas múltiples, usando por ejemplo, un fragmento de relleno para enlazar las secuencias de ácido nucleico de interés, ya sea con RCP, ligación o recombinación. Tal fragmento de relleno puede contener elementos cis, elementos promotores o una secuencia de codificación relevante o secuencia de reconocimiento. En una modalidad preferida, el proceso de enlace se realiza en el mismo recipiente como la amplificación por TI-RCP múltiple. En una modalidad de la presente invención, el enlace de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguos de interés, se realiza en asociación con la amplificación por RCP múltiple , utilizando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple . Esto resulta en la amplificación combinada y enlace de las secuencias obj etivo . De manera general , la composición necesaria para la RCP de traslape-extensión múltiple comprende, una plantilla de ácido nucleico, una enzima con actividad de poli erasa de ADN, mezcla de trifosfato de desoxinucleósido (mezcla dNTP que corrprende dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , y una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple. En una modalidad particular de la presente invención, el enlace de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguos de interés, se realiza por TI -RCP de traslape-extensión múltiple, usando una plantilla derivada de una célula única aislada o una población de células isogénicas . Además , el método comprende una etapa opcional de realizar una amplificación molecular adicional de productos ligados . Preferiblemente , la TI -RCP de traslape-extensión múltiple , es realizada como una reacción de etapa única/un tubo . Una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple de la presente invención, comprende al menos dos series de cebadores capaces de cebar la amplificación y enlace de al menos dos secuencias que codifican la región variable , por ej emplo, amplificación y enlace de secuencias a partir de familias de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con familias de región variable de cadena ligera kappa o lambda, o amplificación y enlace de secuencias a partir de familias del receptor de células T a, ß, ?, ó d. En otra modalidad de la presente invención, la pluralidad de secuencias de nucleótidos de interés, amplificada por TI-RCP múltiple, están enlazadas por ligación. Para lograr esto, la mezcla de cebador múltiple usada para la TI-RCP múltiple, es diseñada de manera tal que las secuencias objetivo amplificadas pueden ser desdobladas con enzimas de restricción apropiadas y se puede realizar el enlace covalente por ligación de ADN (el diseño del cebador es descrito en la sección "Mezclas y Diseños de Cebador" ) . Después de la amplificación por TI-RCP múltiple con tal mezcla de cebador múltiple, las enzimas de restricción necesarias para formar extremos compatibles de secuencias objetivo, son agregadas a la mezcla junto con la ligasa. No se necesita purificación de los productos de RCP previo a esta etapa, aunque la purificación puede ser realizada. La temperatura de reacción para el desdoblamiento de restricción combinado y ligación, es aproximadamente entre 0 y 40°C. Sin embargo, si la polimerasa de la reacción de RCP múltiple está todavía presente en la mezcla, se prefiere una temperatura de incubación por debajo de la temperatura ambiente, más preferidas son temperaturas entre 4 y 16°C. En aún otra modalidad de la presente invención, la pluralidad de secuencias de nucleótidos de interés, amplificadas por TI-RCP múltiple, está ligada por recombinación. En este procedimiento, las secuencias objetivo amplificadas pueden ser unidas usando sitios de recombinación idénticos. El enlace es entonces realizado agregando las reco binasas que facilitan la recombinación. Algunos sistemas de recombinasa adecuados son recombinasa Flp con una variedad de sitios FRT, recombinasa Cre con una variedad de sitios lox, integrasa FC31 las cuales realizan la recombinación entre el sitio attP y el sitio attB, los sistemas de seis ß-reco binasas, así como también el sistema Gin-gix. El enlace por recombinación ha sido ejemplificado por dos secuencias de nucleótidos (VH enlazado con VL) (Chapal, N. et al . , 1997 BioTechniques 23, 518-524), con ello incorporado en este documento por referencia. En una modalidad preferida de la presente invención, las secuencias de nucleótidos de interés, comprenden secuencias que codifican la región variable y enlaces que generan un par cognado de secuencias que codifican la región variable. Tal par cognado puede comprender una o más secuencias que codifican la región constante además de las regiones variables. En una modalidad más preferida de la presente invención, las secuencias de nucleótidos de interés comprenden secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina y el enlace genera un par cognado de secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera. Tal par cognado puede comprender una o más secuencias que codifican la región constante, además de las regiones variables. Además, tal par cognado puede ser aislado de plantillas derivadas de células del linaje de linfocitos B enriquecido a partir de una fracción de células que contienen linfocitos, tal como sangre completa, células mononucleares o células blancas de la sangre. En apenas una modalidad preferida de la presente invención, las secuencias de nucleótidos de interés, comprenden secuencias que codifican la región variable TcR y el enlace genera un par cognado de secuencias que codifican una región variable de cadena o: y una región variable de cadena ß ó secuencias que codifican la región variable de cadena d y región variable de cadena ?. Tal par cognado puede comprender una o más secuencias que codifican la región constante, además de las regiones variables. Además, tal par cognado puede ser aislado de una plantilla derivada de células del linaje de linfocitos T enriquecidos a partir de una fracción de células que contienen linfocitos, tales como sangre completa, células mononucleares, o células blancas de la sangre. Otro aspecto de la presente invención es utilizar la TI-RCP múltiple con una población de células genéticamente diversas como fuentes de plantillas . La mayoría de secuencias que codifican la proteína heteromérica, no varían de célula a célula como es el caso con secuencias que codifican la región variable a partir de proteínas de enlace. De este modo, cuando se utiliza la presente invención para la clonación de tales secuencias que codifican la proteína heteromérica no variable, no existe necesidad de realizar un aislamiento inicial de células únicas. En esta modalidad de la presente invención, una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguos de interés, están ligadas aleatoriamente por un método que comprende, realizar amplificación por TI-RCP múltiple de secuencias de nucleótidos de interés usando una plantilla derivada de una población de células genéticamente diversas y efectuando el enlace de las secuencias de nucleótidos amplificadas de interés. Además, el método comprende una etapa opcional de realizar una amplificación adicional de los productos ligados . Como con el procedimiento de células únicas, el enlace puede ser ya sea realizado utilizando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple para la amplificación, o alternativamente por ligación o recombinación. Preferiblemente, la plantilla derivada de la población de células no está estrictamente contenida dentro de las células. La población de células puede por ejemplo, ser sometida a lisis. La aplicación del proceso de enlace aleatorio en una población de células que expresan proteínas de enlace, permite una generación simplificada de bibliotecas combinatoriaes de secuencias que codifican la región variable. Preferiblemente, la población de células constituye células que expresan proteínas que se enlazan a la región variable, tales como linfocitos B, linfocitos T, células de hibridoma, células de plasma, o una mezcla de estas células. La población de células en la modalidad mencionada anteriormente, puede ser por ejemplo, permeabilizada o sometida a lisis, sin purificación adicional, o los ácidos nucleicos de la plantilla pueden ser aislados de las células por procedimientos estándares. Se prefiere el procedimiento de ti-RCP de traslape-extensión múltiple de una etapa. Sin embargo, el procedimiento de dos etapas puede también ser usado en la modalidad. La invención también proporciona una biblioteca combinatoria comprendida de pares enlazados de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulina. Una forma eficiente para incrementar la especificidad, sensibilidad y rendimiento del proceso de enlace por TI-RCP múltiple, es realizando una amplificación molecular adicional de las secuencias de nucleótidos obtenidas a partir de la TI-RCP múltiple, seguida por enlace por ligación o recombinación o enlace usando la TI-RCP de traslape-extensión múltiple. Esta amplificación adicional es preferiblemente realizada con amplificación por RCP, utilizando una mezcla cebadora adaptada para amplificar las secuencias de ácido nucleico ligadas de interés. La mezcla de cebador utilizada puede ser los cebadores externos de la mezcla de cebador múltiple o la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple, significando cebadores los cuales templan el extremo más externo 5' y 3' de la hebra sentido de las secuencias que codifican la región variable ligada, con ello, permitiendo la amplificación del producto ligado completo. Los cebadores externos pueden también ser descritos como los cebadores de la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple que no contiene extremos de extensión de traslape. Alternativamente, una serie de cebador anidado o semi-anidado puede ser usado para la amplificación adicional de las secuencias de nucleótidos ligadas. Tal RCP anidada, especialmente sirve para incrementar la especificidad del método, así como también para incrementar la cantidad de producto ligado. Por la presente invención, la RCP semi-anidada (como se describe en la sección titulada Mezclas y Diseño de Cebador) , es considerada por funcionar así también como la RCP anidada. De este modo, se desea aunque no necesariamente por la presente invención, realizar una amplificación por RCP adicional de los productos ligados a partir de la TI-RCP de traslape-extensión múltiple o de los productos ligados por ligación o recombinación, preferiblemente usando RCP anidada o RCP semi-anidada.

La ampli icación adicional puede ser ya sea realizada directamente usando una fracción o el producto de reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple completo o producto de ligación o producto de recombinación, o cualquier fracción de cualquiera de estos productos o usar productos ligados parcialmente purificados a partir de cualquiera de estas reacciones, por ejemplo, realizando electrofóresis en gel de agarosa de los productos ligados, y escindiendo el fragmento correspondiente al tamaño esperado de secuencias que codifican la región variable de cadena ligada. Para productos ligados por ti-RCP de traslape-extensión múltiple, la amplificación adicional es preferiblemente realizada directamente en una fracción de la reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple, puesto que esto podría asistir al enlace de las secuencias objetivo individuales que no estuvieron ligadas en la primera reacción. Secuencias de interés Las secuencias de nucleótidos de interés de la presente invención, pueden ser seleccionadas a partir de secuencias que codifican diferentes subunidades o dominios, los cuales cuando se expresan, forman una proteína o parte de una proteína. Tales proteínas que están compuestas de al menos dos subunidades no idénticas, son conocidas como proteínas heteroméricas . Las proteínas heteroméricas son comunes en todas las clases de especies. Algunas de las clases a las cuales tales proteínas pertenecen son por ejemplo, enzimas, inhibidores, proteínas estructurales, toxinas, proteínas de canales, proteínas G, proteínas de receptores, proteínas de la subfamilia de inmunoglobulina, proteínas de transporte, etc. Las secuencias de nucleótidos que codifican tales proteínas heteroméricas no son contiguas, significando por ejemplo, que se originan de genes diferentes, o de moléculas de ARNm diferente. Sin embargo, no contiguo como se usa en la presente invención, puede también significar dominios que codifican secuencias de nucleótidos de la misma proteína, en donde los dominios son separados por secuencias de nucleótidos las cuales no son de interés. En una modalidad de la presente invención, las secuencias de nucleótidos de interés contienen secuencias que codifican regiones variables de la superfamilia de inmunoglobulina, tales como inmunoglobulinas (anticuerpos) , receptores de células B y receptores de células T (TcR) . Especialmente, secuencias que codifican regiones variables a partir de inmunoglobulinas son de interés. Tales secuencias que codifican una región variable comprenden anticuerpos de longitud completa, así como también Fab, Fv, scFV y combinaciones de fragmentos de las secuencias que codifican la región variable, por ejemplo, regiones que determinan la complementariedad (CDR) , genes de unión o genes V o combinaciones de estos. De manera general, la presente invención puede ser aplicada con cualquiera de las combinaciones de secuencias que codifican la región variable y fragmentos de las mismas. La presente solicitud ejemplifica el enlace de la cadena ligera completa con el dominio variable de la cadena pesada. Sin embargo, la presente invención también permite el enlace de solamente los dominios variables de secuencias que codifican Fv o scFVv que generan cadenas ligera y pesada, o el enlace de la cadena ligera completa con la región variable de cadena pesada + el dominio de la región constante CH? + partes de la región de articulación, generando Fab, Fab' o F(ab)2. Además, es posible agregar cualquier región de los dominios de la región constante de cadena pesada a la cadena pesada variable, con ello, generando secuencias que codifican anticuerpos truncados o secuencias que codifican anticuerpos de longitud completa. En una modalidad adicional de la presente invención, secuencias que codifican una región variable de la presente invención, comprenden un tipo de secuencias que codifican una cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda) y una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina. Las secuencias que codifican la región variable derivadas de receptores de células T (TcR) , son también de interés. Tales secuencia que codifican a TcR, comprenden secuencias codificantes para las cadenas beta o alfa de longitud completa o cadenas gamma y delta, así como también TcR solubles o solamente los dominios variables de estas cadenas o proteínas de fusión de cadena única de los mismos (por ejemplo, cadena única ß ó cadena única ?d) . Fuentes de Plantillas Una característica de la presente invención es la capacidad para enlazar secuencias de nucleótidos derivadas de una célula única aislada, una población de células isogénicas, o una población genéticamente diversa de células, las cuales no han sido separadas en recipientes únicos. Las células utilizadas en la presente invención pueden por ejemplo, ser bacterias, levaduras, hongos, células de insecto, células de plantas o células de mamíferos o fracciones de tales células. Las células sanguíneas derivadas de mamíferos, son un ejemplo de una fracción de células que pueden ser utilizadas en la presente invención. Una característica preferida de la presente invención es el uso de células únicas aisladas o una población de células isogénicas como fuente de plantillas, puesto que se evita la aleatorización de las secuencias de ácido nucleico de interés, en particular secuencias que codifican la región variable particular. Esto es de importancia si uno quiere obtener un par original de por ejemplo, secuencias que codifican la región variable.

Otra característica preferida de la presente invención, es obtener una célula única o población de células únicas a partir de una fracción celular que comprende linfocitos, tales como linfocitos B, linfocitos T, células de plasma y/o varios estados de desarrollo de estos linajes celulares . Otras poblaciones de células que expresan proteínas de enlace a partir de la superfamilia de inmunoglobulina, podrían también ser usadas para obtener células únicas. Las líneas celulares tales como células de hibridoma, líneas de células de linajes de linfocitos B o linfocitos T o líneas de células inmortalizadas de virus o células derivadas de donadores, que participan en la respuesta inmune, son también aplicables en la presente invención. Las fracciones de células que contienen linfocitos derivados de donadores, se pueden obtener a partir de tejido o fluido natural el cual es rico en tales células, por ejemplo, sangre, médula ósea, nodos linfáticos, tejido del bazo, tejido de la amígdala o de infiltraciones en y alrededor de tumores o en infiltraciones de tejido inflamatorio. Donadores de células adecuadas para la presente invención, se pueden seleccionar de vertebrados que contienen todos, un sistema inmune adquirido. Los donadores pueden ser ya sea no experimentados, o hiperinmunes, con respecto a un objetivo deseado. Para el aislamiento de proteínas que se enlazan a antígenos con especificidad de enlace hacia un objetivo deseado, son preferidos los donadores hiperinmunes . Tales donadores hiperinmunes pueden ya sea, ser donadores inmunizados con el objetivo, o fragmentos del objetivo, o pueden ser pacientes convalecientes, o individuos no saludables, los cuales están corriendo una respuesta inmune natural hacia el objetivo, por ejemplo, pacientes autoinmunes, pacientes con cáncer, pacientes con enfermedades infecciosas, por ejemplo, pacientes con VIH, pacientes con Hepatitis A, B o C, pacientes con SARS, etc., o pacientes con enfermedades crónicas. Cuando se utilizan proteínas recombinantes para tratamiento, es preferible que se deriven de secuencias que tienen identidad de especies con el individuo a ser tratado (por ejemplo, secuencias humanas para tratamiento de humanos) . Primero, debido a que las proteínas recombinantes derivadas de una secuencia extraña (es decir, no humana) , serán reconocidas por el sistema inmune conduciendo a una respuesta inmune, implicando anticuerpos anti-proteínas policlonales. Estos anticuerpos anti-proteínas pueden bloquear la acción del fármaco ocupando el sitio activo, acelerarán la separación del fármaco y podrán potencialmente, inducir reacciones adversas tales como reacciones de hipersensibilidad después de la exposición repetida. La inmunogenicidad puede, sin embargo, también ser vista en casos en donde la proteína recombinante se deriva de una secuencia que tiene identidad de especies. Tal inmunogenicidad puede por ejemplo, ser inducida por modificaciones post-traduccionales que podrían diferir de aquellas vistas in vivo. Las bibliotecas combinatoriaes de secuencias que codifican la región variable podrían también dar origen a la inmunogenicidad, puesto que consisten de pares aleatorios de secuencias que codifican la región variable creada in vitro. Las reglas que rigen la formación de los pares de la secuencia que codifican la cadena ligera y pesada de anticuerpo (o receptores de células T) in vivo, no son completamente entendidas. Por lo tanto, sigue que algunos de los pares formados in vi tro podrán ser reconocidos por extraños por el sistema inmune, aún a pesar de que ambas secuencias que constituyen el par son perfectamente humanas . Las proteínas de enlace obtenidas de bibliotecas cognadas, por otro lado, no crean dichas combinaciones anormales y son consecuentemente, de inmunogenicidad potencial menor que las proteínas de enlace a partir de bibliotecas combinatoriaes . Esto no significa que los productos de las bibliotecas combinatoriaes son inadecuados para el tratamiento, solo requieren un grado mayor de monitoreo con respecto a los efectos colaterales mencionados anteriormente. Para uso en la presente invención, los donadores de células deben ser preferiblemente de las mismas especies, como las especies a ser tratadas con los productos obtenibles de las secuencias de nucleótidos ligadas de la presente invención. Preferiblemente, un donador de célula es un animal doméstico, una mascota, un humano, o un animal transgénico. Los animales transgénicos que llevan sitios de inmunoglobulina humana, se describen en la Patente Estadounidense No. 6,111,166 y Kuroiwa, Y. et al . Nature Biotechnology; 2002; 20:889-893. Tales animales transgénicos son capaces de producir inmunoglobulinas humanas. De este modo, anticuerpos completamente humanos contra un objetivo específico, se pueden originar por técnicas de inmunización usual de tales animales transgénicos. Esto permite la generación de bibliotecas que codifican para proteínas de enlace con especificidades hacia objetivos más difíciles, tales como antígenos humanos a los cuales no existe o está limitada una respuesta de anticuerpo humano natural. Tales animales transgénicos pueden del mismo modo, ser desarrollados para producir receptores de células T humanas . En una modalidad adicional de la presente invención, la fracción de células que contienen linfocitos, está constituida de sangre completa, médula ósea, células mononucleares, o células blancas de la sangre obtenidas de un donador. Células mononucleares pueden ser aisladas de la sangre, médula ósea, nodos linfáticos, bazos, infiltraciones alrededor de células cancerosas e infiltraciones inflamatorias. Las células mononucleares pueden ser aisladas por técnicas de centrifugación de densidad, por ejemplo, gradientes Ficoll . Si las células mononucleares son aisladas de muestras compuestas de tejido, el tejido es desintegrado antes que la centrifugación del gradiente se realice. La desintegración puede ser realizada, por ejemplo, por métodos mecánicos tales como trituración, electroporación y/o por métodos químicos tales como tratamientos enzimáticos. El aislamiento de células blancas de la sangre, se puede realizar directamente de donadores usando leucofóresis . Las preparaciones crudas de por ejemplo, médula ósea o tejido, las cuales contienen linfocitos, pueden también ser usadas en la presente invención. Tales preparaciones no necesitarán ser desintegradas, por ejemplo, como se describe anteriormente, para facilitar la distribución de células únicas. Una característica adicional de la presente invención, es el enriquecimiento de la fracción de células que contienen linfocitos, por ejemplo, sangre completa, células mononucleares, células blancas de la sangre o médula ósea, con respecto a una población de linfocitos particulares, tales como células a partir del linaje de linfocitos B o linfocitos T. El enriquecimiento de linfocitos B puede por ejemplo, ser realizado usando clasificación de células por perlillas magnéticas o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , tomando ventaja de las proteínas marcadoras de la superficie celular específicas del linaje tales como CD19 u otros marcadores específicos del linaje de células. El enriquecimiento de linfocitos T puede por ejemplo, ser realizado utilizando un marcador de la superficie celular, tal como CD3 u otros marcadores específicos del linaje de células T. Una característica preferida de la presente invención es clasificar los linfocitos B enriquecidas, además de adquirir células del plasma, antes de distribuir las células individualmente entre una pluralidad de recipientes . El aislamiento de las células del plasma es realizado de manera general, por clasificación FACS, utilizando marcadores de la superficie tales como CD38 posiblemente en combinación con CD45. Otros marcadores de la superficie específicos de las células del plasma o combinaciones de los mismos, pueden ser utilizados también, por ejemplo, CD138, CD20, CD21, CD40, CD9, HLA-DR o CD62L, la elección exacta del marcador depende de la fuente de células del plasma, por ejemplo, amígdalas, sangre o médula ósea. Las células del plasma pueden también obtenerse a partir de una población de células que contienen linfocitos no enriquecidas, obtenidas a partir de cualquiera de estas fuentes. Las células del plasma aisladas de la sangre son algunas veces llamadas células del plasma temprano o plasmablastos . En la presente invención, estas células son también llamadas células del plasma aunque son CD19 positivas, contrario a las células del plasma que residen en la médula ósea. Las células del plasma son deseadas para el aislamiento de pares cognados de secuencias que codifican inmunoglobulinas, debido a que la frecuencia superior de estas células produce anticuerpos específicos del antígeno, que reflejan la inmunidad adquirida hacia el antígeno deseado y la mayoría de las células se han sometido a hipermutación somática y por lo tanto, codifican para anticuerpos de alta afinidad. Además, los niveles de ARMm en las células del plasma son elevados, comparados con la población de linfocitos B restantes, de este modo, el procedimiento de transcripción inversa es más eficiente cuando se usan células del plasma únicas. Como una alternativa al aislamiento de células del plasma, las células B de la memoria pueden ser aisladas de una fracción de células que contiene linfocitos, utilizando un marcador de la superficie tal como CD22. Una característica alternativa de la presente invención, es seleccionar los linfocitos B enriquecidos para determinar la especificidad del antígeno antes de distribuir las células entre una pluralidad de recipientes. El aislamiento de linfocitos B específicos del antígeno, se realiza poniendo en contacto los linfocitos B enriquecidos con el antígeno deseado o antígenos que permiten el enlace de antígenos a la superficie expuesta a inmunoglobulina, seguido por aislamiento de aglutinantes. Esto se puede hacer, por ejemplo, por revestimiento de perlillas magnéticas con el antígeno deseado o antígenos, seguido por la clasificación de células por perlillas magnéticas, por FACS, por revestimiento de una columna con los antígenos, seguido por cromatografía de afinidad, por ensayos de selección de filtro u otros métodos conocidos en la técnica. Las células del plasma, así como también linfocitos B, células mononucleares enriquecidas, células blancas de la sangre, sangre completa, médula ósea o preparaciones de tejidos, pueden someterse a aislamiento con respecto a la especificidad del antígeno si esto se desea. Otra característica de la presente invención es, clasificar linfocitos T enriquecidos (por ejemplo, células CD3 positivas) , usando marcadores de la superficie CD45R y/o CD27, para obtener una fracción de células T de la memoria. Los linfocitos T pueden también ser seleccionados para determinar la especificidad del antígeno MHC usando complejos peptídicos MHC (por ejemplo, Callan, M. F. et al . 1998. J. Exp. Med. 187, 1395-1402; Novak, E. J. et al . 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67) . Una característica adicional de la presente invención es la inmortalización de cualquiera de las fracciones de células aisladas descritas anteriormente (por ejemplo, linfocitos B, células del plasma, células de la memoria o linfocitos T) . La inmortalización puede por ejemplo, ser realizada con virus Epstein-Barr (Traggiai, E., et al., 2004. Nat Med 10, 871-875), previo a la distribución celular. Alternativamente, las células únicas aisladas pueden ser inmortalizadas y expandidas, previo a la transcripción inversa. Traggiai et al . , Nat Med. 2004 Aug; 10(8):871-5. Una característica adicional de la presente invención, es la distribución de una población de células deseadas (por ejemplo, células de hibridoma, linaje de líneas de células de linfocitos B o linfocitos T, células de sangre completa, células de médula ósea, células mononucleares, células blancas de la sangre, linfocitos B, células del plasma, linfocitos B específicos del antígeno, células B de la memoria, linfocitos T, linfocitos T específicos de MHC/antígenos, o células T de la memoria) , individualmente, en una pluralidad de recipientes, para obtener una población de células únicas aisladas. Este aislamiento de células únicas se refiere a la separación física de células de una población de células en tal forma, que un recipiente único contiene una célula única, o un micro arreglo, chip o matriz de gel, es cargado en una manera que produce células únicas. Las células pueden ser distribuidas directamente en multitudes de recipientes, tales como arreglos de recipientes únicos limitando la dilución. Los recipientes únicos utilizados en la presente invención, son preferiblemente aquellos aplicables en la RCP (por ejemplo, tubos de RCP y placas de RCP de 96 cavidades o 384 cavidades o arreglos más grandes de recipientes) . Sin embargo, otros recipientes pueden también ser usados . Cuando se distribuyen las células únicas en un gran número de recipientes únicos (por ejemplo, placas de 384 cavidades) , se obtiene una población de células únicas. Tal distribución se puede realizar por ejemplo, dispersando un volumen en un recipiente único que en promedio, abarca una concentración celular de uno, 0.5 ó 0.3 células, con ello, se obtienen recipientes que en promedio, contienen una célula única o menos. Puesto que la distribución de células limitando la dilución es un evento estadístico, una fracción de los recipientes se vaciará, una fracción principal contendrá una célula única, y una fracción menor contendrá dos o más células. Si dos o más células están presentes en un recipiente puede ocurrir alguna aleatorización de las secuencias que codifican la región variable entre las células presentes en los recipientes. Sin embargo, puesto que es un evento menor, no afectará la utilizad total de la presente invención. Adicionalmente, combinaciones de secuencias que codifican una región variable las cuales no poseen la afinidad de enlace deseado y especificidad, más probablemente no serán seleccionadas y por lo tanto, eliminadas durante el proceso de selección. Por lo tanto, eventos menores de aleatorización no afectarán significantemente la biblioteca final de la presente invención. Existen alternativas a la distribución celular limitando la dilución usando, por ejemplo, clasificadores celulares tales como máquinas FACS o robots , que pueden ser programados para distribuir exactamente, células únicas en los recipientes únicos. Estas alternativas son preferibles, puesto que son menos laboriosas y más eficientes en uniformidad, obteniendo una distribución de células únicas en los recipientes únicos. Los procedimientos de enriquecimiento, clasificación y aislamiento descritos anteriormente, se realizan de manera qµe la mayoría de las células se mantienen intactas. La ruptura de las células durante el enriquecimiento y clasificación, podría resultar en aleatorización de las secuencias que codifican la región variable . Sin embargo, esto no se espera sea un problema, puesto que la frecuencia de la ruptura se espera sea baja. El tratamiento de lavado y ARNse posible de las células previo a la distribución en recipientes únicos, removerá cualquier ARN que se ha derramado durante el proceso . Además , cuando se consideran las descripciones anteriores de como distribuir las células para obtener una población de células únicas en una población de recipientes únicos , no se interpreta como una característica absolutamente requerida, que cada recipiente debe contener una célula única . Preferentemente, indica que una mayoría de los recipientes contienen células únicas , por ej emplo, el número de recipientes con dos o más células está por debajo del 25% de la cantidad total de células distribuidas , o aún mejor, está por debajo del 10% .

Una característica adicional de la presente invención es el funcionamiento de una transcripción inversa usando plantillas derivadas de células distribuidas individualmente entre una pluralidad de recipientes. Para propósitos de transcripción inversa (TI) , de conformidad con la presente invención, los ácidos nucleicos dentro de una célula única que sirve como una fuente de plantilla para TI, son considerados por derivarse de una célula única aunque no hayan sido necesariamente separados de los contenidos restantes de tal célula única. Cuando la distribución final de las células únicas a sus recipientes únicos ha sido realizada, las células únicas pueden ser expandidas para obtener una población de células isogénicas, previo a la transcripción inversa. Este proceso proporciona más ARNm a ser usado como plantilla, el cual debe ser importante si un objetivo raro es amplificado y enlazado. Sin embargo, las células deben permanecer genéticamente idénticas con respecto al gen objetivo durante la expansión. Las células aisladas o la población de células isogénicas, puede ser mantenida intacta o usada, tan pronto como la plantilla para la transcripción inversa no se degrade. Preferencialmente, las células son usadas para facilitar la siguiente transcripción inversa y amplificación por RCP. En una modalidad diferente de la presente invención, el método de ti-RCP de traslape-extensión múltiple descrito, o RI-RCP múltiple, seguido por enlace por ligación o recombinación, puede también ser utilizado en una plantilla derivada de una población genéticamente diversa de células las cuales no han sido separadas en recipientes únicos, pero permanecerán juntas como una combinación de células. Este método puede ser usado para la generación de bibliotecas combinatoriaes. Tal procedimiento no requerirá la distribución de células únicas. Sin embargo, las células las cuales pueden ser usadas en este procedimiento son las mismas como aquellas descritas para el procedimiento de células únicas, por ejemplo, una población (combinación) de linfocitos B ó linfocitos T clasificados. Cuando se realiza TI -RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única o TI -RCP múltiple de etapa única, seguido por enlace por ligación o recombinación en tal población de células, es preferible lisar las células previo a la reacción y si el ARN o ARNm total deseado puede ser aislado del lisado. La sensibilidad de la TI -RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única de la presente invención, permite el uso de una cantidad muy baja de plantillas. Como se muestra en el Ejemplo 2 y 3, la TI -RCP de traslape -extensión múltiple de etapa única, se puede llevar a cabo en una cantidad de plantilla que corresponde al lisado de una célula única.

Mezclas y Diseño de Cebadores Las mezclas de cebadores de la presente invención comprenden al menos, cuatro cebadores que forman series de cebadores dos por dos, los cuales son capaces de amplificar al menos, dos diferentes secuencias objetivo de interés. Mezclas de dos o más de tales series de cebadores constituyen una mezcla de cebador múltiple . Preferiblemente una mezcla múltiple comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 series de cebadores (pares cebadores) . En particular para la amplificación de las secuencias que codifican la región variable, puede una seria de cebador individual dentro de la mezcla de cebador múltiple, constituir varios más de dos cebadores. Preferiblemente, una serie de cebador individual comprende al menos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280 ó 300 cebadores. Preferiblemente, el número total de cebadores en la mezcla de cebador múltiple es al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 ó 200 y a lo sumo 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 ó 400 cebadores. Todos los cebadores de la presente invención comprenden una región específica del gen, y preferiblemente todos los cebadores están adicionalmente equipados con un extremo de cebador al extremo 5' del cebador, es decir, secuencias no codificantes al 5', las cuales están fusionadas al extremo 3' de la parte del cebador específica del gen. Tal extremo de cebador es aproximadamente de 6 a 50 nucleósidos de longitud, pero puede también ser más larga si se desea. Después de la amplificación, los extremos cebadores son agregados a las secuencias objetivo. Los extremos de cebador de la presente invención son por ejemplo, extremos de clonación y extremos de enlace tales como, extremos adaptados para enlace por ligación, extremos adaptados para enlace por recombinación o extremos de traslape-extensión. Los extremos de clonación pueden ser desde 6 hasta 20 nucleótidos de longitud o más largos y comprender sitios de restricción y/o sitios de recombinación, los cuales son útiles para la inserción del producto ligado en un vector apropiado . Para permitir el enlace por ligación, las primeras series de mezclas de cebadores múltiples son diseñadas de manera tal que una parte (cebador (es) delantero o inverso) de la primera serie, está equipado con un extremo de enlace que contiene un sitio de restricción que después del desdoblamiento será compatible con un sitio de restricción localizado en el extremo de enlace de una parte de la segunda serie de cebador. Para el enlace de más de dos secuencias objetivo, la segunda parte de la segunda serie de cebador está equipada con un sitio de restricción que después del desdoblamiento será compatible con un sitio de restricción localizado en una parte de la tercera serie de cebador. Este segundo sitio de restricción localizado en la segunda serie de cebador no debe ser compatible con aquel de la primera serie de cebador. Un número considerable de secuencias objetivo se puede ligar diseñando series de cebadores de esta forma. Se deben elegir sitios de restricción con una baja frecuencia o ninguna incidencia, en las secuencias objetivo. Además, es preferible que los sitios de restricción compatibles no sean idénticos, de manera tal que el sitio de ligación llega a ser resistente al desdoblamiento por las enzimas de restricción particular usadas. Esto conducirá la reacción hacia el enlace de la secuencia objetivo con dos secuencias objetivo, puesto que el enlace entre las secuencias objetivo idénticas será desdoblable por las enzimas de restricción. Pares adecuados de sitios de restricción son por ejemplo, Sepl con Xbal (alternativamente Nhel o Avrll, pueden sustituir uno o ambos de estos), Ncol con BspHI, EcoRI con Mfel o PstI con Nsil . Para enlace, Spel puede por ejemplo, ser localizado en una secuencia objetivo, Xbal puede ser localizado en dos secuencias objetivo, Ncol puede ser localizado al otro extremo de dos secuencias objetivo y BspHI en tres secuencias objetivo y así sucesivamente. Para simplificar el proceso además, es una ventaja si las enzimas de restricción funcionan en el mismo amortiguador . Para permitir el enlace por recombinación, las series de cebador de la mezcla de cebador múltiple pueden por ejemplo, ser diseñadas como ejemplificadas en el artículo por Chapal (1997 BioTechniques 23, 518-524), el cual está con ello incorporado por referencia. Para permitir el enlace de las secuencias de nucleótidos de interés en la misma etapa como la amplificación por RCP múltiple, extremos adaptados para RCP de traslape-extensión son agregados en al menos, un cebador de cada primera serie de cebador de la mezcla de cebador múltiple, con ello, generando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple. Los extremos de traslape-extensión son típicamente más largos, variando desde 8 a 75 nucleósidos de longitud, y pueden contener sitios de restricción o sitios de recombinación, los cuales permiten la subsecuente inserción de elementos regulatorios tales como promotores, sitios de enlace ribosomal, secuencias de terminación, o secuencias enlazadoras tales como en una scFv. El extremo de traslape-extensión puede también contener un codón de detención si es que se desea. De manera genera, existen tres tipos de extremos de traslape-extensión, como se ilustra en la Figura 1. En el tipo I, los extremos de traslape-extensión de dos series de cebador solamente se traslapan entre sí . No necesariamente todos los nucleótidos de dos extremos de traslape-extensión son complementarios entre sí. En un aspecto de la presente invención, los nucleótidos complementarios representan entre 60 a 85% del extremo de traslape-extensión. En los extremos de traslape-extensión tipo II, 4 a 6 de los nucleótidos al 5', son complementarios a la región específica del gen de la secuencia objetivo adyacente. En los extremos de traslape-extensión tipo III, el traslape entero es complementario a la secuencia objetivo adyacente. Los extremos de traslape-extensión tipo I y II son preferidos cuando elementos regulatorios y similares, son después insertados entre las secuencias objetivo ligadas. Los extremos de traslape-extensión tipo II son preferidos, si las secuencias objetivo son ligadas por un enlazador definido como se observa con scFv. Los extremos de traslape-extensión tipo III son preferidos si las secuencias objetivos están siendo ligadas en estructura entre sí. El diseño de los extremos de traslape-extensión son dependientes de las características de la secuencia, tales como longitud, contenido de GC relativo (% de GC) , presencia de sitios de restricción, palíndromas, temperatura de fusión, la parte específica del gen a la cual están acoplados, etc.

La longitud de los extremos de traslape-extensión deben ser entre 8 y 75 nucleótidos de longitud, preferiblemente son desde 15 a 40 nucleótidos de largo. Aún más preferidos son desde 22 hasta 28 nucleótidos de longitud. El uso de extremos de traslape-extensión muy largos (50 a 75 nucleótidos) , podría favorecer el enlace de los productos producidos por cada serie de cebador. Sin embargo, la proporción entre la longitud del extremo de traslape-extensión y la región específica del gen, probablemente necesitará ser ajustada cuando se usan extremos de traslape-extensión muy largos. La preferencia de % GC es dependiente de la longitud del extremo de traslape-extensión. Puesto que los extremos más cortos tienen un área más corta en donde son complementarios, necesitan un %GC superior para templar la interacción que los extremos más largos. Otros principios de diseños de cebadores deben del mismo modo, ser observados, por ejemplo, la dimerización de cebador y formación de hairpina, deben ser minimizadas. No deben acoplarse en cebadores falsos. Además, se sabe que la polimerasa de ADN de Taq a menudo agrega una adenosina (A) al extremo 3' de la hebra de ADN recientemente sintetizada, y esta puede ser acomodada por un diseño de extremo de traslape-extensión permitiendo a los extremos de traslape-extensión, acomodarse a la adición A sin plantilla al 3' . La elección de cebadores que portan el extremo de enlace, por ejemplo, el extremo de traslape-extensión, extremo adaptado para enlace por ligación o extremo adaptado para enlace por recombinación, define el orden y dirección de enlace de las secuencias objetivo. No es esencial a la invención si el (los) cebador (es) delantero o cebador (es) inverso de una primera serie o posiblemente ambos cebadores delanteros e inversos, están equipados con el extremo de enlace. Sin embargo, se debe dar alguna consideración a esta de todas formas, puesto que el orden y dirección de las secuencias objetivo en el producto final, deben ser de relevancia por ejemplo, para la inserción de elementos regulatorios tales como promotores y secuencias de terminación o para el enlace en estructura de las secuencias obj etivo individuales . Para el enlace de dos secuencias de nucleótido de interés, el extremo de enlace puede ser agregado ya sea al (los) cebador (es) inverso o cebador (es) delanteros de cada primera serie usada para la amplificación por RCP de cada secuencia objetivo. La presente invención ejemplifica la adición de extremos de traslape-extensión y extremos adaptados para enlace por ligación, a los cebadores delanteros VH y VL de cada serie (por ejemplo, Figura 2 y ejemplo 9, respectivamente). Esto resulta en una dirección de enlace de los productos esto es, 5' a 5' (principio a principio y bi-direccional) . Sin embargo, los extremos de enlace podrán ser agregados al (los) cebador (es) inverso de cada serie (por ejemplo, C? y/o C? en la primera serie y CH ó JH en la segunda serie) . Esto resulta en una dirección de enlace del producto que es 3' a 3' (extremo a extremo y bidireccional) . Una tercera opción es agregar los extremos de enlace al (los) cebador (es) inverso de la primera serie (por ejemplo, cebadores Ck y/o C\) y el (los) cebador (es) delanteros de la segunda serie de cebadores (por ejemplo, cebador (es) VH o viceversa. Esto resulta en una orientación 3' a 5' (principio a extremo y uni-direccional) . La Figura 3 ilustra las direcciones posibles que pueden ser generadas dependiendo de cual cebador de cada primera serie está equipado con el extremo de enlace . Cuando se enlazan más de dos secuencias de nucleótidos de interés, algunas de las series de cebadores necesitan tener extremos enlazados en tanto los cebadores delantero como inverso, de manera tal que un extremo es complementario a un extremo de la serie de cebador precedente y el otro extremo es complementario a uno de los cebadores de la serie de cebador subsecuente . Este principio se mantiene para todas las series de cebadores que amplifican secuencias objetivo que son enlazadas entre dos de otras secuencias objetivo. El diseño de la parte de cebador específica del gen, debe generalmente, observar reglas de diseños de cebadores conocidos, tales como minimizar la dimerización de cebador, formación de hairpina y templado no específico. Además, nucleótidos múltiples G ó C, tales como las bases al 3 ' , son evitadas cuando es posible . La temperatura de fusión (Tm) de las regiones específicas del gen en una primera serie de cebador, preferiblemente deben ser igual a cada otra más/menos 5°C. En la presente invención, valores Tm entre 45°C y 75 °C son deseables, y valores Tm de aproximadamente 60 °C, son óptimos para la mayoría de las aplicaciones. Ventajosamente, el diseño de cebador inicial puede ser auxiliado por programas de computadora desarrollados por esta tarea. Sin embargo, diseños de cebadores generalmente necesitan pruebas de laboratorio y optimización de rutina. Esto se puede hacer, por ejemplo, por análisis de tamaño, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y secuenciamiento de los productos de amplificación obtenidos usando las series de cebador. El uso de opciones degeneradas dentro de cebadores, es un procedimiento útil cuando se amplifican secuencias con regiones variables o cuando se buscan para nuevos elementos de familias que pertenecen a una clase especificada de proteínas. Los números de posiciones degeneradas pueden también requerir optimización. La presente invención abarca series de cebadores mejorados que pueden ser usados en conjunto en un formato altamente multiplexado. La serie de cebador descrita por de Haard (de Haard, H. J. et al . , 1999. J. Biol. Chem. 274, 18218-18230) , fue usada como punto de partida, y se modificó recortando los extremos 3' de los cebadores, para reducir las interacciones no específicas y agregar extremos de traslape-extensión o extremos adaptados para enlace por ligación. Una característica de la presente invención son mezclas de cebadores compuestas de al menos, dos series de cebadores que son capaces de cebar la amplificación y promover el enlace de al menos dos secuencias de nucleótidos de interés. Las mezclas de cebadores de la presente invención, son capaces de cebar la amplificación de al menos, dos subunidades o dominios de proteínas heteroméricas, por ejemplo, que pertenecen a la clase de enzimas, inhibidores, proteínas estructurales, toxinas, proteínas de canales, proteínas G, proteínas del receptor, proteínas de la superfamilia de inmunoglobulina, proteínas de transportación, etc . Una característica de la presente invención es una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple, que comprende series de cebadores en donde al menos, un primer elemento cebador de cada serie de cebadores comprende un extremo de traslape-extensión capaz de hibridizar al extremo de traslape-extensión de un elemento de la serie de cebadores de una segunda serie de cebadores . Los extremos de traslape-extensión permiten el enlace inmediato de los nucleótidos de interés durante la amplificación por RCP de traslape-extensión múltiple, equipando cada producto individual que se origina de la serie de cebadores con un extremo que es complementario a un producto adjunto. Esto sin embargo, no significa que el enlace ocurra necesariamente durante esta primera amplificación por RCP. Dependiendo del establecimiento de la reacción, la mayoría del enlace actual puede ser realizado durante una amplificación adicional con los cebadores externos de la primera amplificación por RCP (amplificación por RCP múltiple) . Una característica adicional de la presente invención, es una serie de cebador diseñada para amplificar una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican una región variable. Ejemplos de tales familias son cadenas ligeras kappa (por ejemplo, VKI-VI en humanos) , cadenas ligeras lambda (por ejemplo, VL1-10 en humanos) y cadenas pesadas variables (por ejemplo, VH1-7 en humanos y VH1-15 en ratones) de inmunoglobulinas, y regiones variables TcR a, ß, ? ó d. Una serie de cebador para la amplificación de una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican una región variable, a menudo comprenden una pluralidad de cebadores, en donde varios cebadores pueden ser cebadores degenerados . La amplificación de familias de secuencias que codifican una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina es por ejemplo, realizada usando una serie de cebador comprendida de una pluralidad de cebadores complementarios al extremo 5' de la región variable de la cadena kappa (cebador (es) VL?) o la secuencia líder kappa (cebador (es) VLKL) y/o la cadena lambda (cebador (es) VL?) o la secuencia líder lambda (cebador (es) L ) (cebadores delanteros) , junto con la región constante kappa (cebador (es) C?) y/o cebadores lambda (cebador (es) C?) (cebadores inversos) o una pluralidad de tales cebadores. Alternativamente, cebadores de la región de unión de cadena ligera (cebador (es) JL? y/o Ju , pueden ser usados como cebadores inversos en lugar de los cebadores de la región constante. Alternativamente, cebadores delanteros templan la región UTR que precede la secuencia líder de la cadena ligera variable. Igualmente, familias de secuencias que codifican la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, pueden ser amplificadas con una serie de cebador utilizando varias combinaciones de cebadores. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores complementarios al extremo 5' de la región variable de cadena pesada (cebador (es VH) o la secuencia líder de esta región (cebador (es VHL (cebadores delanteros), junto con una pluralidad de cebadores de la región de unión de cadena pesada (cebador (es JH) o cebador (es) de una región constante de cadena pesada (cebadores inversos) . El cebador CH puede ser específico del isotipo y en principio, cualquier cebador CH puede ser utilizado (por ejemplo, CH?, CH2, CH3 ó CH) , también uno que podría resultar en una cadena pesada de longitud completa. Alternativamente, los cebadores delanteros templan la región UTR que precede la secuencia líder de la cadena pesada variable . El uso de cebadores delanteros que templan la secuencia líder en lugar del extremo al 5' de la región variable, es particularmente útil si se observa la hibridación cruzada para los cebadores de región variable . Puesto que las mutaciones debido a la hibridación cruzada, serán eliminadas de la proteína final debido a que las secuencias líderes son desdobladas durante el procesamiento de la proteína dentro de la célula. El ejemplo 9 describe el diseño de cebadores líderes de cadena ligera kappa y cadena pesada variable de anticuerpo. El aspecto de que el sitio de cebado está localizado en el extremo al 3' de la secuencia que codifica al líder (C-terminal), es una ventaja sobre los cebadores líderes de anticuerpos previos, puesto que esto permite lanzaderas de las secuencias amplificadas entre los vectores de expresión eucarióticos y bacterianos en una forma que permiten las secuencias líderes funcionales en ambos sistemas. El sistema de diseño descrito en el Ejemplo 9, puede ser fácilmente aplicado a cadenas ligeras lambda de anticuerpo, así como también a cadenas TcR OÍ, ß,? ó d .

Una característica de la presente invención son cebadores, los cuales se templan en el extremo 3' de la secuencia que codifica al líder, precediendo una secuencia que codifica la región variable, y su uso para amplificación de secuencias que codifican la región variable. Una característica preferida de la presente invención, es la aplicación de cebadores con al menos, 90% de identidad de secuencia (preferiblemente al menos, 95% de identidad) , con la región específica del gen de la SEC ID NO 86 a 92, la cual corresponde a cebadores que se templan en el C-terminal de las secuencias que codifican al líder de la cadena pesada (cebadores VHL) • La secuencia específica del gen de estas SEC ID NO, corresponde al número base 18 al extremo 30 de la secuencias (véase también tabla 11) . Otra característica preferida de la presente invención es la aplicación de cebadores con al menos, 90% de identidad de secuencia (preferiblemente al menos, 95% de identidad) con la región específica del gen de la SEC ID NO 93 a 98, la cual corresponde a los cebadores que se templan en el C-terminal de las secuencias que codifican al líder de la cadena ligera kappa (cebadores VLK) • La secuencia específica del gen de estas SEC ID NO, corresponde al número base 25 al extremo 3' de las secuencias (véase también tabla 11) . En una modalidad de la presente invención, la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple para la RCP de traslape-extensión múltiple y posiblemente para la etapa de transcripción inversa, también comprende a) al menos un cebador CL o JL complementario a la hebra sentido de una secuencia que codifica la región de cadena ligera de inmunoglobulina; b) al menos un cebador al 5' VL o cebador líder de VL complementario a la hebra antisentido de una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y capaz de formar una serie de cebador con el (los) cebador (es) en a); c) al menos un cebador CH o JH complementario a la hebra sentido de una secuencia ue codifica el dominio de cadena pesada constante de inmunoglobulina o la región de unión de cadena pesada y al menos un cebador al 5' de VH o cebador líder de VH complementario a la hebra antisentido de una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, y capaz de formar una serie de cebador con el (los) cebador (es) en c) . Las series de cebadores de la presente invención pueden ser por ejemplo, VL? + C?, L? + C?, VL? + JLK/ L + Ji?, VLK + C?, VL?L + C?, VL? + JL?, L + Jtí VH + JH, VH + CH, VHL + JH o VHL + CH o combinaciones de estas, capaces de amplificar una secuencia objetivo que codifica una región variable. En una modalidad adicional son el (los) cebador (es) C (JL) y cebador (es) VL (VLL) adaptados para amplificar secuencias que comprenden regiones variables de cadena ligera kappa o regiones variables de cadena ligera lambda.

En una modalidad preferida de la presente invención, están el (los) cebador (es) CL (JL) y cebador (es) VL (VLL) , adaptados para amplificar tanto secuencias que codifican una región variable de cadena ligera lambda como kappa. En aún una modalidad más preferida de la presente invención, son los cebadores V para amplificación de cadena ligera con al menos, 90% de identidad de secuencia (preferiblemente al menos, 95% de identidad) , con la región específica del gen de la SEC ID 93 a 98, y los cebadores delanteros para amplif icación de cadena pesada son cebadores VHL con al menos 90% de identidad (preferiblemente al menos 95%) con la región específica del gen de la SEC ID 86 a 92 . En una modalidad adicional de la presente invención, los extremos de enlace cebadores portan la inmunoglobulina VL/VLL y VH/VHL, preferiblemente en la forma de extremos de traslape-extensión complementarios . Esto genera secuencias que codifican la región variable, que están ligadas en una forma principio a principio . Para el enlace de secuencias que codifican la región variable en una forma principio a extremo, ya sea los cebadores CL/JL y VH/VHL contienen extremos de enlace o los cebadores VL/VLL y CH/JH contienen extremos de enlace, preferiblemente en la forma de extremos de traslape-extensión complementarios . Para el enlace de las secuencias que codifican la región variable en una forma extremo a extremo , los cebadores CL/JL y CH/JH / contienen extremos de enlace, preferiblemente en la forma de extremos de traslape-extensión complementarios (Figura 3 ) . Preferencialmente , las mezclas de cebador múltiple , que incluyen mezclas de cebador de traslape-extensión múltiple, comprenden dos series de cebador . De este modo, una mezcla comprende al menos , cuatro cebadores diferentes . En un aspecto adicional de la presente invención, una mezcla de cebador múltiple comprende más de cuatro diferentes cebadores . Una mezcla de cebador múltiple de la presente invención, es usada para la amplificación de secuencias obj etivo en un recipiente único . Por ej emplo, son regiones variables de cadena pesada kappa y lambda, todas amplificadas en el mismo recipiente. Una mezcla de cebador múltiple de la presente invención, esta comprendida de 16 diferentes cebadores degenerados distribuidos como sigue: ocho cebadores VH, un cebador n., seis cebadores Vi?, y un cebador C? (Figura 2) . Otra serie está comprendida de 19 cebadores degenerados, distribuidos como sigue : ocho cebadores VH, cuatro cebadores JH, seis cebadores i?, y un cebador C?. Una tercera serie está comprendida de 22 cebadores degenerados distribuidos como sigue : ocho cebadores VH, un cebador CH?, once cebadores VL?/ y dos cebadores C? . Una cuarta serie está comprendida de 27 cebadores degenerados distribuidos como sigue : ocho cebadores VH, un cebador CH?, seis cebadores VL?, un cebador C?, once cebadores L? y dos cebadores C?.

La presente invención también abarca cebadores para una amplificación por RCP adicional de productos ligados obtenidos por TI-RCP múltiple, seguidos por enlace por ligación o recombinación o por TI-RCP de traslape-extensión múltiple. Esta amplificación por RCP adicional, se puede realizar usando una mezcla de cebador adaptada para amplificar las secuencias objetivo ligadas. Tal mezcla de cebador puede comprender los cebadores externos de la mezcla de cebador múltiple o mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple, significando los cebadores que templan al extremo 5' y extremo 3' más externos de la hebra sentido de las secuencias de nucleótidos ligados, con ello, permitiendo la amplificación del producto ligado completo. Un ejemplo de cebadores que pueden ser utilizados como externos en la presente invención son los cebadores CK/JL y/o C?/J?, formando una serie de cebador con los cebadores JH ó CH. Este proceso sirve de manera general, para incrementar la cantidad de producto ligado obtenida a partir de la TI-RCP múltiple, seguida por enlace por ligación o recombinación o de la TI-RCP de traslape-extensión múltiple. Alternativamente, una serie de cebador la cual es anidada comparada con los cebadores externos usados en al TI-RCP múltiple primaria o reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple, pueden ser usados para la amplificación adicional de las secuencias de nucleótido ligadas. En la presente invención, tal serie de cebador es llamada una serie de cebador anidado . El diseño de cebadores anidados , generalmente observa las mismas reglas de diseño como para los cebadores específicos del gen previamente descritos , excepto que ceban el 3 ' en la posición templada de los cebadores externos usados en la TI -RCP múltiple o TI -RCP de traslape-extensión múltiple . El producto resultante de una RCP anidada es por lo tanto, más corto que el producto ligado obtenido por TI -RCP múltiple, seguido por enlace por ligación o recombinación o por TI -RCP de traslape-extensión múltiple. Además, para incrementar la cantidad de producto ligado, la RCP anidada sirve además, para incrementar la especificidad total, especialmente de la tecnología de TI-RCP de traslape-extensión múltiple. Sin embargo, se debe notar que no todas las mezclas de cebador de traslape-extensión múltiple/mezclas de cebador múltiple que han sido descritas anteriormente, son adecuadas para combinación con una serie de cebador anidado, cuando se realiza la amplif icación adicional . En tales casos , los cebadores externos de la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple/mezcla de cebador múltiple , pueden ser usados para la amplificación adicional o una RCP semi-anidada, puede ser aplicada como se describe después . En una modalidad de la presente invención, una mezcla de cebadores JL y JH es usada como cebadores anidados para la amplificación adicional de las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina ligada .

Series de cebadores anidados de la presente invención, pueden también estar comprendidas de un cebador (es) externo (s) inverso (o delantero), de la primera mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple/mezcla de cebador múltiple y un segundo cebador anidado que ceba al 3 ' en la posición templada del cebador (es) externo (s) delantero (o inverso) , de la primera mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple/mezcla de cebador múltiple. El uso de tal serie de cebador para una amplificación por RCP adicional, es generalmente conocido como una RCP semi-anidada. La RCP semi-anidada puede por ejemplo, ser amplificada si es difícil diseñar un cebador anidado en una región específica, por ejemplo, para las secuencias de región variable (cebadores V y J) , debido a que tal cebador podría haberse templado en las regiones que determinan la complementariedad (CDR) . Además, puede ser usada la RCP semi-anidada, cuando es deseable mantener un extremo de las secuencias ligadas intactas, por ejemplo, para propósitos de clonación. Una característica de la presente invención mantiene la secuencia que codifica la cadena ligera constante intacta durante la reacción de amplificación adicional. El (los) cebador (es) CL (inverso) usados para la amplificación adicional, son solamente ligeramente modificados comparados con el (los) cebador (es) externos usados para la reacción primaria (la reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple o TI-RCP múltiple) . La modificación comprende la adición de unas cuantas bases al extremo 3' del cebador (es) CL usados para la amplificación primaria. Además, se puede agregar un extremo de clonación diferente al (los) cebador (es) CL anidados. El (los) cebador (es) delanteros usados en la amplificación adicional, son completamente anidados comparados con el (los) cebador (es) externos específicos de la cadena pesada constante usados en la reacción primaria. El uso combinado del (los) cebador (es) externos en la reacción primaria y el (los) cebador (es) CL anidados ligeramente modificados, junto con el (los) cebador (es) delanteros completamente anidados en la amplificación adicional, resultan en un incremento en la especificidad que es comparable con aquella que se logra con una RCP anidada usando una serie de cebador completamente anidado. En una modalidad preferida de la presente invención, se realiza RCP anidado con cebador (es) JH y cebador (es) CL modificados, en donde entre 2 y 10 pares base específicos del gen han sido agregados al extremo 3 ' comparados al primer cebador (es) CL de la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple/mezcla de cebador múltiple. Optimización de RCP de Traslape-Extensión Múltiple Los parámetros de la etapa de RCP de traslape-extensión múltiple de tanto el procedimiento de una etapa como de dos etapas, pueden ser optimizados en varios parámetros (véase por ejemplo, Henegariu, 0. et al. , 1997.

BioTechniques 23, 504-511; Markoulatos, P. et al. 2002. J. Clin. Lab.

Anal . 16, 47-51) . De manera general, los mismos parámetros de optimización aplican para TI -RCP múltiple, aunque la relación entre los cebadores externos e internos es menos importante para tal reacción. a . Concentración de Cebador La concentración de los cebadores que portan el extremo de traslape-extensión (por ej emplo, los cebadores VH y VL) , es preferiblemente inferior que la concentración de los cebadores externos sin extremo de traslape-extensión (por ej emplo , cebadores JH y kappa) . Si una de las secuencias obj etivo se amplifica con una eficiencia inferior que las otras , por ejerrplo, como un resultado de un %GC superior, puede ser posible igualar la eficacia de arrplif icación. Esto se puede hacer usando una concentración superior de la serie de cebador, la cual media la amplificación con baja eficiencia, o disminuyendo la concentración de otra serie de cebadores .

Por ejerrplo, secuencias que codifican para regiones variables de cadena pesada, tienden a tener un %GC superior y por lo tanto, disminuyen la eficiencia de arrplif icación que las regiones variables de cadena ligera . Esto indica hacia el uso de cebadores VL a una concentración inferior que los cebadores VH . Además , cuando se usa un gran número de cebadores , la concentración de cebador total podría ser una emisión . El límite superior se determina experimentalmente por experimentos de titulación. Para el sistema de RCP "AmpliTaq Gold" de Applied Biosystems, el límite superior se encontró por ser 1.1 µM de la concentración de oligonucleótido total, para otros sistemas, puede sin embargo, ser tan alto como 2.4 µM. Tal límite superior de concentración de oligonucleótido total, influencia la concentración máxima de cebadores individuales. Si la concentración de cebador individual es también baja, es probable que cause una escasa sensibilidad a la RCP. La calidad de los cebadores de oligonucleótidos también se ha encontrado ser importante para la RCP de traslape-extensión múltiple. Los oligonucleótidos purificados por CLAR, han producido los mejores resultados. b. Condiciones de ciclización por RCP: Preferencialmente, las condiciones de ciclización son como sigue : Desnaturalización : 10-30 s 94° Templado: 30-60 s 50-70°C aproximadamente 5°C por debajo de la Tm de los cebadores . Extensión; 1 min x EPL 65-72 °C EPL es Longitud de Producto esperado en kb.

Número de ciclo; 30-80 Extensión final ; 10 minutos 65-72°C.

Para la TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única, se construyeron las siguientes etapas en el programa de ciclización previo a la amplificación por ciclización resumida anteriormente: Transcripción inversa: 30 min 42-60°C Estas condiciones también son usadas en donde se realiza la transcripción inversa separada.

Activación de polimerasa: 10-15 min 95°C las polimerasas de inicio caliente son favorables en TI- RCP de etapa única. Activación de conformidad con el fabricante. Es posible optimizar en todos estos parámetros.

Especialmente, la temperatura de templado es importante. De este modo, todas las series de cebadores individuales que constituyen la mezcla de cebador final, deben ser probadas separadamente para identificar la temperatura y tiempo de templado óptimo, así como también tiempo de desnaturalización y elongación. Esto daría una buena idea acerca de la ventana dentro de la cual estos parámetros pueden ser optimizados para la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple. Los problemas con escasa sensibilidad a la RCP, por ejemplo, debido a la baja concentración de cebador o concentración de plantilla, pueden ser superadas usando un número alto de ciclos térmicos . Un número alto de círculos térmicos constituye entre 35 y 80 ciclos, preferiblemente alrededor de 40 ciclos. Además, tiempos de extensión prolongados, pueden mejorar el proceso de RCP de traslape-extensión múltiple. Los tiempos de extensión largos constituyen 1.5-4 min x ELP, comparado con la extensión normal de 1 minuto. c . Uso de adyuvantes Las reacciones por RCP múltiples, pueden ser ligeramente mejoradas usando un aditivo de RCP, tal como DMSO, glicerol formamida o betaína, el cual relaja el ADN, de este modo, haciendo la desnaturalización de la plantilla más fácil . d. dNTP y MgCl2 La calidad y concentración de desoxinucleósido trifosfato (dNTP) es importante para la RCP de traslape-extensión múltiple. La mejor concentración de dNTP está entre 200 y 400 µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , arriba del cual la amplificación es rápidamente inhibida.

Concentraciones de dNTP inferiores (100 µM de cada dNTP) son suficientes para lograr la amplificación de RCP. dNTP base son sensibles a ciclos de descongelamiento/congelamiento. Después de tres a cinco de tales ciclos, la RCP múltiple a menudo no funciona bien. Para evitar tales problemas, se pueden hacer pequeñas alícuotas de dNTP y mantener congeladas a -20°C. La optimización de la concentración de Mg2+ es crítica, puesto que la mayoría de las polimerasas de ADN son enzimas dependientes del magnesio. Además de la polimerasa de ADN, los cebadores de ADN de plantilla y dNTP, se enlazan al Mg2+. Por lo tanto, la concentración óptima de Mg2+, dependerá de la concentración de dNTP, ADN de plantilla, y composición de amortiguador de muestra. Si los cebadores y/o amortiguadores de ADN de plantilla contienen queladores tales como EDTA o EGTA, puede ser alterado el Mg2+ óptimo aparente. La concentración de Mg2+ excesiva, estabiliza el ADN de doble hebra y previene la completa desnaturalización del ADN, el cual reduce el rendimiento. El excesivo Mg2+, puede también estabilizar el templado espurio de cebadores a sitios de plantilla incorrectos, con ello, disminuyendo la especificidad. Por otro lado, una concentración de Mg2+ inadecuada, reduce la cantidad de producto. Un buen balance entre dNTP y MgCl2, es aproximadamente 200 hasta 400 µM dNTP (de cada uno) a 1.5 hasta 3 mM de MgCl2. e. Concentración de Amortiguador de RCP De manera general, amortiguadores a base de KCl, son suficientes para la RCP de traslape-extensión múltiple; sin embargo, amortiguadores basados en otros componentes tales como (NH4) S04, MgS04, Tris-HCl, o combinaciones de los mismos, pueden también ser optimizados para funcionar con la RCP de traslape-extensión múltiple. Los pares cebadores involucrados en la amplificación de productos más largos, funcionan bien a concentraciones de sal inferior (por ejemplo, 20 a 50 mM de KCl) , mientras pares cebadores involucrados en la amplificación de productos cortos, funcionan bien a concentraciones de sal superiores (por ejemplo, 80 a 100 mM de KCl) . Elevar la concentración de amortiguador a 2X en lugar de IX, puede mejorar la eficiencia de la reacción múltiple. d. Polimerasa de ADN La presente invención es ejemplificada con polimerasa Taq. Alternativamente, otros tipos de polimerasas de ADN resistente al calor que incluyen, por ejemplo, Pfu, Phusion, Pwo, Tgo, Tth, Vent, Deep-vent, pueden ser usadas. Las polimerasas son o con actividad de exonucleasa al 3 ' ó 50, pueden ser usadas ya sea solas o en combinación entre sí. Vectores y Bibliotecas El enlace de las secuencias de nucleótido de interés de conformidad con la presente invención, produce un segmento de nucleótido que comprende las secuencias de nucleótido enlazadas de interés. Además, bibliotecas de tales secuencias de ácido nucleico ligadas de interés, son producidas por los métodos de la presente invención, en particular, bibliotecas de secuencias que codifican una región variable. Una característica de la presente invención, es la inserción de un segmento que contiene secuencias de nucleótidos ligadas de interés, o una biblioteca de secuencias de nucleótido ligadas de interés, generadas por un método de la presente invención, en vectores adecuados. Las bibliotecas pueden ser bibliotecas combinatoriaes o bibliotecas de pares cognados de secuencias que codifican una región variable. Los sitios de restricción generados por los cebadores externos, cebadores anidados o cebadores se i-anidados, son preferiblemente diseñados para igualar sitios de restricción apropiados del vector de elección. Las secuencias de ácido nucleico ligadas de interés, pueden también ser insertadas en vectores por recombinación, si uno de los cebadores anidados, semi-anidados o cebadores externos, estuvieran equipados con un sitio de recombinación adecuado y el vector de elección contiene uno también. Básicamente, no existen limitaciones a los vectores que pueden ser usados como portadores de los productos generados por uno de los métodos de enlace TI-RCP múltiple de la presente invención. Vectores de elección pueden ser adecuados para amplificación y expresión en células que incluyen, por ejemplo, células de bacterias, levaduras, otros hongos, células de insecto, células de plantas o células de mamíferos. Tales vectores pueden ser usados para facilitar etapas de clonación adicionales, de lanzadera entre sistemas de vectores, exhibición del producto insertado en el vector, expresión del producto insertado y/o integrado en el genoma de una célula hospedera. Los vectores de clonación y de lanzadera, son preferiblemente vectores bacterianos. Sin embargo, los otros tipos de vectores pueden también ser aplicados en procedimientos de clonación y lanzadera. Los vectores de exhibición pueden por ejemplo, ser vectores fagos o vectores fagémidos que se originan de la clase de bacteriófagos filamentosos fd, M13, o f1. Tales vectores son capaces de facilitar la exhibición de una proteína que incluye, por ejemplo, una proteína de enlace o un fragmento del mismo, en la superficie de un bacteriófago filamentoso. Los vectores de exhibición adecuados para exhibición en ribosomas, ADN, células de levadura o células de mamífero, también se conocen en la técnica. Estos comprenden por ejemplo, vectores virales o vectores que codifican para proteínas quiméricas . Los vectores de expresión existen para todas las especies mencionadas y una a ser elegida completamente, depende de la proteína a ser expresada. Algunos vectores de expresión son adicionalmente capaces de integrarse en el genoma de una célula hospedera, ya sea por integración aleatoria, o por integración específica del sitio, utilizando sitios de recombinación apropiada. Los vectores de expresión pueden ser diseñados para proporcionar secuencias codificantes adicionales, que cuando el producto ligado es insertado en la estructura a estas secuencias, permite la expresión de una proteína más grande, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de longitud completa, cuando se introducen en una célula hospedera apropiada. Esta inserción en estructura, puede también, facilitar la expresión de proteínas quiméricas que facilitan la exhibición en la superficie de un bacteriófago filamentoso o célula. En un sistema de exhibición de bacteriófago, las secuencias de nucleótido ligadas de interés, pueden ser insertadas en estructura a una secuencia que codifica una proteína revestida tal como pIII ó pVIII (Barbas, C. F. et al . , 1991. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982; Kang, A. S. et al. 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 4363-4366). En una modalidad de la presente invención, los segmentos individuales de secuencias de nucleótido ligadas de interés, están comprendidos de una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera. Preferiblemente, estas secuencias ligadas son insertadas en un vector que contiene secuencias que codifican uno o más dominios constantes de inmunoglobulina. La inserción es diseñada por ingeniería, de manera tal que las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y/o región variable de cadena pesada ligadas, son insertadas en estructura a las secuencias que codifican la región constante. Tal inserción puede por ejemplo, generar un vector de expresión Fab, un vector de expresión de anticuerpo de longitud completa, o un vector de expresión que codifica un fragmento de un anticuerpo de longitud completa. Preferencialmente, tal vector es un vector de expresión adecuado para selección (por ejemplo, vectores E. coli , fagémido o mamíferos) , y las secuencias que codifican la cadena pesada de la región constante, son elegidas de las clases de inmunoglobulina humana IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, ó IgE, con ello, permitiendo la expresión de un anticuerpo recombinante de longitud completa. Además de las secuencias que codifican la cadena pesada constante, el vector puede también contener una secuencia que codifica una cadena ligera constante elegida de cadenas lambda o kappa humanas . Esto es apropiado cuando las secuencias de nucleótidos ligadas, solamente codifican las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina (Fvs) .

En otra modalidad de la presente invención, los segmentos individuales de las secuencias de nucleótidos ligadas, están comprendidas de una secuencia que codifica la región variable de cadena TcR a, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena ß o una secuencia que codifica una región variable de cadena ?, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena d. Preferiblemente, estas secuencias ligadas son insertadas en un vector que contiene secuencias que codifican uno o más dominios constantes TcR. La inserción es diseñada por ingeniería de manera tal que las secuencias que codifican la región variable ligada insertada, están en estructura a las secuencias que codifican la región constante TcR correspondiente. En una modalidad adicional, tal vector es un vector de expresión quimérica que comprende secuencias que codifican un cierre de leucina en estructura a las regiones constantes Tcr. Se ha mostrado que tales constructos incrementan la estabilidad de TcR solubles (Willcox, B. E. et al. 1999. Protein Sci 8, 2418-2433) . Bibliotecas de pares cognados de la presente invención, pueden ser introducidas en vectores por dos diferentes procedimientos. En el primer procedimiento, los pares cognados únicos son insertados individualmente en un vector adecuado. Esta biblioteca de vectores puede entonces, ya sea ser mantenida separada o ser combinada. En el segundo procedimiento, todos los pares cognados son combinados previo a la inserción del vector, seguido por inserción en masa en vectores adecuados que generan una biblioteca combinada de vectores (ilustrada en la Figura 12) . Tal biblioteca de vectores comprende una gran diversidad de pares de secuencias que codifican la región variable. Un aspecto de la presente invención es una biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican una región variable ligada. Preferiblemente, los pares cognados individuales de la biblioteca, comprenden una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada. Otra biblioteca preferida de pares cognados comprende secuencias que codifican una región TcR ligada, en donde cada una de las secuencias que codifican una región TcR individual, comprende una secuencia que codifica una región variable, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena beta y/o una secuencia que codifica una región variable de cadena gamma TcR, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena delta. Otra modalidad de la presente invención es una sub-biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican una región variable ligada, las cuales codifican para especificidades de enlace deseado dirigidas contra un objetivo particular. Preferiblemente, estos pares cognados comprenden secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulina ligada, secuencias que codifican una región variable de cadena beta y una región variable de cadena alfa TcR y/o secuencias que codifican una región variable de cadena delta y región variable de cadena gamma TcR. Una modalidad adicional es una sub-biblioteca seleccionada de una biblioteca original de pares cognados de secuencias que codifican una región variable, como se describe a través de la invención. Una modalidad preferida de la presente invención es una biblioteca o sub-biblioteca que codifica para pares cognados de inmunoglobulinas de longitud completa, seleccionadas de las clases de inmunoglobulina humana IgA, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 ó IgM. Otra característica de la presente invención es una biblioteca o sub-biblioteca que codifica para pares cognados estables y solubles de TcR. Una característica de la presente invención es la diversidad de dichas bibliotecas, las cuales están comprendidas de al menos, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ó 106 pares cognados diferentes. En una modalidad adicional de la presente invención, dichas bibliotecas de pares cognados de secuencias que codifican una región variable ligada, son obtenibles por un método que comprende las etapas descritas en este documento. Esta biblioteca es también llamada la biblioteca original . Clasificación y Selección La biblioteca original de pares de secuencias que codifican una región variable ligada aisladas de un donador, que utiliza uno de los métodos de la presente invención, se espera represente una diversidad de proteínas de enlace, las cuales algunas serán irrelevantes, es decir, no se enlazarán a un objetivo deseado, en particular para bibliotecas combinatoriaes. Por lo tanto, la presente invención abarca enriquecimiento y selección, par una sub-biblioteca que codifica una subserie de diversidades de especificidades de enlace contra un objetivo particular. Para bibliotecas de pares cognados, la diversidad de la biblioteca se espera, represente la diversidad presente en el material donador, con solamente un número menor de regiones variables aleatoriamente ligadas. De este modo, una etapa de enriquecimiento puede no ser necesaria previo a la selección para afinidades de enlace específicas del objetivo en una biblioteca compuesta de pares cognados . En una modalidad adicional de la presente invención, el método para generar una biblioteca de pares de secuencias que codifican una región variable ligada, además comprende crear una sub-biblioteca seleccionando una subserie de pares de secuencias de región variable ligada, que codifican proteínas de enlace con una especificidad objetivo deseado. Tal selección de secuencias que codifican una región variable ligada, también es llamada una biblioteca de pares cognados específicos del objetivo. En una modalidad preferida de la presente invención, es la biblioteca de pares cognados específicos del objetivo de secuencias que codifican una región variable, transferida a un vector de expresión de mamífero. Los ensayos inmunológicos son adecuados de manera general, para la selección de secuencias que codifican una región variable de inmunoglobulina específica del objetivo. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica y constituyen por ejemplo, ELISPOTS, ELISA, ensayos de membrana (por ejemplo, manchados Western), arreglos en filtros, o FACS. Los ensayos pueden ser ya sea realizados en una manera directa, utilizando los polipéptidos producidos a partir de las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina. Alternativamente, se pueden realizar inmunoensayos en combinación con o siguiendo los métodos de enriquecimiento tales como exhibición de fago, exhibición de ribosoma, exhibición de superficie bacteriana, exhibición de levadura, exhibición de virus eucariótico, exhibición de ARN o exhibición covalente (revisado en FitzGerald, K. , 2000.

Drug Discov. Today 5, 253-258) . Como se ilustra en la Figura 10, ambas bibliotecas de expresión Fab cognadas y bibliotecas de expresión de anticuerpos de longitud completa cognados, pueden ser sometidas a selección, con ello, generando una sub-biblioteca de clones positivos. Tales ensayos de selección y procedimientos de enriquecimiento son también adecuados para fragmentos Fv o scFv o bibliotecas combinatoriaes de regiones variables ligadas. En una modalidad preferida de la presente invención, la selección de una sub-biblioteca de pares cognados específicos del objetivo o pares combinatoriaes de secuencias que codifican una región variable, se realiza usando un ensayo de selección de alto rendimiento. Los ensayos de selección de alto rendimiento podrán ser, pero no están restringidos a ensayos ELISA realizados con equipo semi-automatizado o completamente automatizado. Podrá también ser un ensayo de membrana en el cual, las bacterias son robóticamente perforadas y molidas en una membrana apropiada en la superficie de placas de agar que generan arreglos de colonias que expresan moléculas de enlace al antígeno. Las moléculas son secretadas a través de la membrana sobre una segunda membrana revestida de antígeno fundamental, las cuales pueden ser desarrolladas separadamente y usadas para identificar clones que secretan moléculas de enlace al antígeno hacia el objetivo deseado (de Wildt, R. M. , et al, 2000. Nat. Biotechnol. 18, 989-994).

Cuando una sub-biblioteca de pares cognados o pares combinatoriaes de clones que se enlazan al antígeno ha sido seleccionada por una tecnología apropiada, es posible realizar un análisis adicional por secuenciamiento de ADN de las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera de inmunoglobulina ligada. Primero que todo, tal secuenciamiento de ADN proporcionará información acerca de la diversidad de bibliotecas, tales como origen de línea germinal, distribución de la familia y maduración dentro de las regiones de CDR. Tal análisis permitirá la selección de clones, los cuales representan una amplia diversidad, y conducen a clones repetidos. Segundo, el secuenciamiento de ADN revelará mutaciones introducidas durante el proceso de aislamiento. Cuando se analizan secuencias que codifican una región variable, existen tres tipos de mutaciones a considerar cuando se valora si una mutación es aceptable: i) El tipo más frecuente de mutaciones resulta de cebado cruzado intra-familia, en donde los cebadores del gen V ceban a la subserie equivocada dentro de una familia de gen V particular. Los cambios introducidos son principalmente sustituciones de codones que se originan naturalmente en una posición particular. Debido al alto grado de homología de secuencia dentro de una familia del gen V, estos cambios usualmente pueden ser considerados como cambios conservativos y aceptables; ii) Se introducen menos mutaciones frecuentes por cebado cruzado inter-familia (por ejemplo, un cebador de familia VH3 ceba una secuencia que codifica la familia VH1) e induce cambios estructurales más significantes, algunas veces sin contraparte natural. Tales cambios podría potencialmente afectar la inmunogenicidad de la región variable creando nuevos epítopes . Tales cambios pueden ser fácilmente identificados y subsecuentemente reparados usando técnicas biológicas moleculares estándares, o los clones pueden ser excluidos de la biblioteca; iii) Errores creados por la polimerasa de AMD Taq son más fácilmente identificados en las secuencias que codifican la región constante y pueden ser fácilmente eliminados. Sin embargo, mutaciones inducidas por Taq, por supuesto, también estarán 'presentes en las secuencias que codifican la región variable, en donde son indistinguibles de las mutaciones somáticas que se originan I naturalmente, las cuales son también el resultado de mutaciones aleatorias en las secuencias que codifican la región variable. Considerando que las mutaciones son no sistemáticas y solamente afectan pares particulares en formas distintas, parece razonable estar en desacuerdo con tales cambios . Además, el análisis de secuencia puede ser usado para identificar el grado de aleatorización en una biblioteca de par cognado, como se ilustra en la tabla 20 para el grupo H4 de VH. Como se describe en el Ejemplo 9, la presencia de las mutaciones descria en i) y ii) , puede ser evitada en la biblioteca de expresión, cuando se utilizan cebadores que templan en la secuencia líder de las secuencias que codifican una región variable en lugar de los cebadores que templan en la región 5' de las regiones variables. En una modalidad adicional de la presente invención, la sub-biblioteca específica del objetivo y posiblemente de la secuencia, que analiza pares de secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera, son transferidas a un vector de expresión de mamífero. Tal transferencia puede ser realizada en cualquiera de los vectores descritos en la sección previa, permitiendo la expresión de un anticuerpo recombinante de longitud completa. Si la selección se realiza con una biblioteca de expresión de anticuerpo de longitud completa cognado de mamífero, tal transferencia no puede ser necesaria. En otra modalidad de la presente invención, la biblioteca original es generada a partir de una fracción de células que contienen linfocitos, la cual está enriquecida por linfocitos T. Los pares de secuencias que codifican una región variable ligada, constituyen la biblioteca original, pueden ser seleccionados por codificar una subserie de pares de secuencias de región variable ligada, compuestas de cadenas alfa y beta y/o delta y gamma, que codifican proteínas de enlace con una especificidad de objetivo deseado, generando una sub-biblioteca de pares cognados o pares combinatoriaes . Receptores de células T específicos del antígeno, pueden subsecuentemente, ser identificados de una combinación de células transfectadas usando metodología estándar tal como teñido con complejos peptídicos MHC tetraméricos (por ejemplo, Callan, M. F. et al , 1998. J. Exp. Med. 187, 1395-1402; Novak, E. J. et al . , 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67) , midiendo las respuestas celulares en la forma de IL-2 liberado o por medios más sofisticados tales como técnicas de exhibición retroviral o de levadura. Células Hospederas y Expresión Las bibliotecas de la presente invención pueden ser transferidas a vectores adecuados para expresión y producción de proteínas codificadas a partir de las secuencias de ácido nucleico ligadas de interés, en particular, proteínas de enlace que contienen regiones variables o fragmentos de las mismas. Tales vectores son descritos en la sección Vectores y Bibliotecas, y proporcionados para la expresión de por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv, scFv, fragmentos unidos a la membrana o TcRs o TcR solubles, de una especie de elección.

Una característica de la presente invención es la introducción en una célula hospedera, de una biblioteca o una sub-biblioteca de vectores de pares cognados de secuencias que codifican una región variable ligada, o un clon único que codifica un par cognado de secuencias que codifican una región variable ligada, para amplificación y/o expresión. Las células hospederas pueden ser elegidas de células de bacterias, levaduras, otros hongos, células de insecto, células de planta o células de mamífero. Para propósitos de expresión, células de mamífero, tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) , células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NSO), NIH 3T3, células de humano inmortalizadas o fibroblastos, tales como células HeLa, células HEK 293, o PER.C6, son preferidas. La introducción de vectores en células hospederas puede ser realizada por un número de métodos de transformación o transfección conocidos por aquellos expertos en la técnica, que incluyen precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, fusión de espectros RBC, fusión de protoplastos, infección viral y similares. La producción de anticuerpos de longitud completa monoclonales, fragmentos Fab, fragmentos Fv y fragmentos scFv, es bien conocida. La producción de anticuerpos policlonales recombinantes a ser usados para el tratamiento, es un área casi nueva. Se ha descrito una tecnología de manufacturación policlonal recombinante en la solicitud de PCT WO 2004/061104. En corto, esta tecnología involucra la generación de una colección de células, adecuadas como una manufacturación de línea celular. La siguiente descripción de la técnica se hace para una biblioteca de pares cognados, sin embargo, solamente como aplicable para una biblioteca combinatoria. Las células individuales en la colección de células, son capaces de expresar un elemento distinto de la proteína de enlace policlonal recombinante por ejemplo, de una biblioteca de pares cognados. Para asegurar que las células individuales expresan un par cognado único no varios pares cognados de proteína de enlace policlonal, las secuencias de ácido nucleico que codifican los pares cognados, son introducidas en un sitio específico del sitio único en el genoma de cada célula individual . Esta es una característica importante de la colección de células, puesto que previene de aleatorización de las cadenas ligera y pesada expresadas entre sí, pero también debido a que genera células que son virtualmente idénticas entre sí, excepto por las pequeñas diferencias en las regiones variables de los pares cognados individuales. Este ensayo permitirá un crecimiento no desviado de la colección de células sobre el periodo de tiempo necesario para la producción. Para asegurar integración específica del sitio único, una línea de células hospederas sin solamente un sitio de integración debe ser usada, estas son comercialmente disponibles, por ejemplo, células Flp-In CHO de Invitrogen, que contienen un sitio FRT único. Vectores apropiados para esta línea celular contienen un sitio FRT correspondiente y son introducidos en el genoma usando la recombinasa Flp. Existen varias otras recombinasas conocidas, por ejemplo, Cre, beta-recombinasa, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS , integrasa lambda, o integrasa FC31 del fago, que pueden ser usadas en combinación con sus sitios de recombinación correspondientes. Además, vectores apropiados contienen un marcador de selección que permite la selección de integrantes específicos del sitio. La generación de una línea de células de manufacturación policlonal y la producción de una proteína policlonal recombinante a partir de tal línea celular, se puede obtener por varias estrategias de manufacturación y transfección diferentes. Una forma es usar una biblioteca de vectores mezclados juntos en una composición única, para la transfección de una línea de células hospederas con un sitio de integración único por célula. Este método es llamado transfección por volumen o transfección en volumen. De manera general, el diseño de vector y célula hospedera descrito previamente, asegurará que una línea de células policlonales capaz de crecimiento no desviado, se obtendrá después de la sección apropiada. Una base congelada de la línea de células policlonales, será generada antes de la iniciación de la manufacturación de proteína policlonal recombinante. Otra forma es el uso de una biblioteca de vectores divididos en fracciones, que contienen aproximadamente 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca en una composición para transfección. Preferiblemente, una fracción de la biblioteca constituye de 10 a 20 vectores individuales. Cada composición es entonces transferida en una alícuota de células hospederas. Este método es llamado transfección por semi-volumen. El número de alícuotas transfectadas dependerá del tamaño de la biblioteca y el número de vectores individuales en cada fracción. Si la biblioteca por ejemplo, constituye 100 pares cognados distintos, los cuales son divididos en fracciones que contienen 20 elementos distintos en una composición, 5 alícuotas de células hospederas podrán necesitar ser transfectadas con una composición de biblioteca que constituye una fracción distinta de la biblioteca original . Las alícuotas de las células hospederas son seleccionadas para integración específica del sitio. Preferiblemente, las alícuotas distintas son seleccionadas separadamente. Sin embargo, pueden también ser combinadas antes de la selección. Las alícuotas pueden ser analizadas por su diversidad clonal y solamente aquellas con suficiente diversidad serán usadas para generar una base de biblioteca de par cognado policlonal . Para obtener la línea de células policlonales deseadas para manufacturación, las alícuotas pueden ser mezcladas antes de generar la base de congelamiento, inmediatamente después que han sido recuperadas de la base o después de un tiempo de proliferación y adaptación corto. Opcionalmente, las alícuotas de células se mantienen separadas a través de la producción, y la composición de proteína policlonal, es parecido combinando los productos de cada alícuota, preferentemente que las alícuotas de la célula antes de la producción. Una tercera forma, es un método de alto rendimiento en el cual, las células hospederas son transfectadas separadamente usando los vectores individuales que constituyen la biblioteca de pares cognados. Este método es llamado transfección individual . Las células hospederas individualmente transfectadas, son preferiblemente seleccionadas por integración específica del sitio separadamente . Los clones de células individuales generados después de la selección, pueden ser analizados con respecto al tiempo de proliferación y preferiblemente, aquellos con velocidades de crecimiento similar, son usados para generar una base de biblioteca de par cognado policlonal . Los clones de células individuales, pueden ser mezclados para obtener la línea de células policlonales deseadas, antes de generar la base, inmediatamente después que han sido recuperadas de la base, o después de un tiempo de proliferación y adaptación corto. Este procedimiento puede eliminar cualquier desvío de secuencia residual posible durante la transfección, integración y selección. Alternativamente, las células hospederas individualmente transfectadas, son mezcladas antes que se realice la selección, esto permitirá control de desvío de secuencia debido a la transfección. Una característica portada en las estrategias de manufacturación resumidas anteriormente, es que todos los pares cognados individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante, pueden ser producidos en uno o un número limitado de bio-reactores . La única diferencia es la etapa en la cual se eligen para generar una colección de células que constituyen la línea de células de manufacturación policlonal . Una modalidad de la presente invención, es una población de células hospederas que comprende una biblioteca cognada o sub-biblioteca de pares ligados de secuencias que codifican una región variable. En una modalidad adicional, una población de células hospederas comprende una biblioteca obtenida de una población de células únicas aisladas que constituye linfocitos, utilizando la amplificación por TI-RCP múltiple, seguida por enlace por ligación o recombinación o la tecnología de TI-RCP de traslape-extensión múltiple de la presente invención, para enlazar los pares cognados. Otra modalidad de la presente invención, es una población de células hospederas que comprende una biblioteca combinatoria o sub-biblioteca de pares ligados de secuencias que codifican una región variable. Una población de células hospederas de conformidad con la presente invención, abarcará una población diversa de células que corresponden a la diversidad de las bibliotecas que las células han transformado/transfectado con éstas. Preferiblemente, cada célula de la población de células constituye solamente un par cognado de la biblioteca completa de pares cognados, y no elementos individuales de la biblioteca de pares cognados que excede más de 50%, más preferido 25%, o mayormente preferido 10%, del número total de elementos individuales expresados de la población de células hospederas . En una modalidad preferida de la presente invención, la población de células hospederas es de células de mamífero. Una población de células hospederas como se describe anteriormente, puede ser utilizada para la expresión de una proteína de enlace policlonal recombinante, puesto que células individuales de la población constituyen secuencias que codifican la región variable de diversidad diferente.

Una modalidad de la presente invención, es una proteína policlonal recombinante expresada de una población de células hospederas que comprende una biblioteca de vectores que codifican diversos pares cognados de secuencias que codifican una región variable ligada, en donde tal biblioteca es obtenida por el método de la de la presente invención. Típicamente, una proteína policlonal recombinante de la presente invención, está comprendida de al menos 3, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ó 106 proteínas compuestos de diferentes pares cognados. Una modalidad preferida de la presente invención, es una inmunoglobulina policlonal recombinante expresada a partir de una población de células hospederas que comprende una biblioteca de vectores que codifican pares cognados diversos de región variable de cadena pesada y secuencias que codifican una región variable de cadena ligera. Otra modalidad preferida de la presente invención, es una TcR policlonal recombinante expresada de una población de células hospederas que comprende una biblioteca de vectores que codifican pares cognados diversos de una región variable de cadena alfa TcR ligada con secuencias que codifican una región variable de cadena beta y/o secuencias que codifican una región variable de cadena delta ligada con una región variable de cadena gamma TcR.

Otra modalidad de la presente invención es una célula hospedera adecuada para producción de una proteína monoclonal. En particular, un anticuerpo monoclonal comprendido de un par cognado de una región variable de cadena ligera con una región variable de cadena pesada o un TcR monoclonal comprendido de un par cognado de una región variable alfa con una región variable beta o una región variable delta con una región variable gamma. Preferiblemente, tal línea de células de producción monoclonal es una línea de células de hibridoma. Tal anticuerpo monoclonal o TcR puede ser generado agregando las siguientes etapas al método enlazando una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguos de interés a) insertando dichas secuencias de nucleótido ligadas en un vector; b) introduciendo dicho vector en una célula hospedera; c) cultivando dichas células hospederas bajo condiciones adecuadas para expresión; y d) obtener el producto de proteína expresado del vector insertado en dicha célula hospedera. Preferiblemente, el vector introducido en la célula hospedera, codifica un par cognado individual de secuencias que codifican una región variable . Aplicaciones de la Invención Una de las aplicaciones principales de la presente invención es el enlace de pares cognados de secuencias que codifican una región variable, especialmente secuencias que codifican una región variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina o secuencias que codifican una región variable de cadena alfa y beta o gamma y delta TcR, por un método de alto rendimiento, para la generación de bibliotecas de pares cognados. Además de la generación de bibliotecas de pares cognados, la TI-RCP múltiple, seguida por enlace por ligación o recombinación o las técnicas de TI-RCP de traslape-extensión múltiple de la presente invención, pueden ser utilizadas en la generación de bibliotecas combinatoriaes realizando la técnica en una población de células genéticamente diversas, lisados celulares a partir de tal población de células, o un ARN purificado a partir de tal población de células. Las bibliotecas, sub-bibliotecas, o clones únicos a partir de una de estas bibliotecas, facilitan la expresión de proteínas policlonales o monoclonales. Especialmente, los anticuerpos monoclonales o policlonales se pueden obtener a partir de las bibliotecas de la presente invención. El uso de anticuerpos monoclonales recombinantes en diagnóstico, tratamiento y profilaxis, es bien conocido. Los anticuerpos monoclonales y policlonales recombinantes generados por la presente invención, tendrán las mismas aplicaciones como productos de anticuerpos generados por tecnologías existentes. En particular, una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina recombinante policlonal como ingrediente activo, combinada con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, puede ser producida por medio de la presente invención. Más preferidas son composiciones farmacéuticas en donde la inmunoglobulina recombinante policlonal está comprendida de pares cognados de secuencias que codifican una región variable . Tales composiciones farmacéuticas de inmunoglobulinas recombinantes policlonales, pueden ser usadas como medicamentos. La inmunoglobulina recombinante policlonal de la composición, puede ser específica para o reactiva contra un objetivo de enfermedad predeterminado y la composición puede de este modo, ser usada para el tratamiento, alivio o prevención de enfermedades tales como cáncer, enfermedades infecciosas, inflamatorias, alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunes, mal funcionamiento inrpunológico, enfermedades cardiovasculares, enfermedades en el sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, rechazo al transplante o embarazo no deseado, en un mamífero tal como un humano, un animal doméstico o una mascota. La presente invención tiene una aplicación adicional la cual no se puede obtener con técnicas de anticuerpos combinatoriaes monoclonales convencionales. En situaciones en donde los antígenos protectivos son ya sea escasamente caracterizados o completamente desconocidos, tal como en la emergencia de enfermedades infecciosas, es imposible seleccionar un anticuerpo policlonal que proporcionará protección contra la enfermedad. Sin embargo, con la presente invención, será posible obtener células que expresan anticuerpo directamente de donadores con respuesta anticuerpo protectiva establecida, por ejemplo, pacientes convalecientes, y usar el material de partida de estados individuos, para generar una biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican una región variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina. En situaciones en donde por ejemplo, el virus se conoce pero los antígenos protectivos son desconocidos, será posible generar una sub-biblioteca de pares de genes de anticuerpo cognados, con reactividad amplia hacia estructuras antigénicas en el virus. Si un anticuerpo policlonal recombinante es producido de tal sub-biblioteca, probablemente contendrá anticuerpos protectivos . En situaciones en donde los antígenos son completamente desconocidos, un anticuerpo policlonal recombinante generado de una biblioteca de par cognado de por ejemplo, pacientes convalecientes, puede ser usado en la misma forma como son usadas hoy día las inmunoglobulinas hiperinmunes . La razón de esto es que el apareamiento cognado el cual asegura que el anticuerpo policlonal recombinante producido estrechamente se asemeja a la respuesta inmune de anticuerpo del paciente convaleciente.

Otra aplicación de las técnicas para enlazar pares cognados de regiones variables, descritos en la presente invención, es para diagnóstico y propósitos analíticos. Cuando se administra un medicamento a un paciente, siempre existe la posibilidad de una respuesta inmune dirigida hacia el medicamento. La inmunogenicidad puede ser valorada por técnicas convencionales, tales como ensayos de enlace específicos del medicamento con suero o plasma derivado de individuos tratados con medicamento. Alternativamente, los métodos de la presente invención pueden ser usados para reflejar respuestas inmunes de pacientes prontamente después de la administración del medicamento, aislando pares cognados de secuencias que codifican una cadena ligera y cadena pesada variable. Anticuerpos expresados a partir de tal biblioteca, pueden entonces ser seleccionados para reactividad hacia el medicamento o componentes del medicamento. Este método es particularmente útil si la presencia del medicamento en el plasma o suero podría interferir con el método convencional . Tales medicamentos son por ejemplo, anticuerpos. Con métodos convencionales, la identificación de una respuesta inmune anti-medicamento (por ejemplo, una respuesta anti-idiotópica, anti-estructura o anti-Fc inmune) , con relación al tratamiento con un anticuerpo, no puede ser realizada hasta que el anticuerpo usado para el tratamiento ha sido completamente separado de la sangre. Con la presente invención, secuencias que codifican tales anticuerpos anti-medicamento, pueden ser aisladas y analizadas de individuos tratados con el medicamento dentro de un par de semanas. De este modo, podrá ser un método alternativo para la valoración de si los fármacos en general y en particular fármacos a base de anticuerpos, son inmunogénicos . Una aplicación adicional de la presente invención es la validación y comparación de vacunas y programas de inmunización. Esto es particularmente útil durante el desarrollo de la vacuna, puesto que será posible valorar y comparar la diversidad de secuencias de respuestas anticuerpo generadas en respuesta a nuevas vacunas candidatas, además de las comparaciones actuales de afinidades de enlace al anticuerpo y tituladores de suero. Además, la presente invención puede ser usada para analizar, monitorear y comparar las respuestas anticuerpo en vigilancia de la eficacia de vacunas en poblaciones . La presente invención también encuentra aplicaciones fuera del campo de proteínas de enlace que contienen una región variable . Es meramente una materia de optimización para uno de habilidades en la técnica, para adaptar la técnica descrita en la presente invención, para enlazar dos o más secuencias de nucleótidos transcritas que codifican una proteína heteromérica distinta de una proteína de enlace. Tal enlace de secuencias que codifican para dominios o subunidades de una proteína heteromérica, puede ser una ventaja en el aislamiento de estas secuencias que codifican proteínas, puesto que podría reducir el número de etapas considerablemente. Además, es posible aislar por ejemplo, variantes de empalme, mutaciones o nuevos elementos de la familia de tales proteínas, usando solamente una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple/mezcla de cebador múltiple . El enlace de secuencias las cuales codifican dominios distantes de una proteína única, es también una posibilidad. Tal técnica podrá facilitar la búsqueda en relación a la importancia de ciertos dominios en una proteína de dominios múltiples, puesto que podría facilitar la supresión de dominios intermedios . La generación de proteínas acopladas o diméricas es también un área en donde la presente invención puede ser aplicada. Aún si las proteínas a ser ligadas son de diferente origen, por ejemplo, una quimera entre una proteína humana y una de ratón, la presente invención puede ser utilizada mezclando células previo a la transcripción inversa. Tal mezcla celular puede constituir ya sea una población de células a partir de cada una de las especies de una célula única de cada una de las especies .

Ejemplos Ejemplo 1: TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Dos Etapas En este ejemplo, se realizó transcripción inversa (TI) usando una plantilla derivada de una célula única aislada y el ADNc producido se usó como plantilla para más de una RCP de traslape-extensión múltiple. a. Células Se generó una línea de células de ovario de hámster Chino (CHO) que expresa IgGl-kappa, usando la tecnología Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Un vector pLL113 de plásmido que expresa IgG-kappa de mamífero (Figura 4) , se construyó basado en el vector de expresión Flp-In, pcADNR/FRT. Las células CHO-Flp-In fueron co-transfectadas usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , de conformidad con las instrucciones del fabricante, con pLL113 que contiene los genes que codifican el anticuerpo y pOG44 confiriendo expresión temporal de la recombinasa Flp. Se seleccionaron transformantes y verificaron para la producción de IgG-kappa por inmunoensayos. La línea de células seleccionadas se nombró pLL113 de CHO Flp-In, y se mantuvo en medio F12 Ham, suplementado con 2 mM de L-glutamina, FCS al 10% e Higromicina B 900 (medio de mantenimiento) . Se cosecharon células pLL113 de CHO Flp-In usando tripsina y se lavaron 3x en medio de mantenimiento. Después del lavado final, las células fueron resuspendidas en el volumen original del medio de mantenimiento. La concentración celular se determinó usando un sistema Casy-1 (Schárfe System GmbH, Reutlingen, Alemania) y se diluyó en medio de mantenimiento a una concentración de 1 célula/5 µl . b. Transcripción inversa Suspensión celular pLL113 de CHO Flp-In, en promedio que contiene una célula, se dispensó en células únicas de una placa de RCP de 96 cavidades (Thermo-Fast 96, skirted AB-0800, ABgene, Epsom, Surrey, UK) . El ADNc se sintetizó de las células distribuidas utilizando la etapa de transcriptasa inversa (TI) en el protocolo de TI-RCP de una etapa Qiagen (Kit de TI-RCP de una etapa Qiagen, Cat# 210210, Hilden, Alemania) . Cada una de las cavidades contiene los siguientes reactivos en un volumen total de 20 µl : 1 x amortiguador de TI-RCP de una etapa, dNTP en una concentración final de 1 mM de cada uno, 5 pmol de Oligo poli-dT (18) , 26 U de inhibidor de RNase (RNasin, Promega, Madison USA, cat. No. N2111) , 2 µl de mezcla de enzima de TI-RCP de una etapa, y 5 µl de suspensión de células pLL13 de CHO Flp-In.

La reacción de TI se realizó incubando las mezclas de reacción a 55°C por 30 minutos. Subsecuentemente, la transcriptasa inversa fue inactivada incubando la mezcla de reacción a 94°C por 10 minutos. c. RCP de Traslape-Extensión Múltiple Una fracción de los productos de ADNc generados en la etapa b) , se usó como una plantilla para RCP de traslape-extensión múltiple. Las reacciones se realizaron en placas de 96 cavidades. Cada cavidad contiene, en un volumen total de 40 µl, los siguientes reactivos: 1 x amortiguador de TI-RCP de una etapa, dNTP en una concentración final de 500 µM de cada uno, Mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple en las concentraciones como se indica en la Tabla I, 26 U de inhibidor de RNase (RNasin, Promega, Madison USA, cat. No. N2111) , 2 µl de mezcla de enzima de TI-RCP de una etapa, y 1 µl de plantilla de ADNc (derivada de una célula única (etapa b) ) . La mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple usada, comprende los cebadores mostrados en la tabla 1.

Tabla 1 W=AT, S=G/C, R=A G. Secuencias capitalizadas que corresponden a la regi n específica el gen.

Las reacciones se realizaron con un termociclador HT Primus MWG de 96 cavidades (MWG Biotech AG, Ebersberg, Alemania), con las siguientes condiciones de ciclización: Desnaturalización 30 segundos 95°C Templado 30 segundos 50°C 50 ciclos Prolongado 5 minutos 72°C Extensión final 10 minutos 72°C d. RCP Anidada La RCP anidada se realizó usando productos de traslape-extensión múltiple como plantilla. Las reacciones se realizaron en placas de 96 cavidades. Cada cavidad contiene, en un volumen total de 50 µl, los siguientes reactivos: 1 x de Amortiguador BioTaq, dNTP en una concentración final de 400 µl cada uno, 2 mM de MgCl2, Mezcla de cebador de RCP anidada, 1.25 U de Polimerasa de ADN BIOTAQ (Cat. No. BIO-21040, Bioline, ÜK) y 1 µl de producto de RCP de traslape-extensión múltiple (etapa c) . Los cebadores usados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2 Secuencia capitalizadas que corresponden a la región específica.

Las reacciones se realizaron con termociclador MWG Primus HT de 96 cavidades (MWG Biotech AG, Ebersberg, Alemania) con las siguientes condiciones de ciclización: Desnaturalizado 30 s 95°C Templado 30 s 50°C 25 ciclos Prolongado 90 s 72°C Extensión final 10 min 72 °C Los productos anidados se analizaron por electroforesis de gel de agarosa la 1% usando bromuro de etidio para detección (Figura 5) . El tamaño esperado del producto de traslape-extensión fue 1076 pb. Tal producto puede ser observado en las líneas 1, 5, 6,7, 8 y 12 indicadas por flechas (Figura 5A) . En el experimento mostrado, el control negativo es contaminado y una contaminación similar esta también presente en las muestras. La figura 5B ilustra los fragmentos de la Figura 5A, los cuales son relevantes en el presente experimento. El presente experimento ilustra una forma para realizar la RCP de traslape-extensión múltiple de dos etapas, utilizando plantillas derivadas de una célula única. Además, se muestra que es posible realizar aproximadamente veinte RCP de traslape-extensión múltiple usando ADNc generado de una célula única aislada.

Ejemplo 2: TI-RCP de Traslape-extensión Múltiple de Etapa única En este ejemplo la transcripción inversa y la RCP de traslape-extensión múltiple se realizó en una etapa única usando plantillas de células lisadas, en concentraciones que corresponden a 100, 10 ó 1 célula. a. Células La línea celular de hibridoma humano HB-8501 que produce un anticuerpo IgGl-kappa antitetánico, se adquirió de American Type Culture Collection y se cultivó en medio de Dulbecco Modificado de Iscove (Vitacell, Viev, Ucrania, cat. No. 30-2005) que contiene suero de bovino fetal al 10%. Antes de realizar TI-RCP de traslape-extensión múltiple, las células se colectaron, contaron y congelaron a -80 °C en un medio de cultivo en una concentración de 200 células/µl . b. TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única Se usó el kit de TI-RCP de una etapa Qiagen (Qiagen cat. No. 210212, Hilden, Alemania) para la TI -RCP de traslape-extensión múltiple esencialmente de conformidad con las recomendaciones del fabricante . Antes de la adición a los tubos de RCP, los lisados celulares se descongelaron y diluyeron en H20 para producir una concentración de lisado que corresponde a 100, 10 y 1 célula por 5 µl . Cada tubo de RCP contiene los siguientes reactivos en un volumen total de 50 µl : 1 x de Amortiguador TI-RCP de una etapa, dNTP en una concentración final de 400 µl cada uno, mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple en las concentraciones indicadas en la tabla 3, 2 µl de la mezcla de enzima TI-RCP de una etapa, 50 U de inhibidor RNase (RNasin, Promega, Madison USA, cat. No. N2515) , y 5 µl de lisado celular diluido La mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple usada comprende los cebadores mostrados en la tabla 3.

Tabla 3 W=A/T, S=G/C, R=A/G. Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Las reacciones se realizaron usando las siguientes condiciones de ciclización: Transcripción inversa: 30 minutos 55°C Activación de polimerasa: 15 minutos 95°C transcriptasa inversa inactivada y polimerasa Taq activada.

Reacción de RCP: Desnaturalizado 30 s 94°C Templado 30 s 44°C Prolongado 3 min 72°C Extensión final 10 min 72°C Se analizaron diez microlitros de los productos de la reacción por electroforesis de gel de agarosa al 15% usando bromuro de etidio para detección (Figura 6A) . El tamaño esperado de los fragmentos (el tamaño exacto depende de la longitud de las regiones variables) : VH: 410 pb Lc: 680 pb fragmento de traslape-extensión: 1070 pb. Los fragmentos de ADN discretos con movilidades que corresponden a las longitudes de la región variable de cadena pesada (VH) y la región constante y variable de cadena ligera (LC) , se observan para todas las diluciones de lisado celular. Un fragmento menos intenso con movilidad que corresponde al fragmento de traslape-extensión putativo se observa en lisados de 100 y 10 células. El fragmento de traslape-extensión de una muestra de lisado celular, es difícil reconocer, aunque se puede observar en el gel original (véase la flecha en la fotografía mostrada en la Figura 6A y un bosquejo mostrado en la Figura 6B) . c. Identificación del Fragmento de traslape-extensión Se verificó a partir de un experimento producido como uno descrito anteriormente, la presencia de la banda de traslape-extensión. Se escindieron regiones en el gel de agarosa de aproximadamente 1070 pb de una línea que corresponde a 1 célula y de una línea que corresponde a 100 células y el ADN se purificó usando Qiaex II (Qiagen cat. No. 20051, Hilden, Alemania) y se eluyeron en 20 µl de agua. Un microlitro del eluado se sometió a RCP (Biotaq Kit, Bioline, UK cat. No. BIO-21040) de conformidad con las instrucciones del fabricante con cebadores que flanquean el fragmento de traslape-extensión putativo (cebadores JH que corresponden a SEC ID NO 32 a 35 y cebador CLk que corresponde a la SEC ID NO: 17, cada cebador a una concentración de 0.5 µM) . Los parámetros de ciclización son: Desnaturalizado 30 s 95°C Templado 30 s 55°C 30 ciclos Prolongado 1 min 72°C Se analizaron diez microlitros de cada producto de reacción por electroforesis de gel de agarosa al 1% usando bromuro de etidio para detección. Varios fragmentos pueden ser observados incluyendo tanto de 1 como de 100 células, un fragmento con movilidad del fragmento de traslape-extensión esperado (la flecha en la Figura 6C) . El fragmento de 1 kb de la línea de gel que corresponde a una célula se recortó del gel y se purificó usando Qiaex II como se describe anteriormente . El fragmento purificado se digirió con las enzimas de restricción Nhel y Ncol (separadamente) y los productos de reacción se analizaron por electroforesis de gel de agarosa al 1% usando bromuro de etidio para detección (Figura 6D) . Estos sitios de restricción están presentes en el traslape entre VH y LC, y los tamaños esperados después de la digestión son de aproximadamente 410 y 680 pb de longitud, respectivamente (Figura 2) . La digestión Nhel es parcial puesto que una fracción larga está aún presente en el tamaño original .

Ejemplo 3. RCP anidada y TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única combinada En este ejemplo, las reacciones de RCP de traslape-extensión múltiple y transcripción inversa se realizaron en una etapa única por una amplificación de RCP semi-anidada, usando platillas de células usadas, en concentraciones que corresponden a 100, 10 ó 1 célula. a. TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única Se realizó TI-RCP de traslape-extensión múltiple USando lisado de células HB-8501 como se describe en el Ejemplo 2, utilizando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple que comprende los cebadores mostrados en la tabla 4.

Tabla 4 W=A/T, S=G/C, R=A/G. Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Sin embargo se debe notar que para cada mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple únicamente se usaron uno de los cebadores CH?-5, resultando en cinco diferentes mezclas de cebador de traslape-extensión múltiple. Los parámetros restantes son como se describen para la reacción TI-RCP de traslape-extensión múltiple en el Ejemplo 2, únicamente con un cambio en la temperatura de templado a 50 °C. Se realizó una reacción para cada cebador inverso de región constante de cadena pesada (CH?, CH , CH3, CH4, CH5 que corresponden a la SEC ID NO: 49 A 53, respectivamente) utilizando lisados que corresponden a 100, 10, 1 y 0 células. b. RCP semi-anidada Un microlitro del producto de la reacción TI-RCP de traslape-extensión múltiple se sometió a RCP semi-anidada (Biotaq kit, Bioline, UK cat. No. BIO-21040) , esencialmente como se propone por el fabricante . El volumen total de las reacciones fue 50 µl . Los cebadores usados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Las condiciones de ciclización son como sigue: Desnaturalizado 30 s 95 °C Templado 30 s 50 °C y 25 ciclos Prolongado 1. 5 min 72 °C Extensión final 5 min 72 °C Se analizaron diez microlitros de cada reacción por electroforesis de gel de agarosa al 1.5% usando bromuro de etidio para detección (Figura 7) . El fragmento de traslape-extensión putativo de la RCP correspondiente al lisado de una célula y en donde el cebador CH se usó en la primera reacción (véase flecha en la Figura 7), se escindió del gel de agarosa, se purificó usando un kit Qiaex II (Qiagen cat. No. 20051, Hilden, Alemania) y se insertó en pCR2.1-TOPO usando un kit de clonación Invitrogen TOPO TA (Invitrogen cat. No. 45-0641, Carlsbad, CA, USA) . Los insertos de ocho clones se secuenciaron y siete de estos parecían consistir de una región variable de cadena pesada ligada a una región constante y variable de cadena ligera, por la región de traslape esperada. En resumen, la sensibilidad de reacción de TI-RCP de traslape-extensión múltiple combinada y la reacción RCP semi-anidada fue muy satisfactoria, con 4 de 5 cebadores de la región constante capaces de amplificar cantidades significantes de productos de traslape-extensión de lisado que corresponde a una célula única.

Ejemplo 4. RCP Anidada y TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única Combinada Usando Linfocitos B Humanos Enriquecidos como Fuente de Plantilla En este ejemplo, las reacciones RCP de traslape-extensión múltiple y transcripción inversa se realizaron en una etapa única seguida por una RCP de amplificación semi-anidada, usando linfocitos B humanos, únicos, aislados como fuentes de plantillas. a. aislamiento de células B Se inmunizó un donador macho humano con toxoide tetánico. Se colectó una muestra de sangre de 120 ml del donador 6 días después de la inmunización y se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo Noruega, prod. No. 1001976) de conformidad a las instrucciones del fabricante. La población de células CD-19 positivas se enriqueció utilizando clasificación celular por perlillas magnéticas. Las PBMC se tiñeron con anticuerpo anti-CD19 conjugado a FITC (Becton Dickinson, NJ, USA, cat. No. 345776). Se clasificaron las células de perlillas magnéticas usando microperlillas magnéticas conjugadas a anti-FITC y la purificación en columna se realizó de conformidad con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, cat. No. 130-042-401). Las células se diluyeron a una concentración de 200 células por ml en PBS que contiene 2 nM de EDTA y BSA al 0.5%. Se distribuyeron cinco microlitros de células diluidas a tubos de RCP obteniendo aproximadamente una célula única por tubo. Los tubos se almacenaron a -80 °C hasta el uso. b. RCP semi-anidada y TI-RCP de traslape-extensión múltiple Las condiciones para RCP semi-anidada y TI-RCP de traslape-extensión múltiple son como se describen en el Ejemplo 3. Sin embargo, las reacciones son únicamente realizadas con la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple constituida por el cebador CH3 que corresponde a la SEC ID NO: 51. Dieciséis muestras de las reacciones RCP semi-anidada y TI-RCP de traslape-extensión múltiple combinada se analizaron sometiendo 10 µl de cada reacción RCP semi-anidada por electroforesis de gel de agarosa al 1% usando bromuro de etidio para detección (Figura 8) . Como se puede observar en la Figura 8, 2 de 16 líneas (líneas 5 y 6) combinan fragmentos de la movilidad esperada (alrededor de 1 kb) . Además, la línea 2 contiene un fragmento menos intenso a la movilidad esperada. Los fragmentos 1 kb de la línea 5 y 6 se escindieron del gel de agarosa, se purificaron usando un kit Qiaex II (Qiagen cat. No. 20051) y se insertaron en pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación Invitrogen TOPO TA (Invitrogen cat. No. 45-0641, Carlsbad, CA, USA) . Dos clones de cada fragmento aislado tienen insertos del tamaño correcto. La digestión de la enzima de restricción (Ncol y Nhel, separadamente) mostró fragmentos de los tamaños esperados (410 y 680 pb) que indican un enlace correcto entre la región variable de cadena pesada y región constante y variable de cadena ligera que codifican las secuencias. Los dos clones originados del fragmento en la línea se secuenciaron y no mostraron ser idénticos, lo que indica que el VH y Lc enlazados, fueron pares cognados.

Ejemplo 5: RCP Anidada y TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única Combinada Usando Cebadores Vx Específicos En este ejemplo, las reacciones RCP de traslape-extensión múltiple y transcripción inversa se realizaron en una etapa única usando cebadores V? específicos, seguidos por una reacción RCP semi anidada. Se usó ARN total purificado de dos diferentes líneas celulares que expresan familias del gen lambda Ib y le en combinación con la misma región variable de cadena pesada como plantilla. a. Células Se generaron dos líneas de células de ovario de hámster Chino (CHO) que expresan IgGl-lambda, usando la tecnología Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Se construyeron vectores pEm465/01P581 y pEm465/01P582 que expresan IgGl-lambda de mamífero (Figura 9A) , que representa dos familias del gen lambda, basados en el vector de expresión Flp-In, pcADN5/FRT. Las células CHO-Flp-In se co-transfectaron, usando Fugeno 6 (Roche, Mannheim, Alemania) de conformidad con las instrucciones del fabricante, con los plásmidos mencionados anteriormente que contienen los genes que codifican anticuerpos y pOG44 que confiere expresión temporal de la recombinasa Flp. Se seleccionaron los transformantes por inserciones. Las líneas celulares seleccionadas se nombraron CHO Flp-In/Em464/01P581 y CHO Flp-In/Em464/01P582, y se mantuvieron en medio Ham F-12, se suplementaron con 2 mM de L-glutamina, FCS al 10% y 900 µg/ml de Higromicina B (medio de mantenimiento) . Las líneas celulares se colectaron usando tripsina y se lavaron 3x en medio de mantenimiento. Aproximadamente 107 células se usaron para purificación de ARN total usando kit Núcleo Spin (Macherey-Nagel , Duren, Alemania) de conformidad con la descripción del fabricante . Se determinaron las concentraciones de ARN final por mediciones de OD2S0. b. Ti-Rcp de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única Fue esencialmente realizada la TI-RCP de traslape-extensión múltiple usando 50 pg, o 0.5 pg de ARN total como plantilla, como se describe en el Ejemplo 3, utilizando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple que comprende los cebadores mostrados en la Tabla 6 y las condiciones de ciclización especificadas abajo. Transcripción inversa: 30 min 55 °C Activación de polimerasa: 15 min 95°C transcriptasa inversa de inactivación y polimerasa Taq de activación.

Reacción RCP: Desnaturalizado 30 s 95 °C Templado 30 s 50 °C > 35 ciclos Prolongado 5 min 72 °C Extensión final 10 min 72 °C Tabla 6 Y=C/T, W=A/T, S=G/C, R=A/G. Secuencia capitalizadas que corresponden a la región específica del gen e. RCP semi-anidada ün microlitro del producto de la reacción TI-RCP de traslape-extensión múltiple se sometió a RCP semi-anidada (BioTaq kit, Bioline, UK, cat. No. BIO21040) , esencialmente como se propone por el fabricante. Los volúmenes totales de las reacciones son 20 µl. Los cebadores usados se muestran en la tabla 7.

Tabla 7 Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Las condiciones de ciclización son como siguen: Desnatural izado 30 s 95°C Templado 30 s 50°C 25 ciclos Prolongado 1. 5 min 72 °C Extensión final 5 min 72 °C Diez microlitros de los productos anidados se analizaron por electroforesis de gel de agarosa al 1.5% usando bromuro de etidio para detección (Figuras 9B y 9C) . Las flechas indican productos de traslape-extensión con las propiedades de migración esperadas de aproximadamente 1 kb. El presente experimento ilustra que la mezcla del cebador de traslape-extensión múltiple lambda mostrado en la Tabla 6 es aplicable en TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única independiente en la plantilla usada. Además, productos RCP de traslape-extensión específicos se produjeron a 0.5 pg de ARN total. Esta sensibilidad sugiere que la región variable de cadena pesada de enlace cognado y la región variable de cadena ligera que codifica secuencias pueden ser amplificadas de una célula única. Ejemplo 6. Generación de una Sub-biblioteca de Pares Cognados Específicos del Tétano de Secuencias que Codifican Anticuerpos En el presente ejemplo las etapas resumidas en el esquema de flujo ilustrado en la Figura 10, se ejemplifican usando Toxoide Tetánico (TT) como un antígeno objetivo. a. Donadores Los donadores, los cuales previamente se han sido inmunizados con la vacuna Tetánica se reforzaron con la vacuna Tetánica (Statens Serum Institut, Dinamarca) . Seis días después del refuerzo de la vacuna Tetánica, se extrajo una muestra de sangre de aproximadamente 200 ml del donador en un tubo que contiene anticoagulante . Se requiere que los donadores generalmente estén saludables de infecciones crónicas o no silentes. No deben de sufrir de enfermedades autoinmunes o recibir alguna medicación de inmunosupresivos y no deben tener alguna vacunación dentro de al menos 3 meses. También, al tiempo de refuerzo de la vacuna TT, los donadores no deben tener alguna infección seria dentro de al menos un mes . b. Preparación de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) Las PBMC se aislaron de las muestras de sangre usando Lymphoprep (Axis-Shield PoC AS, Norway, prod. No. 1001967) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, la sangre se diluyó 1:1 en PBS y esta suspensión se formó en capas sobre Lymphoprep en una relación 2:1. Se centrifugaron viales por 20 minutos, 25°C a 800 g y se colectó la banda de fase interna blanca. Las células se lavaron en PBS que contiene 2 mM de EDTA. c . Enriquecimiento de Células B El linaje de célula B (células CD19+) del PBMC es enriquecido por selección de células por perlillas magnéticas usando el siguiente procedimiento. Las PBMC aisladas se tiñeron con anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 345776). Todas las etapas se realizaron a 4°C en la oscuridad. El teñido se realizó con 10 µl de lxlO6 células anti-CD19-FITC en un volumen de 100 µl por lxlO6 células usando amortiguador M (PBS, pH 7.2, BSA al 0.5%, 2 mM de EDTA). Esto teñirá el linaje de célula B de las PBMC. Las células se incubaron por 20 minutos seguidas por dos etapas de lavado con amortiguador M. Las células teñidas con anti-CD19-FITC se etiquetaron magnéticamente con microperlillas conjugadas con anti-FICT, usando 10 µl de perlillas magnéticas anti-FITC (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, cat. No. 130-042-401) por lxlO6 células en un volumen de 100 µl de amortiguador M por lxl0e células. La incubación se realizó por 15 minutos seguida por una etapa de lavado con amortiguador M. Las células se suspendieron nuevamente en amortiguador M desgasificado. Se pre-trató una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, cat. No. 130-042-401) con amortiguador M desgasificado de conformidad con las prescripciones del fabricante. La suspensión de células teñidas con anti-CD19-FITC y etiquetadas con perlillas magnéticas anti-FITC se aplicó a la columna y se dejó correr a través de esta. Las células etiquetadas y teñidas (CD19+) se retendrán en los campos magnéticos circundantes a la columna mientras las células no teñidas (CD19-) pasarán a través de la columna. La columna se lavó con amortiguador M desgasificado. El campo magnético se removió y las células CD19+ se colectaron. d. Selección de Células de Plasma Lo eluado de la columna MACS se centrifugó y suspendió nuevamente en amortiguador FACS (PBS, pH 7.2, BSA al 2%) en una concentración de lxlO6 células/60 µl de amortiguador FACS. Se agregaron anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 345776) (10 µl/106 células), anti-CD38-PE (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 555460) (10 µl/106 células) y anti-CD45-PerCP (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 345809) (20 µl/106 células) . La incubación se realizó a 4°C por 20 minutos en la oscuridad, seguida por lavado dos veces y suspendida nuevamente en amortiguador FACS. Las células se clasificaron por clasificación celular activada fluorescente (FACS) usando los siguientes parámetros seleccionados: 1. Dispersión delantera y dispersión lateral para retener linfocitos y monocitos que incluyen células de plasma y blasters de plasma para evitar muerte celular y células con muy alta dispersión lateral, en la cual pueden estar agregados o granulocitos. 2. Las células que son CD19 son positivas y expresan niveles incrementados de CD38 (CD38h:?") . Esto es básicamente únicamente una entrada en CD38 puesto que las PBCM se han enriquecido en una columna MACS por expresión de CD19, pero esto describirá algunos de los contaminantes . 3 . Las células CD45 positivas . Todos los linfocitos expresan CD45. Sin embargo, las células de plasma regulan hacia descendentemente su expresión CD45 comparada con las etapas de diferenciación del linfocito temprano . Por lo tanto, una población discreta de células que corresponde a células de plasma se puede obtener cuando entra en CD45 . Las células cl asi f icadas FACS se col ectaron como células únicas directamente en cavidades únicas de placas de 96 cavidades que cont ienen 5 µl de amort iguador PBS complementado con 5 U del inhibidor RNase (RNasin , Promega , Madi son USA, cat . No . N2515 ) por cavidad . A este punto las células pueden ser congeladas por TI -RCP después o las células pueden proseguir inmediatamente para TI -RCP . e . Enlace de Pares Cognados de Secuencias gue Codifican la Región Variable de Inmunoglobulina La tecnología de TI-RCP de traslape-extensión múltiple es aplica a las células únicas , con ello se logra el enlace cognado de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada del Toxoide anti -Tetánico transcrito . e-1. TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única El kit de TI -RCP de una etapa Qiagen (Qiagen cat. No. 210212, Hilden, Alemania) se usó para la TI-RCP de traslape-extensión múltiple esencialmente de conformidad con la recomendación del fabricante. Placas de 96 cavidades congeladas que contienen una cavidad por célula única, se removieron del congelador y cuando las cavidades están libres de cristales de vidrio, se agregan inmediatamente 15 µl de la mezcla de reacción TI-RCP a cada muestra (célula única) . La mezcla de reacción TI-RCP contiene, en un volumen total de 20 µl, los siguientes reactivos: 1 x de amortiguador TI -RCP de una etapa, dNTP en una concentración final de 400 µl cada una, Mezcla de traslape-extensión múltiple en las concentraciones como se indicó en la tabla 8, 0.8 µl de la mezcla TI-RCP de una etapa, y 20 U de inhibidor RNase (RNasin, Promega, Madison USA, cat. No. N2515) . La composición de la mezcla del cebador de traslape-extensión se muestra en la tabla 8.

Tabla 8 W=A/T, S=G/C, R=A/G. Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Las condiciones de ciclización son como siguen: Transcripción inversa: 30 min 55°C Activación de polimerasa: 15 min 95°C transcriptasa inversa inactivada y polimerasa Taq activada, Reacción RCP Desnaturalizado 30 s 94 Templado 30 s 52 35 ciclos Prolongado 5 min 72 Extensión final 10 min 72°C e-2. Amplificación Adicional Un microtitulador del producto de reacción TI-RCP de traslape-extensión múltiple, de cada muestra, se sometió a RCP semi-anidada (BioTaq kit, Bioline, UK, cat. No. BIO-21040) , esencialmente como se propone por el fabricante utilizando placas de 96 cavidades. El volumen total de cada reacción es 50 µl, que contiene una concentración final de Ix de amortiguador BioTaq, 200 µM de dNTP (de cada uno) , 2 mM de MgCl2, 1.25 U de polimerasa Taq y los cebadores mostrados en la Tabla 9. Las condiciones de ciclización son como sigue: Desnaturalizado 30 s 95°C Templado 30 s 55°C 30 ciclos Prolongado 1.5 min 72 °C Extensión final 5 min 72°C Tabla 9 Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Diez microlitros de una serie limitada de muestras se analizaron por electroforesis de gel de agarosa al 1.5% usando bromuro de etidio para visualización, para verificar que la TI-RCP de traslape-extensión múltiple ha sido exitosa. El tamaño esperado de los fragmentos (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables) : VH: ~410 pb LC: -680 pb Fragmento de traslape-extensión: ~ 1070 pb Dos microlitros de todas las muestras, se corrieron en placas de 96 cavidades, originados del mismo donador, se combinaron en un tubo único. Las muestras agrupadas se digirieron con Xhol y Notl. Los fragmento de traslape- extensión digeridos se purificaron por electroforesis de gel de agarosa al 1% preparativa; los fragmentos de traslape- extensión se escindieron del gel de agarosa y se purificaron usando un kit Qiaex II (Qiagen cat. No. 20051, Hilden, Alemania) . No es necesario agrupar los pares cognados de esta etapa si esto no es deseado. En tal caso, cada reacción individual será sometida a desdoblamiento de restricción y los productos son clonados individualmente en el vector descrito abajo. f. Biblioteca de Expresión Fab Cognada Una biblioteca de vectores Fab generada insertando la combinación de fragmentos de traslape-extensión digeridos Xhol/Notl en el vector JSK301 de E. coli (Figura 11) por ligación de E. coli (TOPO10) , es transformada por electroporación con la biblioteca de vectores Fab y los transformantes se seleccionaron en agar 2xYT que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Se preparó el ADN plásmido de colonias directamente de placas de agar. La preparación del plásmido se derivó de un número mínimo de colonias por donador, que corresponden a 3x del número total de células de plasma únicas originalmente seleccionadas, para mantener la diversidad. Una biblioteca de expresión Fab se generó insertando un promotor procariótico y cásete líder derivado de phh3 (Den, W. et al., 1999 J. Immunol . Methods 22, 45-57) en la preparación del plásmido resultante digiriendo la preparación del plásmido con AscI y Nhel y subsecuente ligación. El proceso de generación de biblioteca es delineada en la Figura 12. Se transformó E. coli (TG1) por electroporación con la biblioteca de expresión Fab resultante y los transformante se seleccionaron en agar 2xYT que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Los donadores individuales se mantuvieron separados durante el procedimiento descrito en Den et al., J Immunol Methods, 1999, Enero 1; 222 (1-2) :45-57. Pueden, sin embargo ser combinados en cualquier etapa donde esta pueda ser deseada. g. Selección de Clones Se seleccionaron los clones que expresan Fab para enlace de antígeno a TT por ensayos de ELIS específicos del antígeno . g-1. Expresión Fab y Generación de Placa Maestra Colonias seleccionadas individualmente de las células TG1, cada que alberga un vector de expresión Fab cognado de la biblioteca generada en la etapa (f) se recogieron en cavidades únicas de placas de 96 cavidades que contienen 2x YT/100 µg/mL Amp/1% de glucosa. Las colonias se hicieron crecer durante la noche a 37 °C con agitación suave. Estas placas son referidas como placas maestras, las cuales se almacenan a -80 °C después de la adición de glicerol a una concentración final de 15%. Antes las placas maestras se almacenaron, se usaron para inoculación de uno o más placas de 384 cavidades que contienen 2 x YT/100 µg/mL Amp 0.1% de glucosa usando un replicador de 96 dientes. Las placas se sellaron y se agitaron por 2 - 3 horas a 37 °C. Se indujo la expresión Fab agregando un volumen igual de 2 x YT/100 µg/mL Amp/0.2 mM IPTG, obteniendo una concentración IPTG final de 0.1 mM. Las placas se sellaron y se agitaron durante la noche a 30 °C. El día siguiente, los sobrenadantes que contienen Fab se analizaron para especificidad de enlace al antígeno TT por ELISA. g-2. Análisis ELISA Placas ELISA de trescientas ochenta y cuatro (384) cavidades (Nunc, Roskilde, Dinamarca, cat. No. 265196) se revistieron durante la noche a 4°C con antígeno de toxoide tetánico (TT) , diluido a una concentración final de 1 µg/mL en PBS en un volumen de 25 µl por cavidad. Se bloquea el exceso de sitios de enlace de las cavidades por 1 hora a temperatura ambiente agregando 2% de M-PBS-T (2% de polvo de leche desnatada en PBS, 0.05%% de Tween 20) . Las cavidades se lavaron 2 veces con PBS-T (PBS, 0.05% de Tween 20) . Los sobrenadantes bacterianos que contienen Fab de g-1, se diluyen 1:2 en M-PBS-T al 2%, y se transfieren a las cavidades ELISA por duplicado. La incubación se realizó por 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron 4 veces con PBS-T. Se agregó a las cavidades Fab/HRM anti-humano de cabra (Sigma, St . Louis, MO, USA, cat. No. A0293) 1:10.000 de dilución en M-PBS-T al 2%. La incubación se realizó por 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron 4 veces con PBS-T. Se agregó el sustrato TMB Plus (KemEnTec, Copenhagen, Dinamarca, cat. No. 4390L) y la incubación se realizó por 5 - 15 minutos. La reacción se detuvo agregando un volumen igual de ÍM de H2S04. Las magnitudes de las reacciones se leyeron a 450 nm en un lector ELISA (Multiscan Ascent, Labsystems, Franklin, USA) . Los clones bacterianos originales que corresponden a clones de enlace al antígeno TT, son subsecuentemente recuperados de las placas maestras originales . Se preparó el ADN plásmido de los clones Fab positivos del antígeno aislado, generando una sub-biblioteca de expresión Fab cognada de clones que se enlazan al antígeno TT. Los clones pueden también ser analizados por un ensayo ELISA de cadena anti-ligera, para lograr correlación entre el número de clones que se enlazan al antígeno y el número de clones que expresan Fab. Además, tal análisis proporciona información de representación de cadena ligera kappa y lambda en los clones . b. Biblioteca de Expresión del Anticuerpo Cognado Para facilitar la expresión de anticuerpos humanos de longitud completa, las regiones variables cognadas del vector de expresión Fab bacteriano deben ser transferidas a un vector de expresión de mamífero que contiene los dominios constantes de uno de los isotipos de inmunoglobulina humana. Tal transferencia puede ser ya sea realizada clon por clon o en masa. Abajo se describe como realizar la transferencia en masa. La transferencia en masa se realiza en dos etapas. Primero, se combinan las preparaciones de plásmido de los clones Fab que se enlazan al antígeno individualmente aislado. El promotor procariótico y el cásete que contiene al líder es intercambiado con un promotor de mamífero y el cásete líder que consiste de la secuencia líder de fosfatasa alcalina humana (AP líder) , promotor 1-alfa factor de extensión humano (EFP) , promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) , secuencia líder IgK que digiere la sub-biblioteca de expresión Fab agrupada con AscI y Nhel seguida por inserción de un promotor de mamífero y cásete líder por una ligación subsecuente. Se transformó E. coli (TOP10) por electroporación con la biblioteca de expresión Fab intercambiada por el promotor resultante y se seleccionaron los transformantes en agar 2xYT que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Se preparó el ADN plásmido de colonias directamente de las placas de agar. La preparación del plásmido se deriva de un número mínimo de colonias por donador, que corresponden a aproximadamente 3x el número total de clones en la biblioteca original, para mantener la diversidad. Segundo, las regiones variables cognadas del vector de expresión Fab intercambiado del promotor se aislaron digiriendo la preparación del plásmido con Xhol y Notl. El fragmento aislado se insertó por ligación en un vector de expresión de mamífero que resulta en una biblioteca de expresión de anticuerpo cognado. El vector usado es esencialmente el mismo como en la Figura 9A, excepto que IgL en este caso corresponde a la secuencia que codifica la cadena ligera kappa. El vector de expresión del mamífero usado anteriormente se basa en el sistema Flp-In específico del sitio (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA, cat. No. K6010-01) . E. coli (TOPO10) se transformó por electroporación con la biblioteca de expresión de anticuerpo cognado resultante y los transformantes se seleccionaron en agar 2xYT que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. Se preparó el ADN plásmido de colonias directamente de las placas de agar. La preparación del plásmido es nuevamente derivada de un número mínimo de colonias por donador, que corresponde a aproximadamente 3x el número total de clones en la biblioteca original, para mantener la diversidad. La preparación de plásmido resultante de la biblioteca de expresión del anticuerpo cognado puede ser usada para transfectar una célula hospedera de mamífero, por ejemplo las células CHO del sistema Flp-In de Invitrogen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA, cat. No. K6010-01) para generar líneas celulares de expresión de mamífero estables por integración mediada de recombinasa Flp. Tal línea celular pude ser usada en la producción de anticuerpos policlonales recombinantes. Ejemplo 7: Selección por Ensayo de Membrana de Alta Densidad Los clones que expresan Fab del Ejemplo 6f, son seleccionados por un ensayo de membrana de alta densidad. a. Generación de Placa Maestra Se generaron las placas maestras como se describe en la etapa (g-1) del Ejemplo 6. b. Preparación de Membrana PVDF Se revistieron las membranas PVDF (Amersham, Uppsala, Suecia, cat. No. NoRPN2020F) de conformidad con las instrucciones del fabricante durante la noche a 4°C con antígeno TT diluido a una concentración final de 1 µg/ml en PBS. Se bloquearon los sitios de exceso de enlace en las membranas por 1 hora en M-PBS al 2% (2% de polvo de leche desnatada en PBS) . Las membranas se enjuagaron 3 veces en PBS . Las membranas se remoj aron en 2x YT por unos pocos minutos . c. Consolidación del Clon Se realizó la consolidación de clones en placas de 384 cavidades transfiriendo clones de las placas maestras en una o más placas de 384 cavidades que contienen 20 µl 2 x YT/cavidad, usando un replicador de 96 dientes. Usando un replicador de 384 dientes la bacteria se transfirió a una o más membranas de nylon por duplicado (Amersham, Uppasala, Suecia, cat. No. RPN2020B) colocadas en placas de agar 2 x YT/Carb/1% de glucosa. Las placas se incubaron 4 - 6 horas a 37 °C. d. Inducción Fab Las membranas PVDF preparadas en la etapa B, se colocaron en unas placas de agar 2 x YT/Carb/0.1 mM IPTG. Las membranas de nylon con el crecimiento de colonias bacterianas se colocaron en la parte superior de las membranas PVDF (una membrana de nylon por membrana de PVDF) en la placa de agar que contiene IPTG. La placa de agar que contiene IPTG se incubó a 30 °C durante la noche para facilitar la expresión Fab inducida por IPTG de las colonias. Las moléculas Fab se difunden a través de la membrana de nylon en la membrana PVDF, en donde los Fab de enlace al antígeno TT serán retenidos en la membrana. e. Detección Las membranas de nylon se removieron y las membranas de PVDF se lavaron 2 x 5 minutos con PBS-T (PBS, Tween 20 al 5%) . Las membranas se incubaron por 30 minutos con M-PBS al 2%. Las membranas PVDF se lavaron 2 x 5 minutos con PBS-T, seguido por incubación por 1 hora con IgG/HRP anti-humano de cabra (Sigma, St . Louis, MO, USA, cat. No. A0293) , 1:100.000 diluido en M-PBS al 2%. Las membranas se lavaron 3 x 5 minutos con PBS-T. Finalmente, las membranas PVDF se incubaron por 5 minutos con sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Femto (Pierce, Rockford, TI, USA, cat. No. 34095) de conformidad con las instrucciones del fabricante . El exceso de sustrato se removió y las membranas PVDF se colocaron bajo una cámara CCD para detección de la señal quimioluminiscente generada en posiciones en la membrana PVDF en donde un fragmento Fab se enlaza al antígeno TT. Los clones que se enlazan al antígeno TT positivo aparecerán como puntos en la imagen. El clon bacteriano original es subsecuentemente recuperado de las placas maestras originales. Se preparó el ADN plásmido de los clones Fab positivos del antígeno aislado, generando una sub-biblioteca de expresión Fab cognado de clones que se enlazan al antígeno TT. f. Correlación entre Clones que se Enlazan al Antígeno y Clones que Expresan Fab Las membranas de nylon removidas en la etapa e, se colocan en una segunda serie de membranas PVDF revestidas con anticuerpo de cadena anti-ligera o anticuerpo anti-Fab de conformidad con el procedimiento en la etapa b. La etapa D y e son entonces repetidas. Los clones Fab positivos entonces aparecerán como puntos en la imagen y se puede hacer una correlación entre el número de clones que se enlazan al antígeno TT y el número de clones que expresan Fab.

Ej emplo 8. Ej emplo Ilustrativo que Describe el Aislamiento de Secuencias que Codifican una Proteína Heteromérica . El presente ej emplo ilustra como una proteína (proteína G) se enlaza al nucleótido de guanina trimérica puede ser aislada en una etapa única utilizando la técnica de TI -RCP de traslape-extensión múltiple de la presente invención . La familia de las sub-unidades de la proteína G es larga, solo en humanos que son de aproximadamente 16 diferentes sub-unidades alfa, 5 sub-unidades beta y 12 sub-unidades gamma. Para el presente ejemplo se eligen la sub-unidad GaS (GenBank No. de acceso X04408) , sub-unidad Gßl (GenBank No. de acceso AF501822) y sub-unidad G l (GenBank no. de acceso BC029367) . El procedimiento de enlace se ilustra en la Figura 13 , en donde la etapa 1 es la etapa de TI -RCP de traslape-extensión múltiple y la etapa 2 es la amplificación adicional del producto enlazado . a . Células Una población de células de hígado humano es obtenida de muestras de desecho quirúrgico. Las células del hígado se desintegraron y sometieron a lisis, el ARN total se aisló de lo lisado usando un kit de ARN L (Macherey - Nagel, Duren, Alemania, cat. No. 740 962.20), de conformidad con las instrucciones del fabricante . b. TI-RCP de traslape-extensión múltiple El kit de TI-RCP de una etapa Qiagen (Qiagen cat. No. 210212, Hilden, Alemania) se usó para TI-RCP de traslape-extensión múltiple esencialmente de conformidad con la recomendación del fabricante. Cada tubo de RCP contiene, en un volumen total de 50 µl, los siguientes reactivos: 1 x amortiguador TI-RCP de una etapa, dNTP en una concentración final de 400 µM de cada una, Mezcla del cebador de traslape-extensión múltiple en las concentraciones como se indica en la Tabla 10, 2 µl de mezcla de la enzima TI-RCP de una etapa, 1 U/µl del inhibidor RNase (RNasin, Promega, Madison USA, cat. No. N2515) , y 50 ng de ARN total. La mezcla del cebador de traslape-extensión múltiple usada, comprende los cebadores mostrados en la tabla 10. Tabla 10 Secuencias capitalizadas que corresponden a la region específica del gen.

Las condiciones de ciclización usadas son: Transcripción inversa: 30 min 42 °C Activación de polimerasa: 15 min 95°C transcriptasa inversa de inactivación y polimerasa Taq de activación. Reacción RCP Desnaturalizado 30 s 94°C Templado 30 s 49°C r 45 ciclos Prolongado 3 min 72°C Extensión final 10 min 72°C c. Amplificación de RCP Un microlitro del producto de la reacción TI-RCP de traslape-extensión múltiple es sometido a una etapa de amplificación RCP adicional (Biotaq kit, Bioline, UK, cat. No. BIO-21040) esencialmente como se propone por el fabricante. Los cebadores usados son al y ?2 como se muestra en la tabla 10 que corresponde a la SEC ID NO: 80 y 85. El volumen total de la reacción es 50 µl . Las condiciones de ciclización son como sigue: Desnaturalizado 30 s 95°C Templado 30 s 53°C - 25 ciclos Prolongado 3 min 72°C Extensión final 10 min 72°C Cinco microlitros del producto de reacción se analizaron por electroforesis de gel de agarosa al 1% usando bromuro de etidio para detección. El tamaño de producto es esperado ser 2215 pb. Sin embargo, fragmentos no unidos adicionales de las sub-unidades pueden estar presentes. Los tamaños esperados de estos fragmentos son Ga: 1228 pb, Gß: 1064 pb y G?: 262 pb. d. Clonación El producto de reacción que permanece se sometió a electroforesis de gel de agarosa al 1% usando bromuro de etidio para detección y el fragmento de traslape-extensión de 2215 pb se escindió del gel de agarosa, se purificó usando un kit Qiaex II (Qiagen, Hilden, Alemania, cat . No. 20051) y se insertó en pCR2.1-TOP0 usando el kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Invitrogen cat . No. 45-0641, Carlsbad, CA, USA) . Además, las secuencias del promotor o los sitios que se enlazan al ribosoma pueden ser insertados corriente arriba de cada secuencia que codifica la sub-unidad para facilitar su expresión del vector. Los sitios de restricción presentes en las secuencias de traslape- extensión son aplicables para tal inserción . e. Consideraciones Generales El enlace de subunidades que codifican las secuencias que constituyen una proteína heteromérica, como se describe anteriormente, puede ser realizado para la mayoría de las proteínas heteroméricas en donde se conoce la secuencia de subunidades individuales. Sin embargo, cuando utiliza una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple capaz de amplificar varios elementos de una familia particular, por ejemplo, todas las sub-unidades a-, ß- y ? de proteína G, es posible identificar y enlazar cualquier combinación de sub-unidades de un tipo celular sin que el primero tenga que analizar cuales elementos de familia son expresados por aquél tipo celular. Por ejemplo, el ejemplo anterior puede ser realizado utilizando una plantilla derivada de células de hígado únicas aisladas que emplean una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple capaz de amplificar y enlazar todas las sub-unidades 16 Ga con las sub-unidades 5 Gß y sub-unidades 12 G?, con ello identificar cual combinación de sub-unidades son expresadas en cada célula y simultáneamente aislar las secuencias codificantes responsables para tal combinación de sub-unidades. Además, el uso de cebadores degenerados podrá aún servir para identificar nuevos elementos de una familia particular. Cuando se enlazan las subunidades de una proteína heteromérica usando la técnica de TI-RCP de traslape-extensión múltiple de la presente invención, se debe considerar el tamaño total del producto enlazado, puesto que existen límites al número de pares base de una polimerasa de ADN. La polimerasa Deep Vent de New England Biolabs, MA, USA es una polimerasa de ADN capaz de generar extensiones del cebador muy largas, de hasta 14,000 pb en longitud. Teóricamente, 14,000 pb pueden codificar una proteína con un peso promedio de 510 kDa. De este modo, es posible aislar secuencias codificantes por proteínas heteroméricas muy largas utilizando el método de la presente invención. La capacidad de extensión puede posiblemente ser incrementada aún además utilizando mezclas de polimerasa de ADN. Ejemplo 9: Diseño de Cebadores Líder: En este ejemplo, se diseñó una serie múltiple de cebadores en los cuales el sitio de cebado se mantiene en la secuencia que codifica la región líder de las familias de cadena ligera kappa y cadena pesada de anticuerpo humano. Cuando se usan cebadores para templar a las secuencias que codifican el N-terminal de las familias de la región variable, se puede observar algún grado de hibridación cruzada. Cebadores de una secuencia de familia del gen particular pueden hibridizar al ADNc de otra familia del gen, la cual en muchos casos, causa la creación de nuevas secuencias . Proteínas producidas de tales secuencias son potencialmente inmunogénicas cuando se usan en el tratamiento. Generalmente, estas nuevas secuencias pueden ser corregidas por RCP, o eliminadas de la biblioteca. Una solución alternativa, es poner el sitio de refuerzo en la secuencia que codifica la región de péptido líder de la región variable del anticuerpo. Secuencias de híbrido, generadas como un resultado de cebado cruzado, serán eliminadas durante el proceso intra-celular del anticuerpo, en el cual el péptido líder que contiene las secuencias inmunogénicas potenciales será desdoblado, y por lo tanto, no estarán presentes en el producto del anticuerpo secretado. Series previas de cebadores líder para clonación del anticuerpo, han sido localizadas en el extremo 5' de la secuencia que codifica al líder, permitiendo la expresión eucariótica directa (Campbell M. J. et al. 1992 Mol Immunol . 29, 193-203). Desafortunadamente, los péptidos líder eucarióticos son poco adecuados para el proceso procariótico. Es posible la facilidad por la cual las secuencias de ácido nucleico son manipuladas en la bacteria, haciendo atractivo desarrollar sistemas de clonación en los cuales, las secuencias de lanzadera entre los vectores bacterianos y vectores de otros organismos hospederos. Por lo tanto, una serie de cebador múltiple, en la cual el sitio de cebado se mantiene en una posición en la secuencia que codifica la región líder, que permite la expresión funcional de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en sistemas de expresión tanto eucarióticos como procarióticos, fue diseñado en el presente ejemplo. El requisito de secuencia para desdoblamiento de péptidasa señal en la región C-terminal de cualquier péptido líder, parece muy similar para sistemas procariotas y ecurariotas (Nielsen H. et al. 1997 Protein Eng. 10, 1-6). Además, sigue que las mutaciones en la región C-terminal del péptido líder es probable tengan efecto en la conformación de la región N-terminal y vice versa. Así, se espera que las secuencias C-terminal puedan ser transferibles entre las especies sin pérdida de función. El concepto básico del diseño del cebador en el presente ejemplo, fue colocar el sitio de cebado en los seis últimos codones de la región C-terminal del péptido líder. La parte restante de la secuencia que codifica al líder, corriente arriba del sitio de cebado (aproximadamente 50 nucleósidos) , debe ser proporcionada por el vector de expresión apropiado igualando las especies hospederas . Por ejemplo, vectores adecuados para expresión en la bacteria gram negativa pueden ser designados con una secuencia líder PelB de longitud completa o parcial. Para expresión de anticuerpos en eucariotas, un vector con una secuencia que codifica al líder de cadena pesada del anticuerpo nativo parcial y una secuencia que codifica al líder de cadena kappa variable parcial, será adecuado. Con respecto al sistema de expresión, los seis últimos aminoácidos del líder, se originarán de la secuencia que codifica al líder de anticuerpo endógeno contenido en el segmento de ácido nucleico insertado en el vector. Las siguientes secuencias de cebadores se designaron para uso en la TI-RCP de traslape-extensión múltiple (tabla 11) . Sin embargo, los extremos traslapados (letras escritas en minúscula) pueden fácilmente ser designados nuevamente para función en el enlace por procedimientos de ligación o recombinación. Tabla 11 M=A/T, R=A/G; Y=C/T, S=G/C. Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Se debe notar que los sitios de restricción en este diseño de cebador ligeramente modificado, se comparan con los cebadores descritos en los ejemplos previos. Así, la secuencia de traslape entre las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y cadena pesada que comprende un sitio de restricción Notl y Nhel, y en el cebador kappa constante ( CLk) , el sitio Notl previo se ha intercambiado con un sitio Ascl. La última modificación debe por supuesto, ser observada cuando se diseñan los cebadores para la amplificación de RCP adicional. Además, el sitio Notl en el vector de clonación, mostrado en la Figura 11, debe ser cambiado a un sitio AscI, y el sitio AscI en la unidad promotora debe ser cambiado a un sitio Notl . La funcionalidad con respecto al desdoblamiento líder se ha probado in si l i co usando SignalP proporcionado por CBS de la Danish Technical University . Los péptidos líder quiméricos probados para la cadena pesada variable, se codificaron por las secuencias de ácido nucleico compuestas de una secuencia PelB truncada, un sitio Notl C-terminal (SEC ID NO 100: ATG AAA TAT CTT CTA CCA ACÁ GCG GCA GCT GGA TTA TTG GCG GCC GCC) , y en asociación con el sitio Notl de la parte específica del gen de una de SEC ID NO 86 a 92, que codifica los seis aminoácidos C-terminal de los elementos de la familia VHL nativa.

Todas las siete secuencias mostraron desdoblamiento de péptido señal en la bacteria gram negativa, usando el programa SigmalP. Los péptidos líder quiméricos probados para la cadena ligera variable, fueron codificados por secuencias de ácido nucleico compuestas de una secuencia PelB truncada, un sitio Nhel C-terminal (SEC ID NO 101: ATG AAA TAT TTG CTA CCA ACÁ GCG GCA GCT GGA TTA TTG TTA CTA GCG) , y en asociación con el sitio Nhel de la parte específica del gen de una de SEC ID NO 93 a 98, que codifica los seis aminoácido C-terminal de los elementos de la familia L L nativa. Todas las seis secuencias muestran desdoblamiento de péptido señal en una bacteria gram negativo, usando el programa SigmalP. Las secuencias de la SEC ID NO 100 y 101 son adecuadas para la construcción de un vector de expresión bacteriano similar a uno ilustrada en la Figura 11, en que el sitio AscI ilustrado en la figura 11 es sustituido con la SEC ID NO 100 y el sitio Nhel es sustituido con la SEC ID NO 101. Además, el sitio Notl ilustrado en la figura 11 necesita ser sustituido por un sitio Ascl. El vector de expresión de mamífero (Figura 9) puede igualmente ser re-designado para permitir la expresión en células de mamífero después de la transferencia de los segmentos que codifican la región variable, a partir del vector bacteriano simplemente descrito. Ejemplo 10. Un Tubo de TI-RCP Múltiple y Enlace por Ligación El presente ejemplo ilustra como una región variable de cadena pesada enlazada que comprende un par cognado y secuencias que codifican la región variable de cadena ligera, pueden ser generadas en un tubo de reacción único usando ligación en lugar de RCP de traslape-extensión, para obtener enlace. a. TI-RCP múltiple Una línea celular producida en el hospedero que expresa las moléculas Fab con especificidad hacia el Toxoide Tetánico, se distribuye limitando la dilución para obtener una célula única en un tubo de RCP único. Además de la célula única, cada tubo de RCP contiene los siguientes reactivos en un volumen total de 20 µl : 1 x de amortiguador Phusion HF dNTP en una concentración final de 200 µM cada uno Mezcla de cebador múltiple en las concentraciones como se indican en la tabla 12 0.8 U de polimerasa Phusion (FinnZymes Cat. No. F-530-L) 1 µl de transcriptasa inversa Sensiscript (Qiagen Cat. No. 205213) 20 U de inhibidor Rnase Tabla 12 W=A/T, R=A/G, S=G/C. Secuencias capitalizadas que corresponden a la región. Las condiciones de ciclización son: Transcripción inversa 30 min 37 °C Desnaturalizado 30 s 98 °C Desnaturalizado 10 s 98°C Templado 30 s 55°C - 40 ciclos Prolongado 30 s 72 °C Extensión final 5 min 72 °C b. Enlace por ligación Para realizar el enlace por ligación, se agregaron ligasa y enzimas de restricción directamente a los productos de reacción TI-RCP múltiple. Alternativamente, la TI-RCP múltiple puede ser purificada previo a esta adición para liberar la mezcla de la polimerasa. Se agregan los siguientes reactivos a cada tubo en un volumen total de 40 µl : lx de amortiguador NEBÍI 1 mM de ATP 50 U de Xbal (New England Biolabs Cat. No. R0145L) 25 U de Spel (New England Biolabs Cat. No. R0133S) 100 µg/ml de BSA 400U de ligasa de ADN T4 (New England Biolabs Cat. No. M0202S) La reacción se incubó a 16 °C durante la noche. Las secuencias que codifican regiones variable de cadena ligera y cadena pesada enlazada se purificaron de la reacción por electroforesis de gel y se escindieron de la banda de aproximadamente 1000 pb. En una versión alternativa de este método, la reacción TI-RCP múltiple se realizó con un cebador CH en lugar de los cebadores JH en la serie de cebador múltiple.

Este cebador puede ser ya sea equipado con un extremo de clonación que permite la inserción en la estructura de la región variable de cadena pesada en el vector de expresión, o una TI-RCP semi anidada puede ser realizada con los cebadores de la tabla 5. Ejemplo 11. Generación de una inmunoglobulina policlonal recombinante con especificidad hacia el Toxoide Tetánico En el presente ejemplo, se usan los resultados de un donador único (TT03) inmunizado con Toxoide Tetánico, para ilustrar las etapas resumidas en los esquemas de flujo en la Figura 10. a. Donadores Ocho donadores los cuales previamente se han inmunizado con la vacuna Tetánica se reforzaron con vacuna Tetánica (Statens Serum Institut, Dinamarca) . Los donadores se asignaron con números TT01 a TT08. Seis días después del refuerzo de la vacuna Tetánica se tomó una muestra sanguínea de aproximadamente 200 ml de los donadores en un tubo que contiene anticoagulante. Los donadores son saludables sin infecciones crónicas, enfermedad autoinmune, o medicación inmunosupresiva y no han tenido alguna vacunación dentro de al menos 3 meses . a-1. Monitoreo de calidad del donador Los pre-sangrados de los donadores se tomaron al tiempo de inmunización. Catorce días después, se tomaron sangrados adicionales para determinar el titulador del suero. Todos los donadores responden con un incremento en el titulador TT. Un ensayo ELISPOT también se estableció para medir la frecuencia de las células de plasma específicas TT. Pueden ser usadas diferentes fracciones celulares para el ELISPOT, por ejemplo, el sangrado principal del día 6, la fracción PBMC, la fracción seleccionada magnética, o la fracción seleccionada por FACS. El ELISPOT puede ser usado para evaluar el material donador y para identificar los mejores respondedores, los cuales pueden entonces proceder a través de la etapa de clasificación y TI-RCP de traslape-extensión múltiple. Para el donador TT03, se realizó un ELISPOT usando la fracción celular CD19+ (véase sección c) . Se realizó el ensayo ELISPOT como se describe por Lakew (Lakew, M. et al., 1997. J. Immunol . Methods 203, 193-198) con modificaciones menores . La frecuencia de las células de plasma específica de TT, se calculó en las fracciones PBMC a 0.021%. b. Preparación de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) Se aislaron las PBMC de la muestra de sangre usando Lymphoprep (Axis-Shield PoC AS, Noruega, prod. No. 1001967) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, la sangre se diluyó 1:1 en PBS y esta suspensión se estratificó sobre Lymphoprep en una relación 2:1. Los viales se centrifugaron por 20 minutos, 25 °C a 800 g y se colectó la banda de fase interna blanca. Las células se lavaron en PBS que contiene 2 mM de EDTA. A partir de 200 ml de la muestra de sangre completa del donador TT03, se obtuvieron aproximadamente 2 x 108 de PBMC. c. Enriquecimiento de células B El linaje de células B (células CD19+) de las PBMC se enriqueció por selección celular por perlillas magnéticas usando el siguiente procedimiento. Las PBMC aisladas se tiñeron con anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 345776) . Todas las etapas se realizaron a 4°C en la oscuridad. El teñido de realizó con 19 µl de anti-CD19-FITC pr. 1 x 106 células en un volumen de 100 µl por lxlO6 células usando amortiguador M (PBS, pH 7.2, BSA al 0.5%, 2 mM de EDTA). Esto teñirá el linaje de células B de las PBMC. Las células se incubaron por minutos seguidas por dos etapas de lavado con amortiguador M. Las células teñidas anti-CD19-FITC se etiquetaron magnéticamente con microperlillas conjugadas anti-FITC, usando 10 µl de perlillas magnéticas anti-FITC (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, cat. No. 130-401) por IxlO6 células en un volumen de 100 µl del amortiguador M por 1 x 106 células. La incubación se realizó por 15 minutos seguida por una etapa de lavado con amortiguador M. Las células se suspendieron nuevamente en amortiguador M desgasificado. Se pre-trató una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, cat. No. 130-042-401) con amortiguador M desgasificado de conformidad con las descripciones del fabricante. La suspensión de células teñidas con anti-CD19-FITC y etiquetadas con perlillas magnéticas anti-FITC se aplicó a la columna y se dejó correr a través de esta. Las células teñidas y etiquetadas (CD19+) se retuvieron en campo magnético alrededor de la columna mientras las células no teñidas (CD19- pasaron a través de la columna. La columna se lavó con amortiguador M desgasificado. El campo magnético se removió y las células CD19+ se colectaron. Se realizó un teñido analítico del material de partida (PBMC) , la fracción sin etiquetar y la fracción etiquetada CD19 a partir de TT03, usando anti-CD19-FITC, anti-CD38-PE y anti-CD45-PerCP (Figura 4) . Esto muestra que la clasificación celular Magnética resulta en dos distintas fracciones comparadas con la fracción PBMC. Las células negativas CD19 se muestran en el panel B y las células positivas CD19 se muestran en el panel C. De la fracción PBMC 11% de las células son CD19+, la extensión de la purificación de la célula positiva CD19 fue 99.5% de Rl (la guía distribuida en la Figura 14C) para TT03. Como se observa en la Figura 14C, el lote anti/CD38/anti-CD45 mostró una población distinta de células CD38hi, CD45in (R2) que corresponden al 1.1% de Rl . Esta población contiene las células de plasma y se colectaron durante la última etapa se selección. Esto indica que en la fracción PBMC, 0.12% de células corresponde a las células de plasma. La fracción de células CD19 positivas se congeló en FCS (Invitrogen, Cat. No. 16000-044) +10% de DMSO (Sigma, cat. No. D2650) para última selección. Un análisis similar a uno observado en la Figura 14 se hizo en las células purificadas MACS que han sido congeladas para asegurarse que las células están intactas (Figura 15) . Los patrones de teñido observados en la Figura 15 son los mismos observados en la Figura 14C a través de una intensidad de teñido ligeramente amplia observada. Las células que se colectaron por clasificación son la sub-serie de Rl y R2. Esto corresponde a aproximadamente 1.1% de las células purificadas MACS. D. Selección de Células de Plasma Lo eluado congelado de la columna MACS se descongeló, centrifugó y suspendió nuevamente en amortiguador FACS (PBS, pH 7.2, 2% de BSA) a una concentración de lxlO6 células/60 µl de amortiguador FACS. Se agregaron anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 3457769(10 µl/106 células), anti-CD38-PE (Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No. 555460) (10 µl/106 células) y anti-CD45-PerCP (Becton Dickenson, NJ, USA), cat. No. 345809) (20 µl/106 células), y la mezcla se incubó a 4°C por 20 minutos en la oscuridad, seguido por lavado dos veces y suspensión nuevamente en amortiguador FACS . Las células se seleccionaron por selección celular activada fluorescente (FACS) usando los siguientes parámetros de activación: 1. Dispersión delantera y dispersión lateral para retener linfocitos y monocitos que incluyen células de plasma y blasters de plasma para evitar muerte celular y células con muy alta dispersión lateral, las cuales pueden ser agregados o granulocitos. 2. Las células que son CD19 positivas y expresan niveles incrementados de CD38(CD38hi) .

Esto es básicamente únicamente una entrada en CD38 puesto que las PBCM han sido enriquecidas en una columna MACS por expresión CD19, pero esto describirá cualquiera de los contaminantes. 3. Células CD45 positivas intermedias. Todos los linfocitos expresan CD45. Sin embargo, las células de plasma regulan descendentemente su expresión CD45, comparada con las etapas de diferenciación de linfocito temprano. Por lo tanto, una población discreta de células que corresponde a células de plasma se puede obtener cuando entran en CD45. Las células seleccionadas FACS del donador TT03, fueron colectadas como la sub-serie de las dos entradas P2 y Pl (Figura 16A y 16B, respectivamente) . Las células son CD38hi (FL2-A) , CD45in (FL3-A) y CD19+, la última debido a la purificación MACS. Brevemente, las células fueron colectadas en volumen, contadas y diluidas en RPMl (Invitrogen, cat. No. 21875-034) que contiene FCS al 10% (Invitrogen, cat. No. 16000-044), 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, cat. No. 15140-122), 2 mM de L-glutamina (cat. No. 25030-024) . Las células fueron entonces dispersadas en cincuenta placas de RCP de 96 cavidades (ABgene, cat. No. AB-0800) con una célula por cavidad en 5 µl de medio. Las placas fueron selladas y congeladas inmediatamente, y se almacenaron para análisis de TI-RCP último. e. Enlace de Pares Cognados de Secuencias que Codifican la Región Variable de Inmunoglobulina Se aplicó la tecnología de TI-RCP de traslape-extensión múltiple a las células únicas obtenidas del donador TT03 , con ello, se logran enlaces cognados de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada del Toxoide anti-Tetánico. e-1. TI-RCP de traslape-extensión Múltiple de Etapa Única Se usó el kit de TI-RCP de una etapa Qiagen (Qiagen cat. No. 210212, Hilden, Alemania) para la TI-RCP de traslape-extensión múltiple esencialmente de conformidad con la recomendación de fabricante. Cincuenta placas RCP de 96 cavidades congeladas que contiene aproximadamente una célula única por cavidad, se removieron del congelador y cuando las células estuvieron libres de cristales de hielo, se agregó 15 µl de la mezcla de reacción TI-RCP inmediatamente a cada cavidad. La mezcla de reacción TI-RCP contiene, en un volumen total de 20 µl los siguientes reactivos: 1 x amortiguador TI-RCP de una etapa dNTP en una concentración final de 400 µM de cada una Mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple en las concentraciones como se indican en la Tabla 13 0.8 µl de la mezcla TI-RCP de una etapa 20 U de inhibidor RNase (RNasin, Promega, Madison USA, cat. No. N2515) La composición de la mezcla del cebador de traslape-extensión múltiple se muestra en la tabla 13.

Tabla 13 W*=A/T, S=G/C, R=A/G, Secuencia capitalizada que corresponde a la región específica del gen. Las condiciones de ciclización son como sigue: Transcripción inversa: 30 minutos 55°C Activación de polimerasa: 15 minutos 95°C transcriptasa inversa inactivada y polimerasa Taq activada.

Reacción RCP : Desnaturalizado 30 s 94 °C Templado 30 s 52 °C 35 ciclos Prolongado 5 min 72 ° C Extensión final 10 min 72 °C e-2. Amplificación adicional Un microlitro del producto de reacción TI-RCP de traslape-extensión múltiple, de cada muestra, se sometió a RCP semi anidada (Biotaq kit, Bioline, UK, cat. No. BIO-21040) , esencialmente como se propone por el fabricante utilizando placas RCP de 96 cavidades (ABgene, cat. No. AB-0800) . El volumen total de cada reacción fue 50 µl, que contiene una concentración final de amortiguador 1 x Biotaq, 200 µM de dNTP (cada uno) 2 mM de MgCl2, 1.25 U de polimerasa Bio Taq y los cebadores se muestran en la tabla 14. Tabla 14 Secuencias capitalizadas que corresponden a la región específica del gen.

Las condiciones de ciclización son como siguen: Desnaturalizado 30 s 95°C Templado 30 s 55°C Prolongado 1.5 min 72°C Extensión final 5 min 72°C Diez microlitros de las muestras de la línea A, cavidad 1-12 de cada placa se analizaron por electroforesis del gel de agarosa al 1.5% usando bromuro de etidio para visualización, para verificar que la TI-RCP de traslápeextensión múltiple es exitosa. El tamaño esperado del fragmento de traslape-extensión es aproximadamente 1070 pb (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables) . La figura 17 muestra las muestras de ocho placas de 96 cavidades. El número promedio de los fragmentos TI-RCP de traslape-extensión exitosos de cincuenta placas de 96 cavidades, se estimó a ocho por placa. Así, el número total de fragmentos TI-RCP de traslape-extensión exitoso se estimó a aproximadamente 400. Diez microlitros de todas las reacciones realizadas, corridas en placas de 96 cavidades, originadas del mismo donador, se consolidaron en un tubo único. Una alícuota que consiste de 200 µl de los producto RCP combinados se purificó subsecuentemente usando el kit de purificación RCP QIAquick de conformidad con el procedimiento del fabricante (Qiagen cat. No. 28106, Hilden, Alemania) usando 60 microlitros de amortiguador EB para elución. La combinación purificada de los productos RCP de traslape se digirió con Xhol y Notl y subsecuentemente se purificó por electroforesis de gel de agarosa al 1% preparativa; los fragmentos de traslape-extensión se escindieron del gel de agarosa y se purificaron usando un kit Qiaex II (Qiagen, cat. No. Hilden, Alemania) . f. Biblioteca de Expresión Fab Cognada Se generó una biblioteca de expresión Fab por un procedimiento de ligación de dos etapas. Inicialmente la combinación de fragmentos de traslape-extensión digeridos descritos anteriormente, se ligó en el vector JSK301 de E. coli digerido con Xhol/Notl (Figura 11) . La reacción de ligación es subsecuentemente transformada en células de E. coli electrocompetentes (componente de electroporación XL1-Blue, Stratagen, cat. No. 200228, La Jolla, USA), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las células de E. coli transformadas se colocaron en 2x YT de agar que contiene 100 µg/ml de carbenicilina. La biomasa que corresponde a aproximadamente 1010-101:L células que se originan de un número de colonias independientes que excede al menos 5 veces el número total de productos se RCP de traslape, se usó como material de partida para preparación de plásmido usando el kit Maxi de preparación de Plásmido Qiagen (Qiagen, cat. No. 12163, Hilden, Alemania). Para permitir la expresión de las secuencias que codifican VH y VL enlazados cognados clonados, un promotor procariótico y un cásete líder se insertó en una segunda etapa de ligación. El fragmento promotor bi-direccional usado (SC ID NO 321) se extrajo del JSK301 original por digestión Ascl/Nhel. La combinación purificada de plásmidos fue igualmente digerida con endonucleasas de restricción Ascl/Nhel y purificada en gel como previamente se describe. Los fragmentos purificados fueron subsecuentemente ligados y transformados en células de E. coli electrocompetente (TGl, Stratagene, cat. No. 200123, La Jolla, USA) y se colocaron en placas en 2xYT agar que contiene 100 µg/ml de carbenicilina y glicosa al 1%. El proceso de generación de biblioteca de expresión Fab es resumido en la Figura 12. g. Selección de Clones Se seleccionaron clones que expresan Fab para enlace al antígeno TT por ensayos ELISA específicos del antígeno. g-1. Generación de Placa Maestra y Expresión de Fab Colonias seleccionadas individuales de las células TGl, cada una alberga un vector de expresión Fab cognado de la biblioteca generada como se describe en la sección (f) se escogieron en cavidades únicas de placas de 96 cavidades que contienen 2 x YT/100 µl/ml Carb/glucosa al 1%. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C con agitación suave. Cuatro placas de 96 cavidades se consolidaron en las cavidades de una placa de 384 cavidades, que contiene 2 x YT/100 µg/ml Carb/glucosa al 1%, usando replicador de 96 dientes. Las placas de 384 cavidades se incubaron durante el día a 37 °C. Las placas se refirieron como placas maestras, y se almacenaron a -80 °C después de la adición de glicerol a una concentración final de 15%. Las placas maestras fueron usadas para inoculación de placas de 384 Cavidades Profundas que contienen 2 x YT/100 µg/ml Carb/glucosa al 0.1% usando un replicador de 96 dientes . Las placas se sellaron y se incubaron por 2 - 3 horas a 37 °C con agitación. La expresión se indujo agitando un volumen igual de 2 x YT/100 µg/ml Carb/0.2 mM de IPTG, obteniendo una concentración final de IPTG de 0.1 mM. Las placas se sellaron e incubaron durante la noche a 30 °C con agitación. El siguiente día, los sobrenadantes que contienen Fab se analizaron para especificidad de enlace al antígeno TT por ELISA. g-2. Análisis ELISA Placas ELISA de trescientas ochenta y cuatro (384) cavidades (Corning Inc. Corning, NY, USA, cat. No. 3700) y se revistieron durante la noche a 4°C con antígeno Toxoide Tetánico (TT) , se diluyeron a una concentración final de 1 µg/ml en PBS en un volumen de 25 µl por cavidad. Se bloqueó el exceso de sitio de enlace de las cavidades por 1 hora a temperatura ambiente (RT) , agregando M-PBS al 2% (2% de polvo de leche desnatada en PBS, Tween 20 al 0.05%). Las cavidades se lavaron 2 veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0.05%) . Los sobrenadantes bacterianos que contienen Fab de la sección (g-1) se diluyeron 1:2 en M-PBS-T al 2% y se transfirieron a las cavidades ELISA por duplicado. La inoculación se realizó por 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron 4 veces con PBS-T. Se agregó Fab/HRP anti-humano de cabra (Sigma, St . Louis, MO, USA, cat. No. A0293) dilución 1:10.000 en M-PBS-T al 2% a las cavidades. La incubación se realizó por 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavaron 4 veces con PBS-T. Se agregó el sustrato TMB Plus (KemEnTec, Copenhagen, Dinamarca, cat. No. 4390L) y la incubación se realizó por 5 - 15 minutos. Las reacciones se detuvieron agregando un volumen igual de ÍM de H2S04, y se analizaron usando un espectrómetro a 450 nm (Multiscan Ascent, Labsystems, Franklin, USA) . Los clones bacterianos originales que corresponden a clones que enlaza el antígeno TT pueden subsecuentemente, ser recuperados de las placas maestras originales. El ADN plásmido puede ser preparado de los clones fab positivos del antígeno aislado, generando una sub-biblioteca de expresión fab cognado de clones que se enlazan al antígeno TT. Una sub-serie de los clones además se analizó por un ensayo ELISA anti-kappa, para lograr una correlación entre el número de clones que se enlazan el antígeno y el número de clones que expresan fab. El ensayo anti-kappa fue generalmente realizado como el ensayo TT, excepto que las cavidades se revistieron con una dilución 1:1000 de anticuerpo kappa anti-humano (Caltag, California, USA, Cat. No. H16000), usando un amortiguador de carbonato, pH 9.6. g-3. Resultados de Selección Los clones de cuatro placas de 384 cavidades se seleccionaron por reactividad con Ab anti-kappa y ensayos ELISA usando TT de conformidad al procedimiento descrito en g-2. Los resultados obtenidos son resumidos en la tabla 15 hasta 19. Los resultados ELISA anti-kappa informan acerca de la expresión de fragmentos Fab en un clon dado, los resultados de ELISA TT informan acerca de la funcionalidad de los fragmentos Fab. Tabla 15. Selección ELISA, anti-kappa de cabra (1440 clones en total) De 1440 clones únicos analizados, 482 clones o 34% exhibieron reactividad anti-Kappa a un nivel que excede la reactivad 2 x antecedente. 395 clones o 27% de los clones mostraron reactividad sobre 3 x antecedente, etc. Los mismos clones se analizaron por reactividad del antígeno TT por ELISA, y los resultados se dan en la tabla 16 abajo: Tabla 16. Selección ELISA, TT de cabra (1440 clones en total) De esta tabla, se observa que 9. 0% de clones muestran reactividad con TT a 2 x antecedente (definido como la señal obtenida por la reactividad de un fragmento Fab con una especificidad irrelevante) . 104 clones reaccionaron a 3 x antecedente (7 . 2% ) etc . De estos clones positivos Fab (482 clones en total) , aproximadamente 27% de los clones (130/482) exhibieron reactividad con TT al nivel 2 x antecedente. Este nivel no cambia significantemente con los otros niveles de antecedente .

Seis placas de 384 cavidades se seleccionaron para clones con reactividad TT. El número de clones que da origen a la reactividad con el antígeno se muestra en la Tabla 17. No se llevó a cabo ELISA anti-kappa con estas placas. Tabla 17. Selección ELISA, TT de cabra (2160 clones en total) El porcentaje de clones positivos TT en placas G054 - G059, fue comparable con aquel encontrado en placas G050 -G053 (tabla 16) . Los resultados de todos los clones seleccionados contra TT (tabla 16 y 17) se resumen en la tabla 18. Tabla 18. Selección de todos los clones, clones reactivos TT En resumen, un total de 339 clones muestran reactividad con TT al menos a niveles de 2x antecedente (tabla 18). Esto corresponde a 9.4% de total de clones seleccionados . Todos los clones positivos que exhiben reactividad con TT a 2 x antecedente se incubaron en placas de 96 cavidades como previamente se describe, de la placa maestra. Al siguiente día, la bacteria se colectó por centrifugación a 4000 rpm por 15 minutos, y la pelotilla se suspendió nuevamente en 0.8 mM de EDTA, 0.4 x PBS, 0.8 M de NaCl, y se incubó en hielo por 15 minutos . El extracto periplásmico se colectó por centrifugación, y la reactividad de los clones se analizó adicionalmente. Se muestran resultados de una placa (G060) para reactividad con anti-Kappa (Figura 18) , Ovalbúmina (antígeno no relacionado) (Figura 19) , TT (figura 20) , y un ensayo competitivo de una etapa usando 10~7 M de concentración del antígeno TT en solución (Figura 21) . Estos ensayos ELISA se realizaron en el mismo extracto periplásmico, en la misma dilución. La mayoría de los clones expresan fragmentos (90/96) (Figura 13) , y clones sin reaccionar con Ovalbúmina (Figura 19) . La reactividad con TT inmovilizado se redujo o completamente inhibió por TT en solución (Figura 21) , indicando que los clones reaccionan específicamente con TT. La reactividad de los clones en la placa G060 se resume en la tabla 19.

Tabla 19. Resumen de la placa G060 (96 clones en total) h. Diversidad de análisis y aprobación del clon El plásmido aislado de 47 clones (de la placa G060) de la sub-biblioteca de expresión Fab de enlace al antígeno TT cognado, se sometió a análisis de secuencia. Las secuencias que codifican la cadena pesada variable se secuenciaron usando el cebador LSN-HCP: AGGAAACAGGAGATATACAT (SEC ID NO 131), templando al promotor ta c P, y las secuencias que codifican la cadena ligera se secuenciaron usando en cebador LSN-LCP: TCGCCAAGGAGACAGTCATA (SEC ID NO 132), templando al promotor l a c P. Los datos de secuencia se analizaron usando el software Vector NTI (Informax, Frederick, MD, USA) . Los datos de secuencia resultantes de la cadena pesada se reescindieron a un par base al 5' del sitio de restricción AscI corriente arriba e inmediatamente al 3 ' del sitio de restricción Xhol corriente abajo. Los datos de secuencia de cadena ligera se reescindieron al segundo par base al 5' del sitio de restricción Nhel corriente arriba y al 3' del último codón "AAA" que codifica la lisina C-terminal de cadena variable. El recorte se realizó para facilitar el análisis adicional tal como traducción de cada secuencia de ADN. Las secuencias que codifican la cadena ligera y pesada variable se analizaron por el empleo del gen de línea germinal, comparando las secuencias para la base de datos de la secuencia de región variable de la línea germinal de base V (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) . El alelo de la línea germinal más cercanamente relacionado, fue así determinado para cada secuencia que muestra un repertorio del gen V que se origina de 12 diferentes alelos de línea germinal de cadena pesada variable que pertenecen a la familia VH, VH1 hasta VH5 y 8 diferentes alelos de línea germinal de cadena pesada kappa variable que pertenecen a VLI , VKIII y VLIV (Tabla 20) . Además, las secuencias del gen variable se tradujeron en secuencias de proteína las cuales se alinearon usando el software AlignX (Informax, Frederick, MD , USA) como se describe en la Figura 22 y Figura 23. Basada en las alineaciones de secuencia de la proteína, las secuencias de cadena variable deben ser categorizadas en grupos de conformidad a eventos de reacomodos V(D)J, designados con H para la secuencia de cadena pesada variable y L para la secuencia de cadena kappa variable seguido por un número único. En cada grupo de reacomodo, las secuencias se categorizaron de conformidad al genotipo de maduración (tipo M en la tabla 20) dentro de las regiones CDR1, 2 y 3, representados por una letra mayúscula en orden alfabético. Siete de los clones tienen codones de detención prematuros, de los que 6 clones fueron una mutación ámbar (TAG) (clon IDs g060:bl2, d08, f06, cl2, f03, c04) y 1 clon fue una mutación opal (TGA) (clon ID g060: hl2) . Estos codones son más probablemente suprimidos por E. coli, resultando en fragmentos fab funcionales . Cuatro de estos codones son elementos de grupos que contienen clones similares que los hace redundantes. Adicionalmente, los clones serán analizados para reemplazar los 3 clones restantes con codones de detención prematuros, como son elementos únicos de sus grupos. De forma alternativa, las secuencias deben ser corregidas por técnicas de biológica molecular estándar tal como RCP, reemplazando el codón de detención con un codón apropiado.

Las 47 secuencias de región V analizadas, deben ser divididas en 20 grupos de reacomodo V(D)J únicos ("grupos" designados en la tabla 20) ambos para el gel kappa variable y pesada variable. Cuatro de los grupos de reacomodo deben ser además divididos en 1 a 4 tipos de maduración (a hasta d) , resultando en 27 secuencias que codifican el anticuerpo único (Tabla 2) . Generalmente, grupos de reacomodo de cadena pesada específica se combinan con grupos de reacomodo de cadena ligera específica (por ejemplo, Hl con Ll, H12 con L24 y así sucesivamente) . Además, el tipo de maduración igualado entre pares de secuencias codifica la cadena ligera variable y la pesada variable (por ejemplo, H4c igualado con L13c) . Tal restricción en apareamiento entre grupos de reacomodo y tipos de maduración, indica apareamiento de las secuencias que codifican la región variable. Sin embargo, el grupo H4 de reacomodo de cadena pesada es una excepción. Pares H4 con dos cadenas L28 y L13 ligeras diferentes. L13 es única para H4 , comprendiendo tipos maduración a, b y c que se igualan con tipos de maduración L13. L28, por otro lado, también se encontró apareado con el elemento único en el grupo H2 de cadena pesada. Dos de siete pares de secuencias de cadena pesada H4a con L13a de cadena pesada y cinco de siete pares de secuencias de cadena pesada H4a con L28a. En resumen, estas observaciones sugieren una TI-RCP de traslape-extensión múltiple aún en donde estuvieron presentes dos células de plasma producen anticuerpo específico TT, con las combinaciones H2-L28 y H4a-L13a de genotipo, en una cavidad única. Eventos de aleatorización raros de apareo del gen de cadena pesada y cadena ligera, tales como para H2 y H4a con L28, fueron esperados conforme el experimento se basó en diluciones limitantes de células de plasma. La identidad de secuencia entre pares cognados individuales de las secuencias que codifican la cadena ligera variable y cadena pesada variable del mismo grupo y el tipo de maduración, es al menos 90% y preferiblemente al menos 95%. Tomando por ejemplo g060g03 y g060a01 del grupo de maduración Hl tipo a. El clon g060g03 corresponde a la SEC ID nucí., par 168:215, en donde la secuencia que codifica la cadena pesada variable corresponde a la SEC ID NO 168 y las secuencias que codifican la cadena ligera variable corresponden a la SEC ID NO 215. El clon g060a01 corresponde al apareamiento SEC ID NO nuclear 133:180. Cuando la SEC ID NO 168 es alineada con la SEC ID NO 133 (las cadenas pesadas variables) 4/369 bases no son idénticas y para las cadenas ligeras variables (SEC ID NOs. 215 y 180) 8/327 bases no son idénticas, esto corresponde a una identidad de secuencia de 98.3% entre estos dos pares cognados (g060g03 y g060a01) . Sin embargo, cuando se observa en identidad de secuencia entre grupos diferentes, no se espera que la identidad de secuencia sea alta, puesto que se desea una sub-biblioteca y diversidad 5 policlonal. En este ejemplo particular, la identidad inferior entre los pares cognados es aproximadamente 40% (por ejemplo, g060bll y g060hll tienen una identidad de secuencia de 39.5%) . Una modalidad de la presente invención es una subió biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican una región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunolgobulina, en donde las inmunoglobulinas obtenidas de dicha biblioteca son capaces de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica. 15 Una modalidad adicional de la presente invención es tal sub-biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende pares cognados individuales con al menos 90% de identidad de 20 secuencia con un apareamiento de SEC ID individual, seleccionado del grupo que consiste de SEC ID 135:182, 168:215, 146:193, 151:198, 173:220, 152:199, 164:211, 148:195, 137:184; 169:216, 138:185, 143:190, 161:208, 166:213, 157:204, 139:186, 134:181, 150:197, 156:203, 25 158:205, 170:217, 178:225, 141:188 ó 144:191. 15881YY00 O ID OO o o 0 IV) o n Asteriscos indican secuencias que codifican V en mezclado. Sec prot., indican números SEC ID de la lista de secuencia que corresponde a las secuencias de proteína y Sec nucí., indican números SEC ID que corresponden a la secuencia de ácido nucleico en la lista de secuencia i. Afinidades aparentes Se preparó un ensayo de competición, para determinar la afinidad aparente o IC50 de coles seleccionados de la placa G060. Brevemente, los fragmentos Fab se expresaron en 50 ml de cultivos como sigue: 50 ml 2x YT/100 µg/ml carb/0.1% de glucosa, se agregó 0.5 ml de cultivo durante la noche, y se agitó aproximadamente 2 horas a 37 °C. Se agregó IPTG a una concentración final de 0.1 mM, y la agitación continúo durante la noche a 30 °C. El siguiente día, la bacteria se colectó por centrifugación a 4000 rpm por 15 minutos, y la pelotilla se suspendió nuevamente en 1 ml de 0.8 mM de EDTA, 0.4 x PBS, 0.8 M de NaCl, y se incubó en hielo por 15 minutos . Los extractos periplásmicos se colectaron por centrifugación, y se almacenaron a -20 °C. El ensayo de competición se realizó como sigue: los extractos periplásmicos en diluciones apropiadas estimadas por titulación, se agregaron a una serie de tubos. Se usó como un control positivo el fragmento mp584 de fab derivado de la exhibición del fago, derivado de la línea celular HB8501 de hibridoma humano que expresa un anticuerpo anti-TT. Se agregó TT soluble al primer tubo a una concentración de 100 nM, y subsecuentemente se diluyó en etapas de cuatro veces en los siguientes tubos, elaborando un total de siete diluciones de TT (de 100 nM a 25 pM) . Las reacciones se incubaron por aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente . Las muestras se transfirieron a placas ELISA revestidas con TT a 1 µg/ml y se bloquearon como previamente se describe. Las placas se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente, seguida por 4 x de lavado con PBS-T, se agregó Fab/HRP anti-humano de cabra a una dilución 1: 10.000 y se incubaron por 1 hora. Se agregó el sustrato TMB Plus (KemEnTech, Dinamarca, cat. No. 4390A) , la incubación se realizó por aproximadamente 10 minutos , y la reacción se detuvo con 1M de H2S0 . Las placas se leyeron a 450 nm. Los datos se trazaron en la Figura 24 . Las afinidades aparentes de los clones analizados se dan en la tabla 21 : Tabla 21 Como se observa en la tabla 21 , los fragmentos tienen afinidades aparentes en el intervalo de pico-molar superior y nano-molar inferior. Además, todos los fragmentos Fab apareados cognados exhiben una afinidad aparente superior que aquella del fragmento Fab derivado de la exhibición del fago . j . Sumario En el donador TT03 , la frecuencia de las células de plasma específico TT en la fracción celular de monocito de sangre periférica, se calculó a 0.022%. Aproximadamente 400 pares cognados de generaron de TT03. 3600 clones de las células transformadas con la biblioteca de par cognado se seleccionaron usando ELISA, de estos, 339 clones mostraron reactividad TT de la selección ELISA. 47 de estos clones se han analizado con respecto a su diversidad clonal. De estos 47 clones, 27 probaron parecer secuencias que codifican la región variable no aleatorizada única. Tres de estos clones contienen un codón de detención prematuro que necesitará corrección antes de la transferencia a un vector de expresión de mamífero. La transferencia a vectores de expresión de mamífero se describe en el ejemplo 1 sección h. Las afinidades aparentes fueron medidas en clones seleccionadas, variando desde el intervalo pico-molar superior a nano-molar inferior . k. Prospectos La Toxina Tetánica es una de las sustancias más tóxicas conocidas con una dosis letal de pocos nanogramos. La toxina es producida por Clostridium tetani, una bacteria del suelo también presente en el tracto digestivo de hasta un 25% de humanos. El programa de inmunización tetánica ha efectivamente abolido la enfermedad en el mundo occidental, aunque 100-200 casos son observados aún en la mayoría de los países occidentales anualmente, con una relación caso-fatalidad de 50%. En el mundo desarrollado, el número de casos es significantemente mayor. El crecimiento bacteriano en heridas penetrantes contaminadas puede conducir a liberación de toxina, finalmente conducir a rigidez, espasmos, insuficiencia respiratoria y muerte. Productos de inmunoglobulina hiperinmune aislados de donadores de sangre humana con un titulador alto de respuesta de anticuerpo contra el Toxoide Tetánico, pueden ser usados para prevenir tétanos o si son instituidos tempranamente, para tratar el tétanos establecido, también en conjunto con la inmunización activa. Sin embargo, debido a la escasez del producto humano, se usa el Toxoide anti-Tetánico hiperinmune equino en el mundo desarrollado. Anticuerpos monoclonales o policlonales recombinantes contra Toxoide tetánico tienen potencial para sustituir productos de globulina hiperinmune para uso terapéutico y/o profiláctico. Anticuerpos monoclonales recombinantes originados de la tecnología de hibridoma convencional se han descrito por ser efectivos contra TT (Chin, J. et al., 2003. Biologicals 31, 45-53) . De forma interesante, se observó un efecto sinergístico cuando se mezclaron dos anticuerpos monoclonales. Así, un anticuerpo Toxoide anti-Tetánico policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica, podrá potencialmente, ser muy efectivo en el tratamiento o protección profiláctica de pacientes en riesgo de desarrollar tétanos . Una modalidad de la presente invención es una inmunoglobulina policlonal recombinante o fragmentos de la misma capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica. Una modalidad preferida de la presente invención es una inmunoglobulina policlonal recombinante o fragmentos de la misma, capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica comprendida de pares cognados de región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulina. Una modalidad adicional de la presente invención es una inmunoglobulina policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica obtenida por el método de conformidad con la presente invención. Una modalidad adicional de la presente invención es una inmunoglobulina policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina tetánica que comprende pares cognados individuales de región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con al menos 90% de identidad de secuencia con un par de SEC ID individual, seleccionado entre pares SEC ID 229:276, 262:309, 240:287, 245:292, 267:314, 246:293, 258:305, 242:289, 231:278, 263:310, 232:279, 237:284, 255:302, 260:307, 251:298, 233:280, 228:275, 244:291, 250:297, 252:299, 264:311, 272:319, 235:282 ó 238:285. Otra modalidad de la invención, es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica como ingrediente activo, pensado para el tratamiento o prevención de tétanos. Preferiblemente, el anticuerpo policlonal recombinante es combinado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de una inmunoglobulina policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica como un medicamento para el tratamiento o protección profiláctica de un paciente en riesgo de desarrollar tétanos. Una modalidad adicional es un método de prevención o tratamiento a un paciente en riesgo de desarrollar tétanos administrando a un paciente en necesidad del mismo, una composición que comprende un anticuerpo policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina tetánica. Ejemplo 12. Comparación de resultados obtenidos de dos donadores En los resultados de los siguientes ejemplos obtenidos del donador TT08 se comparan con los resultados obtenidos del donador TT03 en el Ejemplo 11. Los resultados se resumen en la tabla 22.

Tabla 22 NA = no analizado Esto ilustra claramente que bibliotecas de calidad similar deben ser aisladas de dos diferentes donadores inmunizados con TT. Las razones para el número superior de pares cognados únicos en la biblioteca obtenidos del donador TT08, son más probablemente debido al número más grande de secuencias analizadas.

Ejemplo 13: Comparación de la biblioteca de pares cognados del Ejemplo 11 con una biblioteca de exhibición de fago combinatoria, generada del mismo donador. En el presente ejemplo, se preparó una biblioteca de exhibición de fago combinatoria del mismo donador, previamente usado para preparar la biblioteca de pares cognados, para comparar diversidad de biblioteca, afinidad y especificidad entre bibliotecas de pares cognados y bibliotecas combinatoriaes . a. Construcción de biblioteca de fago combinatoria Se generó una biblioteca que exhibe un fago de fracción CD19+ de células del donador TT03 (idéntica a la fracción celular obtenida en el Ejemplo 11c) . El ARN total se preparó de aproximadamente 5 x 105 CD19+ células usando el kit NucleoSpin de ARN L (Machery-Nagel, cat. No. 740 962.20). El ADNc fue subsecuentemente sintetizado en una reacción oligo (dT) -cebador usando transcriptasa inversa ThermoScript (Invitrogen, cat. No. 11146-016) . Las cadenas VH y kappa fueron amplificadas por RCP usando la polimerasa de ADN HotMasterTaq (Eppendorf, cat. No. 0032 002.692) y cebadores esencialmente como se describe por de Haard et al., (J. Biol. Chem. 274, 18218-18230; 1999), únicamente modificado con respecto a secuencias de reconocimiento a enzimas de restricción en el extremo 5' .

Se generó la biblioteca de exhibición de fago combinatoria por inserción sucesiva de productos de RCP Kappa y VH en el vector que exhibe el fago Em351 (modificado de phh3 descrito en den, W. et al., 1999 J. Immunol . Methods 222, 45-57) . La biblioteca final fue electroporada en cepa de E. coli TGl (Stratagen) . El tamaño de la biblioteca combinatoria contiene 3 x 106 clones independientes con una frecuencia de inserto alta. b. Panorámica de la biblioteca combinatoria Se prepararon partículas de fagos que exhibe Fab de conformidad con procedimientos estándares (por ejemplo, Antibody Engineering, A Practical Approach 1996, ed. McCafferty, Hoogenboom y Chiswell) . Se realizó una panorámica en toxoide tetánico (TT; SSI lote no. 89-2) , diluida a 1 µg/mL en PBS, y se inmovilizó en inmunotubos MaxiSorp (Nuc cat. No. 444202). Siguiendo un periodo de incubación de una hora y varias etapas de lavado, las partículas de fago unidas fueron diluidas usando 100 mM de TEA (Trietilamina) . La partícula de fago eluada se neutralizó y se usó para infectar exponencialmente el crecimiento de células TGl, a partir de las cuales se obtuvieron partículas de fago que exhiben Fab enriquecidas para especificidad de TT. Una segunda ronda de panorámicas usando los fagos eluados se realizó siguiendo el procedimiento general resumido anteriormente . En paralelo, se realizaron tres rondas panorámicas en el fragmento C de la molécula de toxina tetánica (Sigma cat. No. T3694) , siguiendo el procedimiento resumido anteriormente . Se seleccionaron colonias únicas para enlace a la toxina tetánica y al fragmento C de la biblioteca no seleccionada, y después de cada ronda panorámica, de ambas series de panorámicas descritas anteriormente. c. Comparación de especificidad y afinidad de clones de partículas de fagos combinatoriaes y clones de pares cognados Se eligieron colonias únicas a partir de la biblioteca no seleccionada y después de cada ronda de panorámicas (en toxoide tetánico (TT) intacto y el fragmento C de toxoide tetánico, respectivamente) . Las partículas del fago que exhibe Fab, fueron analizadas para determinar la reactividad por ensayos ELISA. El número de clones Fab positivos que exhiben TT y/o reactividad del fragmento C de al menos reactividad de 2x antecedente y al menos reactividad de 4x antecedente, se dan en la tabla 23 a 35 abajo. Todos los resultados se muestran como números de clones específicos/números de clones positivos Fab.

Tabla 23: Clones seleccionados en TT y analizados por ELISA específico de TT Tabla 24: Clones seleccionados en TT y analizados por ELISA específico del fragmento C Tabla 25: Clones seleccionados en el fragmento C y analizados por ELISA específico del fragmento C La panorámica de la biblioteca de exhibición del fago contra TT, reveló un número incrementado de clones específicos de TT cuando se incrementa el número de rondas de panorámicas, y solamente algunos clones fueron identificados en la biblioteca no seleccionada. No se encontraron clones por ser reactivos con el fragmento C de toxoide tetánico a partir de la biblioteca no seleccionada o después de dos rondas de panorámicas de la biblioteca contra TT. Para obtener fragmentos Fab con especificidad del fragmento C a partir de la biblioteca de exhibición de fago combinatoria, esta biblioteca ha sido paneada contra el fragmento C específicamente . Por comparación, trece clones específicos de TT del Ejemplo 11, fueron sometidos a ELISA específico del fragmento C, de estos, siete mostraron reactividad arriba del 2x antecedente. De este modo, fragmentos Fab con especificidad hacia el fragmento C de la toxina tetánica, podrán ser expresados de una biblioteca de pares cognados obtenida a partir de individuos inmunizados con TT. Esto ilustra claramente la desventaja de usar panorámicas para identificar clones con especificidad hacia un antígeno particular. Si fragmentos de antígenos importantes o epítopes son desconocidos, pueden ser descargados durante el paneo, con ello, resultando en un producto menos eficiente al final.

Además, afinidades aparentes de los clones combinatoriaes fueron medidas como se describe en el ensayo del Ejemplo lli. Fueron analizados diez de los clones combinatoriaes obtenidos después de dos rondas de panorámicas en TT, revelando aparentes afinidades de enlace entre 1 y 15 nM. Por comparación, cuatro de los nueve clones analizados de la biblioteca de pares cognados (tabla 21) , mostraron afinidades en el intervalo pico-molar. Esto indica que el apareamiento de las regiones variables como se seleccionaron originalmente o por los donadores del sistema inmune, en combinación con las hipermutaciones somáticas de los pares que han sido sometidos como un par, potencialmente resultan en afinidades de enlace aparentes superiores que las combinaciones aleatorias de tales regiones variables . d. Comparación de secuencias de clones de partículas de fagos combinatoriaes específicos de TT y clones de pares cognados La gran cantidad de datos de secuencia generados de las dos bibliotecas, evita las comparaciones directas de secuencias puras. Para visualizar la diferencia entre los pares de secuencias VH y VL en la biblioteca de exhibición de fago y en la biblioteca de pares cognados, se generaron filogenéticamente tres para las secuencias VH y VL, y los pares fueron ilustrados en una matriz de punto. El apareamiento de la información filogenética en una matriz de punto (Figura 25) , reveló perfiles de distribución muy diferentes de pares de secuencias VH y VL en la biblioteca de exhibición del fago (Figura 25A) , indicando poca relación filogenética entre los genes VH y VL de acuerdo con el apareamiento aleatorio de los genes V en esta biblioteca. Por el contrario, pares de secuencias VH y VL de la biblioteca de pares cognados (Figura 25B) , muestran una apariencia agrupada indicando co-evolución de genes V, como se espera para los pares cognados. También, la diversidad genética es mucho mayor para los genes V en la biblioteca de pares cognados, comparada con los genes V de la biblioteca combinatoria, indicando que el método de aislamiento de genes V apareados cognados, es menos desviado. Ejemplo 14: TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única Combinada y RCP Anidada Usando Células T como Fuentes de Plantillas En este ejemplo, se describe como se puede realizar una TI-RCP de traslape-extensión múltiple de etapa única, en linfocitos T derivados de un donador humano. a. Obtención de una fracción de células que contiene linfocitos Se obtuvo una muestra de sangre a partir de donadores humanos, quienes han sido sometidos al antígeno deseado, por ejemplo, por inmunización, infección natural, malignidades, a través de una reacción inmune u otras enfermedades. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son aisladas usando Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo Noruega, prod. No. 1001967) , de conformidad con las instrucciones del fabricante . En el presente ejemplo, se generaron células T específicas del antígeno por estimulación adicional de la fracción de PBMC. Sin embargo, la TI-RCP de traslápeextensión múltiple puede también ser realizada directamente en células únicas a partir de la fracción de PBMC o en una fracción de células enriquecidas por células T (por ejemplo, por clasificación FACS para células positivas CD3) . b. Generación de células T específicas del antígeno La fracción de células PBMC es re-suspendida en un medio de cultivo apropiado que contiene citosinas relevantes tales como IL2. Además, el antígeno deseado es agregado al cultivo, en donde estará presente en los linfocitos T por células que presentan antígeno (APC) presentes en la fracción PBMC. Alternativamente, células alimentadoras APC tratadas de antemano, de manera tal que están presentando el antígeno deseado, pueden ser agregadas a la fracción PBMC. Tales células alimentadoras APC, pueden ser APC expuestas al antígeno deseado en la forma de por ejemplo, péptido, proteína u otra forma molecular, o ACP microbialmente infectado o células transfectadas para expresar y presentar el antígeno, o APC co-cultivadas con otras células antigénicas, por ejemplo, tales como células cancerosas en la forma de tejido primario o líneas celulares. Muchos tipos diferentes de células alimentadoras APC son conocidos a partir de la literatura, que incluye líneas de células transformadas, líneas de células B, células dendríticas, etc. La fracción PBMC es cultivada por aproximadamente 3 a 5 semanas, durante el cual, células que presentan antígenos recientes, son agregadas junto con citosinas, por ejemplo, en una base semanal. Esto resulta en la proliferación, activación y maduración de linfocitos T. Al final del periodo de cultivación, el cultivo celular será dominado por células T específicas del antígeno. Si estas células son CD4+ o CD8+, depende de la enfermedad, el antígeno, las células APC y las mezclas de citosinas usadas durante el periodo de estimulación. La especificidad del antígeno puede por ejemplo, ser probada con un ensayo CTL, ensayos de proliferación y tetrámeros MHC cargados con el antígeno deseado (Altman, J. D., et al. 1996. Science 274, 94-96). Las células T específicas del antígeno, son distribuidas a tubos PCR, ya sea limitando la dilución o usando un FACS para obtener una célula única contra el recipiente. El recipiente puede ser almacenado a -80°C hasta su uso. b. TI-RCP de Traslape-Extensión Múltiple de Etapa Única Se usó el kit de TI-RCP de una etapa de Qiagen (Qiagen cat. No. 210212, Hilden, Alemania), para la TI-RCP de traslape-extensión múltiple, esencialmente de conformidad con las recomendaciones del fabricante . Antes de la adición de la mezcla de reacción por RCP a los tubos de RCP, las células fueron congeladas . Las mezclas de reacción por RCP y condiciones de ciclización, son inicialmente expuestas como se describe en el Ejemplo 11 e-1. Sin embargo, una cierta cantidad de optimización se puede esperar para una nueva serie de cebadores . La mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple usada, comprende los cebadores mostrados en la tabla 26.

Tabla 26 c. RCP Semi-Anidada La RCP semi-anidada es del mismo modo propuesta para ser realizada como se describe en el Ejemplo 11 e-2, y se puede esperar alguna optimización. Los cebadores usados se muestran en la tabla 27.

Tabla 27 Secuencias catalizadas corresponden a la región específica del gen . Para verificar que la TI-RCP de traslape-extensión múltiple sea exitosa, se analizó una proporción de las muestras a partir de las reacciones de RCP semi-anidadas, sometiendo 10 µl de cada reacción de RCP semi-anidada, a electroforesis en gel de agarosa al 1% usando bromuro de etidio para detección. El tamaño esperado del fragmento de traslape-extensión, es de aproximadamente 850 pb (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables) . Aproximadamente diez microlitros de todas las reacciones realizadas que se originan del mismo donador, son consolidadas en un tubo. Una alícuota de RCP combinada es subsecuentemente purificada usando un kit de purificación por RCP QIAquick, de conformidad con el procedimiento de manufactura (Qiagen cat. No. 28106, Hilden, Alemania. La combinación purificada de productos por RCP traslapados, puede ser diferida con enzimas de restricción apropiadas y subsecuentemente purificada e insertada en un vector adecuado . En el presente experimento, cebadores de la región constante (SEC ID NO . 376 y 377 ) usados en la RCP semi- anidada, son diseñados para sub-clonación del producto de RCP semi-anidado en un vector adecuado. El diseño de los cebadores Cß confía en el cambio de un SER a Met en la posición 21 en el péptido de región constante de la cadena ß, por el cual, se puede introducir un sitio Nsil en la secuencia de ácido nucleico: Nsil tcc cae -> atg cat SER HIS MET HIS Esta traducción debe ser relativamente segura, puesto que SER 21 está expuesto en la región constante de la cadena ß en una estructura de bucle en el extremo próximo de la membrana del dominio.

Este cambio conservativo relativo no está por lo tanto, probablemente interrumpiendo la estructura de dominio total. El diseño del cebador Ca confía en cambiar nucleótidos que corresponden a la pos. 15-17 en el péptido de región constante de cadena a, por los cuales, se puede introducir un sitio Sacl en la secuencia de ácido nucleico : Sacl aaa tcc agt -> aag age tet LYS SER SER LYS SER SER Vectores adecuados por lo tanto, contendrán las partes restantes de las regiones constantes de las cadenas OÍ y ß de TcR, y contendrán modificación apropiada en términos de sitios de restricción. Estos cambios se pueden realizar usando técnicas estándares de sub-clonación y RCP . e . Consideraciones Adicionales La gran cantidad de cebadores de regiones variables , puede potencialmente interactuar de una manera inhibitoria durante la amplificación de RCP de traslape-extensión múltiple . Para evitar esto, pueden ser divididos cebadores de región variable en sub-series y usados separadamente en combinaciones apropiadas . Otras Modalidades Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta especificación, están incorporadas en este documento por referencia, como si cada publicación individual o publicación de patente fuere específicamente e individualmente indicada por estar incorporada por referencia. Aunque la invención mencionada anteriormente ha sido descrita en algún detalle por medio de ilustración y ejerrplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente aparente para aquellos de habilidades ordinarias en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu o ámbito de las reivindicaciones adjuntas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Método para enlazar una pluralidad de secuencias no contiguas de nucleótidos de interés, caracterizado porque dicho método comprende : a) amplificar, en un procedimiento de amplificación molecular múltiple, secuencias de nucleótidos de interés usando una plantilla derivada de una célula única aislada o una población de células isogénicas; y b) efectuar el enlace de las secuencias de nucleótidos de interés ampli icadas en la etapa a) .

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias de nucleótidos de interés comprenden las secuencias que codifican la región variable y el enlace genera un par cognado de secuencias que codifican la región variable .

3. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las secuencias de nucleótidos de interés comprenden secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina y el enlace genera un par cognado de una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada .

4. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las secuencias de nucleótidos de interés comprenden secuencias que codifican la región variable del receptor de células T y el enlace generan un par cognado constituido de una secuencia que codifica la región variable de cadena alfa asociada con una secuencia que codifica la región variable de cadena beta o una secuencia que codifica la región variable de cadena gama asociada con una secuencia que codifica la región variable de cadena delta.

5. Método para enlazar aleatoriamente, una pluralidad de secuencias no contiguas de nucleótidos de interés, caracterizado porque dicho método comprende: a) amplificar, en un procedimiento de amplificación molecular múltiple, secuencias de nucleótidos de interés, usando una plantilla derivada de una población de células genéticamente diversas; y b) efectuar el enlace de las secuencias de nucleótidos de interés, amplificadas en la etapa a) .

6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha población de células son sometidas a lisis.

7. Método de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótido de interés comprende secuencias que codifican una región variable y el enlace genera una biblioteca combinatoria de pares de secuencias que codifican una región variable.

8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótido de interés comprende secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulina y el enlace genera una biblioteca combinatoria de pares de secuencias que codifican una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada.

9. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de nucleótido de interés comprende las secuencias que codifican la región variable del receptor de células T y el enlace genera una biblioteca combinatoria de pares de secuencias que codifican una región variable de cadena a y una región variable de cadena ß .

10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho procedimiento de amplificación molecular múltiple es una amplificación por TI-RCP múltiple.

11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque dicha amplificación por TI-RCP múltiple es un proceso de dos etapas que comprende una etapa de transcripción inversa (RT) separada antes de la amplificación por RCP múltiple.

12. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la amplificación por TI-RCP múltiple es realizada en una etapa única que comprende agregar inicialmente todos los componentes necesarios para realizar tanto la transcripción inversa (RT) como la amplificación por RCP múltiple en un recipiente único.

13. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho enlace de las secuencias de nucleótidos de interés se realiza en el mismo recipiente como la amplificación molecular múltiple. 1 .

Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el enlace de las secuencias de nucleótido de interés es efectuado en asociación con la amplificación por RCP múltiple, utilizando una mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple.

15. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho enlace de las secuencias de nucleótido de interés es efectuado por ligación.

16. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se realiza la amplificación molecular adicional, utilizando una mezcla de cebador adaptada para amplificar las secuencias de ácido nucleico enlazadas de interés.

17. Método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la mezcla de cebador de traslape-extensión múltiple comprende series de cebadores en donde al menos, un elemento de la serie de cebadores de cada serie de cebadores comprende un extremo de traslape-extensión capaz de hibridizar al extremo de traslape-extensión de un elemento de la serie de cebadores de una segunda serie de cebadores .

18. Método de conformidad con la reivindicación 14 ó 17, caracterizado porque la mezcla de cebador traslápeextensión múltiple comprende: a) al menos un cebador CL o JL complementario a la hebra sentido de una secuencia que codifica la región de cadena ligera de inmunoglobulina; b) al menos un cebador VL5' o cebador VL complementario a la hebra antisentido de una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o secuencia líder de la región variable de cadena ligera, y capaz de formar una serie de cebadores con el (los) cebador (es) en la etapa a) ; c) al menos un cebador CH o JH complementario a la hebra sentido de una secuencia que codifica el dominio de cadena pesada constante de inmunoglobulina o una secuencia que codifica la región de unión de cadena pesada; d) al menos un cebador VH5' o VHL complementario a la hebra antisentido de una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o secuencia líder de región variable de cadena pesada, y capaz de formar una serie de cebadores con el (los) cebador (es) en la etapa c) .

19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque los cebadores de la etapa b) son cebadores VLL con al menos 90% de identidad de secuencia con la región específica del gen de la SEC ID 93 a 98, y los cebadores de la etapa d) son cebadores VHL con al menos 90% de identidad de secuencia con la región específica del gen de la SEC ID 86 a 92.

20. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la célula única, la población de células isogénicas o la población de células genéticamente diferentes, se obtiene a partir de una fracción de células que contienen linfocitos.

21. Método para producir una biblioteca de pares cognados, que comprende secuencias que codifican la región variable enlazadas, caracterizado porque dicho método comprende : a) proporcionar una fracción celular que contiene linfocitos de un donador; b) enriquecer opcionalmente una población de linfocitos particular de dicha fracción celular; c) obtener una población de células únicas aisladas, que comprende distribuir células de dicha fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes; y d) amplificar y efectuar el enlace de las secuencias que codifican la región variable contenidas en dicha población de células únicas aisladas, de conformidad con un método de cualquiera de las reivindicaciones I a 4 ó l0 a 20, en cuanto a que estas sean dependientes de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula única aislada individual en la población de células únicas, está expandida a una población de células isogénicas, antes de realizar la amplificación y enlace (etapa d) .

23. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque la fracción celular que contiene linfocitos constituye sangre completa, médula ósea, células mononucleares o células sanguíneas blancas .

24. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque la fracción celular que contiene linfocitos es enriquecida por células del linaje de linfocitos B.

25. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizado porque la fracción celular que contiene linfocitos o linaje de linfocitos B, es enriquecida por células de plasma.

26. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizado porque las células de la fracción celular que contiene linfocitos, linaje de linfocitos B o células de plasma, son enriquecidas por especificidad del antígeno.

27. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque la fracción celular que contiene linfocitos es enriquecida por células del linaje de linfocitos T.

28. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque las células T específicas del antígeno, son generadas por estimulación de la fracción celular que contiene linfocitos.

29. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende insertar las secuencias de nucleótido enlazadas o una biblioteca de pares cognados en un vector.

30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque dicho vector se selecciona entre los vectores de clonación, vectores de lanzadera, vectores de exhibición o vectores de expresión.

31. Método de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque las secuencias de nucleótido enlazadas o los elementos individuales de la biblioteca de pares cognados, comprenden una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina asociada con la secuencia que codifica la región variable de cadena ligera y dichas secuencias son insertadas en la estructura en un vector que ya contiene secuencias que codifican uno o más dominios constantes de inmunoglobulina o fragmentos del mismo.

32. Método de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque las secuencias de nucleótido enlazadas o los elementos individuales de la biblioteca de pares cognados, comprenden una secuencia que codifica la región variable de cadena a del receptor de células T, asociada con secuencias que codifican la región variable de cadena ß y dichas secuencias son insertadas en la estructura en un vector que ya contiene secuencias que codifican uno o más dominios constantes del receptor de células T o fragmentos del mismo.

33. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32, caracterizado porque además comprende crear una sub-biblioteca seleccionando una subserie de pares cognados de secuencias de región variable enlazadas que codifican proteínas de enlace con una especificidad objetivo deseada, generar una biblioteca de pares cognados específica del objetivo de secuencias que codifican la región variable .

34. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizado porque además comprende transferir dicho par cognado o biblioteca de pares cognados específica del objetivo, de secuencias que codifican la región variable a un vector de expresión de mamífero.

35. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el vector de expresión de mamífero codifica uno o más dominios de región constante seleccionado de inmunoglobulina humana clases IgAl, IgA2 , IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, cadena ligera kappa o cadena ligera lambda o de cadenas alfa, beta, delta y/o gamma del receptor de células T.

36. Método de conformidad con una de las reivindicaciones 29 a 35, caracterizado porque además comprende las etapas: a) introducir un vector que codifica un segmento de secuencias de nucleótido enlazadas en una célula hospedera; b) cultivar dichas células hospederas bajo condiciones adaptadas para expresión; y c) obtener el producto de proteína expresado del vector insertado en dicha célula hospedera.

37. Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque dicho producto de proteína es un anticuerpo monoclonal que comprende un par cognado de una región variable de cadena ligera asociada con una región variable de cadena pesada.

38. Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque dicho producto de polipéptido es un receptor de células T que comprende un par cognado de una región variable de cadena alfa asociada con una región variable de cadena beta.

39. Biblioteca de pares cognados, caracterizada porque consiste de secuencias que codifican la región variable ligada.

40. Biblioteca de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque dichos pares cognados de secuencias que codifican la región variable, son obtenidos por el método de conformidad con la reivindicación 21 o cualquier reivindicación dependiente de esta.

41. Biblioteca de conformidad con las reivindicaciones 39 ó 40, caracterizada porque un elemento individual de dichos pares cognados comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina asociada con una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada.

42. Biblioteca de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque dicho elemento individual codifica un anticuerpo de longitud completa seleccionado de inmunoglobulina humana clases IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM.

43. Biblioteca de conformidad con las reivindicaciones 39 ó 40, caracterizada porque un elemento individual de dichos pares cognados comprende una secuencia que codifica una región variable de cadena alfa TcR asociada con una secuencia que codifica la región variable de cadena beta o una secuencia que codifica la región variable de cadena gama asociada con una secuencia que codifica la región variable de cadena delta.

44. Biblioteca de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque dicho elemento individual codifica un TcR de longitud completa.

45. Sub-Biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican la región variable caracterizada porque codifica proteínas que presentan especificidades de enlace deseadas dirigidas contra un objetivo particular.

46. Sub-Biblioteca caracterizada porque codifica proteínas que presentan especificidades de enlace deseadas dirigidas contra un objetivo particular, seleccionadas de una biblioteca de conformidad con una de las reivindicaciones 39 a 44.

47. Sub-Biblioteca de pares cognados de secuencias que codifican una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina enlazada, caracterizada porque las inmunoglobulinas que se expresan de dicha biblioteca, son capaces de reaccionar con, o enlazarse a la Toxina Tetánica.

48. Población de células hospederas, caracterizada porque comprende una biblioteca o sub-biblioteca de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 47.

49. Población de células hospederas de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque las células son células de mamífero.

50. Proteína policlonal recombinante, caracterizada porque se expresa de las células hospederas de conformidad con la reivindicación 48 ó 49.

51. Inmunoglobulina policlonal recombinante o fragmentos de la misma, caracterizados porque son capaces de reaccionar con o enlazarse a la Toxina tetánica.

52. La inmunoglobulina policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque los elementos individuales son pares cognados .

53. La inmunoglobulina policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 51 ó 52, caracterizada porque comprende al menos, dos pares cognados individuales que comprenden una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, asociada con una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera, con al menos, 90% de identidad a un par de SEC ID individual, seleccionado del grupo que consiste de pares SEC ID 229:276, 262:309, 240:287, 245:292, 267:314, 246:293, 258:305, 242:289, 231:278, 263:310, 232:279, 237:284, 255:302, 260:307, 251:298, 233:280; 228:275, 244:291, 250:297, 252:299, 264:311, 272:319, 235:282 ó 238:285.

54. Inmunoglobulina recombinante o fragmentos de la misma capaces de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica, caracterizados porque las regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) se derivan de uno o más pares de la SEC ID de conformidad con la reivindicación 53.

55. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende una inmunoglobulina policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 50 como ingrediente activo, combinada con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable .

56. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica como ingrediente activo, opcionalmente combinada con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

57. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 55 ó 56, caracterizada porque es para uso como un medicamento .

58. Método para prevenir o tratar un paciente en riesgo de desarrollar tétanos, caracterizado porque se administra a un paciente en necesidad del mismo, una composición que comprende un anticuerpo policlonal recombinante capaz de reaccionar con o enlazarse a la Toxina Tetánica.